CN113912662A - 一种发酵液中c21甾体化合物的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵液中C21甾体化合物的纯化方法。该方法包括以下步骤：(1)将发酵液在1,000rpm下离心5min，收集上清液，将1体积上清液冷冻干燥得到析出物，将析出物加入到2体积无水乙醇中，混匀、静置10min后，在10,000rpm下离心5min，收集上清醇提液；(2)将1体积所述醇提液加入到3～5体积沉析剂中，振荡混匀、静置过夜后，在1,000rpm下离心1min，收集沉淀；(3)将所述沉淀置于40℃水浴中挥发至无液体残留，晶体析出即为C21甾体化合物。本发明针对微生物发酵液组成特点，建立C21甾体类物质的纯化方法，该方法操作步骤简单，重复性和稳定性高，所需试剂易得，容易运用至工业大批量生产中，对纯化物质技术领域、医药领域都有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于物质纯化技术领域，尤其涉及一种发酵液中C21甾体化合物的纯化方法。
背景技术
目前熟知的发酵液中物质分离纯化流程大致为：(1)预处理(加热、调pH、絮凝)；细胞分离(过滤、离心分离、膜分离)；(2)初步纯化(沉淀、吸附、萃取、超滤、结晶)；(3)高度纯化(重结晶、离子交换、色谱分离、膜分离)；(4)成品加工(浓缩、无菌过滤、干燥、成型)。
现有报道C21甾体化合物的提纯方法均针对植物体来源材料。而针对具有C21甾体化合物代谢能力的菌种发酵液的提纯方法较少，现有最为常见的提取方法为先乙醇回流提取，再通过大孔树脂吸附纯化。这种提取方法中，提取C21甾体类物质需8倍体积乙醇3次回流，每次1h，该方法成本较高，提取时间较长。对于树脂吸附纯化，涉及装柱后需要乙醇反复洗涤至无色，多次上样重复以确保上柱成功，继而洗脱收集，操作较复杂，如纯化量较大，耗时长。此外，发酵液中包含内生菌的各种代谢物，成分较复杂，且与植物组织液差异较大，常规方法无法满足其中C21甾体类物质的提取。
发明内容
本发明的目的在于提供一种发酵液中C21甾体化合物的纯化方法，旨在解决上述背景技术中现有技术所存在的各种问题。
本发明是这样实现的，一种发酵液中C21甾体化合物的纯化方法，该方法包括以下步骤：
(1)将发酵液在1,000rpm下离心5min，收集上清液，将1体积上清液冷冻干燥得到析出物，将析出物加入到2体积无水乙醇中，混匀、静置10min后，在10,000rpm下离心5min，收集上清醇提液；
(2)将1体积所述醇提液加入到1～7体积沉析剂中，振荡混匀、静置过夜后，在1,000rpm下离心1min，收集沉淀；
(3)将所述沉淀置于40℃水浴中挥发至无液体残留，晶体析出即为C21甾体化合物。
优选地，在步骤(1)中，所述冷冻干燥具体为：在-20℃预冻24h，再于真空环境中冷冻干燥24h。
优选地，在步骤(2)中，所述醇提液与沉析剂的体积比为1﹕4。
优选地，所述沉析剂由乙醚、丙酮按体积比1﹕1构成。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明针对微生物发酵液组成特点，建立C21甾体类物质的纯化方法，该方法操作步骤简单，重复性和稳定性高，所需试剂易得，容易运用至工业大批量生产中，对纯化物质技术领域、医药领域都有重要意义。
附图说明
图1是本发明实施例中两种干燥方法对发酵液的浓缩效果对比图；
图2是本发明实施例中不同体积比醇提液和沉析剂对提取物纯化效果的影响；
图3是本发明实施例中所得C21甾体化合物样品的全波段扫描结果；
图4是本发明实施例中细菌X-32发酵液纯化物的高效液相色谱结果；
图5是本发明实施例中真菌Z-44发酵液纯化物的高效液相色谱结果；
图6是本发明实施例中放线菌F-45发酵液纯化物的高效液相色谱结果；
图7是本发明实施例中细菌X-32发酵液纯化物的质谱检测结果；
图8是本发明实施例中真菌Z-44发酵液纯化物的质谱检测结果；
图9是本发明实施例中放线菌F-45发酵液纯化物的质谱检测结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一、发酵液中C21甾体化合物的提取工艺
1、样品中C21甾体化合物浓缩工艺
将具有C21甾体化合物合成能力的白首乌内生菌种培养至次级代谢期，取10mL发酵液在1,000rpm下离心5min，各取上清液4mL分别采用烘干法和冷冻干燥法进行处理。其中，(1)烘干法条件为：60℃水浴挥干；(2)冷冻干燥法条件为：-20℃预冻24h，真空冷冻干燥24h。
由上处理后分别得到析出物样品A和析出物样品B。两种浓缩方法比较，如图1所示，真空冷冻干燥工艺所制备样品的结晶率高于烘干法。
2、浓缩样品中C21甾体化合物的纯化工艺
(1)C21甾体化合物的萃取
往所述浓缩样品A和样品B中各加入8mL乙醇，匀浆器打匀，10,000rpm离心5min，收集上清醇提液。
(2)C21甾体化合物的沉析
按1﹕1～7体积比在上述醇提液中加入沉析剂(乙醚与丙酮按体积比1﹕1配制)，摇匀，1,000rpm离心1min，40℃水浴挥发至无液体残留，称量剩余物质量。
如图2所示，随着沉析剂添加比例的提高，结晶率呈先上升后下降的趋势，其中，两者体积比1∶4时，结晶率最高。
二、发酵液中C21甾体化合物提取工艺的效果验证
选取3株具有C21甾体化合物合成能力的白首乌内生菌，分别为：细菌X-32、真菌Z-44、放线菌F-45，将其发酵培养至次级代谢期，收集发酵液，利用上述建立方法提取其中C21甾体化合物，并进行分析，验证方法有效性。
1、样品前处理
将上述3株菌的发酵液按建立的提取工艺制备产物样品，用60％乙醇水溶液定容至2mL中，摇匀，经微孔滤膜(0.22μm)过滤后，稀释10倍，备用。
2、紫外全波段扫描
取上述处理样品2μL进行紫外全波长扫描，结果如图3所示，263nm处出现明显吸收峰，且杂峰较少，与现有文献中已知的C21甾体化合物的检测波长特征一致。
3、LC-MS鉴定
对制备得到的纯化物进行HPLC检测及LC-MS鉴定。色谱条件：Alltima C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；采用乙腈(A)-水(B)梯度洗脱(0～10min，35％A。)；流速1mL/min；柱温35℃；检测波长为263nm；进样量10μL。
检测结果如图4～9所示，其中，图4～6分别为细菌X-32、真菌Z-44、放线菌F-45发酵液纯化物的高效液相色谱结果，高效液相色谱结果出现明显主峰，且峰相对集中，可以判断提纯方法较好，得到的化合物纯度约为66.7％，产率约为71.4％。图7～9分别为细菌X-32、真菌Z-44、放线菌F-45发酵液纯化物的质谱检测结果，其结果峰的质谱分析结果也表明，3株白首乌内生菌的发酵液经纯化后得到的3种物质均为C21甾体化合物，分别为隔山消苷C1N、隔山消苷C3N、开德苷元。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种发酵液中C21甾体化合物的纯化方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)将发酵液在1,000rpm下离心5min，收集上清液，将1体积上清液冷冻干燥得到析出物，将析出物加入到2体积无水乙醇中，混匀、静置10min后，在10,000rpm下离心5min，收集上清醇提液；
(2)将1体积所述醇提液加入到1～7体积沉析剂中，振荡混匀、静置过夜后，在1,000rpm下离心1min，收集沉淀；
(3)将所述沉淀置于40℃水浴中挥发至无液体残留，晶体析出即为C21甾体化合物。
2.如权利要求1所述的发酵液中C21甾体化合物的纯化方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述冷冻干燥具体为：在-20℃预冻24h，再于真空环境中冷冻干燥24h。
3.如权利要求1所述的发酵液中C21甾体化合物的纯化方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述醇提液与沉析剂的体积比为1﹕4。
4.如权利要求3所述的发酵液中C21甾体化合物的纯化方法，其特征在于，所述沉析剂由乙醚、丙酮按体积比1﹕1构成。
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