CN103450320B - 一种从赭色小莫勒菌中提取藿烷醇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从赭色小莫勒菌中提取三萜类化合物藿烷醇的方法，主要包括菌株的培养，减压抽滤分离得到菌液和菌丝体，菌丝体恒温干燥后经乙酸乙酯浸提，菌液经乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯提取液经旋蒸获得浸膏，将浸膏多次进行硅胶柱层析，得到的流分旋蒸浓缩，氯仿洗出，自然挥干，并用石油醚，甲醇重结晶，得化合物藿烷醇。本发明原料取材简单；提取步骤简单，成本低；制得的化合物纯度高。

Description

一种从赭色小莫勒菌中提取藿烷醇的方法

技术领域

    本发明涉及一种从赭色小莫勒菌中提取化合物藿烷醇的方法。

背景技术

莫勒菌是虫生真菌的重要成员，由于它能引起粉虱和介壳类昆虫群体性流行病的发生，这使得它有可能成为有用的生物防治剂。虫生真菌的代谢产物中含有多肽、生物碱、萜类化合物、甾醇等多种具有杀虫、抗肿瘤、抗炎、抗菌等活性物质，因此，充分开发利用虫生真菌，将有利于人类医疗水平的发展。

近年来人们发现莫勒菌的代谢产物具有抗菌、抗肿瘤和抗疟原虫等生物活性，这预示该菌在生物农药或医药上存在很大应用价值。

藿烷醇是藿烷类生物合成中的一个重要的前体，而藿烷类物质多具有抗肿瘤、抗炎、抗菌等活性，可以通过对藿烷醇的结构修饰生成各种新的活性物质。目前，尚未有在莫勒菌中发现藿烷醇的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种从赭色小莫勒菌中提取化合物藿烷醇的方法，以促进其药理学的进一步研究和临床上更好的开发和应用。

本发明采取的技术方案如下：

一种从赭色小莫勒菌中提取藿烷醇的方法，包括以下步骤：

1）              赭色小莫勒菌活化后，取菌块接种PDB培养基中，在120~160r/min、20~28℃条件下连续培养5~10天即初级培养，按8％~10％接种量再次转接到PDB培养基中，继续在120~160r/min、20~28℃条件下连续培养25~30天即次级培养；

2）              将培养液用减压抽滤装置过滤，得菌丝体和菌液，菌液直接用乙酸乙酯萃取，萃取液经旋转蒸发仪旋蒸得浸膏；菌丝体在28-35℃下干燥后研磨成粉状，加1~2倍体积的乙酸乙酯浸泡10～14小时，超声20～40分钟，浸提液经旋蒸得菌丝体浸膏，回收乙酸乙酯；

3）              将浸膏进行减压粗分，分别以石油醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇为洗脱剂依次进行洗脱，收集乙酸乙酯部分，经旋蒸得粗品；

4）              以石油醚：丙酮体积比=50:1～1:1梯度洗脱，收集石油醚：丙酮=10:1部分洗脱液，旋蒸浓缩，氯仿溶解，溶解液自然挥干，再经石油醚、甲醇重结晶得藿烷醇。

其中，所述步骤1）中PDB培养基为：200g马铃薯，20g葡萄糖，沸水煮30min，经4层纱布过滤后加单蒸水定容至1L，121℃高压灭菌20min。

所述步骤1）中接种菌块的大小为1×1cm，接种量为2块。

所述步骤2）中菌液用乙酸乙酯萃取具体操作为：将菌液与乙酸乙酯按体积比1：1混合，倒入分液漏斗中，摇瓶萃取菌液2~4次，每次3～5min。

所述步骤3）中进行粗分时减压柱的柱高7~10 cm，所用硅胶为200~300目。

所述步骤4）中将粗品进行梯度洗脱时，石油醚和丙酮的体积比每次降低10个单位，即梯度为50:1，40:1，30:1，20:1，10:1，1:1。

本发明首次在莫勒菌中发现藿烷醇，并对其进行提取和纯化。

本发明的显著优点：

1）    原料取材简单；

2）    提取步骤简单，成本低；

3）    制得的化合物纯度高。

附图说明

图1提取的藿烷醇的纯度验证图

图2 提取的藿烷醇¹H NMR谱

图3 提取的藿烷醇的¹³C NMR谱

图4提取的藿烷醇的¹³C NMR谱(下)和DEPT 135谱(上)

图5提取的藿烷醇的EI-MS谱

图6藿烷醇的化学结构图

具体实施方式

以下是本发明的几个具体实施例，进一步说明本发明，但是本发明不仅限于此。

实施例1

1） 取赭色小莫勒菌（邱君志等，赭色小莫勒菌在中国的发现. 菌物学报，2009.28(1): 148-150）为材料，无菌条件下挑取大小为1×1cm的菌块2块接种到PDB培养基（200g马铃薯，20g葡萄糖，沸水煮30min，经4层纱布过滤后加单蒸水定容至1L，分装到250ml三角瓶中，每瓶装100ml，在121℃高压下灭菌20min）中，在160r/min、25℃条件下连续培养5天即初级培养，按10%接种量再次转接到PDB培养基中，继续在160r/min、20℃条件下连续培养28天即次级培养；

2)  将培养液用减压抽滤装置过滤，得菌丝体和菌液，菌丝体在28℃下干燥之后研磨成粉状，加1倍体积（w/v）的乙酸乙酯浸泡10小时，超声20分钟，浸泡液旋蒸得浸膏，回收乙酸乙酯；将菌液与乙酸乙酯按体积1：1混合、倒入分液漏斗中，摇瓶萃取两次，每次3min，从瓶口倒出乙酸乙酯，将其旋蒸浓缩得菌液浸膏，回收乙酸乙酯；

3)              合并菌液浸膏和菌丝体浸膏，氯仿溶解浸膏，使用200~300目硅胶，6×20cm柱进行减压粗分，柱高7cm，0.5个柱体积收集1个馏分，分别以石油醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇为洗脱剂依次进行洗脱，收集乙酸乙酯部分，经旋蒸得粗品；

4）将粗品上200~300目硅胶，以石油醚：丙酮体积比=50:1～1:1梯度洗脱，取石油醚：丙酮=10:1部分洗脱液，旋蒸浓缩，用氯仿将含有少量杂质的藿烷醇溶解，自然挥干，待晶体析出后，加入甲醇，过滤洗去杂质，剩余的晶体氯仿溶解后重结晶，加入石油醚，过滤洗去杂质，剩余的晶体用再次氯仿溶解后重结晶，直至获得藿烷醇纯品。

5）藿烷醇的纯度通过薄层色谱来验证，如图1所示。展开剂为石油醚：三氯甲烷体积比=1:10，R_f=0.73，可以确定得到的藿烷醇的纯度为99%。

6） 藿烷醇的结构验证：提取的藿烷醇¹H NMR谱，如图2所示，δ1.23(3H，s)，1.20(3H，s)，0.86(3H，s)，0.83(3H，s)，0.81(3H，s)，0.78(3H，s)，0.97（6H，d），表明提取的化合物含有8个甲基。

提取的藿烷醇的¹³C NMR谱，如图3所示，δ21.9，21.6，20.9，18.7，17.0，16.7，16.1，15.8，提示有8个角甲基的碳原子，δ73.9提示化合物中存在着1个连氧碳。

提取的藿烷醇的¹³C NMR谱和DEPT谱对比图谱，如图4所示化合物中含有6个季碳，11个仲碳。

提取的藿烷醇的EI-MS谱，如图5所示，根据其EI-MS的信息m/z：428，推测其分子质量为428。

经EI-MS、¹H NMR、¹³C NMR分析，比对文献（Hoshino T, Nakano S, Kondo T, et al. Squalene–hopenecyclase: final deprotonation reaction, conformational analysis for the cyclization of (3R, S)-2, 3-oxidosqualene and further evidence for the requirement of anisopropylidene moiety both for initiation of the polycyclization cascade and for the formation of the 5-membered E-ring[J]. Org Biomol Chem, 2004, 2(10): 1456~1470），确认提取到的化合物为藿烷醇，其化学结构见图6。

7）提取率：2.33%（提取率%=纯藿烷醇重量/菌液浸膏和菌丝体浸膏总量×100%）。

实施例2

1） 取赭色小莫勒菌为材料，无菌条件下挑取大小为1×1cm的菌块2块接种到PDB培养基中，在120r/min、26℃条件下连续培养8天即初级培养，按9%接种量再次转接到PDB培养基中，继续在120r/min、26℃条件下连续培养30天即次级培养；

2）将培养液用减压抽滤装置过滤，得菌丝体和菌液，菌丝体在32℃干燥之后研磨成粉状，加1.5倍体积（w/v）的乙酸乙酯浸泡12小时，超声30分钟，浸泡液旋蒸得浸膏，回收乙酸乙酯；将菌液与乙酸乙酯按体积1：1混合、倒入分液漏斗中，摇瓶萃取三次，每次4min，从瓶口倒出乙酸乙酯，将其旋蒸浓缩得菌液浸膏，回收乙酸乙酯；

3） 合并菌液浸膏和菌丝体浸膏，氯仿溶解浸膏，使用200~300目硅胶，6×20cm柱进行减压粗分，柱高8cm，0.5个柱体积收集1个馏分，分别以石油醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇为洗脱剂依次进行洗脱，收集乙酸乙酯部分，经旋蒸得粗品；

4）将粗品上200~300目硅胶，以石油醚：丙酮体积比=50:1～1:1梯度洗脱，取石油醚：丙酮=10:1部分洗脱液，旋蒸浓缩，用氯仿将含有少量杂质的藿烷醇溶解，自然挥干，待晶体析出后，加入甲醇，过滤洗去杂质，剩余的晶体氯仿溶解后重结晶，加入石油醚，过滤洗去杂质，剩余的晶体用再次氯仿溶解后重结晶，直至获得藿烷醇纯品。

5）经验证，可以确定得到的纯度为99%的藿烷醇。

提取率：2.33%（提取率%=纯藿烷醇重量/菌液浸膏和菌丝体浸膏总量×100%）。

实施例3

1） 取赭色小莫勒菌为材料，无菌条件下挑取大小为1×1cm的菌块2块接种到PDB培养基中，在140r/min、28℃条件下连续培养10天即初级培养，按8%接种量再次转接到PDB培养基中，继续在120r/min、28℃条件下连续培养25天即次级培养；

2）将培养液用减压抽滤装置过滤，得菌丝体和菌液，菌丝体在35℃干燥之后研磨成粉状，加2倍体积（w/v）的乙酸乙酯浸泡14小时，超声40分钟，浸泡液旋蒸得浸膏，回收乙酸乙酯；将菌液与乙酸乙酯按体积1：1混合、倒入分液漏斗中，摇瓶萃取四次，每次5min，从瓶口倒出乙酸乙酯，将其旋蒸浓缩得菌液浸膏，回收乙酸乙酯；

3） 合并菌液浸膏和菌丝体浸膏，氯仿溶解浸膏，使用200~300目硅胶，6×20cm柱进行减压粗分，柱高9cm，0.5个柱体积收集1个馏分，分别以石油醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇为洗脱剂依次进行洗脱，收集乙酸乙酯部分，经旋蒸得粗品；

4）将粗品上200~300目硅胶，以石油醚：丙酮体积比=50:1～1:1梯度洗脱，取石油醚：丙酮=10:1部分洗脱液，旋蒸浓缩，用氯仿将含有少量杂质的藿烷醇溶解，自然挥干，待晶体析出后，加入甲醇，过滤洗去杂质，剩余的晶体氯仿溶解后重结晶，加入石油醚，过滤洗去杂质，剩余的晶体用再次氯仿溶解后重结晶，直至获得藿烷醇纯品。

5）经验证，可以确定得到的纯度为99%的藿烷醇。

提取率：2.33%（提取率%=纯藿烷醇重量/菌液浸膏和菌丝体浸膏总量×100%）。

Claims (5)

1. 一种从赭色小莫勒菌中提取藿烷醇的方法， 其特征在于 ： 所述方法包括以下步骤 ：

1）  赭色小莫勒菌活化后， 取菌块接种到 PDB培养基中，在 120~160  r/min、 20~28℃条件下连续培养 5~10 天即初级培养，按 8％ ~10％接种量再次转接到 PDB 培养基中，继续在120~160 r/min、20~28℃条件下连续培养25~30天即次级培养；

2） 将培养液用减压抽滤装置过滤，得菌丝体和菌液，菌液直接用乙酸乙酯萃取， 萃取液经旋转蒸发仪旋蒸得浸膏；菌丝体在28-35℃下干燥后研磨成粉状，加1~2倍体积的乙酸乙酯浸泡10～14 小时，超声 20 ～ 40 分钟，浸提液经旋蒸得菌丝体浸膏，回收乙酸乙酯；

3） 将浸膏进行减压粗分，分别以石油醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇为洗脱剂依次进行洗脱，收集乙酸乙酯部分，经旋蒸得粗品；

4） 以石油醚 ： 丙酮体积比 =50:1 ～ 1:1 梯度洗脱， 收集石油醚： 丙酮 =10:1 部分洗脱液，旋蒸浓缩，氯仿溶解，溶解液自然挥干，再经石油醚、甲醇重结晶得藿烷醇；

所述步骤 1）中 PDB 培养基为：200g 马铃薯，20g 葡萄糖，沸水煮 30min， 经 4 层纱布过滤后加单蒸水定容至 1L，121℃高压灭菌，20min。

2. 根据权利要求 1 所述的从赭色小莫勒菌中提取藿烷醇的方法，其特征在于 ： 所述步骤1）中接种菌块的大小为 1×1cm，接种量为 2 块。

3. 根据权利要求 1 所述的从赭色小莫勒菌中提取藿烷醇的方法，其特征在于： 所述步骤 2）中，将菌液与乙酸乙酯按体积比1 ：1 混合，倒入分液漏斗中， 摇瓶萃取菌液 2~4 次，每次3 ～ 5 min。

4. 根据权利要求 1 所述的从赭色小莫勒菌中提取藿烷醇的方法， 其特征在于： 所述步骤3）中进行粗分时减压柱的柱高7~10 cm，所用硅胶为 200~300目。

5. 根据权利要求 1 所述的从赭色小莫勒菌中提取藿烷醇的方法， 其特征在于： 所述步骤 4）中将粗品进行梯度洗脱时， 石油醚和丙酮的体积比每次降低 10 个单位， 即梯度为50:1， 40:1， 30:1， 20:1， 10:1， 1:1。