CN103265599B - 一种从莫勒菌中提取麦角固醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从莫勒菌中提取麦角固醇的方法，包括：1)活化菌株；2)初级培养；3)次级培养；4)减压抽滤得到菌丝体，菌丝体恒温干燥；5)研磨，有机溶剂浸泡，旋蒸得浸膏；6)氯仿溶解浸膏，160~200目硅胶拌样；7）进行200~300目硅胶柱层析，得到的流分旋蒸浓缩，乙酸乙酯洗出，自然挥干，甲醇重结晶，经1HNMR、13CNMR分析，之后查阅文献确认为麦角固醇。

Description

一种从莫勒菌中提取麦角固醇的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从莫勒菌中提取麦角固醇的方法。
背景技术
莫勒菌（Moelleriella ochracea）是粉虱的重要病原真菌，因此其经常被用于粉虱的生物防控，而且取得了显著效果。近年来，人们把目光转移到其代谢产物上来，已分离到一些有生物活性的物质，如具有抗菌、抗肿瘤和抗疟原虫等生物活性的化合物。
麦角固醇是一种重要的医药化学原料，可用于"考的松"和"激素黄体酮"等药物和农药的使用，它还是维生素D的前体，可用于保健类食品及药品添加，具有进一步研究开发的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从莫勒菌中提取麦角固醇的方法，以促进其进一步在医药和食品中的开发，为人类造福。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种从莫勒菌中提取麦角固醇的方法，包括以下步骤：
1）取保存于实验室的莫勒菌菌株（邱君志等，赭色小莫勒菌在中国的发现. 菌物学报，2009.28(1): 148-150）（体积分数为25%的甘油保存），在无菌条件下，用接种环取少量菌块在无菌水中清洗掉甘油，然后涂布于含马铃薯葡萄糖琼脂培养基的平板上，25℃下培养一周时间。
2）待莫勒菌活化后，160~200 r/min、23~28℃条件下连续培养8~12 d即初级培养，按8％~10％接种量转接到M102培养基中，继续在160~200 r/min、23~28℃下连续培养25~30 d即次级培养。
3）减压抽滤得到菌丝体，菌丝体在35~40℃下干燥后研磨成粉状，用2~4倍甲醇浸泡1~3天，超声40~60 min，旋蒸得菌丝体浸膏。
4）将菌丝体浸膏用尽可能少的氯仿溶解（可适当超声，以促进其溶解），然后用硅胶进行拌样。上硅胶柱，以石油醚：乙酸乙酯体积比为30: 1梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比为5: 1部位洗脱液，旋蒸浓缩。
5）将以上得到的化合物，用乙酸乙酯洗出，甲醇重结晶，得到白色粉末。
所述马铃薯葡萄糖琼脂培养基的制备为：200 g马铃薯，沸水煮30 min，经6层纱布过滤后加20 g葡萄糖，15g琼脂，加单蒸水定容至1L，121℃高压灭菌，20 min。
所述M102培养基的制备为：蔗糖30.0 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO4 0.5 g，溶于双蒸水定容至1 L，121℃高压灭菌，20 min。
所述步骤4）中拌样硅胶是160~200目的粗硅胶，进行梯度洗脱所用硅胶是200~300目细硅胶；进行梯度洗脱时，换洗脱液体系体积比为5个跨度：30:1，25:1，20:1，15:1，10:1，5:1。
所述步骤5）中重结晶具体操作为：用乙酸乙酯将得到的含有少量杂质的麦角固醇溶解，自然挥干，待晶体析出后，再用甲醇洗去杂质，析出弃掉，剩余的晶体再用甲醇溶解后重结晶，直至获得单一的麦角固醇。
本发明的显著优点在于：
（1）莫勒菌繁殖快，取材方便；
（2）分离纯化简单，成本低；
（3）制得的化合物含量多，且纯度高。
附图说明
图1是化合物的TLC，化合物经薄层层析TLC、浓硫酸显色为紫红色，说明其为甾类物质。
图2是化合物的EI-MS谱，显示化合物的相对分子量为396。
图3是化合物的1H NMR谱(CDCl3)，表明该化合物存在6个甲基信号。
图4是化合物的13C NMR谱(CDCl3)，显示该物质28个碳信号。
图5是化合物的 DEPT 135谱(CDCl3)，表明化合物存在4个季碳、7个仲碳。
图6是化合物的平面结构。
具体实施方式
实施例1
1)取保存于实验室的莫勒菌菌株（25%甘油保存），在无菌条件下，用接种环取少量菌块在无菌水中清洗掉甘油，然后涂布于含马铃薯葡萄糖琼脂培养基的平板上，25℃条件下培养一周时间。
2）将莫勒菌（野外采集，分离纯化后用25%甘油保藏菌株）活化后，以0.5×0.5 cm（4块）接种于马铃薯葡萄糖培养基（马铃薯去皮，切块，称取200 g，沸水煮30 min， 6层纱布过滤，称取20 g葡萄糖，加蒸馏水定容至1000 mL，pH自然。分装到250 ml三角瓶中，每瓶装100 ml，高压灭菌121℃，20 min。）中， 160 r/min、25℃条件下连续培养10 d即初级培养，按9％接种量转接到M102培养基中，继续在160 r/min、25℃条件下连续培养28 d即次级培养。
3）减压抽滤得到菌丝体，菌丝体在35~40℃下干燥后研磨成粉状，用2倍甲醇浸泡3 d，超声60 min，旋蒸得菌丝体浸膏。
4）将菌丝体浸膏用尽可能少的氯仿溶解（可适当超声，以促进其溶解），然后用160~200目硅胶进行拌样。上200~300目硅胶柱，以石油醚：乙酸乙酯体积比为30:1梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比为5:1部位洗脱液，旋蒸浓缩。
5）将以上得到的化合物，用乙酸乙酯洗出，甲醇重结晶，得到白色粉末。
6）经过其1H NMR、13C NMR分析，之后查阅文献确认为麦角固醇。经计算其提取率为3.9%（提取率%=麦角固醇重量/菌丝体甲醇浸膏总量×100%）。
实施例2
1)取保存于实验室的莫勒菌菌株（25%甘油保存），在无菌条件下，用接种环取少量菌块在无菌水中清洗掉甘油，然后涂布于含马铃薯葡萄糖琼脂培养基的平板上，25℃条件下培养一周时间。
2）将莫勒菌（野外采集，分离纯化后用25%甘油保藏菌株）活化后，以0.5×0.5cm（4块）接种于马铃薯葡萄糖培养基（马铃薯去皮，切块，称取200g，沸水煮30min， 6层纱布过滤，称取20g葡萄糖，加蒸馏水定容至1000mL，pH自然。分装到250ml三角瓶中，每瓶装100ml，高压灭菌121℃,20min。）中， 180r/min、23℃条件下连续培养12天即初级培养，按10％接种量转接到M102培养基中，继续在180r/min、23℃条件下连续培养25天即次级培养。
3）减压抽滤得到菌丝体，菌丝体在35~40℃下干燥后研磨成粉状，用3倍甲醇浸泡1天，超声50分钟，旋蒸得菌丝体浸膏。
4）将菌丝体浸膏用尽可能少的氯仿溶解（可适当超声，以促进其溶解），然后用160~200目硅胶进行拌样。上200~300目硅胶柱，以石油醚：乙酸乙酯体积比为30:1梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比为5:1部位洗脱液，旋蒸浓缩。
5）将以上得到的化合物，用乙酸乙酯洗出，甲醇重结晶，得到白色粉末。
6）经过其1H NMR、13C NMR分析，之后查阅文献确认为麦角固醇。经计算其提取率为3.68%（提取率%=麦角固醇重量/菌丝体甲醇浸膏总量×100%）。
实施例3
1)取保存于实验室的莫勒菌菌株（25%甘油保存），在无菌条件下，用接种环取少量菌块在无菌水中清洗掉甘油，然后涂布于含马铃薯葡萄糖琼脂培养基的平板上，25℃条件下培养一周时间。
2）将莫勒菌（野外采集，分离纯化后用25%甘油保藏菌株）活化后，以0.5×0.5cm（4块）接种于马铃薯葡萄糖培养基（马铃薯去皮，切块，称取200g，沸水煮30min， 6层纱布过滤，称取20g葡萄糖，加蒸馏水定容至1000 mL，pH自然。分装到250 ml三角瓶中，每瓶装100ml，高压灭菌121℃, 20min。）中， 200 r/min、28℃条件下连续培养8天即初级培养，按8％接种量转接到M102培养基中，继续在200r/min、28℃条件下连续培养30天即次级培养。
3）减压抽滤得到菌丝体，菌丝体在35~40℃下干燥后研磨成粉状，用4倍甲醇浸泡2天，超声40分钟，旋蒸得菌丝体浸膏。
4）将菌丝体浸膏用尽可能少的氯仿溶解（可适当超声，以促进其溶解），然后用160~200目硅胶进行拌样。上200~300目硅胶柱，以石油醚：乙酸乙酯体积比为30:1梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比为5:1部位洗脱液，旋蒸浓缩。
5）将以上得到的化合物，用乙酸乙酯洗出，甲醇重结晶，得到白色粉末。
6）经过其1H NMR、13C NMR分析，之后查阅文献确认为麦角固醇。经计算其提取率为3.23%（提取率%=麦角固醇重量/菌丝体甲醇浸膏总量×100%）。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (2)

1.一种从莫勒菌中提取麦角固醇的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）在无菌条件下，用接种环取少量莫勒菌菌块在无菌水中清洗掉甘油，然后涂布于含马铃薯葡萄糖琼脂培养基的平板上，25℃下培养一周时间；
2）待莫勒菌活化后，160~200r/min、23~28℃条件下连续培养8~12天即初级培养，按8％~10％接种量转接到M102培养基中，继续在160~200r/min、23~28℃条件下连续培养25~30天即次级培养；
3）减压抽滤得到菌丝体，菌丝体在35~40℃下干燥后研磨成粉状，用2~4倍质量的甲醇浸泡1~3天，超声40~60分钟，旋蒸得菌丝体浸膏；
4）将菌丝体浸膏用尽可能少的氯仿溶解，然后用硅胶拌样；上硅胶柱，以石油醚：乙酸乙酯体系进行梯度洗脱，换洗脱液体系体积比为5个跨度：30:1，25:1，20:1，15:1，10:1，5:1；收集石油醚：乙酸乙酯体积比为5:1部位洗脱液，旋蒸浓缩；将得到的化合物，用乙酸乙酯洗出，甲醇重结晶，得到白色粉末。
2.根据权利要求1所述的从莫勒菌中提取麦角固醇的方法，其特征在于：所述步骤4）中拌样硅胶是160~200目的粗硅胶，进行梯度洗脱所用硅胶是200~300目细硅胶。
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