CN115894180B - 一种从人参黑斑菌的代谢产物中分离真菌毒素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从人参黑斑菌的代谢产物中分离真菌毒素的方法，属于农业技术领域。本发明提供的方法包括以下步骤：提供人参黑斑菌的发酵液；采用萃取剂对所述发酵液进行萃取，去除所得萃取液中溶剂，得到总提物浸膏；以二氯甲烷‑甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将所述总提物浸膏进行硅胶柱层析分离，共得到6个亚组分，依次记为组分Fr‑A、Fr‑B、Fr‑C、Fr‑D、Fr‑E、Fr‑F；将所述组分Fr‑B依次进行葡萄糖凝胶色谱柱分离和高效液相色谱纯化，得到对羟基苯乙醇。本发明通过对人参黑斑菌的代谢产物进行分离，最终得到了单体化合物对羟基苯乙醇，其对人参叶片具有植物毒活性，为人参黑斑菌毒素。
Description
技术领域
本发明涉及农业技术领域，尤其涉及一种从人参黑斑菌的代谢产物中分离真菌毒素的方法。
背景技术
人参(Panaxginseng)作为一种名贵中药，具有提高人体免疫力、提供营养、改善疲劳和增强抵抗力的作用。人参在其生产过程中易遭受病原菌的侵染，如无人工干预，其最终存苗率通常低于25％。迄今已报道的人参重要病害多达10余种，其中人参黑斑病是一种由寄主特异性病菌链格孢属人参黑斑菌(Alternariapanax)引发的病害，该病害每年发病率在20～30％甚至更高，造成约10～20％的产量损失。每年5月下旬至6月上旬，环境温度高于11℃时，人参植株地上残留部分休眠的分生孢子开始萌发，并引起土壤中人参幼茎黑斑病的发生，使之成为主要传染源。随后，分生孢子围绕坏死的茎开始发育，成为新的侵染源，导致相邻植株上的茎叶相继出现严重的黑斑。人参幼苗被人参黑斑菌侵染后，其茎将逐渐被病菌环形侵染，出现倒伏，最后枯萎腐败。对于成熟人参植株，其叶面通常在夏季被侵染，侵染过程中叶面出现迅速扩大的深褐色坏死斑，叶片周围会逐渐褪绿。
综上，人参黑斑菌侵染会使人参植株地上部分产生明显枯斑，但枯斑的产生机制尚不清楚。目前有研究显示，从人参黑斑菌的代谢产物中分离得到了邻苯二甲酸丁酯，但后期实验验证了所述邻苯二甲酸丁酯不具备成为人参黑斑病致病物质的毒素条件。需要进一步探究人参黑斑病菌毒素种类，对阐明枯斑产生原因以及人参黑斑菌防治工作具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从人参黑斑菌的代谢产物中分离真菌毒素的方法，本发明通过对人参黑斑菌的代谢产物进行分离，最终得到了单体化合物对羟基苯乙醇，其对人参叶片具有植物毒活性，为人参黑斑菌毒素。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种从人参黑斑菌的代谢产物中分离真菌毒素的方法，所述真菌毒素为对羟基苯乙醇，包括以下步骤：
提供人参黑斑菌的发酵液；
采用萃取剂对所述发酵液进行萃取，去除所得萃取液中溶剂，得到总提物浸膏；
以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将所述总提物浸膏进行硅胶柱层析分离，共得到6个亚组分，依次记为组分Fr-A、Fr-B、Fr-C、Fr-D、Fr-E、Fr-F；
将所述组分Fr-B依次进行葡萄糖凝胶色谱柱分离和高效液相色谱纯化，得到对羟基苯乙醇。
优选地，所述萃取前还包括：将所述发酵液进行过滤，收集滤液作为待萃取液。
优选地，所述萃取剂为乙酸乙酯。
优选地，进行所述硅胶柱层析分离时所用拌样硅胶的目数为60～100目，分离硅胶的目数为200～300目。
优选地，进行所述硅胶柱层析分离时，所述总提物浸膏与拌样硅胶的质量比为1：(1.2～1.5)，所述总提物浸膏与分离硅胶的质量比为1:(12～15)。
优选地，按二氯甲烷与甲醇的体积比计，所述洗脱剂的组成依次为1:0、100:1、80:1、50:1、30:1、5:1。
优选地，进行所述硅胶柱层析分离时，每个梯度所用洗脱剂的体积为2～5个柱体积。
优选地，进行所述葡萄糖凝胶色谱柱分离所用洗脱剂为甲醇。
优选地，所述高效液相色谱纯化的条件包括：以甲醇和水为流动相进行梯度洗脱，洗脱程序为0～35min，甲醇由20％增加至100％，流速为2mL/min；色谱柱为反相硅胶半制备柱，型号为YMC-packODS-A，规格为250×10mm，5μm；收集tR为18.0min的色谱峰对应的纯化液。
优选地，所述高效液相色谱纯化后还包括：去除所述纯化液中溶剂，得到对羟基苯乙醇。
本发明提供了一种从人参黑斑菌的代谢产物中分离真菌毒素的方法，所述真菌毒素为对羟基苯乙醇，包括以下步骤：提供人参黑斑菌的发酵液；采用萃取剂对所述发酵液进行萃取，去除所得萃取液中溶剂，得到总提物浸膏；以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将所述总提物浸膏进行硅胶柱层析分离，共得到6个亚组分，依次记为组分Fr-A、Fr-B、Fr-C、Fr-D、Fr-E、Fr-F；将所述组分Fr-B依次进行葡萄糖凝胶色谱柱分离和高效液相色谱纯化，得到对羟基苯乙醇。本发明通过对人参黑斑菌的代谢产物进行分离，最终得到了单体化合物对羟基苯乙醇，并通过叶片穿刺渗透实验验证了其对人参叶片具有植物毒活性，说明所述对羟基苯乙醇为人参黑斑菌毒素，对探究人参黑斑菌导致的枯斑的产生原因及人参黑斑菌防治工作具有重要意义。
附图说明
图1为测试例1中植物毒活性测试结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种从人参黑斑菌的代谢产物中分离真菌毒素的方法，所述真菌毒素为对羟基苯乙醇，包括以下步骤：
提供人参黑斑菌的发酵液；
采用萃取剂对所述发酵液进行萃取，去除所得萃取液中溶剂，得到总提物浸膏；
以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将所述总提物浸膏进行硅胶柱层析分离，共得到6个亚组分，依次记为组分Fr-A、Fr-B、Fr-C、Fr-D、Fr-E、Fr-F；
将所述组分Fr-B依次进行葡萄糖凝胶色谱柱分离和高效液相色谱纯化，得到对羟基苯乙醇。
本发明从人参黑斑菌的代谢产物中分离出对羟基苯乙醇，其能对寄主人参表现出植物毒活性，为人参黑斑菌毒素；所述对羟基苯乙醇易溶于甲醇，可溶于丙酮、乙腈，紫外吸收波长通常在210～280nm之间；所述对羟基苯乙醇具有式I所示结构：
本发明提供人参黑斑菌的发酵液。本发明对所述人参黑斑菌(Alternaria panax)的来源没有特殊限定，本领域技术人员熟知来源的人参黑斑菌均可。本发明优选将人参黑斑菌株于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上进行扩增，然后将处于对数期的人参黑斑菌接种到马铃薯葡萄糖水(PDW)培养基上进行发酵，得到人参黑斑菌的发酵液。在本发明中，所述PDA培养基的配方优选为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂14g/L，其余为蒸馏水。在本发明中，所述PDW培养基的配方优选为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，其余为蒸馏水；本发明优选按照PDW培养基的配方配好后，煮沸30min后用棉纱过滤，滤液经121℃高压灭菌30min后备用。在本发明中，所述发酵优选为在摇床转速为120rpm且温度为25℃避光条件下发酵14天。
得到发酵液后，本发明采用萃取剂对所述发酵液进行萃取，去除所得萃取液中溶剂，得到总提物浸膏。在本发明中，所述萃取前优选还包括：将所述发酵液进行过滤，收集滤液作为待萃取液；本发明优选采用无菌滤纸对所述发酵液进行过滤。在本发明中，所述萃取剂优选为乙酸乙酯。在本发明中，所述萃取的次数优选为2～4次，更优选为3次；每次萃取后分离出有机相，之后采用萃取剂对所得水相进行下一次萃取；将每次萃取所得有机相合并作为萃取液；每次萃取所用萃取剂与待萃取液的体积比优选为1:(0.5～1.5)，更优选为1:1；所述萃取优选在常温条件下进行，在本发明的实施例中，具体是在25℃条件下进行。在本发明中，去除所述萃取液中溶剂的方式优选为将所述萃取液进行旋转蒸发，在得到总提物浸膏的同时优选回收蒸出的溶剂。
得到总提物浸膏后，本发明以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将所述总提物浸膏进行硅胶柱层析分离，共得到6个亚组分，依次记为组分Fr-A、Fr-B、Fr-C、Fr-D、Fr-E、Fr-F。在本发明中，进行所述硅胶柱层析分离时所用拌样硅胶的目数优选为60～100目，分离硅胶的目数优选为200～300目。在本发明中，所述总提物浸膏与拌样硅胶的质量比优选为1:(1.2～1.5)，更优选为1:1.2；所述总提物浸膏与分离硅胶的质量比优选为1:(12～15)，更优选为1:15。本发明优选将所述总提物浸膏均匀拌在拌样硅胶上，之后上样进行硅胶柱层析分离。在本发明中，按二氯甲烷与甲醇的体积比计，所述洗脱剂的组成优选依次为1:0、100:1、80:1、50:1、30:1、5:1；每个梯度所用洗脱剂的体积优选为2～5个柱体积，更优选为3～5个柱体积。本发明优选通过薄层层析硅胶板(TLC)进行点样分析(展开剂优选为二氯甲烷-甲醇混合试剂，二氯甲烷与甲醇体积比优选为5:1)，将具有相同化合物的组分进行合并，共得到6个亚组分，根据梯度顺序，所述亚组分为顺序流出，具体记为组分Fr-A、Fr-B、Fr-C、Fr-D、Fr-E、Fr-F；其中洗脱剂的组成按二氯甲烷与甲醇的体积比计，所述组分Fr-A对应洗脱剂的组成为1:0，所述组分Fr-B对应洗脱剂的组成为100:1，所述组分Fr-C对应洗脱剂的组成为80:1，所述组分Fr-D对应洗脱剂的组成为50:1，所述组分Fr-E对应洗脱剂的组成为30:1，所述组分Fr-F对应洗脱剂的组成为5:1。
本发明将所述组分Fr-B依次进行葡萄糖凝胶色谱柱分离和高效液相色谱纯化，得到对羟基苯乙醇。在本发明中，进行所述葡萄糖凝胶色谱柱分离所用洗脱剂优选为甲醇；所述葡萄糖凝胶色谱柱优选为SephadexLH-20(PharmaciaCo.Ltd.)。本发明优选将葡萄糖凝胶色谱柱分离后所得粗品溶解于甲醇中，依次进行离心和过滤，收集滤液作为待纯化液。在本发明中，溶解所述粗品采用的甲醇优选为色谱甲醇；所述过滤优选为采用0.22μm滤膜过滤。在本发明中，所述高效液相色谱纯化的条件优选包括：以甲醇和水为流动相进行梯度洗脱，洗脱程序为0～35min，甲醇由20％增加至100％，流速为2mL/min；色谱柱为反相硅胶半制备柱，型号为YMC-packODS-A，规格为250×10mm，5μm；收集tR为18.0min的色谱峰对应的纯化液。
在本发明中，所述高效液相色谱纯化后优选还包括：去除所述纯化液中溶剂，得到对羟基苯乙醇。在本发明中，去除所述纯化液中溶剂的方式优选为将所述纯化液进行旋转蒸发。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)人参黑斑菌(Alternariapanax)的发酵，具体步骤如下：
首先准备发酵所用马铃薯葡萄糖水(PDW)培养基，具体配方为马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，其余为蒸馏水，配制后煮沸30min，之后用棉纱过滤，滤液倒入500mL三角瓶中(每瓶300mL)，121℃高压灭菌30min后备用；将生长在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基，用于菌种的扩增，配方为马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂14g/L，其余为蒸馏水)上处于对数期的人参黑斑菌(Alternariapanax)切成小块体，在超净工作台中接种到所述PDW培养基上，在摇床转速为120rpm且温度为25℃避光条件下发酵14天，共发酵100瓶，得到发酵液。
(2)对羟基苯乙醇粗品的制备，具体步骤如下：
采用无菌滤纸对所述发酵液进行过滤，滤液作为待萃取液用乙酸乙酯在常温(25℃)条件下萃取，共萃取三次，每次萃取后分离出乙酸乙酯相，之后采用乙酸乙酯对所得水相进行下一次萃取，每次萃取所用乙酸乙酯与待萃取液的体积相同；将三次萃取所得乙酸乙酯相合并，采用真空旋转蒸发仪进行浓缩，回收乙酸乙酯同时得到总提物浸膏18.26g；
将所述总提物浸膏均匀拌在拌样硅胶上，之后上样进行硅胶柱层析分离，其中，所用拌样硅胶的目数为60～100目，分离硅胶的目数为200～300目，所述总提物浸膏与拌样硅胶的质量比为1:1.2，所述总提物浸膏与分离硅胶的质量比为1:15；所述硅胶柱层析分离具体是以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，按二氯甲烷与甲醇体积比计，所述洗脱剂的组成依次为1:0、100:1、80:1、50:1、30:1、5:1，其中，组成为1:0的洗脱剂用量为5个柱体积，组成为100:1的洗脱剂用量为5个柱体积，组成为80:1的洗脱剂用量为4个柱体积，组成为50:1的洗脱剂用量为3个柱体积，组成为30:1的洗脱剂用量为4个柱体积，组成为5:1的洗脱剂用量为5个柱体积；通过薄层层析硅胶板(TLC)进行点样分析(展开剂为二氯甲烷-甲醇混合试剂，二氯甲烷与甲醇体积比为5:1)，将具有相同化合物的组分进行合并，共得到6个亚组分，根据梯度顺序，所述亚组分为顺序流出，具体记为组分Fr-A、Fr-B、Fr-C、Fr-D、Fr-E、Fr-F；其中洗脱剂的组成按二氯甲烷与甲醇的体积比计，所述组分Fr-A对应洗脱剂的组成为1:0，所述组分Fr-B对应洗脱剂的组成为100:1，所述组分Fr-C对应洗脱剂的组成为80:1，所述组分Fr-D对应洗脱剂的组成为50:1，所述组分Fr-E对应洗脱剂的组成为30:1，所述组分Fr-F对应洗脱剂的组成为5:1；
以甲醇为洗脱剂，将所述组分Fr-B进行葡萄糖凝胶色谱柱(Sephadex LH-20(PharmaciaCo.Ltd.))分离，得到对羟基苯乙醇粗品；
(3)对羟基苯乙醇粗品的纯化，具体步骤如下：
将所述对羟基苯乙醇粗品以色谱甲醇溶解，离心，过0.22μm滤膜后进行高效液相色谱纯化；液相色谱条件包括：以甲醇和水为流动相进行梯度洗脱，洗脱程序为0～35min，甲醇由20％增加至100％，流速为2mL/min，色谱柱为反相硅胶半制备柱(型号为YMC-packODS-A，规格为250×10mm，5μm)，收集tR为18.0min的色谱峰对应的纯化液，收集完成后，将所述纯化液用旋转蒸发仪蒸干，将部分所得蒸干样品进行干燥，用于核磁和质谱测试，通过高分辨质谱和核磁共振手段鉴定了所述蒸干样品为对羟基苯乙醇，纯度高于95％；具体表征数据如下：
白色结晶，HR-ESI-MS(m/z139.0753[M+H]+,calcd.139.0759)；
核磁共振法(NMR)进一步确认该化合物结构：1H-NMR(600MHz，(CD3)2CO)δ:8.12(1H,s,NH-4),7.05(2H,m,H-2,6),6.74(2H,m,H-3,5),3.68(2H,td,H-8),3.61(1H,t,NH-8),2.70(2H,t,H-7)。
13C-NMR(150MHz,(CD3)2CO)δ:156.56(C-4),131.02(C-1),130.74(C-2),129.18(C-6),115.88(C-3),115.88(C-5),64.30(C-8),29.7(C-7)。
液相色谱-质谱联用中确定分子量时所使用的液相色谱分析条件：样品室温度：20℃，柱温：35℃，色谱柱：AcquityUPLCBEHC18(2.1×100mm，1.7μm，WatersCorp.，Milford，USA)，流动相：乙腈和水，色谱方法：40％乙腈，60％水，流速：0.3mL/min。
测试例1
采用叶片穿刺渗透法进行植物毒活性测试，原理为：通过完成对叶片的穿刺，更好地实现受试样品在叶片中的渗透，以在一定期限后观察样品对叶片所造成的损伤；具体步骤如下：
取无菌培养皿，置入预先灭菌的圆形滤纸片一张，加入1mL无菌水(用于保湿)，上置无菌玻璃载片(承载叶片)；取新鲜健康的人参(Panaxginseng)叶片，用体积分数为75％的乙醇水溶液消毒后自然风干，置于玻璃载片上，在叶片左右两侧对称区域用无菌接种针穿刺；
将20μL的样品(对羟基苯乙醇浓度为1mg/mL，溶剂为体积分数为75％的乙醇水溶液)或体积分数为75％的乙醇水溶液(空白对照)滴在叶片上两个预先穿刺的接种部位，每个处理设置3个重复；培养皿置于25℃避光培养5天。
图1为测试例1中植物毒活性测试结果图，其中A为对羟基苯乙醇处理组，B为空白对照组；由图1可知，所述对羟基苯乙醇能够在人参叶片上产生病斑，即对人参叶片表现出植物毒活性，为人参黑斑菌所产生的植物毒素。
由以上实施例可知，本发明中人参病原菌为人参黑斑菌(Alternaria panax)，通过对人参黑斑菌的次生代谢产物进行靶向分离，最终得到了单体化合物对羟基苯乙醇，并通过叶片穿刺渗透实验验证了其对人参叶片的植物毒活性，说明所述对羟基苯乙醇为人参黑斑菌毒素，对探究人参黑斑菌导致的枯斑的产生原因以及人参黑斑菌防治工作具有重要意义。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种从人参黑斑菌的代谢产物中分离真菌毒素的方法，所述真菌毒素为对羟基苯乙醇，包括以下步骤：
将人参黑斑菌株于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上进行扩增，然后将处于对数期的人参黑斑菌接种到马铃薯葡萄糖水培养基上，在摇床转速为120rpm且温度为25℃避光条件下发酵14天，得到人参黑斑菌的发酵液；其中，所述马铃薯葡萄糖琼脂培养基的配方为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂14g/L，其余为蒸馏水；所述马铃薯葡萄糖水培养基的配方为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，其余为蒸馏水；按照马铃薯葡萄糖水培养基的配方配好后，煮沸30min后用棉纱过滤，滤液经121℃高压灭菌30min后备用；
采用萃取剂对所述发酵液进行萃取，去除所得萃取液中溶剂，得到总提物浸膏；所述萃取剂为乙酸乙酯；
以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将所述总提物浸膏进行硅胶柱层析分离，共得到6个亚组分，依次记为组分Fr-A、Fr-B、Fr-C、Fr-D、Fr-E、Fr-F；按二氯甲烷与甲醇的体积比计，所述洗脱剂的组成依次为1:0、100:1、80:1、50:1、30:1、5:1，
将所述组分Fr-B依次进行葡萄糖凝胶色谱柱分离和高效液相色谱纯化，得到对羟基苯乙醇；所述高效液相色谱纯化的条件包括：以甲醇和水为流动相进行梯度洗脱，洗脱程序为0～35min，甲醇由20％增加至100％，流速为2mL/min；色谱柱为反相硅胶半制备柱，型号为YMC-pack ODS-A，规格为250×10mm，5μm；收集tR为18.0min的色谱峰对应的纯化液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述萃取前还包括：将所述发酵液进行过滤，收集滤液作为待萃取液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行所述硅胶柱层析分离时所用拌样硅胶的目数为60～100目，分离硅胶的目数为200～300目。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，进行所述硅胶柱层析分离时，所述总提物浸膏与拌样硅胶的质量比为1:(1.2～1.5)，所述总提物浸膏与分离硅胶的质量比为1:(12～15)。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行所述硅胶柱层析分离时，每个梯度所用洗脱剂的体积为2～5个柱体积。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行所述葡萄糖凝胶色谱柱分离所用洗脱剂为甲醇。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱纯化后还包括：去除所述纯化液中溶剂，得到对羟基苯乙醇。
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