CN114409660B - 一种cpa型吲哚生物碱类化合物及其制备方法与用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物化学技术领域，具体涉及一种CPA型吲哚生物碱类化合物及其制备方法与用途。所述化合物分子式为：C20H18N4O2，其具有下述结构：
Figure DDA0003491570380000011
。本发明还公开了上述化合物的制备方法和用途。本发明化合物为从烟草内源花斑曲霉(Aspergillus versicolor)真菌发酵产物中分离得到的新化合物，通过核磁共振、质谱、红外等波谱数据鉴定为吲哚生物碱类化合物。且该吲哚生物碱类化合物具有显著的抗烟草花叶病毒活性。经抗烟草花叶病毒的实验测试，发现该吲哚生物碱类化合物对烟草花叶病毒的相对抑制率达到56.8％，其活性高于对照品宁南霉素的相对抑制率(32.5％)。本发明化合物结构简单、活性好，可作为抗烟草花叶病毒药物的先导性化合物，在制备抗烟草花叶病毒生物农药中有良好的应用前景。

Description

一种CPA型吲哚生物碱类化合物及其制备方法与用途
技术领域
本发明属于天然产物化学技术领域，具体涉及一种CPA型吲哚生物碱类化合物及其制备方法与用途。
背景技术
微生物在代谢中会产生许多代谢产物。通过发酵工程技术，微生物被培养并高效地将可再生碳水化合物转化为各种有用产品，如柠檬酸、维生素、氨基酸、溶剂、抗生素、酶制剂、生物杀虫剂、生物染色剂、生物表面活性剂、生物碱、类固醇等。发酵工程技术在食品、医药、精细化学品、生物能源、生物材料以及生物质资源化方面发挥着重要作用，对国民经济所作的贡献令人瞩目。
烟草中富含共生微生物，微生物在烟草的种植、烟叶加工等关键环节中均发挥着重要作用。如：在烟草种植过程中，微生物对于土壤成分的改良、土壤中有害成分的分解、烟株的抗病等方面都发挥了非常重要的作用；在烟叶加工过程中，烟草源微生物的功能决定其可在一定程度上改变烟草的化学组成，进而改变烟草的吸味品质。此外，烟草内源真菌中分离鉴定的代谢产物具有不同的药理学作用，如抗菌、抗氧化、抗肿瘤、抗烟草花叶病毒等。因此，加强烟草内生真菌代谢产物研究，对发现活性显著的新骨架类型代谢产物具有重要的科学意义。
曲霉属真菌广泛存在于自然界中。其中，花斑曲霉是一种能产生复合酶的菌株，该菌株除可产生蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等多种功能的酶，因而广泛应用于食品、饲料、酿酒等发酵工业。同时，花斑曲霉次生代谢产物也被认为是一个亟待开发的重要资源。从不同来源的花斑曲霉发酵产物中也分离得到了一系列具有生物活性的天然产物，包括了生物碱、多肽、萜类化合物以及多酚类化合物。
发明内容
本发明从烟草中内源花斑曲霉(Aspergillus versicolor)菌株发酵产物中分离得到了一种新的CPA型吲哚生物碱类化合物，该化合物至今尚未见到相关报道。值得一提的是，该CPA型吲哚生物碱类化合物具有显著的抗烟草花叶病毒活性，其对烟草花叶病毒的相对抑制率达到56.8％，显著高于对照品宁南霉素的相对抑制率(32.5％)。
除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。
本发明第一方面提供一种CPA型吲哚生物碱类化合物，所述化合物分子式为：C20H18N4O2，其具有下述结构：
Figure BDA0003491570360000021
该化合物为棕色胶状物，命名为：花斑曲霉生物碱-J，英文名为：aspergilline-J。
本发明第二方面提供第一方面所述的CPA型吲哚生物碱类化合物的制备方法，具体包括以下步骤：
A、浸膏提取：对烟草中分离鉴定的花斑曲霉菌株YATS1111进行固体发酵，其发酵产物用90wt％～99wt％乙醇超声提取并过滤，滤液浓缩到，然后加入乙酸乙酯与3wt％酒石酸水溶液的混合液充分搅拌均匀，静置分层后分出水相，水相再用Na2CO3调节pH至9.0，并用乙酸乙酯再次萃取，乙酸乙酯相减压浓缩成浸膏，供柱层析分离；
其中，乙酸乙酯与3wt％酒石酸水溶液的混合液中，乙酸乙酯与3wt％酒石酸水溶液的体积比为1:1～1:2；
所述培养基包含：大米和营养液，两者质量体积比600～400g:60～400mL；
所述营养液的组成为：葡萄糖5wt％、蛋白胨0.15wt％、酵母0.5wt％、磷酸二氢钾0.05wt％、硫酸镁0.05wt％、硫酸锰0.05wt％、柠檬酸二铵0.2wt％、牛肉膏0.5wt％，其余量为水，营养液pH为6.8；
B、硅胶柱层析：将步骤A得到的浸膏用200～300目硅胶干法装柱，进行硅胶柱层析；以体积配比分别为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的氯仿-甲醇溶液进行梯度洗脱，合并相同极性的部分，收集各部分洗脱液并浓缩；其中，所述硅胶与所述浸膏的质量比为2～5；
收集其中用体积比为9:1的氯仿-甲醇溶液洗脱时得到的洗脱液，称为第一洗脱液；将上述第一洗脱液浓缩，再次用硅胶层析柱继续分离，用体积配比依次为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的一系列氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集其中用体积比为8:2的氯仿-丙酮溶液洗脱时得到的洗脱液，称为第二洗脱液；
C、高效液相色谱分离：将B步骤最终得到的第二洗脱液浓缩，进行高效液相色谱进行分离纯化，所述高效液相色谱法分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的ZorbaxPrepHT GF色谱柱，流速为20mL/min，流动相为60wt％的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为405nm，第二洗脱液每次进样200μL，收集每次进样后色谱峰保留时间为23.8min时所对应的洗脱液，称为第三洗脱液，将该第三洗脱液脱除溶剂后即得所述的吲哚生物碱类化合物粗品。
优选地，所述步骤A中，乙醇的浓度优选为95wt％。
优选地，所述浸膏在经硅胶柱层析前，将浸膏用甲醇溶解后，用重量比1.5～2.5倍的80～120目硅胶拌样。
优选地，所述步骤C中，高效液相色谱法分离纯化后，所得化合物再次用甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用葡聚糖凝胶柱层析分离，以进一步分离纯化化合物。
本发明第三方面提供第一方面所述的吲哚生物碱类化合物在抗烟草花叶病毒中的应用或在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用。
第一方面所述的CPA型吲哚生物碱类化合物的制备方法，具体如下：
A、菌株分离鉴定：
将75％(V/V)乙醇消毒后的烟草根茎放入无菌的研钵中进行研磨，研磨后转入无菌的塑料管内，1000～3000rpm离心2～10min，吸取1～100微升上清液，涂布在BL平板上，倒置于培养箱中，25～30摄氏度黑暗培养2～10天，反复挑取单菌落培养并编号保存菌种，直到获得单一内生真菌菌落，经ITS测序(Genbank Accession number MT549144，
GCGGGCTGCCTCCGGGCGCCCAACCTCCCACCCGTGAATACCTAACACTGTTGCTTCGGCGGGGAACCCCCTCGGGGGCGAGCCGCCGGGGACTACTGAACTTCATGCCTGAGAGTGATGCAGTCTGAGTCTGAATATAAAATCAGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAACTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCATCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGTGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCGACTAGGGCCGGCCGGGCGCCAGCCGACGTCTCCAACCATTTTTCTTCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA)确定为曲霉属真菌花斑曲霉(Aspergillus versicolor)，其曲霉属真菌花斑曲霉照片见附图1；
B、内生真菌花斑曲霉(Aspergillus versicolor)菌种培养
将A步骤分离得到的花斑曲霉菌种在室温下接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，25～30℃培养7～10天，再接种在50～500毫升的三角瓶中，每个三角瓶含10～100毫升马铃薯葡萄糖培养基，置于25～30摄氏度下震荡培养5～10天得到液体发酵种。马铃薯葡萄糖琼脂培养基的各成分含量为常规技术。菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号是CGMCC No.19910。菌种名称记为花斑曲霉菌株YATS1111。
C、菌株放大发酵
将B步骤培养得到的液体发酵种进行规模化发酵，规模化发酵是在100～1000个100～500mL的冯巴赫瓶中进行，每个瓶含有600～400g大米和60～400mL营养液。营养液的组成为：葡萄糖5wt％、蛋白胨0.15wt％、酵母0.5wt％、磷酸二氢钾0.05wt％、硫酸镁0.05wt％、硫酸锰0.05wt％、柠檬酸二铵0.2wt％、牛肉膏0.5wt％，其余量为水，营养液pH为6.8。高压灭菌后每个瓶中接种1.0～5.0mL步骤B培养得到的液体发酵种，于25～30℃培养15～45天得到花斑曲霉发酵物。
D、浸膏提取：
将C步骤发酵得到的花斑曲霉发酵物用90wt％～99wt％乙醇超声提取后2-5次，每次30-50min，合并提取液过滤并浓缩到小体积，然后在浓缩液中加入乙酸乙酯与3wt％酒石酸水溶液的混合液(混合液中，乙酸乙酯与3wt％酒石酸水溶液的体积比为1:1～1:2)充分搅拌均匀，静置分层后分出水相，水相再用Na2CO3调节pH至9.0，并用乙酸乙酯再次萃取，乙酸乙酯相减压浓缩成浸膏，得到富含生物碱萃取产物供柱层析分离。
E、硅胶柱层析：
将步骤C得到的浸膏用200～300目硅胶干法装柱，进行硅胶柱层析；以体积配比分别为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的氯仿-甲醇溶液进行梯度洗脱，合并相同极性的部分，收集各部分洗脱液并浓缩；其中，所述硅胶与所述浸膏的质量比为2～5；收集其中用体积比为9:1的氯仿-甲醇溶液洗脱时得到的洗脱液，称为第一洗脱液；将上述第一洗脱液浓缩后，再次用硅胶层析柱继续分离，用体积配比依次为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的一系列氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集其中用体积比为8:2的氯仿-丙酮溶液洗脱时得到的洗脱液，称为第二洗脱液。
F、高效液相色谱分离
将E步骤最终得到的第二洗脱液浓缩后，进行高效液相色谱进行分离纯化，所述高效液相色谱法分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的ZorbaxPrepHT GF色谱柱，流速为20mL/min，流动相为60wt％的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为405nm，第二洗脱液每次进样200μL，收集每次进样后色谱峰保留时间为23.8min时所对应的洗脱液，称为第三洗脱液，将该第三洗脱液脱除溶剂后即得所述的吲哚生物碱类化合物粗品。
G、凝胶柱层析纯合化
上述生物碱化合物粗品再次用纯甲醇溶剂，以甲醇为流动性进行葡聚糖凝胶柱层析分离，即可得到所述的生物碱类化合物纯品。
以上述方法制备的吲哚生物碱类化合物的结构是通过以下方法鉴定出来的：
外观观测发现：本发明化合物为棕红色胶状物；紫外-可见吸收光谱显示其在215、268、365、405nm处有最大吸收，证明该化合物中存在芳香环结构；红外光谱(溴化钾压片)显示该化合物中有胺基(3248cm-1)、羰基(1690cm-1)、芳香环(1629、1476、1380cm-1)特征官能团；高分辨质谱(HRESIMS)给出准分子离子峰369.1331[M+Na]+，可确定化合物的分子式为C20H18N4O2。
结合1H和13C与HSQC NMR数据，显示该化合物包括一个4,8取代的苯并[cd]吲哚-2(1H)-酮结构片段(C-2～C-4、C-8～C-15、H-9、H-11～H-13和NH)，一个–C(CH3)2-N-CO-(C-5,C-7,C-16,C-17,H3-16,和H3-17)，一个N-1-(2-(1H-咪唑-5-基)乙基)结构片段(C-18～C-22，H2-18、H2-19、H-21、H-22)。为满足化合物的不饱和度14，-C(CH3)2-N-CO-结构片段还应该和苯并[cd]吲哚-2(1H)-酮链接形成二甲基-1,5-二氢-2H-吡咯-2-酮环(C-4,C-5,C-7,C-8,C-16,C-17,H3-16和H3-17)。该推断可进一步由H-9与C-4,C-7,C-8,H3-16和H3-17与C-8的HMBC相关得到证实。由此可推断化合物为CPA类型的吲哚生物碱。
表-1、化合物的1H NMR和13C NMR数据(CDCl3)
Figure BDA0003491570360000061
除N-1-(2-(1H-咪唑-5-基)乙基)结构片段外，本发明化合物中的其他碳和氢信号和典型的已知CPA类型的吲哚生物碱cyclopiamide(Phytochemistry，1990，29，639)相似，这也进一步证实了化合物为含N-1-(2-(1H-咪唑-5-基)乙基)结构片段的CPA类型生物碱。此外，化合物为CPA类型吲哚生物碱还可进一步通过H-9与C-4/C-7/C-11/C-1、H-11与C-15、H-12与C-10/C-14、H-13与C-11/C-15、H3-16/H3-17与C-7/C-8的HMBC相关得到证实。化合物中存在N-1-(2-(1H-咪唑-5-基)乙基)结构片段也可通过H2-18和C-19/C-20、H2-19和C-18/C-20/C-21、H-21和C-19/C-22、H-22和C-20/C-21的HMBC相关得到证实。
化合物的母体骨架确定后，剩余的取代基位置可通过进一步分析其HMBC相关确定。根据H2-18和C-5/C-7的HMBC相关，可证实N-1-(2-(1H-咪唑-5-基)乙基)结构片取代在N-6位，并且C-18和N-6向连接，至此，化合物的结构可得到确认。化合物命名为花斑曲霉生物碱-J，英文名为aspergilline-J。
化合物的波谱数据：UV(甲醇),λmax(logε)215(4.26)、268(3.88)、365(3.46)、405(3.18)nm；IR(溴化钾压片)νmax 3248、3152、2957、2940、2862、1690、1629、1476、1380、1165、1057、1022、852cm-1；1H and 13C NMR数据(CDCl3，500和125MHz),表-1；ESIMS(正离子模式)m/z 369[M+Na]+；HRESIMS(正离子模式)m/z 369.1331[M+Na]+(计算值369.1327，C20H18N4NaO2)。
本发明的有益效果如下：
1、本发明化合物从烟草内生花斑曲霉真菌菌株发酵产物中分离得到。特别的，本发明的花斑曲霉菌株YATS1111为新的微生物材料，首次从烟草根茎中分离出。此外，通过对菌株发酵过程的培养基进行特定设计，且通过设计发酵产物的分离条件，得到了本发明的化合物。
2、发明人意外发现：本发明化合物具有很好的抗烟草花叶病毒活性。经对抗烟草花叶病毒的实验，发现该吲哚生物碱类化合物的相对抑制率达到56.8％，其活性高于对照品宁南霉素的相对抑制率(32.5％)。以上结果揭示了本发明的化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中有良好的应用前景。
3、本发明化合物分子结构也简单，容易实现人工合成，后续的产业化也可通过人工合成实现。
4、本发明采用了常规柱层析和高效液相色谱结合的制备方法，化合物制备操作流程简单，所获得的本发明化合物纯度高，后续的工业化生产中化合物的品质、纯度有保障。
5、本发明化合物安全无毒，展现出良好的抗烟草花叶病毒活性，可为烟草花叶病的防治提供理想的新骨架类型药源分子。
6、本发明的花斑曲霉菌株YATS1111属于内生真菌，因此容易实现批量化发酵生产。因此，本发明的化合物原料易得，化合物的提取方法简单，容易分离得到，产业化制备容易实现。
附图说明
图1为本发明花斑曲霉菌株YATS1111照片，a、菌落形态；b、显微形态。
图2为本发明所述吲哚生物碱类化合物的核磁共振碳谱。
图3为本发明所述吲哚生物碱类化合物的核磁共振氢谱。
图4为本发明所述吲哚生物碱类化合物的主要HMBC和1H-1HCOSY相关。
具体实施方式
下面对本发明通过实施例作进一步说明，但不仅限于本实施例。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件所用的通用设备、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中所需要的原料均为市售。
本发明所用原料不受培养基类型影响，下面以来源于云南的烟草中分离鉴定的花斑曲霉菌株培养基对本发明做进一步说明：
实施例1
将发明内容部分步骤B培养得到的液体发酵种进行规模化发酵，规模化发酵在500个500mL的冯巴赫瓶中进行，每个瓶含有180g大米和180mL营养液，每个瓶中接种2.5mL培养得到的液体发酵种，于25℃培养30天得到花斑曲霉发酵物。发酵产物用95％的乙醇超声提取3次，每次提取30min；提取液合并，加入到乙酸乙酯与3wt％酒石酸水溶液的混合液(乙酸乙酯与3wt％酒石酸水溶液的体积比为1:1)中充分搅拌，待混合溶液静置分层后分离出水相，水相再用Na2CO3溶液将水层pH值调节至9.0，并用乙酸乙酯再次萃取；分离出乙酸乙酯相减压浓缩成浸膏，得浸膏580g。该浸膏用1.0kg的200目硅胶拌样，用3.0kg 200目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为20:1,8:2,7:3,6:4,5:5的氯仿-甲醇梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到5个部分，其中体积配比为9:1的氯仿-甲醇洗脱部分浓缩，再次进行硅胶柱层析分离，以体积配比分别为9:1,8:2,7:3,6:4,1:1的氯仿-丙酮溶液进行洗脱后，8:2部分的洗脱液浓缩后再用安捷仑1100制备高效液相色谱分离，以60wt％的甲醇水溶液为流动相，ZorbaxPrepHT GF柱(21.2×250mm,5μm)制备柱为固定相，流速为20mL/min，紫外检测器检测波长为405nm，每次进样200μL，收集23.8min的色谱峰，多次累加后蒸干可得化合物粗品；所得产物粗品再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用Sephadex LH-20凝胶柱层析分离，即得该新化合物纯品。
对该新化合物进行表征：
外观观测发现：化合物为棕红色胶状物。紫外-可见吸收光谱显示其在215、268、365、405nm处有最大吸收，证明该化合物中存在芳香环结构。红外光谱(溴化钾压片)显示该化合物中有胺基(3248cm-1)、羰基(1690cm-1)、芳香环(1629、1476、1380cm-1)特征官能团；高分辨质谱(HRESIMS)给出准分子离子峰369.1331[M+Na]+，可确定化合物的分子式为C20H18N4O2。
结合1H和13C与HSQC NMR数据，显示该化合物包括一个4,8取代的苯并[cd]吲哚-2(1H)-酮结构片段(C-2～C-4、C-8～C-15、H-9、H-11～H-13和NH)，一个–C(CH3)2-N-CO-(C-5,C-7,C-16,C-17,H3-16,和H3-17)，一个N-1-(2-(1H-咪唑-5-基)乙基)结构片段(C-18～C-22，H2-18、H2-19、H-21、H-22)。为满足化合物的不饱和度14，-C(CH3)2-N-CO-结构片段还应该和苯并[cd]吲哚-2(1H)-酮链接形成二甲基-1,5-二氢-2H-吡咯-2-酮(C-4,C-5,C-7,C-8,C-16,C-17,H3-16和H3-17)环。该推断可进一步由H-9与C-4,C-7,C-8,H3-16和H3-17与C-8的HMBC相关得到证实。由此可推断化合物为CPA类型的吲哚生物碱。
除N-1-(2-(1H-咪唑-5-基)乙基)结构片段外，本发明化合物中的其他碳和氢信号和典型的已知CPA类型的吲哚生物碱cyclopiamide(Phytochemistry，1990，29，639)相似，这也进一步证实了化合物为含N-1-(2-(1H-咪唑-5-基)乙基)结构片段的CPA类型生物碱。此外，化合物为CPA类型还可进一步通过H-9与C-4/C-7/C-11/C-1、H-11与C-15、H-12与C-10/C-14、H-13与C-11/C-15、H3-16/H3-17与C-7/C-8的HMBC相关得到证实。化合物中存在N-1-(2-(1H-咪唑-5-基)乙基)结构片段也可通过H2-18和C-19/C-20、H2-19和C-18/C-20/C-21、H-21和C-19/C-22、H-22和C-20/C-21的HMBC相关得到证实。
化合物的母体骨架确定后，剩余的取代基位置可通过进一步分析其HMBC相关确定。根据H2-18和C-5/C-7的HMBC相关，可证实N-1-(2-(1H-咪唑-5-基)乙基)结构片取代在N-6位，并且C-18和N-6向连接，至此，化合物的结构可得到确认。化合物命名为花斑曲霉生物碱-J，英文名为aspergilline-J。
实施例2
将发明内容部分步骤B培养得到的液体发酵种进行规模化发酵，规模化发酵在250个1.0L的冯巴赫瓶中进行，每个瓶含有360g大米和360mL营养液，每个瓶中接种5.0mL培养得到的液体发酵种，于30℃培养30天得到花斑曲霉发酵物。发酵产物用95wt％的乙醇超声提取3次，每次提取30min；提取液合并，加入到乙酸乙酯与3wt％酒石酸水溶液的混合液(乙酸乙酯与3wt％酒石酸水溶液的体积比为1:2)中充分搅拌，待混合溶液静置分层后分离出水相，水相再用Na2CO3溶液将水层pH值调节至9.0，并用乙酸乙酯再次萃取；分离出乙酸乙酯相减压浓缩成浸膏，得浸膏610g。该浸膏用1.0kg的200目硅胶拌样，用3.2kg 200目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为20:1,8:2,7:3,6:4,5:5的氯仿-甲醇梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到5个部分，其中体积配比为9:1的氯仿-甲醇洗脱部分浓缩，再次进行柱层析分离，以体积配比分别为9:1,8:2,7:3,6:4,1:1的氯仿-丙酮溶液进行洗脱后，8:2部分的洗脱液浓缩后再用安捷仑1100制备高效液相色谱分离，以60％的甲醇为流动相，ZorbaxPrepHT GF柱(21.2×250mm,5μm)制备柱为固定相，流速为20mL/min，紫外检测器检测波长为405nm，每次进样200μL，收集23.8min的色谱峰，多次累加后蒸干可得化合物粗品；所得产物粗品再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用Sephadex LH-20凝胶柱层析分离，即得该新化合物纯品。
取本实施例制备的新化合物，为棕红色胶状物。测定方法与实施例1中相同，确认实施例2制备的化合物为所述的吲哚生物碱类化合物——花斑曲霉生物碱-J。
实施例3
取实施例1～2制备的任一吲哚生物碱类化合物进行抗烟草花叶病毒活性试验，试验情况如下：
采用半叶法，在药剂的质量浓度均为20μM时对本发明化合物进行抗烟草花叶病毒活性测定。在5～6株烤烟的植株上，选取适用于测试的叶片(叶行正常，无病无虫)，先将叶片均匀撒上细金刚砂，用毛笔将备用的烟草花叶病毒源(3.0×10-3)均匀抹在撒有金刚砂的叶片上，待所有中选的叶片接毒结束后，立即放在盛有药液的培养皿中处理20min，取出，洒去叶片上水珠和约液，将两个半叶复原排放在铺有卫生纸保湿的搪瓷衙内加盖玻璃，控温(23±2)℃，放在温室自然光照射，2～3d即可见枯斑.每个处理都设另一半叶为对照，另外设有1组为商品宁南霉素的处理作为对比，按下公式计算相对抑制率。
XI％＝(CK-T)/CK×100％
X：相对抑制率(％)，CK：浸泡于清水中半片接毒叶的枯斑数(个)，T浸泡于药液中半片接毒叶的枯斑数(个)。
结果表明：本化合物的相对抑制率为56.8％，高于对照宁南霉素的相对抑制率32.5％，说明化合物有很好的抗烟草花叶病毒活性。

Claims (4)

1.一种CPA型吲哚生物碱类化合物的制备方法，其特征在于，所述化合物的制备包括以下步骤：
A、浸膏提取：使用花斑曲霉菌株YATS1111对培养基进行发酵，其发酵产物用90wt%~99wt%乙醇超声提取并过滤，滤液浓缩，然后加入乙酸乙酯与3wt%酒石酸水溶液的混合液充分搅拌均匀，静置分层后分出水相，水相再用Na2CO3调节pH至9.0，并用乙酸乙酯再次萃取，乙酸乙酯相减压浓缩成浸膏，供柱层析分离；
其中，所述花斑曲霉菌株YATS1111保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号是CGMCC NO.19910；
乙酸乙酯与3wt%酒石酸水溶液的混合液中，乙酸乙酯与3wt%酒石酸水溶液的体积比为1:1~1:2；
所述培养基包含：大米和营养液，两者质量体积比是600~400g:60~400 mL；
所述营养液的组成为：葡萄糖5wt%、蛋白胨0.15wt%、酵母0.5wt%、磷酸二氢钾0.05wt%、硫酸镁0.05wt%、硫酸锰0.05wt%、柠檬酸二铵0.2wt%、牛肉膏0.5wt%，其余量为水，营养液pH为6.8；
B、硅胶柱层析：将步骤A得到的浸膏用200~300目硅胶干法装柱，进行硅胶柱层析；以体积配比分别为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的氯仿-甲醇溶液进行梯度洗脱，合并相同极性的部分，收集各部分洗脱液并浓缩；其中，所述硅胶与所述浸膏的质量比为2~5；
收集其中用体积比为9:1的氯仿-甲醇溶液洗脱时得到的洗脱液，称为第一洗脱液；将上述第一洗脱液浓缩，再次用硅胶层析柱继续分离，用体积配比依次为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的一系列氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集其中用体积比为8:2的氯仿-丙酮溶液洗脱时得到的洗脱液，称为第二洗脱液；
C、高效液相色谱分离：将B步骤最终得到的第二洗脱液浓缩，进行高效液相色谱进行分离纯化，所述高效液相色谱法分离纯化是采用21.2 mm×250 mm，5 μm的ZorbaxPrepHT GF色谱柱，流速为20 mL/min，流动相为60wt%的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为405 nm，第二洗脱液每次进样200 μL，收集每次进样后色谱峰保留时间为23.8 min时所对应的洗脱液，称为第三洗脱液，将该第三洗脱液脱除溶剂后即得所述的吲哚生物碱类化合物；
所述吲哚生物碱类化合物分子式为：C20H18N4O2，其具有下述结构：
Figure QLYQS_1
。
2.根据权利要求1所述的吲哚生物碱类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤A中，乙醇的浓度为95wt%。
3.根据权利要求1所述的吲哚生物碱类化合物的制备方法，其特征在于，步骤B中，所述浸膏在经硅胶柱层析前，将浸膏用甲醇溶解后，用重量比1.5 ~ 2.5倍的80 ~ 120目硅胶拌样。
4.根据权利要求1所述的吲哚生物碱类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤C中，高效液相色谱法分离纯化后，所得吲哚生物碱类化合物再次用甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用葡聚糖凝胶柱层析分离，以进一步分离纯化化合物。
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