CN116003416A - 异喹唑啉酮化合物、其制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物化学技术领域，具体涉及异喹唑啉酮A和B的制备及其在抑制烟草花叶病毒中的用途。所述异喹唑啉酮A和B为同分异构体，即1‑(Z)和2(E)，分子式为：C₂₂H₂₁N₃O₃，其具有下述结构：

本发明还公开了上述化合物的制备方法和用途。本发明的异喹唑啉酮具有很好的抗烟草花叶病毒活性。

Description

异喹唑啉酮化合物、其制备方法及用途

技术领域

本发明属于天然产物化学技术领域，具体涉及一种烟草内生杂色曲霉真菌发酵产物中喹唑啉酮生物碱类化合物及其制备方法与应用。

背景技术

烟草是茄科烟草属植物，是世界上种植最广泛的经济作物之一。中国是世界上最大的烟草生产国和消费国，年产量可达4～5亿吨。但是对其内生菌的研究还比较少，其内生菌的次生代谢产物及生物活性有待进一步研究。因此，加强烟草内生菌次生代谢产物的综合利用引起了科研工作者的广泛关注。

根据文献报道，目前从烟草中鉴定出的化合物高达4000多种，主要成分包括二萜类化合物、倍半萜类化合物、黄酮类化合物、生物碱、香豆素等。同时有研究证明，烟草内源真菌中分离鉴定的化合物具有不同的药理学作用，如抗菌、抗氧化、抗肿瘤、抗烟草花叶病毒等。因此，加强烟草内生真菌代谢产物研究，对发现活性显著的新骨架类型代谢产物具有重要的科学意义。

曲霉属真菌广泛存在于自然界中。其中，米曲霉是一种能产生复合酶的菌株，该菌株除可产生蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等多种功能的酶，因而广泛应用于食品、饲料、酿酒等发酵工业。同时，杂色曲霉次生代谢产物也被认为是一个亟待开发的重要资源。从不同来源的杂色曲霉发酵产物中也分离得到了一系列具有生物活性的天然产物，包括了生物碱、多肽、萜类化合物以及多酚类化合物。

为此提出本发明。

发明内容

本发明从烟草中分离鉴定的杂色曲霉菌株培养液分离得到了一种具有抗烟草花叶病毒活性的新喹唑啉酮生物碱类化合物，该化合物至今尚未见到相关报道。

除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。

本发明第一方面公开了异喹唑啉酮化合物，其特征在于，其为同分异构体，1-(Z)和2(E)，分子式为：C₂₂H₂₁N₃O₃，具有下述结构：

两种化合物均为为棕色胶状物，分别命名为：异喹唑啉酮-A和异喹唑啉酮-B。

本发明第二方面提供第一方面所述的异喹唑啉酮化合物的制备方法，具体包括以下步骤：

步骤1：菌株分离鉴定：

内生真菌杂色曲霉(Aspergillus versicolor)的分离：将75％乙醇消毒后的烟草根茎放入无菌的研钵中进行研磨，研磨后转入无菌的塑料管内，1000～3000rpm离心2～10min，吸取1～100微升上清液，涂布在BL平板上，倒置于培养箱中，25～30摄氏度黑暗培养2～10天，反复挑取单菌落培养并编号保存菌种，直到获得单一内生真菌菌落，经ITS测序(Genbank Accession number MT549144，GCGGGCTGCCTCCGGGCGCCCAACCTCCCACCCGTGAATACCTAACACTGTTGCTTCGGCGGGGAACCCCCTCGGGGGCGAGCCGCCGGGGACTACTGAACTTCATGCCTGAGAGTGATGCAGTCTGAGTCTGAATATAAAATCAGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAACTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCATCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGTGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCGACTAGGGCCGGCCGGGCGCCAGCCGACGTCTCCAACCATTTTTCTTCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA)确定为曲霉属真菌杂色曲霉(Aspergillusversicolor)，其曲霉属真菌米曲霉见附图1；

步骤2：内生真菌米曲霉(Aspergillus versicolor)菌种培养：

将步骤1分离得到的米曲霉菌种在室温下接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，25～30℃培养7～10天，再接种在50～500毫升的三角瓶中，每个三角瓶含10～100毫升马铃薯葡萄糖培养基，置于25～30摄氏度下震荡培养5～10天得到液体发酵种；菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号XΓMXXNo.19910。

步骤3：菌株放大发酵：

将步骤2培养得到的液体发酵种进行规模化发酵，规模化发酵是在100～1000个100～500mL的冯巴赫瓶中进行，每个瓶含有50～400g大米和50～400mL蒸馏水，每个瓶中接种1.0～5.0mL步骤B培养得到的液体发酵种，于25～30℃培养15～45天得到杂色曲霉发酵物；

步骤4：浸膏提取：

将步骤3发酵得到的杂色曲霉发酵物用90wt％～99wt％乙醇超声提取后2-5次，每次30-50min，合并提取液过滤并浓缩到小体积，然后在浓缩液中加入乙酸乙酯与3wt％～5wt％的酒石酸混合液充分搅拌均匀，静置分层后分出水相，水相再用Na₂CO₃调节pH至9.0，并用乙酸乙酯再次萃取，乙酸乙酯相减压浓缩成浸膏，得到生物碱萃取产物供柱层析分离；

步骤5：硅胶柱层析：

将步骤4得到的浸膏用200～300目硅胶干法装柱，进行硅胶柱层析；以体积配比分别为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的二氯甲烷-甲醇溶液进行梯度洗脱，合并相同极性的部分，收集各部分洗脱液并浓缩；其中，所述硅胶与所述浸膏的质量比为2～5；收集其中用体积比为9:1的二氯甲烷-甲醇溶液洗脱时得到的洗脱液，称为第一洗脱液；将上述第一洗脱液用硅胶层析柱继续分离，用体积配比依次为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的一系列二氯甲烷-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集其中用体积比为8:2的二氯甲烷-丙酮溶液洗脱时得到的洗脱液，称为第二洗脱液。

步骤6：高效液相色谱分离

将步骤5最终得到的第二洗脱液通入高效液相色谱进行分离纯化，所述高效液相色谱法分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的ZorbaxPrepHT GF色谱柱，流速为10mL/min，流动相为52wt％的甲醇水溶液，DAD检测器检测波长为359nm，第三洗脱液每次进样50μL，收集每次进样后色谱峰收集每次进样后色谱峰，化合物的保留时间为25.4min(ⅰ)和27.8min(ⅱ)时所对应的洗脱液，减压除去溶剂即得所述的异喹唑啉酮-A和异喹唑啉酮-B。

以上述方法制备的喹唑啉酮生物碱类化合物的结构是通过以下方法鉴定出来的：

外观观测发现本发明化合物为棕色胶状物；

紫外-可见吸收光谱显示其在200,210,269,和304nm处有最大吸收，证明该化合物中存在芳香环结构。高分辨质谱(HRESIMS)给出准分子离子峰376.1662[M+H]⁺，可确定化合物的分子式为C₂₂H₂₁N₃O₃。结合¹H和¹³C与HSQC NMR数据与化合物protuboxepin K类似，与protuboxepin K相比，该化合物的C-3与C-16形成一个双键。同时，C-7位的化学位移从127.4ppm(d)向低场移动至154.0ppm(s)，提示C-7连接一个羟基。以上推测可以通过在¹H–¹HCOSY谱图中H₃-17与C-3,C-16,和C-18的HMBC相关得到证实。化合物的平面结构确定以后，该的相应构型主要通过分析该化合物的ROESY谱图及ECD谱图来确定。在化合物1的ROESY谱图中NH-2与H₂-18相关显示它们取向相同，并且间接证明C-3与C-16形成的烯烃构型为Z型。在化合物2的ROESY谱图中NH-2与H₂-18不存在相关性，说明C-3与C-16形成的烯烃构型为E型。化合物C-14的立体构型是通过TDDFT ECD计算获得的结果表明C-14的构型为14R。至此，本发明化合物的结构得到确认。化合物1和2分别命名为：异喹唑啉酮-A和异喹唑啉酮-B。

表1化合物1和2的¹H NMR和¹³C NMR数据(CD₃OD)

本发明的有益效果如下：

1、本发异喹唑啉酮化合物从烟草内生杂色曲霉真菌菌株发酵产物中分离得到，由于内生真菌容易实现批量化发酵生产，因此，本发明的化合物原料易得；化合物的提取方法简单，容易分离得到，产业化制备容易实现。

2、本发明异喹唑啉酮化合物为从烟草内源杂色曲霉(Aspergillus versicolor)真菌发酵产物中分离得到一种新的喹唑啉酮生物碱类化合物。经对抗烟草花叶病毒的实验，化合物1和2的相对抑制率分别为33.6±2.4％和26.7±2.4％，与对照品宁南霉素的相对抑制率(33.2±2.2％)相近。本发明的喹唑啉酮化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中有良好的应用前景。

3、本发明化合物分子结构也简单，容易实现人工合成，后续的产业化也可通过人工合成实现。

4、本发明的制备方法采用了酸碱控制提取异喹唑啉酮-A和喹唑啉酮-B、常规柱层析和高效液相色谱结合的制备方法，化合物制备操作流程简单，所获得的本发明化合物纯度高，后续的工业化生产中化合物的品质、纯度有保障。

5、本发明喹唑啉酮化合物安全无毒，展现出良好的抗烟草花叶病毒活性，可为烟草花叶病的防治提供理想的新骨架类型药源分子。

附图说明

图1为曲霉属真菌杂色曲霉示意图；a、菌落形态；b、显微形态。

图2为所述化合物异喹唑啉酮-A的核磁共振碳谱。

图3为所述化合物异喹唑啉酮-A的核磁共振氢谱。

图4为所述化合物异喹唑啉酮-A的主要HMBC和1H-1HCOSY相关。

图5为所述化合物异喹唑啉酮-A的ECD图。

图6为所述化合物异喹唑啉酮-B的核磁共振碳谱。

图7为所述化合物异喹唑啉酮-B的核磁共振氢谱。

图8为所述化合物异喹唑啉酮-B的主要HMBC和1H-1HCOSY相关。

具体实施方式

下面对本发明通过实施例作进一步说明，但不仅限于本实施例。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件所用的通用设备、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中所需要的原料均为市售。

本发明所用原料不受培养基类型影响，下面以来源于云南的烟草中分离鉴定的杂色曲霉菌株培养基对本发明做进一步说明：

实施例1

将培养得到的液体发酵种进行规模化发酵，规模化发酵在500个500mL的冯巴赫瓶中进行，每个瓶含有180g大米和180mL蒸馏水，每个瓶中接种2.5mL培养得到的液体发酵种，于25～30℃培养30天得到杂色曲霉发酵物。发酵产物用95％的乙醇超声提取3次，每次提取30min；提取液合并，加入到乙酸乙酯与3％的酒石酸混合液(乙酸乙酯:酒石酸＝97:3，质量比)中充分搅拌，待混合溶液静置分层后分离出水相，水相再用Na₂CO₃溶液将水层pH值调节至9.0，并用乙酸乙酯再次萃取；分离出乙酸乙酯相减压浓缩成浸膏，得浸膏580g。该浸膏用1.0kg的80～120目硅胶拌样，用3.0kg的200目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为20:1,8:2,7:3,6:4,5:5的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到5个部分，其中体积配比为7:3的二氯甲烷-甲醇洗脱部分浓缩，再次以体积配比分别为9:1,8:2,7:3,6:4,1:1的二氯甲烷-丙酮溶液进行洗脱后，再用安捷仑1100制备高效液相色谱分离，以59％的甲醇为流动相，ZorbaxPrepHT GF柱(21.2×250mm,5μm)制备柱为固定相，流速为20mL/min，DAD检测器检测波长为359nm，每次进样50μL，分别收集保留时间为25.4min和27.8min时的色谱峰所对应的洗脱液，减压除去溶剂，即得该新化合物纯品1和2。

实施例2

将培养得到的液体发酵种进行规模化发酵，规模化发酵在250个1.0L的冯巴赫瓶中进行，每个瓶含有360g大米和360mL蒸馏水，每个瓶中接种5.0mL培养得到的液体发酵种，于25～30℃培养30天得到杂色曲霉发酵物。发酵产物用95％的乙醇超声提取3次，每次提取30min；提取液合并，加入到乙酸乙酯与3％的酒石酸混合液(乙酸乙酯：酒石酸＝97:3，质量比)中充分搅拌，待混合溶液静置分层后分离出水相，水相再用Na₂CO₃溶液将水层pH值调节至9.0，并用乙酸乙酯再次萃取；分离出乙酸乙酯相减压浓缩成浸膏，得浸膏610g。该浸膏用1.0kg的80～120目硅胶拌样，用3.2kg 200目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为20:1,8:2,7:3,6:4,5:5的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到5个部分，其中体积配比为8:2的二氯甲烷-甲醇洗脱部分浓缩，再次以体积配比分别为9:1,8:2,7:3,6:4,1:1的二氯甲烷-丙酮溶液进行洗脱后，再用安捷仑1100制备高效液相色谱分离，以59％的甲醇为流动相，ZorbaxPrepHT GF柱(21.2×250mm,5μm)制备柱为固定相，流速为20mL/min，DAD检测器检测波长为359nm，每次进样50μL，化合物1收集保留时间为25.4min时所对应的洗脱液，合并馏分减压除去溶剂，即得该新化合物纯品。

实施例3

以上述方法制备的喹唑啉酮生物碱类化合物的结构是通过以下方法鉴定出来的：

外观观测发现：本发明的化合物为棕色胶状物。

紫外-可见吸收光谱显示其在200,210,269,和304nm处有最大吸收，证明该化合物中存在芳香环结构。高分辨质谱(HRESIMS)给出准分子离子峰376.1662[M+H]⁺，可确定化合物的分子式为C₂₂H₂₁N₃O₃。结合¹H和¹³C与HSQC NMR数据与化合物protuboxepin K类似，与protuboxepin K相比，该化合物的C-3与C-16形成一个双键。同时，C-7位的化学位移从127.4ppm(d)向低场移动至154.0ppm(s)，提示C-7连接一个羟基。以上推测可以通过在¹H–¹HCOSY谱图中H₃-17与C-3,C-16,和C-18的HMBC相关得到证实。化合物的平面结构确定以后，该的相应构型主要通过分析该化合物的ROESY谱图及ECD谱图来确定。在化合物1的ROESY谱图中NH-2与H₂-18相关显示它们取向相同，并且间接证明C-3与C-16形成的烯烃构型为Z型。在化合物2的ROESY谱图中NH-2与H₂-18不存在相关性，说明C-3与C-16形成的烯烃构型为E型。化合物C-14的立体构型是通过TDDFT ECD计算获得的结果表明C-14的构型为14R。至此，本发明化合物的结构得到确认。化合物1和2分别命名为：异喹唑啉酮-A和B。

实施例4

取实施例1～3制备的任一化合物进行抗烟草花叶病毒活性试验，试验情况如下：

采用半叶法，在药剂的质量浓度均为20μM时对本发明化合物进行抗烟草花叶病毒活性测定。在5～6株烤烟的植株上，选取适用于测试的叶片(叶行正常，无病无虫)，先将叶片均匀撒上细金刚砂，用毛笔将备用的烟草花叶病毒源(3.0×10^-3)均匀抹在撒有金刚砂的叶片上，待所有中选的叶片接毒结束后，立即放在盛有药液的培养皿中处理20min，取出，洒去叶片上水珠和约液，将两个半叶复原排放在铺有卫生纸保湿的搪瓷衙内加盖玻璃，控温(23±2)℃，放在温室自然光照射，2～3d即可见枯斑.每个处理都设另一半叶为对照，另外设有1组为商品宁南霉素的处理作为对比，按下公式计算相对抑制率。

XI％＝(CK-T)/CK×100％

X：相对抑制率(％)，CK：浸泡于清水中半片接毒叶的枯斑数(个)，T浸泡于药液中半片接毒叶的枯斑数(个)。

该化合物的相对抑制率为33.6±2.4％，与对照品宁南霉素的相对抑制率(33.2±2.2％)相近，说明化合物有很好的抗烟草花叶病毒活性。

以上所述仅用来详细介绍本发明的具体实施方式，但本发明提出的技术方案并不受限于上述方法。在不脱离本技术的基本原理的前提下，所熟悉本领域的技术人员对本发明提出的技术做出的等效修改和变化均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims (5)

1.异喹唑啉酮化合物，其特征在于，其为同分异构体，1-(Z)和2(E)，分子式为：C₂₂H₂₁N₃O₃，具有下述结构：

2.根据权利要求1所述喹唑啉酮化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)浸膏提取：对杂色曲霉菌株YATS1111进行固体发酵，其发酵产物用90wt％～99wt％乙醇超声提取并过滤浓缩，然后加入乙酸乙酯与酒石酸混合液充分搅拌均匀，静置分层后分出水相；水相再用Na₂CO₃调节pH值，并用乙酸乙酯再次萃取；乙酸乙酯相减压浓缩成浸膏；

(2)硅胶柱层析：将步骤(1)得到的浸膏用200～300目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析；以体积配比分别为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的二氯甲烷-甲醇溶液进行梯度洗脱，合并相同极性的部分，收集各部分洗脱液并浓缩；其中，所述硅胶与所述浸膏的质量比为1:(2～5)；收集其中用体积比为9:1的二氯甲烷-甲醇溶液洗脱时得到的洗脱液，称为第一洗脱液；将上述洗脱液用硅胶层析柱继续分离，用体积配比依次为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的二氯甲烷-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集其中用体积比为8:2的二氯甲烷-丙酮溶液洗脱时得到的洗脱液，称为第二洗脱液；

(3)高效液相色谱分离：将步骤(2)得到的第二洗脱液通入高效液相色谱进行分离纯化；所述高效液相色谱法分离纯化采用21.2mm×250mm，5μm的ZorbaxPrepHT GF色谱柱，流速为10mL/min，流动相为52wt％的甲醇水溶液；DAD检测器检测波长为359nm，第三洗脱液每次进样50μL；收集每次进样后色谱峰化合物的保留时间为25.4min和27.8min时所对应的洗脱液，减压除去溶剂即可得到所述的生物碱类化合物纯品。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中使用乙酸乙酯与3wt％～5wt％的酒石酸混合液，水相再用Na₂CO₃调节pH值至9.0。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，浸膏在经硅胶柱层析粗分前，用二氯甲烷和甲醇混合溶剂(2:1)重量1.5～2.5倍的80～120目硅胶拌样。

5.根据权利要求1所述异喹唑啉酮化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中的用途。

Images