CN105838622A - 黑曲霉hc306及在转化柚皮苷制备柚皮素中的应用 - Google Patents
黑曲霉hc306及在转化柚皮苷制备柚皮素中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种黑曲霉(Aspergillus niger)HC306及在生物转化柚皮苷制备柚皮素中的应用，所述黑曲霉HC306保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No:60026，保藏日期2016年3月21日，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编：510075；本发明黑曲霉HC306无毒无害，使用安全，生长迅速，抗杂菌能力强，批次稳定；发酵培养基成分简单，市场价格低，从而柚苷酶的生产成本较低；将含柚苷酶的粗酶液直接运用于根皮素的制备，免去了酶的分离纯化步骤，有助于降低生产成本；柚皮素的转化得率高，最高可达93.4％，且具有副产物少，产物容易提取等优点。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种柚皮素的制备方法，特别涉及一株黑曲霉(Aspergillus niger)HC306，以及该菌株在转化柚皮苷制备柚皮素中的应用。
(二)背景技术
柚皮素(naringenin)，又称柑桔素、柚苷元和柚皮苷原等，化学名4',5,7-三羟基二氢黄酮，CAS号为480-41-1，分子式C15H12O5，分子量为272.25。柚皮素广泛存在于芸香科植物，如葡萄柚、西红柿、葡萄以及柑橘类水果中。药理学研究已表明，柚皮素具有广泛的生理活性，包括抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、降血脂、抗衰老和止咳祛痰等，因此可被开发应用于医药和食品保健等领域。
柚皮素的生产可以直接从一些天然植物中提取分离，如从桃叶、菝葜中提取。但因柚皮素在天然植物中的含量不高，直接提取分离的收率往往较低，如采用CO2超临界萃取技术从桃叶中提取分离柚皮素，平均得率仅为2.18％(陈雪峰等.有机溶剂提取桃叶中柚皮素的工艺研究.食品科技，2009,34(5):209-212)。柚皮素多以其糖苷形式存在于天然植物中，即柚皮苷(naringin，CAS号10236-47-2，分子量580.53)，如在花橘红中，柚皮苷的含量一般可达到10％，所以柚皮素的生产方法多以柚皮苷为底物，采用酸水解或酶水解两种方法得到。目前专利报道多以酸水解制备，如专利CN103467428.A、CN102453011.A、CN104829579.A和CN104829578.A等。酸水解虽然具有工艺简单、成本低的优势，但都需要使用有机酸和大量有机溶剂，不适合现代化生产绿色环保的要求，且产品往往需要经过活性炭脱色处理。专利CN103740610.B采用了生物转化法，用链球菌(Streptococcus sp.)AUH-JLD109和大肠埃希氏菌(Escherichia coli)AUH-D2-1混合培养液转化柚皮苷获得柚皮素，虽有工艺环保，转化率高的优点，但涉及到两种微生物菌株的培养，工艺不够简便，菌体的培养成本较高。目前，有采用柚苷酶水解柚皮苷制备柚皮素的研究报道(邓媛等.黑曲霉TC-01产柚苷酶对柚皮苷酶解作用的研究.中国食品添加剂,2012(3):108-111)，柚苷酶是一种由α-L-鼠李糖苷酶和β-D葡萄糖苷酶组成的复合酶，分别水解柚皮苷上的鼠李糖和葡萄糖残基。较酸碱水解法相比，酶解工艺具有条件温和，产品易纯化等优点。
许多微生物可以产生柚苷酶，特别是曲霉属和青霉属中的一些种，国内外已有不少利用微生物发酵制备柚苷酶的研究报道和专利申请，如专利CN103060287.B、CN101487001.B和CN104404016.A等。如果将微生物发酵制备的柚苷酶，经过分离纯化后用于柚皮素的制备，无疑导致生产成本过高而无法工业化应用。如果利用产柚苷酶的微生物发酵，将滤除菌体的粗酶液直接作为柚苷酶的来源，则可以克服酸水解和纯酶水解解法的不足，具有反应条件温和、专一性强、生产成本低和环境友好等优点。
(三)发明内容
本发明目的是提供一株产生柚苷酶的微生物菌株—黑曲霉(Aspergillus niger)HC306，及其在转化柚皮苷制备柚皮素中的应用，较好地克服现有酸水解法制备中专一性差和转化得率低的问题，本工艺具有成本低、流程简单、产物得率高和转化副产物少等优点。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一株新菌株—黑曲霉(Aspergillus niger)HC306，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:60026，保藏日期2016年3月21日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编：510075。
本发明所述黑曲霉HC306，是从以柚子皮为微生物来源的富集培养物中分离和筛选得到的优良菌株。所述黑曲霉HC306的形态特征如下：在马铃薯琼脂平板培养基上，28℃条件下培养3天，菌落初期为白色绒毛状，之后变成灰色，菌丝上层布满黑色孢子头，背面略带黄褐色。分生孢子头黑褐色放射状，顶囊球形，直径700～800μm，顶囊周围着生双层分生孢子小梗，长短不一，小梗上产生分生孢子，分生孢子褐色球形，直径2.5～4.0μm。
所述黑曲霉HC306的18s rDNA部分核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示：ATACTGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAGTACCTTACTACATGGATACCTGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTGAAAACCTCGACTTCGGAAGGGGTGTATTTATTAGATAAAAAACCAATGCCCTTCGGGGCTCCTTGGTGAATCATAATAACTTAACGAATCGCATGGCCTTGCGCCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGTGGCCTACCATGGTGGCAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACGGGGCTCTTTTGGGTCTCGTAATTGGAATGAGTACAATCTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGTCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGAGTACTGGTCCGGCTGGACCTTTCCTTCTGGGGAATCTCATGGCCTTCACTGGCTGTGGGGGGAACCAGGACTTTTACTGTGAAAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCCTTTGCTCGAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGCGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGATAGTCGGGGGCGTCAGTATTCAGCTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTGCTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTCGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGGGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGACGGTGTTTCTATTATGACCCGTTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACAAAATAAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATCTTTTGGATGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGCGATAACGAACGAGACCTCGGCCCTTAAATAGCCCGGTCCGCATTTGC。
本发明还提供一种所述黑曲霉HC306在生物转化柚皮苷制备柚皮素中的应用。
具体的，所述应用如下：以黑曲霉HC306产酶培养后的发酵液经抽滤获得的滤液为生物催化剂，以柚皮苷为底物，以pH 4.0的磷酸缓冲液为反应介质构成转化体系，于40～50℃、200～250r/min恒温振荡条件下进行转化反应，转化反应结束后，转化液经分离纯化获得柚皮素。
进一步，所述催化剂柚苷酶活力300～400U/mL，在转化体系中体积用量为10％～50％；所述底物柚皮苷的终浓度为5～10g/L转化体系。
进一步，所述转化反应的条件为：在40～50℃、200～250r/min恒温振荡条件下转化1～2h。
所述黑曲霉HC306菌株在产酶培养前，通常需要先经斜面培养基活化培养，或再经过种子培养基扩大培养，然后用孢子或种子液接入发酵培养基进行产酶培养，所述黑曲霉HC306产酶培养方法为：(1)活化培养：将黑曲霉HC306菌种孢子接种于斜面培养基，于28～30℃恒温培养2～3天，获得斜面孢子，所述的斜面培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)；PDA培养基组成为：马铃薯100～200g/L(马铃薯洗净去皮，切成小块，加5倍质量水煮沸20～30min，4层纱布过滤去渣留汁)、蔗糖10～20g/L、琼脂15～20g/L，pH自然；(2)种子扩大培养：挑取取步骤(1)活化培养后黑曲霉HC306斜面孢子接种至种子培养基中，于28～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养2～3天，得种子液；所述种子培养基组成为：蔗糖5～10g/L，玉米浆5～10g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.1g/L，溶剂为自来水，pH 5～6；优选所述种子培养基组成为：蔗糖10g/L，玉米浆10g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.1g/L，溶剂为自来水；(3)产酶培养：将种子液以体积浓度5～10％的接种量接种至发酵培养基中，于28～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养3～4天，获得发酵液，将发酵液过滤，滤液中柚苷酶活性为300～400U/mL，滤液即为催化剂；所述发酵培养基组成为：柚皮苷1～2g/L，蔗糖3～5g/L，玉米浆4～6g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.1g/L，溶剂为自来水，pH 5～6。
进一步，优选所述发酵培养基组成为：柚皮苷2g/L，蔗糖5g/L，玉米浆6g/L，KH2PO42g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.1g/L，溶剂为自来水，pH为5。
所有培养基配制完毕后，立即进行121℃高压蒸汽灭菌15min。
本发明所述分离纯化的方法为：在生物转化反应结束后，转化体系用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液于圆底烧瓶中，45℃下减压蒸干乙酸乙酯后，再加入原转化体系体积1/5的甲醇溶解残留物；甲醇溶液用滤纸过滤后，滤液在45℃下减压干燥(优选滤液转入另一洁净圆底烧瓶中，45℃下减压蒸干甲醇后，加少量甲醇溶解残留物，甲醇溶液转入洁净烧杯中，减压干燥后)，即得柚皮素。
本发明的有益效果主要体现在：(1)本发明提供一株新菌株—黑曲霉HC306，该菌是一株无毒无害、使用安全的菌种；(2)黑曲霉HC306生长迅速，抗杂菌能力强，批次稳定；(3)发酵培养基成分简单，市场价格低，从而柚苷酶的生产成本较低；(4)将含柚苷酶的粗酶液直接运用于柚皮素的制备，免去了酶的分离纯化步骤，有助于降低生产成本；(5)柚皮素的转化得率高，最高可达93.4％，且具有副产物少，产物容易提取等优点。
(四)附图说明
图1柚皮苷转化为柚皮素的化学反应式。
图2 HPLC分析柚皮素浓度的标准曲线。
图3 HPLC法分析对转化样品的分析图谱。曲线A为标准品柚皮苷和柚皮素的HPLC图谱；曲线B为柚皮苷转化0h的对照样品HPLC图谱；曲线C为柚皮苷经生物转化1h后的HPLC图谱(实施例4样品)。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：转化菌株的富集和分离
在250mL三角瓶中加入约20g经粉碎的新鲜柚子皮，于28℃恒温培养5天。将长满霉菌的富集物用无菌水稀释1×106倍后涂布于PDA平板培养基上，于28℃恒温培养4天，挑取颜色和形态不同的霉菌菌落转接PDA斜面培养基，置于28℃恒温培养3天，得孢子丰富的斜面菌株9株，分别予以编号(HC301～HC309)，保藏于4℃冰箱中备用。
所述的平板培养基和斜面培养基均为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，按如下组成和方法配制：马铃薯洗净去皮切成小块，称取200g，加自来水1000mL，煮沸30min，4层纱布过滤去渣，滤液补足到1000mL，再加入蔗糖20g、琼脂18g，pH自然(实测6.5)，加热至琼脂溶化后分装试管或三角瓶中，经高压蒸汽121℃灭菌15min后搁置斜面或倒入无菌培养皿。
实施例2：转化菌株的筛选和分类鉴定
用棉签分别蘸取实施例1获得的各个菌株斜面孢子3次，接入50mL发酵培养基中，于28℃、200r/min恒温振荡条件下产酶培养4天后，50mL发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为粗酶液，约40mL。取25mL粗酶液置于150mL三角瓶中，0.25g柚皮苷溶于25mL的pH 4.0磷酸缓冲液中，两者混合后构成转化体系(总体积50mL)，于40℃、200r/min恒温振荡条件下转化2h；转化反应结束后，取转化液5mL于8000g离心10min，经0.45μm微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱法(HPLC)分析样品中柚皮素的浓度。
HPLC法分析不同菌株发酵制备的粗酶液作催化剂转化柚皮苷后，转化体系中柚皮素的浓度，由此比较不同菌株产酶活力的大小。经过比较，由编号HC306的菌株发酵制备的粗酶液转化柚皮苷，生成柚皮素的得率最高，为58.4％，转化体系中的柚皮素浓度为1.37g/L。
将菌株HC306接种在PDA平板培养基上，28℃条件下培养3天，菌落初期为白色绒毛状，之后变成灰色，菌丝上层布满黑色孢子头，背面略带黄褐色。分生孢子头黑褐色放射状，顶囊球形，直径700～800μm，顶囊周围着生双层分生孢子小梗，长短不一，小梗上产生分生孢子，分生孢子褐色球形，直径2.5～4.0μm。
该菌株交由生工生物工程(上海)有限公司进行18S rDNA测序，测得序列大小为1288bp(SEQ ID NO:1所示)。将该序列在GenBank上进行BLAST比对，与25株黑曲霉菌株的18S rDNA序列有大于99％的同源性。综合HC306菌株的形态特征和18S rDNA的序列分析结果，可以确定HC306菌株为一株黑曲霉(Aspergillus niger)。该菌株已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，GDMCC No:60026，保藏日期2016年3月21日。
所述的PDA平板培养基组成和制备方法同实施例1。
所述的发酵培养基按如下组成和方法配制：柚皮苷1g/L，蔗糖3g/L，玉米浆4g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.1g/L，溶剂为自来水，pH 6。250mL三角瓶装50mL发酵培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌15min。
按上述方法培养黑曲霉HC306，发酵液中的干菌体浓度为4.56g/L，发酵液的柚苷酶活力为316U/mL。
所述的柚苷酶活力测定方法为：取1.9mL的pH 4.0磷酸缓冲液于试管中，加入0.1mL发酵上清液混匀于40℃水浴中预热5min，再加入2mL用pH 4.0磷酸缓冲液配制，浓度为0.3g/L的柚皮苷标准液，于40℃下反应15min，后于100℃水浴中加热20min使酶失活，取出后迅速冷却至室温。空白对照为先将发酵上清液失活后再加入柚皮苷标准液，其他操作与对应的酶反应管相同。经过酶反应后的溶液于室温下8000g离心5min后，用高效液相色谱仪检测样品中的柚皮素浓度。
柚苷酶活力单位的定义：在40℃、pH 4.0的条件下，每分钟生成1μg柚皮素所需的酶量定义为一个柚苷酶活力单位(U)。
所述的pH4.0磷酸缓冲液配制方法为：称取0.8954g的Na2HPO4·12H2O定容至250mL，0.5254g的柠檬酸定容至500mL。然后将两种溶液按照体积比1:2混合，分别利用这两种溶液将混合溶液的pH值调节至4.0。
所述HPLC分析方法为：LC-20AD高效液相色谱仪(日本岛津仪器有限公司)，色谱柱为Phenomenex Luna C18键合硅胶柱(5μm，250mm×4.6mm)，柱温25℃；流动相为体积比1:1的甲醇和水混合物，流速1.0mL/min，检测波长280nm，进样量20μL。由相同分析条件下的标准品柚皮素浓度-峰面积标准曲线(图2)计算出样品中的柚皮素浓度。
实施例3：黑曲霉HC306菌株转化柚皮苷生成柚皮素的应用1
以实施例2筛选获得的黑曲霉HC306为产酶菌种，经种子扩大培养，发酵制备的粗酶液转化处理柚皮苷，柚皮素的摩尔转化得率较实施例2略有提高，重复实验3批次结果无显著性差异，表明该菌种产酶转化柚皮苷生产柚皮素的性能稳定，具体工艺步骤如下：
(1)将4℃冰箱中保藏的黑曲霉HC306斜面菌种接种于新鲜PDA斜面培养基，斜面于28℃恒温培养3天。所述的PDA斜面培养基组成和制备方法同实施例1；
(2)用棉签蘸取步骤(1)活化培养后黑曲霉HC306孢子2次接至50mL种子培养基中，于28℃、200r/min恒温振荡条件下培养3天，得干菌体浓度为6.23g/L的种子液。所述种子培养基组成为：蔗糖5g/L，玉米浆5g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.1g/L，溶剂为自来水，pH 6，250mL三角瓶装50mL种子培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌15min；
(3)步骤(2)种子液以体积浓度10％(即5mL)的接种量接种至50mL发酵培养基中，于28℃、200r/min恒温振荡条件下培养4天，得干菌体浓度为4.75g/L的发酵液。所述的发酵培养基组成如下：柚皮苷1g/L，蔗糖3g/L，玉米浆4g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl20.1g/L，溶剂为自来水，pH 6，250mL三角瓶装50mL发酵培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌15min。
(4)产酶培养结束后，将步骤(3)获得的发酵液50mL用布氏漏斗抽滤，收集的滤液40mL即为粗酶液，按实施例2方法测定其柚苷酶活力为337U/mL。取25mL粗酶液置于150mL三角瓶中；0.25g柚皮苷溶于25mL的pH 4.0磷酸缓冲液中，两者混合后构成转化体系(总体积50mL)，于40℃、200r/min恒温振荡条件下转化2h；转化反应结束后，取转化液5mL于8000g离心10min，经0.45μm微孔滤膜过滤后，按实施例2中的HPLC方法分析样品中柚皮素浓度。
HPLC分析表明，按本实施例方法，黑曲霉HC306菌株制备的粗酶液转化处理柚皮苷，转化样品中柚皮素浓度为1.49g/L，摩尔转化得率为63.5％，较实施例2中转化得率提高了5.12％。实施例3转化方法重复实验3批次，3批次实验结果无显著性差异，表明黑曲霉HC306菌株制备的粗酶液转化柚皮苷为柚皮素的转化性能稳定。
实施例4：黑曲霉HC306菌株转化柚皮苷生成柚皮素的应用2
以黑曲霉HC306为产酶菌种，经过种子培养优化、产酶发酵(培养基组成及初始pH)和转化条件(粗酶液用量、底物浓度和转化时间)优化后，发酵制备的粗酶液转化处理柚皮苷，柚皮素的转化得率较实施例3有大幅度提高，具体工艺步骤如下：
(1)将4℃冰箱中保藏的黑曲霉HC306斜面菌种接种于新鲜斜面培养基，斜面于30℃恒温培养3天。所述的斜面培养基组成和制备方法同实施例1。
(2)用棉签蘸取步骤(1)活化培养后黑曲霉HC306孢子2次接种至种子培养基中，于30℃、250r/min恒温振荡条件下培养2.5天，得干菌体浓度为9.48g/L的种子液。所述种子培养基组成为：蔗糖10g/L，玉米浆10g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.1g/L，溶剂为自来水，pH 6，250mL三角瓶装50mL种子培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌15min；
(3)步骤(2)种子液以体积浓度10％(即5mL)接种量接种至50mL发酵培养基，于30℃、250r/min恒温振荡条件下培养3天，得干菌体浓度为5.82g/L的发酵液。所述的发酵培养基组成如下：柚皮苷2g/L，蔗糖5g/L，玉米浆6g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.1g/L，溶剂为自来水，pH为5，250mL三角瓶装50mL发酵培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌15min。
(4)产酶培养结束后，将步骤(3)获得的发酵液50mL用布氏漏斗抽滤，收集的滤液40mL即为粗酶液，按实施例2方法测定其柚苷酶活力为372U/mL。取5mL粗酶液置于150mL三角瓶中；0.5g柚皮苷溶于45mL的pH 4.0磷酸缓冲液中，两者混合后构成转化体系(总体积50mL)，于50℃、250r/min恒温振荡条件下转化1h；转化反应结束后，取转化液5mL于8000g离心10min，经0.45μm微孔滤膜过滤后，按实施例2中的HPLC方法分析样品中柚皮素浓度。
HPLC分析表明，按本实施例方法，黑曲霉HC306菌株发酵制备的粗酶液转化处理柚皮苷，转化液中柚皮素浓度有大幅度提高，为4.33g/L，摩尔转化得率为92.3％。
实施例5：黑曲霉HC306菌株转化柚皮苷生成柚皮素的应用3
在实施例3的基础上，将产酶培养放大到500mL规模，具体工艺步骤如下：
(1)将4℃冰箱中保藏的黑曲霉HC306斜面菌种接种于新鲜斜面培养基，斜面于30℃恒温培养3天。所述的斜面培养基组成和制备方法同实施例1。
(2)用棉签蘸取步骤(1)活化培养后黑曲霉HC306孢子2次至种子培养基中，于30℃、250r/min恒温振荡条件下培养2.5天，得干菌体浓度为8.84g/L的种子液。所述种子培养基组成实施例4。
(3)步骤(2)种子液以体积浓度5％(即40mL)接种量接种至500mL发酵培养基，于30℃、250r/min恒温振荡条件下培养3天，得干菌体浓度为5.77g/L的发酵液。所述的发酵培养基组成如下：柚皮苷2g/L，蔗糖5g/L，玉米浆6g/L，NaCl 5g/L，KH2PO4 5g/L，MgSO4 0.5g/L，溶剂为自来水，pH为5，2L三角瓶装500mL发酵培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
(4)产酶培养结束后，将步骤(3)获得的发酵液500mL用布氏漏斗抽滤，收集的滤液400mL即为粗酶液，按实施例2方法测定其柚苷酶活力为354U/mL。取其中的5mL粗酶液置于150mL三角瓶中；0.5g柚皮苷溶于45mL的pH 4.0磷酸缓冲液中，两者混合后构成转化体系(总体积50mL)，于50℃、250r/min恒温振荡条件下转化1h；转化反应结束后，取转化液5mL于8000g离心10min，经0.45μm微孔滤膜过滤后，按实施例2中的HPLC方法分析样品中柚皮素浓度。
HPLC分析表明，按本实施例方法，黑曲霉HC306菌株发酵制备的粗酶液转化处理柚皮苷，转化液中柚皮素浓度有大幅度提高，达到4.16g/L，摩尔转化得率达到88.7％。
实施例6：黑曲霉HC306菌株转化柚皮苷生成柚皮素的应用4
在实施例4的基础上，将生物转化体系放大到500mL规模，具体工艺步骤如下：
(1)按实施例4方法，制备黑曲霉HC306的发酵得到的粗酶液80mL。取50mL粗酶液置于1L三角瓶中；5g柚皮苷溶于450mL的pH 4.0磷酸缓冲液中，两者混合后构成转化体系(总体积500mL)，于50℃、250r/min恒温振荡条件下转化1h；转化反应结束后，取转化液5mL于8000g离心10min，经0.45μm微孔滤膜过滤后，按实施例2中的HPLC方法分析样品中柚皮素浓度。
(2)上述转化液495mL，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液于圆底烧瓶中，45℃下减压蒸干乙酸乙酯后，再加入100mL甲醇溶解残留物；甲醇溶液用滤纸过滤后，转入另一洁净圆底烧瓶中，45℃下减压蒸干甲醇后，加少量10mL甲醇溶解残留物，甲醇溶液转入洁净烧杯中，减压干燥后得柚皮素。
HPLC分析表明，按本实施例方法，黑曲霉HC306菌株发酵制备的粗酶液转化处理柚皮苷，转化液中柚皮素浓度为4.38g/L，摩尔转化得率达到93.4％。得2.21g柚皮素，纯度为88.6％，转化收率为85.2％。
Claims (9)
1.黑曲霉(Aspergillus niger)HC306，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No:60026，保藏日期2016年3月21日，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编：510075。
2.一种权利要求1所述黑曲霉HC306在生物转化柚皮苷制备柚皮素中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用是以黑曲霉HC306产酶培养后发酵液经抽滤获得的滤液为催化剂，以柚皮苷为底物，以pH 4.0的磷酸缓冲液为反应介质构成转化体系，于40～50℃、200～250r/min恒温振荡条件下进行转化反应，转化反应结束后，转化液经分离纯化获得柚皮素。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述催化剂柚苷酶活力300～400U/mL，催化剂在转化体系中体积用量为10％～50％。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述底物柚皮苷的终浓度为5～10g/L转化体系。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于转化反应于40～50℃、200～250r/min恒温振荡条件下转化1～2h。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述催化剂制备方法为：(1)活化培养：将黑曲霉HC306菌种孢子接种于斜面培养基，于28～30℃恒温培养2～3天，获得斜面孢子，所述的斜面培养基组成为：马铃薯100～200g/L、蔗糖10～20g/L、琼脂15～20g/L，pH自然；(2)种子扩大培养：挑取步骤(1)活化培养后黑曲霉HC306斜面孢子接种至种子培养基中，于28～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养2～3天，得种子液，所述种子培养基组成为：蔗糖5～10g/L，玉米浆5～10g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.1g/L，溶剂为自来水，pH 5～6；(3)产酶培养：将种子液以体积浓度5～10％的接种量接种至发酵培养基中，于28～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养3～4天，获得发酵液，将发酵液过滤，滤液即为催化剂；所述发酵培养基组成为：柚皮苷1～2g/L，蔗糖3～5g/L，玉米浆4～6g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.1g/L，溶剂为自来水，pH 5～6。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述发酵培养基组成为：柚皮苷2g/L，蔗糖5g/L，玉米浆6g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.1g/L，溶剂为自来水，pH为5。
9.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述转化液分离纯化的方法为：在生物转化反应结束后，转化液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，45℃下减压蒸干乙酸乙酯后，再加入原转化体系体积1/5的甲醇溶解残留物，过滤，滤液在45℃下减压干燥，即得柚皮素。
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