CN102399837A

CN102399837A - 微生物发酵合成阿卡波糖的方法

Info

Publication number: CN102399837A
Application number: CN2011102936991A
Authority: CN
Inventors: 郑裕国; 孙丽慧; 李明刚; 王远山; 沈寅初
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Hangzhou Sino America East China Pharmaceutical Co Ltd; Zhejiang University of Technology ZJUT; Huadong Medicine Co Ltd
Priority date: 2011-09-29
Filing date: 2011-09-29
Publication date: 2012-04-04
Anticipated expiration: 2031-09-29
Also published as: CN102399837B

Abstract

本发明公开了一种微生物发酵合成阿卡波糖的方法，所述的方法为：将阿卡波糖产生菌CCTCC NO：M 209022，接种至适用于所述菌株的含碳源、氮源、无机盐的发酵培养基中，在温度20～32℃进行发酵培养96～192小时，发酵结束后，得发酵液提取分离，得到所述阿卡波糖，其特征在于，发酵培养进行0～60h之间，加入腺苷蛋氨酸的水溶液，使发酵培养基中腺苷蛋氨酸的浓度为1～300μmol/L。本发明通过在阿卡波糖发酵过程中补加腺苷蛋氨酸，提高了阿卡波糖的发酵水平。

Description

微生物发酵合成阿卡波糖的方法

(一)技术领域

本发明属于生物化工领域，涉及一种微生物发酵合成阿卡波糖的方法，特别涉及一种在发酵过程中通过添加腺苷蛋氨酸来提高阿卡波糖合成产量的方法。

(二)背景技术

阿卡波糖(Acarbose)是一种有效的α-糖苷酶抑制剂，它通过竞争性地抑制小肠壁上参与碳水化合物降解的α-葡萄糖苷酶的活性，延迟碳水化合物的分解消化，延缓和减少葡萄糖的吸收，从而达到控制人体内餐后的血糖水平，是临床上用于治疗II型糖尿病的口服药物。

阿卡波糖分子式为C₂₅H₄₃NO₁₈，分子量645.6，pKa1值为5.1。上世纪70年代初Frommer等人于从放线菌Actinoplanes utahensis的培养液中首先分离得到阿卡波糖，后经德国拜耳(Bayer)制药公司研制开发，1990年阿卡波糖首先在德国上市，1996年获得FDA批准在美国上市。

根据文献和专利报道，目前国内外阿卡波糖的生产都是利用微生物发酵法制备而得到，其中游动放线菌应用的最为广泛。为获得高时空得率的产物，降低生产成本，以往大多数的研究多集中在高产菌株的诱变选育(包括采用物理、化学等常规方法进行诱变，也包括利用分子生物学技术改造菌种)、发酵培养基(包括碳源、氮源、金属离子等)的优化、发酵条件(包括温度、pH、溶氧、渗透压、搅拌等条件)的优化以及对阿卡波糖生物合成途径中相关基因簇的研究等方面。

对于发酵培养基的优化策略，目前主要是通过选择合适的碳氮源，并控制发酵液中葡萄糖和麦芽糖的适当比例以及设计合理的补料策略来提高阿卡波糖的发酵单位。Lee等研究发现，添加麦芽糖比添加葡萄糖更有利于阿卡波糖的生产，示踪研究结果表明，阿卡波糖的麦芽糖基团是直接从麦芽糖、麦芽三糖或较高分子的麦芽寡糖中得到；高敬红等用Actinoplanes sp AC-17发酵生产阿卡波糖时研究发现，当葡萄糖和麦芽糖的质量比为2∶1时最有利于被菌体摄取用于阿卡波糖的生物合成。而对于发酵条件的优化策略，研究者发现，除了常规发酵参数，如温度、pH、溶氧等条件会对发酵产量造成一定的影响，同时在微生物发酵中通常不考虑的一个参数-渗透压，对阿卡波糖发酵的最终收率也具有明显的影响作用，因而渗透压参数在发酵过程中也常被控制在一个合理的范围内。Beunink等研究发现，Actinoplanes sp.SE50/110生产阿卡波糖时，培养液的渗透压值在300～500mOsm/kg之间有助于阿卡波糖的生产，其最适宜的渗透压值为400mOsm/kg；Choi和Shin的研究表明，Actinoplanes sp.ATCC31044突变株CKD485-16最适宜的渗透压值为500mOsm/kg，发酵水平达到3200mg/L，提高了39％。

阿卡波糖结构类似物是阿卡波糖发酵液中的常见杂质，阿卡波糖的结构(如式I所示)及其同系物的结构如表1所示。欧洲药典对杂质组分的含量有严格的限制，特别是杂质组分C，其与阿卡波糖分子的结构差异仅在于末端糖苷键的不同，致使产品提取分离难度大，成本高。欧洲最新药典要求杂质组分C的含量小于1.5％。因此，在生产过程中如何有效控制并降低杂质C的含量是工业化生产阿卡波糖的一个重要环节。

在现有的阿卡波糖生产工艺中，使用凝胶、大孔树脂等可以去除杂质C或使其含量下降。但是，使用以上工艺在实际工业化生产中存在着上样量小，收率低、成本高、质量低等诸多缺陷。

表1 阿卡波糖及其同系物结构

注：Ac＝Acarviose，Glc＝葡萄糖，Fru＝果糖，Man＝甘露糖

阿卡波糖是游动放线菌的次级代谢产物，而对于通过在培养液中外源添加小分子促进剂来提高阿卡波糖的发酵产量目前尚未有报道。腺苷蛋氨酸(SAM)(如式II所示)，是蛋氨酸的活性形式，它是一种存在于所有活体生物中的一种重要代谢中间体，是仅次于ATP的第二大广泛使用的酶的底物，能够参与生物体内多种生理过程，如转甲基、转硫、转氨丙基等。SAM及其反应生成的中间物可进一步转化，生成一些与信号传导相关的分子(如AHL、AI-2)，这些信号分子能够激活微生物代谢关键途径相关基因的转录从而调节次级代谢产物的生产，所以SAM对于体内的代谢起着非常重要的调控作用。然而，关于SAM对微生物发酵阿卡波糖过程以及产量和质量的影响，目前还尚未有文献报道。

(三)发明内容

针对微生物发酵合成阿卡波糖产量较低的问题，本发明提供了一种发酵合成阿卡波糖的改进方法，即向发酵培养基中适时适量地添加SAM，来提高阿卡波糖的产量。此方法在不增加额外设备和人力投入的情况下，能够实现阿卡波糖的产量大幅度提高，适合于工业化生产。

因此，本发明目的在于，提供一种在发酵过程中向培养液中适时适量地添加SAM，最终可提高阿卡波糖发酵水平的技术。

为实现以上目的，本发明采用以下技术方案：

一种微生物发酵合成阿卡波糖的方法，所述的方法为：将阿卡波糖产生菌CCTCC NO：M 209022，接种至适用于所述菌株的含碳源、氮源、无机盐的发酵培养基中，在温度20～32℃(优选28℃)进行发酵培养96～192小时，发酵结束后，得发酵液提取分离，得到所述阿卡波糖；发酵培养进行0～60h之间(优选0～36小时之间)，加入如式II所示的腺苷蛋氨酸(简称SAM)的水溶液，使发酵培养基中腺苷蛋氨酸的浓度为1～300μmol/L，优选10～100μmol/L；

本发明所使用的阿卡波糖产生菌为游动放线菌ZJB-08196(Actinoplanes sp.ZJB-08196)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCC NO：M 209022，保藏日期2009年2月16日。

本发明所述的添加SAM，是加入SAM水溶液，SAM水溶液可采用直径为0.22μm微滤膜过滤除菌。所述SAM的水溶液的加入方式可为下列之一：(1)一次性加入；(2)分批间歇加入；(3)流动连续加入。

本发明所述腺苷蛋氨酸的水溶液的浓度通常为0.25～50mmol/L。

本发明所述的发酵培养进行0～60小时之间，加入SAM水溶液，其中的0是指在发酵开始时即加入SAM水溶液，这是本领域技术人员容易理解的。

较为具体的，本发明所述方法为：将置于低温保存的阿卡波糖产生菌转移到新鲜、无菌固体平板上，28℃活化2～3天，挑取菌落接种至种子培养基，在温度28℃，通风搅拌或震荡下培养24～96小时(优选72小时)，得到种子液；将种子液与发酵培养基以体积比1～10％(优选3～5％)的接种量接种至发酵培养基，在温度28℃，通风搅拌或震荡下进行发酵培养96～192小时(优选120～168小时)，在培养至0～60小时(优选0～36h)期间，加入0.25～50mmol/L的SAM的水溶液，使其在发酵培养液中的浓度为1μM～300μM(优选10～100μM)。

本发明所述发酵培养基含有产阿卡波糖菌所需的碳源、氮源、无机盐，所述的碳源为下列之一或几种任意组合：葡萄糖、乳糖、麦芽糖、糊精、淀粉、甘油、甘露醇、山梨醇、糖蜜、秸秆水解液或菊芋水解液；所述的氮源为下列之一或几种任意组合：肉汁、酵母膏、干酵母、大豆粉、玉米浆、蛋白胨、尿素或氨盐(如硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、醋酸胺等)；所述的无机盐为下列之一或几种任意组合：Na盐、K盐、Ca盐、Mg盐、Fe盐、Mn盐、Zn盐、Co盐或Ni盐。所述发酵培养基还可以含有氨基酸类、维生素类和/或核酸类物质。

所述发酵培养基用无机酸或有机酸、碱类调节初始pH值为pH6.0～8.0，优选为6.8～7.0。

较为具体的，本发明实施例采用的发酵培养基组成如下：麦芽糖浆80.0g/L，葡萄糖20.0g/L，黄豆饼粉10.0，g/L，玉米浆5.0g/L，FeCl₃0.1g/L，CaCl₂2.0g/L，CaCO₃6.0g/L，溶剂为水，初始pH 7.0。

本发明实施例采用的种子培养基组成如下：玉米淀粉15.0g/L，黄豆饼粉40.0g/L，甘油20.0g/L，K₂HPO₄0.1g/L，CaCO₃2.0g/L，溶剂为水，初始pH 7.0。

本发明所述的发酵培养基、种子培养基，配制完成后均需要灭菌处理，通常采用121℃灭菌30min。

更具体的，推荐本发明所述方法按如下步骤进行：

(1)将置于低温保存的阿卡波糖产生菌CCTCC NO：M 209022转移到新鲜、无菌固体平板上，28℃活化2～3天，挑取菌落接种至种子培养基，在温度28℃，通风搅拌或震荡下培养24～96小时，得到种子液，所述种子培养基组成如下：玉米淀粉15.0g/L，黄豆饼粉40.0g/L，甘油20.0g/L，K₂HPO₄0.1g/L，CaCO₃2.0g/L，溶剂为水，初始pH7.0；

(2)将种子液与发酵培养基以体积比1～10％的接种量接种至发酵培养基，在温度28℃，通风搅拌或震荡下进行发酵培养96～192小时，在培养至0～60小时期间，加入0.25～50mmol/L腺苷蛋氨酸的水溶液，使发酵培养基中腺苷蛋氨酸的浓度为1～300μmol/L；所述发酵培养基组成如下：麦芽糖80.0g/L，葡萄糖20.0g/L，黄豆饼粉10.0，g/L，玉米浆5.0g/L，FeCl₃0.1g/L，CaCl₂2.0g/L，CaCO₃6.0g/L，溶剂为水，初始pH 7.0；

(3)发酵结束后，得发酵液提取分离，得所述阿卡波糖。

本发明所述发酵液提取分离的方法为：发酵液调节pH值至3，然后进行离心或过滤，得到澄清的阿卡波糖滤液；采用强酸型阳离子交换树脂吸附、洗脱；收集液经脱盐、高分辨率阳离子交换树脂精制，中和，冷冻干燥，制得阿卡波糖。

发酵液中阿卡波糖浓度检测采用HPLC法。样品预处理：发酵液振荡均匀，移取5.0ml置于10ml离心管中，5000rpm离心5分钟，弃沉淀、收集上清；上清与无水乙醇按体积比1∶4混合，10000rpm离心10分钟，收集澄清的上清液，0.45μm微滤膜过滤，滤液采用岛津HPLC分析；HPLC流动相配制：准确称取0.300g KH₂PO₃、0.350g Na₂HPO₃，用超纯水溶解、定容至500ml，0.45μm微滤膜过滤；滤液与色谱纯乙腈按体积比30∶70混合、超声波脱气；HPLC分析条件：岛津LC-20AT泵，岛津SPD-20A紫外-可见光检测器，250mm×4.6mm Hyersil氨基柱(依利特，大连)，柱温箱温度40℃；流动相流速1.0mL/min，进样量为20.0μL，UV检测波长210nm。

本发明的有益效果：利用本发明方法，通过在阿卡波糖发酵培养至0～60小时(优选0～36h)期间，加入SAM的水溶液，使其在发酵培养液中的浓度为1μM～300μM(优选10～100μM)，来提高阿卡波糖的发酵水平。从本发明实施例中可以看出，与不添加SAM的情况相比较，阿卡波糖的发酵效价最高可提高34％；在发酵前期补加100μM的SAM，发酵进行168h，不仅可以提高发酵过程中目标产物阿卡波糖的产量，同时还可以促进生物量的形成和糖质底物的消耗，更为显著的是，杂质组分C含量也减少了61.1％。可见，SAM的适量添加，可以同时提高产品的产量和质量。

(四)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。然而，本领域的技术人员容易理解，以下实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。

发酵液中阿卡波糖浓度检测采用HPLC法。样品预处理：发酵液振荡均匀，移取5.0mL置于10mL离心管中，5000rpm离心5min，弃沉淀、收集上清；上清与无水乙醇按体积比1∶4混合，10000rpm离心10分钟，收集澄清的上清液，0.45μm微滤膜过滤，滤液采用岛津HPLC分析；HPLC流动相配制：准确称取0.300g KH₂PO₃、0.350g Na₂HPO₃，用超纯水溶解、定容至500mL，0.45μm微滤膜过滤；滤液与色谱纯乙腈按体积比30∶70混合、超声波脱气；HPLC分析条件：岛津LC-20AT泵，岛津SPD-20A紫外-可见光检测器，250mm×4.6mm Hyersil氨基柱(依利特，大连)，柱温箱温度40℃；流动相流速1.0mL/min，进样量为20.0μL，UV检测波长210nm。

实施例中所使用的阿卡波糖产生菌为游动放线菌ZJB-08196(Actinoplanes sp.ZJB-08196)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCC NO：M 209022，保藏日期2009年2月16日。

实施例1：

(1)培养基的制备：

配制固体平板培养基，其培养基组成如下：蔗糖25g/L，蛋白胨2g/L，酪氨酸1g/L，K₂HPO₄0.1g/L，KCl 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.1g/L，琼脂20g/L，用自来水配制，初始pH 7.0。121℃灭菌30分钟。

配制种子培养基，其培养基组成如下：玉米淀粉15g/L，黄豆饼粉40g/L，甘油20g/L，K₂HPO₄0.1g/L，CaCO₃2g/L，用自来水配制，初始pH 7.0。121℃灭菌30分钟。

配制发酵培养基，其培养基组成如下：麦芽糖80g/L，葡萄糖20g/L，黄豆饼粉10g/L，玉米浆5g/L，CaCO₃6g/L，FeCl₃0.1g/L，CaCl₂2g/L，用自来水配制，pH 7.0。121℃灭菌30min。

(2)配制SAM水溶液：

用无菌水配制SAM浓度分别为0.25mM、0.5mM、1mM、2mM、4mM、7mM和10mM、15mM、20mM、30mM和50mM的SAM溶液，采用直径为0.22μm微滤膜过滤除菌。

(3)培养方法：

种子培养：将置于低温保存的阿卡波糖产生菌CCTCC NO：M209022转移到新鲜、无菌固体平板上，28℃活化2天后，挑取菌落接种到装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中，摇床转速200rpm，在28℃下培养72小时，得到种子液。

发酵培养：取以上配制好的发酵培养基，倒入12个500mL三角瓶中，每瓶中倒入50mL发酵培养基，每瓶分别接入以上制得的2.5mL种子液进行发酵，发酵温度28℃，摇床转速200rpm。在发酵第12h，向其中11个发酵摇瓶中分别加入上述配制的0.25mM、0.5mM、1mM、2mM、4mM、7mM和10mM、15mM、20mM、30mM和50mM的SAM溶液，每瓶加0.5mL，另外一只摇瓶不加入SAM溶液，加0.5mL无菌水作为对照，总发酵时间144h，采用HPLC法测定发酵液中阿卡波糖的浓度，结果如表2所示。

表2：添加不同SAM浓度对阿卡波糖产量的影响

从上表可以看出，在发酵过程中补加适量的SAM可以提高阿卡波糖的发酵产量。

实施例2：

根据实施例1的结果，选择发酵液中SAM浓度分别为20μM和100μM，按照实施例1的培养方法，考察在发酵进行到不同时间向发酵培养液中添加SAM对阿卡波糖产量的影响，同时，以不添加SAM溶液，而添加等体积无菌水的摇瓶发酵作为对照，HPLC检测发酵液中阿卡波糖的浓度，结果如表3所示。

表3：SAM加入时间对阿卡波糖产量的影响

从上表可以看出，在发酵中前期即从0h到60h过程中，添加适量的SAM都可以明显的提高阿卡波糖的发酵产量，尤其在发酵0h到36h之间添加适量的SAM可显著促进阿卡波糖的生成，然而在发酵进行到稳定期后，添加SAM水溶液对提高阿卡波糖产量的效果并不明显。

实施例3：

根据实施例1和2的结果，在发酵第12h向发酵液中添加SAM，并选择发酵液中SAM浓度分别为10μM和20μM，按照实施例1的培养方法，考察发酵液中添加SAM对阿卡波糖发酵过程和产量的影响，发酵共进行168小时，同时，以不添加SAM溶液，而添加等体积无菌水的摇瓶发酵作为对照，HPLC检测发酵液中阿卡波糖的浓度，结果如表4所示。

表4：添加/不添加SAM对发酵形成阿卡波糖过程和产量的影响

从上表可以看出，在发酵第12h向培养液中添加适量的SAM，可以促进整个发酵过程中阿卡波糖的发酵产量，当在发酵进行到168h，添加20μM SAM组可使阿卡波糖产量达到3439μg/mL，与对照相比，提高了34％。

实施例4：

在发酵第24h向发酵液中添加SAM，使发酵液中SAM浓度为100μM，按照实施例1的培养方法，考察发酵液中添加了SAM后，对发酵过程中阿卡波糖合成、糖质底物消耗、细胞生长以及副产物组分C合成的影响。同时，以不添加SAM溶液，而添加等体积无菌水的摇瓶发酵作为对照，HPLC检测发酵液中阿卡波糖的浓度，细胞干重法测定生物量，苯酚硫酸法测定总糖的浓度，生物传感器测定葡萄糖浓度，结果如表5所示。

表5：添加100μM SAM对发酵过程中细胞生长、底物消耗、产物形成以及杂质组分C形成的影响

从上表可以看出，在发酵前期补加适量的SAM，不仅可以提高发酵过程中目标产物阿卡波糖的产量，同时还可以促进生物量的形成和糖质底物的消耗，更重要的是，与对照组相比，发酵24h添加100μM SAM之后，可使杂质组分C的合成大大减少，由于组分C是阿卡波糖的结构类似物，其形成会给后续产物分离造成了很大困难，最新欧洲药典明确要求，组分C的含量要小于1.5％。从本实例中可以看出，适量添加了SAM之后，不仅可以提高阿卡波糖的发酵产量，同时在发酵终点杂质组分C含量也减少了61.1％。可见，SAM的适量添加，可以提高产品的质量，更有利于产品的下游分离提取。

实施例5：阿卡波糖的提取

取实施例4中的添加100μM SAM、经过168h培养的发酵液50mL，调节pH值至3，3000×g离心10min，弃沉淀，收集上清液；澄清上清液经大孔阳离子交换树脂初分离。层析柱采用2.5×30cm玻璃柱(美国BIO-Rad)。初分离层析选择粒径80μm UNOsphere S填料，湿法装柱，床层高度约20.5cm，介质用5.0×10^-2M盐酸稀酸转型成H⁺型。流动相流速设置为440mL/h(线速度1.5cm/min)，充分平衡后，取3.0mL浓度为6.3g阿卡波糖/升浓缩液的浓缩液上样，超纯水淋洗10个柱体积，洗脱采用5.0×10^-3M盐酸/柱体积梯度洗脱10个柱体积，分部收集、合并相同的洗脱峰，收集液经HPLC分析，重复上述精制操作4批；收集的阿卡波糖组分经离子交换层析脱盐后，调节至pH3，然后进行精制，选择粒径25μm Macro-Prep 25S填料进行阳离子交换层析，湿法装柱，床层高度约20.3cm，介质用5.0×10^-2M盐酸稀酸转型成H⁺型。流动相流速设置为290mL/h(线速度1.0cm/min)，充分平衡后，取1.0mL浓度为8.8g阿卡波糖/升浓缩液的浓缩液上样，超纯水淋洗10个柱体积，洗脱采用5.0×10^-3M盐酸/柱体积梯度洗脱10个柱体积，分部收集、收集液经HPLC分析；重复上述精制操作10批。合并阿卡波糖收集液，物料经阳离子树脂与阴离子树脂吸附部分色素、无机盐离子、中和，冷冻干燥，得0.0801g阿卡波糖，样品纯度98.8％，提取工艺计算综合收率73.2％。

Claims

1.一种微生物发酵合成阿卡波糖的方法，所述的方法为：将阿卡波糖产生菌CCTCC NO：M 209022，接种至适用于所述菌株的含碳源、氮源、无机盐的发酵培养基中，在温度20～32℃进行发酵培养96～192小时，发酵结束后，得发酵液提取分离，得到所述阿卡波糖，其特征在于，发酵培养进行0～60h之间，加入如式II所示的腺苷蛋氨酸的水溶液，使发酵培养基中腺苷蛋氨酸的浓度为1～300μmol/L；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述腺苷蛋氨酸的水溶液的浓度为0.25～50mmol/L。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于在发酵培养进行0～36h之间，加入如式II所示的腺苷蛋氨酸的水溶液，所述腺苷蛋氨酸的水溶液的加入方式为下列之一：(1)一次性加入；(2)分批间歇加入；(3)流动连续加入。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于发酵培养进行0～60h之间，加入如式II所示的腺苷蛋氨酸的水溶液，使发酵培养基中腺苷蛋氨酸的浓度为10～100μmol/L。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵培养基中，所述的碳源为下列之一或几种任意组合：葡萄糖、乳糖、麦芽糖、糊精、淀粉、甘油、甘露醇、山梨醇、糖蜜、秸秆水解液或菊芋水解液；所述的氮源为下列之一或几种任意组合：肉汁、酵母膏、干酵母、大豆粉、玉米浆、蛋白胨、尿素或氨盐；所述的无机盐为下列之一或几种任意组合：Na盐、K盐、Ca盐、Mg盐、Fe盐、Mn盐、Zn盐、Co盐或Ni盐。

6.如权利要求1或5所述的方法，其特征在于所述发酵培养基初始pH值为pH 6.0～8.0。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵培养基组成如下：麦芽糖80.0g/L，葡萄糖20.0g/L，黄豆饼粉10.0，g/L，玉米浆5.0g/L，FeCl₃0.1g/L，CaCl₂2.0g/L，CaCO₃6.0g/L，溶剂为水，初始pH 7.0。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法为：将置于低温保存的阿卡波糖产生菌CCTCC NO：M 209022转移到新鲜、无菌固体平板上，28℃活化2～3天，挑取菌落接种至种子培养基，在温度28℃，通风搅拌或震荡下培养24～96小时，得到种子液；将种子液与发酵培养基以体积比1～10％的接种量接种至发酵培养基，在温度28℃，通风搅拌或震荡下进行发酵培养96～192小时，在培养至0～60小时期间，加入0.25～50mmol/L腺苷蛋氨酸的水溶液，使发酵培养基中腺苷蛋氨酸的浓度为1～300μmol/L；发酵结束后，得发酵液提取分离，得所述阿卡波糖。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法按如下步骤进行：(1)将置于低温保存的阿卡波糖产生菌CCTCC NO：M 209022转移到新鲜、无菌固体平板上，28℃活化2～3天，挑取菌落接种至种子培养基，在温度28℃，通风搅拌或震荡下培养24～96小时，得到种子液，所述种子培养基组成如下：玉米淀粉15.0g/L，黄豆饼粉40.0g/L，甘油20.0g/L，K₂HPO₄0.1g/L，CaCO₃2.0g/L，溶剂为水，初始pH7.0；

(3)发酵结束后，得发酵液提取分离，得所述阿卡波糖。

10.如权利要求1或9所述的方法，其特征在于所述发酵液提取分离的方法为：发酵液调节pH值至3，然后进行离心或过滤，得到澄清的阿卡波糖滤液；采用强酸型阳离子交换树脂吸附、洗脱；收集液经脱盐、高分辨率阳离子交换树脂精制，中和，冷冻干燥，制得阿卡波糖。