CN111690629B

CN111690629B - 一种内切葡聚糖苷酶突变体、基因、工程菌及其应用

Info

Publication number: CN111690629B
Application number: CN202010471544.1A
Authority: CN
Inventors: 柳志强; 周海岩; 易晓男; 周建宝; 薛亚平; 郑裕国; 陈德水; 程新平; 李勉; 王红艳; 陈凯茜
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT; Zhejiang Huakang Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT; Zhejiang Huakang Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2020-05-29
Filing date: 2020-05-29
Publication date: 2022-04-19
Anticipated expiration: 2040-05-29
Also published as: CN111690629A

Abstract

本发明公开一种内切葡聚糖苷酶突变体、基因工程菌及其在降解纤维素中的应用。所述内切葡聚糖苷酶突变体是将SEQ ID No.3所示氨基酸序列第202位的赖氨酸突变为精氨酸。本发明内切葡聚糖苷酶突变体的比活力比野生酶显著提高1.4倍左右。以微晶纤维素为底物时，纤维素酶与突变酶的共同反应，反应催化效率较以纤维素酶单独降解底物显著提高了23.5％，可以看出突变酶显著提高了酶活力，可以降低工业应用的经济成本，为其在食品生物乙醇等工业生产领域提供了应用基础。

Description

一种内切葡聚糖苷酶突变体、基因、工程菌及其应用

(一)技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种采用定点突变方法制备内切葡聚糖苷酶突变体及其应用。

(二)背景技术

面对石化能源稀缺和环境污染带来的双重压力，寻找可再生的清洁能源成为各国科研人员关注的焦点。其中木质纤维素具有来源广泛、价格低廉、再生性强等优点，是地球上最丰富的可再生资源，全球每年通过光合作用产生的植物约亿吨，为避免与人争粮，木质纤维素将成为生物乙醇生产最具潜力的原料。

利用纤维素酶转化木质纤维素生物质，对解决能源危机和环境污染问题具有重要的战略意义。自然界中存在三种协同降解纤维素的酶：内切葡聚糖酶(endo-β-1,4-glucanase,EC 3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(exoglucanase,EC 3.2.1.91)和β-葡聚糖苷酶(β-glucosidase,EC 3.2.1.21)。其中内切葡聚糖酶主要作用于纤维素的非结晶区,随机水解纤维素链中的糖苷键，产生大量不同聚合度的纤维素短链；外切酶(纤维二糖水解酶)可以从纤维素链的还原端(CBHⅠ)或非还原端(CBHⅡ)开始持续水解纤维素寡糖链，释放纤维二糖并由此破坏纤维素的结晶区；β-葡聚糖苷酶则主要水解纤维二糖和可溶性纤维寡糖，最终将纤维素转化为可利用的葡萄糖。

然而，由于木质纤维素结构特殊，由此形成的抗生物降解屏障使其转化效率并不高。因此，探寻一种高效可行的纤维素酶改良方法以提高酶活力，对提升纤维素酶在食品加工、酿造业、造纸工业、纺织业和燃料乙醇炼制等领域的工业应用价值具有重要意义。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供一种内切葡聚糖苷酶突变体、基因、载体、工程菌及其应用，本发明利用定点突变的方法对炭疽菌来源的内切葡聚糖苷酶进行改造，获得酶活性提高的内切葡聚糖苷酶突变体K202R，能够用于降解纤维素特别是纤维素结晶多糖，降低工业应用的经济成本。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种内切葡聚糖苷酶突变体，所述内切葡聚糖苷酶突变体是将SEQ IDNo.3所示氨基酸序列第202位的赖氨酸(Lys)突变为精氨酸(Arg)；所述突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明SEQ ID NO.3所示氨基酸序列为基因库中来源于炭疽菌(Colletotrichum graminicola)M1.001的内切葡聚糖苷酶的氨基酸序列。

本发明还提供一种内切葡聚糖苷酶突变体的编码基因，所述编码基因核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明还涉及包含内切葡聚糖苷酶突变体编码基因的重组载体，以及由重组载体构建的基因工程菌。

本发明所述重组载体以pPIC9K为质粒，所述工程菌以毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115为宿主细胞。

本发明还提供一种所述内切葡聚糖苷酶突变体在降解纤维素中的应用。

进一步，所述纤维素包括羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、Whatman No.1滤纸、细菌微晶纤维素(BMCC)或玉米芯；所述玉米芯是将干燥玉米芯废渣用质量浓度12％KOH水溶液在70℃浸泡12h后，用清水洗涤至pH9以下，冷冻干燥制成。

进一步，所述应用的方法为：以纤维素为底物，以含内切葡聚糖苷酶突变体基因的工程菌经发酵培养后的上清液或上清液提取的纯酶为催化剂，在pH3.5-8.0(优选pH6.5)的缓冲液中构成反应体系，在45-90℃、500rpm反应12-96h(优选65℃、500rpm反应48h)，向反应液中添加纤维素酶，继续反应2h(优选65℃、500rpm反应2h)，然后煮沸10min终止体系的反应，离心(优选12000rpm离心10min)，取上清液，获得降解后的纤维素；所述纤维素酶由100mg/mL外切葡聚糖苷酶无菌水溶液、100mg/mL β-葡萄糖苷酶无菌水溶液以体积比3:1混合，其中外切葡聚糖苷酶的酶活为0.13U/mg，β-葡萄糖苷酶的酶活为4U/mg；所述底物加入终浓度为5-30mg/mL(优选10mg/mL)，所述催化剂加入量为10-50U/mL(优选15-20U/mL)，所述纤维素酶加入终浓度为1-10mg/mL(优选1mg/mL)。

进一步，所述催化剂按如下方法制备：将含内切葡聚糖苷酶突变基因工程菌接种至YPD培养基，30℃培养24h，然后以体积浓度1％接种量转接到含体积浓度1％甘油的BMGY培养基，30℃培养16～20h，4000rpm离心10min，弃上清，菌体沉淀重悬于BMMY培养基中，30℃培养，每24h添加甲醇至体积终浓度为1％诱导目的蛋白表达5天后，12000rpm离心30min，收集上清液；将上清液用孔径0.22μm水系膜过滤，用Ni²⁺螯合琼脂糖树脂柱进行蛋白纯化，分别用含30、50、100、500mM咪唑的pH7.4磷酸缓冲液进行梯度洗脱，收集含100mM咪唑的pH7.4磷酸缓冲液洗脱时的流出液，用10kDa的超滤管过滤后，再用MilliQwater洗涤一次，获得内切葡聚糖苷酶纯酶。所述BMGY培养基组成(g/L)：蛋白胨20，酵母提取物10，甘油10，溶剂为水，pH自然；灭菌后再添加过滤除菌的质量终浓度13.4％YNB，质量终浓度(4×10^-5)％生物素。BMMY培养基组成(g/L)：蛋白胨20，酵母提取物10，溶剂为水，pH自然；灭菌后再添加过滤除菌的质量终浓度13.4％YNB，质量终浓度(4×10^-5)％生物素，体积终浓度1％甲醇。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

相比野生酶，本发明的突变酶最适反应pH值和温度不变，突变酶的比活力比野生酶显著提高1.4倍左右。以羧甲基纤维素钠为底物时，纤维素酶与突变酶的协同反应，反应催化效率较以纤维素酶单独降解底物显著提高了23.5％。

(四)附图说明

图1葡萄糖-DNS标准曲线，Y＝0.0033x-0.02739，R²＝0.9996。

图2为野生酶与突变酶在pH5.0、不同温度条件下的酶活力曲线图，FPA是指滤纸酶活力。

图3为野生酶与突变酶在温度65℃、不同pH条件下的酶活力曲线图，FPA是指滤纸酶活力。

图4葡萄糖-峰面积标准曲线，y＝139730x-7620.8，R²＝0.9999。

图5为降解纤维素产生的葡萄糖含量柱形图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1内切葡聚糖苷酶突变文库的构建

1、构建重组质粒pPIC9K-CgEndo：

首先根据基因库中源自野生型炭疽菌(Colletotrichum graminicola)M1.001的氨基酸序列(GenBank:XP_008100825.1)，以酵母表达宿主进行密码子优化合成基因，得到经优化后的内切葡聚糖苷酶(记为CgEndo)编码基因(核苷酸序列如SEQ ID No.4，氨基酸序列SEQ ID No.3所示)，将上述CgEndo编码基因和pPIC9K载体进行一步克隆，得到重组载体pPIC9K-CgEndo，将重组载体pPIC9K-CgEndo转至克隆宿主E.coli JM109，对得到的转化子测序验证是否为正确的基因克隆(与核苷酸序列SEQ ID No.4相同)，挑选测序正确的菌株，即为野生型内切葡聚糖苷酶菌株(记为Endo-WT)，并提取重组载体pPIC9K-CgEndo。

2、构建重组质粒pPIC9K-CgEndo-K202X

(1)突变位点的选择

以步骤1中SEQ ID No.3所示内切葡聚糖苷酶为模板，使用SWISS-MODEL在线建模，并用Swiss-PdbViewer软件进行分析，用Schrodinger软件进行分子对接。通过多序列比对，同源建模，分子对接等预测，初步确定了对CgEndo序列的第202位点进行饱和突变。以已克隆并测序的内切葡聚糖苷酶CgEndo基因为模板，利用SnapGene软件设计引物，对202位点进行定点饱和突变。

(2)定点饱和突变

以步骤1中重组质粒pPIC9K-CgEndo为模板，以带有突变位点的寡聚核苷酸序列为引物对(引物1和引物2)，利用

Max Super-Fidelity DNA Polymerase试剂盒反向PCR扩增得到包含有突变基因的碱基序列(SEQ ID No.2，氨基酸序列为SEQ ID No.1)的PCR产物，然后利用ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit试剂盒进行一步克隆，获得重组载体pPIC9K-CgEndo-K202X(X即任意氨基酸)，构建突变体转化子文库。重组质粒转入E.coli JM109，涂布于含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养。挑取培养基上的单菌落进行测序验证，得到验证正确的转化子E.coli JM109-pPIC9K-CgEndo-K202X。

引物1：atttacaaaattctnnntttcctgc；

引物2：gagaagaagcaggaaannnagaat。

LB培养基组成(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10，溶剂为水，pH自然。固体培养基在此基础上添加20g/L琼脂粉。

3、含有内切葡聚糖苷酶突变基因工程菌的构建

从步骤2E.coli JM109-pPIC9K-CgEndo-K202X提取质粒，用DNA限制性内切酶SalI将质粒线性化，用琼脂糖凝胶电泳进行检测，将线性化后的质粒回收，然后电转至宿主细胞即毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115感受态中，涂布于MD培养基，30℃培养2～3天后挑取转化子于分别含终浓度100μg/mL的遗传霉素G418的YPD培养基，30℃培养进行抗性筛选，然后挑取菌落大而饱满的克隆于含终浓度150μg/mL G418的YPD培养基，30℃培养，最后挑取菌落大而饱满的克隆于含终浓度200μg/mL G418的YPD培养基，30℃培养，最终筛选到拷贝数高的转化子。提取转化子中的基因组，对目标基因进行测序验证，验证正确的转化子为内切葡聚糖苷酶突变基因工程菌，记为Endo-K202X，其中X为R(精氨酸)、D(天冬氨酸)、V(缬氨酸)、L(亮氨酸)、S(丝氨酸)。

MD培养基组成(g/L)：YNB(无氨基酸酵母氮源)13.4，葡萄糖20，生物素(4×10^-5)％，琼脂粉20，溶剂为水，pH自然。

YPD培养基组成(g/L)：蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20，溶剂为水，pH自然。固体培养基在此基础上添加20g/L琼脂粉。

实施例2内切葡聚糖苷酶突变基因工程菌的表达与酶活力测定

1、基因工程菌的表达

挑取已测序的单菌落接种到刚果红筛选固体培养基上，30℃倒置培养3天，测量菌落直径(D)和周围水解圈直径(H)。根据D/H的大小初判断菌株降解纤维素能力，筛选比值大的菌落进行下一步诱导表达。

将实施例1筛选出的内切葡聚糖苷酶突变基因工程菌接种至5mL的YPD培养基，30℃培养24h，然后以体积浓度1％接种量转接到含体积浓度1％甘油的30mL BMGY培养基，30℃培养16～20h，4000rpm离心10min，弃上清，菌体沉淀重悬于25mL的BMMY培养基中，30℃培养，每24h添加甲醇至体积终浓度为1％诱导目的蛋白表达5天后，12000rpm离心30min，收集发酵液上清，即为粗酶液。发酵液上清用孔径0.22μm水系膜过滤，用Ni²⁺螯合琼脂糖树脂柱进行蛋白纯化，分别用含30、50、100、500mM咪唑的pH7.4磷酸缓冲液进行梯度洗脱，收集含100mM咪唑的磷酸缓冲液洗脱时的流出液，用10kDa的超滤管过滤后，再用MilliQwater洗涤一次，获得内切葡聚糖苷酶纯酶(记为Endo-K202X)500μL。纯化过程中目的蛋白用SDS-PAGE电泳鉴定。

同样条件下，以未经定点突变的野生菌做对照组(记为Endo-WT)，除突变点外，其它遗传背景完全相同。

刚果红筛选培养基(双层)组成：上层为刚果红-羧甲基纤维素培养基，下层为琼脂(20g/L琼脂，溶剂为水)。刚果红-羧甲基纤维素培养基组成(g/L)：羧甲基纤维素钠10，酵母提取物5，刚果红1，NH₄NO₃ 1，KH₂PO₄ 1，MgSO₄·7H₂O 0.5，琼脂20，溶剂为水，pH自然。

BMGY培养基组成(g/L)：蛋白胨20，酵母提取物10，甘油10，溶剂为水，pH自然。灭菌后再添加过滤除菌的质量终浓度13.4％YNB，质量终浓度(4×10^-5)％生物素。

BMMY培养基组成(g/L)：蛋白胨20，酵母提取物10，溶剂为水，pH自然。灭菌后再添加过滤除菌的质量终浓度13.4％YNB，质量终浓度(4×10^-5)％生物素，体积终浓度1％甲醇。

2、酶活力测定

(1)测定原始滤纸酶活：将Whatman No.1滤纸(直径150mm)剪成6cm*1cm的长方形纸片，加入150μL pH5.0磷酸缓冲液，加入50μL实施例2方法制备的纯酶(Endo-WT或Endo-K202X)构成0.2mL体系，50℃、500rpm，振荡反应30min。加入200μL DNS终止反应，煮沸5min。取200μL反应液测OD₅₄₀。根据葡萄糖-DNS标准曲线(如图1)计算酶活。结果显示，突变酶的滤纸酶活各不相同。Endo-WT：21.29U/mg、Endo-K202R：39.28U/mg、Endo-K202D：11.31U/mg、Endo-K202V：30.15U/mg、Endo-K202L：22.46U/mg、Endo-K202S：19.27U/mg。Endo-K202D仅为原酶活的53％，Endo-K202R酶活提高了51％，故选择Endo-K202R作为最佳突变体进行后续研究。

(2)最适温度的测定：反应条件在步骤(1)的基础上，在不同反应温度(45、50、55、60、65、70、75、80、85、90℃)下测定Endo-WT和Endo-K202R酶活力。由图2可以看出，突变酶K202R和野生酶的最适温度都为65℃，其中突变酶Endo-K202R的酶活为138.67U/mg，野生酶酶活为71.76U/mg，突变酶Endo-K202R的比活力是野生酶的1.9倍左右。

(3)最适pH的测定：将步骤(1)中温度改为最适温度65℃，pH5.0改为不同的pH缓冲体系(pH值分别为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)，测定Endo-WT和Endo-K202R酶活力。由图3可以看出，突变酶Endo-K202R和野生酶在pH小于5.0时比活力差异不大，但pH大于5.5时，突变酶Endo-K202R的比活力显著高于野生酶的比活力。两者的最适pH为6.5，其中突变酶Endo-K202R的酶活达224.01U/mg，野生酶酶活为162.48U/mg，是野生酶比活力的1.4倍。

实施例3内切葡聚糖苷酶突变体对纤维素的降解应用研究

底物：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、细菌微晶纤维素(BMCC)、玉米芯(干燥玉米芯废渣用质量浓度12％KOH水溶液在70℃浸泡12h后，用清水洗涤至pH9以下，冷冻干燥制成)。

反应体系为：分别加入终浓度10mg/mL的不同底物，加入0.05mL实施例2制备的内切葡聚糖苷酶纯酶(野生酶Endo-WT或突变酶Endo-K202R，其中突变酶Endo-K202R的酶活为16.80U/mL)为催化剂，在50mM的pH6.5磷酸缓冲液中构成反应体系0.4mL，65℃、500rpm反应48h，反应结束后，每个反应体系添加终浓度1mg/mL的纤维素酶(将100mg/mL外切葡聚糖苷酶无菌水溶液、100mg/mL β-葡萄糖苷酶无菌水溶液以体积比3:1混合，其中外切葡聚糖苷酶的酶活为0.13U/mg，β-葡萄糖苷酶的酶活为4U/mg)，65℃、500rpm反应2h，然后煮沸10min终止体系的反应，12000rpm离心10min，取上清液，利用高效液相色谱法，根据葡萄糖-峰面积标准曲线(如图4)计算葡萄糖的含量。同样条件下，以水代替内切葡聚糖苷酶为对照。

高效液相色谱仪为Water 2414示差折光检测器，色谱柱为Agilent Hi-Plex Na(300×7.7mm)，流动相为5mM H₂SO₄，流速为0.4mL/min，柱温为80℃，进样量为10μL。

以纤维素酶单独降解底物产生的葡萄糖作为100％，计算相对葡萄糖含量。在本实验条件下，当酶共同作用时，可以显著提高对纤维素底物的降解效率，结果见图5。以CMC-Na为底物，相比纤维素酶单独作用时，纤维素酶与野生酶协同作用时，葡萄糖含量无明显变化，纤维素酶与突变酶协同作用时，葡萄糖含量提高了23.5％。以天然纤维素BMCC为底物，纤维素酶与突变酶协同作用时，葡萄糖含量提高了19.7％。以结晶程度更高的玉米芯为底物，纤维素酶与突变酶协同作用时，葡萄糖含量也提高了14.2％。综合以上，可以看出突变酶显著提高了酶活力，对于纤维素结晶多糖部分的降解效果明显。

序列表

<110> 浙江工业大学、浙江华康药业股份有限公司

<120> 一种内切葡聚糖苷酶突变体、基因、工程菌及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 238

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

Met Lys Ile Tyr Asn Tyr Leu Val Val Gly Ile Phe Gly Pro Leu Ala

1 5 10 15

Leu Ala Gln Ser Leu Cys Asp Gln Tyr Gly Tyr Tyr Ala Gln Ala Gly

20 25 30

Tyr Tyr Phe Asn Asn Asn Arg Trp Gly Gln Gly Ser Gly Gln Gly Ser

35 40 45

Gln Cys Leu Thr Val Ser Trp Ala Asn Ser Asp Gly Val Gly Trp Lys

50 55 60

Thr Asp Trp Thr Trp Ser Gly Ser Pro Asn Asn Val Lys Ser Tyr Pro

65 70 75 80

Tyr Ser Gly Ile Thr Met Ser Asn Lys Leu Leu Val Ser Gln Ile Gly

85 90 95

Tyr Leu Gly Thr Ser Ala Ser Trp Gln Tyr Ser Asn Thr Asn Ile Arg

100 105 110

Ala Asn Val Ala Tyr Asp Leu Phe Thr Ala Ala Asp Pro Arg His Asp

115 120 125

Pro Ser Ser Gly Asp Tyr Glu Leu Met Ile Trp Leu Gly Arg Phe Gly

130 135 140

Asp Ile Gln Pro Ile Gly Ser Ser Gln Gly Arg Val Thr Val Gly Ser

145 150 155 160

Arg Ser Trp Asp Leu Trp Tyr Gly Val Asn Asn Gly Met Arg Ile Tyr

165 170 175

Ser Phe Val Ala Ser Ser Pro Ile Ser Gln Phe Asn Glu Asp Val Lys

180 185 190

Pro Phe Phe Thr Tyr Leu Gln Asn Ser Arg Gly Phe Pro Ala Ser Ser

195 200 205

Gln Tyr Leu Ile Thr Phe Gln Phe Gly Thr Glu Pro Phe Thr Gly Gly

210 215 220

Pro Thr Thr Phe Thr Val Ser Asn Trp Asn Ala Lys Val Asn

225 230 235

<210> 2

<211> 717

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

atgaagattt ataactatct tgtcgtgggc atttttggcc ctctagccct tgctcagtct 60

ctatgtgacc agtacggcta ctatgcccag gcaggctatt acttcaataa caaccgctgg 120

ggccagggat ccggccaggg ctcgcaatgc ctaaccgtga gctgggccaa cagcgatggt 180

gttggttgga aaacggattg gacgtggtca ggcagcccca acaatgtcaa gtcctacccg 240

tactcgggaa tcaccatgtc caataagctt ctggttagcc aaattggcta cttgggaaca 300

tctgccagct ggcagtacag taataccaat atccgcgcca acgtcgcgta cgacctcttc 360

actgcggcgg acccgagaca cgaccctagc agtggtgatt atgaactaat gatttggctc 420

ggaaggtttg gggacatcca gcccattgga agctcgcaag gcagagtcac agtgggaagc 480

cgcagttggg atctgtggta tggggtcaat aacgggatga gaatctacag tttcgtggct 540

tccagcccta tttcacagtt caacgaggac gtcaagccct ttttcaccta tcttcaaaac 600

tcgagggggt tccctgccag cagccagtac cttataacct ttcagtttgg cacggaacct 660

ttcacgggtg gcccgaccac gttcaccgtc tccaattgga acgccaaggt gaactga 717

<210> 3

<211> 238

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

Met Lys Ile Tyr Asn Tyr Leu Val Val Gly Ile Phe Gly Pro Leu Ala

1 5 10 15

Leu Ala Gln Ser Leu Cys Asp Gln Tyr Gly Tyr Tyr Ala Gln Ala Gly

20 25 30

Tyr Tyr Phe Asn Asn Asn Arg Trp Gly Gln Gly Ser Gly Gln Gly Ser

35 40 45

Gln Cys Leu Thr Val Ser Trp Ala Asn Ser Asp Gly Val Gly Trp Lys

50 55 60

Thr Asp Trp Thr Trp Ser Gly Ser Pro Asn Asn Val Lys Ser Tyr Pro

65 70 75 80

Tyr Ser Gly Ile Thr Met Ser Asn Lys Leu Leu Val Ser Gln Ile Gly

85 90 95

Tyr Leu Gly Thr Ser Ala Ser Trp Gln Tyr Ser Asn Thr Asn Ile Arg

100 105 110

Ala Asn Val Ala Tyr Asp Leu Phe Thr Ala Ala Asp Pro Arg His Asp

115 120 125

Pro Ser Ser Gly Asp Tyr Glu Leu Met Ile Trp Leu Gly Arg Phe Gly

130 135 140

Asp Ile Gln Pro Ile Gly Ser Ser Gln Gly Arg Val Thr Val Gly Ser

145 150 155 160

Arg Ser Trp Asp Leu Trp Tyr Gly Val Asn Asn Gly Met Arg Ile Tyr

165 170 175

Ser Phe Val Ala Ser Ser Pro Ile Ser Gln Phe Asn Glu Asp Val Lys

180 185 190

Pro Phe Phe Thr Tyr Leu Gln Asn Ser Lys Gly Phe Pro Ala Ser Ser

195 200 205

Gln Tyr Leu Ile Thr Phe Gln Phe Gly Thr Glu Pro Phe Thr Gly Gly

210 215 220

Pro Thr Thr Phe Thr Val Ser Asn Trp Asn Ala Lys Val Asn

225 230 235

<210> 4

<211> 711

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

atgaaaattt ataattattt agttgttggt atttttggtc ctttagcttt agctcaatct 60

ttatgtgatc aatatggtta ttatgctcaa gctggttatt attttaataa taatcgttgg 120

ggtcaaggtt ctggtcaagg ttctcaatgt ttaactgttt cttgggctaa ttctgatggt 180

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tctgcttctt ggcaatattc taatactaat attcgtgcta atgttgctta tgatttattt 360

actgctgctg atcctcgtca tgatccttct tctggtgatt atgaattaat gatttggtta 420

ggtcgttttg gtgatattca acctattggt tcttctcaag gtcgtgttac tgttggttct 480

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tcttctccta tttctcaatt taatgaagat gttaaacctt tttttactta tttacaaaat 600

tctaaatttc ctgcttcttc tcaatattta attacttttc aatttggtac tgaacctttt 660

actggtggtc ctactacttt tactgtttct aattggaatg ctaaagttaa t 711

Claims

1.一种内切葡聚糖苷酶突变体，其特征在于所述内切葡聚糖苷酶突变体是将SEQ IDNo.3所示氨基酸序列第202位的赖氨酸突变为精氨酸。

2.一种权利要求1所述内切葡聚糖苷酶突变体的编码基因，其特征在于所述编码基因核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。

3.一种包含权利要求2所述编码基因的重组载体。

4.一种包含权利要求3所述重组载体的重组基因工程菌。

5.一种权利要求1所述内切葡聚糖苷酶突变体在降解纤维素中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述纤维素包括羧甲基纤维素钠、WhatmanNo.1滤纸、细菌微晶纤维素或玉米芯；所述玉米芯是将干燥的玉米芯废渣用质量浓度12％KOH水溶液在70℃浸泡12h后，用清水洗涤至pH9以下，冷冻干燥制成。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：以纤维素为底物，以含内切葡聚糖苷酶突变体基因的工程菌经发酵培养后的上清液或上清液提取的纯酶为催化剂，在pH3.5-8.0的缓冲液中构成反应体系，在45-90℃、500rpm反应12-96h，向反应液中添加纤维素酶，继续反应2h，然后煮沸终止反应，离心，取上清液，获得降解后的纤维素；所述纤维素酶由100mg/mL外切葡聚糖苷酶无菌水溶液与100mg/mLβ-葡萄糖苷酶无菌水溶液以体积比3:1混合而成，其中外切葡聚糖苷酶的酶活为0.13U/mg，β-葡萄糖苷酶的酶活为4U/mg。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述底物加入终浓度为5-30mg/mL，所述催化剂加入量为10-50U/mL，所述纤维素酶加入终浓度为1-10mg/mL。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：将含内切葡聚糖苷酶突变基因的工程菌接种至YPD培养基，30℃培养24h，然后以体积浓度1％接种量转接到含体积浓度1％甘油的BMGY培养基，30℃培养16～20h，4000rpm离心10min，弃上清，菌体沉淀重悬于BMMY培养基中，30℃培养，每24h添加甲醇至体积终浓度为1％，诱导5天后，12000rpm离心30min，收集上清液；将上清液用孔径0.22μm水系膜过滤，用Ni²⁺螯合琼脂糖树脂柱进行蛋白纯化，分别用含30、50、100、500mM咪唑的pH7.4磷酸缓冲液进行梯度洗脱，收集含100mM咪唑的pH7.4磷酸缓冲液洗脱时的流出液，用10kDa的超滤管过滤后，再用MilliQwater洗涤一次，获得内切葡聚糖苷酶纯酶。