CN114921441B - 一种适配中药预处理糖化的β-葡聚糖酶构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种适配中药预处理糖化的β‑葡聚糖酶构建方法，属于基因工程技术领域。此β‑葡聚糖酶能够在20％的1‑乙基‑3‑甲基咪唑醋酸钠的缓冲液中保留至少81.3％的酶活性，其可以与1‑乙基‑3‑甲基咪唑醋酸钠共同处理纤维素，为纤维素的水解研究和实践打下基础。

Description

一种适配中药预处理糖化的β-葡聚糖酶构建方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种适配中药预处理糖化的β-葡聚糖酶构建方法。
背景技术
β-葡聚糖属植物细胞壁中的结构性非淀粉多糖，是以右旋葡萄糖为基本单位，属于多糖类中的同多糖类，具有线型的空间结构，存在于禾谷类(大麦、燕麦、黑麦和小麦)的糊粉层和胚乳细胞壁中。β-葡聚糖酶对β-葡聚糖具有重要的水解作用，能使其降解为低分子量片段。广义而言，β-葡聚糖酶是指一切能分解β-糖苷键链成的葡萄糖聚合物的酶系，均属于半纤维素酶类。按作用方式不同，β-葡聚糖酶可分为内切和外切两类。包括纤维素酶、昆布多糖酶、β-葡聚糖昔酶、内切β-1，3-葡聚糖酶、外切β-1，3-葡聚糖、内切β-1，2-葡聚糖酶、内切β-1，3-1，4-葡聚糖酶、外切β-1，4-葡聚糖酶和内切β-1，6-葡聚糖酶。在所有这些酶中以β-1，3-1，4-葡聚糖酶最为活跃。
由于中药材中含有大量的纤维素，而且纤维素高度结晶，高度结晶的纤维素限制了纤维素酶的作用。破坏纤维素酶的晶体结构，成为提高纤维素酶降解中药纤维素的关键。
利用1-乙基-3-甲基咪唑醋酸钠溶液预处理结晶态的纤维素，成为一种较为绿色、安全、高效的方法。开发与之匹配的β-葡聚糖酶，使酶在1-乙基-3-甲基咪唑醋酸钠溶液中具有较高的活性，具有重要的意义。对提高中药纤维素糖化效率，降低成本，增加附加值具有实际意义。
因此，如何提供一种适配中药预处理糖化的β-葡聚糖酶构建方法是本领域亟待解决的问题。
发明内容
本发明公开了一种适配中药预处理糖化的β-葡聚糖酶构建方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种β-葡聚糖酶，氨基酸序列为与SEQ ID NO.1具有80％或以上同一性的氨基酸序列；
优选的，所述氨基酸序列为与SEQ ID NO.1具有85％、90％、95％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列；
更优选的，所述氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
做为更优选的技术方案，所述β-葡聚糖酶在SEQ ID NO.1氨基酸序列存在选自以下突变的一种或多种：
F179K、S187L、S208A或F222L；
优选的，所述突变为F179K、S187L、S208A和F222L；
优选地，所述氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
一种β-葡聚糖酶基因，基因序列能够转录产生权利要求1或2所涉及氨基酸序列；
优选的，179K位为AAG，187L为TTG，208A位为GCT，222L为TTG；
做为更优选的技术方案，如上所述β-葡聚糖酶的相关生物材料，为下述(1)-(5)中的至少一种；
(1)编码β-葡聚糖酶的核酸分子；
(2)含有(1)所述核酸分子的表达盒；
(3)含有(1)所述核酸分子的重组载体或含有(2)所述表达盒的核酸分子的重组载体；
(4)含有(1)所述核酸分子的重组微生物、含有(2)所述表达盒的核酸分子的重组微生物或含有(3)所述重组载体的重组微生物；
(5)含有(1)所述核酸分子的植物细胞系、植物组织或植物器官，含有(2)所述表达盒的核酸分子的植物细胞系、植物组织或植物器官，含有(3)所述重组载体的植物细胞系、植物组织或植物器官；
(6)含有(1)所述核酸分子的动物细胞系、动物组织或动物器官，含有(2)所述表达盒的核酸分子的动物细胞系、动物组织或动物器官，含有(3)所述重组载体的动物细胞系、动物组织或动物器官；
一种试剂盒，包括上述的β-葡聚糖酶、上所述的β-葡聚糖酶基因或上述的相关生物材料一种或多种；
一种合成系统，能够自动合成上述的β-葡聚糖酶、上述的β-葡聚糖酶基因或上述的相关生物材料；
一种检查系统，能够检测上述合成的β-葡聚糖酶、β-葡聚糖酶基因或相关生物材料的正确性。
如上所述的β-葡聚糖酶、β-葡聚糖酶基因或相关生物材料在制备降解纤维素制剂中的应用；
优选的，所述纤维素为中药纤维素；
优选的，降解纤维素的溶剂为含有1-乙基-3-甲基咪唑醋酸钠的溶液；
优选的，所述含有1-乙基-3-甲基咪唑醋酸钠的溶液中1-乙基-3-甲基咪唑醋酸钠质量百分比为20％。
检测F179K、S187L、S208A和F222L或其基因相关突变的产品在制备检测上述的β-葡聚糖酶、β-葡聚糖酶基因中的应用。
一种适配中药预处理糖化的β-葡聚糖酶构建方法，利用上述的β-葡聚糖酶基因或上述的相关生物材料构建所述β-葡聚糖酶。
综上所述，本发明公开了一种适配中药预处理糖化的β-葡聚糖酶构建方法，此β-葡聚糖酶能够在20％的1-乙基-3-甲基咪唑醋酸钠的缓冲液中保留至少81.3％的酶活性，在其可以与1-乙基-3-甲基咪唑醋酸钠共同处理纤维素，为纤维素的水解研究和实践打下基础。
附图说明
图1为成功连接的质粒，命名为PIC9K-bgl(pPIC9K-AaBglu12A)。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
菌种、质粒、试剂
E.coli BL21(DE3)菌株购自北京百奥莱博科技有限公司；质粒PIC9K、GS115购自丰晖生物。
琼脂糖、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、乙二胺四乙酸、核酸染料4S Green、甘氨酸、十二烷基硫酸钠、溴酚蓝、甘油、二硫苏糖醇、考马斯亮蓝G250、无水乙醇、冰醋酸、丙烯酰胺、N，N-亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸铵、N，N，N，N-四甲基乙二胺、蔗糖、甘油、异丙基-beta-D-硫代半乳糖吡喃糖苷、咪唑均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；
卡那霉素购自赛国生物科技有限责任公司；酵母提取物、蛋白胨、色谱级甲醇、蛋白Marker购自赛默飞世尔科技公司；核酸Marker购自安诺伦(北京)生物科技有限公司；联苯，对羟基联苯购自阿拉丁集团。一般化学试剂氯化钠，氯化钙购自国药集团有限公司。β-葡聚糖购自上海鼓臣生物技术有限公司。
2xTaq Plus PCR MasterMix试剂盒、质粒小量提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。
EcoR I和NotI限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自NEB公司。
Ni-NTA纯化介质购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
DNS试剂(上海源叶生物科技有限公司)
β-葡聚糖酶基因合成
全合成β-葡聚糖酶的编码序列，带有EcoRI和NotI限制性酶切位点，合成序列如下：
GAATTCATGAAGTTGGCTGTCACTTTGTCTATGCTTGCCGCCACTGCTATGGGTCAAACCATGTGTTCTCAGTATGACAGTGCTTCCTCTCCCCCCTATTCTGTCAACCAAAATCTTTGGGGAGAATACCAAGGTACGGGAAGTCAGTGTGTTTATGTTGACAAGTTGTCTTCATCTGGTGCTTCTTGGCACACTAAGTGGACATGGTCAGGTGGAGAAGGTACCGTCAAGAGTTACTCTAATTCAGGTTTAACCTTTGACAAGAAGCTAGTTTCCGACGTTTCATCCATCCCTACATCAGTAAAGTGGTCACAAGACGACACAAACGTTCAAGCCGATGTCTCATACGACTTATTCACTGCTGCTAACGCAGATCATGCTACTTCTTCTGGTGATTACGAATTGATGATTTGGTTGGCTAGATATGGCACAGTGCAACCAATAGGAAAGCAAATTGCTACCGCCACAGTGGGTGGTAAGTCTTGGGAAGTTTGGTATGGTACATCCGTACAAGCCGGAGCCGAGCAAAAGACCTATAAGTTTGTTGCTGGTTCTCCAATAAACTTGTATTCTGGTGATATTAAAGATTTTTTTAATTACCTGACTCAAAACCAGGGATTTCCCGCTGCTTCTCAACACCTTATCACTCTACAATTTGGAACCGAACCCTTGACTGGCGGACCAGCAACATTCACCGTCGATAACTGGACAGCCTCTGTTAATGCGGCCGC(SEQ ID NO.4)。
其编码的氨基酸序列(SEQ ID NO.3)如下：
MKLAVTLSMLAATAMGQTMCSQYDSASSPPYSVNQNLWGEYQGTGSQCVYVDKLSSSGASWHTKWTWSGGEGTVKSYSNSGLTFDKKLVSDVSSIPTSVKWSQDDTNVQADVSYDLFTAANADHATSSGDYELMIWLARYGTVQPIGKQIATATVGGKSWEVWYGTSVQAGAEQKTYSKVAGSPINLYSGDIKDFFNYLTQNQGFPAASQHLITLQFGTEPLTGGPATFTVDNWTASVN。
PIC9K载体的获取
将从公司购买的保存有质粒PIC9K的大肠杆菌在含卡那霉素的LB培养基进行活化，传代培养，当OD值达到1.0左右时，使用质粒小量提取试剂盒进行质粒提取(提取步骤按说明书进行)，获得PIC9K表达载体，进行下一步酶切反应。
质粒构建
合成β-葡聚糖酶基因并获得PIC9K表达载体后，分别在PCR小管中加入双蒸水、内切酶缓冲液、酶切底物、限制性内切酶(购自NEB公司的EcoR I和Not I，使用规格和方法按说明书进行)，进行双酶切反应，加入顺序从多到少。目的基因和PIC9K置于37℃下分别进行双酶切。
bgl基因片段双酶切体系：超纯水11μL，EcoRI 1μL，NotI 1μL，Buffer 3μL，bgl目的基因14μL。
PIC9K双酶切体系：PIC9K质粒43μL，Not I 1μL，EcoRI 1μL，Buffer 5μL。
使用Not I和EcoR I限制性内切酶在37℃下进行双酶切反应3h后，加入LoadingBuffer终止反应，并根据天根生化科技有限公司生产的胶回收试剂盒说明书纯化、回收双酶切产物。
经过相同的限制性内切酶切割后，双酶切产物具有相同的粘性末端，可以通过DNA连接酶连接成完整的质粒。将含有相同粘性末端的bgl基因和PIC9K双酶切产物置于同一个PCR小管中，连接反应采用10μL体系：将3μL目的基因酶切产物，1μL PIC9K质粒酶切产物，1μL T4 DNA连接酶(购自NEB公司)和5μL超纯水混匀，在16℃下连接过夜。将成功连接的质粒命名为PIC9K-bgl(pPIC9K-AaBglu12A)，载体图谱见图1。
转化
1、毕赤酵母GS115感受态细胞的制备
(1)挑取酵母单菌落，接种至含有5mlYPD液体培养基试管中，30℃，每分钟250转的摇床里过夜培养；
(2)次日，吸取1％(50I.t1)的过夜培养液至含有50mlYPD的250ml三角摇中，30℃，250转的摇床里接着培养约20个小时，至OD600--1.3～1.5；
(3)将菌液转入到50ml离心管罩，4℃15000离心5min，弃上清；
(4)用50ml在冰上预冷的灭菌蒸馏水将菌体沉淀重悬，同上离心，弃上清；
(5)用25ml在冰上预冷的灭菌蒸馏水将菌体沉淀重悬，同上离心，弃上清；
(6)用5ml冰预冷的1M山梨醇将菌体沉淀重悬，同上离心，弃上清；
(7)加入150-200μL冰预冷的1M山梨醇重悬细胞，分装每管800μL。
注)以上操作均在冰上完成；感受态细胞最好是先做现用；也可把感受态冻存，但转化效率会下降很多。
(2)重组质粒的线性化
将提取出来的重组表达质粒经内切酶SacI线性化处理。对空质粒进行同样的酶切处理作为对照，酶切反应体系如下：
重组质粒15μL，10×LBuffer 5μL，SacI 2.5μL，加灭菌水到50μL；
37℃酶切2.5小时。
反应结束后，进行0.8％琼脂糖电泳(90V、30min)，同时使用Middle DNAMarkerI观察酶切结果。使用takara公司的琼脂糖DNA纯化试剂盒进行纯化回收。
(2)转化将连接产物转化到毕赤酵母GS115感受态细胞中，转化步骤如下：
(a)取一管(8091)上述感受态细胞与10pl经SacI线性化处理且纯化回收到的重组表达质粒(约5-20pg)混匀，转入到预冷的0.2cm电击杯中(电转化杯事先紫外照射半小时以上并且预冷，用前先擦干)，轻敲杯壁，使混合液沉于杯底；
(b)在冰上放置5min：
(c)设置电击参数：电压1.5KV、电容25pF、电阻200f2：
(d)将电转化杯置于电转化仪中，进行电击；
(e)电击完毕后，立即加入lml预冷的1M山梨醇，将混合液轻微转移到预冷的无菌离心管中；
(f)涂布于MD平板上，30℃培养3-4天，直到有转化子出现。
β-葡聚糖酶在毕赤酵母中高拷贝转化子的筛选
异源表达
将单菌落挑取至BMGY培养基，然后在30℃，以200rpm在恒温摇床上培养至细胞密度0D600＝2.0-6.0。在室温下，通过以3000xg离心5min收集菌体，然后加入BMMY培养基重悬。每隔24h添加甲醇至0.5％的终浓度进行诱导，诱导3天，得到发酵液。
蛋白纯化
β-葡聚糖酶AaBglu12A的纯化将发酵所得的发酵液以10，000xg离心10min，收集上清液。将所得上清液在4℃对20mM，pH 8.0的Tris-HCl缓冲液透析过夜。透析结束后，将透析液以10，000xg离心10min，并收集所得上清液用于进一步纯化。通过Q-Sepharose强阴离子交换色谱法对β-葡聚糖酶进行纯化，其基本纯化步骤如下所述：用2个柱体积的20mM，pH8.0的Tris-HCl缓冲液平衡Q-S epharose色谱柱(10x50 mm)，以0.5mL/min的流速将粗酶液上样至该色谱柱。.上样结束后，以1mL/min的洗脱流速，用相同缓冲液冲洗5个柱体积，然后以0.500mMNaCl溶液(溶于20mMpH8.0的Tris-HCl缓冲液)的线性梯度洗脱12个柱体积，对各个部分测定酶活力，并将具有可测定酶活力的部分合并收集。整个纯化过程在AKTA FPLC系统上进行。将所收集的部分在4℃，对柠檬酸柠檬酸钠缓冲液透析过夜，得到透析后的酶液。
蛋白含量测定
蛋白含量用BCAProtein ContentAssayKit(BCA法蛋白含量检测试剂盒，北京盒子生工科技有限公司)检测，检测方法如下：
(1)样品稀释：将样品按适当倍数稀释；
(2)BCA工作液的制备：根据使用量按BCA Solution：Copper Solution＝50：1(V：V)配制为BCA。
(3)蛋白标准稀释液的制备：取100μL BSA Standard Solution使用PBS Diluent稀释至1000μL，即为0.5mg/mL蛋白标准稀释液。使用0.5mg/mL蛋白标准稀释液，按表1进行梯度稀释。
表1
编号 1 2 3 4 5 6
蛋白标准稀释液(μL) 0 40 80 120 160 200
PBSDiluent(μL) 200 160 120 80 40 0
蛋白终浓度(mg/mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
吸光值测定：测定562nm处测定管和标准管吸光值，记为A测定和A标准。标准曲线的制备及使用：以0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL为横坐标(x)，对应的A标准为纵坐标(y)，得到线性回归方程，将A测定带入公式中计算x(mg/mL)，乘以相应稀释倍数即为样品蛋白浓度。酶液的蛋白质浓度值计为C(mg/mL)，用于计算葡聚糖酶的比活力。
β-葡聚糖酶酶活的测定方法
发酵液使用未添加1-乙基-3-甲基咪唑醋酸钠的缓冲液稀释一倍，具体方法为：
β-葡聚糖酶活性测定采用3，5一二硝基水杨酸(DNS)法：发酵液3000g离心10min取上清液用磷酸缓冲液(pH6.0，磷酸二氢钠121.03g/L，磷酸氢二钠18.89g/L)稀释，取0.lml加入0.9ml预先在50℃水浴中准确保温10min的底物溶液(2mg/ml地衣多糖，pH6.0磷酸缓冲液)中，50℃准确反应10min加入l.5mlDNS沸水浴5min，用冷水快速冷却，在751GW分光光度计测定OD值，波长520nm。酶单位定义为：在50℃，pH6.0条件下每分钟从底物中释放1μmol还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量为一个酶活单位(U)。测定的酶活为65.00U/mL，酶活记为A。
发酵液稀释时候，向缓冲液中加入1-乙基-3-甲基咪唑醋酸钠使其终浓度为20％，具体方法为：
发酵液3000g离心10min取上清液用1-乙基-3-甲基咪唑醋酸钠磷酸缓冲液(pH6.0，1-乙基-3-甲基咪唑醋酸钠200g/L，磷酸二氢钠121.03g/L，磷酸氢二钠18.89g/L)稀释，取0.lml加入0.9ml预先在50℃水浴中准确保温10min的底物溶液(2mg/ml地衣多糖，pH6.0磷酸缓冲液)中，50℃准确反应10min加入l.5mlDNS沸水浴5min，用冷水快速冷却，在751GW分光光度计测定OD值，波长520nm。酶单位定义为：在50℃，pH6.0条件下每分钟从底物中释放1μmol还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量为一个酶活单位(U)。测定的酶活记为62.40U/mL，酶活计为B。
计算得到B/A为96％，说明改造的β-葡聚糖酶在20％1-乙基-3-甲基咪唑醋酸钠保留了96％的酶活性，
实施例2
β-葡聚糖酶的编码序列如下(SEQ ID NO.2)：
GAATTCATGAAGTTGGCTGTCACTTTGTCTATGCTTGCCGCCACTGCTATGGGTCAAACCATGTGTTCTCAGTATGACAGTGCTTCCTCTCCCCCCTATTCTGTCAACCAAAATCTTTGGGGAGAATACCAAGGTACGGGAAGTCAGTGTGTTTATGTTGACAAGTTGTCTTCATCTGGTGCTTCTTGGCACACTAAGTGGACATGGTCAGGTGGAGAAGGTACCGTCAAGAGTTACTCTAATTCAGGTTTAACCTTTGACAAGAAGCTAGTTTCCGACGTTTCATCCATCCCTACATCAGTAAAGTGGTCACAAGACGACACAAACGTTCAAGCCGATGTCTCATACGACTTATTCACTGCTGCTAACGCAGATCATGCTACTTCTTCTGGTGATTACGAATTGATGATTTGGTTGGCTAGATATGGCACAGTGCAACCAATAGGAAAGCAAATTGCTACCGCCACAGTGGGTGGTAAGTCTTGGGAAGTTTGGTATGGTACATCCGTACAAGCCGGAGCCGAGCAAAAGACCTATAGTTTTGTTGCTGGTTCTCCAATAAACTCATATTCTGGTGATATTAAAGATTTTTTTAATTACCTGACTCAAAACCAGGGATTTCCCGCTAGTTCTCAACACCTTATCACTCTACAATTTGGAACCGAACCCTTCACTGGCGGACCAGCAACATTCACCGTCGATAACTGGACAGCCTCTGTTAATGCGGCCGC；
其所编码的氨基酸序列如下(SEQ ID NO.1)：
MKLAVTLSMLAATAMGQTMCSQYDSASSPPYSVNQNLWGEYQGTGSQCVYVDKLSSSGASWHTKWTWSGGEGTVKSYSNSGLTFDKKLVSDVSSIPTSVKWSQDDTNVQADVSYDLFTAANADHATSSGDYELMIWLARYGTVQPIGKQIATATVGGKSWEVWYGTSVQAGAEQKTYSFVAGSPINSYSGDIKDFFNYLTQNQGFPASSQHLITLQFGTEPFTGGPATFTVDNWTASVN。
其余步骤同实施例1。
根据实施例1的检测方法，测定得到β-葡聚糖酶在含20％的1-乙基-3-甲基咪唑醋酸钠的缓冲溶液中酶活47.25U/mL，在无1-乙基-3-甲基咪唑醋酸钠缓冲溶液中的57.50U/mL，B2/A2＝81.3％，β-葡聚糖酶在20％1-乙基-3-甲基咪唑醋酸钠保留了81.3％的酶活性。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 中农华威生物制药（湖北）有限公司
<120> 一种适配中药预处理糖化的β-葡聚糖酶构建方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 239
<212> PRT
<213> Artificial
<400> 1
Met Lys Leu Ala Val Thr Leu Ser Met Leu Ala Ala Thr Ala Met Gly
1 5 10 15
Gln Thr Met Cys Ser Gln Tyr Asp Ser Ala Ser Ser Pro Pro Tyr Ser
20 25 30
Val Asn Gln Asn Leu Trp Gly Glu Tyr Gln Gly Thr Gly Ser Gln Cys
35 40 45
Val Tyr Val Asp Lys Leu Ser Ser Ser Gly Ala Ser Trp His Thr Lys
50 55 60
Trp Thr Trp Ser Gly Gly Glu Gly Thr Val Lys Ser Tyr Ser Asn Ser
65 70 75 80
Gly Leu Thr Phe Asp Lys Lys Leu Val Ser Asp Val Ser Ser Ile Pro
85 90 95
Thr Ser Val Lys Trp Ser Gln Asp Asp Thr Asn Val Gln Ala Asp Val
100 105 110
Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Ala Ala Asn Ala Asp His Ala Thr Ser Ser
115 120 125
Gly Asp Tyr Glu Leu Met Ile Trp Leu Ala Arg Tyr Gly Thr Val Gln
130 135 140
Pro Ile Gly Lys Gln Ile Ala Thr Ala Thr Val Gly Gly Lys Ser Trp
145 150 155 160
Glu Val Trp Tyr Gly Thr Ser Val Gln Ala Gly Ala Glu Gln Lys Thr
165 170 175
Tyr Ser Phe Val Ala Gly Ser Pro Ile Asn Ser Tyr Ser Gly Asp Ile
180 185 190
Lys Asp Phe Phe Asn Tyr Leu Thr Gln Asn Gln Gly Phe Pro Ala Ser
195 200 205
Ser Gln His Leu Ile Thr Leu Gln Phe Gly Thr Glu Pro Phe Thr Gly
210 215 220
Gly Pro Ala Thr Phe Thr Val Asp Asn Trp Thr Ala Ser Val Asn
225 230 235
<210> 2
<211> 731
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
gaattcatga agttggctgt cactttgtct atgcttgccg ccactgctat gggtcaaacc 60
atgtgttctc agtatgacag tgcttcctct cccccctatt ctgtcaacca aaatctttgg 120
ggagaatacc aaggtacggg aagtcagtgt gtttatgttg acaagttgtc ttcatctggt 180
gcttcttggc acactaagtg gacatggtca ggtggagaag gtaccgtcaa gagttactct 240
aattcaggtt taacctttga caagaagcta gtttccgacg tttcatccat ccctacatca 300
gtaaagtggt cacaagacga cacaaacgtt caagccgatg tctcatacga cttattcact 360
gctgctaacg cagatcatgc tacttcttct ggtgattacg aattgatgat ttggttggct 420
agatatggca cagtgcaacc aataggaaag caaattgcta ccgccacagt gggtggtaag 480
tcttgggaag tttggtatgg tacatccgta caagccggag ccgagcaaaa gacctatagt 540
tttgttgctg gttctccaat aaactcatat tctggtgata ttaaagattt ttttaattac 600
ctgactcaaa accagggatt tcccgctagt tctcaacacc ttatcactct acaatttgga 660
accgaaccct tcactggcgg accagcaaca ttcaccgtcg ataactggac agcctctgtt 720
aatgcggccg c 731
<210> 3
<211> 239
<212> PRT
<213> Artificial
<400> 3
Met Lys Leu Ala Val Thr Leu Ser Met Leu Ala Ala Thr Ala Met Gly
1 5 10 15
Gln Thr Met Cys Ser Gln Tyr Asp Ser Ala Ser Ser Pro Pro Tyr Ser
20 25 30
Val Asn Gln Asn Leu Trp Gly Glu Tyr Gln Gly Thr Gly Ser Gln Cys
35 40 45
Val Tyr Val Asp Lys Leu Ser Ser Ser Gly Ala Ser Trp His Thr Lys
50 55 60
Trp Thr Trp Ser Gly Gly Glu Gly Thr Val Lys Ser Tyr Ser Asn Ser
65 70 75 80
Gly Leu Thr Phe Asp Lys Lys Leu Val Ser Asp Val Ser Ser Ile Pro
85 90 95
Thr Ser Val Lys Trp Ser Gln Asp Asp Thr Asn Val Gln Ala Asp Val
100 105 110
Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Ala Ala Asn Ala Asp His Ala Thr Ser Ser
115 120 125
Gly Asp Tyr Glu Leu Met Ile Trp Leu Ala Arg Tyr Gly Thr Val Gln
130 135 140
Pro Ile Gly Lys Gln Ile Ala Thr Ala Thr Val Gly Gly Lys Ser Trp
145 150 155 160
Glu Val Trp Tyr Gly Thr Ser Val Gln Ala Gly Ala Glu Gln Lys Thr
165 170 175
Tyr Ser Lys Val Ala Gly Ser Pro Ile Asn Leu Tyr Ser Gly Asp Ile
180 185 190
Lys Asp Phe Phe Asn Tyr Leu Thr Gln Asn Gln Gly Phe Pro Ala Ala
195 200 205
Ser Gln His Leu Ile Thr Leu Gln Phe Gly Thr Glu Pro Leu Thr Gly
210 215 220
Gly Pro Ala Thr Phe Thr Val Asp Asn Trp Thr Ala Ser Val Asn
225 230 235
<210> 4
<211> 731
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 4
gaattcatga agttggctgt cactttgtct atgcttgccg ccactgctat gggtcaaacc 60
atgtgttctc agtatgacag tgcttcctct cccccctatt ctgtcaacca aaatctttgg 120
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tcttgggaag tttggtatgg tacatccgta caagccggag ccgagcaaaa gacctataag 540
tttgttgctg gttctccaat aaacttgtat tctggtgata ttaaagattt ttttaattac 600
ctgactcaaa accagggatt tcccgctgct tctcaacacc ttatcactct acaatttgga 660
accgaaccct tgactggcgg accagcaaca ttcaccgtcg ataactggac agcctctgtt 720
aatgcggccg c 731

Claims (5)

1.一种β-葡聚糖酶，其特征在于，所述β-葡聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.一种β-葡聚糖酶基因，其特征在于，基因序列能够转录产生权利要求1所涉及氨基酸序列；
179K位为AAG，187L为TTG，208A位为GCT，222L为TTG。
3.如权利要求1所述β-葡聚糖酶的相关生物材料，为下述(1)-(4)中的至少一种；
(1)编码β-葡聚糖酶的核酸分子；
(2)含有(1)所述核酸分子的表达盒；
(3)含有(1)所述核酸分子的重组载体或含有(2)所述表达盒的核酸分子的重组载体；
(4)含有(1)所述核酸分子的重组微生物、含有(2)所述表达盒的核酸分子的重组微生物或含有(3)所述重组载体的重组微生物。
4.如权利要求1所述的β-葡聚糖酶、权利要求2所述的β-葡聚糖酶基因或权利要求3所述的相关生物材料在制备降解纤维素制剂中的应用；
所述纤维素为中药纤维素；
降解纤维素的溶剂为含有1-乙基-3-甲基咪唑醋酸钠的溶液；
所述含有1-乙基-3-甲基咪唑醋酸钠的溶液中1-乙基-3-甲基咪唑醋酸钠质量百分比为20％。
5.一种适配中药预处理糖化的β-葡聚糖酶构建方法，其特征在于，
利用权利要求2所述的β-葡聚糖酶基因或权利要求3所述的相关生物材料构建所述β-葡聚糖酶。
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