CN110564713B - 一种纤维素内切酶的人工合成基因及其表达载体和蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种编码纤维素内切酶的人工合成基因，该基因至少含有下列核苷酸序列之一的DNA片：1)序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列；2)与SEQ ID No.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。按照本发明所述的基因序列进一步构建重组载体并转化酵母，可实现该重组纤维素内切酶在甲醇诱导下的分泌表达，通过镍亲和纯化，可得到纯度高于95％重组纤维素内切酶，该酶具有很强的将纤维素成分降解并产生葡萄糖的能力，将为分解纤维素并应用于饲料、纺织、食品和生物能源的生产提供高活力的重组酶。

Description

一种纤维素内切酶的人工合成基因及其表达载体和蛋白

技术领域

本发明属于生物分子克隆技术领域，涉及一种纤维素内切酶的人工合成基因及其表达载体和蛋白。

背景技术

纤维素是由葡萄糖以β-1，4糖苷键联接的n个D-吡喃型葡萄糖链构成的大分子多糖，通过氢键的缔合作用，形成纤维束，按分子密度大小分为结晶区和无定形区，其中天然纤维素中主要为结晶纤维素。纤维素是构成植物细胞壁的重要组分，也是目前地球上含量最丰富的可再生性资源。利用纤维素转化技术可生产生物燃料及其加工产品，但是目前纤维素的利用率还非常低，如何提高纤维素的利用率仍是一个世界级的课题。

纤维素的高效利用离不开降解纤维素相关的酶类。纤维素酶复合体是一种超分子结构的多酶蛋白复合体，由多个亚基构成。非复合体纤维素酶由内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶组成。非复合体纤维素酶主要由好氧的丝状真菌产生，它们是分解纤维素的最重要的酶源。纤维素酶能将纤维素类生物质转化为可发酵性糖，再结合发酵技术直接生产生物燃料，其具有技术成熟、效率高、环境友好等优点，成为了新能源研究领域的主要方向之一。

目前虽然发现产纤维素酶的生物群种很多，如细菌、真菌、放线菌及昆虫、软体动物等，但是随着纤维素酶在工、农、畜和医等领域都有广泛的需求，其需求量正日益增大，纤维素酶制剂供不应求，前景十分广阔。而我国的纤维素酶工业制备还处于研究开发阶段，纤维素酶的生产还存在纤维素酶活力较低，生产成本较高，生产周期较长等问题使得纤维素酶的应用受到限制，因此，需要克服纤维素酶大量生产的瓶颈。深入研究纤维素酶的作用机制，加强对纤维素酶的分子生物学研究，特别要充分利用DNA基因重组技术的应用，生产具有高酶活的重组蛋白。纤维素酶系包含内切酶、外切酶和糖苷转移酶3种酶。其中，纤维素内切酶对纤维素的分解起重要作用。目前市售纤维素酶都是各种酶的混合物，很少有利用基因工程手段获得大最高纯度和高活性的纤维素内切酶的相关产品和技术。研发高活力、廉价、大量的糖苷水解酶、纤维素内切酶和纤维素外切酶等纤维素酶工具是提高纤维素的利用率关键。

大肠杆菌的遗传背景清楚，又由于其具有周期短、高效率、易操作、使用安全等特点，成为外源基因的首选表达系统。不少研究者将昆虫神经毒素构建大肠杆菌表达载体，经转化E.coli在BL21(DE3)进行表达，但得到的都是无活性的包涵体，通过体外合适的条件下溶解、变性、复性、纯化，从每升培养基可得到仅能得到几十至上百微克的的可溶性蛋白质。在申请号为201811240264.9和201811281667.8中，以pET28和pET32为载体利用大肠杆菌系统对纤维素内切酶进行了表达并纯化得到一定量活性好的重组蛋白，但利用上述两种载体表达的蛋白都是胞内蛋白，纯化时需要先破碎菌体，纯化步骤比较麻烦且回收率较低。而且在大肠杆菌中表达，可能因为LPS的存在而产生毒性，因此往往需要对表达纯化产物的毒性进行分析测定。最后，要得到高纯度的蛋白往往需要经过多步纯化操作处理，纯化的步骤越多，蛋白质的得率就会越低，且更可能导致目标产物的失活。酵母是一种高效的外源基因表达体系，以Pichia pastoris(毕赤巴斯德酵母)为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。但每一种蛋白能否实现在酵母中的高水平分泌表达需要合适的基因序列、筛选高水平分泌表达的转化子、优化表达条件和建立高效的蛋白纯化方法。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于提供一种纤维素内切酶的人工合成基因及其表达载体和蛋白，还提供制备蛋白的方法与蛋白的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、本发明提供基因，为编码纤维素内切酶的基因，为如下(1)-(2)中任意一种的DNA分子：

(1)由序列表中SEQ ID No.1所示的DNA分子；

(2)与SEQ ID No.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；

进一步，与SEQ ID No.1所示核苷酸序列具有95％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；

进一步，与SEQ ID No.1所示核苷酸序列具有96％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；

进一步，与SEQ ID No.1所示核苷酸序列具有97％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；

进一步，与SEQ ID No.1所示核苷酸序列具有99％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；

其中，序列表中的序列1由1221个脱氧核苷酸组成，本序列包括纤维素内切酶基因的成熟蛋白全长读码框和6个组氨酸残基组成的表达标签、终止密码子及酶切位点，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质。

由上述序列表中的序列1编码得到的蛋白属于本发明的保护范围。

本发明提供蛋白，是如下(1)或(2)：

(1)由序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的由SEQ ID No.2衍生的蛋白质。

其中，序列表中的SEQ ID No.2由400个氨基酸残基组成，其中前396个氨基酸残基为成熟纤维素内切酶蛋白氨基酸序列，后6个氨基酸残基为组氨酸组成的表达标签，其编码基因的读码框包含1221个核苷酸。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

3、含有上述基因的重组载体、表达盒或重组菌也属于本发明的保护范围。

进一步，所述重组载体由空载体和插入该空载体的目的基因组成，具体为将上述基因合成后直接插入表达空载体中，得到表达上述蛋白的重组载体。

进一步，所述重组载体具体为将上述基因插入表达空载体pPICZαA的Xho I和XbaI酶切位点间，得到表达上述蛋白的重组载体。

4、本发明的第四个发明目的是提供一种制备纤维素内切酶蛋白的方法，包括以下步骤：

S1：将技术方案1所述的基因和表达载体pPICZαA分别用Xho I和Xba I双酶切并纯化回收，然后利用连接酶在16℃连接，得重组载体pPICZαA-纤维素内切酶；

S2：将所述重组载体pPICZαA-纤维素内切酶用Sac I单酶切线性化，并用氯化锂转化法转化到毕赤酵母宿主菌中，再经过Zeocin筛选得到阳性克隆；

S3：高水平表达纤维素内切酶转化子的筛选：将PCR验证后的毕赤酵母转化子划线接种至含有1200μg/mL Zeocin的YPD平板，筛选得到高Zeocin抗性的转化子，再用含有10mlBMGY培养液的50毫升离心管于28℃、250rpm条件下培养至OD600＝10左右，离心收集菌体并加入1.5ml的BMMY培养基，28℃、250rpm培养2天，每隔12小时向离心管中加入10μl的甲醇，诱导结束后，离心取上清液10μl用于SDS-PAGE检测，筛选得到高水平分泌表达重组纤维素内切酶蛋白的转化子。同时检测各转化子的酶活性，将10μl上清液加入到90μl含1％的CMC-Na的磷酸二氢钠与柠檬酸缓冲液中(pH＝4)，40℃下反应1小时；取反应后的样品10μl、2μl的浓度为10mmol/L NAD与ATP的混合液，补加水至总体积为95μl，室温下反应5min后，加入5μl浓度为2μmol/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温下反应3min后，于340nm测定吸光值。

S4：将高水平表达纤维素内切酶的转化子用BMGY大量生长培养，之后用BMMY培养基重悬细胞并在28℃继续诱导培养，用于大量分泌纤维素内切酶重组蛋白，并补加甲醇使其质量分数保持在1～1.5％。

进一步，将所述高表达纤维素内切酶的转化子用1L的BMGY培养基扩大培养至OD600为10～15，离心所得菌体用100ml的BMMY培养基重悬后，诱导培养用于大量分泌纤维素内切酶重组蛋白，诱导培养的条件是：28℃、250rpm、每隔24小时向离心管中加入1ml的甲醇，共诱导3-4天。

BMGY扩大生长培养后，一般以生长培养基1/10-1/5体积的诱导培养基BMMY来诱导培养。

优选地，在步骤S4之后，还包括纯化蛋白的如下步骤：

S5：将所述S4发酵后的培养液离心，取上清液利用Tris碱调节pH至7.5，以大于或等于15000g的转速离心30分钟，将获得的上清液加入到经pH 8 Tris-HCl缓冲液平衡后的镍亲合层析柱中，用2～4倍层析柱体积的pH 7.5的含10mM Tris-HCl和20mM咪唑的缓冲液漂洗所述镍亲合层析柱；

S6：用含10mM Tris-HCl和200mM咪唑的缓冲液洗脱所述镍亲合层析柱，将得到的洗脱液利用分子量为10kDa的透析袋于10mM Tris-HCl缓冲液中透析，然后超滤浓缩。

优选地，在步骤S5之后，还包括保存蛋白的如下步骤：

S7：将所述超滤浓缩得到的产品在-80℃下速冻，然后冷冻干燥。

根据上述任一种制备蛋白的方法制备得到的蛋白也属于本发明的保护范围。

通过步骤S3筛选得到的稳定且能高水平分泌表达纤维素内切酶的酵母转化子也属于本发明保护的范围。

上述蛋白、上述基因或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系也是本发明保护的范围。

本发明提供的技术方案具有以下优点：一是根据本技术方案所述的表达方法分泌表达和纯化得到的具有生物活性的重组纤维素内切酶能够有效防止宿主菌对表达产物的降解，减轻宿主细胞代谢的负荷和表达产物对宿主的毒性作用；二是利用酵母载体pPICZαA-纤维素内切酶上的分泌信号α-因子信号肽引导目的蛋白的基因分泌表达，目的蛋白会大量分泌到培养液中，且能形成准确的空间结构，从而保持纤维素内切酶的天然活性；三是通过筛选得到了稳定且能高水平分泌表达得纤维素内切酶的酵母转化子；四是摸索出用真核宿主毕赤酵母来表达纤维素内切酶的方法和快速高效纯化纤维素内切酶的方法，可以降低成本且实现大量生产；六是表达的重组蛋白可以利用镍亲合层析快速纯化，纯化的蛋白具有很强的水解纤维素的生物活性。

本发明通过优化基因首次利用毕赤外源基因表达系统制备了一种来源于茯苓的新颖重组纤维素内切酶。该重组纤维素内切酶的成功制备为下一步的产业化和用于分解纤维素等能源再利用奠定了前期基础。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为本发明实施例中的表达载体pPICZαA-纤维素内切酶构建示意图。

图2为本发明实施例中高Zeocin抗性纤维素内切酶的酵母转化子培养液上清的SDS-PAGE检测结果图。

图3为本发明实施例中在扩大培养条件下，不同时间点目标蛋白表达情况的SDS-PAGE检测结果图。

图4为本发明实施例中200mM咪唑洗脱纯化得到的纤维素内切酶蛋白的SDS-PAGE检测结果图。

图5为对比例酵母转化子上清液中的目标蛋白的SDS-PAGE检测结果图。

图6为本发明实施例中重组纤维素内切酶蛋白的生物学活性检测的薄层层析结果图。

图7为重组纤维素内切酶水解滤纸产生葡萄糖能力的HPLC检测结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

本发明选用毕赤酵母菌株和整合性表达质粒pPICZαA均购自美国Invritrogen公司。

所用培养基配方如下：

1)酵母生长培养基(BMGY)

完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，定容到800mL。121℃蒸气高压灭菌15-20min，冷却到室温，加入100mL 1M磷酸钾溶液，100mI YNB，2mL 500×生物素，20mL 50％灭菌甘油；

2)酵母诱导培养基(BMMY)

完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，定容到800mL。121℃蒸气高压灭菌15-20min，冷却到室温，加入100mL 1M磷酸钾溶液，100mL YNB，2mL500×生物素，10mL甲醇；

3)YPD培养基

完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，定容到900mL，121℃蒸气高压灭菌15-20min，冷却至70℃左右再加入100mL 20％灭菌葡萄糖溶液。在其中加入1.6-1.8％的琼脂可制得YPD固体培养基。

实施例1

本实施例提供了一种优化的人工合成的C-端带有6×His标签的纤维素内切酶基因，具体序列如序列表中的SEQ ID No.1所示，该基因所对应的蛋白质序列如序列表中的序列SEQ ID No.2所示。优化后的DNA序列经NCBI比对，没有明显相似性。

甲醇酵母表达系统是应用最广泛的酵母表达系统，以Pichia pastoris(毕赤巴斯德酵母)为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。酵母是单细胞低等真核生物，酵母表达系统与昆虫表达系统、哺乳动物表达系统相比，兼具两者优点，同时酵母表达系统具有操作简单，成本低廉，可大规模进行发酵等特点，因此是比较理想的重组真核蛋白质生产制备工具。酵母表达产物长期广泛地应用于食品工业，不产生毒素，安全性好，已被认定为安全性生物，其表达产物不需经过大量宿主安全性实验。但是也有不足，易产生不正确的蛋白糖基化，分泌效率低，对于30KD大小的蛋白不易表达。

将本发明根据纤维素内切酶基因自身序列特点和酵母密码子偏好性合成的SEQID No.1DNA序列连接至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA上，得到重组载体，然后利用Invitrogen公司操作手册提供的氯化锂转化法分别将重组载体转化到毕赤酵母宿主菌X-33中，转化后分别用含有100μg/mL Zeocin抗生素的YPD平板进行筛选，利用PCR对转化子进行验证，将PCR验证无误后的毕赤酵母转化子划线分别接种至终浓度为1200μg/mL Zeocin抗生素的YPD平板，分别筛选得高抗性的毕赤酵母转化子。将筛选得到高Zeocin抗性的转化子，用含有10ml BMGY培养液的50毫升离心管于28℃、250rpm条件下培养至OD₆₀₀＝10左右，离心收集菌体并加入1.5ml的BMMY培养基，28℃、250rpm培养2天，每隔12小时向离心管中加入10μl的甲醇，诱导结束后，离心取上清，离心取上清，取上清液10μl用于SDS-PAGE检测，分析目标蛋白的表达情况，结果观察到目标蛋白的大量表达。同时检测各转化子的酶活性，将10μl上清液加入到90μl含1％的CMC-Na的磷酸二氢钠与柠檬酸缓冲液中(pH＝4)，40℃下反应1小时；取反应后的样品10μl、2μl的浓度为10mmol/L NAD与ATP的混合液，补加水至总体积为95μl，室温下反应5min后，加入5μl浓度为2μmol/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温下反应3min后，于340nm测定吸光值，结果表明，SDS-PAGE检测到的高水平表达目标蛋白的转化子其上清液中也同样存在很高的酶活。说明利用本发明提供的序列和方法可以筛选到的转化子可以高水平地分泌表达目标蛋白。

实施例2

本实施例提供一种制备纤维素内切酶基因的方法，具体包括如下步骤：

S1：构建表达载体及转化：将实施例1的基因自身序列特点和酵母密码子偏好性合成的DNA序列表中SEQ ID No.1所示的DNA连接至毕赤酵母诱导型分泌型表达载体pPICZαA，得到重组载体pPICZαA-纤维素内切酶，载体构建如图1所示，图1为本发明实施例中的真核表达载体pPICZαA-纤维素内切酶构建示意图。主要的载体构建步骤优选如下：

(1)用Xho I和Xba I双酶切含合成的纤维素内切酶基因的人工合成质粒，获得目的片断，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司的限制酶产品)：

(2)用Xho I和Xba I双酶切pPICZαA，获得载体片断，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)：

(3)将步骤(1)和(2)得到的目的片断和载体片断用DNA凝胶收回试剂盒回收，该试剂盒购自大连TAKARA公司，具体操作按试剂盒说明书进行。

(4)将步骤(3)回收得到的目的片断和载体用T4DNA连接酶(购自大连TAKARA公司)进行连接反应，目的基因准确插入到含有分泌信号α-因子的分泌型载体读码框内，反应体系如下：

S2：重组质粒的转化：将所述重组载体pPICZαA-纤维素内切酶用Sac I单酶切线性化，按照Invitrogen公司操作手册提供的氯化锂转化法，将重组载体转化到毕赤酵母宿主菌中，本实施例选用的是X-33。转化后用含有100μg/mL Zeocin抗生素的YPD平板进行筛选，利用PCR对转化子进行验证。

S3：高水平分泌表达酵母转化子的筛选和蛋白的表达：将PCR验证后的毕赤酵母转化子划线接种至含有1200μg/mL Zeocin的YPD平板，将筛选得到高Zeocin抗性的转化子，用含有10ml BMGY培养液的50毫升离心管于28℃、250rpm条件下培养至OD₆₀₀＝10左右，离心收集菌体并加入1.5ml的BMMY培养基，28℃、250rpm培养2天，每隔12小时向离心管中加入10μl的甲醇，诱导结束后，离心取上清液10μl用于SDS-PAGE检测，筛选得到了5株高水平分泌表达重组茯苓纤维素内切酶蛋白的转化子。同时检测各转化子的酶活性，将10μl上清液加入到90μl含1％的CMC-Na的磷酸二氢钠与柠檬酸缓冲液中(pH＝4)，40℃下反应1小时；取反应后的样品10μl、2μl的浓度为10mmol/L NAD与ATP的混合液，补加水至总体积为95μl，室温下反应5min后，加入5μl浓度为2μmol/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温下反应3min后，于340nm测定吸光值。根据目标蛋白条带的浓度和吸光值的大小确定最高水平表达纤维素内切酶的转化子，结果表明，所筛选出的5株高水平分泌表达重组茯苓纤维素内切酶的转化子的上清液同样检测到了很高的吸光值，表明这5株转化子的上清液中的蛋白具有很强的酶活。

S4：将S3筛选到的1株高表达纤维素内切酶的转化子用BMGY培养基扩大培养至OD600为8～10，离心所得菌体用BMMY培养基重悬细胞并在28℃继续诱导培养，用于大量分泌纤维素内切酶重组蛋白，并补加甲醇使其质量分数保持在1～1.5％。

进一步，将所述高表达纤维素内切酶的转化子用1L的BMGY培养基扩大培养至OD600为8～10，离心所得菌体用100ml的BMMY培养基重悬后，诱导培养用于大量分泌纤维素内切酶重组蛋白，诱导培养的条件是：28℃、250rpm、每隔24小时向离心管中加入1ml的甲醇，共诱导3-4天。

BMGY扩大生长培养后，一般以生长培养基1/10-1/5体积的诱导培养基BMMY来诱导培养。

优选地，在步骤S4之后，还包括纯化蛋白的如下步骤：

S5：将所述S4发酵后的培养液离心，取上清液利用Tris碱调节pH至7.5，以大于或等于15000g的转速离心30分钟，将获得的上清液加入到经pH 7.5Tris-HCl缓冲液平衡后的镍亲合层析柱中，用2～4倍层析柱体积的pH 7.5的含10mM Tris-HCl和20mM咪唑的缓冲液漂洗所述镍亲合层析柱。

需要说明的是，将高Zeocin抗性的转化子用BMMY培养基小量表达，经SDS-PAGE分析，从高抗性(抗性水平为1200μg/mL Zeocin)转化子中筛选得到了5株稳定且高水平分泌表达纤维素内切酶的酵母转化子，而从抗性水平低于500μg/mL Zeocin YPD平板的转化子分泌表达目标蛋白的能力明显低于高抗性的转化子且酶活检测具有同样的结果，部分高Zeocin抗性转化子分泌目标蛋白的SDS-PAGE结果如图2所示。

同样需要说明的是，用SDS-PAGE检测不同时间目标蛋白表达情况分析，电泳结果如图3所示，图3为本发明实施例中在甲醇诱导下不同时间点目标蛋白表达情况的SDS-PAGE检测结果图。经培养1～4天，通过继续补加甲醇，培养得到的目的蛋白总量更高，具体各上清液总蛋白浓度结果如下表1所示。

表1总蛋白含量

诱导时间	1天	2天	3天	4天
					总蛋白浓度(mg/L)	360	450	710	820

取培养1～4天的发酵液上清，经SDS-PAGE，在40kDa左右有明显目的蛋白表达，且通过继续补加甲醇，培养得到的目的蛋白总量更高，SDS-PAG胶的灰度扫描结果显示，目标蛋白的比例与培养时间成正相关，目的蛋白占上清液总蛋白的比例结果如下表2所示。

表2不同诱导时间得到的目的蛋白占上清液蛋白的百分比含量结果

诱导时间	1天	2天	3天	4天
					百分比含量(％)	68	65	60	58

经计算，虽然目标蛋白比例在下降，但由于总蛋白增加得更快，因此目标蛋白总量仍在明显增加，目的蛋白含量结果如下表3所示，但从结果看也在诱导3天后目标蛋白的增加幅度有所下降。

表3目标蛋白总量

诱导时间	1天	2天	3天	4天
					纤维素内切酶(mg/L)	245	290	430	475

取培养1～4天的发酵液上清，10μl上清液加入到90μl含1％的CMC-Na的磷酸二氢钠与柠檬酸缓冲液中(pH＝4)，40℃下反应1小时；取反应后的样品10μl、2μl的浓度为10mmol/L NAD与ATP的混合液，补加水至总体积为95μl，室温下反应5min后，加入5μl浓度为2μmol/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温下反应3min后，于340nm测定吸光值，所得的吸光值变化如表4所示。从结果可以看出，在培养到第4天之后，酶活力达最大值，但从结果看也在诱导3天后，酶活性增加的幅度明显下降。

表4吸光值变化结果

诱导时间	1天	2天	3天	4天
					340nm测定吸光值	0.88	1.08	1.66	1.84

经计算，经4天的诱导培养，上清液中的酶活力达到35IU/ml。

S6：pH 7.5的含10mM Tris-HCl和20mM咪唑的缓冲液漂洗所述镍亲合层析柱后，再利用含10mM Tris-HCl和200mM咪唑的缓冲液洗脱所述镍亲合层析柱，将得到的洗脱液利用分子量为10kDa的透析袋于10mM Tris-HCl缓冲液中透析，然后超滤浓缩，也可以使用现有技术的其他方法浓缩。

在少量培养时对蛋白洗脱条件进行了试验，发现2～4倍层析柱体积的pH 7.5的含10mM Tris-HCl和20mM咪唑的缓冲液漂洗所述镍亲合层析柱后，分别用含有50mM、100mM、150mM、200mM咪唑的10mM Tris-HCl缓冲液洗脱所述镍亲合层析柱，分别可将目标蛋白洗脱一部分且每部分的蛋白纯度的较高，200mM咪唑的缓冲液几乎已将全部蛋白洗脱。因此大量培养采用经漂洗后就直接采用含有200mM咪唑的10mM Tris-HCl缓冲液洗脱。

优选地，在步骤S5或步骤S6之后，还包括冻干保存蛋白的如下步骤：

S7：将所述超滤浓缩得到的产品在-80℃下速冻，然后冷冻干燥，即得到冻干粉蛋白。冻干粉溶解于生理盐水中，4℃、15000g的转速离心20分钟，取上清液进行SDS-PAGE分析，结果如图4所示，检测到了目标蛋白且目标蛋白具有很高纯度，且说明该蛋白处理的方法不会使蛋白大量变性蛋白仍呈可溶解状态。表5为100ml S4诱导第4天的上清液经纯化后的蛋白量及纯度结果。

表5各步骤蛋白纯化结果

对比例

茯苓的形成是由茯苓菌丝体在适宜的条件下寄生于已死松木上，不断分解松木中的营养，并将菌化后的多余物质积聚迅速膨大，形成的营养贮藏器官和休眠器官即为菌核，俗称松茯苓。发明人利用转录组技术对茯苓的纤维素内切酶基因的表达谱进行分析发现了几个高丰度的纤维素分解的酶基因。利用转录组得到的数据，设计引物，经RT-PCR扩增目标基因并连接至克隆载体，扩增的目标基因天然序列如序列表中SEQ ID No.3所示；同样，也合成了另几种仅仅按酵母密码子偏爱性优化后合成的人工DNA序列分别连接至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA上，其中的一种仅按酵母密码子偏爱性优化后合成的人工序列如序列表中SEQ ID No.4所示(以该序列为代表)。将上述纤维素内切酶基因序列用Xho I和XbaI双酶切，并连接到同样经Xho I和Xba I双酶切的pPICZαA表达载体。重组载体pPICZαA-纤维素内切酶用Sac I单酶切线性化，并用氯化锂转化法转化到毕赤酵母宿主菌中，再经过Zeocin筛选得到阳性克隆。将PCR验证后的毕赤酵母转化子划线接种至含有1200μg/mLZeocin的YPD平板，筛选得到高Zeocin抗性的转化子，用含有10ml BMGY培养液的50毫升离心管于28℃、250rpm条件下培养至OD₆₀₀＝10左右，离心收集菌体并加入1.5ml的BMMY培养基，28℃、250rpm培养2天，每隔12小时向离心管中加入10μl的甲醇，诱导结束后，离心取上清10μl并加入到90μl含1％的CMC-Na的磷酸二氢钠与柠檬酸缓冲液中(pH＝4)，40℃下反应1小时；取反应后的样品10μl、2μl的浓度为10mmol/L NAD与ATP的混合液，补加水至总体积为95μl，室温下反应5min后，加入5μl浓度为2μmol/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温下反应3min后，于340nm测定吸光值。结果显示仅本发明提供的序列能实现目标蛋白的大量表达且具有很高的酶活。同时，以SDS-PAGE检测上清蛋白中目标蛋白的表达情况，SDS-PAGE的检测结果如图5所示，未在目标位置检测到目标蛋白条带。结果说明，只有本发明提供的根据纤维素内切酶基因自身序列特点和酵母密码子偏好性合成的DNA序列表SEQ ID No.1所示的序列转化到毕赤酵母中才能实现目标蛋白的高水平分泌表达。

实施例3

本实施例对纯化的可溶性纤维素内切酶的酶活力进行检测，具体步骤和结果如下：

本发明采用葡萄糖己糖激酶(HK)法测定纤维素内切酶水解羧甲基纤维素钠(CMC-Na)产生葡萄糖的能力，己糖激酶在有ATP存在下催化葡萄糖(D-Glucose)使其磷酸化生成葡萄糖-6磷酸(G-6-P)，G-6-P和辅酶NAD在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的作用下生成NADH和6-磷酸葡萄糖酸，可通过分光光度法测定NADH在340nm波长下的吸光度变化，定量检测样品中葡萄糖的浓度，具体步骤和结果如下：将2μl浓度为1mg/mL的纯化的纤维素内切酶加入到98μl含1％的CMC-Na的磷酸二氢钠与柠檬酸缓冲液中(pH＝4)，40℃下反应1小时；取反应后的样品10μl、2μl的浓度为10mmol/L NAD与ATP的混合液，补加水至总体积为95μl，室温下反应5min后，加入5μl浓度为2μmol/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温下反应3min后，于340nm测定吸光值。同时，以葡萄糖标准品制作标准曲线。所得的标准曲线方程为：Y＝0.0095X-0.0002，线性相关系数r²＝0.9990，标准品的检测结果表如表6示。经计算，每微克蛋白经1小时反应能产生196μg的葡萄糖。

表6标准品的检测结果

标准品浓度(ng/mL)	0	4	8	12	16	20	24
								OD<sub>340</sub>	0	0.036	0.072	0.112	0.146	0.185	0.229

(2)根据(1)的方法，分别利用pH 3，pH3.5，pH4，pH4.5，pH5的磷酸盐缓冲液，对酶活力进行了检测。在不同pH值下，相对活力(设定酶活力最高时pH下的酶活力为100％，其它情况下的相对酶活力是测得该pH条件下产生的葡萄糖总量与酶活力最高pH条件下产生的葡萄糖总量的比值)如表7所示，从表中可以看出，该酶的最适pH为4.5左右。表7为相对酶活力的检测结果。

表7不同pH值下相对酶活

pH	3	3.5	4	4.5	5
						相对酶活(％)	79	86	96	100	55

(3)根据(1)的方法，分别利用pH4的磷酸盐缓冲液，对不同温度下的酶活进行了检测。酶活检测的结果如表8所示，从图中可以看出，该酶的最适温度为45℃左右。表8为不同温度下相对酶活检测结果(设定酶活最高时的温度下的相对酶活为100％，其它情况下的相对酶活是测得该温度条件下产生的葡萄糖总量与酶活力最高的温度下产生的葡萄糖总量的比值)。

表8不同温度下相对酶活

温度(℃)	40	45	50	55	60
						相对酶活(％)	87	100	92	84	72

因此，根据以上结果，本发明所制备的新的茯苓纤维素内切酶是一种能分解羧甲基纤维素钠产生葡萄糖的、最适pH为4.5左右、最适温度为45℃左右的重组茯苓纤维素内切酶重组蛋白。

实施例4

本实施例对纯化的可溶性纤维素内切酶的滤纸水解活力进行薄层层析检测，具体步骤和结果如下：

将100μg的重组蛋白(1mg/ml)加入到100μL浓度为0.01g/ml磨成糊状的定性滤纸溶液中，40℃下分别反应0、1、2和4小时。取硅胶G板于100℃烘箱活化后冷却至室温，用毛细管点样1μL，点样位置为从硅胶板下端1.5cm，两侧2～3cm，每个样品点相距1～1.5cm。将展层剂(乙酸乙酯∶乙酸∶水＝2∶1∶1)于层析缸中平衡，数分钟后，将硅胶板放入。.当展层剂移至距上端2～3cm时，取出硅胶板吹干，均匀喷上显色剂(25％硫酸)，于100℃显色5～30min后从烘箱取出。显色结果如图6所示，从图中可以看出，不加纤维素酶时在仅在原点出现了染色点，在加入纤维素内切酶(酶的情况下，纤维素出现了降解的情况且随着时间的延长纤维素被消化得更加明显且在与葡萄糖标准品的位置出现了斑点，说明加入纤维素内切酶使滤纸出现了水解的现象且产生了少量的葡萄糖，即表明本发明生产的纤维素内切酶能高效地水解纤维素。

实施例5

将纯化毕赤酵母表达的重组茯苓纤维素内切酶溶于pH4.0的20mM的柠檬酸盐缓冲溶液中，终浓度为1mg/ml，将50μL酶液加入到等体积的经研磨成浆状的浓度0.01g/ml滤纸溶液中，40℃下反应1小时。反应结束后，将样品用0.22μm微孔滤膜过滤至样品瓶，供液相色谱分析。液相的方法如下：色谱柱：Aglient氨基柱，250×4.6mm，5μm；流动相：乙腈：水＝70：30(体积比)，流速：1.0mL/min，进样量：10uL，柱温：35℃，检测器：示差折光检测器。HPLC结果如图7所示，其中，上图为葡萄糖的标准品，该峰的保留时间为6.453分钟；中图为滤纸在不加该重组纤维素内切酶的情况下未检测到葡萄糖峰，下图为加入本发明制备的纤维素内切酶反应1小时后，检测到了明显的葡萄糖峰，该峰的保留时间为6.451分钟，葡萄糖浓度约为120ng/μl，说明该重组纤维素内切酶的确具有很强的水解滤纸产生葡萄糖的能力。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，而并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，而并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

序列表

<110> 怀化学院

<120> 一种纤维素内切酶的人工合成基因及其表达载体和蛋白

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1221

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctcgagaaaa gacaatccca agtttggcaa cagtgtggtg gtactggttt ctctggttcc 60

actacttgtg tttccggttc ctactgttcc gagatcaacg actactactc ccagtgtgtt 120

ccaggtactg atccaaacgc tccttctcaa tcttctgctt cttccgctcc accatctcaa 180

cctactggta cttctcctcc tgctgcttct ggtccattga agttctacgg tgttaacatt 240

gccggtttcg acttcggttg taacaccgat ggtaactgtc aggcttctgc tgcttggcca 300

cctttgttga agtattacgg tcacgacggt gagggtcaaa tggaccactt tgttaaggac 360

gacggtttca acgccttcag attgcctgtt ggttggcagt tcttgaccaa cgatgttctt 420

ggtggtccaa tcaacgacgc caacttgcaa gaatacgatg acttggtcca ggcctgtatt 480

aactctggtg ctgctggttg tatcatcgac atccacaact acgctagatg gaacggtgag 540

atcattggtc aaggtggtcc taccaacgaa cagtttgctg ctacttgggg tgctatcgct 600

gctaagtacg ctaacaactc caagatcctg ttcggtgtca tgaacgaacc acacgacgtt 660

ccagatatta acgcttgggc tgactctgtt caggctgctg ttactgctat tagaaacgct 720

ggtgctactt cccagttgat cttgttgcca ggtaacaact ggacttccgc cgaaactttc 780

gtttctaacg gttctgctga cgccctgaac aaggttacta atccagacgg tactaagacc 840

ggcttgatct tcgacgttca caagtatttg gactccgaca actctggtac tcacgctgat 900

tgtgtcacca acaacattgc taatgcctgg cagccattgg ctacttggtt gagagctaat 960

ggtagacagg ctctgaacac tgaaactggt ggtggtaaca ctgactcttg tgcccaattc 1020

ttgtgtgagc agatcgcttt ccaagagcag aactccgatg ttttcctggg ttactttggt 1080

tgggctgctg gtaacttcga cccatcttac gttttgggtg aagtcccaac tcaatccggt 1140

tctacttgga ctgacacttc cttggtttcc gcttgtttgg ctcctaacaa gcaccatcac 1200

catcaccatc actaatctag a 1221

<210> 2

<211> 400

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gln Ser Gln Val Trp Gln Gln Cys Gly Gly Thr Gly Phe Ser Gly Ser

1 5 10 15

Thr Thr Cys Val Ser Gly Ser Tyr Cys Ser Glu Ile Asn Asp Tyr Tyr

20 25 30

Ser Gln Cys Val Pro Gly Thr Asp Pro Asn Ala Pro Ser Gln Ser Ser

35 40 45

Ala Ser Ser Ala Pro Pro Ser Gln Pro Thr Gly Thr Ser Pro Pro Ala

50 55 60

Ala Ser Gly Pro Leu Lys Phe Tyr Gly Val Asn Ile Ala Gly Phe Asp

65 70 75 80

Phe Gly Cys Asn Thr Asp Gly Asn Cys Gln Ala Ser Ala Ala Trp Pro

85 90 95

Pro Leu Leu Lys Tyr Tyr Gly His Asp Gly Glu Gly Gln Met Asp His

100 105 110

Phe Val Lys Asp Asp Gly Phe Asn Ala Phe Arg Leu Pro Val Gly Trp

115 120 125

Gln Phe Leu Thr Asn Asp Val Leu Gly Gly Pro Ile Asn Asp Ala Asn

130 135 140

Leu Gln Glu Tyr Asp Asp Leu Val Gln Ala Cys Ile Asn Ser Gly Ala

145 150 155 160

Ala Gly Cys Ile Ile Asp Ile His Asn Tyr Ala Arg Trp Asn Gly Glu

165 170 175

Ile Ile Gly Gln Gly Gly Pro Thr Asn Glu Gln Phe Ala Ala Thr Trp

180 185 190

Gly Ala Ile Ala Ala Lys Tyr Ala Asn Asn Ser Lys Ile Leu Phe Gly

195 200 205

Val Met Asn Glu Pro His Asp Val Pro Asp Ile Asn Ala Trp Ala Asp

210 215 220

Ser Val Gln Ala Ala Val Thr Ala Ile Arg Asn Ala Gly Ala Thr Ser

225 230 235 240

Gln Leu Ile Leu Leu Pro Gly Asn Asn Trp Thr Ser Ala Glu Thr Phe

245 250 255

Val Ser Asn Gly Ser Ala Asp Ala Leu Asn Lys Val Thr Asn Pro Asp

260 265 270

Gly Thr Lys Thr Gly Leu Ile Phe Asp Val His Lys Tyr Leu Asp Ser

275 280 285

Asp Asn Ser Gly Thr His Ala Asp Cys Val Thr Asn Asn Ile Ala Asn

290 295 300

Ala Trp Gln Pro Leu Ala Thr Trp Leu Arg Ala Asn Gly Arg Gln Ala

305 310 315 320

Leu Asn Thr Glu Thr Gly Gly Gly Asn Thr Asp Ser Cys Ala Gln Phe

325 330 335

Leu Cys Glu Gln Ile Ala Phe Gln Glu Gln Asn Ser Asp Val Phe Leu

340 345 350

Gly Tyr Phe Gly Trp Ala Ala Gly Asn Phe Asp Pro Ser Tyr Val Leu

355 360 365

Gly Glu Val Pro Thr Gln Ser Gly Ser Thr Trp Thr Asp Thr Ser Leu

370 375 380

Val Ser Ala Cys Leu Ala Pro Asn Lys His His His His His His His

385 390 395 400

<210> 3

<211> 1182

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caatcccaag tgtggcaaca gtgcggcggt accggtttct ctggatcaac tacttgcgtg 60

tcgggcagct actgcagcga gatcaacgac tactattcgc aatgtgtccc tggcactgac 120

cccaatgccc ctagtcaatc ctcggcttcc tcagctcccc caagccaacc cactgggact 180

agtcctccag ctgccagcgg ccctctcaag ttctacggcg tcaacatcgc tggttttgat 240

ttcggctgca acaccgacgg aaactgccaa gcctctgctg catggcctcc actccttaaa 300

tactacggcc acgatggcga aggtcagatg gaccacttcg tgaaagatga cggattcaac 360

gccttccgtc tccctgtcgg ctggcagttc ctgacgaacg acgttctcgg aggtcctatc 420

aacgacgcta acctccagga gtacgatgat ctcgttcagg cttgcatcaa ctcaggtgct 480

gccggatgta ttattgatat ccacaactat gctcgttgga acggcgagat tattggacaa 540

ggtggtccca cgaacgaaca gttcgctgct acctggggtg ctatcgcagc caagtacgcc 600

aacaactcaa agatcctctt cggagttatg aacgagcccc atgacgttcc cgacatcaat 660

gcttgggcag attcagttca ggctgctgtt actgccattc gtaacgcagg tgctacttcc 720

caactcatcc tccttcccgg gaacaactgg acctctgcag aaacattcgt ctctaatgga 780

tccgccgatg ccttgaacaa ggtcaccaac cccgacggta ccaaaaccgg attgatcttc 840

gatgttcaca agtacctcga ctccgacaac tccggcacac acgccgactg cgtcactaac 900

aatatcgcca acgcctggca acctctcgcc acctggctgc gggccaacgg ccgtcaagcc 960

ctcaacaccg agaccggtgg aggaaacacg gattcgtgcg ctcagttctt gtgcgagcag 1020

attgctttcc aggagcagaa ctctgatgtg ttccttggct acttcggttg ggctgcaggg 1080

aacttcgacc caagctacgt tcttggggaa gtacccactc agagcggcag tacttggacg 1140

gacacgtccc tcgtttcggc ttgcttggct cctaacaagc ac 1182

<210> 4

<211> 1182

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cagagccagg tttggcagca gtgtggtggc accggtttta gcggtagcac cacctgtgtg 60

agcggtagct attgtagcga aattaacgat tattacagcc agtgtgttcc gggtacagat 120

ccgaatgcac cgagccagag cagcgccagc agcgcacctc cgagtcagcc gaccggtaca 180

agccctccgg cagcaagcgg tccgctgaaa ttctatggtg ttaatattgc cggttttgac 240

tttggctgca ataccgatgg taattgtcag gcaagcgcag catggcctcc gctgctgaaa 300

tactacggtc atgatggtga aggtcagatg gatcattttg tgaaagatga tggctttaat 360

gcatttcgtc tgccggttgg ttggcagttt ctgaccaatg atgttttagg tggtccgatt 420

aatgatgcca acctgcaaga atatgatgat ctggttcagg cctgtattaa tagcggtgca 480

gcaggttgta ttatcgatat tcataactat gcccgttgga acggtgaaat tattggtcaa 540

ggcggtccga ccaatgaaca gtttgcagca acctggggtg caattgccgc aaaatatgca 600

aataacagca aaatcctgtt cggcgttatg aatgaaccgc atgatgttcc ggatattaat 660

gcatgggcag atagcgttca ggcagcagtt accgcaattc gtaatgccgg tgcaaccagc 720

cagctgattc tgctgccagg taataattgg accagcgcag aaacctttgt tagcaatggt 780

agcgcagatg cactgaataa agttaccaat ccggatggca ccaaaaccgg tctgattttt 840

gatgtgcata aatatctgga tagcgataat tcaggcaccc atgcagattg tgttaccaat 900

aacattgcaa atgcatggca gccgctggca acctggctgc gtgcaaatgg tcgtcaggcc 960

ctgaataccg aaaccggtgg tggtaatacc gatagctgtg cccagtttct gtgtgaacaa 1020

attgcatttc aagaacagaa cagcgacgtg tttctgggtt attttggttg ggcagcaggt 1080

aattttgatc cgagctatgt tctgggtgaa gttccgacac agagcggtag tacctggacc 1140

gataccagcc tggttagcgc atgtctggca ccgaataaac at 1182

Claims (5)

1.含有基因的重组载体，其特征在于，重组载体由核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的基因构建到pPICZαA载体中得到。

2.一种纤维素内切酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的基因构建到pPICZαA载体中，经转化到毕赤酵母宿主菌细胞中并用1200μg/mL Zeocin的YPD平板筛选得到高Zeocin抗性的转化子；

2)将步骤1)所得的转化子用BMGY培养基培养至OD₆₀₀为8～10，离心收集细胞沉淀，用BMMY培养基重悬细胞，加入甲醇并使其质量分数为1％～1.5％，诱导1-3天，筛选高水平分泌表达纤维素内切酶的酵母转化子；

3)高水平分泌表达纤维素内切酶的酵母转化子用BMGY大量生长培养，之后用BMMY培养基重悬细胞并在28℃继续诱导培养1-4天，

补加甲醇使其质量分数保持在1％～1.5％。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤3)诱导培养中，BMMY诱导培养基的体积为BMGY生长培养基1/10-1/5体积。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，还包括蛋白纯化步骤：用镍亲合层析柱对步骤3)得到的上清液进行纯化，先用平衡缓冲液平衡层析柱，再将上清液过柱，用含20mM咪唑的pH 7.5缓冲液预洗柱子，然后用含200mM咪唑的pH 7.5缓冲液溶液将融合蛋白洗脱下来即可。

5.权利要求2-4任一项制备方法得到的纤维素内切酶在饲料、纺织、食品和/或生物能源领域中的应用。

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