CN109234293B

CN109234293B - 一种编码β-葡萄糖苷酶基因及其表达载体和蛋白

Info

Publication number: CN109234293B
Application number: CN201811239932.6A
Authority: CN
Inventors: 李洪波; 吴贤文; 董海丽; 胡兴
Original assignee: Huaihua University
Current assignee: HUNAN BUSKY PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.
Priority date: 2018-10-23
Filing date: 2018-10-23
Publication date: 2020-08-04
Anticipated expiration: 2038-10-23
Also published as: CN109234293A

Abstract

本发明涉及一种编码β‑葡萄糖苷酶基因，至少含有下列核苷酸序列之一的DNA片：1)序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列；2)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；或3)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列杂交且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。按照本发明所述的基因序列进一步构建重组载体在大肠杆菌可实现了β‑葡萄糖苷酶的可溶性表达，并简单的通过亲和纯化，即可得到纯度高于95％且浓度较高的保持天然构象的活性蛋白。这有利于产业化生产β‑葡萄糖苷酶。

Description

一种编码β-葡萄糖苷酶基因及其表达载体和蛋白

技术领域

本发明属于生物分子克隆技术领域，涉及一种编码β-葡萄糖苷酶基因及其表达载体和蛋白。

背景技术

β-葡萄糖苷酶(β-D-Glucosidase，EC3.2.1.21)，又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶(cellobias，CB或β-G)和苦杏仁苷酶。它属于纤维素酶类，是纤维素分解酶系中的重要组成成分，能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。β-葡萄糖苷酶还具有转糖苷活力，目的即通过具有转苷活力的葡萄糖苷酶合成功能性低聚葡聚糖、低聚麦芽寡糖、低聚纤维寡糖等可以作为益生元的功能性糖类。因此，该蛋白在食品、饲养和保健品行业等方面都具有重要应用价值。β-葡萄糖苷酶能够水解纤维二糖产生两分子的葡萄糖,是纤维素酶的限速酶,但其含量少、活力低,成为纤维素酶解的瓶颈。

目前，已发现的β-葡萄糖苷酶大部分来自可培养微生物。然而,自然界中,超过99％的微生物不能进行纯培养,严重限制了微生物资源的开发和利用。而且产β-葡萄糖苷酶的微生物主要包括曲霉、木霉、酵母和细菌,但产量低,不易大规模生产。目前关于纤维素酶生产菌株的研究,绝大部分集中于纤维素酶系齐全且酶活力较高的木霉如绿色木霉和里氏木霉等菌株上,但木霉菌发酵产物中存在多种真菌毒素。为克服无法大量生产β-葡萄糖苷酶，利用外源基因表达系统制备该蛋白是必然选择。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种能编码β-葡萄糖苷酶基因，目的之二在于提供这种基因所编码的β-葡萄糖苷酶，以及含有这种基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌等表达载体，目的之四在于提供一种所述基因所编码的β-葡萄糖苷酶的制备方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.一种编码β-葡萄糖苷酶基因，所述基因至少含有下列核苷酸序列之一的DNA片段：

1)序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列；

2)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；

3)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列杂交且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。

进一步，与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列杂交条件为：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；

还可以杂交条件为50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；

还可以杂交条件为50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；

还可以杂交条件为50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；

还可以杂交条件为50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；

还可以杂交条件为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次。

2.其中SEQ ID NO.1所示核苷酸序列由1557个脱氧核苷酸组成，编码序列表中SEQID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白。

1)序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列；

或与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有95％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；

或与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有98％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；

以上三种任一种基因编码得到的β-葡萄糖苷酶属于本发明的保护范围。

进一步，所述β-葡萄糖苷酶为如下(1)或(2)的蛋白：

(1)蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示；

(2)序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有β-葡萄糖苷酶活性的由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质。

序列表中的SEQ ID NO.2由519个氨基酸残基组成，其编码基因的读码框包含1557个核苷酸。

所述一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加是指不多于五十个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加。

3.含有技术方案1所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

进一步，所述的重组载体，由空载体和插入该空载体的目的基因组成，所述目的基因选自以下三种核苷酸序列中的一种：

1)序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列；

进一步，所述空载体为pET28载体。

进一步，所述重组载体为将上述基因插入表达载体pET28的BamH I和Hind III酶切位点间，得到表达上述蛋白的重组载体。

4.一种β-葡萄糖苷酶的制备方法，包括以下步骤：

1)将技术方案1所述的基因重组到构建到pET28载体中；再转化到大肠杆菌菌株中，得到表达株；

2)将步骤1)表达株在LB液体培养基中培养，并加入0.1～0.5mM的IPTG诱导，发酵完毕，超声破碎，离心取上清，得可溶性重组的β-葡萄糖苷酶。

进一步，还包括蛋白纯化步骤：用镍亲合层析柱对步骤2)得到的上清液进行纯化，先用平衡缓冲液平衡层析柱，再将上清液过柱，用含50～100mM咪唑的pH 8.0缓冲液预洗柱子，然后用含100mM～200mM咪唑的pH 8.0缓冲液溶液将融合蛋白洗脱下来即可。

进一步，还包括在pH值为6.0～6.5的条件下透析，将透析后的物质超滤浓缩。

根据上述的制备蛋白的方法制备得到的纯化后的蛋白也属于本发明的保护范围。

5.上述技术方案1所述基因、技术方案2或4得到的蛋白、技术方案3所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在生物燃料乙醇的生产、食品、饲养和印染领域中的应用也属于本发明的保护范围。

进一步，所述蛋白在乳品中乳糖的水解的应用。

本发明的有益效果在于：本发明所述的如序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列可以利用pET28载体和大肠杆菌表达菌株，实现了β-葡萄糖苷酶的可溶性表达，得到大量可溶形式的重组β-葡萄糖苷酶蛋白；进一步简单的通过亲和纯化，即可得到纯度高于95％且浓度较高的活性蛋白，因在本发明的所提供的表达系统内，重组β-葡萄糖苷酶蛋白可按适当的方式折叠，并保持天然构象；三是摸索出一条有效纯化活性重组β-葡萄糖苷酶的方法；通过本发明所提供的蛋白制备方法得到的β-葡萄糖苷酶蛋白具有很强的生物活性。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为本发明实施例中的pET28/GH载体构建示意图。

图2为本发明实施例2可溶性β-葡萄糖苷酶表达的SDS-PAGE检测结果图。

图3为本发明实施例中的纯化前β-葡萄糖苷酶和用包括不同浓度的咪唑的缓冲液纯化得到的重组蛋白的SDS-PAGE检测结果图。

图4为本发明实施例中的浓缩的β-葡萄糖苷酶的SDS-PAGE检测结果图。

图5为本发明实施例中含经RT-PCR克隆的天然β-葡萄糖苷酶的pET28重组载体表达的目标蛋白的SDS-PAGE检测结果图。

图6为本发明实施例中pH对酶活的影响。

图7为本发明实施例中离子强度对酶活的影响。

图8为本发明实施例重组酶对乳糖的水解效果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

本发明选用大肠杆菌表达菌、载体扩增菌株TOP10和表达载体pET28均购自美国Invritrogen公司。

所用培养基配方和试剂配方如下：

1)LB液体培养基：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌，室温保存；

2)LB/Amp平板：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，琼脂粉15g，高压灭菌后，冷却至70℃以下，加入1mL浓度为100mg/ml的卡那霉素(Kan)，充分混均后倒板，4℃避光保存；

3)LB/Kan培养基：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌后，冷却至70℃以下，加入1mL Kan(100mg/ml)，充分混均，4℃保存；LB液体培养基：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌，室温保存。

4)50×TAE琼脂糖凝胶电泳缓冲液：Tris碱121g，冰乙酸28.6mL，0.5mol/L EDTA(pH8.0)50mL，加蒸馏水定容至500mL，室温保存；

5)50mg/mL卡那霉素保存液：卡那霉素0.5g，加蒸馏水溶解并定容至10mL，分装后于-20℃保存；

6)5×SDS-PAGE上样缓冲液：1M Tris-HCl(pH 6.8)1.25mL，SDS 0.5g，BPB 25mg，甘油2.5mL，加去离子水溶解后定容至5mL，分装(约500μL每份)后于室温保存，使用每份加入25μLβ-巯基乙醇混匀；

7)5×SDS-PAGE电泳缓冲液：Tris 15.1g，甘氨酸94g，SDS 5.0g，加入约800mL去离子水，充分搅拌溶解后定容至1L，室温保存；

8)考马斯亮蓝R-250染色液：考马斯亮蓝R-250 0.25g，加入225mL甲醇、46mL的冰乙酸、225mL去离子水并搅拌均匀，滤纸去除颗粒物质后，室温保存；

9)考马斯亮蓝脱色液：冰乙酸50mL，甲醇150mL，去离子水300mL，充分混合后，室温保存。

实施例1

本实施例提供了一种优化的人工合成的β-葡萄糖苷酶基因，具体序列如序列表中的SEQ ID NO：1所示，该基因所对应的蛋白质序列如序列表中的SEQ ID NO：2所示。合成的序列在NCBI数据库中无相似度达50％的序列，它是根据大肠杆菌表达的特点如密码子的偏好性、避免出现复杂的DNA结构、保证合理的GC含量、合适的酶切位点和表达标签及终止信号等特点合成的众多序列中的一种序列，本发明所述的序列及与此序列高度同源的DNA序列在大肠杆菌中均有较其它序列更高的可溶性目标蛋白的表达。

将上述优化后的如序列SEQ ID NO：1所示的基因构建到大肠杆菌表达载体pET28中并获得重组载体，以上经测序验证的重组载体热激转化到大肠杆菌表达菌株的感受态细胞，涂布对应的抗性LB平板，37℃恒温培养箱中培养12小时，筛选转化子，其中重组表达载体pET28/GH1载体构建如图1所示，图1为本发明实施例中的pET28/GH1载体构建示意图。

利用经优化的β-葡萄糖苷酶基因序列的pET28重组载体为表达载体，其对应的表达菌转化子经0.1-0.5mM的IPTG在18℃下诱导均检测到目标蛋白的表达，其菌体总蛋白SDS-PAGE结果如图2所示，β-葡萄糖苷酶的蛋白分子量为55kDa左右。

将人工化学合成经优化的成熟GH1基因连接至pUC通用载体得到pUC/GH1，利用BamH I和Hind III双酶切pUC/GH1，将得到的GH1片段再亚克隆至表达载体pET28中，得到重组表达载体pET28/GH1，载体构建如图1所示。pET28/GH1载体构建的主要步骤如下：

(1)用BamH I和Hind III双酶切重组载体pUC/GH1，获得目的片断GH1，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)：

(2)用BamH I和Hind III双酶切pET28，获得载体片断，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)：

(3)将步骤(1)和(2)得到的目的片断和载体片断用DNA凝胶收回试剂盒回收，该试剂盒购自大连TAKARA公司，具体操作按试剂盒说明书进行。

(4)将步骤(3)回收得到的目的片断和载体用T4DNA连接酶(购自大连TAKARA公司)进行连接反应，目的基因准确插入到表达载体读码框内，反应体系如下：

实施例2

本实施例提供一种制备β-葡萄糖苷酶蛋白的方法，具体包括如下步骤：

S1：将实施例1构建好的重组载体pET28/GH1转化到大肠杆菌TOP10菌株中，再从TOP10中提取重组载体pET28/GH1；用热激法将重组载体pET28/GH1转入到宿主细胞大肠杆菌表达菌株中，用含有Kan抗性的LB平板筛选得到包含有重组载体pET28/GH1的大肠杆菌表达菌株转化子。

S2：可溶性β-葡萄糖苷酶的表达与提取：将包含序列SEQ ID NO：1基因的pET28/GH1重组载体的大肠杆菌重组转化子在37℃的液体LB培养基中培养至OD600为0.3，然后分别加入浓度为0、0.1、0.5mM的IPTG，在18℃诱导12小时，诱导后收集的菌体超声破碎，破碎功率300W，破碎2s，间隙8s，循环90次后，离心取上清液，得到重组的可溶性β-葡萄糖苷酶，SDS-PAGE结果如图2所示。

S3：可溶性β-葡萄糖苷酶的纯化：经扩大培养和在18℃下用0.1mM IPTG诱导12小时，收集经IPTG诱导表达后的表达菌的菌体，将菌体重悬于50ml的缓冲液A(含20mMNa₂HPO₄，200mM NaCl，10mM咪唑和1mM蛋白酶抑制剂PMSF，pH 8.0)中，然后用超声破碎仪进行破碎，破碎功率300W，破碎2s，间隙8s，循环90次；将破碎后的菌液在4℃下，30000g离心15min。本实施例采用的pET28表达载体的N-端已包含一个His×6标签，因此表达的目标蛋白可以利用镍亲合层析柱进行纯化。将离心所得到的上清液加入到经缓冲液A预平衡的镍亲合层析柱中；用100ml缓冲液B(含20mM Na₂HPO₄，200mM NaCl，10mM咪唑，pH 8.0)漂洗蛋白纯化柱子后，再依次用分别加入包括浓度为50、100、200和400mM咪唑的缓冲液C(含20mMNa₂HPO₄，200mM NaCl，pH 8.0)，将蛋白洗脱下来，收集每个浓度咪唑的洗脱液，其中200mM咪唑洗脱的蛋白是纯度在90％以上的可溶性β-葡萄糖苷酶，各浓度咪唑的缓冲液C洗脱的电泳具体结果如图3所示。

S4：可溶性β-葡萄糖苷酶的浓缩：将蛋白质样品在pH5.5-6的20mM NaH₂PO₄下透析，透析结束后，利用截留分子量为15kDa的超滤管进行超滤浓缩即可得到纯度在90％以上的高浓度可溶性β-葡萄糖苷酶，结果如图4所示。利用胶扫描并结合Bradford法对目标蛋白的浓度进行了检测，表1是100ml经IPTG诱导的菌体中可溶性β-葡萄糖苷酶重组蛋白经各纯化步骤的得率与纯度结果。

表1蛋白纯化结果

需要说明的是，在步骤S2得到的上清液中加入SDS-PAGE样品缓冲液，对其可溶蛋白进行分析。在18℃温度下IPTG的浓度为0.1、0.2和0.5mM时，都可以得到可溶性β-葡萄糖苷酶。为节约成本，缩短生产周期，我们优选采用诱导温度18℃，0.1mM的IPTG进行诱导表达。

对比例

茯苓的形成是由茯苓菌丝体在适宜的条件下寄生于已死松木上，不断分解松木中的营养，并将菌化后的多余物质积聚迅速膨大，形成的营养贮藏器官和休眠器官即为菌核，俗称松茯苓。木材的主要成分是纤维素、半纤维素和木素，其中，木材纤维素含量为40％～50％。因此，茯苓菌丝中极可能存在高活性的分泌型纤维素酶。发明人利用转录组技术对茯苓的纤维素酶分解酶的表达谱进行分析发现了几个高丰度的纤维素分解的酶基因。利用转录组得到的数据，设计引物，经RT-PCR扩增目标基因并连接至克隆载体，扩增的目标基因序列如序列表中SEQ ID NO.3所示，将该天然的可溶性β-葡萄糖苷酶基因用BamH I和HindIII双酶切，并连接到同样经BamH I和Hind III双酶切的pET28表达载体。重组载体经热激转化到大肠杆菌表达菌株的感受态细胞，涂布对应的抗性LB平板，37℃恒温培养箱中培养12小时，筛选转化子。将包含优化前基因的pET28/GH1载体的大肠杆菌重组转化子在37℃的液体LB培养基中培养至OD600为0.3，然后分别加入浓度为0、0.1、0.2、0.5mM的IPTG，在18℃诱导12小时，诱导后收集的菌体超声破碎，破碎功率300W，破碎2s，间隙8s，循环90次后，离心取上清液，未得到可溶性β-葡萄糖苷酶，SDS-PAGE结果如图5所示。该对比例结果说明，只有本发明如序列SEQ ID NO.1所示的基因才能在大肠杆菌pET28中实现可溶性的表达。

实施例3

本实施例对纯化的可溶性β-葡萄糖苷酶的酶活力进行检测，具体步骤和结果如下：

以对硝基苯-β-D-吡喃葡糖苷为底物，对硝基苯酚为标准品，对实施例2经S4步骤纯化并浓缩后的β-葡萄糖苷酶进行酶活检测。

(1)标准曲线的绘制：取5μmol/L的对硝基苯，将其用pH6.0的20mM的磷酸二氢钠溶液分别稀释至800、400、200、100、50、25和0nmol/L。取上述稀释液各100μl，分别加入到96孔酶标板中，每浓度各3个重复，于室温下置于全波长酶标仪中，选择吸光值为400nm，测定各稀释浓度的对硝基苯的吸光值，并绘制标准曲线，所得的标准曲线方程为：Y＝0.0011X+0.0024，相关系统r＝0.9996，标准品的检测结果表如表2所示。

表2标准品的检测结果

标准品浓度(nmol/L)	0	25	50	100	200	400	800
								OD<sub>400</sub>	0	0.034	0.059	0.112	0.213	0.454	0.835

(2)样品酶活的测定：取1μl浓度为1mg/mL的纯化的β-葡萄糖苷酶、pH6.0的200mM的磷酸二氢钠溶液10μl、10μl的浓度为5mmol/L硝基苯-β-D-吡喃葡糖苷，补加水至总体积为100μl,40℃下反应15min后，加入100μl浓度为2mol/L的碳酸钠，终止反应。取10μl上述反应终止液，加入到含有90μl pH6.0的20mM的磷酸二氢钠溶液的96孔酶标板中，于400nm测定吸光值。根据标准曲线，计算出经反应后产生的对硝基苯的浓度再乘以20，得到最终生成的对硝基苯的量。同时，定义一分钟得到1nmol的对硝基苯的β-葡萄糖苷酶为1国际单位(IU)。根据计算，该β-葡萄糖苷酶的比活为1.58×10⁵IU/mg酶蛋白，是一种酶活力极强的β-葡萄糖苷酶。

(3)根据(2)的方法，分别利用pH4-8的磷酸盐缓冲液，对酶活进行了检测。在不同pH值下，相对活力如图6所示，从图中可以看出，该酶的最适pH为6左右。表3为不同pH值下相对酶活的检测结果。

表3不同pH值相对酶活

pH	4	5	6	7	8
						相对酶活(％)	77	90	100	72	46

同样，对金属离子(终浓度为0.5mmol/l)对该酶的活力影响进行了检测，金属离子对酶活的影响如图7所示，从结果可以，Co²⁺和Zn²⁺离子能激活该酶，而MoNO₄ ^2-和Cu²⁺离子对酶活有极大的抑制作用。

实施例4

本实施例对纯化的可溶性β-葡萄糖苷酶的乳糖水解活力进行薄层层析检测，具体步骤和结果如下：

将终浓度为1mg/L的β-葡萄糖苷酶加入到10mg/ml的乳糖溶液中，40℃下分别反应0、1、2和4小时。取硅胶G板于100℃烘箱活化后冷却至室温，用毛细管点样1μL，点样位置为从硅胶板下端1.5cm，两侧2～3cm，每个样品点相距1～1.5cm。将展层剂(乙酸乙酯∶乙酸∶水＝2∶1∶1)于层析缸中平衡，数分钟后，将硅胶板放入。当展层剂移至距上端2～3cm时，取出硅胶板吹干，均匀喷上显色剂(25％硫酸)，于100℃显色5～30min后从烘箱取出。显色结果如图8所示，从图中可以看出，该酶在加入β-葡萄糖苷酶与不加(0小时)酶的情况下，显色斑点的位置出现明显差异，说明加入β-葡萄糖苷酶使乳糖出现了水解，迁移位置发生改变。

因此，根据以上结果，本发明所制备的新的茯苓β-葡萄糖苷酶是一种酶活力极强的，最适pH为6左右，Mn²⁺离子能激活而Co²⁺和Cu²⁺抑制的β-葡萄糖苷酶，另外该酶具有很强的水解乳糖的能力。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，而并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

序列表

<110> 怀化学院

<120> 一种编码β-葡萄糖苷酶基因及其表达载体和蛋白

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1557

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccaaaggatt tcatctgggg cttcgccact gcgagcttcc agattgaagg ttcaaccgac 60

gttgacggcc gcggaaagtc tttctgggac gatttctcaa gaacaccggg caagaccctc 120

gatggacgca atggcgacgt cgccactgat tcgtataacc gctggaggga ggacctcgat 180

cttttgagcg aatacggtgt gaagagctac cgtttctcca tcgcctggtc aagaatcatt 240

ccgctcggtg gtcgcaacga ccccgtgaat gaggctggaa tcaagtttta ctcagacctc 300

attgacggct tgctcgagcg aggtattacc ccttttgtga ctttgtatca ctgggatctt 360

cctcaggcac tccacgaccg atacctcggc tggttgaata aggaagagat cgtacaggac 420

tacgttcgct atgcacgagt ttgcttcgag cgtttcggtg accgagtgaa gcactggctt 480

actatgaacg agccctggtg catttccatc ttgggctacg gccgcggcgt cttcgctccc 540

ggaaggtcca gtgaccgttt gcgctcgtcc gaaggggatt cctcgagaga accttggatt 600

gctggacaca gcgtcattct ggctcacgca aacgccgtca aggcttatcg tgaagaattc 660

aaggcgaagc agggtggtca aataggtatc accctcaacg gtgactgggc aatgccatat 720

gacgacagtc ccgcaaatat cgaagccgct caacatgcgc tggacgtcgc tatcggttgg 780

tttgctgacc ccatttatct cggctcgtac ccggccttca tgaaggaaat gttgggagac 840

cggcttccgg agtttaccca agaggaactt gccgtcgtaa agggatcatc cgacttctat 900

ggcatgaaca cgtacaccac caacctttgc aaggccggcg gcgacgacga gttccaggga 960

cacgtcgaat ataccttcac ccgaccagac ggtacacagc tcggtccgca agcccactgc 1020

gcatggcttc aggattatgc tcctggtttc cgagacttgc ttaactacct atacaaacga 1080

taccgtaaac cgatctacgt taccgagaat ggctttgctg tcaaggacga gaactccatg 1140

actatcgagc aggccctcaa ggacgatgct cgtgtgcact actacgctgg tgtcaccgac 1200

gccttgctca acgctgtcaa cgaggacggc gtcgacgttc gcgcatactt cggatggagt 1260

ctgctcgata actttgaatg ggctgacgga tacgtcactc gcttcggtgt tacctacgtc 1320

gactacgaga cccagaagcg gtaccctaaa gattcaggaa agttcttggc gaagtggttc 1380

aaggagcacg tccccgcggc tgaggctgag gcccccaaac ccgtcgttgt cgtcgaggct 1440

gcgaagccca agccaatttc caacggcaag gcacccgtcg tcgagcagtt tcacatcgag 1500

caagcgcaga agggcgctgc accactcaag aagagaaagg caccgtttgc gcgtttt 1557

<210> 2

<211> 519

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Pro Lys Asp Phe Ile Trp Gly Phe Ala Thr Ala Ser Phe Gln Ile Glu

1 5 10 15

Gly Ser Thr Asp Val Asp Gly Arg Gly Lys Ser Phe Trp Asp Asp Phe

20 25 30

Ser Arg Thr Pro Gly Lys Thr Leu Asp Gly Arg Asn Gly Asp Val Ala

35 40 45

Thr Asp Ser Tyr Asn Arg Trp Arg Glu Asp Leu Asp Leu Leu Ser Glu

50 55 60

Tyr Gly Val Lys Ser Tyr Arg Phe Ser Ile Ala Trp Ser Arg Ile Ile

65 70 75 80

Pro Leu Gly Gly Arg Asn Asp Pro Val Asn Glu Ala Gly Ile Lys Phe

85 90 95

Tyr Ser Asp Leu Ile Asp Gly Leu Leu Glu Arg Gly Ile Thr Pro Phe

100 105 110

Val Thr Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln Ala Leu His Asp Arg Tyr

115 120 125

Leu Gly Trp Leu Asn Lys Glu Glu Ile Val Gln Asp Tyr Val Arg Tyr

130 135 140

Ala Arg Val Cys Phe Glu Arg Phe Gly Asp Arg Val Lys His Trp Leu

145 150 155 160

Thr Met Asn Glu Pro Trp Cys Ile Ser Ile Leu Gly Tyr Gly Arg Gly

165 170 175

Val Phe Ala Pro Gly Arg Ser Ser Asp Arg Leu Arg Ser Ser Glu Gly

180 185 190

Asp Ser Ser Arg Glu Pro Trp Ile Ala Gly His Ser Val Ile Leu Ala

195 200 205

His Ala Asn Ala Val Lys Ala Tyr Arg Glu Glu Phe Lys Ala Lys Gln

210 215 220

Gly Gly Gln Ile Gly Ile Thr Leu Asn Gly Asp Trp Ala Met Pro Tyr

225 230 235 240

Asp Asp Ser Pro Ala Asn Ile Glu Ala Ala Gln His Ala Leu Asp Val

245 250 255

Ala Ile Gly Trp Phe Ala Asp Pro Ile Tyr Leu Gly Ser Tyr Pro Ala

260 265 270

Phe Met Lys Glu Met Leu Gly Asp Arg Leu Pro Glu Phe Thr Gln Glu

275 280 285

Glu Leu Ala Val Val Lys Gly Ser Ser Asp Phe Tyr Gly Met Asn Thr

290 295 300

Tyr Thr Thr Asn Leu Cys Lys Ala Gly Gly Asp Asp Glu Phe Gln Gly

305 310 315 320

His Val Glu Tyr Thr Phe Thr Arg Pro Asp Gly Thr Gln Leu Gly Pro

325 330 335

Gln Ala His Cys Ala Trp Leu Gln Asp Tyr Ala Pro Gly Phe Arg Asp

340 345 350

Leu Leu Asn Tyr Leu Tyr Lys Arg Tyr Arg Lys Pro Ile Tyr Val Thr

355 360 365

Glu Asn Gly Phe Ala Val Lys Asp Glu Asn Ser Met Thr Ile Glu Gln

370 375 380

Ala Leu Lys Asp Asp Ala Arg Val His Tyr Tyr Ala Gly Val Thr Asp

385 390 395 400

Ala Leu Leu Asn Ala Val Asn Glu Asp Gly Val Asp Val Arg Ala Tyr

405 410 415

Phe Gly Trp Ser Leu Leu Asp Asn Phe Glu Trp Ala Asp Gly Tyr Val

420 425 430

Thr Arg Phe Gly Val Thr Tyr Val Asp Tyr Glu Thr Gln Lys Arg Tyr

435 440 445

Pro Lys Asp Ser Gly Lys Phe Leu Ala Lys Trp Phe Lys Glu His Val

450 455 460

Pro Ala Ala Glu Ala Glu Ala Pro Lys Pro Val Val Val Val Glu Ala

465 470 475 480

Ala Lys Pro Lys Pro Ile Ser Asn Gly Lys Ala Pro Val Val Glu Gln

485 490 495

Phe His Ile Glu Gln Ala Gln Lys Gly Ala Ala Pro Leu Lys Lys Arg

500 505 510

Lys Ala Pro Phe Ala Arg Phe

515

<210> 3

<211> 1557

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cctaaggact tcatctgggg tttcgccact gcttcctttc agattgaggg ttctaccgac 60

gttgacggta gaggtaagtc cttttgggac gacttctcca gaactccagg aaagaccttg 120

gacggtagaa acggagacgt cgctactgac tcttacaaca gatggcgtga ggaccttgac 180

ttgttgtccg agtacggtgt caagtcttac cgtttctcca tcgcctggtc ccgtatcatt 240

cctcttggtg gtcgtaacga cccagtcaac gaggccggta ttaagtttta ctctgacttg 300

atcgacggtt tgttggagag aggtattact ccatttgtta ctttgtatca ctgggatctt 360

cctcaggctt tacatgaccg ttacttggga tggttgaaca aggaggaaat tgttcaggac 420

tatgtccgtt acgcccgtgt ttgcttcgaa agattcggtg acagagtcaa gcactggttg 480

accatgaacg agccttggtg catttccatc ttgggttacg gaagaggagt tttcgcccca 540

ggtagatctt ctgacagatt gcgttcctct gagggagatt cctccagaga accttggatc 600

gctggtcact ctgtcatttt ggcccatgcc aacgctgtta aggcttaccg tgaggagttc 660

aaggccaagc agggtggaca gatcggaatt actttgaacg gagactgggc catgccatat 720

gatgattccc ctgctaacat cgaagctgct cagcacgctt tggatgttgc cattggttgg 780

ttcgccgacc ctatctactt gggatcttac cctgccttca tgaaggagat gttgggagac 840

cgtttgccag agttcaccca ggaggagttg gctgttgtta agggttcctc tgatttttat 900

ggtatgaata cttataccac taacttgtgt aaggccggtg gagatgacga gtttcaggga 960

catgtcgaat acaccttcac cagaccagac ggtacccaat tgggacctca agctcattgt 1020

gcctggttgc aggattacgc tccaggtttc agagacttgt tgaattactt gtacaagaga 1080

tacagaaagc ctatctacgt cactgagaac ggtttcgccg tcaaggacga gaactctatg 1140

accattgaac aggctttgaa ggacgatgcc agagtccatt attacgccgg tgtcaccgat 1200

gccttgttga acgccgttaa cgaagacggt gtcgacgttc gtgcttactt cggttggtcc 1260

cttttggaca acttcgaatg ggccgacggt tatgtcactc gtttcggtgt cacctacgtc 1320

gattacgaga ctcaaaaaag ataccctaag gattctggaa agtttttggc caagtggttc 1380

aaggaacatg ttcctgccgc tgaggctgaa gctccaaagc ctgttgttgt cgttgaggcc 1440

gctaagccta aacctatctc caacggtaag gctccagtcg tcgagcaatt ccacattgag 1500

caggcccaaa agggagccgc tccacttaag aagagaaagg ccccattcgc ccgtttt 1557

Claims

1.一种编码β-葡萄糖苷酶基因，其特征在于，所述基因的序列为序列表中SEQID NO.1的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的基因编码得到的β-葡萄糖苷酶。

3.根据权利要求2所述的β-葡萄糖苷酶，其特征在于：所述β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

4.含有权利要求1所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组载体，由空载体和插入该空载体的目的基因组成，其特征在于，所述目的基因为权利要求1所述的基因。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述空载体为pET28载体。

7.一种权利要求2或3所述的β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将权利要求1所述的基因重组到构建到pET28载体中；再转化到大肠杆菌菌株中，得到表达株；

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，还包括蛋白纯化步骤：用镍亲合层析柱对步骤2)得到的上清液进行纯化，先用平衡缓冲液平衡层析柱，再将上清液过柱，用含50～100mM咪唑的pH 8.0缓冲液预洗柱子，然后用含100mM～200mM咪唑的pH 8.0缓冲液将融合蛋白洗脱下来即可。

9.根据权利要求7或8所述制备方法得到的蛋白。

10.权利要求1所述基因、权利要求2或3所述β-葡萄糖苷酶、权利要求9所述蛋白、权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在生物燃料乙醇的生产、食品、饲养和/或印染领域中的应用。