CN110747212A

CN110747212A - 一种新果胶酶的基因及其蛋白表达、载体和应用

Info

Publication number: CN110747212A
Application number: CN201911197319.7A
Authority: CN
Inventors: 李洪波; 岳芬芳; 米丹; 何伶靖; 李露露
Original assignee: Huaihua University
Current assignee: Huaihua University
Priority date: 2019-11-29
Filing date: 2019-11-29
Publication date: 2020-02-04
Anticipated expiration: 2039-11-29
Also published as: CN110747212B

Abstract

本发明涉及一种新果胶酶的基因，所述基因为序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列所示；或者是与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性且编码相同生物学功能蛋白质的序列；或者是能与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列杂交且编码相同生物学功能蛋白质的序列。本发明如序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列可以利用pET32载体和大肠杆菌表达菌株，实现了表达产物与增溶因子Trx融合，得到大量可溶形式的Trx‑果胶酶融合蛋白，并通过镍亲和层析和DEAE阴离子交换法纯化得到高纯度和高活性的重组果胶酶蛋白，为大量制备重组果胶酶提供基础。

Description

一种新果胶酶的基因及其蛋白表达、载体和应用

技术领域

本发明属于生物分子克隆技术领域，涉及一种新果胶酶的基因及其蛋白表达、载体和应用。

背景技术

果胶首次是从胡萝卜中提取出的一种水溶性可形成凝胶的物质，主要是由D-半乳糖醛酸以α-1,4糖苷键相连形成的直链和中性糖(鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和木糖)形成的侧链所组成的高分子化合物。果胶酶是指能够催化果胶质分解的多种酶的总称，其广泛存在于植物果实中。目前果胶酶研究已发展到分子水平，由从自然界中筛选、分离发展到诱变和基因工程等多种手段相结合。分离纯化方法的发展也推动了对果胶酶特性的研究。我国的水果种植和水果加工工业发展迅速,为果胶酶的开发和应用提供了广阔的前景。生产厂家应努力提高产品质量和做好售后服务,使果胶酶的开发和应用取得良好的效果。果胶酶在果汁澄清、榨汁、酿酒、榨油等食品行业应用十分广泛。随着我国工业的迅速崛起，果胶酶的市场需求量也越来越大，其应用价值不可估量。然而，目前对高活力的果胶酶的开发的报道仍不多。发明人的前期研究中发现了一种高活力的源自于茯苓的新型高活性果胶酶，但该酶在茯苓中的表达量很低，因此利用外源基因表达系统高效表达该新型重组酶蛋白是开发该果胶酶的必由之路。

目前，人们已经开发了很多表达系统如：杆状病毒表达系统、原核表达系统、酵母表达系统、丝状真菌表达系统、昆虫细胞表达系统、植物表达系统、哺乳动物表达系统等。大肠杆菌的遗传背景清楚，又由于其具有周期短、高效率、易操作、使用安全等特点，成为外源基因的首选表达系统。本发明经反复优化基因和改变表达载体与菌株，获得了一种人工合成的源自于茯苓的果胶酶基因，该优化的基因可以在大肠杆菌表达系统中实现高水平重组表达，利用镍亲合层析和DEAE阴离子交换能有效纯化该重组酶蛋白，该新型重组果胶酶蛋白能澄清果汁，在果汁的生产加工中具有重要的应用开发价值。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新果胶酶的基因，目的之二在于提供这种基因所编码的新果胶酶蛋白，以及含有这种基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌等表达载体，目的之四在于提供一种所述基因编码的新果胶酶的制备方法及其纯化方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种重组果胶酶基因，所述基因与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性。

进一步的改进，所述基因包括SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。

进一步的改进，所述基因为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。

一种重组果胶酶基因的表达方法，包括如下步骤：

步骤一、将SEQ ID NO.1所示核苷酸序列重组到构建到pET32载体中；再转化到大肠杆菌菌株中，得到表达株；

步骤二、表达株在LB液体培养基中培养，并加入0.1～0.5mM的IPTG诱导，发酵完毕，超声破碎，离心取上清，得可溶性的重组果胶酶。

进一步的改进，还包括步骤三、蛋白纯化：用镍亲合层析柱对步骤2)得到的上清液进行纯化，先用平衡缓冲液平衡镍亲合层析柱，再将上清液过柱，用含pH 8.0含40mM咪唑的10mM Tris-Hcl缓冲液漂洗柱子，然后用含200mM咪唑的pH 8.0 10mM Tris-Hcl缓冲液将融合蛋白洗脱下来，洗脱的蛋白上样到pH 8.0含10mM Tris-Hcl缓冲液平衡的DEAE柱，经pH8.0含20mM NaCl的10mM Tris-Hcl缓冲液漂洗柱子后，用pH 6.0含100mM NaCl的10mMPBS缓冲液洗脱，即得到高纯度的重组果胶酶。

上述的重组果胶酶的用途，所述重组果胶酶用于构建重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

上述的重组果胶酶的用途，、所述重组果胶酶用于生产、食品、饲养或印染领域。

进一步的改进，重组果胶酶用含果胶物质的水解。

本发明的有益效果在于：本发明通过改造和测试大量的核苷酸序列发明出如序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列可以利用pET32载体和大肠杆菌表达菌株，实现了表达产物与增溶因子Trx的融合，并得到实现了一种新的果胶酶的可溶性表达，得到大量可溶形式的Trx-果胶酶融合蛋白；进一步通过镍亲和纯化与DEAE离子交换两步法，即可得到纯度高于95％且浓度较高的活性蛋白，因在本发明的所提供的表达系统内，重组果胶酶蛋白可按适当的方式折叠，并保持天然构象；三是摸索出一条有效能得到高纯度高活性的重组果胶酶的纯化方法；通过本发明所提供的蛋白制备方法得到的果胶酶蛋白具有很强的生物活性。

旨在获得高活力重组果胶酶以及生产菌株，对可再果胶的生物转化与利用具有重要的作用。

该果胶酶基因是一种新发现的基因，目前还没有对其进行研究开发的报道。因此，利用有通过改造该果胶酶的DNA序列且优化其表达纯化方法来高效生产该重组果胶酶的方法，得到一种可以降低成本、实现大量生产且具有生物活性的果胶酶，为该酶在工业生产中的应用奠定基础。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为本发明实施例中的pET32/果胶酶载体构建示意图。

图2为本发明实施例中的含有优化后胶酶基因的pET32重组载体表达的目标蛋白的SDS-PAGE检测结果图。

图3为本发明实施例中的含有优化后胶酶基因的pET32重组载体在不同IPTG浓度下表达的目标蛋白的SDS-PAGE检测结果图。

图4为本发明实施例中的纯化的Trx-果胶酶重组蛋白的SDS-PAGE检测结果图。

图5为本发明实施例中含有优化前从茯苓菌丝体中经RT-PCR克隆的天然果胶酶的pET32重组载体表达的目标蛋白的SDS-PAGE检测结果图。

图6为本发明实施例中根据酵母密码子偏爱性合成的果胶酶基因构建的pET32重组载体目标蛋白的SDS-PAGE检测结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

本发明选用大肠杆菌表达菌、载体扩增菌株TOP10和表达载体pET32均购自美国Invritrogen公司。

所用培养基配方和试剂配方如下：

1)LB液体培养基：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌，室温保存；

2)LB/Amp平板：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，琼脂粉15g，高压灭菌后，冷却至70℃以下，加入1mL浓度为100mg/ml的氨苄青霉素(Ampicillin)，充分混均后倒板，4℃避光保存；

3)LB/Amp培养基：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌后，冷却至70℃以下，加入1mL Ampicillin(100mg/ml)，充分混均，4℃保存；LB液体培养基：NaCl10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌，室温保存。

4)50×TAE琼脂糖凝胶电泳缓冲液：Tris碱121g，冰乙酸28.6mL，0.5mol/L EDTA(pH8.0)50mL，加蒸馏水定容至500mL，室温保存；

5)50mg/mL氨苄青霉素保存液：氨苄青霉素0.5g，加蒸馏水溶解并定容至10mL，分装后于-20℃保存；

6)5×SDS-PAGE上样缓冲液：1M Tris-HCl(pH 6.8)1.25mL，SDS 0.5g，BPB 25mg，甘油2.5mL，加去离子水溶解后定容至5mL，分装(约500μL每份)后于室温保存，使用每份加入25μLβ-巯基乙醇混匀；

7)5×SDS-PAGE电泳缓冲液：Tris 15.1g，甘氨酸94g，SDS 5.0g，加入约800mL去离子水，充分搅拌溶解后定容至1L，室温保存；

8)考马斯亮蓝R-250染色液：考马斯亮蓝R-250 0.25g，加入225mL甲醇、46mL的冰乙酸、225mL去离子水并搅拌均匀，滤纸去除颗粒物质后，室温保存；

9)考马斯亮蓝脱色液：冰乙酸50mL，甲醇150mL，去离子水300mL，充分混合后，室温保存。

实施例2

本实施例提供了一种优化的人工合成的新果胶酶基因，具体序列如序列表中的SEQ ID NO：1所示，该基因所对应的蛋白质序列如序列表中的SEQ ID NO：2所示。本发明提供的序列在NCBI数据库中无相似度达60％的序列，它是根据大肠杆菌表达的特点如密码子的偏好性、防止出现复杂的DNA结构以免影响转录效率、保证合理的GC含量、选择合适的酶切位点、理想的表达标签及终止信号等特点人工优化并合成的众多序列中的一种DNA序列。本发明所述的序列及与本序列高度同源的DNA序列在大肠杆菌中均有较其它序列更高的可溶性目标蛋白的表达。

茯苓的形成是由茯苓菌丝体在适宜的条件下寄生于已死松木上，不断分解松木中的营养，并将菌化后的多余物质积聚迅速膨大，形成的营养贮藏器官和休眠器官即为菌核。利用转录组技术对茯苓的果胶分解酶的表达谱进行分析发现了该高丰度的果胶水解酶基因。

将上述优化后的如序列SEQ ID NO：1所示的基因构建到大肠杆菌表达载体pET32中并获得重组载体，以上经测序验证的重组载体热激转化到大肠杆菌表达菌株的感受态细胞，涂布对应的抗性LB平板，37℃恒温培养箱中培养12小时，筛选转化子，其中重组表达载体pET32/果胶酶载体构建如图1所示，图1为本发明实施例中的pET32/果胶酶载体构建示意图。

将人工化学合成经优化的成熟果胶酶基因连接至pUC通用载体得到pUC/果胶酶，利用BamH I和Hind III双酶切pUC/果胶酶，将得到的果胶酶片段再亚克隆至表达载体pET32中，得到重组表达载体pET32/果胶酶，载体构建的主要步骤如下：

(1)用BamH I和Hind III双酶切重组载体pUC/果胶酶，获得目的片断果胶酶，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)：

(2)用BamH I和Hind III双酶切pET32，获得载体片断，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)：

(3)将步骤(1)和(2)得到的目的片断和载体片断用DNA凝胶收回试剂盒回收，该试剂盒购自大连TAKARA公司，具体操作按试剂盒说明书进行。

(4)将步骤(3)回收得到的目的片断和载体用T4DNA连接酶(购自大连TAKARA公司)进行连接反应，目的基因准确插入到表达载体读码框内，反应体系如下：

将重组载体pET32/果胶酶转化到大肠杆菌TOP10菌株中，再从TOP10中提取重组载体pET32/果胶酶；用热激法将重组载体pET32/果胶酶转入到宿主细胞大肠杆菌表达菌株中，用含有Amp抗性的LB平板筛选得到包含有重组载体pET32/果胶酶的大肠杆菌表达菌株转化子。

利用经优化的果胶酶基因序列的pET32重组载体为表达载体，经转化大肠杆菌BL21菌株，随机挑取转化子，其对应的表达菌转化子经0.5mM的IPTG在18℃下诱导均检测到目标蛋白的表达，其菌体总蛋白SDS-PAGE结果如图2所示，本发明的果胶酶的蛋白分子量为40kDa左右，pET32载体在目标蛋白的N-端融合了一个大小为20kDa左右的Trx片段，该片段可以增强外源蛋白表达的可溶性，果胶酶大小为60kDa左右，表达的目标蛋白如箭头所示。

实施例2

本实施例提供一种制备果胶酶蛋白的方法，具体包括如下步骤：

S1：可溶性果胶酶蛋白的表达与提取：将包含序列SEQ ID NO：1基因的pET32/果胶酶载体的大肠杆菌重组转化子在37℃的液体LB培养基中培养至OD600为0.6，然后分别加入浓度为0、0.1、0.5mM的IPTG，在18℃诱导10小时，诱导后收集的菌体超声破碎，破碎功率300W，破碎2s，间隙8s，循环90次后，离心取上清液，得到重组的可溶性融合蛋白果胶酶，SDS-PAGE结果如图3所示，利用终浓度为0、0.1、0.5mM的IPTG进行诱导，目标蛋白的表达没有显著差异，为节约成本，将IPTG诱导的浓度设定为0.1mM。

S2：果胶酶蛋白的纯化：经扩大培养和在18℃下用0.1mM IPTG诱导10小时，收集经IPTG诱导表达后的表达菌的菌体，将菌体重悬于50ml的缓冲液A(含20mM Na₂HPO₄，200mMNaCl，10mM咪唑和1mM蛋白酶抑制剂PMSF，pH 8.0)中，然后用超声破碎仪进行破碎，破碎功率300W，破碎2s，间隙8s，循环90次；将破碎后的菌液在4℃下，30000g离心15min；将离心所得到的上清液加入到经缓冲液A(pH 8.0的10mM Tris-Hcl缓冲液)平衡的镍亲合层析柱中；用含pH 8.0含40mM咪唑的10mM Tris-Hcl缓冲液漂洗柱子，然后用含200mM咪唑的pH 8.010mM Tris-Hcl缓冲液将融合蛋白洗脱下来，洗脱的蛋白上样到pH 8.0含10mM Tris-Hcl缓冲液平衡的DEAE柱，经pH 8.0含20mM NaCl的10mM Tris-Hcl缓冲液漂洗柱子后，用pH 6.0含100mM NaCl的10mM PBS缓冲液洗脱，即得到高纯度的Trx-果胶酶融合蛋白。进一步，还包括在pH值为6.0的条件下透析，将透析后的物质超滤浓缩。

S3：果胶酶蛋白的浓缩：将蛋白质样品在pH6.0的20mM NaH₂PO₄下透析，透析结束后，利用截留分子是来15kDa的超滤管进行超滤浓缩即可得到纯度在95％以上的高浓度重组果胶酶蛋白，结果如图4所示。利用胶扫描并结合Bradford法对目标蛋白的浓度进行了检测，表1是100ml经IPTG诱导的菌体中可溶性果胶酶重组蛋白经各纯化步骤的得率与纯度结果。

表1蛋白纯化结果

纯化步骤	总体积	果胶酶(mg)	目标蛋白纯度(％)	回收率(％)
					纯化前	30	28	<35	100
镍亲合纯化	12	21	>95	70
					DEAE纯化	8	14	>95	50
超滤浓缩	3.1	14	>95	50

需要说明的是，在步骤S2得到的上清液中加入SDS-PAGE样品缓冲液，对其可溶蛋白进行分析。在18℃温度下IPTG的浓度为0.1、0.5和1mM时，都可以得到可溶性果胶酶融合蛋白。为节约成本，缩短生产周期，我们优选采用诱导温度18℃，0.1mM的IPTG进行诱导表达。

对比例

茯苓的形成是由茯苓菌丝体在适宜的条件下寄生于已死松木上，不断分解松木中的营养，并将菌化后的多余物质积聚迅速膨大，形成的营养贮藏器官和休眠器官即为菌核，俗称松茯苓。利用转录组技术对茯苓的果胶分解酶的表达谱进行分析发现了该高丰度的果胶分解的酶基因。利用转录组得到的数据，设计引物，经RT-PCR扩增目标基因并连接至克隆载体，扩增的目标基因序列如序列表中SEQ ID NO.3所示，将该天然的茯苓果胶酶基因用BamH I和Hind III双酶切，并连接到同样经BamH I和Hind III双酶切的pET32表达载体。重组载体经热激转化到大肠杆菌表达菌株的感受态细胞，涂布对应的抗性LB平板，37℃恒温培养箱中培养12小时，筛选转化子。将包含优化前基因的pET32/果胶酶载体的大肠杆菌重组转化子在37℃的液体LB培养基中培养至OD₆₀₀为0.6，然后分别加入浓度为0、0.1、0.5、1mM的IPTG，在18℃诱导10小时，诱导后收集的菌体超声破碎，破碎功率300W，破碎2s，间隙8s，循环90次后，离心取上清液，未得到重组可溶性果胶酶蛋白，SDS-PAGE结果如图5所示。

根据酵母的密码子偏爱性，同样合成了该茯苓果胶酶基因如SEQ ID NO.4所示。用BamH I和Hind III双酶切，并连接到同样经BamH I和Hind III双酶切的pET32表达载体。重组载体经热激转化到大肠杆菌表达菌株的感受态细胞，涂布对应的抗性LB平板，37℃恒温培养箱中培养12小时，筛选转化子。将包含优化前基因的pET32/果胶酶载体的大肠杆菌重组转化子在37℃的液体LB培养基中培养至OD₆₀₀为0.6，然后分别加入浓度为0、0.1、0.5、1mM的IPTG，在18℃诱导10小时，诱导后收集的菌体超声破碎，破碎功率300W，破碎2s，间隙8s，循环90次后，离心取上清液，未得到重组可溶性果胶酶蛋白，SDS-PAGE结果如图6所示。

该对比例结果说明，只有本发明要求保护的人工优化后的茯苓果胶酶基因才能在大肠杆菌中实现可溶性的表达。

实施例3

本实施例对纯化的重组果胶酶对苹果汁、葡萄汁和橙汁的澄清情况进行检测。该酶能提高果汁的澄清度，具体步骤和结果如下：

(1)将0、1、2、5、10毫克的重组果胶酶分别加到10ml的新榨苹果汁中(经2000g离心10分钟所得的果汁上清)，并于室温下静置60分钟。经2000g离心10分钟所得的果汁上清，用分光光度检测它们在OD₆₀₀处的吸光值。测得的结果如表2所示，可以看出，添加了果胶酶的实验组获得的果汁吸光值要低于未加添重组果胶酶的果汁，当添加5毫克的重组果胶酶至10ml苹果汁中，其吸光值要显著低于未加重组果胶酶的实验组。

表2重组果胶酶对苹果汁产量的影响

酶的加入量(mg)	0	1	2	5	10
						OD<sub>600</sub>	1.21	1.19	1.14	1.11	1.06

(2)将0、1、2、5、10毫克的重组果胶酶分别加到10ml的新榨葡萄汁中(经2000g离心10分钟所得的果汁上清)，并于室温下静置60分钟。用分光光度检测它们在OD₆₀₀处的吸光值。测得的结果如表3所示，可以看出，添加了果胶酶的实验组获得的果汁吸光值要低于未加添重组果胶酶的果汁，当添加10毫克的重组果胶酶至10ml葡萄汁中，其吸光值要显著低于未加重组果胶酶的实验组。

表3重组果胶酶对葡萄汁产量的影响

酶的加入量(mg)	0	1	2	5	10
						OD<sub>600</sub>	0.85	0.82	0.77	0.73	0.69

(3)将0、1、2、5、10毫克的重组果胶酶分别加到10ml的新榨橙汁中(经2000g离心10分钟所得的果汁上清)，并于室温下静置60分钟。取果汁，用分光光度检测它们在OD₆₀₀处的吸光值。测得的结果如表4所示，可以看出，添加了果胶酶的实验组获得的果汁吸光值要低于未加添重组果胶酶的果汁，当添加10毫克的重组果胶酶至10ml橙汁中，其吸光值要显著低于未加重组果胶酶的实验组。

表4重组果胶酶对橙汁产量的影响

酶的加入量	0	1	2	5	10
						OD<sub>600</sub>	1.25	1.23	1.20	1.17	1.13

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，而并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

序列表

<110> 怀化学院

<120> 一种重组果酶基因及其表达方法和应用

<130> 3

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1263

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

cagctgagcg gtagcgttgg tccgaccagc agcctgagca gcaaacaggg caccatttgt 60

aatgttctga attatggtgg tagcgtgggt agcagcgata ttggtccggc aattggtaaa 120

gcatttagcg attgtgttac caaagcaacc aatggtgcaa ccctgtatgt tccgcctggt 180

aactataata tgcagacctg gcagaccctg aatcatggca ccaaatgggc atttcagctg 240

gatggtgtta ttacccgtac cagcaccaca ggtggtaata tgattgttat tcagaacgcc 300

aacgacttcg aatttttcag cagcaccggt aaaggtgcaa ttcaaggtaa tggttatcag 360

tgtcgtaatg caggtccgcg tctgattcgt gttgttacct caaccaattg gagcctgcat 420

gacattatta tggttgacag tccggaattt catctggtta ttcaggatgg tagcaatggc 480

gaagtgtata acaccgttat tcgtggtggc aatttaggtg gtagtgatgg tattgatgtt 540

tggggcacca attattggat tcacgatatt gaagtgacca atcgtgatga atgcgttacc 600

gttaaaagtc cggcaaatca tattcaggtt gagcagattt ggtgtaatca gagcggtggt 660

tcagccattg gtagcctggg tgcaaatacc accattcaga atgttctgta tcgcaacgtt 720

tataccaacg gtggcaatca gatcttcatg attaaaagca atggtggcag cggcaccgtg 780

cagaatgtta atctggaaaa ctttattgca cgcaataccg catatggcct ggatattgat 840

cagtattgga gcagccagag caccgcacct ggtaatggtg tgcagctgaa agatattacc 900

tttagcaatt gggatggctt tattaccgat ggtgcccgtc gtgcaccgat tcaggttctg 960

tgtgcagatg gtgcaccgtg taccgatatt aacattaata acgttaatct gtgggcagcc 1020

aataatcagg caaccaataa atgtcgtagc gcctatggta caggtgcatg tctgaaaagc 1080

ggcagcggtg gtagctatag ccaggttacc aaaaccatta gcaaaccgcc tgcatttacc 1140

acaccggcaa ccatgagcgg tgatctgagt gatggttttc cgaccaatag tccgattccg 1200

attcctacca ttccgcctag cttttttccg ggtacacagc cgctgaaagc actggcaggt 1260

aaa 1263

<210> 2

<211> 427

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

Gln Leu Ser Gly Ser Val Gly Pro Thr Ser Ser Leu Ser Ser Lys Gln

1 5 10 15

Gly Thr Ile Cys Asn Val Leu Asn Tyr Gly Gly Ser Val Gly Ser Ser

20 25 30

Asp Ile Gly Pro Ala Ile Gly Lys Ala Phe Ser Asp Cys Val Thr Lys

35 40 45

Ala Thr Asn Gly Ala Thr Leu Tyr Val Pro Pro Gly Asn Tyr Asn Met

50 55 60

Gln Thr Trp Gln Thr Leu Asn His Gly Thr Lys Trp Ala Phe Gln Leu

65 70 75 80

Asp Gly Val Ile Thr Arg Thr Ser Thr Thr Gly Gly Asn Met Ile Val

85 90 95

Ile Gln Asn Ala Asn Asp Phe Glu Phe Phe Ser Ser Thr Gly Lys Gly

100 105 110

Ala Ile Gln Gly Asn Gly Tyr Gln Cys Arg Asn Ala Gly Pro Arg Leu

115 120 125

Ile Arg Val Val Thr Ser Thr Asn Trp Ser Leu His Asp Ile Ile Met

130 135 140

Val Asp Ser Pro Glu Phe His Leu Val Ile Gln Asp Gly Ser Asn Gly

145 150 155 160

Glu Val Tyr Asn Thr Val Ile Arg Gly Gly Asn Leu Gly Gly Ser Asp

165 170 175

Gly Ile Asp Val Trp Gly Thr Asn Tyr Trp Ile His Asp Ile Glu Val

180 185 190

Thr Asn Arg Asp Glu Cys Val Thr Val Lys Ser Pro Ala Asn His Ile

195 200 205

Gln Val Glu Gln Ile Trp Cys Asn Gln Ser Gly Gly Ser Ala Ile Gly

210 215 220

Ser Leu Gly Ala Asn Thr Thr Ile Gln Asn Val Leu Tyr Arg Asn Val

225 230 235 240

Tyr Thr Asn Gly Gly Asn Gln Ile Phe Met Ile Lys Ser Asn Gly Gly

245 250 255

Ser Gly Thr Val Gln Asn Val Asn Leu Glu Asn Phe Ile Ala Arg Asn

260 265 270

Thr Ala Tyr Gly Leu Asp Ile Asp Gln Tyr Trp Ser Ser Gln Ser Thr

275 280 285

Ala Pro Gly Asn Gly Val Gln Leu Lys Asp Ile Thr Phe Ser Asn Trp

290 295 300

Asp Gly Phe Ile Thr Asp Gly Ala Arg Arg Ala Pro Ile Gln Val Leu

305 310 315 320

Cys Ala Asp Gly Ala Pro Cys Thr Asp Ile Asn Ile Asn Asn Val Asn

325 330 335

Leu Trp Ala Ala Asn Asn Gln Ala Thr Asn Lys Cys Arg Ser Ala Tyr

340 345 350

Gly Thr Gly Ala Cys Leu Lys Ser Gly Ser Gly Gly Ser Tyr Ser Gln

355 360 365

Val Thr Lys Thr Ile Ser Lys Pro Pro Ala Phe Thr Thr Pro Ala Thr

370 375 380

Met Ser Gly Asp Leu Ser Asp Gly Phe Pro Thr Asn Ser Pro Ile Pro

385 390 395 400

Ile Pro Thr Ile Pro Pro Ser Phe Phe Pro Gly Thr Gln Pro Leu Lys

405 410 415

Ala Leu Ala Gly Lys His His His His His His

420 425

<210> 3

<211> 1263

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

cagctgtctg ggtctgtggg gcccacatcc tcgctgtcgt cgaagcaggg caccatctgt 60

aacgttctca actatggtgg ctctgtcggt tctagtgaca tcggcccagc cattggtaaa 120

gcgttcagcg actgtgtcac caaggccacc aacggtgcta cgctctacgt gccccctggt 180

aactacaaca tgcagacttg gcagacactg aaccacggta ccaagtgggc gttccagttg 240

gacggtgtca tcacccgtac cagcaccact ggaggtaaca tgatcgtcat ccagaacgct 300

aacgacttcg agttcttctc gagcacgggc aagggtgcca tccagggtaa cggctaccag 360

tgccgcaatg ctggacctcg tctcatccgt gtggtcacgt cgactaactg gtctttgcac 420

gacatcatca tggttgactc tcccgagttc caccttgtca tccaggacgg ctcgaacggt 480

gaagtgtaca acacggtcat tcgcggagga aacctcggcg gttctgacgg tatcgacgtc 540

tggggcacaa actactggat ccacgacatc gaagtcacca accgcgacga gtgcgtcact 600

gtcaagtccc ccgcgaacca cattcaagtc gagcaaatct ggtgcaacca atccggtggc 660

tccgccattg gctcgcttgg tgccaacact accatccaga acgtgctcta ccgcaatgtg 720

tacacgaacg ggggcaacca gatctttatg atcaagtcta atggtggaag tggaacggtg 780

cagaacgtga acttggagaa cttcattgcg aggaatacgg cgtatgggtt ggatattgat 840

cagtattgga gtagccagag tactgcgccg ggcaatggtg tgcagctcaa ggacatcacc 900

ttctctaact gggacggctt catcaccgac ggtgcccgcc gcgcacccat ccaagtcctc 960

tgcgcagacg gcgccccctg cacggacatc aacatcaaca acgtcaacct ctgggccgcc 1020

aacaaccaag ccaccaacaa gtgccgtagt gcgtacggta ctggcgcctg cctcaagtcg 1080

ggcagcggcg gaagttactc gcaggtgacg aagacgatca gcaagccccc tgcgttcact 1140

actccagcaa cgatgagtgg agatttgtcg gatggcttcc cgacgaactc gccgattccg 1200

attccaacta ttccaccgtc gttcttcccc ggcacccagc cgctcaaggc tttggctgga 1260

aag 1263

<210> 4

<211> 1263

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

caattgtctg gttccgttgg tccaacttcc tcattgtcct ctaagcaggg tactatctgc 60

aacgtcttga actacggtgg ttctgttggt tcctctgaca ttggtccagc tatcggtaag 120

gctttctccg actgtgttac taaggctaca aacggtgcca ccttgtacgt tccaccaggt 180

aactacaaca tgcagacttg gcagactctg aaccacggta ctaagtgggc ttttcagttg 240

gacggtgtta tcactagaac ttccactacc ggtggtaaca tgatcgttat ccagaacgct 300

aacgacttcg agttcttctc atccactggt aagggtgcca ttcaaggtaa cggttaccag 360

tgtagaaacg ccggtccaag attgatcaga gttgttactt ctaccaactg gtccctgcac 420

gacatcatta tggttgactc tccagagttc cacctggtta ttcaagacgg ttctaacggt 480

gaggtctaca acaccgttat cagaggtggt aaccttggtg gttccgacgg tattgatgtt 540

tggggaacta actactggat tcacgacatc gaggttacca acagagatga gtgtgttacc 600

gttaagtccc cagctaacca cattcaggtt gagcagatct ggtgtaatca atccggtgga 660

tctgctatcg gttccttggg tgctaacact accattcaga acgtcctgta cagaaacgtc 720

tacaccaacg gtggaaacca gatcttcatg atcaagtcta acggcggttc cggtactgtg 780

cagaacgtta acttggagaa cttcattgcc agaaacaccg cctacggttt ggacattgac 840

caatactggt cctctcaatc cactgctcca ggtaatggtg ttcagttgaa ggacatcact 900

ttctccaact gggacggttt cattactgac ggtgctagaa gggctccaat ccaggttttg 960

tgtgctgatg gtgctccatg taccgacatc aacatcaaca acgtcaactt gtgggctgct 1020

aacaaccagg ctaccaacaa gtgtagatcc gcttacggta ctggtgcctg tttgaagtct 1080

ggttctggtg gatcttactc ccaggtcact aagactattt ccaagccacc agctttcact 1140

actccagcta ctatgtctgg tgacttgtct gacggtttcc caactaactc cccaattcca 1200

attcctacta tcccaccatc tttcttccct ggtactcaac cattgaaggc tttggctggt 1260

aag 1263

Claims

1.一种重组果胶酶基因，其特征在于，所述基因与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性。

2.如权利要求1所述的重组果胶酶基因，其特征在于，所述基因包括SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的重组果胶酶基因，其特征在于，所述基因为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。

4.一种重组果胶酶基因的表达方法，其特征在于，包括如下步骤：

5.如权利要求4所述的重组果胶酶基因的表达方法，其特征在于，还包括步骤三、蛋白纯化：用镍亲合层析柱对步骤2)得到的上清液进行纯化，先用平衡缓冲液平衡镍亲合层析柱，再将上清液过柱，用含pH 8.0含40mM咪唑的10mM Tris-Hcl缓冲液漂洗柱子，然后用含200mM咪唑的pH 8.0 10mM Tris-Hcl缓冲液将融合蛋白洗脱下来，洗脱的蛋白上样到pH8.0含10mM Tris-Hcl缓冲液平衡的DEAE柱，经pH 8.0含20mM NaCl的10mM Tris-Hcl缓冲液漂洗柱子后，用pH 6.0含100mM NaCl的10mM PBS缓冲液洗脱，即得到高纯度的重组果胶酶。

6.一种权利要求4或5所述的重组果胶酶的用途，其特征在于，所述重组果胶酶用于构建重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

7.一种权利要求4或5所述的重组果胶酶的用途，其特征在于，所述重组果胶酶用于果胶水解。

8.如权利要求7所述的重组果胶酶的用途，其特征在于，所述重组果胶酶用于含果胶成分的水解。