CN105793417A

CN105793417A - 变体酶

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Publication number: CN105793417A
Application number: CN201480052997.3A
Authority: CN
Inventors: M·福卡拉基; R·W·霍姆斯; T·卡佩尔; B·R·凯莱门; S·克拉利; S·E·兰茨; I·尼古拉耶夫; 德尔克利 W·范; W·范德尔克利; 利斯豪特 J·F·T·范; J·F·T·范利斯豪特; 斯提格桑斯 S·范; S·范斯提格桑斯
Original assignee: Danisco USA Inc
Current assignee: Danisco USA Inc; Danisco US Inc
Priority date: 2013-07-29
Filing date: 2014-07-24
Publication date: 2016-07-20
Also published as: BR112016002067A2; US20160168550A1; EP3027742B1; AU2014296572A1; JP2016533739A; EP3027743A1; MX2016001319A; US20190169587A1; ZA201600633B; WO2015017255A1; CN105916981A; JP2016533741A; MX2016001317A; CN105683369A; JP2016533740A; WO2015017256A1; US20160186155A1; EP3027741B1; DK3027741T3; DK3027742T3

Abstract

本发明公开了糖基水解酶变体，尤其是糖基水解酶家族61中的某些氧化还原酶的变体。本发明还描述了编码所述糖基水解酶变体的核酸、包含所述糖基水解酶变体的组合物、制备所述变体的方法、以及使用所述变体的方法。

Description

变体酶

相关专利申请的交叉引用

本申请要求所有在2013年7月29日提交的美国临时专利申请序列号61/859,630、61/859,666、61/859,680、61/859,704、61/859,712、61/859,721和61/859,735的优先权权益，所有这些专利内容全文以引用方式并入本文。

发明领域

本公开总体上涉及糖基水解酶变体，尤其是糖基水解酶家族61的某些氧化还原酶的变体。本发明还描述了编码糖基水解酶变体的核酸、包含糖基水解酶变体的组合物、制备变体的方法以及使用变体的方法。

政府权利

本发明是在政府支持下遵照能源部颁发的有条件奖励项目No:De-Fc36-08go18078做出的。政府在本发明中享有一定权利。

发明背景

纤维素和半纤维素是通过光合作用产生的最丰富的植物材料。它们能被许多产生胞外酶的微生物(包括细菌、酵母和真菌)降解并且用作能量源，所述胞外酶能够将聚合底物水解成单体糖(Aro等人，2001)。因为非可再生资源方法的局限性，纤维素成为主要可再生能源的潜能是巨大的(Krishna等人，2001)。通过生物方法对纤维素的有效利用是克服食品、饲料和燃料短缺的一种途径(Ohmiya等人，1997)。

纤维素酶是水解纤维素(β-1,4-葡聚糖或βD-糖苷键)导致形成葡萄糖、纤维二糖、纤维低聚糖等的酶。传统上将纤维素酶分成三个主要类别：内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)(“EG”)、外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)(“CBH”)和β-葡糖苷酶(β-D-葡糖苷葡糖水解酶；EC3.2.1.21)(“BG”)。(Knowles等人，1987；Shulein，1988)。内切葡聚糖酶主要作用在纤维素纤维的非晶部分，而纤维二糖水解酶还能够降解结晶纤维素(Nevalainen和Penttila，1995)。β-葡糖苷酶用于从纤维二糖、纤维低聚糖和其他葡萄糖苷释放D-葡萄糖单元(Freer,1993)。

已知很多细菌、酵母和真菌产生纤维素酶。某些真菌产生能够降解纤维素的结晶形式的全纤维素酶体系，使得纤维素酶容易通过发酵大量产生。丝状真菌发挥特别的作用，因为许多酵母例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)缺乏水解纤维素的能力。(参见，例如，Aro等人，2001；Aubert等人，1988；Wood等人，1988和Coughlan等人。)

CBH、EG和BG的真菌纤维素酶类别可进一步扩展以在每个类别内包括多个组分。例如，已经从包括里氏木霉(Trichodermareesei)的多种真菌来源分离得到多种CBH、EG和BG，里氏木霉(Trichodermareesei)含有产生2种CBH(例如，CBHI(也称为Cel7A或糖基水解酶家族(GH)7A)和CBHII(也称为Cel6A或GH6A))的已知基因、多种EG(例如，EGI(也称为Cel7B或GH7B)、EGII(也称为Cel5A或GH5A)、EGIII(也称为Cel12A或GH12A)、EGV(也称为Cel45A或GH45A)、EGVI(也称为Cel74A或GH74A)、EGVII(也称为Cel61B或GH61b)和EGVIII)的已知基因、以及一系列BG(例如BG1、BG3和BG5)的已知基因。

为了将结晶纤维素有效地转化成葡萄糖，通常需要包含来自CBH、EG和BG每个类别的组分或酶活性的全纤维素酶体系，其中分离的组分在水解结晶纤维素方面不太有效(Filho等人，1996)。已观察到来自不同类别的纤维素酶组分之间的协同关系。具体地讲，EG型纤维素酶和CBH型纤维素酶协同地相互作用以更有效地降解纤维素。(参见，例如，Wood，1985)。

纤维素酶用于处理纺织物以增强洗涤剂组合物的清洁能力、用作软化剂、用于改善棉织物的触感和外观等(Kumar等人，1997)是本领域已知的。

文献中已经描述了具有改善的清洁性能的含纤维素酶的洗涤剂组合物(美国专利4,435,307；英国申请2,095,275和2,094,826)和用于处理织物以改善纺织物的触感和外观的含纤维素酶的洗涤剂组合物(美国专利5,648,263、5,691,178、5,776,757和英国申请1,358,599；“TheShizuokaPrefecturalHammamatsuTextileIndustrialResearchInstituteReport”，第24卷，第54-61页，1986)。

纤维素酶用于将纤维素原料转化为乙醇也是本领域内已知的。这一转化方法具有许多优点，包括易于利用原本将被丢弃的大量原料(例如，燃烧或填埋该原料)。已经考虑将其他材料用作乙醇生产的原料，这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，例如，木材、草本作物和农业或城市废物。近年来，已经鉴定了为增强或加强纤维素材料的酶水解提供进一步辅助作用的新类别糖基水解酶，但是这些新型辅助酶中许多酶的作用机制尚未完全阐明。一个早期已被标注为GH61家族(参见例如，Harris等人，“StimulationofLignocellulosicBiomassHydrolysisbyProteinsofGlycosideHydrolaseFamily61:StructureandFunctionofaLarge,EnigmaticFamily”Biochemistry2010，第49卷，第3305–3316页)的此类糖基水解酶家族曾多次被重新标注，但在发现其中一些家族成员为溶解性多糖单加氧酶之后，其最近被标注为附属活力酶(AA)家族9(LevasseurA.等人，“ExpansionoftheenzymaticrepertoireoftheCAZydatabasetointegrateauxiliaryredoxenzymes”BiotechnolBiofuels2013，第6卷，第1期，第41页)。至少两种GH61酶存在于里氏木霉中(SaloheimoM.,“cDNAcloningofaTrichodermareeseicellulaseanddemonstrationofendoglucanaseactivitybyexpressioninyeast”EurJBiochem.1997，第249卷，第2期，第584-591页；Karlsson等人，“HomologousexpressionandcharacterizationofCel61A(EGIV)ofTrichodermareesei”Eur.J.Biochem.2001，第268卷，第6498-6507页；Karkehabadi等人，“Thefirststructureofaglycosidehydrolasefamily61member,Cel61BfromHypocreajecorina,at1.6Aresolution”JMolBiol.2008，第383卷，第1期，第144-154页；Martinez等人，“Genomesequencingandanalysisofthebiomass-degradingfungusTrichodermareesei(syn.Hypocreajecorina)”NatureBiotechnology2008，第26卷，第553-560页)。不久前，据报道称在里氏木霉基因组中又鉴定出多达四种此类糖基水解酶(M.等人，“Re-annotationoftheCAZygenesofTrichodermareeseiandtranscriptioninthepresenceoflignocellulosicsubstrates”2012，MicrobCellFact.第4卷，第11期，第134页)。

提供具有改善的能力的一组GH61酶变体将在本领域具有优势，因为当其与一种或多种纤维素酶相结合，以及任选还与一种或多种半纤维素酶相结合时，可以加强将木素纤维素生物质底物水解为单糖、二糖和多糖的功效和效率。变体GH61多肽的改善特性包括但不限于：改变的依赖于温度的活性分布、热稳定性、pH活性、pH稳定性、底物特异性、产物特异性和化学稳定性。

发明内容

本发明描述了分离的具有糖基水解酶家族61(GH61)活性的变体多肽、编码此类酶的核酸、含有编码GH61的多核苷酸的宿主细胞(如，表达GH61多肽的宿主细胞)、含有GH61多肽的组合物以及生产和使用它们的方法。

因此，本发明的方面提供亲本GH61酶的变体，其中所述变体具有纤维素酶加强活性，与SEQIDNO:3具有至少80％的序列同一性，并且相比于亲本GH61酶具有选自以下各项的至少一种改善的特性或性能：(a)表达(收率/产量)，(b)热稳定性和/或Tm，(c)全水解产物稀酸预处理玉米秸秆(whPCS)的水解测定活性，以及(d)稀氨预处理玉米秸秆(daCS)的水解测定活性。在某些实施方案中，GH61酶为GH61A酶。

在某些实施方案中，GH61变体具有几个突变，其中的“几个”是指1至10个突变(例如，相比于亲本GH61酶，1至10个氨基酸置换)。

根据本发明的方面的GH61变体，包括但不限于以下变体：

1.亲本糖苷水解酶家族61(GH61)酶的变体，其中所述变体具有纤维素酶活性，与SEQIDNO:3具有至少80％的序列同一性，并且相比于所述亲本GH61酶具有至少一种显著改善的特性，其中所述至少一种显著改善的特性选自：显著更高的解链温度(T_m)，在全水解产物酸预处理玉米秸杆(whPCS)测定中显著改善的性能，在稀氨玉米秸秆(daCS)测定中显著改善的性能，显著改善的蛋白质生产，以及这些特性的组合。

2.1的变体，其中所述变体相比于所述亲本GH61酶具有显著更高的解链温度(T_m)。

3.2的变体，其中所述变体包含选自下列的氨基酸置换：G301S、D124N、S164M、Y318W和它们的组合，其中每个氨基酸置换的位置与SEQIDNO:3对应。

4.1的变体，其中所述变体相比于所述亲本GH61酶，在全水解产物酸预处理玉米秸秆(whPCS)测定以及在稀氨玉米秸秆(daCS)测定中具有显著改善的性能。

5.4的变体，其中所述变体包含选自下列的氨基酸置换：K58V、K64L、P316F、S297E和它们的组合，其中每个氨基酸置换的位置与SEQIDNO:3对应。

6.1的变体，其中所述变体相比于所述亲本GH61酶，在稀氨玉米秸秆(daCS)测定中具有显著改善的性能。

7.6的变体，其中所述变体包含选自下列的氨基酸置换：G295C、G295T、N315W、T303G、Y317W和它们的组合，其中每个氨基酸置换的位置与SEQIDNO:3对应。

8.1的变体，其中所述变体相比于所述亲本GH61酶，在全水解产物酸预处理玉米秸秆(whPCS)测定中具有显著改善的性能。

9.8的变体，其中所述变体包含选自下列的氨基酸置换：H200A、S185D、P316A、N51E和它们的组合，其中每个氨基酸置换的位置与SEQIDNO:3对应。

10.1的变体，其中所述变体相比于所述亲本GH61酶具有显著改善的蛋白质生产。

11.10的变体，其中所述变体包含选自下列的氨基酸置换：V80T、A16N、N51H、N51T、T108K和它们的组合，其中每个氨基酸置换的位置与SEQIDNO:3对应。

12.1的变体，其中所述变体包含选自下列的氨基酸置换：G301S、D124N、S164M、Y318W、A129N、A168K、A16N、A201D、D197A、D197E、D197L、D197M、G235K、G235L、G235S、G295C、G295T、G298C、G301P、H200A、K106C、K58V、K64L、K70E、K70L、K70N、K70S、L290A、L290M、N10D、N315W、N51E、N51H、N51T、P316A、P316F、P52F、Q167K、Q320A、Q320P、Q320S、R304D、R304P、S135E、S185D、S187D、S297C、S297E、S300T、T107E、T107G、T107M、T107N、T107Q、T108A、T108K、T127I、T287A、T303G、T303P、T313K、V104A、V80T、Y291F、Y291W、Y317W和它们的组合。

在某些实施方案中，亲本GH61是真菌糖基水解酶61(GH61)，例如，源自红褐肉座菌(Hypocreajecorina)、深绿肉座菌(Hypocreaatroviridis)、绿肉座菌(Hypocreavirens)、太瑞斯梭孢壳霉(Thielaviaterrestris)或异梭孢壳菌(Thielaviaheterothallica)(或它们各自的无性型、有性型或全型的对应形式)的GH61A，例如，选自SEQIDNO:3、72、73、74和77中任一者的GH61A。

本发明的方面包括酶的催化结构域和/或碳水化合物结合结构域中的变体，所述酶的催化结构域和/或碳水化合物结合结构域与红褐肉座菌GH61A(SEQIDNO:34)的催化结构域和/或红褐肉座菌GH61A(SEQIDNO:51)的碳水化合物结合结构域具有同源性。因此，属于红褐肉座菌GH61A的催化结构域范围内的上述变体中的任一种或其任何组合可应用于与红褐肉座菌GH61A酶的催化结构域同源的催化结构域。同样地，属于红褐肉座菌GH61A的碳水化合物结合结构域范围内的上述变体中的任一种或其任何组合可应用于与红褐肉座菌GH61A酶的碳水化合物结合结构域同源的碳水化合物结合结构域。如上所述，这些催化结构域和/或碳水化合物结合结构域变体相对于它们各自的亲本酶具有至少一种改善的特性。与红褐肉座菌GH61A(SEQIDNO:34)同源的催化结构域的例子示于图2A至图2C中。与红褐肉座菌GH61A(SEQIDNO:51)同源的碳水化合物结合结构域的例子示于图3中。此外，构思了包含(1)GH61变体的催化结构域和第二种酶的碳水化合物结合结构域或(2)GH61变体的碳水化合物结合结构域和第二种酶的催化结构域的嵌合酶，其中嵌合酶的GH61结构域包含如本文所述的一种或多种变体氨基酸。

本发明的方面包括分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含如本文所述的编码亲本GH61变体的多核苷酸序列。所述分离的多核苷酸可存在于载体中，例如，表达载体或用于扩增多核苷酸的载体。该载体可存在于宿主细胞中，该宿主细胞用于扩增载体和/或表达本文所述的所编码的GH61变体。该宿主细胞可以是用于扩增GH61变体多核苷酸和/或表达所编码的GH61变体的任何细胞，例如，细菌细胞、真菌细胞等。可使用的合适真菌细胞类型的例子包括丝状真菌细胞，例如里氏木霉(Trichodermareesei)、长梗木霉(Trichodermalongibrachiatum)、绿色木霉(Trichodermaviride)、康宁木霉(Trichodermakoningii)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、青霉属(Penicillium)、腐质霉属(Humicola)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、灰腐质霉(Humicolagrisea)、金孢子菌属(Chrysosporium)、勒克瑙金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粘帚霉属(Gliocladium)、曲霉属(Aspergillus)、镰孢属(Fusarium)、脉孢菌属(Neurospora)、肉座菌属(Hypocrea)、裸孢壳属(Emericella)、黑曲霉(Aspergillusniger)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)和构巢曲霉(Aspergillusnidulans)的细胞。或者，真菌宿主细胞可以是酵母细胞，例如酿酒酵母(Saccharomycescervisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizzosaccharomycespombe)、许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)、乳酸克鲁维酵母(Kluveromyceslactus)、产朊假丝酵母(Candidautilis)、白假丝酵母(Candidaalbicans)、树干毕赤酵母(Pichiastipitis)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、红发夫酵母(Phaffiarhodozyma)、Arxulaadeninivorans、汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)或者多形德巴利酵母(Debaryomycespolymorphus)。

本发明的方面包括产生变体GH61的方法，该方法包括在合适的培养基中并且在合适的条件下培养含有编码GH61变体的多核苷酸的宿主细胞，以(例如)在编码GH61变体的多核苷酸存在于表达载体中的情况下(即，在编码GH61变体的多核苷酸有效连接至驱动宿主细胞中的GH61变体表达的启动子的情况下)由该多核苷酸表达(或产生)GH61变体。在某些实施方案中，该方法还包括分离所产生的GH61变体。

本发明的方面还包括含有本文所述的GH61变体的组合物。合适组合物的例子包括但不限于，洗涤剂组合物、饲料添加剂，以及用于处理(或水解)纤维素底物(例如，含有纤维素的纺织物，例如牛仔布；含有纤维素的生物质材料，例如已任选地经过预水解加工预处理的木素纤维素生物质材料的混合物等)的组合物。包括如本文所述的GH61变体和纤维素底物的组合物代表本发明的其他方面。含有GH61变体的洗涤剂组合物包括衣物洗涤剂和盘碟洗涤剂，其中此类洗涤剂可还包含另外的组分，例如，表面活性剂。合适的纤维素底物的例子包括但不限于：草、柳枝稷、绳草、黑麦草、草芦、芒草、糖加工残渣、甘蔗渣、农业废弃物、稻秆、稻壳、大麦秸秆、玉米芯、谷类秸秆、小麦秸秆、卡诺拉油菜秸秆、燕麦秸秆、燕麦壳、玉米纤维、秸秆、大豆秸秆、玉米秸秆、林业废弃物、木浆、再生木浆纤维、造纸污泥、锯屑、阔叶木、针叶木及这些物质的组合。

本发明的方面包括水解纤维素底物的方法，该方法包括将所述底物与本文所述的变体GH61接触。在某些实施方案中，GH61变体以无细胞组合物形式提供，而在其他实施方案中，GH61变体以宿主细胞组合物形式提供，其中所述宿主细胞表达所述GH61变体。因此，用于水解纤维素底物的方法的某些实施方案将底物与含有GH61变体表达载体的宿主细胞接触。在某些实施方案中，该方法用于将木素纤维素生物质转化为葡萄糖，其中在这些实施方案的一些中，所述木素纤维素生物质选自但不限于：草、柳枝稷、绳草、黑麦草、草芦、芒草、糖加工残渣、甘蔗渣、农业废弃物、稻秆、稻壳、大麦秸秆、玉米芯、谷类秸秆、小麦秸秆、卡诺拉油菜秸秆、燕麦秸秆、燕麦壳、玉米纤维、秸秆、大豆秸秆、玉米秸秆、林业废弃物、木浆、再生木浆纤维、造纸污泥、锯屑、阔叶木、针叶木及这些物质的组合。在某些其他实施方案中，纤维素底物是含纤维素的纺织物，例如，牛仔布，其中在这些实施方案的一些中，该方法用于处理靛蓝染色的牛仔布(例如，用于石洗工艺中)。

本发明的方面包括含有本文所述的GH61变体的细胞培养上清液组合物。例如，通过如下方式获得细胞培养上清液：在合适的培养基中并且在合适的条件下培养含有编码GH61变体的多核苷酸的宿主细胞，以由该多核苷酸表达GH61变体，并且将GH61变体分泌到细胞培养上清液中。此类细胞培养上清液可包含由宿主细胞产生的其他蛋白质和/或酶，包括内源性和/或外源性表达的蛋白质和/或酶。此类培养基上清液可按原样使用，而仅经受最少的生产后加工或无需生产后加工，所述生产后加工通常可包括用于除去细胞碎片的过滤过程、细胞杀灭过程、和/或用于富集或浓缩其中的酶的超滤或其他步骤。此类上清液在本文中称为“全培养肉汤”或“全纤维素酶培养肉汤”。

GH61变体可通过与一种或多种纤维素酶，和/或一种或多种半纤维素酶共表达来产生。备选地，可在无纤维素酶或半纤维素酶的情况下产生GH61变体。在后一种情况中，GH61变体任选地可与一种或多种纤维素酶和/或一种或多种半纤维素酶进行物理混合以形成酶组合物，该酶组合物可用于特定应用中，例如，用于水解木素纤维素生物质底物。在另外的实施方案中，GH61变体还可与一种或多种辅助酶共表达或物理混合。已知的辅助酶包括(例如)某些甘露聚糖酶，有时可表征为半纤维素酶，但在更多时候被认为是辅助酶、半乳聚糖酶、阿拉伯糖酶、木质素酶、淀粉酶、葡糖醛酸酶、蛋白酶、酯酶(例如，阿魏酸酯酶、乙酰木聚糖酯酶、香豆酸酯酶、果胶甲基酯酶)、脂肪酶、某些其他GH61家族酶、木葡聚糖酶、CIP1、CIP1样蛋白质、CIP2、CIP2样蛋白质、膨胀因子(swollenin)、膨胀素(expansions)、纤维二糖氢化酶、锰过氧化物酶和纤维素破坏蛋白，所述纤维素破坏蛋白可为(例如)纤维素结合模块。

也构思了含有所需变体GH61酶的其他组合物，以及使用此类组合物的方法。

附图简述

图1示出了来自红褐肉座菌的野生型GH61A(GH61A)的核酸序列(顶行)(SEQIDNO:1)和氨基酸序列(底行)(SEQIDNO:2)。SEQIDNO:2中的信号序列加下划线表示。

图2A、图2B和图2C示出了与红褐肉座菌GH61A具有同源性的糖基水解酶催化结构域的氨基酸序列比对(Uniprot)。对下列酶的催化结构域进行比对(SEQIDNO表示各酶的催化结构域的序列)：红褐肉座菌GH61A(SEQIDNO:34)、红棕肉座菌EGIV(SEQIDNO:35)、丰孢木霉EGIV(SEQIDNO:36)、东方肉座菌EGIV(SEQIDNO:37)、木霉属物种EGIV(SEQIDNO:38)、深绿肉座菌GH61(SEQIDNO:39)、绿肉座菌GH61(SEQIDNO:40)、太瑞斯梭孢壳霉GH61(SEQIDNO:41)、四孢脉孢菌EGIV(SEQIDNO:42)、四孢脉孢菌推定蛋白(SEQIDNO:43)、异梭孢壳菌GH61(SEQIDNO:44)、粗糙脉孢菌EGIV(SEQIDNO:45)、大孢粪壳菌推定蛋白(SEQIDNO:46)、小麦全蚀病菌EGIV(SEQIDNO:47)、鞭毛藻丛赤壳菌推定蛋白(SEQIDNO:48)、假禾谷镰刀菌推定蛋白(SEQIDNO:49)以及玉蜀黍赤霉推定蛋白(SEQIDNO:50)。

图3示出了所示糖基水解酶的以下碳水化合物结合结构域的氨基酸序列比对(Uniprot)：来自红褐肉座菌(Hypocreajecorina)的GH61A(SEQIDNO:51)、来自绿肉座菌(Hypocreavirens)的GH61酶(SEQIDNO:52)、来自太瑞斯梭孢壳霉(Thielaviaterrestris)的糖基水解酶家族28酶(SEQIDNO:53)、来自深绿肉座菌(Hypocreaatroviridis)的糖基水解酶家族45酶(SEQIDNO:54)、来自烟色新萨托菌(Neosartoryafumigata)的推定内切葡聚糖酶(SEQIDNO:55)、来自土曲霉(Aspergillusterreus)的推定酶(SEQIDNO:56)、来自红褐肉座菌(Hypocreajecorina)的Cip1(SEQIDNO:57)、来自红棕肉座菌(Hypocrearufa)的外切葡聚糖酶1(SEQIDNO:58)、来自绿肉座菌(Hypocreavirens)的糖基水解酶家族7酶(SEQIDNO:59)、来自深绿肉座菌(Hypocreaatroviridis)的糖基水解酶家族5酶(SEQIDNO:60)、来自费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)的糖基水解酶家族45酶(SEQIDNO:61)、来自康宁木霉(Trichodermakoningii)的外切葡聚糖酶1(SEQIDNO:62)、来自禾生炭疽菌(Colletotrichumgraminicola)的糖基水解酶家族61(SEQIDNO:63)、来自禾生炭疽菌(Colletotrichumgraminicola)的糖基水解酶家族61(SEQIDNO:64)、来自少孢节丛孢菌(Arthrobotrysoligospora)的推定酶(SEQIDNO:65)、来自哈茨木霉(Trichodermaharzianum)的纤维二糖水解酶(SEQIDNO:66)、以及来自青霉属(Penicilliumsp.)的内切葡聚糖酶(SEQIDNO:67)。

详细描述

现将使用以下的定义和例子仅以参考方式对本发明进行详细的描述。本文提及的所有专利和出版物，包括在这些专利和出版物中公开的所有序列明确地以引用方式并入本文。

除非本文另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员一般理解的含义相同。Singleton等人，DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology，第3版，JohnWileyandSons,Ltd.,NewYork(2007)，以及Hale和Marham，TheHarperCollinsDictionaryofBiology,HarperPerennial,NY(1991)为技术人员提供了本发明所用的许多术语的通用词典。虽然与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料均可用于本发明的实践或测试，但本文描述了优选的方法和材料。数值范围包括限定范围的端值在内。除非另外指明，否则核酸以5'到3'方向从左至右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左至右书写。对于本领域的定义和术语，从业者应特别依据如下文献：Green和SambrookMolecularCloning:ALaboratoryManual(第四版)，ColdSpringHarborLaboratoryPress2012和AusubelFM等人，1993。应当理解，本发明不限于所述的特定方法、方案和试剂，它们可有所不同。

本文提供的标题并不对本发明的各个方面或实施方案构成限制，可通过参考整篇说明书了解本发明的各个方面或实施方案。因此，通过参考整篇说明书更全面地定义接下来定义的术语。

本文引用的所有出版物均明确地以引用方式并入本文，用于描述和公开可结合本发明使用的组合物和方法。

I.定义

术语“氨基酸序列”与术语“多肽”、“蛋白”和“肽”同义，是可互换使用的。在此类氨基酸序列表现出活性的情况下，它们可被称为“酶”。对于氨基酸残基使用了常规的单字母或三字母代码，以标准的氨基至羧基末端的方向(即，N→C)呈现氨基酸序列。

术语“核酸”涵盖了DNA、RNA、异源双链核酸分子以及能够编码多肽的合成分子。核酸可以是单链或双链的，且可具有化学修饰。术语“核酸”和“多核苷酸”是可互换使用的。因为遗传密码是简并的，可使用一种以上的密码子编码特定氨基酸，本发明的组合物和方法涵盖编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。因此，本发明构思了编码GH61或其变体的每种可能的变体核苷酸序列，考虑到遗传密码的简并性，所有这些变体核苷酸序列都是可能的。除非另外指明，否则核酸序列以5'至3'方向呈现。

“纤维素酶”是指细菌或真菌外切葡聚糖酶或外切纤维二糖水解酶，和/或内切葡聚糖酶，和/或β-葡糖苷酶。已知这三种不同类型的纤维素酶协同作用以将纤维素及其衍生物转化成葡萄糖。

“内切葡聚糖酶”或“EG”或“EG酶”或“EG多肽”，如本文所用被定义为内切-1,4-β-D-葡聚糖酶，其催化纤维素、地衣多糖和谷类β-D-葡聚糖中1,4β-D-糖苷键的内切水解。在纤维素水解中，这种活性产生新的链末端，该链末端是CBH作用的底物。EG也将水解β-D-葡聚糖(其中也含有1,3-键)中的1,4-键。某些EG已经显示出“进行性地”作用于结晶纤维素[参见例如，Wilson,D.B.Threemicrobialstrategiesforplantcellwalldegradation.Ann.N.Y.Acad.Sci.2008,1125,289–297；和Li,Y,等人Increasedcrystallinecelluloseactivityviacombinationsofaminoacidchangesinthefamily9catalyticdomainandfamily3ccellulosebindingmoduleofThermobifidafuscaCel9A.Appl.Environ.Microbiol.2010,76,2582–2588]。

“GH61”或“GH61酶”等是指属于糖基水解酶61家族的酶，例如，糖基水解酶61a(GH61A)家族。GH61酶可来自真菌细胞，包括真菌亚门或卵菌亚门的丝状真菌。丝状真菌的特征是其营养菌丝体的细胞壁由几丁质、葡聚糖、脱乙酰壳多糖、甘露聚糖和其他复合多糖组成，营养菌丝体的营养生长是通过菌丝伸长来进行，并且碳分解代谢是专性好氧的。丝状真菌亲本细胞可为以下各属(但不限于以下各属)的物种的细胞：木霉属(Trichoderma)，例如，长梗木霉(Trichodermalongibrachiatum)、绿色木霉(Trichodermaviride)、康宁木霉(Trichodermakoningii)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)；青霉属(Penicilliumsp.)；腐质霉属(Humicolasp.)，包括特异腐质霉(Humicolainsolens)和灰腐质霉(Humicolagrisea)；金孢子菌属(Chrysosporiumsp.)，包括勒克瑙金孢子菌(C.lucknowense)；毁丝霉属(Myceliophthorasp.)；粘帚霉属(Gliocladiumsp.)；曲霉属(Aspergillussp.)；镰孢属(Fusariumsp.)；脉孢菌属(Neurosporasp.)；肉座菌属(Hypocreasp.)，例如，红褐肉座菌(Hypocreajecorina)；以及裸孢壳属(Emericellasp.)。如本文所用，术语“木霉属(Trichoderma)”或“木霉属(Trichodermasp.)”是指先前已归类为木霉属或目前归类为木霉属的任何真菌菌株。在某些实施方案中，GH61酶可来自非丝状真菌细胞。GH61A酶的例子包括在红褐肉座菌(Hypocreajecorina)(里氏木霉(Trichodermareesei))、红棕肉座菌(Hypocrearufa)、东方肉座菌(Hypocreaorientalis)、深绿肉座菌(Hypocreaatroviridis)、绿肉座菌(Hypocreavirens)、构巢裸壳孢菌(Emericellanidulans)、土曲霉(Aspergillusterreus)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、黑曲霉(Aspergillusniger)、白曲霉(Aspergilluskawachii)、黄曲霉(Aspergillusflavus)、棒曲霉(Aspergillusclavatus)、小麦全蚀病菌(Gaeumannomycesgraminis)、丰孢木霉(Trichodermasaturnisporum)、四孢脉孢菌(Neurosporatetrasperma)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、烟色新萨托菌(Neosartoryafumigate)、烟色新萨托菌(Neosartoryafumigate)、费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)、太瑞斯梭孢壳霉(Thielaviaterrestris)和异梭孢壳菌(Thielaviaheterothallica)中发现的酶。在某些方面，GH61酶包含的氨基酸序列为：以SEQIDNO:3、72、73、74、77示出的任一种成熟GH61酶序列，与这些成熟GH61酶序列具有至少60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，这些成熟GH61酶序列的等位变体，或者这些成熟GH61酶序列中具有纤维素酶加强活性的片段。在某些实施方案中，GH61A酶具有纤维素酶加强活性，并且含有与SEQIDNO:3具有至少60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列，或者这些氨基酸序列中具有纤维素酶加强活性的片段或衍生物。

当提及GH61酶时，所谓“GH61活性”或“GH61A活性”或“活性”是指GH61家族成员特征性的纤维素酶加强活性。具体地讲，当GH61酶与某些纤维素酶组合时，GH61酶展示出改善的能力，可以加强水解木素纤维素生物质底物以(例如)生成单糖、二糖和多糖的功效和效率。

如本文中所用的酶、蛋白质、多肽、核酸或多核苷酸的“变体”是指该变体衍生自亲本多肽或亲本核酸(例如，天然的、野生型或其他定义的亲本多肽或核酸)，与所述亲本相比，该变体包含至少一种修饰或改变，其中此类修饰或改变是人为干预产生的。因此，变体相比于亲本可具有几个突变，其中“几个”是指1至10个突变。例如，相比于SEQIDNO:3具有1至10个氨基酸置换的变体可被称为具有几个置换的GH61变体。改变/修饰可包括亲本中一个或多个位点的氨基酸/核酸残基置换为不同的氨基酸/核酸残基，亲本中一个或多个位点缺失氨基酸/核酸残基(或一系列氨基酸/核酸残基)，亲本中一个或多个位点插入氨基酸/核酸残基(或一系列氨基酸/核酸残基)，氨基酸序列的氨基端和/或羧基端截短或核酸序列的5'端和/或3'端截短，以及上述改变/修饰的任何组合。根据本发明各方面的变体GH61酶(有时称为“GH61变体”或“GH61A变体”)保留了纤维素酶加强活性，但在某些特定方面可具有改变的特性，例如，具有改善的特性。例如，变体GH61酶可具有改变的最适pH、改善的热稳定性或氧化稳定性，或这些特性的组合，但是变体GH61酶将保留其特征性的纤维素酶加强活性。在某些实施方案中，变体GH61酶为上文所定义的GH61A酶的变体，且具有纤维素酶加强活性。在本发明的一些方面中，变体GH61A酶含有与SEQIDNO:3具有至少60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列，或这些氨基酸序列中的酶活性片段。

“组合的变体”是包含两个或更多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)突变、置换、缺失和/或插入的变体。

如本文所用的“亲本”或“亲本的”多核苷酸、多肽或酶序列(例如，“亲本GH61酶”)或其等同物，是指用作设计变体多核苷酸、多肽或酶的起点或模板的多核苷酸、多肽或酶序列。在某些实施方案中，亲本酶为上述GH61A酶(例如，SEQIDNO:3)。还要指出的是，词语“亲本”或“亲本的”在上下文中可互换使用。

术语“野生型”是指天然存在的多肽或多核苷酸序列，即，不包括人为改变的序列。在一些情况下，使用野生型序列作为亲本的序列。

当谈及核酸部分使用时，术语“异源”表示该核酸包含自然界中相互之间通常不具有相同关系的两种或更多种亚序列。例如，这种核酸通常重组产生，具有例如来自无关基因的两种或更多种序列，这些序列经排列而形成新的功能性核酸，例如启动子来自一种来源，而编码区来自另一种来源。类似地，异源多肽通常是指自然界中相互之间不具有相同关系的两种或更多种亚序列(例如，融合多肽)。

当谈及(例如)细胞、核酸、多肽或载体使用时，术语“重组”表示该细胞、核酸、多肽或载体已经通过引入异源核酸或多肽，或改变天然核酸或多肽进行了修饰，或该细胞衍生自进行了此类修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞内不存在的基因，或表达在另外情况下异常地表达、表达不足或者根本不表达的天然基因。

如本文所用，术语“分离的”或“纯化的”是指从天然产生组分的环境中移出的该组分。一般来讲，在分离的或纯化的核酸或多肽样品中，相比于天然产生核酸或多肽的环境，所关注的核酸或多肽具有更高的绝对或相对浓度。

当描述组合物中的组分或材料(例如，多肽或多核苷酸)时，术语“富集的”是指相比产生富集的组合物的起始组合物，富集的组合物中的组分或材料具有相对更高的浓度。例如，相比于来自宿主生物体的初始发酵产物，富集的GH61组合物(或样品)是指GH61的相对或绝对浓度都增加的组合物。

如本文所用，术语“启动子”是指用于引导下游基因转录的核酸序列。启动子通常适用于正在表达靶基因的宿主细胞。启动子与其他转录和翻译调控核酸序列(也称为“控制序列”)都是表达给定基因所必需的。一般来讲，转录和翻译调控序列包括但不限于，启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活子序列。“组成型”启动子是在大多数环境条件和发育条件下有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调控下有活性的启动子。本发明中适用的诱导型启动子的例子是里氏木霉(红褐肉座菌)cbh1启动子，其以登录号D86235保藏在GenBank中。在另一个方面，启动子为来自红褐肉座菌的cbhII或木聚糖酶启动子。合适启动子的例子包括来自泡盛曲霉或黑曲霉葡糖淀粉酶基因的启动子(Nunberg,J.H.等人，(1984)Mol.Cell.Biol.4,2306-2315；Boel,E.等人(1984)EMBOJ.3,1581-1585)、米黑毛霉羧基蛋白酶基因、红褐肉座菌纤维二糖水解酶I基因(Shoemaker,S.P.等人(1984)欧洲专利申请EP0137280A1)、构巢曲霉trpC基因(Yelton,M.等人，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81,1470-1474；Mullaney,E.J.等人，(1985)Mol.Gen.Genet.199,37-45)、构巢曲霉alcA基因(Lockington,R.A.等人，(1986)Gene33,137-149)、构巢曲霉tpiA基因(McKnight,G.L.等人，(1986)Cell46,143-147)、构巢曲霉amdS基因(Hynes,M.J.等人，(1983)Mol.CellBiol.3,1430-1439)、红褐肉座菌xln1基因、红褐肉座菌cbh2基因、红褐肉座菌eg1基因、红褐肉座菌eg2基因、红褐肉座菌eg3基因，以及高等真核生物启动子(例如)SV40早期启动子(Barclay,S.L.和E.Meller，(1983)MolecularandCellularBiology3,2117-2130)。

当核酸放置为与另一核酸序列存在一定功能关系时，该核酸与另一核酸序列是“有效连接”的。例如，如果多肽表达为参与该多肽分泌的前蛋白，那么编码分泌前导序列即信号肽的DNA有效连接至该多肽的DNA；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么该启动子或增强子有效连接至该序列；或者，如果核糖体结合位点被放置成有利于编码序列的翻译，那么该核糖体结合位点有效连接至该编码序列。一般来讲，“有效连接”是指被连接的DNA序列是邻接的，并且在分泌前导序列的情况下，被连接的DNA序列是邻接的并处于阅读相(readingphase)中。然而，增强子不必是邻接的。连接是通过在便利的限制性位点处的连接反应来实现。如果不存在此类位点，那么根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。因此，术语“有效连接”是指核酸表达控制序列(例如启动子，或者大量转录因子结合位点)和第二核酸序列之间的功能性连接，其中表达控制序列引导对应于第二序列的核酸的转录。

术语“信号序列”、“信号肽”、“分泌序列”、“分泌肽”、“分泌信号序列”、“分泌信号肽”等表示肽序列及编码此类肽的核酸，所述肽序列作为较大多肽的组分，将较大多肽引导通过合成较大多肽的细胞分泌途径。一般来讲，较大多肽(或蛋白)在运输通过分泌途径的过程中通常被剪切以去掉分泌/信号肽，其中多肽的剪切形式(即，没有分泌/信号肽的形式)在本文中通常称为多肽的“成熟形式”。例如，SEQIDNO:2提供来自红褐肉座菌的GH61A(含有信号肽)的氨基酸序列，而SEQIDNO:3提供来自红褐肉座菌的成熟形式的GH61A(即，没有信号肽)的氨基酸序列。

如本文所用，术语“载体”是指设计用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。“表达载体”是指能够将异源DNA片段掺入外来细胞中并使其在该细胞中表达的载体。许多原核和真核表达载体是可商购获得的。合适的表达载体的选择在本领域技术人员的知识范围之内。

因此，“表达盒”或“表达载体”是通过重组或合成方式产生的核酸构建体，其具有一系列允许特定核酸在靶细胞内转录的指定核酸元件。可将重组表达盒掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，除了其他序列以外，表达载体的重组表达盒部分还包含待转录的核酸序列和启动子。

如本文所用，术语“质粒”是指环状双链(ds)DNA构建体，其在许多细菌和一些真核生物中形成染色体外自我复制遗传元件。质粒可用于许多不同目的中的任一种，例如用作克隆载体、增殖载体、表达载体等。

如本文所用，术语“选择性标记”是指能够在细胞中表达的核苷酸序列或由其编码的多肽，并且其中选择性标记在细胞中的表达使得这种细胞能够与不表达所述选择性标记的细胞区分。在某些实施方案中，选择性标记允许表达其的细胞在相应选择性试剂存在下或在相应选择性生长条件下生长。在其他实施方案中，选择性标记凭借物理特征(例如通过荧光、免疫反应性的差异等)从不表达该标记的细胞中鉴定和/或分离出表达该标记的细胞。

一般来讲，编码变体GH61A的核酸分子将在中等至高度严格条件下与本文提供为SEQIDNO:1(天然红褐肉座菌GH61A)的野生型序列(或其互补序列)杂交。然而，在一些情况下，使用具有显著不同密码子使用方式的编码GH61A的核苷酸序列，而由编码GH61A的核苷酸序列所编码的酶具有与天然酶相同或基本上相同的氨基酸序列。例如，根据宿主利用特定密码子的频率(通常称为“密码子优化”)，可修改编码序列以促进在特定原核或真核表达系统中GH61A的较快表达。例如，Te'o等人(FEMSMicrobiologyLetters190:13-19,2000)描述了用于在丝状真菌中表达的基因优化。此类核酸序列有时称为“简并序列”或“简并的序列”。

如果某核酸序列与参考核酸序列在中等至高度严格杂交和洗涤条件下彼此特异性杂交，则认为这两个序列“选择性杂交”。杂交条件基于核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)。例如，“最严格”通常发生在约Tm-5℃(比探针Tm低5℃)；“高严格”发生在比Tm低约5-10℃；“中等”或“中等严格”发生在比探针Tm低约10-20℃；以及“低严格”发生在比Tm低约20-25℃。在功能上，最严格条件可用于鉴定与杂交探针具有严格同一性或近严格同一性的序列；而高严格条件用于鉴定与探针具有约80％或更高序列同一性的序列。

中等和高严格杂交条件在本领域是熟知的(参见例如，Sambrook等人，1989，第9和11章，以及Ausubel,F.M.等人，1993，所述文献明确地以引用方式并入本文)。高严格条件的例子包括，在约42℃时，在50％甲酰胺、5XSSC、5XDenhardt's溶液、0.5％SDS和100μg/ml变性载体DNA中杂交，随后在室温下用2XSSC和0.5％SDS洗涤2次，在42℃下用0.1XSSC和0.5％SDS再洗涤2次。

如本文所用，在谈及细胞时使用的术语“转化的”、“稳定转化的”或者“转基因的”是指细胞具有非天然(异源)的核酸序列，所述非天然(异源)的核酸序列整合进其基因组或作为附加体质粒，在经历多个世代后仍得以保留。

如本文所用，术语“表达”是指基于基因的核酸序列产生多肽的过程。该过程通常包括转录和翻译两者。

有关将核酸序列插入细胞内的术语“引入”是指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括将核酸序列掺入到真核细胞或者原核细胞中，其中所述核酸序列可以掺入到细胞的基因组(例如，染色体、质粒、质体或者线粒体DNA)内，转变成自主复制子，或者瞬时表达(例如，转染的mRNA)。

然后，术语“所需糖基水解酶的表达”或其等同术语是指所需糖基水解酶基因的转录和翻译，其产物包括前体RNA、mRNA、多肽、经翻译后加工的多肽。举例来说，对GH61A表达的测定包括对GH61A酶的蛋白质印迹、对GH61AmRNA的RNA印迹分析和逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)测定，以及纤维素酶加强活性的测定，例如，ShoemakerS.P.和BrownR.D.Jr.(Biochim.Biophys.Acta,1978,523:133-146)和Schulein(1988)中所述的测定的拓展。

术语“宿主细胞”是指含有载体并支持表达构建体的复制和/或转录和/或转录和翻译(表达)的细胞。本发明所用的宿主细胞可以是原核细胞例如大肠杆菌(E.coli)，或真核细胞例如酵母、植物、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是丝状真菌。

如本文所用，术语“洗涤剂组合物”是指目的是用在洗涤介质中用于洗涤弄脏的含纤维素织物的混合物。在本发明的上下文中，此类组合物除纤维素酶和表面活性剂外还可包含另外的水解酶、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂和荧光染料、抗结块剂、掩蔽剂、纤维素酶活化剂、抗氧化剂和增溶剂。

如本文所用，术语“表面活性剂”是指通常在本领域被公认为具有表面活性性质的任何化合物。因此，例如，表面活性剂包括阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂，如通常存在于洗涤剂中的那些表面活性剂。阴离子表面活性剂包括直链或者支链的烷基苯磺酸盐；具有直链或支链烷基或者烯基的烷基或烯基醚硫酸盐；烷基或烯基硫酸盐；烯烃磺酸盐；和链烷磺酸盐。两性表面活性剂包括磺酸季铵盐和甜菜碱型两性表面活性剂。此类两性表面活性剂在同一分子中同时具有带正电和负电的基团。非离子表面活性剂可包括聚氧化烯醚，以及高级脂肪酸链烷醇酰胺或其烯化氧加合物、脂肪酸甘油单酯等。

如本文所用，术语“含纤维素的织物”是指任何由含棉或不含棉纤维素或含棉或不含棉纤维素混纺物制成的缝制或非缝制织物、纱线或纤维，包括天然纤维素制品和人造纤维素制品(如黄麻、亚麻、苎麻、人造丝和莱赛尔纤维)。

如本文所用，术语“含棉织物”是指由纯棉或棉混纺物制成的缝制或非缝制织物、纱线或纤维，包括棉机织物、棉针织品、棉牛仔布、棉纱线、原棉等。

如本文所用，术语“石洗组合物”是指用于石洗含纤维素织物的制剂。石洗组合物用于在销售之前，即，在生产过程中修饰含纤维素织物。相反，洗涤剂组合物目的是用于清洗弄脏的衣服而不是在生产过程中使用。

当第一多肽中的氨基酸位置(或残基)被标注为“等同于”第二相关多肽中的氨基酸位置时，这意指第一多肽的氨基酸位置通过以下各项中的一项或多项而对应于第二相关多肽中所标注的位置：(i)一级序列比对(参见下文对序列比对和序列同一性的描述)；(ii)结构性序列同源性；或(iii)类似的功能特性。因此，第一GH61酶(或其变体)的氨基酸位置可确定为“等同于”(或“同源于”)第二GH61酶(或甚至多种不同GH61酶)中的氨基酸位置。

一级序列比对：可使用一级氨基酸序列比对法来确定等同氨基酸的位置，许多一级氨基酸序列比对法是本领域所熟知的。例如，通过比对两种或更多种不同GH61酶的一级氨基酸序列，有可能将一种GH61酶的氨基酸位置编号指定为等同于另一种比对的GH61酶的位置编号。按照这种方式，源于一种GH61酶(例如，以SEQIDNO:3示出的GH61A酶)的氨基酸序列的编号体系可用于鉴定其他GH61酶中等同(或同源的)氨基酸残基。参见例如，图2和图3中所示的比对。

结构性序列同源性：除了使用一级序列比对法确定“等同”氨基酸位置以外，还可通过测定二级和/或三级结构水平下的同源性来定义“等同”氨基酸位置。例如，对于已通过X射线晶体学测定其三级结构的糖基水解酶来说，等同残基可定义为与红褐肉座菌GH61A比对(N对N、CA对CA、C对C以及O对O)后，糖基水解酶的特定氨基酸残基主链原子中的两个或更多个的原子坐标处于0.13nm内并且优选地为0.lnm内的那些残基。比对是在对最佳模型进行定向和定位以使所考虑的糖基水解酶与红褐肉座菌GH61A二者的非氢蛋白原子的原子坐标最大限度重叠后实现的。最佳模型为给出可获得的最高分辨率的晶体学模型。在两种或更多种不同模型具有相等分辨率的情况下，使用具有最低R因子的模型，R因子使用以下公式由实验衍射数据得到。

类似的功能特性：将第一多肽中在功能上与第二相关多肽(例如，第一糖基水解酶和红褐肉座菌GH61A)的具体残基类似的等同氨基酸残基定义为第一多肽中采取一定构象的那些氨基酸，所述构象使得那些氨基酸可以确定的且归因于第二相关多肽(例如，红褐肉座菌GH61A)的具体残基的方式改变、修改或促成多肽结构、底物结合或催化。当已通过X射线结晶学获得第一多肽的三级结构时，第一多肽的在功能上与第二多肽类似的氨基酸残基占据类似位置，其程度为尽管给定残基的主链原子可能不满足基于占据同源位置的等同性标准，但残基的至少两个侧链原子的原子坐标处于第二多肽(例如红褐肉座菌GH61A)的对应侧链原子的0.13nm内。

关于变体酶(例如，GH61变体)，术语“改善的”、“改善的特性”或“改善的性能”等在本文中被定义为与变体酶相关的、与其相应亲本酶相比得到改善的特征或活性。改善的特性包括但不限于，改善的宿主细胞的产量或表达(有时称为收率)、改善的热稳定性或改变的依赖于温度的活性分布、所需pH或pH范围内改善的活性或稳定性、改善的底物特异性、改善的产物特异性、以及纤维素水解处理步骤中化学品或其他组分存在下改善的稳定性等。可使用一种或多种特定测定法确定改善的性能，所述测定法包括但不限于：(a)表达(蛋白质含量测定，或收率)，(b)热稳定性和/或解链温度(Tm)，(c)全水解产物稀酸预处理玉米秸秆(whPCS)的水解测定，以及(d)稀氨预处理玉米秸秆(daCS)的水解测定。

关于变体多肽(例如，GH61变体)，术语“改善的热稳定性”在本文中被定义为高温下温育一段时间后，变体酶相对于亲本酶展现出酶活性保留(或在GH61酶的具体情况下，保留了酶加强纤维素酶活性的能力)。此类变体相对于亲本，可能展现或可能不展现出改变的热活性分布。例如，在高温下温育后，相对于亲本，变体可具有改善的再折叠能力。

所谓“改善的产物特异性”意指与亲本酶相比，变体酶展现出改变的产物概况，其中在给定应用中，与亲本相比，变体的改变的产物概况得到改善。“产物概况”在本文中被定义为由所关注酶产生的反应产物的化学组成。

所谓“改善的化学稳定性”意指在一种或多种化学品存在下温育一段时间后变体酶展现出酶活性保留，所述化学品在相同条件下降低亲本酶的酶活性。与亲本酶相比，化学稳定性改善的变体能够更好地在此类化学品存在下催化反应进行。

关于酶的“pH范围”是指在其中酶表现出催化活性的pH值的范围。

关于酶的术语“pH稳定的”和“pH稳定性”是指酶在跨宽泛的pH值范围、在预定时段内(例如，15分钟、30分钟、1小时)保持活性的能力。

“百分比序列同一性”或其语法等同形式是指在使用比对算法时，特定序列具有至少一定百分比的氨基酸残基与指定的参照序列的那些氨基酸残基相同。适用于确定序列相似性的算法的例子是BLAST算法，其描述于Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中。用于进行BLAST分析的软件可通过美国国立生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)(<www.ncbi.nlm.nih.gov>)公开获得。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字节来鉴定高评分序列对(HSP)，所述短字节当与数据库序列中相同长度的字节对齐时，或者是匹配的，或者是满足某些正值的阈值分数T。这些初始的相邻字节命中作为起点来寻找包含它们的更长的HSP。这些字节命中在两个方向上沿进行比较的两条序列中的每一序列延伸，直到累积的比对分数不能再增加为止。这些字节命中的延伸在以下情况时停止：累积比对分数从最大获得值下降数量X；累积分数达到零或零以下；或者到达任一序列的末端。BLAST算法的参数W、T、和X确定了比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用的默认值是字长(W)为11，BLOSUM62计分矩阵(参见，Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915(1989))，比对(B)为50，期望值(E)为10，M’5，N’-4和对两条链的比较。

BLAST算法然后进行两条序列之间相似性的统计分析(参见例如，Karlin和Altschul，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似度的测量是最小和概率(P(N))，其提供了两种核苷酸或氨基酸序列之间偶然地发生匹配的概率的指示。例如，如果测试氨基酸序列与蛋白酶氨基酸序列比较中的最小和概率小于约0.1，更优选小于约0.01，并且最优选小于约0.001，则认为氨基酸序列与蛋白酶相似。

当对百分比序列同一性存疑时，以使用默认参数的CLUSTALW算法进行的比对为准。参见Thompson等人，(1994)NucleicAcidsRes.22:4673-4680。对于CLUSTALW算法的默认参数为：

II.分子生物学

本发明的实施方案提供了在所关注宿主细胞(例如，丝状真菌)中有功能的启动子控制下，由编码糖基水解酶的核酸表达所需糖基水解酶(或糖基水解酶的组合)。因此，本发明依赖于重组遗传学领域中的许多常规技术。上文描述了公开合适的重组遗传学方法的例子的基本文本。

本发明构思了本领域已知的任何可将突变引入亲本核酸/多肽的方法。

本发明涉及变体GH61酶(例如，GH61A酶)的表达、纯化和/或分离和使用。这些酶可通过重组方法利用本领域已知的编码GH61酶(包括以SEQIDNO:2至11、13、14和16示出的GH61A/GH61酶，例如来自红褐肉座菌的GH61A)的许多gh61基因中的任一种来制备。可采用任何用于引入突变的便利方法，包括定点诱变。如上文所指出，突变(或变异)包括置换、添加、缺失或截短，其将对应于所表达GH61变体中的一个或多个氨基酸变化。此外，定点诱变和在DNA水平上使表达的蛋白质中引入氨基酸变化的其他方法可见于许多参考文献，例如，Green和Sambrook等人，2012以及Ausubel等人。

通过本领域已知的多种方法制备编码亲本GH61的氨基酸序列变体的DNA。这些方法包括但不限于，通过对早期制备的编码亲本GH61A酶的DNA进行定点(或寡核苷酸介导的)诱变、PCR诱变和盒诱变来制备。

定点诱变是一种可用于制备置换变体的方法。这种技术在本领域是熟知的(参见例如，Carter等人，NucleicAcidsRes.13:4431-4443(1985)以及Kunkel等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488(1987))。简而言之，在进行DNA的定点诱变时，通过如下方式改变起始DNA：首先将编码所需突变的寡核苷酸与该起始DNA的单链杂交。杂交之后，使用杂交的寡核苷酸作为引物，并且使用起始DNA的该条单链作为模板，用DNA聚合酶合成完整的第二链。从而将编码所需突变的寡核苷酸掺入所得的双链DNA。

PCR诱变还适于制备亲本GH61的氨基酸序列变体。参见Higuchi，PCRProtocols，第177-183页(AcademicPress,1990)；以及Vallette等人，Nuc.AcidsRes.17:723-733(1989)。简而言之，当少量的模板DNA用作PCR中的起始材料时，可使用序列与模板DNA的对应区域稍微不同的引物来产生相对大量的特定DNA片段，所述DNA片段仅在引物不同于模板的位置处与模板序列不同。

用于制备变体的另一种方法，即盒诱变，基于由如下文献描述的技术：Wells等人，Gene34:315-323(1985)。起始材料是包含待突变的起始多肽DNA的质粒(或其他载体)。鉴定待突变的起始DNA中的一个或多个密码子。所鉴定的突变位点的每侧必须存在唯一的限制性内切核酸酶位点。如果不存在此类限制性位点，那么它们可这样生成：使用上述寡核苷酸介导的诱变方法在适当的位置将其引入起始多肽DNA。在这些位点对质粒DNA进行切割以使其线性化。使用标准程序合成编码限制性位点之间的DNA序列但包含所需突变的双链寡核苷酸，其中该寡核苷酸的两条链先单独合成，然后再使用标准技术杂交在一起。该双链寡核苷酸被称为盒。该盒被设计为具有与线性化质粒的末端匹配的5'和3'端，使得其可被直接连接至质粒。该质粒现在便含有突变的DNA序列。

备选地或额外地，可确定所需GH61变体的所需氨基酸序列，并且可通过合成产生编码此类GH61变体的核酸序列。

通常可根据所需GH61的预期用途，对如此制备的GH61进行进一步修饰。此类修饰可涉及氨基酸序列的进一步改变、与异源多肽的融合和/或共价修饰。

III.变体GH61多肽和编码该多肽的核酸

在一个方面，提供变体GH61酶。在某些实施方案中，如本文所述，变体GH61酶相对于亲本GH61酶具有一个或多个突变，与成熟形式的红褐肉座菌GH61A(SEQIDNO:3)具有至少60％(即，60％或更高，但小于100％)的氨基酸序列同一性，包括与SEQIDNO:3具有至少70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，直至并且包括99.6％的氨基酸序列同一性。在某些实施方案中，亲本GH61为真菌GH61A(如上文所定义)。另外，变体GH61酶具有纤维素酶加强活性，其中在某些实施方案中，变体GH61与亲本GH61相比具有改善的特性(如本文所详述)。图1中示出了野生型、全长形式的红褐肉座菌(H.jecorina)GH61A的氨基酸序列(SEQIDNO:2)。图2和图3分别示出了红褐肉座菌GH61A(H.jecorina)与许多其他糖基水解酶的催化结构域和碳水化合物结合结构域的序列比对。

在某些实施方案中，变体GH61酶包含在来自红褐肉座菌(H.jecorina)的成熟形式的GH61A(SEQIDNO:3)中的一个或多个氨基酸位置的氨基酸突变。由于根据本发明方面的某些亲本GH61酶可能与来自红褐肉座菌(H.jecorina)的野生型GH61A不具有相同的氨基酸，因此对应于上述残基的氨基酸位置(例如，氨基酸位置K58)还可仅通过位置编号(例如，如表2所示，氨基酸位置58)或用“X”前缀(例如，氨基酸位置X58)来指定。此处应注意，所有三种指定与来自红褐肉座菌的GH61A中的特定氨基酸残基对应的氨基酸位置的方法是可互换的。在某些情况下，可省略“位置”一词(例如，氨基酸58、氨基酸K58或氨基酸X58)。

通过亲本氨基酸序列的一个或多个氨基酸的置换、缺失或插入，而使GH61变体的氨基酸序列不同于亲本GH61氨基酸序列。如果GH61变体的残基(氨基酸)与红褐肉座菌GH61A中的特定残基或该残基的部分是同源的(即，一级结构或三级结构中的位置相对应)或者在功能上是类似的(即，具有相同或相似的功能能力，以在化学上或结构上结合、反应或相互作用)，则GH61A变体的残基(氨基酸)等同于红褐肉座菌GH61A的残基。如本文所用，编号旨在与图1中所示的成熟GH61A氨基酸序列的编号相对应。

可使用“序列比较算法”来确定待确定同源性的氨基酸序列的比对。用于比较的序列的最佳比对可通过以下方式进行，例如，通过Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv.Appl.Math.2:482(1981))、Needleman和Wunsch的同源比对算法(J.Mol.Biol.48:443(1970))、Pearson和Lipman的相似性搜索方法(Proc.Nat’lAcad.Sci.USA85:2444(1988))、通过这些算法的计算机化执行(WisconsinGeneticsSoftwarePackage(GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,WI)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFAST)或通过目测或利用ChemicalComputingGroup(MontrealCanada)开发的MOE。还参见以上定义部分中提供的对“百分比序列同一性”的说明。

在某些实施方案中，变体GH61酶中的一个或多个突变为表1、表2所示的氨基酸置换，和/或存在于解卷积队列(1至4)中的任何一个(参见实施例3)，其中所述置换位点与来自红褐肉座菌(H.jecorina)的成熟形式的GH61A(SEQIDNO:3)相对应。表1、表2中和/或解卷积队列中所示的置换的所有可能组合为本发明构思的实施方案，包括但不限于以下各项：

13.12的变体，其中所述变体包含G301S置换。

14.12至13中任一项的变体，其中所述变体包含D124N置换。

15.12至14中任一项的变体，其中所述变体包含S164M置换。

16.12至15中任一项的变体，其中所述变体包含Y318W置换。

17.12至16中任一项的变体，其中所述变体包含A129N置换。

18.12至17中任一项的变体，其中所述变体包含A168K置换。

19.12至18中任一项的变体，其中所述变体包含A16N置换。

20.12至19中任一项的变体，其中所述变体包含A201D置换。

21.12至20中任一项的变体，其中所述变体包含D197A置换。

22.12至20中任一项的变体，其中所述变体包含D197E置换。

23.12至20中任一项的变体，其中所述变体包含D197L置换。

24.12至20中任一项的变体，其中所述变体包含D197M置换。

25.12至24中任一项的变体，其中所述变体包含G235K置换。

26.12至24中任一项的变体，其中所述变体包含G235L置换。

27.12至24中任一项的变体，其中所述变体包含G235S置换。

28.12至27中任一项的变体，其中所述变体包含G295C置换。

29.12至27中任一项的变体，其中所述变体包含G295T置换。

30.12至29中任一项的变体，其中所述变体包含G298C置换。

31.12至30中任一项的变体，其中所述变体包含G301P置换。

32.12至31中任一项的变体，其中所述变体包含H200A置换。

33.12至32中任一项的变体，其中所述变体包含K106C置换。

34.12至33中任一项的变体，其中所述变体包含K58V置换。

35.12至34中任一项的变体，其中所述变体包含K64L置换。

36.12至35中任一项的变体，其中所述变体包含K70E置换。

37.12至35中任一项的变体，其中所述变体包含K70L置换。

38.12至35中任一项的变体，其中所述变体包含K70N置换。

39.12至35中任一项的变体，其中所述变体包含K70S置换。

40.12至39中任一项的变体，其中所述变体包含L290A置换。

41.12至39中任一项的变体，其中所述变体包含L290M置换。

42.12至41中任一项的变体，其中所述变体包含N10D置换。

43.12至42中任一项的变体，其中所述变体包含N315W置换。

44.12至43中任一项的变体，其中所述变体包含N51E置换。

45.12至43中任一项的变体，其中所述变体包含N51H置换。

46.12至43中任一项的变体，其中所述变体包含N51T置换。

47.12至46中任一项的变体，其中所述变体包含P316A置换。

48.12至46中任一项的变体，其中所述变体包含P316F置换。

49.12至48中任一项的变体，其中所述变体包含P52F置换。

50.12至49中任一项的变体，其中所述变体包含Q167K置换。

51.12至50中任一项的变体，其中所述变体包含Q320A置换。

52.12至51中任一项的变体，其中所述变体包含Q320P置换。

53.12至51中任一项的变体，其中所述变体包含Q320S置换。

54.12至53中任一项的变体，其中所述变体包含R304D置换。

55.12至53中任一项的变体，其中所述变体包含R304P置换。

56.12至55中任一项的变体，其中所述变体包含S135E置换。

57.12至56中任一项的变体，其中所述变体包含S185D置换。

58.12至57中任一项的变体，其中所述变体包含S187D置换。

59.12至58中任一项的变体，其中所述变体包含S297C置换。

60.12至58中任一项的变体，其中所述变体包含S297E置换。

61.12至60中任一项的变体，其中所述变体包含S300T置换。

62.12至61中任一项的变体，其中所述变体包含T107E置换。

63.12至61中任一项的变体，其中所述变体包含T107G置换。

64.12至61中任一项的变体，其中所述变体包含T107M置换。

65.12至61中任一项的变体，其中所述变体包含T107N置换。

66.12至61中任一项的变体，其中所述变体包含T107Q置换。

67.12至66中任一项的变体，其中所述变体包含T108A置换。

68.12至66中任一项的变体，其中所述变体包含T108K置换。

69.12至68中任一项的变体，其中所述变体包含T127I置换。

70.12至69中任一项的变体，其中所述变体包含T287A置换。

71.12至70中任一项的变体，其中所述变体包含T303G置换。

72.12至70中任一项的变体，其中所述变体包含T303P置换。

73.12至72中任一项的变体，其中所述变体包含T313K置换。

74.12至73中任一项的变体，其中所述变体包含V104A置换。

75.12至74中任一项的变体，其中所述变体包含V80T置换。

76.12至75中任一项的变体，其中所述变体包含Y291F置换。

77.12至75中任一项的变体，其中所述变体包含Y291W置换。

78.12至77中任一项的变体，其中所述变体包含Y317W置换。

79.任一前述权利要求所述的变体，其中亲本GH61酶为真菌糖苷水解酶家族61a(GH61A)酶。

在另一方面，提供了编码变体GH61酶的核酸，该变体GH61酶相比亲本GH61酶(例如，如上所述)具有一个或多个突变。在某些实施方案中，该核酸编码的亲本GH61酶与红褐肉座菌GH61A(SEQIDNO:3)具有至少80％(即，80％或更高，但低于100％)的氨基酸序列同一性。在某些实施方案中，编码变体GH61酶的核酸与SEQIDNO:1(不包括该核酸中编码信号序列的部分)具有至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或甚至至少99.9％的同源性/同一性。应当理解，由于遗传密码具有简并性，所以许多核酸可能编码同一种变体GH61酶。此外，可对本文所述的编码变体GH61酶的核酸进行工程改造，实现密码子优化，例如提高该核酸在所关注宿主细胞中的表达水平。某些密码子优化技术在本领域中是已知的。

在某些实施方案中，编码变体GH61酶的核酸在严格条件下与编码GH61的核酸(或与编码GH61的核酸互补的核酸)杂交，该编码GH61的核酸(或与编码GH61的核酸互补的核酸)与SEQIDNO:1(不包括该核酸中编码信号序列的部分)具有至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.9％的同源性/同一性。

核酸可编码“全长”(“fl”或“FL”)变体GH61酶(其包括信号序列)、仅变体GH61酶的成熟形式(其缺少信号序列)、或变体GH61酶的截短形式(其缺少所述成熟形式的N端和/或C端部分)。

编码变体GH61酶的核酸能够有效连接至适用于在所关注宿主细胞中表达该变体GH61酶的载体中的各种启动子和调节子，下文会讲述这一点。

IV.表达重组GH61变体

本发明的各方面包括多种方法和组合物，这些方法和组合物涉及生成编码GH61变体的核酸、包含此类核酸的宿主细胞，由此类宿主细胞产生GH61变体，以及分离、纯化和/或使用此类GH61变体。

就此而论，本发明的实施方案提供已用表达载体转导、转化或转染的宿主细胞，其中表达载体包含编码所需GH61变体的核酸序列。例如，用表达载体转染丝状真菌细胞或酵母细胞，该表达载体包含的启动子或生物活性启动子片段或者一个或多个(例如，一系列)增强子有效连接至编码所需GH61变体的DNA片段，会在宿主细胞系中起作用，使得该细胞系表达所需的GH61变体。

A.核酸构建体/表达载体

可将用于编码所需GH61变体的天然或合成多核苷酸片段掺入异源核酸构建体或载体中，这些异源核酸构建体或载体能够引入所关注的宿主细胞(例如，丝状真菌细胞或酵母细胞)，继而在宿主细胞中复制。本文公开的载体和方法适用于宿主细胞，支持其表达所需的GH61变体。只要载体被引入宿主细胞后，能够表现出需要的复制/表达特性(这些特性通常由使用者规定)，就可使用该载体。大量适宜的载体和启动子是本领域技术人员熟悉的，其中一些可从市面上买到。Sambrook等人,1989、AusubelFM等人,1989和Strathern等人,1981中也描述了克隆载体与表达载体，这些文献都明确以引用方式并入本文。vandenHondel,C.A.M.J.J等人(1991)Bennett,J.W.和Lasure,L.L.(编著)MoreGeneManipulationsinFungi.AcademicPress,pp.396-428描述了用于真菌的恰当表达载体。可采用多种工序将恰当的DNA序列插入质粒或载体(本文统称为“载体”)。一般情况下，采用标准工序将DNA序列插入恰当的限制性核酸内切酶位点。我们认为，此类工序和相关的亚克隆工序都属于本领域技术人员的知识范畴。

制备包含编码所需GH61变体的序列的重组宿主细胞可采用这样的方法，即向所需的宿主细胞中引入包含所需GH61变体编码序列的异源核酸构建体(例如，像下文将进一步详细描述的那样)。例如，可依据众所周知的重组技术将所需GH61变体编码序列插入适宜载体，再用这种载体转化能够表达GH61的丝状真菌。如上文所述，由于遗传密码固有简并性，所以可使用编码基本相同或功能等同氨基酸序列的其他核酸序列来克隆和表达所需的GH61变体。因此应当理解，本发明涵盖包含编码区内的此类置换的序列变体。

本发明还包括重组核酸构建体，这些重组核酸构建体包含上述一种或多种编码所需GH61变体的核酸序列。这些构建体包含载体，例如质粒或病毒载体，其中正向或反向插入了本发明的序列。

异源核酸构建体可包含所需GH61变体的编码序列，包含方式为：(i)与其他编码序列隔离；(ii)与另外的编码序列(例如融合多肽或信号肽编码序列)组合，在这种情况下所需GH61变体编码序列是主要编码序列；(iii)与非编码序列(例如内含子和控制元件如启动子和终止子元件或5'和/或3'非翻译区)组合，这种方式有利于GH61变体编码序列在适宜宿主中高效表达；和/或(iv)在载体或宿主环境中包含，在该环境中，所需GH61变体编码序列是异源基因。

在本发明的一个方面，采用异源核酸构建体将编码所需GH61变体的核酸序列转移到体外宿主细胞中，例如，转移到已建立的丝状真菌细胞系和酵母细胞系中。通过生成稳定表达GH61变体的宿主细胞，便可长期生产所需的GH61变体。由此得出结论，可使用任一种能有效生成稳定转化株的方法来实施本发明。

恰当的载体通常配有编码选择性标记的核酸序列、插入位点和适宜的调控元件(例如启动子和终止序列)。载体可包含有效连接至编码序列的调节序列，包括(例如)非编码序列，例如内含子和控制元件(即，启动子和终止子元件或5'和/或3'非翻译区)，从而有利于编码序列在宿主细胞中(和/或在一般情况下不表达经修饰的可溶性蛋白抗原编码序列的载体或宿主细胞环境中)高效表达。大量适宜的载体和启动子是本领域技术人员熟悉的，其中许多可从市面上买到和/或在Sambrook等人(出处同上)中描述过。

适宜启动子的例子包括组成型启动子和诱导型启动子，例如CMV启动子、SV40早期启动子、RSV启动子、EF-1α启动子、在tet-on或tet-off系统中按所述方式(ClonTech和BASF)包含tet应答元件(TRE)的启动子、β-肌动蛋白启动子，以及在加入某些金属盐时会上调的金属硫蛋白启动子。启动子序列是被特定宿主细胞识别后启动表达的DNA序列。这种序列有效连接至编码变体GH61A多肽的DNA序列。这种连接包括启动子以能够驱动GH61变体编码序列转录/翻译的方式，相对表达载体中编码变体GH61A多肽的DNA序列的起始密码子定位。启动子序列包括介导变体GH61A多肽表达的转录和翻译调控序列。例子包括来自下列基因的启动子：黑曲霉、泡盛曲霉或米曲霉的葡糖淀粉酶、α-淀粉酶或α-葡糖苷酶编码基因；构巢曲霉gpdA或trpC基因；粗糙脉孢菌cbh1或trp1基因；黑曲霉或米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶编码基因；红褐肉座菌cbh1、cbh2、egl1、egl2或者其它纤维素酶编码基因。

依据宿主细胞的类型选择适当的选择性标记，本领域熟知适用于不同宿主的标记。典型的选择性标记基因包括来自构巢曲霉(A.nidulans)或红褐肉座菌(H.jecorina)的argB、来自构巢曲霉(A.nidulans)的amdS、来自粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)或红褐肉座菌(H.jecorina)的pyr4、来自黑曲霉(Aspergillusniger)或构巢曲霉(A.nidulans)的pyrG。适当的选择性标记的其它例子包括但不限于trpc、trp1、oliC31、niaD或leu2，用于转化突变株的异源核酸构建体(例如trp-、pyr-、leu-等)中包含这些标记。

此类选择性标记使得转化株能够利用丝状真菌通常不能代谢的代谢物。例如，来自红褐肉座菌(H.jecorina)的编码乙酰胺酶的amdS基因，允许转化细胞以乙酰胺为氮源生长。选择性标记(例如pyrG)可恢复营养缺陷型突变株在选择性基本培养基中生长的能力，或者选择性标记(例如olic31)可使转化株能够在抑制性药物或抗生素存在的情况下生长。

使用本领域惯用的方法把选择性标记编码序列克隆进任一种适宜的质粒。适宜质粒的例子包括pUC18、pBR322、pRAX和pUC100。pRAX质粒包含来自构巢曲霉(A.nidulans)的AMA1序列，AMA1序列使pRAX质粒能够在黑曲霉(A.niger)中复制。

除非另外指明，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学领域的常规技术，这些常规技术在本领域技术范围内。以下文献全面讲解说明了这些技术：参见(例如)Sambrook等人,1989；Freshney,1987；Ausubel等人,1993；Coligan等人,1991。

B.产生GH61和变体GH61酶的宿主细胞和培养条件

把编码GH61A变体的DNA序列克隆进DNA构建体后，用该DNA构建体来转化微生物。为了表达根据本发明的变体GH61A，可从多种多样的宿主细胞中选出用于转化的微生物。以下各部分是宿主细胞/微生物的例子，并不意在限制可用于实施本发明诸方面的宿主细胞的范围。

(i)丝状真菌

本发明一方面提供了经修饰、选择、培养的丝状真菌，其中修饰、选择、培养的方式使得可用该丝状真菌高效生产或表达(相比对应的未转化亲本丝状真菌)所需的GH61变体。

在经处理和/或修饰后可表达所需糖基水解酶的亲本丝状真菌物种的例子包括但不限于木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicilliumsp.)、腐质霉属(Humicolasp.)(包括特异腐质霉(Humicolainsolens))、曲霉属(Aspergillussp.)(包括黑曲霉(Aspergillusniger))、金孢子菌属(Chrysosporiumsp.)、毁丝霉属(Myceliophthorasp.)、镰孢属(Fusariumsp.)、肉座菌属(Hypocreasp.)、踝节菌属(Talaromycessp.)、侧孢霉属(Sporotricumsp.)、和裸孢壳属(Emericellasp.)。

在常用于培养亲本真菌细胞系的条件下培养表达所需GH61变体的细胞。一般情况下，在含生理盐和营养物质的标准培养基中培养这种细胞，例如下列文献中所述：Pourquie,J等人,BiochemistryandGeneticsofCelluloseDegradation,Aubert,J.P等人编著,AcademicPress,pp.71-86,1988；Ilmen,M等人,Appl.Environ.Microbiol.63:1298-1306,1997。标准培养条件是本领域已知的，例如，置于摇床或发酵罐中28℃温育培养，直到表达出的所需GH61变体量达到目的水平为止。

可例如在科学文献中和/或从真菌来源机构(如美国典型培养物保藏中心(ATCC))，获悉指定丝状真菌的培养条件。待真菌充分生长后，使其细胞暴露于可有效引起或允许所需GH61变体表达的条件。

在所需GH61变体编码序列受诱导型启动子控制的情况下，向培养基中添加有效浓度的诱导剂(如糖、金属盐或抗生素)，诱导所需GH61变体表达。

在一个实施方案中，菌株为黑曲霉(Aspergillusniger)菌株，该菌株是用于获得过表达蛋白质的有用菌株。例如，已知黑曲霉泡盛变种dgr246分泌提高量的分泌的纤维素酶(Goedegebuur等人，Curr.Genet(2002)41:89-98)。还知道黑曲霉泡盛变种的其它菌株(例如GCDAP3、GCDAP4、GAP3-4)，参见Ward等人的文献(Ward,M,Wilson,L.J.andKodama,K.H.,1993,Appl.Microbiol.Biotechnol.39:738-743)。

在另一个实施方案中，菌株为里氏木霉(Trichodermareesei)菌株，该菌株是用于获得过表达蛋白质的有用菌株。例如，已知RL-P37分泌提高量的纤维素酶，参见Sheir-Neiss等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.20:46-53(1984)。RL-P37的功能等同物包括里氏木霉(Trichodermareesei)菌株RUT-C30(ATCC保藏号56765)和菌株QM9414(ATCC保藏号26921)。考虑了这些菌株也可用于过表达变体GH61。

若期望在没有潜在不利天然糖基水解酶或纤维素酶活性的环境中获得GH61变体，有用的是先获得已缺失一个或多个糖基水解酶基因(如gh61a基因)和/或纤维素酶基因的宿主细胞菌株，再向其中引入含有编码所需GH61变体的DNA片段的DNA构建体或质粒。这种菌株可采用任何常规方式制备，例如美国专利5,246,853和WO92/06209中公开的方法，这两份专利的公开内容都据此以引用方式并入本文。在缺失一个或多个糖基水解酶基因(例如，宿主细胞的内源性gh61a基因)的宿主微生物中表达所需GH61变体，可简化鉴定工序和随后的纯化工序(如果要求执行鉴定和纯化工序的话)。

可采用本领域已知的方法，把待缺失或待破坏的所需基因插入质粒，而实现基因缺失。然后，在所需基因编码区内部的适当限制性酶切位点处切割所述缺失质粒，再用选择性标记置换该基因编码序列或该基因编码序列的一部分。在待缺失或待破坏基因的基因座旁侧的DNA序列(长度例如约0.5kb至约2.0kb)可继续留在选择性标记基因旁的一侧。适当的缺失质粒中通常有独特的限制性酶切位点，这种位点使含缺失基因(包括旁侧的DNA序列)与选择性标记基因的片段能够以单个线性片段的形式移除。

在某些实施方案中，宿主菌株中可以有编码所需GH61变体的DNA的不止一个拷贝，便于过表达GH61变体。例如，宿主细胞的基因组中可以整合了所需GH61变体的多个拷贝，备选地，宿主细胞可以包含能够在宿主生物中自主复制的质粒载体。

(ii)酵母

本发明还构思了使用酵母作为宿主细胞，来生产所需的GH61酶。我们已在酿酒酵母(S.cerevisiae)的各菌株中表达了编码水解酶的若干种其他基因。这些基因包含下列序列：编码来自里氏木霉(Trichodermareesei)的以下几种酶的序列：两种内切葡聚糖酶(Penttila等人,1987)，两种纤维二糖水解酶(Penttila等人,1988)，和一种β-葡糖苷酶(CummingsandFowler,1996)；编码来自出芽短梗霉(Aureobasidliumpullulans)的木聚糖酶的序列(LiandLjungdahl,1996)；编码来自小麦的α-淀粉酶的序列(Rothstein等人,1987)，等等。另外，我们还在酿酒酵母的实验室菌株(VanRensburg等人,1998)中成功表达了编码溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)内切-[β]-1,4-葡聚糖酶(END1)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)纤维二糖水解酶(CBH1)、生黄瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)纤维糊精酶(CEL1)和Endomycesfibrilizer纤维二糖酶(Bgl1)的纤维素酶基因表达盒。

(iii)其他

我们还构思了可在一些实施方案中使用除丝状真菌细胞或酵母细胞之外的宿主细胞中的表达系统，包括昆虫细胞或细菌细胞的表达系统。举例来说，某些细菌宿主细胞也可以是产乙醇细胞，例如经工程改造的运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)，不但能够表达所关注的酶/变体，还能够代谢某些单体糖和其他可发酵糖，把它们转变成乙醇。使用本文所述GH61变体的技术人员可视其需要选择适当的宿主细胞，因而本发明不限制宿主细胞的类型。

C.向宿主细胞中引入编码所需GH61的核酸序列

本发明还提供了细胞和细胞组合物，这些细胞和细胞组合物经基因修饰，含有编码所需GH61变体的外源核酸序列。可用克隆载体或表达载体对亲本细胞或细胞系进行基因修饰(例如，转导、转化或转染)。载体可以是(例如)质粒、病毒颗粒、噬菌体等形式，这在上文进一步讲述过。

使用本发明的转化方法，可将全部或一部分转化载体稳定整合进宿主细胞的基因组。然而，本发明还构思了一种转化方法，用该方法可维持自我复制的染色体外转化载体。

可使用任一种熟知的将外来核苷酸序列引入宿主细胞的方法。这些方法包括磷酸钙转染法、聚凝胺感染法、原生质体融合法、电穿孔法、基因枪法、脂质体法、显微注射法、细胞质载体法、病毒载体法，以及用于将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA或其他外来遗传物质引入宿主细胞的其他任何熟知方法(参见例如Sambrooketal.，出处同上)。实质上，使用的特定基因工程方法应当能够将多核苷酸(例如，表达载体)成功引入可表达所需GH61变体的宿主细胞。

可采用多种标准的转染方法来制备里氏木霉细胞系，用于大量表达异源多肽。向产纤维素酶的菌株中引入DNA构建体的一些已公开方法包括：就木霉属(Trichoderma)菌株来说，Lorito,Hayes,DiPietroandHarman,1993,Curr.Genet.24:349-356；Goldman,VanMontaguandHerrera-Estrella,1990,Curr.Genet.17:169-174；Penttila,Nevalainen,Ratto,SalminenandKnowles,1987,Gene6:155-164；就曲霉属(Aspergillus)菌株来说，Yelton,HamerandTimberlake,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:1470-1474；就镰孢属(Fusarium)菌株来说，Bajar,PodilaandKolattukudy,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:8202-8212；就链霉菌属(Streptomyces)菌株来说，Hopwood等人,1985,TheJohnInnesFoundation,Norwich,UK；就芽孢杆菌属(Bacillus)菌株来说，Brigidi,DeRossi,Bertarini,RiccardiandMatteuzzi,1990,FEMSMicrobiol.Lett.55:135-138。用于曲霉属(Aspergillussp.)的适宜转化方法的例子可参见Campbelletal.ImprovedtransformationefficiencyofA.nigerusinghomologousniaDgenefornitratereductase.Curr.Genet.16:53-56；1989。

本发明还包括宿主细胞(例如丝状真菌，诸如红褐肉座菌(H.jecorina)和黑曲霉(A.niger))的新型转化体和有用转化体，这些转化体可用于产生真菌纤维素酶和糖基水解酶的组合物。因此，本发明的诸方面涉及丝状真菌的转化体，这些转化体含有所需GH61变体编码序列，有时还在一个或多个内源性糖基水解酶编码序列中包含缺失或失活性突变(例如，在gh61a编码序列中包含缺失；实施例部分还描述了糖基水解酶和/或纤维素酶基因缺失的宿主细胞)。

此外，可在体外转录包含编码所需糖基水解酶的核酸序列的异源核酸构建体，然后采用众所周知的方法(例如注射法)把所得的RNA引入宿主细胞。

D.分析GH61核酸编码序列和/或蛋白质表达

为了评估已用编码所需GH61变体的核酸构建体转化的细胞系表达所需GH61变体的水平，可在蛋白质水平或RNA水平上进行测定，或者可使用专门测定GH61活性和/或产量的功能性生物测定法进行测定。

一般来讲，用于分析所需GH61变体的表达水平的测定法包括但不限于：RNA印迹法、斑点印迹法(分析DNA或RNA)、RT-PCR法(逆转录酶-聚合酶链反应法)或原位杂交法，使用适当标记的探针(以核酸编码序列为基础)，以及常规的DNA印迹法和放射自显影法。

此外，可例如采用测定GH61活性(纤维素酶加强活性)、表达水平和/或产量的测定法，直接测量样品中经修饰GH61的产量和/或表达水平。可用来评估GH61纤维素酶加强活性的测定法在例如以下文献中描述过：Shoemaker,S.P.andBrown,R.D.Jr.(Biochim.Biophys.Acta,1978,523:133146)、Schulein(1988)及美国专利5,246,853和5,475,101，这些文献都明确以引用方式并入本文。可使用Suurnakkietal.(2000)和Ortegaetal.(2001)中描述的测定法，来测量经修饰GH61加强对分离的可溶与不可溶底物水解的能力。可用于分析测定GH61对纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶或β-葡糖苷酶活性的加强作用的底物包括：结晶纤维素、滤纸、磷酸溶胀纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、纤维低聚糖、甲基伞形酯(methylumbelliferyl)乳糖苷、甲基伞形酯纤维二糖苷、邻硝基苯基乳糖苷、对硝基苯基乳糖苷、邻硝基苯基纤维二糖苷、对硝基苯基纤维二糖苷、邻硝基苯基葡糖苷、对硝基苯基葡糖苷、甲基伞形酯葡糖苷。

此外，可采用免疫学方法来评价蛋白质表达水平，例如ELISA法、竞争性免疫测定法、放射免疫测定法、蛋白质印迹法、间接免疫荧光测定法，等等。这些测定法中有一些可使用可从市面上买到的旨在检测GH61酶的试剂和/或试剂盒执行。可使用这些免疫测定法来定性和/或定量评估所需GH61变体的表达水平。这些方法的细节是本领域技术人员熟悉的，用来实施这些方法的多种试剂也可从市面上买到。在某些实施方案中，可采用特别针对所需变体GH61酶但不针对该变体的亲本GH61的免疫试剂，例如特别针对GH61置换的抗体或GH61变体的融合伴侣(例如N或C端标签序列，如六聚组氨酸标签或FLAG标签)。因此，本发明的诸方面涉及用经纯化的所需GH61变体产生对已表达多肽有特异性的单克隆或多克隆抗体，用于各种免疫测定法。(参见例如Hu等人,1991)。

V.GH61变体多肽的富集、分离和/或纯化方法

一般来讲，宿主细胞培养物中产生的所需GH61变体多肽分泌到培养基(产生含GH61变体的培养上清液)中，然后可将其富集、纯化或分离，例如通过从细胞培养基中除去不需要的成分。然而，在一些情况下，所需GH61变体多肽可能在细胞内生成，因而必须从细胞裂解物中回收。我们采用本领域技术人员常用的技术，从产生所需GH61变体多肽的细胞或细胞上清液中收集这种变体。例子包括但不限于过滤法(例如超滤或微滤法)、离心法、密度梯度分级分离法(例如密度梯度超速离心法)、亲和层析法(Tilbeurgh等人,1984)、离子交换层析法(Goyal等人,1991；Fliess等人,1983；Bhikhabhai等人,1984；Ellouz等人,1987)，包括使用高分离能力的材料的离子交换层析法(Medve等人,1998)、疏水相互作用层析法(TomazandQueiroz,1999)以及双相分配法(Brumbauer等人,1999)。

尽管有时会要求富集、分离或纯化GH61变体多肽，但在其他实施方案中，若需测定GH61介导的纤维素酶加强活性，直接取表达GH61变体多肽的宿主细胞测定即可。因此，有时并不需要富集、分离或纯化所需GH61变体多肽获得GH61变体多肽组合物，就能执行纤维素生物质水解测定法或水解过程。例如，可将根据本发明诸方面的含纤维素酶和糖基水解酶的系统设计成允许表达本文所述变体GH61A的宿主细胞直接用于纤维素水解过程，也就是说，无需从宿主细胞中分离出GH61A，可直接将宿主细胞用于所关注的测定法。

VI.GH61变体的应用

能够理解的是，编码所需GH61变体的核酸、所需的GH61变体多肽及包含这些物质的组合物可用于各式各样的应用，下文将描述其中一些应用。可从很多方面利用本文所述GH61变体的一种或多种改善的性质。例如，可使用热应力条件下性能改善的GH61变体来增加在高温(例如亲本GH61将表现较差的温度)下进行的测定中的纤维素酶加强活性，这样一来，使用者便可减少GH61的总用量(相比亲本GH61的用量)。可在适宜测定纤维素酶组合物的纤维素水解活性的测定过程中利用GH61变体多肽的其他改善的性质，包括：GH61变体的最适pH值改变，在存在表面活性剂的情况下稳定性或活性增大，对底物的比活性增大，底物裂解模式改变以及/或者在所关注宿主细胞中高水平表达。

本文所述的GH61变体可用于加强对几乎任一种纤维素材料的处理力度，例如，用于纺织行业(如，在生物整理或生物石磨过程中)，洗涤剂、动物饲料制造行业，制浆造纸行业和/或生物乙醇制造行业，来加强工艺的效果。

因此，可将本文所述的GH61多肽变体用于洗涤剂组合物，使这种组合物表现出增强的清洁能力、起软化剂的作用和/或能改善棉织物的手感(例如，“石磨水洗”或“生物抛光”)；可将这些GH61多肽变体用于降解木浆为糖的组合物中(例如，在制造生物乙醇的过程中)，以及/或者可将这些GH61多肽变体用于饲料组合物中。分离GH61变体并对其进行表征，能有助于控制这类组合物的特性与活性。

可使用含有本文所述的所需GH61变体的酶混合物组合物来制造乙醇。由该方法制得的乙醇可进一步用作辛烷值助剂，或直接用作替代汽油的燃料。因为乙醇燃料源比石油衍生燃料产品更环保，所以用乙醇作燃料是有利的。大家都知道，使用乙醇可改善空气质量，还可能降低局部臭氧水平和烟雾浓度。此外，用乙醇替代汽油在缓冲不可再生能源与石化物资供应突然波动所造成的影响方面，可能有重要的战略意义。

分别糖化和发酵是这样一种过程：凭借该过程，生物质(例如玉米秸秆)中的纤维素转化成葡萄糖，随后用酵母菌株把葡萄糖转化成乙醇。同时糖化和发酵是这样一种过程：凭借该过程，生物质中的纤维素转化成葡萄糖，与此同时，同一反应器中的酵母菌株把葡萄糖转化成乙醇。因此，可在这两个过程中使用本发明的GH61变体，将生物质降解为乙醇。由现成的纤维素源生产乙醇提供了一种稳定的可再生燃料源。还应当注意，在有些工艺过程中，生物质不会完全分解成葡萄糖(包含例如二糖)，这种情况下的产物可用于除生产乙醇之外的应用。

以纤维素为基础的原料可能有多种形态，可包括农业废弃物、禾草、木材及其他廉价生物质(例如城市垃圾，如再造纸、庭院剪枝等)。可用这些纤维素原料中的任一种发酵生产乙醇。因此，可将各式各样的原料与本发明所要求的糖基水解酶一起使用；而且可以视要开展转化的地域，决定选用何种原料。例如，在美国中西部可能主要有诸如小麦秸秆、玉米秸秆和蔗渣的农业废弃物，但在加利福尼亚可能主要是稻秆。然而应当理解，在任何地域都可选用任何可用的纤维素生物质。

在另一个实施方案中，可对纤维素原料进行预处理。预处理可在高温下进行，此外还添加了稀酸、浓酸或稀碱溶液。添加预处理溶液持续足够长的时间，以至少部分水解半纤维素成分，接着进行中和。

除用本文所述的GH61变体多肽转化生物质外，还可将这些变体多肽用于洗涤剂组合物中，该洗涤剂组合物可包含任何一种或多种洗涤剂成分，例如表面活性剂(包括阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、两性表面活性剂)、水解酶、助洗剂、漂白剂、染蓝剂、荧光染料、抗结块剂、增溶剂、阳离子表面活性剂等等。所有这些成分都是洗涤剂领域众所周知的。含GH61变体多肽的洗涤剂组合物可为任一种便利的形态，包括液体、颗粒、乳液、凝胶、糊状物等。可将洗涤剂组合物配制成某些形态(例如，颗粒)，便于包含纤维素酶保护剂。(参见例如WO1997020025，该专利的标题为“Enzymaticdetergentcompositions”，以引用方式并入本文)。在某些实施方案中，洗涤剂组合物中的GH61多肽变体，以相对于洗涤剂组合物总重量0.00005％至5％的重量百分比存在，例如以相对于洗涤剂组合物总重量约0.0002％至约2％的重量百分比存在。

从上文看出，可使用与亲本GH61酶相比特性改善的GH61变体多肽(以及编码GH61变体多肽的核酸)，来改进任一种利用糖基水解酶(通常在存在至少一种纤维素酶的情况下)的许多测定法和工艺。

实施例

下列实施例将进一步详细描述本发明，所述实施例并不旨在以任何方式限制要求保护的本发明的范围。应将附图视为本发明的说明书和具体实施方式的组成部分。本文引用的所有参考文献中被本文具体提到的内容，以引用方式并入本文。

在下面的实验公开中，采用了下列缩写：M(摩尔每升)，mM(毫摩尔每升)，μM(微摩尔每升)，nM(纳摩尔每升)，mol(摩尔)，mmol(毫摩尔)，μmol(微摩尔)，nmol(纳摩尔)，g、gm(克)，mg(毫克)，μg(微克)，pg(微微克)，L(升)，ml、mL(毫升)，μl和μL(微升)，cm(厘米)，mm(毫米)，μm(微米)，nm(纳米)，U(单位)，V(伏特)，MW(分子量)，s(秒)，min(分钟)，h(小时)，℃(摄氏度)，QS(足量)，ND(未做)，NA(不适用)，rpm(每分钟转数)，H₂O(水)，dH₂O(去离子水)，HCl(盐酸)，aa(氨基酸)，bp(碱基对)，kb(千碱基对)，kD(千道尔顿)，cDNA(复制或互补DNA)，DNA(脱氧核糖核酸)，ssDNA(单链DNA)，dsDNA(双链DNA)，dNTP(脱氧核苷三磷酸)，RNA(核糖核酸)，MgCl₂(氯化镁)，NaCl(氯化钠)，w/v(重量体积比)，v/v(体积比)，g(重力)，OD(光密度)，ABTS(2,2’-连氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐，HPLC(高压液相色谱法)，PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)，PCR(聚合酶链反应)，whPCS(全水解产物稀酸预处理玉米秸秆)，daCS(稀氨预处理玉米秸秆)，Pi或PI(性能指数)，RT-PCR(逆转录PCR)，TFA(三氟乙酸)，FAB(某种杂合β-葡糖苷酶，PCT公开WO2012/125951中描述了这种酶)，SEC(尺寸排阻色谱法)，RPC(反相色谱法)，SEL(位点评价文库)。

实施例1

测定法

下文所述的实施例使用了下列多种测定法。与下文提供的测定规程的任何背离之处，都在实施例中注明。在这些实验中，使用分光光度计来测量反应结束后得到的产物的吸光度。

I.测量葡萄糖

A.使用己糖激酶测定法测量剩余葡萄糖

使用己糖激酶测定法测量由whPCS生成的葡萄糖。将10μL稀释10倍的上清液加入96孔微量滴定板(Costar平底聚苯乙烯板)的孔中，孔中盛有190μL葡萄糖己糖激酶测定混合物(InstrumentationLaboratory,Breda,Netherlands)。室温温育滴定板15min。温育后，测量上清液在340nm处的吸光度。没有合并含剩余葡萄糖的培养物上清液来进一步研究。

B.使用ABTS测定法测量葡萄糖

用ABTS测定法检测了GH61AAvicel活性测定中生成的葡萄糖单体。检测缓冲液的溶剂为50mM醋酸钠缓冲液(pH5.0)，含5.48g/L2,2’-连氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS，Sigma，货号A1888)、0.2U/mLVI-A型辣根过氧化物酶(Sigma，货号P8375)和2U/mL食品级葡萄糖氧化酶(5989U/mL)。向50μLABTS检测溶液中加入50μLGH61A活性测定混合物(来自Avicel活性测定，下面的第VIII部分会讲到)。加入活性测定混合物后，反应以动力学方式进行，5min后在22℃环境温度下，测量OD₄₂₀。每种测定条件总对应一条恰当的葡萄糖校正曲线。

C.使用HPLC测定法确定葡萄糖浓度

使用Agilent1200(AgilentTechnologies)HPLC测定葡萄糖浓度，该仪器装配有REZEX^TMRFQ-FastFruitH+(8％)100mm×7.8mm色谱柱(Phenomenex)，柱温80℃，以0.01NH₂SO₄为洗脱液，流速0.9ml/min。取30μL样品与90μLMilliQ超纯水混合，然后用0.22μmMilliporeMultiscreenHTS96孔过滤系统真空过滤。将过滤后的样品稀释4倍，取10μL注入仪器。正确设置葡萄糖校正参数，测出精确的葡萄糖浓度。

II.蛋白纯化与透析

用1MHEPES(pH8.0)将表达野生型或变体GH61A的红褐肉座菌(Δeg1,Δeg2,Δeg3,Δeg5,Δeg6,Δgh61a,Δcbh1,Δcbh2,Δman1)的上清液稀释4倍，最终体积为500μL。将混合物与加有100mMCuSO₄的200μLBiokalWorkbead40IDAHigh一起温育30分钟，中途混合五次。1,000rpm离心2min，流出的液体中含有纯化蛋白样品。将纯化样品放入Harvardapparatus96孔一次性透析器(Harvardapparatus96welldispodialyzer)中截留分子量10kD的板(#74-0903)上，4℃温度下以50mM乙酸钠(pH5.0)透析过夜(40x)。

III.采用Bradford、归一化和endoH处理法进行蛋白质测定

采用BioRadBradford测定法，以BSA为标准物测定蛋白质浓度。用Bradford测定法获得所选样品的蛋白质浓度，将其与由SECHPLC和/或RPHPLC(以纯化GH61A为基准物)获得的蛋白质数据进行比较。采用以50mMNaAC(pH5.0)适当稀释GH61A样品的方式，来将所有GH61A样品归一化为100ppm，需要时考虑Bradford与HPLC测量值之间的校正因子(以HPLC测量值为指导值)。用来自皱褶链霉菌(S.plicatus)(例如，NEBP0702L)的10ppmendoH糖苷酶处理蛋白质样品，37℃温度下伴随800rpm振荡温育4至20h。

IV.归一化之后用HPLC测定法确定蛋白质含量

A.使用尺寸排阻色谱法(SEC)进行蛋白质测定

使用Agilent1200(AgilentTechnologies)HPLC来测定经endoH处理并归一化后的GH61A变体的浓度，其中该HPLC仪装配有WatersAcquityBEH125SEC1.7μm(4.6mm×150mm)色谱柱。取25μL样品与75μLMilliQ超纯水混合。然后取10μL样品注入色谱柱。化合物洗脱条件为：以NaH₂PO₄(pH6.75)为洗脱液，流速0.35mL/min，等度洗脱4.5min。检测蛋白质在220nm波长处的吸光度。用经纯化野生型GH61A(3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400μg/mL)生成校正曲线，通过该校正曲线确定GH61A变体的蛋白质浓度。将GH61A变体的浓度除以同一块板中野生型GH61A(例如，参考酶)的平均浓度，得到性能指数(PI)。

B.使用反相色谱法(RPC)进行蛋白质测定

使用装配有PhenomenexAerisWidepore3.6uXB-C8(50mm×2.1mm)色谱柱的Agilent1200(AgilentTechnologies)HPLC来测定经纯化培养上清液中GH61A变体蛋白的浓度。取90μL样品与10μL50％乙腈混合。然后取10μL样品注入色谱柱。使用下列梯度洗脱化合物：洗脱液A(0min,90％)，(1.5min,70％)，(3.5min,55％)，(3.6min,5％)，(4.1min,5％)，(4.2min,90％)，(4.5min,90％)。洗脱液A为MilliQ超纯水+0.1％TFA，洗脱液B为乙腈+0.07％TFA。检测蛋白质在220nm波长处的吸光度。用经纯化野生型GH61A(15.625、31.25、62.5、125、250、500μg/mL)生成校正曲线，通过该校正曲线确定GH61A变体的蛋白质浓度。将GH61A变体的浓度除以同一块板中野生型GH61A(例如，参考酶)的平均浓度，得到性能指数(PI)。

V.热稳定性测定法

A.用Avicel测定法测量热稳定性(也称“尾随Avicel(AvicelAfter)测定法”)

热温育GH61A多肽(包括野生型和变体)后，使用Avicel测定法测定其残余活性。取四份25μL等分试样，分别置入96孔PCR板，再置于PCR仪中，66℃温育1h。按下文描述的步骤(参见第VIII部分)测定GH61A多肽经温育后的残余比活性。比较温育后的平均比活性与温育前的平均比活性，确定多肽变体相比野生型酶的相对残余活性。

B.使用 Orange和RT-PCR仪执行蛋白质热转变测定(也称为“Tm测定法”)

按下列步骤测量GH61A多肽(包括野生型和变体)解折叠的程度。在96孔板(HSP9645BioRad)中，将25μLGH61A野生型蛋白样品或变体蛋白样品(未用EndoH处理)与8μLOrange(用50mMNaAC(pH5.0)稀释1000倍)混合。然后把样品放入BioRadCFXConnectRT-PCR仪中温育。首先将样品于30℃温育1min，然后从30℃开始，以每5秒升高0.2℃的速率梯度升温，升至90℃。每隔5秒采集一次荧光数据，用BioRadCFXManager软件分析数据。按上文所述方法测定每种GH61A变体的解链温度(Tm)，将结果与野生型GH61A的Tm平均值(中值)(多次测量)比较。记录下观察到的Tm改善程度。

VI.全水解产物稀酸预处理玉米秸秆(whPCS)水解测定法

如前所述(参见Schell等人,J.Appl.Biochem.Biotechnol.,105:69-86,2003)，首先用2％w/w的H₂SO₄预处理玉米秸秆，滴加3M氢氧化铵，将pH滴定至5.0；随后加入最终浓度为0.01％的叠氮化钠防腐。再加入乙酸钠缓冲液(pH5.0)，获得10％固含量的最终浓度。反应混合物中的纤维素浓度约为3％，向96孔微量滴定板(Corning平底非结合表面聚苯乙烯板)的每孔中滴加70μL这种纤维素悬浮液。我们采用了两种不同的方法来测量在whPCS中的性能：A)向whPCS中加入47μL2g/L的酶背景混合物。这种酶混合物含CBH、BG和EG酶，三者之比约为8:1:1。然后向whPCS/背景酶混合物中添加22μL、11μL、5μL、3μL来自表达野生型GH61A或GH61A变体的红褐肉座菌细胞的100μg/mL纯化上清液。添加补偿体积的乙酸钠缓冲液，弥补总体积的差异。B)向whPCS中加入25μL0.225g/L的酶背景混合物。这种酶背景混合物含CBH、BG和EG酶，三者之比约为4:1.5:1，还含有辅助木聚糖酶和半纤维素酶(代表该混合物中大约5％和20％的酶)。然后向whPCS/背景酶混合物中添加25μL来自表达野生型GH61A或GH61A变体的红褐肉座菌细胞的50μg/mL纯化上清液。添加补偿体积的乙酸钠缓冲液，弥补总体积的差异。将板密封，置于恒温培养箱内，50℃温度下900rpm连续振荡。72h之后，将板置于冰上保持5min，接着向各孔内添加100μL100mM甘氨酸缓冲液(pH10)，使水解反应停止。将板密封，室温下3,000rpm离心2min。取上清液，采用己糖激酶和/或HPLC葡萄糖浓度检测方法分析释出葡萄糖的水解反应产物。生成野生型GH61A酶的剂量响应曲线。将变体GH61A生成的总糖量(平均值)除以由同一剂量野生型GH61A(例如，参考酶)生成的总糖量(平均值)，得到性能指数(PI)。

VII.稀氨预处理玉米秸秆(daCS)水解测定法

将玉米秸秆磨碎，用0.9mm筛网过筛，按PCT公开WO06110901、或已公布美国专利申请20070031918、20070031919、2007-0031953或20070037259中的说明用稀氨预处理，然后滴加1MH₂SO₄将pH滴定至5.0，再加入最终浓度为0.01％的叠氮化钠防腐。再加入乙酸钠缓冲液(pH5.0)，获得10％固含量的最终浓度。反应混合物中的纤维素浓度约为3％。向96孔微量滴定板(Corning平底非结合表面滴定板)的每孔中滴加70μL这种纤维素悬浮液。向daCS中加入25μL0.225g/L的酶背景混合物。这种酶背景混合物含CBH、BG和EG酶(三者之比约为4:1.5:1)，还含有辅助木聚糖酶和半纤维素酶(代表该混合物中大约5％和20％的酶)。然后向daCS/背景酶混合物中添加25μL来自表达野生型GH61A或GH61A变体的红褐肉座菌细胞的25μg/mL纯化上清液。添加补偿体积的乙酸钠缓冲液，弥补总体积的差异。将板密封，置于恒温培养箱内，50℃温度下900rpm连续振荡。72h之后，将板置于冰上保持5min，接着向各孔内添加100μL100mM甘氨酸缓冲液(pH10)，使水解反应停止。将板密封，室温下3,000rpm离心2min。取上清液，采用HPLC葡萄糖浓度检测方法分析释出葡萄糖的水解反应产物。生成野生型GH61A酶的剂量响应曲线。将GH61A变体生成的总糖量(平均值)除以由同一剂量野生型GH61A(例如，参考酶)生成的总糖量(平均值)，得到性能指数(PI)。

VIII.Avicel活性测定法

用50mM(pH5.0)乙酸钠稀释Avicel，得到3.33％w/v的混合物。取75μL这种悬浮液分配到96孔微量滴定板(Corning平底非结合PS)上。随后，向Avicel溶液中滴加15μL10mM的抗坏血酸、15μL1mM的CuCl₂，以及35μL来自表达FAB的(Δeg1,Δeg2,Δeg3,Δeg5,Δeg6,Δgh61a,Δcbh1,Δcbh2,ΔMan1)菌株的714μg/mL培养上清液(参见PCT公开WO2012/125951)。然后向Avicel/FAB混合物中添加10μL100μg/mL的纯化野生型GH61A或GH61A变体。一式四份分析每种野生型和变体。将微量滴定板密封，置于恒温培养箱内，50℃温度下伴随900rpm连续振荡进行温育。20h之后，向各孔内添加100μL100mM甘氨酸缓冲液(pH10)，使水解反应停止。将板密封，室温下3,000rpm离心2min。取上清液，采用ABTS测定法(参见上文I.B部分)分析水解反应产物(在上文I.B部分中也称为GH61A活性测定混合物)。生成野生型GH61A的剂量响应曲线。将GH61A变体生成的总糖量(平均值)除以由同一剂量野生型GH61A(例如，参考酶)生成的总糖量(平均值)，得到性能指数(PI)。

实施例2

I.生成红褐肉座菌GH61A位点评价文库(“SEL”)

将编码红褐肉座菌(H.jecorina)GH61A酶的序列(SEQIDNO:1)克隆进pTTTpyr2载体，生成pTTTpyr2-GH61A质粒(pTTTpyr2载体与PCT公开WO2011/063308(该公开以引用方式并入本文)中描述的pTTTpyrG载体类似，不同之处是用pyr2基因替换了pyrG基因)。全长GH61A酶的氨基酸序列以SEQIDNO:2示出。利用pTTTpyr2-GH61A质粒或pTTTpyrG载体，生成GH61A成熟酶(SEQIDNO:3)所有位点(SEQIDNO:3中第236位至第286位氨基酸位置和第314位氨基酸残基除外)的位点评价文库(SEL)。生成野生型GH61A酶，其中在相关位点处编码相同氨基酸(例如，H1H、G2G等)。

下列SEQIDNO:1示出了编码参考红褐肉座菌GH61A的DNA序列：ATGATCCAGAAGCTTTCCAACCTCCTTGTCACCGCACTGGCGGTGGCTACTGGCGTTGTCGGACATGGACATATTAATGACATTGTCATCAACGGGGTGTGGTATCAGGCCTATGATCCTACAACGTTTCCATACGAGTCAAACCCCCCCATAGTAGTGGGCTGGACGGCTGCCGACCTTGACAACGGCTTCGTTTCACCCGACGCATACCAAAACCCTGACATCATCTGCCACAAGAATGCTACGAATGCCAAGGGGCACGCGTCTGTCAAGGCCGGAGACACTATTCTCTTCCAGTGGGTGCCAGTTCCATGGCCGCACCCTGGTCCCATTGTCGACTACCTGGCCAACTGCAATGGTGACTGCGAGACCGTTGACAAGACGACGCTTGAGTTCTTCAAGATCGATGGCGTTGGTCTCCTCAGCGGCGGGGATCCGGGCACCTGGGCCTCAGACGTGCTGATCTCCAACAACAACACCTGGGTCGTCAAGATCCCCGACAATCTTGCGCCAGGCAATTACGTGCTCCGCCACGAGATCATCGCGTTACACAGCGCCGGGCAGGCAAACGGCGCTCAGAACTACCCCCAGTGCTTCAACATTGCCGTCTCAGGCTCGGGTTCTCTGCAGCCCAGCGGCGTTCTAGGGACCGACCTCTATCACGCGACGGACCCTGGTGTTCTCATCAACATCTACACCAGCCCGCTCAACTACATCATCCCTGGACCTACCGTGGTATCAGGCCTGCCAACGAGTGTTGCCCAGGGGAGCTCCGCCGCGACGGCCACCGCCAGCGCCACTGTTCCTGGAGGCGGTAGCGGCCCGACCAGCAGAACCACGACAACGGCGAGGACGACGCAGGCCTCAAGCAGGCCCAGCTCTACGCCTCCCGCAACCACGTCGGCACCTGCTGGCGGCCCAACCCAGACTCTGTACGGCCAGTGTGGTGGCAGCGGTTACAGCGGGCCTACTCGATGCGCGCCGCCAGCCACTTGCTCTACCTTGAACCCCTACTACGCCCAGTGCCTTAAC

下列SEQIDNO:2示出了红褐肉座菌GH61A全长酶的序列：MIQKLSNLLVTALAVATGVVGHGHINDIVINGVWYQAYDPTTFPYESNPPIVVGWTAADLDNGFVSPDAYQNPDIICHKNATNAKGHASVKAGDTILFQWVPVPWPHPGPIVDYLANCNGDCETVDKTTLEFFKIDGVGLLSGGDPGTWASDVLISNNNTWVVKIPDNLAPGNYVLRHEIIALHSAGQANGAQNYPQCFNIAVSGSGSLQPSGVLGTDLYHATDPGVLINIYTSPLNYIIPGPTVVSGLPTSVAQGSSAATATASATVPGGGSGPTSRTTTTARTTQASSRPSSTPPATTSAPAGGPTQTLYGQCGGSGYSGPTRCAPPATCSTLNPYYAQCLN

下列SEQIDNO:3示出了红褐肉座菌GH61A成熟酶的序列：HGHINDIVINGVWYQAYDPTTFPYESNPPIVVGWTAADLDNGFVSPDAYQNPDIICHKNATNAKGHASVKAGDTILFQWVPVPWPHPGPIVDYLANCNGDCETVDKTTLEFFKIDGVGLLSGGDPGTWASDVLISNNNTWVVKIPDNLAPGNYVLRHEIIALHSAGQANGAQNYPQCFNIAVSGSGSLQPSGVLGTDLYHATDPGVLINIYTSPLNYIIPGPTVVSGLPTSVAQGSSAATATASATVPGGGSGPTSRTTTTARTTQASSRPSSTPPATTSAPAGGPTQTLYGQCGGSGYSGPTRCAPPATCSTLNPYYAQCLN

就选定的178个位点中的每一个位点来说，通常得到14至16种置换变体。得到的SEL变体为分别纯化过的质粒，每种质粒编码的GH61A变体序列都在指定位置处发生了置换。

II.制备GH61A变体

按上文(例如)在PCT专利申请公开WO2009/048488(以引用方式并入本文)中所述步骤，用各单独pTTTpyr2-GH61A或pTTTpyrG-GH61ASEL构建体转化红褐肉座菌(Δeg1,Δeg2,Δeg3,Δeg5,Δeg6,Δgh61a,Δcbh1,Δcbh2,Δman1)菌株的原生质体(每次转化一个GH61A变体)，接种至含乙酰胺的选择性琼脂，28℃培养7d。含乙酰胺琼脂培养出红褐肉座菌(H.jecorina)的原生质体，将这些原生质体收集起来，重新接种，28℃孵育7d。收集孢子于15％甘油中，-20℃冷藏。为了进行GH61A变体制备，取含200μL甘氨酸基本培养基(补充有2％葡萄糖/槐糖混合物)的PVDF滤板，向其中滴入10μL体积的孢子悬液。每种GH61A变体取四份培养。用透氧膜将滤板密封，伴随220rpm振荡，28℃孵育6d。在低压下将培养基转移至微量滴定板，收集上清液。使用实施例1中I.A部分叙述的己糖激酶测定法测量残余葡萄糖量。

实施例3

表征GH61A变体和鉴定高度可组合的置换与生产性置换

我们检测了红褐肉座菌GH61ASEL变体酶的多种受关注性质。具体地讲，我们按实施例1中IV.A或B部分示出的方法检测了GH61A变体的蛋白质表达，按实施例1中V.B部分示出的方法(Tm)检测了GH61A变体的热稳定性，按实施例1中VI.A部分示出的方法、使用测量残余葡萄糖的己糖激酶测定法(whPCSHK)检测了GH61A变体水解whPCS的性能，还按实施例1中VI.B部分示出的方法、使用测量葡萄糖浓度的HPLC测定法(whPCSHPLC)检测了GH61A变体水解whPCS的性能。

我们测定了每种受检测GH61A变体在前述两种whPCS测定法中的性能指数(PI)，并且在蛋白质产量高于某一水平处测定。PI是受检测GH61A变体的性能与参考GH61A(即，相关位点为野生型氨基酸的GH61A)的性能的比值。通常使小于或等于0.05的PI固定在0.05。然而，使为0.0的HPLC蛋白表达值固定在0.04。把含野生型残基的GH61A酶的PI值设定为1.00。将变体的Tm测量值与野生型亲本GH61A的平均Tm测量值相比较，结果显示Tm改善。

我们使用测得的SEL变体PI值，以及其他相关性质的比较结果，鉴定出了GH61A中的生产性位置。本文定义的生产性位置，是指分子内最常用于形成表现出特性改善的组合变体的那些位置，这些位置本身能够发生至少一种可组合突变。本文定义的高度可组合的突变，是指任一可用于生成组合变体的氨基酸位置处的突变。高度可组合的突变改善了分子的至少一种所需性质，同时不会明显降低表达、活性和稳定性。

下表1列出了GH61A中选自上述SEL的多种置换，引入这些置换可构建GH61A组合变体文库。表1中的置换仅仅选择作为具有所关注的改善性质的代表性置换，并不用来表示一种或多种性质改善的全范围变体。以表1置换为基础产生的GH61A组合变体文库中的各单独成员具有至少两种不同的氨基酸置换。表1中的氨基酸残基编号是参照野生型GH61A的成熟氨基酸序列(即SEQIDNO:3)指定的。

表1：选择的用于生成红褐肉座菌GH61A组合文库的多种置换。

以pTTTpyr2-GH61A载体为模板制备了编码GH61A组合变体的多核苷酸，将其转化进大肠杆菌(E.coli)，再接种到含100μg/mL氨苄青霉素的2×TY琼脂板(16g/L细菌用胰蛋白胨(Difco,USA)、10g/L细菌用酵母提取物(Difco,USA)、5g/LNaCl、16g/L细菌用琼脂(Difco,USA))上。37℃孵育过夜，从含100μg/mL氨苄青霉素的2×TY琼脂板上挑选氨苄青霉素抗性大肠杆菌菌落，接种到每孔盛有1mL2×TY培养基(含100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素)的微量滴定板上，37℃培养24h。使用这些细菌培养物纯化质粒DNA。

编码GH61A组合变体的纯化pTTTpyr2-GH61A衍生质粒以150至300ng/μL的浓度使用。按例如美国专利申请公开US2006/0094080A1所述，取5μL质粒DNA进行真菌转化。用各单独pTTTpyr2-GH61A构建体转化红褐肉座菌(Δeg1,Δeg2,Δeg3,Δeg5,Δeg6,Δgh61a,Δcbh1,Δcbh2,Δman1)菌株的原生质体(即，每次转化一个GH61A变体)，接种至24孔微量滴定板上的含乙酰胺的选择性培养基中，28℃培养7d。

收集各变体的红褐肉座菌转化株初始群落中的孢子，在含乙酰胺琼脂板上再次选择，以增加携带质粒的孢子的数量。使用生理盐水溶液收集孢子，重新点样于96孔微量滴定板中，然后用于接种多个生产性培养基，培养生成GH61A变体样品。为此，取96孔滤板(Corning，货号3505)，该滤板每孔装有250μL甘氨酸生产性培养基，这种生产性培养基包含：4.7g/L(NH₄)₂SO₄、33g/L1,4-哌嗪双(丙磺酸)(pH5.5)、6.0g/L甘氨酸、5.0g/LKH₂PO₄、1.0g/LCaCl₂×2H₂O、1.0g/LMgSO₄×7H₂O、2.5mL/L400X里氏木霉痕量元素溶液(含5g/LFeSO₄×7H₂O、1.4g/LZnSO₄×7H₂O、1.6g/LMnSO₄×H₂O、3.7g/LCoCl₂×6H₂O)、20g/L葡萄糖和6.5g/L槐糖，将红褐肉座菌转化株的孢子悬液一式四份地接种到其中。28℃、80％湿度环境中温育滤板6至8d。真空过滤收集培养上清液。

从培养上清液中分离出GH61A组合变体，检测各种活性。使用两种定量方法对每种GH61A组合变体进行定量分析，分别是：实施例1中IV.A部分描述的SEC，实施例1中IV.B部分描述的RPC。相比野生型GH61A，GH61A变体培养上清液中的酶量增加，所以说GH61A变体的产量(或收率)改善。将变体的Tm测量值与野生型亲本多肽的Tm测量值相比较，结果显示变体的热稳定性改善。测定(采用SEC和RPC)经纯化GH61A组合变体在下列一种或多种测定法中的性能指数(PI)值：(i)如实施例1中VI部分所述的whPCS水解测定法(whPCS)；(ii)如实施例1中VII部分所述的daCS水解测定法(daCS)；(iii)如实施例1中VIII部分所述的Avicel活性测定法(Avicel)。

使用线性模型解卷积方法分析按上文所述方法生成的每种GH61A组合变体的数据，其中，使用简单线性模型回归来解卷积置换分别对每种性质产生的影响(假设所有置换可相加，使用非交互作用项)。Ihaka等人,“ALanguageforDataAnalysisandGraphics”J.Comput.GraphicalStatistics1996,5(3):299-314.具体地讲，在把所有置换位点转化成因子变量后(指定野生型氨基酸为第一因子)，使用R基础包中的lm函数建立线性模型(参见下文)。从而解卷积得到GH61A中每种具体的置换对Tm、蛋白质生产(收率)、daCS测定法中的性能以及whPCS测定法中的性能的影响。以下多个解卷积队列分别列出了与Tm、蛋白质生产(收率)、daCS法测定中的性能以及whPCS测定法中的性能这些方面中的一项或多项改善相关联的GH61A置换。

解卷积队列1：与daCS测定法中的活性改善相关联的GH61A置换：N10D、N51E、K58V、K64L、K70S、K70E、V104A、K106C、T108K、T108A、T127I、A129N、Q167K、D197A、D197M、A201D、T287A、Y291F、Y291W、G295T、G295C、S297E、S300T、T303G、T303P、R304D、R304P、T313K、N315W、P316F、Y317W、Q320A、Q320P和Q320S。

解卷积队列2：与whPCS测定法中的活性改善相关联的GH61A置换：N10D、A16N、N51E、P52F、K58V、K64L、K70N、T107G、T107Q、T107E、T107N、T108K、T127I、S185D、D197L、H200A、T287A、Y291F、S297E、T313K、P316A和P316F。

解卷积队列3：与Tm改善相关联的GH61A置换：A16N、N51H、N51T、K70N、K70L、T107N、T107M、D124N、T127I、S164M、Q167K、A168K、S187D、D197E、G235K、T287A、L290A、S297C、G298C、G301S、G301P、T313K、P316A、Y318W和Q320A。

解卷积队列4：与蛋白质生产(收率)改善相关联的GH61A置换：A16N、N51H、N51T、K70N、V80T、T107E、T108K、S135E、S187D、D197E、G235K、G235L、G235S、T287A、L290M和P316A。

解卷积队列1、2、3和/或4中的任一种GH61A置换或这些GH61A置换的任一种组合可用于本发明的诸方面。与前述部分提到的单个SEL变体一样，多种GH61A置换归入不止一个上述解卷积队列。因此，归入2个或2个以上、3个或3个以上、或者全部4个解卷积队列的GH61A置换(例如GH61A的T287A置换，该置换归入以上全部4个解卷积队列)可用于本发明的诸方面。鉴于此，改善的性质组合类似和/或性质改善程度类似的GH61A组合变体将形成独特的功能组。

仅举一例，下列GH61A置换既归入上述解卷积队列1，又归入上述解卷积队列2(但不一定只归入解卷积队列1、2，例如，T287A也归入解卷积队列3、4)：N10D、N51E、K58V、K64L、T108K、T127I、T287A、Y291F、S297E、T313K和P316F。

下表2示出一种以改善的性质组合与性质改善程度为基础，将上述解卷积队列分组的可行方式。在表2中，按以下标准将置换分配到不同组中：

组1：daCS测定法和whPCS测定法两者的PI为至少++改善，至少一者的PI为+++改善。

组2：daCS测定法的PI为至少+++改善，并且whPCS测定法的PI为小于++改善。

组3：whPCS测定法的PI为至少+++改善，但daCS测定法的PI为小于++改善。

组4：ΔTm为至少+++改善。

组5：蛋白质生产的PI为至少+++改善。

组6：任何性质均为至少++改善。

组7：任何性质均为至少+改善。

表2：GH61A变体性质的汇总

表2中的评分标准如下：

Tm评分标准：

++++＝Tm显著升高≥1.5℃

+++＝1.0℃≤Tm显著升高<1.5℃

++＝0.5℃≤Tm显著升高<1.0℃

+＝Tm显著升高<0.5℃

其他各项的评分标准(基于PI)：

++++＝显著升高≥0.03

+++＝显著升高≥0.02且<0.03

++＝显著升高≥0.01且<0.02

+＝显著升高<0.01

应当理解，本文仅出于举例说明的目的描述实施例和实施方案，根据这些实施例和实施方案，本领域的技术人员会想到各种变型或改变，这些变型或改变包括在本申请的实质和范围以及所附权利要求书的范围内。本文引用的所有出版物、专利及专利申请特此全文以引用方式并入本文，用于各种目的。

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序列

Claims

1.一种亲本糖苷水解酶家族61(GH61)酶的变体，其中所述变体具有纤维素酶活性，与SEQIDNO:3具有至少80％的序列同一性，并且相比于所述亲本GH61酶具有至少一种显著改善的性质，其中所述至少一种显著改善的性质选自：显著更高的解链温度(T_m)、在全水解产物酸预处理玉米秸秆(whPCS)测定法中显著改善的性能、在稀氨玉米秸秆(daCS)测定法中显著改善的性能、显著改善的蛋白质生产、以及这些性质的组合。

2.根据权利要求1所述的变体，其中所述变体相比于所述亲本GH61酶具有显著更高的解链温度(T_m)。

3.根据权利要求2所述的变体，其中所述变体包含选自下列的氨基酸置换：G301S、D124N、S164M、Y318W、和所述置换的组合，其中每个氨基酸置换的位置与SEQIDNO:3对应。

4.根据权利要求1所述的变体，其中所述变体相比于所述亲本GH61酶在全水解产物酸预处理玉米秸秆(whPCS)测定法和稀氨玉米秸秆(daCS)测定法中具有显著改善的性能。

5.根据权利要求4所述的变体，其中所述变体包含选自下列的氨基酸置换：K58V、K64L、P316F、S297E、和所述置换的组合，其中每个氨基酸置换的位置与SEQIDNO:3对应。

6.根据权利要求1所述的变体，其中所述变体相比于所述亲本GH61酶在稀氨玉米秸秆(daCS)测定法中具有显著改善的性能。

7.根据权利要求6所述的变体，其中所述变体包含选自下列的氨基酸置换：G295C、G295T、N315W、T303G、Y317W、和所述置换的组合，其中每个氨基酸置换的位置与SEQIDNO:3对应。

8.根据权利要求1所述的变体，其中所述变体相比于所述亲本GH61酶在全水解产物酸预处理玉米秸秆(whPCS)测定法中具有显著改善的性能。

9.根据权利要求8所述的变体，其中所述变体包含选自下列的氨基酸置换：H200A、S185D、P316A、N51E、和所述置换的组合，其中每个氨基酸置换的位置与SEQIDNO:3对应。

10.根据权利要求1所述的变体，其中所述变体相比于所述亲本GH61酶具有显著改善的蛋白质生产。

11.根据权利要求10所述的变体，其中所述变体包含选自下列的氨基酸置换：V80T、A16N、N51H、N51T、T108K、和所述置换的组合，其中每个氨基酸置换的位置与SEQIDNO:3对应。

12.根据权利要求1所述的变体，其中所述变体包含选自下列的氨基酸置换：G301S、D124N、S164M、Y318W、A129N、A168K、A16N、A201D、D197A、D197E、D197L、D197M、G235K、G235L、G235S、G295C、G295T、G298C、G301P、H200A、K106C、K58V、K64L、K70E、K70L、K70N、K70S、L290A、L290M、N10D、N315W、N51E、N51H、N51T、P316A、P316F、P52F、Q167K、Q320A、Q320P、Q320S、R304D、R304P、S135E、S185D、S187D、S297C、S297E、S300T、T107E、T107G、T107M、T107N、T107Q、T108A、T108K、T127I、T287A、T303G、T303P、T313K、V104A、V80T、Y291F、Y291W、Y317W、和所述置换的组合。

13.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述变体包含1至10个氨基酸置换。

14.根据权利要求13所述的变体，其中所述变体是组合变体。

15.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述亲本GH61多肽是真菌糖基水解酶61a(GH61A)。

16.根据权利要求15所述的变体，其中所述真菌GH61A来自红褐肉座菌(Hypocreajecorina)、红棕肉座菌(Hypocrearufa)、东方肉座菌(Hypocreaorientalis)、深绿肉座菌(Hypocreaatroviridis)、绿肉座菌(Hypocreavirens)、构巢裸壳孢菌(Emericellanidulans)、土曲霉(Aspergillusterreus)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、黑曲霉(Aspergillusniger)、白曲霉(Aspergilluskawachii)、黄曲霉(Aspergillusflavus)、棒曲霉(Aspergillusclavatus)、小麦全蚀病菌(Gaeumannomycesgraminis)、丰孢木霉(Trichodermasaturnisporum)、四孢脉孢菌(Neurosporatetrasperma)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、烟色新萨托菌(Neosartoryafumigate)、烟色新萨托菌(Neosartoryafumigate)、费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)、太瑞斯梭孢壳霉(Thielaviaterrestris)、踝节菌属(Talaromycessp.)、侧孢霉属(Sporotricumsp.)、以及异梭孢壳菌(Thielaviaheterothallica)。

17.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述变体与SEQIDNO:3具有至少90％的序列同一性。

18.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述变体与SEQIDNO:3具有至少95％的序列同一性。

19.一种多核苷酸，所述多核苷酸包括编码根据前述权利要求中任一项所述的亲本GH61多肽的变体的多核苷酸序列。

20.一种载体，所述载体包含根据权利要求19所述的多核苷酸。

21.根据权利要求20所述的载体，其中所述载体是表达载体。

22.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求19所述的多核苷酸、根据权利要求20所述的载体、或根据权利要求21所述的表达载体。

23.根据权利要求22所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真菌细胞或细菌细胞。

24.根据权利要求23所述的宿主细胞，其中所述真菌细胞是选自下列的丝状真菌细胞：里氏木霉(Trichodermareesei)、长梗木霉(Trichodermalongibrachiatum)、绿色木霉(Trichodermaviride)、康宁木霉(Trichodermakoningii)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、青霉属(Penicillium)、腐质霉属(Humicola)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、灰腐质霉(Humicolagrisea)、金孢子菌属(Chrysosporium)、勒克瑙金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophilia)、粘帚霉属(Gliocladium)、曲霉属(Aspergillus)、镰孢属(Fusarium)、脉孢菌属(Neurospora)、肉座菌属(Hypocrea)、裸孢壳属(Emericella)、黑曲霉(Aspergillusniger)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、和构巢曲霉(Aspergillusnidulans)。

25.根据权利要求22、23或24所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞表达由所述多核苷酸、所述载体或所述表达载体编码的亲本GH61多肽的所述变体。

26.一种制备变体GH61多肽的方法，所述方法包括在适宜条件下将根据权利要求25所述的宿主细胞在适宜培养基中培养以制备所述变体。

27.根据权利要求26所述的方法，所述方法还包括分离所述制备的变体。

28.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求1至18中任一项所述的GH61变体。

29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述组合物选自：洗涤剂、动物饲料、饲料添加剂、和细胞培养上清液。

30.根据权利要求28或29所述的组合物，其中所述组合物富含所述GH61变体。

31.一种用于水解纤维素底物的方法，所述方法包括使所述底物与根据权利要求1至18中任一项所述的变体GH61多肽接触。