KR20110124242A - 발효 브로쓰 제형물 - Google Patents

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톰 타오 후앙
아론 켈리
존 맥러플인
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다니스코 유에스 인크.
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Abstract

본 개시는 유기산 및/또는 유기산 염을 포함하는 발효 브로쓰 제형물, 및 이 제형물의 제조 및 이용 방법에 관한 것이다.

Description

발효 브로쓰 제형물 {FERMENTATION BROTH FORMULATIONS}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 본원에서 그 전문이 삽입된, 2009 년 2 월 20 일에 제출된 미국 가출원 시리즈 제 61/154,235 호, 2009 년 6 월 10 일에 제출된 제 61/185865 호 및 2010 년 2 월 12 일에 제출된 제 61/304,219 호의 우선권을 주장한다.
1. 본 발명의 기술 분야
본 발명은 발효 브로쓰 (broth) 제형물 및 이의 제조법 및 용도에 관한 것이다.
2. 배경 기술
미생물 배양 또는 발효의 여러 프로세스에 있어서, 혼합물 내 활성 세포를 사멸하는 것은 발효 프로세스 기간 동안 또는 그 기간 끝에서 때때로 필수적이다. 이는 재조합 DNA 를 포함하는 미생물을 생산 숙주로서 육성하고, 임의의 생 재조합 유기체를 주변 환경으로 방출하는 것을 방지하는 것이 바람직한 경우에 특히 적용된다. 미생물이 재조합 DNA 를 포함하지 않는 경우에서도, 생세포가 프로세스의 생성물로 또는 폐기물로 주변 환경에 방출되지 않는 것을 보장하도록, 프로세싱 이전에 세포를 사멸하는 것이 보통 바람직하다.
가열 등의 미생물을 사멸하는데 요구되는 다수의 통상적인 방법은 매우 고된 작업이고, 세포가 사멸되기 이전에 원하는 분비물이 파괴되거나 또는 변경될 수 있다. 이 경우, 세포를 사멸하지 않은 채 생성물을 회수해야 하는데, 여기에는 장황되고 비용이 드는 격납 절차 및 장치의 사용이 요구된다. 미국 특허 제 5,801,034 호 및 제 5,378,621 호에는 탄소수 1 내지 5 의 단일의 유기산으로 미생물 세포를 사멸하는 방법이 기술되어 있다. 그러나, 이들 특허의 실시예에 따르면, 고수준의 유기산과 낮은 pH 가 최적이다. 낮은 pH 조건은 흔히 발효 배지 내 다수의 관심 효소 생성물의 안정성에 해를 입히고, 고수준의 유기산은 효소 생성물을 이용한 효소 촉매작용에 의해 생성되어진 유기 물질을 기질 상에 생성하는 미생물의 발효와 같이, 효소 생성물을 이용하는 것이 바람직한 다운스트림 적용에서 자주 제지된다. 나아가, 미생물 세포의 사멸을 위해 고농도의 화학 제제를 사용하면, 발효 배지로부터 회수된 생성물의 비용이 현저히 증가된다.
따라서, 저농도의 화학 제제가 바람직하고, 덜 가혹한 조건 하에서 세포를 사멸하는 방법을 개발하는 것이 여전히 요구된다.
3. 본 발명의 간단한 개요
효소 등의 다수의 공업용 단백질은 보통 이들이 생성되는 발효 브로쓰 내로 시중에서 공급된다. 전형적으로, 단백질은 (재조합 또는 비재조합) 세포에 의해 발효 배지 및 세포를 포함하는 발효 브로쓰 내에 발현 및 분비된다. 보통, 복제 세포를 주변 환경으로 배출하지 않도록, 단백질을 산업적 적용으로 이용하기 전에 세포를 사멸하는 등 세포를 불활성화시키는 것이 바람직하다. 본 발명의 개시에는, 효소 등 단백질의 활성에 실질적으로 개입하지 않는 방식으로, 세포를 불활성화시킬 필요성이 제시되어 있다.
특정 측면에 있어서, 본 개시는 (a) 하나 이상의 발효 브로쓰, (b) 하나 이상의 1-5 탄소 유기산 (즉, 그의 백본 및 측쇄에 총 1-5 개의 탄소를 갖는 유기산) 및/또는 이의 염을 포함하는 제 1 유기산 성분 [제 1 혼합물의 0.1 내지 15 중량% 함량], 및 (c) 하나 이상의 6 이상 탄소 유기산 (즉, 그의 백본 및 측쇄에 총 6 개 이상의 탄소를 갖는 유기산) 및/또는 이의 염을 포함하는 제 2 유기산 성분, [제 1 혼합물의 0.025 내지 5 중량% 함량] 를 포함하는 제 1 혼합물을, 하나 이상의 상기 발효 브로쓰 내 생세포를 적어도 4 로그 감소시키는 조건 하 및 기간 동안 인큐베이션하여, 발효 브로쓰 제형물을 제조하는 것을 포함하는 발효 브로쓰 제형물의 제조 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 제 1 유기산 성분은, 그 하한이 0.1%, 0.2%, 0.25%, 0.3 %, 0.35%, 0.4%, 0.5%, 0.75%, 또는 1% 로부터 선택되고, 그 상한이 독립적으로 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.75%, 1%, 2%, 3%, 5%, 7%, 10%, 12%, 또는 15% 로부터 선택되는 범위 (제 1 혼합물의 중량 기준) 이고, 예를 들어 제 1 혼합물의 0.2 중량% 내지 1 중량%, 0.2 중량% 내지 0.5 중량%, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 0.25 중량% 내지 5 중량%, 또는 0.3 중량% 내지 3 중량% 등 범위의 양으로 존재한다.
특정 구현예에서, 제 2 유기산 성분은, 그 하한이 0.025%, 0.03%, 0.04%, 0.045%, 0.05%, 0.075%, 0.1%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.5%, 0.75%, 또는 1% 로부터 선택되고, 그 상한이 독립적으로 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.75%, 1%, 2%, 3%, 또는 5% 로부터 선택되는 범위 (제 1 혼합물의 중량기준) 이고, 예를 들어 제 1 혼합물의 0.04 중량% 내지 3 중량%, 0.2 중량% 내지 0.5 중량%, 0.1 중량% 내지 1 중량%, 0.25 중량% 내지 5 중량% 또는 0.3 중량% 내지 3 중량% 등 범위의 양으로 존재한다. 유기산은 적합하게 6- 내지 10-탄소 유기산, 6- 내지 9- 탄소 유기산, 또는 6- 내지 8-탄소 유기산일 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 제 2 유기산 성분은 6-탄소산 및/또는 이의 염, 7-탄소산 및/또는 이의 염, 8-탄소산 및/또는 이의 염, 9-탄소산 및/또는 이의 염, 또는 10-탄소산 및/또는 이의 염을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다.
인큐베이션 기간은 그 하한이 4 시간, 6 시간, 8 시간, 10 시간, 12 시간, 14 시간, 16 시간, 18 시간 또는 20 시간으로부터 선택되고, 그 상한이 독립적으로 12 시간, 16 시간, 20 시간, 24 시간, 28 시간, 32 시간 또는 36 시간으로부터 선택된 범위인 것이 적합하고, 예를 들어 4 시간 내지 36 시간, 예를 들어 8 시간 내지 36 시간, 20 시간 내지 28 시간, 8 시간 내지 16 시간, 10 시간 내지 20 시간, 16 시간 내지 30 시간 등이다.
인큐베이션 조건에는, 적합하게 하한이 20℃, 22℃, 25℃, 28℃, 30℃, 32℃, 34℃, 36℃, 38℃, 또는 40℃ 로부터 선택되고, 상한이 독립적으로 28℃, 33℃, 35℃, 40℃, 45℃, 50℃, 또는 55℃ 로부터 선택되는 범위의 온도, 예를 들어 20℃ 내지 50℃, 25℃ 내지 40℃, 28℃ 내지 33℃ 등의 범위의 온도가 포함된다.
인큐베이션 조건에는, 적합하게 하한이 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 또는 4.2 로부터 선택되고, 상한이 독립적으로 3.8, 4, 4.2, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.2, 또는 5.5 로부터 선택되는 범위의 pH, 예를 들어 3.5 내지 5, 4 내지 4.7, 또는 4.2 내지 4.5 범위의 pH 가 포함된다. pH 는, 인큐베이션의 개시 및/또는 인큐베이션 기간 중 한 회 이상, 예를 들어 pH-조절제를 첨가하여 조절될 수 있다. 특정 구현예에서, pH-조절제는 인산, 황산 또는 수산화나트륨이다. 또한 특정 구현예에서 제 1 및/또는 제 2 유기산 성분이 인큐베이션 개시 및/또는 인큐베이션 기간 동안에 pH 를 조절하는데 중요한 역할을 할 수 있다는 점도 본원에서 고려되므로, 추가 pH 조절제에 대한 요구가 부분적으로 또는 전적으로 완화된다.
특정 구현예에서, 본 개시의 방법은 혼합물 내 하나 이상의 발효 브로쓰에서 생세포 수를 적어도 5 log 감소, 6 log 감소, 7 log 감소 또는 8 log 감소시킨다.
특정 구현예에서, 제 1 혼합물의 제 1 과 제 2 유기산 성분의 총 중량% 이하의 양으로, 오직 하나의 유기산 성분만을 포함하는 상기 조건에 적용된 제 2 혼합물 또는 대안 혼합물에서 보다, 제 1 혼합물의 것에서는 적어도 0.25-배, 적어도 0.5-배, 적어도 1-배, 적어도 2-배, 적어도 5-배 또는 적어도 10-배 초과로 생세포가 감소된다. 예를 들어, 본 개시의 방법과 관련된, 제 1 함량 (예, 1 중량%) 의 제 1 유기산 성분 및 제 2 함량 (0.5 중량%) 의 제 2 유기산 성분을 이용하면, 동일하거나 유사한 조건 하에서, 상기 제 1 함량과 제 2 함량 합계의 함량 (예, 1.5 중량%) 이하인 제 3 함량의 제 1 유기산 성분 또는 제 2 유기산 성분 단독을 사용한 것보다 생세포 수가 크게 감소된다.
본 방법은 진균류 세포, 예를 들어 사상 진균류 세포를 불활성화시키는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 사상 진균류 세포는 속 트리코데르마 (Trichoderma), 아스페르길러스 (Aspergillus), 페니실륨 (Penicillium), 휴미콜라 (Humicola), 키리소스포륨 (Chrysosporium), 또는 뉴로스포라 (Neurospora) 로부터 선택된다. 본 개시의 방법, 제형물 및 조성물에 적합한 추가 세포 유형은 하기 섹션 5.2.1 에 기술된다.
특정 구현예에서, 제 1 유기산 성분은 아세트산, 아세트산염, 포름산, 포름산염, 프로피온산, 프로피온산염, 또는 이들 둘 이상의 혼합물을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 한 구현예에서, 제 1 유기산 성분은 아세트산 및/또는 이의 염을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
특정 구현예에서, 제 2 유기산 성분은 벤조산, 벤조산염, 시클로헥산카르복실산, 시클로헥산카르복실산염, 4-메틸발레르산, 4-메틸발레르산염, 페닐아세트산, 페닐아세트산염, 또는 이들 둘 이상의 혼합물을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 한 구현예에서, 제 2 유기산 성분은 벤조산 및/또는 이의 염을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
본 방법의 특정 구현예에서, 제 1 유기산 성분은 상기 1-5 탄소 유기산의 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘 염을 포함하고, 및/또는 제 2 유기산 성분은 상기 6 이상 탄소 유기산의 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘 염을 포함한다.
일정 특정 구현예에서, 제 1 유기산 성분은 아세트산을 0.2 - 0.4 중량% 농도로 포함하고, 제 2 유기산 성분은 나트륨 벤조에이트를 0.2 - 0.4 중량% 농도로 포함하며, 및/또는 기간은 24 시간이고, 및/또는 조건은 40℃ 의 온도를 포함하고, 및/또는 조건은 4 내지 4.6 의 pH 를 포함한다.
본 개시의 방법에서, 제 1 혼합물은 또한 예를 들어 오염 박테리아 또는 진균류의 성장을 억제하는 하나 이상의 항균제를 포함할 수도 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 항균제는 제 1 혼합물의 0.0005 내지 0.05 중량% 의 양으로 존재하며, 그 함량의 예는 제 1 혼합물의 0.001 내지 0.025 중량% 이다. 특정 구현예에서, 항균제는 이소-알파-산, 테트라-이소 알파산, 및/또는 베타산을 함유하는 홉 추출물을 포함한다. 특정 구현예에서 제 1 및/또는 제 2 유기산 성분이 항균 역할을 할 수 있어, 추가 항균제에 대한 필요성을 부분적으로 또는 전적으로 완화시킬 수 있다는 점도 또한 본원에서 고려된다.
본 방법은 상기 인큐베이션 단계 이전에 제 1 혼합물의 제조 단계, 예를 들어 하나 이상의 발효 브로쓰를, 하나 이상의 1-5 탄소 유기산 및/또는 이의 염, 하나 이상의 6 이상 탄소 유기산 및/또는 이의 염, 및 임의로는 하나 이상의 추가 시약, 예컨대 pH 조절제 및/또는 항균제와 조합하는 것에 의한 제 1 혼합물의 제조 단계를 추가로 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 세포를 배양하여 본 개시에서 사용된 하나 이상의 발효 브로쓰를 제조하는 단계를 추가로 포함한다. 비제한적인 그 예로, 발효 브로쓰는 하기 섹션 5.2.2 에 기술된 세포 배양 방법 중 임의의 방법에 따라 제조될 수 있다. 따라서, 본 개시의 조성물 및 제형물은 본원에서 개시된 방법에 의해 제조된 발효 브로쓰를 포함할 수 있다.
임의의 이론에 구애받지 않고, 본 발명자들은, 본원에서 기술된 2 가지 유기산 성분을 사용하면, 단일의 유기산 성분을 이용하는 것과 비교할 때, 세포 불활성화에 요구되는 전체의 유기산 성분을 (예, 생세포의 수를 본원에서 기술한 바 4 log 인수 이상 감소시킴으로써) 감소시킬 수 있으며, 인큐베이션 반응을 달리 가능한 것보다 높은 pH 에서 실행시킬 수 있어 출발 발효 브로쓰 내 효소와 같은 단백질의 폴딩 및 안정성에 악영향을 최소화시킬 수 있다고 여긴다. 따라서, 특정 측면에서, 본 방법은 하나 이상의 효소가 그의 출발 효소 활성의 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 를 보유하는 발효 브로쓰 제형물을 제공하는 조건 하에서 실시된다.
본 개시는 본원에서 기술된 방법에 의해 수득되거나 또는 수득가능한 발효 브로쓰 제형물을 추가로 제공한다.
따라서, 특정 구현예에서, 본 개시는 하기를 포함하는 조성물을 제공한다: (a) 세포 함유 발효 브로쓰 하나 이상; (b) 1-5 탄소 유기산 및/또는 이의 염 하나 이상을 포함하는 제 1 유기산 성분 [상기 조성물의 0.2 내지 1.5 중량% 의 함량], (c) 6 이상 탄소 유기산 및/또는 이의 염 하나 이상을 포함하는 제 2 유기산 성분 [상기 조성물의 0.04 내지 0.6 중량% 의 함량].
특정 구현예에서, 제 1 유기산 성분은 그 하한이 0.1%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.5%, 0.75%, 또는 1% 로부터 선택되고, 그 상한이 독립적으로 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.75%, 1%, 2%, 3%, 5%, 7%, 10%, 12%, 또는 15% (조성물의 중량 기준) 으로부터 선택되는 범위이고, 예를 들어 조성물의 0.2 내지 1 중량%, 0.2 내지 0.5 중량%, 0.1 내지 10 중량%, 0.25 내지 5 중량% 또는 0.3 내지 3 중량% 의 양으로 존재한다.
특정 구현예에서, 제 2 유기산 성분은 그 하한이 0.025%, 0.03%, 0.04%, 0.045%, 0.05%, 0.075%, 0.1%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.5%, 0.75%, 또는 1% 로부터 선택되고, 그 상한이 독립적으로 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.75%, 1%, 2%, 3%, 또는 5% (조성물의 중량 기준) 로부터 선택되는 범위이고, 예를 들어 조성물의 0.04 내지 3 중량%, 0.2 내지 0.5 중량%, 0.1 내지 1 중량%, 0.25 내지 5 중량% 또는 0.3 내지 3 중량% 등 범위의 양으로 존재한다.
본 개시의 제형물 및 조성물 내 유기산 성분은 적어도 부분적으로는 해리 형태인 것이 전형적이고, 이러한 성분들이 해리 형태인 경우, 성분의 중량% 는 해리된 이온 (예, 양이온) 의 중량이 아닌, 조성물 또는 제형물 제조에 사용된 건조 물질 (예, 산 또는 염) 의 중량을 지칭하는 것이 자명하다. 이러한 성분들이 해리되는 정도는 이들의 각 pKa 값에 좌우될 것이다. 제형물 또는 조성물은 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60% 또는 적어도 70% 의 유기산 성분이 해리되는 pH 조건 및 온도에서 제조되는 것이 바람직하다.
특정 측면에서, 본 개시의 조성물은 그 하한이 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 또는 4.2 로부터 선택되고, 그 상한이 독립적으로 3.8, 4, 4.2, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.2, 또는 5.5 로부터 선택되는 범위가 적합한 pH, 예를 들어 3.5 내지 5, 4 내지 4.7, 또는 4.2 내지 4.5 의 pH 에서 존재한다.
특정 측면에서, 본 개시의 조성물 내 세포는 대개 또는 완전히 비(非)생세포이다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 생세포가 조성물 내에 존재한다면, 상기 조성물 내 비생세포 대 생세포의 비는 적어도 10:1, 적어도 50:1, 적어도 100:1, 적어도 1000:1, 적어도 10,000:1, 적어도 100,000:1 또는 적어도 1,000,000:1 이다.
특정 측면에서, 세포는 진균류 세포, 예를 들어 사상 진균류 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 사상 진균류 세포는 속 트리코데르마, 아스페르길러스, 페니실륨, 휴미콜라, 키리소스포륨, 또는 뉴로스포라이다.
본 개시의 조성물의 특정 구현예에서, 제 1 유기산 성분은 아세트산, 아세트산염, 포름산, 포름산염, 프로피온산, 프로피온산염, 또는 이들 둘 이상의 혼합물을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 구현예에서, 제 1 유기산 성분은 아세트산 및/또는 이의 염을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
본 개시의 조성물의 특정 구현예에서, 제 2 유기산 성분은 벤조산, 벤조산염, 시클로헥산카르복실산, 시클로헥산카르복실산염, 4-메틸발레르산, 4-메틸발레르산염, 페닐아세트산, 페닐아세트산염, 또는 이들 둘 이상의 혼합물을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 특정 구현예에서, 제 2 유기산 성분은 벤조산 및/또는 이의 염를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
특정 구현예에서, 제 1 유기산 성분은 1-5 탄소 유기산의 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘 염을 포함하고, 및/또는 제 2 유기산 성분은 6 이상 탄소 유기산의 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘 염을 포함한다.
본 개시의 방법 및 조성물에서 적합한 유기산의 추가 상세 설명 및 구현예는 하기 섹션 5.2.4 에 기술한다.
특정 구현예에서, 제 1 유기산 성분은 아세트산을 0.2-0.4 중량% 의 농도로 포함하고, 및/또는 제 2 유기산 성분은 나트륨 벤조에이트를 0.2-0.4 중량% 의 농도로 포함한다.
본 개시의 조성물은 하나 이상의 항균제를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 항균제는 조성물의 0.0005 내지 0.05 중량% 인 함량, 예를 들어 상기 조성물의 0.001 내지 0.025 중량% 의 함량으로 존재한다. 특정 구현예에서, 항균제는 이소-알파-산, 테트라-이소 알파산, 및/또는 베타산 함유 홉 추출물을 포함한다.
본 개시의 방법, 제형물 및 조성물에서 사용된 발효 브로쓰는 전형적으로 세포에 의해 분비된 하나 이상의 단백질을 포함한다. 상기 하나 이상의 단백질 중 적어도 하나는 재조합으로 발현될 수 있고/있거나 효소, 예를 들어 엑소글루카나아제, 엔도글루카나아제, 헤미셀룰라아제 또는 β-글루코시다아제이다. 특정 구현예에서, 발효 브로쓰는 예를 들어 엑소글루카나아제, 엔도글루카나아제, 헤미셀룰라아제 또는 β-글루코시다아제 중 둘 이상과 같은, 세포에 의해 분비되고 재조합 발현된 다수의 효소를 포함한다. 본 개시의 조성물 및 제형물 내에 적합하게 존재하는 추가 효소는 하기 섹션 5.2.3 에 기술한다. 특정 측면에서, 단백질은 본 개시의 제형물 또는 조성물의 3 내지 30 중량%를 구성한다. 특정 구현예에서, 단백질은 본 개시의 제형물 또는 조성물의 5 내지 15 중량 퍼센트, 7 내지 10 중량 퍼센트, 6 내지 12 중량 퍼센트, 5 내지 20 중량 퍼센트, 10 내지 25 중량 퍼센트, 10 내지 20 중량 퍼센트, 8 내지 15 중량 퍼센트 또는 6 내지 10 중량 퍼센트를 구성한다.
일부 특정 구현예에서, 본 개시의 제형물 또는 조성물은 하기 활성들 중 1, 2, 또는 3 가지 모두를 갖는다:
(a) 2000, 2100, 2200, 2350, 2500 또는 2650 CMC U/g 로부터 선택되는 하한에서, 독립적으로 2400, 2600, 2800, 3000, 3200, 3500, 3750 또는 4000 CMC U/g 로부터 선택되는 상한까지의 범위, 예를 들어 2200 CMC U/g 내지 2800 CMC U/g, 2200 CMC U/g 내지 3200 CMC U/g, 2500 내지 3500 CMC U/g, 등의 범위의 엔도글루카나아제 활성;
(b) 300, 375, 450, 475, 500, 525, 550, 600, 650, 또는 700 pNPG U/g 로부터 선택되는 하한에서, 독립적으로 475, 525, 575, 635, 700, 775, 800, 850, 900 또는 950 pNPG U/g 로부터 선택되는 상한까지의 범위, 예를 들어 525 pNPG U/g 내지 775 pNPG U/g, 300 pNPG U/g 내지 800 pNPG U/g, 350 pNPG U/g 내지 850 pNPG U/g, 등의 범위의 β-글루코시다아제 활성; 및
(c) 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750 또는 3000 ABX U/g 으로부터 선택되는 하한에서, 독립적으로 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000 또는 7000 ABX U/g 로부터 선택되는 상한까지의 범위, 예를 들어 2000 ABX U/g 내지 5000 ABX U/g, 1500 ABX U/g 내지 4500 ABX U/g, 3500 ABX U/g 내지 5500 ABX U/g, 등의 범위의 자일라나아제 활성.
또 다른 측면에서, 본 발명은 셀룰로오스성 (cellulosic) 물질을 임의의 상기 발효 브로쓰 제형물 또는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 셀룰로오스성 물질의 가수분해 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 셀룰로오스성 물질은, 임의로는 효소 가수분해를 강화하도록 예비처리되어진 리그노셀룰로오스성 물질과 같은 식물 바이오매스 (biomass) 물질이다. 따라서, 특정 측면에서, 본 개시의 제형물 및 조성물은 비(非)가수분해된 셀룰로오스성 물질, 부분 가수분해된 셀룰로오스성 물질, 또는 실질적으로 전체가 가수분해된 (예, >90% 가수분해 또는 >95% 가수분해된) 셀룰로오스성 물질을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 부분 가수분해된 셀룰로오스성 물질은 (i) 40% 이하, 50% 이하, 60% 이하, 70% 이하, 80% 이하 또는 90% 이하의 가수분해된 셀룰로오스성 물질이거나; (ii) 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 또는 적어도 70% 가수분해된 셀룰로오스성 물질이거나; 또는 (iii) (i) 과 (ii) 로부터 독립적으로 선택된 값들의 쌍에 속하는 범위, 예를 들어 30%-80% 또는 40%-90% 로 가수분해된 것이다. 상기 중량범위의 본원에 기술된 제형물 및 조성물의 성분 (예, 유기산) 은 일반적으로 셀룰로오스성 물질 또는 셀룰로오스성 물질의 가수분해 생성물을 포함하지 않는다는 점에 주의한다.
본 개시의 제형물 및 조성물의 추가 상세사항 및 구현예는 하기 섹션 5.3 에 기술되어 있다.
관점들에서, 본 개시는 본 개시의 제형물 또는 조성물 내 유기 물질을 생성하는 미생물을 발효시킴으로써 유기 물질을 생성하는 방법을 제공한다. 한 구현예에서, 미생물은 에탄올발생 (ethanologenic) 미생물이고, 유기 물질은 에탄올이다. 본 개시의 조성물은 동시 당화 발효 반응 (simultaneous saccharification and fermentation; "SSF") 또는 분리 가수분해 발효 반응 (separate hydrolysis and fermentation; "SHF") 에 사용될 수 있다.
임의 이론에 구애받지 않고, 본 개시의 제형물 및 조성물은, 본 개시의 조성물과 유사 또는 동일하나, 오직 하나의 유기산 성분만을 대안 제형물 또는 조성물 내 발효 브로쓰(들) 내 세포를 불활성화 또는 사멸하는 양으로 포함하는 제형물 또는 조성물 (본원에서는 각각 대안 제형물 또는 대안 조성물로 지칭됨) 보다 발효 미생물의 억제제를 적게 포함한다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 개시의 제형물 또는 조성물의 존재 하 발효 미생물에 의한 생성물 내 유기 물질의 수율은, 상기 대안 제형물 또는 조성물의 존재 하 유기 물질의 수율보다 적어도 0.25-배, 적어도 0.5-배, 적어도 1-배, 적어도 2-배, 적어도 5-배 또는 적어도 10-배 크다. 예로, 효소, 제 1 함량의 (예, 1 중량%) 제 1 유기산 성분 및 제 2 함량의 (0.5 중량%) 의 제 2 유기산 성분을 포함하는 본 개시의 조성물 또는 제형물이 발효 미생물과 함께 사용되는 경우, 발효 미생물에 의해 생성된 유기 물질의 수율은, 동일한 효소 및 제 3 함량 (상기 제 1 함량과 제 2 함량의 합 (예, 1.5 중량%) 이하) 의 제 1 유기산 성분 또는 제 2 유기산 성분 하나만을 포함하는 조성물이, 동일하거나 유사한 조건 하에서 사용된 경우의 수율보다 더 크다.
따라서, 특정 구현예에서, 본 제형물 및 조성물이 SSF 반응에 사용된다. 이 방법은 본 개시의 제형물 또는 조성물을 포함하는 SSF 반응 혼합물, 발효 미생물 및 셀룰로오스성 기질을 SSF 조건에 적용시키는 것을 포함한다. 임의로는, 방법은 SSF 반응 혼합물의 형성 단계, 예를 들어 본 개시의 제형물 또는 조성물, 에타놀로겐 (ethanologen) 및 임의로는 셀룰로오스성 기질의 조합에 의한, SSF 반응 혼합물의 형성 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, SSF 조건은 보충 질소 공급원의 부재를 포함한다. 또 다른 특정 구현예에서, 조건은 셀룰로오스의 글루코오스 및/또는 헤미-셀룰로오스 당 (예, 자일로오스, 아라비노오스, 및/또는 만노오스) 로의 가수분해와 글루코오스 및/또는 헤미-셀룰로오스의 유기 물질 (예, 에탄올) 로의 전환 모두에 도움이 된다. 본 개시의 제형물 또는 조성물, 발효 미생물 및 임의로는 셀룰로오스성 물질을 포함하는 SSF 반응 혼합물이 또한 본 개시에 포함되며, 마찬가지로 셀룰로오스성 물질이 적어도 부분적으로 가수분해되어 있거나 발효되어져 있는 SSF 반응 생성물도 포함된다.
기타 구현예에서, 본 제형물 및 조성물이 SHF 반응에 사용된다. 이 방법은 본 개시의 제형물 또는 조성물, 및 셀룰로오스성 기질을 포함하는 SHF 반응 혼합물을 SHF 조건에 적용시키는 것을 포함한다. 임의로는, 이 방법은 SHF 반응 혼합물의 형성 단계, 예를 들어 본 개시의 제형물 또는 조성물 및 셀룰로오스성 기질의 조합에 의한 SHF 반응 혼합물의 형성 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, SHF 조건은 셀룰로오스의 글루코오스 및/또는 헤미-셀룰로오스 당 (예, 자일로오스, 아라비노오스, 및/또는 만노오스) 로의 가수분해에 도움이 된다. 임의로는 이후 SHF 반응 생성물은 그 결과로서 수득한 글루코오스 및/또는 헤미-셀룰로오스를 유기 물질 (예, 에탄올) 로 전환하는 발효 반응에서 사용된다. 본 개시의 제형물 또는 조성물 및 셀룰로오스성 물질을 포함하는 SHF 반응 혼합물은, 또한 셀룰로오스성 물질이 적어도 부분적으로 가수분해되어져 있는 SHF 반응 생성물과 마찬가지로 본 개시에 의해 포함된다.
셀룰로오스성 물질의 가수분해 방법의 추가 상세 설명 및 구현예, 및 유기 물질의 생성 방법은 하기 섹션 5.4 및 5.5 에 기술한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 포장재 (packaging) 및 본 개시에 따른 제형물, 조성물, SSF 반응 혼합물, SSF 반응 생성물, SHF 반응 혼합물 또는 SHF 반응 생성물을 포함하는 키트 (kit) 를 제공한다. 일부 구현예에서, 키트는 발효 미생물을 이용한 유기 물질의 생성 방법에서의 사용 지침서, 예를 들어 키트 내 에탄올발생 미생물과 세포-사멸된 전체의 (whole) 브로쓰 또는 조성물로 가수분해된 셀룰로오스성 기질을 이용한 에탄올 생성 방법에서의 사용 지침서를 추가로 포함한다. 본 개시의 키트의 추가 자세 사항 및 구현예는 하기 섹션 5.6 에 기술한다.
본 개시의 방법, 제형물 및 조성물의 추가 구체적인 구현예는 하기 섹션 5.7 에 나타낸다.
4. 도면의 간단한 설명
도 1 은 T. 리세이 (T.reesei) 세포 사멸에 대한 온도 및 제형물 화학 농도의 효과를 나타낸다.
도 2 는 40℃ 및 pH 4 에서 T. 리세이 세포 사멸에 대한 나트륨 벤조에이트 농도의 효과를 나타낸다.
도 3 은 진균류 세포 사멸에 대한 세포 사멸 조건의 효과를 나타낸다.
도 4 는 6 이상 탄소를 갖는 유기산에 대한 화학 구조 및 pKa 값을 나타낸다.
도 5 는 40℃ 및 pH 4 에서 T. 리세이 세포 사멸에 대한 6 이상 탄소를 갖는 상이한 유기산의 효과를 나타낸다.
도 6 은 실시예 2 에 기술된 세정 APB 가수분해물 상 L. 람노서스 (L. rhamnosus) 로부터의 락트산 생성을 나타낸다.
도 7 은 실시예 2 에 기술된 세정 APB 가수분해물 상 Thermosacc 효모로부터의 에탄올 생성을 나타낸다.
도 8 은 실시예 2 에 기술된 세정 APB 가수분해물 상 Thermosacc 효모 발효 동안 글루코오스 축적을 나타낸다.
5. 상세한 설명
5.1 정의
본원에 사용된 바, 용어 "숙주 세포" 는 폴리펩티드의 생산을 위한 재조합 발현 벡터가 폴리펩티드의 발현을 위해 트랜스펙션될 수 있는 세포 또는 세포주를 지칭한다. 숙주 세포에는 단일 숙주 세포의 후손이 포함되고, 상기 후손은, 자연적, 우연적 또는 의도적 돌연변이화로 인해, (형태적으로 또는 전체 게놈 DNA 보체에 있어서) 원래 부모 세포와 반드시 완전히 동일하지는 않다. 숙주 세포에는 발현 벡터를 이용해 생체내 트랜스펙션 또는 형질전환된 세포가 포함된다. "숙주 세포" 는 사상 진균주, 특히 트리코데르마 종 균주의 세포 및 그로부터 제작된 원형질을 지칭한다.
세포, 핵산, 단백질 또는 벡터와 관련된 언급에서 사용되는 경우, 용어 "재조합" 은, 세포, 핵산 또는 벡터가 이종성 핵산 또는 단백질의 도입 또는 본래 핵산 또는 단백질의 변화로 인해 개질되었음을 가리키거나 또는 세포가 그렇게 개질된 세포로부터 유도되었음을 가리킨다. 따라서, 예를 들어 재조합 세포는 본래 (비-재조합) 형태의 세포에서 발견되지 않는 유전자를 발현하거나 또는 그렇지 않으면, 발현 하에 비정상적으로 발현되는 본래 유전자를 발현하거나 또는 아예 발현하지 않는다.
"사상 진균류" 는 유마이코티나 및 오마이코타 아문 (subdivision Eumycotina and Oomycota) 의 모든 섬유성 형태를 나타낸다 (Alexopoulos, C. J. (1962), Introductory Mycology, Wiley, New York 참조). 이들 진균류는 키틴, 베타-글루칸, 및 기타 복합 다당류로 이루어지는 세포벽을 갖는 영양 균사체를 특징으로 한다. 본 발명의 사상 진균류는 효모와 형태학적, 생리학적 및 유전적으로 구별된다. 사상균에 의한 영양 성장은 균사 연장에 의한 것이며, 탄소 이화 작용은 절대 호기성이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "트리코데르마" 또는 "트리코데르마 종" 은 이전에, 또는 현재 트리코데르마로 분류된 임의의 진균류 속을 나타낸다.
용어 "배양하는" 은 액체 또는 고체 배지 내 성장을 위한 적합한 조건 하에 미생물 세포 집단을 성장시키는 것을 나타낸다.
본원에서 사용된 바, 본원에서 상호교환하여 사용되는 용어 "셀룰로오스성 기질" 또는 "셀룰로오스성 물질" 은, 셀룰로오스 및/또는 헤미-셀룰로오스 포함 물질을 지칭한다. 셀룰로오스성 기질은 리그노셀룰로오스성 물질일 수 있으며, 이는 셀룰로오스, 헤미-셀룰로오스, 및 서로 및 리그닌과 교차결합된 베타 글루칸을 포함한다. 이러한 셀룰로오스성 기질은 또한 기타 물질, 예컨대 펙틴, 단백질, 전분 및 지질을 포함할 수 있으나, 전형적으로는 주 성분으로서 셀룰로오스, 헤미-셀룰로오스, 및 베타-글루칸을 포함한다.
"발효 미생물" 은 유기 물질의 생성을 위한 바람직한 발효 프로세스에서 사용되기에 적합한 임의의 미생물을 지칭한다.
본원에서 사용된 바 용어 "발효 브로쓰" 는 회수 및/또는 정제가 아예 행해지지 않거나 또는 최소로 행해진, 세포 발효에 의해 생성된 제조물을 지칭한다. 예를 들어, 발효 브로쓰는, 미생물 배양물을 포화될 때까지 성장시키고, 단백질 합성 (예, 숙주 세포에 의한 효소의 발현) 및 세포 배양 배지로의 분비가 허용되도록 탄소-제한 조건 하에서 인큐베이션되는 경우에 제조된다. 발효 브로쓰는 발효 말미에 유도된 비분획화 또는 분획화된 발효 물질 함유물을 포함할 수 있다. 전형적으로는, 발효 브로쓰는 비분획화되고, 미생물 세포 (예, 사상 진균류 세포) 가 예컨대 원심분리로 제거된 후에 존재하는 소비된 배양 배지 및 세포 부스러기를 포함한다. 일부 구현예에서, 발효 브로쓰는 소비된 세포 배양 배지, 세포외 효소 및 생 및/또는 비생 미생물 세포를 포함한다.
"에탄올발생" 이란, 탄수화물로부터 주된 발효 생성물로서 에탄올을 생성하는 미생물의 능력을 지칭한다. 일부 구현예에서, 에탄올발생 미생물이 또한 기타 유기 물질을 생성시키는데 사용될 수 있다.
"카르복시메틸셀룰로오스 단위" 또는 "CMC U" 는 50℃ 및 pH 4.8 에서 1 분 내 1 μmol 의 환원 당 (글루코오스 당량으로 표시) 을 유리시키는 엔도글루카나아제 활성의 단위를 지칭한다.
"pNP-글루코시드 단위" 또는 "pNPG U" 는 50℃ 및 pH 4.8 에서 파라-니트로페닐-B-D-글루코피라노시드로부터 니트로페놀 1 μmol 를 유리시키는 베타-글루코시다아제 활성 단위를 지칭한다.
"ABX 단위" 또는 "ABX U" 는 디니트로살리실산 (DNS) 법 (Miller, 1959, Anal Chem., 31:426-428) 을 이용하여 검정되는 바와 같이, 50 mM 시트르산-Na 시트레이트 버퍼 pH 5.3 중, 50℃ 에서 자작나무로부터의 1% 자일란 용액으로부터 1 μmol 자일로오스 환원 당 당량을 유리시키는 자일라나아제 활성 단위를 지칭한다.
5.2 세포 사멸 방법
본 발명은 배양 배지에서 세포를 사멸하여, 세포-사멸된 전체의 브로쓰를 생성시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포를 약 0.2 내지 약 1 중량% 농도의 탄소수 1 내지 5 의 제 1 유기산 및 약 0.04 내지 약 0.3 중량% 농도의 탄소수 6 이상의 제 2 유기산의 조합물과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포를 약 0.2 내지 약 0.5 중량% 농도의 탄소수 1 내지 5 의 제 1 유기산 및 약 0.2 내지 약 0.5 중량% 농도의 탄소수 6 이상의 제 2 유기산의 조합물과 접촉시키는 것을 포함한다. 기타 구현예에서, 상기 방법은 세포를 약 0.25 내지 약 0.5 중량% 농도의 탄소수 6 이상의 유기산과 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 실질적으로 완전한 (즉, 처리 후 생세포가 적어도 약 4, 5, 또는 6 log 감소) 또는 완전한 (즉, 처리 후 생세포 없음) 세포 사멸을 이루는 적합한 기간 동안 적합한 pH 와 온도에서 수행된다. pH 는 약 3.5 내지 약 4.5, 약 4 내지 약 4.4, 또는 약 3.9 내지 약 4.2 이고, 온도는 약 30℃ 내지 약 40℃ 이고, 상기 pH 및 온도에서 약 8 내지 약 24 시간 동안 상기 방법이 수행되는 것이 전형적이다. 한 구현예에서, 상기 방법은 pH 약 4 및 온도 약 40℃ 에서 약 24 시간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 세포는 융해 (lysis) 없이 사멸된다. 일부 구현예에서, 세포 일부 또는 전부는 융해된다.
5.2.1 미생물 세포
세포는 전형적으로 미생물 세포, 예를 들어 박테리아 또는 진균류 세포이고, 전형적으로 효소 또는 유기 화합물 등의 관심대상인 하나 이상의 분자를 생성한다. 일부 구현예에서, 세포는 재조합으로 발현된 하나 이상의 효소를 생성한다. 일부 구현예에서, 관심 분자는 세포외 배양 배지로 분비된다. 일부 구현예에서, 관심 분자는 세포내에서 생성되고, 세포외 배양 배지로 분비되지는 않는다. 분자가 세포내에서 생성되고 세포외로 분비되지 않는 경우, 분자를 액체 배지로 방출시키도록 사멸된 세포의 융해가 요구될 수 있다.
일부 구현예에서, 미생물 세포는 천연 발생 사상 진균류, 천연 발생 또는 유도 돌연변이가 있는 사상 진균류 및 유전자 조작되어진 사상 진균류를 비롯한 사상 진균류 세포이다.
일부 구현예에서, 진균류 세포는 아스페르길러스 , 아크레모늄 ( Acremonium ), 아우레오바시듐 ( Aureobasidium ), 뷰베리아 ( Beauveria ), 브제르칸데라 (Bjerkandera), 세팔로스포륨 ( Cephalosporium ), 세리포리옵시스 ( Ceriporiopsis ), 캐토뮴 (Chaetomium), 키리소스포륨, 클라비셉스 (Claviceps), 코치오볼러스 (Cochiobolus), 콥리누스 (Coprinus), 코리올루스 (Coriolus), 코리나스커스 (Corynascus), 크립토코커스 (Cryptococcus), 시아터스 (Cyathus), 엔도티아 (Endothia), 엔도티아, 필로바시듐 (Filobasidium), 푸사리움 (Fusarium), 질로클라듐 (Gilocladium), 휴미콜라, 마그나포르테 (Magnaporthe), 마이셀리오프토라 (Myceliophthora), 미로테시움 (Myrothecium), 무코르 (Mucor), 네오칼리마스틱스 (Neocallimastix), 뉴로스포라, 파에일로마이세스 (Paeilomyces), 페니실륨, 파네로캐에테 (Phanerochaete), 필레비아 (Phlebia), 피로마이세스 (Piromyces), 플레우로투스 (Pleurotus), 포도스포라 (Podospora), 파에실로마이세스 (Paecilomyces), 피리큘라리아 (Pyricularia), 리조무코르 (Rhizomucor), 리조푸스 (Rhizopus), 스키조필룸 (schizophylum), 스포로트리쿰 (Sporotrychum), 스타고노스포라 (Stagonospora), 탈라로마이세스 (Talaromyces), 토이폴라듐 (Toypoladium), 트리코데르마, 테르모마이세스 (Thermomyces), 테르모아스커스 (Thermoascus), 티엘라비아 (Thielavia), 톨리포클라듐 (Tolypocladium), 트리초피톤 (Trichophyton), 및 트라메테스 (Trametes) 종 또는 이들로부터 유도된 종이다. 일부 구현예에서, 진균류 세포는 아스페르길러스 아큘레아투스 (Aspergillus aculeatus), 아스페르길러스 아와모리 (Aspergillus awamori), 아스페르길러스 포에티두스 (Aspergillus foetidus), 아스페르길러스 자포니쿠스 (Aspergillus japonicus), 아스페르길러스 니둘란스 (Aspergillus nidulans), 아스페르길러스 니거 (Aspergillus niger), 아스페르길러스 푸미가투스 (Aspergillus fumigatus), 또는 아스페르길러스 오리재 (Aspergillus oryzae) 이다. 일부 구현예에서, 진균류 세포는 푸사리움 박트리디오이데스 (Fusarium bactridioides), 푸사리움 세레랄리스 (Fusarium cerealis), 푸사리움 크룩웰렌스 (Fusarium crookwellense), 푸사리움 쿨모룸 (Fusarium culmorum), 푸사리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum), 푸사리움 그라미늄 (Fusarium graminum), 푸사리움 헤테로스포룸 (Fusarium heterosporum), 푸사리움 네군디 (Fusarium negundi), 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum), 푸사리움 레티쿨라툼 (Fusarium reticulatum), 푸사리움 로세움 (Fusarium roseum), 푸사리움 삼부시눔 (Fusarium sambucinum), 푸사리움 사르코크로움 (Fusarium sarcochroum), 푸사리움 스포로트리키오이데스 (Fusarium sporotrichioides), 푸사리움 술푸레움 (Fusarium sulphureum), 푸사리움 토룰로숨 (Fusarium torulosum), 푸사리움 트리코테시오이데스 (Fusarium trichothecioides), 또는 푸사리움 베네나툼 (Fusarium venenatum) 이다. 일부 구현예에서 진균류 세포는 브제르칸데라 아두스타 (Bjerkandera adusta), 세리포리옵시스 아네이리나 (Ceriporiopsis aneirina), 세리포리옵시스 카레기에아 (Ceriporiopsis caregiea), 세리포리옵시스 길베스켄스 (Ceriporiopsis gilvescens), 세리포리옵시스 판노신타 (Ceriporiopsis pannocinta), 세르포리옵시스 리불루사 (Cerporiopsis rivulosa), 세리포리옵시스 수브라파 (Ceriporiopsis subrufa), 세리포리옵시스 수브베르미스포라 (Ceriporiopsis subvermispora), 코리올루스 히르수투스 (Coriolus hirsutus), 휴미콜라 인솔렌스 (Humicola insolens), 휴미콜라 라누기노사 (Humicola lanuginosa), 무코르 미에헤이 (Mucor miehei), 마이셀리오프토라 테르모필라 (Myceliophthora thermophila), 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa), 시탈리듐 테르모필룸 (Scytalidium thermophilum), 티엘라비아 테레스트리스 (Thielavia terrestris), 트라메테스 플레우로투스, 트라메테스 빌로사 (Trametes villosa), 트라메테스 베르시콜러 (Trametes versicolor), 캐토뮴 파에실로마이세스, 엔도티아 무코르, 페니실륨 푸르푸로게눔 (Penicillium purpurogenum), 페니실륨 푸니쿨로숨 (Penicillium funiculosum), 파네로캐에테 키리소스포륨, 필레비아 라디에이트 (Phlebia radiate), 또는 플레우로투스 에린지 (Pleurotus eryngii) 이다. 일부 구현예에서 진균류 세포는 트리코데르마 하르지아눔 (Trichoderma harzianum), 트리코데르마 코닌기 (Trichoderma koningii), 트리코데르마 롱기브라키아툼 (Trichoderma longibrachiatum), 트리코데르마 리세이, 또는 트리코데르마 비리데 (Trichoderma viride) 이다.
5.2.2 미생물 세포의 배양
미생물 세포는, 발현을 도모하는 당업계에 공지되어 있는 임의의 배양 방법에 의해 배양될 수 있다. 일반적으로, 하나 이상의 관심 분자 (예, 하나 이상의 효소 및/또는 유기 화합물) 의 생성에 적합한 조건, 예를 들어 셀룰로오스성 기질을 가수분해할 수 있는 효소 발현에 적합한 조건이 사용된다. 미생물 배양물의 발효는 셀룰라아제가 발현되게 하는 조건 및 적합한 배지 내에서 작동되는 실험실 또는 공업용 발효조에서의, 진탕 플라스크 배양, 소- 또는 대-규모 발효, 예컨대 연속식, 배치식 (batch), 유가식 (fed-batch) 또는 고체 상태 발효를 포함할 수 있다. 당업계에서 공지된 절차를 이용하여 탄소 및 질소 공급원 및 무기 염을 포함하는 적절한 영양 배지 내에서 배양이 일어난다. 적절한 배양 배지, 온도 범위, 및 효소 또는 기타 단백질 등의 생체 분자와 같은 관심 분자의 성장 및 생성에 적합한 기타 조건은 당업계에 공지되어 있다.
발효, 예컨대 사상 진균류 세포의 발효는, 탄소-함유 기질을 제한 인자로서 제어하여 세포로 탄소-함유 기질을 양호하게 전환시키고, 상당량의 비전환된 기질로 세포가 오염되는 것을 피할 수 있게 하는 방식으로 흔히 행해진다. 후자는 수용성 기질로는 문제가 되지 않는데, 그 이유는 임의의 잔존 미량은 손쉽게 세정되어 제거되기 때문이다. 그러나, 이는 불용성 기질의 경우에서는 문제가 될 수 있어, 적합한 세정 단계 등의 추가의 생성물-처리 단계가 요구될 수 있다.
발효는 미생물 세포, 예를 들어 사상 진균류 세포를 정지기 (stationary phase) 까지 성장시키고, 이 세포를 하나 이상의 관심 분자를 발현하기에 충분한 시간 동안 제한 탄소 조건 하에 유지함으로써 수행될 수 있다.
5.2.3 미생물 세포에 의해 발현된 효소
본 발명의 방법에서 사용된 미생물 세포는 비재조합체 및/또는 재조합체, 예를 들어 비재조합 및/또는 재조합 사상 진균류일 수 있다. 일부 구현예에서, 미생물 세포는 그 미생물 세포와 상동성 또는 이종성일 수 있는 하나 이상의 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 미생물 세포, 예를 들어 사상 진균류 세포는 이 세포와 상동성 또는 이종성일 수 있는 하나 이상의 유전자를 포함하는데, 이때 하나 이상의 유전자는 셀룰로오스성 기질을 분해할 수 있는 효소를 인코딩 (encode) 한다. 셀룰로오스성 물질 분해 효소를 인코딩하는 유전자는 당업자에게 공지되어 있다. 셀룰로오스성 기질을 분해하는 효소를 인코딩하는 유전자의 적절한 비제한적인 예에는 엔도글루카나아제, 셀로바이오히드롤라아제, 글루코히드롤라아제, 베타-글루코시다아제, 자일로글루카나아제, 자일라나아제, 자일로시다아제, 알파-아라비노푸라노시다아제, 알파-글루쿠로니다아제, 아세틸 자일란 에스테라아제, 만나나아제, 만노시다아제, 알파-갈락토시다아제, 만난 아세틸 에스테라아제, 갈락타나아제, 아라비나나아제, 펙테이트 리아제, 펙틴 리아제, 펙테이트 리아제, 폴리갈락투로나아제, 펙틴 아세틸 에스테라아제, 펙틴 메틸 에스테라아제, 알파-아라비노푸라노시다아제, 베타-갈락토시다아제, 갈락타나아제, 아라비나나아제, 알파-아라비노푸라노시다아제, 람노갈락투로나아제, 람노갈락투로난 리아제, 및 람노갈락투로난 아세틸 에스테라아제, 자일로갈락투로노시다아제, 자일로갈락투로나아제, 람노갈락투로난 리아제, 리그닌 페록시다아제, 망간-의존 페록시다아제, 및 락카아제가 포함된다.
본 발명의 일부 구현예에서, 재조합 미생물, 예컨대 재조합 사상 진균류 세포는 효소(들)를 과발현하여 셀룰로오스성 기질의 분해를 향상시킨다. 다르게는, 미생물 세포는 효소(들)를 과발현하여 셀룰로오스성 기질의 분해를 향상시키는 재조합 세포와 비재조합 세포의 혼합물일 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 미생물 세포, 예컨대 사상 진균류 세포는 β-글루코시다아제를 과발현한다. 다르게는, 미생물 세포는 β-글루코시다아제를 과발현하는 재조합 세포와 비재조합 세포의 혼합물일 수 있다.
용어 "베타-글루코시다아제"는, 베타-D-글루코오스의 방출로 셀로비오스의 가수분해를 촉진하는 특정 GH 패밀리 내 것 (이에 제한되지는 않지만 GH 패밀리 1, 3, 7, 9 또는 48 내의 것 포함) 및/또는 EC 3.2.1.21 로 분류된 베타-D-글루코시드 글루코히드롤라아제로서 본원에서 정의된다. 과발현된 베타-글루코시다아제는 숙주 세포의 것과 동일하거나 또는 상이한 종으로부터 유래된 것일 수 있다. 특히, 과발현된 베타-글루코시다아제는 진균류 세포에서 발현되는 진균류 베타-글루코시다아제일 필요가 없다.
일부 구현예에서, 베타-글루코시다아제는 베타-글루코시다아제를 인코딩하는 유전자를 발현시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 베타-글루코시다아제는 예를 들어 그람-양성 유기체 (예, 바실러스 (Bacillus) 및 악티노마이세테스 (Actinomycetes)) 또는 진핵 숙주 (예, 트리코데르마, 아스페르길러스, 사카로마이세스 (Saccharomyces), 및 피치아 (Pichia))에 의해 세포외 장소로 분비될 수 있다. 일부 구현예에서, 베타-글루코시다아제가 본래 수준에 비해 재조합 미생물 내에서 과발현될 수 있다는 점이 이해되어야 한다. 일부 구현예에서, 베타-글루코시다아제의 발현을 위해 숙주 세포를 이용하는 경우, 세포를 유전자 조작하여 그 세포에 내생성인 하나 이상의 단백질의 발현을 감소시킬 수 있다. 한 구현예에서, 세포는 하나 이상의 본래의 유전자, 특히 결실되었거나 또는 불활성화되어진 분비된 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 프로테아제-인코딩 유전자 (예, 아스파르틸 프로테아제-인코딩 유전자: 문헌 [Berka et al, Gene 1990 86:153-162 및 USP 6,509,171] 참조) 또는 셀룰라아제-인코딩 유전자가 결실 또는 불활성화될 수 있다. 한 구현예에서, 트리코데르마 종 숙주 세포, 예컨대 T. 리세이 숙주 세포는 PCT 출원 제 WO05/001036 호에 기술된 바와 같이 cbh1, cbh2 및 egl1, 및 egl2 유전자에서 불활성화 결실을 포함한다. 베타-글루코시다아제를 인코딩하는 핵산이 트리코데르마 종 숙주 세포의 핵 게놈에 존재할 수 있거나, 또는 트리코데르마 숙주 세포에서 복제하는 플라스미드 내에 존재할 수 있다.
사용될 수 있는 베타-글루코시다아제의 예는 하기로부터의 베타-글루코시다아제가 포함된다: 아스페르길러스 아큘레아투스 (Kawaguchi et al., 1996, Gene 173: 287-288), 아스페르길러스 카와치 (Iwashita et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 5546-5553), 아스페르길러스 오리재 (WO2002/095014), 셀룰로모나스 비아조테아 (Cellulomonas biazotea) (Wong et al., 1998, Gene 207: 79-86), 사카로마이콥시스 피불리게라 (Saccharomycopsis fibuligera) (Machida et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol. 54: 3147-3155), 스키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) (Wood et al., 2002, Nature 415: 871-880), 트리코데르마 리세이 베타-글루코시다아제 1 (US 특허 제 6,022,725 호), 트리코데르마 리세이 베타-글루코시다아제 3 (US 특허 제 6,982,159 호), 트리코데르마 리세이 베타-글루코시다아제 4 (US 특허 제 7,045,332 호), 트리코데르마 리세이 베타-글루코시다아제 5 (US 특허 제 7,005,289 호), 트리코데르마 리세이 베타-글루코시다아제 6 (USPN 20060258554), 및 트리코데르마 리세이 베타-글루코시다아제 7 (USPN 20040102619).
일부 구현예에서, 미생물 세포에 의해 세포외 분비된 관심 효소(들)은 세포외 배양 배지 및/또는 세포 사멸된 브로쓰 내에서 가용성이다. 일부 구현예에서, 미생물 세포에 의해 세포외 분비된 관심 효소(들)은 세포외 배양 배지 및/또는 세포 사멸된 브로쓰에서 불용성이다. 일부 구현예에서, 세포외 배양 배지 및/또는 세포 사멸된 브로쓰는 가용성 및 불용성의 관심 효소들의 혼합물을 포함한다.
5.2.4 유기산
본 발명의 방법은, 생세포의 양을 예를 들어 적어도 4 log, 5 log, 6 log, 7 log 또는 8 log 감소시키는 양으로 세포를 불활성화시키도록 본원에서 기술된 바와 같은 조건 및 양으로 배양 배지 내 세포를 유기산(들) 또는 이의 염(들)과 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 방법은 세포를, 약 0.1 중량% 내지 약 15 중량%, 0.2 중량% 내지 약 1 중량%, 또는 약 0.2 중량% 내지 약 0.5 중량% 농도의 탄소수 1 내지 5 의 제 1 유기산 (또는 이의 염), 및 약 0.025 내지 5 중량%, 0.04 내지 약 0.3 중량%, 또는 약 0.2 내지 약 0.5 중량% 의 탄소수 6 이상의 제 2 유기산 (또는 이의 염) 과 접촉시키는 것을 포함한다. 각종 구현예에서, 제 1 유기산은 약 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4, 0.5, 0.55, 0.6, 0.65, 0.7, 0.75, 0.8, 0.85, 0.9, 0.95, 또는 1 중량% 중 임의의 농도로, 약 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 또는 0.3, 0.35, 0.4, 0.45, 또는 0.5 중량% 중 임의의 농도로 하는 제 2 유기산과 조합되어 사용된다. 한 구현예에서, 제 1 유기산은 약 0.2 내지 약 0.5 중량%, 또는 약 0.28 중량% 의 농도의 아세트산이고, 제 2 유기산은 약 0.04 중량% 내지 약 0.06 중량%, 또는 약 0.044 중량% 농도의 벤조산이다. 한 구현예에서, 제 1 유기산은 약 0.2 중량% 내지 약 0.5 중량%, 또는 약 0.28 중량% 농도의 아세트산이고, 제 2 유기산은 약 0.2 중량% 내지 약 0.5 중량%, 또는 약 0.22 중량% 농도의 벤조산이다.
일부 구현예에서, 방법은 약 0.25 중량% 내지 약 0.5 중량% 의, 탄소수 6 이상인 유기산 (또는 그의 염) 과 세포를 접촉하는 것을 포함한다. 각종 구현예에서, 탄소수 6 이상인 유기산은 약 0.25, 0.3, 0.35, 0.4, 0.45, 또는 0.5 중량% 중 임의의 농도로 사용된다. 한 구현예에서, 탄소수 6 이상의 유기산은 약 0.5 중량% 의 농도의 벤조산이다.
일부 구현예에서 탄소수 1 내지 5 의 유기산은 아세트산, 포름산, 프로피온산 (또는 이의 염), 또는 이의 조합이다. 한 구현예에서, 탄소수 1 내지 5 의 유기산은 아세트산이다.
일부 구현예에서, 탄소수 6 이상의 유기산은 벤조산, 시클로헥산카르복실산, 4-메틸발레르산, 아디프산, 3-메틸글루타르산, 페닐아세트산 (또는 이의 염), 또는 이의 조합이다. 한 구현예에서, 탄소수 6 이상의 유기산은 벤조산 (또는 이의 염, 예컨대 나트륨 벤조에이트) 이다. 일부 구현예에서, 탄소수 6 이상의 유기산은 6 내지 8 개 (즉, 6, 7, 또는 8 개) 의 탄소 원자를 포함한다. 일부 구현예에서 탄소수 6 이상의 유기산은 1 또는 2 개의 카르복실산 관능기를 포함한다. 일부 구현예에서, 탄소수 6 이상의 유기산은 방향족 유기산이다. 일부 구현예에서, 탄소수 6 이상의 유기산은 7 또는 8 개의 탄소 및 1 개의 페닐기를 포함한다.
5.3 조성물
본 발명은 본원에서 기술된 바와 같은 세포를 사멸하는 방법에 의한 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서 조성물은 본원에서 기술된 유기산(들), 사멸된 세포 및/또는 세포 부스러기, 및 배양 배지를 포함하는 세포-사멸된 전체의 브로쓰이다. 일부 구현예에서 조성물은 본원에서 기술된 바와 같은 유기산(들)을 포함하고, 임의로는 사멸된 세포 및/또는 세포 부스러기를 추가로 포함한다. 한 구현예에서, 사멸된 세포 및/또는 세포 부스러기는 본원에서 기술된 바와 같은 세포-사멸된 전체의 브로쓰로부터 제거되어, 상기 성분들이 없는 조성물을 제공한다. 본 발명의 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물은 전형적으로 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물을 제조하는데 사용되었던 미생물 세포에 의해 생성된 관심 분자 (예, 생체 분자, 예컨대 단백질, 예컨대 효소 및/또는 유기 물질) 하나 이상을 포함한다.
이로 제한되지는 않지만, 소르비톨, 나트륨 클로라이드, 칼륨 소르베이트, 및 당업계에 공지된 그 외의 것을 비롯한 추가의 보존제 및/또는 항균제 (예, 정균제) 가 임의로는 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물에 첨가될 수 있다.
일부 구현예에서 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물에, 미생물 세포에 의해 비교적 낮은 수준으로 발현되거나 또는 내생적으로 발현되지 않은 하나 이상의 효소 활성이 보충될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 효소가 첨가되어, 셀룰로오스성 기질을 예를 들어, 발효성 당, 예컨대 글루코오스 또는 헤미-셀룰로오스 당 (예, 자일로오스, 아라비노오스, 만노오스) 으로 분해하는 것을 개선시킬 수 있다. 보충 효소(들)은 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물에 보충제로서 첨가될 수 있고, 그 효소(들)은 별개의 발효 브로쓰의 성분일 수 있거나 또는 정제될 수 있거나, 또는 최소한으로 회수 및/또는 정제될 수 있다. 적합한, 보충 효소의 비제한적인 예에는 셀로바이오히드롤라아제, 엔도글루카나아제, 베타-글루코시다아제, 엔도-베타-1,3(4)-글루카나아제, 글루코히드롤라아제, 자일로글루카나아제, 자일라나아제, 자일로시다아제, 아라비노푸라노시다아제, 알파-글루쿠로니다아제, 아세틸 자일란 에스테라아제, 만나나아제, 만노시다아제, 알파-갈락토시다아제, 만난 아세틸 에스테라아제, 갈락타나아제, 아라비나나아제, 펙테이트 리아제, 펙티나아제 리아제, 펙테이트 리아제, 폴리갈락투로나아제, 펙틴 아세틸 에스테라아제, 펙틴 메틸 에스테라아제, 베타-갈락토시다아제, 갈락타나아제, 아라비나나아제, 알파-아라비노푸라노시다아제, 람노갈락투로나아제, 페룰산 에스테라아제 람노갈락투로난 리아제, 람노갈락투로난 아세틸 에스테라아제, 자일로갈락투로노시다아제, 자일로갈락투로나아제, 람노갈락투로난 리아제, 리그닌 페록시다아제, 망간-의존 페록시다아제, 하이브리드 페록시다아제, (리그닌 페록시다아제 및 망간-의존 페록시다아제의 조합된 특성을 가짐), 글루코아밀라아제, 아밀라아제, 프로테아제, 및 락카아제가 있다.
일부 구현예에서 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물은, 하기에 제한되는 것은 아니나 하기를 포함하는 셀룰로오스분해성 효소를 포함한다: (i) 엔도글루카나아제 (EG) 또는 1,4--d-글루칸-4-글루카노히드롤라아제 (EC 3.2.1.4), (ii) 1,4--d-글루칸 셀로바이오히드롤라아제 (엑소-셀로바이오히드롤라아제, CBH) (EC 3.2.1.91) 및 1,4--d-글루칸 글루카노히드롤라아제 (또한 셀로덱스트리나아제로 공지됨) (EC 3.2.1.74) 를 포함하는 엑소글루카나아제, 및 (iii) 베타-글루코시다아제 (BG) 또는 베타-글루코시드 글루코히드롤라아제 (EC 3.2.1.21).
일부 구현예에서 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물은 엑소글루카나아제, 엔도글루카나아제, 헤미-셀룰라아제, 및 베타-글루코시다아제로부터 선택된 하나 이상의 효소를 포함한다. 한 구현예에서, 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물은 약 1000 내지 약 2000, 약 1500 내지 약 2500, 약 2200 내지 약 2800, 또는 약 2500 CMC U/g 엔도글루카나아제 활성 및 약 450 내지 약 775, 약 525 내지 약 775, 약 400 내지 약 800, 또는 약 650 pNPG U /g 베타-글루코시다아제 활성을 갖는다. 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 활성 및 파라-니트로페닐-B-D-글루코피라노시드 (pNPG) 활성은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 측정될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ghose, T. K., "Measurement of Cellulase Activities," Pure & Appl. Chem. 59, pp. 257-268, 1987); Chen, H., Hayn, M., Esterbauer, H. "Purification and characterization of two extracellular b-glucosidases from Trichoderma reesei,"Biochimica et Biophysica Acta, 1992, 1121, 54-60 참조).
일부 구현예에서 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물은, 아세트산을 약 0.2 중량% 내지 약 1 중량%, 약 0.2 중량% 내지 약 0.5 중량%, 또는 약 0.28 중량% 농도로, 및 벤조산을 약 0.2 중량% 내지 약 0.5 중량%, 또는 약 0.22 중량% 농도로, 약 3.9 내지 약 4.3, 약 3.5 내지 약 4.5, 약 4 내지 약 5, 약 4.5 내지 약 5.5, 약 4.8 내지 약 5.2, 또는 약 4 의 pH 에서 포함한다.
일부 구현예에서 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물은 발효 말미에 유도된 비분획화된 함유물의 발효 물질을 포함한다. 전형적으로, 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물은, 미생물 세포 (예, 사상 진균류 세포) 를 포화시까지 성장시키고, 단백질 합성 (예, 셀룰라아제 및/또는 글루코시다아제 효소(들) 의 발현) 이 가능하도록 탄소-제한 조건 하 인큐베이션한 후 존재하는 소비된 배양 배지 및 세포 부스러기를 포함한다. 일부 구현예에서 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물은, 소비된 세포 배양 배지, 세포외 효소 및 사멸된 사상 진균류 세포를 포함한다. 일부 구현예에서 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물에 존재하는 미생물 세포는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 투과 및/또는 용해될 수 있다.
본 발명은 또한 셀룰로오스성 물질, 본원에서 기술된 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물, 및 배양 배지 내 발효 미생물의 혼합물을 포함하는 반응성 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 반응 조성물은 실질적으로 보충 질소 공급원이 없다. 일부 구현예에서, 발효 미생물은 에탄올발생 미생물이다. 일부 구현예에서, 반응 조성물 내 유기 물질의 생성은, 약 1.4 중량% 아세트산 및 약 0.22 중량% 벤조산을 포함하는 반응성 조성물과 비교시 적어도 약 50% 증가된다. 한 구현예에서, 발효 미생물은 에탄올발생 미생물이며, 유기 물질은 에탄올이고, 반응성 조성물 내 에탄올의 생성은 약 1.4 중량% 아세트산 및 약 0.22 중량% 벤조산을 포함하는 반응성 조성물과 비교시 적어도 약 10 배 증가된다.
본원에서 기술된 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물은 전형적으로 액체이나, 불용성 성분들, 예컨대 사멸된 세포, 세포 부스러기, 배양 배지 성분 및/또는 불용성 효소(들)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 불용성 성분이 제거되어 맑은 액체 조성물을 제공할 수 있다.
5.4 셀룰로오스성 물질의 가수분해 방법
본 발명은 셀룰로오스성 물질의 가수분해 방법을 제공한다. 이 방법은, 셀룰로오스성 물질을, 본원에서 기술된 바와 같은 세포 사멸 방법으로 수득한 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물과, 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물 내 하나 이상의 효소(들)에 의해 셀룰로오스성 물질의 효소 가수분해가 이루어지기에 충분한 양으로 접촉시키는 것을 포함한다.
셀룰로오스성 기질의 적합한 비제한적인 예에는, 이로 제한되지는 않지만 하기가 포함된다: 바이오매스, 초본 물질, 농예 잔류물, 삼림 잔류물, 도시 고형 폐기물, 폐지, 및 펄프 및 페이퍼 잔류물. 본 발명에서 사용되기 위한 셀룰로오스성 기질의 통상의 형태에는, 이에 제한되는 것은 아니나 나무, 관목 및 풀, 밀, 밀짚, 사탕수수 바가스 (bagasse), 옥수수, 옥수수 껍질, 알의 섬유를 포함한 옥수수 알, 옥수수 등의 곡물의 제분 생성물 및 부산물 및 도시 고형 폐기물, 폐지 및 정원 쓰레기가 포함된다. 셀룰로오스성 기질은 "자연 그대로의 바이오매스 (예컨대, 나무, 관목, 풀, 열매, 꽃, 초본작물, 경질 및 연질 목재) , "자연 그대로가 아닌 바이오매스 (예컨대, 농예 부산물, 상업용 유기 폐기물, 건축 및 폭파 잔해, 도시 고형 폐기물 및 정원 쓰레기), 또는 자연 그대로의 바이오매스와 자연그대로가 아닌 바이오매스의 혼합물인 "배합 바이오매스"로부터 수득될 수 있다.
일부 구현예에서 셀룰로오스성 기질은 목재, 목재 펄프, 제지 폐기물, 종이 펄프 쓰레기, 입자 보드, 옥수수 여물, 옥수수 섬유, 쌀, 페이퍼 및 펄프 프로세싱 폐기물, 목재 또는 초본 식물, 열매 펄프, 식물성 펄프, 속돌, 증류기 그레인, 풀, 왕겨, 사탕수수 바가스, 코튼, 황마, 대마, 아마, 대나무, 사이잘, 마닐라삼, 짚, 옥수수 속대, 증류기 그레인, 잎, 밀짚, 코코넛 털, 조류 (algae), 지팽이풀 (switchgrass), 및 이의 혼합물을 포함한다.
셀룰로오스 기질은 그대로 사용될 수 있거나, 또는 당업계에 공지된 통상의 방법을 이용한 예비처리에 적용될 수 있다. 이러한 예비처리에는 화학적, 물리적 및 생물학적 예비처리가 포함된다. 예를 들어, 물리적 예비처리 기술에는, 제한하지 않고 각종 종류의 제분, 분쇄, 스티밍/스팀 폭발, 조사 및 수소화 열분해가 포함될 수 있다. 화학적 예비처리 기술에는 제한 하지 않고 희석산, 알칼리, 유기 용매, 암모니아, 이산화황, 이산화탄소, 및 pH-제어 수소화열분해가 포함될 수 있다. 생물학적 예비처리 기술에는 제한하지 않고, 리그닌-가용화 미생물을 적용하는 것이 포함될 수 있다.
5.5 미생물 내 유기 물질의 생성 방법
본 발명은 미생물, 예컨대 발효 미생물 내 유기 물질의 생성 방법을 제공한다. 이 방법은 가수분해된 셀룰로오스성 물질을 상기에 기재된 바와 같은 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물로 제조하고, 가수분해된 셀룰로오스성 물질의 존재 하에서 발효 미생물을, 이 발효 미생물이 하나 이상의 관심 유기 물질(들)을 생성하는데 적합한 조건 하 성장시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 발효 미생물은 에탄올발생 미생물이고, 상기 방법이 사용되어 에탄올을 생성시킨다. 일부 구현예에서 예비처리된 셀룰로오스성 물질이 사용된다.
셀룰로오스성 물질의 가수분해 및 유기 물질을 생성하는 발효 미생물의 발효가 동시 또는 순차적으로 발생할 수 있다.
일부 구현예에서 본원에서 기술된 바와 같은 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물을 사용하면, 발효 미생물이 성장되는 셀룰로오스성 물질을 약 1.4 중량% 아세트산 및 약 0.22 중량% 벤조산을 포함하는 조성물로 가수분해하는 방법과 비교시, 유기 물질 생성을 적어도 약 50% 증가시킨다. 일부 구현예에서, 유기 물질 (예, 에탄올 또는 또 다른 유기 분자) 의 생성은, 발효 미생물이 성장되는 셀룰로오스성 물질을 약 1.4 중량% 아세트산 및 약 0.22 중량% 벤조산을 포함하는 조성물로 가수분해하는 방법과 비교시, 적어도 약 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 배 증가된다.
적합한 발효 미생물은 당, 예컨대 글루코오스, 자일로오스, 갈락토오스, 아라비노오스, 만노오스, 또는 올리고당을 원하는 발효 생성물 또는 생성물들로 발효 또는 전환시킬 수 있다. 발효 미생물의 적합한 비제한적인 예에는, 진균류 유기체, 예컨대 효모 및 박테리아가 포함된다.
일부 구현예에서, 발효 미생물은 에탄올발생 미생물, 예컨대 천연 발생 에탄올발생 유기체, 천연 발생 또는 유도된 돌연변이를 갖는 에탄올발생 유기체, 또는 유전자 조작되어진 에탄올발생 유기체이다.
일부 구현예에서, 에탄올발생 미생물은, 효율적으로 글루코오스를 에탄올로 발효시킬 수 있는 효모 세포, 예컨대 사카로마이세스 세레비시애 (cerevisiae), S. 우바룸 ( uvarum ), 클루이베로마이세스 파길리스 ( Kluyveromyces fagilis ), 칸디다 슈도트로피칼리스 ( candida pseudotropicalis ), 및 파치솔렌 탄노필 루스 ( Pachysolen tannophilus) 이다. 적합한 균주에는, 이로 제한되는 것은 아니지만, S. 세레비시애 D5A (ATCC200062), S. 세레비시애 Y567 (ATCC24858), ACA 174 (ATCC 60868), MY91 (ATCC 201301), MY138 (ATCC 201302), C5 (ATCC 201298), ET7 (ATCC 201299), LA6 (ATCC 201300), OSB21 (ATCC 201303), F23 (S. 글로보서스 (S.globosus) ATCC 90920), ACA 174 (ATCC 60868), A54 (ATCC 90921), NRCC 202036 (ATCC 46534), ATCC 24858, ATCC 24858, G 3706 (ATCC 42594), NRRL, Y-265 (ATCC 60593), Sa28 (ATCC 26603), 및 ATCC 24845-ATCC 24860 가 포함된다. 본 발명에서 사용되기에 적합한 기타 비(非)세레비시애 효소 균주에는, 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) (tozony ID 4922), S. 파스토리아누스 (S. pastorianus) SA 23 (S. 칼스베르겐시스 (S. carlsbergensis) ATCC 26602), S. 파스토리아누스 (S. 칼스베르겐시스 ATCC 2345), 칸디다 악시도테르모필룸 (Candida acidothermophilum ; 이사트첸키아 오리엔탈리스 (Issatchenkia orientalis), ATCC 20381) 가 포함된다. 일부 구현예에서, 에탄올발생 미생물은 재조합 효모 균주이다. 적합한 재조합 효모는 자일로오스 리덕타아제, 자일리톨 데히드로게나아제 및/또는 자일루로키나아제를 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다 (예를 들어, USPN 5,789,210 참조).
일부 구현예에서, 에탄올발생 미생물은 박테리아 세포, 예를 들어, 그람-음성, 통성 혐기성 박테리아 세포, 예컨대 엔테로박테리아세애 ( Enterobacteriaceae ) 과의 박테리아 세포이다. 일부 구현예에서, 에탄올발생 미생물은 속 에스케리치아 (Escherichia) 또는 클렙시엘라 ( Klebsiella ) 의 것, 예를 들어, E. coli B, E. coli DH5α, E. coli KO4 (ATCC 55123), E. coli KO11 (ATCC 55124), E. coli KO12 (ATCC 55125), E. coli LY01, K. oxytoca M5A1, 또는 K. oxytoca P2 (ATCC 55307) 이다. 일부 구현예에서, 에탄올발생 미생물은 지모모나스 (Zymomonas ) 종이거나 또는 지모모나스 모빌리스 ( Zymomonas mobilis ; ATCC31821) 로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 재조합 지모모나스 균주는 예를 들어, 자일로오스 이소머라아제, 자일루로키나아제, 트랜스알도라아제 및 트랜스케톨라아제를 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다.
셀룰로오스성 물질을 글루코오스 및 기타 소형의 당류로 가수분해하는 것은 중요한 단계이며, 동시 당화 발효 (SSF) 는 이들 당을 에탄올로 변환시키는 에탄올발생 미생물의 생 배양물에 좌우된다.
발효 미생물을 가수분해물에 첨가하고, 발효를 30-80 시간과 같이 12-96 시간 동안 진행되게 하는 것이 통상적이다. 온도는 전형적으로 26-40℃, 예를 들어, 약 32℃ 이고, pH 는 전형적으로 3-6 이다.
발효 후, 관심 유기 물질을 당업계에 공지되어 있는 임의의 방법으로 회수한다. 이러한 방법에는, 이에 제한되는 것은 아니지만 증류, 추출, 크로마토그래피, 전기영동 절차 및 분별 용해가 포함된다. 예를 들어, 에탄올 발효에서, 알코올은 증류라는 통상적인 방법에 의해 분리 및 정제될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 수득된 에탄올은 연료 에탄올, 음료 에탄올 또는 산업용 에탄올로서 사용될 수 있다.
본 발명의 이론에 구애받지 않으면, 혼탁의 세포-사멸된 전체의 브로쓰는 에탄올발생 미생물에 잔류 영양분을 제공하는 것으로 여겨진다. 이는 에탄올 발효를 더 신속하게 도모할 수 있고 에탄올 수율을 증진시킬 수 있다. 당화 셀룰로오스에 부가하여, 에탄올 미생물에 보충 영양분의 함량을 감소시키거나 또는 영양분 브로쓰를 제공해야할 필요성을 제거하는 능력으로, 에탄올 발효 공정에서의 원료 비용이 감소된다.
일부 구현예에서, 발효 미생물에서의 유기 물질의 생성 방법에서, 본원에서 기술된 바와 같은 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물을 이용하는 것은 발효 미생물을 위한 보충의 질소 공급원의 양 및/또는 종류를 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 발효 미생물의 성장에 요구되는 효모 추출물, 펩톤 및/또는 우레아의 양을 감소시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에서 기술된 바와 같은 발효 미생물에서의 유기 물질의 생성 방법은 발효 미생물을 위한 보충의 질소 및/또는 영양 공급원이 부재이거나 또는 실질적으로 없다. 일부 구현예에서, 본 방법 및 조성물은 효모 추출물, 펩톤, 및/또는 우레아가 부재이거나 또는 실질적으로 없다. 본 발명의 방법 및 조성물은 보충 질소 공급원이 부재이거나 또는 실질적으로 없을 수 있으나, 미량의 질소 및/또는 영양 공급원이 불순물로서 존재할 수 있거나, 발효 미생물에 전체 발효 브로쓰의 영양치를 실질적으로 증가시키지 않을 양으로 첨가될 수 있음이 당업자에게는 자명하다.
한 구현예에서, 본 발명은 동시 당화 발효에 의한 유기 물질의 생성 방법을 제공한다. 이 방법은 보충 질소 공급원의 부재하에서, 셀룰로오스성 물질 (예, 예비처리된 셀룰로오스성 물질), 셀룰로오스성 물질을 가수분해할 수 있는 하나 이상의 효소(들) (예, 엑소글루카나아제, 엔도글루카나아제, 헤미-셀룰라아제, 및/또는 베타-글루코시다아제) 를 포함하는 본원에서 기술된 바와 같은 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물, 및 발효 미생물을 조합하는 것을 포함한다. 셀룰로오스성 물질, 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물, 및 발효 미생물은 셀룰로오스의 글루코오스 및/또는 헤미-셀룰로오스 당 (예, 자일로오스, 아라비노오스, 및/또는 만노오스) 으로의 가수분해와 글루코오스 및/또는 헤미-셀룰로오스 당의 유기 물질로의 전환 모두에 도움이 되는 조건 하에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유기 물질의 생성은 약 1.4 중량% 아세트산 및 약 0.22 중량% 벤조산을 포함하는 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물이 사용되는 방법과 비교시, 적어도 약 50% 증가된다. 한 구현예에서, 발효 미생물은 에탄올발생 미생물이고, 유기 물질은 에탄올이며, 에탄올의 생성은, 약 1.4 중량% 아세트산 및 약 0.22 중량% 벤조산이 포함된 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물이 사용되는 방법과 비교시 적어도 약 10 배 증가된다. 한 구현예에서, 약 1000 내지 약 2000, 약 1500 내지 약 2500, 약 2200 내지 약 2800, 또는 약 2500 CMC U/g 엔도글루카나아제 활성 및 약 450 내지 약 775, 약 525 내지 약 775, 약 400 내지 약 800, 또는 약 650 pNPG U/g 베타-글루코시다아제 활성, 약 0.2 중량% 내지 약 1 중량%, 약 0.2 중량% 내지 약 0.5 중량%, 또는 약 0.28 중량% 아세트산, 약 0.2 중량% 내지 약 0.5 중량%, 또는 약 0.22 중량% 벤조산 (또는 약 0.26% 나트륨 벤조에이트) 을 갖는 세포-사멸된 전체의 브로쓰가, 약 3.9 내지 약 4.3, 약 3.5 내지 약 4.5, 약 4 내지 약 5, 약 4.5 내지 약 5.5, 약 4.8 내지 약 4.2, 또는 약 4 의 pH 에서 사용된다.
5.6 키트
본 발명은 또한 키트도 제공한다. 본 발명의 키트는 본원에서 기술된 바와 같은 유기산의 조합물을 포함하는 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물을 포함한다. 적합한 포장재가 제공된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "포장재"란, 본원에서 기술된 바와 같은 키트의 성분들을 고정된 허용치 내에서 수용할 수 있고 시스템 내에서 통상 사용되는 고형의 매트릭스, 물질 또는 용기를 지칭한다.
키트는 또한 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물의 사용 지침을 포함할 수 있다. 예를 들어, 지침은 셀룰로오스성 기질의 가수분해 방법에서 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물의 사용 또는 본원에서 기술된 바와 같은 발효 미생물 내 유기 물질의 생성 방법에서의 사용에 관해 제공될 수 있다. 지침은 인쇄된 형태, 또는 플로피 디스크, CD 또는 DVD 와 같은 전자 매체의 형태, 또는 상기 지침을 수득할 수 있는 웹사이트 주소 형태로 제공될 수 있다.
5.7 특정 구현예
한 측면에서, 본 발명은 발효 배양물 내 세포를 사멸하는 방법을 제공한다. 이 방법은 배양 배지에서 세포를 포함하는 발효 배양물을, 탄소수 1 내지 5 의 제 1 유기산 또는 이의 염 및 탄소수 6 이상의 제 2 유기산 또는 이의 염과 접촉시키는 것을 포함한다. 한 구현예에서, 제 1 유기산의 농도는 약 0.2 중량% 내지 약 1 중량% 이고, 제 2 유기산의 농도는 약 0.04 중량% 내지 약 0.3 중량% 이다. 한 구현예에서, 제 1 유기산의 농도는 약 0.2 중량% 내지 약 0.5 중량% 이고, 제 2 유기산의 농도는 약 0.2 중량% 내지 약 0.5 중량% 이다. 이 방법은 실질적으로 완전히 세포를 사멸시켜 세포-사멸된 전체의 브로쓰를 제조하기에 충분한 온도 및 pH 에서 일정 기간 동안 진행된다. 일부 구현예에서, 상기 기간은 약 8 내지 약 24 시간이고, 온도는 약 30℃ 내지 약 40℃ 이고, pH 는 약 3.5 내지 약 4.5, 약 3.9 내지 약 4.2, 또는 약 4 내지 약 4.4 이다. 한 구현예에서, 상기 기간은 약 24 시간이고, 온도는 약 40℃ 이고, pH 는 약 4 이다. 실질적으로 완전한 세포 사멸은 전형적으로 생세포가 적어도 약 4 log, 5 log, 6 log, 7 log, 또는 8 log 감소됨을 포함한다.
세포 사멸 방법의 일부 구현예에서, 세포는 미생물 세포 (즉, 진균류 또는 박테리아) 이다. 일부 구현예에서, 세포는 진균류 세포, 예를 들어, 사상 진균류 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 트리코데르마, 아스페르길러스 , 페니실륨, 휴미콜 라, 키리소스포륨, 및 뉴로스포라로부터 선택된다.
세포를 사멸하는 방법의 일부 구현예에서, 제 1 유기산은 아세트산, 포름산, 또는 프로피온산으로부터 선택된다. 한 구현예에서, 제 1 유기산은 아세트산이다. 일부 구현예에서, 제 2 유기산은 벤조산, 시클로헥산카르복실산, 4-메틸발레르산, 및 페닐아세트산으로부터 선택된다. 한 구현예에서, 제 2 유기산은 벤조산이다. 일부 구현예에서 유기산의 염, 예를 들어, 나트륨 벤조에이트가 사용된다. 한 구현예에서, 제 1 유기산은 약 0.28 중량% 농도의 아세트산이고, 제 2 유기산은 약 0.044 중량% 농도의 벤조산 (또는 약 0.052 중량% 농도의 나트륨 벤조에이트) 이다. 한 구현예에서, 제 1 유기산은 약 0.28 중량% 농도의 아세트산이고, 제 2 유기산은 약 0.22 중량% 농도의 벤조산 (또는 약 0.26 중량% 농도의 나트륨 벤조에이트) 이다.
세포 사멸 방법의 일부 구현예에서, 세포는 세포밖 배양 배지로 관심 효소 적어도 하나를 분비시킨다. 일부 구현예에서, 관심 효소는 재조합적으로 발현된다. 일부 구현예에서, 세포는 엑소글루카나아제, 엔도글루카나아제, 헤미-셀룰라아제, 및 베타-글루코시다아제로부터 선택되는 관심 효소 적어도 하나를 분비시킨다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에서 기술된 세포를 사멸하는 방법 중 임의의 방법에 의해 생성된 세포-사멸된 전체의 브로쓰를 제공한다. 한 구현예에서, 세포-사멸된 전체의 브로쓰는, 세포를 사멸하기 전 세포에 의해 세포밖 배양 배지로 분비된 하나 이상의 효소를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포-사멸된 전체의 브로쓰는 세포밖 배양 배지에 엑소글루카나아제, 엔도글루카나아제, 헤미-셀룰라아제, 및 베타-글루코시다아제로부터 선택된 하나 이상의 효소를 포함한다. 일부 구현예에서 세포-사멸된 전체의 브로쓰는 약 1000 내지 약 2000, 약 1500 내지 약 2500, 약 2200 내지 약 2800, 또는 약 2500 CMC U/g 엔도글루카나아제 활성 및 약 450 내지 약 775, 약 525 내지 약 775, 약 400 내지 약 800, 또는 약 650 pNPG U/g 베타-글루코시다아제 활성을 갖는다. 한 구현예에서, 조성물은 약 2200 내지 약 2800 CMC U/g 엔도글루카나아제 활성 및 약 450 내지 약 775 pNPG U/g 베타-글루코시다아제 활성을 약 3.9 내지 약 4.3의 pH 에서 갖는다.
일부 구현예에서, 발효 미생물에 의한 유기 물질의 생성은, 약 1.4 중량% 아세트산 및 약 0.22 중량% 벤조산을 포함하는 세포-사멸된 전체의 브로쓰가 사용되는 방법과 비교시, 세포-사멸된 전체 브로쓰의 존재 하에서 적어도 약 50% 증가된다. 한 구현예에서, 발효 미생물은 에탄올발생 미생물이다. 한 구현예에서, 발효 에탄올발생 유기체에 의한 에탄올 생성은, 약 1.4 중량% 아세트산 및 약 0.22 중량% 벤조산을 포함하는 세포-사멸된 전체의 브로쓰가 사용되는 방법과 비교시, 적어도 약 10 배 증가된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 탄소수 1 내지 5 의 제 1 유기산 또는 이의 염 및 탄소수 6 이상의 제 2 유기산 또는 이의 염 및 관심 효소를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물은 또한 사멸된 세포 및 배양 배지를 포함하는데, 이때 세포는 배양 배지에서 성장하였고, 제 1 유기산 및 제 2 유기산과의 접촉 이전에 관심 효소를 생성하였다. 한 구현예에서, 제 1 유기산은 약 0.2 중량% 내지 약 1 중량% 의 농도로 조성물 내에 존재하고, 제 2 유기산은 약 0.04 중량% 내지 약 0.3 중량% 의 농도로 존재한다. 한 구현예에서, 제 1 유기산은 약 0.2 중량% 내지 약 0.5 중량% 의 농도로 조성물 내에 존재하고, 제 2 유기산은 약 0.2 중량% 내지 약 0.5 중량% 의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, 제 1 유기산은 아세트산, 포름산, 또는 프로피온산으로부터 선택된다. 한 구현예에서, 제 1 유기산은 아세트산이다. 일부 구현예에서, 제 2 유기산은 벤조산, 시클로헥산카르복실산, 4-메틸발레르산, 및 페닐아세트산으로부터 선택된다. 한 구현예에서, 제 2 유기산은 벤조산이다. 일부 구현예에서 유기산의 염, 예를 들어, 나트륨 벤조에이트가 사용된다. 한 구현예에서, 제 1 유기산은 약 0.28중량% 농도의 아세트산이고, 제 2 유기산은 약 0.044 중량% 농도의 벤조산 (또는 약 0.052 중량% 농도의 나트륨 벤조에이트) 이다. 한 구현예에서, 제 1 유기산은 약 0.28 중량% 농도의 아세트산이고, 제 2 유기산은 약 0.22 중량% 농도의 벤조산 (또는 약 0.26 중량% 농도의 나트륨 벤조에이트)이다. 일부 구현예에서, 조성물은 엑소글루카나아제, 엔도글루카나아제, 헤미-셀룰라아제, 및 베타-글루코시다아제로부터 선택된 하나 이상의 효소를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 약 1000 내지 약 2000, 약 1500 내지 약 2500, 약 2200 내지 약 2800, 또는 약 2500 CMC U/g 엔도글루카나아제 활성 및 약 450 내지 약 775, 약 525 내지 약 775, 약 400 내지 약 800, 또는 약 650 pNPG U/g 베타-글루코시다아제 활성을 갖는다. 일부 구현예에서 pH 는 약 3.9 내지 약 4.3, 약 3.5 내지 약 4.5, 약 4 내지 약 5, 약 4.5 내지 약 5.5, 약 4.8 내지 약 5.2, 또는 약 4 이다. 한 구현예에서, 조성물은 약 2200 내지 약 2800 CMC U/g 엔도글루카나아제 활성 및 약 450 내지 약 775 pNPG U/g 베타-글루코시다아제 활성을 약 3.9 내지 약 4.3 의 pH 에서 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 셀룰로오스성 물질을, 본원에서 기재된 바와 같은 세포 사멸 방법에 의해 생성된 세포-사멸된 전체의 브로쓰, 또는 탄소수 1 내지 5 의 제 1 유기산 또는 이의 염, 탄소수 6 이상의 제 2 유기산 또는 이의 염 및 본원에서 기재된 바와 같은 관심 효소 적어도 하나를 포함하는 조성물과, 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물 내 하나 이상의 효소에 의한 셀룰로오스성 물질의 효소 가수분해를 야기하기에 유효한 양으로 접촉시키는 것을 포함하는, 셀룰로오스성 물질의 가수분해 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 배양 배지 및 사멸된 세포를 추가로 포함하는 조성물이 사용되는데, 이때 세포는 배양 배지에서 성장되었고, 제 1 유기산과 제 2 유기산과의 접촉 이전에 관심 효소를 생성하였다. 일부 구현예에서, 셀룰로오스성 물질은 식물 바이오매스 물질이다. 한 구현예에서, 셀룰로오스성 물질은 리그노셀룰로오스성 물질이다. 일부 구현예에서, 셀룰로오스성 물질은 예비처리되어 효소 가수분해를 강화시킨다. 본 발명은 또한 본원에서 기술된 바와 같은 세포 사멸 방법에 의해 생성된 세포-사멸된 전체의 브로쓰, 또는 탄소수 1 내지 5 의 제 1 유기산 또는 이의 염, 탄소수 6 이상의 제 2 유기산 또는 이의 염, 관심 효소 적어도 하나 및 임의로는 발효 배양 배지 및 사멸된 세포를 포함하는 본원에서 기술된 바와 같은 조성물을 이용한 가수분해에 의해 생성된 가수분해된 셀룰로오스성 물질을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 유기 물질의 생성 방법을 제공한다. 이 방법은 미생물이 유기 물질을 생성하기에 적합한 조건 하에서, 본원에서 기술된 바와 같은 세포 사멸 방법에 의해 생성된 세포-사멸된 전체의 브로쓰, 또는 탄소수 1 내지 5 의 제 1 유기산 또는 이의 염, 탄소수 6 이상의 제 2 유기산 또는 이의 염, 관심 효소 적어도 하나 및 임의로는 발효 배양 배지 및 사멸된 세포를 포함하는 본원에서 기술된 바와 같은 조성물을 이용한 가수분해에 의해 생성된 가수분해된 셀룰로오스성 물질의 존재 하, 배양 배지에서 유기 물질을 생성하는 발효 미생물을 포함한다. 한 구현예에서, 미생물은 에탄올발생 미생물이고, 유기 물질은 에탄올이다. 한 구현예에서, 배양 배지 내 유기 물질의 농도는, 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물이 약 1.4 중량% 아세트산 및 약 0.22 중량% 벤조산을 포함하는 것을 제외하고, 방법에서 사용된 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물과 유사하거나, 실질적으로 동일하거나 또는 동일한 성분을 포함하는 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물로 셀룰로오스성 물질을 가수분해하는 방법과 비교시, 적어도 약 50% 증가된다. 한 구현예에서, 발효 에탄올발생 유기체에 의한 에탄올 생성은 약 1.4 중량% 아세트산 및 약 0.22 중량% 벤조산을 포함하는 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물이 사용된 방법과 비교시, 적어도 약 10 배 증가된다.
일부 구현예에서, 셀룰로오스성 물질의 효소 가수분해 및 미생물의 발효가 동시에 일어난다. 기타 구현예에서, 셀룰로오스성 물질의 효소 가수분해는 미생물의 발효 전에 발생된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 동시 당화 발효에 의한 유기 물질 생성 방법을 제공한다. 이 방법은 (a) 보충 질소 공급원의 부재하에서, 셀룰로오스성 기질, 본원에서 기술된 바와 같은 세포 사멸 방법으로 생성된 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 탄소수 1 내지 5 의 제 1 유기산 또는 이의 염, 탄소수 6 이상의 제 2 유기산 또는 이의 염, 관심 효소 하나 이상 및 임의로는 발효 배양 배지 및 사멸된 세포를 포함하는 본원에서 기술된 바와 같은 조성물 및 발효 미생물을 조합함; 및 셀룰로오스성 기질, 세포-사멸된 전체의 발효 브로쓰 또는 조성물 및 발효 미생물을 배양 배지에서 셀룰로오스의 글루코오스 및/또는 헤미-셀룰로오스 당 (예, 자일로오스, 아라비노오스, 및/또는 만노오스) 으로의 가수분해 및 글루코오스 및/또는 헤미-셀룰로오스의 유기 물질로의 전환에 도움이되는 조건 하에서 인큐베이션함을 포함하는데, 이때 배양 배지 내 유기 물질의 농도는, 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물이 약 1.4 중량% 아세트산 및 약 0.22 중량% 벤조산을 포함하는 것을 제외하고 방법에서 사용된 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물과 유사하거나, 실질적으로 동일하거나, 또는 동일한 성분을 포함하는 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물로 셀룰로오스성 물질이 가수분해되는 방법과 비교시, 적어도 약 50% 증가된다. 한 구현예에서, 발효 미생물은 에탄올발생 미생물이고, 유기 물질은 에탄올이다. 한 구현예에서, 발효 에탄올발생 유기체에 의한 에탄올의 생성은 약 1.4 중량% 아세트산 및 약 0.22 중량% 벤조산을 포함하는 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물이 사용된 방법과 비교시 적어도 약 10 배 증가된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 유기 물질의 생성을 위한 반응성 조성물을 제공한다. 반응성 조성물은, 셀룰로오스성 기질, 본원에 기재된 바와 같은 세포 사멸 방법에 의해 생성된 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 탄소수 1 내지 5 의 제 1 유기산 또는 이의 염, 탄소수 6 이상의 제 2 유기산 또는 이의 염, 적어도 하나의 관심 효소 및 임의로는 발효 배양 배지 및 사멸된 세포를 포함하는 본원에서 기재된 바와 같은 조성물 및 배양 배지 내 발효 미생물의 혼합물을 포함한다. 반응성 조성물은 실질적으로 보충 질소 공급원이 없고, 배양 배지 내 유기 물질의 농도는, 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물이 약 1.4 중량% 아세트산 및 약 0.22 중량% 벤조산을 포함하는 것을 제외하고 방법에서 사용된 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물과 유사하거나, 실질적으로 동일하거나 또는 동일한 성분을 포함하는 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물로 셀룰로오스성 물질이 가수분해되는 방법과 비교시, 적어도 약 50% 증가된다. 한 구현예에서, 발효 미생물은 에탄올발생 미생물이고 유기 물질은 에탄올이다. 한 구현예에서, 발효 에탄올발생 유기체에 의한 에탄올의 생성은 약 1.4 중량% 아세트산 및 약 0.22 중량% 벤조산을 갖는 조성물 또는 세포-사멸된 전체의 브로쓰를 포함하는 조성물과 비교시 적어도 약 10 배 증가된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 포장재 내에, 본원에서 기재된 바와 같은 세포 사멸 방법에 의해 생성된 세포-사멸된 전체의 브로쓰, 또는 탄소수 1 내지 5 의 제 1 유기산 또는 이의 염, 탄소수 6 이상의 제 2 유기산 또는 이의 염, 적어도 하나의 관심 효소, 임의로는 발효 배양 배지 및 사멸된 세포를 포함하는 본원에서 기술된 바와 같은 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 키트는 발효 미생물을 이용한 유기 물질의 생성 방법에서의 사용 지침, 예를 들어 키트 내 세포-사멸된 전체의 브로쓰 또는 조성물로 가수분해된 셀룰로오스성 기질 또는 에탄올발생 미생물을 이용한 에탄올 생성 방법에서의 사용 지침을 추가로 포함한다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 이로 제한되지는 않는다.
6. 실시예
실시예 1
세포 사멸 조건
진균류 세포수의 측정
트리코데르마 리세이의 150 시간 발효로부터 수득한 분취물을 멸균수로 103 의 희석 배수로 계단 희석하였다. 이어서, 희석액 100㎕ 샘플을, Difco™ (REF#213200) 사에서 구입한 감자 포도당 한천 (potato dextrose agar; PDA) 에 도말플레이팅하고 25℃ 에서 인큐베이션하였다. 이어서, 인큐베이션된 PDA 플레이트를 인큐베이션 후 3 일 후에 콜로니형성단위 (CFU) 에 대해 카운팅하였다. CFU 는 한천 상에 존재하는 성장 세포의 분리된 개별 무리로서 특징지어지고, 한천 상에 존재하는 이들 CFU 의 개수 ×플레이팅된 희석률이 원래 샘플 내에 존재하는 CFU 의 개수이다.
아스페르길러스 니거 및 페니실륨 푸니쿨로숨의 별개의 포자 현탁액을 Difco™(REF#213200) 사에서 구입한 PDA 상에서 도말 플레이팅하고, 25℃ 에서 3 일 동안 인큐베이션하였다. 이어서, A. 니거 및 P. 푸니쿨로숨 콜로니를 포함하는 분리된 섹션의 PDA 를 무균상 제거하고, 5 g/L 효모 추출물과 20 g/L 글루코오스로 이루어진 효모 추출물 글루코오스 (yeast extract glucose; YEG) 를 포함하는 분리 진탕 플라스크에 넣었다. 이어서, 진탕 플라스크를 200 rpm 및 33℃ 로 세팅된 회전식 진탕기 상에서 3 일 동안 인큐베이션하였다. 성장 배양물의 샘플을 꺼내어, 멸균수로 104 의 희석배수로 계단 희석하였다. 이후, 희석액 100㎕ 샘플을 PDA 상에 도말 플레이팅하고, 25℃ 에서 인큐베이션하였다. 이어서, 인큐베이션된 PDA 플레이트를 CFU 에 대하여 카운팅하였다.
상이한 온도에서 아세트산 및 나트륨 벤조에이트를 이용한 T. 리세이 세포 사멸
트리코데르마 리세이 발효 브로쓰를 하기 표 1 에 기술된 바와 같이 5 가지의 분취물로 분리하고 제형화하였다. 이어서, 제형화된 브로쓰의 pH 를 10% (w/w) 황산을 이용하여 4.0 으로 조절하였다. 이어서, 각 제형물을 3 가지의 분취물로 추가로 나누어, 그 중 한 분취물은 10℃ 에서 인큐베이션하고, 또 다른 한 분취물은 25℃ 에서 인큐베이션하고, 나머지 한 분취물은 40℃ 에서 인큐베이션하였다. 24 시간의 인큐베이션 후, 분취물 모두를 10% (w/w) 수산화나트륨을 이용하여 pH 를 4.8 로 조절하였다. 이후, 각 분취물을 멸균수로 계단 희석하고, PDA 상에 도말 플레이팅하고, 25℃ 에서 인큐베이션하였다. 이어서, 인큐베이션된 PDA 플레이트를 CFU 에 대해서 카운팅하였다.
T. 리세이 발효 브로쓰의 제형 기재사항
분취물 # 제형물
1 11.2 g/L 아세트산, 2.06 g/L 나트륨 벤조에이트
2 8.4 g/L 아세트산, 1.55 g/L 나트륨 벤조에이트
3 5.6 g/L 아세트산, 1.03 g/L 나트륨 벤조에이트
4 2.8 g/L 아세트산, 0.52 g/L 나트륨 벤조에이트
5 20 g/L 아세트산
모든 제형물에 있어서, 40℃ 의 온도에서는 완전한 세포 사멸이 달성되었다. T. 리세이 세포 사멸은 저온에서 달성될 수 있으나, 고농도의 유기산을 요구한다. 도 1 은 T. 리세이 세포 사멸에 대한 온도와 제형물의 화학적 농도의 효과를 나타내는 그래프이다.
나트륨 벤조에이트의 효과
나트륨 벤조에이트를 분리된 T. 리세이 분취물에 최종 농도 2.5 g/L 나트륨 벤조에이트 또는 5 g/L 나트륨 벤조에이트가 되게 첨가하였다. 이어서, 분취물을 pH 4 로 조절하였고, 24 시간 동안 40℃ 에서 인큐베이션하였다. 24 시간의 인큐베이션 후, 모든 분취물의 pH 를 10% (w/w) 수산화나트륨을 이용하여 4.8 로 조절하였다. 이어서, 각각의 분취물을 멸균수를 이용하여 계단 희석하고, PDA 상에 도말 플레이팅한 다음, 25℃ 에서 인큐베이션하였다. 이어서, 인큐베이션된 PDA 플레이트를 CFU 에 대해 카운팅하였다. 그 결과를 도 2 에 나타낸다.
2.5 g/L 나트륨 벤조에이트, pH 4 로 제형된 T. 리세이 제형물은 24 시간의 40℃ 인큐베이션 후에 생세포가 5 log 감소된 반면, 5 g/L 나트륨 벤조에이트, pH 4 의 T. 리세이 제형물은 24 시간의 40℃ 인큐베이션 후에 10 CFU 미만이 존재하는 7 log 감소를 보였다.
A. 니거 및 P. 푸니쿨로숨 배양물에 세포 사멸 조건의 적용
아세트산 및 나트륨 벤조에이트를, 이들 각각의 최종 농도를 2.8 g/L 및 2.6 g/L 로 하여, T. 리세이, A. 니거 및 P. 푸니쿨로숨 성장 배양물의 분리 분취물에 첨가하였다. 이어서, 분취물을 pH 4 로 조절하고, 24 시간 동안 40℃ 에서 인큐베이션하였다. 24 시간의 인큐베이션 후, 모든 분취물의 pH 를 10% (w/w) 수산화나트륨을 이용하여 4.8 로 조절하였다. 이어서, 각 분취물을 멸균수로 계단희석하였고, PDA 상에 도말 플레이팅하고, 25℃ 에서 인큐베이션하였다. 이어서, 인큐베이션된 PDA 플레이트를 CFU 에 대해 카운팅하였다. 그 결과를 도 3 에 나타낸다.
24 시간의 세포 사멸 조건으로의 노출 후, T. 리세이, A. 니거 및 P. 푸니쿨로숨에서 어떠한 생세포도 존재하지 않았다.
탄소수 6 이상의 유기산으로의 세포 사멸
T. 리세이 발효 브로쓰의 분리된 비제형화 분취물을 하기 표 2 에 나타낸 바와 같이 탄소수 6 이상의 유기산을 갖는 10 개의 분취물로 추가 분리·제형화하였다. 유기산의 화학 구조 및 pKa 를 도 4 에 나타낸다.
탄소수 6 이상의 유기산을 갖는 T. 리세이 발효 브로쓰의 제형물
T. 리세이 분취물 # 제형물 조성
1 5 g/L 시클로헥산카르복실산
2 15 g/L 시클로헥산카르복실산
3 5 g/L L-아스코르브산
4 15 g/L L-아스코르브산
5 5 g/L 아디프산 (pH 5)
6 15 g/L 아디프산 (pH 5)
7 5 g/L 4-메틸발레르산
8 15 g/L 4-메틸발레르산
9 5 g/L 3-메틸글루타르산
10 15 g/L 3-메틸글루타르산
11 5 g/L 페닐아세트산
이어서, 제형화 배양물의 pH 를 10% (w/w) 황산을 이용하여 pH 를 4.0 으로 조절하였다. 이어서, 제형화 배양물을 40℃ 에서 인큐베이션하였다. 2 및 4 시간의 인큐베이션 후, 제형화 배양물의 pH 를 측정하고, 10% (w/w) 황산으로 pH 를 4.0 으로 조절하고, 다시 40℃ 인큐베이션하였다. 24 시간의 인큐베이션 후, 제형화 배양물을 꺼낸 다음, 100㎕ 의 제형화 배양물을 100, 101, 102 및 103 의 희석하여 PDA 상에 도말 플레이팅하고, 25℃ 에서 인큐베이션하였다. 이어서, 인큐베이션된 PDA 플레이트를 CFU 에 대해 카운팅하였다. 그 결과를 도 5 에 나타낸다.
실시예 2
미생물에서의 유기 물질의 생성에 대한 세포-사멸된 전체의 브로쓰의 효과
엑소글루카나아제, 엔도글루카나아제, 헤미-셀룰라아제, 및 베타-글루코시다아제 효소를 세포밖 배지로 분비하는 T. 리세이 세포의 발효 배양물로부터 세포-사멸된 전체의 브로쓰를 제조하였다. 발효 배양물을 실시예 1 에 기술된 바와 같이 24 시간 동안 40℃ 및 pH 4 에서 0.28 중량% 아세트산 및 0.052 중량% 나트륨 벤조에이트로 처리 ("브로쓰 A") 또는 24 시간 동안 10℃ 및 pH 4 에서 1.4 중량% 아세트산, 0.26 중량% 나트륨 벤조에이트, 및 0.5 중량% 칼륨 소르베이트로 처리 ("브로쓰 B") 하였다. 미생물이 유기 물질을 생성하는 발효에 대한 상기 두 브로쓰의 효과를 조사하였다. 상기 브로쓰를 사용하여 셀룰로오스성 기질을 가수분해하여 미생물 성장을 위한 탄소 공급원으로서 사용되는 글루칸 가수분해물을 생성시켰다. 글루칸 가수분해물 상에서 성장된 미생물에 의한 유기 물질의 생성을 평가하였다.
가수분해물 생산
예비처리된 바가스를 국립 재생 에너지 연구소 (National Renewable Energy Laboratory; NREL) 로부터 수득했다. 바가스를 NREL 에서 승온 및 묽은 황산으로 예비처리하였다 (Schell et al. (2004) Bioresource Technology 91, 179-188). 이어서, 산 예비처리된 바가스를 탈이온수로 pH 가 4.2 초과가 될 때까지 세정하고, 그 후 잔류하는 물을 진공 여과로 제거하였다. 이어서, 세정된 산 예비처리된 바가스 (washed acid pretreated bagasse; wAPB) 를 20 분 동안 121℃ 에서 오토클레이브 처리시켜 wAPB 기질에서 임의의 미생물 오염물을 제거하였다. 이어서, 오토클레이브 처리된 wAPB 로부터, 글루칸 기질 1 g 당 브로쓰 A 또는 브로쓰 B 의 80 mg 단백질 용량을 이용하여 13% (w/w) 글루칸 가수분해물을 생산하였다. 각 가수분해물을 200 rpm 으로 세팅된 회전 진탕기에서 50℃ 에서 5 일간 인큐베이션하는 것으로 이루어진 당화 조건 하 생산하였다. 이어서, 각 가수분해물의 글루코오스 농도를 하기 HPLC 검정 섹션에서 개괄된 절차에 따라 분석하였다. wAPB 의 당화 후, 각 가수분해물을 3 개의 플라스크로 분리하고 멸균 여과된 50mM 나트륨 시트레이트 버퍼 (pH 4.8) 로 희석하여, 1% (w/w) 글루칸, 7% (w/w) 글루칸, 및 13% (w/w) 글루칸 가수분해물 혼합물을 제조하였다.
락토바실러스 람노서스 배양물 제조
동결건조된 락토바실러스 람노서스 (ATCC7469) 를, 미국 미생물 보존센터 (American Type Culture Collection; ATCC) 로부터 수득하고, 멸균수로 재수화하였다. 이어서, 재수화된 L. 람노서스를 Difco™ (REF#288210) 에서 구입된 락토바실리 MRS 한천 상에 도말 플레이팅하고, 2 일 동안 37℃ 에서 인큐베이션하여, L. 람노서스 콜로니를 수득하였다. 이어서, L. 람노서스 콜로니를 Difco™(REF#288130) 사에서 구입한 락토바실리 MRS 브로쓰를 포함하는 진탕 플라스크에 무균상 첨가하였다. 이어서, L. 람노서스 진탕 플라스크를 1 일 동안 33℃ 및 150 rpm 으로 세팅된 회전 진탕기에서 인큐베이션하여 성장 배양물을 수득했다.
L. 람노서스 가수분해물 발효
L. 람노서스의 성장 배양물을 3% (v/w) 의 농도로 하여, 브로쓰 A 및 B 로 생성된 7% (w/w) 글루칸에서의 wAPB 함유 분리 가수분해물 플라스크에 접종하였다. L. 람노서스가 접종된 플라스크를 37℃ 및 150 rpm 로 세팅된 회전 진탕기에서 5 일 동안 혐기성 조건 하에서 발효시켰다. 발효 혼합물을 인큐베이션 제 1 일, 제 2 일, 제 3 일, 및 제 5 일 후에 샘플링하여 락트산 및 글루코오스 농도에 대해 하기 HPLC 섹션에 개괄된 절차에 따라 분석하였다. 그 결과를 도 6 에 나타낸다.
Thermosacc 효모 동시 당화 발효 ( SSF )
세정된 산 예비처리된 바가스, 50mM 나트륨 시트레이트 버퍼 (pH 4.8), 및 브로쓰 A 또는 B 를, 기질 글루칸 1 g 당 80 mg 의 단백질 농도로 분리 플라스크에 첨가하였다. 이어서, 각 플라스크에 1% (v/w) 의 재수화된 Thermosacc 효모를 접종한 다음, 10% (w/w) 효모 추출물, 10% (w/w) 펩톤, 및 1% (w/w) 글루코오스로 이루어진 1% (v/w) 효모 영양분을 접종하였다. 이어서, 각 플라스크를 38℃ 및 150 rpm 로 세팅된 회전 진탕기에서 인큐베이션하였다. 발효 혼합물을 인큐베이션 제 2 일, 제 3 일, 제 4 일, 및 제 5 일 후에 샘플링하여, 하기 HPLC 검정에 개괄된 절차에 따라 에탄올 및 글루코오스 농도에 대해 분석하였다. 그 결과를 도 7 및 8 에 나타낸다.
HPLC 검정
HPLC 분석을 위한 모든 샘플을 5mM 황산 중 10x 희석하고, 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과한 다음 HPLC 에 주입했다. HPLC 분석은 BioRad Aminex HPX-87H 이온 배제 컬럼 (300mm x 7.8mm) 을 이용하여 수행하였다.
결과
브로쓰 A 및 B 로 생산된 가수분해물 모두는 130 g/L 초과의 글루코오스를 생성하고, 각각 90.4% 및 92.6% 의 글루코오스 전환% 를 갖는다. 락트산은 두 가수분해물 어디에도 검출되지 않았다.
글루칸이 더 적게 로딩된 wAPB 으로, L. 람노서스로부터 생성된 락트산의 농도는 증가되는데, 이는 기질로부터의 강한 억제 효과를 시사한다. 13% 글루칸 로딩의 wAPB, 브로쓰 A 및 B 로 생산된 가수분해물에서, 생성된 락트산의 수준은 서로 유의하게 상이하지 않았다. 브로쓰 A 로부터 생산된 7% 글루칸 로딩의 wAPB 상 L. 람노서스로부터의 락트산 생성량은, 브로쓰 B 로 생산된 가수분해물로부터의 락트산 생성량보다 1.5 배 컸다. 도 6 은 브로쓰 A 및 B 로부터 생성된 wAPB 가수분해물 상 L. 람노서스로부터의 락트산 생성량을 비교하는 그래프이다.
브로쓰 A 로부터 생산된 13% 글루칸의 wAPB 가수분해물 상 Thermosacc 효모로부터의 에탄올 생성량은 브로쓰 B 로부터 생성된 가수분해물보다 12.5 배 더 컸다 (도 7). 도 7 은 브로쓰 A 및 B 로부터 생산된 13% 글루칸 wAPB 가수분해물 상 Thermosacc 효모로부터의 에탄올 생성량을 비교하는 그래프이다. 5 일간의 Thermosacc 효모 발효 후, 브로쓰 B 생산 가수분해물에서의 잔류 글루코오스 축적은 브로쓰 A 생산 가수분해물보다 4 배 더 컸다. 도 8 은 브로쓰 A 및 B 로부터 생성된 가수분해물의 Thermosacc 효모 발효 동안의 글루코오스 축적을 비교하는 그래프이다.
앞선 본 발명을, 해석의 명확성을 위해 예시 및 실시예를 통해 일정 부분 상세하게 기술하였으나, 본 발명의 범주 및 취지를 벗어나지 않는 한 특정 변경 및 변형이 수행될 수 있다. 따라서, 상기 기술이 본 발명의 영역을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본원에서 인용된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 구체적으로 개별적으로 참조로 인용되는 것으로 표시된 것과 동일한 범위로 그 전문이 본원에서 참조로서 인용된다.

Claims (75)

  1. 하기를 포함하는 제 1 혼합물:
    (a) 하나 이상의 발효 브로쓰,
    (b) 상기 혼합물의 0.1 내지 15 중량% 의 양의, 하나 이상의 1-5 탄소 유기산 및/또는 이의 염을 포함하는 제 1 유기산 성분, 및
    (c) 상기 혼합물의 0.025 내지 5 중량% 의 양의, 하나 이상의 6 이상 탄소 유기산 및/또는 이의 염을 포함하는 제 2 유기산 성분
    을, 상기 하나 이상의 발효 브로쓰 내 생세포를 적어도 4 log 감소시키는 조건 하 및 기간 동안 인큐베이션하여 발효 브로쓰 제형물을 제조하는 것을 포함하는 발효 브로쓰 제형물의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 제 1 유기산 성분의 함량이 상기 제 1 혼합물의 0.2 중량% 내지 1 중량%, 0.2 중량% 내지 0.5 중량%, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 0.25 중량% 내지 5 중량% 또는 0.3 중량% 내지 3 중량% 인 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 제 2 유기산 성분의 함량이 상기 제 1 혼합물의 0.04 중량% 내지 3 중량%, 0.2 중량% 내지 0.5 중량%, 0.1 중량% 내지 1 중량%, 0.25 중량% 내지 5 중량% 또는 0.3 중량% 내지 3 중량% 인 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기간이 8 시간 내지 36 시간인 방법.
  5. 제 2 항에 있어서, 상기 기간이 20 시간 내지 28 시간인 방법.
  6. 제 1 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조건이 20℃ 내지 50℃ 의 온도를 포함하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 조건이 25℃ 내지 40℃ 의 온도를 포함하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 조건이 28℃ 내지 33℃ 의 온도를 포함하는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조건이 3.5 내지 5 의 pH 를 포함하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 조건이 4 내지 4.7 의 pH 를 포함하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 조건이 4.2 내지 4.5 의 pH 를 포함하는 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인큐베이션이 상기 하나 이상의 발효 브로쓰 내 생세포의 수를 적어도 5 log 감소, 6 log 감소, 7 log 감소 또는 8 log 감소시키는 조건 하 및 기간 동안 행해지는 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 발효 브로쓰 내 생세포의 상기 감소가, 상기 제 1 혼합물 내 제 1 유기산 성분 및 제 2 유기산 성분의 총 중량% 이하의 양으로 상기 제 1 유기산 성분 및 상기 제 2 유기산 성분 중 오직 하나만을 포함하는 상기 조건에 적용된 제 2 혼합물에 대해서 보다, 적어도 0.5-배, 적어도 1-배, 적어도 2-배, 적어도 5-배 또는 적어도 10-배 초과인 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 진균류 세포인 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 진균류 세포가 사상 진균류 세포인 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 사상 진균류 세포가 속 트리코데르마, 아스페르길러스, 페니실륨, 휴미콜라, 키리소스포륨, 또는 뉴로스포라로부터 선택되는 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 유기산 성분이 아세트산, 아세트산염, 포름산, 포름산염, 프로피온산, 프로피온산염, 또는 이들 둘 이상의 혼합물을 포함하거나 또는 이로 이루어진 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 제 1 유기산 성분이 아세트산 및/또는 이의 염을 포함하거나 또는 이로 이루어진 방법.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 유기산 성분이 벤조산, 벤조산염, 시클로헥산카르복실산, 시클로헥산카르복실산염, 4-메틸발레르산, 4-메틸발레르산염, 페닐아세트산, 페닐아세트산염, 또는 이들 둘 이상의 혼합물을 포함하거나 또는 이로 이루어진 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 제 2 유기산 성분이 벤조산 및/또는 이의 염을 포함하거나 또는 이로 이루어진 방법.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 유기산 성분이 상기 1-5 탄소 유기산의 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘 염을 포함하고/하거나, 상기 제 2 유기산 성분이 상기 6 이상 탄소 유기산의 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘 염을 포함하는 방법.
  22. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 유기산 성분이 0.2-0.4 중량% 농도의 아세트산을 포함하고, 제 2 유기산 성분이 0.2-0.4 중량% 농도의 나트륨 벤조에이트를 포함하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 기간이 24 시간이고, 상기 조건이 40℃ 의 온도, 및 4 내지 4.6 의 pH 를 포함하는 방법.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 발효 브로쓰 중 적어도 하나가 상기 세포에 의해 분비된 하나 이상의 단백질을 포함하는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 하나 이상의 단백질 중 상기 적어도 하나가 상기 세포에 의해 재조합적으로 발현되는 방법.
  26. 제 24 항 또는 제 25 항에 있어서, 상기 하나 이상의 단백질 중 적어도 하나가 효소인 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 효소가 엑소글루카나아제, 엔도글루카나아제, 헤미셀룰라아제 또는 β-글루코시다아제인 방법.
  28. 제 26 항에 있어서, 상기 하나 이상의 발효 브로쓰 중 적어도 하나가 세포에 의해 재조합적으로 발현되고 분비된 다수의 효소를 포함하는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 다수의 효소가 각각 엑소글루카나아제, 엔도글루카나아제, 헤미셀룰라아제 또는 β-글루코시다아제인 방법.
  30. 제 1 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조건이 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 의 상기 하나 이상의 발효 브로쓰의 효소 활성을 갖는 발효 브로쓰 제형물을 도모하게 하는 방법.
  31. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 5 내지 15 중량 퍼센트의 상기 제 1 혼합물을 이루는 방법.
  32. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인큐베이션 기간 동안 상기 제 1 혼합물에 pH-조절제를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 상기 pH-조절제가 인산인 방법.
  34. 제 32 항에 있어서, 상기 pH-조절제가 황산인 방법.
  35. 제 32 항에 있어서, 상기 pH-조절제가 수산화나트륨인 방법.
  36. 제 1 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 혼합물이 하나 이상의 항균제를 추가로 포함하는 방법.
  37. 제 36 항에 있어서, 상기 하나 이상의 항균제의 함량이 상기 제 1 혼합물의 0.0005 내지 0.05 중량% 인 방법.
  38. 제 37 항에 있어서, 상기 하나 이상의 항균제의 함량이 상기 제 1 혼합물의 0.001 내지 0.025 중량% 인 방법.
  39. 제 37 항 또는 제 38 항에 있어서, 항균제가 이소-알파-산, 테트라-이소 알파산, 및/또는 베타산을 포함하는 홉 추출물을 포함하는 방법.
  40. 제 1 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인큐베이션 단계 이전에 상기 제 1 혼합물을 제조하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  41. 제 40 항에 있어서, 상기 제 1 혼합물이, 하나 이상의 발효 브로쓰를 하나 이상의 1-5 탄소 유기산 및/또는 이의 염, 하나 이상의 6 이상 탄소 유기산 및/또는 이의 염, 및 임의로는 하나 이상의 추가 시약과 조합하는 것을 포함하는 프로세스에 의해 제조되는 방법.
  42. 제 41 항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가 시약이 pH 조절제 및/또는 항균제를 포함하는 방법.
  43. 제 1 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득된 또는 수득가능한 발효 브로쓰 제형물.
  44. 제 43 항에 있어서, 엑소글루카나아제, 엔도글루카나아제, 헤미셀룰라아제, 및 β-글루코시다아제로부터 선택된 하나 이상의 세포외 효소를 포함하는 발효 브로쓰 제형물.
  45. 제 43 항 또는 제 44 항에 있어서, 2200 내지 2800 CMC U/g 의 엔도글루카나아제 활성, 및 525 내지 775 pNPG U/g 의 β-글루코시다아제 활성을 갖는 발효 브로쓰 제형물.
  46. 제 43 항 또는 제 44 항에 있어서, 2200 내지 3200 CMC U/g 의 엔도글루카나아제 활성, 300 내지 800 pNPG U/g 의 β-글루코시다아제 활성 및 2000 내지 5000 ABX U/g 의 자일라나아제 활성을 갖는 발효 브로쓰 제형물.
  47. 하기를 포함하는 조성물:
    (a) 세포 함유 발효 브로쓰 하나 이상;
    (b) 상기 조성물의 0.2 내지 1.5 중량% 의 양의, 하나 이상의 1-5 탄소 유기산 및/또는 이의 염을 포함하는 제 1 유기산 성분
    (c) 상기 조성물의 0.04 내지 0.6 중량% 의 양의, 하나 이상의 6 이상 탄소 유기산 및/또는 이의 염을 포함하는 제 2 유기산 성분.
  48. 제 47 항에 있어서, 상기 제 1 유기산 성분의 함량이 상기 조성물의 0.2 중량% 내지 1 중량%, 0.2 중량% 내지 0.5 중량%, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 0.25 중량% 내지 5 중량% 또는 0.3 중량% 내지 3 중량% 인 조성물.
  49. 제 47 항 또는 제 48 항에 있어서, 상기 제 2 유기산 성분의 함량이 상기 조성물의 0.04 중량% 내지 3 중량%, 0.2 중량% 내지 0.5 중량%, 0.1 중량% 내지 1 중량%, 0.25 중량% 내지 5 중량% 또는 0.3 중량% 내지 3 중량% 인 조성물.
  50. 제 47 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 주로 또는 완전히 비(非)생세포인 조성물.
  51. 제 50 항에 있어서, 생세포가 상기 조성물 내에 존재하는 경우, 상기 조성물 내 비생세포 대 생세포의 비가 적어도 10:1, 적어도 50:1, 적어도 100:1, 적어도 1000:1, 적어도 10,000:1, 적어도 100,000:1 또는 적어도 1,000,000:1 인 조성물.
  52. 제 47 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서, pH 가 3.5 내지 5 인 조성물.
  53. 제 52 항에 있어서, pH 가 4 내지 4.7 인 조성물.
  54. 제 53 항에 있어서, pH 가 4.2 내지 4.5 인 조성물.
  55. 제 47 항 내지 제 54 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 진균류 세포를 포함하는 조성물.
  56. 제 55 항에 있어서, 상기 진균류 세포가 사상 진균류 세포인 조성물.
  57. 제 56 항에 있어서, 상기 사상 진균류 세포가 속 트리코데르마, 아스페르길러스, 페니실륨, 휴미콜라, 키리소스포륨, 또는 뉴로스포라인 조성물.
  58. 제 47 항 내지 제 57 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 유기산 성분이 아세트산, 아세트산염, 포름산, 포름산염, 프로피온산, 프로피온산염, 또는 이들 둘 이상의 혼합물을 포함하거나 또는 이로 이루어진 조성물.
  59. 제 58 항에 있어서, 상기 제 1 유기산 성분이 아세트산 및/또는 이의 염을 포함하거나 또는 이로 이루어진 조성물.
  60. 제 47 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 2 유기산 성분이 벤조산, 벤조산염, 시클로헥산카르복실산, 시클로헥산카르복실산염, 4-메틸발레르산, 4-메틸발레르산염, 페닐아세트산, 페닐아세트산염, 또는 이들 둘 이상의 혼합물을 포함하거나 또는 이로 이루어진 조성물.
  61. 제 60 항에 있어서, 상기 제 2 유기산 성분이 벤조산 및/또는 이의 염을 포함하거나 또는 이로 이루어진 조성물.
  62. 제 47 항 내지 제 61 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 유기산 성분이 상기 1-5 탄소 유기산의 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘 염을 포함하고/하거나 상기 제 2 유기산 성분이 상기 6 이상 탄소 유기산의 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘 염을 포함하는 조성물.
  63. 제 47 항 내지 제 57 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 유기산 성분이 아세트산을 0.2-0.4중량% 의 농도로 포함하고, 제 2 유기산 성분이 나트륨 벤조에이트를 0.2-0.4중량% 의 농도로 포함하는 조성물.
  64. 제 47 항 내지 제 63 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포에 의해 분비된 하나 이상의 단백질을 포함하는 조성물.
  65. 제 64 항에 있어서, 상기 하나 이상의 단백질 중 상기 적어도 하나가 상기 세포에 의해 재조합적으로 발현되는 조성물.
  66. 제 64 항 또는 제 65 항에 있어서, 상기 하나 이상의 단백질 중 적어도 하나가 효소인 조성물.
  67. 제 66 항에 있어서, 상기 효소가 엑소글루카나아제, 엔도글루카나아제, 헤미셀룰라아제 또는 β-글루코시다아제인 조성물.
  68. 제 64 항에 있어서, 세포에 의해 재조합적으로 발현되고 분비된 다수의 효소를 포함하는 조성물.
  69. 제 68 항에 있어서, 상기 다수의 효소가 각각 엑소글루카나아제, 엔도글루카나아제, 헤미셀룰라아제 또는 β-글루코시다아제인 조성물.
  70. 제 47 항 내지 제 69 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 5 내지 15 중량 퍼센트의 상기 조성물을 이루는 조성물.
  71. 제 47 항 내지 제 70 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항균제를 추가로 포함하는 조성물.
  72. 제 71 항에 있어서, 상기 하나 이상의 항균제의 함량이 상기 조성물의 0.0005 내지 0.05 중량% 인 조성물.
  73. 제 72 항에 있어서, 상기 하나 이상의 항균제의 함량이 상기 조성물의 0.001 내지 0.025 중량% 인 조성물.
  74. 제 72 항 또는 제 73 항에 있어서, 상기 항균제가 이소-알파-산, 테트라-이소 알파산, 및/또는 베타산을 포함하는 홉 추출물을 포함하는 조성물.
  75. (a) 포장재 및 (b) 제 43 항 또는 제 45 항에 따른 발효 브로쓰 제형물 또는 제 47 항 내지 제 74 항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 키트.
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