JP2019524081A - キシラナーゼ変異体およびそれをコードするポリヌクレオチド - Google Patents

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Abstract

本発明は、キシラナーゼ変異体、この変異体をコードするポリヌクレオチド；このポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクト、ベクター、および宿主細胞；このキシラナーゼ変異体を含む組成物およびこの変異体の使用方法に関する。

Description

配列表の参照
本出願は、コンピュータ読み取り可能な形態の配列表を含んでおり、これは、本明細書おいて参照により援用される。
本発明は、キシラナーゼ変異体、この変異体をコードするポリヌクレオチド；このポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクト、ベクター、および宿主細胞；このキシラナーゼ変異体を含む組成物およびこの変異体の使用方法に関する。
キシランは、あらゆる陸上植物に見られるヘミセルロースである（Ｐｏｐｐｅｒ ａｎｄ Ｔｕｏｈｙ，２０１０，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １５３：３７３−３８３）。キシランは特に二次細胞壁および木部細胞に豊富に含まれる。ＩＩ型細胞壁を有する草ではグルクロノアラビノキシランが主要なヘミセルロースであり、これは草を原料とする多くの食品および飼料製品中に可溶性または不溶性の食物繊維として存在する。
植物キシランはキシロピラノースがβ−１，４結合した主鎖を有し、Ｏ２位またはＯ３位が種特異的および組織特異的にアラビノース、グルクロン酸および酢酸で置換されていることもある。コーン、モロコシ、コメおよびキビなどの経済的に重要な種を含むキビ亜科（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ）のデンプンに富んだ種子は、その細胞壁に特殊なタイプの高度に置換されたキシランを有する。小麦粉と比較すると、小麦粉ではアラビノキシラン主鎖中のキシロシル単位の６０％超が非置換である。コーンカーネルキシランでは、非置換主鎖キシロシルの対応する割合は２０〜３０％であり、モロコシでは３５〜４０％である（Ｈｕｉｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ４２：２６９−２７９）。さらに、コーンおよびモロコシでは、キシラン側鎖が、他のキシランによく見られる単一のアラビノースまたはグルクロン酸置換より長いこともある。このさらなる側鎖複雑性は、多くの場合に、Ｌ−およびＤ−ガラクトース糖およびＤ−キシロース糖が側鎖アラビノースまたはグルクロン酸に結合していることに起因する。コーンカーネルキシランのアラビノースはまた約１０個に１個がフェルラ酸でエステル化され、およびキシロースは約４個に１個がアセチル化を有する（Ａｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．５８：６１４１−６１４８）。これらの要因がすべて合わさって、従来のキシラナーゼによる分解に抵抗性であるトウモロコシおよびモロコシの高度に置換されたキシランとなっている。
キシラン主鎖の加水分解に関与する公知の酵素は、配列類似性に基づき各酵素ファミリーに分類される（ｃａｚｙ．ｏｒｇ）。主にエンドキシラナーゼ活性を有する酵素は、これまでグリコシドヒドロラーゼファミリー（ＧＨ）５、８、１０、１１、３０および９８に記載されている。ファミリー内の酵素は三次元折り畳みなどの何らかの特徴を共有し、かつ通常は同じ反応機構を共有する。あるＧＨファミリーは狭域の、または単一特異的な基質特異性を有し、一方、別のファミリーは広域の基質特異性を有する。
アラビノキシランのキシロース主鎖を壊すため、市販のＧＨ１０およびＧＨ１１キシラナーゼが使用されることが多い。動物飼料では、これにより穀物細胞壁の分解がもたらされ、続いて細胞内に封入されている栄養素（デンプンおよびタンパク質）の放出が向上する。キシランの分解はまた、後腸発酵に利用され得るキシロースオリゴマーの形成ももたらし、従って動物がより消化し易いエネルギーを得る助けとなり得る。しかしながら、かかるキシラナーゼは側鎖立体障害を起こし易く、コムギからのアラビノキシランの分解には有効であるが、コーンまたはモロコシなどのイネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）種の種子に見られるキシランに対してはあまり有効でない。
コーンは世界中で動物飼料に用いられており、従って、細胞壁の内部に閉じ込められているキシロースおよび他の栄養素をより多く放出させるための、細胞壁の高度に分岐したキシラン主鎖を壊す能力のあるキシラナーゼ活性を有する新規ポリペプチドの発見が求められている。
本発明は、その親と比較して向上した特性を有するキシラナーゼ変異体を提供する。
本発明は、配列番号１の位置２４、２６、３６、３７、６０、７１、７４、７５、７６、１２４、１３３、１５５、１６７、２０８、３１７、および３２１に対応する１つ以上の（例えば数個の）位置に置換を含む、キシラナーゼ変異体であって、キシラナーゼ活性を有し、および配列番号１、２、３、４、５または６と少なくとも６０％の配列同一性を有するキシラナーゼ変異体に関する。本発明はまた、本発明のキシラナーゼ変異体を含む顆粒、液体組成物、動物飼料添加物または動物飼料などの組成物にも関する。
本発明はまた、このキシラナーゼ変異体をコードする単離ポリヌクレオチド；このポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクト、ベクター、および宿主細胞；およびこのキシラナーゼ変異体の作製方法にも関する。
本発明はさらに、動物飼料における；動物飼料添加物における；動物飼料における使用のための組成物の調製における；動物飼料の栄養価を向上させるための；動物飼料の消化率を増加させるための；動物における１つ以上の性能パラメータを向上させるための；植物系材料からキシランを可溶化するための；および／または植物系材料からデンプンを放出させるためのキシラナーゼ変異体の使用；発酵製品の作製方法；生地またはベークド製品の調製方法；およびキシラナーゼ変異体の入手方法に関する。
配列表の概要
配列番号１は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からの成熟ＧＨ３０キシラナーゼのアミノ酸配列である。
配列番号２は、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）からの成熟ＧＨ３０キシラナーゼのアミノ酸配列である。
配列番号３は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）からの成熟ＧＨ３０キシラナーゼのアミノ酸配列である。
配列番号４は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からの成熟ＧＨ３０キシラナーゼのアミノ酸配列である。
配列番号５は、パエニバチルス・パブリ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｂｕｌｉ）からの成熟ＧＨ３０キシラナーゼのアミノ酸配列である。
配列番号６は、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＨＢ−２６からの成熟ＧＨ３０キシラナーゼのアミノ酸配列である。
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）キシラナーゼ（配列番号１）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）キシラナーゼ（配列番号２）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）キシラナーゼ（配列番号３）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）キシラナーゼ（配列番号４）、パエニバチルス・パブリ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｂｕｌｉ）キシラナーゼ（配列番号５）およびバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）キシラナーゼ（配列番号６）のアミノ酸配列のアラインメントである。
定義
キシラナーゼ：用語「キシラナーゼ」は、一部のグルクロノアラビノキシランにおける１，４−β−Ｄ−キシロシル結合の内部加水分解を触媒するグルクロノアラビノキシランエンド−１，４−β−キシラナーゼ（Ｅ．Ｃ． ３．２．１．１３６）を意味する。キシラナーゼ活性は、０．０１％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００および２００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６中３７℃で０．２％ＡＺＣＬ−グルクロノキシランを基質として決定することができる。キシラナーゼ活性の１単位は、２００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６中の基質としての０．２％ＡＺＣＬ−グルクロノキシランから３７℃、ｐＨ６で毎分１．０μｍのアズリンが産生されるものとして定義される。
突然変異体：「突然変異体」という用語は、同一の染色体座を占める遺伝子の２つ以上の代替形態のいずれかを意味する。突然変異体は突然変異を介して自然に生じ、個体群において多型性をもたらし得る。遺伝子突然変異は、非表現性（コードされるポリペプチドに変化無し）であることが可能であり、または、異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドがコードされ得る。ポリペプチドの突然変異体は、遺伝子の突然変異体によってコードされたポリペプチドである。
動物：用語「動物」は、ヒトを除くすべての動物を指す。動物の例は、非反芻動物、および反芻動物である。反芻動物には、例えば、ヒツジ、ヤギ、ウシ、例えば、肉牛、乳牛、および幼若子牛、シカ、ヤク（ｙａｎｋ）、ラクダ、ラマおよびカンガルーなどの動物が含まれる。非反芻動物には、単胃動物、例えばブタ（ｐｉｇ）またはブタ（ｓｗｉｎｅ）（限定はされないが、子ブタ、成長期ブタ、および雌ブタを含む）；シチメンチョウ、アヒルおよびニワトリなどの家禽（限定はされないが、ブロイラーヒヨコ、産卵鶏を含む）；ウマ（限定はされないが、熱血種、冷血種および温血種を含む）、幼若子牛；魚類（限定はされないが、ブリ、ピラルクー、バルブ、バス、オキスズキ、ボカチコ、ブリーム、カジカ、コロソマ、コイ、ナマズ、カトラ、サバヒー、チャー、シクリッド、スギ、タラ、クラッピー、ヨーロッパヘダイ、ニベ、ウナギ、ハゼ、キンギョ、グーラミ、ハタ、グァポート、オヒョウ、ジャワ（ｊａｖａ）、ラベオ、イケカツオ、ドジョウ、サバ、ミルクフィッシュ、クロサギ、マッドフィッシュ、ボラ、パコ（ｐａｃｏ）、パールスポット、ペヘレイ、パーチ、キタカワカマス、ポンパーノ、ローチ、サケ、ヒゲナガヒレナマズ、ソーガー、シーバス、タイ、シャイナー、カワアナゴ、スネークヘッド、フエダイ、アカメ、シタビラメ、アイゴ、チョウザメ、マンボウ、アユ、テンチ、テラー、テラピア、マス、マグロ、ターボット、シロマス、ウォールアイおよびホワイトフィッシュを含む）；および甲殻類（限定はされないが、コエビおよびクルマエビを含む）が含まれる。
動物飼料：用語「動物飼料」は、動物による摂取に好適な、またはそれを意図する任意の化合物、調製物、または混合物を指す。単胃動物用の動物飼料は典型的には濃縮物ならびにビタミン、ミネラル、酵素、直接給与生菌、アミノ酸および／または他の飼料原料を（プレミックス中などに）含み、一方、反芻動物用の動物飼料は概してフォーレージ（粗飼料およびサイレージを含む）を含み、さらに、濃縮物ならびにビタミン、ミネラル、酵素、直接給与生菌、アミノ酸および／または他の飼料原料を（プレミックス中などに）含み得る。
アラビノキシラン含有材料：用語「アラビノキシラン含有材料」は、アラビノキシランを含有する任意の材料を意味する。アラビノキシランは、木および穀物粒を含めた植物の一次および二次細胞壁の両方に見られるヘミセルロースであり、２つのペントース糖、アラビノースおよびキシロースの共重合体からなる。アラビノキシラン鎖は多数の１，４結合したキシロース単位を含む。多くのキシロース単位が２−置換、３−置換または２，３−置換アラビノース残基で置換される。
アラビノキシラン含有材料の例は、フォーレージ、粗飼料、種子および穀粒（例えば、コーン、エンバク、ライムギ、オオムギ、コムギからの全粒か、または破砕、粉砕等によって調製されるかのいずれか）、樹木または広葉樹（ポプラ、ヤナギ、ユーカリ、ヤシ、カエデ、カバノキなど）、タケ、草本および／または木質エネルギー作物、農産食品および飼料作物、動物飼料製品、キャッサバの皮、カカオポッド、サトウキビ、サトウダイコン、ローカストビーンパルプ、野菜または果実の搾りかす、木材廃棄物、樹皮、削りくず、おがくず、木材パルプ、パルプ廃液、古紙、厚紙、建設および解体木材廃棄物、産業または都市廃棄物の廃水、固体またはスラッジ、肥料、醸造および／または発酵過程からの副産物、湿潤醸造用穀物、乾燥醸造用穀物、廃穀物、蒸留かすおよびバガスである。
本明細書に定義するとおりのフォーレージにはまた、粗飼料も含まれる。フォーレージは、乾草などの新鮮植物材料およびフォーレージ植物からのサイレージ、草および他のフォーレージ植物、草および他のフォーレージ植物、海藻、発芽穀物およびマメ科植物など、またはこれらの任意の組み合わせである。フォーレージ植物の例は、アルファルファ（ムラサキウマゴヤシ）、セイヨウミヤコグサ、アブラナ（例えば、ケール、ナタネ（キャノーラ）、ルタバガ（スウィード）、カブ）、クローバー（例えば、アルサイククローバー、アカクローバー、サブクローバー、シロクローバー）、草（例えば、ギョウギシバ、スズメノチャヒキ、オオカニツリ、ウシノケグサ、ヒースグラス（ｈｅａｔｈ ｇｒａｓｓ）、イチゴツナギ、ススキ、カモガヤ、ドクムギ、スイッチグラス、オオアワガエリ）、コーン（トウモロコシ）、アサ、キビ、オオムギ、エンバク、ライムギ、モロコシ、ダイズおよびコムギならびにテンサイなどの野菜である。エンシレージに好適な作物は、普通の草、クローバー、アルファルファ、ベッチ、エンバク、ライムギおよびトウモロコシである。フォーレージにはさらに、穀物生産からの作物残渣（コーンストーバー；コムギ、オオムギ、エンバク、ライムギおよび他の穀物からの藁など）；テンサイストーバーなどの野菜からの残渣；ダイズ、ナタネおよび他のマメ科植物からの茎葉など、油糧種子生産からの残渣；および動物またはヒトの食用穀物の精製からの、または燃料生産もしくは他の産業からの画分が含まれる。
粗飼料は、概して、種子および穀粒からの繊維、ふすま、殻など、高レベルの繊維を含む乾燥植物材料、ならびに作物残渣（ストーバー、コプラ、藁、もみ殻、ビート廃液など）である。
アラビノキシラン含有材料の好ましい供給源は、フォーレージ、粗飼料、種子および穀粒、サトウキビ、サトウダイコンおよび木材パルプである。
増体量：用語「増体量」は、所与の期間中における動物の生体重の増加、例えば１日目〜２１日目の体重の増加を意味する。
ｃＤＮＡ：「ｃＤＮＡ」という用語は、真核細胞または原核細胞から得られたスプライスされた成熟ｍＲＮＡ分子から逆転写によって調製可能であるＤＮＡ分子を意味する。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡ中に存在し得るイントロン配列を欠いている。元の一次ＲＮＡ転写物は、スプライスされた成熟ｍＲＮＡとして出現する前にスプライシングを含む一連のステップを介して処理されるｍＲＮＡに対する前駆体である。
コード配列：「コード配列」という用語は、変異体のアミノ酸配列を直接的に特定するポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は、一般にオープンリーディングフレームによって判定されるが、これは、ＡＴＧ、ＧＴＧもしくはＴＴＧなどの開始コドンで始まり、ＴＡＡ、ＴＡＧもしくはＴＧＡなどの終止コドンで終わる。コード配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはこれらの組み合わせであってよい。
制御配列：「制御配列」という用語は、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドの発現に必要なすべての核酸配列を意味する。各制御配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドに対して自生（すなわち、同じ遺伝子由来）であっても外来性（すなわち、異なる遺伝子由来）であっても、相互に自生もしくは外来性であってもよい。このような制御配列としては、これらに限定されないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモータ、シグナルペプチド配列、および、転写ターミネータが挙げられる。制御配列としては、プロモータ、ならびに、転写および翻訳停止シグナルが最低限挙げられる。制御配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドのコード領域との制御配列の連結反応を促進させる特定の制限部位を導入するために、リンカーと共に提供され得る。
発現：「発現」という用語は、変異体の生成に関与するいずれかのステップを含み、特にこれらに限定されないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾および分泌が挙げられる。
発現ベクター：「発現ベクター」という用語は、変異体をコードするポリヌクレオチドを含み、また、発現をもたらす制御ヌクレオチドに作動可能に結合している直線状または環状のＤＮＡ分子を意味する。
飼料要求率：用語「飼料要求率」、動物の体重を特定の量だけ増加させるため動物に与えられる飼料の量。飼料要求率の向上とは、飼料要求率の低下を意味する。「飼料要求率の低下」または「飼料要求率の向上」とは、飼料中に飼料添加組成物を使用する結果、動物の体重を特定の量だけ増加させるために動物に与える必要のある飼料の量が、飼料に前記飼料添加組成物が含まれない場合に動物の体重を同じ量だけ増加させるために必要な飼料の量と比較して低下することを意味する。
飼料効率：用語「飼料効率」は、所定期間内に動物に不断給餌するか、または特定量の食餌を与えたときの単位飼料当たりの増体量の大きさを意味する。「飼料効率の増加」とは、飼料中に本発明に係る飼料添加組成物を使用する結果、前記飼料添加組成物の非存在下で給餌される動物と比較して単位飼料摂取量当たりの増体量が増加することを意味する。
断片：用語「断片」は、成熟ポリペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシル末端の１つ以上の（例えば数個の）アミノ酸が欠けているポリペプチドを意味する；ここで断片はキシラナーゼ活性を有する。一態様において、断片は、少なくとも３３０アミノ酸残基、少なくとも３５０アミノ酸残基、または少なくとも３７０アミノ酸残基を含む。
一態様において、断片は、配列番号１の少なくとも３３０アミノ酸残基、配列番号１の少なくとも３５０アミノ酸残基、または配列番号１の少なくとも３７０アミノ酸残基を含む。一態様において、断片は、配列番号２の少なくとも３３０アミノ酸残基、配列番号２の少なくとも３５０アミノ酸残基、または配列番号２の少なくとも３７０アミノ酸残基を含む。一態様において、断片は、配列番号３の少なくとも３３０アミノ酸残基、配列番号３の少なくとも３５０アミノ酸残基、または配列番号３の少なくとも３７０アミノ酸残基を含む。一態様において、断片は、配列番号４の少なくとも３３０アミノ酸残基、配列番号４の少なくとも３５０アミノ酸残基、または配列番号４の少なくとも３７０アミノ酸残基を含む。一態様において、断片は、配列番号５の少なくとも３３０アミノ酸残基、配列番号５の少なくとも３５０アミノ酸残基、または配列番号５の少なくとも３７０アミノ酸残基を含む。一態様において、断片は、配列番号６の少なくとも３３０アミノ酸残基、配列番号６の少なくとも３５０アミノ酸残基、または配列番号６の少なくとも３７０アミノ酸残基を含む。
高度に分岐したキシラン：用語「高度に分岐したキシラン」は、アラビノキシラン主鎖中の５０％超のキシロシル単位が置換されていることを意味する。これは、好ましくは、Ｈｕｉｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，２０００，４２：２６９−２７９において実施されるとおりの結合分析から計算される。
宿主細胞：「宿主細胞」という用語は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物または発現ベクターを伴う形質転換、形質移入、形質導入等に対する感受性を有するいずれかの細胞型を意味する。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異によって親細胞とは異なっている親細胞のいずれかの子孫を包含する。
向上した特性：「向上した特性」という用語は、親と比較して、向上した変異体に関連する特徴を意味する。かかる向上した特性としては、限定はされないが、触媒効率、触媒速度、化学安定性、酸化安定性、ｐＨ活性、ｐＨ安定性、比活性、貯蔵条件下での安定性、基質結合、基質切断、基質特異性、基質安定性、表面特性、熱活性、および熱安定性が挙げられる。ある実施形態において、向上した特性は、向上した熱安定性である。
単離された：「単離された」という用語は、天然では存在しない形態または環境にある物質を意味する。単離された物質の非制限的例として、（１）任意の非天然型物質、（２）これらに限定されないが、天然では関連している天然に存在する成分の１つまたは複数または全部から少なくとも部分的に取り出された任意の酵素、変異体、核酸、タンパク質、ペプチドもしくは補因子；（３）天然に存在する物質に対して、人為的に修飾された任意の物質；または（４）天然では関連している他の成分と比較して物質の量を増加すること（例えば、物質をコードする遺伝子の複数のコピー；物質をコードする遺伝子と天然で関連するプロモータより強力なプロモータの使用）によって修飾された任意の物質が挙げられる。単離された物質は、発酵ブロスサンプル中に存在し得る。
成熟ポリペプチド：「成熟ポリペプチド」という用語は、Ｎ−末端処理、Ｃ−末端切断、グリコシル化、リン酸化などのような、翻訳および任意の翻訳後修飾後のその最終形態でのポリペプチドを意味する。
一態様において、成熟ポリペプチドは配列番号１のアミノ酸１〜３９１である。一態様において、成熟ポリペプチドは配列番号２のアミノ酸１〜３９１である。一態様において、成熟ポリペプチドは配列番号３のアミノ酸１〜３９２である。一態様において、成熟ポリペプチドは配列番号４のアミノ酸１〜３９１である。一態様において、成熟ポリペプチドは配列番号５のアミノ酸１〜３９３である。一態様において、成熟ポリペプチドは配列番号６のアミノ酸１〜３９１である。
当該技術分野では、宿主細胞が、同じポリヌクレオチドによって発現する２つ以上の異なる成熟ポリペプチド（すなわち、異なるＣ末端および／またはＮ末端アミノ酸を有するもの）の混合物を産生し得ることは公知である。また、当該技術分野では、異なる宿主細胞がポリペプチドを別様にプロセシングし、従って、あるポリヌクレオチドを発現する一つの宿主細胞が、同じポリヌクレオチドを発現する別の宿主細胞と比較して異なる成熟ポリペプチド（例えば、異なるＣ末端および／またはＮ末端アミノ酸を有するもの）を産生し得ることも公知である。
成熟ポリペプチドコード配列：用語「成熟ポリペプチドコード配列」は、キシラナーゼ活性を有する成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。
ミュータント：「ミュータント」という用語は、変異体をコードするポリヌクレオチドを意味する。
核酸構築物：「核酸構築物」という用語は、一本鎖もしくは二本鎖である核酸分子を意味し、これは、天然遺伝子から単離されるか、または、本来自然には存在し得ないような核酸のセグメント、もしくは、合成された核酸のセグメントを含有するよう修飾されており、１つまたは複数の制御配列を含む。
栄養素消化率：用語「栄養素消化率」は、胃腸管または胃腸管の特定の区分、例えば小腸から消失する栄養素の割合を意味する。栄養素消化率は、対象に投与されるものと、対象の糞便となって出てくるものとの差、または対象に投与されるものと、胃腸管の特定の区分、例えば回腸の消化管内容物中に残るものとの差として計測されてもよい。
本明細書で使用されるとおりの栄養素消化率は、所定期間内の排泄物の総回収量を用いて；または動物によって吸収されない、かつ研究者が胃腸管全体または胃腸管の一区分で消失した栄養素量を計算することを可能にする不活性マーカを使用して、栄養素の摂取量と排泄栄養素量との差により計測されてもよい。かかる不活性マーカは、二酸化チタン、酸化クロムまたは酸不溶性灰分であってもよい。消化率は、飼料中の栄養素の割合として、または飼料中の栄養素の単位質量当たりの可消化栄養素の単位質量として表されてもよい。本明細書で使用されるとおりの栄養素消化率には、デンプン消化率、脂肪消化率、タンパク質消化率、およびアミノ酸消化率が含まれる。
本明細書で使用されるとおりのエネルギー消化率は、摂取飼料の総エネルギーから糞便の総エネルギーを引いたもの、または摂取飼料の総エネルギーから動物の胃腸管の特定の区分、例えば回腸に残る消化管内容物の総エネルギーを引いたものを意味する。本明細書で使用されるとおりの代謝可能エネルギーは見かけの代謝可能エネルギーを指し、摂取飼料の総エネルギーから糞便、尿、およびガス状消化産物に含まれる総エネルギーを引いたものを意味する。エネルギー消化率および代謝可能エネルギーは栄養素消化率と同じ計測方法を用いて（飼料の代謝可能エネルギーの計算には窒素排泄量を適切に補正する）、総エネルギー摂取量と糞便中または胃腸管の特定の区分に存在する消化管内容物中に排泄される総エネルギーとの差として計測されてもよい。
作動可能に結合：「作動可能に結合」という用語は、制御配列がコード配列の発現をもたらすよう、ポリヌクレオチドのコード配列と比して制御配列が適切な位置に位置されている構成を意味する。
親または親キシラナーゼ：「親」または「親キシラナーゼ」という用語は、本発明のキシラナーゼ変異体をもたらすよう置換が行われたキシラナーゼを意味する。親は、天然に存在する（野生型）ポリペプチドまたはその変異体であり得る。
パーセンテージ可溶化キシラン：用語「パーセンテージ可溶化キシラン」は、酵素とのインキュベーション前に基質中に存在するキシロースの総量と比較した、酵素とのインキュベーション後に上清中に計測されるキシロースの量を意味する。本発明の目的上、パーセンテージ可溶化キシランは脱脂・脱デンプントウモロコシ（ｄｅｆａｔｔｅｄ ｄｅｓｔａｒｃｈｅｄ ｍａｉｚｅ：ＤＦＤＳＭ）を基質として使用して計算されてもよい。ＤＦＤＳＭは、実験の節にある「脱脂・脱デンプントウモロコシ（ＤＦＤＳＭ）の調製」に従い調製される。
脱脂・脱デンプントウモロコシ（ＤＦＤＳＭ）からのパーセンテージ可溶化キシランは、本明細書の「キシロース可溶化アッセイ」に記載されるとおりの、２０μｇ酵素／ｇ ＤＦＤＳＭおよび４０℃、ｐＨ５で２．５時間のインキュベーションの反応条件を用いて決定されてもよい。従って用語「脱脂・脱デンプントウモロコシ（ＤＦＤＳＭ）１グラム当たり２０μｇのキシラナーゼ変異体および４０℃、ｐＨ５で２．５時間のインキュベーションの反応条件下で実施される」は、パーセンテージ可溶化キシランが本明細書の「キシロース可溶化アッセイ」に記載されるとおり計算されると理解されるべきである。
より詳細な実施形態において、２％（ｗ／ｗ）ＤＦＤＳＭ懸濁液を１００ｍＭ酢酸ナトリウム、５ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ５に調製し、穏やかに撹拌しながら室温で３０分間水和させた。水和後、２００μｌ基質懸濁液を９６ウェルプレートにピペッティングし、２０μｌ酵素溶液と混合することにより、基質に対して２０ＰＰＭの最終酵素濃度（２０μｇ酵素／ｇ基質）を得た。酵素／基質混合物をプレートインキュベーターにおいて穏やかに撹拌（５００ＲＰＭ）しながら４０℃で２．５時間放置して加水分解させた。酵素加水分解後、酵素／基質プレートを３０００ＲＰＭで１０分間遠心し、５０μｌ上清を１００μｌ １．６Ｍ ＨＣｌと混合し、３００μｌ ＰＣＲチューブに移し、ＰＣＲ機において９０℃で４０分間放置して酸加水分解させた。酸加水分解後に試料を１２５μｌ １．４Ｍ ＮａＯＨで中和し、ＨＰＡＥ−ＰＡＤにロードして単糖分析にかけた。
配列同一性：２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の関連性が、「配列同一性」というパラメータによって記載される。
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、例えばバージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて判定される。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティおよびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳボージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長の同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性割合として用いられ、以下のとおり算出される。
（同等の残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数）
本発明の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性は、ＥＭＢＯＳＳ ｐａｃｋａｇｅ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，ｓｕｐｒａ）、例えばバージョン５．０．０以降のＮｅｅｄｌｅ ｐｒｏｇｒａｍに実装されているＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，ｓｕｐｒａ）を用いて判定される。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティ、および、ＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長の同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性割合として用いられ、以下のとおり算出される：
（同一のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数）
ストリンジェンシー条件：種々のストリンジェンシー条件は、以下のとおり定義される。
用語「超低ストリンジェンシー条件」は、少なくとも１００ヌクレオチド長のプローブについて、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング手順に従う、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ剪断変性サケ精子ＤＮＡ、および２５％ホルムアミド中４２℃でのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。キャリア材料は最終的に、５５℃で１．４×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて３回、各１５分間洗浄される。
用語「低ストリンジェンシー条件」は、少なくとも１００ヌクレオチド長のプローブについて、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング手順に従う、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ剪断変性サケ精子ＤＮＡ、および２５％ホルムアミド中４２℃でのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。キャリア材料は最終的に、６０℃で１．４×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて３回、各１５分間洗浄される。
用語「中ストリンジェンシー条件」は、少なくとも１００ヌクレオチド長のプローブについて、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング手順に従う、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ剪断変性サケ精子ＤＮＡ、および３５％ホルムアミド中４２℃でのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。キャリア材料は最終的に、６５℃で１．４×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて３回、各１５分間洗浄される。
用語「中−高ストリンジェンシー条件」は、少なくとも１００ヌクレオチド長のプローブについて、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング手順に従う、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ剪断変性サケ精子ＤＮＡ、および３５％ホルムアミド中４２℃でのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。キャリア材料は最終的に、６５℃で０．７×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて３回、各１５分間洗浄される。
用語「高ストリンジェンシー条件」は、少なくとも１００ヌクレオチド長のプローブについて、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング手順に従う、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ剪断変性サケ精子ＤＮＡ、および５０％ホルムアミド中４２℃でのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。キャリア材料は最終的に、７０℃で０．７×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて３回、各１５分間洗浄される。
「超高ストリンジェンシー条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブについて、５×ＳＳＰＥにおける４２℃、０．３％ ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片化および修飾サケ精子ＤＮＡ、ならびに、５０％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング手順に従うことを意味する。キャリア材料は、最終的に、０．７×ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳを用いて、１５分間ずつかけて７５℃で３回洗浄される。
サブ配列：用語「サブ配列」は、成熟ポリペプチドコード配列の５’および／または３’末端の１つ以上の（例えば数個の）ヌクレオチドが欠けているポリヌクレオチドを意味する；このサブ配列は、キシラナーゼ活性を有する断片をコードする。
変異体：用語「変異体」は、１つ以上の（例えば数個の）位置に改変、すなわち、置換、挿入、および／または欠失を含むキシラナーゼ活性を有するポリペプチドを意味する。置換とは、ある位置を占めるアミノ酸を別のアミノ酸に置き換えることを意味し；欠失とは、ある位置を占めるアミノ酸を取り除くことを意味し；および挿入とは、ある位置を占めるアミノ酸に隣接してその直後にアミノ酸を加えることを意味する。本発明の変異体は、配列番号１のポリペプチドのキシラナーゼ活性の少なくとも２０％、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％を有する。
野生型キシラナーゼ：「野生型」キシラナーゼという用語は、自然界において見出されるバクテリア、酵母、糸状真菌などの天然に存在する微生物により発現されるキシラナーゼを意味する。
従来の変異体の決定
本発明の目的のために、配列番号１は、他のリパーゼ中の対応するアミノ酸残基の判定に用いられる。別のキシラナーゼのアミノ酸配列を配列番号１とアラインメントし、アラインメントに基づいて、配列番号１における任意のアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置番号を、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）で実行されているようなＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）、例えばバージョン５．０．０以降を用いて決定する。用いるパラメータは、ギャップ開始ペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ０．５、およびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。
他のキシラナーゼにおける対応するアミノ酸残基の同定は、特にこれらに限定されないが、ＭＵＳＣＬＥ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｂｙ ｌｏｇ‐ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ；バージョン３．５以降；Ｅｄｇａｒ，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２：１７９２−１７９４）、ＭＡＦＦＴ（バージョン６．８５７以降；Ｋａｔｏｈ ａｎｄ Ｋｕｍａ，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０：３０５９−３０６６；Ｋａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３：５１１−５１８；Ｋａｔｏｈ ａｎｄ Ｔｏｈ，２００７，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２３：３７２−３７４；Ｋａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５３７：３９−６４；Ｋａｔｏｈ ａｎｄ Ｔｏｈ，２０１０，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２６：１８９９−１９００）、および、ＣｌｕｓｔａｌＷを採用するＥＭＢＯＳＳ ＥＭＭＡ（１．８３以降；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２：４６７３−４６８０）を含むいくつかのコンピュータプログラムを、それぞれのデフォルトパラメータで用いることによる複数のポリペプチド配列のアライメントにより判定可能である。
配列番号１のポリペプチドから他の酵素が分化して、従来からの配列に基づく比較による関係の検出ができない場合（Ｌｉｎｄａｈｌ ａｎｄ Ｅｌｏｆｓｓｏｎ，２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９５：６１３−６１５）、他の対配列比較アルゴリズムを用いることが可能である。配列に基づくサーチにおける感度は、データベースのサーチにポリペプチドファミリー（プロファイル）の確率表現を利用するサーチプログラムを用いることで高めることが可能である。例えば、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムは、反復データベースサーチプロセスを介してプロファイルを生成し、離れた相同体を検出することが可能である（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）。ポリペプチドに係るファミリーまたはスーパーファミリーがタンパク質構造データベースにおいて１つまたは複数の表現を有する場合には、感度をさらに高めることが可能である。ＧｅｎＴＨＲＥＡＤＥＲ（Ｊｏｎｅｓ，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：７９７−８１５；ＭｃＧｕｆｆｉｎ ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ，２００３，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １９：８７４−８８１）などのプログラムは、問い合わせ配列に係るフォールド構造を予想するニューラルネットワークに対する入力として、多様なソース（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、二次構造予測、構造アラインメントプロファイルおよび溶媒和ポテンシャル）からの情報を利用する。同様に、Ｇｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１３：９０３−９１９による方法が、未知の構造の配列とＳＣＯＰデータベースに存在するスーパーファミリーモデルとのアラインに用いられることが可能である。次いで、これらのアラインメントを用いてポリペプチドに係る相同性モデルを生成することが可能であり、このようなモデルは、その目的のために開発された多様なツールを用いて正確に評価可能である。
公知の構造のタンパク質に関して、数々のツールおよびリソースが、構造アラインメントの検索および生成のために使用可能である。例えばタンパク質のＳＣＯＰスーパーファミリーが構造的にアラインされており、これらのアラインメントはアクセスおよびダウンロードが可能である。２つ以上のタンパク質構造は距離アラインメントマトリックス（Ｈｏｌｍ ａｎｄ Ｓａｎｄｅｒ，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ３３：８８−９６）または組み合わせ拡張法（Ｓｈｉｎｄｙａｌｏｖ ａｎｄ Ｂｏｕｒｎｅ，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１：７３９−７４７）などの多様なアルゴリズムを用いてアラインすることが可能であり、これらのアルゴリズムを、可能性のある構造相同体を発見するために、対象の構造と共に問い合わせ構造データベースに対して追加的に実行することが可能である（例えば、Ｈｏｌｍ ａｎｄ Ｐａｒｋ，２０００，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １６：５６６−５６７）。
本発明の変異体の記載において、以下の命名法が参照を容易とするために採用される。公認されているＩＵＰＡＣの１文字または３文字のアミノ酸略記が利用されている。
置換．アミノ酸置換に関しては以下の命名法が用いられている：元のアミノ酸、位置、置換されたアミノ酸。従って、位置２２６でのスレオニンのアラニンでの置換は、「Ｔｈｒ２２６Ａｌａ」または「Ｔ２２６Ａ」と示される。複数の突然変異は加算記号（「＋」）によって分けられており、例えば、「Ｇｌｙ２０５Ａｒｇ＋Ｓｅｒ４１１Ｐｈｅ」または「Ｇ２０５Ｒ＋Ｓ４１１Ｆ」とされ、それぞれ、グリシン（Ｇ）のアルギニン（Ｒ）による、および、セリン（Ｓ）のフェニルアラニン（Ｆ）による位置２０５および４１１での置換が表されている。
欠失．アミノ酸欠失に関しては以下の命名法が用いられている：元のアミノ酸、位置、＊。従って、位置１９５におけるグリシンの欠失は、「Ｇｌｙ１９５＊」または「Ｇ１９５＊」と表記される。複数の欠失は、記号（「＋」）を加えることにより区切られ、例えば「Ｇｌｙ１９５＊＋Ｓｅｒ４１１＊」または「Ｇ１９５＊＋Ｓ４１１＊」とされる。
挿入．アミノ酸挿入に関しては以下の命名法が用いられている：元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸。従って、位置１９５におけるグリシンの後ろへのリジンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓ」または「Ｇ１９５ＧＫ」と表記される。複数のアミノ酸の挿入は、［元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されるアミノ酸＃１、挿入されるアミノ酸＃２；以下同様］と表記される。例えば、位置１９５におけるグリシンの後ろへのリジンおよびアラニンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓＡｌａ」または「Ｇ１９５ＧＫＡ」と指示される。
そのような場合、挿入されるアミノ酸残基は、挿入されるアミノ酸残基の前にあるアミノ酸残基の位置番号に小文字を加えることにより付番される。従って上記の例であれば、配列は以下のようになる：
Figure 2019524081
複数の改変．複数の改変を含む変異体はプラス記号（「＋」）によって区切られ、例えば、「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ＋Ｇｌｙ１９５Ｇｌｕ」または「Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ」が位置１７０および１９５のアルギニンおよびグリシンの、それぞれチロシンおよびグルタミン酸による置換を表す。
異なる改変。異なる改変を１つの位置に導入することが可能である場合、これらの異なる改変はコンマによって区切られ、例えば、「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ，Ｇｌｕ」は、位置１７０におけるアルギニンのチロシンまたはグルタミン酸による置換を表す。ゆえに、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ，Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ，Ａｌａ」は以下の変異体を表す：「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」、「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、および「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」。
発明の詳細な説明
本発明は、配列番号１の位置２４、２６、３６、３７、６０、７１、７４、７５、７６、１２４、１３３、１５５、１６７、２０８、３１７、および３２１に対応する１つ以上の（例えば数個の）位置に置換を含む、単離キシラナーゼ変異体に関し、ここで変異体はキシラナーゼ活性を有する。
変異体
本発明は、位置２４、２６、３６、３７、６０、７１、７４、７５、７６、１２４、１３３、１５５、１６７、２０８、３１７、および３２１に対応する１つ以上の（例えば数個の）位置に置換を含む、キシラナーゼ変異体を提供し、ここで変異体はキシラナーゼ活性を有する。ある実施形態において、変異体は親キシラナーゼと比較して熱安定性が向上している。ある実施形態において、変異体はＧＨ３０キシラナーゼ変異体、好ましくはＧＨ３０サブファミリー８変異体である。
一実施形態において、変異体は、親キシラナーゼのアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。
別の実施形態において、変異体は、配列番号１に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。ある実施形態において、変異体は、配列番号１と比較して熱安定性が向上している。
別の実施形態において、変異体は、配列番号２に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。ある実施形態において、変異体は、配列番号２と比較して熱安定性が向上している。
別の実施形態において、変異体は、配列番号３に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。ある実施形態において、変異体は、配列番号３と比較して熱安定性が向上している。
別の実施形態において、変異体は、配列番号４に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。ある実施形態において、変異体は、配列番号４と比較して熱安定性が向上している。
別の実施形態において、変異体は、配列番号５に対して、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。ある実施形態において、変異体は、配列番号５と比較して熱安定性が向上している。
別の実施形態において、変異体は、配列番号６に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。ある実施形態において、変異体は、配列番号６と比較して熱安定性が向上している。
一実施形態において、本発明は、２４、２６、３６、３７、６０、７１、７４、７５、７６、１２４、１３３、１５５、１６７、２０８、３１７、および３２１からなる群から選択される１つ以上の（例えば数個の）位置に置換を含む、親キシラナーゼと比較して熱安定性が向上しているＧＨ３０サブファミリー８キシラナーゼ変異体に関し、ここで位置は配列番号１の位置に対応し、および変異体はキシラナーゼ活性を有し、かつ配列番号１と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する。
ある実施形態において、親キシラナーゼは、本明細書において以下に記載するような、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＧＨ３０サブファミリー８キシラナーゼである。一実施形態において、親キシラナーゼは、配列番号１または配列番号４、好ましくは配列番号１など、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＧＨ３０サブファミリー８キシラナーゼである。一実施形態において、親キシラナーゼは、配列番号２または配列番号６など、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＧＨ３０サブファミリー８キシラナーゼである。一実施形態において、親キシラナーゼは、配列番号３など、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＧＨ３０サブファミリー８キシラナーゼである。別の態様において、親キシラナーゼは、本明細書において以下に記載するような、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）ＧＨ３０サブファミリー８キシラナーゼである。一実施形態において、親キシラナーゼは、配列番号５など、パエニバチルス・パブリ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｂｕｌｉ）ＧＨ３０サブファミリー８キシラナーゼである。
一態様において、本発明の変異体中の改変の数は、１〜２０、例えば、１〜１０および１〜５、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の改変である。
別の態様において、変異体は、位置２４、２６、３６、３７、６０、７１、７４、７５、７６、１２４、１３３、１５５、１６７、２０８、３１７、および３２１に対応する１つ以上の（例えば数個の）位置に置換を含む。別の態様において、変異体は、位置２４、２６、３６、３７、６０、７１、７４、７５、７６、１２４、１３３、１５５、１６７、２０８、３１７、および３２１のいずれかに対応する２つの位置に置換を含む。別の態様において、変異体は、位置２４、２６、３６、３７、６０、７１、７４、７５、７６、１２４、１３３、１５５、１６７、２０８、３１７、および３２１のいずれかに対応する３つの位置に置換を含む。別の態様において、変異体は、位置２４、２６、３６、３７、６０、７１、７４、７５、７６、１２４、１３３、１５５、１６７、２０８、３１７、および３２１に対応する各位置に置換を含む。ある実施形態において、変異体は親キシラナーゼと比較して熱安定性が向上している。ある実施形態において、親キシラナーゼは、本明細書において以下に記載するような、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＧＨ３０サブファミリー８キシラナーゼである。一実施形態において、親キシラナーゼは、配列番号１または配列番号４、好ましくは配列番号１など、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＧＨ３０サブファミリー８キシラナーゼである。一実施形態において、親キシラナーゼは、配列番号２または配列番号６など、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＧＨ３０サブファミリー８キシラナーゼである。一実施形態において、親キシラナーゼは、配列番号３など、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＧＨ３０サブファミリー８キシラナーゼである。別の態様において、親キシラナーゼは、本明細書において以下に記載するような、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）ＧＨ３０サブファミリー８キシラナーゼである。一実施形態において、親キシラナーゼは、配列番号５など、パエニバチルス・パブリ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｂｕｌｉ）ＧＨ３０サブファミリー８キシラナーゼである。
別の態様において、変異体は、位置２４に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。別の態様において、位置２４に対応する位置におけるアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ、詳細にはＴｒｐで置換されている。別の態様において、変異体は、配列番号１のポリペプチドの置換Ｈ２４Ｗを含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、位置２６に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。別の態様において、位置２６に対応する位置におけるアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ、詳細にはＧｌｕで置換されている。別の態様において、変異体は、配列番号１のポリペプチドの置換Ａ２６Ｅを含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、位置３６に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。別の態様において、位置３６に対応する位置におけるアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ、詳細にはＬｅｕまたはＴｈｒで置換されている。別の態様において、変異体は、配列番号１のポリペプチドの置換Ｒ３６Ｌ，Ｔを含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、位置３７に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。別の態様において、位置３７に対応する位置におけるアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ、詳細にはＬｅｕまたはＴｈｒで置換されている。別の態様において、変異体は、配列番号１のポリペプチドの置換Ｅ３７Ｌ，Ｔを含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、位置６０に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。別の態様において、位置６０に対応する位置におけるアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ、詳細にはＡｓｎで置換されている。別の態様において、変異体は、配列番号１のポリペプチドの置換Ｒ６０Ｎを含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、位置７１に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。別の態様において、位置７１に対応する位置におけるアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ、詳細にはＩｌｅ、Ｌｅｕ、またはＴｈｒで置換されている。別の態様において、変異体は、配列番号１のポリペプチドの置換Ｋ７１Ｉ，Ｌ，Ｔを含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、位置７４に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。別の態様において、位置７４に対応する位置におけるアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ、詳細にはＩｌｅまたはＬｅｕで置換されている。別の態様において、変異体は、配列番号１のポリペプチドの置換Ｖ７４Ｉ，Ｌを含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、位置７５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。別の態様において、位置７５に対応する位置におけるアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ、詳細にはＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、またはＴｈｒで置換されている。別の態様において、変異体は、配列番号１のポリペプチドの置換Ｋ７５Ｅ，Ｌ，Ｎ，Ｔを含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、位置７６に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。別の態様において、位置７６に対応する位置におけるアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ、詳細にはＬｅｕで置換されている。別の態様において、変異体は、配列番号１のポリペプチドの置換Ｈ７６Ｌを含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、位置１２４に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。別の態様において、位置１２４に対応する位置におけるアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ、詳細にはＴｙｒで置換されている。別の態様において、変異体は、配列番号１のポリペプチドの置換Ｆ１２４Ｙを含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、位置１３３に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。別の態様において、位置１３３に対応する位置におけるアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ、詳細にはＩｌｅで置換されている。別の態様において、変異体は、配列番号１のポリペプチドの置換Ｙ１３３Ｉを含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、位置１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。別の態様において、位置１５５に対応する位置におけるアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ、詳細にはＭｅｔで置換されている。別の態様において、変異体は、配列番号１のポリペプチドの置換Ｉ１５５Ｍを含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、位置１６７に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。別の態様において、位置１６７に対応する位置におけるアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ、詳細にはＧｌｕで置換されている。別の態様において、変異体は、配列番号１のポリペプチドの置換Ｎ１６７Ｅを含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、位置２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。別の態様において、位置２０８に対応する位置におけるアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ、詳細にはＬｅｕで置換されている。別の態様において、変異体は、配列番号１のポリペプチドの置換Ｖ２０８Ｌを含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、位置３１７に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。別の態様において、位置３１７に対応する位置におけるアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ、詳細にはＡｓｐで置換されている。別の態様において、変異体は、配列番号１のポリペプチドの置換Ｓ３１７Ｄを含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、位置３２１に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。別の態様において、位置３２１に対応する位置におけるアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ、詳細にはＡｌａで置換されている。別の態様において、変異体は、配列番号１のポリペプチドの置換Ｇ３２１Ａを含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４および２６に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４および６０に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４および７１に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４および７４に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４および７５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４および７６に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４および３１７に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４および３２１に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６および６０に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６および７１に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６および７４に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６および７５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６および７６に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６および３１７に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６および３２１に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置３６および３７に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置３６および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置３６および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置３７および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置３７および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置３７および３１７に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置３７および３２１に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７１および７４に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７１および７５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７１および７６に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７１および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７１および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７１および３１７に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７１および３２１に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７４および７５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７４および７６に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７４および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７４および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７４および３１７に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７４および３２１に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７５および７６に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７５および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７５および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７５および３１７に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７５および３２１に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７６および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７６および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７６および３１７に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７６および３２１に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置１２４および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置１２４および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置１２４および３１７に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置１２４および３２１に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置１３３および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置１３３および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置１３３および３１７に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置１３３および３２１に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置１５５および１６７に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置１５５および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置１５５および３１７に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置１５５および３２１に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置１６７および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置１６７および３１７に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置１６７および３２１に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２０８および３１７に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２０８および３２１に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置３１７および３２１に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、２６、および７１に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、２６、および７４に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、２６、および７５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、２６、および７６に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、２６、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、２６、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、７１、および７４に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、７１、および７５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、７１、および７６に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、７１、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、７１、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、７４、および７５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、７４、および７６に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、７４、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、７４、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、７５、および７６に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、７５、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、７５、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、７６、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、７６、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、１５５、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６、７１、および７４に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６、７１、および７５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６、７１、および７６に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６、７１、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６、７１、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６、７４、および７５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６、７４、および７６に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６、７４、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６、７４、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６、７５、および７６に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６、７５、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６、７５、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６、７６、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６、７６、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６、１５５、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置３６、３７、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置３６、３７、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置３６、１５５、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置３７、１５５、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７１、７４、および７５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７１、７４、および７６に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７１、７４、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７１、７４、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７１、７５、および７６に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７１、７５、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７１、７５、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７１、７６、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７１、７６、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７１、１５５、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７４、７５、および７６に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７４、７５、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７４、７５、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７４、７６、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７４、７６、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７４、１５５、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７５、７６、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７５、７６、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７５、１５５、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７６、１５５、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置１２４、１５５、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置１３３、１５５、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置１５５、１６７、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、２６、７１、および７４に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、２６、７１、および７５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、２６、７１、および７６に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、２６、７１、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、２６、７１、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、７１、７４、および７５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、７１、７４、および７６に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、７１、７４、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、７１、７４、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、７４、７５、および７６に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、７４、７５、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、７４、７５、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、７４、７６、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、７４、７６、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、７５、７６、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、７５、７６、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、７６、１５５、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６、７１、７４、および７５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６、７１、７４、および７６に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６、７１、７４、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６、７１、７４、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６、７４、７５、および７６に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６、７４、７５、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６、７４、７５、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６、７５、７６、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６、７５、７６、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６、７６、１５５、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置３６、３７、１５５、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７１、７４、７５、および７６に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７１、７４、７５、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７１、７４、７５、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７１、７５、７６、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７１、７５、７６、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７１、７６、１５５、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７４、７５、７６、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７４、７５、７６、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７４、７６、１５５、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７５、７６、１５５、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、２６、７１、７４、および７５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、２６、７１、７４、および７６に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、２６、７１、７４、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、２６、７１、７４、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、７１、７４、７５、および７６に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、７１、７４、７５、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、７１、７４、７５、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、７４、７５、７６、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、７４、７５、７６、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、７５、７６、１５５、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６、７１、７４、７５、および７６に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６、７１、７４、７５、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６、７１、７４、７５、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６、７４、７５、７６、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６、７１、７４、７５、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６、７４、７５、７６、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６、７４、７５、７６、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６、７５、７６、１５５、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７１、７４、７５、７６、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７１、７４、７５、７６、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７１、７５、７６、１５５、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７４、７５、７６、１５５、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、２６、７１、７４、７５、および７６に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、２６、７１、７４、７５、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、２６、７１、７４、７５、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、７１、７４、７５、７６、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、７１、７４、７５、７６、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、７４、７５、７６、１５５、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６、７１、７４、７５、７６、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６、７１、７４、７５、７６、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６、７４、７５、７６、１５５、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置７１、７４、７５、７６、１５５、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、２６、７１、７４、７５、７６、および１５５に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、２６、７１、７４、７５、７６、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、７１、７４、７５、７６、１５５、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２６、７１、７４、７５、７６、１５５、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、上に記載したような位置２４、２６、７１、７４、７５、７６、１５５、および２０８に対応する位置に置換を含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、Ｈ２４Ｗ、Ａ２６Ｅ、Ｖ７４Ｌ、Ｋ７５Ｌ、Ｈ７６Ｌ、Ｉ１５５Ｍ、およびＶ２０８Ｌからなる群から選択される１つ以上の（例えば数個の）置換を含むか、またはこれから成る。ある実施形態において、変異体は親キシラナーゼと比較して熱安定性が向上している。ある実施形態において、親キシラナーゼは、本明細書において以下に記載するような、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＧＨ３０サブファミリー８キシラナーゼである。一実施形態において、親キシラナーゼは、配列番号１または配列番号４、好ましくは配列番号１など、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＧＨ３０サブファミリー８キシラナーゼである。一実施形態において、親キシラナーゼは、配列番号２または配列番号６など、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＧＨ３０サブファミリー８キシラナーゼである。一実施形態において、親キシラナーゼは、配列番号３など、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＧＨ３０サブファミリー８キシラナーゼである。別の態様において、親キシラナーゼは、本明細書において以下に記載するような、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）ＧＨ３０サブファミリー８キシラナーゼである。一実施形態において、親キシラナーゼは、配列番号５など、パエニバチルス・パブリ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｂｕｌｉ）ＧＨ３０サブファミリー８キシラナーゼである。
別の態様において、変異体は、配列番号１のポリペプチドの置換Ｈ２４Ｗ＋Ａ２６Ｅを含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、配列番号１のポリペプチドの置換Ｈ２４Ｗ＋Ｖ７４Ｌを含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、配列番号１のポリペプチドの置換Ｈ２４Ｗ＋Ｋ７５Ｌを含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、配列番号１のポリペプチドの置換Ｈ２４Ｗ＋Ｈ７６Ｌを含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、配列番号１のポリペプチドの置換Ｈ２４Ｗ＋Ｉ１５５Ｍを含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、配列番号１のポリペプチドの置換Ｈ２４Ｗ＋Ｖ２０８Ｌを含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、配列番号１のポリペプチドの置換Ａ２６Ｅ＋Ｖ７４Ｌを含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、配列番号１のポリペプチドの置換Ａ２６Ｅ＋Ｋ７５Ｌを含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、配列番号１のポリペプチドの置換Ａ２６Ｅ＋Ｈ７６Ｌを含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、配列番号１のポリペプチドの置換Ａ２６Ｅ＋Ｉ１５５Ｍを含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、配列番号１のポリペプチドの置換Ａ２６Ｅ＋Ｖ２０８Ｌを含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、配列番号１のポリペプチドの置換Ｖ７４Ｌ＋Ｋ７５Ｌを含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、配列番号１のポリペプチドの置換Ｖ７４Ｌ＋Ｈ７６Ｌを含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、配列番号１のポリペプチドの置換Ｖ７４Ｌ＋Ｉ１５５Ｍを含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、配列番号１のポリペプチドの置換Ｖ７４Ｌ＋Ｖ２０８Ｌを含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、配列番号１のポリペプチドの置換Ｋ７５Ｌ＋Ｈ７６Ｌを含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、配列番号１のポリペプチドの置換Ｋ７５Ｌ＋Ｉ１５５Ｍを含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、配列番号１のポリペプチドの置換Ｋ７５Ｌ＋Ｖ２０８Ｌを含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、配列番号１のポリペプチドの置換Ｈ７６Ｌ＋Ｉ１５５Ｍを含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、配列番号１のポリペプチドの置換Ｈ７６Ｌ＋Ｖ２０８Ｌを含むか、またはこれから成る。
別の態様において、変異体は、配列番号１のポリペプチドの置換Ｉ１５５Ｍ＋Ｖ２０８Ｌを含むか、またはこれから成る。
変異体は、１つ以上の（例えば数個の）他の位置に１つ以上の追加的な改変をさらに含み得る。
一実施形態において、本発明は、以下からなる群から挙げられる置換を含む、親キシラナーゼと比較して熱安定性が向上しているＧＨ３０サブファミリー８キシラナーゼ変異体に関する：
Figure 2019524081
 ここで位置は配列番号１の位置に対応し、および変異体はキシラナーゼ活性を有し、かつ配列番号１と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する。ある実施形態において、親キシラナーゼは、本明細書において以下に記載するような、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＧＨ３０サブファミリー８キシラナーゼである。一実施形態において、親キシラナーゼは、配列番号１または配列番号４、好ましくは配列番号１など、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＧＨ３０サブファミリー８キシラナーゼである。一実施形態において、親キシラナーゼは、配列番号２または配列番号６など、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＧＨ３０サブファミリー８キシラナーゼである。一実施形態において、親キシラナーゼは、配列番号３など、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＧＨ３０サブファミリー８キシラナーゼである。別の態様において、親キシラナーゼは、本明細書において以下に記載するような、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）ＧＨ３０サブファミリー８キシラナーゼである。一実施形態において、親キシラナーゼは、配列番号５など、パエニバチルス・パブリ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｂｕｌｉ）ＧＨ３０サブファミリー８キシラナーゼである。
ある実施形態において、置換は、以下からなる群から選択される：
Figure 2019524081
Figure 2019524081
Figure 2019524081
キシラナーゼ変異体は、１つ以上のアミノ酸置換をさらに含み得る。アミノ酸の変更は軽微なものであり得、すなわち、タンパク質の折り畳みおよび／または活性に顕著に影響しない保存的アミノ酸置換または挿入；典型的には１〜３０アミノ酸の微小な欠失；アミノ末端メチオニン残基などの微小なアミノ−またはカルボキシル−末端延伸；２０〜２５残基以下の小リンカーペプチド；または、正味の電荷または他の機能を変えることにより精製を容易とする、ポリヒスチジン配列、抗原エピトープもしくは結合ドメインなどの微小な延伸であり得る。
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシンおよびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシンおよびバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）、ならびに、低分子アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニンおよびメチオニン）の群に含まれるものによる。特異的活性を概して変化させないアミノ酸置換は当該技術分野において公知であり、例えば、Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ ａｎｄ Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，１９７９，Ｉｎ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋにより記載される。一般的な置換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｓｎ／Ｇｌｎ、Ｇｌｎ／Ｇｌｕ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、およびＡｓｐ／Ｇｌｙである。保存的置換の他の例は、ＧからＡ；ＡからＧ、Ｓ；ＶからＩ、Ｌ、Ａ、Ｔ、Ｓ；ＩからＶ、Ｌ、Ｍ；ＬからＩ、Ｍ、Ｖ；ＭからＬ、Ｉ、Ｖ；ＰからＡ、Ｓ、Ｎ；ＦからＹ、Ｗ、Ｈ；ＹからＦ、Ｗ、Ｈ；ＷからＹ、Ｆ、Ｈ；ＲからＫ、Ｅ、Ｄ；ＫからＲ、Ｅ、Ｄ；ＨからＱ、Ｎ、Ｓ；ＤからＮ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、Ｑ；ＥからＱ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｎ；ＳからＴ、Ａ；ＴからＳ、Ｖ、Ａ；ＣからＳ、Ｔ、Ａ；ＮからＤ、Ｑ、Ｈ、Ｓ；ＱからＥ、Ｎ、Ｈ、Ｋ、Ｒである。
あるいは、アミノ酸変更は、ポリペプチドの物理化学的性質が改変されるような性質のものである。例えば、アミノ酸変更は、ポリペプチドの熱安定性を向上させ、基質特異性を改変し、最適ｐＨを変更するようなものなどであってよい。
ポリペプチド中の必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発またはアラニンスキャニング突然変異誘発などの技術分野において公知である手法に準拠して同定することが可能である（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５）。後者の技術においては、単一のアラニン突然変異が分子中のすべての残基に導入され、得られるミュータント分子は、分子の活性に重要であるアミノ酸残基を同定するためにキシラナーゼ活性についてテストされる。また、Ｈｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９−４７０８を参照のこと。酵素の活性部位または他の生物学的相互作用はまた、推定される接触部位アミノ酸の突然変異との組み合わせにより、核磁気共嗚、結晶構造解析、電子回折、または、光親和性標識などの技術によって測定される構造の物理的分析によって判定可能である。例えば、ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４；Ｗｌｏｄａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３０９：５９−６４を参照のこと。必須アミノ酸の同一性はまた、関連するポリペプチドとのアライメントから推定可能である。
ある実施形態において、変異体は親酵素と比較して熱安定性が向上している。
一実施形態において、本発明は、キシラナーゼ活性を有するキシラナーゼ変異体に関し、ここで：
（ａ）キシラナーゼ変異体は、配列番号１の位置２４、２６、３６、３７、６０、７１、７４、７５、７６、１２４、１３３、１５５、１６７、２０８、３１７、および３２１に対応する１つ以上の位置に置換を含み；
（ｂ）キシラナーゼ変異体は、配列番号１に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有し；および
（ｃ）キシラナーゼ変異体は親キシラナーゼと比較して熱安定性が向上している。
一実施形態において、本発明は、キシラナーゼ活性を有するキシラナーゼ変異体に関し、ここで：
（ａ）キシラナーゼ変異体は、配列番号１の位置２４、２６、６０、７１、７４、７５、７６、１５５、２０８、３１７、および３２１に対応する１つ以上の位置に置換を含み；
（ｂ）キシラナーゼ変異体は、配列番号１に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有し；および
（ｃ）キシラナーゼ変異体は親キシラナーゼと比較して熱安定性が向上している。
一実施形態において、本発明は、キシラナーゼ活性を有するキシラナーゼ変異体に関し、ここで：
（ａ）キシラナーゼ変異体は、Ｈ２４Ｗ、Ａ２６Ｅ、Ｒ３６Ｌ、Ｒ３６Ｔ、Ｅ３７Ｔ、Ｒ６０Ｎ、Ｋ７１Ｔ、Ｋ７１Ｉ、Ｖ７４Ｌ、Ｖ７４Ｉ、Ｋ７５Ｎ、Ｋ７５Ｌ、Ｈ７６Ｌ、Ｉ１５５Ｍ、Ｎ１６７Ｅ、Ｖ２０８Ｌ、Ｓ３１７ＤおよびＧ３２１Ａからなる群から選択される１つ以上の置換を含み、ここで位置は配列番号１の位置に対応し；
（ｂ）キシラナーゼ変異体は、配列番号１に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有し；および
（ｃ）キシラナーゼ変異体は親キシラナーゼと比較して熱安定性が向上している。
一実施形態において、本発明は、キシラナーゼ活性を有するキシラナーゼ変異体に関し、ここで：
（ａ）キシラナーゼ変異体は、Ｈ２４Ｗ、Ａ２６Ｅ、Ｒ６０Ｎ、Ｋ７１Ｔ、Ｋ７１Ｉ、Ｖ７４Ｌ、Ｖ７４Ｉ、Ｋ７５Ｎ、Ｋ７５Ｌ、Ｈ７６Ｌ、Ｉ１５５Ｍ、Ｖ２０８Ｌ、Ｓ３１７Ｄ、Ｇ３２１Ａ、Ｒ３６Ｔ＋Ｉ１５５Ｍ、Ｒ３６Ｌ＋Ｉ１５５Ｍ、Ｉ１５５Ｍ＋Ｎ１６７Ｅ、Ｒ３６Ｔ＋Ｖ２０８Ｌ、Ｒ３６Ｌ＋Ｖ２０８Ｌ、Ｎ１６７Ｅ＋Ｖ２０８Ｌ、Ｅ３７Ｔ＋Ｖ２０８ＬおよびＲ３６Ｔ＋Ｅ３７Ｔからなる群から選択される１つ以上の置換を含み、ここで位置は配列番号１の位置に対応し；
（ｂ）キシラナーゼ変異体は、配列番号１に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有し；および
（ｃ）キシラナーゼ変異体は親キシラナーゼと比較して熱安定性が向上している。
一実施形態において、親キシラナーゼは配列番号１である。
親キシラナーゼ
ある実施形態において、親キシラナーゼは、分類上の目、バチルス目（Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）、好ましくは分類上の科、バチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）から、またはより好ましくは、属、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）またはパエニバチルス・パブリ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｂｕｌｉ）から得られる、または得ることが可能である。一実施形態において、親キシラナーゼは、分類上の目、バチルス目（Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）、好ましくは分類上の科、バチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）から得られる、または得ることが可能であり、配列番号１と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する。
ある実施形態において、親キシラナーゼはＧＨ３０サブファミリー８キシラナーゼである。ある実施形態において、親キシラナーゼは、本明細書において以下に記載するような、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＧＨ３０サブファミリー８キシラナーゼである。一実施形態において、親キシラナーゼは、配列番号１または配列番号４、好ましくは配列番号１など、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＧＨ３０サブファミリー８キシラナーゼである。一実施形態において、親キシラナーゼは、配列番号２または配列番号６など、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＧＨ３０サブファミリー８キシラナーゼである。一実施形態において、親キシラナーゼは、配列番号３など、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＧＨ３０サブファミリー８キシラナーゼである。別の態様において、親キシラナーゼは、本明細書において以下に記載するような、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）ＧＨ３０サブファミリー８キシラナーゼである。一実施形態において、親キシラナーゼは、配列番号５など、パエニバチルス・パブリ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｂｕｌｉ）ＧＨ３０サブファミリー８キシラナーゼである。
親キシラナーゼは、（ａ）キシラナーゼ活性を有する、配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドであってもよい。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号１と１０アミノ酸以下、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸だけ異なる。別の態様において、親は、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、またはこれから成る。別の態様において、親は、キシラナーゼ活性を有する配列番号１の断片である。
親キシラナーゼは、（ａ）キシラナーゼ活性を有する、配列番号２と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドであってもよい。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号２と１０アミノ酸以下、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸だけ異なる。別の態様において、親は、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、またはこれから成る。別の態様において、親は、キシラナーゼ活性を有する配列番号２の断片である。
親キシラナーゼは、（ａ）キシラナーゼ活性を有する、配列番号３と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドであってもよい。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号３と１０アミノ酸以下、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸だけ異なる。別の態様において、親は、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、またはこれから成る。別の態様において、親は、キシラナーゼ活性を有する配列番号３の断片である。
親キシラナーゼは、（ａ）キシラナーゼ活性を有する、配列番号４と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドであってもよい。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号４と１０アミノ酸以下、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸だけ異なる。別の態様において、親は、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、またはこれから成る。別の態様において、親は、キシラナーゼ活性を有する配列番号４の断片である。
親キシラナーゼは、（ａ）キシラナーゼ活性を有する、配列番号５と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドであってもよい。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号５と１０アミノ酸以下、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸だけ異なる。別の態様において、親は、配列番号５のアミノ酸配列を含むか、またはこれから成る。別の態様において、親は、キシラナーゼ活性を有する配列番号５の断片である。
親キシラナーゼは、（ａ）キシラナーゼ活性を有する、配列番号６と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドであってもよい。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号６と１０アミノ酸以下、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸だけ異なる。別の態様において、親は、配列番号６のアミノ酸配列を含むか、またはこれから成る。別の態様において、親は、キシラナーゼ活性を有する配列番号６の断片である。
他の親キシラナーゼは、以下のＧＥＮＥＳＥＱＰ受託番号のうちの１つであってもよい：
ＢＣＭ０３６９０、ＢＢＹ２５４４１、ＢＢＤ４３８３３、ＡＺＧ８７７６０、ＢＢＷ７５０９０、ＢＣＭ０３６８２、ＢＢＷ９６６７５、ＢＣＭ０３６７１、ＡＤＪ３５０２２、ＢＢＷ８３５２５、ＢＣＭ０３６８５、ＢＢＷ８８０３１、ＢＣＭ０３７０７、ＡＺＨ７０２３８、ＡＺＧ８７７６６、ＢＢＸ３６７４８、ＢＣＭ０３６８６、ＡＺＱ２３４７７、ＢＣＭ０３６７７、ＢＣＭ０３６９１、ＢＣＭ０３６８１、ＢＣＭ０３６７６、ＢＣＭ０３６８８、ＡＺＧ６８５５８、ＡＤＪ３５０２８、ＢＣＭ０３６８７、ＢＢＧ８０９６４、ＡＺＸ６６６４７、ＡＺＨ７０２４４、ＢＣＭ０３６８９、ＡＺＭ９５９０３、ＢＢＷ７９３１４、ＢＢＸ４７０４９、ＢＣＭ０３６８３、ＢＣＭ０３６７９、ＢＢＷ９５８４０、ＢＢＸ５２４０１、ＢＢＷ９２２４６、ＢＢＸ４２０６３およびＡＺＧ６８５５２。
他の親キシラナーゼは、以下のＵｎｉｐｒｏｔ受託番号のうちの１つであってもよい：Ａ０Ａ０１６ＱＩＴ０、Ａ０Ａ０２４ＢＥＮ２、Ａ０Ａ０５９Ｎ８Ｐ２、Ａ０Ａ０６０Ｊ１Ｑ４、Ａ０Ａ０６０Ｊ３Ｎ３、Ａ０Ａ０６０ＭＤＰ８、Ａ０Ａ０６３ＸＥＢ２、Ａ０Ａ０６３Ｚ３Ｆ５、Ａ０Ａ０６６ＺＱＨ２、Ａ０Ａ０６８ＱＧ８０、Ａ０Ａ０６９ＤＪＡ１、Ａ０Ａ０７４ＱＡ１６、Ａ０Ａ０７６ＧＨ６２、Ａ０Ａ０７６Ｘ０９５、Ａ０Ａ０８０ＵＧＩ０、Ａ０Ａ０８１ＤＲＨ７、Ａ０Ａ０８１Ｌ９Ｐ３、Ａ０Ａ０８５ＣＣＱ４、Ａ０Ａ０８６ＤＲＴ４、Ａ０Ａ０８６ＳＧＣ４、Ａ０Ａ０８６ＷＷＴ９、Ａ０Ａ０８９Ｊ０Ｔ９、Ａ０Ａ０８９Ｌ７Ｑ４、Ａ０Ａ０８９ＬＳ３０、Ａ０Ａ０８９ＭＡ９６、Ａ０Ａ０８９ＭＭＹ５、Ａ０Ａ０９０ＺＹ１８、Ａ０Ａ０９３ＵＧ９６、Ａ０Ａ０９７ＲＥＴ６、Ａ０Ａ０９７ＲＴ５７、Ａ０Ａ０Ａ０ＴＪＸ０、Ａ０Ａ０Ａ０ＴＳ０５、Ａ０Ａ０Ａ１ＳＴＢ１、Ａ０Ａ０Ａ７ＧＬＺ８、Ａ０Ａ０Ａ８Ｃ３Ｖ５、Ａ０Ａ０Ｂ０ＱＧＩ０、Ａ０Ａ０Ｂ４Ｓ８４１、Ａ０Ａ０Ｃ２ＴＭＺ１、Ａ０Ａ０Ｃ５ＣＹＤ２、Ａ０Ａ０Ｄ７ＸＨＬ０、Ａ０Ａ０Ｄ７ＸＰＶ８、Ａ０Ａ０Ｄ８ＪＪＷ７、Ａ０Ａ０Ｅ１ＬＮＧ３、Ａ０Ａ０Ｅ１Ｐ２Ｔ５、Ａ０Ａ０Ｆ５ＭＣＱ０、Ａ０Ａ０Ｆ５ＹＵＶ２、Ａ０Ａ０Ｇ２Ｍ１Ｖ３、Ａ０Ａ０Ｇ２Ｚ０９９、Ａ０Ａ０Ｇ３ＶＤＰ８、Ａ０Ａ０Ｈ１ＲＷ５１、Ａ０Ａ０Ｈ３ＤＺＣ９、Ａ０Ａ０Ｊ１ＨＮＥ５、Ａ０Ａ０Ｊ１Ｉ８Ｓ６、Ａ０Ａ０Ｊ５ＸＢＢ３、Ａ０Ａ０Ｊ６Ｅ３Ｈ１、Ａ０Ａ０Ｊ６ＥＮＹ２、Ａ０Ａ０Ｊ６ＭＺ８１、Ａ０Ａ０Ｊ６ＰＴＴ５、Ａ０Ａ０Ｋ０ＨＹＬ４、Ａ０Ａ０Ｋ６ＪＺ６２、Ａ０Ａ０Ｋ６Ｌ１Ｅ５、Ａ０Ａ０Ｋ６Ｌ５Ｃ０、Ａ０Ａ０Ｋ６ＬＲＣ５、Ａ０Ａ０Ｋ６ＭＢＺ９、Ａ０Ａ０Ｋ９ＥＩ７９、Ａ０Ａ０Ｋ９Ｇ２Ｍ８、Ａ０Ａ０Ｌ６Ｃ９Ｎ３、Ａ０Ａ０Ｌ７ＭＴ０５、Ａ０Ａ０Ｌ７ＳＧＬ４、Ａ０Ａ０Ｍ０ＨＢＴ０、Ａ０Ａ０Ｍ２ＥＩ３６、Ａ０Ａ０Ｍ２Ｓ６Ｅ２、Ａ０Ａ０Ｍ９Ｘ３６９、Ａ０Ａ０Ｐ０ＴＫＮ９、Ａ０Ａ０Ｐ７ＧＣ５１、Ａ０Ａ０Ｑ３Ｗ７Ｔ１、Ａ０Ａ０Ｑ４Ｒ８Ｉ７、Ａ０Ａ０Ｑ７ＳＤＳ０、Ａ０Ａ０Ｒ３Ｋ８７３、Ａ０Ａ０Ｔ６ＬＤ５４、Ａ０Ａ０Ｕ３Ｍ２２６、Ａ０Ａ０Ｕ５Ｑ０００、Ａ０Ａ０Ｖ８ＱＮ０６、Ａ０Ａ０Ｖ８ＱＰＱ０、Ａ０Ａ０Ｖ８ＲＣＫ０、Ａ０Ａ０Ｗ１Ｑ０Ｙ８、Ａ０Ａ０Ｗ７ＸＩ４８、Ａ０Ａ０Ｗ８Ｋ８３０、Ａ０Ａ０Ｘ１ＴＣＲ２、Ａ０Ａ０Ｘ８Ｃ７Ｋ８、Ａ０Ａ０Ｘ８ＤＨＮ５、Ａ０Ａ０Ｘ８ＫＤＨ２、Ａ０Ａ０Ｘ９ＬＢＮ０、Ａ０Ａ１０１ＹＣ９２、Ａ０Ａ１０１ＹＬ９７、Ａ０Ａ１１７ＳＺＰ６、Ａ０Ａ１２４ＪＱＭ２、Ａ０Ａ１２５ＵＩＦ６、Ａ０Ａ１２７ＤＱＺ４、Ａ０Ａ１３２ＢＰ８０、Ａ０Ａ１３２ＴＧＵ４、Ａ０Ａ１３２ＴＳＱ５、Ａ０Ａ１３６ＡＥＢ９、Ａ０Ａ１４２Ｆ５８６、Ａ０Ａ１５０Ｌ２Ｙ６、Ａ０Ａ１６０ＥＨＤ０、Ａ０Ａ１６４ＸＭＮ２、Ａ０Ａ１７２ＨＮＷ１、Ａ０Ａ１７２ＸＩＲ５、Ａ０Ａ１９９ＮＩ６３、Ａ０Ａ１９９ＷＨＴ５、Ａ０Ａ１Ａ０ＣＣ４４、Ａ０Ａ１Ａ０Ｇ７Ｑ３、Ａ０Ａ１Ａ５ＶＶ２３、Ａ０Ａ１Ａ５ＹＬＤ９、Ａ０Ａ１Ａ７ＬＫＦ３、Ａ０Ａ１Ｂ２ＡＷ７６、Ａ０Ａ１Ｃ３ＳＩＴ４、Ａ０Ａ１Ｃ４ＡＨＧ６、Ａ０Ａ１Ｄ９ＰＫ７８、Ａ０Ａ１Ｅ４Ｙ０Ｆ１、Ａ０Ａ１Ｇ９ＭＡＤ１、Ａ０Ａ１Ｊ０ＢＢＰ６、Ａ０Ａ１Ｊ０Ｃ７Ｉ７、Ａ０Ａ１Ｊ５ＷＲＣ５、Ａ０Ａ１Ｊ６Ｆ１Ｄ５、Ａ０Ａ１Ｋ１ＴＢＡ７、Ａ０Ａ１Ｌ３ＰＴ４５、Ａ０Ａ１Ｌ３ＱＹＩ６、Ａ０Ａ１Ｌ３ＳＨ５２、Ａ０Ａ１Ｌ４ＤＭ２０、Ａ０Ａ１Ｌ５ＬＮＵ４、Ａ０Ａ１Ｌ６ＣＥＭ３、Ａ０Ａ１Ｌ６ＺＬＮ８、Ａ０Ａ１Ｌ６ＺＴＤ９、Ａ０Ａ１Ｍ７ＳＭＭ４、Ａ０Ａ１Ｎ６Ｓ５００、Ａ０Ａ１Ｎ７Ｂ９３０、Ａ０Ａ１Ｎ７Ｅ７Ｅ０、Ａ０Ａ１Ｒ１Ｅ８Ｇ３、Ａ０Ａ１Ｒ１ＥＳＪ７、Ａ０Ａ１Ｒ１ＦＱ７７、Ａ０Ａ１Ｒ１ＧＢＫ８、Ａ０Ａ１Ｒ１ＧＴ０２、Ａ０Ａ１Ｒ１ＨＨ７７、Ａ０Ａ１Ｓ２Ｆ２Ｒ２、Ａ０Ａ１Ｕ３ＵＬＶ５、Ａ７Ｚ５Ａ１、Ａ８ＦＤＶ２、Ｂ３ＫＦ３８、Ｄ１ＭＥＰ８、Ｄ３ＥＨ０２、Ｄ４ＦＸＣ２、Ｅ０ＲＤＵ２、Ｅ１ＡＣＦ９、Ｅ１ＵＶ０３、Ｅ３Ｅ３２２、Ｅ８ＶＪ４５、Ｆ４Ｅ４Ｂ０、Ｆ４ＥＫＵ６、Ｇ０ＩＫＷ９、Ｇ４ＥＶＱ６、Ｇ４ＨＧＬ４、Ｇ４Ｐ７Ｆ１、Ｇ７Ｗ２Ｊ１、Ｈ０ＦＮＮ１、Ｈ１ＡＣＺ７、Ｈ２ＡＪ５４、Ｈ３Ｋ３５２、Ｈ６ＣＰＪ０、Ｈ６ＷＣＺ０、Ｈ８ＸＭＲ３、Ｉ４ＸＢ６４、Ｊ０Ｘ３Ｖ６、Ｊ７ＪＶＺ４、Ｋ２ＨＪＴ３、Ｋ２Ｐ３Ｈ７、Ｌ０ＢＬＺ３、Ｌ０ＣＹ７２、Ｌ８ＡＫＢ２、Ｍ１ＫＪＴ１、Ｍ１Ｕ２Ｊ５、Ｍ１ＸＡＵ４、Ｍ２Ｕ９Ｎ８、Ｎ０ＤＦＩ８、Ｑ４５０７０、Ｑ６ＹＫ３７、Ｑ７０Ｋ０２、Ｒ９ＴＹＮ３、Ｓ６ＦＳ４０、Ｓ６ＦＸＳ９、Ｕ１Ｔ３６２、Ｕ１ＺＣ４４、Ｕ２ＴＭ９０、Ｕ４ＰＬ９９、Ｕ５Ｘ５Ｂ８、Ｖ５ＭＲＵ９、Ｖ７Ｑ６Ｍ１、Ｖ９ＲＥＹ３、Ｗ４ＡＺＨ７、Ｗ４ＢＸＩ４、Ｗ４Ｃ６Ｘ９、Ｗ４Ｄ８０１、Ｗ４ＤＥＬ３、Ｗ８ＩＬＧ７およびＷ９ＴＦＴ６。
ポリペプチドは、あるポリペプチドの領域が他のポリペプチドの領域のＮ末端またはＣ末端で融合したハイブリッドポリペプチドであり得る。
親は、他のポリペプチドが本発明のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合した融合ポリペプチドまたは切断可能な融合ポリペプチドであり得る。融合ポリペプチドは、他のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを本発明のポリヌクレオチドに融合させることにより生成される。融合ポリペプチドを生成する技術は技術分野において公知であり、フレーム中にあるよう、また、融合ポリペプチドの発現が同一のプロモータおよびターミネータの制御下にあるよう、ポリペプチドをコードするコード配列を結合することなどである。融合ポリペプチドはまた、融合ポリペプチドが翻訳後に形成されるインテインテクノロジーを用いて構築され得る（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，ＥＭＢＯ Ｊ．１２：２５７５−２５８３；Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：７７６−７７９）。
融合ポリペプチドは、２つのポリペプチド間に切断部位をさらに含んでいることが可能である。融合タンパク質を分泌すると、この部位が切断されて、２つのポリペプチドが放出される。切断部位の例としては、これらに限定されないが、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：５６８−５７６；Ｓｖｅｔｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６：２４５−２５１；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ−Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：３４８８−３４９３；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：４９８−５０３；および、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：３７８−３８１；Ｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：５０５−５１２；Ｃｏｌｌｉｎｓ−Ｒａｃｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：９８２−９８７；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：２４０−２４８；および、Ｓｔｅｖｅｎｓ，２００３，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｌｄ ４：３５−４８において開示されている部位が挙げられる。
親は、すべての種類の微生物から得られてもよい。本発明の目的のために、「〜から得られる」という用語は、本明細書において用いられるところ、所与のソースに関連して、ポリヌクレオチドによってコードされる親は、ソースによって生成されるか、または、ソースからのポリヌクレオチドが挿入された系統によって生成されることを意味すべきである。一態様において、親は、細胞外で分泌される。
ポリペプチドは細菌性ポリペプチドであってもよい。例えば、ポリペプチドは、キシラナーゼ活性を有するバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、またはストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ポリペプチドなど、グラム陽性菌ポリペプチドであってもよい。一実施形態において、ポリペプチドは、バチルス綱（Ｂａｃｉｌｌｉ）の細菌からのもの、例えば、バチルス目（Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）からのもの、またはパエニバチルス科（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）からのもの、またはパエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）からのもの、またはパエニバチルス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ）−１９１７９またはパエニバチルス・パナシソリ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｎａｃｉｓｏｌｉ）種からのものである。
別の実施形態において、ポリペプチドは、クロストリジウム綱（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）の細菌からのもの、例えば、クロストリジウム目（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ）からのもの、またはクロストリジウム科（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ）からのもの、またはクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）からのもの、またはクロストリジウム・サッカロブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）種からのものである。
別の実施形態において、ポリペプチドは、クロストリジウム綱（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）の細菌からのもの、例えば、クロストリジウム目（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ）からのもの、またはルミノコッカス科（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）からのもの、またはルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）からのもの、またはルミノコッカス属種（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＣＡＧ：３３０からのものである。
別の実施形態において、ポリペプチドは、ガンマプロテオバクテリア綱（Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）の細菌からのもの、例えば、アルテロモナス目（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）からのもの、またはシュードアルテロモナス科（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）からのもの、またはシュードアルテロモナス属（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）からのもの、またはシュードアルテロモナス・テトラオドニス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｔｅｔｒａｏｄｏｎｉｓ）種からのものである。
別の実施形態において、ポリペプチドは、ガンマプロテオバクテリア綱（Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）の細菌からのもの、例えば、エンテロバクター目（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）からのもの、または腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）からのもの、またはペクトバクテリウム属（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）からのもの、またはペクトバクテリウム・カロトボラム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）種からのものである。
別の実施形態において、ポリペプチドは、放線菌綱（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）の細菌からのもの、例えば、ストレプトミセス目（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）からのもの、またはストレプトミセス科（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）からのもの、またはストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）からのもの、またはストレプトミセス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ）−６２６２７からのものである。
別の実施形態において、ポリペプチドは、ガンマプロテオバクテリア綱（Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）の細菌からのもの、例えば、ビブリオ目（Ｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ）からのもの、またはビブリオ科（Ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ）からのもの、またはビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）からのもの、またはビブリオ・リゾスフェラエ（Ｖｉｂｒｉｏ ｒｈｉｚｏｓｐｈａｅｒａｅ）種からのものである。
一態様において、親は、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、またはバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）キシラナーゼである。
別の態様において、親は、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ）、またはストレプトコッカス・エクイ亜種ゾエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｓｕｂｓｐ．Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）キシラナーゼである。
別の態様において、親は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）キシラナーゼ、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するキシラナーゼである。
上に挙げた種に関して、本発明が、完全および不完全な状態の両方を含み、また、それらが知られている種の名称にかかわらず、他の分類学上の均等物、例えば、アナモルフを包含することは理解されよう。当業者であれば、適切な均等物の同一性を容易に認識されよう。
これらの種の系統は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ドイツ微生物細胞培養コレクション（ＤＳＭＺ：Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ）、オランダ微生物株保存センター（ＣＢＳ：Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ Ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）、および、農業研究局特許培養物コレクション（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｐａｔｅｎｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、北方リサーチセンター（ＮＲＲＬ：Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）などの多数の微生物保存機関において公共に容易に利用可能である。
親は、上記のプローブを用いて、自然（例えば、汚染物、コンポスト、水等）から単離された微生物、または、天然材料（例えば、汚染物、コンポスト、水等）から直接的に得られたＤＮＡサンプルを含む他のソースから同定および得られ得る。微生物およびＤＮＡを自然環境から直接的に単離する技術は技術分野において周知である。次いで、親をコードするポリヌクレオチドは、他の微生物または混合ＤＮＡサンプルのゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリを同じようにスクリーニングすることにより得られ得る。一旦、親をコードするポリヌクレオチドがプローブで検出されたら、ポリヌクレオチドは、当業者に公知の技術（例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照のこと）を利用することにより単離またはクローン化され得る。
変異体の調製
本発明はまた、キシラナーゼ活性を有する変異体を入手する方法にも関し、この方法は、（ａ）親キシラナーゼに、配列番号１の位置２４、２６、３６、３７、６０、７１、７４、７５、７６、１２４、１３３、１５５、１６７、２０８、３１７、および３２１に対応する１つ以上の（例えば数個の）位置で置換を導入するステップであって、変異体がキシラナーゼ活性を有するステップと；（ｂ）変異体を回収するステップとを含む。ある実施形態において、変異体は、配列番号１と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する。ある実施形態において、親キシラナーゼは、配列番号１と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する。一実施形態において、置換は、Ｈ２４Ｗ、Ａ２６Ｅ、Ｒ３６Ｌ、Ｒ３６Ｔ、Ｅ３７Ｔ、Ｒ６０Ｎ、Ｋ７１Ｔ、Ｋ７１Ｉ、Ｖ７４Ｌ、Ｖ７４Ｉ、Ｋ７５Ｎ、Ｋ７５Ｌ、Ｈ７６Ｌ、Ｉ１５５Ｍ、Ｎ１６７Ｅ、Ｖ２０８Ｌ、Ｓ３１７ＤおよびＧ３２１Ａからなる群から選択される。本発明はさらに、本明細書に記載される方法によって作製されたキシラナーゼ変異体に関する。
一実施形態において、本発明は、キシラナーゼ活性を有し、かつ親キシラナーゼと比較して熱安定性が向上している変異体を入手する方法に関し、ここで親キシラナーゼはＧＨ３０サブファミリー８キシラナーゼであり、この方法は、（ａ）親キシラナーゼに、２４、２６、３６、３７、６０、７１、７４、７５、７６、１２４、１３３、１５５、１６７、２０８、３１７、および３２１からなる群から選択される１つ以上の（例えば数個の）位置（位置は配列番号１の位置に対応する）で置換を導入するステップであって、変異体が配列番号１と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するステップと；（ｂ）変異体を回収するステップとを含む。ある実施形態において、親キシラナーゼは、配列番号１と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する。一実施形態において、置換は、Ｈ２４Ｗ、Ａ２６Ｅ、Ｒ３６Ｌ、Ｒ３６Ｔ、Ｅ３７Ｔ、Ｒ６０Ｎ、Ｋ７１Ｔ、Ｋ７１Ｉ、Ｖ７４Ｌ、Ｖ７４Ｉ、Ｋ７５Ｎ、Ｋ７５Ｌ、Ｈ７６Ｌ、Ｉ１５５Ｍ、Ｎ１６７Ｅ、Ｖ２０８Ｌ、Ｓ３１７ＤおよびＧ３２１Ａからなる群から選択される。本発明はさらに、本明細書に記載される方法によって作製されたキシラナーゼ変異体に関する。
一実施形態において、本発明は、キシラナーゼ活性を有し、かつ親キシラナーゼと比較して熱安定性が向上している変異体を入手する方法に関し、ここで親キシラナーゼは配列番号１と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有し、この方法は、（ａ）親キシラナーゼに、配列番号１の２４、２６、３６、３７、６０、７１、７４、７５、７６、１２４、１３３、１５５、１６７、２０８、３１７、および３２１からなる群から選択される１つ以上の（例えば数個の）位置で置換を導入するステップであって、変異体が配列番号１と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％を有するステップと；（ｂ）変異体を回収するステップとを含む。一実施形態において、置換は、Ｈ２４Ｗ、Ａ２６Ｅ、Ｒ３６Ｌ、Ｒ３６Ｔ、Ｅ３７Ｔ、Ｒ６０Ｎ、Ｋ７１Ｔ、Ｋ７１Ｉ、Ｖ７４Ｌ、Ｖ７４Ｉ、Ｋ７５Ｎ、Ｋ７５Ｌ、Ｈ７６Ｌ、Ｉ１５５Ｍ、Ｎ１６７Ｅ、Ｖ２０８Ｌ、Ｓ３１７ＤおよびＧ３２１Ａからなる群から選択される。本発明はさらに、本明細書に記載される方法によって作製されたキシラナーゼ変異体に関する。
一実施形態において、本発明は、キシラナーゼ活性を有し、かつ親キシラナーゼと比較して熱安定性が向上している変異体を入手する方法に関し、ここで親キシラナーゼは配列番号２と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有し、この方法は、（ａ）親キシラナーゼに、配列番号２の２４、２６、３６、３７、６０、７１、７４、７５、７６、１２４、１３３、１５５、１６７、２０８、３１７、および３２１からなる群から選択される１つ以上の（例えば数個の）位置で置換を導入するステップであって、変異体が配列番号２と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するステップと；（ｂ）変異体を回収するステップとを含む。
一実施形態において、本発明は、キシラナーゼ活性を有し、かつ親キシラナーゼと比較して熱安定性が向上している変異体を入手する方法に関し、ここで親キシラナーゼは配列番号３と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有し、この方法は、（ａ）親キシラナーゼに、配列番号３の２４、２６、３６、３７、６０、７１、７４、７５、７６、１２４、１３３、１５５、１６７、２０８、３１７、および３２１からなる群から選択される１つ以上の（例えば数個の）位置で置換を導入するステップであって、変異体が配列番号３と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するステップと；（ｂ）変異体を回収するステップとを含む。
一実施形態において、本発明は、キシラナーゼ活性を有し、かつ親キシラナーゼと比較して熱安定性が向上している変異体を入手する方法に関し、ここで親キシラナーゼは配列番号４と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有し、この方法は、（ａ）親キシラナーゼに、配列番号４の２４、２６、３６、３７、６０、７１、７４、７５、７６、１２４、１３３、１５５、１６７、２０８、３１７、および３２１からなる群から選択される１つ以上の（例えば数個の）位置で置換を導入するステップであって、変異体が配列番号４と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するステップと；（ｂ）変異体を回収するステップを含むと。
一実施形態において、本発明は、キシラナーゼ活性を有し、かつ親キシラナーゼと比較して熱安定性が向上している変異体を入手する方法に関し、ここで親キシラナーゼは配列番号５と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有し、この方法は、（ａ）親キシラナーゼに、配列番号５の２４、２６、３６、３７、６０、７１、７４、７５、７６、１２４、１３３、１５５、１６７、２０８、３１７、および３２１からなる群から選択される１つ以上の（例えば数個の）位置で置換を導入するステップであって、変異体が配列番号５と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するステップと；（ｂ）変異体を回収するステップとを含む。
一実施形態において、本発明は、キシラナーゼ活性を有し、かつ親キシラナーゼと比較して熱安定性が向上している変異体を入手する方法に関し、ここで親キシラナーゼは配列番号６と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有し、この方法は、（ａ）親キシラナーゼに、配列番号６の２４、２６、３６、３７、６０、７１、７４、７５、７６、１２４、１３３、１５５、１６７、２０８、３１７、および３２１からなる群から選択される１つ以上の（例えば数個の）位置で置換を導入するステップであって、変異体が配列番号６と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するステップと；（ｂ）変異体を回収するステップとを含む。
変異体は、部位特異的突然変異誘発、合成遺伝子構築、半合成遺伝子構築、無作為突然変異誘発、シャッフリング等などの技術分野において公知であるいずれかの突然変異誘発法を用いて調製可能である。
部位特異的突然変異誘発は、親をコードするポリヌクレオチドにおける１つまたは複数の規定の部位で１つまたは複数（例えば、いくつか）の突然変異を導入する技術である。
部位特異的突然変異誘発は、所望の突然変異を含有するオリゴヌクレオチドプライマーが使用されるＰＣＲによってインビトロで達成されることが可能である。部位特異的突然変異誘発はまた、親をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドにおける部位が制限酵素により切断され、および、その後、ポリヌクレオチドに突然変異を含有するオリゴヌクレオチドが連結されるカセット式突然変異誘発によってインビトロで行われることが可能である。通常、プラスミドおよびオリゴヌクレオチドを消化する制限酵素は同一であり、プラスミドの付着末端と挿入断片とを互いに連結させる。例えば、Ｓｃｈｅｒｅｒ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：４９４９−４９５５；および、Ｂａｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：７３４９−４９６６を参照のこと。
部位特異的突然変異誘発はまた、技術分野において公知である方法によってインビボで達成可能である。例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１１５４号明細書；Ｓｔｏｒｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：７７３−７７６；Ｋｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：２８５−２９０；および、Ｃａｌｉｓｓａｎｏ ａｎｄ Ｍａｃｉｎｏ，１９９６，Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ．Ｎｅｗｓｌｅｔｔ．４３：１５−１６を参照のこと。
いずれかの部位特異的突然変異誘発法が本発明において用いられることが可能である。変異体の調製に用いられることが可能である多くの市販のキットが入手可能である。
合成遺伝子構築には、対象のポリペプチドをコードするための設計されたポリヌクレオチド分子のインビトロ合成が伴う。遺伝子合成は、Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２００４，Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１０５０−１０５４）により記載されている多重マイクロチップ系テクノロジー、ならびに、オリゴヌクレオチドが合成されると共に光による制御が可能なマイクロ流体チップにアセンブルされる同様のテクノロジーなどの多数の技術を利用して行うことが可能である。
単一もしくは複数のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入は、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５３−５７；Ｂｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２１５２−２１５６；国際公開第９５／１７４１３号パンフレット；または、国際公開第９５／２２６２５号パンフレットにより開示されているものなどの公知の突然変異誘発方法、組換え法、および／または、シャッフリング法、これに続く関連するスクリーニング法を用いて行い、テストすることが可能である。用いられることが可能である他の方法としては、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０８３２−１０８３７；米国特許第５，２２３，４０９号明細書；国際公開第９２／０６２０４号パンフレット）、および、領域特異的突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ ４６：１４５；Ｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＤＮＡ ７：１２７）が挙げられる。
突然変異誘発／シャッフリング法は、宿主細胞によって発現されたクローン化突然変異誘発ポリペプチドの活性を検出するために、高スループット自動スクリーニング法と組み合わせることが可能である（Ｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：８９３−８９６）。活性ポリペプチドをコードする突然変異誘発ＤＮＡ分子は、宿主細胞から回収可能であり、技術分野における標準的な方法を用いて直ぐに配列決定されることが可能である。これらの方法では、ポリペプチドにおける個別のアミノ酸残基の重要性を直ぐに判定することが可能である。
半合成遺伝子構築は、合成遺伝子構築および／または部位特異的突然変異誘発および／またはランダム突然変異誘発および／またはシャッフリングの態様を組み合わせることにより達成される。半合成構築は、ＰＣＲ技術と組み合わされる、合成されたポリヌクレオチド断片を利用するプロセスに代表される。それ故、遺伝子の定義された領域が新たに合成され得、一方で、他の領域が部位特異的突然変異誘発性プライマーを用いて増幅され得、一方で、さらに他の領域がエラープローンＰＣＲまたは非エラープローンＰＣＲ増幅に供され得る。次いで、ポリヌクレオチドサブ配列がシャッフルされ得る。
ポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明の変異体をコードする単離されたポリヌクレオチドにも関する。
核酸構築物
本発明はまた、制御配列と適合性のある条件下で好適な宿主細胞においてコード配列の発現をもたらす１つまたは複数の制御配列と作動可能に結合した本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関する。
ポリヌクレオチドは、変異体の発現をもたらすために多様な方法で操作され得る。ベクターへの挿入に先立つポリヌクレオチドの操作が、発現ベクターに応じて望ましいか、必要であり得る。組換えＤＮＡ法を利用するポリヌクレオチドの改変技術が技術分野において周知である。
制御配列は、ポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識されるポリヌクレオチドである、プロモータであり得る。プロモータは、変異体の発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモータは、ミュータント、切断型および雑種プロモータを含む宿主細胞において転写活性を示すいずれかのポリヌクレオチドであり得、ならびに、宿主細胞に対して相同性または非相同性である細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る。
細菌性宿主細胞における本発明の核酸構築物の転写をもたらす好適なプロモータの例は、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）レバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子（Ａｇａｉｓｓｅ ａｎｄ Ｌｅｒｅｃｌｕｓ，１９９４，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １３：９７−１０７）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃオペロン、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔｒｃプロモータ（Ｅｇｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）、ストレプトマイセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）および原核β−ラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：３７２７−３７３１）、ならびに、ｔａｃプロモータ（ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１−２５）から得られるプロモータである。さらなるプロモータが、“Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ”，Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ２４２：７４−９４；および、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，ｓｕｐｒａに記載されている。タンデムプロモータの例が国際公開第９９／４３８３５号パンフレットに開示されている。
糸状真菌宿主細胞において本発明の核酸構築物の転写をもたらす好適なプロモータの例を以下に挙げる：アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）酸性安定性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）もしくはアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）アルカリ性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ、フサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ（国際公開第９６／００７８７号パンフレット）、フサリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）アミログルコシダーゼ（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フサリウム・ベネナツム・ダリア（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ Ｄａｒｉａ） （国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フサリウム・ベネナツム・クイン（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ Ｑｕｉｎｎ） （国際公開第００／５６９００号パンフレット）、リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテアーゼ、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）β−グルコシダーゼ、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドラーゼＩ、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドラーゼＩＩ、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＶ、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩ、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）β−キシロシダーゼ、ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモータ（非翻訳リーダーが、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子由来の非翻訳リーダーにより置換されたアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）中性α−アミラーゼ遺伝子；非制限的例として、非翻訳リーダーが、アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子由来の非翻訳リーダーにより置換されたアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼがある）；ならびにこれらのミュータント、切断型、およびハイブリットプロモータ。
酵母宿主において、有用なプロモータは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）メタロチオネイン（ＣＵＰ１）、およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３−ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主のその他の有用なプロモータは、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｙｅａｓｔ ８：４２３−４８８に記載されている。
制御配列は転写ターミネータであってもよく、これは、宿主細胞によって転写の終止と認識される。ターミネータ配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドの３’末端に作動可能に結合する。宿主細胞において機能的であるすべてのターミネータが用いられ得る。
細菌性宿主細胞について好ましいターミネータは、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）アルカリプロテアーゼ（ａｐｒＨ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ（ａｍｙＬ）および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）リボソームＲＮＡ（ｒｒｎＢ）に係る遺伝子から得られる。
糸状真菌宿主細胞の好ましいターミネータは、アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニレート・シンターゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、およびフサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られる。
酵母宿主細胞の好ましいターミネータは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）シトクロムＣ（ＣＹＣ１）、およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のその他の有用なターミネータは、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ．ａｌ．，１９９２（前掲）によって記載されている。
制御配列はまた、プロモータの下流側であって、遺伝子の発現を高める遺伝子のコード配列の上流側のｍＲＮＡスタビライザ領域であり得る。
好適なｍＲＮＡスタビライザ領域の例は、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子（国際公開第９４／２５６１２号パンフレット）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＰ８２遺伝子（Ｈｕｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７７：３４６５−３４７１）から入手される。
制御配列はまた、リーダー、すなわち、宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域であってもよい。リーダー配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドの５’末端に作動可能に結合される。宿主細胞において機能性である任意のリーダーを用いてよい。
糸状真菌宿主細胞の好ましいリーダーは、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼおよびアスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）トリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。
酵母宿主細胞の好適なリーダーは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α因子、およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
制御配列はまた、ポリアデニル化配列であってもよく、これは、変異体コード配列の３’末端に作動可能に結合し、転写されると、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するためのシグナルとして宿主細胞に認識される配列である。宿主細胞において機能性である任意のポリアデニル化配列を用いてよい。
糸状真菌宿主細胞の好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニレート・シンターゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、およびフサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られる。
酵母宿主細胞に有用なポリアデニル化配列が、ＧｕｏおよびＳｈｅｒｍａｎ，１９９５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌ．１５：５９８３−５９９０に記載されている。
制御配列はまた、変異体のＮ−末端にリンクしたシグナルペプチドをコードし、および、変異体を細胞の分泌経路に送るシグナルペプチドコード領域であり得る。ポリヌクレオチドのコード配列の５’−末端は、変異体をコードするコード配列のセグメントと共に、翻訳読み枠に元々リンクしたシグナルペプチドコード配列を本質的に含有し得る。または、コード配列の５’−末端は、コード配列に対して外来性のシグナルペプチドコード配列を含有し得る。コード配列がシグナルペプチドコード配列を元々含有していない場合には、外来性のシグナルペプチドコード配列が必要とされる場合がある。または、外来性のシグナルペプチドコード配列は単に、変異体の分泌を増強するために天然シグナルペプチドコード配列を置き換えてもよい。しかしながら、発現変異体を宿主細胞の分泌経路に送るいずれかのシグナルペプチドコード配列が用いられてもよい。
細菌宿主細胞の効果的なシグナルペプチドコード配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＮＣＩＢ１１８３７マルトジェニックアミラーゼ、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）サブチリシン、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）β−ラクタマーゼ、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）α−アミラーゼ、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｐｒｓＡの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。さらなるシグナルペプチドが、Ｓｉｍｏｎｅｎ ａｎｄ Ｐａｌｖａ，１９９３，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５７：１０９−１３７に記載されている。
糸状真菌宿主細胞の有効なシグナルペプチドコード配列は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）中性アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）セルラーゼ、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）エンドグルカナーゼＶ、フミコラ・ラヌギノーサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼ、およびリゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテアーゼの遺伝子から得られる。
酵母宿主細胞に有用なシグナルペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α因子およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）インベルターゼの遺伝子から得られる。その他の有用なシグナルペプチドコード配列は、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ．ａｌ．，１９９２（前掲）によって記載されている。
制御配列はまた、変異体のＮ末端に位置するプロペプチドをコードするプロペプチドコード配列であり得る。得られるポリペプチドは、酵素原またはプロポリペプチド（または、いくつかの場合においてヂモーゲン）として知られる。プロポリペプチドは一般に不活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒または自己触媒切断によって活性ポリペプチドに転換されることが可能である。プロペプチドコード配列は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）天然プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、ミセリオフトラテルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ラッカーゼ（国際公開第９５／３３８３６号パンフレット）、リゾムコールミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼおよびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子に係る遺伝子から得られ得る。
シグナルペプチドとプロペプチド配列との両方が存在する場合、プロペプチド配列は変異体のＮ末端の隣に位置され、シグナルペプチド配列は、プロペプチド配列のＮ末端の隣に位置される。
宿主細胞の増殖に比した変異体の発現を制御する制御配列を加えることが望ましい場合もある。制御系の例は、化学的刺激または物理的刺激に対して応答して遺伝子の発現をオンオフさせるものであり、制御化合物の存在が含まれる。原核系中の制御系は、ｌａｃ、ｔａｃおよびｔｒｐオペレーター系を含む。酵母では、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系を用いてよい。糸状真菌では、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼプロモータ、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡα−アミラーゼプロモータ、およびアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）グルコアミラーゼプロモータを用いてよい。制御配列のその他の例は、遺伝子増幅を可能にする配列である。真核細胞系では、このような制御配列として、メトトレキサートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸還元酵素、および重金属で増幅されるメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。こうしたケースでは、変異体をコードするポリヌクレオチドを、制御配列と作動可能に結合する。
発現ベクター
本発明はまた、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチド、プロモータ、ならびに、転写および翻訳終止シグナルを含む組換え発現ベクターに関する。種々のヌクレオチドおよび制御配列が一緒になって、このような部位で変異体をコードするポリヌクレオチドの挿入または置換を可能とするために１つまたは複数の好都合な制限部位を含み得る組換え発現ベクターが生成される。または、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む核酸構築物を発現に適切なベクターに挿入することにより発現され得る。発現ベクターの形成において、コード配列は、コード配列が、発現に適切な制御配列と作動可能にリンクするようベクター中に位置されている。
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ法に簡便に供されることが可能であり、ポリヌクレオチドの発現をもたらすことが可能であるいずれかのベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞に対するベクターの親和性に応じることとなる。ベクターは、直鎖または閉鎖された環状プラスミドであり得る。
ベクターは、例えばプラスミド、染色体外要素、微小染色体または人工染色体などの、自己複製ベクター（すなわち、染色体外のエンティティとして存在し、その複製が染色体複製とは無関係なベクター）であり得る。ベクターは、自己複製を確実とするための何らかの手段を含有し得る。または、ベクターは、宿主細胞に導入された際に、ゲノム中に統合され、および、中に統合された染色体と一緒に複製されるものであり得る。しかも、単一のベクターもしくはプラスミド、または、一緒になって、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを含有する２つ以上のベクターもしくはプラスミド、または、トランスポゾンが用いられてもよい。
ベクターは、形質転換、形質移入、形質導入等された細胞の選択を容易とする１つまたは複数の選択マーカを含有してもよい。選択マーカは、その生成物が、殺生剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体に対する原栄養性等をもたらす遺伝子である。
細菌性選択マーカの例は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）もしくは枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｄａｌ遺伝子、または、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、ネオマイシン、スペクチノマイシンまたはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を与えるマーカである。酵母宿主細胞の好適なマーカは、これらに限定されないが、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３である。糸状真菌宿主細胞で使用される選択マーカとしては、これらに限定されないが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルボモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノスリシン・アセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスフォトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニレート・シンターゼ）、ならびにこれらの均等物が挙げられる。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞での使用に好適なのは、アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ａｍｄＳおよびｐｙｒＧ遺伝子、ならびにストレプトマイセス・ヒグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ｂａｒ遺伝子である。
ベクターは、宿主細胞のゲノムへのベクターの統合、または、ゲノムとは無関係の細胞中のベクターの自律複製を許容する要素を含有してもよい。
宿主細胞ゲノムへの統合に関して、ベクターは、変異体をコードするポリヌクレオチドの配列、または、相同的もしくは非相同的組換えによるゲノムへの統合に係るベクターのいずれかの他の要素に依存し得る。または、ベクターは、染色体における正確な位置での宿主細胞のゲノムへの相同的組換えによる統合をもたらす追加のポリヌクレオチドを含有していてもよい。正確な位置で統合される可能性を高めるために、統合要素は、相同的組換えの確率を高めるために対応する標的配列に対して高度の配列同一性を有する、１００〜１０，０００塩基対、４００〜１０，０００塩基対および８００〜１０，０００塩基対などの十分な数の核酸を含有しているべきである。統合要素は、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同的であるいずれかの配列であり得る。さらに、統合要素は、非コーディングまたはコーディングポリヌクレオチドであり得る。他方で、ベクターは、非相同的組換えにより宿主細胞のゲノムに統合され得る。
自律複製に関して、ベクターは、対象の宿主細胞におけるベクターの自律的な複製を可能とする複製起点をさらに含んでいてもよい。複製起点は、細胞において機能する自律複製を媒介するいずれかのプラスミドレプリケータであり得る。「複製起点」または「プラスミドレプリケータ」という用語は、インビボでのプラスミドまたはベクターの複製を可能とするポリヌクレオチドを意味する。
細菌性複製起点の例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における複製を許容するプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７およびｐＡＣＹＣ１８４の複製起点、ならびに、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における複製を許容するｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０およびｐＡＭβ１の複製起点である。
酵母宿主細胞で用いられる複製起点の例としては、２μ複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３の組み合わせ、およびＡＲＳ４とＣＥＮ６の組み合わせがある。
糸状真菌宿主細胞で有用な複製起点の例は、ＡＭＡ１およびＡＮＳ１である（Ｇｅｍｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅ ９８：６１−６７；Ｃｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：９１６３−９１７５；国際公開第００／２４８８３号パンフレット）。ＡＭＡ１遺伝子の単離および当該遺伝子を含むプラスミドまたはベクターの構築は、国際公開第００／２４８８３号パンフレットに開示の方法に従って達成することができる。
本発明のポリヌクレオチドの２つ以上のコピーが宿主細胞に挿入されて、変異体の生成が高められてもよい。ポリヌクレオチドのコピーの数は、配列の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞ゲノムに統合することにより、または、増幅可能な選択マーカ遺伝子をポリヌクレオチドに含めることにより増加させることが可能であり、ここで、選択マーカ遺伝子の増幅されたコピー、従って、ポリヌクレオチドの追加のコピーを含有する細胞は、適切な選択可能な薬剤中で細胞を培養することにより選択可能である。
上記の要素を連結して本発明の組換え発現ベクターを構築するために用いられる手法は、当業者に周知である（例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照のこと）。
宿主細胞
本発明はまた、本発明の変異体の生成をもたらす１つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクした本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞に関する。ポリヌクレオチドを含む構築物もしくはベクターは、構築物もしくはベクターが染色体性組み込み体として、もしくは、既述の自己複製余剰−染色体性ベクターとして維持されるよう宿主細胞に導入される。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異により親細胞と同等ではない親細胞のいずれかの子孫を包含する。宿主細胞の選択は、変異体をコードする遺伝子およびそのソースに大きく依存することとなる。
宿主細胞は、例えば、原核生物または真核生物などの、変異体の組換え生成において有用ないずれかの細胞であり得る。
原核宿主細胞は、グラム陽性またはグラム陰性バクテリアのいずれかであり得る。グラム陽性バクテリアとしては、これらに限定されないが、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。グラム陰性バクテリアとしては、これらに限定されないが、カムピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ネイッセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）およびウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）が挙げられる。
細菌宿主細胞は、特にこれらに限定されないが、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）細胞を含むいずれかのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞であり得る。
細菌宿主細胞はまた、特にこれらに限定されないが、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ）、およびストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｓｕｂｓｐ．Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）細胞のいずれかのストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞を含むいずれかのストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞であり得る。
細菌宿主細胞はまた、特にこれらに限定されないが、ストレプトマイセス・アウロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）、およびストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）細胞を含むいずれかのストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞であり得る。
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ，１９７９，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１１−１１５を参照のこと）、コンピテント細胞の形質転換（例えば、Ｙｏｕｎｇ ａｎｄ Ｓｐｉｚｉｚｅｎ，１９６１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８１：８２３−８２９、または、Ｄｕｂｎａｕ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎ，１９７１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５６：２０９−２２１を参照のこと）、エレクトロポレーション（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａ ａｎｄ Ｄｏｗｅｒ，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：７４２−７５１を参照のこと）、または、接合（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｅ，１９８７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：５２７１−５２７８を参照のこと）により実施され得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｈａｎａｈａｎ，１９８３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７−５８０を参照のこと）またはエレクトロポレーション（例えば、Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６１２７−６１４５を参照のこと）により実施され得る。ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション（例えば、Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（Ｐｒａｈａ）４９：３９９−４０５を参照のこと）、接合（例えば、Ｍａｚｏｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：３５８３−３５８５を参照のこと）、または、形質導入（例えば、Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：６２８９−６２９４を参照のこと）により実施され得る。シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、エレクトロポレーション（例えば、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６４：３９１−３９７を参照のこと）、または、接合（例えば、Ｐｉｎｅｄｏ ａｎｄ Ｓｍｅｔｓ，２００５，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：５１−５７を参照のこと）により実施され得る。ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、自然の受容能（例えば、Ｐｅｒｒｙ ａｎｄ Ｋｕｒａｍｉｔｓｕ，１９８１，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５−１２９７を参照のこと）、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｃａｔｔ ａｎｄ Ｊｏｌｌｉｃｋ，１９９１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ ６８：１８９−２０７を参照のこと）、エレクトロポレーション（例えば、Ｂｕｃｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：３８００−３８０４を参照のこと）または接合（例えば、Ｃｌｅｗｅｌｌ，１９８１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４５：４０９−４３６を参照のこと）により実施され得る。しかしながら、ＤＮＡを宿主細胞に導入するための技術分野において公知であるいずれかの方法を用いることが可能である。
宿主細胞はまた、哺乳動物、昆虫、植物、または真菌細胞などの真核細胞であってもよい。
宿主細胞は真菌細胞であってもよい。本明細書で用いる「真菌」には、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、および接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）、ならびに卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）ならびにあらゆる栄養胞子形成菌が含まれる（以下によって定義されているとおり：Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ ａｎｄ Ｂｉｓｂｙ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｆｕｎｇｉ，８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，ＣＡＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）。
真菌宿主細胞は、酵母細胞であってもよい。本明細書で用いる「酵母」には、子嚢菌酵母（エンドミセス目（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ））、担子菌酵母、および不完全菌類（Ｆｕｎｇｉ Ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉ）（ブラストミセス属（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ））に属する酵母が含まれる。酵母の分類は将来変わる可能性があるため、本発明の目的に関して、酵母は、Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｙｅａｓｔ（Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｐａｓｓｍｏｒｅ，ａｎｄ Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｓｏｃ．Ａｐｐ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ Ｎｏ．９，１９８０）に記載されているとおり定義する。
酵母宿主細胞は、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、サッカロミセス・カルスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ジアスタチカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ドウグラシ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・オビホルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）、もしくはヤロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞などのカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、またはヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の細胞であってよい。
真菌宿主細胞は、糸状真菌宿主細胞であってもよい。「糸状真菌」には、真菌類（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）および卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）のあらゆる糸状形態が含まれる（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９５（前掲）により定義されているとおり）。糸状真菌は、一般に、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、および他の複雑な多糖類から構成される菌糸壁を特徴とする。栄養成長は、菌糸伸長によって行われ、炭素異化作用は、必ず好気的である。対照的に、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母による栄養成長は、単細胞性葉状体の発芽によるものであり、また炭素異化作用は発酵性であり得る。
糸状真菌宿主細胞は、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ヤケイロタケ属（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリナス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、カワラタケ属（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコル属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフソラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスチックス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ネウロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロカエテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、フレビア属（Ｐｈｌｅｂｉａ）、ピロミセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、ヒラタケ属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、シゾフィラム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、ホウロクタケ属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、またはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の細胞であってよい。
例えば、糸状真菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ホエチダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、ヤケイロタケ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ ａｄｕｓｔａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・カレジエア（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｃａｒｅｇｉｅａ）、セリポリオプシス・ギルベッセンス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｇｉｌｖｅｓｃｅｎｓ）、セリポリオプシス・パノンシンタ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｐａｎｎｏｃｉｎｔａ）、セリポリオプシス・リブロサ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｒｉｖｕｌｏｓａ）、セリポリオプシス・サブルファ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｓｕｂｒｕｆａ）、セリポリオプシス・サベルミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、クリソスポリウム・イノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウム・ケラチノフィラム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウム・メルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム・パニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム・クイーンズランジカム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・トプロピカム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・ゾナタム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｚｏｎａｔｕｍ）、コプリヌス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、コリオラス・ハースタス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉｒｓｕｔｕｓ）、フサリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フサリウム・クロックウェレンズ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フサリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フサリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フサリウム・グラミナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フサリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ）、フサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・レチキュラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フサリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、フサリウム・サムブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フサリウム・サルクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フサリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フサリウム・トルロサム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フサリウム・トリコセシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノーサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコル・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオプソラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ネウロスポラ・クラサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・プルプロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フレビア・ラジアータ（Ｐｈｌｅｂｉａ ｒａｄｉａｔａ）、プレウロツス・エリンギ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｅｒｙｎｇｉｉ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トラメテス・ビロサ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｉｌｌｏｓａ）、トラメテス・ベルシカラー（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンジブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、またはトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）の細胞であってよい。
真菌細胞は、それ自体知られている方法において、プロトプラストの形成、プロトプラストの形質転換、および細胞壁の再生を含む方法により形質転換することができる。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の形質転換のための好適な手順は、次の文献に記載されている：欧州特許第２３８０２３号明細書、Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１４７０−１４７４、およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１４１９−１４２２。フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種を形質転換する好適な方法は、次の文献に記載されている：Ｍａｌａｒｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．１９８９ Ｇｅｎｅ ７８ １４７−１５６、および国際公開第９６／００７８７号パンフレット。酵母は、次の文献に記載されている手順を用いて形質転換することができる：ＢｅｃｋｅｒおよびＧｕａｒｅｎｔｅ，Ｉｎ Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．ａｎｄ Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １９４，ｐｐ １８２−１８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３；ならびにＨｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２０。
生成方法
本発明はまた：（ａ）変異体の発現に好適な条件下で本発明の宿主細胞を培養するステップ；および、（ｂ）変異体を回収するステップを含む変異体の生成方法に関する。
宿主細胞は、技術分野において公知である方法を用いる変異体の生成に好適な栄養培地中で培養される。例えば、細胞は、好適な培地中に、変異体の発現および／または単離が許容される条件下で行われる実験用または産業用発酵槽において、フラスコ振盪培養、または、小規模もしくは大規模発酵（連続、回分、流加または固相発酵を含む）により培養され得る。培養は、技術分野において公知である手法を用いて、炭素および窒素源、および、無機塩を含む好適な栄養培地において行われる。好適な培地は、商業的供給者から入手可能であるか、または、公開されている組成物に従って調製され得る（例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ中）。変異体が栄養培地に分泌される場合、変異体は培地から直接回収可能である。変異体が分泌されない場合、変異体は細胞可溶化物から回収可能である。
変異体は、変異体に特異的である技術分野において公知である方法を用いて検出され得る。これらの検出法としては、これらに限定されないが、特定の抗体の使用、酵素生成物の形成、または、酵素基質の消失が挙げられる。例えば、酵素アッセイを用いて変異体の活性を判定し得る。
変異体は技術分野において公知である方法を用いて回収され得る。例えば、変異体は、特にこれらに限定されないが、採取、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発または沈殿を含む従来の手法によって栄養培地から回収され得る。
変異体は、特にこれらに限定されないが、実質的に純粋な変異体を得るための、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除）、電気泳動法（例えば、分取等電点電気泳動）、吸収率較差溶解度（例えば、硫酸アンモニウム析出）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または、抽出（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒｙｄｅｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９を参照のこと）を含む技術分野において公知である多様な手法によって精製され得る。
代替的な態様において、変異体は回収されず、変異体を発現する本発明の宿主細胞が変異体ソースとして用いられる。
発酵ブロス配合物または細胞組成物
本発明はまた、本発明のポリペプチドを含む発酵ブロス配合物または細胞組成物にも関する。発酵ブロス生成物は、例えば、細胞（本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を含む宿主細胞であって、目的のポリペプチドの産生に使用される宿主細胞を含む）、細胞デブリ、バイオマス、発酵培地および／または発酵産物など、発酵過程で用いられる追加的な成分をさらに含む。一部の実施形態において、組成物は、１つまたは複数の有機酸、死滅化細胞および／または細胞デブリ、および培養培地を含有する細胞死滅化全ブロスである。
用語「発酵ブロス」は、本明細書で使用されるとき、回収および／または精製を全くまたは最小限しか行わない細胞発酵により作製される調製物を指す。例えば、発酵ブロスは、微生物培養物を飽和するまで成長させ、炭素制限条件下でインキュベートしてタンパク質を合成させて（例えば、宿主細胞による酵素の発現）、細胞培養培地中に分泌させると作製される。発酵ブロスは、発酵の終了時に由来する発酵材料の非分画または分画内容物を含有し得る。典型的には、発酵ブロスは非分画であり、使用済みの培養培地および微生物細胞（例えば糸状菌細胞）の例えば遠心による除去後に存在する細胞デブリを含む。一部の実施形態において、発酵ブロスは、使用済みの細胞培養培地、細胞外酵素、および生存および／または非生存微生物細胞を含有する。
ある実施形態において、発酵ブロス配合物および細胞組成物は、少なくとも１つの１〜５炭素の有機酸および／またはその塩を含む第１の有機酸成分と、少なくとも１つの６炭素以上の有機酸および／またはその塩を含む第２の有機酸成分とを含む。具体的な実施形態において、第１の有機酸成分は、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、その塩、または前述のうちの２つ以上の混合物であり、第２の有機酸成分は、安息香酸、シクロヘキサンカルボン酸、４−メチル吉草酸、フェニル酢酸、その塩、または前述のうちの２つ以上の混合物である。
一態様において、組成物は１つまたは複数の有機酸を含有し、および任意選択で死滅化細胞および／または細胞デブリをさらに含有する。一実施形態において、死滅化細胞および／または細胞デブリは細胞死滅化全ブロスから除去されて、これらの成分を含まない組成物が提供される。
発酵ブロス配合物または細胞組成物は、限定はされないが、ソルビトール、塩化ナトリウム、ソルビン酸カリウム、および当該技術分野において公知の他のものを含め、保存剤および／または抗菌剤（例えば静菌剤）をさらに含み得る。
細胞死滅化全ブロスまたは組成物は、発酵の終了時に由来する発酵材料の非分画内容物を含有し得る。典型的には、細胞死滅化全ブロスまたは組成物は、微生物細胞（例えば、糸状菌細胞）を飽和するまで成長させ、炭素制限条件下でインキュベートしてタンパク質を合成させた後に存在する使用済みの培養培地および細胞デブリを含有する。一部の実施形態において、細胞死滅化全ブロスまたは組成物は、使用済みの細胞培養培地、細胞外酵素、および死滅化糸状菌細胞を含有する。一部の実施形態において、細胞死滅化全ブロスまたは組成物中に存在する微生物細胞は、当該技術分野において公知の方法を用いて透過処理および／または溶解される。
本明細書に記載されるとおりの全ブロスまたは細胞組成物は、典型的には液体であるが、死滅化細胞、細胞デブリ、培養培地成分、および／または１つまたは複数の不溶性酵素など、不溶性成分を含有し得る。一部の実施形態では、不溶性成分が除去されて清澄化液体組成物が提供され得る。
本発明の全ブロス配合物および細胞組成物は、国際公開第９０／１５８６１号パンフレットまたは国際公開第２０１０／０９６６７３号パンフレットに記載される方法によって作製されてもよい。
酵素組成物
本発明はまた、本発明のポリペプチドを含む組成物にも関する。好ましくは、組成物は本発明のポリペプチドが濃縮される。用語「濃縮される」とは、組成物のキシラナーゼ活性が、例えば、少なくとも１．１、例えば、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも２．０、少なくとも３．０、少なくとも４．０、少なくとも５．０、少なくとも１０の濃縮倍数で増加していることを指す。
ある実施形態において、本組成物は、本発明のポリペプチドと、以下に記載するとおりの１つ以上の配合剤とを含む。
組成物は、アセチルキシランエステラーゼ、アシルグリセロールリパーゼ、アミラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、アラビノフラノシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、フェルロイルエステラーゼ、ガラクタナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、グルカン１，４−ａ−グルコシダーゼ、グルカン１，４−α−マルトヒドロラーゼ、グルカン１，４−ａ−グルコシダーゼ、グルカン１，４−α−マルトヒドロラーゼ、リゾホスホリパーゼ、リゾチーム、α−マンノシダーゼ、β−マンノシダーゼ（マンナナーゼ）、フィターゼ、ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＤ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、ペクチンエステラーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼまたはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上の（例えば数個の）酵素など、複数の酵素活性をさらに含み得る。
組成物は、１つ以上の微生物をさらに含み得る。ある実施形態において、微生物は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ポリミクサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ）、ビフィドバクテリウム属種（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、カルノバクテリウム属種（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、クロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、クロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス属種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、ラクトバチルス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、アシドフィルス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ファルシミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｕｓ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス属種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、ロイコノストック属種（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．）、メガスフェラ・エルスデニイ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ）、メガスフェラ属種（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｓｐ．）、ペディオコッカス・アシディラクチシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｓｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、ペディオコッカス属種（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、プロピオニバクテリウム・ソエニイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｏｅｎｉｉ）、プロピオニバクテリウム属種（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）およびストレプトコッカス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
ある実施形態において、本組成物は、本明細書に開示されるとおりの１つ以上の配合剤、好ましくは、グリセロール、エチレングリコール、１，２−プロピレングリコールまたは１，３−プロピレングリコール、塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、チオ硫酸ナトリウム、炭酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、デキストリン、グルコース、スクロース、ソルビトール、ラクトース、デンプン、カオリンおよびセルロースからなるリストから選択される化合物のうちの１つ以上を含む。
ある実施形態において、本組成物は、ビタミン、ミネラルおよびアミノ酸からなるリストから選択される１つ以上の成分を含む。
ある実施形態において、本組成物は、本明細書に開示されるとおりのキビ亜科（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ）の植物系材料、好ましくはトウモロコシ、コーン、モロコシ、スイッチグラス、キビ、トウジンビエ、アワ、または加工した形態、例えば、粉砕コーン、粉砕トウモロコシ、脱脂トウモロコシ、脱脂・脱デンプントウモロコシ、粉砕モロコシ、粉砕スイッチグラス、粉砕キビ、粉砕アワ、粉砕トウジンビエ、またはこれらの任意の組み合わせなどを含む。
配合物
本発明の酵素は、液体または固体として配合されてもよい。液体配合物について、配合剤は、ポリオール（例えば、グリセロール、エチレングリコールまたはプロピレングリコールなど）、塩（例えば、塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウムなど）または糖もしくは糖誘導体（例えば、デキストリン、グルコース、スクロース、およびソルビトールなど）を含み得る。従って一実施形態において、本組成物は、本発明のポリペプチドと、グリセロール、エチレングリコール、１，２−プロピレングリコール、１，３−プロピレングリコール、塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、デキストリン、グルコース、スクロース、およびソルビトールからなるリストから選択される１つ以上の配合剤とを含む液体組成物である。液体配合物は、飼料をペレット化した後にそれに噴霧してもよく、または動物に与える飲用水に添加してもよい。
固形配合物について、配合物は例えば顆粒、噴霧乾燥粉末または凝集塊としてであってもよい（例えば、国際公開第２０００／７００３４号パンフレットに開示されるとおり）。配合剤は、塩（有機または無機亜鉛、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩、例えば、酢酸カルシウム、安息香酸カルシウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、ソルビン酸カルシウム、硫酸カルシウム、酢酸カリウム、安息香酸カリウム、炭酸カリウム、塩化カリウム、クエン酸カリウム、ソルビン酸カリウム、硫酸カリウム、酢酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸亜鉛、安息香酸亜鉛、炭酸亜鉛、塩化亜鉛、クエン酸亜鉛、ソルビン酸亜鉛、硫酸亜鉛）、デンプンまたは糖もしくは糖誘導体（例えば、スクロース、デキストリン、グルコース、ラクトース、ソルビトールなど）などを含み得る。
一実施形態において、本組成物は、本発明のキシラナーゼと、塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、チオ硫酸ナトリウム、炭酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、デキストリン、グルコース、スクロース、ソルビトール、ラクトース、デンプンおよびセルロースからなるリストから選択される１つ以上の配合剤とを含む噴霧乾燥組成物などの固体組成物である。好ましい実施形態において、配合剤は、以下の化合物：硫酸ナトリウム、デキストリン、セルロース、チオ硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウムおよび炭酸カルシウムのうちの１つ以上から選択される。
本発明はまた、本発明のキシラナーゼを任意選択で１つ以上の追加的な酵素と組み合わせて含む酵素顆粒／粒子にも関する。この顆粒は、コアと、任意選択でコアを囲む１つ以上のコーティング（外層）とで構成される。
典型的には、顆粒の顆粒径／粒径は、等価な球の直径として計測したとき（体積基準平均粒径）、２０〜２０００μｍ、特に５０〜１５００μｍ、１００〜１５００μｍまたは２５０〜１２００μｍである。
コアは、例えば、結晶化、沈殿、パンコーティング、流動床コーティング、流動床アグロメレーション、ロータリーアトマイゼーション、押出し、プリリング、球形化、サイズリダクション方法、ドラム式造粒、および／または高剪断造粒などの造粒技術を含む方法により、原料のブレンドを造粒することによって調製し得る。
コアの調製方法については、Ｃ．Ｅ．Ｃａｐｅｓ；Ｖｏｌｕｍｅ １；１９８０；Ｅｌｓｅｖｉｅｒによる「粉体工学ハンドブック；粒径の拡大（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｏｗｄｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ ｅｎｌａｒｇｅｍｅｎｔ）」を参照することができる。調製方法には、例えば以下のような、公知の飼料および顆粒形成技術が含まれる：
ａ）噴霧乾燥生成物、ここでは液体酵素含有溶液が噴霧乾燥塔で霧化されて小さい液滴を形成し、それらの液滴が乾燥塔内を下る間に乾燥して酵素含有粒子材料を形成する；
ｂ）積層生成物、ここでは予め形成された不活性コア粒子の周りに酵素が層としてコーティングされ、ここでは典型的には予め形成されたコア粒子が流動化されている流動床装置で酵素含有溶液が霧化され、および酵素含有溶液がコア粒子に付着して乾き切ると、コア粒子の表面上に乾燥した酵素の層が残る。所望の粒径の有用なコア粒子を見付けることができる場合には、このようにして所望の粒径の粒子を得ることができる。この種の生成物については、例えば国際公開第９７／２３６０６号パンフレットに記載されている；
ｃ）吸収コア粒子、ここでは酵素をコアの周りに層としてコーティングするというよりむしろ、酵素がコアの表面上へと、および／またはその中へと吸収される。かかる手法については、国際公開第９７／３９１１６号パンフレットに記載されている。
ｄ）押出しまたはペレット状生成物、ここでは酵素含有ペーストが加圧によりペレット化され、または圧力下で小さい開口を通じて押し出されて切断されることにより粒子となり、この粒子は続いて乾燥される。押出し開口が作られる材料（通常は穿孔を有するプレート）が押出し開口に対する許容圧力降下を制限するため、かかる粒子は通常はかなりのサイズを有する。また、小さい開口を用いる場合に押出し圧力が極めて高くなると酵素ペーストの発熱量が増加し、これは酵素にとって有害である；
ｅ）プリリング生成物、ここでは酵素含有粉末が溶融ワックス中に懸濁され、この懸濁液が例えば回転ディスク噴霧機を通じて冷却チャンバ内へと噴霧され、そこで液滴が急速に固化する（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓ．Ｓｈｏｗｅｌｌ（ｅｄｉｔｏｒ）；「粉末状洗剤；界面活性剤科学シリーズ（Ｐｏｗｄｅｒｅｄ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ；Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｅｒｉｅｓ）」；１９９８；ｖｏｌ．７１；ｐａｇｅ １４０−１４２；Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ）。得られる生成物は、酵素が不活性材料の表面に集中しているのでなく、その全体にわたって均一に分布しているものである。また、米国特許第４，０１６，０４０号明細書および米国特許第４，７１３，２４５号明細書もこの技術に関して報告している；
ｆ）ミキサー造粒生成物、ここでは例えば従来の造粒成分の乾燥粉末組成物に液体が添加され、酵素は液体または粉末のいずれかまたは両方によって導入される。この液体と粉末が混合され、液体の水分が乾燥粉末に吸収されるに従い乾燥粉末の成分が付着して凝集し始めることになり、粒子が作り出されて、酵素を含む顆粒が形成されることになる。かかる手法については、米国特許第４，１０６，９９１号明細書および関連文献の欧州特許第１７０３６０号明細書、欧州特許第３０４３３２号明細書、欧州特許第３０４３３１号明細書、国際公開第９０／０９４４０号パンフレットおよび国際公開第９０／０９４２８号パンフレットに記載されている。様々な高剪断ミキサーが造粒機として使用され得るこの手法の特定の生成物においては、酵素としての酵素からなる顆粒、充填剤および結合剤等をセルロース繊維と混合して粒子を強化することにより、いわゆるＴグラニュレート（Ｔ−ｇｒａｎｕｌａｔｅ）が得られる。よりロバストである強化粒子は、放出される酵素粉塵が少ない。
ｇ）サイズリダクション、ここでは酵素を含有する大型粒子、ペレット、錠剤、ブリケット等の粉砕または破砕によってコアが作製される。求められるコア粒子画分は、粉砕または破砕生成物を篩分けすることにより得られる。過大および過小な粒径の粒子は再利用することができる。サイズリダクションについては、（Ｍａｒｔｉｎ Ｒｈｏｄｅｓ（ｅｄｉｔｏｒ）；「粉体工学の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｏｗｄｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」；１９９０；Ｃｈａｐｔｅｒ １０；Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）に記載されている；
ｈ）流動床造粒、これは、粒子状物質を気流中に懸濁し、その流動化粒子にノズルから液体を噴霧することを伴う。噴霧液滴が当たった粒子は濡れて粘着性になる。この粘着性粒子が他の粒子に衝突してそれに付着し、顆粒を形成する；
ｉ）コアは、流動床乾燥機などで乾燥に供されてもよい。飼料または洗剤工業における他の公知の顆粒乾燥方法が当業者によって用いられ得る。乾燥は、好ましくは２５〜９０℃の生成物温度で行われる。一部の酵素については、酵素を含むコアがコーティング前に含有する水が少量であることが重要である。過剰な水が除去されないまま感水性の酵素がコーティングされた場合、その水がコア内に捕捉されることになり、酵素の活性に悪影響を及ぼし得る。乾燥前、コアは好ましくは０．１〜１０％ｗ／ｗの水を含有する。
コアは、充填剤、繊維材料（セルロースまたは合成繊維）、安定化剤、可溶化剤、懸濁剤、粘性調節剤、ライトスフェア（ｌｉｇｈｔ ｓｐｈｅｒｅｓ）、可塑剤、塩、滑沢剤および芳香剤などの追加的な材料を含み得る。
コアは、合成高分子、ワックス、脂肪、または炭水化物などの結合剤を含み得る。
コアは、多価カチオンの塩、還元剤、抗酸化剤、過酸化物分解触媒および／または酸性緩衝成分を、典型的には均一ブレンドとして含み得る。
一実施形態において、コアは、塩（酢酸カルシウム、安息香酸カルシウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、ソルビン酸カルシウム、硫酸カルシウム、酢酸カリウム、安息香酸カリウム、炭酸カリウム、塩化カリウム、クエン酸カリウム、ソルビン酸カリウム、硫酸カリウム、酢酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸亜鉛、安息香酸亜鉛、炭酸亜鉛、塩化亜鉛、クエン酸亜鉛、ソルビン酸亜鉛、硫酸亜鉛など）、デンプンまたは糖もしくは糖誘導体（例えば、スクロース、デキストリン、グルコース、ラクトース、ソルビトールなど）、糖または糖誘導体（例えば、スクロース、デキストリン、グルコース、ラクトース、ソルビトールなど）、有機小分子、デンプン、穀粉、セルロースおよびミネラルおよび粘土鉱物（含水フィロケイ酸アルミニウムとしても知られる）からなる群から選択される材料を含む。一実施形態において、コアはカオリナイトまたはカオリンなどの粘土鉱物を含む。
コアは、酵素がそこに吸収された、または表面上に例えば流動床コーティングによって塗布された不活性粒子を含み得る。
コアは直径が２０〜２０００μｍ、特に５０〜１５００μｍ、１００〜１５００μｍまたは２５０〜１２００μｍであり得る。
コアは少なくとも１つのコーティングに囲まれてもよく、例えばそれにより貯蔵安定性が向上し、取扱い中の粉塵形成が減少し、または顆粒を着色し得る。任意選択のコーティングは、塩および／またはワックスおよび／または穀粉コーティング、または他の好適なコーティング材料を含み得る。
コーティングは、コアの重量を基準として少なくとも０．１％、例えば、少なくとも０．５％、１％または５％の量で塗布されてもよい。この量は高々１００％、７０％、５０％、４０％または３０％であり得る。
コーティングは、好ましくは少なくとも０．１μｍ厚さ、特に少なくとも０．５μｍ、少なくとも１μｍまたは少なくとも５μｍである。一部の実施形態において、コーティングの厚さは１００μｍ未満、例えば６０μｍ未満、または４０μｍ未満である。
コーティングは、実質的に連続的な層を形成することによりコアユニットをカプセル化しなければならない。実質的に連続的な層とは、孔がほとんどまたは全くないコーティングであり、従ってコーティングされていない範囲がほとんどまたは全くない状態でコアユニットがカプセル化または封入されるものと理解されるべきである。層またはコーティングは、詳細には厚さが均一でなければならない。
コーティングは、当該技術分野において公知のとおりの他の材料、例えば、充填剤、付着防止剤、色素、染料、可塑剤および／または結合剤、例えば、二酸化チタン、カオリン、炭酸カルシウムまたはタルクをさらに含み得る。
塩コーティングは、少なくとも６０重量％の塩、例えば、少なくとも６５重量％、少なくとも７０重量％、少なくとも７５重量％、少なくとも８０重量％、少なくとも８５重量％、少なくとも９０重量％、少なくとも９５重量％または少なくとも９９重量％の塩を含み得る。
塩は、塩が完全に溶解している塩溶液から加えるか、または微粒子が５０μｍ未満、例えば１０μｍ未満または５μｍ未満である塩懸濁液から加えることができる。
塩コーティングは、単一の塩または２つ以上の塩の混合物を含み得る。塩は水溶性であってもよく、詳細には、２０℃で１００ｇの水中少なくとも０．１ｇ、好ましくは水１００ｇ当たり少なくとも０．５ｇ、例えば、水１００ｇ当たり少なくとも１ｇ、例えば水１００ｇ当たり少なくとも５ｇの溶解度を有してもよい。
塩は、無機塩、例えば、硫酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、ホスホン酸塩、硝酸塩、塩化物塩または炭酸塩、または単純有機酸（１０個未満の炭素原子、例えば６個以下の炭素原子）の塩、例えばクエン酸塩、マロン酸塩もしくは酢酸塩などであってもよい。これらの塩におけるカチオンの例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛またはアルミニウムなど、アルカリ金属またはアルカリ土類金属イオン、アンモニウムイオンまたは第一遷移系列の金属イオンである。アニオンの例としては、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硫酸塩、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、チオ硫酸塩、リン酸塩、一塩基性リン酸塩、二塩基性リン酸塩、次亜リン酸塩、ピロリン酸二水素、四ホウ酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、メタケイ酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、ソルビン酸塩、乳酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、酪酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、酒石酸塩、アスコルビン酸塩またはグルコン酸塩が挙げられる。詳細には、硫酸、亜硫酸、リン酸、ホスホン酸、硝酸、塩化物または炭酸のアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩、または単純有機酸、例えばクエン酸、マロン酸または酢酸の塩が使用されてもよい。
コーティング中の塩は、２０℃で６０％超、特に７０％超、８０％超または８５％超の一定の湿度を有してもよく、またはそれはかかる塩の別の水和物形態（例えば無水物）であってもよい。塩コーティングは、国際公開第１９９７／０５２４５号パンフレット、国際公開第１９９８／５４９８０号パンフレット、国際公開第１９９８／５５５９９号パンフレット、国際公開第２０００／７００３４号パンフレット、国際公開第２００６／０３４７１０号パンフレット、国際公開第２００８／０１７６６１号パンフレット、国際公開第２００８／０１７６５９号パンフレット、国際公開第２０００／０２０５６９号パンフレット、国際公開第２００１／００４２７９号パンフレット、国際公開第１９９７／０５２４５号パンフレット、国際公開第２０００／０１７９３号パンフレット、国際公開第２００３／０５９０８６号パンフレット、国際公開第２００３／０５９０８７号パンフレット、国際公開第２００７／０３１４８３号パンフレット、国際公開第２００７／０３１４８５号パンフレット、国際公開第２００７／０４４９６８号パンフレット、国際公開第２０１３／１９２０４３号パンフレット、国際公開第２０１４／０１４６４７号パンフレットおよび国際公開第２０１５／１９７７１９号パンフレットに記載されるとおりか、または国際公開第２００１／０００４２号パンフレットに記載されるなどのポリマーコーティングであってもよい。
好適な塩の具体的な例は、ＮａＣｌ（ＣＨ２０℃＝７６％）、Ｎａ２ＣＯ３（ＣＨ２０℃＝９２％）、ＮａＮＯ３（ＣＨ２０℃＝７３％）、Ｎａ２ＨＰＯ４（ＣＨ２０℃＝９５％）、Ｎａ３ＰＯ４（ＣＨ２５℃＝９２％）、ＮＨ４Ｃｌ（ＣＨ２０℃＝７９．５％）、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４（ＣＨ２０℃＝９３，０％）、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４（ＣＨ２０℃＝９３．１％）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（ＣＨ２０℃＝８１．１％）、ＫＣｌ（ＣＨ２０℃＝８５％）、Ｋ２ＨＰＯ４（ＣＨ２０℃＝９２％）、ＫＨ２ＰＯ４（ＣＨ２０℃＝９６．５％）、ＫＮＯ３（ＣＨ２０℃＝９３．５％）、Ｎａ２ＳＯ４（ＣＨ２０℃＝９３％）、Ｋ２ＳＯ４（ＣＨ２０℃＝９８％）、ＫＨＳＯ４（ＣＨ２０℃＝８６％）、ＭｇＳＯ４（ＣＨ２０℃＝９０％）、ＺｎＳＯ４（ＣＨ２０℃＝９０％）およびクエン酸ナトリウム（ＣＨ２５℃＝８６％）である。他の例としては、ＮａＨ２ＰＯ４、（ＮＨ４）Ｈ２ＰＯ４、ＣｕＳＯ４、Ｍｇ（ＮＯ３）２、酢酸マグネシウム、酢酸カルシウム、安息香酸カルシウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、ソルビン酸カルシウム、硫酸カルシウム、酢酸カリウム、安息香酸カリウム、炭酸カリウム、塩化カリウム、クエン酸カリウム、ソルビン酸カリウム、酢酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸亜鉛、安息香酸亜鉛、炭酸亜鉛、塩化亜鉛、クエン酸亜鉛およびソルビン酸亜鉛が挙げられる。
塩は無水形態であってもよく、または国際公開第９９／３２５９５号パンフレットに記載されるなどの、結晶水が結合した水和塩、すなわち結晶塩水和物であってもよい。具体的な例としては、無水硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）、無水硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ）、硫酸亜鉛七水和物（ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ）、リン酸ナトリウム二塩基性七水和物（Ｎａ２ＨＰＯ４．７Ｈ２Ｏ）、硝酸マグネシウム六水和物（Ｍｇ（ＮＯ３）２（６Ｈ２Ｏ））、クエン酸ナトリウム二水和物および酢酸マグネシウム四水和物が挙げられる。
好ましくは塩は塩の溶液として、例えば流動床を用いて適用される。
ワックスコーティングは、少なくとも６０重量％、例えば、少なくとも６５重量％、少なくとも７０重量％、少なくとも７５重量％、少なくとも８０重量％、少なくとも８５重量％、少なくとも９０重量％、少なくとも９５重量％または少なくとも９９重量％のワックスを含み得る。
ワックスの具体的な例は、ポリエチレングリコール類；ポリプロピレン類；カルナウバ蝋；カンデリラ蝋；蜜蝋；水素添加植物油または獣脂、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチルヒドロキシプロピルセルロース（ＭＨＰＣ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、水素添加牛脂、水素添加パーム油、水素添加綿実および／または水素添加ダイズ油；脂肪酸アルコール類；モノグリセリド類および／またはジグリセリド類、例えばステアリン酸グリセリル（ここでステアリン酸塩はステアリン酸とパルミチン酸との混合物である）；微結晶性ワックス；パラフィン；および脂肪酸、例えば水素添加直鎖長鎖脂肪酸およびその誘導体である。好ましいワックスはパーム油または水素添加パーム油である。
顆粒は、本発明のキシラナーゼを含むコアと、１つ以上の塩コーティングと、１つ以上のワックスコーティングとを含み得る。複数のコーティングを伴う酵素顆粒の例は、国際公開第１９９３／０７２６３号パンフレット、国際公開第１９９７／２３６０６号パンフレットおよび国際公開第２０１６／１４９６３６号パンフレットに示される。
無粉塵性顆粒が、例えば米国特許第４，１０６，９９１号明細書および同第４，６６１，４５２号明細書に開示されるとおり作製されてもよく、任意選択で当該技術分野において公知の方法によりコーティングされてもよい。コーティング材料は、蝋様コーティング材料および塗膜形成コーティング材料であり得る。蝋様コーティング材料の例は、平均モル重量が１０００〜２００００のポリ（エチレンオキシド）生成物（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）；１６〜５０エチレンオキシド単位を有するエトキシ化ノニルフェノール類；アルコールが１２〜２０個の炭素原子を含み、かつ１５〜８０エチレンオキシド単位であるエトキシ化脂肪アルコール；脂肪アルコール；脂肪酸；ならびに脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドおよびトリグリセリドである。流動床技術による塗布に好適な塗膜形成コーティング材料の例は、英国特許出願公開第１４８３５９１号明細書に提供される。
顆粒は１つ以上の追加的な酵素をさらに含み得る。このとき各酵素がより多くの顆粒に存在するためより均一な酵素分布が確保されることになり、また、粒径が異なることに起因する異なる酵素の物理的な分離も減少する。多酵素共顆粒の作製方法は、ｉｐ．ｃｏｍ開示ＩＰＣＯＭ０００２００７３９Ｄに開示される。
共顆粒を使用することによる酵素配合物の別の例が、国際公開第２０１３／１８８３３１号パンフレットに開示される。
本発明はまた、欧州特許第２３８，２１６号明細書に開示される方法により調製される保護酵素にも関する。
従って、さらなる態様において、本発明は、
（ａ）本発明に係るキシラナーゼを含むコア、および
（ｂ）コアを囲む１つ以上の層からなるコーティング
を含む顆粒を提供する。
一実施形態において、コーティングは、本明細書に記載されるとおりの塩コーティングを含む。一実施形態において、コーティングは、本明細書に記載されるとおりのワックスコーティングを含む。一実施形態において、コーティングは、本明細書に記載されるとおりの塩コーティングと、続いてワックスコーティングとを含む。
動物飼料添加物
本発明はまた、１つ以上の本発明のキシラナーゼを含む動物飼料組成物および動物飼料添加物にも関する。ある実施形態において、動物飼料または動物飼料添加物は、配合剤と１つ以上の本発明のキシラナーゼとを含む。さらなる実施形態において、配合剤は、以下の化合物：グリセロール、エチレングリコール、１，２−プロピレングリコールまたは１，３−プロピレングリコール、塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、チオ硫酸ナトリウム、炭酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、デキストリン、グルコース、スクロース、ソルビトール、ラクトース、デンプンおよびセルロースのうちの１つ以上を含む。
従って本発明はさらに、１つ以上のビタミンと本発明のキシラナーゼ変異体とを含む動物飼料添加物に関する。本発明はまた、１つ以上のミネラルと本発明のキシラナーゼ変異体とを含む動物飼料添加物にも関する。本発明はまた、１つ以上のアミノ酸と本発明のキシラナーゼ変異体とを含む動物飼料添加物にも関する。
ある実施形態において、動物飼料添加物中の酵素の量は、組成物の重量を基準として０．００１％〜１０％である。
ある実施形態において、動物飼料添加物は、好ましくは本明細書において上記に記載されるとおりの、１つ以上の配合剤を含む。
ある実施形態において、動物飼料添加物は、好ましくは本明細書において以下に記載するとおりの、１つ以上の追加的な酵素を含む。
ある実施形態において、動物飼料添加物は、好ましくは本明細書において以下に記載するとおりの、１つ以上のプロバイオティクスを含む。
ある実施形態において、動物飼料添加物は、好ましくは本明細書において以下に記載するとおりの、１つ以上のビタミンを含む。
ある実施形態において、動物飼料添加物は、好ましくは本明細書において以下に記載するとおりの、１つ以上のミネラルを含む。
ある実施形態において、動物飼料添加物は、好ましくは本明細書において以下に記載するとおりの、１つ以上のアミノ酸を含む。
ある実施形態において、動物飼料添加物は、好ましくは本明細書において以下に記載するとおりの、１つ以上のプレバイオティクスを含む。
ある実施形態において、動物飼料添加物は、好ましくは本明細書において以下に記載するとおりの、１つ以上の有機酸を含む。
ある実施形態において、動物飼料添加物は、好ましくは本明細書において以下に記載するとおりの、１つ以上のフィトジェニクス（ｐｈｙｔｏｇｅｎｉｃｓ）を含む。
動物飼料
本発明はまた、１つ以上の本発明のキシラナーゼ変異体を含む動物飼料組成物にも関する。本発明はまた、本明細書に記載されるとおりの顆粒と植物系材料とを含む動物飼料にも関する。本発明はまた、本明細書に記載されるとおりの動物飼料添加物と植物系材料とを含む動物飼料にも関する。一実施形態において、植物系材料はキビ亜科（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ）からのものである。
動物飼料組成物または餌は、比較的高含量のタンパク質を有する。家禽およびブタの餌は、国際公開第０１／５８２７５号パンフレットの表Ｂ、列２〜３に示されるとおり特徴付けることができる。魚の餌は、この表Ｂの列４に示されるとおり特徴付けることができる。さらに、かかる魚の餌は通常、２００〜３１０ｇ／ｋｇの粗脂肪含量を有する。
本発明に係る動物飼料組成物は５０〜８００ｇ／ｋｇの粗タンパク質含量を有し、さらに、少なくとも１つの本明細書で特許請求されるとおりのキシラナーゼを含む。
さらに、または（上記に示した粗タンパク質含量の）代替として、本発明の動物飼料組成物は、１０〜３０ＭＪ／ｋｇの代謝可能エネルギー含量；および／または０．１〜２００ｇ／ｋｇのカルシウム含量；および／または０．１〜２００ｇ／ｋｇの利用可能リン含量；および／または０．１〜１００ｇ／ｋｇのメチオニン含量；および／または０．１〜１５０ｇ／ｋｇのメチオニン＋システイン含量；および／または０．５〜５０ｇ／のリジン含量を有する。
詳細な実施形態において、代謝可能エネルギー、粗タンパク質、カルシウム、リン、メチオニン、メチオニン＋システイン、および／またはリジンの含量は、国際公開第０１／５８２７５号パンフレットの表Ｂにある範囲２、３、４または５（Ｒ．２〜５）のいずれか１つの範囲内である。
粗タンパク質は、窒素（Ｎ）に係数６．２５を乗じたものとして計算され、すなわち粗タンパク質（ｇ／ｋｇ）＝Ｎ（ｇ／ｋｇ）×６．２５である。窒素含量はケルダール法（Ａ．Ｏ．Ａ．Ｃ．，１９８４、Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ａｎａｌｙｓｉｓ １４ｔｈ ｅｄ．，Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ）によって決定される。
代謝可能エネルギーは、ＮＲＣ刊行物「ブタにおける栄養要求（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｓｗｉｎｅ）」，改訂第９版，１９８８年，ブタ栄養分科会（ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ ｓｗｉｎｅ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ），動物栄養委員会（ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ ａｎｉｍａｌ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ），農業理事会（ｂｏａｒｄ ｏｆ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ），国立研究評議会（ｎａｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｕｎｃｉｌ）．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ｐｐ．２−６、および欧州家禽飼料エネルギー値表（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｔａｂｌｅ ｏｆ Ｅｎｅｒｇｙ Ｖａｌｕｅｓ ｆｏｒ Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｆｅｅｄ−ｓｔｕｆｆｓ），Ｓｐｅｌｄｅｒｈｏｌｔ ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ ｐｏｕｌｔｒｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ，７３６１ ＤＡ Ｂｅｅｋｂｅｒｇｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ．Ｇｒａｆｉｓｃｈ ｂｅｄｒｉｊｆ Ｐｏｎｓｅｎ ＆ ｌｏｏｉｊｅｎ ｂｖ，Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ．ＩＳＢＮ ９０−７１４６３−１２−５に基づき計算することができる。
完全動物食品中のカルシウム、利用可能リンおよびアミノ酸の食餌含量は、Ｖｅｅｖｏｅｄｅｒｔａｂｅｌ １９９７，ｇｅｇｅｖｅｎｓ ｏｖｅｒ ｃｈｅｍｉｓｃｈｅ ｓａｍｅｎｓｔｅｌｌｉｎｇ，ｖｅｒｔｅｅｒｂａａｒｈｅｉｄ ｅｎ ｖｏｅｄｅｒｗａａｒｄｅ ｖａｎ ｖｏｅｄｅｒｍｉｄｄｅｌｅｎ，Ｃｅｎｔｒａｌ Ｖｅｅｖｏｅｄｅｒｂｕｒｅａｕ，Ｒｕｎｄｅｒｗｅｇ ６，８２１９ ｐｋ Ｌｅｌｙｓｔａｄ．ＩＳＢＮ ９０−７２８３９−１３−７などの飼料表に基づき計算される。
詳細な実施形態において、本発明の動物飼料組成物は、上記に定義するとおりの少なくとも１つの植物性タンパク質を含有する。
本発明の動物飼料組成物はまた、肉骨粉、羽毛粉、および／または魚粉などの動物性タンパク質も、典型的には０〜２５％の量で含有し得る。本発明の動物飼料組成物はまた、可溶性物質を含む乾燥醸造用穀物（Ｄｒｉｅｄ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ Ｇｒａｉｎｓ ｗｉｔｈ Ｓｏｌｕｂｌｅｓ：ＤＤＧＳ）も、典型的には０〜３０％の量で含み得る。
なおもさらに詳細な実施形態において、本発明の動物飼料組成物は、０〜８０％トウモロコシ；および／または０〜８０％モロコシ；および／または０〜７０％コムギ；および／または０〜７０％オオムギ；および／または０〜３０％エンバク；および／または０〜４０％大豆ミール；および／または０〜２５％魚粉；および／または０〜２５％肉骨粉；および／または０〜２０％乳清を含有する。
動物飼料は植物性タンパク質を含み得る。詳細な実施形態において、植物性タンパク質のタンパク質含量は少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％（ｗ／ｗ）である。植物性タンパク質は、マメ科植物および穀類、例えば、マメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）（マメ科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ））、アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｃｅａｅ）、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）、およびイネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）の植物からの材料、例えば、大豆ミール、ルピナスミール、菜種ミール、およびこれらの組み合わせなどの植物性タンパク質供給源に由来してもよい。
詳細な実施形態において、植物性タンパク質供給源は、マメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）の１つ以上の植物からの材料、例えば、ダイズ、ルピナス、エンドウマメ、またはマメである。別の詳細な実施形態において、植物性タンパク質供給源は、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）の１つ以上の植物からの材料、例えば、テンサイ、サトウダイコン、ホウレンソウまたはキノアである。植物性タンパク質供給源の他の例は、菜種、およびキャベツである。別の詳細な実施形態において、ダイズが好ましい植物性タンパク質供給源である。植物性タンパク質供給源の他の例は、オオムギ、コムギ、ライムギ、エンバク、トウモロコシ（コーン）、コメ、およびモロコシなどの穀類である。
動物の餌は、例えばマッシュ飼料（非ペレット状）またはペレット状飼料として製造することができる。典型的には、粉砕飼料が混合され、当該の種向けの規格に従い十分な量の必須ビタミンおよびミネラルが加えられる。酵素は固体または液体酵素配合物として加えることができる。例えば、マッシュ飼料については、固体または液体酵素配合物は原料混合ステップの前またはその最中に加えられてもよい。ペレット状飼料についてもまた、（液体または固体）キシラナーゼ／酵素調製物は飼料原料ステップの前またはその最中に加えられてもよい。典型的には液体キシラナーゼ／酵素調製物は本発明のキシラナーゼを任意選択でグリセロール、エチレングリコールまたはプロピレングリコールなどのポリオールと共に含み、液体配合物をペレットに噴霧することによるなど、ペレット化ステップの後に加えられる。酵素はまた、飼料添加物またはプレミックスに混入されてもよい。
或いは、キシラナーゼは、粉末大豆ミールなどの増量剤との液体酵素溶液の混合物を冷凍し、次にその混合物を凍結乾燥することにより調製し得る。
餌中の最終的な酵素濃度は、餌１ｋｇ当たり０．０１〜２００ｍｇの酵素タンパク質、好ましくは０．０５〜１００ｍｇ／ｋｇ餌、より好ましくは０．１〜５０ｍｇ、さらにより好ましくは動物の餌１ｋｇ当たり０．２〜２０ｍｇの酵素タンパク質の範囲内である。
現在のところ、酵素は以下の量（投与量範囲）：０．０１〜２００；０．０５〜１００；０．１〜５０；０．２〜２０；０．１〜１；０．２〜２；０．５〜５；または１〜１０（−これらの範囲は全て、飼料１ｋｇ当たりのｍｇキシラナーゼタンパク質（ｐｐｍ）である）のうちの１つ以上で投与されることが企図される。
飼料１ｋｇ当たりのｍｇキシラナーゼタンパク質を決定するためには、飼料組成物からキシラナーゼが精製され、相対アッセイを用いて精製キシラナーゼの比活性が決定される（キシラナーゼ活性の項を参照）。従って飼料組成物のキシラナーゼ活性もまた同じアッセイを用いて決定され、およびこれらの２つの決定に基づき、飼料１ｋｇ当たりのｍｇキシラナーゼタンパク質としての投与量が計算される。
詳細な実施形態において、本発明の動物飼料添加物は、動物の餌または飼料中に０．０１〜１０．０％；より詳細には０．０５〜５．０％；または０．２〜１．０％（％は１００ｇの飼料当たりのｇ添加剤を意味する）のレベルで含まれることが意図される（または含まれる必要があると規定される）。従ってこれは詳細にはプレミックス用である。
同じ原則が飼料添加物中のｍｇキシラナーゼタンパク質の決定に適用される。当然ながら、飼料添加物または飼料の調製に使用されるキシラナーゼのサンプルが利用可能である場合、比活性はこのサンプルから決定される（飼料組成物または添加剤からキシラナーゼを精製する必要はない）。
キビ亜科（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ）からの植物系材料
一実施形態において、キビ亜科（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ）からの植物系材料は、ウシクサ連（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎｅａｅ）、例えば、階級ウシクサ属（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ）またはアンドロプテルム属（Ａｎｄｒｏｐｔｅｒｕｍ）またはオキナワカルカヤ属（Ａｐｌｕｄａ）またはアポコピス属（Ａｐｏｃｏｐｉｓ）またはコブナグサ属（Ａｒｔｈｒａｘｏｎ）またはモンツキガヤ属（Ｂｏｔｈｒｉｏｃｈｌｏａ）またはヒメアブラススキ属（Ｃａｐｉｌｌｉｐｅｄｉｕｍ）またはキオナクネ属（Ｃｈｉｏｎａｃｈｎｅ）またはオキナワミチシバ属（Ｃｈｒｙｓｏｐｏｇｏｎ）またはコエロラキス属（Ｃｏｅｌｏｒａｃｈｉｓ）またはジュズダマ属（Ｃｏｉｘ）またはオガルカヤ属（Ｃｙｍｂｏｐｏｇｏｎ）またはオニササガヤ属（Ｄｉｃｈａｎｔｈｉｕｍ）またはジヘテロポゴン属（Ｄｉｈｅｔｅｒｏｐｏｇｏｎ）またはカリマタガヤ属（Ｄｉｍｅｒｉａ）またはエリオヌルス属（Ｅｌｉｏｎｕｒｕｓ）またはチャボウシノシッペイ属（Ｅｒｅｍｏｃｈｌｏａ）またはエウクラスタ属（Ｅｕｃｌａｓｔａ）またはウンヌケ属（Ｅｕｌａｌｉａ）またはゲルマイニア属（Ｇｅｒｍａｉｎｉａ）またはウシノシッペイ属（Ｈｅｍａｒｔｈｒｉａ）またはヘテロフォリス属（Ｈｅｔｅｒｏｐｈｏｌｉｓ）またはアカヒゲガヤ属（Ｈｅｔｅｒｏｐｏｇｏｎ）またはヒッパリガヤ属（Ｈｙｐａｒｒｈｅｎｉａ）またはハイペルテリア属（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｌｉａ）またはチガヤ属（Ｉｍｐｅｒａｔａ）またはカモノハシ属（Ｉｓｃｈａｅｍｕｍ）またはイセイレマ属（Ｉｓｅｉｌｅｍａ）またはケルリオコロア属（Ｋｅｒｒｉｏｃｈｌｏａ）またはアシボソ属（Ｍｉｃｒｏｓｔｅｇｉｕｍ）またはミスカンチジウム属（Ｍｉｓｃａｎｔｈｉｄｉｕｍ）またはススキ属（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）またはヌネシテア属（Ｍｎｅｓｉｔｈｅａ）またはオフィウロス属（Ｏｐｈｉｕｒｏｓ）またはオクシルハキス（Ｏｘｙｒｈａｃｈｉｓ）またはアイアシ属（Ｐｈａｃｅｌｕｒｕｓ）またはフォリウルス属（Ｐｈｏｌｉｕｒｕｓ）またはイタチガヤ属（Ｐｏｇｏｎａｔｈｅｒｕｍ）またはポリトカ属（Ｐｏｌｙｔｏｃａ）またはポリトリアス属（Ｐｏｌｙｔｒｉａｓ）またはシュードポゴナテルム（Ｐｓｅｕｄｏｐｏｇｏｎａｔｈｅｒｕｍ）またはシュードソルグフム属（Ｐｓｅｕｄｏｓｏｒｇｈｕｍ）またはリタクネ属（Ｒｈｙｔａｃｈｎｅ）またはツノアイアシ属（Ｒｏｔｔｂｏｅｌｌｉａ）またはワセオバナ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）（例えばサトウキビ）またはサルガ属（Ｓａｒｇａ）またはウシクサ属（Ｓｃｈｉｚａｃｈｙｒｉｕｍ）またはセヒマ属（Ｓｅｈｉｍａ）またはソルガストルム属（Ｓｏｒｇｈａｓｔｒｕｍ）またはモロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）またはオオアブラススキ属（Ｓｐｏｄｉｏｐｏｇｏｎ）またはヒメウシノシッペイ属（Ｔｈａｕｍａｓｔｏｃｈｌｏａ）またはテレポゴン属（Ｔｈｅｌｅｐｏｇｏｎ）またはメガルカヤ属（Ｔｈｅｍｅｄａ）またはトラキポゴン属（Ｔｒａｃｈｙｐｏｇｏｎ）またはオギ節（Ｔｒｉａｒｒｈｅｎａ）またはトリプサクム属（Ｔｒｉｐｓａｃｕｍ）またはウレリトルム属（Ｕｒｅｌｙｔｒｕｍ）またはベチベル属（Ｖｅｔｉｖｅｒｉａ）またはボッシア属（Ｖｏｓｓｉａ）またはクセロクロア属（Ｘｅｒｏｃｈｌｏａ）またはトウモロコシ属（Ｚｅａ）からのものである。
好ましい実施形態において、キビ亜科（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ）からの植物系材料は、階級トウモロコシ属（Ｚｅａ）からのもの、例えば、種、ゼア・ディプロペレンニス（Ｚｅａ ｄｉｐｌｏｐｅｒｅｎｎｉｓ）、ゼア・ルクシュリアンス（Ｚｅａ ｌｕｘｕｒｉａｎｓ）、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、ゼア・ニカラグエンシス（Ｚｅａ ｎｉｃａｒａｇｕｅｎｓｉｓ）またはゼア・ペレンニス（Ｚｅａ ｐｅｒｅｎｎｉｓ）である。
好ましい実施形態において、キビ亜科（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ）からの植物系材料は、階級ソルガム属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）からのもの、例えば、種、ソルガム・アンプルム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ａｍｐｌｕｍ）、ソルガム・アングスツム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ａｎｇｕｓｔｕｍ）、ソルガム・アルンディナセウム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅｕｍ）、ソルガム・アウストラリエンセ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ａｕｓｔｒａｌｉｅｎｓｅ）、ソルガム・ビコロル（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、ソルガム・ブラキポデュム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｒａｃｈｙｐｏｄｕｍ）、ソルガム・ブルボスム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｕｌｂｏｓｕｍ）、ソルガム・エカリナツム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｅｃａｒｉｎａｔｕｍ）、ソルガム・エクススタンス（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｅｘｓｔａｎｓ）、ソルガム・グランデ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｇｒａｎｄｅ）、ソルガム・ハレペンセ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｈａｌｅｐｅｎｓｅ）、ソルガム属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）ハイブリッド栽培品種、ソルガム・インテルジェクツム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｉｎｔｅｒｊｅｃｔｕｍ）、ソルガム・イントランス（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｉｎｔｒａｎｓ）、ソルガム・ラクシフロルム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｌａｘｉｆｌｏｒｕｍ）、ソルガム・レイオクラデュム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｌｅｉｏｃｌａｄｕｍ）、ソルガム・マクロスペルムム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｍａｃｒｏｓｐｅｒｍｕｍ）、ソルガム・マタランケンセ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｍａｔａｒａｎｋｅｎｓｅ）、ソルガム・ニチデュム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｎｉｔｉｄｕｍ）、ソルガム・プルモスム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｐｌｕｍｏｓｕｍ）、ソルガム・プロピンクウム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｐｒｏｐｉｎｑｕｕｍ）、ソルガム・プルプレオセリセウム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｐｕｒｐｕｒｅｏｓｅｒｉｃｅｕｍ）、ソルガム・スチポイデウム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｓｔｉｐｏｉｄｅｕｍ）、ソルガム・スダネンセ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｓｕｄａｎｅｎｓｅ）、ソルガム・チモレンセ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｔｉｍｏｒｅｎｓｅ）、ソルガム・ベルシコロル（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、ソルガム属種（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｓｐ．）「シルク（Ｓｉｌｋ）」または国際公開第２００７／００２２６７号パンフレットに定義されるとおりのソルガム属種（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｓｐ．）である。
別の実施形態において、キビ亜科（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ）からの植物系材料は、キビ連（Ｐａｎｉｃｅａｅ）からのもの、例えば、階級、アクリトカエテ属（Ａｃｒｉｔｏｃｈａｅｔｅ）、アクロケラス属（Ａｃｒｏｃｅｒａｓ）、アレクスフロイディア属（Ａｌｅｘｆｌｏｙｄｉａ）、アルロテロプシス属（Ａｌｌｏｔｅｒｏｐｓｉｓ）、アンフィカルプム属（Ａｍｐｈｉｃａｒｐｕｍ）、アンキストラクネ属（Ａｎｃｉｓｔｒａｃｈｎｅ）、アンテフォラ属（Ａｎｔｈｅｐｈｏｒａ）、ビロードキビ属（Ｂｒａｃｈｉａｒｉａ）（例えばシグナルグラス）、カリプトコロア属（Ｃａｌｙｐｔｏｃｈｌｏａ）、クリノイガ属（Ｃｅｎｃｈｒｕｓ）、ケチウム属（Ｃｈａｅｔｉｕｍ）、ケトポア属（Ｃｈａｅｔｏｐｏａ）、カメラフィス属（Ｃｈａｍａｅｒａｐｈｉｓ）、クロロカリムマ属（Ｃｈｌｏｒｏｃａｌｙｍｍａ）、クレイストクロア属（Ｃｌｅｉｓｔｏｃｈｌｏａ）、キフォクレナ属（Ｃｙｐｈｏｃｈｌａｅｎａ）、ヒメチゴザサ属（Ｃｙｒｔｏｃｏｃｃｕｍ）、ニコゲヌカキビ属（Ｄｉｃｈａｎｔｈｅｌｉｕｍ）、メヒシバ属（Ｄｉｇｉｔａｒｉａ）、ディスソコンドルス属（Ｄｉｓｓｏｃｈｏｎｄｒｕｓ）、ヒエ属（Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ）、エントラシア属（Ｅｎｔｏｌａｓｉａ）、ナルコビエ属（Ｅｒｉｏｃｈｌｏａ）、ホモフォリス属（Ｈｏｍｏｐｈｏｌｉｓ）、ヒグロクロア属（Ｈｙｇｒｏｃｈｌｏａ）、ヒレバテス属（Ｈｙｌｅｂａｔｅｓ）、イクソフォルス属（Ｉｘｏｐｈｏｒｕｓ）、ラシアキス属（Ｌａｓｉａｃｉｓ）、レウコフリス属（Ｌｅｕｃｏｐｈｒｙｓ）、ロウイシエルラ属（Ｌｏｕｉｓｉｅｌｌａ）、メガロプロタクネ属（Ｍｅｇａｌｏｐｒｏｔａｃｈｎｅ）、メガチルスス属（Ｍｅｇａｔｈｙｒｓｕｓ）、メリニス属（Ｍｅｌｉｎｉｓ）、ミクロカラムス属（Ｍｉｃｒｏｃａｌａｍｕｓ）、ヒメスズメノヒエ属（Ｍｏｏｒｏｃｈｌｏａ）、ネウラクネ属（Ｎｅｕｒａｃｈｎｅ）、オドンテリトルム属（Ｏｄｏｎｔｅｌｙｔｒｕｍ）、チヂミザサ属（Ｏｐｌｉｓｍｅｎｕｓ）、オットクロア属（Ｏｔｔｏｃｈｌｏａ）、キビ属（Ｐａｎｉｃｕｍ）、パラクテヌム属（Ｐａｒａｃｔａｅｎｕｍ）、パラネウラクネ属（Ｐａｒａｎｅｕｒａｃｈｎｅ）、パラテリア属（Ｐａｒａｔｈｅｒｉａ）、パロディオフィルロクロア属（Ｐａｒｏｄｉｏｐｈｙｌｌｏｃｈｌｏａ）、スズメノヒエツナギ属（Ｐａｓｐａｌｉｄｉｕｍ）、チカラシバ属（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）、プラジオセツム属（Ｐｌａｇｉｏｓｅｔｕｍ）、ポエキロスタキス属（Ｐｏｅｃｉｌｏｓｔａｃｈｙｓ）、シューデキノレナ属（Ｐｓｅｕｄｅｃｈｉｎｏｌａｅｎａ）、シュードケトクロア属（Ｐｓｅｕｄｏｃｈａｅｔｏｃｈｌｏａ）、ウキシバ属（Ｐｓｅｕｄｏｒａｐｈｉｓ）、ルピクロア属（Ｒｕｐｉｃｈｌｏａ）、ヌメリグサ属（Ｓａｃｃｉｏｌｅｐｉｓ）、スクタクネ属（Ｓｃｕｔａｃｈｎｅ）、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）、セタリオプシス属（Ｓｅｔａｒｉｏｐｓｉｓ）、スノウデニア属（Ｓｎｏｗｄｅｎｉａ）、ツキイゲ属（Ｓｐｉｎｉｆｅｘ）、イヌシバ属（Ｓｔｅｎｏｔａｐｈｒｕｍ）、ステレオクレナ属（Ｓｔｅｒｅｏｃｈｌａｅｎａ）、トラスヤ属（Ｔｈｒａｓｙａ）、クロイワザサ属（Ｔｈｕａｒｅａ）、チリドレピス属（Ｔｈｙｒｉｄｏｌｅｐｉｓ）、トリコレナ属（Ｔｒｉｃｈｏｌａｅｎａ）、未分類のキビ連（Ｐａｎｉｃｅａｅ）、ウラントエキウム属（Ｕｒａｎｔｈｏｅｃｉｕｍ）、ニクキビモドキ属（Ｕｒｏｃｈｌｏａ）（例えばシグナルグラス）、ワルワルレヤ属（Ｗａｌｗｈａｌｌｅｙａ）、ホワイテオクロア属（Ｗｈｉｔｅｏｃｈｌｏａ）、ヤキルラ属（Ｙａｋｉｒｒａ）、イベシア属（Ｙｖｅｓｉａ）、ズロアゲア属（Ｚｕｌｏａｇａｅａ）またはジゴクロア属（Ｚｙｇｏｃｈｌｏａ）である。
好ましい実施形態において、キビ亜科（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ）からの植物系材料は、階級、キビ属（Ｐａｎｉｃｕｍ）からのもの、例えば、種、パニクム・アデノフォルム（Ｐａｎｉｃｕｍ ａｄｅｎｏｐｈｏｒｕｍ）、パニクム属未同定種アクアチクムＪＫＴ−２０１２（Ｐａｎｉｃｕｍ ａｆｆ．ａｑｕａｔｉｃｕｍ ＪＫＴ−２０１２）、パニクム・アマルム（Ｐａｎｉｃｕｍ ａｍａｒｕｍ）、パニクム・アンチドタレ（Ｐａｎｉｃｕｍ ａｎｔｉｄｏｔａｌｅ）、パニクム・アクアチクム（Ｐａｎｉｃｕｍ ａｑｕａｔｉｃｕｍ）、パニクム・アルクツム（Ｐａｎｉｃｕｍ ａｒｃｔｕｍ）、パニクム・アルンディナリエ（Ｐａｎｉｃｕｍ ａｒｕｎｄｉｎａｒｉａｅ）、パニクム・アトロサングイネウム（Ｐａｎｉｃｕｍ ａｔｒｏｓａｎｇｕｉｎｅｕｍ）、パニクム・アウリコムム（Ｐａｎｉｃｕｍ ａｕｒｉｃｏｍｕｍ）、パニクム・アウリツム（Ｐａｎｉｃｕｍ ａｕｒｉｔｕｍ）、パニクム・バルトレッティイ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｂａｒｔｌｅｔｔｉｉ）、パニクム・ベルギイ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｂｅｒｇｉｉ）、パニクム・ビスルカツム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｂｉｓｕｌｃａｔｕｍ）、パニクム・ボリビエンセ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｂｏｌｉｖｉｅｎｓｅ）、パニクム・ブラッザビッレンセ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｂｒａｚｚａｖｉｌｌｅｎｓｅ）、パニクム・ブレビホリウム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉｕｍ）、パニクム・カアグアズエンセ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｃａａｇｕａｚｕｅｎｓｅ）、パニクム・カンペストレ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｃａｍｐｅｓｔｒｅ）、パニクム・カピッラレ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｃａｐｉｌｌａｒｅ）、パニクム・カイエンネンセ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｃａｙｅｎｎｅｎｓｅ）、パニクム・カイヨエンセ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｃａｙｏｅｎｓｅ）、パニクム・ケルビカツム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｃｅｒｖｉｃａｔｕｍ）、パニクム・クロロレウクム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｃｈｌｏｒｏｌｅｕｃｕｍ）、パニクム・クライトニイ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｃｌａｙｔｏｎｉｉ）、パニクム・コロラツム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｃｏｌｏｒａｔｕｍ）、パニクム・キアネセンス（Ｐａｎｉｃｕｍ ｃｙａｎｅｓｃｅｎｓ）、パニクム・デコンポシツム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｕｍ）、パニクム・デウスツム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｄｅｕｓｔｕｍ）、パニクム・ディコトミフロルム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｄｉｃｈｏｔｏｍｉｆｌｏｒｕｍ）、パニクム・ディンクラゲイ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｄｉｎｋｌａｇｅｉ）、パニクム・ディスチコフィッルム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｄｉｓｔｉｃｈｏｐｈｙｌｌｕｍ）、パニクム・ドレゲアヌム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｄｒｅｇｅａｎｕｍ）、パニクム・エレファンチペス（Ｐａｎｉｃｕｍ ｅｌｅｐｈａｎｔｉｐｅｓ）、パニクム・ファウリエイ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｆａｕｒｉｅｉ）、パニクム・フレクシレ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｆｌｅｘｉｌｅ）、パニクム・フルビイコラ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｆｌｕｖｉｉｃｏｌａ）、パニクム・ゴウイニイ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｇｏｕｉｎｉｉ）、パニクム・グラキリカウレ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｇｒａｃｉｌｉｃａｕｌｅ）、パニクム・グラヌリフェルム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｇｒａｎｕｌｉｆｅｒｕｍ）、パニクム・グラテマレンセ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｇｕａｔｅｍａｌｅｎｓｅ）、パニクム・ハッリイ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｈａｌｌｉｉ）、パニクム・ヘテロスタキウム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｔａｃｈｙｕｍ）、パニクム・ヒルチカウレ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｈｉｒｔｉｃａｕｌｅ）、パニクム・ヒルツム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｈｉｒｔｕｍ）、パニクム・ヒレイクム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｈｙｌａｅｉｃｕｍ）、パニクム・インクムベンス（Ｐａｎｉｃｕｍ ｉｎｃｕｍｂｅｎｓ）、パニクム・インフェスツム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｉｎｆｅｓｔｕｍ）、パニクム・イタリクム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｉｔａｌｉｃｕｍ）、パニクム・レツム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｌａｅｔｕｍ）、パニクム・レビノデ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｌａｅｖｉｎｏｄｅ）、パニクム・ラニペス（Ｐａｎｉｃｕｍ ｌａｎｉｐｅｓ）、パニクム・ラルコミアヌム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｌａｒｃｏｍｉａｎｕｍ）、パニクム・ロンギペディケッラツム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｌｏｎｇｉｐｅｄｉｃｅｌｌａｔｕｍ）、パニクム・マクリシアヌム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍａｃｈｒｉｓｉａｎｕｍ）、パニクム・マラコトリクム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍａｌａｃｏｔｒｉｃｈｕｍ）、パニクム・マルガリチフェルム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍａｒｇａｒｉｔｉｆｅｒｕｍ）、パニクム・ミクランサム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍｉｃｒａｎｔｈｕｍ）、パニクム・ミリアケウム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍｉｌｉａｃｅｕｍ）、パニクム・ミリオイデス（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍｉｌｉｏｉｄｅｓ）、パニクム・ミッレグラナ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍｉｌｌｅｇｒａｎａ）、パニクム・ミスタシピュム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍｙｓｔａｓｉｐｕｍ）、パニクム・ナタレンセ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｎａｔａｌｅｎｓｅ）、パニクム・ネフェロフィルム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｎｅｐｈｅｌｏｐｈｉｌｕｍ）、パニクム・ネルボスム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｎｅｒｖｏｓｕｍ）、パニクム・ノタツム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｎｏｔａｔｕｍ）、パニクム・オリロイデス（Ｐａｎｉｃｕｍ ｏｌｙｒｏｉｄｅｓ）、パニクム・パルドスム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｐａｌｕｄｏｓｕｍ）、パニクム・パンスム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｐａｎｓｕｍ）、パニクム・パントリクム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｐａｎｔｒｉｃｈｕｍ）、パニクム・パルビフォリウム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｐａｒｖｉｆｏｌｉｕｍ）、パニクム・パルビグルメ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｅ）、パニクム・ペデルセニイ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｐｅｄｅｒｓｅｎｉｉ）、パニクム・ペニシッラツム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｐｅｎｉｃｉｌｌａｔｕｍ）、パニクム・ペテルソニイ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｐｅｔｅｒｓｏｎｉｉ）、パニクム・ファラグミトイデス（Ｐａｎｉｃｕｍ ｐｈｒａｇｍｉｔｏｉｄｅｓ）、パニクム・ピアウイエンセ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｐｉａｕｉｅｎｓｅ）、パニクム・ピロスム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｐｉｌｏｓｕｍ）、パニクム・プレイアンツム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｐｌｅｉａｎｔｈｕｍ）、パニクム・ポリコムム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｐｏｌｙｃｏｍｕｍ）、パニクム・ポリゴナツム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｐｏｌｙｇｏｎａｔｕｍ）、パニクム・シューディサクネ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｐｓｅｕｄｉｓａｃｈｎｅ）、パニクム・ピグメウム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｐｙｇｍａｅｕｍ）、パニクム・ピルラリウム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｐｙｒｕｌａｒｉｕｍ）、パニクム・クイーンズランディクム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、パニクム・ラケモスム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｒａｃｅｍｏｓｕｍ）、パニクム・レペンス（Ｐａｎｉｃｕｍ ｒｅｐｅｎｓ）、パニクム・リゾゴヌム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｒｈｉｚｏｇｏｎｕｍ）、パニクム・リギデュルム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｒｉｇｉｄｕｌｕｍ）、パニクム・リバレ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｒｉｖａｌｅ）、パニクム・ルデ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｒｕｄｅ）、パニクム・ルドゲイ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｒｕｄｇｅｉ）、パニクム・スキンジイ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｓｃｈｉｎｚｉｉ）、パニクム・シュワッケアヌム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｓｃｈｗａｃｋｅａｎｕｍ）、パニクム・セッロウィイ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｓｅｌｌｏｗｉｉ）、パニクム・セミヌデュム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｓｅｍｉｎｕｄｕｍ）、パニクム・スタプフィアヌム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｓｔａｐｆｉａｎｕｍ）、パニクム・ステノデス（Ｐａｎｉｃｕｍ ｓｔｅｎｏｄｅｓ）、パニクム・ストラミネウム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｓｔｒａｍｉｎｅｕｍ）、パニクム・スバルビデュム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｓｕｂａｌｂｉｄｕｍ）、パニクム・スブティラムロスム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｓｕｂｔｉｒａｍｕｌｏｓｕｍ）、パニクム・スマトレンセ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｓｕｍａｔｒｅｎｓｅ）、パニクム・テネッルム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｔｅｎｅｌｌｕｍ）、パニクム・テヌイフォリウム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｔｅｎｕｉｆｏｌｉｕｍ）、パニクム・トリカンツム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｔｒｉｃｈａｎｔｈｕｍ）、パニクム・トリキディアクネ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｔｒｉｃｈｉｄｉａｃｈｎｅ）、パニクム・トリコイデス（Ｐａｎｉｃｕｍ ｔｒｉｃｈｏｉｄｅｓ）、パニクム・トリコレノイデス（Ｐａｎｉｃｕｍ ｔｒｉｃｈｏｌａｅｎｏｉｄｅｓ）、パニクム・ツエルクヘイミイ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｔｕｅｒｃｋｈｅｉｍｉｉ）、パニクム・ツルギデュム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｔｕｒｇｉｄｕｍ）、パニクム・ウルビッレアヌム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｕｒｖｉｌｌｅａｎｕｍ）、パニクム・バリデュム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｖａｌｉｄｕｍ）、パニクム・ベネズエレ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）、パニクム・ベッルコスム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ）、パニクム・ビルガツム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ）、パニクム・ウェットシュテイニイ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｗｅｔｔｓｔｅｉｎｉｉ）、キビ属種（Ｐａｎｉｃｕｍ ｓｐ．）、キビ属種クリスティン１６−２００（Ｐａｎｉｃｕｍ ｓｐ．Ｃｈｒｉｓｔｉｎ １６−２００）、キビ属種ＥＬＳ−２０１１（Ｐａｎｉｃｕｍ ｓｐ．ＥＬＳ−２０１１）、キビ属種ＥＭ３８９（Ｐａｎｉｃｕｍ ｓｐ．ＥＭ３８９）またはキビ属種フォレスト７６１（Ｐａｎｉｃｕｍ ｓｐ．Ｆｏｒｅｓｔ ７６１）である。
さらなる実施形態において、キビ亜科（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ）からの植物系材料は、トウモロコシ（トウモロコシ属（Ｚｅａ））、コーン（トウモロコシ属（Ｚｅａ））、モロコシ（ソルガム属（Ｓｏｒｇｈｕｍ））、スイッチグラス（パニクム・ビルガツム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ））、キビ（パニクム・ミリアケウム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍｉｌｉａｃｅｕｍ））、トウジンビエ（ケンクルス・ビオラケウス（Ｃｅｎｃｈｒｕｓ ｖｉｏｌａｃｅｕｓ）、別称ペニセタム・グラウクム（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ））、アワ（セタリア・イタリカ（Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ）、別称パニクム・イタリクム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｉｔａｌｉｃｕｍ））または加工形態、例えば、粉砕コーン、粉砕トウモロコシ、脱脂トウモロコシ、脱脂・脱デンプントウモロコシ、粉砕モロコシ、粉砕スイッチグラス、粉砕キビ、粉砕アワ、粉砕トウジンビエ、またはこれらの任意の組み合わせである。
ある実施形態において、キビ亜科（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ）からの植物系材料は、植物の種子からのものである。好ましい実施形態において、キビ亜科（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ）からの植物系材料は、トウモロコシ（トウモロコシ属（Ｚｅａ））、コーン（トウモロコシ属（Ｚｅａ））、モロコシ（ソルガム属（Ｓｏｒｇｈｕｍ））、スイッチグラス（パニクム・ビルガツム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ））、キビ（パニクム・ミリアケウム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍｉｌｉａｃｅｕｍ））、トウジンビエ（ケンクルス・ビオラケウス（Ｃｅｎｃｈｒｕｓ ｖｉｏｌａｃｅｕｓ）、ペニセタム・グラウクム（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ）とも称される）、アワ（セタリア・イタリカ（Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ）、パニクム・イタリクム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｉｔａｌｉｃｕｍ）とも称される）の種子からのものであり、または種子は、粉砕コーン、粉砕トウモロコシ、脱脂トウモロコシ、脱脂・脱デンプントウモロコシ、粉砕モロコシ、粉砕スイッチグラス、粉砕キビ、粉砕アワ、粉砕トウジンビエ、またはこれらの任意の組み合わせなど、加工されている。
別の実施形態において、本明細書に記載される組成物は、任意選択で１つ以上の酵素を含む。酵素は、ＮＣ−ＩＵＢＭＢ，１９９２）からのハンドブック「酵素命名法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）」に基づき分類することができ、またインターネット：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｅｎｚｙｍｅ／のＥＮＺＹＭＥサイトも参照のこと。ＥＮＺＹＭＥは、酵素の命名法に関する情報のリポジトリである。これは主として国際生化学・分子生物学連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：ＩＵＢ−ＭＢ）の命名法委員会、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９２の勧告に基づき、ＥＣ（酵素委員会（Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ））番号が付与されている特徴付けられている各種酵素について説明している（Ｂａｉｒｏｃｈ Ａ．「ＥＮＺＹＭＥデータベース（Ｔｈｅ ＥＮＺＹＭＥ ｄａｔａｂａｓｅ）」，２０００，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２８：３０４−３０５）。このＩＵＢ−ＭＢ酵素命名法は、その基質特異性に基づき、かつ場合によってはその分子機構に基づく；かかる分類は、これらの酵素の構造的特徴は反映しない。
エンドグルカナーゼ、キシラナーゼ、ガラクタナーゼ、マンナナーゼ、デキストラナーゼ、リゾチームおよびガラクトシダーゼなど、特定のグリコシドヒドロラーゼ酵素の別の分類が、Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ ｅｔ ａｌ，「炭水化物活性酵素データベース（ＣＡＺｙ）２００３年（Ｔｈｅ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ａｃｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅｓ ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＡＺｙ）ｉｎ ２０１３）」，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１ Ｊａｎｕａｒｙ ２０１４）４２（Ｄ１）：Ｄ４９０−Ｄ４９５に記載されている；ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇもまた参照のこと。
従って本発明の組成物はまた、フィターゼ（ＥＣ３．１．３．８または３．１．３．２６）；キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）；ガラクタナーゼ（ＥＣ３．２．１．８９）；α−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２２）；プロテアーゼ（ＥＣ３．４）；ホスホリパーゼＡ１（ＥＣ３．１．１．３２）；ホスホリパーゼＡ２（ＥＣ３．１．１．４）；リゾホスホリパーゼ（ＥＣ３．１．１．５）；ホスホリパーゼＣ（３．１．４．３）；ホスホリパーゼＤ（ＥＣ３．１．４．４）；例えば、α−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）などのアミラーゼ；アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．５５）；β−キシロシダーゼ（ＥＣ３．２．１．３７）；アセチルキシランエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．７２）；フェルロイルエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．７３）；セルラーゼ（ＥＣ３．２．１．４）；セロビオヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．９１）；β−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）；プルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）、α−マンノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２４）、マンナナーゼ（ＥＣ３．２．１．２５）およびβ−グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４またはＥＣ３．２．１．６）、またはこれらの任意の混合物を含む群から選択される少なくとも１つの他の酵素も含み得る。
詳細な実施形態において、本発明の組成物はフィターゼ（ＥＣ３．１．３．８または３．１．３．２６）を含む。市販のフィターゼの例としては、Ｂｉｏ−Ｆｅｅｄ（商標）Ｐｈｙｔａｓｅ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）Ｐ、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＮＰおよびＲｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＨｉＰｈｏｓ（ＤＳＭ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、Ｎａｔｕｐｈｏｓ（商標）（ＢＡＳＦ）、Ｎａｔｕｐｈｏｓ（商標）Ｅ（ＢＡＳＦ）、Ｆｉｎａｓｅ（登録商標）およびＱｕａｎｔｕｍ（登録商標）Ｂｌｕｅ（ＡＢ Ｅｎｚｙｍｅｓ）、ＯｐｔｉＰｈｏｓ（登録商標）（Ｈｕｖｅｐｈａｒｍａ）、ＡｖｅＭｉｘ（登録商標）Ｐｈｙｔａｓｅ（Ａｖｅｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、Ｐｈｙｚｙｍｅ（登録商標）ＸＰ（Ｖｅｒｅｎｉｕｍ／ＤｕＰｏｎｔ）およびＡｘｔｒａ（登録商標）ＰＨＹ（ＤｕＰｏｎｔ）が挙げられる。他の好ましいフィターゼとしては、例えば、国際公開第９８／２８４０８号パンフレット、国際公開第００／４３５０３号パンフレット、および国際公開第０３／０６６８４７号パンフレットに記載されるものが挙げられる。
詳細な実施形態において、本発明の組成物はキシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）を含む。市販のキシラナーゼの例としては、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＷＸ（ＤＳＭ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、Ｅｃｏｎａｓｅ（登録商標）ＸＴおよびＢａｒｌｅｙ（ＡＢ Ｖｉｓｔａ）、Ｘｙｌａｔｈｉｎ（登録商標）（Ｖｅｒｅｎｉｕｍ）、Ｈｏｓｔａｚｙｍ（登録商標）Ｘ（Ｈｕｖｅｐｈａｒｍａ）、Ａｘｔｒａ（登録商標）ＸＢ（キシラナーゼ／β−グルカナーゼ、ＤｕＰｏｎｔ）およびＡｘｔｒａ（登録商標）ＸＡＰ（キシラナーゼ／アミラーゼ／プロテアーゼ、ＤｕＰｏｎｔ）、ＡｖｅＭｉｘ（登録商標）ＸＧ １０（キシラナーゼ／グルカナーゼ）およびＡｖｅＭｉｘ（登録商標）０２ ＣＳ（キシラナーゼ／グルカナーゼ／ペクチナーゼ、Ａｖｅｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、およびＮａｔｕｒｇｒａｉｎ（ＢＡＳＦ）が挙げられる。
詳細な実施形態において、本発明の組成物はプロテアーゼ（ＥＣ３．４）を含む。市販のプロテアーゼの例としては、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＰｒｏＡｃｔ（ＤＳＭ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）が挙げられる。
詳細な実施形態において、本発明の組成物はα−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）を含む。市販のα−アミラーゼの例としては、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＡおよびＲＯＮＯＺＹＭＥ（登録商標）ＲｕｍｉＳｔａｒ（商標）（ＤＳＭ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）が挙げられる。
一実施形態において、本発明の組成物は、ＦＲＡ（登録商標）Ｏｃｔａｚｙｍｅ（Ｆｒａｍｅｌｃｏ）、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）Ｇ２、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＶＰおよびＲｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＭｕｌｔｉＧｒａｉｎ（ＤＳＭ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、Ｒｏｖａｂｉｏ（登録商標）ＥｘｃｅｌまたはＲｏｖａｂｉｏ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅ（Ａｄｉｓｓｅｏ）などの多成分酵素製品を含む。
追加的な酵素
別の実施形態において、本明細書に記載される組成物は、任意選択で１つ以上の酵素を含む。酵素は、ＮＣ−ＩＵＢＭＢ，１９９２）からのハンドブック「酵素命名法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）」に基づき分類することができ、またインターネット：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｅｎｚｙｍｅ／のＥＮＺＹＭＥサイトも参照のこと。ＥＮＺＹＭＥは、酵素の命名法に関する情報のリポジトリである。これは主として国際生化学・分子生物学連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：ＩＵＢ−ＭＢ）の命名法委員会、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９２の勧告に基づき、ＥＣ（酵素委員会（Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ））番号が付与されている特徴付けられている各種酵素について説明している（Ｂａｉｒｏｃｈ Ａ．「ＥＮＺＹＭＥデータベース（Ｔｈｅ ＥＮＺＹＭＥ ｄａｔａｂａｓｅ）」，２０００，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２８：３０４−３０５）。このＩＵＢ−ＭＢ酵素命名法は、その基質特異性に基づき、かつ場合によってはその分子機構に基づく；かかる分類は、これらの酵素の構造的特徴は反映しない。
エンドグルカナーゼ、ガラクタナーゼ、マンナナーゼ、デキストラナーゼ、リゾチームおよびガラクトシダーゼなど、特定のグリコシドヒドロラーゼ酵素の別の分類が、Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ ｅｔ ａｌ，「炭水化物活性酵素データベース（ＣＡＺｙ）２０１３年（Ｔｈｅ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ａｃｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅｓ ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＡＺｙ）ｉｎ ２０１３）」，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１ Ｊａｎｕａｒｙ ２０１４）４２（Ｄ１）：Ｄ４９０−Ｄ４９５に記載されている；ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇもまた参照のこと。
従って本発明の組成物はまた、アセチルキシランエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．２３）、アシルグリセロールリパーゼ（ＥＣ３．１．１．７２）、α−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）、β−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．２）、アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．５５）、セロビオヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．９１）、セルラーゼ（ＥＣ３．２．１．４）、フェルロイルエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．７３）、ガラクタナーゼ（ＥＣ３．２．１．８９）、α−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２２）、β−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２３）、グルカン１，４−ａ−グルコシダーゼ（グルコアミラーゼ）（ＥＣ３．２．１．３）、グルカン１，４−α−マルトヒドロラーゼ（マルトジェニックα−アミラーゼ）（ＥＣ３．２．１．１３３）、β−グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．６）、β−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）、トリアシルグリセロールリパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）、リゾホスホリパーゼ（ＥＣ３．１．１．５）、リゾチーム（ＥＣ３．２．１．１７）、α−マンノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２４）、β−マンノシダーゼ（マンナナーゼ）（ＥＣ３．２．１．２５）、フィターゼ（ＥＣ３．１．３．８、ＥＣ３．１．３．２６、ＥＣ３．１．３．７２）、ホスホリパーゼＡ１（ＥＣ３．１．１．３２）、ホスホリパーゼＡ２（ＥＣ３．１．１．４）、ホスホリパーゼＤ（ＥＣ３．１．４．４）、プロテアーゼ（ＥＣ３．４）、プルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）、ペクチンエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．１１）、キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８、ＥＣ３．２．１．１３６）、β−キシロシダーゼ（ＥＣ３．２．１．３７）、またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される少なくとも１つの他の酵素も含み得る。
詳細な実施形態において、本発明の組成物はガラクタナーゼ（ＥＣ３．２．１．８９）およびβ−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２３）を含む。
詳細な実施形態において、本発明の組成物はα−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２２）を含む。
詳細な実施形態において、本発明の組成物はフィターゼ（ＥＣ３．１．３．８または３．１．３．２６）を含む。市販のフィターゼの例としては、Ｂｉｏ−Ｆｅｅｄ（商標）Ｐｈｙｔａｓｅ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）Ｐ、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＮＰおよびＲｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＨｉＰｈｏｓ（ＤＳＭ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、Ｎａｔｕｐｈｏｓ（商標）（ＢＡＳＦ）、Ｎａｔｕｐｈｏｓ（商標）Ｅ（ＢＡＳＦ）、Ｆｉｎａｓｅ（登録商標）およびＱｕａｎｔｕｍ（登録商標）Ｂｌｕｅ（ＡＢ Ｅｎｚｙｍｅｓ）、ＯｐｔｉＰｈｏｓ（登録商標）（Ｈｕｖｅｐｈａｒｍａ）、ＡｖｅＭｉｘ（登録商標）Ｐｈｙｔａｓｅ（Ａｖｅｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、Ｐｈｙｚｙｍｅ（登録商標）ＸＰ（Ｖｅｒｅｎｉｕｍ／ＤｕＰｏｎｔ）およびＡｘｔｒａ（登録商標）ＰＨＹ（ＤｕＰｏｎｔ）が挙げられる。他の好ましいフィターゼとしては、例えば、国際公開第９８／２８４０８号パンフレット、国際公開第００／４３５０３号パンフレット、および国際公開第０３／０６６８４７号パンフレットに記載されるものが挙げられる。
詳細な実施形態において、本発明の組成物はキシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）を含む。市販のキシラナーゼの例としては、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＷＸ（ＤＳＭ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、Ｅｃｏｎａｓｅ（登録商標）ＸＴおよびＢａｒｌｅｙ（ＡＢ Ｖｉｓｔａ）、Ｘｙｌａｔｈｉｎ（登録商標）（Ｖｅｒｅｎｉｕｍ）、Ｈｏｓｔａｚｙｍ（登録商標）Ｘ（Ｈｕｖｅｐｈａｒｍａ）、Ａｘｔｒａ（登録商標）ＸＢ（キシラナーゼ／β−グルカナーゼ、ＤｕＰｏｎｔ）およびＡｘｔｒａ（登録商標）ＸＡＰ（キシラナーゼ／アミラーゼ／プロテアーゼ、ＤｕＰｏｎｔ）、ＡｖｅＭｉｘ（登録商標）ＸＧ １０（キシラナーゼ／グルカナーゼ）およびＡｖｅＭｉｘ（登録商標）０２ ＣＳ（キシラナーゼ／グルカナーゼ／ペクチナーゼ、Ａｖｅｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、およびＮａｔｕｒｇｒａｉｎ（ＢＡＳＦ）が挙げられる。
詳細な実施形態において、本発明の組成物はプロテアーゼ（ＥＣ３．４）を含む。市販のプロテアーゼの例としては、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＰｒｏＡｃｔ（ＤＳＭ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）が挙げられる。
詳細な実施形態において、本発明の組成物はα−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）を含む。市販のα−アミラーゼの例としては、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＡおよびＲＯＮＯＺＹＭＥ（登録商標）ＲｕｍｉＳｔａｒ（商標）（ＤＳＭ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）が挙げられる。
一実施形態において、本発明の組成物は、ＦＲＡ（登録商標）Ｏｃｔａｚｙｍｅ（Ｆｒａｍｅｌｃｏ）、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）Ｇ２、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＶＰおよびＲｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＭｕｌｔｉＧｒａｉｎ（ＤＳＭ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、Ｒｏｖａｂｉｏ（登録商標）ＥｘｃｅｌまたはＲｏｖａｂｉｏ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅ（Ａｄｉｓｓｅｏ）などの多成分酵素製品を含む。
ユーバイオティクス
ユーバイオティクスは、胃腸管内の健常なミクロフローラバランスをもたらすように設計される化合物である。ユーバイオティクスには、以下にさらに詳細に記載するプロバイオティクス、プレバイオティクス、フィトジェニクス（精油）および有機酸など、幾つもの異なる飼料添加物が包含される。
プロバイオティクス
ある実施形態において、動物飼料組成物は１つ以上の追加的なプロバイオティクスをさらに含む。詳細な実施形態において、動物飼料組成物は、以下の属：ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）およびメガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）のうちの１つ以上からの細菌またはこれらの任意の組み合わせをさらに含む。
好ましい実施形態において、動物飼料組成物は、以下の株：枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ポリミクサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス属種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ）、およびペディオコッカス属種（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ）、ラクトバチルス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ）、ビフィドバクテリウム属種（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ）、アシドフィルス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ペディオコッカス・アシディラクチシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｓｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、プロピオニバクテリウム・ソエニイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｏｅｎｉｉ）、ラクトバチルス・ファルシミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｕｓ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、クロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ ｓｓｐ．ａｎｉｍａｌｉｓ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス亜種サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｓｓｐ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、メガスフェラ・エルスデニイ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ）、プロピオニバクテリウム属種（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｓｐ）のうちの１つ以上からの細菌をさらに含む。
より好ましい実施形態において、組成物、動物飼料添加物または動物飼料は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の以下の株：３Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０６）、１５Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０７）、２２Ｃ−Ｐ１（ＰＴＡ−６５０８）、２０８４（ＮＲＲＬ Ｂ−５００１３０）、ＬＳＳＡ０１（ＮＲＲＬ−Ｂ−５０１０４）、ＢＳ２７（ＮＲＲＬ Ｂ−５０１ ０５）、ＢＳ １８（ＮＲＲＬ Ｂ−５０６３３）、ＢＳ ２７８（ＮＲＲＬ Ｂ−５０６３４）、ＤＳＭ ２９８７０、ＤＳＭ ２９８７１、ＤＳＭ ３２３１５、ＮＲＲＬ Ｂ−５０１３６、ＮＲＲＬ Ｂ−５０６０５、ＮＲＲＬ Ｂ−５０６０６、ＮＲＲＬ Ｂ−５０６２２およびＰＴＡ−７５４７のうちの１つ以上からの細菌をさらに含む。
より好ましい実施形態において、組成物、動物飼料添加物または動物飼料は、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）の以下の株：ＮＲＲＬ Ｂ−５００１６、ＡＴＣＣ ７００３８５、ＮＲＲＬ Ｂ−５０８８５またはＮＲＲＬ Ｂ−５０８８６のうちの１つ以上からの細菌をさらに含む。
より好ましい実施形態において、組成物、動物飼料添加物または動物飼料は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｆｏｒｍｉｓ）の以下の株：ＮＲＲＬ Ｂ ５００１５、ＮＲＲＬ Ｂ−５０６２１またはＮＲＲＬ Ｂ−５０６２３のうちの１つ以上からの細菌をさらに含む。
より好ましい実施形態において、組成物、動物飼料添加物または動物飼料は、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）の以下の株：ＤＳＭ ２９８６９、ＤＳＭ ２９８６９、ＮＲＲＬ Ｂ ５０６０７、ＰＴＡ−７５４３、ＰＴＡ−７５４９、ＮＲＲＬ Ｂ−５０３４９、ＮＲＲＬ Ｂ−５０６０６、ＮＲＲＬ Ｂ−５００１３、ＮＲＲＬ Ｂ−５０１５１、ＮＲＲＬ Ｂ−５０１４１、ＮＲＲＬ Ｂ−５０１４７またはＮＲＲＬ Ｂ−５０８８８のうちの１つ以上からの細菌をさらに含む。
動物飼料組成物中の細菌株の各々の細菌数は１×１０４〜１×１０１４ＣＦＵ／乾燥物質ｋｇ、好ましくは１×１０６〜１×１０１２ＣＦＵ／乾燥物質ｋｇ、およびより好ましくは１×１０７〜１×１０１１ＣＦＵ／乾燥物質ｋｇである。より好ましい実施形態において動物飼料組成物中の細菌株の各々の細菌数は１×１０８〜１×１０１０ＣＦＵ／乾燥物質ｋｇである。
動物飼料組成物中の細菌株の各々の細菌数は１×１０５〜１×１０１５ＣＦＵ／動物／日、好ましくは１×１０７〜１×１０１３ＣＦＵ／動物／日、およびより好ましくは１×１０８〜１×１０１２ＣＦＵ／動物／日である。より好ましい実施形態において、動物飼料組成物中の細菌株の各々の細菌数は１×１０９〜１×１０１１ＣＦＵ／動物／日である。一実施形態において、プロバイオティクスの量は、組成物の重量を基準として０．００１％〜１０％である。
別の実施形態において、１つ以上の細菌株が、安定した胞子の形態で存在する。
市販の製品の例は、Ｃｙｌａｃｔｉｎ（登録商標）（ＤＳＭ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、Ａｌｔｅｒｉｏｎ（Ａｄｉｓｓｅｏ）、Ｅｎｖｉｖａ ＰＲＯ（ＤｕＰｏｎｔ Ａｎｉｍａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）、Ｓｙｎｃｒａ（登録商標）（ミックス酵素＋プロバイオティクス、ＤｕＰｏｎｔ Ａｎｉｍａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）、Ｅｃｏｂｉｏｌ（登録商標）およびＦｅｃｉｎｏｒ（登録商標）（Ｎｏｒｅｌ／Ｅｖｏｎｉｋ）およびＧｕｔＣａｒｅ（登録商標）ＰＹ１（Ｅｖｏｎｉｋ）である。
プレバイオティクス
プレバイオティクスは、その宿主のウェルビーイングに寄与する微生物（例えば、細菌および真菌）の成長または活性を誘導する物質である。プレバイオティクスは、典型的には、胃腸管の上部を消化されずに通過して、基質として作用することにより大腸に生着する有利な細菌の成長または活性を刺激する難消化性繊維化合物である。通常は、プレバイオティクスは胃腸管内のビフィズス菌および乳酸菌の数または活性を増加させる。
酵母派生物（不活化全酵母または酵母細胞壁）もまたプレバイオティクスと見なすことができる。酵母派生物は、マンナンオリゴ糖、酵母βグルカンまたはタンパク質含量を含むことが多く、通常は酵母、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の細胞壁に由来する。
一実施形態において、プレバイオティクスの量は、組成物の重量を基準として０．００１％〜１０％である。酵母製品の例は、Ｙａｎｇ（登録商標）およびＡｇｒｉｍｏｓ（Ｌａｌｌｅｍａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）である。
フィトジェニクス
フィトジェニクスは、ハーブ、香辛料または他の植物に由来する、飼料添加物として使用される一群の天然の成長促進物質または非抗生物質系成長促進物質である。フィトジェニクスは、精油／抽出物から調製される単一の物質、精油／抽出物、単一の植物および植物の混合物（ハーブ生成物）または精油／抽出物／植物の混合物（特殊生成物）であり得る。
フィトジェニクスの例は、ローズマリー、セージ、オレガノ、タイム、チョウジ、およびレモングラスである。精油の例は、チモール、オイゲノール、メタクレゾール、バニリン、サリチル酸塩、レゾルシン、グアイアコール、ギンゲロール、ラベンダー油、イオノン類、イロン、ユーカリプトール、メントール、ハッカ油、α−ピネン；リモネン、アネトール、リナロール、ジヒドロジャスモン酸メチル、カルバクロール、プロピオン酸／プロピオン酸塩、酢酸／酢酸塩、酪酸／酪酸塩、ローズマリー油、チョウジ油、ゲラニオール、テルピネオール、シトロネロール、アミルおよび／またはサリチル酸ベンジル、シンナムアルデヒド、植物性ポリフェノール（タンニン）、ターメリックおよびウコン抽出物である。
一実施形態において、フィトジェニクス（ｐｈｙｔｏｇｅｎｅｉｃｓ）の量は、組成物の重量を基準として０．００１％〜１０％である。市販の製品の例は、Ｃｒｉｎａ（登録商標）（ＤＳＭ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）；Ｃｉｎｅｒｇｙ（商標）、Ｂｉａｃｉｄ（商標）、ＰｒｏＨａｃｉｄ（商標）ＣｌａｓｓｉｃおよびＰｒｏＨａｃｉｄ（商標）Ａｄｖａｎｃｅ（商標）（全てＰｒｏｍｉｖｉ／Ｃａｒｇｉｌｌ）およびＥｎｖｉｖｏ ＥＯ（ＤｕＰｏｎｔ Ａｎｉｍａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）である。
有機酸
有機酸（Ｃ１〜Ｃ７）は、植物または動物組織の通常の構成要素として自然界に広く分布している。有機酸はまた、主に大腸内の炭水化物の微生物発酵を通じても形成される。有機酸は、ニワトリの壊死性腸炎および幼若ブタの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）感染など、腸の障害に対して予防効果があるため、ブタおよび家禽生産において抗生物質系成長促進物質の代用品として使用されることが多い。有機酸は単一成分または典型的には２種もしくは３種の異なる有機酸の混合物として販売され得る。有機酸の例は、プロピオン酸、ギ酸、クエン酸、乳酸、ソルビン酸、リンゴ酸、酢酸、フマル酸、安息香酸、酪酸および酒石酸またはこれらの塩（典型的には二ギ酸カリウムまたは酪酸ナトリウムなどのナトリウム塩またはカリウム塩）である。
一実施形態において、有機酸の量は、組成物の重量を基準として０．００１％〜１０％である。市販の製品の例は、ＶｅｖｏＶｉｔａｌｌ（登録商標）（ＤＳＭ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、Ａｍａｓｉｌ（登録商標）、Ｌｕｐｒｉｓｉｌ（登録商標）、Ｌｕｐｒｏ−Ｇｒａｉｎ（登録商標）、Ｌｕｐｒｏ−Ｃｉｄ（登録商標）、Ｌｕｐｒｏ−Ｍｉｘ（登録商標）（ＢＡＳＦ）、ｎ−Ｂｕｔｙｒｉｃ Ａｃｉｄ ＡＦ（ＯＸＥＡ）およびＡｄｉｍｉｘ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ（Ｎｕｔｒｉａｄ）である。
プレミックス
本明細書で上記に例示したとおりの飼料添加物の組成物を動物飼料、例えば家禽飼料に混入させることは、実際には濃縮物またはプレミックスを使用して行われる。プレミックスは、１つ以上のマイクロ原料と希釈剤および／またはキャリアとの好ましくは均一な混合物を意味する。プレミックスは、より大きい混合物中におけるマイクロ原料の一様な分布を促進するために用いられる。本発明に係るプレミックスは飼料原料または飲用水に固形分として（例えば水溶性粉末として）または液体として加えることができる。
アミノ酸
本発明の組成物は１つ以上のアミノ酸をさらに含み得る。動物飼料中に使用されるアミノ酸の例は、リジン、アラニン、β−アラニン、スレオニン、メチオニンおよびトリプトファンである。一実施形態において、アミノ酸の量は、組成物の重量を基準として０．００１％〜１０％である。
ビタミンおよびミネラル
別の実施形態において、動物飼料は、１つ以上の脂溶性ビタミンおよび／または１つ以上の水溶性ビタミンなど、１つ以上のビタミンを含み得る。別の実施形態において、動物飼料は、任意選択で、１つ以上の微量ミネラルおよび／または１つ以上の多量ミネラルなど、１つ以上のミネラルを含み得る。
通常、脂溶性および水溶性ビタミン、ならびに微量ミネラルは、飼料への添加が意図されるいわゆるプレミックスの一部を形成し、一方、多量ミネラルは、通常は飼料に別途添加される。
脂溶性ビタミンの非限定的な例としては、ビタミンＡ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、およびビタミンＫ、例えばビタミンＫ３が挙げられる。
水溶性ビタミンの非限定的な例としては、ビタミンＣ、ビタミンＢ１２、ビオチンおよびコリン、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ナイアシン、葉酸およびパントテン酸、例えば、Ｃａ−Ｄ−パントテン酸が挙げられる。
微量ミネラルの非限定的な例としては、ホウ素、コバルト、塩化物、クロム、銅、フッ化物、ヨウ素、鉄、マンガン、モリブデン、ヨウ素、セレンおよび亜鉛が挙げられる。
多量ミネラルの非限定的な例としては、カルシウム、マグネシウム、リン、カリウムおよびナトリウムが挙げられる。
一実施形態において、ビタミンの量は、組成物の重量を基準として０．００１％〜１０％である。一実施形態において、ミネラルの量は、組成物の重量を基準として０．００１％〜１０％である。
これらの成分の（家禽および子ブタ／ブタを例とした）栄養所要量は、国際公開第０１／５８２７５号パンフレットの表Ａに挙げられている。栄養所要量とは、これらの成分が指示される濃度で餌に供給されなければならないことを意味する。
代替として、本発明の動物飼料添加物は、国際公開第０１／５８２７５号パンフレットの表Ａに指定される個別成分のうちの少なくとも１つを含む。少なくとも１つとは、１、または２、または３、または４など、最大１３全て、または最大１５全ての個別成分のうちのいずれか、そのうちの１つ以上を意味する。より具体的には、この少なくとも１つの個別成分は、表Ａの第４列、または第５列、または第６列に指示される範囲内の飼料中濃度を提供するような量で本発明の添加剤に含まれる。
さらに別の実施形態において、本発明の動物飼料添加物は、以下のビタミンのうちの少なくとも１つを含み、好ましくは以下の表１に指定される範囲内の飼料中濃度を（それぞれ子ブタの餌、およびブロイラーの餌について）提供する。
Figure 2019524081
他の飼料原料
本発明の組成物は、着色剤、安定剤、成長改良添加剤およびアロマ化合物／フレーバー、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）；活性酸素発生種、抗酸化剤、抗菌ペプチド、抗真菌ポリペプチドおよびマイコトキシン管理化合物をさらに含み得る。
着色剤の例は、βカロチン、アスタキサンチン、およびルテインなどのカロテノイド類である。
アロマ化合物／フレーバーの例は、クレオソール、アネトール、デカラクトン、ウンデカラクトンおよび／またはドデカラクトン、イオノン類、イロン、ギンゲロール、ピペリジン、プロピリデンフタリド（ｐｒｏｐｙｌｉｄｅｎｅ ｐｈａｔａｌｉｄｅ）、ブチリデンフタリド（ｂｕｔｙｌｉｄｅｎｅ ｐｈａｔａｌｉｄｅ）、カプサイシンおよびタンニンである。
抗菌ペプチド（ＡＭＰ）の例は、国際公開第０３／０４４０４９号パンフレットおよび国際公開第０３／０４８１４８号パンフレットに開示される化合物およびポリペプチドを含め、ＣＡＰ１８、ロイコシンＡ（Ｌｅｕｃｏｃｉｎ Ａ）、トリトルプチシン、プロテグリン−１、タナチン、デフェンシン、ラクトフェリン、ラクトフェリシン、およびノビスピリン（Ｒｏｂｅｒｔ Ｌｅｈｒｅｒ，２０００）などのオビスピリン、プレクタシン類、およびスタチン類、ならびに抗菌活性を保持している上記の変異体または断片である。
抗真菌ポリペプチド（ＡＦＰ）の例は、国際公開第９４／０１４５９号パンフレットおよび国際公開第０２／０９０３８４号パンフレットに開示されるとおりの、アスペルギルス・ギガンテウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）、およびアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ペプチド、ならびに抗真菌活性を保持しているその変異体および断片である。
多価不飽和脂肪酸の例は、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸（ｄｏｃｏｓｏｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、エイコサペンタエン酸およびγ−リノール酸など、Ｃ１８、Ｃ２０およびＣ２２多価不飽和脂肪酸である。
活性酸素発生種の例は、過ホウ酸塩、過硫酸塩、または過炭酸塩などの化学物質；およびオキシダーゼ、オキシゲナーゼまたはシンテターゼ（ｓｙｎｔｅｔｈａｓｅ）などの酵素である。
抗酸化剤を使用して、発生し得る活性酸素種の数を制限し、活性酸素種レベルを抗酸化剤と均衡させることができる。
動物飼料中にはデオキシニバレノール、アフラトキシン、ゼアラレノンおよびフモニシンなどのマイコトキシンが見られることもあり、負の（ｎｍｅｇａｔｉｖｅ）動物性能または病気をもたらし得る。マイコトキシンの失活によるか、またはマイコトキシンの結合によるなどしてマイコトキシンレベルを管理し得る化合物を飼料に添加して、これらの負の効果を改善することができる。マイコトキシン管理化合物の例は、Ｖｉｔａｆｉｘ（登録商標）、Ｖｉｔａｆｉｘ Ｕｌｔｒａ（Ｎｕｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｍｙｃｏｆｉｘ（登録商標）、Ｍｙｃｏｆｉｘ（登録商標）Ｓｅｃｕｒｅ、ＦＵＭｚｙｍｅ（登録商標）、Ｂｉｏｍｉｎ（登録商標）ＢＢＳＨ、Ｂｉｏｍｉｎ（登録商標）ＭＴＶ（Ｂｉｏｍｉｎ）、Ｍｏｌｄ−Ｎｉｌ（登録商標）、Ｔｏｘｙ−Ｎｉｌ（登録商標）およびＵｎｉｋｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ（Ｎｕｔｒｉａｄ）である。
植物
本発明はまた、回収可能な量でポリペプチドまたはドメインを発現および生成するように、本発明のポリヌクレオチドを含む単離された植物、例えば、トランスジェニック植物、植物部分、または植物細胞に関する。ポリペプチドまたはドメインは、植物または植物部分から回収することができる。あるいは、ポリペプチドまたはドメインを含む植物または植物部分は、食品または飼料の品質を改善する、例えば、栄養価、嗜好性および流体学的性質を高めるように、または非栄養因子を破壊するために用いられる。
トランスジェニック植物は、双子葉（ｄｉｃｏｔ）または単子葉（ｍｏｎｏｃｏｔ）であってよい。単子葉植物の例としては、牧草（ブルーグラス、ポア（Ｐｏａ））などのイネ科牧草、フェツカ（Ｆｅｓｔｕｃａ）、ドクムギ（Ｌｏｌｉｕｍ）などの飼料草、ヌカボ（Ａｒｇｏｓｔｉｓ）などの寒地型牧草、ならびに例えば、コムギ、オーツムギ、ライムギ、オオムギ、イネ、モロコシ、およびトウモロコシ（コーン）が挙げられる。
双子葉植物の例としては、タバコ、ルピナスなどのマメ科、ジャガイモ、テンサイ、エンドウマメ、インゲンマメおよびダイズ、ならびに例えば、カリフラワー、ナタネなどのアブラナ科植物（アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ））、およびごく近縁のモデル生物：シロイロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）がある。
植物部分の例としては、茎、カルス、葉、根、果実、種子、および塊茎、ならびにこれらの部分を含む個々の組織、例えば、表皮、葉肉、柔組織、維管束組織、分裂組織が挙げられる。
植物細胞および特定の植物細胞区分、例えば、葉緑体、アポプラスト、ミトコンドリア、液胞、ペルオキシソームおよび細胞質も植物部分であると考えられる。
さらに、このような植物、植物部分および植物細胞の子孫も本発明の範囲に含まれる。
当分野では公知の方法により、ポリペプチドまたはドメインを発現するトランスジェニック植物または植物細胞を構築してもよい。
本発明はまた、本発明のポリペプチドまたはドメインを生成する方法にも関し、この方法は、（ａ）ポリペプチドまたはドメインの生成を可能にする条件下で、ポリペプチドまたはドメインをコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物もしくは植物部分を培養するステップ；および（ｂ）ポリペプチドまたはドメインを回収するステップを含む。
使用
本発明はまた、例えば、動物飼料、発酵製品の作製方法、およびベーキングへのキシラナーゼ変異体、またはその組成物の使用方法にも関する。本発明はまた、例えば以下に記載するものなど、キシラナーゼ変異体、またはその組成物の使用方法にも関する。
動物飼料への使用
本発明はまた、動物飼料へのキシラナーゼ変異体の使用方法にも関する。
用語の動物には、あらゆる動物が含まれる。動物の例は、非反芻動物、および反芻動物である。反芻動物には、例えば、ヒツジ、ヤギ、およびウシ、例えば、肉牛、乳牛、および幼若子牛などの動物が含まれる。詳細な実施形態において、動物は非反芻動物である。非反芻動物には、単胃動物、例えばブタ（ｐｉｇ）またはブタ（ｓｗｉｎｅ）（限定はされないが、子ブタ、成長期ブタ、および雌ブタを含む）；シチメンチョウ、アヒルおよびニワトリなどの家禽（限定はされないが、ブロイラーヒヨコ、産卵鶏を含む）；ウマ（限定はされないが、熱血種、冷血種および温血種を含む）、幼若子牛；および魚類（限定はされないが、サケ、マス、テラピア、ナマズおよびコイを含む；および甲殻類（限定はされないが、コエビおよびクルマエビを含む）が含まれる。
本発明に係る使用において、キシラナーゼ変異体は餌の前、後、またはそれと同時に動物に与えられてもよい。後者が好ましい。
詳細な実施形態において、キシラナーゼ変異体が飼料または動物飼料添加物に添加される形態は、明確に規定されている。明確に規定されているとは、キシラナーゼおよび／またはアラビノフラノシダーゼ調製物が、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定したとき少なくとも５０％の純度であることを意味する（国際公開第０１／５８２７５号パンフレットの実施例１２を参照）。他の詳細な実施形態において、キシラナーゼおよび／またはアラビノフラノシダーゼ調製物は、この方法によって決定したとき少なくとも６０、７０、８０、８５、８８、９０、９２、９４、または少なくとも９５％の純度である。
明確に規定されたキシラナーゼ調製物は有利である。例えば、妨害または汚染する他のキシラナーゼを本質的に含まないキシラナーゼの飼料に対する正確な用量投与が、はるかに容易である。正確な用量投与という用語は、詳細には、一貫した不変の結果を達成するという目的、および所望の効果に基づき投与量を最適化可能であることを指す。
しかしながら、動物飼料における使用には、キシラナーゼはそれほど高純度でなくてもよい；例えば他の酵素を含んでもよく、その場合、それはキシラナーゼ調製物と称され得る。
キシラナーゼ調製物は、（ａ）飼料に直接添加されてもよく、または（ｂ）後に飼料に添加される（または処理過程で使用される）飼料添加物またはプレミックスなどの１つ以上の中間組成物の生産において使用されてもよい。上記に記載する純度は、上記の（ａ）または（ｂ）のいずれに従い使用されるかに関わらず、元のキシラナーゼ調製物の純度を指す。
動物飼料の栄養価を向上させる方法
本発明はさらに、キシラナーゼ変異体を飼料に添加することを含む、キビ亜科（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ）からの植物系材料を含む動物飼料の栄養価を向上させる方法に関する。
動物飼料の栄養価を向上させるという用語は、飼料中の栄養素のアベイラビリティを向上させることを意味する。栄養価とは、詳細には、飼料のアラビノキシラン含有画分（例えば、ヘミセルロースなど）の可溶化および分解を向上させて、それにより極めて扱い難いヘミセルロースで構成された細胞壁を有する胚乳にある細胞からの栄養素の放出の増加をもたらすことを指す。結果的に、アラビノキシランオリゴマーの放出増加は細胞壁の破壊を示し、結果として飼料の栄養価が向上し、増加した成長率および／または増体量および／または飼料要求率（すなわち、増体量に対する摂取飼料重量）がもたらされる。加えてアラビノキシランオリゴマー放出は、これらの成分それ自体の直接の利用、または後腸に容易に吸収されてエネルギー代謝に利用され得る短鎖脂肪酸の産生につながる後腸内での細菌発酵による利用のいずれの向上ももたらす。
動物性能を向上させる方法
本発明はさらに、キシラナーゼ変異体およびキビ亜科（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ）からの植物系材料を１匹以上の動物に投与することを含む、動物の１つ以上の性能パラメータを向上させる方法に関する。
キビ亜科（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ）からの植物系材料はキシラナーゼ変異体と一緒に、または別個に投与されてもよい。キシラナーゼ変異体は組成物または動物飼料添加物として投与されてもよい。ある実施形態において、キビ亜科（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ）からの植物系材料は、トウモロコシ、コーン、モロコシ、スイッチグラス、キビ、トウジンビエ、アワまたは加工形態、例えば、粉砕コーン、粉砕トウモロコシ、脱脂トウモロコシ、脱脂・脱デンプントウモロコシ、粉砕モロコシ、粉砕スイッチグラス、粉砕キビ、粉砕アワ、粉砕トウジンビエ、またはこれらの任意の組み合わせである。さらなる実施形態において、キビ亜科（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ）からの植物系材料は、植物の種子画分（胚乳および／または殻など）からのものである。
ある実施形態において、動物の性能の向上は増体量の増加である。別の実施形態において、向上は飼料要求率の向上である。さらなる実施形態において、向上は飼料効率の増加である。さらなる実施形態において、向上は増体量の増加および／または飼料要求率の向上および／または飼料効率の増加である。
植物系材料からのキシランを可溶化する方法
本発明はさらに、例えば、キビ亜科（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ）からの植物系材料に見られる立体障害性アラビノキシランのキシロース主鎖を分解し、それによりアラビノースおよびキシロースとして計測されるアラビノキシランをより多量に可溶化することによる、植物系材料からのキシランを可溶化する方法に関する。分解の増加、およびそれによるアラビノースおよびキシロース放出の増加は、キビ亜科（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ）からの植物系材料を使用する多くの産業に利点をもたらし得る。
未処理植物材料中に存在するデンプンの量が、アラビノキシランの有意な可溶化の検出を困難にする。従って置換度への影響なく植物材料中に存在するデンプンおよび脂肪が除去されているモデル基質を使用して、公知の先行技術の併用と比べて向上した酵素併用の決定を支援することができる。１つのモデル基質は脱脂・脱デンプントウモロコシ（ＤＦＤＳＭ）であり、本実施例に記載されるとおり調製することができる。モデル基質が強酸性または塩基性条件または高温を用いて調製されないことが重要であり、なぜならかかる条件は、キシラン主鎖に存在する側鎖炭水化物分子および／またはエステル基を除去し得るためである。これらの側鎖基が除去される場合、錯体形成能および置換度が低下し、公知の解決法によって容易に分解されるアラビノキシラン材料がもたらされることになる。バイオマス変換において熱、酸および／または塩基による前処理が用いられるのは、この理由による。
アラビノキシランの可溶化を計測するためには、可溶性アラビノキシランを酸で加水分解し、すると上清中にキシロースおよびアラビノースが放出される。次に、例えば本明細書に記載されるとおりＨＰＬＣ方法を用いてこのキシロースおよびアラビノースを検出する。アラビノキシランの可溶化度が高いほど、酸加水分解時に放出されるキシロースおよびアラビノースの量が多くなる。アラビノキシランの可溶化が高まることにより細胞壁が開き、内部に閉じ込められているデンプンおよびタンパク質などの栄養素が放出され得るものと考えられる。デンプンおよび他の栄養素の放出により動物性能の向上がもたらされ、および／または動物飼料の栄養価が向上し得る。
ある実施形態において、脱脂・脱デンプントウモロコシ（ＤＦＤＳＭ）１グラム当たり２０μｇのキシラナーゼ変異体および４０℃、ｐＨ５で２．５時間のインキュベーションの反応条件下でこの方法が実施されたとき、パーセンテージ可溶化キシランは少なくとも４％である。
別の実施形態において、脱脂・脱デンプントウモロコシ（ＤＦＤＳＭ）１グラム当たり２０μｇのキシラナーゼ変異体および４０℃、ｐＨ５で２．５時間のインキュベーションの反応条件下でこの方法が実施されたとき、キシラナーゼ変異体はキビ亜科（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ）からの植物系材料から少なくとも７％の可溶化キシランを可溶化する。
より好ましい実施形態において、脱脂・脱デンプントウモロコシ（ＤＦＤＳＭ）１グラム当たり２０μｇのキシラナーゼ変異体および４０℃、ｐＨ５で２．５時間のインキュベーションの反応条件下でこの方法が実施されたとき、キシラナーゼ変異体はキビ亜科（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ）からの植物系材料から少なくとも９．５％の可溶化キシランを可溶化する。
デンプンを放出させる方法
本発明はさらに、キビ亜科（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ）からの植物系材料をキシラナーゼ変異体で処理することを含む、植物系材料からデンプンを放出させる方法に関する。
発酵産物の作製方法
非糊化デンプン含有材料からの発酵産物の作製方法
本発明はまた、デンプン含有材料の糊化なしに（すなわち蒸煮なしに）デンプン含有材料から発酵産物を作製する方法にも関する（多くの場合に「生デンプン加水分解」法と称される）。エタノールなどの発酵産物は、デンプン含有材料および水を含有する水性スラリーを液化させることなく作製することができる。一実施形態において、本発明の方法は、糊化開始温度未満で、好ましくはα−アミラーゼおよび／または炭水化物源発生酵素の存在下において、（例えば粉砕した）デンプン含有材料、例えば粒状デンプンを糖化して、好適な発酵生物により発酵させて発酵産物にすることのできる糖類を作製することを含む。この実施形態において、所望の発酵産物、例えばエタノールは、糊化されていない（すなわち未蒸煮の）、好ましくは粉砕された穀物粒、例えばコーンから作製される。
従って、一態様において、本発明は、デンプン含有材料から発酵産物を作製する方法であって、デンプン含有材料の糖化および発酵を同時に、前記デンプン含有材料の糊化開始温度未満の温度で、本発明の変異体プロテアーゼの存在下において、炭水化物源発生酵素および発酵生物を使用して行うことを含む方法に関する。糖化および発酵はまた、分けてもよい。従って別の態様において、本発明は、以下のステップ：
（ｉ）糊化開始温度未満の温度で炭水化物源発生酵素、例えばグルコアミラーゼを使用してデンプン含有材料を糖化させるステップ；および
（ｉｉ）発酵生物を使用して発酵させるステップ；
を含む、発酵産物を作製する方法に関し、ここでステップ（ｉ）は、少なくともグルコアミラーゼおよび本発明のキシラナーゼ変異体を使用して行われる。
一実施形態では、ステップ（ｉ）にαアミラーゼ、詳細には真菌α−アミラーゼもまた加えられる。ステップ（ｉ）および（ｉｉ）は同時に実施されてもよい。
糊化デンプン含有材料から発酵産物を作製する方法
この態様において、本発明は、デンプン含有材料から発酵産物、特にエタノールを作製する方法に関し、この方法は、液化ステップおよび順次または同時に実施される糖化および発酵ステップを含む。結果的に、本発明は、
（ａ）α−アミラーゼの存在下でデンプン含有材料を液化させるステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた液化材料を炭水化物源発生酵素を使用して糖化させるステップ；
（ｃ）発酵生物を使用して発酵させるステップ
を含む、デンプン含有材料から発酵産物を作製する方法に関し；ここでステップａ）、ｂ）および／またはｃ）の間に本発明のキシラナーゼ変異体が存在する。
スラリーは糊化温度を上回るまで加熱し、α−アミラーゼ変異体を添加して液化（減粘）を開始させてもよい。ある実施形態では、ステップ（ａ）でα−アミラーゼに供する前に、スラリーをジェット蒸煮することによりスラリーをさらに糊化させてもよい。液化は、ある実施形態では、三段階ホットスラリー法として行われ得る。スラリーがｐＨ４〜６、詳細にはｐＨ４．５〜５．５で６０〜９５℃、好ましくは７０〜９０℃、例えば好ましくは８０〜８５℃に加熱され、α−アミラーゼ変異体が任意選択でプルラナーゼおよび／またはプロテアーゼ、好ましくはメタロプロテアーゼと共に添加されて液化（減粘）が開始される。液化プロセスは、通常はｐＨ４〜６、詳細にはｐＨ４．５〜５．５で行われる。糖化ステップ（ｂ）は当該技術分野において周知の条件を用いて行われてもよい。例えば、全糖化プロセスは最長約２４〜約７２時間続き得るが、しかしながら、温度３０〜６５℃、典型的には約６０℃で典型的には４０〜９０分の前糖化を行うのみで、続いて並行複発酵法（ＳＳＦ法）で発酵中に完全に糖化させることが一般的である。糖化は、典型的には、２０〜７５℃、詳細には４０〜７０℃、典型的には約６０℃の温度、およびｐＨ４〜５、通常は約ｐＨ４．５で行われる。発酵産物、特にエタノールの作製に最も広く用いられている方法は並行複発酵（ＳＳＦ）法であり、ここでは糖化に関して保留する段階がなく、つまり、酵母などの発酵生物と酵素とが一緒に添加され得る。ＳＳＦは典型的には、２５℃〜４０℃、例えば２８℃〜３５℃、例えば３０℃〜３４℃、好ましくは約３２℃前後の温度で行われ得る。ある実施形態において発酵は６〜１２０時間、詳細には２４〜９６時間継続する。
デンプン含有材料
本発明の方法では、任意の好適なデンプン含有出発物質が用いられてもよい。出発物質は、概して所望の発酵産物に基づき選択される。本発明の方法における使用に好適なデンプン含有出発物質の例としては、オオムギ、マメ、キャッサバ、穀類、コーン、ミロ、エンドウマメ、ジャガイモ、コメ、ライムギ、サゴ、モロコシ、サツマイモ、タピオカ、コムギ、および全粒、またはこれらの任意の混合物が挙げられる。デンプン含有材料はまた、蝋様または非蝋様タイプのコーンおよびオオムギであってもよい。好ましい実施形態において、デンプン含有材料はコーンである。好ましい実施形態において、デンプン含有材料はコムギである。
発酵産物
用語「発酵産物」は、発酵生物を使用して発酵させることを含む方法またはプロセスにより作製される産物を意味する。発酵産物としては、アルコール類（例えば、エタノール、メタノール、ブタノール）；有機酸（例えば、クエン酸、酢酸、イタコン酸、乳酸、コハク酸、グルコン酸）；ケトン類（例えば、アセトン）；アミノ酸（例えば、グルタミン酸）；ガス（例えば、Ｈ２およびＣＯ２）；抗生物質（例えば、ペニシリンおよびテトラサイクリン）；酵素；ビタミン類（例えば、リボフラビン、Ｂ１２、βカロチン）；およびホルモン類が挙げられる。好ましい実施形態において、発酵産物はエタノール、例えば、燃料エタノール；飲用エタノール、すなわち、飲用に適した中性スピリッツ；または飲用アルコール産業（例えば、ビールおよびワイン）、乳業（例えば、発酵乳製品）、皮革産業およびタバコ産業で使用される工業用エタノールまたは産物である。好ましいビールタイプには、エール、シュタウト、ポーター、ラガー、ビター、モルトリカー、発泡酒、高アルコールビール、低アルコールビール、低カロリービールまたはライトビールが含まれる。ある実施形態において発酵産物はエタノールである。
発酵生物
用語「発酵生物」は、所望の発酵産物の作製に好適な、酵母および糸状菌などの細菌および真菌生物を含めた任意の生物を指す。好適な発酵生物は、アラビノース、フルクトース、グルコース、マルトース、マンノース、またはキシロースなどの発酵性糖を直接または間接的に所望の発酵産物に発酵させる、すなわち変換することが可能である。
発酵生物の例としては、酵母などの真菌生物が挙げられる。好ましい酵母としては、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、詳細にはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはサッカロミセス・ウバルム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ）の株；ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、詳細にはピキア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）ＣＢＳ ５７７３などのピキア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）またはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の株；カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、詳細にはカンジダ・アラビノフェルメンタンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｒａｂｉｎｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、カンジダ・ボイジニ（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ）、カンジダ・ジッデンシイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｄｉｄｄｅｎｓｉｉ）、カンジダ・シェハテ（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｈｅｈａｔａｅ）、カンジダ・ソノレンシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、またはカンジダ・ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）の株が挙げられる。他の発酵生物としては、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、詳細にはハンゼヌラ・アノマラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ）またはハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）の株；クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、詳細にはクルイベロミセス・フラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）またはクルイベロミセス・マルクシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）の株；およびシゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、詳細にはシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）の株が挙げられる。
ある実施形態において、発酵生物は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の株など、Ｃ６糖発酵生物である。
ある実施形態において、発酵生物は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の株など、Ｃ５糖発酵生物である。
発酵
発酵条件は、例えば、植物材料の種類、利用可能な発酵性糖、１つまたは複数の発酵生物および／または所望の発酵産物に基づき決定される。当業者は好適な発酵条件を容易に決定することができる。発酵は、従来用いられている条件で行われ得る。好ましい発酵プロセスは嫌気性プロセスである。
例えば、発酵は７５℃もの高い温度、例えば４０〜７０℃、例えば５０〜６０℃で行われてもよい。しかしながら、ほぼ室温（約２０℃）に至るまでの大幅に低い最適温度の細菌もまた公知である。好適な発酵生物の例については、上記の「発酵生物」の節を参照することができる。
酵母を使用したエタノール作製には、発酵は２４〜９６時間、詳細には３５〜６０時間続き得る。ある実施形態において、発酵は２０〜４０℃、好ましくは２６〜３４℃、詳細には約３２℃の温度で行われる。ある実施形態において、ｐＨはｐＨ３〜６、好ましくは約ｐＨ４〜５である。
ベーキングにおける使用
本発明は、本発明のキシラナーゼ変異体を生地に混入させることを含む生地の調製方法を開示する。
語句「生地に混入させる」は、本明細書では、生地、生地を作る元になる任意の原料、および／または生地を作る元になる生地原料の任意の混合物にキシラナーゼ変異体を添加することとして定義される。
換言すれば、キシラナーゼ変異体は生地調製のいかなる段階で添加されてもよく、一段階、二段階、またはそれより多い段階で添加されてもよい。キシラナーゼ変異体は、当該技術分野において周知の方法を用いて、こねて焼かれる生地の原料に添加されてもよい。
用語「生地」は、本明細書では、こねる、または延ばすのに十分な固さのある穀粉および他の原料の混合物として定義される。
生地は、コムギ、オオムギ、ライムギ、エンバク、トウモロコシ、モロコシ、コメ、キビ、およびこれらの任意の混合物を含め、任意の穀物粒に由来する穀粉を含み得る。
生地はまた、他の従来の生地原料、例えば、粉乳、グルテン、およびダイズなどのタンパク質；卵（全卵、卵黄、または卵白のいずれか）；アスコルビン酸、臭素酸カリウム、ヨウ素酸カリウム、アゾジカルボンアミド（ＡＤＡ）または過硫酸アンモニウムなどの酸化剤；Ｌ−システインなどのアミノ酸；デンプン；および／または塩化ナトリウム、酢酸カルシウム、硫酸ナトリウムまたは硫酸カルシウムなどの塩も含み得る。デンプンは、コムギデンプン、コーンスターチ、トウモロコシデンプン、タピオカデンプン、キャッサバデンプン、ジャガイモデンプン；および／またはスクロース、ショ糖、ラクトース、または高フルクトースコーンシロップなどの糖であってもよい。
生地は、粒状脂肪またはショートニングなどの脂肪（トリグリセリド）を含み得る。
生地は、生、冷凍、またはパーベーキング（プレベーキング）であってもよい。
生地は、通常どおり膨化させた生地または膨化に供される生地である。生地は、化学的膨化剤、例えば重炭酸ナトリウムを添加することによるか、または（生地を発酵させる）膨剤を添加することによるなど様々な方法で膨化させてもよく、しかし、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の培養物（パン酵母）、例えば、市販のＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株など、好適な酵母培養物を添加することにより生地を膨化させることが好ましい。
ベークド製品
本発明はまた、ソフトまたはクリスピーな性質の、およびホワイト、ライトまたはダークタイプの、生地（食物繊維入り生地など）からのベークド製品または蒸し製品の調製方法にも関する。
ベークド製品の例は、典型的にはローフ型またはロール型のパン、角型食パン、トーストパン、蓋ありおよび蓋なし角型食パン、バンズ、ハンバーガー用バンズ、ロールパン、フランスパン、黒パン、全粒パン、リッチブレッド、ふすまパン、フラットブレッド、トルティーヤ、ピタパン、アラビアパン、ナン、蒸しパン、およびこれらの任意の変種である。
本発明の好ましい実施形態
本発明の好ましい実施形態を以下の一組の項目に記載する。
１．配列番号１の位置２４、２６、３６、３７、６０、７１、７４、７５、７６、１２４、１３３、１５５、１６７、２０８、３１７、および３２１に対応する１つ以上の位置に置換を含む、キシラナーゼ変異体であって、キシラナーゼ活性を有し、および配列番号１、２、３、４、５または６に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する、キシラナーゼ変異体。
２．配列番号１に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する、項目１のキシラナーゼ変異体。
３．配列番号２に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する、項目１または２のキシラナーゼ変異体。
４．配列番号３に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する、項目１〜３のいずれかのキシラナーゼ変異体。
５．配列番号４に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する、項目１〜４のいずれかのキシラナーゼ変異体。
６．配列番号５に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する、項目１〜５のいずれかのキシラナーゼ変異体。
７．配列番号６に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する、項目１〜６のいずれかのキシラナーゼ変異体。
８．変異体が単離されている、項目１〜７のいずれかのキシラナーゼ変異体。
９．親キシラナーゼの変異体である、項目１〜８のいずれかのキシラナーゼ変異体であって、親キシラナーゼが配列番号１に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する、キシラナーゼ変異体。
１０．親キシラナーゼが配列番号１のアミノ酸配列を含むか、またはこれから成り、または配列番号１の断片であって、キシラナーゼ活性を有する断片である、項目９のキシラナーゼ変異体。
１１．親キシラナーゼの変異体である、項目１〜８のいずれかのキシラナーゼ変異体であって、親キシラナーゼが配列番号２に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する、キシラナーゼ変異体。
１２．親キシラナーゼが配列番号２のアミノ酸配列を含むか、またはこれから成り、または配列番号２の断片であって、キシラナーゼ活性を有する断片である、項目１１のキシラナーゼ変異体。
１３．親キシラナーゼの変異体である、項目１〜８のいずれかのキシラナーゼ変異体であって、親キシラナーゼが配列番号３に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する、キシラナーゼ変異体。
１４．親キシラナーゼが配列番号３のアミノ酸配列を含むか、またはこれから成り、または配列番号３の断片であって、キシラナーゼ活性を有する断片である、項目１３のキシラナーゼ変異体。
１５．親キシラナーゼの変異体である、項目１〜８のいずれかのキシラナーゼ変異体であって、親キシラナーゼが配列番号４に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する、キシラナーゼ変異体。
１６．親キシラナーゼが配列番号４のアミノ酸配列を含むか、またはこれから成り、または配列番号４の断片であって、キシラナーゼ活性を有する断片である、項目１５のキシラナーゼ変異体。
１７．親キシラナーゼの変異体である、項目１〜８のいずれかのキシラナーゼ変異体であって、親キシラナーゼが配列番号５に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する、キシラナーゼ変異体。
１８．親キシラナーゼが配列番号５のアミノ酸配列を含むか、またはこれから成り、または配列番号５の断片であって、キシラナーゼ活性を有する断片である、項目１７のキシラナーゼ変異体。
１９．親キシラナーゼの変異体である、項目１〜８のいずれかのキシラナーゼ変異体であって、親キシラナーゼが配列番号６に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する、キシラナーゼ変異体。
２０．親キシラナーゼが配列番号６のアミノ酸配列を含むか、またはこれから成り、または配列番号６の断片であって、キシラナーゼ活性を有する断片である、項目１９のキシラナーゼ変異体。
２１．親キシラナーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する、項目１〜２０のいずれかのキシラナーゼ変異体。
２２．親キシラナーゼが、分類上の目、バチルス目（Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）、好ましくは分類上の科、バチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）から得られる、または得ることが可能である、項目１〜２１のいずれかのキシラナーゼ変異体。
２３．親キシラナーゼが、分類上の属、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）またはパエニバチルス・パブリ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｂｕｌｉ）から得られる、または得ることが可能である、項目１〜２２のいずれかのキシラナーゼ変異体。
２４．改変の数が１〜２０、例えば、１〜１０および１〜５、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の改変である、項目１〜２０のいずれかのキシラナーゼ変異体。
２５．位置２４に対応する位置に置換を含む、項目１〜２４のいずれかのキシラナーゼ変異体。
２６．置換が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ、詳細にはＴｒｐによるものである、項目２５のキシラナーゼ変異体。
２７．位置２６に対応する位置に置換を含む、項目１〜２６のいずれかのキシラナーゼ変異体。
２８．置換が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ、詳細にはＧｌｕによるものである、項目２７のキシラナーゼ変異体。
２９．位置３６に対応する位置に置換を含む、項目１〜２８のいずれかのキシラナーゼ変異体。
３０．置換が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ、詳細にはＬｅｕまたはＴｈｒによるものである、項目２９のキシラナーゼ変異体。
３１．位置３７に対応する位置に置換を含む、項目１〜３０のいずれかのキシラナーゼ変異体。
３２．置換が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ、詳細にはＬｅｕまたはＴｈｒによるものである、項目３１のキシラナーゼ変異体。
３３．位置６０に対応する位置に置換を含む、項目１〜３２のいずれかのキシラナーゼ変異体。
３４．置換が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ、詳細にはＡｓｎによるものである、項目３３のキシラナーゼ変異体。
３５．位置７１に対応する位置に置換を含む、項目１〜３４のいずれかのキシラナーゼ変異体。
３６．置換が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ、詳細にはＩｌｅ、Ｌｅｕ、またはＴｈｒによるものである、項目３５のキシラナーゼ変異体。
３７．位置７４に対応する位置に置換を含む、項目１〜３６のいずれかのキシラナーゼ変異体。
３８．置換が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ、詳細にはＩｌｅまたはＬｅｕによるものである、項目３７のキシラナーゼ変異体。
３９．位置７５に対応する位置に置換を含む、項目１〜３８のいずれかのキシラナーゼ変異体。
４０．置換が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ、詳細にはＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、またはＴｈｒによるものである、項目３９のキシラナーゼ変異体。
４１．位置７６に対応する位置に置換を含む、項目１〜４０のいずれかのキシラナーゼ変異体。
４２．置換が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ、詳細にはＬｅｕによるものである、項目４１のキシラナーゼ変異体。
４３．位置１２４に対応する位置に置換を含む、項目１〜４２のいずれかのキシラナーゼ変異体。
４４．置換が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ、詳細にはＴｙｒによるものである、項目４３のキシラナーゼ変異体。
４５．位置１３３に対応する位置に置換を含む、項目１〜４４のいずれかのキシラナーゼ変異体。
４６．置換が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ、詳細にはＩｌｅによるものである、項目４５のキシラナーゼ変異体。
４７．位置１５５に対応する位置に置換を含む、項目１〜４６のいずれかのキシラナーゼ変異体。
４８．置換が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ、詳細にはＭｅｔによるものである、項目４７のキシラナーゼ変異体。
４９．位置１６７に対応する位置に置換を含む、項目１〜４８のいずれかのキシラナーゼ変異体。
５０．置換が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ、詳細にはＧｌｕによるものである、項目４９のキシラナーゼ変異体。
５１．位置２０８に対応する位置に置換を含む、項目１〜５０のいずれかのキシラナーゼ変異体。
５２．置換が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ、詳細にはＬｅｕによるものである、項目５１のキシラナーゼ変異体。
５３．位置３１７に対応する位置に置換を含む、項目１〜５２のいずれかのキシラナーゼ変異体。
５４．置換が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ、詳細にはＡｓｐによるものである、項目５３のキシラナーゼ変異体。
５５．位置３２１に対応する位置に置換を含む、項目１〜５４のいずれかのキシラナーゼ変異体。
５６．Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ、詳細にはＡｌａによる置換、項目５５のキシラナーゼ変異体。
５７．位置２４、２６、３６、３７、７１、７４、７５、７６、１５５、および２０８に対応する位置のうちの２つに置換を含む、項目１〜５６のいずれかのキシラナーゼ変異体。
５８．位置２４、２６、３６、３７、７１、７４、７５、７６、１５５、および２０８に対応する位置のうちの３つに置換を含む、項目１〜５６のいずれかのキシラナーゼ変異体。
５９．位置２４、２６、３６、３７、７１、７４、７５、７６、１５５、および２０８に対応する位置のうちの４つに置換を含む、項目１〜５６のいずれかのキシラナーゼ変異体。
６０．位置２４、２６、３６、３７、７１、７４、７５、７６、１５５、および２０８に対応する位置のうちの５つに置換を含む、項目１〜５６のいずれかのキシラナーゼ変異体。
６１．位置２４、２６、３６、３７、７１、７４、７５、７６、１５５、および２０８に対応する位置のうちの６つに置換を含む、項目１〜５６のいずれかのキシラナーゼ変異体。
６２．位置２４、２６、３６、３７、７１、７４、７５、７６、１５５、および２０８に対応する位置のうちの７つに置換を含む、項目１〜５６のいずれかのキシラナーゼ変異体。
６３．位置２４、２６、３６、３７、７１、７４、７５、７６、１５５、および２０８に対応する各位置に置換を含む、項目１〜５６のいずれかのキシラナーゼ変異体。
６４．親と比べて向上した特性を有する、項目１〜６３のいずれかのキシラナーゼ変異体であって、向上した特性が、触媒効率、触媒速度、化学安定性、酸化安定性、ｐＨ活性、ｐＨ安定性、比活性、貯蔵条件下での安定性、基質結合、基質切断、基質特異性、基質安定性、表面特性、熱活性、および熱安定性からなる群から選択される、キシラナーゼ変異体。
６５．親キシラナーゼが配列番号１である、項目６４のキシラナーゼ変異体。
６６．親キシラナーゼと比べて熱安定性が向上している、項目１〜６３のいずれかのキシラナーゼ変異体。
６７．配列番号１と比べて熱安定性が向上している、項目１〜６３のいずれかのキシラナーゼ変異体。
６８．項目１〜６７のいずれかのキシラナーゼ変異体と配合剤とを含む組成物。
６９．配合剤が、以下の化合物：グリセロール、エチレングリコール、１，２−プロピレングリコールまたは１，３−プロピレングリコール、塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、チオ硫酸ナトリウム、炭酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、デキストリン、グルコース、スクロース、ソルビトール、ラクトース、デンプン、カオリン、マルトデキストリン、シクロデキストリン、コムギ、ＰＶＡ、酢酸塩、リン酸塩およびセルロースのうちの１つ以上を含む、項目６８の組成物。
７０．１つ以上の追加的な酵素をさらに含む、項目６８または６９の組成物。
７１．１つ以上の追加的な酵素が、アセチルキシランエステラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、アラビノフラノシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、フェルロイルエステラーゼ、ガラクタナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、リパーゼ、グルカン１，４−ａ−グルコシダーゼ、グルカン１，４−α−マルトヒドロラーゼ、リゾホスホリパーゼ、リゾチーム、マンナナーゼ、α−マンノシダーゼ、β−マンノシダーゼ、フィターゼ、ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＤ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチンリアーゼ、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、項目７０の組成物。
７２．１つ以上の微生物をさらに含む、項目６８〜７１のいずれかの組成物。
７３．１つ以上の微生物が、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ポリミクサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ）、ビフィドバクテリウム属種（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、カルノバクテリウム属種（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、クロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、クロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス属種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、ラクトバチルス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、アシドフィルス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ファルシミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｕｓ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス属種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、ロイコノストック属種（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．）、メガスフェラ・エルスデニイ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ）、メガスフェラ属種（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｓｐ．）、ペディオコッカス・アシディラクチシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｓｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、ペディオコッカス属種（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、プロピオニバクテリウム・ソエニイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｏｅｎｉｉ）、プロピオニバクテリウム属種（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）およびストレプトコッカス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、項目７２の組成物。
７４．植物系材料をさらに含む、項目６８〜７３のいずれかの組成物。
７５．植物系材料が、キビ亜科（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ）からのものである、項目７４の組成物。
７６．キビ亜科（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ）からの植物系材料が、トウモロコシ、コーン、モロコシ、スイッチグラス、キビ、トウジンビエ、アワまたは加工形態、例えば、粉砕コーン、粉砕トウモロコシ、脱脂トウモロコシ、脱脂・脱デンプントウモロコシ、粉砕モロコシ、粉砕スイッチグラス、粉砕キビ、粉砕アワ、粉砕トウジンビエ、またはこれらの任意の組み合わせである、項目７５の組成物。
７７．キビ亜科（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ）からの植物系材料が、植物の種子画分（胚乳および／または殻など）からのものである、項目７４〜７５の組成物。
７８．項目１〜６７のいずれかのキシラナーゼ変異体と配合剤とを含む顆粒。
７９．１つ以上の配合剤が、グリセロール、エチレングリコール、１，２−プロピレングリコールまたは１，３−プロピレングリコール、塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、チオ硫酸ナトリウム、炭酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、デキストリン、グルコース、スクロース、ソルビトール、ラクトース、デンプン、カオリンおよびセルロースからなるリストから選択され、好ましくは、１，２−プロピレングリコール、１，３−プロピレングリコール、硫酸ナトリウム、デキストリン、セルロース、チオ硫酸ナトリウム、カオリンおよび炭酸カルシウムからなるリストから選択される、項目７８の顆粒。
８０．顆粒がコア粒子と１つ以上のコーティングとを含む、項目７８または７９の顆粒。
８１．コーティングが塩および／またはワックスおよび／または穀粉を含む、項目８０の顆粒。
８２．１つ以上の追加的な酵素をさらに含む、項目７８〜８１のいずれかの顆粒。
８３．１つ以上の追加的な酵素が、アセチルキシランエステラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、アラビノフラノシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、フェルロイルエステラーゼ、ガラクタナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、リパーゼ、グルカン１，４−ａ−グルコシダーゼ、グルカン１，４−α−マルトヒドロラーゼ、リゾホスホリパーゼ、リゾチーム、マンナナーゼ、α−マンノシダーゼ、β−マンノシダーゼ、フィターゼ、ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＤ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチンリアーゼ、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、項目８２の顆粒。
８４．項目１〜６７のいずれかのキシラナーゼ変異体、項目６８〜７７のいずれかの組成物または項目７８〜８３のいずれかの顆粒と、
１つ以上のビタミン；
１つ以上のミネラル；
１つ以上のアミノ酸；
１つ以上のフィトジェニクス；
１つ以上のプレバイオティクス；
１つ以上の有機酸；および
１つ以上の他の飼料原料
からなる群から選択される１つ以上の成分を含む動物飼料添加物。
８５．項目１〜６７のいずれかのキシラナーゼ変異体を含む液体配合物。
８６．キシラナーゼ変異体が、液体配合物の０．０１％〜２５％ｗ／ｗ、好ましくは０．０５％〜２０％ｗ／ｗ、より好ましくは０．２％〜１５％ｗ／ｗ、より好ましくは０．５％〜１５％ｗ／ｗまたは最も好ましくは１．０％〜１０％ｗ／ｗのキシラナーゼ変異体で投与される、項目８５の液体配合物。
８７．２０％〜８０％ｗ／ｗのポリオールをさらに含む、項目８５または８６の液体配合物。
８８．ポリオールが、グリセロール、ソルビトール、プロピレングリコール（ＭＰＧ）、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、１，２−プロピレングリコールまたは１，３−プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、約６００未満の平均分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および約６００未満の平均分子量を有するポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、項目８７の液体配合物。
８９．０．０１％〜２．０％ｗ／ｗの保存剤をさらに含む、項目８５〜８８のいずれかの液体配合物。
９０．保存剤が、ソルビン酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウムおよび安息香酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｏｎ ｂｅｎｚｏａｔｅ）またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、項目８９の液体配合物。
９１．１つ以上の酵素；
１つ以上の微生物；
１つ以上のビタミン；
１つ以上のミネラル；
１つ以上のアミノ酸；
１つ以上のフィトジェニクス；
１つ以上のプレバイオティクス；
１つ以上の有機酸；および
１つ以上の他の飼料原料
からなるリストから選択される１つ以上の成分をさらに含む、項目８５〜９０のいずれかの液体配合物。
９２．項目８５〜９１のいずれかの液体配合物を植物系材料上に塗布することを含む、動物飼料の調製方法。
９３．液体配合物がスプレーによって塗布される、項目９２の方法。
９４．植物系材料が、マメ科植物、穀類、エンバク、ライムギ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、コーン、モロコシ、スイッチグラス、キビ、トウジンビエ、アワ、ダイズ、野生ダイズ、マメ、ルピナス、テパリービーン、ベニバナインゲン、スリムジムマメ（ｓｌｉｍｊｉｍ ｂｅａｎ）、ライマメ、サヤインゲン、ソラマメ（Ｂｒｏａｄ ｂｅａｎ）（ソラマメ（ｆａｖａ ｂｅａｎ））、ヒヨコマメ、レンズマメ、ピーナッツ、スパニッシュピーナッツ、キャノーラ、ナタネ（セイヨウアブラナ）、コメ、テンサイ、キャベツ、サトウダイコン、ホウレンソウ、キノア、またはエンドウマメ、これらの加工形態（大豆ミール、菜種ミールなど）またはこれらの任意の組み合わせを含む、項目９２または９３の方法。
９５．植物系材料がペレット状形態である、項目９２〜９４のいずれかの方法。
９６．項目１〜６７のいずれかのキシラナーゼ変異体、項目６８〜７７のいずれかの組成物、項目７８〜８３のいずれかの顆粒、項目８４の動物飼料添加物または項目８５〜９１のいずれかの液体配合物と植物系材料とを含む動物飼料。
９７．植物系材料がキビ亜科（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ）からのものである、項目９６の動物飼料。
９８．キビ亜科（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ）からの植物系材料が、トウモロコシ、コーン、モロコシ、スイッチグラス、キビ、トウジンビエ、アワまたは加工形態、例えば、粉砕コーン、粉砕トウモロコシ、脱脂トウモロコシ、脱脂・脱デンプントウモロコシ、粉砕モロコシ、粉砕スイッチグラス、粉砕キビ、粉砕アワ、粉砕トウジンビエ、またはこれらの任意の組み合わせである、項目９７の動物飼料。
９９．キビ亜科（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ）からの植物系材料が、植物の種子画分（胚乳および／または殻など）からのものである、項目９６または９７の動物飼料。
１００．項目９２〜９５のいずれかの方法を用いて、または項目９６〜９９のいずれかの動物飼料をペレット化することにより調製されるペレット状動物飼料。
１０１．動物の１つ以上の性能パラメータを向上させる方法であって、項目１〜６７のいずれかのキシラナーゼ変異体、項目６８〜７７のいずれかの組成物、項目７８〜８３のいずれかの顆粒、項目８４の動物飼料添加物、項目８５〜９１のいずれかの液体配合物、項目９６〜９９のいずれかの動物飼料または項目１００のペレット状動物飼料を１匹以上の動物に投与することを含む方法。
１０２．植物系材料からキシランを可溶化させる方法であって、植物系材料を項目１〜６７のいずれかのキシラナーゼ変異体、項目６８〜７７のいずれかの組成物、項目７８〜８３のいずれかの顆粒、項目８４の動物飼料添加物または項目８５〜９１のいずれかの液体配合物で処理することを含む方法。
１０３．植物系材料からデンプンを放出させる方法であって、植物系材料を項目１〜６７のいずれかのキシラナーゼ変異体、項目６８〜７７のいずれかの組成物、項目７８〜８３のいずれかの顆粒、項目８４の動物飼料添加物または項目８５〜９１のいずれかの液体配合物で処理することを含む方法。
１０４．動物飼料の栄養価を向上させるための方法であって、植物系材料を含む飼料に、項目１〜６７のいずれかのキシラナーゼ変異体、項目６８〜７７のいずれかの組成物、項目７８〜８３のいずれかの顆粒、項目８４の動物飼料添加物または項目８５〜９１のいずれかの液体配合物を添加することを含む方法。
１０５．植物系材料がキビ亜科（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ）からのものである、項目１０２〜１０４のいずれかの方法。
１０６．キビ亜科（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ）からの植物系材料が、トウモロコシ、コーン、モロコシ、スイッチグラス、キビ、トウジンビエ、アワまたは加工形態、例えば、粉砕コーン、粉砕トウモロコシ、脱脂トウモロコシ、脱脂・脱デンプントウモロコシ、粉砕モロコシ、粉砕スイッチグラス、粉砕キビ、粉砕アワ、粉砕トウジンビエ、またはこれらの任意の組み合わせである、項目１０５の方法。
１０７．キビ亜科（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ）からの植物系材料が植物の種子画分（胚乳および／または殻など）からのものである、項目１０５または１０６の方法。
１０８．項目１〜６７のいずれかのキシラナーゼ変異体、項目６８〜７７のいずれかの組成物、項目７８〜８３のいずれかの顆粒、項目８４の動物飼料添加物、項目８５〜９１のいずれかの液体配合物、項目９６〜９９のいずれかの動物飼料または項目１００のペレット状動物飼料の：
動物飼料における；
動物飼料添加物における；
動物飼料における使用のための組成物の調製における；
動物飼料の栄養価を向上させるための；
動物飼料の消化率を増加させるための；
動物における１つ以上の性能パラメータを向上させるための；
植物系材料からキシランを可溶化するための
植物系材料からデンプンを放出させるための
使用。
１０９．植物系材料がキビ亜科（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ）からのものである、項目１０８の使用。
１１０．キビ亜科（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ）からの植物系材料が、トウモロコシ、コーン、モロコシ、スイッチグラス、キビ、トウジンビエ、アワまたは加工形態、例えば、粉砕コーン、粉砕トウモロコシ、脱脂トウモロコシ、脱脂・脱デンプントウモロコシ、粉砕モロコシ、粉砕スイッチグラス、粉砕キビ、粉砕アワ、粉砕トウジンビエ、またはこれらの任意の組み合わせである、項目１０９の使用。
１１１．キビ亜科（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ）からの植物系材料が、植物の種子画分（胚乳および／または殻など）からのものである、項目１０８〜１１０のいずれかの使用。
１１２．以下のステップ：
（ａ）デンプン含有材料を糊化開始温度未満の温度でα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、および項目１〜６７のいずれかのキシラナーゼ変異体によって糖化するステップ；および
（ｂ）発酵生物を使用して発酵させるステップ
を含む、発酵産物の作製方法。
１１３．デンプン含有材料から発酵産物を作製する方法であって、
（ａ）デンプン含有材料をα−アミラーゼによって液化させるステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた液化材料をグルコアミラーゼおよび項目１〜６７のいずれかのキシラナーゼ変異体によって糖化させるステップ；
（ｃ）発酵生物を使用して発酵させるステップ
を含む方法。
１１４．ステップｂ）とｃ）とが同時に実施される、項目１１３の方法。
１１５．デンプン含有材料が、トウモロコシ、コーン、コムギ、ライムギ、オオムギ、ライコムギ、モロコシ、スイッチグラス、キビ、トウジンビエ、アワを含む、項目１１２〜１１４のいずれかの方法。
１１６．発酵産物がアルコール、特にエタノールである、項目１１２〜１１５のいずれかの方法。
１１７．発酵生物が酵母、特にサッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、より詳細にはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、項目１１２〜１１６のいずれかの方法。
１１８．デンプン含有材料からエタノールを作製するための項目１〜６７のいずれかのキシラナーゼ変異体の使用。
１１９．生地または生地から調製されるベークド製品の調製方法であって、項目１〜６７のいずれかのキシラナーゼ変異体を生地に混入させることを含む方法。
１２０．生地が、コムギ、オオムギ、ライムギ、エンバク、トウモロコシ、モロコシ、コメ、キビ、およびこれらの任意の混合物からなる群から選択される穀粉を含む、項目１１９の方法。
１２１．項目１〜６７のいずれかのキシラナーゼ変異体をコードする単離ポリヌクレオチドであって、組換え宿主細胞におけるキシラナーゼ変異体の産生を誘導する１つ以上の制御配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチド。
１２２．項目１２１のポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクト。
１２３．項目１２１のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
１２４．項目１２２の核酸コンストラクトまたは項目１２３の発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
１２５．キシラナーゼ変異体の作製方法であって、
ａ．キシラナーゼ変異体の発現に好適な条件下で項目１２４の宿主細胞を培養すること；および
ｂ．キシラナーゼ変異体を回収すること
を含む方法。
１２６．項目１２１のポリヌクレオチドで形質転換されたトランスジェニック植物、植物部分または植物細胞。
１２７．項目１〜６７のいずれかのキシラナーゼ変異体の作製方法であって、
ａ．キシラナーゼ変異体の産生につながる条件下で、キシラナーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物または植物細胞を培養すること；および
ｂ．キシラナーゼ変異体を回収すること
を含む方法。
１２８．項目１〜６７のいずれかのキシラナーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド。
１２９．発現宿主におけるポリペプチドの産生を誘導する１つ以上の制御配列に作動可能に連結された項目１２８のポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクトまたは発現ベクター。
１３０．ポリペプチドの産生を誘導する１つ以上の制御配列に作動可能に連結された項目１２８のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞。
１３１．項目１〜６７のいずれかのキシラナーゼ変異体の作製方法であって、
（ａ）その野生型の形態でポリペプチドを産生する細胞を、ポリペプチドの産生につながる条件下で培養すること；および
（ｂ）ポリペプチドを回収すること
を含む方法。
１３２．項目１〜６７のいずれかのキシラナーゼ変異体の作製方法であって、
（ａ）ポリペプチドの産生につながる条件下で項目１３０の組換え宿主細胞を培養すること；および
（ｂ）ポリペプチドを回収すること
を含む方法。
１３３．項目１〜６７のいずれかのキシラナーゼ変異体を含む全ブロス配合物または細胞培養組成物。
１３４．キシラナーゼ変異体の入手方法であって、親キシラナーゼに、配列番号１の位置２４、２６、３６、３７、６０、７１、７４、７５、７６、１２４、１３３、１５５、１６７、２０８、３１７、および３２１に対応する１つ以上の位置で置換を導入すること（キシラナーゼ変異体がキシラナーゼ活性を有する）；およびキシラナーゼ変異体を回収することを含む方法。
１３５．キシラナーゼ変異体が親と比べて向上した特性を有し、向上した特性が、触媒効率、触媒速度、化学安定性、酸化安定性、ｐＨ活性、ｐＨ安定性、比活性、貯蔵条件下での安定性、基質結合、基質切断、基質特異性、基質安定性、表面特性、熱活性、および熱安定性からなる群から選択される、項目１３４の方法。
１３６．親キシラナーゼが、配列番号１と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する、項目１３４または１３５の方法。
１３７．置換が、Ｈ２４Ｗ、Ａ２６Ｅ、Ｒ３６Ｌ、Ｒ３６Ｔ、Ｅ３７Ｔ、Ｒ６０Ｎ、Ｋ７１Ｔ、Ｋ７１Ｉ、Ｖ７４Ｌ、Ｖ７４Ｉ、Ｋ７５Ｎ、Ｋ７５Ｌ、Ｈ７６Ｌ、Ｉ１５５Ｍ、Ｎ１６７Ｅ、Ｖ２０８Ｌ、Ｓ３１７ＤおよびＧ３２１Ａからなる群から選択される、項目１３４〜１３６のいずれかの方法。
１３８．項目１３４〜１３７のいずれかの方法によって作製されるキシラナーゼ変異体。
本発明は以下の例によってさらに説明され、これらの例は本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならない。
基質
脱デンプントウモロコシ（ＤＳＭ）の調製
１０７ｋｇの粉砕トウモロコシ（＜１０ｍｍ）を槽内において５３℃で２５３ｋｇの水道水と混合してスラリーを作成する。スラリーの温度は４７℃およびｐＨ５．９である。ｐＨを１Ｌの１Ｎ ＮａＯＨで６．１５に調整し、次に槽を９５℃に加熱する。１．１１９ｋｇのＴｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）α−アミラーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を５２℃で添加し、９５℃で８０分間インキュベートする。インキュベーション終了時に計測されるｐＨは６．１７である。スラリーに冷温の水道水を加え、このスラリーを遠心し、ＷｅｓｔｆａｌｉａデカンターＣＡ−２２５−１１０（４９５０±１０ｒｐｍ、流量約６００ｌ／ｈ）を使用して３回デカントすると、６４．５ｋｇのスラッジが得られる。次にスラッジを収集し、凍結し、凍結乾燥すると、１７．１ｋｇの脱デンプントウモロコシ（ＤＳＭ）が得られる。
脱脂・脱デンプントウモロコシ（ＤＦＤＳＭ）の調製
上記に記載したとおり調製した１００グラムの脱デンプントウモロコシに５００ｍＬのアセトンを加える。スラリーを５分間撹拌し、沈殿させる。アセトンをデカントし、この手順を２回繰り返す。残渣を一晩風乾すると脱脂・脱デンプントウモロコシ（ＤＦＤＳＭ）が得られ、これは室温で保存する。
脱デンプンモロコシの調製
全モロコシ種子を粉砕して篩分けし、０．５ｍｍ未満の画分をさらなる処理に使用する。篩分けした画分を２５ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ５．５中に２０％乾燥物質で懸濁し、脱デンプンする。脱デンプンは、８５℃、５００ｐｐｍ Ｔｅｒｍａｍｙｌ ＳＣ α−アミラーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）で２０分間の第１のステップと、続く６５℃で２５０ｐｐｍ Ａｔｔｅｎｕｚｙｍｅ Ｆｌｅｘ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いた一晩のインキュベーションを伴う。スラリーを遠心し、液体をデカントする。この後、ＭｉｌｌｉＱ水、２００ｐｐｍ Ｔｅｒｍａｍｙｌ ＳＣおよび２００ｐｐｍ Ａｔｔｅｎｕｚｙｍｅ Ｆｌｅｘを加え、６５℃で一晩インキュベートすることを用いてもう一度脱デンプンを行う。
Ｗｈａｔｍａｎ Ｆガラス繊維フィルタを通じた真空ろ過によって液体からモロコシ繊維を分離する。次にろ過ケーキを過剰の水で数回洗浄して可溶性糖類を除去する。最後に脱デンプンモロコシ繊維をオーブンにおいて６５℃で乾燥させ、乾燥した繊維をコーヒーグラインダーで速やかに粉砕して粒径を略１ｍｍ未満にした。
キシロース可溶化アッセイ
脱脂・脱デンプントウモロコシ（ｄｅｆａｔｔｅｄ ｄｅｓｔｒａｃｈｅｄ Ｍａｉｚｅ）（ＤＦＤＳＭ）に対するキシラナーゼ変異体の活性は、高性能陰イオン交換クロマトグラフィーとパルスアンペロメトリック検出（ＨＰＡＥ−ＰＡＤ）との併用により計測される。２％（ｗ／ｗ）ＤＦＤＳＭ懸濁液を１００ｍＭ酢酸ナトリウム、５ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ５に調製し、穏やかに撹拌しながら室温で３０分間水和させる。水和後、２００μｌ基質懸濁液を９６ウェルプレートにピペッティングし、２０μｌ酵素溶液と混合することにより基質に対して２０ＰＰＭの最終酵素濃度（２０μｇ酵素／ｇ基質）を得た。酵素／基質混合物は、プレートインキュベーター（Ｂｉｏｓａｎ ＰＳＴ−１００ ＨＬ）で穏やかに撹拌（５００ＲＰＭ）しながら４０℃で２．５時間放置して加水分解させる。酵素加水分解後、酵素／基質プレートを３０００ＲＰＭで１０分間遠心し、５０μｌ上清（加水分解物）を１００μｌ １．６Ｍ ＨＣｌと混合して３００μｌ ＰＣＲチューブに移し、ＰＣＲ機において９０℃で４０分間放置して酸加水分解させる。この酸加水分解の目的は、キシラナーゼ変異体によって放出される可溶性多糖類を、ＨＰＡＥ−ＰＡＤを用いて定量化することのできる単糖類に変換することである。酸加水分解後に１２５μｌ １．４Ｍ ＮＡＯＨで試料を中和し、ＨＰＡＥ−ＰＡＤにかけて単糖分析（キシロース、アラビノースおよびグルコース）を行う（ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラムを使用するＤｉｏｎｅｘ ＩＣＳ−３０００）。試料と同じ手順の酸加水分解に供される単糖ストック溶液を使用して適切な検量線を作成する。パーセンテージ可溶化キシロースを以下の式に従い計算する：
Figure 2019524081
 式中、［キシロース］はＨＰＡＥ−ＰＡＤによって計測した上清中のキシロース濃度を表し、Ｖは試料の容積を表し、ＭＷはアラビノキシラン中の内部キシロースの分子量を表し（１３２ｇ／ｍｏｌ）、ＸｘｙｌはＤＦＤＳＭ中のキシロース分率を表し（０．１０２）、およびＭｓｕｂは試料中のＤＦＤＳＭの質量を表す。
実施例１：配列番号１のキシラナーゼの変異体の構築
部位特異的突然変異誘発によってキシラナーゼ変異体を作成した。キシラナーゼ遺伝子を含む生物から調製したゲノムＤＮＡを部位特異的突然変異体の作成用鋳型として使用した。
突然変異誘発フォワードプライマーおよびリバースプライマーを使用して断片を作成した。この断片をメガプライマーとして使用して挿入カセットを得た。形質転換時における二重交差による組込みを可能にするため、このカセットは末端に上流および下流配列を含んだ。選択を行い、キシラナーゼ遺伝子のＤＮＡシーケンシングにより突然変異を確認した。
変異体は実施例２に記載されるとおり試験した。
実施例２：タンパク質熱変性分析（ＴＳＡ、サーマルシフトアッセイ）
リアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｓｔｅｐ−Ｏｎｅ−Ｐｌｕｓ）を使用して配列番号１の変異体のタンパク質熱変性をＳｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓ−６６５０）でモニタした。緩衝液：１００ｍＭギ酸／ギ酸ナトリウム ｐＨ３．７７＋５０ｍＭ ＮａＣｌ。
９６ウェル白色ＰＣＲプレートにおいて、１５μｌの試料（精製脱塩酵素、緩衝液中５０ｐｐｍ）を緩衝液中のＳｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ（濃度＝１０倍；供給業者からのストック溶液＝５０００倍）と混合（１：１）した。
プレートを光学的ＰＣＲシールで密閉した。７６℃／時の走査速度で、２５℃で開始して９６℃で終了するようにＰＣＲ装置を設定した。
励起用の内蔵ＬＥＤ青色光およびＲＯＸフィルタ（６１０ｎｍ、発光）を使用して２０秒毎に蛍光をモニタした。
一次導関数（ｄＦ／ｄＫ）の最大値としてＴｍ値を計算した（Ｇｒｅｇｏｒｙ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．１４：７００）。ΔＴｍはキシラナーゼ変異体のＴｍと野生型キシラナーゼのＴｍとの差であり、以下の表２に提供する。
Figure 2019524081
Figure 2019524081
これらの結果から、キシラナーゼ変異体は野生型キシラナーゼと比べて熱安定性が向上していることが示される。
実施例３：培養ブロス試料のタンパク質熱変性分析（ＴＳＡ、サーマルシフトアッセイ）
別のＧＨ３０サブファミリー８キシラナーゼにおいて（実施例１に記載されるとおりの方法を用いて）選択の置換を行い、かかる置換もまた同様の熱安定化特性を示し得るかどうかを見た。ＧＨ３０＿８キシラナーゼは、配列番号１と９０．５％の同一性を有するバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）からのＧＨ３０＿８キシラナーゼである配列番号６であった。
タンパク質熱変性はリアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｓｔｅｐ−Ｏｎｅ−Ｐｌｕｓ）を使用してＳｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓ−６６５０）でモニタした。
培養ブロス試料はＴＳＡ分析の前に凝結させて希釈した：
培養ブロスに、Ｇｕｌｂｒａｎｄｓｅｎから調達可能な４ｖ／ｖ−％ＧＣ８５０（商標）（Ａｌ２（ＯＨ）５Ｃｌ）またはＮｏｒｄＰａｃ １８（Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａｌｕｍｉｎａｔ Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋから入手可能）を加え、混合してスピンダウンした。
この上清に対し、１０ｖ／ｖ−％１．０Ｍ ＨＣｌと、続いて緩衝液：１００ｍＭギ酸／ギ酸ナトリウムｐＨ３．７７＋５０ｍＭ ＮａＣｌ中８倍希釈物であった。
９６ウェル白色ＰＣＲプレートにおいて、１５μｌ試料（凝結させて希釈した）を緩衝液中のＳｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ（濃度＝１０倍；供給業者からのストック溶液＝５０００倍）と混合（１：１）した。
プレートを光学的ＰＣＲシールで密閉した。７６℃／時の走査速度で、２５℃で開始して９６℃で終了するようにＰＣＲ装置を設定した。
励起用の内蔵ＬＥＤ青色光およびＲＯＸフィルタ（６１０ｎｍ、発光）を使用して２０秒毎に蛍光をモニタした。
一次導関数（ｄＦ／ｄＫ）の最大値としてＴｍ値を計算した（Ｇｒｅｇｏｒｙ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．１４：７００）。
ΔＴｍはキシラナーゼ変異体のＴｍと野生型キシラナーゼのＴｍとの差であり、以下の表３に提供する。
Figure 2019524081
これらの結果は、配列番号１の熱安定性をもたらす置換がまた、配列番号６の熱安定性ももたらすことを示している。従って、かかる置換が他の類似のＧＨ３０＿８キシラナーゼ、特に分類上の科、バチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）からのＧＨ３０＿８キシラナーゼの熱安定性をもたらし得ることを予想し得る。
実施例４：動物飼料および動物飼料添加物
顆粒
顆粒は、本発明のキシラナーゼ変異体を硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウムおよび／またはセルロースなどの充填剤と共に造粒し、次に任意選択で顆粒をワックスコーティング（例えば水素添加パーム油）または塩コーティング（例えば硫酸ナトリウムおよび／または硫酸マグネシウム）でコーティングすることにより調製する。
或いは、顆粒は、本発明のキシラナーゼ変異体の液体溶液を不活性コアに吸収させて、次に任意選択で顆粒をワックスコーティング（例えば水素添加パーム油）または塩コーティング（例えば硫酸ナトリウムおよび／または硫酸マグネシウム）でコーティングすることにより調製する。
動物飼料添加物
プレミックス１キロ当たり０．０１ｇ〜１０ｇの酵素タンパク質を含有する本発明のキシラナーゼ変異体（任意選択でコーティングされた顆粒として配合される）のプレミックス配合物を以下のプレミックスに加える：
Figure 2019524081
動物飼料
これは、上記に記載したとおりの動物飼料添加物を含む動物飼料（ブロイラー飼料）の例である：
６２．５５％トウモロコシ
３３．８％大豆ミール（５０％粗タンパク質）
１．０％ダイズ油
０．２％ＤＬ−メチオニン
０．２２％ＤＣＰ（リン酸二カルシウム）
０．７６％ＣａＣＯ３（炭酸カルシウム）
０．３２％砂
０．１５％ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）
１％の上記のプレミックス
原料を混合し、飼料を所望の温度、例えば、６０、６５、７５、８０、８５、９０またはさらには９５℃でペレット化する。
液体配合物
本発明のキシラナーゼ変異体の液体配合物は、０．１％〜１０ｗ／ｗ酵素タンパク質、４０〜６０％グリセロール、０．１〜０．５％安息香酸ナトリウムおよび水を含む。この液体配合物を上記に記載されるペレット状動物飼料に噴霧する（この場合、動物飼料添加物は本発明のキシラナーゼ変異体を含まないであろう）。
本明細書に記載され、特許請求されている本発明は、本明細書に開示されている特定の態様によって範囲が限定されるべきではなく、これは、これらの態様は本発明の数々の態様の例示であることが意図されているためである。いずれかの同等の態様は本発明の範囲内であることが意図されている。実際に、本明細書に示され、記載されているものに追加した本発明の種々の改変形態が、前述の記載から当業者には明らかとなるであろう。このような改変形態もまた、添付の特許請求の範囲の範囲内に属することが意図されている。競合する場合には、定義を含む本開示が優先されることとなる。

Claims (29)

  1. 配列番号１の位置２４、２６、３６、３７、６０、７１、７４、７５、７６、１２４、１３３、１５５、１６７、２０８、３１７、および３２１に対応する１つ以上の位置に置換を含む、キシラナーゼ変異体であって、キシラナーゼ活性を有し、および配列番号１、２、３、４、５または６に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有するキシラナーゼ変異体。
  2. 配列番号１、２、３、４、５および／または６に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する、請求項１に記載のキシラナーゼ変異体。
  3. 前記置換が、Ｈ２４Ｗ、Ａ２６Ｅ、Ｒ３６Ｌ、Ｒ３６Ｔ、Ｅ３７Ｔ、Ｒ６０Ｎ、Ｋ７１Ｔ、Ｋ７１Ｉ、Ｖ７４Ｌ、Ｖ７４Ｉ、Ｋ７５Ｎ、Ｋ７５Ｌ、Ｈ７６Ｌ、Ｉ１５５Ｍ、Ｎ１６７Ｅ、Ｖ２０８Ｌ、Ｓ３１７ＤおよびＧ３２１Ａからなる群から選択される、請求項１または２に記載のキシラナーゼ変異体。
  4. 親キシラナーゼの変異体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキシラナーゼ変異体であって、前記親キシラナーゼが配列番号１に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する、キシラナーゼ変異体。
  5. 前記親と比べて向上した特性を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のキシラナーゼ変異体であって、前記向上した特性が、触媒効率、触媒速度、化学安定性、酸化安定性、ｐＨ活性、ｐＨ安定性、比活性、貯蔵条件下での安定性、基質結合、基質切断、基質特異性、基質安定性、表面特性、熱活性、および熱安定性からなる群から選択される、キシラナーゼ変異体。
  6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載のキシラナーゼ変異体と配合剤とを含む組成物。
  7. １つ以上の追加的な酵素；
    １つ以上の微生物；および／または
    植物系材料
    をさらに含む、請求項６に記載の組成物。
  8. 請求項１〜５のいずれか一項に記載のキシラナーゼ変異体と配合剤とを含む顆粒。
  9. 請求項１〜５のいずれか一項に記載のキシラナーゼ変異体、請求項６または７に記載の組成物または請求項８に記載の顆粒と、
    １つ以上のビタミン；
    １つ以上のミネラル；
    １つ以上のアミノ酸；
    １つ以上のフィトジェニクス；
    １つ以上のプレバイオティクス；
    １つ以上の有機酸；および
    １つ以上の他の飼料原料
    からなる群から選択される１つ以上の成分とを含む動物飼料添加物。
  10. 請求項１〜５のいずれか一項に記載のキシラナーゼ変異体と、任意選択で２０％〜８０％ｗ／ｗのポリオールおよび／または０．０１％〜２．０％ｗ／ｗ保存剤とを含む液体配合物。
  11. １つ以上の酵素；
    １つ以上の微生物；
    １つ以上のビタミン；
    １つ以上のミネラル；
    １つ以上のアミノ酸；
    １つ以上のフィトジェニクス；
    １つ以上のプレバイオティクス；
    １つ以上の有機酸；および
    １つ以上の他の飼料原料
    からなるリストから選択される１つ以上の成分をさらに含む、請求項１０に記載の液体配合物。
  12. 請求項１〜５のいずれか一項に記載のキシラナーゼ変異体、請求項６または７に記載の組成物、請求項８に記載の顆粒、請求項９に記載の動物飼料添加物または請求項１０または１１に記載の液体配合物と植物系材料とを含む動物飼料。
  13. 動物の１つ以上の性能パラメータを向上させる方法であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載のキシラナーゼ変異体、請求項６または７に記載の組成物、請求項８に記載の顆粒、請求項９に記載の動物飼料添加物、請求項１０または１１に記載の液体配合物または請求項１２に記載の動物飼料を１匹以上の動物に投与することを含む方法。
  14. 植物系材料からキシランを可溶化させる方法であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載のキシラナーゼ変異体、請求項６または７に記載の組成物、請求項８に記載の顆粒、請求項９に記載の動物飼料添加物または請求項１０または１１に記載の液体配合物で植物系材料を処理することを含む方法。
  15. 植物系材料からデンプンを放出させる方法であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載のキシラナーゼ変異体、請求項６または７に記載の組成物、請求項８に記載の顆粒、請求項９に記載の動物飼料添加物または請求項１０または１１に記載の液体配合物で植物系材料を処理することを含む方法。
  16. 動物飼料の栄養価を向上させる方法であって、植物系材料を含む飼料に、請求項１〜５のいずれか一項に記載のキシラナーゼ変異体、請求項６または７に記載の組成物、請求項８に記載の顆粒、請求項９に記載の動物飼料添加物または請求項１０または１１に記載の液体配合物を添加することを含む方法。
  17. 請求項１〜５のいずれか一項に記載のキシラナーゼ変異体、請求項６または７に記載の組成物、請求項８に記載の顆粒、請求項９に記載の動物飼料添加物、請求項１０または１１に記載の液体配合物または請求項１２に記載の動物飼料の：
    動物飼料における；
    動物飼料添加物における；
    動物飼料における使用のための組成物の調製における；
    動物飼料の栄養価を向上させるための；
    動物飼料の消化率を増加させるための；
    動物における１つ以上の性能パラメータを向上させるための；
    植物系材料からキシランを可溶化するための
    植物系材料からデンプンを放出させるための
    使用。
  18. 発酵産物の作製方法であって、以下のステップ：
    （ａ）デンプン含有材料を糊化開始温度未満の温度でα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、および請求項１〜５のいずれか一項に記載のキシラナーゼ変異体によって糖化させるステップ；および
    （ｂ）発酵生物を使用して発酵させるステップ
    を含む方法。
  19. 生地または前記生地から調製されるベークド製品の調製方法であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載のキシラナーゼ変異体を前記生地に混入させることを含む方法。
  20. 請求項１〜５のいずれか一項に記載のキシラナーゼ変異体をコードする単離ポリヌクレオチドであって、組換え宿主細胞における前記キシラナーゼ変異体の産生を誘導する１つ以上の制御配列に作動可能に連結されているポリヌクレオチド。
  21. 請求項２０に記載のポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクトまたは発現ベクター。
  22. 請求項２１に記載の核酸コンストラクトまたは発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
  23. キシラナーゼ変異体の作製方法であって、
    （ａ）前記キシラナーゼ変異体の発現に好適な条件下で請求項２２に記載の宿主細胞を培養すること；および
    （ｂ）前記キシラナーゼ変異体を回収すること
    を含む方法。
  24. キシラナーゼ変異体の入手方法であって、親キシラナーゼに、配列番号１の位置２４、２６、３６、３７、６０、７１、７４、７５、７６、１２４、１３３、１５５、１６７、２０８、３１７、および３２１に対応する１つ以上の位置で置換を導入すること（前記キシラナーゼ変異体がキシラナーゼ活性を有する）；および前記キシラナーゼ変異体を回収することを含む方法。
  25. 前記変異体が、配列番号１と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記キシラナーゼ変異体が親と比べて向上した特性を有し、前記向上した特性が、触媒効率、触媒速度、化学安定性、酸化安定性、ｐＨ活性、ｐＨ安定性、比活性、貯蔵条件下での安定性、基質結合、基質切断、基質特異性、基質安定性、表面特性、熱活性、および熱安定性からなる群から選択され、好ましくは熱安定性の向上である、請求項２４または２５に記載の方法。
  27. 前記親キシラナーゼが、配列番号１と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記置換が、Ｈ２４Ｗ、Ａ２６Ｅ、Ｒ３６Ｌ、Ｒ３６Ｔ、Ｅ３７Ｔ、Ｒ６０Ｎ、Ｋ７１Ｔ、Ｋ７１Ｉ、Ｖ７４Ｌ、Ｖ７４Ｉ、Ｋ７５Ｎ、Ｋ７５Ｌ、Ｈ７６Ｌ、Ｉ１５５Ｍ、Ｎ１６７Ｅ、Ｖ２０８Ｌ、Ｓ３１７ＤおよびＧ３２１Ａからなる群から選択される、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の方法によって作製されるキシラナーゼ変異体。
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