DE4343591A1 - Verfahren zum evolutiven Design und Synthese funktionaler Polymere auf der Basis von Formenelementen und Formencodes - Google Patents

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren gemäß Anspruch 1.

Die rasante Entwicklung der letzten Jahre im Bereich der Bio­ wissenschaften hat nicht nur die Grundlagenforschung, sondern gerade auch die angewandte Forschung in diesem Feld stimu­ liert. Proteine spielen hier aufgrund ihres breiten Wirkungs­ spektrums eine herausragende Rolle. Ein ganzer Zweig der modernen Biotechnologie beschäftigt sich heute mit dem sog. "Protein Engineering", d. h. der Herstellung von Designer- Proteinen, die entweder auf der Grundlage bekannter Proteine durch graduelles Abändern oder durch vollständige Neusynthese entwickelt werden. Man unterscheidet hier vor allem zwei Ansätze, das rationale und das irrationale Design.

Rationales Design ist darauf aus, eine Aminosäuresequenz zu produzieren, die sich in eine gewünschte Struktur faltet, und zusätzlich die erhoffte Funktion aufweist. Damit hängt diese Strategie ganz offensichtlich von einem tiefen Verstän­ dnis des "Protein folding" ab. Fortschritte in den letzten Jahren betrafen u. a. das rationale Design einfacher Struk­ tur-Domänen. Das Design größerer Proteine mit komplexen oder gar beispiellos neuen Eigenschaften liegt jedoch immer noch außerhalb der Möglichkeiten dieses Ansatzes. Demgegenüber setzt irrationales Design keine Informationen über die Proteinstruktur, Proteinfaltung etc. voraus. Einzig die Kenntnis der gewünschten Eigenschaft und eine Möglichkeit, Molekülpopulationen gemessen an dieser Eigenschaft zu be­ werten, sind hier Voraussetzung. Ausgehend von einer "com­ binatorial library" aus Peptiden oder Proteinen werden Moleküle mit der gewünschten Eigenschaft selektiert und erst im Nachhinein analysiert. Hier wird also der Mechanismus, nachdem ein Molekül die gestellte Aufgabe meistert, nicht im voraus determiniert.

Obwohl dieser Ansatz in sehr eleganter Weise gerade auch in jüngster Zeit Peptide mit einfachen und z. T. neuen Eigen­ schaften hervorgebracht hat, stellt sich auch hier das Problem, wie man zu größeren Proteinen mit komplexeren Funktionen kommen kann. Schon eine vollständige Bank eines 20mers liefert mit 20²⁰ = 10²⁶ verschiedenen Sequenzen eine astronomisch hohe Zahl zu untersuchender Moleküle. Soll die Peptidsequenz auch noch durch eine Nukleinsäure codiert werden, stellt sich das Problem in noch gravierender Weise. Da der genetische Code degeneriert ist, d. h. eine Aminosäure u. U. durch mehrere verschiedene Codons repräsentiert wird, ergibt sich hier eine Zahl von mindestens 4⁶⁰ = 10³⁶ Mole­ külen, die synthetisiert werden. Normalerweise wird an der dritten Codonposition nur G oder C zugelassen, um Stopcodons weitgehend zu vermeiden. Die verbleibende Zahl von 10³⁰ Molekülen übersteigt noch immer die Standardausbeute einer kommerziellen DNA-Synthese um 12 Größenordnungen. Eine weitere Reduktion der pro Position zugelassenen Codons wurde von Youvan vorgeschlagen. Ob diese Methode den meßbaren Se­ quenzraum nicht in unzulänglicher Weise einschränkt, gerade bei der Suche nach neuen Funktionen, bleibt abzuwarten.

Zum Aufbau funktionaler Strukturen arbeitet die Natur mit modularen Systemen. Bekannt sind die Nukleotidbausteine, die Aminosäure-Bausteine (als Nukleotidtripletts kodiert) und Exon-Domänen (aus Aminosäurebausteinen aufgebaut). Die evo­ lutive Optimierung funktionaler Biopolymere entsprechend der Patentanmeldung WO 92/18645 geht von der Vorstellung aus, durch kontinuierliche Verbesserung bestehender Basiseigen­ schaften, z. B. eines Enzyms, bei der kontinuierlichen Anpassung an erwünschte Reaktionsbedingungen wie Ionenstärke, Temperatur, pH-Wert eine optimale Struktur zu finden. Sind vorteilhafte oder mindestens neutrale Mutationen möglich, so sind durch mehrmalige Wiederholungen von Selektion und Mutation auch entfernte Bereiche des Sequenzraumes zugäng­ lich, die durch die Ausgangspopulation nicht abgedeckt waren. Von der ursprünglichen, bereits funktionsfähigen Struktur entfernt man sich jedoch bei diesem Vorgehen in keinem Schritt. Optimiert wird eine Eigenschaft des Aus­ gangsmoleküls, die bereits - wenn auch in bescheidenem Maße - im ursprünglichen Molekül inhärent ist. Der "Pfad", den eine solche Evolution durch den Sequenzraum nimmt, ist bestimmt durch die zugänglichen, in Richtung der Optima führenden Grate in der unterliegenden Wertelandschaft. Wie bei allen Methoden, die den Sequenzraum nicht vollständig erschließen, besteht bei diesem Vorgehen die nur schwer einzuschätzende Gefahr, in einem lokalen Optimum stecken­ zubleiben. Für die Praxis bedeutet dies, daß bestimmte Regionen des Sequenzraumes einschließlich der dort befind­ lichen Optima, durch breite und tiefe Täler abgetrennt sind. Bei der begrenzten Populationsgröße von Molekülspezies in Experimenten (P 43 22 147, WO 92/18645) ist aber die Wahr­ scheinlichkeit zu niedrig, entfernte Vielfehlermutanten zu erzeugen, die sich jenseits dieser Schranke befinden und den Weg zu diesen neuen Optima anzeigen.

Die Natur hat eine Anzahl von Mechanismen entwickelt, mit dieser Problematik umzugehen: lange Entwicklungszeiträume, Rekombinationsverfahren (horizontaler Gentransfer, Crossing­ over, Genkonversion, Exon-Rekombination (exon-shuffling), Virusshuttles, mobile Elemente (Transposons), Untereinheiten- Struktur von komplexen Proteinen)) sowie Multigenfamilien mit Pseudogenen.

Mit der Anzahl der parallel geführten Mutantenbildung und Selektion läßt sich die Chance auf Erzeugung einer ge­ wünschten Vielfehlermutante erhöhen; durch Rekombination lassen sich mutierte Gensegmente effizient mischen. Funktionslose Pseudogene als Mitglieder einer funktions­ fähigen Multigenfamilie lassen sich als Vielfehlermutanten auch über längere Entwicklungszeiträume ohne Gegenselektion in ihrer Existenz erhalten, um eventuell bei Rückerhaltung einer Funktion wieder positiv selektierbar zu werden.

Die Übertragung dieser Mechanismen auf eine effiziente in- vitro-Optimierung ist offensichtlich nicht ohne weiteres möglich. Die Schwierigkeiten müssen jedoch in jedem Falle für solche Aufgabenstellungen gelöst werden, bei denen eine kontinuierliche Optimierung nicht erwartet werden kann. Dies trifft insbesondere für solche Anpassungsprozesse zu, bei denen eine Funktion vollständig neu etabliert werden muß.

Das der Erfindung zugrundeliegende technische Problem be­ trifft die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung oligomerer oder polymerer Funktionselemente wie Biopolymere mit funktionalen Eigenschaften, beispielsweise Enzymen, Ribozymen, Wirkstoffen, etc. Dabei soll unter Ausnutzung evolutiver Strategien ein den herkömmlichen Screening-Ver­ fahren überlegenes Verfahren bereitgestellt werden.

Gelöst wird dieses Problem durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1. Die sich daran anschließenden Unteransprüche betreffen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Erfindungsgemäß werden zur Herstellung oligomerer oder polymerer Funktionselemente aus Formenelementen zunächst Formenelemente durch chemische oder enzymatische Verknüpfung von mindestens zwei Monomeren aufgebaut und die so erhält­ lichen Formenelemente dann zu Funktionselementen verknüpft. Dabei entspricht die Natur der chemischen Bindung zwischen den Monomeren derjenigen zwischen den jeweiligen Formen­ elementen. Die so erhältlichen Funktionselemente können dann auf die bestimmten potentiellen Funktionen getestet werden. Die Vorteile der erfindungsgemäßen Vorgehensweise werden durch die nachfolgende Beschreibung weiter verdeutlicht.

Bevorzugt wird die Verknüpfung der Formenelemente unter Einsatz einer festen Phase als Reaktionsträger durchgeführt. Die Verknüpfung der Formenelemente kann chemisch und/oder enzymatisch erfolgen. Die Verknüpfung der Formenelemente zu den Funktionselementen kann entweder planmäßig durch gezielte Zugabe der einzelnen Formenelemente und nachfolgender Ver­ knüpfung oder auch statistisch durch zufällig gesteuerte Zugabe der Funktionselemente und deren Verknüpfung erfolgen. Es ist dabei möglich, die Verknüpfung schrittweise aufbauend stereospezifisch und/oder gerichtet durchzuführen.

Als Formenelemente kommen vorzugsweise Nukleinsäuren, doppel­ strängige oder einzelsträngige DNA und/oder RNA und/oder modifizierte Nukleinsäuren in Frage. Als Formenelemente kommen auch Peptide und/oder Polypeptide und/oder sonstige kopplungsfähige chemische Oligomer-Formenelemente in Frage. Dazu können auch Oligo- oder Polysaccharide gehören.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Formenelemente als bereits syntheti­ sierte Oligomerbausteine eingesetzt oder im Reaktionsgefäß quasi in situ hergestellt.

Es ist vorteilhaft, die Reaktion der Formenelemente in parallel geführten Mikroreaktionsansätzen (wie in P 43 22 147.5 vorgeschlagen) durchzuführen, bei denen die Formen­ elemente in vorbestimmter Reihenfolge verknüpft werden. Insbesondere werden nach erfolgter Synthese die Reaktions­ produkte wie Funktionselemente oder Vorstufen davon an der festen Phase gebunden bleiben und nach Abtrennung der Reaktionspartner weiter verarbeitet oder von der Festphase entkoppelt. Es ist jedoch ebenfalls möglich, die Reaktion in geeigneten, dem Fachmann bekannten Reaktionsbedingungen in Lösung durchzuführen oder die festphasengekoppelte oder in homogener Lösung durchgeführte Reaktion miteinander zu kombinieren.

Durch Einsatz der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) (PCT/EP 93/01291) wird es ermöglicht, die Funktionsweise der Funktionselemente im gleichen Volumenelement direkt zu bewerten, in dem auch die Synthese abläuft. Dies bedeutet eine sehr direkte Möglichkeit, das Ergebnis einer aufbauenden Funktionselementsynthese zu kontrollieren.

Vorzugsweise wird pro Reaktionsschritt, bei der schrittweisen Verknüpfung der Formenelement, jeweils ein Formenelement als Reaktionspartner an fester Phase gekoppelt. Es können auch Mischungen von Formenelementen eingesetzt werden und/oder im Reaktionsgefäß direkt generiert werden. Werden als Formen­ elemente Nukleinsäuren verwendet, so ist es vorteilhaft, wenigstens einen Reaktionspartner mit einer Schnittstelle eines Restriktionsenzym zu versehen oder ein Nukleinsäure­ formenelement zu verwenden, welches frei von Start- und/oder Stopcodons ist. Vorzugsweise sind die Reaktionsschnittstellen solche, die von Restriktionsenzymen der Klasse IIS erkannt werden können. Die Einführung von Restriktionsschnittstellen dieser Enzymklasse ist vorteilhaft, da beliebige Sequenzen gerichtet verknüpft werden können, ohne daß die Wahl des Reaktionsenzyms die Sequenzerfordernisse des Endproduktes beeinflußt.

Sind in den zu verknüpfenden Formenelemente einzelsträngige Überhänge eingeführt, so können darüber beliebige Sequenzen gerichtet verknüpft werden, ohne daß dabei irgendwelche Anforderungen an die Sequenz des gewünschten Endproduktes gestellt werden müssen. Dieses Erfordernis kann auch durch selektive Phosphorylierung anstelle und in Kombination mit der Einführung der einzelsträngigen Überhänge erzielt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt den Einsatz von Formenelementen, die nach röntgen-kristallographisch analy­ sierten natürlichen Funktionsdomänen von Proteinen und Polypeptiden bekannt sind. Es können so bereits bekannte Bausteine bzw. Module von in der Natur bereits vorkommenden Funktionselementen benutzt werden.

Die zu verwendenden Formenelemente können auch aus Selektionsexperimenten gewonnen werden.

Insbesondere vorteilhaft ist die Verwendung von Formen­ elementen in einer Länge von 1 bis 60 Aminosäuren oder Nukleotidsequenzen entsprechender Kodierungslänge. Die Formenelemente können auch an bestimmten Positionen degeniert sein und/oder Deletionen oder Insertionen tragen, insbe­ sondere bei Verwendung von Nukleotiden als Formenelemente.

Es wird auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens wie oben beschrieben zur Synthese parallel aufgebaut er Formen-Bibliotheken funktionaler Oligomere oder Polymere beansprucht.

Die ursprüngliche Aufgabe von "combinatorial libraries" ist eher das Angebot einer Funktionen-Vielfalt als einer Sequenz­ vielfalt. Es ist heute eine Tatsache, daß die drei­ dimensionale Struktur von Proteinen relativ stabil gegen Substitutionen einzelner Aminosäuren ist. Durch die große Zahl aufgeklärter Proteinstrukturen gewann man die Er­ kenntnis, daß Proteine zwar keine oder nur sehr geringe Sequenzhomologie aufweisen können, aber trotzdem die gleiche oder sehr ähnliche 3D-Struktur einnehmen können. Dies beruht möglicherweise darauf, daß nur eine begrenzte Anzahl mög­ licher Faltungsweisen von Aminosäureketten unter biologischen Bedingungen stabil ist. Strukturelle Verwandtschaft spiegelt aber auch die Evolution rezenter Proteine aus einer relativ begrenzten Zahl von Ur-Strukturen, -Modulen heraus wieder. Diese Module können als kleine, funktionelle Domänen oder kompakte Struktureinheiten verstanden werden und können auch in heutigen Genen leicht aufgespürt werden. In der Hypothese des "Exon-shuffling" wird vermutet, daß die Evolution zu komplexeren Proteinen gerade durch die Kombination von Exons, also Modulen im oben beschriebenen Sinn enorm beschleunigt wurde. Wenn man annimmt, daß die Zahl der Exons, die die Konstruktion aller heute bekannten Proteine erlauben würde, zwischen 1000 und 7000 zu suchen ist, eröffnet eine hier­ archische Strategie des "Protein Design" mit Bausteinen zunehmender Komplexität die Möglichkeit der viel schnelleren Durchmessung eines "shape space" mit zugehörigerer "fitness landscape" als es die Suche in einer traditionellen "com­ binatorial library" gestatten würde. Ein Protein aus 150 Aminosäuren (die Größe einer klassischen Nukleotidbindungs­ stelle, der sog. "Rossman fold") müßte nach herkömmlichem Verfahren aus einer Bibliothek von 20¹⁵⁰ = 10¹⁹⁵ verschiedenen Aminosäuresequenzen selektiert werden. Kombinationen von 1000 verschiedenen Modulen der Länge 30 Aminosäuren ergeben hingegen nur eine Komplexität von 1000⁵ = 10¹⁵ Molekülen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist ein hierarchisches Ver­ fahren zum Design von Proteinen, Nukleinsäuren deren Derivaten oder chemischer Oligo- oder Polymere mit bestimmten gewünschten Eigenschaften, ausgehend von Modul -Bibliotheken, im folgenden als Formenelemente bezeichnet. Erfindungsgemäß können die Formenelemente auch Gensegmente sein, die für Formenelemente kodieren. Die als Module fungierenden Formen­ elemente sollen zufällig kombinierbar sein. Kleinere Proteine oder Untereinheiten für größere Proteine mit bestimmten Eigenschaften werden in einem anschließenden Selektions­ schritt aus dem Pool von Modulkombinationen herausgesondert und können ihrerseits wieder als Bausteine in einer Unterein­ heits-Bibliothek dienen, usw.

Auf jeder Konstruktionsstufe kann durch fehlerhafte Kopierung einzelner Bausteine zusätzlich ein "Rauschen" auf Aminosäure­ sequenzebene eingeführt werden. Dies ermöglicht die Modu­ lierung der dreidimensionalen Anordnung chemischer Gruppen und somit eine weitere funktionelle Optimierung selektierter Moleküle. Die vorgeschlagene Strategie erfordert eine neue Art von "Artificial Gene Assembly".

Bisher werden vor allem zwei Methoden angewandt, denen gemeinsam ist, daß die DNA in einer bestimmten Orientierung ligiert wird, um damit auch die Abfolge der Aminosäuren festzulegen. Die wohl älteste Methode - von Khorana und seinen Mitarbeitern entwickelt - arbeitet mit überlappend komplementären einzelsträngigen DNA Molekülen, die vor der Ligation miteinander hybridisiert werden. Die zweite Methode nutzt Schnittstellen von Restriktionsenzymen im zu konstruierenden Gen, um an diesen Stellen das Gen in Blöcke zu unterteilen, die dann in mehreren aufeinanderfolgenden Schritten zusammengesetzt werden. Durch beide Methoden wird die Sequenz an den Übergängen der verwendeten Oligo-DNAs bzw. Blöcke methodisch bedingt festgelegt. Dies aber entspricht gerade nicht der Anforderung nach beliebiger Austauschbarkeit der einzelnen Module schon in der Konstruktionsphase des Gens. Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist also not­ wendigerweise auch eine neue Art des "Artificial Gene Assembly". Erfindungsgemäß wird in allgemeiner Form wie folgt verfahren:

• - Das Verfahren des "Artificial Gene Assembly" arbeitet analog des in der WO 92/18645 beschriebenen Verfahrens;
• - das Verfahren erschließt nicht den Umgang mit der Varianz im Sequenzraum sondern mit der Varianz im sogenannten Formenraum. Der Formenraum, gebildet aus Basiselementen definierter stabiler Formenelemente, reduziert die Komplexität der Varianten der Bauelemente des Sequenzraumes;
• - das Verfahren erschließt den Funktionsraum über eine Variation von Bausteinen des Formenraumes;
• - als Bausteine werden Bausteine des Form-Codes (siehe unten) eingesetzt;
• - für die Auswahl der Bausteine werden bestimmte Aus­ wahlkriterien zur Vorselektion eingesetzt, die theoretischen Annahmen entsprechen oder natürlichen Formen-Analoga entsprechen.

Als Module zur parallel geführten Variation (Mutation) und Selektion stehen bislang nur die Nukleotide oder Aminosäuren als synthetisch oder enzymatisch handhabbare Bausteine eines Polyiners für gerichtete Kopplungsprozesse zur Verfügung. Der direkte Zugang zu einer funktionalen Oberflächenstruktur eines Polymers scheitert wie oben angeführt in vielen Fällen am Problem der großen Zahlen der Varianten des Sequenzraumes.

Gegenstand dieses evolutiven Anpassungsprozesses ist der Einsatz modularer Bausteine, dem Formencode, bestehend aus den Formenelementen. Der Formencode umfaßt Formenelemente, aufgebaut aus Elementen des Sequenzraumes. Der Formencode, wie er beispielsweise aus natürlichen Polymeren wie Proteinen, Polypeptiden oder funktionalen Nukleinsäuren abgeleitet werden kann, kodiert unter festgesetzten äußeren Bedingungen stabile Formenelemente (Sekundärstrukturen, eventuell Tertiärstrukturelemente enthaltend). Dabei ist bemerkenswert, daß sehr unterschiedliche Sequenzen (Primär­ strukturen) für sehr ähnliche Formenelemente kodieren können.

Mit anderen Worten, im Formenraum sehr eng benachbarte Elemente können im Sequenzraum sehr weit voneinander entfernt liegen (große Hamming Distanz). Das gleiche gilt für den umgekehrten Fall. Im erfindungsgemäßen Sinne erklärt eben diese Eigenschaft, daß bereits der Austausch formenmäßig gleicher Sequenzen im Sequenzraum einen großen Schritt im Sinne einer Vielfehlermutante bedeuten kann. Mit Hilfe der erfindungsgemäßen angesprochenen Syntheseverfahren ist diese Anforderung technisch umsetzbar. Die Erstellung der ent­ sprechenden Verteilungen gelingt durch programmierte Synthese. Sie ist nicht, wie in WO 92/18645 beschrieben, durch fehlerhafte Replikation im Sinne fehlerbehafteter PCR-Verfahren zu erreichen.

Die Abb. 8 erläutert die Begriff Sequenzraum, Formenraum und Funktionsraum. Analog der betrachteten Beziehung von Formenraum und Sequenzraum gilt für die Beziehung von Formen­ raum und Funktionsraum, daß eng benachbarte, homologe Ele­ mente im Formenraum im Funktionsraum weit voneinander ent­ fernt sein können. Wie in Abb. 8 schematisch angedeutet, ist für die Funktion eines Polymers die Geometrie und die physikochemische Topologie und Dynamik der Moleküloberfläche maßgebend, die mit einem zweiten Molekül in Wechselwirkung tritt. Die darunterliegende Struktur, definiert aus dem Formencode, könnte sehr unterschiedlicher chemischer Natur sein. Ähnliche Funktionen im Funktionenraum erklären sich durch ähnliche Grenzflächen-Topologien.

Gerade im Hinblick auf die in Experimenten realisierbaren relativ kleinen Molekülpopulationen, ist es von ent­ scheidender Bedeutung, daß die erzeugte Variation im Formen­ raum in viel effizienterer Weise als etwa die Variation im Sequenzraum die mögliche Funktionenvielfalt im Funktionsraum repräsentiert.

Die folgenden Figurenbeschreibungen erläutern an Beispielen schematisch die Erfindung näher.

Die Fig. 1 betrifft zwei einzelsträngige DNA bzw. RNA- Moleküle, die chemisch oder enzymatisch (z. B. T4 RNA Ligase) ligiert werden, wobei eines der Moleküle über einen spalt­ baren Linker (z. B. Biotin-Streptavidin) an fester Phase immobilisiert ist, während das andere Molekül frei in Lösung vorliegt.

Es stehen dazu heute eine ganze Reihe von Festphasen­ materialien (z. B. magnetische, oberflächenaktivierte Kunst­ stoffkugeln) zur Verfügung. Dieses Verfahren gestattet den schrittweisen Aufbau von größeren DNAs bzw. RNAs. Nach jedem Ligationsschritt werden nicht umgesetzte RNAs weggewaschen und die an fester Phase befindlichen Ligationsprodukte in den nächsten Ligationsansatz transferiert. Vorteilhafterweise ist die Handhabung, insbesondere die Reinigung der jeweiligen Ligationsprodukte sehr einfach.

Nach Abschluß der letzten Ligation wird das Produkt direkt als Effektormolekül eingesetzt oder in einer (in vitro) Translationsreaktion zunächst in die entsprechende Protein­ struktur übersetzt, welche dann als Effektormolekül fungiert.

Die Fig. 2 betrifft zwei vollständig doppelsträngige DNA- Moleküle, die chemisch oder enzymatisch (z. B. T4 DNA Ligase) "blunt end" ligiert werden, wobei eines über einen spaltbaren Linker an fester Phase imobilisiert ist, während das andere frei in Lösung vorliegt. Auf diese Weise können schrittweise größere doppelsträngige DNA Moleküle aufgebaut werden. Die gerichtete Ligation wird durch unterschiedliche Phosphory­ lierung der Reaktionspartner erreicht. Modul A und das letzte Modul sind so entworfen, daß sie jeweils eine Schnittstelle für ein Restriktionsenzym enthalten. Dies ermöglicht erstens die Abspaltung des Produktes von der festen Phase und zweit­ ens die anschließende, gerichtete Klonierung der DNA (siehe auch Fig. 5).

Zu Fig. 3: DNA-Moleküle können gemäß Fig. 2 ebenfalls ligiert werden, wenn das in Lösung befindliche Molekül an einer Seite ein einzelsträngiges Ende besitzt, d. h. nicht vollständig doppelsträngig vorliegt. Dieses Ende steht auf diese Weise nicht für die Doppelstrang-spezifische Ligation, z. B. mit T4 DNA Ligase zur Verfügung. In Kombination mit den schon erwähnten Phosphorylierungsstrategien (Fig. 2, insbe­ sondere Variante 1) ergibt sich die Möglichkeit, die Ligation ohne unerwünschte Nebenprodukte durchzuführen. Das in Lösung befindliche DNA-Molekül kann so entworfen sein, daß es vor seinem einzelsträngigen Ende noch die Schnittstelle eines Restriktionsenzyms vorzugsweise die eines Class IIS Enzyms (z. B. AlwI) mit Erkennungsstelle in dem abzuschneidenden, teilweise einzelsträngigen DNA-Stück) besitzt. Nach der Ligation kann das Ligationsprodukt an fester Phase mit dem Restriktionsenzym geschnitten werden. Auf diese Weise entsteht wieder ein vollständig doppelsträngiges DNA-Molekül an fester Phase. Alternativ kann das einzelsträngige Ende mit einer Polymerase zum Doppelstrang aufgefüllt oder mit einer Exonuklease abverdaut werden.

Zu Fig. 4: Restriktionsschnittstellen können (überlappend) auch entstehen, indem zwei doppelsträngige DNA-Moleküle miteinander ligiert werden.

Zu Fig. 5: Vollständig oder teilweise doppelsträngige DNA-Moleküle können gemäß Fig. 1-4 ligiert werden, auch wenn Mischungen von Molekülen (z. B. B, C, D) verwendet werden. Auf diese Weise entstehen Mischungen von immobi­ lisierten Molekülen, die jeweils verschiedenen Kombinationen der eingesetzten Bausteine entsprechen. Am Ende des letzten Ligationsschrittes kann die Gesamt-DNA oder ein Teil davon mit Hilfe von Restriktionsenzymen, die innerhalb des Kon­ struktes schneiden, von der festen Phase abgespalten und ggf. in ein Phagen- oder Bakteriendisplay-System kloniert werden. Die DNA kann aber auch in einem kombinierten in-vitro-Trans­ kriptions- und Translationssystem exprimiert werden.

Zu Fig. 6: Ausgehend von Modul-Bibliotheken können Peptide, Proteindomänen und kleine Proteine durch zufällige Kom­ bination von einzelnen Modulen erzeugt werden. Entsprechend einem hierarchischen Verfahren zum Proteindesign können in einer weiteren Stufe dann auch Proteindomänen als Bausteine kombiniert werden. Auf jeder Komplexitätsstufe können Mutationen eingefügt werden, die - ohne die globale Struktur zu verändern - eine Feinabstimmung der dreidimensionalen An­ ordnung chemischer Gruppen erlauben.

Fig. 7 erläutert schematisch, daß verschiedene Proteine trotz unterschiedlicher, katalytisch aktiver Aminosäuren im aktiven Zentrum in Bezug auf das Substrat homologe Funktionen besitzen (Chymotrypsin/Trypsin) oder trotz ähnlicher räum­ licher Anordnung der Aminosäuren im aktiven Zentrum gänzlich unterschiedliche Reaktionen katalysieren (Trypsin/Elastase) können.

Fig. 8 erläutert den Zusammenhang der Begriffe Sequenzraum- Formenraum-Funktionsraum.

Der Sequenzraum ist durch die linearen Nachbarschafts­ beziehungen der Polymer-Bauelemente einer Polymerstruktur definiert. Homologien beschreiben Ähnlichkeiten (in %) in der Abfolge der Bauelemente einer chemischen Stoffklasse. Je höher der Verwandtschaftsgrad zweier Sequenzen desto geringer der Abstand im Sequenzraum.

• a) . . . AATAATGCGCAATATTAGGCCT . . .
• b) . . . AATAAAAAGCAATATTAAGCCT . . .
• c) . . . TTAGCTAGCGATGCGCGCCGGG . . .

Zum Beispiel weisen die Sequenzen a) und b) eine erhebliche Homologie auf, während Sequenz c) keinerlei Ähnlichkeiten mit a) und b) zeigt.

Der Formenraum ist definiert durch die "räumlichen" Nach­ barschaftsbeziehungen der durch ihn repräsentierten Polymere. Der Abstand zweier Sequenzen ist durch den Verwandtschafts­ grad ihrer Strukturen bestimmt. Homologie bedeutet hier Ähnlichkeit der Gesamtstrukturen von Polymeren, die wiederum aus chemisch verknüpften Bauelementen bestehen. Im Formenraum benachbarte Moleküle können im Sequenzraum durchaus weit voneinander entfernt liegen und umgekehrt. [Analog s. o.: Struktur a) 3 alpha-Helices, Struktur b) 2 Alpha-Helices plus unstrukturierter Bereich mit endständiger, kurzer Helix, c) antiparalleles beta-Faltblatt aus 4 Blättern]. Der Funktionen­ raum ist definiert durch die geometrische, dynamische und physikalisch/chemische Oberflächenstruktur, die mit einem weiteren Molekül in spezifische Wechselwirkung treten kann. Homologien beschreiben Ähnlichkeiten der Oberflächenstruktur und den damit verbundenen Wechselwirkungseigenschaften.

Claims (20)

1. Verfahren zur Herstellung oligomerer oder polymerer Funktionselemente aus Formenelementen, wobei die Funktionselemente erhältlich sind durch Verknüpfung von mindestens zwei Formenelementen, von denen mindestens ein Formenelement selbst aus mindestens zwei Monomeren aufgebaut ist, die durch mindestens eine chemische Bindung verknüpft sind, die der chemischen Bindung zwischen zwei Formenelementen entspricht.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Verknüpfung der Formenelemente unter Einsatz einer testen Phase als Reaktionsträger durchgeführt wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 und/oder 2, wobei die Ver­ knüpfung der Formenelemente chemisch und/oder enzy­ matisch erfolgt.

4. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-3, wobei die Verknüpfung von Formenelementen zu Funktions­ elementen planmäßig und/oder stochastisch erfolgt.

5. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-4, wobei die Verknüpfung schrittweise aufbauend, stereospezifisch und/oder gerichtet erfolgt.

6. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Formenelemente zur Stoffklasse der Nukleinsäuren, doppelsträngiger und/oder einzelsträngiger DNA und/oder RNA und/oder modifizierten Nukleinsäuren und/oder Peptiden und/oder Polypeptiden gehören und/oder aus sonstigen kopplungs­ fähigen chemischen Oligomer-Formenelementen aufgebaut sind.

7. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß die Formenelemente als bereits synthetisierte Oligomer-Bausteine eingesetzt werden oder zunächst im Reaktionsgefäß generiert werden.

8. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionen in parallel geführten Mikro-Reaktionsansätzen durchgeführt werden, bei denen Formenelemente in vorbestimmter Reihenfolge verknüpft werden.

9. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß nach erfolgter Synthese die Reaktionsprodukte, wie Funktionselemente oder Vorstufen davon festphasengekoppelt bleiben oder in die lösliche Phase entkoppelt werden.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Reaktionsprodukte mit einem biologischen Testsystem vereinigt werden, wobei die Funktion im gleichen Volumenelement wie die Synthese bewertend gemessen wird, z. B. durch den Ein­ satz der FCS-Analysetechnik.

11. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß pro Reaktionsschritt bei der schrittweisen Verknüpfung der Formenelemente je­ weils ein Formenelement als Reaktionspartner an fester Phase gekoppelt ist.

12. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß Mischungen von Formen­ elementen eingesetzt werden und/oder generiert werden können.

13. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß im Falle des Aufbaues von Nukleinsäure-Formenelementen und/oder der Verknüpfung von Nukleinsäure-Formenelementen wenigstens ein Reaktionspartner eine Schnittstelle für ein Re­ striktionsenzym enthält und/oder frei von Start- und/ oder Stopcodons ist.

14. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-13, dadurch gekennzeichnet, daß über die Einführung von Restriktionsschnittstellen, insbesondere solchen für Enzyme der Klasse IIS beliebige Sequenzen gerichtet verknüpft werden können, ohne daß Sequenzerfordernisse des erwünschten Endproduktes die Wahl des Reaktions­ enzyms beeinflussen.

15. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-14, dadurch gekennzeichnet, daß über die Einführung von einzelsträngigen Überhängen und/oder selektive Phosphorylierung, beliebige Sequenzen gerichtet ver­ knüpft werden können, ohne daß dabei irgendwelche Anforderungen an die Sequenz des erwünschten Endpro­ duktes entstehen.

16. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-15, dadurch gekennzeichnet, daß Formenelemente nach dem Vorbild röntgenkristallografisch analysierter natür­ licher Proteine oder Polypeptide eingesetzt werden.

17. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-16, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eines der ver­ wendeten Formenelemente aus Selektionsexperimenten stammt.

18. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-17, dadurch gekennzeichnet, daß die Formenelemente zwischen 1 und 60 Aminosäuren enthalten oder Nukleotide ent­ sprechender Kodierungslänge.

19. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-18, dadurch gekennzeichnet, daß Formenelemente eingesetzt werden, die an bestimmten Positionen degeneriert sind und/oder Deletionen oder Insertionen tragen.

20. Verwendung des Verfahrens gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-19 zur Synthese parallel aufgebauter Formen-Bibliotheken funktionaler Oligomere oder Poly­ mere.