CN104540394A - 热稳定天冬酰胺酶变体以及对其进行编码的多核苷酸 - Google Patents

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CN104540394A CN201380042430.3A CN201380042430A CN104540394A CN 104540394 A CN104540394 A CN 104540394A CN 201380042430 A CN201380042430 A CN 201380042430A CN 104540394 A CN104540394 A CN 104540394A
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富木亚纪
A·斯文森
H·V·亨德里克森
M·A·斯特林格
绫部圭一
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Abstract

本发明涉及天冬酰胺酶变体。本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸；包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞；以及使用这些变体的方法。本发明进一步涉及一种生产发酵产品的方法，该方法包括：在本发明的天冬酰胺酶的存在下，用α-淀粉酶将含淀粉材料液化为糊精；用葡糖淀粉酶将该糊精糖化为糖，并且使用发酵生物发酵该糖。

Description

热稳定天冬酰胺酶变体以及对其进行编码的多核苷酸
序列表的引用
本申请包括一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
发明背景
发明领域
本发明涉及天冬酰胺酶变体、编码这些变体的多核苷酸、产生这些变体的方法以及使用这些变体的方法。本发明进一步涉及使用一种或多种发酵生物从植物材料生产糖、糊精和发酵产品的方法。
相关技术说明
熟知的是，可以通过减少食物材料中的天冬酰胺的量的处理来减少加热食物产品中的丙烯酰胺形成，例如通过使食物材料经受天冬酰胺酶的作用(参见例如，WO 2004/026042)。
已经鉴定了多种真菌天冬酰胺酶；参见例如，WO 2004/030468或WO 2004/032648。已经描述了用于改进其特性的此类天冬酰胺酶的蛋白质工程。WO 2008/128974、WO 2008/128975和WO 2011/134916披露了来自黑曲霉的在更碱性的pH下具有改进活性的天冬酰胺酶变体。WO 2008/110513披露了来自米曲霉的具有改进的热稳定性的天冬酰胺酶变体。然而，在天冬酰胺酶的某些工业应用中，例如，在法式炸薯条的生产中，甚至更高的热稳定性是所希望的。
本发明的一个目的是提供与其亲本相比具有改进的特性的天冬酰胺酶变体。
现今，通过发酵生物生产大量难于合成地生产的商业产品。此类产品包括醇类(例如，丁醇、乙醇、甲醇、1,3-丙二醇)；有机酸类(例如，乙酸、柠檬酸、葡糖酸盐、葡糖酸、衣康酸、乳酸、琥珀酸、2,5-二酮-D-葡糖酸)；酮类(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)；以及更复杂的化合物，包括例如抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；以及激素。发酵也通常被用于可食用酒精(例如，啤酒和白酒)、乳制品(例如，用于生产酸奶酪和干酪)、皮革以及烟草工业中。
在本领域已知大量通过由含淀粉材料的降解提供的糖进行发酵来生产发酵产品(例如，乙醇)的方法。
然而，从此类植物材料中生产糖、糊精和发酵产品(例如乙醇)仍成本太高。因此，对提供可以增加发酵产品的产率并且由此减少生产成本的方法存在需要。
本发明的一个另外的目的是提供用于生产发酵产品的改进方法。
发明概述
在一个方面中，本发明涉及一种天冬酰胺酶变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置140或241的一个或多个位置处包括取代，或在对应于SEQ ID NO:2的位置27的位置处包括缺失，其中该变体与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少50％序列一致性，并且其中该变体具有天冬酰胺酶活性。
在另一个方面中，本发明涉及一种天冬酰胺酶变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置122、140、197、238、239、240、241、253、258、259、297或373的一个或多个位置处包括取代，或在对应于SEQID NO:2的位置27、28或29的一个或多个位置处包括缺失，其中该变体与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少80％序列一致性，并且其中该变体具有天冬酰胺酶活性。
在另一个方面中，本发明涉及一种天冬酰胺酶变体，该变体包括(i)以下取代中的一个或多个，其中每个位置都对应于SEQ ID NO:2中的位置：T71C、T74C、K122A、V139G、T140D、K194L、D197E、S238C、N239C、K240R、P241E、K253R、I258Y、R259C、R259V、S334W、S338W、G356D、K363R或E373H，或(ii)缺失，该缺失位于对应于SEQ ID NO:2的位置27的位置处；其中该变体与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少50％序列一致性，并且其中该变体具有天冬酰胺酶活性。
在另一个方面中，本发明涉及一种天冬酰胺酶变体，该变体包括(i)以下取代中的一个或多个，其中每个位置都对应于SEQ ID NO:2中的位置：T71C、T74A、T74C、K122A、K122R、V139G、T140D、K194L、D197E、I228M、S238C、N239C、K240R、P241E、K253R、I258V、I258Y、R259C、R259V、S297V、S299A、T314A、P333L、S334P、S334W、E337S、S338G、S338W、G356D、K363R或E373H，或(ii)缺失，该缺失位于对应于SEQ ID NO:2的位置27、28或29的一个或多个位置处；其中该变体与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少80％序列一致性，并且其中该变体具有天冬酰胺酶活性。
在另一个方面中，本发明涉及一种天冬酰胺酶变体，该变体具有至少76℃，优选至少77℃、至少78℃、至少79℃或至少80℃，例如至少81℃、至少82℃、至少83℃、至少84℃或至少85℃的解链温度Tm，其中该Tm是通过差示扫描量热法确定，并且该变体与SEQ IDNO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少50％序列一致性。
本发明还涉及编码这些变体的分离的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及产生这些变体的方法。
本发明还涉及在食物产品的生产中使用这些变体的方法。
本发明还涉及获得这些变体的方法。
本发明还涉及一种生产发酵产品的方法，包括：
(a)在本发明的天冬酰胺酶的存在下，用α-淀粉酶将一种含淀粉材料液化为糊精；
(b)用糖化酶将该糊精糖化为糖；并且
(c)使用发酵生物发酵该糖，以生产该发酵产品。
本发明还涉及一种生产糖的方法，包括：
(a)在本发明的天冬酰胺酶的存在下，用α-淀粉酶将一种含淀粉材料液化为糊精；并且
(b)用糖化酶将该糊精糖化为糖。
本发明还涉及一种生产发酵产品的方法，包括：
(a)用本发明的天冬酰胺酶处理一种含淀粉材料；
(b)用α-淀粉酶将该处理的含淀粉材料液化为糊精；
(c)用糖化酶将该糊精糖化为糖；并且
(d)使用发酵生物发酵该糖，以生产该发酵产品。
本发明还涉及一种生产糊精的方法，包括：
(a)在本发明的天冬酰胺酶的存在下，用α-淀粉酶将一种含淀粉材料液化为糊精；并且
(b)回收该糊精。
本发明还涉及一种生产发酵产品的方法，包括：
(a)用本发明的天冬酰胺酶处理一种含淀粉材料；
(b)用α-淀粉酶将该处理的含淀粉材料液化为糊精；
(c)用糖化酶将该糊精糖化为糖；并且
(d)使用发酵生物发酵该糖，以生产该发酵产品。
本发明还涉及一种生产糖的方法，包括：
(a)用本发明的天冬酰胺酶处理一种含淀粉材料；
(b)用α-淀粉酶将该处理的含淀粉材料液化为糊精；并且
(c)用糖化酶将该糊精糖化为糖。
本发明还涉及一种生产糊精的方法，包括：
(a)用本发明的天冬酰胺酶处理一种含淀粉材料；并且
(b)用α-淀粉酶将该处理的含淀粉材料液化为糊精。
本发明还涉及一种生产发酵产品的方法，包括用α-淀粉酶将一种含淀粉材料转化为糊精；用葡糖淀粉酶将该糊精糖化为糖；并且在本发明的天冬酰胺酶的存在下，使用发酵生物在低于该含淀粉材料的初始凝胶化温度的温度下以一个单一步骤发酵该糖。
本发明还涉及一种生产发酵产品的方法，包括
(a)用本发明的天冬酰胺酶处理一种含一种或多种氨基酸以及一种或多种可溶性糖的植物提取物；
(b)从该植物提取物生产糖蜜；
(c)稀释该糖蜜；并且
(d)用发酵生物发酵该稀释的糖蜜，以生产乙醇。
本发明还涉及一种生产发酵产品的方法，包括
(a)用本发明的天冬酰胺酶处理一种含一种或多种氨基酸以及一种或多种可溶性糖的植物提取物；并且
(b)用发酵生物发酵该处理的植物提取物，以生产该发酵产品。
本发明还涉及一种生产糖的方法，包括
(a)用本发明的天冬酰胺酶处理一种含一种或多种氨基酸以及一种或多种可溶性糖的植物提取物；并且
(b)从该处理的植物提取物中回收该糖。
本发明还涉及一种生产蔗糖的方法，包括
(a)用本发明的天冬酰胺酶处理一种含一种或多种氨基酸以及一种或多种可溶性糖的植物提取物；
(b)澄清该植物提取物；
(c)浓缩发现于该澄清的植物提取物中的糖(例如，通过蒸发)，以形成含蔗糖的浆液；
(d)从该浆液中结晶蔗糖；并且
(e)回收蔗糖。
定义
α-淀粉酶(α1,4-葡聚糖4葡聚糖水解酶，EC 3.2.1.1)是催化淀粉以及其他直链和支链1,4葡糖苷寡糖和多糖的水解的一组酶。
天冬酰胺酶：术语“天冬酰胺酶”意指具有天冬酰胺酶活性的酶，即催化天冬酰胺水解为天冬氨酸的酶(EC 3.5.1.1)。可以根据描述于实例中的天冬酰胺酶活性测定之一(例如，通过ASNU测定)确定天冬酰胺酶活性。在一个方面中，本发明的变体具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的天冬酰胺酶活性。
等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占用同一染色体位点的一种基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是静默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
cDNA：术语“cDNA”是指可以通过得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子的反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。
编码序列：术语“编码序列”意指一种多核苷酸，该多核苷酸直接规定了一种变体的氨基酸序列。编码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指为编码本发明的一种变体的一种多核苷酸的表达所需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生(native)的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种变体的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
表达：术语“表达”包括涉及一种变体的产生的任何步骤，包括(但不限于)转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指一种直链或环状DNA分子，该分子包括编码一种变体的一种多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
片段：术语“片段”意指在一种成熟多肽的氨基和/或羧基末端不存在一个或多个(例如若干个)氨基酸的一种多肽；其中该片段具有天冬酰胺酶活性。在一个方面中，一个片段包含至少300个氨基酸残基、至少325个氨基酸残基或至少350个氨基酸残基。
葡糖淀粉酶(葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶，EC 3.2.1.3)是催化末端(1→4)-连接的α-D-葡萄糖残基依次从链的非还原端水解并释放β-D-葡萄糖的一组酶。
高严谨度条件：术语“高严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹(Southern blotting)程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包括本发明的一种多核苷酸的一种核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
改进的特性：术语“改进的特性”意指与一种变体相关的相对于亲本有所改进的特征。此类改进的特性包括但不限于，催化效率、比活性、底物结合、储存稳定性、化学稳定性、氧化稳定性、最适温度、最适pH、pH稳定性、较低的产物抑制、离子(例如，NaCl)存在下的活性、糖或糖醇(例如，木糖醇)存在下的活性、四聚体稳定性以及热稳定性。
分离的：术语“分离的”意指在自然界中不存在的一种形式或环境中的一种物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质；(2)至少部分地从与其在自然界中相关联的一种或多种或全部天然存在的组分中除去的任何物质，包括但不局限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于自然界中发现的那种物质通过人工手动修饰的任何物质；或者(4)通过相对于与其天然相关联的其他组分增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。一种分离的物质可以存在于发酵液样品中。
低严谨度条件：术语“低严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针来说，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5×SSPE、0.3％SDS、200微克/毫升剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在50℃下洗涤三次，每次15分钟。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一个方面中，基于预测SEQ ID NO:2的氨基酸1至19是信号肽的SignaIP(尼尔森(Nielsen)等人，1997，蛋白质工程(ProteinEngineering)10:1-6)，成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸20至378。在一个优选方面中，基于N-末端测序，成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸27至378。在另一个方面中，基于N-末端测序，成熟多肽是SEQID NO:2的氨基酸27-378、30-378、75-378或80-378。在另一个方面中，成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸80-378。本领域中已知的是，一个宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有天冬酰胺酶活性的成熟多肽的一种多核苷酸。在一个方面中，基于预测SEQ ID NO:1的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP(尼尔森(Nielsen)等人，1997，同上)，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸58至1134。在一个优选方面中，基于编码的天冬酰胺酶的N-末端测序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸79至1134。在另一个方面中，基于编码的天冬酰胺酶的N-末端测序，成熟多肽编码序列是SEQID NO:1的核苷酸79-1134、88-1134、223-1134或238-1134。
中严谨度条件：术语“中严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切和变性的鲑精DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。
中-高严谨度条件：术语“中-高严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针来说，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5×SSPE、0.3％SDS、200微克/毫升剪切并变性的鲑鱼精子DNA以及或者35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2％SDS，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。
突变体：术语“突变体”意指编码一种变体的多核苷酸。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链-或双链核酸分子，其分离自天然存在的基因，或其被修饰成以本来在自然界中不存在的方式含有核酸的区段，或其为合成的，其包含一个或多个控制序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指一种配置，其中一个控制序列相对于一种多核苷酸的编码序列放置在一个适当位置处，以使得控制序列指引编码序列的表达。
亲本或亲本天冬酰胺酶：术语“亲本”或“亲本天冬酰胺酶”意指一种天冬酰胺酶，对该天冬酰胺酶进行一种改变以产生本发明的酶变体。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。
序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“序列一致性”描述。
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open SoftwareSuite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来测定两个氨基酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。标记为“最长一致性”的尼德尔的输出(使用–非简化(nobrief)选项获得)被用作百分比一致性并且被计算如下：
(一致的残基X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000，同上)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼和翁施，1970，同上)来测定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。标记为“最长一致性”的尼德尔的输出(使用–非简化选项获得)被用作百分比一致性并且被计算如下：
(一致的脱氧核糖核苷酸X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
子序列：术语“子序列”意指使一个或多个(例如，若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺少的多核苷酸；其中该子序列编码具有天冬酰胺酶活性的一个片段。在一个方面中，子序列包含至少900个核苷酸、至少975个核苷酸或至少1050个核苷酸。
Tm：在本发明的上下文中，术语“Tm”(解链温度)意指对应于温度自记曲线的信号的尖端的温度，如通过差示扫描量热法(DSC)所测量，使用20mM乙酸钠(pH 5.0)作为透析缓冲液。优选地，如实例7地进行DSC。Tm(解链温度)也可以被称为Td(热变性温度)。
变体：术语“变体”意指具有天冬酰胺酶活性的、在一个或多个(例如，若干个)位置处包含改变(即，取代、插入和/或缺失)的一个多肽。取代意指占据一个位置的氨基酸替换不同的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指在邻接并且紧随占据一个位置的氨基酸之后添加一个氨基酸。本发明的这些变体具有SEQ IDNO:2的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的天冬酰胺酶活性。
非常高严谨度条件：术语“非常高严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。
非常低严谨度条件：术语“非常低严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在45℃下洗涤三次，每次15分钟。
野生型天冬酰胺酶：术语“野生型”天冬酰胺酶意指由见于自然界中的一种天然存在的微生物(如一种细菌、酵母或丝状真菌)表达的一种天冬酰胺酶。
变体命名惯例
出于本发明的目的，将SEQ ID NO:2中披露的成熟多肽用以确定另一种天冬酰胺酶中的对应的氨基酸残基。将另一种天冬酰胺酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2中披露的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000，遗传学趋势16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼和翁施，1970，分子生物学杂志48:443-453)来确定与SEQ ID NO:2中所披露的成熟多肽中的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。
可以通过使用若干计算机程序、使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种天冬酰胺酶中的相应氨基酸残基的鉴别，所述计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数预期的多种序列比较；版本3.5或更新版本；埃德加(Edgar)，2004，核酸研究(Nucleic AcidsResearch)32:1792-1797)、MAFFT(版本6.857或更新版本；加藤(Katoh)和库马(Kuma)，2002，核酸研究30:3059-3066；加藤等人，2005，核酸研究33:511-518；加藤和都(Toh)，2007，生物信息学(Bioinformatics)23:372-374；加藤等人，2009，分子生物学方法 (Methods in Molecular Biology)537:39-64；加藤和都，2010，生物信 息学26:1899-1900)、以及采用ClustalW(1.83或更新版本；汤姆斯(Thompson)等人，1994，核酸研究22:4673-4680)的EMBOSS EMMA。
当其他天冬酰胺酶与SEQ ID NO:2的成熟多肽相分歧使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(林达尔(Lindahl)和埃洛弗松(Elofsson)，2000，分子生物学杂志295:613-615)，可以使用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中的更大灵敏度可以使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表示(特征曲线)来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(阿特休尔(Atschul)等人，1997，《核酸研究》25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白结构数据库中具有一个或多个代表，则可以实现甚至更大的灵敏度。程序如GenTHREADER(琼斯(Jones)，1999，《分子生物学杂志》287:797-815；麦古芬(McGuffin)和琼斯，2003，《生物信息学》19:874-881)利用来自不同来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱、以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，高夫(Gough)等人，2000，《分子生物学杂志》313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评定这类模型的准确度。
对于已知结构的蛋白，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问的并且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(奥尔姆(Holm)和桑德(Sander)，1998，蛋白质(Proteins)33:88-96)或者组合延伸(Shindyalov和伯恩(Bourne)，1998，《蛋白质工程》11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，奥尔姆和帕克(Park)，2000，《生物信息学》16:566-567)。
在描述本发明的变体中，以下所述的命名法适于方便参考。使用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。
取代。对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。因此，在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或者“T226A”。多个突变由加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表分别在位置205和位置411处甘氨酸(G)被精氨酸(R)取代，并且丝氨酸(S)被苯丙氨酸(F)取代。可替代地，可以使用氨基酸取代的如下命名法：位置，取代的氨基酸。因此，在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“226Ala”或“226A”。
缺失。对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。因此，在位置195处的甘氨酸缺失表示为“Gly195*”或者“G195*”。多个缺失可以由加号(“+”)分开，例如，“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
插入。对于氨基酸插入，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。因此，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸被表示为“Gly195GlyLys”或者“G195GK”。多个氨基酸的插入被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2；等]。例如，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸被表示为“Glyl95GlyLysAla”或“G195GKA”。
在这类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号中来对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此将是：
亲本： 变体：
195 195 195a 195b
G G-K-A
多种改变。包含多种改变的变体可以由加号(“+”)分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或者“R170Y+G195E”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。
不同改变。可以在一个位置上引入不同的改变时，这些不同的改变可以由一个逗号分开，例如“Arg170Tyr,Glu”代表在位置170上的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”表示以下变体：
“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”以及“Tyr167Ala+Arg170Ala”。
发明详细说明
SEQ ID NO:1是来自米曲霉的天冬酰胺酶基因的编码序列。基于编码的成熟天冬酰胺酶的N-末端测序，核苷酸1-78编码信号序列。SEQID NO:2是来自米曲霉的天冬酰胺酶的氨基酸序列。基于N-末端测序，氨基酸1-26是信号序列。SEQ ID NO:3是一种编码米曲霉天冬酰胺酶变体的基因的编码序列，该变体具有以下取代：N70K S307A A323RT327V A349Q S351A V353I。SEQ ID NO:4是米曲霉天冬酰胺酶变体的氨基酸序列，该变体具有以下取代：N70K S307A A323R T327VA349Q S351A V353I。SEQ ID NO:5是一种编码米曲霉天冬酰胺酶变体的基因的编码序列，该变体具有以下取代：N70K A323R T327V A349QS351A V353I。SEQ ID NO:6是米曲霉天冬酰胺酶变体的氨基酸序列，该变体具有以下取代：N70K A323R T327V A349Q S351A V353I。SEQID NO:10是来自黑曲霉的天冬酰胺酶的氨基酸序列。
变体
在一个方面中，本发明涉及一种天冬酰胺酶变体(例如分离的天冬酰胺酶变体)，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置140或241的一个或多个位置处包括取代，或在对应于SEQ ID NO:2的位置27的位置处包括缺失，其中该变体与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少50％序列一致性，并且其中该变体具有天冬酰胺酶活性。
在一个实施例中，该变体与亲本天冬酰胺酶的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在一个实施例中，对应于位置140的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Trp、Tyr或Val取代，优选被Asp取代。在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T140D或由其组成。
在另一个实施例中，对应于位置241的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代，优选被Glu取代。在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代P241E或由其组成。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置27和28的位置处包括缺失。
在另一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置27、28和29的位置处包括缺失。
在一个实施例中，该变体中的取代数目是1-20个，例如，1-10个或1-5个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置71、74、122、139、194、197、228、238、239、240、253、258、259、297、299、314、333、334、337、338、356、363或373的一个或多个位置处进一步包括取代，例如在此描述的那些。
在另一个实施例中，该变体进一步包括以下取代中的一个或多个：T71C、T74A、T74C、K122A、K122R、V139G、K194L、D197E、I228M、S238C、N239C、K240R、K253R、I258V、I258Y、R259C、R259V、S297V、S299A、T314A、P333L、S334P、S334W、E337S、S338G、S338W、G356D、K363R或E373H。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置70、307、323、327、349、351或353的一个或多个位置处进一步包括取代。
在另一个实施例中，该变体进一步包括以下取代中的一个或多个：N70K、S307A、A323R、T327V、A349Q、S351A或V353I。
在另一个实施例中，该变体进一步包括以下取代中的两个或更多个：N70K、S307A、A323R、T327V、A349Q、S351A或V353I。
在另一个实施例中，该变体进一步包括以下取代中的三个或更多个：N70K、S307A、A323R、T327V、A349Q、S351A或V353I。
在另一个实施例中，该变体进一步包括以下取代中的四个或更多个：N70K、S307A、A323R、T327V、A349Q、S351A或V353I。
在另一个实施例中，该变体进一步包括以下取代中的五个或更多个：N70K、S307A、A323R、T327V、A349Q、S351A或V353I。
在另一个实施例中，该变体进一步包括以下取代中的六个或更多个：N70K、S307A、A323R、T327V、A349Q、S351A或V353I。
在另一个实施例中，该变体进一步包括以下取代：N70K、S307A、A323R、T327V、A349Q、S351A以及V353I。
在一个实施例中，该变体在对应于位置290的位置处进一步包括取代。
在另一个实施例中，该变体进一步包括取代K290V。
在一个优选实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置241的位置处包括取代，其中该变体与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少50％序列一致性，如至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。在一个更优选的实施例中，该变体包括取代241E。在一个甚至更优选的实施例中，与SEQ ID NO:2相比，该变体进一步包括以下取代中的至少一个：122A、240R、299A、334P、337S或338W，优选与SEQ ID NO:2相比，以下取代中的至少一个：122A、299A、334P、337S或338W。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:10的位置237的位置处包括取代，其中该变体与SEQ ID NO:10的成熟多肽具有至少80％序列一致性，如至少85％，例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。优选地，该变体包括取代237E。
在第二方面中，本发明涉及一种天冬酰胺酶变体(例如分离的天冬酰胺酶变体)，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置122、140、197、238、239、240、241、253、258、259、297或373的一个或多个位置处包括取代，或在对应于SEQ ID NO:2的位置27、28或29的一个或多个位置处包括缺失，其中该变体与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少80％序列一致性，并且其中该变体具有天冬酰胺酶活性。
在一个实施例中，该变体与亲本天冬酰胺酶的氨基酸序列具有至少85％，例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少85％，例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％，例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少85％，例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置27的位置处包括缺失。在另一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置27和28的位置处包括缺失。在另一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置27、28和29的位置处包括缺失。
在一个实施例中，该变体中的取代数目是1-20个，例如，1-10个或1-5个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代。
在一个实施例中，该变体在对应于任何位置122、140、197、238、239、240、241、253、258、259、297或373的两个或更多个位置处包括取代。在另一个实施例中，该变体在对应于任何位置122、140、197、238、239、240、241、253、258、259、297或373的三个或更多个位置处包括取代。在另一个实施例中，该变体在对应于位置122、140、197、238、239、240、241、253、258、259、297或373的四个或更多个位置处包括取代。
在一个实施例中，该变体在对应于位置122的位置处包括取代或由其组成。在另一个实施例中，对应于位置122的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Ala或Arg取代，最优选被Ala取代。在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代K122A或K122R或由其组成。
在一个实施例中，该变体在对应于位置140的位置处包括取代或由其组成。在另一个实施例中，对应于位置140的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Trp、Tyr或Val取代，优选被Asp取代。在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T140D或由其组成。
在一个实施例中，该变体在对应于位置197的位置处包括取代或由其组成。在另一个实施例中，对应于位置197的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Glu取代。在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代D197E或由其组成。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置238的位置处包括取代或由其组成。在另一个实施例中，对应于位置238的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Cys取代。在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S238C或由其组成。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置239的位置处包括取代或由其组成。在另一个实施例中，对应于位置239的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Cys取代。在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N239C或由其组成。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置240的位置处包括取代或由其组成。在另一个实施例中，对应于位置240的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Arg取代。在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代K240R或由其组成。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置241的位置处包括取代或由其组成。在另一个实施例中，对应于位置241的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代，优选被Glu取代。在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代P241E或由其组成。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置253的位置处包括取代或由其组成。在另一个实施例中，对应于位置253的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Arg取代。在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代K253R或由其组成。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置258的位置处包括取代或由其组成。在另一个实施例中，对应于位置258的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Tyr或Val取代。在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I258Y或I258V或由其组成。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置259的位置处包括取代或由其组成。在另一个实施例中，对应于位置259的位置处的氨基酸被Ala、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Cys或Val取代。在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代R259C或R259V或由其组成。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置297的位置处包括取代或由其组成。在另一个实施例中，对应于位置297的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Val取代。在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S297V或由其组成。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置373的位置处包括取代或由其组成。在另一个实施例中，对应于位置373的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被His取代。在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代E373H或由其组成。
在一个实施例中，该变体在对应于位置122和140的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置122和197的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置122和238的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置122和239的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置122和240的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置122和241的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置122和253的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置122和258的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置122和259的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置122和297的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置122和373的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置140和197的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置140和238的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置140和239的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置140和240的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置140和241的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置140和253的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置140和258的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置140和259的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置140和297的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置140和373的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置197和238的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置197和239的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置197和240的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置197和241的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置197和253的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置197和258的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置197和259的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置197和297的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置197和373的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置238和239的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置238和240的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置238和241的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置238和253的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置238和258的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置238和259的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置238和297的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置238和373的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置239和240的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置239和241的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置239和253的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置239和258的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置239和259的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置239和297的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置239和373的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置240和241的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置240和253的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置240和258的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置240和259的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置240和297的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置240和373的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置241和253的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置241和258的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置241和259的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置241和297的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置241和373的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置253和258的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置253和259的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置253和297的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置253和373的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置258和259的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置258和297的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置258和373的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置259和297的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置259和373的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一个实施例中，该变体在对应于位置297和373的位置处包括取代或由其组成，例如上面描述的那些。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置71、74、139、194、228、299、314、333、334、337、338、356或363的一个或多个位置处进一步包括取代。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置70、307、323、327、349、351或353的一个或多个位置处进一步包括取代。
在另一个实施例中，该变体进一步包括以下取代中的一个或多个：N70K、S307A、A323R、T327V、A349Q、S351A或V353I。
在另一个实施例中，该变体进一步包括以下取代中的两个或更多个：N70K、S307A、A323R、T327V、A349Q、S351A或V353I。
在另一个实施例中，该变体进一步包括以下取代中的三个或更多个：N70K、S307A、A323R、T327V、A349Q、S351A或V353I。
在另一个实施例中，该变体进一步包括以下取代中的四个或更多个：N70K、S307A、A323R、T327V、A349Q、S351A或V353I。
在另一个实施例中，该变体进一步包括以下取代中的五个或更多个：N70K、S307A、A323R、T327V、A349Q、S351A或V353I。
在另一个实施例中，该变体进一步包括以下取代中的六个或更多个：N70K、S307A、A323R、T327V、A349Q、S351A或V353I。
在另一个实施例中，该变体进一步包括以下取代：N70K、S307A、A323R、T327V、A349Q、S351A以及V353I。
在一个实施例中，该变体在对应于位置290的位置处进一步包括取代。
在另一个实施例中，该变体进一步包括取代K290V。
在一个优选实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置122的位置处包括取代，其中该变体与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％序列一致性，如至少85％，例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。在一个更优选的实施例中，该变体包括取代122A。在一个甚至更优选的实施例中，与SEQ ID NO:2相比，该变体进一步包括以下取代中的至少一个：240R、241E、299A、334P、337S或338W，优选与SEQ ID NO:2相比，以下取代中的至少一个：241E、299A、334P、337S或338W。
在一个优选实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置240的位置处包括取代，其中该变体与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％序列一致性，如至少85％，例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。在一个更优选的实施例中，该变体包括取代240R。在一个甚至更优选的实施例中，与SEQ ID NO:2相比，该变体进一步包括以下取代中的至少一个：122A、241E、299A、334P、337S或338W。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:10的位置118的位置处包括取代，其中该变体与SEQ ID NO:10的成熟多肽具有至少80％序列一致性，如至少85％，例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。优选地，该变体包括取代118A。
在第三方面中，本发明涉及一种天冬酰胺酶变体(例如分离的天冬酰胺酶变体)，该变体包括(i)以下取代中的一个或多个，其中每个位置都对应于SEQ ID NO:2中的位置：位置71处的氨基酸被Cys取代、位置74处的氨基酸被Cys取代、位置122处的氨基酸被Ala取代、位置139处的氨基酸被Gly取代、位置140处的氨基酸被Asp取代、位置194处的氨基酸被Leu取代、位置197处的氨基酸被Glu取代、位置238处的氨基酸被Cys取代、位置239处的氨基酸被Cys取代、位置240处的氨基酸被Arg取代、位置241处的氨基酸被Glu取代、位置253处的氨基酸被Arg取代、位置258处的氨基酸被Tyr取代、位置259处的氨基酸被Cys或Val取代、位置334处的氨基酸被Trp取代、位置338处的氨基酸被Trp取代、位置356处的氨基酸被Asp取代、位置363处的氨基酸被Arg取代或位置373处的氨基酸被His取代，或(ii)缺失，该缺失位于对应于SEQ ID NO:2的位置27的位置处；其中该变体与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少50％序列一致性，并且其中该变体具有天冬酰胺酶活性。
在一个优选实施例中，该变体包括(i)以下取代中的一个或多个，其中每个位置都对应于SEQ ID NO:2中的位置：T71C、T74C、K122A、V139G、T140D、K194L、D197E、S238C、N239C、K240R、P241E、K253R、I258Y、R259C、R259V、S334W、S338W、G356D、K363R或E373H，或(ii)缺失，该缺失位于对应于SEQ ID NO:2的位置27的位置处；其中该变体与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少50％序列一致性，并且其中该变体具有天冬酰胺酶活性。
在一个实施例中，该变体与亲本天冬酰胺酶的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置27的位置处包括缺失。在另一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置27和28的位置处包括缺失。在另一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置27、28和29的位置处包括缺失。
在一个实施例中，该变体中的取代数目是1-20个，例如，1-10个或1-5个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代。
在一个实施例中，该变体包括以下取代中的至少两个：位置71处的氨基酸被Cys取代、位置74处的氨基酸被Cys取代、位置122处的氨基酸被Ala取代、位置139处的氨基酸被Gly取代、位置140处的氨基酸被Asp取代、位置194处的氨基酸被Leu取代、位置197处的氨基酸被Glu取代、位置238处的氨基酸被Cys取代、位置239处的氨基酸被Cys取代、位置240处的氨基酸被Arg取代、位置241处的氨基酸被Glu取代、位置253处的氨基酸被Arg取代、位置258处的氨基酸被Tyr取代、位置259处的氨基酸被Cys或Val取代、位置334处的氨基酸被Trp取代、位置338处的氨基酸被Trp取代、位置356处的氨基酸被Asp取代、位置363处的氨基酸被Arg取代、或位置373处的氨基酸被His取代。在另一个实施例中，该变体包括以下取代中的至少两个：T71C、T74C、K122A、V139G、T140D、K194L、D197E、S238C、N239C、K240R、P241E、K253R、I258Y、R259C、R259V、S334W、S338W、G356D、K363R或E373H。
在另一个实施例中，该变体包括以下取代中的至少三个：位置71处的氨基酸被Cys取代、位置74处的氨基酸被Cys取代、位置122处的氨基酸被Ala取代、位置139处的氨基酸被Gly取代、位置140处的氨基酸被Asp取代、位置194处的氨基酸被Leu取代、位置197处的氨基酸被Glu取代、位置238处的氨基酸被Cys取代、位置239处的氨基酸被Cys取代、位置240处的氨基酸被Arg取代、位置241处的氨基酸被Glu取代、位置253处的氨基酸被Arg取代、位置258处的氨基酸被Tyr取代、位置259处的氨基酸被Cys或Val取代、位置334处的氨基酸被Trp取代、位置338处的氨基酸被Trp取代、位置356处的氨基酸被Asp取代、位置363处的氨基酸被Arg取代、或位置373处的氨基酸被His取代。在另一个实施例中，该变体包括以下取代中的至少三个：T71C、T74C、K122A、V139G、T140D、K194L、D197E、S238C、N239C、K240R、P241E、K253R、I258Y、R259C、R259V、S334W、S338W、G356D、K363R或E373H。
在另一个实施例中，该变体包括以下取代中的至少四个：位置71处的氨基酸被Cys取代、位置74处的氨基酸被Cys取代、位置122处的氨基酸被Ala取代、位置139处的氨基酸被Gly取代、位置140处的氨基酸被Asp取代、位置194处的氨基酸被Leu取代、位置197处的氨基酸被Glu取代、位置238处的氨基酸被Cys取代、位置239处的氨基酸被Cys取代、位置240处的氨基酸被Arg取代、位置241处的氨基酸被Glu取代、位置253处的氨基酸被Arg取代、位置258处的氨基酸被Tyr取代、位置259处的氨基酸被Cys或Val取代、位置334处的氨基酸被Trp取代、位置338处的氨基酸被Trp取代、位置356处的氨基酸被Asp取代、位置363处的氨基酸被Arg取代、或位置373处的氨基酸被His取代。在另一个实施例中，该变体包括以下取代中的至少四个：T71C、T74C、K122A、V139G、T140D、K194L、D197E、S238C、N239C、K240R、P241E、K253R、I258Y、R259C、R259V、S334W、S338W、G356D、K363R或E373H。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置228、297、299、314、333或337的一个或多个位置处进一步包括取代。
在另一个实施例中，该变体进一步包括以下取代中的一个或多个：I228M、S297V、S299A、T314A、P333L或E337S。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置70、307、323、327、349、351或353的一个或多个位置处进一步包括取代。
在另一个实施例中，该变体进一步包括以下取代中的一个或多个：N70K、S307A、A323R、T327V、A349Q、S351A或V353I。
在另一个实施例中，该变体进一步包括以下取代中的两个或更多个：N70K、S307A、A323R、T327V、A349Q、S351A或V353I。
在另一个实施例中，该变体进一步包括以下取代中的三个或更多个：N70K、S307A、A323R、T327V、A349Q、S351A或V353I。
在另一个实施例中，该变体进一步包括以下取代中的四个或更多个：N70K、S307A、A323R、T327V、A349Q、S351A或V353I。
在另一个实施例中，该变体进一步包括以下取代中的五个或更多个：N70K、S307A、A323R、T327V、A349Q、S351A或V353I。
在另一个实施例中，该变体进一步包括以下取代中的六个或更多个：N70K、S307A、A323R、T327V、A349Q、S351A或V353I。
在另一个实施例中，该变体进一步包括以下取代：N70K、S307A、A323R、T327V、A349Q、S351A以及V353I。
在一个实施例中，该变体在对应于位置290的位置处进一步包括取代。
在另一个实施例中，该变体进一步包括取代K290V。
在一个优选实施例中，与SEQ ID NO:2相比，该变体包括取代122A，其中该变体与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少50％序列一致性，如至少55％，例如至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。在一个更优选的实施例中，与SEQ ID NO:2相比，该变体进一步包括以下取代中的至少一个：240R、241E、299A、334P、337S或338W，优选与SEQ ID NO:2相比，以下取代中的至少一个：241E、299A、334P、337S或338W。
在一个优选实施例中，与SEQ ID NO:2相比，该变体包括取代240R，其中该变体与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少50％序列一致性，如至少55％，例如至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。在一个更优选的实施例中，与SEQ ID NO:2相比，该变体进一步包括以下取代中的至少一个：122A、241E、299A、334P、337S或338W。
在一个优选实施例中，与SEQ ID NO:2相比，该变体包括取代338W，其中该变体与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少50％序列一致性，如至少55％，例如至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。在一个更优选的实施例中，与SEQ ID NO:2相比，该变体进一步包括以下取代中的至少一个：122A、240R、241E、299A、334P或337S，优选与SEQ ID NO:2相比，以下取代中的至少一个：122A、241E、299A、334P或337S。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:10相比，该变体包括取代334W，其中该变体与SEQ ID NO:10的成熟多肽具有至少80％序列一致性，如至少85％，例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在第四方面中，本发明涉及一种天冬酰胺酶变体(例如分离的天冬酰胺酶变体)，该变体包括(i)以下取代中的一个或多个，其中每个位置都对应于SEQ ID NO:2中的位置：T71C、T74A、T74C、K122A、K122R、V139G、T140D、K194L、D197E、I228M、S238C、N239C、K240R、P241E、K253R、I258V、I258Y、R259C、R259V、S297V、S299A、T314A、P333L、S334P、S334W、E337S、S338G、S338W、G356D、K363R或E373H，或(ii)缺失，该缺失位于对应于SEQ ID NO:2的位置27、28或29的一个或多个位置处；其中该变体与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少80％序列一致性，并且其中该变体具有天冬酰胺酶活性。
在一个实施例中，该变体与亲本天冬酰胺酶的氨基酸序列具有至少85％，例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少85％，例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％，例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少85％，例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置27的位置处包括缺失。在另一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置27和28的位置处包括缺失。在另一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置27、28和29的位置处包括缺失。
在一个实施例中，该变体中的取代数目是1-20个，例如，1-10个或1-5个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代。
在一个实施例中，该变体包括以下取代中的至少两个：T71C、T74A、T74C、K122A、K122R、V139G、T140D、K194L、D197E、I228M、S238C、N239C、K240R、P241E、K253R、I258V、I258Y、R259C、R259V、S297V、S299A、T314A、P333L、S334P、S334W、E337S、S338G、S338W、G356D、K363R或E373H。在另一个实施例中，该变体包括以下取代中的至少三个：T71C、T74A、T74C、K122A、K122R、V139G、T140D、K194L、D197E、I228M、S238C、N239C、K240R、P241E、K253R、I258V、I258Y、R259C、R259V、S297V、S299A、T314A、P333L、S334P、S334W、E337S、S338G、S338W、G356D、K363R或E373H。在另一个实施例中，该变体包括以下取代中的至少四个：T71C、T74A、T74C、K122A、K122R、V139G、T140D、K194L、D197E、I228M、S238C、N239C、K240R、P241E、K253R、I258V、I258Y、R259C、R259V、S297V、S299A、T314A、P333L、S334P、S334W、E337S、S338G、S338W、G356D、K363R或E373H。
在一个实施例中，该变体包括取代T71C或由其组成。
在另一个实施例中，该变体包括取代T74A或由其组成。
在另一个实施例中，该变体包括取代T74C或由其组成。
在另一个实施例中，该变体包括取代K122A或由其组成。
在另一个实施例中，该变体包括取代K122R或由其组成。
在另一个实施例中，该变体包括取代V139G或由其组成。
在另一个实施例中，该变体包括取代T140D或由其组成。
在另一个实施例中，该变体包括取代K194L或由其组成。
在另一个实施例中，该变体包括取代D197E或由其组成。
在另一个实施例中，该变体包括取代I228M或由其组成。
在另一个实施例中，该变体包括取代S238C或由其组成。
在另一个实施例中，该变体包括取代N239C或由其组成。
在另一个实施例中，该变体包括取代K240R或由其组成。
在另一个实施例中，该变体包括取代P241E或由其组成。
在另一个实施例中，该变体包括取代K253R或由其组成。
在另一个实施例中，该变体包括取代I258V或由其组成。
在另一个实施例中，该变体包括取代I258Y或由其组成。
在另一个实施例中，该变体包括取代R259C或由其组成。
在另一个实施例中，该变体包括取代R259V或由其组成。
在另一个实施例中，该变体包括取代S297V或由其组成。
在另一个实施例中，该变体包括取代S299A或由其组成。
在另一个实施例中，该变体包括取代T314A或由其组成。
在另一个实施例中，该变体包括取代P333L或由其组成。
在另一个实施例中，该变体包括取代S334P或由其组成。
在另一个实施例中，该变体包括取代S334W或由其组成。
在另一个实施例中，该变体包括取代E337S或由其组成。
在另一个实施例中，该变体包括取代S338G或由其组成。
在另一个实施例中，该变体包括取代S338W或由其组成。
在另一个实施例中，该变体包括取代G356D或由其组成。
在另一个实施例中，该变体包括取代K363R或由其组成。
在另一个实施例中，该变体包括取代E373H或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括以下取代中的一个或多个：K122A、K240R、P241E、S299A、S334P、E337S或S338W。
在另一个实施例中，该变体包括以下取代中的两个或更多个：K122A、K240R、P241E、S299A、S334P、E337S或S338W。
在另一个实施例中，该变体包括以下取代中的三个或更多个：K122A、K240R、P241E、S299A、S334P、E337S或S338W。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置70、307、323、327、349、351或353的一个或多个位置处进一步包括取代。
在另一个实施例中，该变体进一步包括以下取代中的一个或多个：N70K、S307A、A323R、T327V、A349Q、S351A或V353I。
在另一个实施例中，该变体进一步包括以下取代中的两个或更多个：N70K、S307A、A323R、T327V、A349Q、S351A或V353I。
在另一个实施例中，该变体进一步包括以下取代中的三个或更多个：N70K、S307A、A323R、T327V、A349Q、S351A或V353I。
在另一个实施例中，该变体进一步包括以下取代中的四个或更多个：N70K、S307A、A323R、T327V、A349Q、S351A或V353I。
在另一个实施例中，该变体进一步包括以下取代中的五个或更多个：N70K、S307A、A323R、T327V、A349Q、S351A或V353I。
在另一个实施例中，该变体进一步包括以下取代中的六个或更多个：N70K、S307A、A323R、T327V、A349Q、S351A或V353I。
在另一个实施例中，该变体进一步包括以下取代：N70K、S307A、A323R、T327V、A349Q、S351A以及V353I。
在一个实施例中，该变体在对应于位置290的位置处进一步包括取代。
在另一个实施例中，该变体进一步包括取代K290V。
在一个优选实施例中，与SEQ ID NO:2相比，该变体包括取代299A，其中该变体与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％序列一致性，如至少85％，例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。在一个更优选的实施例中，与SEQ ID NO:2相比，该变体进一步包括以下取代中的至少一个：122A、240R、241E、334P、337S或338W，优选与SEQ ID NO:2相比，以下取代中的至少一个：122A、241E、334P、337S或338W。
在一个优选实施例中，与SEQ ID NO:2相比，该变体包括取代334P，其中该变体与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％序列一致性，如至少85％，例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。在一个更优选的实施例中，与SEQ ID NO:2相比，该变体进一步包括以下取代中的至少一个：122A、240R、241E、299A、337S或338W，优选与SEQ ID NO:2相比，以下取代中的至少一个：122A、241E、299A、337S或338W。
在一个优选实施例中，与SEQ ID NO:2相比，该变体包括取代337S，其中该变体与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％序列一致性，如至少85％，例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。在一个更优选的实施例中，与SEQ ID NO:2相比，该变体进一步包括以下取代中的至少一个：122A、240R、241E、299A、334P或338W，优选与SEQ ID NO:2相比，以下取代中的至少一个：122A、241E、299A、334P或338W。
在第五方面中，本发明涉及一种天冬酰胺酶变体(例如分离的天冬酰胺酶变体)，该变体具有至少76℃，优选至少77℃、至少78℃、至少79℃或至少80℃，例如至少82℃、至少83℃、至少84℃或至少85℃的解链温度Tm，其中该Tm是通过差示扫描量热法确定，并且该变体与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少50％序列一致性。
在第六方面中，本发明涉及一种天冬酰胺酶变体(例如分离的天冬酰胺酶变体)，与SEQ ID NO:10相比，该变体包括取代286V，其中该变体与SEQ ID NO:10的成熟多肽具有至少80％序列一致性，如至少85％，例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
根据上面披露的方面中的任一项，本发明的变体可以在一个或多个(例如，若干个)其他位置处进一步包括一个或多个另外的改变，例如一个或多个另外的取代。
这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的较小缺失；较小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的较小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的较小延伸，如聚组氨酸段(tract)、抗原表位或结合结构域。
保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变特异性活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979在蛋白质(The Proteins)，学术出版社(Academic Press)，纽约中描述。常见取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。
可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质:改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。
可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁汉(Cunningham)和威尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的天冬酰胺酶活性进行测试以鉴别对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定的对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见，例如，德弗斯(de Vos)等人，1992，科学255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生化学会联合会快报309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断鉴别必需氨基酸。
根据上面披露的方面中的任一项，本发明的变体可以由325至375个，例如330至370、335至365或340至360个氨基酸组成。
根据上面披露的方面中的任一项，本发明的变体与亲本酶相比，可以具有改进的特性。或，与现有技术的天冬酰胺酶相比，它们可以具有改进的特性。如果有待如下文所陈述地使用该变体，则这样的一种改进的特性将典型地是一种相关的特性，例如在一种用于生产食物产品的方法中或在一种从含淀粉材料生产发酵产品的方法中。
与亲本天冬酰胺酶相比，展现出改进的特性的变体是一种展示出相关特性的可测量减少或增加的变体，典型地这样使得该变体更适于如下文所陈述地使用，例如在一种用于生产食物产品的方法中或在一种从含淀粉材料生产发酵产品的方法中。
在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的催化效率，即较高的kcat。与所需的亲本天冬酰胺酶的量相比，这将允许在用于生产食物产品的方法中使用较小量的该变体。
在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体在较高的温度下具有较高的kcat。
在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的比活性。在本发明的上下文中，比活性意指以单位/mg纯蛋白而测量的天冬酰胺酶活性。可以根据描述于实例中的天冬酰胺酶活性测定之一(例如，通过ASNU测定)确定天冬酰胺酶活性。
在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的底物结合，即较低的Km。
在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的储存稳定性。改进的储存稳定性意指在储存条件下的改进的稳定性。
在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的化学稳定性。
在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的氧化稳定性。
在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有较高的最适温度。
在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有降低的最适pH。更具体地，它可以是一个更适于在用于生产食物产品的方法中使用的最适pH。
在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的pH稳定性。
在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有较低的产物抑制。
在一个实施例中，与亲本酶相比，在离子(例如，NaCl)的存在下该变体的活性是不同的。
在一个实施例中，与亲本酶相比，在糖或糖醇(例如，木糖醇)的存在下该变体的活性是不同的。
在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的四聚体稳定性。
在一个优选实施例中，根据上面披露的方面中的任一项，相对于亲本，本发明的变体具有改进的热稳定性。
在一个优选实施例中，根据上面披露的方面中的任一项，相对于由SEQ ID NO:2编码的天冬酰胺酶，本发明的变体具有改进的热稳定性。
在另一个优选实施例中，根据上面披露的方面中的任一项，相对于由SEQ ID NO:4编码的天冬酰胺酶，本发明的变体具有改进的热稳定性。
可以将热稳定性确定为热处理后的残余天冬酰胺酶活性除以未进行热处理的天冬酰胺酶活性。热处理可以是在例如pH 4、pH 5、pH 6或pH 7处或附近于高温下孵育例如10、20、40、60、120或240分钟。在此上下文中，可以将未进行热处理的天冬酰胺酶活性确定为于4℃下在与进行热处理的样品相同的缓冲液中进行孵育并且持续相同时间的样品的天冬酰胺酶活性，或它可以是热处理之前的天冬酰胺酶活性。
可以如描述于本申请的实例3中地确定残余天冬酰胺酶活性。
与未进行热处理的天冬酰胺酶活性相比，本发明的多肽在pH 5下于高温下在0.5％酸式焦磷酸钠(SAPP)中孵育一段时间(例如，240分钟)后，显示出至少40％，如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的残余天冬酰胺酶活性。
在本发明的上下文中，高温可以意指例如60℃、65℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃或80℃。
在一个优选实施例中，将热稳定性确定为热处理后的残余天冬酰胺酶活性除以未进行热处理的天冬酰胺酶活性，其中热处理是在pH 5下于70℃-80℃下孵育240分钟，并且其中将未进行热处理的天冬酰胺酶活性确定为于4℃下在与进行热处理的样品相同的缓冲液中进行孵育并且持续相同时间的样品的天冬酰胺酶活性。
在一个优选实施例中，根据上面披露的方面中的任一项，本发明的变体在去离子水中用0.5％SAPP在70℃、pH 5下孵育4小时后的残余活性是未进行这样的孵育的活性的至少20％、优选至少40％、更优选至少60％、甚至更优选至少80％。可以通过如描述于实例中的rASNU测定来确定天冬酰胺酶活性。可以在pH 6下和37℃下对其进行确定。
在另一个优选实施例中，根据上面披露的方面中的任一项，本发明的变体在去离子水中用0.5％SAPP在72℃、pH 5下孵育4小时后的残余活性是未进行这样的孵育的活性的至少5％，优选至少10％、更优选至少20％、甚至更优选至少40％，例如至少60％或至少80％。
在另一个优选实施例中，根据上面披露的方面中的任一项，本发明的变体在去离子水中用0.5％SAPP在74℃、pH 5下孵育4小时后的残余活性是未进行这样的孵育的活性的至少1％，优选至少5％、更优选至少10％、甚至更优选至少20％，例如至少40％或至少60％。
在另一个优选实施例中，根据上面披露的方面中的任一项，本发明的变体在35℃、pH 6下的活性是50℃、pH 6下的其活性的至少20％、优选至少30％、更优选至少35％。
在另一个优选实施例中，根据上面披露的方面中的任一项，本发明的变体在70℃、pH 6下的活性是50℃、pH 6下的其活性的至少20％、优选至少25％、更优选至少30％。
在另一个优选实施例中，根据上面披露的方面中的任一项，本发明的变体(i)在35℃、pH 6的活性是50℃、pH 6下的其活性的至少20％、优选至少30％、更优选至少35％，并且(ii)在70℃、pH 6下的活性是50℃、pH 6下的其活性的至少20％、优选至少25％、更优选至少30％。
在另一个优选实施例中，根据上面披露的方面中的任一项，本发明的变体在pH 5下的活性是pH 6.5下的其活性的至少20％、优选至少30％、更优选至少40％、甚至更优选至少50％。可以在50℃下确定该活性。
在另一个优选实施例中，根据上面披露的方面中的任一项，本发明的变体(i)在35℃、pH 6的活性是50℃、pH 6下的其活性的至少20％、优选至少30％、更优选至少35％，(ii)在70℃、pH 6下的活性是50℃、pH 6下的其活性的至少20％、优选至少25％、更优选至少30％，并且(iii)在pH 5、50℃下的活性是pH 6.5、50℃下的其活性的至少20％、优选至少30％、更优选至少40％、甚至更优选至少50％。
在另一个优选实施例中，根据上面披露的方面中的任一项，本发明的变体在去离子水中用0.5％SAPP在pH 4和70℃下孵育2小时后的残余活性是未进行这样的孵育的活性的至少20％、优选至少30％、更优选至少40％、甚至更优选至少50％。
可以通过差示扫描量热法(DSC)将热稳定性确定为解链温度Tm。如描述于实例7中地进行DSC测定。在一个优选实施例中，根据上面披露的方面中的任一项，本发明的变体具有至少76℃，优选至少77℃、至少78℃、至少79℃或至少80℃的解链温度Tm，其中该Tm是通过差示扫描量热法确定。在另一个优选实施例中，根据上面披露的方面中的任一项，本发明的变体具有至少82℃、至少83℃、至少84℃或至少85℃的解链温度Tm，其中该Tm是通过差示扫描量热法确定。
可以在热转移测定(TSA)中将热稳定性确定为解链温度Tm。如描述于实例6中地进行TSA测定。在一个优选实施例中，根据上面披露的方面中的任一项，本发明的变体具有至少72℃，优选至少73℃、至少74℃或至少75℃的解链温度Tm，其中该Tm是通过TSA确定。在另一个优选实施例中，根据上面披露的方面中的任一项，本发明的变体具有至少76℃、至少77℃、至少78℃、至少79℃或至少80℃的解链温度Tm，其中该Tm是通过TSA确定。
亲本天冬酰胺酶
亲本天冬酰胺酶可以是(a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％序列一致性的一种多肽；(b)由一种多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸在低严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或(ii)(i)的全长互补体杂交；或(c)由一种多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％序列一致性。
在一个实施例中，该亲本是一种具有天冬酰胺酶活性的多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。在一个实施例中，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差不超过10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。
在另一个实施例中，该亲本包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成。在另一个实施例中，该亲本包括SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。在另一个实施例中，该亲本包括SEQ ID NO:2的氨基酸27至378或由其组成。
在另一个实施例中，该亲本是SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个片段，该片段包含至少320个氨基酸残基，例如至少340个或至少360个氨基酸残基。
在另一个实施例中，该亲本是SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个等位基因变体。
在另一个实施例中，该亲本由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在非常低严谨度条件下、低严谨度条件下、中严谨度条件下、中-高严谨度条件下、高严谨度条件下或非常高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或(ii)(i)的全长互补体杂交(萨拉布鲁克(Sambrook)等人，1989，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约)。
可以使用SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列、连同SEQ ID NO:2的多肽或其片段来设计核酸探针以根据本领域熟知的方法来鉴别并克隆对来自不同属或种的菌株的亲本进行编码的DNA。具体而言，可以根据标准DNA印迹程序，使用这类探针与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴别和分离其中的对应基因。这类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。本发明涵盖此类探针。
可以针对与上文所述的探针杂交并编码一个亲本的DNA，来筛选由这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库。来自这类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴别与SEQ ID NO:1或其子序列杂交的克隆或DNA，将载体材料用于DNA印迹中。
出于本发明的目的，杂交表明多核苷酸在非常低到非常高严谨度条件下与一种被标记的核酸探针杂交，该探针对应于(i)SEQ ID NO:1；(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；(iii)其全长互补体；或(iv)其子序列。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下该核酸探针所杂交的分子。
在一个实施例中，该核酸探针是SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列。在另一个实施例中，核酸探针是SEQ ID NO:1的核苷酸79至1134。在另一个实施例中，该核酸探针是对SEQ ID NO:2的多肽；其成熟多肽；或其片段进行编码的多核苷酸。在另一个实施例中，该核酸探针是SEQ ID NO:1。
在另一个实施例中，该亲本由一种多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％、例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。
亲本天冬酰胺酶可以是(a)与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少60％序列一致性的一种多肽；(b)由一种多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸在低严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列或(ii)(i)的全长互补体杂交；或(c)由一种多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少60％序列一致性。
在一个实施例中，该亲本是一种具有天冬酰胺酶活性的多肽，该多肽与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。在一个实施例中，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:4的成熟多肽相差不超过10个氨基酸，例如1、4、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。
在另一个实施例中，该亲本包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由其组成。在另一个实施例中，该亲本包括SEQ ID NO:4的成熟多肽或由其组成。在另一个实施例中，该亲本包括SEQ ID NO:4的氨基酸27至378或由其组成。
在另一个实施例中，该亲本是SEQ ID NO:4的成熟多肽的一个片段，该片段包含至少320个氨基酸残基，例如至少340个或至少360个氨基酸残基。
在另一个实施例中，该亲本是SEQ ID NO:4的成熟多肽的一个等位基因变体。
在另一个实施例中，该亲本由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在非常低严谨度条件下、低严谨度条件下、中严谨度条件下、中-高严谨度条件下、高严谨度条件下或非常高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列、或(ii)(i)的全长互补体杂交(萨拉布鲁克等人，1989，分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港，纽约)。
在另一个实施例中，该亲本由一种多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少60％、例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。
该亲本可以是一种杂合多肽，其中一种多肽的一个区域在另一种多肽的一个区域的N-末端或C-末端处融合。
亲本可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一多肽的多核苷酸融合到本发明的多核苷酸而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。融合多肽还可以使用内含肽技术来构建，其中融合多肽在翻译后产生(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学266:776-779)。
融合多肽可以在两个多肽之间进一步包括一个切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两个多肽。裂解位点的实例包括但不限于在以下各项中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，《工业微生物与生物技术杂志》(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯韦蒂纳(Svetina)等人，2000，《生物技术杂志》(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯马森-威尔逊(Rasmussen-Wilson)等人，1997，《应用与环境微生物学》(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；沃德(Ward)等人，1995，《生物技术》(Biotechnology)13:498-503；以及孔特雷拉斯(Contreras)等人，1991，《生物技术》9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，《生物化学》(Biochemistry)25:505-512；柯林斯-瑞思(Collins-Racie)等人，1995，《生物技术》13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，《蛋白质：结构、功能与遗传》(Proteins:Structure,Function,and Genetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，《药物发现的世界》(Drug Discovery World)4:35-48。
该亲本可以从任何属的微生物中获得。出于本发明的目的，如在此结合一种给定的来源使用的术语“从...中获得”应意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或者由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生的。在一个实施例中，该亲本是胞外分泌的。
该亲本可以是一种真菌天冬酰胺酶。它可以是一种丝状真菌天冬酰胺酶，例如枝顶孢霉属、伞菌属、链格孢属、曲霉属、短梗霉属、Botryospaeria、葡孢盘菌属(Botryotinia)、拟蜡菌属、毛喙壳属、金孢子菌属、麦角菌属、旋孢腔菌属、鬼伞属、乳白蚁属、棒囊壳属、隐丛赤壳菌属、隐球菌属、色二孢属、黑耳属、线黑粉酵母属、镰刀菌属、赤霉属、全鞭毛虫属、腐质霉属、耙齿菌属、蘑燕属、小腔球菌属、梨孢菌属、黑果菌属、多孔菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、新萨托菌属(Neosartorya)、链孢菌属、拟青霉属、青霉菌属、平革菌属、瘤胃壶菌属、Poitrasia、假黑盘菌属、假披发虫属、根毛霉菌属、裂褶菌属、核盘菌属(Sclerotinia)、柱顶孢属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳霉属、弯颈霉属、木霉属、长毛盘菌属、轮枝孢属、小包脚菇属、或炭角菌属天冬酰胺酶。
在一个实施例中，该亲本是一种解纤维枝顶孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、土曲霉、富氏葡萄孢盘菌(Botryotinia fuckeliana)、因奥普斯金孢子菌属(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、莫达瑞姆金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、带多金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、杆孢状镰孢菌(Fusarium bactridioides)、谷类镰孢菌、库威镰孢菌(Fusarium crookwellense)、黄色镰孢菌、禾谷镰孢菌、禾赤镰孢菌(Fusarium graminum)、异孢镰孢菌、合欢木镰孢菌、尖孢镰孢菌、多枝镰孢菌、粉红镰孢菌、接骨木镰孢菌、肤色镰孢菌、拟分枝孢镰孢菌、硫色镰孢菌、圆镰孢菌(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢菌(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢菌、灰腐质霉、特异腐质霉、柔毛腐质霉、白囊耙齿菌、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)、粗糙脉孢菌、产黄青霉、橘青霉、绳状青霉、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、核盘菌、无色梭孢壳菌(Thielaviaachromatica)、阿波梭孢壳菌(Thielavia albomyces)、白毛梭孢壳菌(Thielavia albopilosa)、澳洲梭孢壳菌(Thielavia australeinsis)、菲美蒂梭孢壳菌(Thielavia fimeti)、小孢梭孢壳菌(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳菌(Thielavia ovispora)、秘鲁梭孢壳菌(Thielaviaperuviana)、毛梭孢壳菌(Thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳菌(Thielaviaspededonium)、亚嗜热梭孢壳菌(Thielavia subthermophila)、太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)、哈茨木霉、康氏木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉天冬酰胺酶。
在一个实施例中，该亲本是米曲霉天冬酰胺酶，例如SEQ ID NO:2的天冬酰胺酶或其成熟多肽。
在另一个实施例中，该亲本是黑曲霉天冬酰胺酶，例如披露于WO2004/030468中的天冬酰胺酶。
将理解的是，对于以上提到的物种而言，本发明涵盖完全状态和不完全状态(perfect and imperfect states)二者、以及其他分类学等效物，例如无性型，而不管它们已知的物种名称是什么。本领域的普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。
这些物种的株系可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)、以及美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。
可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等等)获得的DNA样品鉴定和获得该亲本。用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可通过在另一种微生物或混合DNA样本的基因组DNA或cDNA文库中类似地进行筛选来获得编码亲本的多核苷酸。一旦用一种或多种探针检测到编码亲本的多核苷酸，就可以通过使用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆该多核苷酸(参见，例如，萨姆布鲁克等人，1989，见上文)。
变体的制备
本发明还涉及一种用于获得天冬酰胺酶变体的方法，该方法包括在亲本天冬酰胺酶中在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置122、140、197、241、253或373的一个或多个位置处引入取代，其中该变体具有天冬酰胺酶活性；并且回收该变体。
优选地，亲本天冬酰胺酶与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少50％序列一致性，例如与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少60％、至少70％或至少80％序列一致性，更优选与SEQID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列一致性。
在另一个方面中，本发明涉及一种用于获得天冬酰胺酶变体的方法，该方法包括在亲本天冬酰胺酶中在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置122、140、197、238、239、240、241、253、258、259、297或373的一个或多个位置处引入取代，该亲本天冬酰胺酶与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少80％序列一致性，其中该变体具有天冬酰胺酶活性；并且回收该变体。
优选地，亲本天冬酰胺酶与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列一致性。
在另一个方面中，本发明涉及一种用于获得天冬酰胺酶变体的方法，该方法包括在亲本天冬酰胺酶中引入以下取代中的一个或多个，其中每个位置都对应于SEQ ID NO:2中的位置：位置71处的氨基酸被Cys取代、位置74处的氨基酸被Cys取代、位置122处的氨基酸被Ala或Arg取代、位置139处的氨基酸被Gly取代、位置140处的氨基酸被Asp取代、位置194处的氨基酸被Leu取代、位置197处的氨基酸被Glu取代、位置238处的氨基酸被Cys取代、位置239处的氨基酸被Cys取代、位置240处的氨基酸被Arg取代、位置241处的氨基酸被Glu取代、位置253处的氨基酸被Arg取代、位置258处的氨基酸被Tyr取代、位置259处的氨基酸被Cys或Val取代、位置299处的氨基酸被Ala取代、位置334处的氨基酸被Trp取代、位置338处的氨基酸被Trp取代、位置356处的氨基酸被Asp取代、位置363处的氨基酸被Arg取代、或位置373处的氨基酸被His取代，其中该变体具有天冬酰胺酶活性；并且回收该变体。
在一个优选实施例中，该方法包括在亲本天冬酰胺酶中引入以下取代中的一个或多个，其中每个位置都对应于SEQ ID NO:2中的位置：T71C、T74C、K122A、K122R、V139G、T140D、K194L、D197E、I228M、S238C、N239C、K240R、P241E、K253R、I258Y、R259C、R259V、S299A、S334W、S338W、G356D、K363R或E373H，其中该变体具有天冬酰胺酶活性；并且回收该变体。
优选地，亲本天冬酰胺酶与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少50％序列一致性，例如与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少60％、至少70％或至少80％序列一致性，更优选与SEQID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少95或至少98％序列一致性。
在另一个方面中，本发明涉及一种用于获得天冬酰胺酶变体的方法，该方法包括在亲本天冬酰胺酶中引入以下取代中的一个或多个，该亲本天冬酰胺酶与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少80％序列一致性，其中每个位置都对应于SEQ ID NO:2中的位置：T71C、T74A、T74C、K122A、K122R、V139G、T140D、K194L、D197E、I228M、S238C、N239C、K240R、P241E、K253R、I258V、I258Y、R259C、R259V、S297V、S299A、T314A、P333L、S334P、S334W、E337S、S338G、S338W、G356D、K363R或E373H，其中该变体具有天冬酰胺酶活性；并且回收该变体。
优选地，亲本天冬酰胺酶与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列一致性。
对于所有以上方面，可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备这些变体，例如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。
定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。
通过使用涉及含有所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，所述盒式诱变涉及由限制性酶在包含编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将含有突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化该质粒与该寡核苷酸的限制性内切酶是相同的，以允许该质粒的粘性末端以及插入片段彼此连接。参见，例如，谢勒(Scherer)和戴维斯(Davis)，1979，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)76:4949-4955；以及巴顿(Barton)等人，1990，《核酸研究》18:7349-4966。
还可以通过本领域已知的方法体内实现定点诱变。参见，例如，美国专利申请公开号2004/0171154；斯道瑞希(Storici)等人，2001，《自然生物技术》(Nature Biotechnol.)19:773-776；卡伦(Kren)等人，1998，《自然医学》(Nat.Med.)4:285-290；以及凯利萨诺(Calissano)和马奇诺(Macino)，1996，《真菌遗传学简讯》(Fungal Genet.Newslett.)43:15-16。
在本发明中可以使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的很多可商购的试剂盒。
合成基因构建需要体外合成一种设计的多核苷酸分子以编码一种所感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，如由田(Tian)等人(2004，《自然》432:1050-1054)所描述的基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。
使用已知的诱变、重组和/或改组方法、随后进行一个相关的筛选程序可以做出单一或多种氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，这些相关的筛选程序例如由Reidhaar-Olson(瑞德哈尔-奥尔森)和Sauer(萨奥尔)，1988，科学241:53-57；Bowie(鲍依)和萨奥尔，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)86:2152-2156；WO95/17413；或者WO 95/22625所描述的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向突变诱变(德贝夏(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA 7:127)。
可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(Nature Biotechnology)17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多个方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是，利用合成的多核苷酸片段的一个过程结合PCR技术。因此，基因的限定的区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以经受易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的变体的多核苷酸，例如分离的多核苷酸。
核酸构建体
本发明还涉及包括编码本发明的一种变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的一种多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在一种适合的宿主细胞中的表达。
可以按多种方式来操纵该多核苷酸以提供一种变体的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
控制序列可以是一个启动子，即由一个宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的一种多核苷酸。启动子包含介导该变体的表达的转录控制序列。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(阿盖塞(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus)，1994，分子微生物学(Molecular Microbiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因69:301-315)、天蓝色链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊75:3727-3731)、以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(Scientific American)242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(Useful proteins from recombinantbacteria)”；以及在萨姆布鲁克等人，1989，见上文中。串联启动子的实例披露在WO 99/43835中。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代)；以及其突变型启动子、截短型启动子、以及杂合型启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1/GAP、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，《酵母》(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。
控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的一种转录终止子。该终止子序列被可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的3’-端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何终止子。
用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因获得。
丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。
用于酵母宿主细胞的优选终止子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子由罗马努斯等人，1992，见上文描述。
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal of Bacteriology)177:3465-3471)。
该控制序列还可以是一个前导子，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。前导子序列可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的5’-端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何前导子。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导子是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
适用于酵母宿主细胞的前导子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
该控制序列还可以是一种多腺苷酸化序列，即被可操作地连接至该变体编码序列的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别成将多腺苷酸残基添加到所转录的mRNA上的一个信号的一种序列。在宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列都可以使用。
用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
有用于酵母宿主细胞的多腺苷酸化序列在郭(Guo)和谢尔曼(Sherman)，1995，《分子细胞生物学》(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990中有过描述。
该控制序列还可以是信号肽编码区，编码与变体的N-端连接的信号肽，并且引导该变体进入细胞的分泌通路。多核苷酸的编码序列的5’-末端可以固有地包含信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码该变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，编码序列的5’-末端可以包含对该编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地置换天然信号肽编码序列，以便增加变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、以及枯草芽孢杆菌prsA。西蒙纳(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，《微生物学评论》(Microbiological Reviews)57:109-137描述了另外的信号肽。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获得自以下项的基因的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的信号肽获得自以下项的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。见上文，罗马诺斯等人(1992)描述了其他有用的信号肽编码序列。
该控制序列还可以是编码位于变体的N-末端处的前肽的一个前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或者在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割前肽而被转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α因子。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻该变体的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。
还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节该变体的表达的调节序列。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调控化合物的存在。原核系统中的调节序列包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该变体的多核苷酸将与该调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包含编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生一个重组表达载体，这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生表达载体时，编码序列是位于该载体中，以使得该编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体、或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制的任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同包含有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。
该载体优选包含允许容易选择转化细胞、转染细胞、转导细胞或类似细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型、等。
细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包含但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。
载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该变体的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，载体可以进一步包含使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。
用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、以及ARS4与CEN6的组合。
适用于丝状真菌细胞的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分离和包括该基因的质粒或载体的构建可根据WO00/24883披露的方法完成。
可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到一个宿主细胞中以增加变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个与该多核苷酸的可扩增的选择性标记基因可以获得增加的多核苷酸拷贝数目，其中通过在适当选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克等人，1989，同上文)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的一种多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码该变体的基因及其来源。
宿主细胞可以是在重组产生一个变体中有用的任何细胞，例如一个原核细胞或一个真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌菌、梭杆菌菌、螺旋杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌、以及马链球菌兽瘟亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、以及浅青紫链霉菌细胞。
可以通过原生质体转化(参见，例如常(Chang)和科恩(Cohen)，1979，《分子遗传学和基因组》(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如，杨(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，《细菌学杂志》(J.Bacteriol.)81:823-829、或者杜布(Dubnau)和大卫杜夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，《分子生物学杂志》56:209-221)、电穿孔(参见，例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，《生物技术》(Biotechniques)6:742-751)、或共轭(参见，例如，凯勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，《细菌学杂志》169:5271-5278)实现DNA到芽孢杆菌细胞中的引入。可以通过原生质体转化(参见，例如，哈那汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志166:557-580)或者电穿孔(参见，例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究16:6127-6145)实现DNA到大肠杆菌细胞中的引入。可以通过原生质体转化、电穿孔(参见，例如，贡(Gong)等人，2004，叶线形微生物学(Folia Microbiol.(Praha))49:399-405)、接合(参见，例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志171:3583-3585)、或者转导(参见，例如，伯克(Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊98:6289-6294)实现DNA到链霉菌属细胞中的引入。可以通过电穿孔(参见，例如，蔡(Choi)等人，2006，《微生物学方法杂志》(J.Microbiol.Methods)64:391-397)、或者接合(参见，例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，《应用与环境微生物学》71:51-57)实现DNA到假单孢菌属细胞中的引入。可以通过天然感受态(参见，例如，佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，《感染与免疫》(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，卡特(Catt)和卓林克(Jollick)，1991，《微生物》(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，《应用与环境微生物学》65:3800-3804)或者接合(参见，例如，克利威尔(Clewell)，1981，《微生物学评论》(Microbiol.Rev.)45:409-436)实现DNA到链球菌属细胞中的引入。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如在此所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、以及接合菌门(Zygomycota)、连同卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安斯沃思和拜斯比真菌词典(Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi)，第8版，1995，国际应用生物科学中心(CAB International)，大学出版社(University Press)，英国剑桥(Cambridge,UK)中进行定义的)。
该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子囊酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌类(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，因此出于本发明的目的，酵母应如酵母的生物学和活性(Biology and Activities of Yeast)(斯金纳(Skinner)、帕斯莫尔(Passmore)、以及达文波特(Davenport)编辑，应用细菌学学会讨论会系列号9(Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9)，1980)中所描述来定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思等人，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)、或木霉属细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟赌菌(Ceriporiopsis aneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsiscaregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsis gilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsis rivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、拉克淖金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在EP 238023和约尔顿(Yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊81:1470-1474、以及克里斯滕森(Christensen)等人，1988，生物/技术(Bio/Technology)6:1419-1422中描述。用于转化镰刀菌属物种的适合方法由马拉迪尔(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156、以及WO 96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：贝克尔(Becker)和瓜伦特(Guarente)，在阿贝尔森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.编，酵母遗传学与分子生物学指南，酶学方法(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methodsin Enzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约；伊藤(Ito)等人，1983，细菌学杂志(J.Bacteriol.)153:163；以及哈尼恩(Hinnen)等人，1978，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:1920。
产生方法
本发明还涉及产生一种变体的方法，这些方法包括：(a)在适合于该变体的表达的条件下培养本发明的一种宿主细胞；并且(b)回收该变体。
使用本领域已知的方法在适合于产生该变体的一种营养培养基中培养这些宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在一种适合的培养基中并在允许该变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养该细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包含碳和氮来源及无机盐。合适的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果该变体被分泌到该营养培养基中，则该变体可直接从该培养基中回收。如果该变体没有分泌，则它可从细胞裂解液中回收。
使用本领域已知的对这些变体特异的方法可以检测该变体。这些检测方法包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用一种酶测定来确定该变体的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收该变体。例如，可以通过多种常规程序从该营养培养基中回收该变体，这些常规程序包括但不局限于收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。
可以通过本领域中已知的多种程序来纯化变体以获得基本上纯的变体，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见，例如，《蛋白质纯化》(Protein Purification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。
在一个替代实施例中，没有回收该变体，而是将表达该变体的本发明的宿主细胞用作该变体的一个来源。
发酵液配制品或细胞组合物
本发明还涉及包含本发明的变体的一种发酵液配制品或一种细胞组合物。发酵液产物进一步包括在发酵过程中使用的另外的成分，例如像，细胞(包括含有编码本发明的变体的基因的宿主细胞，这些宿主细胞被用于产生感兴趣的变体)、细胞碎片、生物质、发酵介质和/或发酵产物。在一些实施例中，该组合物是含有一种或多种有机酸、杀死的细胞和/或细胞碎片、以及培养基的细胞杀死全培养液。
如在此使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生、不经历或经历最低限的回收和/或纯化的制剂。举例来说，当微生物培养物生长至饱和，在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞表达酶)并且分泌到细胞培养基中时，产生发酵液。发酵液可以包含在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，发酵液是未分级的并且包含用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液包含用过的细胞培养基、胞外酶、以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。
在一个实施例中，该发酵液配制品和细胞组合物包括一种第一有机酸组分(包括至少一种1-5碳的有机酸和/或其盐)以及一种第二有机酸组分(包括至少一种6碳或更多碳的有机酸和/或其盐)。在一个具体实施例中，该第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐，或前述酸中的两种或更多种的混合物；并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐，或前述酸中的两种或更多种的混合物。
在一方面，该组合物包含一种或多种有机酸，并且任选地进一步包含杀死的细胞和/或细胞碎片。一个实施例中，从细胞杀死全培养液中去除这些杀死的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。
这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含一种防腐剂和/或抗微生物(例如抑菌)剂，包括但不限于山梨糖醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域中已知的其他试剂。
细胞杀死全培养液或组合物可以含有在发酵结束时衍生的发酵材料的未分级的内容物。典型地，该细胞杀死全培养液或组合物包含用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，细胞杀死全培养液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶、和杀死的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知方法来使细胞杀死全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。
在此描述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶组分，例如杀死的细胞、细胞碎片、培养基组分、和或一种或多种不溶的酶。在一些实施例中，可以除去不溶组分以提供澄清的液体组合物。
可以通过WO 90/15861或WO 2010/096673所述的方法产生本发明的全培养液配制品和细胞组合物。
酶组合物
本发明还涉及包含本发明的一种变体的组合物。优选地，这些组合物富含这种变体。术语“富含”指示该组合物的天冬酰胺酶活性已经增加，例如，富集因子为至少1.1。
这些组合物可以包括本发明的一种变体作为主要酶组分，例如一种单组分组合物。可替代地，这些组合物可以包括多种酶活性，如一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶，例如，α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、碳水化物酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白分解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
这些组合物可根据本领域已知的方法制备并且可以是液体或干燥组合物的形式。可以根据本领域中已知的方法稳定这些组合物。
下面给出了本发明的组合物的优选用途的实例。可以基于本领域已知的方法来确定组合物的剂量和使用该组合物的其他条件。
用途
根据本发明的天冬酰胺酶变体或包括此类天冬酰胺酶变体的组合物可以用于食物产品生产中。在一个实施例中，使用本发明的变体或包括这样的变体的组合物减少在基于含天冬酰胺原料的热加工食物产品中形成的丙烯酰胺的量。
在一个实施例中，本发明涉及一种用于从食物材料生产食物产品的方法，该方法包括(i)向该食物材料中添加一种本发明的变体，并且(ii)加热该酶处理的食物材料。以有效减少食物材料中存在的天冬酰胺的水平的量将该变体添加至该食物材料中。这将导致加热步骤中形成较少的丙烯酰胺，丙烯酰胺的形成在酶处理后发生。此类方法披露于例如WO 04/026043中。披露于WO 04/026043中的方法以及披露的所有优选项都通过引用而结合。
有待用本发明的变体处理的食物材料可以是将被包括在该食物产品中的任何原料或它可以是获得食物产品的最终形式之前在生产给出中出现的该食物产品的任何中间形式。它可以是使用的任何个别的原料和/或其任何混合物和/或还包括添加剂和/或加工助剂的其任何混合物，和/或其任何后续加工形式。例如，对于食物产品面包，该食物材料可以包括例如小麦、小麦粉、与其他面包成分的其初始混合物，这些其他面包成分是例如像水、盐、酵母和面包改进组合物、混合面团、揉好的面团、经发酵面团以及部分烘焙的面团。例如，对于一些基于马铃薯的食物产品(例如马铃薯零食或炸丸子)，该食物材料可以是马铃薯泥(potato mash)或脱水的马铃薯薄片或颗粒。对于其他基于马铃薯的食物产品(例如已切成薄片的马铃薯片或炸薯条)，该食物材料可以是已经任选被去皮、脱皮和/或干燥的马铃薯块。对于墨西哥玉米片，该食物材料可以是玉米粉糊。对于早餐谷物、该食物材料可以是例如全麦粉、燕麦粉、玉米粉、小麦仁、燕麦仁或燕麦片。对于基于咖啡的食物产品，该食物材料可以是绿咖啡豆。
食物产品可以由植物源的至少一种原料制成，例如马铃薯、咖啡、可可、水稻、谷物，例如小麦、黑麦玉米(rye corn)、玉蜀黍、大麦、去壳谷粒、荞麦以及燕麦。由超过一种原料制成的食物产品也被包括在本发明的范围内，例如包括小麦(例如，以小麦粉的形式)和马铃薯两者的食物产品。本发明的方法可以适于生产例如基于谷物的产品，如面包、糕点、蛋糕、脆饼干、面包圈、荷兰蜂蜜蛋糕(Dutch honey cake)、曲奇、姜饼、姜味蛋糕(gingercake)、早餐谷物或薄脆；基于蔬菜的产品，例如基于马铃薯的产品，如炸薯条、已切成薄片的马铃薯片、基于面团的马铃薯零食、复合马铃薯产品或炸丸子；或基于咖啡的产品。
已知如上举出的原料包含大量天冬酰胺，该天冬酰胺涉及生产过程的加热步骤过程中的丙烯酰胺形成。可替代地，天冬酰胺可以源于除原料以外的其他来源，例如源于蛋白质水解物，例如酵母提取物、大豆水解物、酪蛋白水解物等，其在食物生产过程中被用作添加剂。一种优选生产过程是马铃薯产品的生产，例如马铃薯零食、已切成薄片的马铃薯片或炸薯条，该生产包括深层油炸或烘焙。另一种优选生产过程是早餐谷物的生产，该生产包括烘烤。另一种优选生产过程是从小麦粉和/或来自其他谷物源的面粉烘焙面包以及其他烘焙产品。
可以将该变体(优选是一种热稳定变体)可以在升高的温度下添加至食物材料，例如在40℃-80℃下，如50℃-75℃或60℃-70℃。
酶处理后，使该酶处理的食物材料经受热处理。热处理是用于从食物材料(即，食物产品的原料或中间形式)生产食物产品的方法的一部分。在常规方法(即，未进行天冬酰胺酶处理的方法)中，与本发明的方法相比，在热处理过程中将形成更多的丙烯酰胺，在本发明的方法中，食物材料的一些天冬酰胺被天冬酰胺酶变体水解。
优选加热步骤是食物产品的中间形式的至少一部分(例如，食物产品的表面)暴露于促进丙烯酰胺形成的温度(例如110℃或更高或120℃或更高)的那些步骤。根据本发明的方法中的加热步骤可以在烤箱中进行，例如在180℃-220℃的温度下，如用于面包以及其他焙烤产品的烘焙，或在油中进行，例如在160℃-190℃的温度下，如马铃薯片或炸薯条的油炸。
通过本发明的方法获得的食物产品的特征在于：与可通过以下生产方法获得的等效食物产品相比的显著减少的丙烯酰胺水平，该生产方法不包括以有效减少涉及加热步骤过程中的丙烯酰胺形成的天冬酰胺的水平的量添加天冬酰胺酶。
与通过一种不包括天冬酰胺酶处理的类似过程获得的食物产品相比，根据本发明的方法可以用于获得生产的食物产品的丙烯酰胺含量减少多于25％、优选多于30％或多于40％、更优选多于50％。
在另一个方面中，本发明提供了可通过本发明的方法获得的如上所述的食物产品。
在另一个方面中，本发明涉及在上文所述的天冬酰胺酶变体生产食物产品的用途。
根据本发明的天冬酰胺酶变体还可以用于肿瘤的治疗中。肿瘤细胞的代谢需要L-天冬酰胺，L-天冬酰胺可以被天冬酰胺酶迅速降解。根据本发明的天冬酰胺酶变体可以在一些人类白血病的治疗中用作助剂。在实验动物和人类中给予天冬酰胺酶引起某些淋巴瘤和白血病的退行。因此，在一个实施例中，本发明涉及用于在例如肿瘤的治疗中，例如在动物或人类的淋巴瘤或白血病的治疗中用作药剂的本发明的天冬酰胺酶或包括这样的变体的组合物。
植物
本发明还涉及植物，例如转基因植物、植物部分或植物细胞，其包括本发明的多核苷酸，以便以可回收的量表达和产生该变体。该变体可以从植物或植物部分回收。可替代地，可以按原样将含有该变体的植物或植物部分用于改善食品或饲料的质量，例如，改善营养价值、可口性、以及流变性质，或用以破坏抗营养因子。
转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草，如草甸草(蓝草，早熟禾属)；饲草，如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；温带草，如翦股颖属(Agrostis)；以及谷类，例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱、以及玉蜀黍(玉米)。
双子叶植物的实例是烟草、豆类(如羽扇豆(lupins)、马铃薯、糖甜菜(sugar beet)、豌豆、豆(bean)和大豆(soybean))、以及十字花科植物(十字花科(family Brassicaceae))(如花椰菜、油菜籽、以及紧密相关的模式生物拟南芥)。
植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子、以及块茎、以及包括这些部分的独立组织，例如，表皮、叶肉、薄壁组织(parenchyme)、维管组织、分生组织。特定植物细胞区室，如叶绿体、质外体(apoplast)、线粒体、液泡、过氧化物酶体以及细胞质也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论是何种组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如分离以有助于本发明的利用的特定组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚、胚乳、糊粉和种皮。
同样包含于本发明范围内的是这类植物、植物部分以及植物细胞的子代。
表达变体的转基因植物或植物细胞可以根据本领域已知的方法来构建。简而言之，通过如下方法构建该植物或植物细胞：将编码变体的一个或多个表达构建体并入到植物宿主基因组或叶绿体基因组中，并且使所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。
表达构建体宜为包括编码变体的多核苷酸的核酸构建体，该多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当的调节序列可操作地连接。而且，表达构建体可包含用于鉴别整合了此表达构建体的植物细胞的选择性标记，和将此构建体引入所讨论的植物所必需的DNA序列(后者取决于所用的引入DNA的方法)。
例如，基于希望在何时、何处、以及如何表达该变体来确定对调控序列如启动子和终止子序列和任选的信号或转运序列的选择。例如，编码变体的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且可以使基因产物靶向特定组织或植物部分，如种子或叶。调节序列由例如塔格(Tague)等人，1988，植物生理学(Plant Physiology)86:506描述。
对于组成型表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1、或稻肌动蛋白1启动子(弗兰克(Franck)等人，1980，细胞(Cell)21:285-294；克里斯滕森(Christensen)等人，1992，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)18:675-689；张(Zhang)等人，1991，植物细胞(Plant Cell)3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是以下各项的启动子，例如来自贮藏库组织(例如种子、马铃薯块茎、和果实)(Edwards(爱德华兹)和Coruzzi(科鲁兹)，1990,Ann.Rev.Genet.(遗传学年鉴)24:275-303)，或来自代谢库组织(例如分生组织)(Ito(伊藤)等人，1994,Plant Mol.Biol.(植物分子生物学)24:863-878)，种子特异性启动子，例如来自水稻的谷蛋白、醇溶谷蛋白、球蛋白或白蛋白启动子(Wu(吴)等人，1998,Plant Cell Physiol.(植物与细胞生理学)39:885-889)，来自豆球蛋白B4的蚕豆启动子和来自蚕豆的未知种子蛋白基因(Conrad(康拉德)等人，1998,J.Plant Physiol.(植物生理学杂志)152:708-711)，来自种子油体蛋白的启动子(Chen(陈)等人，1998,Plant Cell Physiol.(植物与细胞生理学)39:935-941)，来自欧洲油菜的贮藏蛋白napA启动子，或本领域已知的任何其他种子特异性启动子，例如，如在WO91/14772中所述的。此外，启动子可以是叶特异性启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(京冢(Kyozuka)等人，1993，植物生理学(PlantPhysiol.)102:991-1000)、小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(麦卓(Mitra)和希金斯(Higgins)，1994，植物分子生物学26:85-93)、来自稻的aldP基因启动子(加贺屋(Kagaya)等人，1995，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)248:668-674)、或伤口诱导型启动子(如马铃薯pin2启动子)(许(Xu)等人，1993，植物分子生物学22:573-588)。同样地，启动子可以通过非生物处理来诱导，如温度、干旱、或盐度变化，或通过外源施加的激活该启动子的物质来诱导，例如乙醇、雌激素、植物激素(如乙烯、脱落酸和赤霉酸)、以及重金属。
启动子增强子元件也可以用于实现变体在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是置于启动子与编码变体的多核苷酸之间的内含子。例如，许等人，1993，见上文，披露了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。
该选择性标记基因及该表达构建体的任何其他部分可以选自本领域中可用的那些。
可以根据本领域中已知的常规技术将核酸构建体结合到植物基因组中，这些常规技术包括农杆菌介导的转化、病毒介导的转化、微注射、粒子轰击、生物射弹转化、以及电穿孔(加塞尔(Gasser)等人，1990，科学244:1293；波特里库斯(Potrykus)，1990，生物/技术8:535；岛本(Shimamoto)等人，1989，自然338:274)。
目前根癌农杆菌介导的基因转移是一种用于产生转基因双子叶植物(关于综述，请参见霍伊卡(Hooykas)和施尔伯鲁特(Schilperoort)，1992，《植物分子生物学》19:15-38)并且用于转化单子叶植物的方法，但对于这些植物还常常使用其他的转化方法。用于产生转基因单子叶植物的方法是粒子(涂覆有转化DNA的微观金或钨粒子)轰击胚愈伤组织或发育中的胚(克里斯托(Christou)，1992，植物杂志(Plant J.)2:275-281；岛本，1994，生物技术当前述评(Curr.Opin.Biotechnol.)5:158-162；瓦西尔(Vasil)等人，1992，生物/技术10:667-674)。用于转化单子叶植物的替代方法是基于原生质体转化，如由奥米儒勒(Omirulleh)等人，1993，植物分子生物学21:415-428所描述。另外的转化方法包括美国专利号6,395,966和7,151,204(两者都通过引用以其全文结合于此)中所描述的那些。
在转化后，根据本领域熟知的方法选出已并入了表达构建体的转化体，并使其再生成为完整植物。通常设计转化程序用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两个独立的T-DNA构建体的共转化或利用特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。
除用本发明的构建体直接转化特定植物基因型外，还可以通过使具有该构建体的植物与缺乏该构建体的第二植物进行杂交来产生转基因植物。例如，可以通过杂交将编码变体的构建体引入特定植物品种中，无需总是直接地转化该给定品种的植物。因此，本发明不仅涵盖了从根据本发明已经转化的细胞直接再生的植物，而且还涵盖了这类植物的后代。如在此使用的，后代可以是指根据本发明制备的亲本植物的任何代的后代。此类后代可以包含根据本发明制备的DNA构建体。杂交导致通过供体植物系与起始系交叉授粉，将转基因引入植物系。此类步骤的非限制性实例描述于美国专利号7,151,204中。
植物可以通过回交转化方法生成。例如，植物包含被称为回交转化的基因型、种系、近交体、或杂交体的植物。
可以使用遗传标记以协助本发明的一种或多种转基因从一个遗传背景渗入到另一个。标记协助的选择提供了相对于常规育种的优势，在于其可以用于避免由表型变异导致的错误。另外，遗传标记可以在具体杂交的个别后代中提供有关良种种质相对程度的数据。例如，当具有所希望性状并且另外具有非农艺学所希望的遗传背景的植物与良种亲本杂交时，可以使用遗传标记来选择不仅具有感兴趣的性状，还具有相对较大比例所希望种质的后代。以此方式，使一种或多种性状渗入特定遗传背景所需的世代数得以最小化。
本发明还涉及产生本发明的变体的方法，这些方法包括：(a)在有益于产生该变体的条件下培养包括编码该变体的多核苷酸的一种转基因植物或一种植物细胞；并且(b)回收该变体。
用于从含淀粉材料生产发酵产品、糊精和糖的方法
本发明还涉及一种生产发酵产品的方法，包括：
(a)在本发明的天冬酰胺酶的存在下，用α-淀粉酶将一种含淀粉材料液化为糊精；
(b)用糖化酶将该糊精糖化为糖；并且
(c)使用发酵生物发酵该糖，以生产该发酵产品。
本发明还涉及一种生产糖的方法，包括：
(a)在本发明的天冬酰胺酶的存在下，用α-淀粉酶将一种含淀粉材料液化为糊精；并且
(b)用糖化酶将该糊精糖化为糖。
本发明还涉及一种生产糊精的方法，包括
(a)在本发明的天冬酰胺酶的存在下，用α-淀粉酶将一种含淀粉材料液化为糊精；并且
(b)回收该糊精。
本发明还涉及一种生产发酵产品的方法，包括：
(a)用本发明的天冬酰胺酶处理一种含淀粉材料；
(b)用α-淀粉酶将该处理的含淀粉材料液化为糊精；
(c)用糖化酶将该糊精糖化为糖；并且
(d)使用发酵生物发酵该糖，以生产该发酵产品。
本发明还涉及一种生产糖的方法，包括：
(a)用本发明的天冬酰胺酶处理一种含淀粉材料；
(b)用α-淀粉酶将该处理的含淀粉材料液化为糊精；并且
(c)用糖化酶将该糊精糖化为糖。
本发明还涉及一种生产糊精的方法，包括：
(a)用本发明的天冬酰胺酶处理一种含淀粉材料；并且
(b)用α-淀粉酶将该处理的含淀粉材料液化为糊精。
淀粉是在植物细胞内作为不可溶于水中的微小颗粒形式形成。当放入冷水中时，这些淀粉颗粒可以吸收少量的液体并且膨胀。在最多50℃至75℃的温度下，该膨胀可以是可逆的。然而，在更高温度下，开始不可逆膨胀，称为“胶凝化”。有待加工的颗粒状淀粉可以是高度精制的淀粉质量，优选地至少90％、至少95％、至少97％或至少99.5％纯，或它可以为含更粗糙的淀粉的材料，这些材料包括(例如，经过碾磨的)全谷物，全谷物包含非淀粉部分，如胚芽残留物和纤维。该原材料(如全谷物)可以例如经过碾磨减少粒度，以便展开结构并且允许进一步加工。根据本发明，以下两种方法是优选的：湿式和干式碾磨。在干式碾磨中，整个谷粒被碾磨并且使用。湿式碾磨使胚芽与粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)良好分离，并且时常应用于在生产中使用淀粉水解物例如糖浆的场所。干式和湿式碾磨两者是本领域中众所周知的淀粉加工法并且可以用于本发明的方法中。在一个实施例中，该粒度被减少至0.05-3.0mm、优选0.1-0.5mm之间，或使得至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％的含淀粉的材料适合通过一个具有0.05-3.0mm筛网、优选0.1-0.5mm筛网的筛子。
该含淀粉材料可以用于生产糖、糊精或发酵产品。通常，用α-淀粉酶将含糖材料液化为糊精，然后进行糖化(将糊精转化为糖的过程)和发酵(将糖转化为发酵产品的过程)。
在一个实施例中，在液化之前，用本发明的天冬酰胺酶处理该含淀粉材料。可以在适于酶活性的任何pH和温度下进行此处理，持续一段时间以允许发生酶反应。在一个实施例中，温度在20℃-90℃的范围内，例如20℃-65℃或40℃-60℃；pH在4.5-6.5的范围内；并且该段时间在5分钟-2小时的范围内，例如5分钟-1小时。
在一个实施例中，在液化之前，将一种天冬酰胺酶添加至该含淀粉材料。
在一个实施例中，在液化过程中添加本发明的天冬酰胺酶。
在α-淀粉酶，优选细菌α-淀粉酶和/或酸性真菌α-淀粉酶的存在下进行液化。在一个实施例中，在液化过程中还存在植酸酶。
在典型的液化过程中，α-淀粉酶将长链淀粉降解为支链以及线性的较短单元(麦芽糊精)。液化可以作为一个三步热浆液方法进行。将浆液加热至60℃-95℃之间(例如，77℃-86℃、80℃-85℃或83℃-85℃)并且添加一种或多种α-淀粉酶以开始液化(稀释)。液化过程在85℃下进行1-2小时。pH通常在5.5与6.2之间。为了确保这些条件下最佳的酶稳定性，任选地添加1mM钙(以便提供约40ppm游离钙离子)。如此处理之后，液化淀粉具有的一个“葡萄糖当量”(DE)将为10-15。
随后，可以将该浆液在95℃-140℃之间(例如，105℃-125℃)喷射蒸煮1-15分钟，例如约3-10分钟，尤其是5分钟左右。然后，将该浆液冷却至60℃-95℃，并且添加更多的一种或多种α-淀粉酶，以获得最终水解(二次液化)。在pH 4.5-6.5下，典型地在5与6之间的pH下进行喷射蒸煮。可以例如在喷射蒸煮之前，将α-淀粉酶以单一剂量添加。
可以使用本领域熟知的条件，用葡糖淀粉酶或β-淀粉酶以及任选地脱支酶(例如异淀粉酶或支链淀粉酶)进行糖化。例如，全部糖化步骤可以持续从约24至约72小时，然而，还常见地在30℃-65℃之间的温度(典型地约60℃)下进行典型地40-90分钟的预糖化，随后在一个同时糖化和发酵过程(SSF)中，在发酵过程中进行完全糖化。典型地在20℃-75℃的范围内的温度(例如，25℃-65℃和40℃-70℃，典型地60℃左右)下，并且在约4与5之间的pH下，一般在约pH 4.5下进行糖化。
糖化步骤和发酵步骤可以依序或同时进行。在一个实施例中，同时进行糖化和发酵(SSF)，其中不存在针对糖化的保持阶段，意指一起添加发酵生物(例如酵母)以及一种或多种酶。当发酵生物是酵母(例如酿酒酵母菌株)并且发酵产品是乙醇时，SSF典型地在20℃-40℃的温度，例如26℃-34℃，优选32℃左右下进行。
其他发酵产品可以在本领域的普通技术人员熟知的、适于讨论中的发酵生物的条件和温度下发酵。可以在发酵过程中上下调整温度。
可以通过本领域熟知的方法回收糊精。
可以通过本领域熟知的方法回收糖。
可以通过本领域熟知的方法(例如，通过蒸馏)回收发酵产品。
在一个具体实施例中，在将含淀粉材料转化为糊精和/或用本发明的天冬酰胺酶处理该含淀粉材料之前，本发明的方法进一步包括以下步骤：
(x)减少该含淀粉材料的粒度；并且
(y)形成一种包含该含淀粉材料和水的浆液。
用于减少该含淀粉材料的粒度的方法为本领域的普通技术人员所已知。在一个实施例中，将该含淀粉材料碾磨，以减少粒度。
该水性浆液可以包含含淀粉材料的从10-55wt.％干固体(DS)，优选25-45wt.％干固体(DS)，更优选30-40wt.％干固体(DS)。
用于从含未凝胶化的含淀粉材料生产发酵产品的方法
本发明还涉及一种在含淀粉材料未凝胶化(通常称为“没有蒸煮”)的情况下用于从含淀粉材料生产发酵产品的方法。在一个实施例中，该方法包括在低于初始凝胶化温度下，优选在α-淀粉酶和/或一种或多种产碳水化合物源的酶(一种或多种糖化酶)的存在下将(例如，碾磨的)含淀粉材料糖化，以产生可以由发酵生物发酵为发酵产品的糖。
因此，本发明的此方面涉及一种生产发酵产品的方法，包括用α-淀粉酶将一种含淀粉材料转化为糊精；用葡糖淀粉酶将该糊精糖化为糖；并且在本发明的天冬酰胺酶的存在下，使用发酵生物在低于该含淀粉材料的初始凝胶化温度的温度下单步地发酵该糖。
术语“初始凝胶化温度”指淀粉的凝胶化发生的最低温度。通常，在水中加热的淀粉在约50℃与75℃之间开始凝胶化；凝胶化的准确温度依赖于具体的淀粉，并能够由本领域的技术人员容易地确定。因此，初始凝胶化温度可根据植物种类、植物种类的具体品种、以及生长条件而变化。一种给定的含淀粉材料的初始凝胶化温度是使用古林斯坦(Gorinstein)和李(Lii)，1992，淀粉44(12):461-466所描述的方法，使5％的淀粉颗粒丧失双折射的温度。
本发明的方法可以进一步包括回收该发酵产品，例如通过蒸馏。
该含淀粉材料可以是一种浆液，例如颗粒状淀粉，可以制备具有该含淀粉材料的10-55wt.％干固体(DS)、优选25-45wt.％干固体、更优选30-40wt.％干固体。该浆液可以包括水和/或工艺用水，如釜馏物(逆流)、洗涤器水、蒸发器冷凝物或馏出物、由蒸馏得到的侧流汽提器水，或来自其他发酵产物工厂的工艺用水。由于该方法是在低于初始凝胶化温度下进行的并且因此没有发生显著的粘度增加，所以如果希望的话，可以使用高水平的釜馏物。在一个实施例中，水性浆液含有约1至约70vol.％、优选地15-60vol.％、尤其是从约30至50vol.％的水和/或工艺用水，如釜馏物(逆流)、洗涤器水、蒸发器冷凝物或馏出物、由蒸馏得到的侧流汽提器水，或来自其他发酵产物工厂的工艺用水，或其组合等。
该含淀粉材料可以优选地通过干式或湿式碾磨来将粒度减少至0.05-3.0mm、优选0.1-0.5mm而制备。经受本发明的方法或工艺之后，该含淀粉材料中的至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的干固体被转化成一种可溶的淀粉水解物。
在低于初始凝胶化温度下执行本发明的此方面的方法，例如25℃-40℃之间的范围内的温度，如25℃-40℃、29℃-35℃、30℃-34℃，如32℃左右。本领域的普通技术人员可以容易地确定适合的工艺条件。
本发明的方法可以在从约3与7之间，例如3.5至6或pH 4至5的pH下进行。
在一个实施例中，进行发酵，这样使得糖水平(例如，葡萄糖水平)保持在较低水平，例如低于6wt.％、低于约3wt.％、低于约2wt.％、低于约1wt.％.、低于约0.5wt.％、低于0.25％wt.％或低于约0.1wt.％。通过简单地采用调整量的酶和发酵生物就可以实现这样的低水平的糖。本领域的普通技术人员可容易地确定有待使用的酶和发酵生物的剂量/数量。还可以选择酶和发酵生物的所采用的量以在发酵液中维持低麦芽糖浓度。例如，麦芽糖水平可保持在低于约0.5wt.％，例如低于约0.2wt.％。
含淀粉材料
可以在本发明的方法中使用任何适合的含淀粉起始材料。通常基于所希望的发酵产品来选择起始材料。适于在本发明的方法中使用的含淀粉起始材料的实例包括大麦、豆类、树薯(cassava)、谷物、玉米、买罗高梁(milo)、豌豆、马铃薯、水稻、黑麦、西米、高粱、甘薯、木薯(tapioca)、小麦以及全谷物或其任何混合物。该含淀粉材料还可以是一种蜡质或非蜡质类型的玉米和大麦。
从植物提取物生产发酵产品和糖的方法
本发明还涉及一种从包含一种或多种氨基酸以及一种或多种可溶性糖(例如，果糖、半乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和/或其低聚物)的植物提取物(例如，甘蔗)生产糖和/或发酵产品(如乙醇)的方法，该方法包括向该植物提取物施用本发明的天冬酰胺酶。
具体而言，本发明涉及一种生产发酵产品的方法，包括
(a)用本发明的天冬酰胺酶处理一种含一种或多种氨基酸以及一种或多种可溶性糖的植物提取物；
(b)从该植物提取物生产糖蜜；
(c)稀释该糖蜜；并且
(d)用发酵生物发酵该稀释的糖蜜，以生产乙醇。
本发明还涉及一种生产发酵产品的方法，包括
(a)用本发明的天冬酰胺酶处理一种含一种或多种氨基酸以及一种或多种可溶性糖的植物提取物；并且
(b)用发酵生物发酵该处理的植物提取物，以生产该发酵产品。
本发明还涉及一种生产糖的方法，包括
(a)用本发明的天冬酰胺酶处理一种含一种或多种氨基酸以及一种或多种可溶性糖的植物提取物；并且
(b)从该处理的植物提取物中回收该糖。
本发明还涉及一种生产蔗糖的方法，包括：
(a)用本发明的天冬酰胺酶处理一种含一种或多种氨基酸以及一种或多种可溶性糖的植物提取物；
(b)澄清该植物提取物；
(c)浓缩发现于该澄清的植物提取物中的糖(例如，通过蒸发)，以形成含蔗糖的浆液；
(d)从该浆液中结晶蔗糖；并且
(e)回收蔗糖。
该糖可以是任何糖，包括但不限于，果糖、半乳糖、葡萄糖、麦芽糖或蔗糖。
甘蔗是甘蔗属(禾本科，蜀黍族)的高多年生禾草的6至37个种的任一个。传统地，甘蔗加工需要两个阶段。从刚收获的甘蔗碾磨提取原糖，并且有时使糖脱色，以制备用于地方消费的“磨白”糖。精制机然后生产为99％蔗糖的精制白糖。
碾磨机洗涤、剁碎并使用旋转刀切碎甘蔗。切碎的甘蔗反复地与水混合并在称作破碎机的滚转机或扩散器之间压碎，以产生甘蔗原汁。甘蔗原汁包含10％-15％蔗糖，并且将称作蔗渣的剩余纤维状固体焚烧为燃料。接下来，将蔗汁与石灰混合，以调节其pH至7。此混合使蔗糖分解为葡萄糖和果糖，并且沉淀一些杂质。然后静置该混合物，允许石灰以及其他悬浮固体沉降，从而形成澄清汁。用于澄清蔗汁的其他方法(例如亚硫酸化和碳酸化)在本领域是已知的。将澄清汁在多效蒸发器中浓缩，以制备包含约60wt.％蔗糖的浆液。将此浆液进一步在真空下浓缩，直到它变得过饱和，并且然后用结晶糖接种。冷却后，更多的糖从浆液中结晶。离心机将蔗糖与糖蜜分开。另外的结晶提取了更多的蔗糖；最终残余物称作黑糖蜜(blackstrap)。
澄清后，通过多步蒸发法从蔗汁中除去水。来自此方法对于蔗糖提取而言不可行的残留物称作糖蜜并且通常用作燃料乙醇生产的底物。
在本发明的方法中，用本发明的天冬酰胺酶处理该植物提取物，并且从该处理的植物提取物生产糖蜜。糖蜜是通过以下而生产的：澄清该植物提取物；浓缩发现于该澄清的植物提取物中的糖(例如，通过蒸发)以形成浆液；并且从浆液中结晶蔗糖以形成糖蜜。然后，将糖蜜用例如水或植物提取物汁(例如，蔗汁)稀释，并且将该稀释的糖蜜发酵，以产生产发酵产品。
可以在蒸发之前的任何步骤中用本发明的天冬酰胺酶处理该植物提取物。例如，可以在汁提取、破碎、汁回收和/或汁澄清的过程中，用本发明的天冬酰胺酶处理该植物提取物。因此，可以在碾磨工艺过程中和/或在澄清步骤中添加该天冬酰胺酶。
本发明的方法可以进一步包括回收该发酵产品。
本发明的方法可以进一步包括回收该糖。可以通过本领域已知的方任何法回收糖。例如，通过以下方法回收蔗糖，该方法包括
(x)澄清该植物提取物；
(y)浓缩发现于该澄清的植物提取物中的糖(例如，通过蒸发)，以形成浆液；并且
(z)从该浆液中结晶蔗糖。
如上所解释，典型地，碾磨机在7左右的pH下进行糖和/或乙醇的原汁澄清，以最小化美拉德(Maillard)产物形成。本发明的方法的另一个益处是可以在更碱性的pH(如7.5-9，例如8-9的pH)下澄清原汁用于糖和/或乙醇生产。通过使用本发明的天冬酰胺酶避免美拉德产物形成，可以使用较高的pH，这就品质(糖亮度和/或汁更轻)、产率(降低精炼工艺中失去的糖量)和生产力(降低澄清保持时间)而言，改进了澄清性能。
该植物提取物可以是甜高粱、甜菜、甘蔗或其任何混合物。具体而言，该植物提取物可以是甘蔗原汁或澄清的蔗汁。
发酵产品
术语“发酵产品”意指通过包括使用发酵生物的发酵过程生产的产品。发酵产品包括醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、琥珀酸、葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)；抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；以及激素。在一个优选实施例中，该发酵产品是乙醇，例如燃料乙醇；饮用乙醇，即，可饮用的酒精；或工业乙醇，或可消费醇工业(例如，啤酒和葡萄酒)、奶制品工业(例如，发酵的奶制品)、皮革工业及烟草工业所使用的产品。优选的啤酒类型包括爱尔啤酒(ale)、烈性黑啤酒(stout)、波特啤酒(porter)、拉格啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、麦芽酒(malt liquor)、低麦芽啤酒(happoushu)、高醇啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒、或清淡啤酒。
发酵生物
术语“发酵生物”是指适于生产所希望的发酵产品的任何生物，包括细菌和真菌生物，例如酵母和丝状真菌。根据本发明，适合的发酵生物能够将可发酵糖(如阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露糖或木糖)直接或间接地发酵(即，转化)为所希望的发酵产品。
发酵生物的实例包括真菌生物，例如酵母。优选酵母包括酵母属的菌株，特别是酿酒酵母或葡萄汁酵母；毕赤酵母属的菌株，特别是树干毕赤酵母，例如树干毕赤酵母CBS 5773或巴斯德毕赤酵母；假丝酵母属的菌株，特别是阿拉伯糖发酵假丝酵母(Candidaarabinofermentans)、博伊丁假丝酵母、迪丹斯假丝酵母(Candidadiddensii)、休哈塔假丝酵母、萨纳瑞西斯假丝酵母(Candidasonorensis)、假热带假丝酵母(Candida tropicalis)或产朊假丝酵母。其他发酵生物包括汉逊酵母属的菌株，特别是异常汉森酵母或多形汉逊酵母；克鲁维酵母属的菌株，特别是脆壁克鲁维酵母或马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)；以及裂殖酵母属的菌株，特别是粟酒裂殖酵母。
优选的细菌发酵生物包括埃希氏菌属的菌株，特别是大肠杆菌；发酵单胞菌属的菌株，特别是运动发酵单胞菌；发酵杆菌属的菌株，特别是棕榈科发酵杆菌(Zymobactor palmae)；克雷伯菌属的菌株，特别是产酸克雷伯菌；明串珠菌属的菌株，特别是肠膜状明串珠菌；梭菌属的菌株，特别是丁酸梭菌；肠杆菌属的菌株，特别是产气肠杆菌；以及高温厌氧杆菌属的菌株，特别是高温厌氧杆菌BG1L1(应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotech.)77:61-86)、产乙醇高温厌氧杆菌(Thermoanarobacter ethanolicus)、产甲烷高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacter mathranii)或热解糖高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum)。乳杆菌属的菌株也被预期，如谷氨酸棒状杆菌R、嗜热葡糖苷酶芽孢杆菌(Bacillusthermoglucosidaisus)和嗜热葡糖苷酶土芽孢杆菌(Geobacillusthermoglucosidasius)的菌株。
在一个实施例中，该发酵生物是一种C6糖发酵生物，如例如酿酒酵母的菌株。
在一个实施例中，将该发酵生物添加至发酵培养基中，这样使得每mL的发酵培养基的活发酵生物(如酵母)计数在从105至1012个的范围内，优选从107至1010个，尤其是约5 x 107个。
酵母是一种用于乙醇发酵的优选发酵生物。优选的是酵母属的菌株，尤其是酿酒酵母种的菌株，优选是对高水平的乙醇(即，直到例如约10、12、15或20vol.％或更多的乙醇)耐受的菌株。
可商购的酵母包括LNF SA-1、LNF BG-1、LNF PE-2和LNF CAT-1(可获得自巴西的LNF)，RED STARTM和ETHANOL REDTM酵母(可获得自富酶泰斯/乐斯富(Fermentis/Lesaffre)，美国)，FALI(可获得自弗莱施曼酵母(Fleischmann’s Yeast)，美国)，SUPERSTART和THERMOSACCTM新鲜酵母(可获得自乙醇技术(Ethanol Technology)，威斯康星州(WI)，美国)，BIOFERM AFT和XR(可获得自NABC-北美生物产品集团(NABC-North American Bioproducts Corporation)，佐治亚州(GA)，美国)，GERT STRAND(可获得自格特·斯特兰德AB公司(Gert Strand AB)，瑞典)以及FERMIOL(可获得自帝斯曼食品配料部(DSM Specialties))。
根据本发明，能够从可发酵糖生产所希望的发酵产品的发酵生物优选在精确条件条件下以具体生长速率生长。当将该发酵生物引入进/添加至发酵培养基中时，接种的发酵生物经过多个阶段。不出现原始生长。此时期称为“停滞期”并且可以被认为是适应时期。在称为“对数期”的接下来的阶段过程中，生长速率逐渐增加。在最大生长期间后，速率停止并且发酵生物进入“静止期”。在另外的时间段后，发酵生物进入“死亡期”，其中活细胞的数目下降。
发酵
基于例如植物材料的种类、可获得的可发酵糖、一种或多种发酵生物和/或所希望的发酵产品确定发酵条件。本领域的普通技术人员可以容易地确定适合的发酵条件。根据本发明，发酵可以在常规使用的条件下进行。优选的发酵过程是厌氧过程。
例如，发酵可以在高达75℃，例如40℃-70℃之间，如50℃-60℃之间的温度下进行。然而，还已知的是细菌具有低至室温左右(20℃左右)的显著较低的最适温度。适合的发酵生物的实例可以发现于上面的“发酵生物”部分中。
对于使用酵母生产乙醇，发酵可以持续24至96小时，特别是持续35至60小时。在一个实施例中，在20℃至40℃，优选26℃至34℃之间，特别是32℃左右的温度下进行发酵。在一个实施例中，pH是从pH 3至6，优选pH 4至5左右。
其他发酵产品可以在本领域的普通技术人员已知的、适于讨论的发酵生物的温度下发酵。
典型地在3与7之间的范围内的pH，优选从pH 3.5至6，如pH 5左右下进行发酵。发酵典型地持续6-96小时。
本发明的方法可以作为分批过程或作为连续过程进行。可以在超滤系统中执行发酵，其中将渗余物在固体、水和发酵生物的存在下保持在再循环之下，并且其中渗透物是包含所希望的发酵产品的液体。同样想到的是在具有超滤膜的连续膜反应器中执行的方法/工艺，并且其中将渗余物在固体、水和一种或多种发酵生物的存在下保持在再循环之下，并且其中渗透物是包含发酵产品的液体。
发酵后，可以将发酵生物与发酵的浆液分开并再循环。
发酵培养基
短语“发酵培养基(fermentation media)”或“发酵培养基(fermentation medium)”是指进行发酵的环境并且包括发酵底物，即被一种或多种发酵生物代谢的碳水化合物来源。
发酵培养基可以包括针对一种或多种发酵生物的其他营养素和一种或多种生长刺激剂。营养素和生长刺激剂被广泛地用于发酵领域中并且包括氮源，例如氨；维生素以及矿物质或其组合。
回收
继发酵之后，可以将发酵产品与发酵培养基分开。可以将发酵培养基蒸馏以提取所希望的发酵产品或可以通过微滤或膜过滤技术从发酵培养基中提取所希望的发酵产品。可替代地，可以通过汽提回收发酵产品。回收方法在本领域中是熟知的。
酶
下面描述的一种或多种酶有待以“有效量”用于本发明的方法中。
天冬酰胺酶
天冬酰胺酶可以是一种EC 3.5.1.1酶(天冬酰胺酶或L-天冬酰胺酰氨基水解酶)。
在一个优选方面中，该天冬酰胺酶是一种天冬酰胺酶变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置140或241的一个或多个位置处包括取代，或在对应于SEQ ID NO:2的位置27的位置处包括缺失，其中该变体与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少50％序列一致性，并且其中该变体具有天冬酰胺酶活性。
在另一个优选方面中，该天冬酰胺酶是一种天冬酰胺酶变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置122、140、197、238、239、240、241、253、258、259、297或373的一个或多个位置处包括取代，或在对应于SEQ ID NO:2的位置27、28或29的一个或多个位置处包括缺失，其中该变体与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少80％序列一致性，并且其中该变体具有天冬酰胺酶活性。
在另一个优选方面中，该天冬酰胺酶是一种天冬酰胺酶变体，该变体包括(i)以下取代中的一个或多个，其中每个位置都对应于SEQID NO:2中的位置：位置71处的氨基酸被Cys取代、位置74处的氨基酸被Cys取代、位置122处的氨基酸被Ala取代、位置139处的氨基酸被Gly取代、位置140处的氨基酸被Asp取代、位置194处的氨基酸被Leu取代、位置197处的氨基酸被Glu取代、位置238处的氨基酸被Cys取代、位置239处的氨基酸被Cys取代、位置240处的氨基酸被Arg取代、位置241处的氨基酸被Glu取代、位置253处的氨基酸被Arg取代、位置258处的氨基酸被Tyr取代、位置259处的氨基酸被Cys或Val取代、位置334处的氨基酸被Trp取代、位置338处的氨基酸被Trp取代、位置356处的氨基酸被Asp取代、位置363处的氨基酸被Arg取代或位置373处的氨基酸被His取代，或(ii)缺失，该缺失位于对应于SEQ ID NO:2的位置27的位置处；其中该变体与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少50％序列一致性，并且其中该变体具有天冬酰胺酶活性。
优选地，该变体包括(i)以下取代中的一个或多个，其中每个位置都对应于SEQ ID NO:2中的位置：T71C、T74C、K122A、V139G、T140D、K194L、D197E、S238C、N239C、K240R、P241E、K253R、I258Y、R259C、R259V、S334W、S338W、G356D、K363R或E373H，或(ii)缺失，该缺失位于对应于SEQ ID NO:2的位置27的位置处；其中该变体与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少50％序列一致性，并且其中该变体具有天冬酰胺酶活性。
在另一个优选方面中，该天冬酰胺酶是一种天冬酰胺酶变体，该变体包括(i)以下取代中的一个或多个，其中每个位置都对应于SEQID NO:2中的位置：T71C、T74A、T74C、K122A、K122R、V139G、T140D、K194L、D197E、I228M、S238C、N239C、K240R、P241E、K253R、I258V、I258Y、R259C、R259V、S297V、S299A、T314A、P333L、S334P、S334W、E337S、S338G、S338W、G356D、K363R或E373H，或(ii)缺失，该缺失位于对应于SEQ ID NO:2的位置27、28或29的一个或多个位置处；其中该变体与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少80％序列一致性，并且其中该变体具有天冬酰胺酶活性。
在另一个优选方面中，该天冬酰胺酶是一种天冬酰胺酶变体，该变体具有至少76℃，优选至少77℃、至少78℃、至少79℃或至少80℃，例如至少82℃、至少83℃、至少84℃或至少85℃的解链温度Tm，其中该Tm是通过差示扫描量热法确定，并且该变体与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少50％序列一致性。
α-淀粉酶
根据本发明，可以使用任何α-淀粉酶，例如真菌、细菌或植物源的。在一个优选实施例中，该α-淀粉酶是一种酸性α-淀粉酶，例如酸性真菌α-淀粉酶或酸性细菌α-淀粉酶。术语“酸性α-淀粉酶”意指以有效量添加，在3至7、优选从3.5至6或更优选从4-5的范围内的pH下具有最适活性的一种α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)。
细菌α-淀粉酶
用于在本发明中使用的α-淀粉酶可以是一种细菌α-淀粉酶，例如来源于芽孢杆菌属。在一个优选实施例中，该芽孢杆菌属α-淀粉酶来源于解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的菌株，但是也可以来源于其他芽孢杆菌属物种。
α-淀粉酶的具体实例包括WO 99/19467中的SEQ ID NO:5的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶、WO 99/19467中的SEQ ID NO:4的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶和WO 99/19467中的SEQ ID NO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(所有序列都通过引用而特此结合)。在一个实施例中，该α-淀粉酶可以是一种与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3、4或5所示的任何序列分别具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性程度的酶。
芽孢杆菌α-淀粉酶还可以是一种变体和/或杂合体，尤其是在任何以下各项中所述的一种变体和/或杂合体：WO 96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60059、以及WO 02/10355(所有文献都通过引用而特此结合)。具体的α-淀粉酶变体披露于美国专利号6,093,562、6,187,576和6,297,038中(通过引用而特此结合)并且包括具有以下改变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSGα-淀粉酶)变体：在位置R179至G182处的一个或两个氨基酸的缺失，优选披露于WO 96/23873中的一种双缺失-参见例如第20页，第1-10行(通过引用而特此结合)，优选与披露于WO 99/19467的SEQ ID NO:3阐述的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的氨基酸序列相比对应于δ(181-182)的双缺失，或使用WO 99/19467(该参考文献通过引用而特此结合)中的SEQ ID NO:3进行编号的氨基酸R179和G180的缺失。甚至更优选的是芽孢杆菌α-淀粉酶，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，它与披露于WO 99/19467中的SEQ ID NO:3阐述的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比具有与对应于δ(181-182)的一种双缺失并且进一步包括N193F取代(也被表示为I181*+G182*+N193F)。
细菌杂合α-淀粉酶
该α-淀粉酶可以是一种杂合α-淀粉酶，例如一种包括地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(示于WO 99/19467的SEQ ID NO:4中)的445个C-末端氨基酸残基和来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶(示于WO 99/19467的SEQ ID NO:5中)的37个N-末端氨基酸残基的α-淀粉酶，该α-淀粉酶具有以下取代中的一个或多个(尤其是全部)：
G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌编号)。还优选的是具有以下突变(或在其他芽孢杆菌α-淀粉酶中的对应突变)中的一个或多个的变体：H154Y、A181T、N190F、A209V以及Q264S和/或在位置176与179之间的两个残基的缺失，优选E178和G179的缺失(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:5进行位置编号)。
在一个实施例中，以0.0005-5KNU/g DS(干固体)，优选0.001-1KNU/g DS，如0.050KNU/g DS左右的量给予该细菌α-淀粉酶。
真菌α-淀粉酶
真菌α-淀粉酶包括来源于曲霉属的菌株的α-淀粉酶，例如白曲霉、黑曲霉和米曲霉α-淀粉酶。
一种优选的酸性真菌α-淀粉酶是与在WO 96/23874中示为SEQ IDNO:10的氨基酸序列的成熟部分展现出高度一致性，即至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％一致性的α-淀粉酶。
另一种优选的酸性α-淀粉酶来源于黑曲霉的菌株。在一个优选实施例中，该酸性真菌α-淀粉酶是在Swiss-prot/TeEMBL数据库中在主入藏号P56271下披露为“AMYA_ASPNG”并且描述于WO 89/01969(实例3-通过引用而结合)中的黑曲霉α-淀粉酶。一种来源于黑曲霉的酸性真菌α-淀粉酶是SP288(可获得自诺维信公司(Novozymes A/S)，丹麦)。
其他野生型α-淀粉酶包括来源于亚灰树花菌属(Meripilus)和根毛霉属的菌株，优选大型亚灰树花菌或微小根毛霉的菌株的那些(WO2004/055178，将其通过引用结合在此)。
在一个优选实施例中，该α-淀粉酶来源于白曲霉(金子(Kaneko)等人，1996，发酵与生物工程杂志(J.Ferment.Bioeng.)81:292-298：“编码来自白曲霉的酸稳定的α-淀粉酶的一种基因的核苷酸序列的分子克隆和测定(Molecular-cloning and determination of thenucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stable alpha-amylase fromAspergillus kawachii)”；并且进一步被披露为EMBL：#AB008370)。
该真菌α-淀粉酶还可以是一种包含一个淀粉结合结构域(SBM)和一个α-淀粉酶催化结构域的野生型酶或其变体。
真菌杂合α-淀粉酶
在一个优选的实施例中，该真菌酸性α-淀粉酶是一种杂合α-淀粉酶。真菌杂合α-淀粉酶的实例包括披露于WO 2005/003311、美国专利申请公开号2005/0054071(诺维信公司)和WO 2006/069290(诺维信公司)(通过引用而特此结合)中的α-淀粉酶。杂合α-淀粉酶可以包括一个α-淀粉酶催化结构域(CD)和一个碳水化合物结合结构域/模块(CBM)(例如一个淀粉结合结构域(SBD))以及任选地一个接头。
杂合α-淀粉酶的实例包括披露于WO 2006/069290中的实例的表1至5中的那些，包括具有催化结构域JA118和罗耳阿太菌(Atheliarolfsii)SBD的变体(WO 2006/069290中的SEQ ID NO:100)、具有罗耳阿太菌AMG接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(WO 2006/069290中的SEQ ID NO:101)、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(将其在美国申请号11/316,535的表5中披露为氨基酸序列SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:96的组合)或作为WO 2006/069290的表5中的V039、以及具有罗耳阿太菌葡糖淀粉酶接头和SBD的大型亚灰树花菌α-淀粉酶(WO 2006/069290中的SEQID NO:102)。其他杂合α-淀粉酶列于美国申请号11/316,535和WO2006/069290(将其通过引用而特此结合)的实例4的表3、4、5以及6中。
杂合α-淀粉酶的其他实例包括披露于美国专利申请公开号2005/0054071中的那些，包括披露于第15页上表3中的那些，例如具有白曲霉接头和淀粉结合结构域的黑曲霉α-淀粉酶。
其他α-淀粉酶与任何上述α-淀粉酶展现出高度的序列一致性，即与上面披露的成熟酶序列展现出至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％一致性。
根据本发明，能以0.001至10AFAU/g DS、优选从0.01至5AFAU/gDS、尤其是0.3至2AFAU/g DS或0.001至1FAU-F/g DS、优选0.01至1FAU-F/g DS的量添加酸性α-淀粉酶。
商用α-淀粉酶产品
包括α-淀粉酶的优选的商用组合物包括MYCOLASETM(DSM)、BANTM、TERMAMYLTMSC、FUNGAMYLTM、LIQUOZYMETMX、LIQUOZYMETMSC和SANTMSUPER、SANTMEXTRA L(诺维信公司)以及CLARASETML-40,000、DEX-LOTM、SPEZYMETMFRED、SPEZYMETMAA、SPEZYMETMALPHA、SPEZYMETMDELTA AA、GC358、GC980、SPEZYMETMCL和SPEZYMETMRSL(丹尼斯克公司(Danisco A/S))，以及来自黑曲霉的称作SP288的酸性真菌α-淀粉酶(可获得自诺维信公司，丹麦)。
产碳水化合物源的酶(糖化酶)
术语“产碳水化合物源的酶”包括葡糖淀粉酶(葡萄糖生成器)、β-淀粉酶和麦芽糖淀粉酶(两种麦芽糖生成器)并且还包括α-葡糖苷酶、异淀粉酶和支链淀粉酶。产碳水化合物源的酶能够产生可以被讨论中的一种或多种发酵生物用作能源的碳水化合物，例如，当在用于生产发酵产品(例如乙醇)的本发明的方法中使用时。产生的碳水化合物可以被直接或间接地转化为所希望的发酵产品，优选乙醇。根据本发明，可以使用产碳水化合物源的酶的混合物。共混物包括以下混合物，这些混合物包括至少一种葡糖淀粉酶以及一种α-淀粉酶，尤其是一种酸性淀粉酶，甚至更优选的是一种酸性真菌α-淀粉酶。
在本发明的一个优选实施例中，葡糖淀粉酶活性(AGU)与酸性真菌α-淀粉酶活性(FAU-F)之间的比例(即，AGU/FAU-F)可以在0.1与100AGU/FAU-F之间，特别是2与50AGU/FAU-F之间，例如在从10-40AGU/FAU-F的范围内，尤其是当进行一步发酵时(粗淀粉水解-RSH)，即当同时进行糖化和发酵时(即，不进行液化步骤)。
在一种常规的淀粉到乙醇的方法(即，包括液化步骤)中，可以如EP 140410中定义该比例，尤其是当同时进行糖化和发酵时。
葡糖淀粉酶
葡糖淀粉酶可以来源于任何适合的来源，例如来源于微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌源的，选自下组,该组由以下各项组成:曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(博埃尔(Boel)等人，1984，欧洲分子生物学学会杂志3(5):1097-1102)，或其变体，例如披露于WO 92/00381、WO 00/04136和WO 01/04273中的那些(来自诺维信，丹麦)；披露于WO 84/02921中的泡盛曲霉葡糖淀粉酶，米曲霉葡糖淀粉酶(哈塔(Hata)等人，1991，农业、生物学与化学(Agric.Biol.Chem.)55(4):941-949)，或其变体或片段。其他曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A和G139A(陈(Chen)等人，1996，蛋白质工程(Prot.Eng.)9:499-505)；D257E和D293E/Q(陈等人，1995，蛋白质工程8:575-582)；N182(陈等人，1994，生物化学杂志(Biochem.J.)301:275-281)；二硫键，A246C(费艾洛伯(Fierobe)等人，1996，生物化学35:8698-8704；以及在位置A435和S436中引入Pro残基(李(Li)等人，1997，蛋白质工程(Protein Eng.)10:1199-1204)。
其他葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(以前命名为罗尔伏革菌)葡糖淀粉酶(参见美国专利号4,727,026和长坂(Nagasaka)等人，1998，应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)50:323-330)，踝节菌属葡糖淀粉酶，特别是来源于Talaromyces duponti、埃默森踝节菌(WO 99/28448)、Talaromyces leycettanus(美国专利登记号32,153)以及嗜热踝节菌(美国专利号4,587,215)。
其他葡糖淀粉酶包括来自以下各项的葡糖淀粉酶：梭菌属(特别是嗜热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP 135138)和嗜热解硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO 86/01831))，瓣环栓菌(Trametes cingulata)，纸质厚孢孔菌(Pachykytospora papyracea)以及大白桩菇(Leucopaxillus giganteus)，全部披露于WO 2006/069289中；或披露于PCT/US 2007/066618中的红边隔孢伏革菌(Peniophorarufomarginata)；或其混合物。可以在本发明中使用杂合葡糖淀粉酶。杂合葡糖淀粉酶的实例披露于WO 2005/045018中。具体实例包括披露于实例1的表1和4中的杂合葡糖淀粉酶(这些杂合体通过引用而特此结合)。
该葡糖淀粉酶可以与任何上述葡糖淀粉酶具有高度序列一致性，即与上述成熟酶序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％一致性。
可商购的葡糖淀粉酶组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SANTMSUPER，SANTMEXTRA L，SPIRIZYMETMPLUS，SPIRIZYMETMFUEL，SPIRIZYMETM B4U，SPIRIZYME ULTRATM和AMGTM E(来自诺维信公司，丹麦)；OPTIDEXTM300，GC480TM和GC147TM(来自杰能科国际公司(Genencor Int.)，美国)；AMIGASETM和AMIGASETMPLUS(来自DSM)；G-ZYMETM G900，G-ZYMETM和G990ZR(来自杰能科国际公司)。
能以0.02-20AGU/g DS、优选0.1-10AGU/g DS、尤其是1-5AGU/gDS之间、例如0.1-2AGU/g DS、例如0.5AGU/g DS或以0.0001-20AGU/g DS的量、优选0.001-10AGU/g DS、尤其是0.01-5AGU/g DS之间、例如0.1-2AGU/g DS的量添加葡糖淀粉酶。
β-淀粉酶
β-淀粉酶(E.C 3.2.1.2)是传统地给予外切作用的麦芽糖淀粉酶的名称，其催化直链淀粉、支链淀粉和相关葡萄糖聚合物中的1,4-α-糖苷键水解。麦芽糖单位以一种逐步方式依次从非还原链末端去除，直到该分子被降解，或在支链淀粉的情况下，直到到达分支点。释放的麦芽糖具有β端基异构构型，因此名称为β-淀粉酶。
β-淀粉酶已经从多种植物和微生物中分离(福格蒂(Fogarty)和凯利(Kelly)，1979，工业微生物学进展(Progress in IndustrialMicrobiology)15:112-115)。这些β-淀粉酶的特征在于具有从40℃至65℃范围内的最适温度并且具有从4.5至7范围内的最适pH。来自大麦的可商购β-淀粉酶是来自丹麦的诺维信公司的NOVOZYMTM WBA和来自美国的杰能科国际公司SPEZYMETM BBA 1500。
麦芽糖淀粉酶
淀粉酶还可以是一种麦芽糖α-淀粉酶(葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶，EC 3.2.1.133)，其催化α-构型的直链淀粉和支链淀粉水解为麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的麦芽糖淀粉酶可商购自诺维信公司。麦芽糖α-淀粉酶描述于美国专利号4,598,048、4,604,355和6,162,628中，将其通过引用而特此结合。
能以0.05-5mg总蛋白/克DS或0.05-5MANU/g DS的量添加麦芽糖淀粉酶。
植酸酶
可以在本发明的方法中使用任何植酸酶。植酸酶是通过特异性水解肌醇与磷之间的酯键来降解植酸盐和/或植酸的酶。植酸酶活性被认为是许多成分中的磷和离子可用性。在一些实施例中，植酸酶能够从肌醇六磷酸盐(例如，植酸)释放至少一种无机磷酸盐。可以根据其对植酸盐分子上的水解开始处的磷酸酯基团的特异性位置的偏好对植酸酶进行分组(例如，3-植酸酶(EC 3.1.3.8)或6-植酸酶(EC 3.1.3.26))。植酸酶的一个实例是肌醇-六磷酸(hexakiphosphate)-3-磷酸水解酶。
植酸酶可以获得自微生物，例如真菌和细菌生物。例如，植酸酶可以获得自丝状真菌，如曲霉属(例如，无花果曲霉、烟曲霉、黑曲霉及土曲霉)，枝孢属(Cladospirum)，毛霉属(例如，梨形毛霉)，毁丝霉属(例如，嗜热毁丝霉)，青霉属(例如，大麦青霉(P.hordei)(ATCC号22053))、桧状青霉(P.piceum)(ATCC号10519)或短密青霉(P.brevi-compactum)(ATCC号48944)，踝节菌属(例如，嗜热踝节菌)，嗜热丝孢菌属(WO 99/49740)以及木霉属.(例如，里氏木霉)。
在一个实施例中，该植酸盐降解酶获得自酵母(例如，Arxulaadeninivorans、异常毕赤酵母、许旺酵母)，革兰氏阴性细菌(例如，大肠杆菌、克雷伯菌属、假单胞菌属)和革兰氏阳性细菌(例如，芽孢杆菌属，例如枯草芽孢杆菌)。
该植酸酶可以获得自柠檬酸杆菌属、肠杆菌属或隔孢伏革菌属。
在一个实施例中，该植酸酶来源于布丘菌属(Buttiauxiella spp.)，例如乡间布丘菌(B.agrestis)、布里纳氏布丘氏菌(B.brennerae)、费拉格布丘氏菌(B.ferragutiase)、伽瓦尼布丘氏菌(B.gaviniae)、伊查德氏布丘氏菌(B.izardii)、诺基亚布丘氏菌(B.noackiae)以及瓦姆波德布丘氏菌(B.warmboldiae)。在一些实施例中，该植酸酶是一种披露于WO 2006/043178或美国申请号11/714,487中的植酸酶。
在一个优选实施例中，该植酸酶与美国申请号12/263,886的SEQID NO:31中阐述的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％以及至少99％序列一致性。
可商购的植酸酶是NATUPHOS(BASF)、RONOZYME P(诺维信公司)、PHZYME(丹尼斯克公司，迪沃萨(Diversa))以及FINASE(AB酶公司(AB Enzymes))。用于确定微生物植酸酶活性的方法和植酸酶单位的定义披露于恩格伦(Engelen)等人，1994，AOAC国际杂志(Journal of AOAC International)77:760-764中。该植酸酶可以是一种野生型植酸酶或其活性变体或活性片段。
支链淀粉酶
可以在本发明的方法中使用任何支链淀粉酶。在一个实施例中，该支链淀粉酶是一种GH57支链淀粉酶，例如一种获得自嗜热球菌属(Thermococcus)的菌株的支链淀粉酶，包括嗜热球菌属AM4、嗜热球菌属HJ21、Thermococcus barophilus、Thermococcus gammatolerans、热水嗜热球菌(Thermococcus hydrothermalis)、Thermococcuskodakarensis、海滨嗜热球菌(Thermococcus litoralis)以及超嗜热古细菌(Thermococcus onnurineus)；或获得自火球菌属的菌株的支链淀粉酶，如深海火球菌(Pyrococcus abyssi)和强烈火球菌。
蛋白酶
可以在糖化、发酵、同时糖化和发酵过程中添加一种蛋白酶。该蛋白酶可以是任何蛋白酶。在一个优选实施例中，该蛋白酶是一种微生物源的，优选真菌或细菌源的酸性蛋白酶。酸性真菌蛋白酶是优选的，但是也可以使用其他蛋白酶。
适合的蛋白酶包括微生物蛋白酶，如真菌的和微生物的蛋白酶。优选的蛋白酶是酸性蛋白酶，即由在低于pH 7的酸性条件下水解蛋白质的能力表征的蛋白酶。
酸性真菌蛋白酶可以来源于曲霉属、假丝酵母属、革盖菌属、内座壳属(Endothia)、Enthomophtra、耙齿菌属、毛霉属、青霉属、根霉属、小核菌属以及球拟酵母菌属。具体而言，该蛋白酶可以来源于棘孢曲霉(WO 95/02044)、泡盛曲霉(林田(Hayashida)等人，1977，农业、生物学与化学42(5),927-933)、黑曲霉(参见例如，快禅(Koaze)等人，1964，日本农业、生物学与化学(Agr.Biol.Chem.Japan)28:216)、斋藤曲霉(参见例如，吉田(Yoshida)，1954，日本农业、化学与社会学杂志(J.Agr.Chem.Soc.Japan)28:66)、或米曲霉，如pepA蛋白酶；以及来自米黑毛霉或微小毛霉的酸性蛋白酶。
该蛋白酶可以是一种中性或碱性蛋白酶，如来源于芽孢杆菌属的菌株的蛋白酶。一种具体蛋白酶来源于解淀粉芽孢杆菌并且具有作为登录号P06832可在Swissprot获得的序列。这些蛋白酶与披露于Swissprot数据库，登录号P06832中的氨基酸序列可以具有至少90％序列一致性，例如至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或特别是至少99％一致性。
该蛋白酶与WO 2003/048353中披露为SEQ ID NO:1的氨基酸序列可以具有至少90％序列一致性，例如至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或特别是至少99％一致性。
该蛋白酶可以是一种选自下组的木瓜蛋白酶样蛋白酶,该组由以下各项组成：EC 3.4.22.*内的蛋白酶(半胱氨酸蛋白酶)，例如EC 3.4.22.2(木瓜蛋白酶)、EC 3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶)、EC 3.4.22.7(萝蘼蛋白酶(asclepain))、EC 3.4.22.14(猕猴桃蛋白酶)、EC 3.4.22.15(组织蛋白酶L)、EC 3.4.22.25(甘氨酰内肽酶)以及EC 3.4.22.30(木瓜蛋白酶Q(caricain))。
在一个实施例中，该蛋白酶是一种来源于曲霉属的菌株(例如米曲霉)的蛋白酶制剂。在另一个实施例中，该蛋白酶来源于根毛霉属的菌株，优选是米黑根毛霉。在另一个实施例中，该蛋白酶是一种蛋白酶制品，优选是一种来源于曲霉属的菌株(例如米曲霉)的蛋白质分解制品和一种来源于根毛霉属的菌株(优选米黑根毛霉)的蛋白酶的混合物。
天冬氨酸蛋白酶描述于例如蛋白水解酶手册(Handbook ofProteolytic Enzymes)中，由A.J.巴雷特(Barrett)、N.D.罗林斯(Rawlings)和J.F.沃森纳(Woessner)编辑，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥，1998，第270章。天冬氨酸蛋白酶的实例包括例如披露于以下各项中的那些：贝尔卡(Berka)等人，1990，基因96:313；贝尔卡等人，1993，基因125:195-198；和戈米(Gomi)等人，1993，生物科学、生物科技与生物化学(Biosci.Biotech.Biochem.)57:1095-1100，将其通过引用而特此结合。
该蛋白酶还可以是一种金属蛋白酶，将其定义为一种选自下组的蛋白酶，该组由以下各项组成：
(a)属于EC 3.4.24的蛋白酶(金属内肽酶)；优选EC 3.4.24.39(酸性金属蛋白酶)；
(b)属于以上手册的M组的金属蛋白酶；
(c)尚未指定族的金属蛋白酶(指定：族MX)，或属于族MA、MB、MC、MD、ME、MF、MG、MH中的任一种的金属蛋白酶(如在以上手册的第989-991页所定义)；
(d)其他家族的金属蛋白酶(如以上手册的第1448-1452页所定义)；
(e)具有一个HEXXH基序的金属蛋白酶；
(f)具有一个HEFTH基序的金属蛋白酶；
(g)属于家族M3、M26、M27、M32、M34、M35、M36、M41、M43或M47中的任一种的金属蛋白酶(如以上手册的第1448-1452页所定义)；
(h)属于M28E家族的金属蛋白酶；以及
(i)属于家族M35的金属蛋白酶(如以上手册的第1492-1495页所定义)。
在其他具体实施例中，金属蛋白酶是其中肽键上的亲核攻击由被二价金属阳离子活化的水分子介导的水解酶。二价阳离子的实例是锌、钴或锰。可以通过氨基酸配体将金属离子保持在适当位置。配体的数目可以是五、四、三、二、一或零。在一个具体实施例中，数目是二或三，优选是三。
对于在本发明的方法中使用的金属蛋白酶的起源没有限制。在一个实施例中，将该金属蛋白酶分类为EC 3.4.24，优选EC 3.4.24.39。在一个实施例中，该金属蛋白酶是一种酸稳定的金属蛋白酶，例如一种真菌的酸稳定的金属蛋白酶，如来源于嗜热子嚢菌属的菌株，优选金黄色嗜热子囊菌的菌株，特别是金黄色嗜热子囊菌CGMCC号0670的金属蛋白酶(分类为EC 3.4.24.39)。在另一个实施例中，该金属蛋白酶来源于曲霉属的菌株，优选米曲霉的菌株。
在一个实施例中，该金属蛋白酶与WO 2010/008841的SEQ ID NO:1(一种金黄色嗜热子囊菌金属蛋白酶)的氨基酸-178至17、-159至177或优选氨基酸1至177(成熟多肽)具有至少80％、至少82％、至少85％、至少90％、至少95％或至少97％的序列一致性程度；并且该金属蛋白酶具有金属蛋白酶活性。在具体实施例中，该金属蛋白酶由与如上所述的SEQ ID NO:1具有一定一致性程度的氨基酸序列组成。
金黄色嗜热子囊菌金属蛋白酶是适于在本发明的方法中使用的金属蛋白酶的一个优选实例。另一种金属蛋白酶来源于米曲霉并且包括披露于WO 2003/048353中的SEQ ID NO:11的序列，或其氨基酸-23-353；-23-374；-23-397；1-353；1-374；1-397；177-353；177-374；或177-397，以及披露于WO 2003/048353中的SEQ ID NO:10。
另一种适于在本发明的方法中使用的金属蛋白酶是包括WO2010/008841的SEQ ID NO:5的米曲霉金属蛋白酶，或一种作为分离的多肽的金属蛋白酶，该多肽与SEQ ID NO:5具有至少约80％、至少82％、至少85％、至少90％、至少95％或至少97％一致性程度；并且该多肽具有金属蛋白酶活性。在具体实施例中，该金属蛋白酶由SEQ IDNO:5的氨基酸序列组成。
在一个具体实施例中，金属蛋白酶具有一种氨基酸序列，该氨基酸序列与金黄色嗜热子囊菌或米曲霉金属蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸-178至177、-159至177或+1至177相差四十个、三十五个、三十个、二十五个、二十个或相差十五个氨基酸。
在另一个实施例中，金属蛋白酶具有一种氨基酸序列，该氨基酸序列与这些金属蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸-178至177、-159至177或+1至177相差十个、或相差九个、或相差八个、或相差七个、或相差六个、或相差五个氨基酸，例如，相差四个、相差三个、相差两个、或相差一个氨基酸。
在具体实施例中，该金属蛋白酶a)包括以下各项或b)由以下各项组成
i)WO 2010/008841的SEQ ID NO:1的氨基酸-178至177、-159至177或+1至177的氨基酸序列；
ii)WO 2010/008841的SEQ ID NO:3的氨基酸-23-353、-23-374、-23-397、1-353、1-374、1-397、177-353、177-374或177-397的氨基酸序列；
iii)WO 2010/008841的SEQ ID NO:5的氨基酸序列；或
i)、ii)和iii)的具有蛋白酶活性的序列等位基因变体或片段。
WO 2010/008841的SEQ ID NO:1的氨基酸-178至177、-159至177或+1至177或WO 2010/008841的SEQ ID NO:3的氨基酸-23-353、-23-374、-23-397、1-353、1-374、1-397、177-353、177-374或177-397的片段是一种自这些氨基酸序列的氨基和/或羧基端缺失一个或多个氨基酸的多肽。在一个实施例中，片段包含至少75个氨基酸残基、或至少100个氨基酸残基、或至少125个氨基酸残基、或至少150个氨基酸残基、或至少160个氨基酸残基、或至少165个氨基酸残基、或至少170个氨基酸残基、或至少175个氨基酸残基。
在另一个实施例中，该金属蛋白酶与另一种蛋白酶组合，该蛋白酶是例如真菌蛋白酶，优选是酸性真菌蛋白酶。
可商购产品包括ESPERASETM、FLAVOURZYMETM、NOVOZYMTMFM2.0L及iZyme BA(可获得自诺维信公司，丹麦)以及来自美国的杰能科国际公司(Genencor International,Inc.)的GC106TM和SPEZYMETMFAN。
该蛋白酶能以0.0001-1mg酶蛋白/g DS，优选0.001至0.1mg酶蛋白/g DS的量存在。可替代地，该蛋白酶能以0.0001至1LAPU/g DS，优选0.001至0.1LAPU/g DS和/或0.0001至1mAU-RH/g DS，优选0.001至0.1mAU-RH/g DS的量存在。
在此描述和要求的本发明不由在此披露的具体实施例限制范围，这是因为这些实施例旨在作为本发明的若干方面的说明。任何等价的实施例都旨在处于本发明的范围之内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员而言从前述描述将变得清楚。这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为标准。
在此引用不同的参考文献，其披露内容通过引用以其全文结合。
优选实施例
1.一种天冬酰胺酶变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置140或241的一个或多个位置处包括取代，或在对应于SEQ ID NO:2的位置27的位置处包括缺失，其中该变体与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少50％序列一致性，并且其中该变体具有天冬酰胺酶活性。
2.如实施例1所述的变体，该变体与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
3.如实施例1-2中任一项所述的变体，对应于位置140的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Trp、Tyr或Val取代，优选被Asp取代。
4.如实施例1-2中任一项所述的变体，对应于位置241的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代，优选被Glu取代。
5.如实施例1-4中任一项所述的变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置27和28的位置处包括缺失。
6.如实施例1-5中任一项所述的变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置27、28和29的位置处包括缺失。
7.一种天冬酰胺酶变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置122、140、197、238、239、240、241、253、258、259、297或373的一个或多个位置处包括取代，或在对应于SEQ ID NO:2的位置27、28或29的一个或多个位置处包括缺失，其中该变体与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少80％序列一致性，并且其中该变体具有天冬酰胺酶活性。
8.如实施例7所述的变体，该变体与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少85％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
9.如实施例7-8中任一项所述的变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置122、240或241的一个或多个位置处包括取代。
10.如实施例7-9中任一项所述的变体，该变体在对应于SEQ IDNO:2的位置27的位置处包括缺失。
11.如实施例7-10中任一项所述的变体，该变体在对应于SEQID NO:2的位置27和28的位置处包括缺失。
12.如实施例7-11中任一项所述的变体，该变体在对应于SEQ IDNO:2的位置27、28和29的位置处包括缺失。
13.如实施例7-12中任一项所述的变体，对应于位置122的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代，优选被Ala或Arg取代，最优选被Ala取代。
14.如实施例7-12中任一项所述的变体，对应于位置140的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Trp、Tyr或Val取代，优选被Asp取代。
15.如实施例7-12中任一项所述的变体，对应于位置197的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代，优选被Glu取代。
16.如实施例7-12中任一项所述的变体，对应于位置238的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr或Val取代，优选被Cys取代。
17.如实施例7-12中任一项所述的变体，对应于位置239的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代，优选被Cys取代。
18.如实施例7-12中任一项所述的变体，对应于位置240的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代，优选被Arg取代。
19.如实施例7-12中任一项所述的变体，对应于位置241的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代，优选被Glu取代。
20.如实施例7-12中任一项所述的变体，对应于位置253的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代，优选被Arg取代。
21.如实施例7-12中任一项所述的变体，对应于位置258的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代，优选被Tyr或Val取代。
22.如实施例7-12中任一项所述的变体，对应于位置259的位置处的氨基酸被Ala、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代，优选被Cys或Val取代。
23.如实施例7-12中任一项所述的变体，对应于位置297的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr或Val取代，优选被Val取代。
24.如实施例7-12中任一项所述的变体，对应于位置373的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代，优选被His取代。
25.一种天冬酰胺酶变体，该变体包括(i)以下取代中的一个或多个，其中每个位置都对应于SEQ ID NO:2中的位置：T71C、T74C、K122A、V139G、T140D、K194L、D197E、S238C、N239C、K240R、P241E、K253R、I258Y、R259C、R259V、S334W、S338W、G356D、K363R或E373H，或(ii)缺失，该缺失位于对应于SEQ ID NO:2的位置27的位置处；其中该变体与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少50％序列一致性，并且其中该变体具有天冬酰胺酶活性。
26.如实施例25所述的变体，该变体包括以下取代中的一个或多个：K122A、K240R、P241E或S338W。
27.如实施例25-26中任一项所述的变体，该变体在对应于SEQID NO:2的位置27和28的位置处包括缺失。
28.如实施例25-27中任一项所述的变体，该变体在对应于SEQID NO:2的位置27、28和29的位置处包括缺失。
29.如实施例25-28中任一项所述的变体，该变体与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
30.一种天冬酰胺酶变体，该变体包括(i)以下取代中的一个或多个，其中每个位置都对应于SEQ ID NO:2中的位置：T71C、T74A、T74C、K122A、K122R、V139G、T140D、K194L、D197E、I228M、S238C、N239C、K240R、P241E、K253R、I258V、I258Y、R259C、R259V、S297V、S299A、T314A、P333L、S334P、S334W、E337S、S338G、S338W、G356D、K363R或E373H，或(ii)缺失，该缺失位于对应于SEQ ID NO:2的位置27、28或29的一个或多个位置处；其中该变体与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少80％序列一致性，并且其中该变体具有天冬酰胺酶活性。
31.如实施例30所述的变体，该变体包括以下取代中的一个或多个：K122A、K240R、P241E、S299A、S334P、E337S或S338W。
32.如实施例30-31中任一项所述的变体，该变体在对应于SEQID NO:2的位置27的位置处包括缺失。
33.如实施例30-32中任一项所述的变体，该变体在对应于SEQID NO:2的位置27和28的位置处包括缺失。
34.如实施例30-33中任一项所述的变体，该变体在对应于SEQID NO:2的位置27、28和29的位置处包括缺失。
35.如实施例30-34中任一项所述的变体，该变体与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少85％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
36.如实施例1-35中任一项所述的变体，该变体相对于亲本具有一种改进的特性，其中该特性选自下组,该组由以下各项组成：催化效率、比活性、底物结合、储存稳定性、化学稳定性、氧化稳定性、最适温度、最适pH、pH稳定性、较低的产物抑制、离子(例如，NaCl)存在下的活性、糖或糖醇(例如，木糖醇)存在下的活性、四聚体稳定性以及热稳定性。
37.如实施例1-36中任一项所述的变体，该变体相对于亲本具有一种改进的热稳定性。
38.如实施例1-37中任一项所述的变体，该变体具有至少76℃，优选至少77℃、至少78℃、至少79℃或至少80℃，例如至少82℃、至少83℃、至少84℃或至少85℃的解链温度Tm，其中该Tm是通过差示扫描量热法确定。
39.如实施例1-38中任一项所述的变体，其中该成熟多肽是SEQID NO:2的氨基酸27至378。
40.一种天冬酰胺酶变体，该变体具有至少76℃，优选至少77℃、至少78℃、至少79℃或至少80℃，例如至少82℃、至少83℃、至少84℃或至少85℃的解链温度Tm，其中该Tm是通过差示扫描量热法确定，并且该变体与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少50％序列一致性。
41.如实施例40所述的天冬酰胺酶变体，该变体与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
42.如实施例1-41中任一项所述的变体，该变体是一种选自下组的亲本天冬酰胺酶变体，该组由以下各项组成：
a.一种与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％序列一致性的多肽；
b.一种由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在低严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，或(ii)(i)的全长互补体杂交；
c.一种由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％的一致性；以及
d.SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个片段，该片段具有天冬酰胺酶活性。
43.如实施例42所述的变体，其中该亲本天冬酰胺酶与SEQ IDNO:2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。
44.如实施例42-43中任一项所述的变体，其中该亲本天冬酰胺酶由一种多核苷酸编码，该多核苷酸在低严谨度条件下、中严谨度条件下、中-高严谨度条件下、高严谨度条件下、或非常高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或(ii)(i)的全长互补体杂交。
45.如实施例42-44中任一项所述的变体，其中该亲本天冬酰胺酶由一种多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。
46.如实施例42-45中任一项所述的变体，其中该亲本天冬酰胺酶包括SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。
47.如实施例42-46中任一项所述的变体，其中该亲本天冬酰胺酶是SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个片段，其中该片段具有天冬酰胺酶活性。
48.如实施例1-41中任一项所述的变体，该变体是一种选自下组的亲本天冬酰胺酶变体，该组由以下各项组成：
a.一种与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少60％序列一致性的多肽；
b.一种由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在低严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列，或(ii)(i)的全长互补体杂交；
c.一种由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少60％的一致性；以及
d.SEQ ID NO:4的成熟多肽的一个片段，该片段具有天冬酰胺酶活性。
49.如实施例48所述的变体，其中该亲本天冬酰胺酶与SEQ IDNO:4的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。
50.如实施例48-49中任一项所述的变体，其中该亲本天冬酰胺酶由一种多核苷酸编码，该多核苷酸在低严谨度条件下、中严谨度条件下、中-高严谨度条件下、高严谨度条件下、或非常高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列或(ii)(i)的全长互补体杂交。
51.如实施例48-50中任一项所述的变体，其中该亲本天冬酰胺酶由一种多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。
52.如实施例48-51中任一项所述的变体，其中该亲本天冬酰胺酶包括SEQ ID NO:4的成熟多肽或由其组成。
53.如实施例48-52中任一项所述的变体，其中该亲本天冬酰胺酶是SEQ ID NO:4的成熟多肽的一个片段，其中该片段具有天冬酰胺酶活性。
54.如实施例42-53中任一项所述的变体，该变体与该亲本天冬酰胺酶的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
55.如实施例1-54中任一项所述的变体，其中该变体由325至375个，例如330至370、335至365或340至360个氨基酸组成。
56.如实施例1-55中任一项所述的变体，其中取代的数目是1-20个，例如1-10或1-5个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代。
57.如实施例1-56中任一项所述的变体，该变体在对应于任何位置71、74、122、139、140、194、197、228、238、239、240、241、253、258、259、297、299、314、333、334、337、338、356、363或373的两个位置处包括取代。
58.如实施例1-56中任一项所述的变体，该变体在对应于任何位置71、74、122、139、140、194、197、228、238、239、240、241、253、258、259、297、299、314、333、334、337、338、356、363或373的的三个位置处包括取代。
59.如实施例1-56中任一项所述的变体，该变体在对应于任何位置71、74、122、139、140、194、197、228、238、239、240、241、253、258、259、297、299、314、333、334、337、338、356、363或373的四个位置处包括取代。
60.如实施例1-56中任一项所述的变体，该变体在对应于任何位置71、74、122、139、140、194、197、228、238、239、240、241、253、258、259、297、299、314、333、334、337、338、356、363或373的五个位置处包括取代。
61.如实施例1-56中任一项所述的变体，该变体在对应于任何位置71、74、122、139、140、194、197、228、238、239、240、241、253、258、259、297、299、314、333、334、337、338、356、363或373的六个位置处包括取代。
62.如实施例1-56中任一项所述的变体，该变体在对应于任何位置71、74、122、139、140、194、197、228、238、239、240、241、253、258、259、297、299、314、333、334、337、338、356、363或373的七个位置处包括取代。
63.如实施例1-56中任一项所述的变体，该变体在对应于任何位置71、74、122、139、140、194、197、228、238、239、240、241、253、258、259、297、299、314、333、334、337、338、356、363或373的八个位置处包括取代。
64.如实施例1-63中任一项所述的变体，该变体在对应于SEQID NO:2的位置70、307、323、327、349、351或353的一个或多个位置处进一步包括取代。
65.如实施例64所述的变体，该变体包括以下取代中的一个或多个：N70K、S307A、A323R、T327V、A349Q、S351A或V353I。
66.如实施例1-65中任一项所述的变体，该变体在对应于位置290的位置处进一步包括取代。
67.如实施例66所述的变体，该变体包括取代K290V。
68.一种用于自食物材料生产食物产品的方法，该方法包括：
(a)向该食物材料中添加如实施例1-67中任一项所述的变体；并且
(b)加热该经酶处理的食物材料。
69.如实施例68所述的方法，其中以有效减少该食物材料中存在的天冬酰胺的水平的量将该变体添加至该食物材料中。
70.如实施例68-69中任一项所述的方法，其中该方法用于减少该食物产品中的丙烯酰胺。
71.如实施例68-70中任一项所述的方法，其中该食物产品是基于谷物的产品，如面包、糕点、蛋糕、脆饼干、面包圈、荷兰蜂蜜蛋糕、曲奇、姜饼、姜味蛋糕、早餐谷物或薄脆；基于蔬菜的产品，例如基于马铃薯的产品，如炸薯条、已切成薄片的马铃薯片、基于面团的马铃薯零食、复合马铃薯产品或炸丸子；或基于咖啡的产品。
72.如实施例68-70中任一项所述的方法，其中该食物材料是一种基于马铃薯的食物材料并且其中该食物产品是一种基于马铃薯的食物产品。
73.如实施例68-70中任一项所述的方法，其中该食物材料是一种基于咖啡的材料并且其中该食物产品是一种咖啡产品。
74.一种编码如实施例1-67中任一项所述的变体的分离的多核苷酸。
75.一种包含如实施例74所述的多核苷酸的核酸构建体。
76.一种包含如实施例74所述的多核苷酸的表达载体。
77.一种包含如实施例74所述的多核苷酸的宿主细胞。
78.一种生产天冬酰胺酶变体的方法，该方法包括：
a.在适合于表达该变体的条件下培养如实施例77所述的宿主细胞；并且
b.回收该变体。
79.一种用如实施例74所述的多核苷酸转化的转基因植物、植物部分或植物细胞。
80.一种产生如实施例1-67中任一项所述的变体的方法，该方法包括：
a.在有益于产生该变体的条件下，培养包括一种编码该变体的多核苷酸的一种转基因植物或植物细胞；并且
b.回收该变体。
81.一种用于获得天冬酰胺酶变体的方法，该方法包括在亲本天冬酰胺酶中在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置122、140、197、241、253或373的一个或多个位置处引入取代，其中该变体具有天冬酰胺酶活性；并且回收该变体。
82.一种用于获得天冬酰胺酶变体的方法，该方法包括在亲本天冬酰胺酶中在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置122、140、197、238、239、240、241、253、258、259、297或373的一个或多个位置处引入取代，该亲本天冬酰胺酶与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少80％序列一致性，其中该变体具有天冬酰胺酶活性；并且回收该变体。
83.一种用于获得天冬酰胺酶变体的方法，该方法包括在亲本天冬酰胺酶中引入以下取代中的一个或多个，其中每个位置都对应于SEQ ID NO:2中的位置：T71C、T74C、K122A、K122R、V139G、T140D、K194L、D197E、I228M、S238C、N239C、K240R、P241E、K253R、I258Y、R259C、R259V、S299A、S334W、S338W、G356D、K363R或E373H，其中该变体具有天冬酰胺酶活性；并且回收该变体。
84.一种用于获得天冬酰胺酶变体的方法，该方法包括在亲本天冬酰胺酶中引入以下取代中的一个或多个，该亲本天冬酰胺酶与SEQID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少80％序列一致性，其中每个位置都对应于SEQ ID NO:2中的位置：T71C、T74A、T74C、K122A、K122R、V139G、T140D、K194L、D197E、I228M、S238C、N239C、K240R、P241E、K253R、I258V、I258Y、R259C、R259V、S297V、S299A、T314A、P333L、S334P、S334W、E337S、S338G、S338W、G356D、K363R或E373H，其中该变体具有天冬酰胺酶活性；并且回收该变体。
85.如实施例81-84中任一项所述的方法，其中该变体天冬酰胺酶具有比该亲本天冬酰胺酶高的热稳定性。
86.如实施例81-85中任一项所述的方法，其中该变体具有比该亲本天冬酰胺酶高的解链温度Tm，其中该Tm是通过差示扫描量热法确定。
87.一种生产发酵产品的方法，该方法包括：
(a)在如实施例1-67中任一项所述的天冬酰胺酶的存在下，用α-淀粉酶将一种含淀粉材料液化为糊精；
(b)用糖化酶将该糊精糖化为糖；并且
(c)使用发酵生物发酵该糖，以生产该发酵产品。
88.一种生产发酵产品的方法，该方法包括：
(a)用如实施例1-67中任一项所述的天冬酰胺酶处理一种含淀粉材料；
(b)用α-淀粉酶将该处理的含淀粉材料液化为糊精；
(c)用糖化酶将该糊精糖化为糖；并且
(d)使用发酵生物发酵该糖，以生产该发酵产品。
89.如实施例88所述的方法，其中用该天冬酰胺酶在20℃-90℃的温度下处理该含淀粉材料。
90.如实施例89所述的方法，其中该天冬酰胺酶是一种EC3.5.1.1酶。
91.如实施例87-90中任一项所述的方法，该方法进一步包括回收该发酵产品。
92.一种生产糖的方法，该方法包括：
(a)在如实施例1-67中任一项所述的天冬酰胺酶的存在下，用α-淀粉酶将一种含淀粉材料液化为糊精；并且
(b)用糖化酶将该糊精糖化为糖。
93.如实施例92所述的方法，其中该糖是麦芽糖。
94.如实施例92所述的方法，其中该糖是葡萄糖。
95.如实施例94所述的方法，该方法进一步包括将葡萄糖转化为果糖。
96.如实施例92-95中任一项所述的方法，其中在该天冬酰胺酶的存在下，将该含淀粉材料液化为糊精。
97.如实施例92所述的方法，其中该天冬酰胺酶是一种EC3.5.1.1酶。
98.一种生产糖的方法，该方法包括：
(a)用如实施例1-67中任一项所述的天冬酰胺酶处理一种含淀粉材料；
(b)用α-淀粉酶将该处理的含淀粉材料液化为糊精；并且
(c)用糖化酶将该糊精糖化为糖。
99.如实施例98所述的方法，其中该糖是麦芽糖。
100.如实施例98所述的方法，其中该糖是葡萄糖。
101.如实施例100所述的方法，该方法进一步包括将葡萄糖转化为果糖。
102.如实施例92-101中任一项所述的方法，其中用该天冬酰胺酶在20℃-90℃的温度下处理该含淀粉材料。
103.如实施例98所述的方法，其中该天冬酰胺酶是一种EC3.5.1.1酶。
104.如实施例98-103中任一项所述的方法，该方法进一步包括回收该糖。
105.如实施例95-97和101-104中任一项所述的方法，该方法进一步包括回收该果糖。
106.一种生产糊精的方法，该方法包括
(a)在如实施例1-67中任一项所述的天冬酰胺酶的存在下，用α-淀粉酶将一种含淀粉材料液化为糊精。
107.如实施例106所述的方法，其中在该天冬酰胺酶的存在下，将该含淀粉材料液化为糊精。
108.如实施例106所述的方法，其中该天冬酰胺酶是一种EC3.5.1.1酶。
109.一种生产糊精的方法，该方法包括：
(a)用如实施例1-67中任一项所述的天冬酰胺酶处理一种含淀粉材料；并且
(b)用α-淀粉酶将该处理的含淀粉材料液化为糊精。
110.如实施例109所述的方法，其中用该天冬酰胺酶在20℃-90℃的温度下处理该含淀粉材料。
111.如实施例109所述的方法，其中该天冬酰胺酶是一种EC3.5.1.1酶。
112.如实施例106-111中任一项所述的方法，该方法进一步包括回收该糊精。
113.如实施例87-112中任一项所述的方法，其中在65℃-110℃，例如80℃-100℃或80℃-90℃的温度下将该含淀粉材料液化为糊精。
114.如实施例87-113中任一项所述的方法，其中该液化包括在95℃-140℃之间的温度下进行喷射蒸煮。
115.如实施例87-114中任一项所述的方法，该方法进一步包括在20℃-75℃之间，优选25℃-65℃之间的温度下进行典型地40-90分钟的预糖化。
116.如实施例87-115中任一项所述的方法，其中在20℃-75℃，优选25℃-65℃的范围内的温度下进行该糖化。
117.如实施例87-116中任一项所述的方法，其中该糖化酶是一种β-淀粉酶、葡糖淀粉酶或麦芽糖α-淀粉酶。
118.如实施例87-117中任一项所述的方法，其中用一种糖化酶以及一种支链淀粉酶和/或异淀粉酶将糊精糖化为糖。
119.如实施例87-118中任一项所述的方法，其中在一种蛋白酶的存在下进行糖化和/或发酵。
120.如实施例87-119中任一项所述的方法，其中同时进行糖化和发酵。
121.如实施例120所述的方法，其中在20℃-40℃的温度下进行糖化和发酵。
122.如实施例87-121中任一项所述的方法，其中该含淀粉材料选自下组，该组由以下各项组成：大麦、豆类、树薯、谷物、玉米、买罗高梁、豌豆、马铃薯、水稻、黑麦、西米、高粱、甘薯、木薯、小麦以及全谷物或其任何混合物。
123.一种生产发酵产品的方法，该方法包括用α-淀粉酶将一种含淀粉材料转化为糊精；用葡糖淀粉酶将该糊精糖化为糖；并且在如实施例1-67中任一项所述的天冬酰胺酶的存在下，使用发酵生物在低于该含淀粉材料的初始凝胶化温度的温度下单步地发酵该糖。
124.如实施例87-123中任一项所述的方法，其中该发酵产品选自下组，该组由以下各项组成：醇类(例如，丁醇、乙醇、甲醇、1,3-丙二醇)；有机酸类(例如，乙酸、柠檬酸、衣康酸、葡糖酸、葡糖酸盐、乳酸、琥珀酸、2,5-二酮-D-葡糖酸)；酮类(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)；以及更复杂的化合物，包括例如抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；以及激素。
125.如实施例124所述的方法，其中该发酵产品是乙醇。
126.如实施例87-125中任一项所述的方法，其中该发酵生物是一种酵母。
127.一种生产发酵产品的方法，该方法包括
(a)用如实施例1-67中任一项所述的天冬酰胺酶处理一种含一种或多种氨基酸以及一种或多种可溶性糖的植物提取物；
(b)从该处理的植物提取物生产糖蜜；
(c)稀释该糖蜜；并且
(d)用发酵生物发酵该稀释的糖蜜，以生产该发酵产品。
128.如实施例127所述的方法，其中用一种天冬酰胺酶处理该植物提取物。
129.如实施例127所述的方法，其中该天冬酰胺酶是一种EC3.5.1.1酶。
130.如实施例127-129中任一项所述的方法，其中该植物提取物是甘蔗原汁或澄清的蔗汁。
131.如实施例127-130中任一项所述的方法，其中糖蜜的生产包括
(x)澄清该植物提取物；
(y)浓缩发现于该澄清的植物提取物中的糖(例如，通过蒸发)，以形成浆液；并且
(z)从该浆液中结晶蔗糖，以形成糖蜜。
132.如实施例127-131中任一项所述的方法，其中步骤(a)发生在蒸发之前的任何时间。
133.如实施例132所述的方法，其中步骤(a)发生在汁提取、破碎、汁回收和/或汁澄清的过程中。
134.一种生产发酵产品的方法，该方法包括：
(a)用如实施例1-67中任一项所述的天冬酰胺酶处理一种含一种或多种氨基酸以及一种或多种可溶性糖的植物提取物；并且
(b)用发酵生物发酵该处理的植物提取物，以生产该发酵产品。
135.如实施例134所述的方法，其中用该天冬酰胺酶处理该植物提取物。
136.如实施例134所述的方法，其中该天冬酰胺酶是一种EC3.5.1.1酶。
137.如实施例127-136中任一项所述的方法，其中该植物提取物是甘蔗原汁或澄清的蔗汁。
138.如实施例127-137中任一项所述的方法，该方法进一步包括回收该发酵产品。
139.如实施例127-138中任一项所述的方法，其中该发酵产品选自下组，该组由以下各项组成：醇类(例如，丁醇、乙醇、甲醇、1,3-丙二醇)；有机酸类(例如，乙酸、柠檬酸、衣康酸、葡糖酸、葡糖酸盐、乳酸、琥珀酸、2,5-二酮-D-葡糖酸)；酮类(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)；以及更复杂的化合物，包括例如抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；以及激素。
140.如实施例139所述的方法，其中该发酵产品是乙醇。
141.如实施例127-140中任一项所述的方法，其中该发酵生物是一种酵母。
142.一种生产糖的方法，该方法包括：
(a)用如实施例1-67中任一项所述的天冬酰胺酶处理一种含一种或多种氨基酸以及一种或多种可溶性糖的植物提取物；并且
(b)从该植物提取物中回收该糖。
143.如实施例142所述的方法，其中该糖是果糖、半乳糖、葡萄糖、麦芽糖或蔗糖。
144.一种生产蔗糖的方法，该方法包括：
(a)用一种天冬酰胺酶处理一种含一种或多种氨基酸以及一种或多种可溶性糖的植物提取物；
(b)澄清该植物提取物；
(c)浓缩发现于该澄清的植物提取物中的糖(例如，通过蒸发)，以形成含蔗糖的浆液；
(d)从该浆液中结晶蔗糖；并且
(e)回收蔗糖。
145.如实施例144所述的方法，其中用该天冬酰胺酶处理该植物提取物。
146.如实施例144所述的方法，其中该天冬酰胺酶是一种EC3.5.1.1酶。
147.如实施例144-146中任一项所述的方法，其中该植物提取物是甘蔗原汁或澄清的蔗汁。
148.如实施例144-147中任一项所述的方法，其中步骤(a)发生在蒸发之前的任何时间。
149.如实施例148所述的方法，其中步骤(a)发生在汁提取、破碎、汁回收和/或汁澄清的过程中。
150.如实施例144-149中任一项所述的方法，其中用该天冬酰胺酶处理甘蔗原汁。
151.如实施例144-150中任一项所述的方法，其中用该天冬酰胺酶处理用于糖生产的澄清的蔗汁。
152.如实施例144-151中任一项所述的方法，其中用该天冬酰胺酶处理用于乙醇生产的澄清的蔗汁。
153.如实施例144-152中任一项所述的方法，其中该植物提取物选自下组，该组由以下各项组成：甜高粱、甜菜、甘蔗或其任何混合物。
154.如实施例144-153中任一项所述的方法，其中在7.5-9，例如8-9的pH下澄清该原汁用于糖和/或乙醇生产。
通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。
实例
实例1：
天冬酰胺酶活性(ASNU)测定
天冬酰胺酶的活性能以ASNU测量。将一个天冬酰胺酶单位(ASNU)定义为在37℃和pH 7.0下于具有9.2mg/ml天冬酰胺的0.1M MOPS缓冲液中在1分钟内产生1.0微摩尔的氨所需的酶量。
天冬酰胺酶将天冬酰胺水解为天冬氨酸和铵。产生的铵与α-酮戊二酸组合，以形成谷氨酸，由此NADH被氧化为NAD+。由剩余的谷氨酸脱氢酶催化该反应。通过340nm下的光度测定法测量NADH的消耗。NADH在340处具有一定吸光度，而NAD+没有吸光度。因此测量颜色的下降，并且可以与天冬酰胺酶活性相互关联。
相对于已知活性的天冬酰胺酶标准品确定活性。可以将一种具有公告活性的商用产品(像Acrylaway L)用作标准品。
葡糖淀粉酶活性(AGU)
可以按葡糖淀粉酶单位(AGU)来测量葡糖淀粉酶活性。Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在以下标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量：37℃，pH 4.3，底物：麦芽糖23.2mM，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间5分钟。
可以使用自动分析仪系统。将变旋酶添加到葡萄糖脱氢酶试剂中，由此使存在的任何α-D-葡萄糖变为β-D-葡萄糖。葡萄糖脱氢酶在以上提到的反应中与β-D-葡萄糖特异性反应，形成NADH，在340nm下使用光度计测定该NADH作为原始葡萄糖浓度的量度。
α-淀粉酶活性(KNU)
可以使用马铃薯淀粉作为底物来确定α-淀粉酶活性。此方法是基于由酶分解改性的马铃薯淀粉，并且该反应随后是将淀粉/酶的样品溶液与碘溶液混合。最初形成微黑蓝色，但淀粉分解过程中蓝色变弱并且然后逐渐变为红褐色，将其与有色玻璃标准品比较。
将一个Kilo Novo α-淀粉酶单位(KNU)定义为在标准条件下(即，在37℃+/-0.05；0.0003M Ca2+；和pH 5.6下)糊精化5260mg淀粉干物质Merck可溶性淀粉(Merck Amylum solubile)的酶量。
酸性α-淀粉酶活性(AFAU)
能以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)或FAU-F测量酸性α-淀粉酶的活性。能以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)测量酸性α-淀粉酶活性，相对于酶标准品而确定AFAU。1AFAU被定义为在下述标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶量。
酸性α-淀粉酶是一种内-α-淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖-葡糖水解酶，EC 3.2.1.1)，它水解在淀粉分子的内部区域中的α-1,4-糖苷键以形成具有不同链长度的糊精和寡糖。与碘形成的颜色的强度跟淀粉的浓度成正比。使用反向比色法将酶活性测定为在指定的分析条件下淀粉浓度的减小。
蓝色/紫色 t＝23秒 脱色
FAU-F的确定
相对于具有公告强度的酶标准品测量FAU-F真菌α-淀粉酶范围(Fungamyl)。
蛋白酶测定法-AU(RH)
可以用变性血红蛋白作为底物来确定蛋白水解活性。在用于确定蛋白水解活性的安森-血红蛋白(Anson-Hemoglobin)方法中，变性血红蛋白被消化，并且用三氯乙酸(TCA)沉淀未消化的血红蛋白。用酚试剂确定TCA可溶产物的量，酚试剂可以与酪氨酸和色氨酸一起给出蓝色。
将一个安森(Anson)单位(AU-RH)定义为在标准条件(即，25℃，pH 5.5和10分钟反应时间)下以初始速率消化血红蛋白，以使得每分钟释放的TCA可溶性产物的量与酚试剂给出与一毫当量的酪氨酸相同的颜色的酶量。
AU(RH)法描述于EAL-SM-0350中并且经要求可获得自丹麦的诺维信公司(Novozymes A/S Denmark)。
蛋白酶测定法(LAPU)
一个亮氨酸氨肽酶单位(LAPU)是在以下条件下每分钟分解1微摩尔底物的酶量：26mM的L-亮氨酸-对硝基苯胺作为底物，0.1M Tris缓冲液(pH 8.0)，37℃，10分钟反应时间。
LAPU描述于经要求可获得自丹麦的诺维信公司的EB-SM-0298.02/01中。
麦芽糖淀粉酶活性(MANU)
一个MANU(Maltogenic Amylase Novo Unit，麦芽糖淀粉酶Novo单位)是在浓度为10mg麦芽三糖(西格玛(Sigma)M 8378)底物/毫升0.1M柠檬酸盐缓沖液(pH 5.0)下，在37℃下持续30分钟，每分钟释放一微摩尔的麦芽糖所需的酶量。
实例2：酵母文库和定点变体的构建
材料与方法：
菌株与质粒
使用大肠杆菌DH12S(可获得自Gibco BRL公司)来从酵母拯救质粒。
pJN065N2是一种在TPI启动子的控制之下的酿酒酵母和大肠杆菌穿梭载体，衍生自描述于WO 2008/110513中的pJN001N2，在其中已经插入了米曲霉天冬酰胺酶蛋白工程化基因的成熟部分。pJN001N2具有来自特异腐质霉角质酶的信号序列(MKFFTTILSTASLVAALP)，随后是米曲霉天冬酰胺酶的成熟部分的序列(SEQ ID NO:2的氨基酸27-378)。pJN065N2编码与野生型米曲霉天冬酰胺酶相比具有氨基酸取代N70K A323R T327V A349Q S351A V353I的JN065变体。在WO2008/110513中，将JN065变体称为JN065N2。
将酿酒酵母YNG318：MATa Dpep4[cir+]ura3-52，leu2-D2，his 4-539用于天冬酰胺酶变体表达。这被描述于生物化学杂志272(15)，第9720-9727页，1997中。
培养基与底物
10X基础溶液：酵母氮源w/o氨基酸(DIFCO)66.8g/l，琥珀酸盐100g/l，NaOH 60g/l。
SC-葡萄糖：20％葡萄糖(即，终浓度为2％＝2g/100ml)100ml/l，5％苏氨酸4ml/l，1％色氨酸10ml/l，20％酪蛋氨基酸25ml/l，10X基础溶液100ml/l。使用孔径大小为0.20微米的过滤器将溶液灭菌。将琼脂和H2O(大约761ml)一起热压处理，并且向琼脂溶液中添加分开灭菌的SC-葡萄糖溶液。
YPD：细菌蛋白胨20g/l，酵母提取物10g/l，20％葡萄糖100ml/l。
PEG/LiAc溶液：40％PEG400050ml，5M乙酸锂1ml
DNA操纵
除非另外说明，否则使用如以下所述的分子生物学标准方法来进行DNA操纵和转化：萨拉布鲁克等人(1989)，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约；奥苏贝尔·F·M(Ausubel,F.M.)等人(编辑)“分子生物学实验指南(Current protocols in MolecularBiology)”，约翰威立父子公司，1995；哈伍德·C·R(Harwood,C.R.)&卡廷·S·M(Cutting,S.M.)(编辑)。
酵母转化
通过乙酸锂法进行酵母转化：将0.5微升的由适当的限制性内切酶消化的载体、1微升的PCR片段和10微升的载体DNA(Clontech公司)混合并添加至在冰上的100微升的YNG318感受态细胞中。向细胞中添加0.6ml PEG/LiAc溶液并温和混合。将混合物在30℃、200rpm下孵育30min并且然后加热至42℃，持续15min。
将悬浮液离心5秒，并且将沉淀的酵母细胞溶解于1ml的YPD中并倾倒在SC-葡萄糖板上。将板在30℃下孵育3天，以制备菌落。通过描述于核酸研究第20卷，第14期(1992)3790中的洛赛克和卡西尔法(Robzyk and Kassir’s method)提取酵母总DNA。
DNA测序
通过电穿孔(BIO-RAD基因脉冲发生器(BIO-RAD Gene Pulser))进行用于DNA测序的大肠杆菌转化。通过碱法(分子克隆，冷泉港)或使用质粒试剂盒制备DNA质粒。通过凯杰(Qiagen)凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。使用PTC-200DNA引擎(PTC-200DNA Engine)进行PCR。使用ABI PRISMTM 310基因分析器来测定所有的DNA序列。
通过SOE PCR法(通过重叠延伸剪接(Splicing by OverlapExtension)，参见“PCR：一种实用方法(PCR:A practical approach)”，第207-209页，牛津大学出版社(Oxford University press)，编辑麦克弗森(McPherson)、夸克(Quirke)、泰勒(Taylor))构建酵母文库和定点变体，随后将与载体消化物混合的纯化PCR片段引入进酿酒酵母中用于体内重组。
用于扩增和测序的通用引物
使用以下引物通过SOE法与简并引物(AM34+反向引物和AM35+正向引物)一起制备包含任何突变的片段的DNA片段或仅仅扩增整个天冬酰胺酶基因(AM34+AM35)。
AM34    TAGGAGTTTAGTGAACTTGC
AM35    TTCGAGCGTCCCAAAACC
通过凯杰(Qiagen)凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。将所得纯化的片段与载体消化物混合。将混合溶液引入进酿酒酵母中，以通过体内重组构建文库或定点变体。
实例3：文库筛选
如实例2中地制备酵母克隆/文库，使用JN065或JN070变体作为模板。将关于SC-葡萄糖的克隆接种进包含YPD培养基的96孔微量滴定板的孔中并在28℃下孵育3天。为了确定热处理后的剩余活性，在升高的温度下孵育20分钟后在55℃下测量培养物上清液的天冬酰胺水解活性(4℃作为对照品)。然后，选择具有增加的剩余活性的克隆并且确认序列。
天冬酰胺酶活性测定(rASNU测定)-用于实例3、8、9、10、11 以及12中
试剂：
·1M磷酸钾缓冲液(pH 6.0)
1M KH2PO4(136g/500ml)+1M K2HPO4(174g/500ml)
调节至pH 6.0
·100mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)+0.1％tritonX-100(1L)
100ml 1M磷酸钾缓冲液(pH 6.0)
1g Triton X-100
调节至1000ml
·2M羟胺(HA)溶液(100ml)
13.9g羟胺
用100mM磷酸钾缓冲液(pH 6)调节至100ml
·终止溶液(500ml)
23.83ml乙酸盐
13.88g FeCl36H2O
84ml 5N HCl
用H2O调节至500ml
·底物溶液(100ml)
10ml 1M磷酸钾缓冲液
0.5g L-天冬酰胺
5ml 2M HA溶液
用H2O调节至100ml
活性测定：
1用移液管吸取20微升样品至孔中。
2向孔中添加100微升的底物溶液。
3在55℃下孵育20min.(或如指定的另外方式)
4向孔中添加100微升的终止溶液。
5测量A490。
将结果与对照的结果针对相对作用进行比较或与已知活性的标准品以ASNU比较。将如根据此测定确定的活性称为rASNU。
热稳定性筛选：
用于针对改进的热稳定性的变体的初始筛选，将96孔样品板在相关筛选温度下孵育20min(4℃用于对照)。然后添加底物溶液并且将板在55℃下孵育20min.并如上处理。
测试的变体：
与描述于WO 2008110513中的野生型米曲霉天冬酰胺酶(参见SEQ ID NO:6)相比，克隆JN065具有氨基酸取代N70K A323R T327VA349Q S351A V353I。
A27*意指氨基酸A27被缺失。
表1 对WT的取代
变体 取代
JN070 N70K S307A A323R T327V A349Q S351A V353I
JN077 N70K V128C A323R T327V A349Q S351A V353I
JN095 N70K A323R T327V A349Q S351A V353I K363R
表2 对JN070取代
结果：
表3 70℃孵育后的残余活性
变体
JN070 86％(JN06581％)
JN077 49％(JN06538％)
JN095 76％(JN06546％)
表4 在升高的温度下孵育之后的残余活性
实例4：天冬酰胺酶变体在曲霉属中的表达
使用包括以上实例中的天冬酰胺酶变体基因的构建体构建用于曲霉属的表达载体。曲霉属表达载体由一个表达盒组成，该表达盒是基于融合至构巢曲霉磷酸丙糖异构酶的非翻译前导序列的黑曲霉中性淀粉酶II启动子(Pna2/tpi)和黑曲霉淀粉糖苷酶终止子(Tamg)。质粒上还存在使得可以在作为唯一氮源的乙酰胺上生长的来自构巢曲霉的曲霉属选择性标记amdS。如描述于拉森(Lassen)等人(2001)，应用与环境微生物学(Applied and Environmental Micorbiology)，67，4701-4707中，将天冬酰胺酶变体的表达质粒转化进曲霉属中。用于每个构建体，分离、纯化并在摇瓶中孵育10-20个菌株。
实例5：天冬酰胺酶变体的纯化
通过三个步骤进行天冬酰胺酶变体的纯化：使用疏水作用色谱(HIC)介质，HIC柱和阴离子交换色谱柱进行分批纯化。最后，使用12k-14k MWCO透析膜用10L的20mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)透析样品。
实例6：酶热稳定性测量(TSA)
将纯化的酶用0.5％SAPP(pH 5.0)稀释至0.5mg/ml并与等体积的用Milli-Q水稀释的SYPRO Orange(英杰公司(Invitrogen))混合。将三十微升的混合物溶液转移至LightCycler 480多孔板96(LightCycler480Multiwell Plate 96)(罗氏诊断公司(Roche Diagnostics))并将板密封。
TSA的设备参数：
仪器：LightCycler 480实时PCR系统(罗氏应用科学部(RocheApplied Science))
扫描速率：0.02℃/秒
扫描范围：37℃-96℃
积分时间1.0秒
激发波长465nm
发射波长580nm
将获得的荧光信号标准化进0和1的范围内。将解链温度(Tm)定义为标准化值最接近0.5时的温度。
表5 通过TSA测定的Tm
变体编号 通过TSA的Tm(℃)
野生型 64.5-64.7
JN065 70.43
JN070 72.2-72.9
JN079 72.77
JN102 73.49
JN117 73.54
JN135 77.19
JN140 75.53
JN145 77
JN148 76.91
JN152 76.69
JN158 77.8
JN159 76.76
JN161 81.83
JN162 79.15
JN165 80.05
JN166 79.71
JN167 80.87
JN168 80.32
JN178 81.91
JN179 80.04
JN180 83.72
JN181 81.91
JN182 83.03
JN183 82.17
JN184 77.53
JN226 87.93
实例7：酶热稳定性测量(DSC)
用于差示扫描量热法(DSC)的样品制备：
·将样品转移至透析盒(皮尔斯公司(Pierce)，目录号66380，10kDa MWCO)并用20mM乙酸钠(pH 5.0)透析。
·将透析缓冲液在浓度确定(通过280nm处的吸收测量值(A280))中的空白并且用作DSC的参照。
·使用透析缓冲液调节样品的体积，直到获得大约0.5-0.55的A280。利用基于氨基酸序列数据计算的消光系数(Vector NTI版本9.0.0)，这对应于大约1.5-1.7mg/ml的酶浓度。
·将样品通过真空吸引器脱气并且在装载进DSC仪器之前磁力搅拌大约10分钟。
DSC数据记录与处理：
·仪器：VP-毛细管DSC，MicroCal(GE医疗集团(GE Healthcare))
·扫描间隔：20℃-110℃
·扫描速率：200℃/h
·数据处理软件：OriginLab MicroCal LLC Cap DSC
将热变性温度(Td)确定为对应于温度自记曲线中的信号的尖端的温度。
表6 通过DSC测定的Td
样品 Td
JN065 75.5
JN102 77.9
JN117 77.7
JN140 81.2
JN145 80.3
JN152 80.9
JN158 83.2
JN162 83.1
JN180 88.2
JN183 88.6
实例8：0.5％SAPP中的酶热稳定性
将纯化的酶用0.5％焦磷酸二氢钠(SAPP)(pH 5.0)稀释至6rASNU/ml左右的浓度。将五十微升的稀释酶溶液转移至96孔PCR板上并且通过使用热循环仪在70℃-80℃下孵育4小时。孵育后，立即将10微升的孵育溶液添加至在96孔板中的rASNU测定的100微升预孵育底物溶液中并且在37℃或50℃下孵育20min。通过添加100微升的终止溶液使反应终止并且测量490nm处的吸光度。使用在25℃下进行孵育的类似样品的活性作为对照确定残余活性。
表7 4小时后的残余活性
实例9：温度活性
将纯化的酶用20mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)稀释至2rASNU/ml左右的浓度。将十微升的酶溶液添加至在96孔PCR板中的在不同温度下预孵育的100微升底物溶液中并孵育20min。通过添加100微升的终止溶液使反应终止并且测量490nm处的吸光度。
表8 50℃下的温度活性(以活性百分比计)
实例10：70℃下的pH稳定性
将纯化的酶用0.5％SAPP(pH 4.0-7.0)(使用HCl或NaOH调节pH)稀释至6rASNU/ml左右的浓度。将五十微升的稀释酶溶液转移至96孔PCR板上并在70℃下孵育2小时。孵育后，立即将10微升的孵育溶液添加至在96孔板中的rASNU测定的100微升预孵育底物溶液中并且在50℃下孵育20min。通过添加100微升的终止溶液使反应终止并且测量490nm处的吸光度。使用在25℃下进行孵育的类似样品的活性作为对照确定残余活性。
表9 pH稳定性
实例11：pH活性
将纯化的酶用20mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)稀释至2rASNU/ml左右的浓度。将十微升的酶溶液添加至具有不同pH的100微升预孵育底物溶液中，该底物溶液是通过将2倍的rASNU测定的底物溶液与等体积的200mM布里顿-罗宾逊(Britton-Robinson)缓冲液(pH 2.5-11.5)混合而构建。在50℃下孵育20min后，通过添加100微升的终止溶液使反应终止并且测量490nm处的吸光度。
表10 pH活性
实例12：黑曲霉天冬酰胺酶变体
将黑曲霉天冬酰胺酶基因及其变体基因引入进酿酒酵母中作为米曲霉天冬酰胺酶基因，并且如描述于实例3中地比较残余活性。
表11 在升高的温度下孵育之后的残余活性
实例13：天冬酰胺酶活性测定-用于实例14中
原理
天冬酰胺酶将天冬酰胺水解为天冬氨酸和铵。使用奈斯勒试剂(Nessler’s reagent)确定产生的铵。
相对于具有已知活性的标准品(以ASNU计)或相对于相关对照样品确定活性。将如根据此测定确定的活性称为nASNU。
酶孵育
程序：
缓冲液 750μL
天冬酰胺(25mg/mL) 100μL
样品 100μL
1.5M TCA(终止剂) 50μL
总体积 1,000μL
混合缓冲液和天冬酰胺并且使其在37℃下平衡10-15min。添加酶标准品或样品并且在37℃下孵育10min。添加TCA，以终止反应。
铵确定(奈斯勒测定)
温度 环境
pH ～12，通过添加奈斯勒试剂加以控制
奈斯勒试剂 氯化汞(II)，碘化钾，氢氧化钾
孵育时间 10min
A436 440nm处的端点测量值
程序：
微量滴定板
Milli-Q水 140μL
样品 20μL
奈斯勒试剂 40μL
总体积 200μL
将Milli-Q水、样品和奈斯勒试剂添加至微量滴定板中。摇动10秒并且然后在再次摇动之前将其孵育10min,并且在440nm处读数。
实例14：测试NaCl和木糖醇对酶活性的影响
为了测试NaCl或木糖醇对天冬酰胺酶活性的影响，将化合物直接添加至缓冲液中并且使用描述于实例13中的标准测定来测量天冬酰胺酶活性。测试两个浓度的NaCl并且测试一个浓度的木糖醇。
使用的缓冲液是：
缓冲液：20mM柠檬酸缓冲液(pH 6)，0.001％triton X100：
木糖醇：70.8g缓冲液+29.2g木糖醇
NaCl-1：91.8g缓冲液+8.2g氯化钠
NaCl-2：84g缓冲液+16g氯化钠
将存在NaCl或木糖醇的情况下的测量的活性与不具有NaCl和木糖醇的缓冲液中的活性(设定为100％)进行比较。下面示出了结果。
如由结果所见，变体的活性比wt酶的活性受NaCl和木糖醇的影响更小。
实例15：Km和kcat确定
将纯化的酶用20mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)稀释至比活性为2rASNU/ml左右的溶液。将十毫升的酶溶液添加至包含不同浓度(0.22-26.6mM)的L-天冬酰胺的100微升预孵育底物溶液中，该底物溶液是通过将L-天冬酰胺一水合物溶解于包含0.02％TritonX-100的100mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0)中而构建。在50℃下孵育10min后，通过使用氨测试试剂盒(Ammonia Test Kit)(和光纯药株式会社(WakoPure Chemicals,Japan)，日本)遵照包装说明书方案来测量反应混合物中产生的氨量。从米氏方程(Michaelis-Menten equation)确定Km和Vmax，并且使用Vmax计算kcat。
Km[mM] kcat[秒-1]
野生型 0.95 121.1
JN161 0.69 171.5
JN167 0.67 126.8
JN178 0.88 127.1
JN180 0.83 185.1
JN181 0.58 138.3
JN182 0.91 186.5
JN183 0.91 188.6
在此描述并且要求的本发明不限于在此披露的具体方面的范围，因为这些方面意图作为本发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员而言从前述描述将变得清楚。这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。

Claims (15)

1.一种天冬酰胺酶变体，该变体包括(i)以下取代中的一个或多个，其中每个位置都对应于SEQ ID NO:2中的位置：T71C、T74A、T74C、K122A、K122R、V139G、T140D、K194L、D197E、I228M、S238C、N239C、K240R、P241E、K253R、I258V、I258Y、R259C、R259V、S297V、S299A、T314A、P333L、S334P、S334W、E337S、S338G、S338W、G356D、K363R或E373H，或(ii)缺失，该缺失位于对应于SEQ ID NO:2的位置27、28或29的一个或多个位置处；其中该变体与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少80％序列一致性，并且其中该变体具有天冬酰胺酶活性。
2.如权利要求1所述的变体，该变体与SEQ ID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少85％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
3.如权利要求1-2中任一项所述的变体，该变体相对于由SEQ IDNO:2编码的天冬酰胺酶具有一种改进的热稳定性。
4.如权利要求1-3中任一项所述的变体，该变体相对于由SEQ IDNO:6编码的天冬酰胺酶具有一种改进的热稳定性。
5.如权利要求1-4中任一项所述的变体，该变体是一种选自下组的亲本天冬酰胺酶变体，该组由以下各项组成：
a.一种与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％序列一致性的多肽；
b.一种由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在低严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，或(ii)(i)的全长互补体杂交；
c.一种由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％的一致性；以及
d.SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个片段，该片段具有天冬酰胺酶活性。
6.如权利要求1-5中任一项所述的变体，该变体在对应于SEQ IDNO:2的位置70、290、307、323、327、349、351或353的一个或多个位置处进一步包括取代。
7.如权利要求6所述的变体，该变体包括以下取代中的一个或多个：N70K、K290V、S307A、A323R、T327V、A349Q、S351A或V353I。
8.如权利要求1-7中任一项所述的变体，其中该成熟多肽是氨基酸27至378。
9.一种用于从食物材料生产食物产品的方法，该方法包括：
a.向该食物材料中添加如权利要求1-8中任一项所述的变体；并且
b.加热该经酶处理的食物材料。
10.一种编码如权利要求1-8中任一项所述的变体的分离的多核苷酸。
11.一种包括如权利要求10所述的多核苷酸的核酸构建体。
12.一种包括如权利要求10所述的多核苷酸的表达载体。
13.一种包括如权利要求10所述的多核苷酸的宿主细胞。
14.一种生产天冬酰胺酶变体的方法，该方法包括：
a.在适合于表达该变体的条件下培养如权利要求13所述的宿主细胞；并且
b.回收该变体。
15.一种用于获得天冬酰胺酶变体的方法，该方法包括在亲本天冬酰胺酶中引入以下取代中的一个或多个，该亲本天冬酰胺酶与SEQID NO:2或4的任一个的成熟多肽具有至少80％序列一致性，其中每个位置都对应于SEQ ID NO:2中的位置：T71C、T74A、T74C、K122A、K122R、V139G、T140D、K194L、D197E、I228M、S238C、N239C、K240R、P241E、K253R、I258V、I258Y、R259C、R259V、S297V、S299A、T314A、P333L、S334P、S334W、E337S、S338G、S338W、G356D、K363R或E373H，其中该变体具有天冬酰胺酶活性；并且回收该变体。
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