ES2621921T3 - Enzimas para tratamiento de almidón - Google Patents

Abstract

Polipéptido híbrido que comprende una primera secuencia de aminoácidos que comprende un módulo catalítico con actividad de alfa-amilasa y una segunda secuencia de aminoácidos que comprende un módulo de unión a carbohidratos, donde dicha primera secuencia de aminoácidos tiene al menos 75% de identidad con la SEQ ID nº: 24 y donde dicha segunda secuencia de aminoácidos tiene al menos un 75% de identidad con cualquier secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente en la SEQ ID nº: 52, SEQ ID nº: 76, SEQ ID nº: 78, SEQ ID nº: 80, SEQ ID nº: 82, SEQ ID nº: 84, SEQ ID nº: 86, SEQ ID nº: 90, SEQ ID nº: 92, SEQ ID nº: 94, SEQ ID nº: 96, SEQ ID nº: 98, SEQ ID nº: 109, SEQ ID nº: 137, SEQ ID nº: 139, SEQ ID nº: 141 y SEQ ID nº: 143.

Description

DESCRIPCIÓN

Enzimas para tratamiento de almidón

Referencia cruzada a listado de secuencias y microorganismos depositados 5

[0001] La presente aplicación contiene información en forma de un listado de secuencias, que está anexo a la solicitud y también presentada en un soporte de datos que acompaña a esta solicitud. Además, la presente solicitud se refiere a microorganismos depositados.

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Campo de la invención

[0002] La presente invención se refiere a polipéptidos que comprenden un módulo de unión a carbohidratos ("CBM") y un dominio catalítico de alfa-amilasa. Además, la invención se refiere a polipéptidos de alfa-amilasas de tipo salvaje que comprenden dominios catalíticos de alfa-amilasa útiles y/o CBMs al igual que a las 15 secuencias de dominio catalítico y/o secuencias CBM. La invención también se refiere al uso de tales polipéptidos en un proceso de licuefacción de almidón donde el almidón se degrada en fragmentos de oligo y/o polisacáridos menores.

Antecedentes de la invención 20

[0003] Un gran número de enzimas y procesos se han descrito para convertir el almidón en hidrolizados de almidón, tal como maltosa, glucosa o jarabes de especialidad, bien para uso como edulcorantes o como precursores para otros sacáridos tales como fructosa. La glucosa también se puede fermentar a etanol u otros productos de fermentación, tal como ácido cítrico, glutamato monosódico, ácido glucónico, gluconato de sodio, 25 gluconato de calcio, gluconato de potasio, glucono beta lactona, o eritorbato de sodio, ácido itacónico, ácido láctico, ácido glucónico; cetonas; aminoácidos, ácido glutámico (monoglutaminato de sodio), penicilina, tetraciclina; enzimas; vitaminas, tales como riboflavina, B12, beta-caroteno u hormonas.

[0004] Almidón es un polímero de peso molecular alto consistente en cadenas de unidades de glucosa. 30 Normalmente consiste en aproximadamente el 80% de amilopectina y 20% de amilosa. La amilopectina es un polisacárido ramificado donde las cadenas lineales de residuos de D-glucosa en alfa-1,4 se unen por enlaces glucosídicos alfa-1,6.

[0005] La amilosa es un polisacárido lineal constituido de unidades de D-glucopiranosa enlazadas entre sí por 35 enlaces glucosídicos alfa-1,4. En el caso de convertir el almidón en un hidrolizado de almidón soluble, el almidón es despolimerizado. El proceso de despolimerización convencional consiste en un paso de gelatinización y dos pasos del proceso consecutivo, es decir un proceso de licuefacción y un proceso de sacarificación.

[0006] El almidón granulado consiste en gránulos microscópicos, que son insolubles en agua a temperatura 40 ambiente. Cuando un lodo de almidón acuoso se calienta, los gránulos se hinchan y finalmente estallan, dispersando las moléculas de almidón en la solución. Durante este proceso de "gelatinización" hay un aumento espectacular en la viscosidad. Como el nivel de sólidos es 30-40% en un proceso industrial típico, el almidón tiene que ser diluido o "licuado" de modo que pueda ser manipulado. Esta reducción en la viscosidad es hoy obtenida en su mayoría por degradación enzimática. Durante el paso de licuefacción, el almidón de cadena larga 45 se degrada en unidades ramificadas menores y lineales (maltodextrinas) por una alfa-amilasa. El proceso de licuefacción es típicamente realizado a alrededor de 105-110°C durante aproximadamente 5 a 10 minutos seguidos de aproximadamente 1-2 horas a alrededor de 95°C. La temperatura es luego bajada a 60°C, una glucoamilasa (también conocida como GA o AMG) o una beta-amilasa y opcionalmente una enzima desramificante, tal como una isoamilasa o una pululanasa son agregadas, y el proceso de sacarificación procede 50 durante aproximadamente 24 a 72 horas.

[0007] Será aparente de la discusión anterior que el proceso de conversión de almidón convencional consume mucha energía debido a los requisitos diferentes en cuanto a temperatura durante los varios pasos. Es así deseable poder seleccionar y/o diseñar las enzimas usadas en el proceso de modo que el proceso total se puede 55 realizar sin tener que gelatinizar el almidón. Tales procesos de "almidón crudo" son las patentes de EEUU Nos. 4,591,560, 4,727,026, y 4,009,074, patente EP nº 0171218 y solicitud de patente danesa PA 2003 00949. La presente invención divulga polipéptidos diseñados para, entre otras cosas, tales procesos y que incluyen una secuencia de aminoácidos de un CBM y una secuencia de aminoácidos de una enzima degradante de almidón. Las enzimas híbridas son el objeto de la WO 9814601, WO0077165 y WO2005/003311. La WO98/16633 divulga 60 una alfa-amilasa híbrida que comprende un núcleo catalítico de una alfa-amilasa de Bacillus licheniformis y un módulo de unión de carbohidrato de una endoglucanasa V de Humicola insolens. La enzima híbrida demostró tener propiedades mejoradas. La WO03/056002 describe cómo mejorar la termoestabilidad de alfa-amilasas por modificación química.

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Resumen de la invención

[0008] El presente inventor ha descubierto sorprendentemente que añadiendo un módulo de unión a carbohidratos (CBM) a ciertas alfa-amilasas la actividad y especificidad se pueden alterar aumentando así la eficacia de varios procesos degradantes de almidón, por ejemplo, que comprenden degradación de almidón 5 crudo, por ejemplo, almidón no gelatinizado y/o almidón gelatinizado. También cambiando un CBM por otro la actividad y especificidad pueden ser alteradas.

[0009] Tales híbridos consistentes en un polipéptido con actividad de alfa-amilasa y un módulo de unión de carbohidrato, principalmente teniendo afinidad para almidón, tienen la ventaja sobre alfa-amilasas existentes que 10 por selección de un dominio catalítico con propiedades deseadas por ejemplo, el perfil de pH, el perfil de temperatura, la resistencia a la oxidación, la estabilidad de calcio, la afinidad de sustrato o el perfil de producto se puede combinar con un módulo de unión de carbohidrato con afinidades de enlace más fuertes o más débiles, por ejemplo, afinidades específicas para amilosa, afinidades específicas para amilopectina o afinidades para estructura específica en el carbohidrato. Así la invención se refiere a híbridos con propiedades alteradas 15 relativamente a la alfa-amilasa sin el CBM y/o con respecto a amilasas del estado de la técnica, tal como teniendo estabilidad aumentada y/o actividad a bajo pH, por ejemplo, a pH por debajo de 4, tal como a 3.5, actividad aumentada hacia almidón granulado, y/o degradación aumentada de almidón granulado a bajo pH incluso en ausencia de glucoamilasa o a niveles de glucoamilasa baja, y/o con perfil de producto alterado.

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[0010] Debido a la actividad de hidrólisis superior de este polipéptido el proceso de conversión de almidón total se puede realizar sin tener que gelatinizar el almidón, es decir, los polipéptidos hidrolizan almidón granulado en un proceso de almidón crudo al igual que almidón completamente o parcialmente gelatinizado en un proceso de almidón tradicional. Por consiguiente la invención proporciona en un primer aspecto un polipéptido híbrido que comprende una primera secuencia de aminoácidos que comprende un módulo catalítico con actividad de alfa-25 amilasa y una segunda secuencia de aminoácidos que comprende un módulo de unión a carbohidratos, donde dicha primera secuencia de aminoácidos tiene al menos 75% de identidad con la SEC ID nº: 24 y donde dicha segunda secuencia de aminoácidos tiene al menos 75% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID nº: 52, SEQ ID nº: 76, SEQ ID nº: 78, SEQ ID nº: 80, SEQ ID nº: 82, SEQ ID nº: 84, SEQ ID nº: 86, SEQ ID nº: 88, SEQ ID nº: 90, SEQ ID nº: 92, SEQ ID nº: 94, SEQ ID nº: 96, 30 SEQ ID nº: 98, SEQ ID nº: 109, SEQ ID nº: 137, SEQ ID nº: 139, SEQ ID nº: 141 y SEQ ID nº: 143.

[0011] En otros aspectos la invención proporciona usos del polipéptido del primer aspecto para sacarificación, en un proceso que comprende fermentación, en un proceso de conversión de almidón, en un proceso para producir etanol. 35

[0012] En otro aspecto la invención proporciona una composición que comprende el polipéptido aislado del primer aspecto.

[0013] En otro aspecto la invención proporciona un proceso para sacarificar almidón, donde un almidón se trata 40 con el polipéptido del primer aspecto.

[0014] En otro aspecto la invención proporciona un proceso que comprende; a) contactar un almidón con un polipéptido que comprende un módulo catalítico con actividad de alfa-amilasa y un módulo de unión de carbohidrato, es decir, el polipéptido del primer, segundo y tercer aspecto; b) incubar dicho almidón con dicho 45 polipéptido; c) fermentar para producir un producto de fermentación, d) opcionalmente recuperar el producto de fermentación, donde una enzima con actividad de glucoamilasa está bien ausente o presente en una cantidad inferior a 0,5 AGU/g DS, de forma más preferible no más de o incluso menos de 0,4 AGU/g DS, incluso de forma más preferible no más de o incluso menos de 0,3 AGU/g DS, y de la forma más preferible no más de o incluso menos de 0,1 AGU, tal como no más de o incluso menos de 0,05 AGU/g DS de sustrato de almidón y donde los 50 pasos a, b, c, y/o d se pueden realizar separadamente o simultáneamente.

[0015] En otro aspecto la invención proporciona un proceso de producción de etanol a partir de material que contiene almidón por fermentación, dicho proceso comprende: (i) licuar dicho material que contiene almidón con un polipéptido que comprende un módulo catalítico de la invención y un módulo de unión de carbohidrato de la 55 invención, es decir, el polipéptido del primer y segundo aspecto; (ii) sacarificar la trituración licuada obtenida; (iii) fermentar el material obtenido en el paso (ii) en presencia de un organismo fermentador y opcionalmente comprendiendo la recuperación del etanol.

[0016] En otros aspectos la invención proporciona un ADN representado por una secuencia que codifica un 60 polipéptido según el primer aspecto y un constructo de ADN que comprende dicha secuencia de ADN.

Descripción detallada de la invención

[0017] El término "almidón granular" se entiende como almidón crudo sin cocer, es decir, almidón que no ha sido 65 sometido a una gelatinización. El almidón se forma en plantas como pequeños gránulos insolubles en agua.

Estos gránulos se conservan en almidones a temperaturas inferiores a la temperatura de gelatinización inicial. Cuando se ponen en agua fría, los granos pueden absorber una pequeña cantidad del líquido. Hasta 50°C a 70°C la inflamación es reversible, el grado de reversibilidad dependiendo del almidón particular. Con temperaturas más altas una inflamación irreversible llamada gelatinización empieza.

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[0018] El término "temperatura de gelatinización inicial" se entiende como la temperatura mínima en la que comienza la gelatinización del almidón. El almidón calentado en agua empieza a gelatinizar entre 50°C y 75ºC; la temperatura exacta de gelatinización depende del almidón específico y puede ser determinada rápidamente por el experto en la materia. Así, la temperatura de gelatinización inicial puede variar dependiendo de la especie de la planta, de la variedad particular de las especies de la planta al igual que con las condiciones de crecimiento. 10 En el contexto de esta invención la temperatura de gelatinización inicial de un almidón dado es la temperatura en la que la birrefringencia se pierde en el 5% de los gránulos de almidón que utilizan el método descrito por Gorinstein. S. y Lii. C., Starch/Starke, Vol. 44 (12) págs. 461-466 (1992).

[0019] El término "hidrolizado de almidón soluble" se entiende como los productos solubles de los procesos de la 15 invención y pueden comprender mono-, di-, y oligosacáridos, tales como glucosa, maltosa, maltodextrinas, ciclodextrinas y cualquier mezcla de estas. Preferiblemente al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97% o al menos 98% de los sólidos secos del almidón granulado se convierten en un hidrolizado de almidón soluble.

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[0020] El término "homología" de polipéptidos se entiende como el grado de identidad entre dos secuencias que indican una derivación de la primera secuencia de la segunda. La homología puede ser determinada adecuadamente mediante programas informáticos conocidos en la técnica tales como GAP proporcionado en el paquete de programa GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., 25 (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453. Los siguientes ajustes para comparación de secuencias de aminoácidos son usados: penalización por creación de espacio de 3.0 y penalización por extensión de espacio de 0.1. La parte pertinente de la secuencia de aminoácidos para la determinación de la homología es el polipéptido maduro, es decir, sin el péptido señal.

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[0021] Las condiciones experimentales adecuadas para determinar la hibridación a astringencia baja, media o alta entre una sonda de nucleótidos y una secuencia de ADN o ARN homóloga implica prerremojar el filtro con los fragmentos de ADN o ARN por hibridar en 5 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio, Sambrook et al. 1989) durante 10 min, y prehibridación del filtro en una solución de 5 x SSC, 5 x solución de Denhardt (Sambrook et al. 1989), 0.5% SDS y 100 microgramos/ml de ADN de esperma del salmón desnaturalizado y sometido a un baño 35 de ultrasonidos desnaturalizado (Sambrook et al. 1989), seguido de hibridación en la misma solución con una concentración de 10ng/ml de un cebado de forma aleatoria (Feinberg, A. P. y Vogelstein, B. (1983) anal. Biochem. 132:6-13), sonda marcado en 32P-dCTP (actividad específica > 1 x 109 CPM/microgramo) durante 12 horas en alrededor de 45°C. El filtro es luego lavado dos veces durante 30 minutos en 2 x SSC, 0.5% SDS a alrededor de 55°C (astringencia baja), de forma más preferible a alrededor de 60°C (astringencia media), todavía 40 de forma más preferible a alrededor de 65°C (astringencia media/alta), incluso de forma más preferible a alrededor de 70°C (astringencia alta), e incluso de forma más preferible a alrededor de 75°C ( astringencia muy alta).

[0022] Las moléculas a las que se hibrida la sonda de oligonucleótidos bajo estas condiciones son detectadas 45 utilizando una película radiográfica.

Polipéptidos

[0023] El polipéptido de la divulgación puede ser una enzima híbrida o el polipéptido puede ser una enzima de 50 tipo salvaje que ya comprende un módulo catalítico con actividad de alfa-amilasa y un módulo de unión a carbohidratos. El polipéptido de la divulgación también puede ser una variante de tal enzima de tipo salvaje. El híbrido se puede producir por fusión de una primera secuencia de ADN que codifica unas primeras secuencias de aminoácidos y una segunda secuencia de ADN que codifica una segunda secuencia de aminoácidos, o el híbrido se puede producir como un gen completamente sintético basado en el conocimiento de las secuencias de 55 aminoácidos de CBMs adecuados, enlazadores y dominios catalíticos.

[0024] Los términos "enzima híbrida" o "polipéptido híbrido" se utilizan en este caso para caracterizar aquellos de los polipéptidos de la invención que comprenden una primera secuencia de aminoácidos que comprenden al menos un módulo catalítico con actividad de alfa-amilasa y una segunda secuencia de aminoácidos que 60 comprende al menos un módulo de unión a carbohidratos donde el primero y el segundo son derivados de distintas fuentes. El término "fuente" siendo entendido como, por ejemplo, pero no limitado a una enzima progenitora, por ejemplo, una amilasa o glucoamilasa, u otra actividad catalítica que comprende un módulo catalítico adecuado y/o un CBM adecuado y/o un enlazador adecuado.

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[0025] Los números de clasificación enzimática (números EC) están de acuerdo con las recomendaciones (1992)

del comité de nomenclatura de la unión internacional de bioquímica y biología Molecular, Academic Press Inc, 1992.

[0026] Los polipéptidos como se denominan en este caso incluyen especies que incluyen una secuencia de aminoácidos de una enzima de alfa-amilasa (EC 3.2.1.1) enlazada (es decir, unida de manera covalente) a una 5 secuencia de aminoácidos que comprende un módulo de unión a carbohidratos (CBM).

[0027] Enzimas híbridas conteniendo CBM, al igual que descripciones detalladas de la preparación y purificación de las mismas, se conocen en la técnica [ver, por ejemplo, WO 90/00609, WO 94/24158 y WO 95/16782, al igual que Greenwood et al. Biotechnology and Bioengineering 44 (1994) pp. 1295-1305]. Estas pueden, por ejemplo, 10 ser preparadas transfomando en una célula huésped un constructo de ADN que comprende al menos un fragmento de ADN que codifica el módulo de unión a carbohidratos ligado, con o sin un enlazador, a una secuencia de ADN que codifica el polipéptido de interés, y haciendo crecer la célula huésped transformada para expresar el gen fusionado. El CBM en un polipéptido de la invención se puede situar C-terminalmente, N-terminalmente o internamente en el polipéptido. En una forma de realización un polipéptido puede comprender 15 más de un CBM, por ejemplo, dos CBM; uno situado C-terminalmente, el otro N-terminalmente o los dos CBM en serie posicionados C-terminalmente, N-terminalmente o internamente. No obstante, los polipéptidos con más de dos CBM son igualmente contemplados.

Alfa-amilasas de la divulgación 20

[0028] La divulgación se refiere a polipéptidos de alfa-amilasa útiles como donantes (amilasas progenitoras) de CBM, enlazadores y/o módulos catalíticos. El polipéptido de la divulgación puede ser una enzima alfa-amilasa de tipo salvaje (EC 3.2.1.1) o el polipéptido también puede ser una variante de tal enzima de tipo salvaje. Además el polipéptido de la divulgación puede ser un fragmento de tal enzima, por ejemplo, tal como un dominio catalítico, 25 es decir, un fragmento con actividad de alfa-amilasa pero que está separado de un CBM si este está presente en la enzima tipo salvaje, o tal como un CBM, es decir, un fragmento con un módulo de unión al carbohidrato. También puede ser una enzima híbrida que comprende un fragmento de tal enzima de alfa-amilasa, por ejemplo, que comprende un dominio catalítico, un enlazador y/o un CBM derivado de una enzima de alfa-amilasa de la divulgación. 30

[0029] Además, el polipéptido de la divulgación puede ser un fragmento de tal enzima, por ejemplo, un fragmento que todavía comprende un dominio catalítico funcional al igual que un CBM si este está presente en la enzima de tipo salvaje, o, por ejemplo, un fragmento de una enzima tipo salvaje, esta enzima de tipo salvaje no comprende un CBM, y donde dicho fragmento comprende un dominio catalítico funcional. 35

[0030] Enzima de alfa-amilasa: la divulgación se refiere a polipéptidos nuevos que comprenden un módulo de unión a carbohidratos ("CBM") y que tienen actividad de alfa-amilasa. Tales polipéptidos se pueden derivar de cualquier organismo, son preferidos aquellos de origen fúngico o bacteriano.

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[0031] Las alfa-amilasas de la divulgación incluyen alfa-amilasas obtenibles de unas especies dentro de un género seleccionado de la lista consistente en Absidia, Acremonium, Coniochaeta, Coriolus, Cryptosporiopsis, Dichotomocladium, Dinemasporium, Diplodia, Fusarium, Gliocladium, Malbranchea, Meripilus, Necteria, Penicillium, Rhizomucor, Stereum, Streptomyces, Subulispora, Syncephalastrum, Thamindium, Thermoascus, Thermomyces, Trametes, Trichophaea y Valsaria. La alfa-amilasa se puede derivar de cualquier género, especie 45 o secuencia enumerados en la tabla 1.

[0032] Preferiblemente la alfa-amilasa es derivada de cualquier especie seleccionada del grupo consistente en Thermomyces lanuginosus; en particular un polipéptido con los aminoácidos 1-441 en SEC ID nº: 14, Malbranchea sp.; en particular un polipéptido con los aminoácidos 1-471 en SEC ID nº: 18, Rhizomucor pusillus; 50 en particular un polipéptido con los aminoácidos 1-450 en SEC ID nº: 20, Dichotomocladium hesseltinei; en particular un polipéptido con los aminoácidos 1-445 en SEC ID nº: 22, Stereum sp.; en particular un polipéptido con los aminoácidos 1-498 en SEC ID nº: 26, Trametes sp.; en particular un polipéptido con los aminoácidos 18-513 en SEC ID nº: 28, Coriolus consors; en particular un polipéptido con los aminoácidos 1-507 en SEC ID nº: 30, Dinemasporium sp.; en particular un polipéptido con los aminoácidos 1-481 en SEC ID nº: 55 32,Cryptosporiopsis sp.; en particular un polipéptido con los aminoácidos 1-495 en SEC ID nº: 34, Diplodia sp.; en particular un polipéptido con los aminoácidos 1-477 en SEC ID nº: 38, Gliocladium sp.; en particular un polipéptido con los aminoácidos 1-449 en SEC ID nº: 42,Nectria sp.; en particular un polipéptido con los aminoácidos 1-442 en SEC ID nº: 115, Fusarium sp.; en particular un polipéptido con los aminoácidos 1-441 en SEC ID nº: 117, Thermoascus auranticus; en particular un polipéptido con los aminoácidos 1-477 en SEC ID nº: 60 125, Thamindium elegans; en particular un polipéptido con los aminoácidos 1-446 en SEC ID nº: 131, Absidia cristata; en particular un polipéptido con los aminoácidos 41-481 en SEC ID nº: 157, Acremonium sp.; en particular un polipéptido con los aminoácidos 22-626 en SEC ID nº: 159, Coniochaeta sp.; en particular un polipéptido con los aminoácidos 24-630 en SEC ID nº: 161, Meripilus giganteus; en particular un polipéptido con los aminoácidos 27-602 en SEC ID nº: 163, Penicillium sp.; en particular un polipéptido con los aminoácidos 21-65 643 en SEC ID nº: 165, Streptomyces limosus; en particular un polipéptido con los aminoácidos 29-566 en SEC

ID nº: 167, Subulispora procurvata; en particular un polipéptido con los aminoácidos 22-613 en SEC ID nº: 169, Syncephalastrum racemosum; en particular un polipéptido con los aminoácidos 21-463 en SEC ID nº: 171, Trametes currugata ; en particular un polipéptido con los aminoácidos 21-587 en SEC ID nº: 173, Trichophaea saccata; en particular un polipéptido con los aminoácidos 30-773 en SEC ID nº: 175, Valsaria rubricosa; en particular un polipéptido con los aminoácidos 22-586 en SEC ID nº: 177 y Valsaria spartii; en particular un 5 polipéptido con los aminoácidos 20-582 en SEC ID nº: 179.

[0033] Según la divulgación, también son preferidas las secuencias de aminoácidos de alfa-amilasa con al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o incluso al menos 98% de homología al péptido maduro de cualquiera de los polipéptidos 10 anteriormente mencionados. En otra forma de realización preferida la secuencia de aminoácidos de alfa-amilasa tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de cualquiera de las secuencias de aminoácidos anteriormente mencionadas en no más de 10 posiciones, no más de 9 posiciones, no más de 8 posiciones, no más de 7 posiciones, no más de 6 posiciones, no más de 5 posiciones, no más de 4 posiciones, no más de 3 posiciones, no más de 2 posiciones, o incluso no más de 1 posición. 15

[0034] Según la divulgación, también son preferidas las secuencias de aminoácidos de alfa-amilasa codificadas por una secuencia de ADN con al menos 50%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o incluso al menos 98% homología a cualquier secuencia seleccionada del grupo consistente en los polinucleótidos mostrados como SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 3, 20 SEC ID nº: 5, SEC ID nº: 7, SEC ID nº: 9, SEC ID nº: 11, SEC ID nº: 13, SEC ID nº: 15, SEC ID nº: 17, SEC ID nº: 19, SEC ID nº: 21, SEC ID nº: 23, SEC ID nº: 25, SEC ID nº: 27, SEC ID nº: 29, SEC ID nº: 31, SEC ID nº: 33, SEC ID nº: 35, SEC ID nº: 37, SEC ID nº: 39, SEC ID nº: 41, SEC ID nº: 43, SEC ID nº: 110, SEC ID nº: 112, SEC ID nº: 114, SEC ID nº: 116, SEC ID nº: 118, SEC ID nº: 120, SEC ID nº: 122, SEC ID nº: 124, SEC ID nº: 126, SEC ID nº: 128, SEC ID nº: 130, SEC ID nº: 132, SEC ID nº: 134, SEC ID nº: 154 y SEC ID nº: 156. SEC ID 25 nº: 13, SEC ID nº: 17, SEC ID nº: 19, SEC ID nº: 21, SEC ID nº: 25, SEC ID nº: 27, SEC ID nº: 29, SEC ID nº: 31, SEC ID nº: 33, SEC ID nº: 37, SEC ID nº: 41, SEC ID nº: 114, SEC ID nº: 116, SEC ID nº: 124, SEC ID nº: 130, SEC ID nº: 156, SEC ID nº: 158, SEC ID nº: 160, SEC ID nº: 162, SEC ID nº: 164, SEC ID nº: 166, SEC ID nº: 168, SEC ID nº: 170, SEC ID nº: 172, SEC ID nº: 174, SEC ID nº: 176 y SEC ID nº: 178. Es más preferible cualquier secuencia de aminoácidos de alfa-amilasa codificada por una secuencia de ADN que se hibrida bajo 30 astringencia baja, media, media/alta, astringencia alta y/o muy alta para cualquiera de las secuencias de ADN de alfa-amilasas anteriormente mencionadas. También preferidas son las secuencias de ADN que codifican una secuencia de aminoácidos de alfa-amilasa y que tienen al menos 50%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99%, o incluso 100% de homología a cualquiera de las secuencias de ADN de alfa-amilasa anteriormente mencionadas. 35

[0035] Dominios catalíticos de alfa-amilasa: en una forma de realización la divulgación se refiere a dominios catalíticos derivados de polipéptidos que comprenden un módulo de unión a carbohidratos ("CBM") y que tienen una actividad de alfa-amilasa, tales como dominios catalíticos derivados de un polipéptido seleccionado de las alfa-amilasas mostradas en SEC ID nº: 14, SEC ID nº: 18, SEC ID nº: 20, SEC ID nº: 22, SEC ID nº: 26, SEC ID 40 nº: 28, SEC ID nº: 30, SEC ID nº: 32, SEC ID nº: 34, SEC ID nº: 38, SEC ID nº: 42, SEC ID nº: 115, SEC ID nº: 117, SEC ID nº: 125, SEC ID nº: 131, SEC ID nº: 157, SEC ID nº: 159, SEC ID nº: 161, SEC ID nº: 163, SEC ID nº: 165, SEC ID nº: 167, SEC ID nº: 169, SEC ID nº: 171, SEC ID nº: 173, SEC ID nº: 175, SEC ID nº: 177 y SEC ID nº: 179. Preferidos son los dominios catalíticos mostrados en los aminoácidos 1-441 en SEC ID nº: 14, los aminoácidos 1-471 en SEC ID nº: 18, los aminoácidos 1-450 en SEC ID nº: 20, los aminoácidos 1- 445 en SEC 45 ID nº: 22, los aminoácidos 1-498 en SEC ID nº: 26, los aminoácidos 18-513 en SEC ID nº: 28, los aminoácidos 1-507 en SEC ID nº: 30, los aminoácidos 1-481 en SEC ID nº: 32, los aminoácidos 1-495 en SEC ID nº: 34, los aminoácidos 1-477 en SEC ID nº: 38, los aminoácidos 1- 449 en SEC ID nº: 42, los aminoácidos 1-442 en SEC ID nº: 115, los aminoácidos 1-441 en SEC ID nº: 117, los aminoácidos 1-477 en SEC ID nº: 125, los aminoácidos 1-446 en SEC ID nº: 131, los aminoácidos 41-481 en SEC ID nº: 157, los aminoácidos 22-502 en SEC ID nº: 159, 50 los aminoácidos 24-499 en SEC ID nº: 161, los aminoácidos 27-492 en SEC ID nº: 163, los aminoácidos 21-496 en SEC ID nº: 165, los aminoácidos 29-501 en SEC ID nº: 167, los aminoácidos 22-487 en SEC ID nº: 169, los aminoácidos 21-463 en SEC ID nº: 171, los aminoácidos 21-477 en SEC ID nº: 173, los aminoácidos 288-773 en SEC ID nº: 175, los aminoácidos 22-471 en SEC ID nº: 177 y los aminoácidos 20-470 en SEC ID nº: 179. También preferidas son las secuencias de dominio catalítico con al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al 55 menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o incluso al menos 95% de homología a cualquiera de las secuencias de dominio catalítico anteriormente mencionadas. En otra forma de realización preferida de la divulgación, la secuencia de dominio catalítico tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de cualquiera de las secuencias de dominio catalítico anteriormente mencionadas en no más de 10 posiciones, no más de 9 posiciones, no más de 8 posiciones, no más de 7 posiciones, no más de 6 posiciones, no más de 5 posiciones, 60 no más de 4 posiciones, no más de 3 posiciones, no más de 2 posiciones, o incluso no más de 1 posición.

[0036] También preferidas son las secuencia de aminoácidos de dominio catalítico codificadas por una secuencia de ADN con al menos 50%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o incluso al menos 95% de homología a cualquier secuencia seleccionada del grupo 65 consistente en los polinucleótidos mostrados como los nucleótidos 1-1326 en SEC ID nº: 13, nucleótidos 1- 1413

en SEC ID nº: 17, nucleótidos 1-1350 en SEC ID nº: 19, nucleótidos 1-1338 en SEC ID nº: 21, nucleótidos 1-1494 en SEC ID nº: 25, nucleótidos 52-1539 en SEC ID nº: 27, nucleótidos 1-1521 en SEC ID nº: 29, nucleótidos 1-1443 en SEC ID nº: 31, nucleótidos 1-1485 en SEC ID nº: 33, nucleótidos 1-1431 en SEC ID nº: 37, nucleótidos 1-1347 en SEC ID nº: 41, nucleótidos 1-1326 en SEC ID nº: 114, nucleótidos 1-1323 en SEC ID nº: 116, nucleótidos 1-1431 en SEC ID nº: 124, nucleótidos 1-1338 en SEC ID nº: 130, nucleótidos 121-1443 en SEC ID 5 nº: 156, nucleótidos 64- 1506 en SEC ID nº: 158, nucleótidos 70-1497 en SEC ID nº: 160, nucleótidos 79-1476 en SEC ID nº: 162, nucleótidos 61-1488 en SEC ID nº: 164, nucleótidos 85-1503 en SEC ID nº: 166, nucleótidos 64-1461 en SEC ID nº: 168, nucleótidos 61-1389 en SEC ID nº: 170, nucleótidos 61- 1431 en SEC ID nº: 172, nucleótidos 862-2322 en SEC ID nº: 174, nucleótidos 64-1413 en SEC ID nº: 176 y nucleótidos 58-1410 en SEC ID nº: 178. 10

Es mayormente preferible cualquier secuencia de aminoácidos de dominio catalítico codificada por una secuencia de ADN que se hibrida bajo astringencia baja, media, media/alta, alta y/o muy alta para cualquiera de las secuencias de ADN anteriormente mencionadas. También preferidas son las secuencias de ADN que codifican una secuencia de aminoácidos de dominio catalítico y que tiene al menos 50%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al 15 menos 99%, o incluso 100% de homología a cualquiera de las secuencias de ADN del dominio catalítico anteriormente mencionado.

[0037] Secuencias enlazadoras: en una forma de realización la divulgación se refiere a secuencias enlazadoras derivadas de polipéptidos que comprenden un módulo de unión a carbohidratos ("CBM") y que tienen actividad 20 de alfa-amilasa. Preferidas son unas secuencias de aminoácidos enlazadoras seleccionadas del grupo consistente en los mostrados como aminoácidos 503-528 en SEC ID nº: 159, aminoácidos 500-532 en SEC ID nº: 161, aminoácidos 493-507 en SEC ID nº: 163, aminoácidos 497-539 en SEC ID nº: 165, aminoácidos 488-512 en SEC ID nº: 169 en 478-491 en SEC ID nº: 173, aminoácidos 472-486 en SEC ID nº: 177 y aminoácidos 471-481 en SEC ID nº: 179. También preferidas son secuencias de aminoácidos enlazadoras con al menos 60%, al 25 menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o incluso al menos 95% de homología a cualquiera de las secuencias enlazadoras anteriormente mencionadas. En otra forma de realización preferida de la divulgación, la secuencia enlazadora tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de cualquiera de las secuencias enlazadoras anteriormente mencionadas en no más de 10 posiciones, no más de 9 posiciones, no más de 8 posiciones, no más de 7 posiciones, no más de 6 posiciones, no más de 5 30 posiciones, no más de 4 posiciones, no más de 3 posiciones, no más de 2 posiciones, o incluso no más de 1 posición.

[0038] Módulos de enlace de carbohidratos: en una forma de realización la divulgación se refiere a CBMs derivados de polipéptidos que comprenden un módulo de unión a carbohidratos ("CBM") y que tienen actividad 35 alfa-amilasa, dicho CBM derivado de un polipéptido seleccionado de las alfa-amilasas mostradas en SEC ID nº: 14, SEC ID nº: 18, SEC ID nº: 20, SEC ID nº: 22, SEC ID nº: 26, SEC ID nº: 28, SEC ID nº: 30, SEC ID nº: 32, SEC ID nº: 34, SEC ID nº: 38, SEC ID nº: 42, SEC ID nº: 115, SEC ID nº: 117, SEC ID nº: 125, SEC ID nº: 131, SEC ID nº: 157, SEC ID nº: 159, SEC ID nº: 161, SEC ID nº: 163, SEC ID nº: 165, SEC ID nº: 167, SEC ID nº: 169, SEC ID nº: 171, SEC ID nº: 173, SEC ID nº: 175, SEC ID nº: 177 y SEC ID nº: 179. Preferida es una 40 secuencia de aminoácidos de CBM seleccionada del grupo que consiste en la secuencia con los aminoácidos 529-626 en SEC ID nº: 159, los aminoácidos 533-630 en SEC ID nº: 161, los aminoácidos 508-602 en SEC ID nº: 163, los aminoácidos 540-643 en SEC ID nº: 165, los aminoácidos 502-566 en SEC ID nº: 167, los aminoácidos 513-613 en SEC ID nº: 169, los aminoácidos 492-587 en SEC ID nº: 173, los aminoácidos 30-287 en SEC ID nº: 175, los aminoácidos 487-586 en SEC ID nº: 177 y los aminoácidos 482-582 en SEC ID nº: 179. También 45 preferidas son las secuencias de aminoácidos de CBM con al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o incluso al menos 95% de homología a cualquiera de las anteriormente mencionadas secuencias de aminoácidos de CBM. En otra forma de realización preferida de la divulgación, la secuencia de CBM tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de cualquiera de las anteriormente mencionadas secuencias de CBM en no más de 10 posiciones, no más de 9 posiciones, no más 50 de 8 posiciones, no más de 7 posiciones, no más de 6 posiciones, no más de 5 posiciones, no más de 4 posiciones, no más de 3 posiciones, no más de 2 posiciones, o incluso no más de 1 posición.

[0039] También preferida es una secuencia de aminoácidos de CBM codificada por una secuencia de ADN con al menos 50%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al 55 menos 90% o incluso al menos 95% de homología a cualquier secuencia seleccionada del grupo consistente en los polinucleótidos mostrados como nucleótidos 1585-1878 en SEC ID nº: 158, nucleótidos 1597-1890 en SEC ID nº: 160, nucleótidos 1522-1806 en SEC ID nº: 162, nucleótidos 1618-1929 en SEC ID nº: 164, nucleótidos 1504-1701 en SEC ID nº: 166, nucleótidos 1537-1842 en SEC ID nº: 168, nucleótidos 1474-1764 en SEC ID nº: 172, nucleótidos 61-861 en SEC ID nº: 174, nucleótidos 1459-1761 en SEC ID nº: 176 y nucleótidos 1444-1749 en 60 SEC ID nº: 178. SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 3, SEC ID Nº: 5, SEC ID nº: 7, SEC ID nº: 9, SEC ID nº: 11, SEC ID nº: 13, SEC ID nº: 15, SEC ID nº: 17, SEC ID nº: 19, SEC ID nº: 21, SEC ID nº: 23, SEC ID nº: 25, SEC ID nº: 27, SEC ID nº: 29, SEC ID nº: 31, SEC ID nº: 33, SEC ID nº: 35, SEC ID nº: 37, SEC ID nº: 39, SEC ID nº: 41, SEC ID nº: 43, SEC ID nº: 110, SEC ID nº: 112, SEC ID nº: 114, SEC ID nº: 116, SEC ID nº: 118, SEC ID nº: 120, SEC ID nº: 122, SEC ID nº: 124, SEC ID nº: 126, SEC ID nº: 128, SEC ID nº: 130, SEC ID nº: 132, SEC ID nº: 134, 65 SEC ID nº: 154 y SEC ID nº: 156. Más preferida es cualquier secuencia de aminoácidos de CBM codificada por

una secuencia de ADN que se hibrida bajo astringencia baja, media, media/alta, alta y/o muy alta a la secuencia de ADN complementaria de cualquiera de las secuencias de ADN de CBM antes mencionadas. También preferidas son las secuencias de ADN que codifican una secuencia de aminoácidos de CBM y que tiene al menos 50%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99%, o incluso 100% de homología a cualquiera de las anteriormente 5 mencionadas secuencias de ADN de CBM.

[0040] Las secuencias de ADN mostradas como nucleótidos 1504-1701 en SEC ID nº: 166 y nucleótidos 61-861 en SEC ID nº: 174 y las secuencias de aminoácidos codificadas comprenden además del CBD también una secuencia enlazadora. 10

Tabla 1

Alfa-amilasas usadas como dominio catalítico y donantes de CBM. Posiciones para dominio catalítico, secuencias enlazadoras y CBM.

Especies

Cepa Nº SEC ID nº Péptido maduro Dominio catalítico Enlazador CBM Tipo

Absidia cristata

NN047841 SEC ID nº: 156 121-1443 121-1443 ADN

Absidia cristata

NN047841 SEC ID nº: 157 41- 481 41- 481 Aa

Acremonium sp.

NN045509 SEC ID nº: 158 64- 1878 64- 1506 1507-1584 1585-1878 ADN

Acremonium sp.

NN045509 SEC ID nº: 159 22- 626 22- 502 503-528 529-626 Aa

Coniochaeta sp.

NN047603 SEC ID nº: 160 70- 1890 70- 1497 1498-1596 1597-1890 ADN

Coniochaeta sp.

NN047603 SEC ID nº: 161 24- 630 24- 499 500-532 533-630 Aa

Coriolus consors

NN048884 SEC ID nº: 29 1-1521 1-1521 ADN

Coriolus consors

NN048884 SEC ID nº: 30 1-507 1-507 Aa

Cryptosporiopsissp.

NN047117 SEC ID nº: 33 1-1485 1-1485 ADN

Cryptosporiopsissp.

NN047117 SEC ID nº: 34 1-495 1-495 Aa

Dichotomocladium hesseltinei

NN103100 SEC ID Nº: 21 1-1338 1-1338 ADN

Dichotomocladium hesseltinei

NN103100 SEC ID nº: 22 1-445 1-445 Aa

Dinemasporiumsp.

NN043050 SEC ID nº: 31 1-1443 1-1443 ADN

Dinemasporiumsp.

NN043050 SEC ID nº: 32 1-481 1-481 Aa

Diplodia sp.

NN047649 SEC ID nº: 37 1-1431 1-1431 ADN

Diplodia sp.

NN047649 SEC ID nº: 38 1-477 1-477 Aa

Fusarium sp.

NN046318 SEC ID nº: 116 1-1323 1-1323 ADN

Fusarium sp.

NN046318 SEC ID nº: 117 1-441 1-441 Aa

Gliocladium sp.

NN047683 SEC ID nº: 41 1-1347 1-1347 ADN

Gliocladium sp.

NN047683 SEC ID nº: 42 1-449 1-449 Aa

Malbranchea sp.

NN046840 SEC ID nº: 17 1-1413 1-1413 ADN

Malbranchea sp.

NN046840 SEC ID nº: 18 1-471 1-471 Aa

Meripilus giganteus

NN006040 SEC ID nº: 162 79- 1806 79- 1476 1477-1521 1522-1806 ADN

Meripilus giganteus

NN006040 SEC ID nº: 163 27- 602 27- 492 493-507 508-602 Aa

Nectria sp.

NN047728 SEC ID nº: 114 1-1326 1-1326 ADN

Nectria sp.

NN047728 SEC ID nº: 115 1-442 1-442 Aa

Penicillium sp.

NN050730 SEC ID nº: 164 61- 1929 61- 1488 1489-1617 1618-1929 ADN

Penicillium sp.

NN050730 SEC ID nº: 165 21- 643 21- 496 497-539 540-643 Aa

Rhizomucorpusillus

NN101459 SEC ID nº: 19 1-1350 1-1350 ADN

Rhizomucorpusillus

NN101459 SEC ID nº: 20 1-450 1-450 Aa

Stereum sp.

NN048875 SEC ID nº: 25 1-1494 1-1494 ADN

Stereum sp.

NN048875 SEC ID nº: 26 1-498 1-498 Aa

Streptomyces limosus

ATCC19778 SEC ID nº: 166 85- 1701 85- 1503 1)1504-1701 ADN

Streptomyces limosus

ATCC19778 SEC ID nº: 167 29- 566 29- 501 1)502-566 Aa

Subulispora procurvata

NN042875 SEC ID nº: 169 22- 613 22- 487 488-512 513-613 Aa

Subulispora provurvata

NN042875 SEC ID nº: 168 64- 1842 64- 1461 1462-1536 1537-1842 ADN

Syncephalastrum racemosum

NN047920 SEC ID nº: 170 61- 1389 61- 1389 ADN

Syncephalastrum racemosum

NN047920 SEC ID nº: 171 21- 463 21- 463 Aa

Thamindium elegans

NN050372 SEC ID nº: 130 1-1338 1-1338 ADN

Thamindium elegans

NN050372 SEC ID nº: 131 1-446 1-446 Aa

Thermoascus auranticus

NN047354 SEC ID nº: 124 1-1431 1-1431 ADN

Thermoascus auranticus

NN047354 SEC ID nº: 125 1-477 1-477 Aa

Thermomyces lanuginosus

NN044958 SEC ID nº: 13 1-1326 1-1326 ADN

Thermomyces lanuginosus

NN044958 SEC ID nº: 14 1-441 1-441 Aa

Trametes currugata

CGMCC5.61 SEC ID nº: 172 61- 1764 61- 1431 1432-1473 1474-1764 ADN

Trametes currugata

CGMCC5.61 SEC ID nº: 173 21- 587 21- 477 478-491 492-587 Aa

Trametes Sp.

NN048968 SEC ID nº: 27 52- 1539 52- 1539 ADN

Trametes Sp.

NN048968 SEC ID nº: 28 18- 513 18- 513 Aa

Trichophaea saccata

NN102806 SEC ID nº: 174 61- 2322 862-2322 1)61-861 ADN

Trichophaea saccata

NN102806 SEC ID nº: 175 30- 773 288-773 1)30-287 Aa

Valsaria rubricosa

NN046835 SEC ID nº: 176 64- 1761 64- 1413 1414-1458 1459-1761 ADN

Valsaria rubricosa

NN046835 SEC ID nº: 177 22- 586 22- 471 472-486 487-586 Aa

Valsaria spartii

NN050508 SEC ID nº: 178 58- 1749 58- 1410 1411-1443 1444-1749 ADN

Valsaria spartii

NN050508 SEC ID nº: 179 20- 582 20- 470 471-481 482-582 Aa

1) La secuencia comprende CBM y enlazador

[0041] Los polipéptidos de alfa-amilasa se pueden aplicar en los procesos de degradación de almidón y/o usar como donantes de dominio catalítico y/o CBM para un polipéptido híbrido. Un polipéptido preferido de la divulgación, por ejemplo, un polipéptido híbrido, comprende una primera secuencia de los aminoácidos que comprende un módulo catalítico con actividad de alfa-amilasa y una segunda secuencia de aminoácidos que comprende un módulo de unión a carbohidratos, donde dicha segunda secuencia de aminoácidos tiene al menos 5 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, tal como al menos 95% de homología a cualquier secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente en los aminoácidos 529-626 en SEC ID nº: 159, los aminoácidos 533-630 en SEC ID nº: 161, los aminoácidos 508-602 en SEC ID nº: 163, los aminoácidos 540- 643 en SEC ID nº: 165, los aminoácidos 502-566 en SEC ID nº: 167, los aminoácidos 513-613 en SEC ID nº: 169, los aminoácidos 492-587 en SEC ID nº: 173, los aminoácidos 30-287 en SEC ID nº: 175, los 10 aminoácidos 487-586 en SEC ID nº: 177 y los aminoácidos 482-582 en SEC ID nº: 179. Más preferidos son polipéptidos, por ejemplo, polipéptidos híbridos, donde dicha primera secuencia de aminoácidos tiene al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, tal como al menos 95% de homología a cualquier secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente en aminoácidos 1-441 en SEC ID nº: 14, los aminoácidos 1-471 en SEC ID nº: 18, los aminoácidos 1-450 en SEC ID nº: 20, los aminoácidos 1-445 en 15 SEC ID nº: 22, los aminoácidos 1-498 en SEC ID nº: 26, los aminoácidos 18-513 en SEC ID nº: 28, los aminoácidos 1-507 en SEC ID nº: 30, los aminoácidos 1-481 en SEC ID nº: 32, los aminoácidos 1-495 en SEC ID nº: 34, los aminoácidos 1-477 en SEC ID nº: 38, los aminoácidos 1-449 en SEC ID nº: 42, los aminoácidos 1-442 en SEC ID nº: 115, los aminoácidos 1-441 en SEC ID nº: 117, los aminoácidos 1-477 en SEC ID nº: 125, los aminoácidos 1-446 en SEC ID nº: 131, los aminoácidos 41-481 en SEC ID nº: 157, los aminoácidos 22-502 en 20 SEC ID nº: 159, los aminoácidos 24-499 en SEC ID nº: 161, los aminoácidos 27-492 en SEC ID nº: 163, los aminoácidos 21-496 en SEC ID nº: 165, los aminoácidos 29-501 en SEC ID nº: 167, los aminoácidos 22-487 en SEC ID nº: 169, los aminoácidos 21-463 en SEC ID nº: 171, los aminoácidos 21-477 en SEC ID nº: 173, los aminoácidos 288-773 en SEC ID nº: 175, los aminoácidos 22-471 en SEC ID nº: 177 y los aminoácidos 20-470 en SEC ID nº: 179. También preferidos son los polipéptidos, por ejemplo, polipéptidos híbridos, donde una 25 secuencia enlazadora está presente en una posición entre dicha primera y dicha segunda secuencia de aminoácidos, dicha secuencia enlazadora con al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, tal como al menos 95% de homología a cualquier secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente en los aminoácidos 503-528 en SEC ID nº: 159, aminoácidos 500-532 en SEC ID nº: 161, aminoácidos 493-507 en SEC ID nº: 163, aminoácidos 497-539 en SEC ID nº: 165, aminoácidos 488-512 en SEC 30 ID nº: 169 en 478-491 en SEC ID nº: 173, aminoácidos 472-486 en SEC ID nº: 177 y aminoácidos 471-481 en SEC ID nº: 179.

Secuencia de alfa-amilasa

35

[0042] Dominios catalíticos, es decir, dominios catalíticos de alfa-amilasa (en particular alfa-amilasas estables en ácido), que son apropiados para construcción de polipéptidos de los tipos de la presente divulgación se pueden derivar de cualquier organismo, preferidos son aquellos de origen fúngico o bacteriano.

[0043] Preferiblemente la alfa-amilasa es una enzima de tipo salvaje. De forma más preferible la alfa-amilasa es 40 una alfa-amilasa variante que comprende modificaciones de aminoácidos conduciendo a actividad aumentada, estabilidad de proteína aumentada a bajo pH, y/o a pH alto, estabilidad aumentada hacia disminución de calcio, y/o estabilidad aumentada a temperatura elevada.

[0044] Alfa-amilasas pertinentes para usar en un híbrido de la divulgación incluyen alfa-amilasas obtenibles de 45 unas especies seleccionadas de la lista consistente en Absidia, Acremonium, Aspergillus, Coniochaeta, Coniochaeta, Cryptosporiopsis, Dichotomocladium, Dinemasporium sp., Diplodia, Fusarium, Gliocladium, Malbranchea, Meripilus Trametes, Nectria, Nectria, Penicillium, Phanerochaete, Rhizomucor, Rhizopus, Streptomyces, Subulispora, Syncephalastrum, Thaminidium, Thermoascus, Thermomyces, Trametes, Trichophaea y Valsaria. El dominio catalítico de alfa-amilasas también se puede derivar de unas bacterias, por 50 ejemplo, Bacillus.

[0045] Preferiblemente la secuencia de aminoácidos de alfa-amilasas seleccionada es derivada de Meripilus giganteus.

55

[0046] Preferiblemente el híbrido según la divulgación comprende una secuencia de aminoácidos de alfa-amilasa seleccionada del grupo consistente en los módulos catalíticos de alfa-amilasa enumerados en la tabla 1 o 2.

[0047] De la forma más preferible, el híbrido de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de alfa-amilasa seleccionada de Meripilus giganteus (SEC ID nº: 24). 60

[0048] También preferidos para invención son híbridos que comprenden una secuencia de aminoácidos de alfa-amilasa con al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o incluso al menos 95% de homología a cualquier secuencia seleccionada de la SEC ID nº: 24.

65

[0049] En otra forma de realización preferida, la enzima híbrida tiene una secuencia de alfa-amilasa que difiere

de una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEC ID nº: 24 en no más de 10 posiciones, no más de 9 posiciones, no más de 8 posiciones, no más de 7 posiciones, no más de 6 posiciones, no más de 5 posiciones, no más de 4 posiciones, no más de 3 posiciones, no más de 2 posiciones, o incluso no más de 1 posición.

[0050] También preferidos son híbridos que comprenden una secuencia de aminoácidos de alfa-amilasas 5 codificada por una secuencia de ADN con al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o incluso al menos 95% de homología a la secuencia seleccionada de la SEC ID nº: 23.

[0051] Más preferidos según la divulgación son híbridos que comprenden una alfa-amilasa codificada por una secuencia de ADN que se hibrida a astringencia baja, media, media/alta, alta y/o muy alta para cualquier 10 secuencia de ADN seleccionada de la SEC ID nº: 23

Secuencia enlazadora

[0052] La secuencia enlazadora puede ser cualquier secuencia enlazadora adecuada, por ejemplo, una 15 secuencia enlazadora derivada de una alfa-amilasa o una glucoamilasa. El enlazador puede ser un enlace, o un grupo de conexión corto que comprende de aproximadamente 2 a aproximadamente 100 átomos de carbono, en particular de 2 a 40 átomos de carbono. No obstante, el enlazador es preferiblemente una secuencia de aproximadamente 2 a aproximadamente 100 residuos de aminoácidos, más preferiblemente de 4 a 40 residuos de aminoácidos, tal como de 6 a 15 residuos de aminoácidos. 20

[0053] Preferiblemente los híbridos que comprenden una secuencia enlazadora derivados de cualquier especie seleccionada del grupo consistente en Acremonium, Coniochaeta, Coniochaeta, Meripilus, Pachykytospora, Penicillium, Sublispora, Trametes, Trichophaea, Valsaria, Athelia, Aspergillus, Trametes y Leucopaxillus. El enlazador también se puede derivar de una bacteria, por ejemplo, de una cepa comprendida en Bacillus sp. Más 25 preferiblemente el enlazador es derivado de unas especies seleccionadas del grupo consistente en Acremonium sp., Coniochaeta sp., Coniochaeta sp., Meripilus giganteus, Penicillium sp.,Sublispora provurvata, Trametes corrugata, Trichophaea saccata, Valsaria rubricosa, Valsario spartii, Aspergillus kawachii, Aspergillus niger, Athelia rolfsii, Leucopaxillus gigantus, Pachykytospora papairacea, Trametes cingulata y Bacillus flavothermus.

30

[0054] Preferiblemente el híbrido comprende una secuencia de aminoácidos enlazadora seleccionada del grupo consistente en los enlaces enumerados en la tabla 1 o 2.

[0055] De forma más preferible el enlazador es un enlazador de una glucoamilasa seleccionada del grupo consistente en Pachykytospora papairacea (SEC ID nº: 46), Trametes cingulata (SEC ID nº: 48),Leucopaxillus 35 gigantus (SEC ID nº: 50), Athelia rolfsii (SEC ID nº: 68), Aspergillus kawachii (SEC ID nº: 70), Aspergillus niger (SEC ID nº: 72) o un enlazador de una alfa-amilasa seleccionada del grupo consistente en Sublispora provurvata (SEC ID nº: 54), Valsaria rubricosa (SEC ID nº: 56), Acremonium sp. (SEC ID nº: 58), Meripilus giganteus (SEC ID nº: 60), Bacillus flavothermus (SEC ID nº: 62, SEC ID nº: 64 o SEC ID nº: 66), Coniochaeta sp. AM603 (SEC ID nº: 74), Coniochaeta sp. (SEC ID nº: 145), Trametes corrugata (SEC ID nº: 147), Valsario spartii (SEC ID nº: 40 149), Penicillium sp. (SEC ID nº: 151), Trichophaea saccata (SEC ID nº: 52).

[0056] También preferida para la invención es cualquier secuencia de aminoácidos enlazadora con al menos un 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o incluso al menos 95% de homología a cualquier secuencia seleccionada del grupo consistente en SEC ID nº: 46, SEC ID nº: 48, SEC ID nº: 50, SEC ID nº: 52, SEC ID nº: 45 54, SEC ID nº: 56, SEC ID nº: 58, SEC ID nº: 60, SEC ID nº: 62, SEC ID nº: 64, SEC ID nº: 66, SEC ID nº: 68, SEC ID nº: 70, SEC ID nº: 72, SEC ID nº: 74, SEC ID nº: 145, SEC ID nº: 147, SEC ID nº: 149 y SEC ID nº: 151.

[0057] En otra forma de realización preferida la enzima híbrida tiene una secuencia enlazadora que difiere de unas secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo consistente en SEC ID nº: 46, SEC ID nº: 48, SEC ID 50 nº: 50, SEC ID nº: 52, SEC ID nº: 54, SEC ID nº: 56, SEC ID nº: 58, SEC ID nº: 60, SEC ID nº: 62, SEC ID nº: 64, SEC ID nº: 66, SEC ID nº: 68, SEC ID nº: 70, SEC ID nº: 72, SEC ID nº: 74, SEC ID nº: 145, SEC ID nº: 147, SEC ID nº: 149 y SEC ID nº: 151 en no más de 10 posiciones, no más de 9 posiciones, no más de 8 posiciones, no más de 7 posiciones, no más de 6 posiciones, no más de 5 posiciones, no más de 4 posiciones, no más de 3 posiciones, no más de 2 posiciones, o incluso no más de 1 posición. 55

[0058] También preferidos son los híbridos que comprenden una secuencia enlazadora codificada por una secuencia de ADN con al menos un 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o incluso al menos 95% de homología a cualquier secuencia seleccionada del grupo consistente en SEC ID nº: 45, SEC ID nº: 47, SEC ID nº: 49, SEC ID nº: 51, SEC ID nº: 53, SEC ID nº: 55, SEC ID nº: 57, SEC ID nº: 59, SEC ID nº: 61, SEC ID nº: 60 63, SEC ID nº: 65, SEC ID nº: 67, SEC ID nº: 69, SEC ID nº: 71, SEC ID nº: 73, SEC ID nº: 144, SEC ID nº: 146, SEC ID nº: 148, y SEC ID nº: 150.

[0059] Más preferidos según la divulgación son los híbridos que comprenden una secuencia enlazadora codificada por una secuencia de ADN que se hibrida bajo astringencia alta, media o baja a cualquier secuencia 65 de ADN seleccionada del grupo que consiste en SEC ID nº: 45, SEC ID nº: 47, SEC ID nº: 49, SEC ID nº: 51,

SEC ID nº: 53, SEC ID nº: 55, SEC ID nº: 57, SEC ID nº: 59, SEC ID nº: 61, SEC ID nº: 63, SEC ID nº: 65, SEC ID nº: 67, SEC ID nº: 69, SEC ID nº: 71, SEC ID nº: 73, SEC ID nº: 144, SEC ID nº: 146, SEC ID nº: 148, y SEC ID nº: 150.

[0060] En formas de realización preferidas el enlazador que se origina de la fuente de CBM se usa, por ejemplo, 5 cuando se usa el CBM de glucoamilasa de A. rolfsii la secuencia enlazadora de la glucoamilasa de A. rolfsii se usa en el híbrido también.

Módulos de unión a carbohidratos

10

[0061] Un módulo de unión a carbohidratos (CBM), o como frecuentemente se hace referencia, un dominio de unión a carbohidratos es una secuencia de aminoácidos del polipéptido que se enlaza preferentemente a un poli u oligosacárido (carbohidrato), frecuentemente - pero no necesariamente exclusivamente - a una forma insoluble en agua (incluso cristalina) de la misma.

15

[0062] CBM derivados de enzimas degradantes de almidón son frecuentemente referidos como módulos de unión al almidón o SBM (CBM que pueden ocurrir en determinadas enzimas amilolíticas, tal como ciertas glucoamilasas (GA), o en enzimas tales como ciclodextrina glucanotransferasas, o en alfa-amilasas). Asimismo, otras sub-clases de CBM abrazarían, por ejemplo, módulos de enlace de celulosa (CBM de enzimas celulolíticas), módulos de unión a quitina (CBM que típicamente se originan en quitinasas), módulos de unión a 20 xilano (CBM que típicamente se originan en xilanasas), módulos de unión de manano (CBM que típicamente se originan en mananasas). SBM son frecuentemente referidos como SBDs (Dominios de unión a almidón).

[0063] CBM se encuentran como partes integrales de polipéptidos grandes o proteínas consistentes en dos o más regiones de la secuencia de aminoácidos del polipéptido, especialmente en enzimas hidrolíticas (hidrolasas) 25 que típicamente comprenden un módulo catalítico que contiene el sitio activo para hidrólisis de sustrato y un módulo de unión a carbohidratos (CBM) para unión al sustrato de carbohidrato en cuestión. Tales enzimas pueden comprender más de un módulo catalítico y uno, dos o tres CBM y opcionalmente además comprenden una o varias regiones de la secuencia de aminoácidos del polipéptido que conecta el(los) CBM con el(los) módulo(s) catalítico(s), una región de este último tipo normalmente siendo denominada un "enlazador". Ejemplos 30 de enzimas hidrolíticas que comprenden un CBM - algunas de las cuales ya han sido mencionadas arriba - son celulasas, xilanasas, mananasas, arabinofuranosidasas, acetilesterasas y quitinasas. CBM también han sido encontrados en algas, por ejemplo, en el alga roja Porphyra purpurea en forma de una proteína de unión a polisacáridos no hidrolítica.

35

[0064] En las proteínas/polipéptidos donde se originan CBM (por ejemplo, enzimas, típicamente enzimas hidrolíticas), un CBM se puede localizar en el término N o C o en una posición interna.

[0065] Esta parte de un polipéptido o proteína (por ejemplo, enzima hidrolítica) que constituye un CBM per se típicamente consiste en más de aproximadamente 30 y menos de aproximadamente 250 residuos de 40 aminoácidos.

[0066] El "Módulo de unión a carbohidratos de Familia 20" o un módulo CBM-20 está definido en el contexto de esta invención como una secuencia de aproximadamente 100 aminoácidos con al menos 45% de homología al módulo de unión a carbohidratos (CBM) del polipéptido descrito en la figura 1 por Joergensen et al. (1997) en 45 Biotecnol. Lett. 19:1027-1031. El CBM comprende los últimos 102 aminoácidos del polipéptido, es decir, la subsecuencia del aminoácido 582 al aminoácido 683. La numeración de familias de glicósido hidrolasa aplicada en esta divulgación sigue el concepto de Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (1999) CAZy - servidor de enzimas activas de carbohidrato en URL: http: //afmb.cnrs-mrs.fr/~cazi/CAZi/index.html o alternativamente Coutinho, P.M. & Henrissat, B. 1999; The modular structure of cellulases and other carbohydrate-active enzymes: an integrated 50 database approach. En "Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation", K. Ohmiia, K. Hayashi, K. Sakka, Y. Kobayashi, S. Karita y T. Kimura eds., Uni Publishers Co., Tokyo, págs. 15-23. 15-23 y Bourne, Y. & Henrissat, B. 2001; Glycoside hydrolases and glycosyltransferases: families and functional modules, Current Opinion in Structural Biology 11:593-600.

55

[0067] Ejemplos de enzimas que comprenden un CBM adecuado para usar en el contexto de la invención son alfa-amilasas, alfa-amilasas maltogénicas, celulasas, xilanasas, mananasas, arabinofuranosidasas, acetilesterasas y quitinasas. Además CBM de interés en relación a la presente invención incluyen CBM que derivan de glucoamilasas (EC 3.2.1.3) o de CGTasas (EC 2.4.1.19).

60

[0068] CBM que derivan de fuentes fúngicas, bacterianas o vegetales generalmente servirán para usar en el híbrido de la invención. Son preferidos los CBM de origen fúngico. A este respecto, técnicas adecuadas para el aislamiento de los genes pertinentes se conocen bien en la técnica.

[0069] Preferidos son híbridos que comprenden un CBM de módulo de unión a carbohidratos de Familia 20, 21 o 65 25. CBM de módulo de unión a carbohidratos de Familia 20 adecuados para la invención se pueden derivar de

glucoamilasas de Aspergillus awamori (SWISSPROT Q12537), Aspergillus kawachii (SWISSPROT P23176), Aspergillus niger (SWISSPROT P04064), Aspergillus oryzae (SWISSPROT P36914), de alfa-amilasas de Aspergillus kawachii (EMBL:#AB008370), Aspergillus nidulans (NCBI AAF17100.1), de beta-amilasas de Bacillus cereus (SWISSPROT P36924), o de CGTasas de Bacillus circulans (SWISSPROT P43379). Preferido es un CBM de la alfa-amilasa de Aspergillus kawachii (EMBL:#AB008370) al igual que CBM que tienen al menos 60%, 5 al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o incluso al menos 95% de homología al CBM de la alfa-amilasa de Aspergillus kawachii (EMBL:#AB008370). CBM más preferidos incluyen los CBM de la glucoamilasa de Hormoconis sp. tal como de Hormoconis resinae (Sin. Creosote fungus o Amorphotheca resinae) tal como el CBM de SWISSPROT:Q03045, de Lentinula sp. tal como de Lentinula edodes (seta shiitake) tal como el CBM de SPTREMBL:Q9P4C5, de Neurospora sp. tal como de Neurospora 10 crassa tal como el CBM de SWISSPROT:P14804, de Talaromyces sp. tal como de Talaromyces bissoclamidioides, de Geosmithia sp. tal como de Geosmithia cilindrospora, de Scorias sp. tal como de Scorias spongiosa, de Eupenicillium sp. tal como de Eupenicillium ludwigii, de Aspergillus sp. tal como de Aspergillus japonicus, de Penicillium sp. tal como de Penicillium cf. miczynskii, de Thysanophora sp., y de Humicola sp. tal como de Humicola grisea var. thermoidea tal como el CBM de SPTREMBL:Q12623. 15

[0070] Preferiblemente el híbrido comprende un CBM que es derivado de cualquier familia o especies seleccionadas del grupo consistente en Acremonium, Aspergillus, Athelia, Coniochaeta, Cryptosporiopsis, Dichotomocladium, Dinemasporium, Diplodia, Gliocladium, Leucopaxillus, Malbranchea, Meripilus, Nectria, Pachykytospora, Penicillium, Rhizomucor, Rhizomucor pusillus, Streptomyces, Subulispora, Thermomyces, 20 Trametes, Trichophaea saccata y Valsaria. El CBM también se puede derivar de una planta, por ejemplo, de maíz (por ejemplo, Zea mays) o una bacteria, por ejemplo, Bacillus. De forma más preferible el híbrido comprende un CBM derivado de cualquier especie seleccionada del grupo consistente en Acremonium sp., Aspergillus kawachii, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Athelia rolfsii, Bacillus flavothermus, Coniochaeta sp., Cryptosporiopsis sp., Dichotomocladium hesseltinei, Dinemasporium sp., Diplodia sp., Gliocladium sp., 25 Leucopaxillus gigantus, Malbranchea sp, Meripilus giganteus, Nectria sp., Pachykytospora papairacea, Penicillium sp., Rhizomucor pusillus, Streptomyces termocianeoviolaceus, Streptomyces limosus, Subulispora provurvata, Thermomyces lanuginosus, Trametes cingulata, Trametes corrugata, Trichophaea saccata, Valsaria rubricosa, Valsario spartii y Zea mays.

30

[0071] Preferiblemente el híbrido comprende una secuencia de aminoácidos de CBM seleccionada del grupo consistente en los CBM enumerados en la tabla 1 o 2.

[0072] De la forma más preferible el híbrido comprende un CBM de una glucoamilasa seleccionada del grupo consistente en Pachykytospora papairacea (SEC ID nº: 76), Trametes cingulata (SEC ID nº: 78), Leucopaxillus 35 gigantus (SEC ID nº: 80), Athelia rolfsii (SEC ID nº: 92), Aspergillus kawachii (SEC ID nº: 94), Aspergillus niger (SEC ID nº: 96) o de una alfa-amilasa seleccionada del grupo consistente en Trichopheraea saccata (SEC ID nº: 52), Subulispora provurvata (SEC ID nº: 82), Valsaria rubricosa (SEC ID nº: 84), Acremonium sp. (SEC ID nº: 86), Meripilus giganteus (SEC ID nº: 88), Bacillus flavothermus (SEC ID nº: 90), Coniochaeta sp. (SEC ID nº: 98), Zea mays (SEC ID nº: 109), Coniochaeta sp. (SEC ID nº: 137), Trametes corrugata (SEC ID nº: 139), Valsario spartii 40 (SEC ID nº: 141) y Penicillium sp. (SEC ID nº: 143).

[0073] En otra forma de realización preferida la enzima híbrida tiene una secuencia CBM que difiere de unas secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo consistente en SEC ID nº: 52, SEC ID nº: 76, SEC ID nº: 78, SEC ID nº: 80, SEC ID nº: 82, SEC ID nº: 84, SEC ID nº: 86, SEC ID nº: 88, SEC ID nº: 90, SEC ID nº: 92, SEC 45 ID nº: 94, SEC ID nº: 96, SEC ID nº: 98, SEC ID nº: 109, SEC ID nº: 137, SEC ID nº: 139, SEC ID nº: 141 y SEC ID nº: 143 en no más de 10 posiciones, no más de 9 posiciones, no más de 8 posiciones, no más de 7 posiciones, no más de 6 posiciones, no más de 5 posiciones, no más de 4 posiciones, no más de 3 posiciones, no más de 2 posiciones, o incluso no más de 1 posición.

50

[0074] También preferidos son cualquier CBM codificado por una secuencia de ADN con al menos un 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o incluso al menos 95% de homología a cualquier secuencia seleccionada del grupo consistente en SEC ID nº: 75, SEC ID nº: 77, SEC ID nº: 79, SEC ID nº: 81, SEC ID nº: 83, SEC ID nº: 85, SEC ID nº: 87, SEC ID nº: 89, SEC ID nº: 91, SEC ID nº: 93, SEC ID nº: 95, SEC ID nº: 97, SEC ID nº: 108, SEC ID nº: 136, SEC ID nº: 138, SEC ID nº: 140 y SEC ID nº: 142. Más preferido según la 55 divulgación es cualquier CBM codificado por una secuencia de ADN que se hibrida bajo astringencia alta, media o baja a cualquier secuencia de ADN seleccionada del grupo consistente en SEC ID nº: 75, SEC ID nº: 77, SEC ID nº: 79, SEC ID nº: 81, SEC ID nº: 83, SEC ID nº: 85, SEC ID nº: 87, SEC ID nº: 89, SEC ID nº: 91, SEC ID nº: 93, SEC ID nº: 95, SEC ID nº: 97, SEC ID nº: 108, SEC ID nº: 136, SEC ID nº: 138, SEC ID nº: 140 y SEC ID nº: 142. 60

[0075] Otros CBM adecuados del módulo de unión a carbohidratos de Familia 20, 21 o 25 pueden ser encontrados en URL: http://afmb.cnrs-mrs.fr/~cazy/CAZY/index.html).

[0076] Una vez que una secuencia de nucleótidos que codifica la región de unión a sustratos (unión a 65 carbohidratos) ha sido identificada, bien como ADNc o ADN cromosómico, puede luego ser manipulada en una

variedad de vías para fusionarla a una secuencia de ADN que codifica el polipéptido de interés. El fragmento de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de unión a carbohidratos y el ADN que codifica el polipéptido de interés son luego ligados con o sin un enlazador. El ADN ligado resultante puede luego ser manipulado en una variedad de vías para conseguir la expresión.

5

Formas de realización particulares

[0077] En una forma de realización preferida, el polipéptido comprende un CDM derivado de Athelia rolfsii, Pachykytospora papairacea, Valsaria rubricosa o Meripilus giganteus. Preferidos son cualquier polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos CBM seleccionada del grupo que consiste en glucoamilasa Athelia 10 rolfsii (SEQ ID nº: 92), la glucoamilasa Pachykytospora papairacea (SEQ ID nº: 76), la alfa-amilasa Valsaria rubricosa (SEQ ID nº: 84) y la alfa-amilasa Meripilus giganteus (SEQ ID nº: 88).

[0078] En una forma de realización preferida, el polipéptido comprende un módulo catalítico derivado de la alfa-amilasa Meripilus giganteus y/o un CBM derivado de A. rolfsii. En una forma de realización preferida particular, el 15 polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID nº: 102 o el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos con al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o incluso al menos 95% de homología a la secuencia de aminoácidos anteriormente mencionada.

[0079] En otra forma de realización preferida, el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de 20 cualquiera de las secuencias de aminoácidos de secuencia de aminoácidos mostradas en la SEQ ID nº: 102 en no más de 10 posiciones, no más de 9 posiciones, no más de 8 posiciones, no más de 7 posiciones, no más de 6 posiciones, no más de 5 posiciones, no más de 4 posiciones, no más de 3 posiciones, no más de 2 posiciones o incluso no más de 1 posición.

25

[0080] Preferidos también son cualquier polipéptido codificado por una secuencia de ADN con al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o incluso al menos 95% de homología a cualquier secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID nº: 102.

[0081] Otras formas de realización preferidas de los polipéptidos de la divulgación se muestran en la tabla 3, 4, 5 30 y 6 en la sección de ejemplos. Preferido también según la divulgación es cualquier polipéptido con al menos 70%, más preferiblemente al menos 80% e incluso más preferiblemente al menos 90% de homología a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos mostrados en tablas 1 a 7.

[0082] En una forma de realización preferida, el polipéptido comprende un CBM con al menos 75% de homología 35 a la glucoamilasa A. rolfsii CBM (SEQ ID nº: 92) y un dominio catalítico con al menos 75% de homología a un dominio catalítico seleccionado de la SEQ ID nº: 24. En una forma de realización más preferida, el polipéptido comprende la glucoamilasa A. rolfsii CBM (SEQ ID nº: 92) y un dominio catalítico seleccionado de SEQ ID nº: 24.

[0083] En una forma de realización preferida, el polipéptido comprende un dominio catalítico con al menos 75% 40 de homología al dominio catalítico de alfa-amilasa Meripilus giganteus (SEQ ID nº: 24) y un CBM con al menos 75% de homología a un CBM seleccionado del grupo que consiste en glucoamilasa Pachykytospora papairacea CBM en la SEQ ID nº: 145, la alfa-amilasa Valsaria rubricosa CBM en la SEQ ID nº: 84 y el Zea mays CBM en la SEQ ID nº: 109. En una forma de realización más preferida, el polipéptido comprende el dominio catalítico de alfa-amilasa Meripilus giganteus (SEQ ID nº: 24) y un CBM seleccionado del grupo consistente en glucoamilasa 45 Pachykytospora papairacea CBM en la SEQ ID nº: 145, la alfa-amilasa Valsaria rubricosa CBM en la SEQ ID nº: 84 y el Zea mays CBM en la SEQ ID nº: 109.

[0084] En una forma de realización particular de la divulgación, el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en V001; V002; V003; V004; V005; V006; V007; V008; V009; V010; V011; V012; V013; V014; V015; 50 V016; V017; V018; V019; V021; V022; V023; V024; V025; V026; V027; V028; V029; V030; V031; V032; V033; V034; V035; V036; V037; V038; V039; V040; V041; V042; V043; V047; V048; V049; V050; V051; V052; V054; V055; V057; V059; V060; V061; V063; V064; V065; V066; V067; V068 y V069.

Vectores de expresión 55

[0085] La presente divulgación también se refiere a vectores de expresión recombinantes que pueden comprender una secuencia de ADN que codifica el polipéptido, un promotor, una secuencia de péptido señal y señales de parada transcripcional y traslacional. Las distintas secuencias de ADN y de control anteriormente descritas se pueden juntar para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o varios 60 sitios de restricción convenientes para permitir inserción o sustitución de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido en tales sitios. Alternativamente, la secuencia de ADN de la presente invención se puede expresar por inserción de la secuencia de ADN o un constructo de ADN comprendiendo la secuencia en un vector apropiado para la expresión. En la creación del vector de expresión, la secuencia codificante se localiza en el vector de modo que la secuencia codificante es operativamente enlazada con las secuencias de control 65 apropiadas para la expresión y posiblemente secreción.

[0086] El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus), que puede ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinante y pueden provocar la expresión de la secuencia de ADN. La elección del vector típicamente dependerá de la compatibilidad del vector con la célula huésped en que el vector debe ser introducido. Los vectores pueden ser plásmidos lineales o circulares 5 cerrados. El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma, un cósmido o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula huésped, se integra en el genoma y se replica con el(los) cromosoma(s) en 10 el(los) que ha sido integrado. El sistema de vector puede ser un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total para ser introducido en el genoma de la célula huésped, o un transposón.

Marcadores 15

[0087] Los vectores de la presente divulgación preferiblemente contienen uno o varios marcadores seleccionables, que permiten la selección fácil de células transformadas. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia biocida o vírica, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxótrofos y similares. 20

[0088] Ejemplos de marcadores seleccionables para usar en una célula huésped de hongo filamentoso se pueden seleccionar del grupo incluyendo, pero no limitado a, amdS (acetamidasa), argB (ornitina-carbamoiltransferasa), bar (fosfonitricina acetiltransferasa), hygB (higromicina fósforo- transferasa), niaD (nitrato-reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa), trpC (antranilato sintasa), y 25 marcadores de resistencia a glufosinato, al igual que equivalentes de otras especies. Preferidos para usar en una célula de Aspergillus son los marcadores amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el marcador bar de Streptomyces hygroscopicus. Además, la selección se puede realizar por cotransformación, por ejemplo, como se describe en WO 91/17243, donde el marcador seleccionable está en un vector separado.

30

[0089] Los vectores de la presente divulgación preferiblemente contienen un(os) elemento(s) que permite(n) la integración estable del vector en el genoma de la célula huésped o replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma de la célula.

[0090] Los vectores de la presente divulgación se pueden integrar en el genoma de la célula huésped cuando se 35 introducen en una célula huésped. Para integración, el vector puede depender de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de interés o cualquier otro elemento del vector para integración estable del vector en el genoma por recombinación homóloga o ninguna recombinación homóloga. Alternativamente, el vector puede contener secuencias de ADN adicionales para dirigir la integración por recombinación homóloga en el genoma de la célula huésped. Las secuencias de ADN adicionales permiten al vector ser integrado en el genoma de la célula 40 huésped en una(s) ubicación(es) precisa(s) en el(los) cromosoma(s). Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos integracionales deberían preferiblemente contener un número suficiente de ADN, tal como 100 a 1.500 pares de bases, preferiblemente 400 a 1.500 pares de bases, y de la forma más preferible 800 a 1.500 pares de bases, que son altamente homólogos a la secuencia objetivo correspondiente para mejorar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos integracionales 45 pueden ser cualquier secuencia que es homóloga a la secuencia meta en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos integracionales pueden ser secuencias de ADN no codificantes o codificantes. Por otro lado, el vector se puede integrar en el genoma de la célula huésped por recombinación no homóloga. Estas secuencias de ADN pueden ser cualquier secuencia que es homóloga a una secuencia meta en el genoma de la célula huésped, y, además, pueden ser secuencias no codificantes o codificantes. 50

[0091] Para replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permite al vector replicarse de manera autónoma en la célula huésped en cuestión.

[0092] El episoma que replica el vector plásmido AMA1 descrito en WO 00/24883 puede ser utilizado. 55

[0093] Más de una copia de una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de interés se puede insertar en la célula huésped para amplificar la expresión de la secuencia de ADN. La amplificación estable de la secuencia de ADN se puede obtener integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped usando métodos bien conocidos en la técnica y seleccionando transformantes. 60

[0094] Los procedimientos usados para enlazar los elementos anteriormente descritos para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son bien conocidos por un experto en la materia (ver, por ejemplo, Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor, Nueva York). 65

Células huésped

[0095] La célula huésped de la divulgación, que comprende un constructo de ADN o bien un vector de expresión comprendiendo la secuencia de ADN que codifica el polipéptido, es ventajosamente usada como una célula huésped en la producción recombinante del polipéptido, por ejemplo, una enzima híbrida, una enzima tipo salvaje 5 o una enzima de tipo salvaje genéticamente modificada. La célula se puede transformar con un vector de expresión. Alternativamente, la célula se puede transformar con el constructo de ADN de la invención codificando el polipéptido, por ejemplo, una enzima híbrida, una enzima de tipo salvaje o una enzima de tipo salvaje genéticamente modificada, integrando convenientemente el constructo de ADN (en una o varias copias) en el cromosoma huésped. La integración del constructo de ADN en el cromosoma huésped se puede realizar según 10 métodos convencionales, por ejemplo, por recombinación homóloga o heteróloga.

[0096] La célula huésped puede ser cualquier célula eucariota o procariótica apropiada, por ejemplo, una célula bacteriana, una célula de hongo filamentoso, una levadura, una célula vegetal o una célula mamífera.

15

[0097] En una forma de realización preferida, la célula huésped es un hongo filamentoso representado por los siguientes grupos de Ascomycota, incluyen, por ejemplo, Neurospora, Eupenicillium (=Penicillium), Emericella (=Aspergillus), Eurotium (=Aspergillus).

[0098] En una forma de realización más preferida, el hongo filamentoso incluye todas las formas filamentosas de 20 la subdivisión Eumycota y Oomycota (como se define por Hawksworth et al. En, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8ª Edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido. Los hongos filamentosos se caracterizan por un micelio vegetativo compuesto por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano, y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por alargamiento hifal y el catabolismo de carbono es estrictamente aeróbico. 25

[0099] En una forma de realización aún más preferida, la célula huésped de hongo filamentoso es una célula de una especie de, pero no limitada a una célula seleccionada del grupo consistente en una cepa de una especie de Aspergillus, preferiblemente Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus kawachii, o una cepa de Bacillus, o una cepa de Fusarium, tal como una cepa de Fusarium oxysporium, Fusarium 30 graminearum (en el estado perfecto llamada Gribberella zeae, anteriormente Sphaeria zeae, sinónimo con Gibberella roseum y Gibberella roseum f. sp. cerealis), o Fusarium sulphureum (en el estado perfecto llamada Gibberella puricaris, sinónimo con Fusarium trichothecioides, Fusarium bactridioides, Fusarium sambucium, Fusarium roseum, y Fusarium roseum var. graminearum), Fusarium cerealis (sinónimo con Fusarium crookwellense), o Fusarium venenatum. 35

[0100] En una forma de realización más preferida, la célula huésped de hongo filamentoso es una célula perteneciente a una cepa de una especie de Aspergillus, preferiblemente Aspergillus oryzae o Aspergillus niger.

[0101] La célula huésped de hongo filamentoso puede ser una célula huésped de hongo filamentoso de tipo 40 salvaje o una variante, un mutante o una célula huésped de hongo filamentoso genéticamente modificada. En una forma de realización preferida de la invención la célula huésped es una cepa carente de proteasa o proteasa negativa. También específicamente contempladas son las cepas de Aspergillus, tales como cepas de Aspergillus niger, genéticamente modificadas para interrumpir o reducir la expresión de glucoamilasa, alfa-amilasa estable en ácido, alfa-1,6 transglucosidasa, y actividades de proteasa. 45

Transformación de células huésped de hongo filamentoso

[0102] Células huésped de hongo filamentoso se pueden transformar por un proceso que implica la formación de protoplastos, transformación de los protoplastos, y regeneración de la pared celular en cierto modo conocido en 50 la técnica. Procedimientos adecuados para transformación de células huésped de Aspergillus están descritos en EP 238 023, EP 184 438, y Yelton et al. 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81:1470- 1474. Un método adecuado de transfomación de especies de Fusarium es descrito por Malardier et al. 1989, Gene 78:147-156 o patente de EEUU nº 6,060,305.

55

Aislamiento y clonación de una secuencia de ADN que codifica una alfa-amilasa progenitora

[0103] Las técnicas usadas para aislar o clonar una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de interés se conocen en la técnica e incluyen aislamiento de ADN genómico, preparación de ADNc, o una combinación de las mismas. La clonación de las secuencias de ADN de la presente invención de tal ADN genómico pueden ser 60 efectuadas, por ejemplo, usando la reacción en cadena de polimerasa (PCR) bien conocida o selección de anticuerpos de bibliotecas de expresión para detectar fragmentos de ADN clonado con características estructurales compartidas. Ver, por ejemplo, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Otros procedimientos de amplificación de ADN tal como reacción en cadena de la ligasa (LCR), transcripción activada ligada (LAT) y amplificación basada en la secuencia de ADN (NASBA) 65 pueden ser utilizados.

[0104] La secuencia de ADN que codifica una alfa-amilasa progenitora se puede aislar de cualquier célula o microorganismo que produce la alfa-amilasa en cuestión, usando varios métodos bien conocidos en la técnica. Primero, un ADN genómico y/o genoteca de ADNc debería ser construido utilizando ADN cromosómico o ARN mensajero del organismo que produce la alfa-amilasa que debe ser estudiada. Luego, si la secuencia de 5 aminoácidos de la alfa-amilasa es conocida, sondas oligonucleótidas marcadas pueden ser sintetizadas y usadas para identificar clones que codifican alfa-amilasa de una genoteca genómica obtenida a partir del organismo en cuestión. Alternativamente, una sonda de oligonucleótidos marcada que contiene homólogos de secuencias para otro gen de alfa-amilasa conocido podrían usarse como una sonda para identificar clones de codificación de alfa-amilasa, usando condiciones de hibridación y de lavado de astringencia muy baja a muy alta. 10

[0105] Otro método para identificar clones que codifican alfa-amilasa implicarían insertar fragmentos de ADN genómico en un vector de expresión, tal como un plásmido, transformar bacterias de alfa-amilasa negativas con la biblioteca de ADN genómico resultante, y luego colocar en placas las bacterias transformadas sobre agar conteniendo un sustrato para alfa-amilasa (es decir, maltosa), así permitiendo que los clones que expresan la 15 alfa-amilasa sean identificados.

[0106] Alternativamente, la secuencia de ADN que codifica el polipéptido se puede preparar sintéticamente por métodos estándares establecidos, por ejemplo, el método de fosforamidita descrito por S.L. Beaucage y Caruthers, (1981), Tetrahedron Letters 22, p. 1859-1869, o el método descrito por Matthes et al. (1984), EMBO J. 20 3, p. 801-805. En el método de fosforamidita, los oligonucleótidos son sintetizados, por ejemplo, en un sintetizador de ADN automático, purificados, apareados, ligados y clonados en vectores apropiados.

[0107] Finalmente, la secuencia de ADN puede ser de origen mezclado genómico y sintético, de origen mezclado sintético y de ADNc o de origen mezclado genómico y de ADNc, preparado ligando fragmentos de origen 25 sintético, genómico o de ADNc (según sea apropiado, los fragmentos corresponden con varias partes de la secuencia de ADN entera), conforme a técnicas estándares. La secuencia de ADN también se puede preparar por reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando cebadores específicos, por ejemplo como se describe en la patente de EEUU nº 4,683,202 o R.K. Saiki et al. (1988), Science 239, 1988, págs. 487-491.

30

Secuencia de ADN aislada

[0108] La presente divulgación se refiere, entre otras cosas, a una secuencia de ADN aislada que comprende una secuencia de ADN que codifica un polipéptido, por ejemplo, una enzima híbrida, una enzima de tipo salvaje o una enzima de tipo salvaje genéticamente modificada que incluye una secuencia de aminoácidos de un módulo 35 catalítico con actividad alfa-amilasa y una secuencia de aminoácidos de un módulo de unión a carbohidratos, donde el módulo catalítico es de origen fúngico.

[0109] El término "secuencia de ADN asilada" como se utiliza en este caso se refiere a una secuencia de ADN, que está esencialmente libre de otras secuencias de ADN, por ejemplo, al menos aproximadamente 20% pura, 40 preferiblemente al menos aproximadamente 40% pura, de forma más preferible al menos aproximadamente 60% pura, incluso de forma más preferible al menos aproximadamente 80% pura, y de la forma más preferible al menos aproximadamente 90% pura como se determina por electroforesis de agarosa.

[0110] Por ejemplo, una secuencia de ADN aislada se puede obtener por procedimientos de clonación 45 estandares usados en ingeniería genética para recolocar la secuencia de ADN desde su ubicación natural a un sitio diferente donde será reproducida. Los procedimientos de clonación pueden implicar escisión y aislamiento de un fragmento de ADN deseado comprendiendo la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de interés, inserción del fragmento en una molécula de vector, e incorporación del vector recombinante en una célula huésped donde copias múltiples o clones de la secuencia de ADN serán replicados. Una secuencia de ADN 50 aislada se puede manipular en una variedad de vías para proveer la expresión del polipéptido de interés. La manipulación de la secuencia de ADN antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar secuencias de ADN utilizando métodos de ADN recombinante se conocen bien en la técnica.

55

Constructo de ADN

[0111] La presente divulgación se refiere, entre otras cosas, a un constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica un polipéptido, por ejemplo, una enzima híbrida que comprende una primera secuencia de aminoácidos que comprende un módulo catalítico con actividad de alfa-amilasa y una segunda 60 secuencia de aminoácidos que comprende un módulo de unión a carbohidratos o una enzima de tipo salvaje que comprende una primera secuencia de aminoácidos que comprende un módulo catalítico con actividad de alfa-amilasa y una segunda secuencia de aminoácidos que comprende un módulo de unión a carbohidratos. "Constructo de ADN" se define aquí como una molécula de ADN, bien uni- o bicatenario, que es aislado de un gen de origen natural o que ha sido modificado para contener segmentos de ADN, que se combinan y se 65 superponen en cierto modo, que de lo contrario no existirían en la naturaleza. El término constructo de ADN es

sinónimo con el término casete de expresión cuando el constructo de ADN contiene todas las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia codificante de la presente invención.

Mutagénesis dirigida al sitio

5

[0112] Una vez una secuencia de ADN que codifica la alfa-amilasa progenitora ha sido aislada, y los sitios deseables para mutación identificados, las mutaciones se pueden introducir utilizando oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos contienen secuencias de nucleótidos que flanquean los sitios de mutación deseados. En un método específico, un gap monocatenario de ADN, la secuencia que codifica alfa-amilasa, se crea en un vector que lleva el gen de alfa-amilasa. Luego el nucleótido sintético, que lleva la mutación deseada, se aparea a 10 una parte homóloga del ADN monocatenario. El espacio restante es luego rellenado con ADN polimerasa I (fragmento Klenow) y la construcción es ligada usando T4 ligasa. Un ejemplo específico de este método es descrito en Morinaga et al. (1984), Biotechnology 2, p. 646-639. La patente de EEUU nº 4,760,025 revela la introducción de oligonucleótidos que codifican mutaciones múltiples mediante la realización de alteraciones menores del casete. No obstante, una variedad incluso superior de mutaciones se pueden introducir en cualquier 15 momento por el método Morinaga, porque una multitud de oligonucleótidos, de longitudes varias, pueden ser introducidos.

[0113] Otro método para introducir mutaciones en secuencias de ADN que codifican alfa-amilasa es descrito en Nelson y Long, (1989), Analytical Biochemistry 180, p. 147-151. Implica la generación en 3 pasos de un 20 fragmento de PCR con la mutación deseada introducida usando una cadena de ADN químicamente sintetizada como uno de los cebadores en las reacciones de PCR. Del fragmento generado por PCR, un fragmento de ADN que lleva la mutación se puede aislar por escisión con endonucleasas de restricción y reinsertar en un plásmido de expresión.

25

Mutagénesis aleatoria localizada

[0114] La mutagénesis aleatoria puede estar ventajosamente localizada en una parte de la alfa-amilasa progenitora en cuestión. Esto puede, por ejemplo, ser ventajoso cuando ciertas regiones de la enzima han sido identificadas por ser de importancia particular para una propiedad dada de la enzima, y cuando se modifican se 30 prevé que resultan en una variante con propiedades mejoradas. Tales regiones pueden normalmente ser identificadas cuando la estructura terciaria de la enzima original ha sido dilucidada y relacionada con la función de la enzima.

[0115] La mutagénesis aleatoria localizada o específica de la región, es convenientemente realizada usando 35 técnicas de mutagénesis generada por PCR como se ha descrito anteriormente o cualquier otra técnica adecuada conocida en la técnica. Alternativamente, la secuencia de ADN que codifica la parte de la secuencia de ADN que va a ser modificada puede ser aislada, por ejemplo, por inserción en un vector adecuado, y dicha parte puede ser posteriormente sometida a mutagénesis usando cualquiera de los métodos de mutagénesis mencionados anteriormente. 40

Variantes de enzimas híbridas o de tipo salvaje

[0116] El rendimiento en un proceso de degradación de almidón de una enzima de tipo salvaje o híbrida que comprende un módulo de unión a carbohidratos ("CBM") y un módulo catalítico de alfa-amilasa se puede mejorar 45 a través de ingeniería de proteínas, tal como por mutagénesis dirigida al sitio, por mutagénesis aleatoria localizada, preparando sintéticamente una variante nueva de la enzima progenitora de tipo salvaje o enzima híbrida progenitora, o por cualquiera de las otras técnicas de ingeniería de proteínas adecuadas.

[0117] Las variantes se pueden producir utilizando técnicas de ingeniería de proteínas convencionales. 50

Expresión de los polipéptidos en una célula huésped

[0118] La secuencia de nucleótidos que debe ser introducida en el ADN de la célula huésped se puede integrar en constructos de ácidos nucleicos comprendiendo la secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a una o 55 varias secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula huésped adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control.

[0119] Una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido se puede manipular en una variedad de vías para proveer la expresión del polipéptido. La manipulación de la secuencia de nucleótidos antes de su inserción 60 en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar secuencias de nucleótidos utilizando métodos de ADN recombinante se conocen bien en la técnica.

[0120] La secuencia de control puede ser una secuencia del promotor apropiada, una secuencia de nucleótidos que se reconoce por una célula huésped para la expresión de la secuencia de nucleótidos. La secuencia del 65 promotor contiene secuencias de control transcripcionales, que median la expresión del polipéptido. El promotor

puede ser cualquier secuencia de nucleótidos que muestra actividad transcripcional en la célula huésped de elección incluyendo promotores mutantes, truncados, e híbridos, y se pueden obtener de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares bien homólogos o heterólogos a la célula huésped.

[0121] Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de 5 la presente invención, especialmente en una célula huésped bacteriana, son los promotores obtenidos del operón lac de E. coli, gen de agarasa de Streptomyces coelicolor (dagA), gen de levansucrasa de Bacillus subtilis (sacB), gen de alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL), gen de amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus (amyM), gen de alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), gen de penicilinasa de Bacillus licheniformis (penP), genes xylA y xylb de Bacillus, y gen de beta-lactamasa procariótica (Villa-Kamaroff 10 et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731), al igual que el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25). Otros promotores son descritos en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 1980,242: 74-94; y en Sambrook et al., 1989, supra.

15

[0122] Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de la presente invención en una célula huésped fúngica filamentosa son promotores obtenidos de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa-amilasa estable en ácido de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger o de Aspergillus awamori (glaA), lipasa de Rhizomucor miehei, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa fosfato 20 isomerasa de Aspergillus oryzae, acetamidasa de Aspergillus nidulans, y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), al igual que el promotor NA2-tpi (un híbrido de los promotores de los genes para alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae), y promotores mutantes, truncados, e híbridos de los mismos.

25

[0123] En un huésped de levadura, promotores útiles se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), galactocinasa de Saccharomyces cerevisiae (GAL1), alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP), y 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros promotores útiles para células huésped de levadura son descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488. 30

[0124] La secuencia de control también puede ser una secuencia de terminador de la transcripción adecuada, una secuencia reconocida por una célula huésped para terminar la transcripción. La secuencia de terminador es operativamente enlazada al término 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Cualquier terminador que es funcional en la célula huésped de elección se puede utilizar en la presente invención. 35

[0125] Terminadores preferidos para células huésped fúngicas filamentosas son obtenidos de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

40

[0126] Terminadores preferidos para células huésped de levadura son obtenidos de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae, y gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores útiles para células huésped de levadura son descritos por Romanos et al., 1992, supra.

45

[0127] La secuencia de control también puede ser una secuencia líder adecuada, una región no traducida de un ARNm que es importante para traslación por la célula huésped. La secuencia líder es operativamente enlazada al término 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Cualquier secuencia que es funcional en la célula huésped de elección se puede utilizar en la presente invención.

50

[0128] Líderes preferidos para células huéspedes fúngicas filamentosas son obtenidos de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans.

[0129] Líderes adecuados para células huéspedes de levadura son obtenidos de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), quinasa de 3-fosfoglicerato de Saccharomyces cerevisiae, alfa-factor de 55 Saccharomyces cerevisiae, y alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP).

[0130] La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia operativamente enlazada al término 3' de la secuencia de nucleótidos y que, cuando se transcribe, se reconoce 60 por la célula huésped como una señal para añadir residuos de poliadenosina al ARNm transcrito. Cualquier secuencia de poliadenilación que es funcional en la célula huésped de elección se puede utilizar en la presente invención.

[0131] Secuencias de poliadenilación preferidas para células huésped fúngicas filamentosas son obtenidas de los 65 genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilato sintasa de

Aspergillus nidulans, proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum, y alfa-glucosidasa de Aspergillus niger.

[0132] Secuencias de poliadenilación útiles para células huéspedes de levadura son descritas por Guo y Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990.

5

[0133] La secuencia de control también puede ser una región codificante del péptido señal que codifica para una secuencia de aminoácidos enlazada al término amino de un polipéptido y dirige el polipéptido codificado en la vía secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificante de la secuencia de nucleótidos puede intrínsecamente contener una región codificante del péptido señal naturalmente enlazado en el marco de lectura del movimiento con el segmento de la región de codificación que codifica el polipéptido segregado. 10 Alternativamente, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una región codificante del péptido señal que es foráneo a la secuencia codificante. La región codificante del péptido señal foráneo se puede requerir donde la secuencia codificante naturalmente no contiene una región codificante del péptido señal. Alternativamente, la región codificante del péptido señal foráneo puede simplemente reemplazar la región codificante del péptido señal natural para mejorar la secreción del polipéptido. No obstante, cualquier región 15 codificante del péptido señal que dirige el polipéptido expresado en la vía secretora de una célula huésped de elección se puede utilizar en la presente invención.

[0134] Regiones codificantes del péptido señal eficaces para células huéspedes bacterianas son las regiones codificantes del péptido señal obtenidas de los genes para amilasa maltogénica de Bacillus NCIB 11837, alfa-20 amilasa de Bacillus stearothermophilus, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamasa de Bacillus licheniformis, proteasas neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM), y prsA de Bacillus subtilis. Otros péptidos señal son descritos por Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

[0135] Regiones codificantes del péptido señal eficaces para células huéspedes fúngicas filamentosas son las 25 regiones codificantes del péptido señal obtenidas de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, celulasa de Humicola insolens, y lipasa de Humicola lanuginosa.

[0136] Péptidos señal útiles para células huésped de levadura son obtenidas de los genes para alfa-factor de 30 Saccharomyces cerevisiae e invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Otras regiones codificantes del péptido señal útiles son descritas por Romanos et al., 1992, supra.

[0137] La secuencia de control también puede ser una región codificante del propéptido que codifica para una secuencia de aminoácidos situada en el término amino de un polipéptido. El polipéptido resultante es conocido 35 como una proenzima o propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos). Un propolipéptido es generalmente inactivo y se puede convertir en un polipéptido activo maduro por escisión catalítica o autocatalítica del propéptido del propolipéptido. La región codificante del propéptido se puede obtener de los genes para proteasa alcalina de Bacillus subtilis (aprE), proteasa neutra de Bacillus subtilis (nprT), alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, y lacasa de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836). 40

[0138] Cuando tanto las regiones del péptido señal y del propéptido están presentes en el término amino de un polipéptido, la región del propéptido está situada junto al término amino de un polipéptido y la región del péptido señal está situada junto al término amino de la región del propéptido.

45

[0139] También puede ser deseable añadir secuencias reguladoras que permiten la regulación de la expresión del polipéptido relativa al crecimiento de la célula huésped. Ejemplos de sistemas reguladores son los que accionan la expresión del gen para ser activado o desactivado en respuesta a una sustancia química o estímulo físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Sistemas reguladores en sistemas procarióticos incluyen los sistemas del operador lac, tac, y trp. En la levadura, el sistema ADH2 o sistema GAL1 puede ser 50 utilizado. En hongos filamentosos, el promotor de TAKA alfa-amilasa, promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger, y promotor de glucoamilasa de Aspergillus oryzae se pueden utilizar como secuencias reguladoras. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son las que permiten la amplificación génica. En sistemas eucarióticos, estos incluyen el gen de dihidrofolato reductasa que se amplifica en presencia de metotrexato, y los genes de metalotioneína que se amplifican con metales pesados. En estos casos, la secuencia de nucleótidos que codifica 55 el polipéptido sería operativamente enlazada con la secuencia reguladora.

[0140] Las varias secuencias de nucleótidos y de control anteriormente descritas se pueden unir entre sí para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o varios sitios de restricción convenientes para permitir inserción o sustitución de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido en tales sitios. 60 Alternativamente, la secuencia de nucleótidos de la presente invención se puede expresar por inserción de la secuencia de nucleótidos o un constructo de ácidos nucleicos comprendiendo la secuencia en un vector apropiado para la expresión. En la creación del vector de expresión, la secuencia codificante se localiza en el vector de modo que la secuencia codificante es operativamente enlazada con las secuencias de control apropiadas para la expresión. 65

[0141] El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que puede ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinante y pueden provocar la expresión de la secuencia de nucleótidos. La elección del vector típicamente dependerá de la compatibilidad del vector con la célula huésped en que el vector debe ser introducido. Los vectores pueden ser plásmidos lineales o circulares cerrados. 5

[0142] El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma, o un cromosoma artificial.

10

[0143] El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula huésped, se integra en el genoma y se replica con el(los) cromosoma(s) en que ha sido integrado. Además, un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total que debe ser introducido en el genoma de la célula huésped, o un transposón puede ser utilizado. 15

[0144] Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen uno o varios marcadores seleccionables que permiten una selección fácil de células transformadas. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia biocida o vírica, resistencia para metales pesados, prototrofia para auxótrofos, y similares. 20

[0145] Marcadores adecuados para células huésped de levadura son ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, y URA3. Marcadores seleccionables para usar en una célula huésped fúngica filamentosa incluyen, pero de forma no limitativa, amdS (acetamidasa), argB (ornitina-carbamoiltransferasa), bar (fosfonitricina acetiltransferasa), hygB (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa), sC 25 (sulfato adeniltransferasa), trpC (antranilato sintasa), al igual que equivalentes de los mismos.

[0146] Preferidos para usar en una célula de Aspergillus son los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen bar de Streptomyces hygroscopicus.

30

[0147] Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen un elemento(s) que permite la integración estable del vector en el genoma de la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma.

[0148] Para integración en el genoma de la célula huésped, el vector puede depender la secuencia de 35 nucleótidos que codifica el polipéptido o cualquier otro elemento del vector para integración estable del vector en el genoma por recombinación homóloga o no homóloga. Alternativamente, el vector puede contener secuencias de nucleótidos adicionales para dirigir la integración por recombinación homóloga en el genoma de la célula huésped. Las secuencias de nucleótidos adicionales permiten que el vector sea integrado en el genoma de la célula huésped en una(s) ubicación(es) precisa(s) en el(los) cromosoma(s). Para aumentar la probabilidad de 40 integración en una ubicación precisa, los elementos integracionales deberían preferiblemente contener un número suficiente de nucleótidos, tal como 100 a 1.500 pares de bases, preferiblemente 400 a 1.500 pares de bases, y de la forma más preferible 800 a 1.500 pares de bases, que son altamente homólogos a la secuencia meta correspondiente para mejorar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia que es homóloga a la secuencia meta en el genoma de la célula huésped. 45 Además, los elementos integracionales pueden ser secuencias de nucleótidos codificantes o no codificantes. Por otro lado, el vector se puede integrar en el genoma de la célula huésped por recombinación no homóloga.

[0149] Para replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permite al vector replicarse de manera autónoma en la célula huésped en cuestión. Ejemplos de orígenes bacterianos de 50 replicación son los orígenes de replicación de los plásmidos pBR322; pUC19; pACYC177, y pACYC184 que permiten la replicación en E. coli, y pUB110; pE194; pTA1060, y pAMß1 permitiendo la replicación en Bacillus. Ejemplos de orígenes de replicación para usar en una célula huésped de levadura son el origen de replicación de 2 micras, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3, y la combinación de ARS4 y CEN6. El origen de replicación puede ser uno con una mutación que hace su funcionamiento termosensible en la célula huésped 55 (ver, por ejemplo, Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1433).

[0150] Más de una copia de una secuencia de nucleótidos de la presente invención se puede insertar en la célula huésped para aumentar la producción del producto génico. Un aumento en el número de copias de la secuencia de nucleótidos puede ser obtenido integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la 60 célula huésped o incluyendo un gen marcador seleccionable amplificable con la secuencia de nucleótidos donde células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable, y por tanto copias adicionales de la secuencia de nucleótidos, se pueden seleccionar por cultivo de las células en presencia del agente seleccionable apropiado.

65

[0151] Los procedimientos usados para enlazar los elementos anteriormente descritos para construcción de los

vectores de expresión recombinantes de la presente invención se conocen por un experto en la materia (ver, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

[0152] Células huéspedes: la presente invención también se refiere a un hongo de fermentación recombinante, o una célula huésped que comprende el constructo de ácidos nucleicos de la invención, que son ventajosamente 5 usados en la producción recombinante de los polipéptidos en el sitio. Un vector que comprende una secuencia de nucleótidos de la presente invención se introduce en una célula huésped de modo que el vector es mantenido como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico que se duplica como se ha descrito anteriormente.

10

[0153] La célula huésped es una célula fúngica. "Hongos" como se utiliza en este caso incluye el filo Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota y Zygomycota (como se define por Hawksworth et al., en, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) al igual que Oomycota (como se cita en el Hawksworth et al., 1995, supra, página 171) y todos los hongos mitospóricos (Hawksworth et al., 1995, supra). 15

[0154] En una forma de realización más preferida, la célula huésped fúngica es una célula fúngica filamentosa. "Hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (como se define por Hawksworth et al., 1995, supra). Los hongos filamentosos se caracterizan por una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano, y otros polisacáridos complejos. El crecimiento 20 vegetativo es por alargamiento hifal y el catabolismo de carbono es estrictamente aeróbico.

[0155] En una forma de realización preferida, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de hongos termofílicos o termotolerantes tales como una especie dentro de Ascomycotina, Basidiomycotina, Zygomycota o Chytridiomycota, en particular una especie en el grupo consistente en Chaetomium, Thermoascus, Malbranchea, 25 o Thielavia, tal como Thielavia terrestris o Trichophaea. Incluso de forma más preferible la célula huésped es una cepa de Trichophaea saccata o Humicola, tal como H.insolens.

[0156] Células fúngicas se pueden transformar por un proceso que implica la formación de protoplastos, transformación de los protoplastos, y regeneración de la pared celular en cierto modo conocido per se. 30 Procedimientos adecuados para transformación de células huésped de Aspergillus son descritos en EP 238 023 y Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474. Métodos adecuados para transformar especies de Fusarium son descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147- 156 y WO 96/00787. La levadura se puede transformar utilizando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abelson, J.N. y Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, 35 volumen 194, págs 182-187, Academic Press, Inc., New York ; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920.

Expresión de las enzimas en plantas

40

[0157] Una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de interés, tal como una enzima híbrida o una variante de una enzima de tipo salvaje o un híbrid de la presente invención, puede ser transformada y expresada en plantas transgénicas como se describe abajo.

[0158] La planta transgénica puede ser dicotiledónea o monocotiledónea para abreviar una dicot o una monocot. 45 Ejemplos de plantas monocot son hierbas, tales como hierbas de prados (poa pratense, Poa), hierba para forraje tal como Festuca, Lolium, césped templado, tal como Agrostis, y cereales, por ejemplo, trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo y maíz (maíz).

[0159] Ejemplos de plantas dicot son tabaco, legumbres, tales como altramuces, patata, remolacha azucarera, 50 guisante, judía y semilla de soja, y plantas crucíferas (familia Brassicaceae), tales como coliflor, colza y el organismo tipo tan cercanamente relacionado Arabidopsis thaliana.

[0160] Ejemplos de partes de planta son varilla, callo, hojas, raíz, frutas, semillas, y tubérculos al igual que los tejidos individuales que comprenden estas partes, por ejemplo, epidermis, mesófilo, parénquima, tejidos 55 vasculares, meristemas. En el presente contexto, los compartimentos celulares específicos de planta, tales como cloroplasto, apoplasto, mitocondria, vacuola, peroxisomas y citoplasma se consideran como parte de una planta. Además, cualquier célula vegetal, cualquiera que sea el origen del tejido, se considera como parte de planta. Asimismo, partes de planta tales como tejidos específicos y células aisladas para facilitar la utilización de la invención se consideran también partes de planta, por ejemplo, embriones, endospermas, aleurona y 60 revestimientos de semillas.

[0161] También están incluidas dentro del campo de la invención la progenie de tales plantas, partes de planta y células vegetales.

65

[0162] La planta transgénica o célula vegetal que expresa el polipéptido de interés se puede construir conforme a

métodos conocidos en la técnica. En resumen, la planta o célula vegetal se construye por incorporación de uno o varios constructos de expresión que codifican el polipéptido de interés en el genoma huésped de planta y propagan la planta modificada resultante o célula vegetal en una planta transgénica o célula vegetal.

[0163] Convenientemente, el constructo de expresión es un constructo de ADN que comprende un gen que 5 codifica el polipéptido de interés en la asociación operable con secuencias reguladoras apropiadas requeridas para la expresión del gen en la planta o parte de planta de elección. Además, el constructo de expresión puede comprender una etiqueta seleccionable útil para identificación de células huésped en las que se han integrado el constructo de expresión y secuencias de ADN necesarias para la introducción del constructo en la planta en cuestión (la último depende del método de introducción de ADN por ser usado). 10

[0164] La elección de secuencias reguladoras, tales como secuencias promotoras y terminadoras y opcionalmente secuencias de señal o tránsito se determina, por ejemplo, basándose en cuando, donde y como se desea expresar la enzima. Por ejemplo, la expresión del gen que codifica la enzima de la invención puede ser constitutiva o inducible, o puede ser tejido específico, desarrollable, fase y el producto génico puede estar dirigido 15 a un compartimento específico de célula, tejido o parte de planta tales como semillas u hojas. Secuencias reguladoras son, por ejemplo, descritas por Tague et al, Plant Phys., 86, 506, 1988.

[0165] Para la expresión constitutiva se pueden usar el 35S-CaMV, la ubiquitina-1 de maíz y el promotor de actina 1 de arroz (Franck et al. 1980. Cell 21: 285-294, Christensen AH, Sharrock RA and Quail 1992. Genes de 20 poliubiquitina de maíz: estructura, perturbación térmica de expresión y empalme de transcripción, y actividad promotora después de la transferencia a protoplastos por electroporación. Planta Mo. Biol. 18, 675-689.; Zhang W, McElroy D. y Wu R 1991, Analysis of rice Act1 5' region activity in transgenic rice plants. Plant Cell 3,1155-1165). Promotores organoespecíficos pueden, por ejemplo, ser un promotor de tejidos sumideros de almacenamiento tales como semillas, tubérculos de patata, y frutas (Edwards & Coruzzi, 1990. Annu. Rev. 25 Genet. 24: 275-303), o de tejidos sumidero metabólicos tales como meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol.

Biol. 24: 863-878), un promotor específico de semilla como la glutelina, prolamina, globulina o promotor de albúmina de arroz (Wu et al., Plant and Cell Physiology Vol. 39, nº 8 págs. 885-889 (1998), un promotor de Vicia faba de la legumbre B4 y el gen de proteína de semilla desconocida de Vicia faba descrito por Conrado U. et al, Journal of Plant Physiology Vol. 152, nº 6, pp. 708-711 (1998), un promotor de una proteína del cuerpo de aceite 30 de semilla (Chen et al., Plant and Cell Physiology, Vol. 39, nº 9, págs. 935-941 (1998), el promotor de napA de la proteína de almacenamiento Brassica napus, o cualquier otro promotor específico de semilla conocido en la técnica, por ejemplo, como se describe en WO 91/14772. Además, el promotor puede ser un promotor específico de hoja tal como el promotor de rbcs de arroz o tomate (Kyozuka et al., Plant Physiology, Vol. 102, nº 3, págs. 991-1000 (1993), el promotor de gen de adenina metiltransferasa del virus de chlorella (Mitra, A. and Higgins, 35 DW, Plant Molecular Biology, Vol. 26, nº 1, págs. 85-93 (1994), o el promotor de gen aldP de arroz (Kagaya et al., Molecular and General Genetics, Vol. 248, nº 6, págs. 668-674 (1995), o un promotor inducible por herida como el promotor de patata pin2 (Xu et al, Plant Molecular Biology, Vol. 22, nº 4, págs. 573-588 (1993). Asimismo, el promotor puede ser inducible por tratamientos abióticos tales como temperatura, sequía o alteraciones en la salinidad o inducidas por sustancias aplicadas exógenamente que activan el promotor, por 40 ejemplo, etanol, estrógenos, hormonas vetegales como etileno, ácido abscísico y ácido giberélico y metales pesados.

[0166] Un elemento intensificador del promotor se puede utilizar para conseguir expresión más alta de la enzima en la planta. Por ejemplo, el elemento intensificador del promotor puede ser un intrón que es colocado entre el 45 promotor y la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima. Por ejemplo, Xu et al. op cit revelan el uso del primer intrón del gen de actina de arroz 1 para mejorar la expresión.

[0167] El gen marcador seleccionable y cualquiera de las otras partes del constructo de expresión se pueden elegir de aquellos disponibles en la técnica. 50

[0168] El constructo de ADN se incorpora en el genoma vegetal según técnicas convencionales conocidas en la técnica, incluyendo transformación mediada por Agrobacterium, transformación mediada por virus, micro inyección, bombardeo de partícula, transformación biolística, y electroporación (Gasser et al, Science, 244,1293; Potrykus, Bio/Techn. 8, 535,1990; Shimamoto et al, Nature, 338, 274,1989). 55

[0169] Actualmente, la transferencia de gen mediado por Agrobacterium tumefaciens es el método de elección para generar las dicots transgénicas (para revisión Hooykas & Schilperoort, 1992, Plant Mol. Biol., 19: 15-38), y también puede usarse para transformar monocots, aunque frecuentemente se usan otros métodos de transformación para estas plantas. Actualmente, el método de elección para generar monocots transgénicas que 60 complementan la aproximación de Agrobacterium es bombardeo de partícula (partículas de tungsteno u oro microscópico recubiertas con el ADN en transfomación) de callos embrionarios o embriones en desarrollo (Christou, 1992, Plant J., 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin. Biotecnol., 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Un método alternativo para transformación de monocots se basa en transformación de protoplasto como se describe por Omirulleh S, et al., Plant Molecular Biology, Vol. 21, nº 3, 65 págs. 415-428 (1993).

[0170] Después de la transformación, los transformantes que han incorporado el constructo de expresión se seleccionan y regeneran en plantas enteras según métodos bien conocidos en la técnica. Frecuentemente el procedimiento de transformación se diseña para la eliminación selectiva de genes de selección bien durante la regeneración o en las siguientes generaciones usando, por ejemplo, cotransformación con dos constructos de T-5 ADN separados o escisión específica de sitio del gen de selección por una recombinasa específica.

Tratamiento de almidón

[0171] El polipéptido del primer, segundo y tercer aspecto se puede utilizar en un proceso para licuar almidón, 10 donde un sustrato de almidón granulado o gelatinizado se trata en el medio acuoso con la enzima híbrida. El polipéptido del primer, segundo y/o tercer aspecto también se puede usar en un proceso para sacarificación de un sustrato de almidón licuado. Un uso preferido está en un proceso de fermentación donde un sustrato de almidón es licuado y/o sacarificado en presencia del polipéptido del primer, segundo y/o tercer aspecto para producir glucosa y/o maltosa adecuada para conversión en un producto de fermentación por un organismo 15 fermentativo, preferiblemente una levadura. Tales procesos de fermentación incluyen un proceso para producir etanol para combustible o etanol potable (alcohol portátil), un proceso para producir una bebida, un proceso para producir compuestos orgánicos deseados, tales como ácido cítrico, ácido itacónico, ácido láctico, ácido glucónico, gluconato de sodio, gluconato de calcio, gluconato de potasio, glucono delta lactona, o eritorbato de sodio; cetonas; aminoácidos, tal como ácido glutámico (monoglutaminato de sodio), pero también compuestos 20 más complejos tales como antibióticos, tales como penicilina, tetraciclina; enzimas; vitaminas, tales como riboflavina, B12, beta-caroteno; hormonas, que son difíciles de producir sintéticamente.

[0172] El almidón por ser procesado puede ser una calidad de almidón altamente refinado, preferiblemente al menos una pureza de 90%, al menos 95%, al menos 97% o al menos 99,5% o puede ser un almidón más crudo 25 que contiene material que comprende grano entero molido incluyendo fracciones no amiláceas tales como residuos de germen y fibras. La materia prima, tal como grano entero, se muele en orden para descubrir la estructura y permitir el tratamiento ulterior. Dos procesos de la molienda se prefieren según la invención: molienda en seco y mojada. También se puede aplicar sémola de maíz, y sémola de maíz preferiblemente molida. 30

[0173] El grano molido seco además del almidón comprende cantidades significativas de compuestos de carbohidrato sin almidón. Cuando tal material heterogéneo se procesa por cocción de chorro frecuentemente solo se consigue una gelatinización parcial del almidón. Como los polipéptidos de la invención tienen una actividad alta hacia el almidón no gelatinizado los polipéptidos son aplicados ventajosamente en un proceso que 35 comprende almidón molido seco cocinado a chorro por licuefacción y/o sacarificación.

[0174] Además, debido a la actividad de hidrólisis superior del polipéptido del primer aspecto se reduce inmensamente la necesidad de glucoamilasa durante el paso de sacarificación. Esto permite la realización de sacarificación a niveles muy bajos de actividad de glucoamilasa y preferiblemente la actividad de glucoamilasa 40 está o bien ausente o presente, entonces presente en una cantidad de no más de o incluso menor que 0.5 AGU/g DS, de forma más preferible no más de o incluso menor que 0.4 AGU/g DS, incluso de forma más preferible no más de o incluso menor que 0.3 AGU/g DS, y de la forma más preferible menor que 0.1 AGU, de forma tal que no más de o incluso menor que 0.05 AGU/g DS de sustrato de almidón. Expresada en mg la proteína enzimática, la enzima que tiene actividad de glucoamilasa está o bien ausente o presente en una 45 cantidad de no más de o incluso menor que 0.5 mg EP/g DS, de forma más preferible no más de o incluso menor que 0.4 mg EP/g DS, incluso de forma más preferible no más de o incluso menor que 0.3 mg EP/g DS, y de la forma más preferible no más de o incluso menor que 0.1 mg EP/g DS, tal como no más de o incluso menor que 0.05 mg EP/g DS o no más de o incluso menor que 0.02 mg EP/g DS de sustrato de almidón. La glucoamilasa puede preferiblemente derivar de una cepa dentro de Aspergillus sp. Talaromyces sp., Pachykytospora sp. o 50 Trametes sp., de forma más preferible de Aspergillus niger, Talaromyces emersonii, Trametes cingulata o Pachykytospora papiracea.

[0175] Nuevamente debido a la actividad de hidrólisis superior del polipéptido del primer aspecto la necesidad de alfa-amilasa en el paso de licuefacción y/o sacarificación es inmensamente reducida. Expresado en mg de el 55 polipéptido de proteína enzimática del primer aspecto se puede dosificar en cantidades de no más de o incluso menor que 0.5 mg EP/g DS, de forma más preferible no más de o incluso menor que 0.4 mg EP/g DS, incluso de forma más preferible no más de o incluso menor que 0.3 mg EP/g DS, y de la forma más preferible no más de o incluso menor que 0.1 mg EP/g DS, tal como no más de o incluso menor que 0.05 mg EP/g DS o no más de o incluso menor que 0.02 mg EP/g DS de sustrato de almidón. El polipéptido del primer aspecto se puede dosificar 60 en cantidades de 0.05 a 10.0 AFAU/g DS, preferiblemente 0.1 a 5.0 AFAU/g DS, de forma más preferible de 0.25 a 2.5 AFAU/g DS de almidón. El proceso puede comprender; a) la puesta en contacto de un sustrato de almidón con un polipéptido que comprende un módulo catalítico con actividad de alfa-amilasa y un módulo de unión a carbohidratos, p. ej, el polipéptido del primer aspecto; b) incubación de dicho sustrato de almidón con dicho polipéptido durante un tiempo y a una temperatura suficiente para conseguir la conversión de al menos 90%, o al 65 menos 92%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, al

menos 99.5% p/p de dicho sustrato de almidón en azúcares fermentables; c) fermentación para producir un producto de fermentación, d) opcionalmente recuperación del producto de fermentación. Durante los pasos del proceso b) y/o c) una enzima con actividad de glucoamilasa está o bien ausente o presente en una cantidad de 0,001 a 2,0 AGU/g DS, de 0,01 a 1,5 AGU/g DS, de 0,05 a 1,0 AGU/g DS, de 0,01 a 0.5 AGU/g DS. Preferiblemente la enzima con actividad de glucoamilasa está o bien ausente o presente en una cantidad de no 5 más de o incluso menor que 0.5 AGU/g DS, de forma más preferible no más de o incluso menor que 0.4 AGU/g DS, incluso de forma más preferible no más de o incluso menor que 0.3 AGU/g DS, y de la forma más preferible no más de o incluso menor que 0.1 AGU, tal como no más de o incluso menor que 0.05 AGU/g DS de sustrato de almidón. Expresado en mg de proteína enzimática la enzima con actividad de glucoamilasa está o bien ausente o presente en una cantidad de no más de o incluso menor que 0.5 mg EP/g DS, de forma más preferible 10 no más de o incluso menor que 0.4 mg EP/g DS, incluso de forma más preferible no más de o incluso menor que 0.3 mg EP/g DS, y de la forma más preferible no más de o incluso menor que 0.1 mg EP/g DS, tal como no más de o incluso menor que 0.05 mg EP/g DS o no más de o incluso menor que 0.02 mg EP/g DS de sustrato de almidón. En el proceso el paso a, b, c, y/o d se puede realizar separada o simultáneamente.

15

[0176] En otro aspecto el proceso puede comprender; a) la puesta en contacto de un sustrato de almidón con una célula de levadura transformada para expresar un polipéptido que comprende un módulo catalítico con actividad de alfa-amilasa y un módulo de unión a carbohidratos, p. ej, el polipéptido del primer y/o segundo aspecto; b) incubación de dicho sustrato de almidón con dicha levadura durante un tiempo y a una temperatura suficiente para conseguir la conversión de al menos 90% p/p de dicho sustrato de almidón en azúcares 20 fermentables; c) fermentación para producir etanol; d) opcionalmente recuperación de etanol. Los pasos a, b, y c se pueden realizar separada o simultáneamente.

[0177] En otro aspecto adicional el proceso que comprende la hidrólisis de un lodo de almidón granulado o gelatinizado, en particular hidrólisis de almidón granulado en un hidrolizado de almidón soluble a una 25 temperatura inferior a la temperatura de gelatinización inicial de dicho almidón granulado. Además de ser contactado con un polipéptido que comprende un módulo catalítico con actividad de alfa-amilasa y un módulo de unión a carbohidratos, por ejemplo, el polipéptido del primer aspecto, el almidón se puede contactar con una enzima seleccionada del grupo consistente en; una alfa-amilasa fúngica (EC 3.2.1.1), una beta-amilasa (E.C. 3.2.1.2), y una glucoamilasa (E.C.3.2.1.3). En una forma de realización adicional se pueden añadir una alfa-30 amilasa bacteriana o una enzima desramificante, tal como una isoamilasa (E.C. 3.2.1.68) o unas pululanasas (E.C. 3.2.1.41). En el contexto de la presente invención una alfa-amilasa bacteriana es una alfa-amilasa tal y como se define en WO 99/19467 en la página 3, línea 18 a página 6, línea 27.

[0178] En una forma de realización el proceso se realiza a una temperatura inferior a la temperatura de 35 gelatinización inicial.

Preferiblemente la temperatura en la que los procesos son realizados es al menos 30°C, al menos 31°C, al menos 32°C, al menos 33°C, al menos 34°C, al menos 35°C, al menos 36°C, al menos 37°C, al menos 38°C, al menos 39°C, al menos 40°C, al menos 41°C, al menos 42°C, al menos 43°C, al menos 44°C, al menos 45°C, al menos 46°C, al menos 47°C, al menos 48°C, al menos 49°C, al menos 50°C, al menos 51°C, al menos 52°C, al 40 menos 53°C, al menos 54°C, al menos 55°C, al menos 56°C, al menos 57°C, al menos 58°C, al menos 59°C, o preferiblemente al menos 60°C. El pH en el que se realiza el proceso puede estar en la gama de 3.0 a 7.0, preferiblemente de 3.5 a 6.0, o de forma más preferible de 4.0-5.0. En una forma de realización preferida el proceso comprende fermentación, p. ej con una levadura para producir etanol, por ejemplo, a una temperatura alrededor de 32°C, tal como de 30 a 35°C. 45

[0179] En otra forma de realización preferida el proceso comprende sacarificación y fermentación simultáneas , p. ej con una levadura para producir etanol, u otro organismo de fermentación adecuado para producir un compuesto orgánico deseado, tal como a una temperatura de 30 a 35°C, por ejemplo, a alrededor de 32°C.

50

[0180] En los procesos de fermentación anteriores el contenido de etanol alcanza al menos 7%, al menos 8%, al menos 9%, al menos 10%, al menos 11%, al menos 12%, al menos 13%, al menos 14%, al menos 15% tal como al menos 16% etanol.

[0181] El lodo de almidón por ser usado en cualquiera de los aspectos anteriores puede tener 20-55% de 55 almidón granulado

sólido seco, preferiblemente 25-40% de almidón granulado sólido seco, de forma más preferible 30-35% de almidón granulado sólido seco. Después de ser contactado con el polipéptido que comprende un módulo catalítico con actividad de alfa-amilasa y un módulo de unión a carbohidratos, p. ej, el polipéptido del primer aspecto al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 60 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o preferiblemente al menos 99% de los sólidos secos del almidón granulado se convierten en un hidrolizado de almidón soluble.

[0182] En otra forma de realización preferida el polipéptido que comprende un módulo catalítico con actividad de 65 alfa-amilasa y un módulo de unión a carbohidratos, p. ej, el polipéptido del primer aspecto, se usa en un proceso

para licuefacción, sacarificación de un almidón gelatinizado, por ejemplo, pero no limitado a gelatinización por cocción de chorro. El proceso puede comprender fermentación para producir un producto de fermentación, por ejemplo, etanol. Tal proceso para producir etanol a partir de material que contiene almidón por fermentación comprende: (i) licuar dicho material que contiene almidón con un polipéptido que comprende un módulo catalítico con actividad de alfa-amilasa y un módulo de unión a carbohidratos, p. ej, el polipéptido del primer aspecto; (ii) 5 sacarificar el macerado licuado obtenido; (iii) fermentar el material obtenido en el paso (ii) en presencia de un organismo de fermentación. Opcionalmente el proceso comprende además la recuperación del etanol. La sacarificación y fermentación se pueden realizar como un proceso de sacarificación y fermentación simultáneas (SSF proceso). Durante la fermentación el contenido de etanol alcanza al menos 7%, al menos 8%, al menos 9%, al menos 10% tal como al menos 11%, al menos 12%, al menos 13%, al menos 14%, al menos 15% tal 10 como al menos 16% de etanol.

[0183] El almidón por ser procesado en los procesos de los aspectos anteriores puede en particular ser obtenido de tubérculos, raíces, varillas, legumbres, cereales o grano entero. Más específicamente el almidón granulado puede ser obtenido de granos, mazorcas, trigo, cebada, centeno, sorgo, sagú, mandioca, tapioca, sorgo, arroz, 15 guisantes, judía, plátano o patatas. Especialmente contemplados están ambos tipos de maíz y cebada, cerosos y no cerosos.

[0184] La invención también se refiere a una composición que comprende el polipéptido del primer y/o segundo aspecto. En una forma de realización particularmente preferida, la composición comprende un polipéptido del 20 primer aspecto, siendo dicho polipéptido seleccionado del grupo consistente en V001; V002; V003; V004; V005; V006; V007; V008; V009; V010; V011; V012; V013; V014; V015; V016; V017; V018; V019; V021; V022; V023; V024; V025; V026; V027; V028; V029; V030; V031; V032; V033; V034; V035; V036; V037; V038; V039; V040; V041; V042; V043; V047; V048; V049; V050; V051; V052; V054; V055; V057; V059; V060; V061; V063; V064; V065; V066; V067; V068 y V069. La composición puede comprender además una enzima seleccionada del 25 grupo que comprende; una alfa-amilasa fúngica (EC 3.2.1.1), una beta-amilasa (E.C. 3.2.1.2), una glucoamilasa (E.C.3.2.1.3) y unas pululanasas (E.C. 3.2.1.41). La glucoamilasa puede preferiblemente derivar de una cepa de Aspergillus sp., tal como Aspergillus niger, o de una cepa de Talaromyces sp. y en particular derivada de Talaromyces leycettanus como la glucoamilasa descrita en la patente estadounidense nº. Re. 32, 153, Talaromyces duponti y/o Talaromyces thermopiles tales como las glucoamilasas descritas en la patente 30 estadounidense nº 4,587,215 y de forma más preferible derivada de Talaromyces emersonii. De la forma más preferible la glucoamilasa es derivada de la cepa Talaromyces emersonii CBS 793.97 y/o con la secuencia descrita como SEC ID nº: 7 en WO 99/28448. Más preferida es una glucoamilasa que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% o incluso al menos 95% de homología con la secuencia de aminoácidos ya mencionada. Una preparación comercial de Talaromyces 35 glucoamilasa se suministra por Novozymes A/S como combustible de SPIRIZYME.

[0185] También preferidos para una composición que comprende el polipéptido del primer y/o segundo aspecto y una glucoamilasa son los polipéptidos con actividad de glucoamilasa que se derivan de una cepa del género Trametes, preferiblemente Trametes cingulata. Más preferidos son los polipéptidos con actividad de glucoamilasa 40 y con al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% o incluso al menos 95% de homología con aminoácidos para aminoácidos de polipéptido maduro 1 a 575 de SEC ID nº: 5 en la solicitud de patente estadounidense nº 60/650,612.

[0186] También se prefieren para una composición que comprende el polipéptido del primer y/o segundo aspecto 45 y una glucoamilasa polipéptidos con actividad de glucoamilasa que son derivadas de una cepa del género Pachykytospora, preferiblemente, Pachykytospora papiracea o la cepa de E. coli depositada en DSMZ y a la que se ha dado el nº DSM 17105. Más preferidos son polipéptidos con actividad de glucoamilasa y que tienen al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% o incluso al menos 95% de homología con aminoácidos para aminoácidos 1 a 556 de polipéptido maduro de la SEC ID nº: 2 de en la solicitud de 50 patente estadounidense nº 60/650,612.

[0187] La composición anteriormente descrita se puede utilizar para licuar y/o sacarificar un almidón gelatinizado o granulado, al igual que un almidón parcialmente gelatinizado. Un almidón parcialmente gelatinizado es un almidón que hasta cierto punto es gelatinizado, es decir, donde parte del almidón está irreversiblemente 55 aumentada y gelatinizada y parte del almidón sigue estando presente en un estado granuloso.

[0188] La composición anteriormente descrita puede comprender preferiblemente alfa-amilasa ácida presente en una cantidad de 0,01 a 10 AFAU/g DS, preferiblemente 0,1 a 5 AFAU/g DS, de forma más preferible 0,5 a 3 AFAU/AGU, y de la forma más preferible 0,3 a 2 AFAU/g DS. La composición se puede aplicar en cualquiera de 60 los procesos de almidón anteriormente descritos.

Ejemplos

Materiales y métodos 65

Determinación de actividad de alfa-amilasa ácida

[0189] Cuando se usa según la presente invención la actividad de cualquier alfa-amilasa ácida se puede medir en AFAU (unidades de alfa-amilasa fúngica ácida), que se determinan con respecto a un estándar enzimático. 1 AFAU se define como la cantidad de enzima que degrada 5,260 mg sustancia seca de almidón por hora bajo las 5 condiciones estándar mencionadas abajo.

[0190] La alfa-amilasa ácida, es decir, la alfa-amilasa estable en ácido, una endo-alfa-amilasa (1,4-alfa- D-glucan-glucano-hidrolasa, E.C. 3,2,1,1) hidroliza enlaces alfa-1,4-glucosidicos en las regiones internas de la molécula de almidón para formar dextrinas y oligosacáridos con diferentes longitudes de cadena. La intensidad 10 de color formada con yodo es directamente proporcional a la concentración de almidón. La actividad de amilasa se determina utilizando colorimetría inversa como una reducción en la concentración de almidón bajo las condiciones analíticas especificas.

15

Condiciones estándar/condiciones de reacción:

Sustrato:

almidón soluble, aprox. 0.17 g/L

Tampón:

citrato, aprox. 0.03 M

Yodo (I2):

0.03 g/L

CaCl2:

1.85 mM

pH:

2.50 ± 0.05

Temperatura de incubación:

40°C

Tiempo de reacción:

23 segundos

Longitud de onda:

590 nm

Concentración enzimática:

0.025 AFAU/mL

Gama de trabajo de enzima:

0.01-0.04 AFAU/mL

20

[0191] Una carpeta EB-SM-0259,02/01 que describe este método analítico con más detalle está disponible bajo pedido a Novozymes A/S, Dinamarca, esta carpeta está incluida por la presente por referencia.

Actividad de glucoamilasa

25

[0192] La actividad de glucoamilasa se puede medir en las unidades de amiloglucosidasa (AGU). La AGU se define como la cantidad de enzima, que hidroliza 1 micromol de maltosa por minuto bajo las condiciones estándar 37°C, pH 4.3, sustrato: maltosa 23.2 mM, tampón: acetato 0.1 M, tiempo de reacción 5 minutos.

[0193] Se puede utilizar un sistema autoanalizador. La mutarotasa se añade al reactivo de glucosa 30 deshidrogenasa de modo que cualquier alfa-D-glucosa presente se convierte en beta-D-glucosa. La glucosa deshidrogenasa reacciona específicamente con beta-D-glucosa en la reacción mencionada anteriormente, formando NADH que se determina usando un fotómetro a 340 nm como una medida de la concentración de glucosa original.

35

Incubación de AMG:

Sustrato:

maltosa 23.2 mM

Tampón:

acetato 0.1 M

Ph:

4.30 ± 0.05

Incubación

37°C ± 1

Temperatura:

Tiempo de reacción:

5 minutos

Gama de trabajo de enzima:

0.5-4.0 AGU/mL

Reacción de color:

GlucDH:

430 U/L

Mutarotasa:

9 U/L

NAD:

0.21 mM

Tampón:

fosfato 0.12 M; 0.15 M NaCl

pH:

7.60 ± 0.05

Temperatura de incubación:

37°C ± 1

Tiempo de reacción:

5 minutos

Longitud de onda:

340 nm

[0194] Una carpeta (EB-SM-0131,02/01) que describe este método analítico con más detalle está disponible a solicitud de Novozymes A/S, Dinamarca, esta carpeta se incluye por la presente por referencia.

Cepas y plásmidos 5

[0195] E. coli DH12S (disponible de Gibco BRL) fue usado para rescate de plásmido de levadura.

[0196] pLA1 es un vector transportador de S. cerevisiae y E. coli bajo el control del promotor TPI, construido de pJC039 descrito en WO 01/92502. La secuencia de señal de alfa-amilasa ácida de Aspergillus niger, el gen de 10 alfa-amilasa ácida de Aspergillus niger (SEC ID nº: 1) y la secuencia parcial de genes de glucoamilasa Athelia rolfsii que comprende el enlazador (SEC ID nº: 67) y el CBM (SEC ID nº: 91) ha sido insertado. La secuencia completa del plásmido se da en SEC ID nº: 103. El gen de alfa-amilasa es la secuencia de 5029 a 6468, el enlazador es la secuencia de 6469 a 6501 y el CBM es la secuencia de 6502 a 6795. El vector fue usado para construcción híbrida de CBM de alfa-amilasa. 15

[0197] Saccharomyces cerevisiae YNG318: MATa Dpep4[cir+]] ura3-52, leu2-D2, his 4-539 fue usado para expresión de variantes de alfa-amilasa. Se describe en J. Biol. Chem. 272 (15), págs 9720- 9727, 1997.

Medios y sustratos 20

[0198]

10X solución Basal: base nitrogenada de levadura sin aminoácidos (Difco) 66.8 g/l, succinato 100 g/l, NaOH 60 g/l. 25

[0199] SC-Glucosa: 20% glucosa (es decir, una concentración final de 2% = 2 g/100ml)) 100 ml/l, 5% treonina 4 ml/l, 1% triptófano 10 ml/l, 20% ácidos de casamino 25 ml/l, 10 X solución basal 100 ml/l. La solución es esterilizada utilizando un filtro de un tamaño de poros de 0.20 micrómetros. Agar y H2O (aprox. 761 ml) se someten a autoclave juntos, y la solución de glucosa SC esterilizada separadamente se añade a la solución de 30 agar.

YPD: bacto-peptona 20 g/l, extracto de levadura 10 g/l, 20% glucosa 100 ml/l.

Solución PEG/LiAc: 40% PEG4000 50 ml, 5 M acetato de litio 1 ml

35

Manipulaciones de ADN

[0200] A menos que se declare lo contrario, las transformaciones y manipulaciones de ADN fueron realizadas utilizando métodos estándar de biología molecular como se describe en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al. (eds.), 40 "Current Protocols in Molecular Biology" John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R. and Cutting, S. M. (eds.).

Transformación de levadura

[0201] La transformación de levadura se efectuó por el método de acetato de litio. Mezcla 0.5 microL de vector 45 (digerida por endonucleasas de restricción) y 1 microL de fragmentos de PCR. Descongelar células competentes YNG318 en hielo. Mezclar 100 microL de las células, la mezcla de ADN y 10 microL de ADN portador (Clontech) en 12 ml de tubos de polipropileno (Falcon 2059). Añadir 0.6 ml de solución PEG/LiAc y mezclar suavemente. Incubar durante 30 min a 30°C, y 200 r.p.m. Incubar durante 30 min a 42°C (golpe de calor). Transferir a un tubo de eppendorf y centrifugar durante 5 seg. Eliminar el sobrenadante y reducir en 3 ml de YPD. Incubar la 50 suspensión celular durante 45 min a 200 r.p.m. a 30°C. Verter la suspensión en placas de glucosa SC e incubar a 30°C durante 3 días para hacer colonias. Se extrajo el ADN total de levadura por el método Robzyk y Kassir's descrito en Nucleic Acids Research, Vol. 20, nº 14 (1992) 3790.

Secuenciación de ADN 55

[0202] La transformación de E. coli para secuenciación del ADN se efectuó por electroporación (BIO-RAD Gen

pulser).

Los plásmidos de ADN fueron preparados por el método alcalino (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor) o con el equipo plásmido Qiagen®. Fragmentos de ADN fueron recuperados de gel de agarosa por el equipo de extracción de gel Qiagen.

El PCR fue realizado utilizando un motor de ADN PTC-200. El analizador genético de ABI PRISM™ 310 fue 5 usado para determinación de todas las secuencias de ADN.

Tabla 2

Aminoácido (AA) y números de secuencias de ADN de dominios catalíticos (CD), enlazadores, módulos de unión de carbohidrato (CBM), plásmidos, y cebadores aplicados. AA es alfa amilasa, GA es glucoamilasa.

Tipo

Código Origen de secuencia SEC ID

CD

C001 AA de Aspergillus niger SEC ID nº: 1 ADN

CD

C001 AA de Aspergillus niger SEC ID nº: 2 Aa

CD

C002 fungamyl de AA de Aspergillus oryzae SEC ID nº: 3 ADN

CD

C002 fungamyl de AA de Aspergillus oryzae SEC ID nº: 4 Aa

CD

C003 variante de fungamyl de AA de Aspergillus oryzae SEC ID nº: 5 ADN

CD

C003 variante de fungamil de AA de Aspergillus oryzae SEC ID nº: 6 Aa

CD

C004 AA de Trichophaea saccata SEC ID nº: 7 ADN

CD

C004 AA de Trichophaea saccata SEC ID nº: 8 Aa

CD

C005 AA de Subulispora provurvata SEC ID nº: 9 ADN

CD

C005 AA de Subulispora procurvata SEC ID nº: 10 Aa

CD

C006 AA de Valsaria rubricosa SEC ID nº: 11 ADN

CD

C006 AA de Valsaria rubricosa SEC ID nº: 12 Aa

CD

C007 AA de Thermomyces lanuginosus SEC ID nº: 13 ADN

CD

C007 AA de Thermomyces lanuginosus SEC ID nº: 14 Aa

CD

C008 AA de Acremonium sp. SEC ID nº: 15 ADN

CD

C008 AA de Acremonium sp. SEC ID nº: 16 Aa

CD

C009 AA de Malbranchea sp. SEC ID nº: 17 ADN

CD

C009 AA de Malbranchea sp. SEC ID nº: 18 Aa

CD

C010 AA de Rhizomucor pusillus SEC ID nº: 19 ADN

CD

C010 AA de Rhizomucor pusillus SEC ID nº: 20 Aa

CD

C011 AA de Dichotomocladium hesseltinei SEC ID nº: 21 ADN

CD

C011 AA de Dichotomocladium hesseltinei SEC ID nº: 22 Aa

CD

C012 AA de Meripilus giganteus SEC ID nº: 23 ADN

CD

C012 AA de Meripilus giganteus SEC ID nº: 24 Aa

CD

C013 AA de Stereum sp. SEC ID nº: 25 ADN

CD

C013 AA de Stereum sp. SEC ID nº: 26 Aa

CD

C014 Trametes sp. SEC ID nº: 27 ADN

CD

C014 Trametes sp. SEC ID nº: 28 Aa

CD

C015 AA de censores Coriolus SEC ID nº: 29 ADN

CD

C015 AA de censores Coriolus SEC ID nº: 30 Aa

CD

C016 AA de Dinemasporium sp. SEC ID nº: 31 ADN

CD

C016 AA de Dinemasporium sp. SEC ID nº: 32 Aa

CD

C017 AA de Cryptosporiopsis sp. SEC ID nº: 33 ADN

CD

C017 AA de Cryptosporiopsis sp. SEC ID nº: 34 Aa

CD

C018 AA de Coniochaeta sp. SEC ID nº: 35 ADN

CD

C018 AA de Coniochaeta sp. SEC ID nº: 36 Aa

CD

C020 AA de Diplodia sp. SEC ID nº: 37 ADN

CD

C020 AA de Diplodia sp. SEC ID nº: 38 Aa

CD

C021 AA de Nectria sp. SEC ID nº: 39 ADN

CD

C021 AA de Nectria sp. SEC ID nº: 40 Aa

CD

C022 AA de Gliocladium sp. SEC ID nº: 41 ADN

CD

C022 AA de Gliocladium sp. SEC ID nº: 42 Aa

CD

C023 AA de Streptomyces termocianeoviolaceus SEC ID nº: 43 ADN

CD

C023 AA de Streptomyces termocianeoviolaceus SEC ID nº: 44 Aa

Enlazador

C024 GA de pachykytospora papairacea SEC ID nº: 45 ADN

Enlazador

C024 GA de pachykytospora papairacea SEC ID nº: 46 Aa

Enlazador

C025 GA de Trametes cingulata SEC ID nº: 47 ADN

Enlazador

C025 GA de Trametes cingulata SEC ID nº: 48 Aa

Enlazador

C026 GA de Leucopaxillus gigantus SEC ID nº: 49 ADN

Enlazador

C026 GA de Leucopaxillus gigantus SEC ID nº: 50 Aa

Enlazador+CBM

C027 AA de Trichophaea saccata SEC ID nº: 51 ADN

Enlazador+CBM

C027 AA de Trichophaea saccata SEC ID nº: 52 Aa

Enlazador

C028 AA de Sublispora provurvata SEC ID nº: 53 ADN

Enlazador

C028 AA de sublispora provurvata SEC ID nº: 54 Aa

Enlazador

C029 AA de Valsaria rubricosa SEC ID nº: 55 ADN

Enlazador

C029 AA de Valsaria rubricosa SEC ID nº: 56 Aa

Enlazador

C030 AA de Acremonium sp. SEC ID nº: 57 ADN

Enlazador

C030 AA de Acremonium sp. SEC ID nº: 58 Aa

Enlazador

C031 AA de Meripilus giganteus SEC ID nº: 59 ADN

Enlazador

C031 AA de Meripilus giganteus SEC ID nº: 60 Aa

Enlazador

C032 AA de Bacillus flavothermus AA enlazador corto SEC ID nº: 61 ADN

Enlazador

C032 AA de Bacillus flavothermus enlazador corto SEC ID nº: 62 Aa

Enlazador

C033 AA de Bacillus flavothermus AA enlazador largo SEC ID nº: 63 ADN

Enlazador

C033 AA de Bacillus flavothermus AA enlazador largo SEC ID nº: 64 Aa

Enlazador

C034 AA de Bacillus flavothermus SEC ID nº: 65 ADN

Enlazador

C034 AA de Bacillus flavothermus SEC ID nº: 66 Aa

Enlazador

C035 GA de Athelia rolfsii SEC ID nº: 67 ADN

Enlazador

C035 GA de Athelia rolfsii SEC ID nº: 68 Aa

Enlazador

C036 GA de Aspergillus kawachii SEC ID nº: 69 ADN

Enlazador

C036 GA de Aspergillus kawachii SEC ID nº: 70 Aa

Enlazador

C037 GA de Aspergillus niger SEC ID nº: 71 ADN

Enlazador

C037 GA de Aspergillus niger SEC ID nº: 72 Aa

Enlazador

C038 AA de coniochaeta sp. SEC ID nº: 73 ADN

Enlazador

C038 AA de coniochaeta sp. SEC ID nº: 74 Aa

CBM

C039 GA de pachykytospora papairacea SEC ID nº: 75 ADN

CBM

C039 GA de pachykytospora papairacea SEC ID nº: 76 Aa

CBM

C040 GA de Trametes cingulata SEC ID nº: 77 ADN

CBM

C040 GA de Trametes cingulata SEC ID nº: 78 Aa

CBM

C041 GA de leucopaxillus gigantus SEC ID nº: 79 ADN

CBM

C041 GA de leucopaxillus gigantus SEC ID nº: 80 Aa

CBM

C042 AA de subulispora provurvata SEC ID nº: 81 ADN

CBM

C042 AA de subulispora provurvata SEC ID nº: 82 Aa

CBM

C043 AA de valsaria rubricosa SEC ID nº: 83 ADN

CBM

C043 AA de valsaria rubricosa SEC ID nº: 84 Aa

CBM

C044 AA de Acremonium sp. SEC ID nº: 85 ADN

CBM

C044 AA de Acremonium sp. SEC ID nº: 86 Aa

CBM

C045 AA de Meripilus giganteus SEC ID nº: 87 ADN

CBM

C045 AA de Meripilus giganteus SEC ID nº: 88 Aa

CBM

C046 AA de Bacillus flavothermus SEC ID nº: 89 ADN

CBM

C046 AA de Bacillus flavothermus SEC ID nº: 90 Aa

CBM

C047 GA de Athelia rolfsii SEC ID nº: 91 ADN

CBM

C047 GA de Athelia rolfsii SEC ID nº: 92 Aa

CBM

C048 GA de Aspergillus kawachii SEC ID nº: 93 ADN

CBM

C048 GA de Aspergillus kawachii SEC ID nº: 94 Aa

CBM

C049 GA de Aspergillus niger SEC ID nº: 95 ADN

CBM

C049 GA de Aspergillus niger SEC ID nº: 96 Aa

CBM

C050 coniochaeta sp. SEC ID nº: 97 ADN

CBM

C050 coniochaeta sp. SEC ID nº: 98 Aa

Híbrido

V051 híbrido de CD de variante de fungamyl y CBM de GA de A. rolfsii SEC ID nº: 99 ADN

Híbrido

V051 híbrido de CD de variante de fungamyl y CBM de GA de A. rolfsii SEC ID nº: 100 Aa

Híbrido

V019 híbrido de CD de AA de R. pusillus AA y CBM de GA de A. rolfsii SEC ID nº: 101 Aa

Híbrido

V022 híbrido de AA de M. giganteus AA y CBM de GA de A. rolfsii SEC ID nº: 102 Aa

Plásmido

pLA1 plásmido SEC ID nº: 103 ADN

Cebador

P001 cebador SEC ID nº: 104 ADN

Cebador

P002 Cebador SEC ID nº: 105 ADN

Cebador

P003 Cebador SEC ID nº: 106 ADN

Cebador

P004 Cebador SEC ID nº: 107 ADN

CBM

Zea mays SEC ID nº: 108 ADN

CBM

Zea mays SEC ID nº: 109 Aa

CD

C051 Termoascus sp. II SEC ID nº: 110 ADN

CD

C051 AA de Termoascus sp. II SEC ID nº: 111 Aa

CD

C055 AA de coniochaeta sp. II SEC ID nº: 112 ADN

CD

C055 AA de coniochaeta sp.II SEC ID nº: 113 Aa

CD

C052 AA de Nectria sp. SEC ID nº: ADN

114

CD

C052 AA de Nectria sp. SEC ID nº: 115 Aa

CD

C054 AA de Fusarium sp. SEC ID nº: 116 ADN

CD

C054 AA de Fusarium sp. SEC ID nº: 117 Aa

CD

C057 AA de corrugata Trametes SEC ID nº: 118 ADN

CD

C057 AA de corrugata Trametes SEC ID nº: 119 Aa

CD

C059 AA de Penicillium sp. SEC ID nº: 120 ADN

CD

C059 AA de Penicillium sp. SEC ID nº: 121 Aa

CD

C060 AA de valsaria spartii SEC ID nº: 122 ADN

CD

C060 AA de valsaria spartii SEC ID nº: 123 Aa

CD

C061 AA de Thermoascus aurantiacus SEC ID nº: 124 ADN

CD

C061 AA de Thermoascus aurantiacus SEC ID nº: 125 Aa

CD

C062 AA de Phanerochaete chrysosporium SEC ID nº: 126 ADN

CD

C062 AA de Phanerochaete chrysosporium SEC ID nº: 127 Aa

CD

C063 AA de Rhizopus oryzae SEC ID nº: 128 ADN

CD

C063 AA de Rhizopus oryzae SEC ID nº: 129 Aa

CD

C064 AA de thaminidium elegans SEC ID nº: 130 ADN

CD

C064 AA de thaminidium elegans SEC ID nº: 131 Aa

CD

C065 AA de absidia cristata SEC ID nº: 132 ADN

CD

C065 AA de absidia cristata SEC ID nº: 133 Aa

CD

C066 AA de Syncephalastrum racemosum SEC ID nº: 134 ADN

CD

C066 AA de Syncephalastrum racemosum SEC ID nº: 135 Aa

CBM

C067 AA de coniochaeta sp. SEC ID nº: 136 ADN

CBM

C067 AA de coniochaeta sp. SEC ID nº: 137 Aa

CBM

C068 AA de corrugata Trametes SEC ID nº: 138 ADN

CBM

C068 AA de corrugata Trametes SEC ID nº: 139 Aa

CBM

C069 AA de valsario spartii AA SEC ID nº: 140 ADN

CBM

C069 AA de valsario spartii SEC ID nº: 141 Aa

CBM

C070 AA de Penicillium sp. SEC ID nº: 142 ADN

CBM

C070 AA de Penicillium sp. SEC ID nº: 143 Aa

Enlazador

C072 AA de coniochaeta sp. SEC ID nº: 144 ADN

Enlazador

C072 AA de coniochaeta sp. SEC ID nº: 145 Aa

Enlazador

C073 AA de Trametes corrugata SEC ID nº: ADN

146

Enlazador

C073 AA de Trametes corrugata SEC ID nº: 147 Aa

Enlazador

C074 AA de valsario spartii SEC ID nº: 148 ADN

Enlazador

C074 AA de valsario spartii SEC ID nº: 149 Aa

Enlazador

C075 AA de Penicillium sp. SEC ID nº: 150 ADN

Enlazador

C075 AA de Penicillium sp. SEC ID nº: 151 Aa

CD

C077 AA de Streptomyces limosus SEC ID nº: 154 ADN

CD

C077 AA de Streptomyces limosus SEC ID nº: 155 Aa

Ejemplo 1: construcción de la secuencia de ácidos nucleicos V019, que codifica alfa amilasas de Rhizomucor pusillus y CBM de glucoamilasa de Athelia rolfsii

[0203] El vector pLA1 fue digerido con la endonucleasa de restricción apropiada para recortar la región que 5 codifica el dominio catalítico de alfa-amilasa de A. niger. El gen de alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus fue amplificado por PCR utilizando los cebadores P001 (SEC ID nº: 104) y P002 (SEC ID nº: 105), el fragmento amplificado se muestra como SEC ID nº: 19.

Sistema de reacción por PCR:

Condiciones:

38. 9 micro L

H2O 1 98°C 10 seg

5 micro L

10 X tampón de reacción 2 68°C 90 seg

1 micro L

Klen la de Taq (Clontech) 1-2 30 ciclos

4 micro L

10 mM dNTPs 3 68°C 10min

0.3micro L

X 2100 pmole/micro L Cebadores

0.5 micro L

Modelo de ADN

10

[0204] Fragmentos de ADN fueron recuperados de gel de agarosa por el equipo de extracción de gel Qiagen. Los fragmentos purificados resultantes fueron mezclados con la digestión del vector. La solución mezclada fue introducida en

Saccharomyces cerevisiae para construcción del plásmido de expresión pLAV019 por recombinación in vivo.

15

Ejemplo 2: construcción de la secuencia de ácidos nucleicos V022, que codifica alfa amilasa de Meripilus giganteus y CBM de glucoamilasa rolfsii de Athelia

[0205] El gen de alfa-amilasa de Meripilus giganteus fue amplificado por PCR utilizando los cebadores P003 (SEC ID nº: 106) y P004 (SEC ID nº: 107). 20

[0206] Los fragmentos de ADN fueron recuperados del gel de agarosa por el equipo de extracción de gel Qiagen.Los fragmentos purificados resultantes y el vector pLA1 digerido por endonucleasa de restricción apropiada para recortar la región que codifica el dominio catalítico de alfa-amilasa de A. niger fueron mezclados. La solución mezclada fue introducida en Saccharomyces cerevisiae para construcción del plásmido de expresión 25 pLAV022 por recombinación in vivo.

Ejemplo 3. expresión de amilasas con CBM en Aspergillus oryzae

[0207] Los constructos que comprenden los genes de alfa amilasa con CBM descritos en los ejemplos 1 y 2 30 fueron usados para construir los vectores de expresión, pAspV019 y pAspV022, respectivamente. Los dos plásmidos, pAspV019 y pAspV022, consisten en un casete de expresión basado en el promotor de amilasa II neutra de Aspergillus niger fusionado a la secuencia líder no traducida de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans (Pna2/tpi) y el terminador de amiloglicosidasa de Aspergillus niger (Tamg). También presente en el plásmido estaba el marcador amdS selectivo de Aspergillus de Aspergillus nidulans que permite el crecimiento 35 en la acetamida como única fuente de nitrógeno. Los plásmidos de expresión pAspV019 y pAspV022 fueron transformados en el Aspergillus como se describe en Lassen et al. (2001), Applied and Medioambiental Microbiology, 67,4701-4707. Los transformantes que expresan V019 y V022, fueron aislados, purificados y cultivados en frascos de agitación. Los caldos de cultivo de fermentaciones de Aspergillus oryzae que expresa amilasa con CBM fueron purificados por purificación de afinidad (Biochem. J. (2003) 372,905-910). 40

Ejemplo 4. Amilasas con CBM

[0208] Polipéptidos de la invención fueron producidos; una selección de dominios catalíticos fueron fusionados a la región de enlace CBM de glucoamilasa de Athelia rolfsii, y una selección de regiones CBM fueron unidas al dominio catalítico de Aspergillus oryzae C003 (una variante fungamyl PE).

[0209] Debido a que el CBM+enlazador de alfa-amilasa de Trichophaea saccata se localiza en el terminal N, se 5 insertó entre la señal SP288 y el dominio catalítico de Aspergillus oryzae. Los otros CBMs fueron todos colocados C-terminalmente.

[0210] La variante V008 comprendía tanto un enlazador colocado C-terminalmente como región CBM de glucoamilasa de Atelia rolfsii y un enlazador+CBM colocado N-terminalmente de alfa- amilasa de Trichophaea 10 saccata.

[0211] Variantes CBM de la alfa-amilasa de Aspergillus oryzae y variantes de dominio catalítico de glucoamilasa CBM de Athelia rolfsii se catalogan en las tablas 3 y 4 respectivamente. Otros polipéptidos producidos de la invención se catalogan en las tablas 5 y 6. 15

[0212] La variantes tienen actividad mejorada en el almidón, especialmente en el almidón granulado.

Tabla 3

20

Polipéptidos con dominio catalítico de variante fungamyl de AA de A. oryzae (SEC ID nº: 6)

Código

Enlazador y CBM de CBM Enlazador

V001

AA de sublispora provurvata SEC ID nº: 82 SEC ID nº: 54

V002

Valsaria rubricosa SEC ID nº: 84 SEC ID nº: 56

V003

AA de Acremonium sp. SEC ID nº: 86 SEC ID nº: 58

V004

GA de pachykytospora papairacea SEC ID nº: 76 SEC ID nº: 46

V005

Trametes cingulata SEC ID nº: 78 SEC ID nº: 48

V006

leucopaxillus gigantus SEC ID nº: 80 SEC ID nº: 50

V007

AA de Meripilus giganteus SEC ID nº: 88 SEC ID nº: 60

V008

AA de Trichophaea saccata (CBM21-Nterm incl. enlazador) SEC ID nº: 52

GA de +A. rolfsii (C-term)

SEC ID nº: 92 SEC ID nº: 68

V009

AA de Trichophaea saccata (CBM21-Nterm incl. enlazador) SEC ID nº: 52

V010

AA de Bacillus flavothermus con enlazador corto SEC ID nº: 90 SEC ID nº: 62

V011

AA de Bacillus flavothermus con enlazador largo SEC ID nº: 90 SEC ID nº: 64

V012

AA de Bacillus flavothermus SEC ID nº: 90 SEC ID nº: 66

Tabla 4

Polipéptidos con el enlazador de GA de A. rolfsii (SEC ID nº: 68) y CBM (SEC ID nº: 92)

Código

Módulo catalítico de: dominio catalítico de SEC ID

V013

AA de Trichophaea saccata SEC ID nº: 8

V014

AA de subulispora provurvata SEC ID nº: 10

V015

AA de valsaria rubricosa SEC ID nº: 12

V016

AA de Thermomyces lanuginosus SEC ID nº: 14

V017

AA de Acremonium sp. SEC ID nº: 16

V018

AA de malbranchea sp. SEC ID nº: 18

V019

AA de Rhizomucor pusillus SEC ID nº: 20

V021

AA de dichotomocladium hesseltinei SEC ID nº: 22

V022

AA de Meripilus giganteus SEC ID nº: 24

V023

stereum sp. SEC ID nº: 26

V024

AA de Streptomyces limosus SEC ID nº: 155

V025

censores Coriolus SEC ID nº: 30

V026

AA de dinemasporium sp. SEC ID nº: 32

V027

AA de cryptosporiopsis sp. SEC ID nº: 34

V028

AA de coniochaeta sp. SEC ID nº: 36

V029

AA de Diplodia sp. SEC ID nº: 38

V030

AA de nectria sp. SEC ID nº: 40

V031

AA de Gliocladium sp. SEC ID nº: 42

V032

AA de Streptomyces termocianeoviolaceus SEC ID nº: 44

V047

Termoascus sp. ll SEC ID nº: 111

V048

coniochaeta sp.2 SEC ID nº: 113

V049

AA de nectria sp. SEC ID nº: 115

V050

Fusarium sp. SEC ID nº: 117

V051

corrugata Trametes SEC ID nº: 119

V052

valsaria spartii SEC ID nº: 123

V054

Thermoascus aurantiacus SEC ID nº: 125

V055

Penicillium sp. SEC ID nº: 121

V057

Phanerochaete chrysosporium SEC ID nº: 127

V059

Rhizopus oryzae SEC ID nº: 129

V060

thaminidium elegans SEC ID nº: 131

V061

absidia cristata SEC ID nº: 133

V063

syncephalastrum racemosum SEC ID nº: 135

Tabla 5

Polipéptidos con otros dominios catalíticos /CBMs con enlazador. En V069 CBM y enlazador son de diferente origen.

Código

Dominio catalítico de: CD SEC ID nº CBM y enlazador de: Enlazador SEC ID nº CBM SEC ID nº

V033

AA de Acremonium sp. SEC ID nº: 16 GA de pachykytospora papairacea SEC ID nº: 46 SEC ID nº: 145

V034

AA de Rhizomucor pusillus SEC ID nº: 20 GA de pachykytospora papairacea SEC ID nº: 46 SEC ID nº: 145

V035

AA de Meripilus giganteus SEC ID nº: 24 GA de pachykytospora papairacea SEC ID nº: 46 SEC ID nº: 145

V036

AA de Meripilus giganteus SEC ID nº: 24 valsaria rubricosa SEC ID nº: 56 SEC ID nº: 84

V037

AA de Meripilus giganteus SEC ID nº: 24 AA de Meripilus giganteus SEC ID nº: 60 SEC ID nº: 88

V038

AA de Rhizomucor pusillus SEC ID nº: 20 GA de Aspergillus kawachii SEC ID nº: 70 SEC ID nº: 94

V039

AA de Rhizomucor pusillus SEC ID nº: 20 GA de Aspergillus niger SEC ID nº: 72 SEC ID nº: 96

V040

variante de fungamiy A. oryzae SEC ID de NO:06 Coniochaeta sp. AM603 SEC ID nº: 74 SEC ID nº: 98

V069

AA de Meripilus giganteus SEC ID nº: 24 Enlazador de GA de Zea mays CBM A. rolf SEC ID nº: 68 SEC ID nº: 109

Tabla 6 5

Polipéptidos con dominio catalítico de AA de Rhizomucor pusillus (SEC ID nº: 20) y CBM y enlazador de:

Código

CBM de CBM SEC ID nº Enlazador de SEC ID nº del enlazador

V041

GA de A. rolfsii SEC ID nº: 92 AA de A. kawachii SEC ID nº: 70

V042

GA de A. rolfsii SEC ID nº: 92 GA de A. niger SEC ID nº: 72

V043

Zea mays SEC ID nº: 109 GA de A. rolf SEC ID nº: 68

V064

coniochaeta sp. SEC ID nº: 113 coniochaeta sp. SEC ID nº: 145

V065

Trametes corrugata SEC ID nº: 119 Trametes corrugata SEC ID nº: 147

V066

Valsaria spartii SEC ID nº: 123 Valsaria spartii SEC ID nº: 149

V067

Penicillium sp. SEC ID nº: 121 Penicillium sp. SEC ID nº: 151

V068

Meripulus giganteus SEC ID nº: 88 Meripulus giganteus SEC ID nº: 60

Ejemplo 5

10

[0213] El rendimiento del polipéptido V019 fue evaluado en las fermentaciones de mini-escala con dosificaciones diferentes de glucoamilasa de Talaromyces emersonii. El sustrato de almidón, 583.3g de maíz molido se añadieron a 912.2 g de agua del grifo. Esta mezcla fue suplementada con 4.5 ml de un 1 g/L de solución de penicilina. El pH de este lodo fue ajustado a 5.0 con 40% H2SO4. El nivel de DS fue determinado por duplicado para ser 34.2 ± 0.8%. Aproximadamente 5 g de este lodo se añadió a 20 ml viales. Cada vial fue dosificado con 15 la cantidad apropiada de enzima seguido de la adición de 200 microL levadura de propagación/5 g lodo. Las dosificaciones reales estaban basadas en el peso exacto de lodo de maíz en cada vial. Los viales fueron incubados a 32°C. Las fermentaciones fueron seguidas por la medición de la pérdida de peso en el tiempo. A las 70 horas las fermentaciones fueron detenidas y preparadas por análisis de hPLC. La Preparación de hPLC consistía en parar la reacción por adición de 50 microL de 40% H2SO4, centrifugado, y filtración a través de un 20

filtro de 0.45 micrómetros. Las muestras que esperan el análisis de hPLC fueron almacenadas a 4°C.

Tabla 7

Rendimiento de polipéptido V019 en las fermentaciones a mini-escala. 70 hr de etanol con respecto a 0.14 AGU/DS y ninguna alfa-amilasa.

Dosis de amilasa (mg proteína/g DS)

Dosis de GA de T. emersonii (AGU/g DS) 70 hr etanol

0

0.14 1.00

0

0.50 1.35

0

0.86 1.73

0.05

Ninguna 3.69

0.05

0.14 3.69

0.05

0.50 3.73

0.05

0.86 3.73

5

Ejemplo 6

[0214] Los sustratos para sacarificación fueron preparados por disolución de un DE 11 de maltodextrina obtenida a partir de licuado de almidón de maíz con alfa-amilasa bacteriana termoestable (LIQUOZiME X™, Novozymes A/S) en el agua de milli-Q™, y ajustando el contenido de materia sólida seca (DS) a 30%. Los experimentos de 10 sacarificación fueron realizados en viales de cristal sellados de 2 ml a 60°C y pH inicial de 4.3 bajo agitación continua. Dos dosificaciones diferentes de alfa-amilasa de CBM V019 o V022 fueron aplicadas encima de un tratamiento estándar con 0.35 AGU/g DS de glucoamilasa de Talaromyces emersonii y 0.04 AFAU/g DS de alfa-amilasa ácida de A. niger.

15

[0215] Las muestras se tomaron a intervalos establecidos y se calentaron en agua en ebullición durante 15 minutos para inactivar las enzimas. Tras el enfriamiento, las muestras fueron diluidas a DS 5% y filtradas (Sartorius MINISART™ NML 0.2 micro-m), antes de ser analizadas por HPLC. Los niveles de glucosa como un % de carbohidrato soluble total se dan en la tabla 8 abajo.

20

Tabla 8

Todos los tratamientos con 0.35 AGU/g DS de glucoamilasa de Talaromyces emersonii y 0.04 AFAU/g DS de alfa-amilasa ácida A.niger.

DP1

Enzima adicional

Variantes de alfa-amilasa ácida AFAU/g DS 24 h 48 h 70 h

Control

0 81.5 90.2 93.1

V019

0.0875 95.7 96.2 95.6

0.1750 92.1 96.2 96.2

V022

0.0875 93.8 95.6 95.5

0.1750 92.9 95.9 96.0

Ejemplo 6

25

[0216] Los tratamientos SSF de almidón crudo fueron evaluados en las fermentaciones a mini-escala. Un 35% de sustancia seca de lodo de almidón granulado se obtuvo de la mezcla de 410 g de maíz finamente molido, 590 ml de agua del grifo, 3.0 mls 1 g/L penicilina y 1 g de urea. El lodo fue ajustado a pH 4.5 usando 5 N de NaOH y muestras de 5 g fueron distribuidas en viales de 20 ml. La cantidad apropiada de enzimas fue dosificada y los viales fueron inoculados con levadura. Los viales fueron incubados a 32°C. 9 fermentaciones de réplica de cada 30 tratamiento fueron llevadas a cabo. Tres réplicas fueron seleccionadas durante 24 horas, 48 horas y 70 horas de análisis de punto en el tiempo. Los viales fueron agitados a las 24,48 y 70 horas. El análisis en punto temporal consistió en pesar los viales y preparar la muestra para HPLC. Para hPLC la reacción fue detenida por adición de 50 microL de 40% H2SO4, centrifugado, y filtración a través de un filtro de 0.45 um. Las muestras esperando el análisis hPLC fueron almacenadas a 4°C. 35

Ejemplo 6a

[0217] Las enzimas y cantidades usadas se muestran en la tabla de debajo. A-AMG es una composición de glucoamilasa de Aspergillus niger. 40

Tabla 9

SSF de Almidón crudo con glucoamilasa de Aspergillus niger y V019, dosificación enzimática

Nº de prueba

% de dosis mg/gDS AGU/gDS AFAU/gDS

A-AMG

V019 A-AMG V019 A-AMG V019

2

100% 0% 0.5 0 0.95 0

3

90% 10% 0.45 0.01 0.855 0.01

4

80% 20% 0.4 0.02 0.76 0.02

5

70% 30% 0.35 0.03 0.665 0.03

6

60% 40% 0.3 0.04 0.57 0.04

7

45% 55% 0.225 0.055 0.4275 0.055

8

30% 70% 0.15 0.07 0.285 0.07

9

15% 85% 0.075 0.085 0.1425 0.085

10

0% 100% 0 0.1 0 0.1

[0218] El rendimiento de etanol bueno después de 70 horas de fermentación fue observado en la gama de 1,7-85,5 AGU/AFAU proporción de AMG de A. niger a V019, que indica rendimiento robusto en una gama amplia de 5 proporción de actividad para las mezclas de AMG de A. niger a V019.

Tabla 10

SSF de almidón crudo con glucoamilasa de Aspergillus niger y V019, resultados

Nº de prueba

AGU/gDS AFAU/gDS Rendimiento de etanol (g/l) proporción AGU/AFAU

A-AMG

V019 24hr 48hr 70hr

2

0.950 0.000 77.73 119.46 139.27 N/A

3

0.855 0.010 92.93 134.65 144.39 85.5

4

0.760 0.020 93.13 133.74 145.42 38.0

5

0.665 0.030 92.66 134.32 147.56 22.2

6

0.570 0.040 91.68 132.86 145.77 14.3

7

0.428 0.055 90.17 130.87 146.26 7.8

8

0.285 0.070 87.11 127.74 144.82 4.1

9

0.143 0.085 84.32 120.95 143.40 1.7

10

0.000 0.100 80.80 114.55 134.08 0.0

10

Ejemplo 6b

[0219] Las enzimas y cantidades usadas se muestran en la tabla de abajo. A-AMG es una composición de glucoamilasa de Talaromyces emersonii.

15

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1. Polipéptido híbrido que comprende una primera secuencia de aminoácidos que comprende un módulo catalítico con actividad de alfa-amilasa y una segunda secuencia de aminoácidos que comprende un módulo de unión a carbohidratos, donde dicha primera secuencia de aminoácidos tiene al menos 75% de identidad con la 5 SEQ ID nº: 24 y donde dicha segunda secuencia de aminoácidos tiene al menos un 75% de identidad con cualquier secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente en la SEQ ID nº: 52, SEQ ID nº: 76, SEQ ID nº: 78, SEQ ID nº: 80, SEQ ID nº: 82, SEQ ID nº: 84, SEQ ID nº: 86, SEQ ID nº: 90, SEQ ID nº: 92, SEQ ID nº: 94, SEQ ID nº: 96, SEQ ID nº: 98, SEQ ID nº: 109, SEQ ID nº: 137, SEQ ID nº: 139, SEQ ID nº: 141 y SEQ ID nº: 143. 10
2. 2. Polipéptido, según la reivindicación 1, donde una secuencia enlazadora está presente en una posición entre dicha primera y dicha segunda secuencia de aminoácidos, dicha secuencia enlazadora tiene al menos un 75% de identidad con cualquier secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consistee en la SEQ ID nº: 46, SEQ ID nº: 48, SEQ ID nº: 50, SEQ ID nº: 54, SEQ ID nº: 56, SEQ ID nº: 58, SEQ ID nº: 60, SEQ ID nº: 62, SEQ 15 ID nº: 64, SEQ ID nº: 66, SEQ ID nº: 68, SEQ ID nº: 70, SEQ ID nº: 72, SEQ ID nº: 74, SEQ ID nº: 145, SEQ ID nº: 147, SEQ ID nº: 149, SEQ ID nº: 151, y SEQ ID nº: 52.
3. 3. Composición que comprende un polipéptido, según cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

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4. 4. Proceso para la sacarificación de almidón, donde un almidón se trata con el polipéptido, según cualquiera de las reivindicaciones 1-2.
5. 5. Proceso, según la reivindicación 4, donde el almidón es almidón gelatinizado o granulado.

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6. 6. Proceso, según cualquiera de las reivindicaciones 4-5, donde el almidón sacarificado se contacta con un organismo fermentador para producir un producto de fermentación.
7. 7. Proceso, según la reivindicación 6, donde el organismo fermentador es una levadura y el producto de fermentación es etanol. 30
8. 8. Proceso que comprende:

   (a) contactar un almidón con un polipéptido que comprende un módulo catalítico con actividad de alfa-amilasa y un módulo de unión a carbohidratos, según cualquiera de las reivindicaciones 1-2;

   (b) incubación de dicho almidón con dicho polipéptido; 35

   (c) fermentación para producir un producto de fermentación,

   d) opcionalmente, recuperación del producto de fermentación,

   donde una enzima con actividad de glucoamilasa está ausente o presente en una cantidad de no más de o incluso menos del 0,5 AGU/g DS, más preferiblemente, no más de o incluso menos del 0,4 AGU/g DS, aún más preferiblemente, no más de o incluso menos del 0,3 AGU/g DS y, de la forma más preferible, no más de o incluso 40 menos del 0,1 AGU, tal como no más de o incluso menos del 0,05 AGU/g DS de sustrato de almidón y donde el paso a, b, c y/o d se puede realizar separadamente o simultáneamente.
9. 9. Proceso de producción de etanol de material que contiene almidón por fermentación, dicho proceso comprende: 45

   (i) licuefacción de dicho material que contiene almidón con un polipéptido que comprende un módulo catalítico con actividad de alfa-amilasa y un módulo de unión de carbohidratos, según las reivindicaciones 1-2;

   (ii) sacarificación del triturado licuado obtenido;

   (iii) fermentación del material obtenido en la etapa (ii) en presencia de un organismo fermentador. 50
10. 10. ADN representado por una secuencia que codifica un polipéptido, según cualquiera de las reivindicaciones 1-2.
11. 11. Constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN, según la reivindicación 10. 55
12. 12. Composición, según la reivindicación 3, dicha composición comprende además una glucoamilasa.
13. 13. Composición, según la reivindicación 12, donde la glucoamilasa se deriva de una cepa dentro de Talaromyces, sp. Aspergillus, sp. Trametes sp. o Pachykytospora sp. 60
14. 14. Proceso que comprende:

    (a) contactar un sustrato de almidón con una célula de levadura transformada con un constructo de ADN, según la reivindicación 11;

    (b) retener dicho sustrato de almidón con dicha célula de levadura; 65

    (c) fermentación para producir etanol;

    (d) opcionalmente, recuperación del etanol;

    donde los pasos a, b y c se realizan separadamente o simultáneamente.
15. 15. Uso de la composición, según cualquiera de las reivindicaciones 12-13 para la licuefacción y/o sacarificación de un almidón gelatinizado, uno parcialmente gelatinizado o uno granulado. 5