CN100402645C - 葡糖淀粉酶变体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种亲代真菌葡糖淀粉酶的变体，其显示改进的热稳定性和/或使用糖类底物的增加的比活性。

Description

葡糖淀粉酶变体
发明领域
本发明涉及亲代AMG的葡糖淀粉酶变体(突变体)，尤其是其具有改良的热稳定性和/或增加的比活性，以适于如淀粉转化，如由淀粉产生葡萄糖。更具体地，本发明涉及葡糖淀粉酶变体及这类变体酶的用途。
发明背景
葡糖淀粉酶(1，4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC 3.2.1.3.)是催化D-葡萄糖从淀粉或相关的寡糖和多糖分子的非还原性末端释放的酶。葡糖淀粉酶由多种丝状真菌和酵母产生，其中来自曲霉属的那些葡糖淀粉酶是商业上最重要的。
葡糖淀粉酶在商业上用于将已由α-淀粉酶部分水解的玉米淀粉转化为葡萄糖。然后葡萄糖通过葡糖异构酶进一步转化为由几乎等量的葡萄糖和果糖组成的混合物。这种混合物，或另外还富含果糖的混合物是全球商业化的常用的高果糖玉米糖浆。这种糖浆是世界上通过酶法生产的最大吨位的产品。淀粉到果糖的转化过程涉及的三种酶是所生产的最重要的工业用酶。
葡糖淀粉酶在高果糖玉米糖浆的生产中的商业应用方面存在的主要问题之一是葡糖淀粉酶的相对低的热稳定性。葡糖淀粉酶不如α-淀粉酶或葡糖异构酶热稳定，其具有最大活性和稳定性的pH低于α-淀粉酶或葡糖异构酶。因此，它必须在具有较低温度和pH的隔离容器内使用。
来自黑曲霉的葡糖淀粉酶具有由一段长而高度O-糖基化的接头所分隔催化结构域(氨基酸1-440)和淀粉结合结构域(氨基酸509-616)(Svensson等，1983，Carlsberg Res.Commun.48，529-544，1983和1986，Eur.J.Biochem.154，497-502)。来自泡盛曲霉X100变种的葡糖淀粉酶的催化结构域(氨基酸1-471)采用一种(α/α)6折叠，其中六个保守的α→α环区段连接着外柱和内柱(outer and inner barrels)(Aleshin等，1992，J.Biol.Chem.267，19291-19298)。葡糖淀粉酶的晶体结构与1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin)(Harris等，1993，Biochemistry，32，1618-1626)及假四糖抑制物阿卡波糖(acarbose)和D-葡萄糖-二氢阿卡波糖(D-gluco-dihydroacarbose)(Aleshin等，1996，生物化学，35，8319-8328)的复合还分别与作为广义酸和碱起作用的谷氨酸179和400相容。已用蛋白质工程研究了这些残基在催化中的关键作用(Sierks等，1990，Protein Engng.3，193-198；Frandsen等，(1994)，Biochemistry，33，13808-13816)。在葡糖淀粉酶-复合体结构中突出的是在四个糖基残基结合亚位点-1、+1、+2和+3处葡糖淀粉酶-糖类相互作用(Aleshin等，1996，Biochemistry，35，8319-8328)，利用定点突变体结合动力学分析深入研究了对于结合和催化均很重要的残基(Sierks等，1989，Protein Engng.2，621-625；Sierks等，1990，Protein Engng.3，193-198；Berland等，1995，Biochemistry，34，10153-10161；Frandsen等，1995，Biochemistry，34，10162-10169)。
已描述了黑曲霉葡糖淀粉酶中增强热稳定性的不同的取代：i)取代α螺旋甘氨酸：G137A和G139A(Chen等，1996，Protein Engng.9，499-505)；ii)消除易断裂的Asp-X肽键，D257E和D293E/Q(Chen等，1995，ProteinEngng.8，575-582)；阻止N182中的脱酰胺作用(Chen等，1994，Biochem.J.301，275-281)；iv)添加二硫键的工程改造，A246C(Fierobe等，1996，Biochemistry，35，8698-8704)；和v)在A435和S436位导入Pro残基(Li等，1997，Protein Engng.10，1199-1204)。此外Clark Ford于1997年10月17日提交了一篇论文：酶工程，14，北京/中国，1997年10月，12-17，摘要编号：摘要集第0-61页。该摘要提到了在(未公开的)泡盛曲霉(Aspergillusawamori)葡糖淀粉酶中G137A、N20C/A27C、及S30P位置的突变以改进热稳定性。
其它有关葡糖淀粉酶的信息可在互联网主页http://www.public.iastate.edu/～pedro/glase/glase.html上找到。Pedro M.Coutinho的“葡糖淀粉酶WWW主页”(97年10月8日最近更新)公开了有关葡糖淀粉酶的资料，其中包括可由曲霉属菌株得到的葡糖淀粉酶。在黑曲霉葡糖淀粉酶中进行的化学修饰和定点修饰已经列出。
发明简述
本发明的目的是提供改良的葡糖淀粉酶变体，其具有改进的热稳定性和/或适用于如淀粉转化过程的糖化步骤中的增加的比活性。
术语“一种具有改进的热稳定性的葡糖淀粉酶变体”在本发明的上下文中指一种葡糖淀粉酶变体，其具有比相应亲代葡糖淀粉酶更高的T1/2(半寿期)。T1/2的测定(方法I和方法II)在下面“材料和方法”部分中描述。
术语“一种具有增加的比活性的葡糖淀粉酶变体”在本发明的上下文中指一种葡糖淀粉酶变体，其针对所述糖中α-1，4键的比活性增加。所述比活性测定为kcat或AGU/mg(如下面“材料和方法”部分所述进行测量)。增加的比活性指当分别与相应亲代葡糖淀粉酶的kcat或AGU/mg值比较时，kcat或AGU/mg值更高。
本发明的发明人提供了亲代葡糖淀粉酶的许多改良的变体，其与相应的亲代酶相比具有改进的热稳定性和/或增加的比活性。热稳定性的改进是通过在亲代葡糖淀粉酶中取代选择的位点而获得的。这将在下面详细描述。
命名
在本说明书和权利要求书中，使用了氨基酸残基的传统的单字母和三字母密码。为便于参考，本发明的葡糖淀粉酶变体用以下命名法描述：
原始氨基酸：位置：取代的氨基酸
根据该命名法，例如第30位的丙氨酸取代为天冬酰胺可表示为：
Ala30Asn或A30N
在同一位置缺失丙氨酸表示为：
Ala30*或A30*
插入另一种氨基酸残基，如赖氨酸，表示为：
Ala30AlaLys或A30AK
一连串氨基酸残基如氨基酸残基30-33的缺失表示为(30-33)*或Δ(A30-N33)。
当一种特定葡糖淀粉酶与其它葡糖淀粉酶相比包含一处“缺失”并在该位置进行了插入，这类情况下，将第36位插入一个天冬氨酸可表示为：
*36Asp或*36D
多个突变用加号分隔，即：
Ala30Asp+Glu34Ser或A30N+E34S
表示分别在第30和34位将丙氨酸和谷氨酸取代为天冬酰胺和丝氨酸。多个突变还可按如下分隔，意思与加号一样，即：
Ala30Asp/Glu34Ser或A30N/E34S
当在指定位置插入一或多种可替换的氨基酸残基时，表示为
A30N，E或A30N/E，或A30N或A30E
此外，当在本文中，一个适于修饰的位点得到鉴定而未提出任何具体的修饰时，应理解为可用任何氨基酸残基取代该位点存在的氨基酸残基。因此，如当提到第30位丙氨酸的修饰，但未具体说明时，应理解为该丙氨酸可缺失或取代成任何其它氨基酸，即R，N，D，A，C，Q，E，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V中的任何一个。
附图简述
图1显示含有黑曲霉G1葡糖淀粉酶基因的质粒pCAMG91。
发明详述
本发明的工作旨在改善特定葡糖淀粉酶的热稳定性和/或增加其比活性，所述特定葡糖淀粉酶可得自真菌生物体，尤其曲霉属的菌株，而且它们自身是根据它们在淀粉转化或醇发酵中合适的特性而被选择的。
鉴定被突变以获得改良的热稳定性和/或增加的比活性的位置和/或区域
分子动力学(MD)模拟指蛋白质结构中氨基酸的活动性(mobility)(见McCammon，JA和Harvey，SC.，1987，“Dynamics of proteins and nucleic acids”，Cambridge University Press.)。通常将这类蛋白质动力学与结晶的B因子进行比较(见Stout，GH和Jensen，LH，1989，“X-ray structure determination”，Wiley)。通过在可滴定的残基的不同质子化状态下实施MD模拟，可对与pH相关的残基活动性进行模拟。选择具有高度活动性或灵活性(此处为各向同性波动)的区域进行随机诱变。在此应理解，蛋白质特定区域中发现的高度活动性可通过取代这些残基中的残基而在耐热方面得到改善。所述取代直接针对残基，可改变残基的动力学行为，如使其具有更大侧链和/或成为这样的残基，所述残基能与邻近环境中的残基形成改进的接触。来自黑曲霉的AMG可用于MD模拟。如何实施MD模拟已在下文“材料和方法”部分描述。
通过分子动力学(MD)模拟发现的适于在希望获得改良的热稳定性和/或增加的比活性时进行突变的区域如下：
区域：1-18，
区域：19-35，
区域：73-80，
区域：200-212，
区域：234-246，
区域：334-341，
区域：353-374，
区域：407-411，
区域：445-470，
发现的有兴趣用于增加比活性和/或改善热稳定性的区域是邻近活性位点的区域。位于底物结合位点的α螺旋之间的区域，而且其可包含所述α螺旋的N末端侧和C末端侧的位置，对于该酶的活性很重要。这些区域组成如下区域：
区域：40-62，
区域：93-127，
区域：170-184，
区域：234-246，
区域：287-319，
区域：388-414。
根霉属(Rhizopus)、踝节菌属(Talaromyces)如Talaromyces emersonii(在W0 99/28448中公开)、和草根霉属(Thielavia)对麦芽糖糊精包括麦芽糖和麦芽糖庚糖(maltohepatose)具有高比活性。因此，在(转移)增加比活性方面特别有利的区域是：
区域：200-212，
区域：287-300，
区域：305-319。
本发明人已发现，确实有可能通过修饰亲代葡糖淀粉酶氨基酸序列中的一或多个氨基酸残基，来改善亲代葡糖淀粉酶的热稳定性和/或增加其比活性。本发明是基于这一发现。
相应地，本发明第一方面涉及一种亲代葡糖淀粉酶的改良变体，其在下述区域和位点中包含一或多个突变。
亲代葡糖淀粉酶
本发明所考虑的亲代葡糖淀粉酶包括真菌葡糖淀粉酶，尤其是获自曲霉属菌株的葡糖淀粉酶，如黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶以及它们的变体或突变体、同源葡糖淀粉酶、和结构和/或功能类似于SEQ ID NO：2的其它葡糖淀粉酶。具体包含的是黑曲霉葡糖淀粉酶G1和G2，其公开于Boel等，1984，“Glucoamylases G1 and G2 from Aspergillus niger are synthesized from twodifferent but closely related mRNA”，EMBO J，3(5)，第1097-1102页。G2葡糖淀粉酶公开于SEQ ID NO：2。G1葡糖淀粉酶公开于SEQ ID NO：13。另一包含的AMG骨架为Talaromyces emersonii，尤其是公开于WO 99/28448(Novo Nordisk)的Talaromyces emersonii DSM。
商业上可得到的亲代葡糖淀粉酶
商业上可得到的亲代葡糖淀粉酶包括Novo Nordisk的AMG，还包括来自Genencor，Inc.USA、Gist-Brocades，Delft，荷兰这两家公司的葡糖淀粉酶。
葡糖淀粉酶变体
本发明第一方面涉及一种亲代葡糖淀粉酶的变体，其在NO：2所示的氨基酸序列中的以下位点或区域和/或显示与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少60％的同源性的同源葡糖淀粉酶的相应位点或区域内包含一个或多个突变：
区域：1-18，
区域：19-35，
区域：40-62，
区域：73-80，
区域：93-127，
区域：170-184，
区域：200-212，
区域：234-246，
区域：287-319，
区域：334-341，
区域：353-374，
区域：388-414，
区域：445-470，
但不包含以下取代：N20C，A27C，S30P，Y48W，Y50F，W52F，R54K/L，D55G/V，G57A，K108R，D112Y，Y116A/W，S119C/W/E/G/Y/P，W120H/L/F/Y，G121T/A，R122Y，P123G，Q124H，R125K，W170F，N171S，Q172N，T173G，G174C，Y175F，D176N/E，L177H/D，W178R/D，E179Q/D，E180D/Q，V181D/A/T，N182A/D/Q/Y/S，G183K，S184H，W212F，R241K，A246C，D293E/Q，A302V，R305K，Y306F，D309N/E，Y312W，W317F，E389D/Q，H391W，A392D，A393P，N395Q，G396S，E400Q/C，Q401E，G407D，E408P，L410F，S411A/G/C/H/D，S460P。
在一个实施方案中，突变的区域为区域：1-18。特别优选的位点包括以下之一或更多：1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18。
具体的突变包括以下之一或更多：A1V，T2P/Q/R/H/M/E/K，L3N，N9A，A11E/P，I18V。
优选的突变组合包括以下之一或更多：
A1V+L66R+Y402F+N427S+S486G，
T2K+S30P+N427M+S44G+V470M，
T2E+T379A+S386K+A393R，
T2Q+A11P+S394R，
T2R+L66V+S394P+Y402F
T2M+N9A+T390R+D406N+L410R，
T2R+S386R+A393R，
A11P+T2Q+S394R，
A11E+E408R，
I18V+T51S+S56A+V59T+L60A。
在一个实施方案中，突变的区域为区域：19-35。优选的亚区包括以下之一或更多：21-26，31-35。特别优选的位点包括以下之一或更多：19，21，22，23，24，25，26，28，29，31，32，33，34，35。具体的突变包括以下之一或更多：L19N，N20T，G23A，A24S/T，D25S/T/R，G26A，A27S/T，W28R/Y，S30T/N，G31A，A32V，D33R/K/H，S34N。
在一个实施方案中，突变的区域为区域：40-62。优选的亚区包括以下之一或更多：40-47，58-62。特别优选的位点包括以下之一或更多：40，41，42，43，44，45，46，47，49，51，53，56，58，59，60，61，62。
具体的突变包括以下之一或更多：
S40C/A/G，
T43R，
T51S/D，
T53D，
S56A/C，
V59T/A，
L60A。
优选的突变组合包括以下之一或更多：
T51S+S56A+V59T+L60A+I18V
V59A+A393R+T490A+PLASD(N末端延伸)。
一个实施方案中，突变的区域为区域：73-80。特别优选的位点包括以下之一或更多：73，74，75，76，77，78，79，80。
具体的突变包括以下之一或更多：
S73P/D/T/N/Q/E，
L74I/D，
L75A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/K/M/P/S/T/V，优选为I/N/D，
S76A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V，优选T/A，
T77V/T，
I78V，
E79A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/Y/V，优选为Q/R/K，
N80A/R/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V，优选为H/D/E/R/K/T/S/Y。
在一个实施方案中，突变的区域为区域：93-127。在另一个实施方案中，亚区为：区域：93-124。优选的亚区包括以下之一或更多：93-107，109-111，113-115。
特别优选的位点包括以下之一或更多：93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，109，110，111，113，114，115，117，118，126，127。
具体的突变包括以下之一或更多：N93T，
P94V，
S95N，
D97S，
L98S/P，
S100T/D，
A102S/＊，
P107M/L/A/G/S/T/V/I，
N110T，
V111P，
D112N，
E113M/A，
T114S，
A115Q/A，
Y116F，
S119A/R/N/D/Q/H/I/L/K/F/M/T/V，优选为A，
R122A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/V，
G127A.
优选的突变组合包括以下之一或更多：
S119P+G447S，
S119P+Y402F，
S119P+A393R，
S119P+I189T+223F+F227Y+Y402F
S119P+T416H+Y402F+Y312Q.
在一个实施方案中，突变的区域为区域：170-184。具体的突变包括以下之一或更多：
N171R/K/Q/E/W/F/Y，
Q172A/R/N/D/C/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V，
T173K/R/S/N/Q，
G174A，S，
Y175N/Q/D/E，
D176L
L177I
E180N/M
V181I/T
N182R/C/E/G/H/I/L/K/M/P/T/W/Y/V.
G183A
S184D/N/E/Q/L/I/T/R/K.
在一个实施方案中突变的区域为区域：200-212。优选的亚区包括：200-211。特别优选的位点包括以下之一或更多：200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211。具体的突变包括以下之一或更多：A201D，，F202L，A203L，T204K，A205R/S，V206L/N，G207N，S208H/T/D，S209T，S211P，W212N/A/T。
在一个实施方案中突变的区域为区域：234-246。优选的亚区包括以下之一或更多：234-240，242-245。特别优选的位点包括以下之一或更多：234，235，236，237，238，239，240，242，243，244，245。具体的突变包括以下之一或更多：
L234A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/K/M/F/P/S/T/W/Y/V.
A235S
F237Y/H/N/D.
D238T/S.
S239A/R/N/D/C/G/H/I/L/F/P/S/T/Y/V.
S240G
S242S/P/T/A/Y/H/N/D.
G243S/P/T/A/Y/H/N/D.
K244R，
A246T.
优选的突变组合包括以下之一或更多：A246T+T72I。
在一个实施方案中突变的区域为区域：287-319。优选的亚区包括以下之一或更多：287-292，294-301，313-316。
特别优选的位点包括以下之一或更多：
287，288，289，290，291，292，294，295，296，297，298，299，300，301，
303，307，308，310，311，313，314，315，316，318，319.
具体的突变包括以下之一或更多：
S287A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/T/V，
I288L/N/Q，
Y289F，
T290A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/V，
L291I/D/N，
N292D，
D293A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/S/T/V，
G294A/R/N/D/C/Q/E/H/I/L/K/M/P/S/T/V，
L295A/R/N/D/C/Q/E/G/H/K/M/S/T/V，
S296A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/T/V，
D297A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/T/V，
S298A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/T/V，
E299A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/M/S/T/V.
V301T/I，
A302R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V/，优选为S，
V303T/I，
G304A，
R305A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/F/M/P/S/T/W/Y/V，
Y306A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/T/W/V.
E308A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/M/P/S/T/V，优选为Q，
D309L，
T310V/S，
Y311N，
Y312Q/N，
N313T/S/G
N315Q/E/R，
F318A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/T/W/Y/V，优选为Y。
优选的突变组合包括以下之一或更多：
Y312Q+S119P+T416H+Y402F，
Y312Q+S119P+Y402F+T416H+S411V，
Y312Q+T416H
N313G+F318Y.
在一个实施方案中突变的区域为区域：334-341。特别优选的位点包括以下之一或更多：334，335，336，337，338，339，340，341。
具体的突变包括以下之一或更多：
D336A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/S/T/W/Y/V.
K337A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/M/F/P/S/T/W/Y/V.
Q338A/R/N/D/C/G/H/I/L/F/P/S/T/Y/V.
G339S/P/T/A.
S340I/T/N/V/A/D/G.
L341F/L/I/V.
优选突变组合包括以下之一或更多：S340G+D357S+T360V+S386P。
在一个实施方案中突变的区域为区域：353-374。特别优选的位点包括以下之一或更多：353，354，355，356，357，358，359，360，361，362，363，364，365，366，367，368，369，370，371，372，373，374。
具体的突变包括以下之一或更多：
A353D/S，
S356P/N/D，
D357S，
A359S，
T360V，
G361S/P/T/A，
T362R，
S364A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V，
S365A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V，
S366T，
S368P/T/A，
T369A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V，
S371Y/H/N/D，
S372F/Y/C/L/P/H/R/I/T/N/S/V/A/D/G.
优选的突变组合包括以下之一或更多：
S356P+S366T，
D357S+T360V+S371H.
D357S+T360V+S386P+S340G.
在一个实施方案中突变的区域为区域：388-414。优选的亚区包括以下之一或更多：397-399，402-406，412-414。
特别优选的位点包括以下之一或更多：
388，389，390，394，397，398，399，402，403，404，405，406，409，412，413，414.
具体的突变包括以下之一或更多：T390R，
A393R，
S394P/R，
M398L，
S399A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/T/W/Y/V，优选为T/Q/C，
Y402A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/V，优选为F，
D403S，
S405T，
D406N，
E408C/R，
A409R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V，优选为P，
L410R/I，
S411R/N/Q/E/I/L/K/F/M/P/T/W/Y/V，优选为V，
A412C，
R413A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V.
D414A.
优选的突变组合包括以下之一或更多：
A393R+T490A+V59A+PLASD(N末端延伸))
S394R+T2Q+A11P，
Y402F+S411V，
Y402F+S411V+S119P
Y402F+S411V+S119P+A393R，
Y402F+Y312Q+S119P+T416H，
E408R+S386N，
E408R+A425T+S465P+T494A，
L410R+A393R，
Y402F+Y312Q+S119P+T416H+S411V+A393R.
在一个实施方案中突变的区域为区域：445-470。优选的亚区包括以下之一或更多：445-459，461-470。特别优选的位点包括以下之一或更多：445，446，447，448，449，450，451，452，453，454，455，456，457，458，459，461，462，463，464，465，466，467，467，468，469，470.
具体的突变包括以下之一或更多：G447S，G456C/P，S465P。
特定的变体包括具有一或多个以下取代的变体：
   A1V，T2E/P/Q/R/H/M，L3P/N，N9A，A11P/E，I18V，L19N，N20T，G23A，A24S/T，D25S/T/R，G26A，A27S/T，W28R/Y，S30T/N，G31A，A32V，D33R/K/H，S34N，S40C，T43R，T51D/S，T53D，S56A/C，V59T/A，L60A，N93T，P94V，S95N，D97S，L98P/S，S100T/D，A102S/＊，N110T，V111P，D112N，E113M/A，T114S，A115Q/G，Y116F，S119A，G127A，N182E，A201D，F202L，A203L，T204K，A205R/S，V206L/N，G207N，S208H/T/D，S209T，S211P，W212N/A/T，A246T Y312Q，N313T/S/G，A353D/S，S356P/N/D，D357S，A359S，T360V，G361S/P/T/A，T362R，S364A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V，S365A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V，S366T，S368P/T/A，T369A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V，S371Y/H/N/D，S372F/Y/C/L/P/H/R/I/T/N/S/V/A/D/G，T390R，A393R，S394R/P，M398L，S399C/Q/T，Y402F，D403S，S405T，D406N，E408C/R，L410I/R，S411V，A412C，D414A，G447S，S465P.
改良的热稳定性
本发明第二方面涉及亲代葡糖淀粉酶的变体，其具有改进的热稳定性，尤其在40-80℃，优选60-80℃，且优选在pH 4-5时，所述变体在NO：2所示的氨基酸序列中的以下位点或区域和/或显示与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少60％的同源性的同源葡糖淀粉酶的相应位点或区域中包含一个或更多突变：
区域：1-18，
区域：19-35，
区域：73-80，
区域：93-127，
区域：170-184，
区域：200-212，
区域：234-246，
区域：287-319，
区域：334-341，
区域：353-374，
区域：388-414，
区域：445-470，
但不包含以下取代：N20C，A27C，S30P，A246C。
如底物结合可改善稳定性区域93-127，用于根据本发明的热稳定作用还包含区域：170-184，区域：305-319。
在一个实施方案中，突变的区域为区域：1-18。特别优选的位点包括以下之一或更多：1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18。
特异性突变包括以下之一或更多：A1V，T2P/Q/R/H/M/E，N9A，A11E/P。
优选的突变组合包括以下之一或更多：
A1V+L66R+Y402F+N427S+S486G，
T2K+S30P+N427M+S44G+V470M，
T2E+T379A+S386K+A393R，
T2R+S386R+A393R，
A11P+T2Q+S394R，
T2Q+A11P+S394R，
T2R+L66V+S394P+Y402F，
T2M+N9A+T390R+D406N+L410R，
T2R+S386R+A393R，
A11E+E408R。
在一个实施方案中，突变的区域为区域：19-35。优选的亚区包括以下之一或更多：21-26，31-35。特别优选的位点包括以下之一或更多：19，21，22，23，24，25，26，28，29，31，32，33，34，35。具体的突变包括以下之一或更多：L19N，N20T，G23A，A24S/T，D25S/T/R，G26A，A27S/T，W28R/Y，S30T/N，G31A，A32V，D33R/K/H，S34N。
一个实施方案中，突变的区域为区域：73-80。特别优选的位点包括以下之一或更多：73，74，75，76，77，78，79，80。
具体的突变包括以下之一或更多：
S73P/D/T/N/Q/E，
L74I/D，
L75A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/K/M/P/S/T/V ，优选为I/N/D，
S76A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V，优选T/A，
T77V/T，
I78V，
E79A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/Y/V，优选为Q/R/K，
N80A/R/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V，优选为H/D/E/R/K/T/S/Y。
在一个实施方案中，突变的区域为区域：93-127。在另一个实施方案中，亚区为：区域：93-124。优选的亚区包括以下之一或更多：93-107，109-111，113-115。
特别优选的位点包括以下之一或更多：93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，109，110，111，113，114，115，117，118，126，127。
优选的突变包括以下之一或更多：
P107M/L/A/G/S/T/V/I，
S119A/R/N/D/Q/H/I/L/K/F/M/T/V，优选为A，
R122A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/V,
优选的突变组合包括以下之一或更多：
S119P+G447S。
S119P+A393R。
在一个实施方案中，突变的区域为区域：170-184。具体的突变包括以下之一或更多：
N171R/K/Q/E/W/F/Y，
Q172A/R/N/D/C/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V，
T173K/R/S/N/Q，
G174A，S，
Y175N/Q/D/E，
D176L
L177I
E180N/M
V181I/T
N182R/C/E/G/H/I/L/K/M/P/T/W/Y/V.
G183A
S184D/N/E/Q/L/I/T/R/K.
在一个实施方案中突变的区域为区域：200-212。优选的亚区包括：200-211。特别优选的位点包括以下之一或更多：200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211。具体的突变包括以下之一或更多：A203L，S211P。
在一个实施方案中突变的区域为区域：234-246。优选的亚区包括以下之一或更多：234-240，242-245。特别优选的位点包括以下之一或更多：234，235，236，237，238，239，240，242，243，244，245。具体的突变包括以下之一或更多：
L234A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/K/M/F/P/S/T/W/Y/V，
A235S，
F237Y/H/N/D，
D238T/S，
S239A/R/N/D/C/G/H/I/L/F/P/S/T/Y/V，
S240G，
S242S/P/T/A/Y/H/N/D，
G243S/P/T/A/Y/H/N/D，
K244R，
A246T.
优选的突变组合包括以下之一或更多：A246T+T72I。
在一个实施方案中突变的区域为区域：287-319。优选的亚区包括以下之一或更多：287-292，294-301，313-316。
在一个附加的实施方案中，所述亚区包括：305-319。特别优选的位点包括以下之一或更多：
287，288，289，290，291，292，294，295，296，297，298，299，300，301，302，
303，307，308，310，311，313，314，315，316，318，319.
具体的突变包括以下之一或更多：
Y312Q，
F318A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/T/W/Y/V，优选为Y。
优选的突变组合包括以下之一或更多：
N313G+F318Y
Y302Q+S119P+T416H+Y402F。
在一个实施方案中突变的区域为区域：334-341。特别优选的位点包括以下之一或更多：334，335，336，337，338，339，340，341。
特异性突变包括以下之一或更多：
D336A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/S/T/W/Y/V.
K337A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/M/F/P/S/T/W/Y/V.
Q338A/R/N/D/C/G/H/I/L/F/P/S/T/Y/V.
G339S/P/T/A.
S340I/T/N/V/A/D/G.
L341F/L/I/V.
优选突变组合包括以下之一或更多：S340G+D357S+T360V+S386P。
在一个实施方案中突变的区域为区域：353-374。特别优选的位点包括以下之一或更多：353，354，355，356，357，358，359，360，361，362，363，364，365，366，367，368，369，370，371，372，373，374。
具体的突变包括以下之一或更多：
A353D/S，
S356P/N/D，
D357S，
A359S，
T360V，
G361S/P/T/A，
T362R，
S364A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V，
S365A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V，
S366T，
S368P/T/A，
T369A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V，
S371Y/H/N/D，
S372F/Y/C/L/P/H/R/I/T/N/S/V/A/D/G.
优选的突变组合包括以下之一或更多：
S356P+S366T，
D357S+T360V+S371H，
D357S+T360V+S386P+S340G。
在一个实施方案中突变的区域为区域：388-414。优选的亚区包括以下之一或更多：397-399，402-406，412-414。
在一个附加的实施方案中，所述亚区为：407-411。
特别优选的位点包括以下之一或更多：
388，389，390，394，397，398，399，402，403，404，405，406，409，412，413，414.
具体的突变包括以下之一或更多：T390R，
A393R，
A394P/R，
S399A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/T/W/Y/V，优选为T/Q/C，
Y402A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/V，优选为F，
D403S，
S405T，
D406N，
E408C/R，
Q409A/R/N/D/C/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V，优选为P，
L410I/R，
S411V，
A412C，
R413A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V，
D414A。
优选的突变组合包括以下之一或更多：
A393R+T2R+S386R，
A393R+T490A+V59A+PLASD(N末端延伸)
S394R+T2Q+A11P，
Y402F+T2R+L66V+S394P，
Y402F+S411V+S119P
Y402F+S411V，
Y402F+312Q+S119P+T416H，
S411V+A393R，
E408R+S386N，
E408R+A425T+S465P+T494A，
L410R+A393R，
S411V+S119P+402F+A393R，
S411V+S119P+402F+A393R+T416H。
在一个实施方案中突变的区域为区域：445-470。优选的亚区包括以下之一或更多：445-459，461-470。特别优选的位点包括以下之一或更多：
445，446，447，448，449，450，451，452，453，454，455，456，457，458，459，461，462，463，464，465，466，467，467，468，469，470。
具体的突变包括以下之一或更多：G447S，G456C/P，S465P。
优选的突变组合包括以下之一或更多：
G447S+S119P，
S465P+E408R+A425T+T494A。
增加的比活性
本发明第三方面涉及一种亲代葡糖淀粉酶的变体，其具有增加的比活性，其在NO：2所示的氨基酸序列中的以下位点或区域和/或显示与SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列具有至少60％的同源性的同源葡糖淀粉酶的相应位点或区域中包含一个或多个突变：
区域：1-18，
区域：40-62，
区域：93-127，
区域：170-184，
区域：200-212，
区域：234-246，
区域：287-319，
区域：388-414，
但不包含以下取代：S411G。
在一个实施方案中，突变的区域为区域：1-18。特别优选的位点包括以下之一或更多：1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18。
具体的突变为：L3N，I18V。
优选的突变组合包括以下之一或更多：
I18V+T51S+S56A+V59T+L60A。
在一个实施方案中，突变的区域为区域：40-62。优选的亚区包括以下之一或更多：40-47，58-62。特别优选的位点包括以下之一或更多：40，41，42，43，44，45，46，47，49，51，53，56，58，59，60，61，62。具体的突变包括以下之一或更多：S40C，T43R，T51S/D，T53D，S56A/C，V59T，L60A。
优选的突变组合包括以下之一或更多：
T51S+S56A+V59T+L60A+I18V。
在一个实施方案中，突变的区域为区域：93-127。在一个附加实施方案中亚区为：区域：93-124。优选的亚区包括以下之一或更多：93-107，109-111，113-115。
特别优选的位点包括以下之一或更多：93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，109，110，111，113，114，115，117，118，126，127。
优选的突变包括以下之一或更多：N93T，P94V，S95N，D97S，L98S/P，S100T/D，A102S/*，N110T，V111P，D112N，E113M/A，T114S，A115Q/G，Y116F，S119A，G127A。
优选的突变组合包括以下之一或更多：
S119P+Y402F，
S119P+Y402F+I189T+Y223F+F227Y。
在一个实施方案中，突变的区域为区域：170-184。具体的突变包括以下之一或更多：
N171R/K/Q/E/W/F/Y，
Q172A/R/N/D/C/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V，
T173K/R/S/N/Q，
G174A，S，
Y175N/Q/D/E，
D176L
L177I
E180N/M
V181I/T
N182R/C/E/G/H/I/L/K/M/P/T/W/Y/V，优选为E，
G183A
S184D/N/E/Q/L/I/T/R/K.
在一个实施方案中突变的区域为区域：200-212。优选的亚区包括：200-211。特别优选的位点包括以下之一或更多：200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211。具体的突变包括以下之一或更多：A201D，F202L，A203L，T204K，A205R/S，V206L/N，G207N，S208H/T/D，S209T，W212N/A/T。
在一个实施方案中突变的区域为区域：234-246。优选的亚区包括以下之一或更多：234-240，242-245。特别优选的位点包括以下之一或更多：234，235，236，237，238，239，240，242，243，244，245。
在一个实施方案中突变的区域为区域：287-319。优选的亚区包括以下之一或更多：287-292，294-301，313-316。
特别优选的位点包括以下之一或更多：
287，288，289，290，291，292，294，295，296，297，298，299，300，301，302，303，307，308，310，311，313，314，315，316，318，319.
具体的突变包括以下之一或更多：
S287A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/T/V，
I288L/N/Q，
Y289F，
T290A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/V，
L291I/D/N，
N292D，
D293A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/S/T/V，
G294A/R/N/D/C/Q/E/H/I/L/K/M/P/S/T/V，
L295A/R/N/D/C/Q/E/G/H/K/M/S/T/V，
S296A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/T/V，
D297A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/T/V，
S298A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/T/V，
E299A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/M/S/T/V.
V301T/I，
A302R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V/，优选为S，
V303T/I，
G304A，
R305A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/F/M/P/S/T/W/Y/V，
Y306A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/T/W/V.
E308A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/M/P/S/T/V，优选为Q，
D309L，
T310V/S，
Y311N，
Y312Q/N，优选为Q，
N313T/S/G，优选为S，
N315Q/E/R。
在一个实施方案中突变的区域为区域：388-414。优选的亚区包括以下之一或更多：397-399，402-406，412-414。
特别优选的位点包括以下之一或更多：388，389，390，394，397，398，399，402，403，404，405，406，409，412，413，414。
具体的突变包括以下之一或更多：M398L，S399C/Q/T，Y402F，D403S，S405T，E408C/R，S411V，A412C，D414A。
优选的突变组合包括以下之一或更多：
Y402F+S119P，
Y402F+S119P+I189T+Y223F+F227Y。
在本发明一个优选实施方案中，待突变的区域为：
区域：287-300，
区域：305-319，
和/或显示与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少60％的同源性的同源葡糖淀粉酶的相应位点或区域。
同源性(同一性)
测定两个蛋白质序列之间的同一性程度作为上文所述的亲代葡糖淀粉酶的同源性，其显示第一个序列与第二个序列的差异。利用本领域已知的计算机程序，例如GCG程序包中提供的GAP(Program Manual for the WisconsinPackage，第8版，1994年8月，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)可适当地测定同源性(Needleman，S.B和Wunsch，C.D.，1970，Journal of Molecular Biology，48，p443-453)。为了进行多肽序列对比，使用了具有下列设置的Gap：Gap产生罚分为3.0，Gap延伸罚分为0.1，由本发明的类似DNA序列编码的成熟多肽部分与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的成熟部分显示的同一性程度优选至少为60％，如70％，至少80％，至少90％，更优选至少为95％，更优选至少为97％，最优选至少为99％。
优选亲代葡糖淀粉酶含有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；或其等位基因变体；或其具有葡糖淀粉酶活性的片段。
SEQ ID NO：2的片段是由此氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失了一个或多个氨基酸的多肽。例如，AMG G2(SEQ ID NO：2)是具有葡糖淀粉酶活性的黑曲霉G1葡糖淀粉酶的片段(Boel等，1984，EMBO J，3(5)，p.1097-1102)。等位基因变体表示占据相同染色体基因座的任何两个或多个可替代的基因形式。等位基因变异是通过突变天然产生的，并可导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽没有改变)，或者可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
通过插入或缺失一个或多个氨基酸残基和/或用不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基，同源的亲代葡糖淀粉酶的氨基酸序列可与SEQ IDNO：2的氨基酸序列有所不同。优选氨基酸的改变从性质来说是微小的，即不会显著影响蛋白质折叠和/或活性的保守的氨基酸取代；小的缺失，一般为1至约30个氨基酸缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基-末端的甲硫氨酸残基；多至约20至25个残基的小连接肽；或便于通过改变净电荷或另外的功能进行纯化的小的延伸，如多-组氨酸通道，抗原性表位或结合结构域。
在另一个实施方案中，分离的亲代葡糖淀粉酶由核酸序列编码，该核酸序列在很低严紧性条件下，优选在低严紧性条件下，更优选在中度严紧性条件下，更优选在中-高度严紧性条件下，甚至更优选在高度严紧性条件下，最优选在很高严紧性的条件下与核酸探针杂交，所述探针能在相同的条件下与以下序列杂交：(i)SEQ ID NO：1的核酸序列，(ii)SEQ ID NO：1的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的亚序列，或(iv)(i)，(ii)或(iii)的互补链(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatus，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，冷泉港，纽约)。SEQ ID NO：1的亚序列可为至少100个核苷酸，或者优选至少为200个核苷酸。此外，该亚序列可编码具有葡糖淀粉酶活性的多肽片段。亲代多肽也可以是具有葡糖淀粉酶活性的多肽的等位变体或片段。
可使用SEQ ID NO：1的核酸序列或其亚序列，以及SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其片段设计核酸探针，从而根据本领域已知的方法从不同的属或种的菌株中鉴定和克隆编码具有葡糖淀粉酶活性的多肽的DNA。特别是，可根据标准的Southern印迹方法，可将这些探针用于与感兴趣的属或种的基因组DNA或cDNA杂交，以鉴定和分离其中的相应基因。这种探针可以比完整序列短很多，但其长度应该至少为15，优选至少为25，更优选至少为35个核苷酸。也可使用较长的探针。DNA和RNA探针都可以使用。通常标记探针以检测相应的基因(例如用32P，3H，35S，生物素或抗生物素蛋白(avidin))。本发明包括这种探针。
因此，可从由其它生物体制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选与上述探针杂交，且编码具有葡糖淀粉酶活性的多肽的DNA。通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其它分离技术可分离得自其它生物体的基因组或其它DNA。将文库中的DNA或经分离的DNA转移至并固定于硝酸纤维素或其它适当的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO：1或其亚序列同源的克隆或DNA，将载体材料用于Southern印迹。对本发明而言，杂交指的是：在严紧度很低至很高的条件下，核酸序列与核酸探针杂交，所述探针对应于SEQ IDNO：1所示的核酸序列，其互补链或其亚序列。使用X-射线胶片检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。
对于长度至少为100个核苷酸的长探针而言，使用2×SSC，0.2％SDS将载体材料最终洗涤3次，每次15分钟，洗涤温度优选至少为45℃(很低的严紧度)，更优选至少为50℃(低严紧度)，更优选至少为55℃(中度严紧度)，更优选至少为60℃(中-高度严紧度)，甚至更优选至少为65℃(高严紧度)，最优选至少为70℃(很高的严紧度)。
对于长度为大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针而言，严紧性条件的定义是：根据标准的Southern印迹方法，在比使用Bolton和McCarthy(1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：1390)的算式计算出的Tm低5℃至10℃的温度下，在0.9M NaCl，0.09M Tris-HCl，pH7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1×Denhardt’s溶液，1mM焦磷酸钠，1mM磷酸二氢钠，0.1mM ATP和0.2mg酵母RNA/ml中进行预杂交，杂交和杂交后的洗涤。
对于长度为大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针而言，在比计算出的Tm低5℃至10℃的温度下，用6×SSC+0.1％SDS将载体材料洗涤1次，15分钟，再用6×SSC洗涤2次，每次15分钟。
本发明还涉及通过下列方法产生的分离的核酸序列：(a)在很低，低，中度，中-高度，高度或很高的严紧条件下使DNA与SEQ ID NO：1的序列，或其互补链，或其亚序列杂交；和(b)分离核酸序列。亚序列优选为至少100个核苷酸的序列，例如编码具有葡糖淀粉酶活性的多肽片段的序列。
本发明包含的亲代葡糖淀粉酶具有的活性为SEQ ID NO：2所示成熟多肽的葡糖淀粉酶活性的至少20％，优选为至少40％，更优选至少为60％，甚至更优选至少为80％，甚至更优选至少为90％，最优选至少为100％。
在优选的实施方案中，本发明的变体使用麦芽糖糊精作为底物，优选在约60-80℃的温度范围内，优选为63-75℃，优选在pH4-5，特别是4.2-4.7时具有改良的热稳定性和/或增加的比活性。
在另一个优选的实施方案中，本发明的变体被用于例如乙醇发酵。
在优选的实施方案中，亲代葡糖淀粉酶是黑曲霉G1葡糖淀粉酶(Boel等，1984，EMBO J，3(5)，p1097-1102)。亲代葡糖淀粉酶可以是截短的葡糖淀粉酶，例如AMG G2葡糖淀粉酶。
克隆编码亲代葡糖淀粉酶的DNA序列
可使用本领域已知的多种方法，从能够产生所述葡糖淀粉酶的任何细胞或微生物中分离编码亲代葡糖淀粉酶的DNA序列。首先，应使用得自能够产生待研究的葡糖淀粉酶的生物体的染色体DNA或信使RNA来构建基因组DNA和/或cDNA文库。然后，如果葡糖淀粉酶的氨基酸序列是已知的，可合成标记的寡核苷酸探针，以用于从所述生物体制备的基因组文库中鉴定编码葡糖淀粉酶的克隆。或者，可将含有与另一个已知葡糖淀粉酶基因同源的序列的标记寡核苷酸探针用作探针，使用很低至很高严紧度的杂交和洗涤条件来鉴定编码葡糖淀粉酶的克隆。
另一种鉴定编码葡糖淀粉酶的克隆的方法包括：将基因组DNA片段插入表达载体，如质粒，用所得基因组DNA文库转化葡糖淀粉酶-阴性细菌，然后将转化的细菌铺于含有葡糖淀粉酶底物(即麦芽糖)的琼脂上，从而鉴定出表达葡糖淀粉酶的克隆。
或者，可通过已建立的标准方法经合成而制备编码酶的DNA序列，所述方法包括例如S.L.Beaucage和M.H.Caruthers，(1981)，Tetrahedron Letters，22，p.1859-1869所述的亚磷酰胺(phosphoroamidite)法，或Matthes等，1984，EMBO J，3，p.801-805所述的方法。在亚磷酰胺法中，寡核苷酸在如DNA自动合成仪中合成，纯化，退火，连接并克隆至适当载体中。
最后，DNA序列可以是混合的基因组和合成来源的，混合的合成和cDNA来源的或混合的基因组和cDNA来源的，它们是根据标准技术，通过连接合成来源，基因组来源或cDNA来源的片段(适当时，对应于完整DNA序列的多个部分的片段)而制备的。也可使用特异性引物，通过聚合酶链式反应(PCR)制备DNA序列，例如US 4,683,202或R.K.Saiki等，1988，Science，239，1988，p487-491。
定点诱变
一旦分离出编码葡糖淀粉酶的DNA序列，鉴定出理想的突变位点，可使用合成的寡核苷酸导入突变。这些寡核苷酸含有所需突变位点侧翼的核苷酸序列。在特定的方法中，在携有葡糖淀粉酶基因的载体中产生DNA(即葡糖淀粉酶编码序列)的单链缺口。然后使携有所需突变的合成核苷酸与单链DNA的同源部分退火。用DNA聚合酶I(Klenow片段)补平残留的缺口，使用T4连接酶连接构建体。此方法的具体例子描述于Morinaga等，1984，Biotechnology，2，p.646-639。US 4,760,025公开了通过对表达盒进行微小的改变来导入编码多个突变的寡核苷酸。另外，通过Morinaga的方法可导入大量不同长度的寡核苷酸，因此可在一次导入更多种的突变。
另一种将突变导入编码葡糖淀粉酶的DNA序列的方法描述于Nelson和Long，1989，Analytical Biochemistry，180，p147-151。该方法包括3步产生PCR片段，所述片段含有通过使用化学合成的DNA链作为PCR反应中的一个引物而导入的所需突变。通过用限制性内切核酸酶裂解，从PCR-产生的片段中分离出携有突变的DNA片段，并重新插入表达质粒中。
另外，Sierks等，1989，Protein Eng.，2，621-625；Sierks等，1990，ProteinEng.，卷3，193-198也描述了曲霉属葡糖淀粉酶中的定点诱变。
随机诱变
适当的随机诱变可以是翻译成所述氨基酸序列的基因的至少三个部分中的局部或区域-特异性随机诱变，也可以是整个基因中的随机诱变。
可使用本领域已知的任何方法方便地对编码亲代葡糖淀粉酶的DNA序列进行随机诱变。
有关上述内容，本发明的另一方面涉及产生亲代葡糖淀粉酶变体的方法，其中相对于亲代而言，变体表现出增加的热稳定性，所述方法包括：
(a)对编码亲代葡糖淀粉酶的DNA序列进行随机诱变，
(b)在宿主细胞中表达步骤(a)中所得的突变DNA序列，和
(c)筛选表达葡糖淀粉酶变体的宿主细胞，相对于亲代葡糖淀粉酶而言，所述变体具有改变的特性(即热稳定性)。
如本文工作实施例所述，优选使用掺加(doped)引物进行本发明之上述方法的步骤(a)(参见下文)。
例如，可通过使用适当的物理或化学诱变剂，通过使用适当的寡核苷酸，或通过对DNA序列进行PCR-产生的诱变来进行随机诱变。另外，可通过使用这些诱变剂的任何组合进行随机诱变。诱变剂可为例如诱导转换(transition)，颠换(transversion)，倒位(inversion)，置乱(scrambling)，缺失(deletion)和/或插入(insertion)的诱变剂。
适用于本发明的物理或化学诱变剂的例子包括紫外线(UV)照射，羟胺，N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)，O-甲基羟胺，亚硝酸，乙基甲烷磺酸酯(EMS)，亚硫酸氢钠，甲酸和核苷酸类似物。当使用这些诱变剂时，一般通过下述方法进行诱变，即在适于发生诱变的条件下，在存在选定诱变剂时保温待诱变的编码亲代酶的DNA序列，并选择具有所需特性的突变DNA。
当通过使用寡核苷酸进行诱变时，在待改变的位置处合成寡核苷酸的过程中，可在寡核苷酸中添加(dope)或掺加(spike)3个非亲代核苷酸。可进行添加或掺加以避免出现不必要的氨基酸密码子。可通过任何已知技术，必要时使用例如PCR，LCR或任何DNA聚合酶和连接酶，将经添加或掺加的寡核苷酸掺入编码葡糖淀粉酶的DNA中。
优选使用“恒定的随机添加”进行添加，其中各个位置处的野生型和突变的百分比是预先确定好的。另外，添加可定向于优选的以导入某些核苷酸，籍此优选导入一个或多个特定的氨基酸残基。可进行添加以在每个位置处导入90％野生型和10％突变。选择添加方案的其它考虑基于基因以及蛋白质结构的限制。通过使用DOPE程序可制订掺加方案，所述程序可特别地确保不会导入终止密码子。
当使用PCR-产生的诱变时，在增加核苷酸错误掺入的条件下，对经化学处理或未经处理的编码亲代葡糖淀粉酶的基因进行PCR(Deshler，1992；Leung等，技术，Vol.1，1989，p11-15)。
可使用大肠杆菌(Fowler等，Molec.Gen.Genet.，133，1974，p.179-191)、酿酒酵母或任何其它微生物的增变菌株(mutator strain)进行编码葡糖淀粉酶的DNA的随机诱变，诱变方法包括例如：将含有亲代糖基化酶的质粒转化至增变菌株，培养具有质粒的增变菌株，从增变菌株中分离突变质粒。随后，将突变质粒转化至表达生物体。
待诱变的DNA序列可方便地存在于基因组或cDNA文库中，所述文库由表达亲代葡糖淀粉酶的生物体制备。或者，DNA序列可存在于适当载体，如质粒或噬菌体上，再将所述载体与诱变剂保温，或将所述载体暴露于诱变剂中。待诱变的DNA也可存在于宿主细胞中，或者整合于所述细胞的基因组中，或者存在于细胞所携有的载体上。最后，待诱变的DNA可以是分离的形式。应理解待进行随机诱变的DNA序列优选为cDNA或基因组DNA序列。
在某些情况下，在进行表达步骤b)或筛选步骤c)之前，可方便地扩增突变的DNA序列。可根据本领域已知的方法进行这种扩增，本发明优选的方法是使用寡核苷酸引物进行PCR-产生的扩增，所述引物是根据亲代酶的DNA或氨基酸序列制备的。
与诱变剂保温或暴露于其中之后，通过在允许表达发生的条件下培养携有所述DNA序列的适当宿主细胞来表达突变的DNA。用于此目的的宿主细胞可为用任选存在于载体上的突变的DNA序列转化的宿主细胞，或者为在诱变处理过程中携有编码亲代酶的DNA序列的宿主细胞。适当宿主细胞的例子如下：革兰氏阳性细菌，如枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，迟缓芽孢杆菌，短芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌，环状芽孢杆菌，灿烂芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌，青紫链霉菌或鼠灰链霉菌；和革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌。
突变的DNA序列可进一步含有编码允许突变的DNA序列表达的功能的DNA序列。
定位随机诱变
随机诱变可有利地定位于所述亲代葡糖淀粉酶的一部分。当鉴定出酶的某些区域对酶的特定特性十分重要时，和当经修饰后有望产生具有改良特性的变体时，进行定位随机诱变是有利的。当已阐明亲代酶的三级结构时，一般即可鉴定出该区域，并与酶的功能关联。
通过使用上文所述的PCR-产生的诱变技术或本领域已知的任何其它适当技术，可方便地进行局部的或区域特异性的随机诱变。或者，可通过例如插入适当的载体来分离编码待修饰的DNA序列部分的DNA序列，随后，可使用上述诱变方法中的任一种对所述部分进行诱变。
另一种提供本发明变体的方法包括基因改组，其描述于例如WO95/22625(Affymax Technologies N.V.)或WO 96/00343(来自Novo NordiskA/S)。
葡糖淀粉酶变体的表达
根据本发明，使用表达载体可将通过上述方法或本领域已知的任何其它方法产生的编码变体的编码DNA序列以酶的形式表达，所述载体一般包括编码下述的控制序列：启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号，和任选的阻抑蛋白基因或多种激活物基因。
表达载体
携有编码本发明葡糖淀粉酶变体的DNA序列的重组表达载体可以是便于经受重组DNA方法的任何载体，载体的选择经常取决于欲导入该载体的宿主细胞。载体可为这样的载体，当将所述载体导入宿主细胞时，该载体能整合至宿主细胞基因组并与整合了该载体的染色体一起复制。适当表达载体的例子包括pMT838。
启动子
在载体中，DNA序列应与适当启动子序列可操作相连。启动子可以是在选定宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列，所述启动子可得自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。
用于指导编码本发明葡糖淀粉酶变体的DNA序列的转录，尤其是在细菌宿主中的转录的适当启动子的例子是大肠杆菌lac操纵子的启动子，天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因dagA启动子，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子，嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子，解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(amyQ)的启动子，枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。为了在真菌宿主中转录，有用启动子的例子是得自编码下列的基因的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶，来自酿酒酵母的TPI(丙糖磷酸异构酶)启动子(Alber等，1982，J.Mol.Appl.Genet，1，p419-434)，曼赫根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，曼赫根毛霉脂肪酶，米曲霉碱性蛋白酶，米曲霉丙糖磷酸异构酶或构巢曲霉乙酰胺酶。
表达载体
本发明的表达载体也可含有适当的转录终止子，在真核生物中，还含有与编码本发明的α-淀粉酶变体的DNA序列可操作相连的聚腺苷酸化序列。终止和聚腺苷酸化序列适于得自与启动子相同的来源。
载体还可含有能使载体在所述宿主细胞中复制的DNA序列。这种序列的例子是质粒pUC19，pACYC177，pUB110，pE194，pAMB1和pIJ702的复制起点。
载体也可含有选择标记，例如其产物可补偿宿主细胞中的缺陷的基因，如来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或能赋予抗生素抗性的基因，所述抗生素抗性例如氨苄青霉素，卡那霉素，氯霉素或四环素抗性。此外，载体可含有曲霉属选择标记，如amdS，argB，niaD和sC，产生潮霉素抗性的标记，或按WO91/17243所述通过共转化完成选择。
分别连接本发明的编码葡糖淀粉酶变体的DNA构建体，启动子，终止子和其它元件，并将它们插入含有复制所必需信息的适当载体，所用方法是本领域技术人员众所周知的(参见例如Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版，冷泉港，1989)。
宿主细胞
本发明的细胞含有上文所述的本发明的DNA构建体或表达载体，在重组生产本发明的葡糖淀粉酶变体时，所述细胞可有利地用作宿主细胞。可方便地通过将DNA构建体(一个或多个拷贝)整合至宿主染色体，而用编码变体的本发明的DNA构建体转化细胞。一般认为整合是有利的，因为此时DNA序列更可能在细胞中稳定维持。可根据常规方法，如同源或异源重组将DNA构建体整合至宿主染色体。或者，可用上文所述的与不同类型的宿主细胞相关的表达载体转化细胞。
本发明的细胞可以是高等生物，如哺乳动物或昆虫的细胞，但优选是微生物细胞，例如细菌或真菌(包括酵母)细胞。
适当细菌的例子是革兰氏阳性细菌，如枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，迟缓芽孢杆菌，短芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌，环状芽孢杆菌，灿烂芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌，或青紫链霉菌或鼠灰链霉菌，或革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌。通过例如以本身已知的方式进行原生质体转化或使用感受态细胞即可实现对细菌的转化。
可从糖酵母或裂殖酵母，如酿酒酵母的菌种中有利地选择酵母生物体。
宿主细胞也可以是丝状真菌，例如属于曲霉属的种的菌株，最优选为米曲霉或黑曲霉，或镰孢属的菌株，例如以下菌种的菌株：尖镰孢，禾谷镰孢(其完全阶段称为Gribberella zeae，以前被称为Sphaeria zeae，与Gibberellaroseum和Gibberella roseum f.sp.cerealis同义)或硫色镰孢(其完全阶段称为Gibberella puricaris，与Fusarium trichothecioides，杆孢状镰孢，接骨木镰孢(Fusarium sambucium)，玫瑰色镰孢和玫瑰色镰孢graminearum变种同义)，樱桃镰孢(Fusarium cerealis)(与Fusarium crokkwellnse同义)或Fusariumvenenatum。
在本发明的优选实施方案中，宿主细胞是蛋白酶缺陷或蛋白酶阴性菌株。
例如，蛋白酶缺陷菌株米曲霉JaL 125缺失了被称为“alp”的碱性蛋白酶基因。该菌株描述于WO 97/35956(Novo Nordisk)。
可通过下述方法转化丝状真菌细胞，所述方法包括形成原生质体并进行原生质体转化，接着以本身已知的方法再生细胞壁。曲霉属用作宿主微生物描述于EP 238023(Novo Nordisk A/S)，其内容并入本文作为参考。
产生葡糖淀粉酶变体的方法
在另一方面，本发明涉及产生本发明的葡糖淀粉酶变体的方法，所述方法包括在有助于产生变体的条件下培养宿主细胞，并从细胞和/或培养基中回收变体。
用于培养细胞的培养基是适用于培养所述宿主细胞和表达本发明的葡糖淀粉酶变体的任何常规培养基。适当的培养基可以商购或根据出版的配方(例如按美国典型培养物保藏中心目录所述的方法)制备。
通过众所周知的方法可从培养基中方便地回收由宿主细胞分泌的葡糖淀粉酶变体，所述方法包括从培养基中通过离心或过滤来分离细胞，利用诸如硫酸铵的盐沉淀培养基中的蛋白质组分，接着使用层析方法，如离子交换层析，亲和层析等。
淀粉转化
本发明提供了使用本发明的葡糖淀粉酶变体由淀粉生产葡萄糖等的方法。该方法一般包括以下步骤，即在α-淀粉酶的存在下部分水解前体淀粉，然后在葡糖淀粉酶的存在下，通过裂解α-(1→4)和α-(1→6)葡糖苷键，从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非-还原性末端进一步水解释放D-葡萄糖。
利用α-淀粉酶部分水解前体淀粉可通过水解内部的α-(1→4)键而初步裂解淀粉分子。在商业应用中，使用α-淀粉酶初步水解在约105℃的温度下进行。处理了很高浓度的淀粉，通常为30％至40％固体。在此高温下初步水解通常进行5分钟。然后将部分水解的淀粉转移至第二个罐中，在85℃至98℃的温度下保温约1至2小时以得到10至15葡萄糖当量(D.E.)。
通常在降低的温度，即30℃至62℃，在独立的罐中，在葡糖淀粉酶的存在下，进行从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非-还原性末端进一步水解释放D-葡萄糖的步骤。优选将底物液体的温度降至55℃至60℃，溶液的pH从约5.5至6.5降至约3至5.5。优选溶液的pH为4至4.5。在溶液中加入葡糖淀粉酶，将反应进行24至72小时，优选36至48小时。
使用本发明的热稳定性葡糖淀粉酶变体，可在比传统的分批糖化法高的温度下进行糖化。根据本发明，可在60至80℃，优选在63至75℃的温度下进行糖化。该温度适用于传统的分批法(上文所述)和连续糖化法。
实际上，必须在超过60℃的温度下进行连续糖化法，所用温度应能维持合理的高流量穿过膜，或者能使微生物污染最小化，所述糖化法包括一个或多个膜分离步骤，即过滤步骤。因此，本发明的热稳定性变体提供了以较合理的成本和/或使用较低酶蛋白质剂量，在工业糖化法可接受的时间内进行大规模连续糖化法的可能性。根据本发明，糖化时间甚至可以缩短。
在60℃至80℃的温度，本发明的葡糖淀粉酶变体(如AMG变体)的活性基本上高于传统使用的30至60℃的温度下的活性。因此，通过升高葡糖淀粉酶的工作温度，可在较短的时间内进行糖化过程。
另外，通过改善热稳定性，T1/2(“材料和方法”一节所定义的半寿期)也得以改善。由于本发明的葡糖淀粉酶变体的热稳定性得以改善，只需加入很少量的葡糖淀粉酶以替代在糖化过程中失活的葡糖淀粉酶。在本发明的糖化过程中，更多的葡糖淀粉酶能维持活性。此外，当在高于63℃的温度下进行糖化过程时，微生物污染的风险也有所降低。
用葡糖淀粉酶，酸性淀粉酶和支链淀粉酶进行的典型糖化试验中的葡萄糖产率为95.5至96.5％。其余的糖类一般由1％麦芽糖，1.5-2％异麦芽糖和1-1.5％高级寡糖组成。由于在高浓度的葡萄糖和高的干-固体水平存在下，葡糖淀粉酶具有形成回复突变产物的趋势，因此也产生了二糖。
对液化之后溶液中存在的糖类和糖化过程中形成的糖类的比活性提高的葡糖淀粉酶可能是有利的，因为随后可使用降低的酶蛋白质剂量或缩短的处理时间。通常，相对于短链糖类而言，葡糖淀粉酶偏好由长链糖类组成的底物，因此，针对例如麦芽糖庚糖(maltoheptaose)的比活性比针对麦芽糖的比活性高约6倍。因此，针对短链糖类，如麦芽糖的比活性提高(不降低针对寡糖的活性)也允许使用较低酶剂量和/或较短处理时间。
此外，用具有增加的α-1，4-水解活性(如果α-1，6活性未改变或甚至降低)的葡糖淀粉酶变体可得到较高的葡萄糖产量，由于使用了量有所降低的酶蛋白质，减少了α-1，6回复突变产物的形成(较少的异麦芽糖)。
可使用“材料和方法”一节中所述的方法，在37℃或60℃下测定比活性。
其中使用了本发明的葡糖淀粉酶变体的糖化方法的例子包括JP3-224493；JP 1-191693；JP 62-272987；EP 452,238和WO 99/27124中所述的方法(所有参考文献皆并入本文作为参考)。
另一方面，本发明涉及将液化淀粉溶液糖化的方法，所述方法包括步骤：
(i)糖化步骤，在该步骤中，发生了一个或多个酶促糖化过程，随后的步骤是
(ii)一个或多个高温膜分离步骤，
其中使用本发明的热稳定性葡糖淀粉酶变体进行酶促糖化。
在本发明的方法中，可组合使用本发明的葡糖淀粉酶变体和仅水解具有至少4个葡糖残基的分子中的α-(1→6)葡糖苷键的酶。优选组合使用本发明的葡糖淀粉酶变体和支链淀粉酶或异淀粉酶。异淀粉酶和支链淀粉酶的脱支用途，酶的分子特性和具有葡糖淀粉酶活性的酶的潜在用途列于G.M.A.vanBeynum等，Starch Conversion Technology，Marcel Dekker，纽约，1985，101-142。
另一方面，本发明涉及本发明的葡糖淀粉酶变体在淀粉转变过程中的用途。
另外，本发明的葡糖淀粉酶变体可用于包括连续糖化步骤的淀粉连续转变过程。
本发明的葡糖淀粉酶变体也可以固定化的形式使用。这是合适的，经常用于产生特制的糖浆，如麦芽糖糖浆，并进一步用于与果糖糖浆的生产有关的寡糖的残液流(raffinate stream)。
本发明的葡糖淀粉酶也可用于生产燃料或饮料用乙醇的方法，或者用于生产有机化合物的发酵方法，所述有机化合物如柠檬酸，抗坏血酸，赖氨酸，谷氨酸。
材料和方法
材料：
酶：
AMG G1：黑曲霉葡糖淀粉酶G1，公开于Boel等，1984，EMBO J，3(5)，1097-1102和SEQ ID NO：13，可得自Novo Nordisk。
AMG G2：截短的黑曲霉葡糖淀粉酶G1，示于SEQ ID NO：2，可得自Novo Nordisk。
溶液：
缓冲液：0.05M醋酸钠(6.8g溶于1l milli-Q-水中)，pH4.5
终止溶液：0.4M NaOH
GOD-perid，124036，Boehringer Mannheim
底物：
麦芽糖：29mM(1g麦芽糖溶于100ml 50mM醋酸钠，pH4.5)(Sigma)
麦芽糖庚糖：10mM，115mg/10ml(Sigma)
宿主细胞：
米曲霉JaL 125：米曲霉IFO 4177得自Institute for Fermentation，Osaka；17-25 Juso Hammachi 2-Chome Yodogawa-ku，Osaka，日本，其具有被称为“alp”的碱性蛋白酶基因(描述于Murakami K等，1991，Agric.Biol.Chem.，55，p2807-2811)缺失，所述缺失是通过使用米曲霉pyrG基因为标记，经一步基因取代法(描述于G.May，“Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi”，1992，p.1-25，J.R.Kinghorn和G.Turner编；Blackie Academic and Professional)完成的。菌株JaL 125进一步描述于WO 97/35956(Novo Nordisk)。
微生物
菌株：酿酒酵母YNG318：MATαleu2-Δ2 ura3-52 his4-539 pep4-Δ1[cir+]
质粒：
pCAMG91：见图1，该质粒含有黑曲霉G1葡糖淀粉酶(AMG G1)，pCAMG91的构建描述于Boel等，1984，EMBO J，3(7)，p.1581-1585。
pMT838：该质粒编码截短的黑曲霉葡糖淀粉酶G2(SEQ ID NO：2)。
pJSO026：(酿酒酵母表达质粒)(J.S.Okkels，1996，“A URA3-promoterdeletion in a pYES vector increases the expression level of a fungal lipase inSaccharomyces cerevisiae”，Recombinant DNA Biotechnology III：TheIntegration of Biology and Engineering Science，Vol.782 of the Annals of theNew York Academy of Science)。更具体地，通过用得自酿酒酵母的组成型表达的TPI(丙糖磷酸异构酶)启动子(Albert和Karwasaki，1982，J.Mol.Appl.Genet.，1，419-434)替代pYES2.0的诱导型GAL1-启动子，并缺失URA3启动子的一部分，由pYES2.0得到表达质粒pJSO37。
方法：
酿酒酵母YNG318的转化
混合DNA片段和开环载体，并通过标准方法转化至酵母酿酒酵母YNG318中。
测定以Kcat(sec.-1)表示的比活性
在选定的温度下，如37℃或60℃，将750μl底物(1％麦芽糖，50mM醋酸钠，pH4.3)保温5分钟。
加入50μl用醋酸钠稀释的酶。在0，3，6，9和12分钟之后取出100μl等分试样，并转移至100μl 0.4M氢氧化钠中以终止反应。也包括空白对照。
将20μl转移至微滴板中，加入200μl GOD-Perid溶液，室温下保温30分钟之后，在650nm下测定光吸收值。
葡萄糖被用作标准，比活性被计算为Kcat(sec.-1)。
测定AGU活性并表示为AGU/mg
一个Novo淀粉葡糖苷酶单位(AGU)被定义为于37℃和pH4.3，每分钟水解1μM麦芽糖的酶量。分析方法(AEL-SM-0131)的详细描述可根据要求由Novo Nordisk提供。
使用Boehringer Mannheim的Glucose GOD-Perid试剂盒，124036，通过(AEL-SM-0131)的改良方法将活性测定为AGU/ml。标准：AMG-标准，批号7-1195，195 AGU/ml。
于37℃，将375μl底物(1％麦芽糖，50mM醋酸钠，pH4.3)保温5分钟。加入25μl用醋酸钠稀释的酶。10分钟之后通过加入100μl 0.25M氢氧化钠以终止反应。将20μl转移至96孔微滴板中，加入200μl GOD-Perid溶液，室温下保温30分钟之后，在650nm下测定光吸收值，根据AMG-标准将活性计算为AGU/ml。
然后用活性(AGU/ml)除以蛋白质浓度(mg/ml)，计算出比活性(AGU/mg)。
米曲霉的转化(一般方法)
用米曲霉的孢子接种100ml YPD(Sherman等，1981，Method in YeastGenetics，冷泉港实验室)，振荡培养约24小时。通过流经miracloth过滤以收获菌丝体，并用200ml 0.6M MgSO4洗涤。将菌丝体悬浮于15ml 1.2MMgSO4，10mM NaH2PO4，pH5.8中。在冰上冷却悬浮液，加入1ml含有120mgNovozymTM 234的缓冲液。5分钟之后，加入1ml 12mg/ml BSA(Sigma型号H25)，于37℃持续缓慢搅拌保温1.5至2.5小时，直至在显微镜下检查出样品中可见大量原生质体。
通过miracloth过滤悬浮液，将滤液转移至无菌的试管中，铺一层5ml0.6M山梨糖醇，100mM Tris-HCl，pH7.0。1000g离心15分钟，从MgSO4垫层的上部收集原生质体，在原生质体悬浮液中加入2体积的STC(1.2M山梨糖醇，10mM Tris-HCl，pH7.5，10mM CaCl2)，以1000g将混合物离心5分钟。将原生质体沉淀物重悬于3ml STC中，并重新沉淀。重复该步骤，最终，将原生质体重悬于0.2-1ml STC中。
将100μl原生质体悬浮液与溶于10μl STC中的5-25μg p3SR2(携有构巢曲霉amdS基因的质粒，其描述于Hynes等，Mol.And Cel.Biol.，Vol.3，No.8，1430-1439，Aug.1983)混合。将混合物置于室温放25分钟，加入0.2ml 60％PEG 4000(BDH 29576)，10mM CaCl2和10mM Tris-HCl，pH7.5，小心混合(两次)，最终加入0.85ml相同的溶液并小心混合。将混合物置于室温放25分钟，以2500g离心15分钟，将沉淀物重新悬浮于2ml 1.2M山梨糖醇中。再进行一次沉降之后，将原生质体铺于基本平板(Cove，1966，Biochem.Biophys.Acta113，51-56)，所述平板含有1.0M蔗糖，pH7.0，以10mM乙酰胺为氮源，并含20mM CsCl以抑制背景生长。于37℃保温4至7天之后，挑选孢子，悬浮于无菌水中，铺平板以得到单菌落。重复该方法，储存第二次重分离之后的单菌落孢子，将其作为确定的转化子。
补料分批发酵
在含有麦芽糖糊精作为碳源，尿素作为氮源，和酵母提取物的培养基中进行补料分批发酵。通过将所述米曲霉宿主细胞的摇瓶培养物接种于含有3.5％碳源和0.5％氮源的培养基中来进行补料分批发酵。在pH5.0和34℃下培养24小时之后，开始持续补加碳源和氮源。碳源被当成限速因子，它可以确保存在过量的氧。补料分批培养持续4天，然后通过离心，超滤，清洗过滤和除菌过滤回收酶。
纯化
过滤培养液(culture broth)，加入硫酸铵(AMS)至浓度为1.7M AMS，将pH调节为pH5。离心除去沉淀的物质，将含有葡糖淀粉酶活性的溶液上样于预先用1.7M AMS，20mM醋酸钠，pH5平衡过的Toyo Pearl Butyl柱。使用1.7至0M AMS的线性梯度，用超过10倍柱体积的10mM醋酸钠，pH4.5洗脱结合的蛋白质。收集含葡糖淀粉酶的级分，对着20mM醋酸钠，pH4.5进行透析。然后将溶液上样于预先用10mM Piperazin，Sigma，pH5.5平衡过的QSepharose柱。用平衡缓冲液洗下未结合的物质。用超过10倍柱体积的10mMPiperazin，pH5.5中的0-0.3M氯化钠线性梯度洗脱结合的蛋白质。收集含葡糖淀粉酶的级分，通过SDS-PAGE确定纯度。
T1/2(半寿期)方法I
使用下列方法将变体的热稳定性测定为T1/2：于68℃或70℃，将950μl50mM醋酸钠缓冲液(pH4.3)(NaOAc)保温5分钟。加入50μl溶于缓冲液中的酶(4 AGU/ml)。在0，5，10，20，30和40分钟之后取出2×40μl样品，并在冰上冷却。将保温之前(0分钟)测定的活性(AGU/ml)用作对照(100％)。稳定性的降低(以百分比表示)被计算为保温时间的函数。在不同的时间测定％残留的葡糖淀粉酶活性。T1/2是直至％相对活性降低为50％所花的时间。
T1/2(半寿期)(方法II)
通过在所述温度(如70℃)下，在30％葡萄糖，50mM醋酸钠，pH4.5中保温所述酶(ca 0.2 AGU/ml)来测定T1/2。在给定的时间间隔取出样品，置于冰上冷却，并通过pNPG法(如下文所述)测定残留的酶活性。
在不同的时间测定％残留的葡糖淀粉酶活性。T1/2是直至％相对活性降低为50％所花的时间。
残留的酶活性(pNPG法)
pNPG试剂：
将0.2g pNPG(对-硝基苯基葡糖吡喃糖苷)溶解于0.1M醋酸盐缓冲液(pH4.3)，并将体积调节至100ml。
硼酸盐溶液：
将3.8g Na2B4O7·10H2O溶解于Milli-Q水中，并将体积调节为100ml。
在25μl样品中加入50μl底物，于50℃保温2小时。通过加入150μl硼酸盐溶液以终止反应。测定405nm处的光密度，计算残留的活性。
构建pAMGY
按下述构建pAMGY载体：用AMG基因取代pJSO026中的脂肪酶基因，AMG基因是使用含有AMG基因的模板质粒pLAC103，用正向引物FG2：5’-CAT CCC CAG GAT CCT TAC TCA GCA ATG-3’和反向引物RG2：5’-CTCAAA CGA CTC ACC AGC CTC TAG AGT-3’经PCR扩增得到的。于37℃，用XbaI和SmaI将pJSO026质粒消化2小时，使用Klenow片段将PCR扩增子成为平端，然后用XbaI消化。连接载体片段和PCR扩增子，通过电转化转化至大肠杆菌。所得载体被称为pAMGY。
构建pLaC103
黑曲霉AMGII cDNA克隆(Boel等，1984，文献同上)被用作来源以构建pLaC103，从而在酿酒酵母中表达GII型AMG。
按下述几个步骤进行构建。
用XbaI裂解pT7-212(EP37856/US专利5162498)，用Klenow DNA聚合酶和dNTP使其成为平端。用EcoRI裂解之后，从琼脂糖凝胶电泳中纯化所得的载体片段，并与pBoel53的2.05kb EcoRI-EcoRV片段连接，籍此在所得质粒pG2x中重新产生位于AMG编码片段的EcoRV末端的XbaI位点。
为了除去AMG编码序列上游的DNA，并在编码AMG的DNA中安插适当的限制性内切核酸酶识别位点，需制备下列构建体：
分离p53的930bp EcoRI-PstI片段，用AluI裂解，将所得771bp Alu-PstI片段连接至具有平端EcoRI位点的pBR322(见上文)，并用PstI裂解。在所得质粒pBR-AMG’中，在离AMG编码序列起始密码子仅34bp的位置处重新产生了EcoRI位点。
从pBR-AMG’中分离775bp EcoRI-PstI片段，并在包括pT7-212的XbaI-EcoRI载体片段的连接反应中与pG2x的1151bp PstI-XbaI片段连接。
在碱性磷酸酶的存在下，用BamHI裂解所得质粒pT7GII，灭活磷酸酶之后用SphI进行部分消化。由此反应得到2489bp SphI-BamHI片段，其含有与AMGII编码序列相连的酿酒酵母TPI启动子。
上述片段和pT7GII的1052bp BamHI片段与经碱性磷酸酶处理的，由SphI-BamHI消化所得的pMT743(EP37856/US5162498)载体片段相连接，所得质粒是pLaC103。
筛选热稳定性AMG变体
在下文所述的热稳定性滤膜试验中筛选文库。
滤膜试验分析热稳定性
于30℃，将酵母文库铺于含100μg/ml氨苄青霉素的SCFura-琼脂平板上的醋酸纤维素(OE 67，Schleicher & Schuell，Dassel，德国)-和硝酸纤维素滤膜(Protran-Ba 85，Schleicher & Schuell，Dassel，德国)的夹层中放置至少72小时。将菌落影印铺板于用甲醇激活1分钟的PVDF滤膜(Immobilon-P，Millipore，Bedford)，或者Protran滤膜(未激活)，随后用0.1M NaAc洗涤，置于室温下保温2小时。用自来水洗涤PVDF/Protran滤膜上的菌落，在保温之前用针头特异性标记各个滤膜夹层和PVDF/Protran滤膜，从而能在筛选之后将阳性变体定位于滤膜上。将具有结合变体的PVDF滤膜转移至含0.1M NaAc，pH4.5的容器中，于47℃保温(如果是Protran滤膜，则在67-69℃保温)15分钟。室温下储存SC ura-琼脂平板上的醋酸纤维素和硝酸纤维素滤膜的夹层直至使用。保温之后，在含有5％麦芽糖，1％琼脂糖，50mM NaAc，pH4.5的平板上检测残留的活性。按与滤膜夹层相同的方式标记具PVDF滤膜的检测平板，50℃保温2小时。取出PVDF滤膜之后，用Glucose GOD perid(BoehringerMannheim GmbH，德国)染色检测平板。在白色背景上，检测平板上具有残留活性的变体被检测为暗绿色的点。改良变体位于储存平板上。在与第一次筛选相同的条件下将改良变体再筛选2次。
使用掺加方案进行随机诱变的一般方法
通过下列步骤进行随机诱变：
1.在亲代酶中选择需修饰的区域，
2.确定选定区域中的突变位点和无需突变的位点，
3.确定应进行何种类型的突变，例如与所构建的变体的所需稳定性和/或性能相关的突变，
4.选择结构合理的突变，
5.考虑到步骤4，调整步骤3所选择的残基，
6.利用适当的掺加算法分析核苷酸分布，
7.必要时，将需要的残基调整为实际的遗传密码，例如考虑到遗传密码的局限性，例如为了避免导入终止密码子；本领域技术人员会意识到在实践中不能使用一些密码子的组合，而需改动这些组合，
8.制备引物，
9.使用引物进行随机诱变，
10.通过筛选所需的改良特性来选择所得的葡糖淀粉酶变体。
掺加算法规则
用于步骤6的适当的掺加算法是本领域众所周知的。一个这种算法描述于Tomandl，D等，1997，Journal of Computer-Aided Molecular Design，11：29-38。另一个算法是DOPE(Jensen，LJ，Andersen，KV，Svendsen，A和Kretzschmar，T，1998，Nucleic Acid Research，26：697-702)。
使用分子模拟推断出温度活性重要区的方法
对目的酶(本文是AMG)的X-射线结构和/或模型-制作结构进行分子动力学模拟。使用CHARMM(得自分子模拟(MSI))程序或其它适当程序，如DISCOVER(得自MSI)进行分子动力学模拟。所述动力学模拟在真空，或包括结晶水，或与包埋于适当水体如球体或盒中的目的酶一起进行。模拟进行300皮秒(ps)，或更长时间，如300至1200ps。推断出结构中CA碳的各向同性波动，并且进行结构之间的比较。有关如何获得各向同性波动的详细描述见于CHARMM手册(得自MSI)(并入本文作为参考)。
可使用可带电氨基酸上的标准电荷进行分子动力学模拟。例如，Asp和Glu带负电，Lys和Arg带正电。此状况类似于约7.0的中性pH。为了分析较低的pH，可以滴定分子以便得到正常可滴定残基在pH 2-10的pKa变化；所述残基为Lys，Arg，Asp，Glu，Tyr和His。Ser，Thr和Cys也是可滴定的，但是不在考虑之列。此处，因pH所致的电荷改变被描述为：在高pH时Arg，Lys都带负电，Asp，Glu都不带电。这模仿了4至5的pH，此时一般会发生Asp和Glu的滴定。
通过使用MSI程序包中的HOMOLOGY模型可获得目的酶的模型构建。泡盛曲霉变体X100的晶体结构可见于例如Brookhaven数据库中的3GLY和1DOG。
实施例
实施例1  构建AMG G2变体
定点诱变：
为了构建AMG G2(SEQ ID NO：2)的变体，按供应商的说明使用了市售的Chameleon双链定点诱变试剂盒。
通过在含有AMG G1形式的质粒pCAMG91(见图1)中缺失介于G2第1362位核苷酸和G2第1530位核苷酸之间的DNA，制备pMT838，将编码所述AMG G2酶的基因置于上述pMT838上。
按说明书用以下引物：
7258：5’p gaa tga ctt ggt tga cgc gtc acc agt cac 3’(SEQ ID NO：3)
将pMT838中氨苄青霉素基因的ScaI位点转换为MluI位点(从而改变在氨苄青霉素抗性基因中发现的ScaI位点，并用于切割MluI位点)。然后将含有所述AMG基因的pMT838载体用作DNA聚合酶、寡聚核苷酸7258(SEQID NO：3)和21401(SEQ ID NO：4)的模板。
引物编号21401(SEQ ID NO：4)作为选择引物使用。
21401：5’p gg gga tca tga tag gac tag cca tat taa tga agg gca tat acc acg ccttgg acc tgc gtt ata gcc 3’
(改变了在AMG基因中发现的ScaI位点但未改变氨基酸序列)
通过添加含所需突变的相应寡聚核苷酸将所需突变(如半胱氨酸残基的引入)引入所述AMG基因中。
引物107581用于引入T12P
107581：5’pgc aac gaa gcg ccc gtg gct cgt ac 3’(SEQ ID NO：5)
通过对整个基因测序来检验突变。使用上文“材料与方法”部分所述的方法，将所述质粒转入米曲霉。并如上文“材料与方法”部分所述发酵和纯化变体。
实施例2  通过局部随机掺加诱变来构建比亲代酶热稳定性增强的黑曲 霉AMG变体
在黑曲霉AMG的预选区实施随机诱变以增强热稳定性。
残基：
区域：L19-G35
区域：A353-V374
用DOPE软件(见材料与方法)测定上述区域中每一所示的改变的插入(spiked)密码子以使终止密码子的量减至最少(见表1)。计算密码子的三个位置中核苷酸的真实分布，从而得出所示的氨基酸改变的群体。在指定位置对掺加区域进行特异性掺加，从而能有较多机会获得所需残基，但仍允许有其它可能性。
第一列为待突变的氨基酸，第二列为野生型的百分率，第三列为新的氨基酸。
表1在L19-G35中的掺加
L19        90％        N
N20        95％        T
N21        恒定不变的
I22        恒定不变的
G23        95％        A
A24        90％        S，T
D25        93％        S，T，R
G26        95％        A
A27        90％        S，T
W28        ＜80％      R，Y
V29        恒定不变的
S30        93％        T，N
G31        95％        A
A32        95％        V
D33        80％        R，K，H
S34        90％        N
G35        恒定不变的
所得掺加寡核苷酸链示于表2，为有义链：包含引物序列、野生型核苷酸序列、亲代氨基酸序列及每一掺加位置的核苷酸分布。
表2：
位置：            19       20     21     22     23     24    25    26     27
氨基酸序列：      L        N      N      I      G      A     D     G      A
引物：            12T      A3T    AAC    ATC    G4G    5CG   67C   G4T    8CT
野生型核苷酸序列：CTG      AAT    AAC    ATC    GGG    GCG   GAC   GGT    GCT
位置(续)：        28       29     30     31     32     33    34    35
氨基酸序列(续)：  W        V      S      G      A      D     S     G
引物：            91010    GTG    1112C  G4C    G13G   141516      1718T  GGC
野生型核苷酸序列：TGG      GTG    TCG    GGC    GCG    GAC         TCT    GGC
每一掺加位置的核苷酸分布：
1：A10，C90
2：A6，T94
3：A95，C5
4：G95，C5
5：G91，A3，T3，C3
6：G95，A3，C2
7：G3，A95，C2
8：G92，A4，T4
9：A3，T97
10：G95，T5
11：G3，A97
12：G95，A2，C3
13：T5，C95
14：G88，A8，C4
15：G7，A93
16：G4，C96
17：G4，A96
18：G95，A2，C3
正向引物(SEQ ID NO：6)：
FAMGII  ′5-C GAA GCG ACC GTG GCT CGT ACT GCC ATC 12T A3T AAC ATC
G4G 5CG 67C G4T 8CT 91010 GTG 1112C G4C G13G 141516 1718T GGC ATT
GTC GTT GCT AGT CCC AGC ACG GAT AAC-3′
反向引物(SEQ ID NO：7)：
RAMG1：5’-GAT GGC AGT ACG AGC CAC GGT CGC TTC G-3’
表3在A353-V374区中的掺加
A353        ＜80％      D，E，Q，N，Y
L354        90％        Q，E
Y355        90％        N，Q
S356        90％        T，D，N
G357        80％        P，A，S，T
A358        93％        S
A359        90％        S，T，N
T360        90％        R，K
G361        85％        A，S，T
T362        90％        S
Y363        恒定不变的
S364        93％        D
S365        93％        N，Q，K
S366        93％        P，D
S367        恒定不变的
S368        93％        D，N，T
T369        93％        Q，E
Y370        恒定不变的
S371        93％        N
S372        93％        N，T
I373        恒定不变的
V374        93％        N，Y，H
所得掺加寡核苷酸链示于表4，为有义链：包含引物序列、野生型核苷酸序列、亲代氨基酸序列及每一掺加位置的核苷酸分布。
表4：
位置：            353    354      355    356    357    358    359    360    361    362
氨基酸序列：      A      L        Y      S      D      A      A      T      G      T
引物：            123    45A      6AC    78C    910T   11CT   1213T  1415A  1617C  18CC
野生型核苷酸序列：GCA    CTG      TAC    AGC    GAT    GCT    GCT    ACT    GGC    ACC
位置(续)：        363    364      365    366    367    368    369    370
氨基酸序列(续)：  Y      S        S      S      S      S      T      Y
引物：            TAC    1920T    A2122  2324C  AGT    1425C  2627G  T28T
野生型核苷酸序列：TAC    TCT      TCG    TCC    AGT    TCG    ACT    TAT
位置(续)：        371    372      373    374
氨基酸序列(续)：  S      S        I      V
引物：            A16T   2930T    ATT    313233
野生型核苷酸序列：AGT    AGC      ATT    GTA
每一掺加位置的核苷酸分布。
1：G91，A3，T3，C3
2：A13，C87
3：A40，T60
4：G3，A3，C94
5：A6，T94
6：G4，A4，T92
7：G2，A96，C2
8：G93，A3.5，C3.5
9：G87，A8，C5
10：A84，C16
11：G93，T7
12：G92，A5，T3
13：A3，C97
14：G3，A97
15：G2，A2，T4，C92
16：G93，A7
17：G93，C7
18：A90，T10
19：G4，A96
20：G95，A5
21：G96，A4
22：G3，C97
23：G2，A1，T95，C2
24：A3，C97
25：G95，A3，C2
26：G2，A96，C2
27：A5，C95
28：A95，T5
29：G2，A98
30：G94，A4，C2
31：G94，A3，T1，C2
32：A4，T96
33：A20，C80
引物：FAMGIV(SEQ ID NO：8)
5，-GTG TCG CTG GAC TTC TTC AAG 123 45A 6AC 78C 910T 11CT 1213T1415A 1617C 18CC TAC 1920T A2122 2324C AGT 1425C 2627G T28T A16T2930C ATT 313233 GAT GCC GTG AAG ACT TTC GCC GA-3′
引物：RAMGVI(SEQ ID NO：9)
5’-ctt gaa gaa gtc cag cga cac-3’
随机诱变
使用表2和3中显而易见的插入的寡核苷酸(其通用术语称为FAMG)、L19-G35的反向引物RAMG，以及特异性SEQ ID NO：2引物，包含N末端的引物(FG2：5’-CAT CCC CAG GAT CCT TAC TCA GCA ATC-3’(SEQ IDNO：10)和包含C末端的引物(RG2：5’-CTC AAA CGA CTC ACC AGC CTCTAG AGT(SEQ ID NO：11)，以通过重叠延伸法(Horton等，Gene，77(1989)，第61-68页)产生带有21个碱基对的一段重叠的PCR-文库-片段。质粒pAMGY是聚合酶链式反应的模板。经同源重组在大肠杆菌/酵母穿梭质粒pAMGY中克隆PCR片段(见材料和方法)。
筛选
如上面“材料和方法”部分所述，在热稳定性滤膜试验中用Protran滤膜，并在67-69℃温育，以筛选文库。
实施例3通过有DNA寡聚核苷酸插入的PCR改组来构建比亲代酶热 稳定性增强的黑曲霉AMG变体
用聚合酶链式反应(PCR)方法制备携带AMG基因及侧翼区的DNA片段。用DNA酶消化约10μg DNA，并在2％琼脂糖凝胶上电泳。从凝胶上纯化50-150bp的片段。将约1μg纯化片段与5-15倍摩尔过量的携带所需突变的寡聚核苷酸混合。寡聚核苷酸是如下类型的(分别用于构建Hk1ib1，Hk1ib2，Hk1ib3等)：
Hk1ib1：
Hk1-T2X：
5′-ATGTGATTTCCAAGCGCGCGVNNTTGGATTCATGGTTGAGCAA
Hk1-N9X：
5′-CCTTGGATTCATGGTTGAGCVNNGAAGCGACCGTGGCTCGTAC
Hk1-A11X：
5′-ATTCATGGTTGAGCAACGAAVNNACCGTGGCTCGTACTGCCAT
Hk1-L66X：
5′-TCCTCAAGACCCTCGTCGATVNNTTCCGAAATGGAGATACCAG
Hk1-S386X：
5′-CTTTCGCCGATGGCTTCGTCVNNATTGTGGAAACTCACGCCGC
Hk1-E389X：
5′-ATGGCTTCGTCTCTATTGTGVNNACTCACGCCGCAAGCAACGG
Hk1-T390X：
5′-GCTTCGTCTCTATTGTGGAAVNNCACGCCGCAAGCAACGGCTC
Hk1-A393X：
5′-CTATTGTGGAAACTCACGCCVNNAGCAACGGCTCCATGTCCGA
Hk1-S394X：
5′-TTGTGGAAACTCACGCCGCAVNNAACGGCTCCATGTCCGAGCA
Hk1-N395X：
5′-TGGAAACTCACGCCGCAAGCVNNGGCTCCATGTCCGAGCAATA
Hk1-G396X：
5′-AAACTCACGCCGCAAGCAACVNNTCCATGTCCGAGCAATACGA
Hk1-K404X：
5′-CCATGTCCGAGCAATACGACVNNTCTGATGGCGAGCAGCTTTC
Hk1-D406X：
5′-CCGAGCAATACGACAAGTCTVNNGGCGAGCAGCTTTCCGCTCG
Hk1-E408X：
5′-AATACGACAAGTCTGATGGCVNNCAGCTTTCCGCTCGCGACCT
Hk1-L410X：
5′-ACAAGTCTGATGGCGAGCAGVNNTCCGCTCGCGACCTGACCT
Hk1-L423X：
5′-CCTGGTCTTATGCTGCTCTGVNNACCGCCAACAACCGTCGTAA
Hk1-N426X：
5′-ATGCTGCTCTGCTGACCGCCVNNAACCGTCGTAACTCCGTCGTG
Hk1-N427X：
5′-CTGCTCTGCTGACCGCCAACVNNCGTCGTAACTCCGTCGTGCCT
Hk1-Y402X：
5′-ACGGCTCCATGTCCGAGCAANNCGACAAGTCTGATGGCGAGCAGCT
Hk1ib2：
Hk2-L234X-SENSE：
5′-CTGGACCGGCAGCTTCATTNNKGCCAACTTCGATAGCAGCC
Hk2-A235S-ANTISENSE：
5′-GAACGGCTGCTATCGAAGTTAGACAGAATGAAGCTGCCGGTC
Hk2-F237X-SENSE：
5-CAGCTTCATTCTGGCCAACNATGATAGCAGCCGTTCCGGCA
Hk2-D238T-ANTISENSE：
5′-CCTTGCCGGAACGGCTGCTAGTGAAGTTGGCCAGAATGAAGC
Hk2-D238S-ANTISENSE：
5′-CCTTGCCGGAACGGCTGCTAGAGAAGTTGGCCAGAATGAAGC
Hk2-S239X-SENSE：
5′-TCATTCTGGCCAACTTCGATNNCAGCCGTTCCGGCAAGGACG
Hk2-S240G-ANTISENSE：
5′-TTGCGTCCTTGCCGGAACGACCGCTATCGAAGTTGGCCAGAA
Hk2-S242X-ANTISENSE：
5′-GGGTGTTTGCGTCCTTGCCAKNACGGCTGCTATCGAAGTTG
Hk2-G243X-ANTISENSE：
5′-GGAGGGTGTTTGCGTCCTTAKNGGAACGGCTGCTATCGAAG
Hk2-K244R-SENSE：
5′-CGATAGCAGCCGTTCCGGCAGAGACGCAAACACCCTCCTGG
Hk2-T310V-ANTISENSE：
5′-ACGGGTTGCCGTTGTAGTAAACGTCCTCAGGGTACCGACCC
Hk2-T310S-ANTISENSE：
5′-ACGGGTTGCCGTTGTAGTAAGAGTCCTCAGGGTACCGACCC
Hk2-Y311N-SENSE：
5′-TCGGTACCCTGAGGACACGAATTACAACGGCAACCCGTGGT
Hk2-Y312Q-ANTISENSE：
5′-GGAACCACGGGTTGCCGTTTTGGTACGTGTCCTCAGGGTAC
Hk2-Y312N-ANTISENSE：
5′-GGAACCACGGGTTGCCGTTATTGTACGTGTCCTCAGGGTAC
Hk2-N313T-SENSE：
5′-CCCTGAGGACACGTACTACACTGGCAACCCGTGGTTCCTGT
Hk2-N313S-SENSE：
5′-CCCTGAGGACACGTACTACTCTGGCAACCCGTGGTTCCTGT
Hk2-N313G-SENSE：
5′-CCCTGAGGACACGTACTACGGTGGCAACCCGTGGTTCCTGT
Hk2-N315Q-ANTISENSE：
5′-AGGTGCACAGGAACCACGGTTGGCCGTTGTAGTACGTGTCC
Hk2-N315E-ANTISENSE：
5′-AGGTGCACAGGAACCACGGTTCGCCGTTGTAGTACGTGTCC
Hk2-N315R-ANTISENSE：
5′-AGGTGCACAGGAACCACGGTCTGCCGTTGTAGTACGTGTCC
Hk2-F318Y-ANTISENSE：
5′-CGGCAGCCAAGGTGCACAGATACCACGGGTTGCCGTTGTAG
Hk2-Q409P-SENSE：
5′-CGACAAGTCTGATGGCGAGCCACTTTCCGCTCGCGACCTGA
Hk1ib3：
Hk3-D336X-SENSE：
5′-CGATGCTCTATACCAGTGGNNKAAGCAGGGGTCGTTGGAGG
Hk3-K337X-SENSE：
5′-TGCTCTATACCAGTGGGACNNKCAGGGGTCGTTGGAGGTCA
Hk3-Q338X-ANTISENSE：
5′-CTGTGACCTCCAACGACCCGNNCTTGTCCCACTGGTATAGA
Hk3-G339X-SENSE：
5′-ATACCAGTGGGACAAGCAGNCUTCGTTGGAGGTCACAGATG
Hk3-S340X′-ANTISENSE：
5′-ACACATCTGTGACCTCCAAANTCCCCTGCTTGTCCCACTGG
Hk3-S340X″-ANTISENSE：
5′-ACACATCTGTGACCTCCAAANCCCCCTGCTTGTCCCACTGG
Hk3-L341X-SENSE：
5′-GTGGGACAAGCAGGGGTCGNUUGAGGTCACAGATGTGTCGC
Hk3-K352Q-SENSE：
5′-TGTGTCGCTGGACTTCTTCCAAGCACTGTACAGCGATGCTG
Hk3-K352R-SENSE：
5′-TGTGTCGCTGGACTTCTTCAGAGCACTGTACAGCGATGCTG
Hk3-A353D-ANTISENSE：
5′-TAGCAGCATCGCTGTACAGATCCTTGAAGAAGTCCAGCGAC
Hk3-A353S-ANTISENSE：
5′-TAGCAGCATCGCTGTACAGAGACTTGAAGAAGTCCAGCGAC
Hk3-S356P-SENSE：
5′-ACTTCTTCAAGGCACTGTACCCAGATGCTGCTACTGGCACCT
Hk3-S356N-SENSE：
5′-ACTTCTTCAAGGCACTGTACAAUGATGCTGCTACTGGCACCTA
Hk3-S356D-SENSE：
5′-ACTTCTTCAAGGCACTGTACGAUGATGCTGCTACTGGCACCTA
Hk3-D357S-ANTISENSE：
5′-GAGTAGGTGCCAGTAGCAGCAGAGCTGTACAGTGCCTTGAAGA
Hk3-A359S-SENSE：
5′-GGCACTGTACAGCGATGCTTCTACTGGCACCTACTCTTCGT
Hk3-T360V-ANTISENSE：
5′-TGGACGAAGAGTAGGTGCCAACAGCAGCATCGCTGTACAGT
Hk3-G361X-SENSE：
5′-TGTACAGCGATGCTGCTACTNCTACCTACTCTTCGTCCAGTTC
Hk3-T362R-ANTISENSE：
5′-GTCGAACTGGACGAAGAGTATCTGCCAGTAGCAGCATCGCTG
Hk3-S364X-SENSE：
5′-TGCTGCTACTGGCACCTACNNKTCGTCCAGTTCGACTTATAG
Hk3-S365X-SENSE：
5′-TGCTACTGGCACCTACTCTNNKTCCAGTTCGACTTATAGTAG
Hk3-S366T-ANTISENSE：
5′-ATGCTACTATAAGTCGAACTAGTCGAAGAGTAGGTGCCAGTA
Hk3-S368X-ANTISENSE：
5′-TCTACAATGCTACTATAAGTAGNACTGGACGAAGAGTAGGTG
Hk3-T369X-SENSE：
5′-CTACTCTTCGTCCAGTTCGNNKTATAGTAGCATTGTAGATGCC
Hk3-S371X-ANTISENSE：
5′-TTCACGGCATCTACAATGCTATNATAAGTCGAACTGGACGAAG
Hk3-S372X-SENSE：
5′-CGTCCAGTTCGACTTATAGTNNTATTGTAGATGCCGTGAAGAC
向DNA酶处理的DNA与寡聚核苷酸的混合物中添加核苷酸、PCR缓冲液和Taq/Pwo聚合酶。实施PCR装配反应，条件为首先94℃2分钟，然后94℃30秒、45℃30秒、72℃60秒共进行35-40个循环；最后72℃5分钟。
以1μl装配反应物为模板，并加入与AMG基因侧翼区退火的引物，进行PCR扩增反应。参数为：首先94℃2分钟，然后以94℃30秒、55℃30秒、72℃90秒进行35-40个循环；最后72℃10分钟。
由1％琼脂糖凝胶纯化所得PCR产物，将其与线性化的载体混合并转化至感受态的酵母细胞中，如上所述。
实施例4比活性
如上实施例1所述构建的AMG G2变体。以KcAT表示的比活性在纯化样品上，以pH 4.3，37℃的条件，用麦芽糖和麦芽糖庚糖为底物，如在“材料和方法”部分所述进行测定。以AGU/mg表示的比活性也在pH 4.3，37℃，用麦芽糖为底物，如在“材料和方法”部分所述进行测定。
Figure C9980865300551
实施例5在70℃时的热稳定性
用实施例1所述方法构建AMG G2S 119P变体。
按上文“材料和方法”部分所述，使用方法I将热稳定性测定为T1/2，在50mM NaOAc，pH4.5，70℃，0.2AGU/ml中保温30分钟之后将热稳定性测定为％残留活性。试验结果列于下表，并将试验结果与野生型黑曲霉AMG G2相比。
  黑曲霉AMG(酶)   残留活性(％)   T<sub>1/2</sub>(分钟)
  S119P变体   22   17
  野生型(SEQ ID NO：2)   13   8
实施例6 68℃时的热稳定性
使用实施例3所述的方法构建AMG G2变体，只是下表中的第1和2号变体是通过按WO 95/22625(来自Affymax Technologies N.V.)所述的改组而制备的。
如上文“材料和方法”部分所述，于68℃使用方法I将热稳定性测定为T1/2，并与相同条件下的野生型黑曲霉AMG G2比较。过滤上清液之后对培养液进行变体的评价。
  变体   T<sub>1/2</sub>(分钟)   T<sub>1/2</sub>黑曲霉AMGG2(野生型)(分钟)
  1   A246T+T72I   11.3   8.5
  2   G447S+S119P   11.4   7.9
  3   E408R+A425T+S465P+T494A   8.6   8.1
  4   E408R+S386N   12.6   8.9
  5   T2P   9.3   8.5
  6   T2Q+A11P+S394R   10.7   8.5
  7   T2H   9.5   8.9
  8   A11E+E408R   12.7   9.3
  9   T2M+N9A+T390R+D406N+L410R   10.7   8.5
  10   A393R   17.7   8.4
  11   T2R+S386R+A393R   14.1   8.4
  12   A393R+L410R   14.7   7.9
  13   A1V+L66R+Y402F+N427S+S486G   11.7   8.5
  14   T2K+S30P+N427M+S444G+V470M   11.4   8.4
纯化样品在70℃的热稳定性
  酶   T<sub>1/2</sub>(分钟)
  15   AMG G2(野生型)   7.4
  16   T2E+T379A+S386K+A393R   11.6
  17   E408R+S386N   10.2
  18   T2Q+A11P+S394R   9.8
  19   A1V+L66R+Y402F+N427S+S486G   14.1
  20   A393R   14.6
  21   T2R+S386R+A393R   14.1
  22   A393R+L410R   12.9
  23   Y402F   10.1
实施例7在68℃的热稳定性
用实施例3所述方法并随后改组阳性变体，从而构建AMG G2变体。
如“材料和方法”部分所述使用方法I在68℃将热稳定性测定为T1/2，并与同样条件下的野生型黑曲霉AMG G2相比较。将上清过滤后对培养液进行变体的评估。
  变体   T<sub>1/2</sub>(分钟)   T<sub>1/2</sub>黑曲霉AMGG2(野生型)(分钟)
  24   PLASDi+V59A+A393R+T490A   27.2   6.8
i为N末端延伸
实施例8
在68℃的热稳定性
用实施例3所述方法构建AMG G2变体。如“材料和方法”部分所述使用方法I在68℃将热稳定性测定为T1/2，并与同样条件下的野生型黑曲霉AMG G2相比较。将上清过滤后对培养液进行变体的评估。
  变体   T<sub>1/2</sub>(分钟)   T<sub>1/2</sub>黑曲霉AMGG2(野生型)(分钟)
  25   D357S+T360V+S371H   6.6   5.9
  26   N313G+F318Y   8.9   5.9
  27   S356P+S366T   7.3   5.8
  28   S340G+D357S+T360V+S386P   7.2   5.8
实施例9
在70℃的热稳定性
用实施例1所述方法构建AMG G2变体，并评价为半纯化(将培养液过滤，再于G-25柱上脱盐)样品。
用方法I在50mM NaOAc，pH 4.5，70℃，如以上“材料和方法”部分所述将热稳定性测定为％残留活性。检验结果列于下表，并与黑曲霉AMG G2比较。
  酶   T<sub>1/2</sub>(分钟)
  29   AMG G2(野生型)   7
  30   Y402F+S411V   60
  31   S119P+Y402F+S411V   115
  32   S119P+Y312Q+Y402F+T416H   50
实施例10在70℃时存在30％葡萄糖的情况下的热稳定性
用实施例3的方法构建AMG G2变体。
用方法II在70℃如“材料和方法”部分所述将热稳定性测定为T1/2，并与同样条件下的野生型黑曲霉AMG G2比较。
 酶   T<sub>1/2</sub>(小时)
  33  AMG G2(野生型)   1.5
  34  Y402F   2.5
  35  A393R   4.0
  36  T2R+S386R+A393R   2.0
  37  PLASD(N末端)+V59A+A393R+T490A   16.0
实施例11AMG变体S119P+Y402F+S411V和PLASD(N-末 端)+V59A+A393R+T490A各自的糖化性能
AMG变体S119P+Y402F+S411V和PLASD(N-末端)+V59A+A393R+T490A均具有改良的热稳定性，在70℃时如下述测定了它们各自的糖化性能。
参照酶为野生型黑曲霉AMG G2。
糖化在如下条件进行：
底物      10 DE麦芽糖糊精，约30％DS(w/w)
温度      70℃
起始pH    4.3(在70℃)
酶的用量  0.24 AGU/g DS
糖化
通过如下方法制备糖化的底物：将(从普通玉米制备的)麦芽糖糊精溶于沸腾的Milli-Q水中，并将干物质调节为约30％(w/w)。pH调至4.3。将相当于15g干物质的底物的等分试样转移至50ml兰帽玻璃烧瓶中，并置于水浴中搅拌。加入酶，必要时重新调整pH。重复实验。定期取样，在HPLC上分析测定糖的组成。
序列表
(1)序列资料：
(i)申请人：
(A)姓名：NOVO NORDISK A/S
(B)街道：Novo Alle
(C)城市：DK-2880 Bagsvaerd
(E)国家：丹麦
(F)邮编：DK-2880
(G)电话：+45 4444 8888
(H)电传：+45 4449 3256
(ii)发明标题：葡糖淀粉酶变体
(iii)序列数：81
(iv)计算机可读形式：
(A)介质类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容机
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release #1.0，Version #1.25(EPO)
(2)SEQ ID NO：1的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：1605个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑构型：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“cDNA”
(vi)来源：
(B)菌株：黑曲霉
(ix)特征：
(A)名称/关键词：信号肽
(B)位置：1..72
(ix)特征：
(A)名称/关键词：成熟肽
(B)位置：73..1602
(ix)特征：
(A)名称/关键词：CDS
(B)位置：1..1602
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1
ATG TCG TTC CGA TCT CTA CTC GCC CTG AGC GGC CTC GTC TGC ACA GGG     48
Met Ser Phe Arg Ser Leu Leu Ala Leu Ser Gly Leu Val Cys Thr Gly
-24             -20             -15             -10
TTG GCA AAT GTG ATT TCC AAG CGC GCG ACC TTG GAT TCA TGG TTG AGC     96
Leu Ala Asn Val Ile Ser Lys Arg Ala Thr Leu Asp Ser Trp Leu Ser
             -5                   1               5
AAC GAA GCG ACC GTG GCT CGT ACT GCC ATC CTG AAT AAC ATC GGG GCG    144
Asn Glu Ala Thr Val Ala Arg Thr Ala Ile Leu Asn Asn Ile Gly Ala
     10                  15                  20
GAC GGT GCT TGG GTG TCG GGC GCG GAC TCT GGC ATT GTC GTT GCT AGT    192
Asp Gly Ala Trp Val Ser Gly Ala Asp Ser Gly Ile Val Val Ala Ser
 25                  30                  35                  40
CCC AGC ACG GAT AAC CCG GAC TAC TTC TAC ACC TGG ACT CGC GAC TCT    240
Pro Ser Thr Asp Asn Pro Asp Tyr Phe Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser
                 45                  50                  55
GGT CTC GTC CTC AAG ACC CTC GTC GAT CTC TTC CGA AAT GGA GAT ACC    288
Gly Leu Val Leu Lys Thr Leu Val Asp Leu Phe Arg Asn Gly Asp Thr
             60                  65                  70
AGT CTC CTC TCC ACC ATT GAG AAC TAC ATC TCC GCC CAG GCA ATT GTC    336
Ser Leu Leu Ser Thr Ile Glu Asn Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Ile Val
         75                  80                  85
CAG GGT ATC AGT AAC CCC TCT GGT GAT CTG TCC AGC GGC GCT GGT CTC    384
Gln Gly Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Ser Gly Ala Gly Leu
     90                  95                 100
GGT GAA CCC AAG TTC AAT GTC GAT GAG ACT GCC TAC ACT GGT TCT TGG    432
Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Glu Thr Ala Tyr Thr Gly Ser Trp
105                 110                 115                 120
GGA CGG CCG CAG CGA GAT GGT CCG GCT CTG AGA GCA ACT GCT ATG ATC    480
Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile
                125                 130                 135
GGC TTC GGG CAG TGG CTG CTT GAC AAT GGC TAC ACC AGC ACC GCA ACG    528
Gly Phe Gly Gln Trp Leu Leu Asp Asn Gly Tyr Thr Ser Thr Ala Thr
            140                 145                 150
GAC ATT GTT TGG CCC CTC GTT AGG AAC GAC CTG TCG TAT GTG GCT CAA    576
Asp Ile Val Trp Pro Leu Val Arg Asn Asp Leu Ser Tyr Val Ala Gln
        155                 160                 165
TAC TGG AAC CAG ACA GGA TAT GAT CTC TGG GAA GAA GTC AAT GGC TCG    624
Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Ser
    170                 175                 180
TCT TTC TTT ACG ATT GCT GTG CAA CAC CGC GCC CTT GTC GAA GGT AGT    672
Ser Phe Phe Thr Ile Ala Val Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser
185                 190                 195                 200
GCC TTC GCG ACG GCC GTC GGC TCG TCC TGC TCC TGG TGT GAT TCT CAG    720
Ala Phe Ala Thr Ala Val Gly Ser Ser Cys Ser Trp Cys Asp Ser Gln
                205                 210                 215
GCA CCC GAA ATT CTC TGC TAC CTG CAG TCC TTC TGG ACC GGC AGC TTC    768
Ala Pro Glu Ile Leu Cys Tyr Leu Gln Ser Phe Trp Thr Gly Ser Phe
            220                 225                 230
ATT CTG GCC AAC TTC GAT AGC AGC CGT TCC GGC AAG GAC GCA AAC ACC    816
Ile Leu Ala Asn Phe Asp Ser Ser Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr
        235                 240                 245
CTC CTG GGA AGC ATC CAC ACC TTT GAT CCT GAG GCC GCA TGC GAC GAC    864
Leu Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp
    250                 255                 260
TCC ACC TTC CAG CCC TGC TCC CCG CGC GCG CTC GCC AAC CAC AAG GAG     912
Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Glu
265                 270                 275                 280
GTT GTA GAC TCT TTC CGC TCA ATC TAT ACC CTC AAC GAT GGT CTC AGT     960
Val Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Gly Leu Ser
                285                 290                 295
GAC AGC GAG GCT GTT GCG GTG GGT CGG TAC CCT GAG GAC ACG TAC TAC    1008
Asp Ser Glu Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Thr Tyr Tyr
            300                 305                 310
AAC GGC AAC CCG TGG TTC CTG TGC ACC TTG GCT GCC GCA GAG CAG TTG    1056
Asn Gly Asn Pro Trp Phe Leu Cys Thr Leu Ala Ala Ala Glu Gln Leu
        315                 320                 325
TAC GAT GCT CTA TAC CAG TGG GAC AAG CAG GGG TCG TTG GAG GTC ACA    1104
Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp Asp Lys Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr
    330                 335                 340
GAT GTG TCG CTG GAC TTC TTC AAG GCA CTG TAC AGC GAT GCT GCT ACT    1152
Asp Val Ser Leu Asp Phe Phe Lys Ala Leu Tyr Ser Asp Ala Ala Thr
345                 350                 355                 360
GGC ACC TAC TCT TCG TCC AGT TCG ACT TAT AGT AGC ATT GTA GAT GCC    1200
Gly Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Ser Ile Val Asp Ala
                365                 370                 375
GTG AAG ACT TTC GCC GAT GGC TTC GTC TCT ATT GTG GAA ACT CAC GCC    1248
Val Lys Thr Phe Ala Asp Gly Phe Val Ser Ile Val Glu Thr His Ala
            380                 385                 390
GCA AGC AAC GGC TCC ATG TCC GAG CAA TAC GAC AAG TCT GAT GGC GAG    1296
Ala Ser Asn Gly Ser Met Ser Glu Gln Tyr Asp Lys Ser Asp Gly Glu
        395                 400                 405
CAG CTT TCC GCT CGC GAC CTG ACC TGG TCT TAT GCT GCT CTG CTG ACC    1344
Gln Leu Ser Ala Arg Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Leu Leu Thr
    410                 415                 420
GCC AAC AAC CGT CGT AAC TCC GTC GTG CCT GCT TCT TGG GGC GAG ACC    1392
Ala Asn Asn Arg Arg Asn Ser Val Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu Thr
425                 430                 435                 440
TCT GCC AGC AGC GTG CCC GGC ACC TGT GCG GCC ACA TCT GCC ATT GGT    1440
Ser Ala Ser Ser Val Pro Gly Thr Cys Ala Ala Thr Ser Ala Ile Gly
                445                 450                 455
ACC TAC AGC AGT GTG ACT GTC ACC TCG TGG CCG AGT ATC GTG GCT ACT    1488
Thr Tyr Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Trp Pro Ser Ile Val Ala Thr
            460                 465                 470
GGC GGC ACC ACT ACG ACG GCT ACC CCC ACT GGA TCC GGC AGC GTG ACC    1536
Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Pro Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr
        475                 480                 485
TCG ACC AGC AAG ACC ACC GCG ACT GCT AGC AAG ACC AGC ACC ACG ACC    1584
Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr Ala Ser Lys Thr Ser Thr Thr Thr
    490                 495                 500
CGC TCT GGT ATG TCA CTG TGA                                        1605
Arg Ser Gly Met Ser Leu
505                 510
(2)SEQ ID NO：2的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：534个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2
Met Ser Phe Arg Ser Leu Leu Ala Leu Ser Gly Leu Val Cys Thr Gly
-24             -20                 -15                 -10
Leu Ala Asn Val Ile Ser Lys Arg Ala Thr Leu Asp Ser Trp Leu Ser
             -5                   1               5
Asn Glu Ala Thr Val Ala Arg Thr Ala Ile Leu Asn Asn Ile Gly Ala
     10                  15                  20
Asp Gly Ala Trp Val Ser Gly Ala Asp Ser Gly Ile Val Val Ala Ser
 25                  30                  35                  40
Pro Ser Thr Asp Asn Pro Asp Tyr Phe Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser
                 45                  50                  55
Gly Leu Val Leu Lys Thr Leu Val Asp Leu Phe Arg Asn Gly Asp Thr
             60                  65                  70
Ser Leu Leu Ser Thr Ile Glu Asn Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Ile Val
         75                  80                  85
Gln Gly Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Ser Gly Ala Gly Leu
     90                  95                 100
Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Glu Thr Ala Tyr Thr Gly Ser Trp
105                 110                 115                 120
Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile
                125                 130                 135
Gly Phe Gly Gln Trp Leu Leu Asp Asn Gly Tyr Thr Ser Thr Ala Thr
            140                 145                 150
Asp Ile Val Trp Pro Leu Val Arg Asn Asp Leu Ser Tyr Val Ala Gln
        155                 160                 165
Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Ser
    170                 175                 180
Ser Phe Phe Thr Ile Ala Val Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser
185                 190                 195                 200
Ala Phe Ala Thr Ala Val Gly Ser Ser Cys Ser Trp Cys Asp Ser Gln
                205                 210                 215
Ala Pro Glu Ile Leu Cys Tyr Leu Gln Ser Phe Trp Thr Gly Ser Phe
            220                 225                 230
Ile Leu Ala Asn Phe Asp Ser Ser Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr
        235                 240                 245
Leu Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp
    250                 255                 260
Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Glu
265                 270                 275                 280
Val Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Gly Leu Ser
                285                 290                 295
Asp Ser Glu Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Thr Tyr Tyr
            300                 305                 310
Asn Gly Asn Pro Trp Phe Leu Cys Thr Leu Ala Ala Ala Glu Gln Leu
        315                 320                 325
Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp Asp Lys Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr
    330                 335                 340
Asp Val Ser Leu Asp Phe Phe Lys Ala Leu Tyr Ser Asp Ala Ala Thr
345                 350                 355                 360
Gly Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Ser Ile Val Asp Ala
                365                 370                 375
Val Lys Thr Phe Ala Asp Gly Phe Val Ser Ile Val Glu Thr His Ala
            380                 385                 390
Ala Ser Asn Gly Ser Met Ser Glu Gln Tyr Asp Lys Ser Asp Gly Glu
        395                 400                 405
Gln Leu Ser Ala Arg Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Leu Leu Thr
    410                 415                 420
Ala Asn Asn Arg Arg Asn Ser Val Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu Thr
425                 430                 435                 440
Ser Ala Ser Ser Val Pro Gly Thr Cys Ala Ala Thr Ser Ala Ile Gly
                445                 450                 455
Thr Tyr Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Trp Pro Ser Ile Val Ala Thr
            460                 465                 470
Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Pro Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr
        475                 480                 485
Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr Ala Ser Lys Thr Ser Thr Thr Thr
    490                 495                 500
Arg Ser Gly Met Ser Leu
505                 510
(2)SEQ ID NO：3的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：20个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑构型：线性
(ix)特征：
(A)名称/关键词：misc-特征
(B)其它资料：/desc＝“引物7258”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3
gaatgacttg gttgacgcgt  caccagtcac                         20
(2)SEQ ID NO：4的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：68个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑构型：线性
(ix)特征：
(A)名称/关键词：misc-特征
(B)其它资料：/desc＝“引物21401”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4
ggggatcatg ataggactag ccatattaat gaagggcata taccacgcct
tggacctgcg ttatagcc                                     68
(2)SEQ ID NO：5的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：25个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑构型：线性
(ix)特征：
(A)名称/关键词：misc-特征
(B)其它资料：/desc＝“引物107581”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5
gcaacgaagc gcccgtggct cgtac                             25
(2)SEQ ID NO：6的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：109个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑构型：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(ix)特征：
(A)名称/关键词：misc-特征
(B)其它资料：/desc＝“引物FAMGII”
(ix)特征：
(A)名称/关键词：misc-特征
(B)位置：
30，33，42，44，47，48，51，53，56，57，58，
62，63，66，69，71，72，73，74，75
(D)其它资料：/Note＝
1：A10，C90
2：A6，T94
3：A95，C5
4：G95，C5
5：G91，A3，T3，C3
6：G95，A3，C2
7：G3，A95，C2
8：G92，A4，T4
9：A3，T97
10：G95，T5
11：G3，A97
12：G95，A2，C3
13：T5，C95
14：G88，A8，C4
15：G7，A93
16：G4，C96
17：G4，A96
18：G95，A2，C3
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6
CGAAGCGACC GTGGCTCGTA CTGCCATC12 TA3TAACATC G4G5CG67CG
4T8CT91010GT G1112CG4CG13G 1415161718TGGCA TTGTCGTTGC
TAGTCCCAGC ACGGATAAC                                 109
(2)SEQ ID NO：7的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：28个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑构型：线性
(ix)特征：
(A)名称/关键词：misc-特征
(B)其它资料：/desc＝“引物RAMG1”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：7
GATGGCAGTA CGAGCCACGG TCGCTTCG                        28
(2)SEQ ID NO：8的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：110个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑构型：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(ix)特征：
(A)名称/关键词：misc-特征
(B)其它资料：/desc＝“引物FAMGIV”
(ix)特征：
(A)名称/关键词：misc-特征
位置：22，23，24，25，26，28，31，32，34，35，
37，40，41，43，44，46，47，49，55，56，59，60，
61，62，67，68，70，71，74，77，79，80，85，86，87
(D)其它资料：/Note＝
1：G91，A3，T3，C3
2：A13，C87
3：A40，T60
4：G3，A3，C94
5：A6，T94
6：G4，A4，T92
7：G2，A96，C2
8：G93，A3.5，C3.5
9：G87，A8，C5
10：A84，C16
11：G93，T7
12：G92，A5，T3
13：A3，C97
14：G3，A97
15：G2，A2，T4，C92
16：G93，A7
17：G93，C7
18：A90，T10
19：G4，A96
20：G95，A5
21：G96，A4
22：G3，C97
23：G2，A1，T95，C2
24：A3，C97
25：G95，A3，C2
26：G2，A96，C2
27：A5，C95
28：A95，T5
29：G2，A98
30：G94，A4，C2
31：G94，A3，T1，C2
32：A4，T96
33：A20，C80
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8
GTGTCGCTGG ACTTCTTCAA G12345A6AC 78C910T11CT12
13T1415A1617C18C CTAC1920TA2122 2324CAGT1425C26
27GT28TA16T2930 CATT313233GAT GCCGTGAAGA CTTTCGCCGA 110
(2)SEQ ID NO：9的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：21个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑构型：线性
(ix)特征：
(A)名称/关键词：misc-特征
(B)其它资料：/desc＝“引物RAMGVI”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：9
CTTGAAGAAG TCCAGCGACA C
(2)SEQ ID NO：10的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：27个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑构型：线性
(ix)特征：
(A)名称/关键词：misc-特征
(B)其它资料：/desc＝“引物FG2”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：10
CATCCCCAGG ATCCTTACTC AGCAATG
(2)SEQ ID NO：11的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：27个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑构型：线性
(ix)特征：
(A)名称/关键词：misc-特征
(B)其它资料：/desc＝“引物RG2”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：11
CTCAAACGAC TCACCAGCCT CTAGAGT
<210>12
<211>2602
<212>DNA
<213>黑曲霉
<220>
<221>信号肽
<222>(270)...(323)
<221>成熟肽
<222>(342)...(2438)
<221>内含子
<222>(484)...(558)
<221>内含子
<222>(846)...(900)
<221>内含子
<222>(998)...(1058)
<221>内含子
<222>(1697)...(1754)
<400>12
ttcgtcgcct aatgtctcgt ccgttcacaa actgaagagc ttgaagtggc gagatgtctc      60
tgcaggaatt caagctagat gctaagcgat attgcatggc aatatgtgtt gatgcatgtg     120
cttcttcctt cagcttcccc tcgtgcgagt gaggtttggc tataaattga agtggttggt     180
cggggttccg tgaggggctg aagtgcttcc tcccttttag gcgcaactga gagcctgagc     240
ttcatcccca gcatcattac acctcagcaa tgtcgttccg atctctactc gccctgagcg     300
gcctcgtctg cacagggttg gcaaatgtga tttccaagcg cgcgaccttg gattcatggt     360
tgagcaacga agcgaccgtg gctcgtactg ccatcctgaa taacatcggg gcggacggtg     420
cttgggtgtc gggcgcggac tctggcattg tcgttgctag tcccagcacg gataacccgg     480
actgtatgtt tcgagctcag atttagtatg agtgtgtcat tgattgattg atgctgactg     540
gcgtgtcgtt tgttgtagac ttctacacct ggactcgcga ctctggtctc gtcctcaaga     600
ccctcgtcga tctcttccga aatggagata ccagtctcct ctccaccatt gagaactaca     660
tctccgccca ggcaattgtc cagggtatca gtaacccctc tggtgatctg tccagcggcg     720
ctggtctcgg tgaacccaag ttcaatgtcg atgagactgc ctacactggt tcttggggac     780
ggccgcagcg agatggtccg gctctgagag caactgctat gatcggcttc gggcagtggc     840
tgcttgtatg ttctccaccc ccttgcgtct gatctgtgac atatgtagct gactggtcag     900
gacaatggct acaccagcac cgcaacggac attgtttggc ccctcgttag gaacgacctg     960
tcgtatgtgg ctcaatactg gaaccagaca ggatatggtg tgtttgtttt attttaaatt    1020
tccaaagatg cgccagcaga gctaacccgc gatcgcagat ctctgggaag aagtcaatgg    1080
ctcgtctttc tttacgattg ctgtgcaaca ccgcgccctt gtcgaaggta gtgccttcgc    1140
gacggccgtc ggctcgtcct gctcctggtg tgattctcag gcacccgaaa ttctctgcta    1200
cctgcagtcc ttctggaccg gcagcttcat tctggccaac ttcgatagca gccgttccgg    1260
caaggacgca aacaccctcc tgggaagcat ccacaccttt gatcctgagg ccgcatgcga    1320
cgactccacc ttccagccct gctccccgcg cgcgctcgcc aaccacaagg aggttgtaga    1380
ctctttccgc tcaatctata ccctcaacga tggtctcagt gacagcgagg ctgttgcggt    1440
gggtcggtac cctgaggaca cgtactacaa cggcaacccg tggttcctgt gcaccttggc    1500
tgccgcagag cagttgtacg atgctctata ccagtgggac aagcaggggt cgttggaggt    1560
cacagatgtg tcgctggact tcttcaaggc actgtacagc gatgctgcta ctggcaccta    1620
ctcttcgtcc agttcgactt atagtagcat tgtagatgcc gtgaagactt tcgccgatgg    1680
cttcgtctct attgtggtaa gtctacgcta gacaagcgct catgttgaca gagggtgcgt    1740
actaacagaa gtaggaaact cacgccgcaa gcaacggctc catgtccgag caatacgaca    1800
agtctgatgg cgagcagctt tccgctcgcg acctgacctg gtcttatgct gctctgctga    1860
ccgccaacaa ccgtcgtaac tccgtcgtgc ctgcttcttg gggcgagacc tctgccagca    1920
gcgtgcccgg cacctgtgcg gccacatctg ccattggtac ctacagcagt gtgactgtca    1980
cctcgtggcc gagtatcgtg gctactggcg gcaccactac gacggctacc cccactggat    2040
ccggcagcgt gacctcgacc agcaagacca ccgcgactgc tagcaagacc agcaccagta    2100
cgtcatcaac ctcctgtacc actcccaccg ccgtggctgt gactttcgat ctgacagcta    2160
ccaccaccta cggcgagaac atctacctgg tcggatcgat ctctcagctg ggtgactggg    2220
aaaccagcga cggcatagct ctgagtgctg acaagtacac ttccagcgac ccgctctggt    2280
atgtcactgt gactctgccg gctggtgagt cgtttgagta caagtttatc cgcattgaga    2340
gcgatgactc cgtggagtgg gagagtgatc ccaaccgaga atacaccgtt cctcaggcgt    2400
gcggaacgtc gaccgcgacg gtgactgaca cctggcggtg acaatcaatc catttcgcta    2460
tagttaaagg atggggatga gggcaattgg ttatatgatc atgtatgtag tgggtgtgca    2520
taatagtagt gaaatggaag ccaagtcatg tgattgtaat cgaccgacgg aattgaggat    2580
atccggaaat acagacaccg gg                                             2602
<210>SEQ ID NO：13
<211>长度：640
<212>类型：PRT
<213>生物体：黑曲霉
<400>SEQ ID NO：13
Met Ser Phe Arg Ser Leu Leu Ala Leu Ser Gly Leu Val Cys Thr Gly
 1               5                  10                  15
Leu Ala Asn Val Ile Ser Lys Arg Ala Thr Leu Asp Ser Trp Leu Ser
            20                  25                  30
Asn Glu Ala Thr Val Ala Arg Thr Ala Ile Leu Asn Asn Ile Gly Ala
        35                  40                  45
Asp Gly Ala Trp Val Ser Gly Ala Asp Ser Gly Ile Val Val Ala Ser
    50                  55                  60
Pro Ser Thr Asp Asn Pro Asp Tyr Phe Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser
65                  70                  75                  80
Gly Leu Val Leu Lys Thr Leu Val Asp Leu Phe Arg Asn Gly Asp Thr
                85                  90                  95
Ser Leu Leu Ser Thr Ile Glu Asn Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Ile Val
            100                 105                 110
Gln Gly Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Ser Gly Ala Gly Leu
        115                 120                 125
Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Glu Thr Ala Tyr Thr Gly Ser Trp
    130                 135                 140
Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile
145                 150                 155                 160
Gly Phe Gly Gln Trp Leu Leu Asp Asn Gly Tyr Thr Ser Thr Ala Thr
                165                 170                 175
Asp Ile Val Trp Pro Leu Val Arg Asn Asp Leu Ser Tyr Val Ala Gln
            180                 185                 190
Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Ser
        195                 200                 205
Ser Phe Phe Thr Ile Ala Val Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser
    210                 215                 220
Ala Phe Ala Thr Ala Val Gly Ser Ser Cys Ser Trp Cys Asp Ser Gln
225                 230                 235                 240
Ala Pro Glu Ile Leu Cys Tyr Leu Gln Ser Phe Trp Thr Gly Ser Phe
                245                 250                 255
Ile Leu Ala Asn Phe Asp Ser Ser Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr
            260                 265                 270
Leu Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp
        275                 280                 285
Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Glu
    290                 295                 300
Val Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Gly Leu Ser
305                 310                 315                 320
Asp Ser Glu Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Thr Tyr Tyr
                325                 330                 335
Asn Gly Asn Pro Trp Phe Leu Cys Thr Leu Ala Ala Ala Glu Gln Leu
            340                 345                 350
Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp Asp Lys Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr
        355                 360                 365
Asp Val Ser Leu Asp Phe Phe Lys Ala Leu Tyr Ser Asp Ala Ala Thr
    370                 375                 380
Gly Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Ser Ile Val Asp Ala
385                 390                 395                 400
Val Lys Thr Phe Ala Asp Gly Phe Val Ser Ile Val Glu Thr His Ala
                405                 410                 415
Ala Ser Asn Gly Ser Met Ser Glu Gln Tyr Asp Lys Ser Asp Gly Glu
            420                 425                 430
Gln Leu Ser Ala Arg Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Leu Leu Thr
        435                 440                 445
Ala Asn Asn Arg Arg Asn Ser Val Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu Thr
    450                 455                 460
Ser Ala Ser Ser Val Pro Gly Thr Cys Ala Ala Thr Ser Ala Ile Gly
465                 470                 475                 480
Thr Tyr Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Trp Pro Ser Ile Val Ala Thr
                485                 490                 495
Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Pro Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr
            500                 505                 510
Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr Ala Ser Lys Thr Ser Thr Ser Thr
        515                 520                 525
Ser Ser Thr Ser Cys Thr Thr Pro Thr Ala Val Ala Val Thr Phe Asp
    530                 535                 540
Leu Thr Ala Thr Thr Thr Tyr Gly Glu Asn Ile Tyr Leu Val Gly Ser
545                 550                 555                 560
Ile Ser Gln Leu Gly Asp Trp Glu Thr Ser Asp Gly Ile Ala Leu Ser
                565                 570                 575
Ala Asp Lys Tyr Thr Ser Ser Asp Pro Leu Trp Tyr Val Thr Val Thr
            580                 585                 590
Leu Pro Ala Gly Glu Ser Phe Glu Tyr Lys Phe Ile Arg Ile Glu Ser
        595                 600                 605
Asp Asp Ser Val Glu Trp Glu Ser Asp Pro Asn Arg Glu Tyr Thr Val
    610                 615                 620
Pro Gln Ala Cys Gly Thr Ser Thr Ala Thr Val Thr Asp Thr Trp Arg
625                 630                 635                 640
<210>SEQ ID NO：14
<211>长度：43
<212>类型：DNA
<213>生物体：人工序列
atgtgatttc caagcgcgcg vnnttggatt catggttgag caa
<220>特征：
<223>其它资料：引物HK1-T2X
<400>SEQ ID NO：14
<210>SEQ ID NO：15
<211>长度：43
<212>类型：DNA
<213>生物体：人工序列
<220>特征：
<223>其它资料：引物HK1-N9X
<400>SEQ ID NO：15
ccttggattc atggttgagc vnngaagcga ccgtggctcg tac
<210>SEQ ID NO：16
<211>长度：43
<212>类型：DNA
<213>生物体：人工序列
<220>特征：
<223>其它资料：引物HK1-A11X
<400>SEQ ID NO：16
attcatggtt gagcaacgaa vnnaccgtgg ctcgtactgc cat
<210>SEQ ID NO：17
<211>长度：43
<212>类型：DNA
<213>生物体：人工序列
<220>特征：
<223>其它资料：引物HK1-L66X
<400>SEQ ID NO：17
tcctcaagac cctcgtcgat vnnttccgaa atggagatac cag
<210>SEQ ID NO：18
<211>长度：43
<212>类型：DNA
<213>生物体：人工序列
<220>特征：
<223>其它资料：引物HK1-S386X
<400>SEQ ID NO：18
ctttcgccga tggcttcgtc vnnattgtgg aaactcacgc cgc
<210>SEQ ID NO：19
<211>长度：43
<212>类型：DNA
<213>生物体：人工序列
<220>特征：
<223>其它资料：引物HK1-E389X
<400>SEQ ID NO：19
atggcttcgt ctctattgtg vnnactcacg ccgcaagcaa cgg
<210>SEQ ID NO：20
<211>长度：43
<212>类型：DNA
<213>生物体：人工序列
<220>特征：
<223>其它资料：引物HK1-T390X
<400>SEQ ID NO：20
GCTTCGTCTC TATTGTGGAA VNNCACGCCG CAAGCAACGG CTC
<210>SEQ ID NO：21
<211>长度：43
<212>类型：DNA
<213>生物体：人工序列
<220>特征：
<223>其它资料：引物HK1-A393X
ctattgtgga aactcacgcc vnnagcaacg gctccatgtc cga
<400>SEQ ID NO：21
<210>SEQ ID NO：22
<211>长度：43
<212>类型：DNA
<213>生物体：人工序列
<220>特征：
<223>其它资料：引物HK1-S394X
<400>SEQ ID NO：22
ttgtggaaac tcacgccgca vnnaacggct ccatgtccga gca
<210>SEQ ID NO：23
<211>长度：43
<212>类型：DNA
<213>生物体：人工序列
<220>特征：
<223>其它资料：引物HK1-N395X
<400>SEQ ID NO：23
tggaaactca cgccgcaagc vnnggctcca tgtccgagca ata
<210>SEQ ID NO：24
<211>长度：43
<212>类型：DNA
<213>生物体：人工序列
<220>特征：
<223>其它资料：引物HK1-G296X
<400>SEQ ID NO：24
aaactcacgc cgcaagcaac vnntccatgt ccgagcaata cga
<210>SEQ ID NO：25
<211>长度：43
<212>类型：DNA
<213>生物体：人工序列
<220>特征：
<223>其它资料：引物HK1-K404X
<400>SEQ ID NO：25
ccatgtccga gcaatacgac vnntctgatg gcgagcagct ttc
<210>SEQ ID NO：26
<211>长度：43
<212>类型：DNA
<213>生物体：人工序列
<220>特征：
<223>其它资料：引物HK1-D406X
<400>SEQ ID NO：26
ccgagcaata cgacaagtct vnnggcgagc agctttccgc tcg
<210>SEQ ID NO：27
<211>长度：43
<212>类型：DNA
<213>生物体：人工序列
<220>特征：
<223>其它资料：引物HK1-E408X
<400>SEQ ID NO：27
aatacgacaa gtctgatggc vnncagcttt ccgctcgcga cct
<210>SEQ ID NO：28
<211>长度：42
<212>类型：DNA
<213>生物体：人工序列
<220>特征：
<223>其它资料：引物HK1-L410X
<400>SEQ ID NO：28
acaagtctga tggcgagcag vnntccgctc gcgacctgac ct
<210>SEQ ID NO：29
<211>长度：43
<212>类型：DNA
<213>生物体：人工序列
<220>特征：
<223>其它资料：引物HK1-L423X
<400>SEQ ID NO：29
cctggtctta tgctgctctg vnnaccgcca acaaccgtcg taa
<210>SEQ ID NO：30
<211>长度：44
<212>类型：DNA
<213>生物体：人工序列
<220>特征：
<223>其它资料：引物HK1-N426X
<400>SEQ ID NO：30
atgctgctct gctgaccgcc vnnaaccgtc gtaactccgt cgtg
<210>SEQ ID NO：31
<211>长度：44
<212>类型：DNA
<213>生物体：人工序列
<220>特征：
<223>其它资料：引物HK1-N427X
<400>SEQ ID NO：31
CTGCTCTGCT GACCGCCAAC VNNCGTCGTA ACTCCGTCGT GCCT
<210>SEQ ID NO：32
<211>长度：46
<212>类型：DNA
<213>生物体：人工序列
<220>特征：
<223>其它资料：引物HK1-Y402X
<400>SEQ ID NO：32
ACGGCTCCAT GTCCGAGCAA NNCGACAAGT CTGATGGCGA GCAGCT
<210>SEQ ID NO：33
<211>长度：41
<212>类型：DNA
<213>生物体：人工序列
<220>特征：
<223>其它资料：引物HK2-L234X-有义
<400>SEQ ID NO：33
ctggaccggc agcttcattn nkgccaactt cgatagcagc c
<210>SEQ ID NO：34
<211>长度：42
<212>类型：DNA
<213>生物体：人工序列
<220>特征：
<223>其它资料：引物HK2-A235X-反义
<400>SEQ ID NO：34
gaacggctgc tatcgaagtt agacagaatg aagctgccgg tc
<210>SEQ ID NO：35
<211>长度：41
<212>类型：DNA
<213>生物体：人工序列
<220>特征：
<223>其它资料：引物HK2-NF237X-有义
<400>SEQ ID NO：35
cagcttcatt ctggccaacn atgatagcag ccgttccggc a
<210>SEQ ID NO：36
<211>长度：42
<212>类型：DNA
<213>生物体：人工序列
<220>特征：
<223>其它资料：引物HK2-D238T-反义
<400>SEQ ID NO：36
ccttgccgga acggctgcta gtgaagttgg ccagaatgaa gc
<210>SEQ ID NO：37
<211>长度：42
<212>类型：DNA
<213>生物体：人工序列
<220>特征：
<223>其它资料：引物HK2-D238S-反义
<400>SEQ ID NO：37
ccttgccgga acggctgcta gagaagttgg ccagaatgaa gc
<210>SEQ ID NO：38
<211>长度：42
<212>类型：DNA
<213>生物体：人工序列
<220>特征：
<223>其它资料：引物HK2-S239X-有义
<400>SEQ ID NO：38
tcattctggc caacttcgat nncagccgtt ccggcaagga cg
<210>SEQ ID NO：39
<211>长度：42
<212>类型：DNA
<213>生物体：人工序列
<220>特征：
<223>其它资料：引物HK2-S240G-反义
<400>SEQ ID NO：39
ttgcgtcctt gccggaacga ccgctatcga agttggccag aa
<210>SEQ ID NO：40
<211>长度：41
<212>类型：DNA
<213>生物体：人工序列
<220>特征：
<223>其它资料：引物HK2-S242X-反义
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cgtccagttc gacttatagt nntattgtag atgccgtgaa gac

Claims (27)

1.具有与亲代葡糖淀粉酶相比改良的热稳定性的亲代葡糖淀粉酶变体，其在下列位置或区域中具有一个或多个突变：
区域：388-414，
其中所述的亲代葡糖淀粉酶是具有SEQ ID NO：2的黑曲霉G2葡糖淀粉酶。
2.权利要求1的变体，其中变体含有一个或多个下列突变：
E408R+A425T+S465P+T494A，E408R+S386N，T2Q+A11P+S394R，A11E+E408R，T2M+N9A+T390R+D406N+L410R，A393R，T2R+S386R+A393R，A393R+L410R，A1V+L66R+Y402F+N427S+S486G，T2E+T379A+S386K+A393R，A1V+L66R+Y402F+N427S+S486G，T2R+S386R+A393R，Y402F，V59A+A393R+T490A，Y402F+S411V，S119P+Y402F+S411V或S119P+Y312Q+Y402F+T416H。
3.DNA构建体，其含有编码权利要求1或2的葡糖淀粉酶变体的DNA序列。
4.重组表达载体，其携有根据权利要求3的DNA构建体。
5.细胞，所述细胞被根据权利要求3的DNA构建体或根据权利要求4的载体转化。
6.根据权利要求5的细胞，其为微生物。
7.根据权利要求6的细胞，其为细菌或真菌。
8.根据权利要求7的细胞，其为蛋白酶缺损的米曲霉或黑曲霉。
9.转化淀粉或将淀粉部分水解成含葡萄糖的浆液的方法，所述方法包括在根据权利要求1或2的葡糖淀粉酶变体的存在下糖化淀粉水解液的步骤。
10.权利要求9的方法，其中葡糖淀粉酶的剂量范围为0.05至0.5AGU/g干固体。
11.权利要求9或10的方法，其包括糖化干固体重量比至少30％的淀粉水解液。
12.权利要求9的方法，其中在选自支链淀粉酶和异淀粉酶的脱支酶存在下进行糖化。
13.权利要求12的方法，其中的支链淀粉酶得自Bacillusacidopullulyticus或Bacillus deramificans，异淀粉酶得自淀粉皮假单胞菌。
14.权利要求9的方法，其中在pH3至5.5，60至80℃的温度下糖化24至72小时。
15.权利要求14的方法，其中在pH4至4.5中糖化36至48小时。
16.糖化液化淀粉溶液的方法，所述方法包括步骤：
(i)糖化步骤，在该步骤中，发生了一个或多个酶促糖化过程，随后的步骤是
(ii)一个或多个高温膜分离步骤，
其中使用根据权利要求1或2的葡糖淀粉酶变体进行酶促糖化。
17.根据权利要求1或2的葡糖淀粉酶变体在淀粉转化过程中的用途。
18.根据权利要求17用途，其中的淀粉转化过程为淀粉连续转化过程。
19.根据权利要求18的用途，其中淀粉连续转化过程包括连续的根据权利要求18的糖化方法。
20.根据权利要求1或2的葡糖淀粉酶变体在生产寡糖的方法中的用途。
21.根据权利要求1或2的葡糖淀粉酶变体在生产特制浆液的方法中的用途。
22.根据权利要求1或2的葡糖淀粉酶变体在生产燃料用乙醇的方法中的用途。
23.根据权利要求1或2的葡糖淀粉酶变体在生产饮料的方法中的用途。
24.根据权利要求1或2的葡糖淀粉酶变体在发酵生产有机化合物的方法中的用途。
25.根据权利要求24的用途，其中的有机化合物为柠檬酸、抗坏血酸、赖氨酸或谷氨酸。
26.改良亲代葡糖淀粉酶的热稳定性的方法，所述方法包括在SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的一个或多个下列位置或区域中进行突变：
区域：388-414，
其中所述的亲代葡糖淀粉酶是具有SEQ ID NO：2的黑曲霉G2葡糖淀粉酶。
27.根据权利要求26的方法，其具有一个或多个下列取代：
E408R+A425T+S465P+T494A，E408R+S386N，T2Q+A11P+S394R，A11E+E408R，T2M+N9A+T390R+D406N+L410R，A393R，T2R+S386R+A393R，A393R+L410R，A1V+L66R+Y402F+N427S+S486G，T2E+T379A+S386K+A393R，A1V+L66R+Y402F+N427S+S486G，T2R+S386R+A393R，Y402F，V59A+A393R+T490A，Y402F+S411V，S119P+Y402F+S411V或S119P+Y312Q+Y402F+T416H。
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