MX2010013122A - Composicion de enzima de sacarificacion y metodo de sacarificacion de la misma. - Google Patents

Abstract

La presente descripción se refiere a una alfa-amilasa (AmyE) de Bacillus subtilis o sus variantes de la misma. La AmyE o sus variantes de las mismas se pueden usar para producir de manera más eficiente azúcares fermentables a partir de almidón. También se describe una composición que comprende una glucoamilasa y AmyE o variante de la misma y método para procesar almidón utilizando la composición descrita de la enzima.

Description

COMPOSICION DE ENZIMA DE SACARIFICACION Y METODO SACARIFICACION DE LA MISMA Campo de la Intención Una composición que comprende una glucoa alfa-amilasa (AmyE) de Bacillus subtilis o varian a es útil a manera de ejemplo en la produ ares fermentables a partir de sustrato de ién se describen a manera ejemplo métodos glucdamilasa y una AmyE o variante de la mi cir etanol a partir de almidón.

Antecedentes de la Invención Se usan ampliamente almidones vegetales, por on de maíz en la producción industrial de productos es y biocombustibles . Por ejemplo, el jarabe de maí nido de fructosa (HFCS) es una forma procesada de ombustible reduce de forma significativa las emis en tanto que mantiene o aún mejora el desem r. Por otra parte, el etanol es un combustible re odo' que su uso puede redu ir la dependencia tes finitas de combustibles sólidos. Adicionalm de etanol puede disminuir la acumulación neta de arbono en la atmósfera.

Se pueden producir jarabes y biocombus ir de almidón por un proceso enzimático que cat omposición de almidón en glucosa. Este proceso e rende típicamente una secuencia de reacciones ca enzima : (1) Licuefacción: Las alfa-amilasas (EC lizan primero la degradación de una suspen dón, que puede contener 30-40 % p/p de sólidos se ltodextranos.. Las alfa-amilasas son endohidrol licuefacto resultante tiene un bajo equival rosa (DE) y contiene maltosa y azúcares con alto olimerización (DPn) . (2) Sacarificación: Las glucoamilasas y/o 1 asas maltogénicas catalizan la hidrólisis de los eductores de los maltodextran formados despu efacción, liberando D-gluc maltosa e isomal rificación produce jarabes de alto cont alto contenido de maltosa o de alto cont En el caso anterior, las glucoamilasas amente la sacarificación bajo condiciones raturas elevadas, por ejemplo 60 °C, pH 4 amilasas usadas en este proceso se obtienen tí ongos, por ejemplo, glucoamilasa de Aspergill en OptidexMR L400 o glucoamilasa de Humincola ezimas des-ramificadoras , tal como las pul sa de Aspergillus oryzae, el ingrediente ac seM L. Las reacciones de sacarificación de s para producir varios productos, se repres muacion : - Almidón Licuado 0.3 % de D-glucjosa 2.0 % de maltosa 97,7 % de otros clligosacáridos Sacarificación ~pH 4.5 -pH Glucoamilasa y/o malto iasa pu ulanasa 50 pp 6Ü°C, 72 h ~55° Iarabe de glucosa íarabe de maltosa 97 % de D-glucosa 4 % de D-glucosa 1.5 % de maltosa 56 % de maltosa 0,5 % de isomaltosa 28 % de maltotriosa LO % de otros oiigosacáridos 12 % de otros oligosac (3) Procesamiento adicional : Un pu ficación en el proceso se presenta después a producción de un jarabe de alto contenido de camente la sacarificación se presenta durant s, tiempo por el cual muchas glucoamilasas fu en actividad significativa, Además , toma una ificativa, por ejemplo, más de 70 % del ti ificación para que el rendimiento de glu mente desde 85% a 96%. Esto es principalmente idrólisis ineficiente de oligosacáridos de b ular por la glucoamilasa . Por consiguiente, el áximo de la producción de gllucosa requerirá u ivamente alta de glucoamilasa y/o un peri ngado de sacarificación. Adicionalmente , aun amilasas maltogénicas y las glucoamilas la sacarificación, las enzimas operan típic ente pH y diferentes temperaturas, como se iormente . Si ambas enzimas usan de manera ltáneas, catalizadas por glucoamilasa de ei . Adicionalmente , el uso de AmyE o variante sacarificación, por ejemplo, mejora ificativa la producción de jarabe de maíz nido de fructosa (HFCS) ol a partir de alm La presente descripción proporciona una com sacarificar un almidón que comprende una glucoa lfa-amilasa . La alfa-amilasa es una alfa-amilas acillus subtilis o una varíante de AmyE que t ncía de aminoácidos con al menos aproximadamen imadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproxim o aproximadamente 98 % de identidad a una una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 to, la alfa-amilasa puede tener un nivel si idad de transglucosidasa como una AmyE que t ncia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En otro asp ión de sustrato, estabilidad térmica, per tividad, perfil de pH/estabilidad, estabilida ción, estabilidad a menor nivel de iones de idad específica, o cualquier combinación de las omposición puede comprender además una fita anasa, una beta-amilasa, una alfa-amilasa fungoi asa, una celulosa, una hemicelulasa, una lipa asa, y/o una isoamilasa. También se describe u procesar un almidón, que comprende sición descrita. En un aspecto, la composición para producir jarabe de maíz de alto conte osa al mezclar adicionalmente una glucosa- isómer aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0, por 7.5. En otro aspecto, la composición se puede u cir etanol. Para la producción de etanol, se forma simultánea sacarificación amilasa es una alfa-amilasa de Bacillus subtilis variante de AmyE que tiene una secuencia de ami menos aproximadamente aproximadament imadamente 90 %, aproximadamente 95 %, o aproxim identidad a una AmyE que tiene una secu ácidos de SEQ ID NO: 1. En otro aspecto, la Am ender una secuencia de aminoácidos expuesta en: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO SEQ ID NO: 27, SE SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO SEQ ID NO: 31, SE EQ ID NO: 33, o SEQ ID NO: 34. En un aspecto, sa puede ser una variante de AmyE que puede ropiedades alteradas en comparación a la enzima tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: edades alteradas pueden ser especificidad de s de sustrato, patrón de escisión de s ilidad térmica, perfil de pH/actividad, pe -amilasa, una alfa-amilasa fungoidea, una prote losa, una hemicelulasa, una lipasa, una cutinasa, milasa. En aún otro aspecto, el método de sacari lmidón puede comprender además producir jarabe de contenido de fructosa (HFCS) . La producción de j de alto contenido de fructosa se puede lograr al glucosa-isomerasa a un pH de aproximadament imadamente 8.0, por ejemplo, pH de 7.5. lidad, el producto contiene aproximadamente 40-tosa. En otro aspecto, el método de sacarific don puede comprender ademas fermentar el rificado para producir etanol. -. La sacarificaci entación se pueden realizar de forma simultánea ucción de etanol . También proporciona un mé rende además recuperar el etanol. La producción d e comprender destilar el etanol. La fermentaci rothermophilus (SEQ ID NO: 25; AmyS; "B . 11us licheniformis (SEQ ID NO 26 ; AmyL; "B . subtilis (SEQ ID NO: 27; AmyE; "B. sujb"J .

La Figura 2 representa una compara ucturas tridimensionales bre alfa-amilasa ilis (AmyE; Protein Data Bank Acceso No. 1UA7) asa de G. stearothermophilus (AmyS; Protein D so No. 1HVX) .

Las Figuras 3A-3B representan epuestas de alfa-amilasa de G. stearothermophilu in Data Bank Acceso No. 1HVX) (sombreado en gr eniformis (AmyL; Protein Data Bank Acceso No reado en oscuro) . La Figura 3A muestra una com I, en tanto que La Figura 3B muestra una vista a s cadenas laterales seleccionadas de aminoácidos La Figura 3C representa una vista estereogr ácidos. Los residuos se enumeran desde el ácido en la forma madura de las enzimas.

La Figura 5 representa plásmido pME630 ende un polinucleótido (marcado "SAMY ica para AmyE-tr (SEQ ID NO: 2) . El plásmido c linucleótido en cuadro con gen SAMY que codif ecuencia de señal de la alfa-amilasa de B. liche ada "pre LAT") .

La Figura 6 representa eij. análisis por HPL ctos de reacción catalizados por AmyE dur ación con maltosa.

La Figura 7 representa lia composición de a síntesis de maltotriosa mediada por AmyE ( sa y maltotriosa) con el paso del tiempo.

La Figura 8 representa la formación de glu ("AmyE de longitud completa"), AmyE-tr h, 2 h, 4 h y 24 h de AmyS con un sustrato DP7.

Las Figuras 11A-11D representan los produ mposición detectados por HPLC después de una h, 1 h, 2 h, y 3 h de SPEZVMEMR FRED ("Fred") ato DP7.

Las Figuras 12A-12C representan los produ mposición detectados por HPLC después de una in min, 30 min y 90 min de AmyE (SEQ ID NO: 1) con rina de maíz natural.

La Figura 13 representa la formación de et tr ("AmyE truncada") y amilasa SPEZYME XTRA ("X ntacion convencional a pH 4.3 y pH 5.8 La Figura 14 representa la hidrólisis de lar (crudo) insoluble en etanol por AmyE de eta ("AmyE-FL") y AmyE-tr en comparación a alf spergillus kawachii (AkAA) sola o una mezcla as. La absorbancia 520 nm se gráfico contra e varias reacciones de sacarificación.

La Figura 17 representa detección de ual insoluble (IRS) en la sacarificación catali s combinaciones de enzimas.

Figura 18 representa niveles de iores (DP4+) durante la reacción de sacarificaci os usando (1) HGA (glucoamilasa de Humicola gris {glucoamilasa de Trichoderma reesei) , y ( ementada con AmyE.

La Figura 19 representa el nivel de glucosa fermentación con varias glucoamilasas y/o naciones de glucoamilasa y AmyE.

La Figura 20 representa el porcentaje de nte después de la fermentación con varias gluco arias combinaciones de glucoamilasa y AmyE. efiniciones y Abreviaciones De acuerdo con esta descripción detallada, siguientes abreviaciones y definiciones. Se debe como se usa en la presente, las formas singulare " y "el, la" incluyen las referencias plurales el contexto dicte claramente lo contrario. por ejemplo, la referencia "una enzima" inc dad de estas enzimas y la referencia ion" incluye la referencia una o más formu ivalentes de las mismas conocidas por los expert ica y demás . menos que se defina de otro modo, inos técnicas y científicos usados en la present significado como se enpiende comúnmente la técnica. A continuación se proporci términos . hebra complementaria a través de apareamiento d como el proceso de amplificación como se lleva a logias de reacción en cadena de la polimerasa nucleico hibridizado puede existir como ADN o individual o. de doble hebra, un heterodú DN, o un copolimero de AR /ADN. Como se us nte, "copolimero" se refiere a una hebra indiv nucleico que comprende tanto ribonucleótid irribonucleótidos . Los ácidos nucleicos íos que hibridizan bajo "condiciones altamente ácido nucleico descrito en presente. Las con ente severas se definen como hibridación a 50 °C o a 65°C en 0. IX SSC (IX SSC = NaCl 0.15 M, ci 0.015 M, pH 7.0).

Como se usa en presente "secue ótidos" o "secuencia de ácido nucleico" se refie ncialmente libre de al menos otro componente con aterial está naturalmente asociado y se encuent aleza .

"Purificado" significa que el material est relativamente puro por ejemplo imadamente 90 % puro, al menos aproximadamen , o al menos aproximadamente 98 % puro.

"Termoestable" significa que la enzima después de la exposición a temperaturas e ermoestabilidad de cualquier AmyE se mide por (ti/2) , donde la mitad de la actividad enzim e por la vida media. La vida media se mide al de ctividad, específica de alfa-amilasa de la en nece durante el tiempo a una temperatura dete cularmente a una temperatura usada para una ap ífic . de una solución o un sólido, dependiendo del odo de aplicación y/o del modo de administración.

"Oligosacárido" significa una molécu hidrato compuesta de 3-20 monosacáridos .

"Homólogo" significa una entidad que t o grado de entidad u homología" con las p ncias de aminoácidos y las presentes secuen ótidos. Una "secuencia homologa" incluye una s minoácidos que tiene al menos 85 % de ident ncia a la secuencia sujeto, por ejemplo, al men , 95 %, 96 %, 97 %, 98 % Ó 99 de identid ncia sujeto. Típicamente, los homólogos comprend s residuos de sitio activo como la secuencia s ácidos .

Como se una en la presante, "célula trans ye células que se han transformado por el relación que les permite funcionar esta. Por ejemplo, una secuencia reg ablemente enlazada a una secuencia codificante, una manera tal que la expresión de la s ficante se logra bajo una condición compatible ncias de control.

Como se usa en la presente, "biológicamente efiere a una secuencia que tiene una función est o bioquímica similar como la secuencia forma natural , aunque no necesariamente .

Como se usa en la presente, "almidón" se r uier material comprendido de ".os carbohidratos c polisacárido de plantas, comprendidos de am peptina con la fórmula (C6HioO¡)2# en donde "X" uier número. En particular, término se r on" significa solubilización de una molécula de formar una suspensión viscosa.

Como se usa en la presente, "tempera inización" se refiere a la .emperatura más ba presenta la gelatinización un sustrato de emperatura exacta depende del sustrato especí on y adicionalmente puede depender de la cular y de las condiciones de crecimiento de la al de la cual se obtiene el almidón.

"DE" o "equivalente de dextrosa" es un al para medir la concentradion de azúcares re lculada como el porcentaje de los sólidos se han convertido a azúcares reductores. El lar que no se ha hidrolizado tiene un DE Imente 0, y D-glucosa tiene DE de 100.

Como se usa en la presente, "sustrato osa. El jarabe de glucosa tendrá un DE de al meno as modalidades, el jarabe de glucosa puede con de 21 % de agua en tanto que al menos 25 de ctores, calculado como dextrosa. En una modal de glucosa puede incluir menos 90 % de D-gl a. modalidad, el jarabe glucosa puede in s 95 % de D-glucosa. En algunas modalidades, los sa y jarabe de glucosa se usan de manera indisti Como se usa en la presen "azúcares ferme efiere a sacáridos que son capaces de ser metab condiciones de fermentación ce levadura. Estos efieren principalmente a glucosa, maltosa, y mal , DP2 y DP3) .

Como se usa en la presente, "contenido e refiere al contenido total de azúcar pre omposición de almidón.

Como se usa en la presente, "grados la gravedad específica de un líquido. ión entre la gravedad especítica (s . g . ) , y los es: para líquidos más pesados que el agua: s.g. -grados Baumé) ; y para líquidos más ligeros que = 140 ÷ (grados Baumé + 130) .

Para suspensiones de almidón, por nsiones espesas e hidrolizados de almidón, la umé-sustancias secas se describe en Cleland J. é-Dry Substance Tables for Starch Suspensions Chem. anal, Ed. , 15: '334-36 (1943). Ver cal Data Tables, " Corn Refiners Associatio Los grados Baumé son útiles en la indus en húmedo de maíz tanto para el control de para la venta comercial de productos de hidrólis " im sídicos dentro de la molécula de almidón de un oria. En contraste, las enzimas amilolític ntes, tal como las beta-amilasas (EC 3.2.1.2; lucan-maltohidrolasa) y algunas amilasas específ ctos tal como alfa-amilasa maltogénica (EC 3. de la molécula de almidón del extremo no redu ato. Estas enzimas también han descrito como afectan la hexo- o endo-hidrólisis de enlaces sídicos en policacáridos que contienen unidade sa 1 , 4 -a-enlazadas . Otro término usado para d enzimas es glucogenasa. Las nzi-mas ^e ejemplo 1, 4-glucan-4-glucanohidrolasa.

Como se usa en la presente, "glucoamil re a la clase a amiloglucosida.sa de enzimas (EC amilasa, a-1 , 4 -D-glucan-maltohidrolasa) . Est exo-actuantes que liberan residuos de gluc si1-transferasa .

Como se usa en la presente, "sacárido pos o "IPS" se refiere a la amilosa que no se h és de la licuefacción y sacarificación. Cu on sacarificado se prueba con yodo, la amilosa nido de DPn se une a yodo y produce un col terístico. El IPS es altamente indesea aciones de procesamiento almidón, debido a ncía refleja hidrólisis incompleta de almidón.

Como se usa en la presente, "almidón uble" o "IRS" se refiere a almidón incompl lizado que muestra sedimentos después ificación. Un alto nivel de sedimentos es indes aciones de edulcorantes, debido a que pueden in rma sustancial con la eficiencia de producción y endimiento. El IRS también contribuye a una de unidades de anhidroglucopiranosa en un minado. Los ejemplos de DPI son los monosacár glucosa y fructosa. Los ejemplos de DP2 ridos, tal como maltosa sacarosa. Un DP+ a polímeros con un grado de polimerización mayor Como se usa en la presente, "poner en con iar" se refiere a la colocación de las ctivas en proximidad suficientemente cerc ctivo sustrato para permitir que las enzimas co ustrato al producto final. Aquellos expertos ea reconocerán que las soluciones de mezclad a con los sustratos respectivos pueden afectar l ntacto o el mezclado.

Abreviaciones Aplican las siguientes abreviaciones a meno ue de otro modo : AmyL alfa-amilasa de Bacillus lichenif AmyR amilasa Spezimé Xtra AmyS alfa-amilasa de Geobacillus stearothern AS sulfato de alcohol BAA a-amilasa bacteriana ADNc ADN complementario CMC carboximetilceíulosa DE Equivalente de Dextrosa DI destilado, desilonizado ADN ácido desoxiribonucleótido DP3 grado de polimerización con tres subuni DPn grado de polimerización con n subunida DS o ds sólidos seco DT PA ácido dietiltriaminopentaacético EC comisión enzimática para clasific HGA glucoamilasa H]junícola grísea HPLC cromatografía líquida de alta IPS sacárido yodo-positivo IPTG isopropil ß-D-tiogalactosido IRS almidñon insoluble residual kg kilogramo LA Agar luria LB Caldo luria LIT residuo de leucina (L) en la posici laza con un residuo de treonina (T) , donde se ácidos por abreviaciones de una sola letra, co das en la técnica.

LU Unidades de Lipasa MOPS ácido 3- (N-morfolino) propanosulfó MT tonelada métrica PM peso molecular ppm partes por millón PVA poli (alcohol v.milico) PVP poli (vinilpirrolidona) AU Unidades de Amilasa de Referencia RMSD desviación de ra z media cuadr ti ARN ácido ribonucleico rpm revoluciones por minuto SAS sulfonatos de alcano secundarios IX SSC NaCl 0.15 M, citato de sodio 0.015 M, SSF sacarificación y fermentación simultán SSU unidad de almidón soluble; equiva ctor de 1 mg de glucosa liberada por minuto TAED tetraacetiletilendiamina TNBS cido trinitrobecenosulfónico TrGA glucoamilasa de Trichoderma reese w/v peso/volumen entes en microorganismos y tejidos de animales y capaces de hidrolizar enlaces alfa- 1 , 4 -glucosi ógeno, almidón, polisacáridos relacionados, y osac 'ridos . Aunque todas las alfa-amilasas po función catalítica, varían grandemente sus se aminoácidos . La identidad de secuencia en rentes amilasas puede ser virtualmente no exist que cae por abajo de pesar de la cons ción de la secuencia de aminoácidos, las alfa- rten un esquema topológico, total , común qu ificado después de que se han determin cturas tridimensionales de alfa-amilasas de di ies. La estructura tridimensional común revé ios : (1) un barril nTIM" conocido como domini región de asa larga conocida1 como dominio B tada dentro del dominio A, y (3) una región c bra y a-hélice en el dominio A) . Tanto el domini ominio B están directamente comprendidos en la lítica de una alfa-amilasa, debido a que la es imensional indica que el dominio A blanque vo y el dominio traslapa el sitio activo des ionalmente , el dominio A considera puesto que los residuos de aminoácido vo están localizados en las asas que enlazan l as a las alfa-hélices adyacentes. Se cree que el termina la especificidad de la enzima al afectar sustrato. MacGregor et al., Biochi . Biophy : 1-20 (2001) .

Las alfa-amilasas "tipo Termamyl" se refie de alfa-amilasas ampliamente usadas en la indu esamiento de almidón. La alfa-amilasa de B. lich tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, NCIB 12512, NCIB 12513, y DSM 9375, todo ribe en detalle en la Pateríte de los Estado ro 6,440,716 y WO 95/26397, y se incorpora en la referencia.

Aunque las alfa-amilasas contienen ersal los tres dominios analizados anteriorme ucturas tridimensionales de algunas alfa-amila AmyE de B. subtilis, difieren de forma signific -amilasas tipo Termamyl . Estas enzimas se ctivamente como alfa-amilasas no tipo Termamyl. L presenta una alineación de secuencias de alfa-ami acillus stearothermophilus (SEQ ID NO: 25; llus licheniformis {SEQ ID NO 26) , y Bacillus ID NO: 27; AmyE). La alienación de secuencias s programa Kal 2.0 (disponib : //www. ebi . ac . uk/Tools/kalign/inde . html ; ver ) (Protein Data Bank Acceso No. 1BAG) ; Kaga a et riol. 185:6981-84 (2001) (Protein Data Bank Ac . Es desinterés particular comparar la estru al de AmyE con aquellas "alfa-amilasas tipo Te se indica en la Figura 2, un esquema topológico ífica al comparar las estructuras tridimensional y AmyS . Ambas amilasas presentan una estructu ar con tres dominios. Ver, por ejemplo Protein D o Nos. 1UA7 y 1.HVX, respectivamente.

Sin embargo, un examen cercano de las est mensionales de AmyS, AmyL y E.myE, revela una di ctural considerable entre AmyE y las alfa-amila Cuando se sobreponente forma conjunta tas dos amilasas se traslapan casi para cad res dominios. Estas presentes diferencias signif nivel de la cadena lateral de aminoácid ctural es a través de la determinación de la de íz media cuadrática (RMSD) base a una alineac sional determinada. La RMSD es la medida de la d dio entre las dos estructuras de proteína sobre amente, se puede medir la similitud de la es mensional por la RMSD de las coordenadas ató carbonos después de una sobreposición corporal a. Cuando la estructura tridimensional de AmyL Bank Acceso No. 1BLI) se sobrepone a aquella ein Data Bank Acceso No. 1HVX) , la RMSD e rom entre 419 residuos de aminoácido en base onible en http://pymol.orc,). La comparac cturas tridimensionales entre AmyE (Protein D o No. 1UA7) y AmyS (Protein Data Bank Acceso No embargo, una RMSD 8.134 ángstrom e úos de aminoácido. 3.2.1.1; 1 , 4-ot-D-glucan-glucanohidrolasa) de B. s secuencia representativa de AmyE se expone en SE 27. La secuencia de aminoácidos de AmyE mostrad O: 1 es aquella de la forma madura, sin la secu 1 nativa. La secuencia de aminoácidos de AmyE mos ID NO: 27 contienen una secuencia de señal que residuos de aminoácido. La secuencia de aminoá ecuencia de señal nativa de esta AmyE se muestr O: 17. La forma madura de esta AmyE se refiere e de la presente descripción como "AmyE de leta" . Otras secuencias de AmyE tienen a imadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproxim % aproximadamente aproximadamente 9 dad de secuencia a la AmyE de SEQ ID NO: 1, U tmo BLAST de alineación de secuencias etros de alineación por defecto. Por ejemplo, Las secuencias adicionales de proteína AmyE lias descritas en NCBI Accesos Nos. ABK54355 (SE AAF14358 (SEQ ID NO: 30), AAT01440 (SEQ (SEQ ID NO: 32), AAQ8 3841 (SEQ ID NO: 1528 (SEQ ID NO: 34), los contenidos de lo rporan en la presente como referencia.

Una "variante" de AmyE comprende una modi ecuencia de aminoácidos de una secuencia de Amy enta de forma natural. Como se usa en la prese que se presenta de forma natural también es una enitora" , "secuencia progenitor" , pol enitor", o "AmyE tipo silvestre". La modific oácido puede comprender una! sustitución, ad esión de aminoácido. La modificación de aminoáci ante AmyE puede ser el resultado de una mutació enta de manera natural resultado de modi variante retiene al menos aproximadament imadamente 85 %, aproximadamente 90, aproximada aproximadamente 98 % de identidad de secu oácidos a la AmyE de SEQ ID NO: 1, medido eación BLAST de las secuencias de proteína etros de alineación por cefecto. Por ejem ante puede tener una, dos, tres, hasta cinco, has a veinte sustituciones de aminoácido en comparac encia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Típicam n modificaciones a los residuos de aminoácido q ieren para la función biológica. La selección dúos de aminoácido que se van a modificar se pue la homología de secuencia entre las secuencias eneral, los aminoácidos que están bien conservado encias de AmyE más probablemente se van a reque ctividad biológica. Por el contrario, es menos e aminoácido de SEQ ID NO: 1. una modalidad, nte puede comprender 1-3 sust tuciones de aminoá cto a los residuos de aminoácido del dominio B que se presenta de forma natural. En otra modali variante puede tener una ructura tridimensi aslapa con aquella de una AmyE que se presenta al, ya sea total o solo el dominio B, dent rom en promedio. algunas modalidades, una AmyE variant ntar una o más propiedades alteradas en compa ias de la enzima progenitora. Las propiedades a n dar por resultado desempeño mejorado de la var ración a su progenitor. Estas propiedades pueden ificidad de sustrato, unión a sustrato, pa ión de sustrato, estabilidad térmica, pe tividad, perfil de pH/estabilidad, estabilida úos adicionales de aminoácido del N-terminal , después de la escisión de la secuencia de señ escribe en Yang et al, "Nucleotide sequence se gene from Bacillus subtili\ Nucleic Acids 9 (1983) . Una "forma madura" una AmyE se def oducto de todas estas modificaciones pos- traduc secuencia expresada de AmyE. Las secuencias l N-terminal del producto primario de traducció den para formar la AmyE mac.ura se puede desi a alternativa como una "secuencia de señal" , "s , o "pro-secuencia". secuencia de señal puede codificarse gen como la AmyE. Por ejemplo, la AmyE expuest O: 1 se expresa de forma natural de una secu y los aminoácidos N-terminales adicionales qu ecuencia MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASAETA KS onales del N- terminal que no son secuencias d ejemplo, una secuencia señal de 31 re ácido de B. licheniformis ("secuencia guía de fusionar en cuadro con una secuencia de AmyE.

Una variante de AmyE para el propósito ipción tiene al menos actividad parcial o si -D-glucan-glucanohidrolasa, en comparación a u se presenta de forma natural. Adicionalmen nte de AmyE para el propósito de esta descripci también un nivel similar de activi glucosidasa en comparación a la AmyE que ti ncia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. La acti glucosidasa se mide en base a la síntesis enzim triosa a partir de maltosa como se describe ío 2.2. Las variantes pueden tener la misma ac s propiedades como una AmyE tipo silvestre, o para la actividad enzimática. Por ejemplo, la tener un pH óptimo más ácido alcalino .

Una AmyE "truncada" ("AmyE-tr") significa na supresión de secuencia de todo o parte del do nal de unión a almidón. En la AmyE-tr de SEQ I ejemplo, la AmyE de SEQ ID NO: 1 se trunca en el . Está disponible una estructura de cristal de re .5 Á de esta AmyE-tr en Protein Databank No. d , que se describe en Fujimoto et al, "Crystal . catalytic-site mutant alphal-amylase from B. exed with maltopentaose" , J. Mol. Biol. 277: La AmyE-tr se puede truncar en otras posició , Y423, P424, D426 o 1427 de la AmyE de SEQ I condición que se remueva todo o parte del do nal de unión a almidón.

Los ácidos nucleicos que codifican para Am sibles, secuencias que se incorpora en la prese rencia. Los ácidos nucleicos pueden ser secue ARNm, o ADNc . Los ácidos nucleicos incluye encias degeneradas" de cualquiera de los eicos mencionados anteriormente. Una secuencia de iene al menos un codón que cod|ifica para el mismo aminoácido pero tiene una diferente secue eótidos de las secuencias de ácido nucleico, men iormente . Por ejemplo, los ácidos nucleicos uiera secuencia de ácido nucí ico que codifique variante de la misma. pueden diseñar se eradas para la expresión óptima al usar por un organismo hospedador, partícula También se proporcionan ¡vectores que compre leicos que codifican para AmyE o variant proporcionan células hospedadoras que co ilidad, dependencia de Ca2+, intervalo de pH, est oxidación, y termoestabilid d. En un aspec antes de AmyE se expresan a altos niveles con re AmyE tipo silvestre, tanto que retie cterísticas de desempeño de la AmyE tipo silve determinar los niveles expresión y de ática usando ensayos nórmalejs conocidos por e a técnica en este campo. En otro aspecto las estran características mejoradas de desemp ción a la enzima tipo silvesstre, tal como est rada a altas temperaturas o actividad mejorada res de pH, por ejemplo, pH 4.0 a 6.0 o pH 8.0 La variante de AmyE se puede expresar rado en una célula hospedadorá en comparación a sión se refiere en general a la cantidad de a que se puede recuperar de un caldo de ferm cialmente a temperaturas aproximadamente 60 lo, 50-70°C, para el uso en sacarificación, a m lo. Las variantes pueden tener estabilidad al idad especifica a otras temperaturas, dependien variante se va a usar en otras aplicac siciones. Por ejemplo, en productos de horne ante puede exhibir actividad especifica alt rvalos superiores de temperatura.

Las variantes de AmyE también puede ilidad alterada a la oxidación, en partícul ilidad a la oxidación, en comparación a enitora. Por ejemplo, la estabilidad incrementa ción es ventajosa en composiciones detergente ilidad disminuida a la oxidación puede ser vent mposición para licuefacción de almidón.

Las variantes de AmyE descritas en la ificidad, medida por índices de exo-espec itos en la presente, a manera de ejemplo. Las v AmyE incluyen aquellas que enen exo-espec ior o incrementada en comparación a las éptidos progenitores de los cuales se de nalmente cuando se mide bajo condiciones idént manera, por ejemplo, los polipéptidos de vari pueden tener un índice de exo-específicidad de 40 %, 50 %, 60 %, 70 80 %, 90 , 100 %, 500 1000 5000 10,000 % o supe ración a sus polipéptidos progenitores.

En un aspecto, la variante de AmyE tiene ilidad de pH como la secuencia parental . to, la variante comprende una mutación que con intervalo de estabilidad de pH o cambia el inte un área deseada para un propósito comercial fin O %, 100 %, 200 % o mayor vida media en comparac éptido progenitor bajo condiciones idénticas de a alternativa, o además, la variante de AmyE pue actividad específica en comparación al pol nitor bajo condiciones idénticas de pH.

En otro aspecto, se proporciona un ácido ementario a un ácido nucleico que codifi uiera de las variantes de AmyÉ expuestas en la p onalmente, se proporciona ácido nucleico dizar al complemento. En otra modalidad, la s el uso en los métodos y composiciones descrit nte es una secuencia sintética. Incluye, per a a, secuencias producidas con uso de codón ópt presión en un organismo hospedador particular oducción de Alfa-Amilasas Una secuencia de ADN que codifica para la va encia de ADN que codifica paral la alfa-amilasa, p uier vector que se pueda someter de manera conve edimientos de ADN recombinante, y la elección de derá frecuentemente de la ce ula hospedadora en a. a introducir. De esta manera, el vector pued r de replicación autónoma, decir, un ve te como una entidad extra cromosómica, la replica es independiente de la replicación cromosóm r, un plásmido, un bacteriófago o un cromosómico, mini- cromosoma o un cromosoma art anera alternativa, el vector puede ser uno que, c duce en una célula hospedadora, se integra en e a célula hospedador y se replica conjuntamente somas en los cuales se ha integrado. El gen i ién se puede amplificar para crear múltiples co en el cromosoma mediante uso de una cons eótidos de control que codifican para un p ador, sitio de unión a ribosoma, señal de i ucción, y opcionalmente, un gen represor o uno m adores. En un aspecto, todas las secuencias d as, dirigieron el material al medio de cultivo una más fácil recolección de enzimas y opcionalm ficación. Los procedimientos usados para l trucción de ADN que codifica para una AmyE o var misma, el promotor, terminador y otros el activamente, y para insertarlos en vectores adecu ienen la información necesaria para la replicac conocidos por el experto en la técnica Sambrook et al . , MOLECULAR CLONING L, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989 and 3rrad ed., En el vector, la secuencia de ADN se debe anera operable a una secuencia promotora adec ubtilis, B. licheniformis, Bl stearothermophil liquefaciens, el promotor del operón lac de tores dagA o celA del gen de agarasa de Stre color, y los promotores de genes xylA subtilis, etc. Para transcripción dador fungoideo, los ejemplos de promotores út los derivados del gen que codifica para la amil spergillus oryzae, la proteinasea aspártica de Rh alfa-amilasa neutral de Aspergillus ni amilasa estable a ácido de niger, la glucoam iger, la lipasa de Rhizomucor miehei, la ina de A. oryzae, la triosa-fosfato-isomeras e, o la acetamidasa de A. nidulans . Cuando el ica para una alfa-amilasa descrita en la pre sa en una especie bacteriana bal como E. coli, cionar, por ejemplo, un promotor adecuado, a p ecuencia de ADN que codifica para la variant asa. Las secuencias de terminación de poliadenil en derivar de manera adecuada las mismas fuen promotor. El promotor puede comprender ade encia de ADN que permita que el vector se repliq hospedadora en cuestión Los ejemplos encia son los orígenes de replicación de los p 9, pACYC177, pUBUO, pE194, pAMBl, pICatH, y pIJ7 El vector también puede comprender un ccionable, por ejemplo, gen el producto lementa un defecto en la célula hospedadora, tal S dal de B, subtilís o B. licheniformis , o un ere resistencia a antibióticos, por ejemplo, re mpicilina, canamicina, cloranfenicol o tetr, ionalmente, el vector puede comprender marca cción de Aspergillus tal como amdS, argB, niaD, ncía de señal original se puede reemplazar ente secuencia de señal, ¡que se logra de niente por la sustitución de las secuencias de ican para la respectiva secuencia de señal. Por ido nucleico que codifica para AmyE es enlaza d ble a una secuencia de señal de B . licheniformi expresión mostrado la Figura 5. Se ncias de señal en más detalle más adelante .

Una célula aislada, ya sea que compre rucción de ADN o un vector de expresión, ventajosa como una célula hóspedadora en la pr inante de una alfa-amilasa . La célula s formar con la construcción de ADN que codifica amilasa, opcionalmente al integrar la construc (en una o más copias) en el cromosoma hospedad ración se considera en general que es una ventaj erianos, adecuados son especies bacteriana tivas tal como Bacillaceae, 'incluyendo B. subt eniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearotherm alkalophilus , B. amyloliquefiaciens, B. coagul us, B. megaterium, y B. thuringiensis ; Streptomy como S. murinus; especies bacterianas de cido uyendo Lactococcus sp., tal como L. lactis; Lacto incluyendo L. reuteri; Leuconostoc sp.; Pediococ reptococcus sp. Aún otros hospedadores útiles llus sp. A 7-7, a manera de ejemplo. De rnativa, las cepas de una especie bacterian tiva que corresponde a Enterobacteriaceae , inclu o a Pseudomonadaceae se pueden seleccionar co nismo hospedador.

Un organismo hospedador adecuado de lev e seleccionar de especies biot ¡ecnológicamente per ntado realizadas en un fermeritador de tanque ag mil litros (3000 L) . el medio de crecimiento en consistir de sólidos de remojo de maíz y harina fuentes de compuestos orgánicos, junto co nicas como una fuente de sodio, potasio, sio y sulfato, así como elementos traza. Tipi fuente de carbohidrato tal corro glucosa también edio inicial. Una vez que se na establecido por ltivo y empieza a crecer, se dosifica el carbohi anque para mantener el cultivo como se conoc remueven muestras del fermentador a in ares para medir el título enzimático usan ío, un método de ensayo colprimétrico . El pr ntación se detiene cuando velocidad de produ zima se detiene, lo que se incrementa de acuer iones .

Se pueden cultivar células hospedador iciones adecuadas que permitan la expresión d asa. La expresión de las proteínas puede ser cons que se produzcan de manera continua, o induci iere un estímulo para iniciar la expresión. En el esión inducible, se puede iniciar la produc eínas cuando se requiera por la adición de una s ctora, por ejemplo, dexameta ona, IPTG, o Sefa O de cultivo, a manera de ejemplo. También s ucir polipéptidos de manera recombinante en un o libre de células, tal como el sistema de retic onejo y TnTMR (Promega) .

Se puede cultivar un hospedador para exprés asa, bajo condiciones aeróbicas en el medio el hospedador. Se puede proporcionar la agitaci inación de agitación y aireacion, con la produc sarias para la célula hospedadora con relaci ucción del alf -amilasa .

La actividad amilolítica de la enzima determinar usando almidón de patata como ra de ejemplo. Este método se basa en la desco almidón modificado de patata por la enzima igue al mezclar muestras de la) solución de almid una solución de yodo. Inicialmente, se forma negruzco, pero durante la descomposición del al r azul se vuelve más débil y gradualmente se cam rojizo, que se compara una norma de vidrio color urificación del Alfa-Amilasa pueden usar métodos convencionales arar una alfa-amilasa purificada o variante de 1 ués de la fermentación, e obtiene un c entación, y las células microbianas y varios ementado de incubación para recolectar precipit iene la enzima purificada. La solución se c do técnicas convencionales hasta que se obtiene ado de la enzima. La concentración de la solu iene la enzima se puede lograr por cualquiera icas descritas anteriormente. una moda1idad, oración giratoria al vacío y/o ultrafiltración. D rnativa, se puede usar ultrafi Itración.

Por "agente de precipitación" para los pr urificación se quiere decir un compuesto efect ipitar del alfa-amilasa descrita en la present ción, no importa cuál puec.a ser la natura ipitado, es decir, cristalina, amorfa, o una m S . Se puede realizar la precipitación usan lo, un agente de precipitación de haluro metál tes de precipitación de haluro metálico i peración, incluyendo el tiempo de incubación, e eratura y concentración del alfa-amilasa descri enté, será fácilmente evidente para un expert ica después de la prueba de rutina.

En general, se adicionan al menos aproxima v (peso/volumen) a aproximadamente 25 % p/v d lico a la solución concentrada de la variante de ualmente al menos 8 % p/v. En general, no se de aproximadamente 25 % p/v de haluro metáli ción concentrada de variante de enzima y usuali de aproximadamente 20 % p/v. ha. concentración óp te de precipitación de haluro metálico depender s cosas, de la naturaleza del alfa-amilasa descri enté específica y de su concentración en la soluc Otra alternativa para efectuar la precipit enzima es usar compuestos orgánicos que se uyen, pero no se limitan a, éster metílico de xibenzoico (metil-PARABENO) y éster propllico droxibenzoico (propil-PARABENO) , que también son ervadores de amilasa. La adición de este ag ipitación de compuesto orgánico proporciona la ve flexibilidad de las condiciones de precipita ecto al pH, temperatura, concentración entración de agente dé precipitación, y ti bación. En general, se adiciona al menos 0.01 de precipitación de compuesto orgánico a la entrada de variante de enzima y usualmente al me v. En general, se adiciona no más de 0.3 % p/v d precipitación de compuesto orgánico a la entrada de variante de enzima y usualmente no má .

La solución concentrada enzima, que con ere del pl tipo silvestre.

El tiempo de incubación necesario para ob ipitado de enzima purificada depende de la natur nzima específica, de la concentración de la enzi agentes específicos de precipitación y entraciones . En general, ¡el tiempo efecti ipitar la variante de enzima está entre aproxima roximadamente 30 horas; usualmente no excede cer s . En la presencia del afente de precipita uesto orgánico, aún se pue:de reducir el ti bación a menos de aproximadamente 10 horas, y e aún cerca de 6 horas .

En general, la temperatura durante la i entre aproximadamente 4°C y aproximadament ímente, el método se lleva a cabo a una temperat imadamente 10 °C y aproximadamente 45 °C, y d ion del haluro metálico como del compuesto orgáni período de incubación subsiguiente . ados de agitación incluyén agitación rnec dida, aireación vigorosa, o cualquier técnica sim La enzima purificada se puede ionalmente por técnicas convencionales de separac filtración, centrifugación, nicrofiltración, fi toria al vacío, ultrafiltración, filtración en filtración en membrana, cruzada, microfiltra rana de flujo cruzado, o similares. La filtr ana cruzada puede ser un método usado. La puri ional del precipitado de enzima purificada S er al lavar el precipitado con agua. Por eje ipitado de enzima purificada se puede lavar con iene el agente de precipitación de haluro metál lo, con agua que contiene el haluro metálic ipitacion con 70 % de saturación entonces se dis mortiguador y se aplica a una columna tal mna Sephadex G-100, y se eluyel para recuperar va de la enzima. Para purificación adicional, un procedimiento convencional tal como cromatog rcambio iónico.

Se usan enzimas purificas para to caciones en las cuales se ut liza en general la ejemplo, se pueden usar en detergentes de lava vedores de manchas, en la industria alimentici esamiento de almidón y horneado, y en compo acéuticas como ayudas digestivas. Se pueden pro roducto final que es ya sea lí uido (solución, S sa) o sólido (granular o polvo) . manera alternativa, el producto de e recuperar y se adiciona un agente floculador al esar caña de azúcar o para producir compuestos 0 ados, por ejemplo, ácido cítrico, ácido itacónic ico, ácido glucónico, cetonas, aminoácidos, antib as, vitaminas y hormonas. La conversión de a es de fructosa consiste normalmente de tres áticos consecutivos: un proceso de licueface so de sacarificación, y un proceso de isomerizac Como se usa en la presente, el efacción" o "licuar" significa un proceso por el ierte el almidón a dextrinas menos viscosas y d corta. En general, este proceso compre tinización del almidón de forma simultánea con, o la adición de una alfa-amilasa. Como se us ente, el término "licuefacción primaria" se refi de licuefacción cuando la temperatura de la SU aumenta a o cerca de su tempera uefacción secundaria" se refiere al paso de licu iguiente a la licuefacción primaria (calentamien cuando la suspensión spesa se deja en eratura ambiente. Este paso de enfriamiento pued inutos a 180 minutos, por ejemplo 90 minuto tos. Como se usa en la presente, el término wmi efacción secundaria" se refiere al tiempo scurrido desde el inicio de la licuefacción secun nto en que se mide el Equivalente de Dextrosa (DE Después del proceso de licuefacción, eden convertir típicamente en dextrosa por la ad glucoamilasa (por ejemplo, AjMG de Novozymes, onalmente una enzima desramificadora, tal c ilasa o una pululanasa (por ejemplo, Promoz zymes, A/S) . Antes de este paso, el pH se camente a un valor por abajo de aproximadamente esta razón, la reacción se puede catalizar p sola., opcionalmente sin una glucoamila adicional de la presente alfa-amilasa es en convertir dextrinas en dextlrosa por la acción alfa-amilasa bajo las mismas condiciones de reac óptimas para glucoamilasa . Esta propiedad vent y variantes de la misma se describe en la s isional de pantente de los Estados Unidos No. 61/ entada el 6 de junio de 2008, incorporada en la referencia en su totalidad. Debido a que antes de la misma operan al mismo pH y températ lucoamilasa, la AmyE y variantes de la misma s ionar antes o después de la catálisis adicional oamilasa, o por un cóctel de AmyE o variante de a glucoamilasa. De esta manera, se evitan sarios por el ajuste de pH y de la temperatu oamilasas pueden ser de origen fungoide glucoamilasas bacterianas de ejemplo son rgillus, en particular glucoamilasa Gl o I et al., EMBO J. 3(5): 1097-1102 (1984) ) , o vari mismas, tal como se descrtibe en WO 92/0038 4136; glucoamilasa de A. awamori (WO 8 oamilasa de A. oryzae (Hata t al., Agrie. Biol ) : 941-949 (1991)), o variantes o fragmentos as. En una modalidad, el proceso también comprend dominio de unión a carbohidrato del tipo descri 2613. Otras variantes contempladas de glucoam rgillus incluyen variantes para mejorar la est G137A y G139A (Chen al. , Prot. Eng. 9 D257E y D293E/Q (Chen et al., Prot. Eng, i995)); N182 (Chen et al., Biochem. J. 301: 4) ) ; enlaces de disulfuro, A246C (Fierobe hermoamylolyticum (EP 135138) y C. thermohydrosu 86/01831) . Las glucoamilasas adecuadas inclu oamilasas derivadas de Aspergillus oryzae, tal oamilasa que tiene 60 %, 65 %, 70 85 o aún 90 % de homología a la secue o cidos mostrada en SEQ ID NO : 2 en WO 00/04136. adecuadas las glucoamil comerciales, tal ; AJ G 300 L; SANMR SUPER y AM¾ ,WMKR E (Novozymes) ; (Danisco US Inc., Genencor División); AMI SEMR PLUS (de DSM) ; G-ZYME1 MR G900 (Enzyme Bio-Sys kMR (glucoamilasa de A. niger y bajo roteasa) .

Las alfa-amilasas descritas en la pres n combinar de manera ventajosa con una glucoam composición para procesamiento de almidón, por una composición para sacarificación. Debido s enzimas proporcionan un "cóctel" con un espectr ctividad. Por ejemplo, el almidón se puede acto con una o más enzimas seleccionadas del g iste de una alfa-amilasa fungoidea (EC 3.2.1. -amilasa bacteriana, por ejemplo, una alfa-ami llus o una alfa-amilasa no de Bacillus, y/o u asa (EC 3.2.1.2) . En una modalidad, se puede a enzima amilolltica o enzima des-ramificadora, ad como isoamilasa (EC 3.2.1 .68) , o pululana 1.41) a la alfa-amilasa des|crita en la pres ilasa hidroliza los enlaces -1, 6-D-glucosíd ficación en la amilopeptina y ß- límite -dextriñ e distinguir de las pululanasas por la incapacid ilasa para atacar pululano y por la acción lim ilasa en las a- límite-dextrinas . Se pueden a as des-ramificadoras en antidades efectiv ia la hidrólisis (por ejemplo, como 3-fita 3.8) o como 6-fitasas (EC 3.1.3.26)). Un ejempl itasa es mio-inositol-hexaquisfosfato-3 - fosfohidr Se pueden obtener fitasas de microorgani organismos fungoideos y/o bacterianos. Algunos oorganismos incluyen, por ejemplo, Aspergill lo, A. niger, A. terreus, ficum y A. fu liophthora (M. thermoph Ua) , Talaromyce ophilus) Trichoderma spp (T. reesei) . y Ther om 9740) . También, están disporjibles las fitasas cie Penicillium, por ejemplo, P. hordei (ATCC No. iceum (ATCC No. 10519), o PÍ brevi-compactum ( 4) . Ver, por ejemplo Patente de los Estados Un 5,762. Además, están disponibles las fitasas de ejemplo, B. subtilis) , Pseudomonas, Peniophora, Ojbacter, Unterjacter, uttiauxella En una modalidad, la fi¡tasa es una deriva eria Buttiauxiella spp. La Buttiauxiella spp. in stis, B. brennerae, B. ferragutiase, B. gavi dii, B. noackiae, y B. warmboldiae. Las cepa cies Buttiauxella están disponibles de DSMZ, e onal Resource Center fbr Biological Offenstrabe 7B, 38124 Braunschweig, Alemania. La e Buttiauxella sp., bajo el numero de acceso NCI n ejemplo de una cepa particu].ármente útil de la e obtener una fitasa y se usa de acuerdo a la ripción. En algunas modalidac.es, la fitasa es estre, una variante de la misma (tal como BP-11) WO 06/043178, o variante como se describe /0220498, publicada el 11 de septiembre de 2 lo, una BP tipo silvestre variantes de la iben en la Tabla 1 de la WO 06/043178, en tener temperaturas óptimas en el intervalo de y el pH óptimo en el interva.lo de aproximadamen imadamente 7.0. Las beta-amilasas contempladas i no se limitan a, beta-amilasas de cebada Spez SpezymeMR DBA, OptimaltM MR ME, Optimalt .MR BBA ; y Novozym WBA (Novozymes AÁS) .

Después del proceso de sacarificación, rosa se puede convertir en jarabe de alto cont tosa usando una glucosa- isomerasa inmovilizada ( tzyme ) , a manera de ejemplo. A este respe lizado de almidón soluble del proceso se s ersión en jarabe basado en almidón de alto cont tosa (HFSS) , tal como jarabe de maiz de alto cont tosa (HFCS) . Esta conversión se puede lograr us sa-isomerasa, · particularmente una glucosa-i ada en un soporte sólido . Las is medio de una operación unitaria costosa, de mod 1 de concentración de Ca2+ libre está por abajo pueden obtener ahorros ción .

Las alfa-amilasas descritas en la ieren ventajosamente menos o riada de Ca2+ adicion stabilidad. Por esta razón, se puede reducir o ntamente el Ca2+ adicionado a una reac sacarificación, remoción antes de poner en contacto la m ión con glucosa- isomerasa se puede evitar a, ahorrando tiempo, y costo o incrementado la ef proceso para producir un jarabe de alto cont osa . almidón que se va a procesar se puede ob culos, raíces, tallos, legumbres, cereales uyendo fracciones no de almidón tal como dúos de germen. La materia prima, tal como do, tal como el grano molido, se muele para uctura y permitir el procesamiento adicional.

Dos procesos de molienda son adecuados. Mol do y en seco. En la molienda en seco, se muel 0 entero. La molienda en húmedo da una buena se I germen y harina (proteina y granulos de al ímente se usa en la producción de jarabes. enda en seco como en húmedo son bien conocida ica de procesamiento de almidón y también se c el uso con las composiciones y métodos descr eso se puede llevar a cabo en un sis afiltración donde se retiene el producto reteñ rculación en la presencia de enzimas, almidón n , donde el producto permeado es el hidrolizado de ucto permeado es el hidrolizadb de almidón solubl El grano molido seco comprenderá ca ificativas de compuestos de carbohidrato no de ás del almidón. Cuando este material heterog esa por cocción a chorro, frecuentemente solo gelatinización parcial del almidón. Por consiguie -amilasas que tienen una alta actividad hacia el elatinizado se aplican de manera ventajosa en un comprende licuefacción y/o sacarificación del cocido con chorros La suspensión espesa de lmidón que se va a quiera de los aspectos anteriores puede tener cer aproximadamente 55 % de sólidos secos de lar, aproximadamente 25 % a aproximadamente os secos de almidón granular, o aproximadament imadamente 35 % de sólidos secos de almidón gra ejemplo, etanol. Este proceso para producir ir del material que contiene almidón por rende: (i) licuar el material que contiene rificar el puré licuado obtenido; y (iii) ferm rial obtenido en el paso (i en la presenci ismo termentador. Opcionalmente, el proceso c cuperación de etanol. Durante la fermenta nido de etanol alcanza al menos aproximadamente s aproximadamente 8 %, al os aproximadamente s aproximadamente 10 % tal como al menos aproxim , al menos aproximadamente 12 menos aproxim , al menos aproximadamente 14 %, al menos 15 16 % de etanol.

Los procesos de sacarificación y ferment n llevar a cabo como un proceso simult ificación y fermentación (SSF) . Cuando la ferm de le producto retenido se mantiene bajo la cir a presencia de enzimas, almidón natural, l entes de levadura y agua y donde el producto ret quido que contiene etanol.

El hidrolizado de almidón soluble del én se puede usar para la producción de un pro ntación que comprende fermentar el almidón trata cto de fermentación, tal como ácido cítrico, g ólido, ácido glucónico, gluconato de sodio, gluc o, gluconato de potasio, glucono-delta- lact rbato de sodio.

Producción de Etanol a Partir de Almidón En general, la producción de alcohol (eta entero se puede separar en cuatro pasos prin nda, licuefacción, sacarificición y fermenta usar en la sacarificación una glucoamilasa y u En el proceso de licuefacción, los grán on se solubilizan por hidrólisis a maltodr ipalmente de un DP mayor de 4. La hidrólisis r a cabo por tratamiento ácido o de manera alfa-amilasa . Se usa hidrólisis acida en u ada. La materia prima puede ser grano entero corriente secundaria del procesamiento de almi facción enzimática se lleva a cabo típicamente so de suspensión espesa líente de tres pa nsión espesa se calienta entre aproximadam , típicamente cerca de 80-85°C, y se adicion as. Entonces, la suspensión espesa se cose con c aproximadamente 95-140 °C, hípicamente cerca , se enfría a aproximadamente 60-95°C y se adici as para obtener la hidrólisis final. El pro facción se lleva a cabo a aproximadamente pH rificación se usan una glucoamilasa y AmyE o var isma. Un paso de sacarificación completa pue horas, sin embargo, común solo hacer rificación de típicamente 40-90 minutos y luego c sacarificación durante fermentación rificación se lleva a cabo en general a tempera imadamente 30-65 °C, típicamente cerca de aproxim , y a un pH de 4.5.

La levadura típicamente de Saccharomyces iona al puré y la fermentación está en curso dur tal como típicamente 5-60 horas. La tern entre aproximadamente 26-34°C, típicam imadamente 32°C, y el pH de aproximadamente camente cerca de aproximadamente pH 4-5. Se se rocesos más ampliamente usados son un proceso si acarificación y fermentación (¡SSF) donde no hay bles o etanol industrial. Dejado de la fermentac rano, que se usa típicamente para pienso de ani en forma líquida o seca. Los detalles adicionales ar a cabo la licuefacción, la sacarificac entación, la destilación y la recuperación conocidos por la persona experta en la téc rdo al proceso de esta descripción, la sacarifi entación se pueden llevar a cabo de forma simul ra separada.

Aunque la presente invjención se ha desc con referencia a ejemplos más adelante, se pueden hacer varias modificaciones sin apart ritu de la invención, y se conocerá fácilmente rto en la técnica.

Composiciones de Limpieza y de Lavado de Trasto La AmyE o variantes de ta misma, analizad te tensioactivo puede ser anionico, no iónico, ca térico o una mezcla de estos tipos. El detergen ener de 0 % a aproximadamente 90 % en peso de u ioactivo no iónico, tal como alcoholes de caden oxilados, etoxilados, no formadores de espuma adores de espuma. las aplicaciones detergentes, la antes de la misma se usan usualmente en una com ida que contiene propilenglicol . La AmyE o vari misma se pueden solubilizar en propilenglic lo, al hacer circular en una solución de prop 5 % volumen/volumen que contiene 10 % de cí io . composición detergente de lavado contener sales mej oradoras detergente ánicos y/o orgánicos . Los me [¡oradores de deter sales solubles en agua de fpsfonatos. Los eje adores inorgánicos que contienen fósforo, presentes, incluyen carbonatos, boratos y sili es alcalinos, solubles en a.gua, así como los de aluminio-silicatos cristalinos o amorfos, in gua, de los cuales las zeolitas son representant idos .

Los ejemplos de mej oradores orgánicos, a yen el metal alcalino; amcnio y amonio sus tos; succinatos; malonatos; siilfonatos de ácidos ximetoxi-succinatos ; poli cetatos de xilatos ; policarboxilatos ; amiñopoliearbo cetil-carboxilatos; y polihidroxisulfonatos .

Otros aglutinantes orgánicos adecuados incl límero y polímeros de mayor peso molecular, que tienen propiedades mej oradoras , por ejemplo, cop loroisocianúrico, tribromoisoci moisocianúrico, y dicloroisocianúrico, y sales s con cationes solubilizadores en agua tal como io. También son adecuados los compuestos de hid La composición limpiadora puede ueadores de oxigeno, por ej emplo en la forma inorgánica, opcionalmentb con un precu ueador o como un compuesto de peroxi- cido . Los os de compuestos blanqueadores de peroxi adecú ratos de metales alcalinos, tanto tetrahidrat idratos, percarbonatos , persilicatos , y perfos es alcalinos. Los materia es activadores a yen tetraacetiletilendiamina (TAED) y triace rol . Los sistemas de activación de bla ticos también pueden estar presentes, t rato o percarbonato, triaaetato de de gli gentes convencionales, por ejemplo, oculante, material de relleno, depresores de es anti-corrosión, agentes de suspensión de s es secuestrantes, agentes anti-de depósito de s es deshidratantes, tintes bactericidas , escentes, espesadores y perfumes.

Finalmente, la AmyE o variantes de la n usar en detergentes convencionales de la os, por ejemplo, en cualquiera de los dét itos en las siguientes publicaciones de patente deración que la AmyE o variantes de la misma, d a presente, se usan en lugar de, o adem s de c amilasa descrita en las patentes listadas y sol cadas: CA 2006687, GB 2200132, GB 2234980, GB 741617, DE 3727911, DE 4212166, DE 4137470, DE 205071, WO 93/25651, O 93/18129, O 93/04 ntes de la misma pueden ser un componente sición detergente. Como talJ pueden incluí sición detergente en la forma de un granulad , un líquido estabilizado, o una enzima prote n producir granulados no en polvo, por ejemplo, ibe en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4 661,452 y opcionalmente se p eden revestir por idos en la técnica. Los ejempíos de materiales evestimiento son productos de poli (óxido ietilenglicol , PEG) con pesos molares medios de 0; nonilfenoles etoxilados que tienen des de óxido de etileno; alcoholes grasos etoxi uales el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de c os cuales hay de 15 a 80 unidades de óxido de ; oles grasos; ácidos grasos; y mono- y di- ridos de ácidos grasos . Los ejemplos de mater ÍSCO A/S) o EP 238216, a maneta de ejemplo. Los an reconocido por largo tie po como estabiliza eínas así como para mejorar 1a solubilidad de pr por ejemplo, Kaushik et al., J. Biol. Chem. 278 2003) y referencias citadas en las mismas; y M.

J. Chromatography 757: 237-24 5 (1997) . composiciones de detergente pueden quier forma conveniente, por ejemplo, como geles, ulos, pastas, o líquidos. Un detergente líquido p que contiene típicamente hasta aproximadame y de 0 % a aproximadamente 30 % de también puede estar en la forma de un tip que contiene solo aproximadamente 30 % de ag La composición detergente comprende uno tensoactivos , cada uno de los cuales p ico, no iónico, catiónico o zwiteriónico . El de oxilado, etoxilato de nonil::enol, alquilpoligl ildimetilaminaóxido, monoetanolamida de ácid ilado, monoetanolamida de ácido graso, o amida droxi-alquil-graso, como describe, por ejemp 6154. composición detergente puede co ionalmente una o más diferentes enzimas, tal como nasa, proteasa, celulasa, peroxidasa, y/o lac quier combinación.

El detergente puede contener de aproximadam roximadamente 65 % de un mej orador detergente ador de complejo tal como zeolita, difosfato, tri onato, citrato, ácido nitrilotriacético (NTA) endiaminatetraacético ilentriaminapentaacético (DTMPA) , ácido alq enil- succínico, silicatos solubles aciones de lavandería o lavado de trastos, sin trar uso en limpiadores de superficies y produ l a partir de almidón o biomasa El detergente puede comprender uno o más po ej emplos incluyen carboximetilcelulosa (vinilpirrolidona) (PVP) , polietilenglicol (alcohol vinílico) (PVA) , policarboxilat crilatos, copolímeros ácido málico/acr imeros de lauril-metacrilato/ácido acrílico. detergente puede comprenden un ueador, que puede comprender una fuente de H202 rato o percarbonato opcionalmente combinado ador blanqueador formador de perácido, tal com oiloxibencenosulfonato (NOBS) J De manera alterna blanqueador puede comprender peroxiácidos imida o sulfona, a manera de ejemplo. El ribe, por ejemplo en WO 92/19709 y WO 92/19708.

El detergente también puede contener edientes convencionales de detergente ta dicionadores de tela tal come arcillas, reforza a, supresores de jabonaduras, agentes anti-co tes de suspensión de suciedad, agentes anti-redep edad, tintes, bactericidas, abrillantadores óp ume, a manera de ejemplo. El pH (medido en sa a concentración de uso) usualmente es ne lino, por ejemplo, pH de aproximadamente imadamente 11.0.

La variante de alfa-amil ¡asa se puede incor entraciones convencionalmente empleadas en déte actualidad se contempla que, en la com rgente, la variante de alfa-am lasa se puede adic cantidad que corresponde a 0.00001-1.0 mg (calcul de etileno (EO) ) o alquil-sulfato (por ejempl proximadamente 1 % a aproximadamente 4 %; etox ol (por ejemplo, Cm-isalcohol , 7 EO) de aproximad aproximadamente 9 %; carbonato de sodio (por 3) de aproximadamente 14 % a aproximadamente ato soluble, de aproximadamente 2 a aproximadame eolita (por ejemplo, NaAlSi04) de aproximadament imadamente 22 % sulfato de sodio (por ejemplo, % a aproximadamente 6 %; cit:rato de sodio/ácido ejemplo, C6H5Na307/C6H807) de aproximadamente imadamente 15 %; perborato de sodio (por ejempl aproximadamente 11 % a aproximadamente imadamente % aproximadamente ximetilcelulosa (CMC) y de 0 % a aproximadame eros (por ejemplo, copolimero de ácido maleico/a PEG) de 0-3 %; enzimas (ca! culadas como enzi roximadamente 3 %; etoxilato de ai ohol, 7 EO) de aproximadamente 5 ¦ onato de sodio (por ejemplo, Na2CO aproximadamente 21 o, o silicato solub a aproximadamente 4 % zeoli aproximadamente 24 % a aproxim % · sulfato de sodio (por ejemplo imadamente 4 % a aproximadamente /ácido cítrico (por ejemplo, C6H5Na307/C6H807) imadamente 15 %; carboximetiJlcelulosa (CMC) imadamente 2 %; polímeros (por ejemplo, copol maleico/acrílico, PVP, PEG) o / uladas como proteína de enzima pura) de 0.000 dientes menores (por ejemplo, supresores de jabo me) de 0-5 . (3) Una composición detergente formulada ita (como NaAlSi04) de [aproximadamente 2 imadamente 33 %; sulfato de sodio (por ejemplo, 0 % a aproximadamente 4 % ; perborato de so NaB03-H20) de aproximadamente ; TAED de aproximadamente 2 % a aproximadamen onato (por ejemplo, EDTMPA) de¡ 0 % a aproximadame oximetilcelulosa (CMC) de 0 % a aproximadamen eros (por ejemplo, copolímero| de ácido maleico/a PEG) de 0-3 %; enzimas (calculadas como pro a pura) de 0.0001-0.1 %; ingredientes menor lo, supresores de jabonaduras, perfume, abrilla eos) de 0-5 o, o (4) Una composición detergente formulada lado que tiene una densidad aparente de al menos comprende alquilbencenosulfonato lineal (calcul ) de aproximadamente 8 % a aproximadamente PEG) de 1-3 %; enzimas (calculadas como pro pura) de 0.0001-0.1 %; e ingredientes meno , supresores de jabonaduras , perfume) de 0-5 o, ? Una composición detergente, líquida, ac nde alquilbencenosulfonato lineal (calcula de aproximadamente 15 % a aproximadament ato de alcohol (por ejemplo / C12-i5alcohol/ 7 ohol, 5 EO) de aproximadamente 12 % a aproximada abón como ácido graso (por ejemplo, ácido ol imadamente proximadamente nilsuccínico (C12-14) de % a aproximadament etanol de aproximadament ¾ a aproximadamen proximadamente 2 % a aproximadame a aproximadamente 3 %; políme de 0 % a aproximadamente 3 %; bor % a aproximadamente 2 %; etanol ohol, 7 EO, o C12-i5alcohol/ 5 EO) de 3-9 %; ja o graso (por ejemplo, ácido oleico) de aproximad aproximadamente 10 o, o ze lita (como NaAlS aproximadamente ci sio de aproximadamente 9 % a alproximadamente 18 % ejemplo, B407) de aproximadamente 0 % a aproximad arboximetilcelulosa (CMC) 0 % a aproximadame meros (por ejemplo PEG, PVP) de 0 % a aproximad polímeros de anclaje (por ejemplo, copolí crilato de laurilo/ácido acríiico) ; relación mol 800) de 0 % a aproximadamente 3 %; glicerol d imadamente 5 %; enzimas (calculada como pro ma pura) de 0.0001-0.1 %; e ingredientes meno plo, dispersantes, supresores de j abonaduras , llantadores ópticos) de 0-5 %.

Una composición detergente formulada proximadamente 2 % a aproximadamente 8 % perb (por ejemplo, NaB03.H20) de aproximadamente imadamente 18 TAED de aproximadamente imadamente 7 %; polímeros (por ejemplo, copol maleico/acrílico, PEG) aproximadamente imadamente 5 % enzimas ¡lculadas como pro a pura) de 0.0001-0.1 % ingredientes meno ío, abrillantador óptico, supresores me) de 0-5 o (8) Una composición detergente formulada lado que comprende alquilbencenosulfonato ulado como ácido) de proximadamente 8 imadamente 14 % monoetanblamida de ác lado de aproximadamente 5 % a aproximadament como ácido graso % a aproximadament nato de sodio (por ejemplo, ??20?3) de aproximad a pura) de 0.0001-0.1 ingredientes meno ío, supresores de jabonaduras, perfume) de 0-5 %. (9) Una composición detergente formulada lado que comprende alquiIbencenosulfonato ulado como ácido) de aproximadamente 6 imadamente 12 % agente ténsioactivo no io imadamente 1 % a aproximadamente 4 %; jabón co de aproximadamente 2 ¾ a aproximadamente 6 %; c odio (por ejemplo, Na2C03) de aproximadamente imadamente 22 %; zeolita (por ejemplo, NaAl imadamente 18 % a aproximadamente 32 %; sulfato ejemplo, Na2S04) de aproximadamente 5 % a aproxim o, o citrato de sodio (por ejemplo, C6H5Na imadamente 3 % a aproximadamente 8 %; perborato ejemplo, NaB03.H20) de aproximadamente imadamente 9 % activador blanqueador (por ejemp o) de aproximadamente 15 o, "o a aproximadament isulfato de alcohol (por ejemplo, Ci2-i5alcohol , imadamente 8 % a aproximadamente 15 etox hol (por ejemplo Ci2-i5alcohol , 7 EO, o Ci2-i5alcoho proximadamente 3 % a aproximadamente o graso (por ejemplo, áci láurico) de imadamente 3 aminoetanol aproximadament imadamente 5 %; citrato de sodio de aproximadam aproximadamente 10 % hidrotropo (por ensulfonato de sodio) de aproximadamente imadamente 6 %; borato ejemplo, B407) imadamente carboximétilcelulosa de imadamente etanol de aproximadamente imadamente 3 %; propilenglicoÍL de aproximadamen imadamente 5 %; enzimas (calculadas como pro a pura) de 0.0001-0.1 %; e ingredientes meno imadamente 1 % a aproximadamente 3 %; políme copolímero de ácido eico/acrílico, pol je, tal como copolímero de m tacrialto de lauri aproximadamente % glic imadamente aproximadamente culadas como proteína de enzima pura) de 0.0001-edientes menores (por ejemplo, hidrotropos, dispe me, abrillantadores ópticos) de 0-5 %. (12) Una composición detergente formulada lado que tiene una densidad aparente de al menos comprende agente tensioactivo ilbencenosulfonato lineal, sulfato de alqu insulfonato, ásteres metílicos de ácido a-sulf osulfonatos , jabón) de aproximadamente 25 imadamente 40 %; agente tensioactivo no ión lo, etoxilato de alcohol) de aproximadamente ma pura) de 0.0001-0.1 o, o ingredientes menor plo, perfume, abrillantadores ópticos) de 0-3 %. (13) Composiciones detergentes como se des composiciones 1)-12) supra, en donde todo o p ilbencenosulfonato lineal reemplaza por Ci8) alquilo . (14) Una composición debergente formulada iado que tiene una densidad aparente de al menos comprende sulfato de (C12-Ci8)a quilo de aproximad aproximadamente 15 % etoxilato imadamente 3 % a aproximadamente 6 %; amida hidroxi-alquil -graso de aproximadamente 1 imadamente 5 ¾ zeolita ( >or ejemplo NaAl imadamente 10 % a aproximadamente 20 %; di atificado (por ejemplo SK56 de Hoech imadamente 10 % a aproximadamente 20 %; carb llantador óptico, fotoblanqueador, perfume, supre adura) de 0-5 % Una composición tergente formulada ulado que tiene una densidad aparente de al menos comprende sulfato de (Ci2-Ci8) alquilo de aproximad aproximadamente 8 % etoxilato de alc imadamente 11 % a aproximadamente 15 %; j imadamente 1 % a aapprrooxxiimmaaddaasmente ita A de aproximadamente 35 % a aproximadament nato de sodio (como Na2C03) de aproximadament imadamente 8 silicato soluble de 0 imadamente 4 %; percarbonato de sodio de aproxim o. aproximadamente 22 % TAED de ximetilcelulosa (CMC) de 0 aproximadamen eros (por ejemplo, policarboxilatos y PVP) d imadamente 3 %; enzimas (ca culadas como pro (18) Composiciones detergentes como se en 1), 3), 7), 9)., 12), 14) , y 15) , que c ionalmente un catalizador de manganeso. (19) Composición detergente formulada detergente no acuoso que . comprende un ioactivo, no iónico, liquido, tal como por ol primario, alcoxilado, lineal, un sistema m ejemplo, fosfato)/ una enzima y álcali. El de ién puede comprender agente t nsioactivo aniónic ma blanqueador.

En otra modalidad, se piiede incorporar la tano en las composiciones detergentes y us ión/limpieza de la biopelicula prese iles/ropas sucias domésticas y/o industriales.

La composición detergente se puede form lo como una composición detergente de lavanderí ntes de alfa-amilasa, y una o más enzimas lim entes, tal como una proteasa) una lipasa, una c carbohidrasa, una celulasa, una pectinasa, una r arabinasa, una galactanasa, una xilanasa, una lacassa, y/o una peroxidasa, y/o combinaciones s. En general, las propiedades de las enzimas ser compatibles con el detergente selecciona ío, pH óptimo, compatibilidad con otros ingr áticos y no enzimáticos, etc.), y las enzima presentes en cantidades efectivas.

Proteasas : las proteasas adecuadas ias de origen animal, vegetal o microbiano. Tam ados los mutantes químicamente modificados o m roteína. La proteasa puede ser una serina-protea oproteasa, por ejemplo, una proteasa microbiana a proteasa tipo tripsina. Los ejemplos de p 0 0744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 9 7/07202, EP 407225, y EP 2 60105. Algunas en sa comercialménte disponibles incluyen Lipol laseMR Ultra (Novo Nordisk A/S) Poliesterasas : las poliesterasas a yen, pero no se limitan aquellas descrita (Danisco A/S) y WO 01/14629 (Danisco A/S en incluir en cualquier combinación con otras izadas en la presente.

Amilasas: las composiciones se pueden comb alfa-amilasas, tal como alfa--amilasa no variant incluir amilasas comercialménte disponibles, t no limitado a, Duramyl , Te mamyli MVJRK, Fungamyl MR o Nordisk A/S) , Rapidase , y Pürastar .MMRK (Danisco Celulasas: Se pueden adicionar celulasa 9259, a manera de ejemplo, Las celulasas de empladas para el uso son aquellas que tienen bene do de color para el texti1. Los ejemplos lasas son celulasas descritas en EP 0495257; EP 9/25846 (Danisco A/S) , WO 96/34108 (Danisco 1262; WO 96/29397; y WO 98/08940, a manera de s ejemplos son variantes de aelulasa, tal como tas en WO 94/07998; WO 98/12307; WO 9 K98/00299; EP 531,315; Paterites de los Estado 5,457, 046; 5,686,593; 5,763,254. Las cialmente disponibles incluyén Celluzyme y Nordisk A/S) ; Clazinase MR y Puradax® HA (Danisc 500(B) MMRK (Kao Corporation).

Peroxidasas/Oxidasas : peroxidasas/ adas contempladas para el en las compo yen aquellas de origen vegetal, bacteriano o fu ienen una o más enzimas, o al adicionar un nado que comprende todas estas enzimas. Un gente, es decir, un aditivo separado o un nado, se puede formular copo un granulado, nsión espesa, etc. Las formulaciones adecú ivos detergentes granulados incluyen granulado .

Se pueden producir granulados no en pol como se describe en las Patentes de los s Nos. 4, 106, 991 y 4,661,452 y opcionalmente s tí por métodos conocidos en .,a técnica. Los eje íales cerosos de revestimiento son produ (óxido de etileno) (por ejemplo, polietilenglico pesos molares medios de 1,0 00 a 20,000; noni lados que tienen de 16 a 50 unidades de no; alcoholes grasos etoxilados en los cuales dos establecidos . Se pueden preparar cuerdo al método descrito en EP 238 216 La composición detergentle puede estar en c a conveniente, por ejemplo, una barra, tablet o, gránulo, pasta, o líquido. bn detergente líqui acuoso, que contiene típicamente hasta aproximada agua, y de 0 % a aproximadamente 30 % de nico. También se contemplan geles detergentes c contienen 30 % o menos de agua . La composición de rende uno o más agentes tensioactivos, que puede eos, incluyendo semi-polares, aniónicos, cati eriónicos, o cualquier combiiiacion de los mis tes tensioactivos están presentes típicamente a .l % a 60 % en peso .

Cuando se incluye en 1á presente, el de endrá típicamente de aproximadamente etoxilato de alcohol, etoxilato lpoliglicosido, alquildime ami tanolamida de ácido graso etoxilado, monoetanol graso, amida de ácido polihidrpxi-alquil -g ados de N-acil-N-alquilo de glucosamina ("glucam El detergente puede contener de 0 imadamente 65 % de un me orador de detergente dor de complejo tal como zeolita, difosfato, tri nato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacétic ndiaminatetraacético (EDTA) , lentraaminapentaacético, ácido alquil- o a nico, silicatos solubles o si icatos estratifica SKS-6 de Hoechst) El detergente puede comprender uno o más po ej emplos son carboximetil-celulosa (vinilpirrolidona) (PVP) , poli (etilenglicol) a alternativa, el sistema blanqueador puede co iácidos (por ejemplo, los peroxiácidos tipo amid lfonas) . El sistema blanqueador también puede blanqueador enzimático Las enzimas de la composición detergente ilizar usando agentes estabilizadores convenc jemplo, poliol (por ejemplo, propilenglicol o gl zúcar o alcohol de azúcar, láctico, ácido erivado de ácido bórico (por ejemplo, un éster d tico) , o un derivado de ácido fenil-boróni ío, ácido 4-formilfenil-forónico) . La composi formular como se describe en WO 92/19709 y WO 9 El detergente también puede contener dientes convencionales de detergente, tal c ío, acondicionadores de tejido, que incluyen a zadores de espuma, supresores de jabonaduras, e proteína de enzima por litro de licor de lava a aún más particular de 0.1 s. aproximadamente 1 ína de enzima por litro de licor de lavado.

Un ensayo representativo que se puede u r la eficiencia de una composición limpiad ende AmyE o una variante de la misma, incluye un uestra. Una "muestra" es una ieza de material que tiene aplicada la misma una ma ial puede ser, por ejemplo, tejidos produc on, poliéster o mezcla de fibras naturales y sin anera alternativa, el material puede ser papel, filtro o nitrocelulosa, o una pieza de un como cerámica, metal o vidrio. Para mancha se basa en almidón, pero puede leche, tinta hierba, té vino, espinaca, de chocolate, queso, arcilia, pigmento, ac uestra puede ser de material textil, de papel, material adecuado. La muestra más pequeña puede a fijada ya sea antes o después de que se coloq vidad de una placa de microtitulo de 24, 4 vidades . La mancha más pequeña también se puede plicar una mancha a una piezct pequeña de mater lo, la muestra más pequeña puede ser una pieza d una mancha de diámetro de 5/8 de pulgada (15.8 pulgadas (6.35 mm) de diámetro. El punzón fabric a se diseña de una manera tal que distribuye orma simultánea a todas las concavidades de una oncavidades. El dispositivo permite la distrib de una muestra por concavidad cargar simpl placa de 96 concavidades/ múltiples vec sitivos de punzón de múltipies agujeros para distribuir de forma simultánea mue uede examinar el sobrenadante para la suciedad ea por medición directa de atsorbancia o despué ción de revelado de color secundario. El anális edad liberada también se oiede tomar por ctral de masa.

En una modalidad, un protocolo de ona control sobre el grado de fijación de resultado, es posible producir muestras q lo, liberen cantidades variables de mancha c en la ausencia de la enzima que se va a probar anchas fijas conduce a una mejora dramátic ción señal a ruido en los ensayos de ionalmente, al variar el grado de fijación, s ar manchas que dan resultados óptimos bajo la iciones de limpieza.

Las muestras que tienen manchas de "concen dón con peróxido de hidrógeno al 0.0003 % a 0 ra de ejemplo. Otras combinaciones incluyen h aca fijada con glutaraldehído al 0.001 a 1 %, ge a de Coomassie fijada con glutaraldehído al 0.0 chocolate, leche y hollín fijados con glutarald 1 % a 1 % La muestra también se puede agitar dur ación con la enzima y/o formulación deterge del desempeño de lavado son dependientes tación de las muestras en s concavidades (ho vertical) , particularmente en la placa vidades . Esto indicará que el mezclado fue insu te el periodo de incubación. Aunque hay var asegurar una agitación suficiente durante la inc uede construir un soporte de placa en el eala la placa de microtítulo entre dos pl Se puede usar ácido trini'trobencenosulfónic cuantificar la concentración grupos amino avado. Esto puede servir como una medida de la roteína que se removió de la muestra (ver, por t y Tainturier, Anal. BiochemJ 249: 184-200 {199 rgo, si un detergente o una muestra de enzima co ormación de fragmentos inusualmente pequeños de ejemplo, de la presencia de peptidasas en la ees se obtendrá una señal de TNBS más grande, e "ruido" .

Otro medio para medir el desempeño del re/leche/tinta que se basa en la liberación de t uede cuantificar al medir la absorbancia del do. La absorbancia se puede medir a cualquier lo entre 350 y 800 nm. En una modalidad, la lon se mide a 410 nm o 620 nm. El licor de lavado t itud de onda, apropiada. El si tema también se pu determinar una composición adecuada de enz gente para lavado de trastos, por ejemplo a de sangre/leche/tinta sustrato adecu ropa, plástico o cerámica.

En un aspecto, se fija una mancha de BMI car peróxido de hidrógeno al 0.03 % a la mu ón/BMI durante 30 minutos a 25 °C o al aplicar drógeno al 0.03 % a la muestra de algodón/BMI du os a 60 °C. Se cortan muestras más pequ imadamente 0.25 pulgadas (6 mm) de la mu ón/BMI y se colocan en las concavidades de una título de 96 concavidades. En cada concavidad, mezcla conocida de una composición detergent a, tal como una proteína variante. Después de co dor de placa adhesiva en la parte superior de a/algodón durante 30 minutos a 25 °C. Lo mismo r con manchas de chocolate, leche y/o hollín.

Composiciones de Desencolado de Textiles, y Uso También se contemplan composiciones y méto r tejidos (por ejemplo, para desencolar un una o más AmyE o variant de la misma. La miento de tejidos, que son bien conocidos en la , por ejemplo, Patente de Estados Uni 7,316) . Por ejemplo, en uní aspecto, se me ción y apariencia de un tejido por un mét ende poner en contacto el tejido con una var a en una solución. En un aspecto, el tejido se t lución bajo presión.

En un aspecto, las enzimas se aplican d iés de la tejedura de textiles, o durante la do puede proseguir a una etapa de desencolado, e seguir por uno o más pasos adicionales de proce ejido. El desencolado es el acto de remover el os textiles. Después de la tejedura, el revéstim ado se puede remover antes del procesamiento a tejido a fin de asegurar un resultado homogé ba de lavado. También se proporciona un mét ncolar, el cual comprende drólisis enzimát lado por la acción de una variante de enzima.

La AmyE o variantes misma se pue S O con otros reactivos químicos de desenco as de desencolado para desencolar tejidos, in os que contienen algodón, como aditivos detergen lo, en composiciones acuosas. AmyE o variant también se pueden usar en composiciones y meto una apariencia lavada piedra en tej ido sible el algodón a los pasos subsiguientes de ático. La variante de alfa- amilasa se puede os de acabado de prendas del dril (por eje ceso de bio- lapidación" ) , desencolado enzimátic rciona blandura a tejidos, y/o proceso de acabad Será evidente para aquellos expertos en la se pueden hacer varias modificaciones y variacion siciones y métodos para usar las mismas sin espíritu o alcance del uso propuesto. De esta ma que las modificaciones y va iaciones vengan de ce de las reivindicaciones anexas y sus equivale los ?? 1 Construcción de Plásmido Se clonaron ácidos nucleicos que codifican de SEQ ID NO: l o una variante C- terminal tru ido pUBHO descritos en McKenzie et al, Plasmi (1986) : "ori-pUB" origen de replic 10; "reppUB" es el gen de replicasa de pUBHO, en de resistencia a neomicina/canamucina de o" es el marcador de resistencia a bleomicina, ? erminador transcripcional de amilasa de B. lichen Se montaron construcciones de plásmido esion de AmyE y AmyE-tr usando la secuencia que AmyE descrita por Yang et al, "Nucleotide seq amilasa gene from Bacillus subtilis," Nucí. Ac ) : 237-49 (1983) . El plásmido pME629.5 contiene eico que codifica para AmyE de longitud complet O: 1. El gen tiene una supresión de tres bas encia que codifica para el dominio de unión a al aración a la secuencia descrita, por Yang et al.

El plásmido pME630.7 contiene la secuencia Para la construcción del plásmido de expré nucleico que codifica para AmyE se amplificó o HerculaseMR (Stratagene, California) . Los prod se purificaron usando una columna provista en u urificación por PCR Qiagen dIAquik1 (Qiagen, V fornia) , y se re-suspende en 5¡ 0 µ?. de agua purifi i-QMR. Se digirieron 50. dél ADN purificado encial con Hpal (Roche) y PstI (Roche) , y itante se re- suspendió en 30 L de agua purifi i-QMR. Se clonaron 10-20 ng/pL de ADN en el pl smi o los sitios de clonación Psitl y Hpal. Las me ión se transformaron directamente en células com , subtilis (genotipo: DaprE, DnprE, degUHy3 IIE3501, SLiyE: :xylRPxylAcomK-phleo) . Las células ubtilis tiene un gen complementario (comK) que un promotor inducible por xilosa. La competenc para estudios adicionales. Se cultivar ivos de los transformantes durante 8h en LB neomicina. Entonces, se adicionaron 3 pre-cultivo en un matraz de 250 mL relleno c edio de cultivo (descrito mas adelante) compl g/mL de neomicina aCl5 5 mM. El m ivo fue un medio semi do, enriquecido tiguador MOPS, con urea como la fuente princ ógeno, glucosa como la fuentie principal de ca mentado con o. "o de soytone para un imiento celular. Los matraces agitados se i nte 60-65 horas a 37°C, con mezclado 250 r ivos se recolectaron por c ntrifugación a 5 nte 20 minutos en tubos cónicos. Puesto qu de longitud completa como las proteínas t myE se expresaron a altos niveles, se usa Ensayo Bradforcl para Determinación de Conte ína en Placa de Microtitulo de 96 Concavidades. determinó la concentración de prot nadantes de muestra usando el tinte reactivo Start (Bio-Rad, California) . Se obtuvieron mues ación de caldos de cultivos cultivados en pl título (MTP) durante 3 días con agitac aireación humidificada . Se combinó una muestra ltrado de cultivo con 2f0 µ?· del Tinte ord QuickStartMR en una concavidad de una segú és del mezclado completo, las MTP se incubaron ños 10 minutos a temperatura ambiente . Se removi jas de aire y se midió la OD (densidad óptica) a determinar la concentración de proteína, se sus ra de fondo (de concavidades no inoculadas) ras de la muestra. idad de enzima requerida bajo condiciones de ens cir un micromol de tri-sacárido a partir de mal to. En un ensayo típico, sé adicionó una mu ota de AmyE , de 0.1 mi , a 5 mi de maltosa tiguador de fosfato, pH 4.5 incubó du tos a 60 °C. La reacción se teirminó al colocar la baño de agua hirviente durante 10 minutos. La ri-sacárido presente en la muestra se determinó p Determinación de Actividad de Glucoamilasa midió la actividad de glucoamilasa u yo basado en su capacidad para catalizar la hidró trofenil-alfa-D-glucopiranósido . (PNPG) a gluco ofenol. A un pH alcalino, el n:.trofenol liberado olor amarillo que es proporcional a la acti oamilasa y se monitoriza a nm. Una un idad de glucoamilasa (GAU) se define como la ca ina la reacción enzimática al precipitar el sust solución de etanol % sobrenadante ra espectrofotométrica a 501 nm. El grado de in olor es proporcional a la actividad de la enz ad de pululanasa estable a ácido (ASPU) se define idad de enzima que libera un potencial lente como glucosa a part de pululano por min 60°C.

Fermentación Convencional de Etanol Dos lotes de licuefacto (DS al 31 %) River Energy, que tienen urea 400 taron a pH 4.3 y pH 5.8 (usando H2S04 5N) . Se adí g de substrato a un matraz Erlenmeyer de 125 ficaron las amilasas AmyE-tr y SPEZYME XTRA a 0 S. Se inocularon las fermentaciones con 0,2 dura Rojo Etanol Estrella RJoja al 10 o, "o (w/ dosificó una a-amilasa de A. kawachii (AkAA; 6) a 1.5 SSU/g de DS . La secuencia de aminoácidos escribe en SEQ ID NO: 4 de la Patente de los s No. 7,332,319. La capacidad de AmyE y AmyE lizar maíz molido entero también se comparó un lucoamilasa de G. reesei (TrGA; SEQ ID NO: 7) do GAU/g más -amilasa de A, kawachii dosificada DS . La secuencia de aminoácidos de TrGA se dese ID NO: 3 de la WO 2006/0 60062. Las se in ntaciones con 0.2 mi de levadura Rojo-Etanol al 10 % (p/v) pre-hidratada minutos en agu ncubaron matraces a 32°C con barras agitadoras a fermentaciones de 72 h.

Determinación de Formación de Glucosa por Medici lisis de Maltosa y Maltoheptaósa prepararon soluciones de maltosa o malto eces en hidróxido de sodio 10 mM. ólisis de Almidón Insoluble Para medir la hidrólisis de almidón luble, se diluyó AmyE purificada (24.5g/L) entración final de 20.4 ppm amortiguad proteína entonces se adicion maíz al 5 preparada en amor .6, a una concentración final d mezcla se incubó en un agitador a 32 °C. Las mué ieron de forma periódica y diluyeron 10 veces para extinguir la reacción do de Detección de HPLC La composición de los product rificación se midió por sistema de HPLC Gold 32 Karat Fullerton, CA) . El enido a 50°C, está equipado con una col Prueba de Sedimento Las muestras del jarabe sacarificado n baño de agua a 60 °C durante 10-30 minut arlas a una temperatura constante. Sin emba bación no debe ser más prolongada que una hor sario, el valor de DS se ajusto a 35% ± 0.5 % ant ba. Las muestras se mezclaron bien en un ético, y se transfirieron a un tubo de centrifuga ga. Las muestras se centrifugaron a 2500 rpm (1 minutos . El sedimento, si está prese le en el fondo del tubo de centrifuga.

Preparación de Filtrado a Partir de Almidón Saca Las chaquetas de la columna se mantuvieron nsertaron dos discos de papel ltro y se roscar mento hasta ajustarse contra la junta de anillo anto que se colocó en su lugar un matraz de vaci iendo con el sujetador del tubo de salida. El m lazó con un matraz de filtro de 250 mi, ta laron aproximadamente 2.0 gramos de ayuda de fi gramos de licor de prueba un vaso de labora En tanto que la muestra se está agitando en ética, se usa una jeringa para remover la muestra idad buscada. Se puede usar a una balanza rior para este paso. En tanto que se mantie ículas en suspensión, la cant:.dad completa se tr damente a la columna con la ayuda de un em tador del tubo de salida se encendió, y se i rizador. El filtrado se recolectó hasta que za la parte superior del lecho de filtro, y se iempo. El filtrado recolecta.do será adecuado a. adicional, es decir, la prueba de yodo.

. Prueba de yodo ió en un baño de hielo. Se adicionaron 0.5 mi de odo (0.02 M) a la muestra de filtrado enfriada. probó la capacidad de AmyE para c osa a glucosa a pH 4.5 y 516 (usando amortig ato de sodio) , usando el ensaco de formación de rito en el Ejemplo 2.7. Las reacciones se an ués de 2, 5 y 8 días . Como s muestra en la (SEQ ID NO: 1), AmyE-tr (SEQ ID NO: 2), y Amy31A 3) convirtieron de manera efectiva maltosa a glu que la alfa-amilasa de Geobacillus stearotherm (SEQ ID NO: 4, mostrada con una secuencia gu oácidos) , mostró solo una cantidad mínima de form osa bajo estas condiciones. lo 4 Se probó la capacidad de AmyE (SEQ ID N nte 72 horas. Como se puede ver en la Fig convierte casi todo el substrato de osa por 72 horas. Los resultados muestran apaz de degradar un substrato DP7 a eficiente.

Por comparación, la degradación de un subs por 1 ppm de ya sea AmyS (SEQ ID NO: 4) o SPEZY ed" ; SEQ ID NO: 8) se represen a en las Figuras 1 Figuras 11A-11D, respectivamente. Se an de las reacciones usando el procedimiento to en el Ejemplo 2.4 anterior. Las Figuras esentan los productos de reacción a 0 horas, 2 horas después de la adición de AmyS. Las representan los productos de reacción a 0 2 horas y 3 horas después de la adición de os resultados muestran que una proporción cons ?? 5 probó - el desempeño de AmyE trun ntación convencional de etanol en el licuef River Energy de DS) , usando encional de fermentación de etanol descrito en el El desempeño de AmyE-ty (SE ID NO: 2) se c sa SPEZYME XTRA (Danisco Uá Inc., Genencor D ; SEQ ID NO: 5) a pH 4.3 y pH 5.8. SE llevaro ntaciones durante 48 horas. dosificaron An SPEZYME XTRA a 0.2 mg/g Como se mué 13, el rendimiento final de etanol producido p . pH 5.8 es 12.0% (v/v) . AmyE-tr a pH 4.3 pr imiento final de etanol de 7.3 g. (v/v) . Los rend es de etanol en la presencia amilasa SPEZY n 2.7 % (v/v) a pH 4.3 y 3.9 % (v/v) a pH 5.8. ce de esta manera significat.vamente más etan peño de formación de etanol de AmyE y AmyE-tr se lfa-amilasa de A. kawachii (AkAA, SEQ icada a 1.5 SSU/g, una mezcla de glucoamilas i (TrGA; SEQ ID NO: 7) dosificada a 0.5 GAU/g m sa de A. kawachii dosificada a 1.5 SSU/g DS . Ta ngitud completa como AmyE truncada se dosificar DS.

La Figura 14 muestra el rendimiento final d icido por las enzimas a pH y pH 5.8. Cuando 5.8, ambas AmyE (-·-) y AmyE- :r {-¦-) se desempe a comparable a TrGA/AkAA (-A-) , con AmyE que s ente los rendimientos etanol observad AkAA. AmyE (-O-) y AmyE-tr (-?-) produjeron eta pero el rendimiento no fue tan alto como el obte AkAA (-?-) . En comparación, AkAA se desempeño po pH probados (-?<>-). Este ejemplo demuestra ds de almidón refinado (Cargill, Minneapolis, de Ca2+, y 100 ppm de dióxido azufre (S02) du e con agitación constante. El de la suspensió justó a aproximadamente 5.8 con carbonato de sod Los grados Baumé de la suspensión espesa imadamente 22.3. La alfa-amiLasa termoestable (Danisco US, Inc., Genencor División) se adi ra subsiguiente a 0.56 kg/MT ds de maíz. La su sa se envió a través de un chorro de plant ado con un hidrocalentador MIÓl a 0.5 gpm con t encia de 6 minutos, se coció a una temperatura aproximadamente 107-109°C para cocción prima lectaron muestras a la salida y se colocaron en agua a 95° C. Se llevó a cabo adicionalm facción secundaria a 95 °C sin ninguna enzima ad icuefacción secundaria se cont nuó hasta que un composición de sacáridos (azúcares superi ntables) se determinó por HPLC o tinción r de muestras extraídas a diferentes interv o. Los resultados se compilan en la Tabla 1. 1. Efecto de AmyE en lfi producción de ntables TrGA AmyE { ni Horas Dpi DP2 DP3 Azúcares fermenta- GAU/g) dades (hr) (p/v%) (p/v%) (p/v%) bles totales (DPI AMYE/g) +DP2+DP3; p/v%) 0.4 46.84 8.92 0.74 56.50 0.4 18 64.86 3.69 0.42 68.97 0.4 24 69.45 1.99 0.45 71.90 0.4 54 78.09 1.33 0.35 79.77 0.8 10.76 17.74 14.99 43.49 0.8 18 21.00 23.21 15.29 59.51 0.8 24 27.60 24.51 14.02 66.13 0.8 54 47.97 20.57 8.00 76.54 0.3 28.29 6.65 2.93 37.86 0.3 18 54.52 6.83 0.62 61.97 0.3 24 63.32 4.33 0.45 68.10 TrGA AmyE {uni Horas Dpl DP2 DP3 Azúcares fermenta-GAU/g) dades (hr) (p/v%) (p/v%) <p/v%) bles totales (DPI AMYE/g) +DP2+DP3 ; p/v%) 0.2 0 6 19.78 4.99 3.40 28.17 0.2 0 18 43.78 8.20 1.29 53.27 0.2 0 24 54.51 7.65 0.51 62.67 0.2 0 54 69.77 1.66 0.45 71.88 0.2 0.2 6 23.90 13.25 9.26 46.41 0.2 0.2 18 42.38 19.70 5.51 67.58 0.2 0.2 24 51.83 16.94 3.97 72.74 0.2 0.2 54 75.74 7.97 3.03 86.74 0.2 0.4 6 20.42 13.96 11.06 45.43 0.2 0.4 18 41.16 21.56 7.18 69.90 0.2 0.4 24 51.18 18.86 5.89 75.92 0.2 0.4 54 76.99 9.16 3.67 89.82 0.2 0.8 6 25.65 20.39 13.34 59.38 0.2 0.8 18 49.14 20.16 6.95 76.26 0.2 0.8 24 58.76 16.60 5.82 81.18 0.2 0.8 54 80.85 9.06 3.40 93.32 0.1 0 6 11.20 7.46 3.84 22.49 0.1 0 18 24.34 6.24 3.47 34.05 0.1 0 24 33.46 7.88 2.46 43.80 0.1 0 54 58.44 5.99 0.40 64.84 nación de TrGA y AmyE es mái eficiente que TrGA acarificación. La combinación de TrGA y AmyE tado (1) un mayor nivel de azucares fermentabl y DP3 conjuntamente) , y (2) una proporción lisis de alcoholes superiores (>DP4+) . De esta omplementación de AmyE a TrGA es capaz de prod res fermentables que un probeso convencional glucoamilasas . lo 8 Se caracterizaron otras lfa-amilasas de jemplo, SPEZYME FRED y GC358 (ambas de Danisco cor División), en la sacarificación como el Ej carificación del substrato de almidón licuado se a pH 5.2 y a 32°C con la presencia de T sición de sacáridos (tanto a.zúcares fermentab iores) se determinó de las muestras extraídas llus. a 2. Efecto de otras alfa-atnilasas de Bacillu ucción de azúcares fermentables lo 9 Cuando se probó el almidón sacarificado c q ier amilosa que escapa a la hidrólisis se u o se refleja por la absorbanci¡a a 520 nm) con el po en la sacarificación catalizada por inaciones de enzimas. La complementacion de Amy a TrGA redujo significativamente el IPS a lar a aquel con una cantidad equivalente de S aMK (Novozymes A/S) .

Adicionalmente, se obsqrvó que está pre r nivel de almidón residual insoluble (IRS) ciones de sacarificación complementadas con don residual insoluble se refiere a npletamente idrolizado que se muestra como se és de la sacarificación. Un rdvel alto de sedim icularmente indeseable en apiicaciones de edulc do a que pueden interferir sustancialmente iencia de producción y reducir el resultado. La F ca la presencia de una cantidad significativa d niveles variables de (1) AmyIS, (2) AnGA (OPTDE eo US, Inc., Genencor División) , y (3) una pu IMAX"* L- 1000, Danisco US, Iric, Genencor Divis sición de sacáridos (azucare:s tanto fermentab iores) se determinó por HPLC o tinción de ras extraídas a 6, 18, 24, 48, y 72 hor ltados se compilan en la Tabla 3. 3. Efecto de AnGA, AmyjB, y concentraci anasa en la producción de azúqares fermentables Optide AmyE Optima Tiempo DPI DP2 DP3 Azucares x L (Unid x Li (hr) fermentables 400 (GA ades/ 000 (AS totales (DPI U/g) g) PUs/g) DP2+DP3p ) 0.22 70.60 6. 44 0.33 77.38 0.22 18 89.04 85 0.38 91.27 0.22 24 92.10 99 0.36 94.45 0.22 48 94.59 81 0.32 97.72 Optide AmyE Optima Tiempo DPI DP2 DP3 Azúcares x L (Unid x Li (hr) fermentables 400 (GA ades/ 000 (AS totales (DPI u/g) g) PUs/g) +DP2+DP3p/v%) 0.11 0.2 0.16 24 82.94 S .43 2.03 94.40 0.11 0.2 0.16 48 93.36 3 .97 1.32 98.65 0.11 0.2 0.16 72 93.35 4 .25 1.03 98.62 0.11 0.4 0 6 44.23 2 5.41 7.89 78.53 0.11 0.4 0 18 78.24 1' ) .67 1.58 90.48 0.11 0.4 0 24 86.37 6 .79 1.24 94.40 0.11 0.4 0 48 91.78 5 .03 0.75 97.56 0.11 0.4 0 72 92.56 5 .65 0.69 98.91 0.11 0.4 0.16 6 43.92 21 ) .99 8.62 79.53 0.11 0.4 0.16 18 78.31 i: L.95 2.34 92.61 0.11 0.4 0.16 24 87.88 7 .30 1.85 97.03 0.11 0.4 0.16 48 92.13 5 .35 1.22 98.70 0.11 0.4 0.16 72 92.10 5 .63 0.98 98.71 Los ciatos presentados en la Tabla 3 muest: lementación de 0.2 unidades/g de AmyE a 0.11 capaz de (1) producir un mayor nivel ntables, y (2) reducir azúcares superiore ?? 11 Para caracterizar adicionalmente la capa como una enzima útil en sacarificación, s combinada con diferentes ucoamilasas, así 1a de glucoamilasas , a un substrato de almidón acarificación se realizó a pH 5.2 y 32 °C. La com 'los sacáridos (azúcares tanto fermentable riores) se determinó de muestras extraídas a 6, 1 oras. Como se muestra en la Tabla 4, la adición d glucoamilasas o la mezcla de glucoamilasas itado un nivel incrementado de azúcares ferm les y un nivel significativamente reducido de azú ntables . 4. Efecto de AmyE combinada <bon varias glucoami carificación ienos Horas DPI; DP2; DP3; icares fermen- Azucares áticos (hr) p/v%) p/v%) p/v%) Jabíes totales superiores {DE l .+DP2+DP3 ;p/v¾) (DP4+;p/v%) 48 75.72 1.39 0.33 77.44 22.56 U HGA 6 14.49 3.25 5.39 23.13 76.87 18 41.61 9.19 3.76 54.55 45.45 24 52.00 10.67 0.79 63.46 36.55 48 78.36 1.97 0.38 80.71 19.29 AU A. 6 26.48 8,97 8.43 43.89 56.11 er + mg/g 18 54.76 16.28 1.22 72.26 27.74 yE 24 60.44 13.34 0.88 74.66 25.34 48 79.06 4.14 0.74 83.93 16.07 GAU 6 32.36 10.79 5.20 48.35 51.65 + 0.01 AmyE 18 60.76 10.67 1.32 72.75 27.25 ientes Horas DPI; DP2; DP3; Azí icares fermen- Azúcares áticos ( r) p/v%) p/v%) p/v%) ts íbles totales superiores (DF] LDP2+DP3 ;pM) (DP4+;p/v%) ger + 6 25.82 6.26 5.13 37.21 62.79 + HGA 0.13 18 58.85 8.84 0.37 68.05 31.95 J/g 24 65.13 5.89 0.35 71.36 28.64 48 80.69 1.52 0.38 82.60 17.40 ger + 6 25.14 8.54 7.33 41.01 58.99 + HGA 0.13 18 55.86 13.90 1.31 71.07 28.93 /g + 0.01 24 62.70 11.08 1.24 75.02 24.98 /g 48 83.32 4.06 1.11 88.48 11.52 Adicionalmente; las pendientes prima ndarias para los experimentos anterio fic ión se calcularon se com ilan en la Tabl a 5. Comparación de pendientes primarias y sec sacarificación con AmyE y varias glucoamilasas . lo 12 Adicionalmente , se caracterizaron las ven AmyE como una enzima en la produce ombustibles . Se descongeló 1 icuefacto de maíz ro de Illinois River Energy (Rochelle, IL) a 75 ue se lleva a temperatura ambiente. El pH se dej Combinación de enzimas enl fermentación Los matraces se incubaren a 32 °C en un agi forzado 150 rpm. Se removieron muestras a i ramados para análisis por HPLC y al final entación para análisis de almidón. Los resul ilaron en la Tabla 7 y se muestran en la Figura igura 20. a 7. Análisis de composición de fermentació orción de producción de etanq1, aunque ambas pr OI significativamente más lentp que TrGA sola y l * nyE/TrGA (25/75) . Una comparacion de los datos de dual indica que la mezcla AmyE/TrGA (25/75) se d anera equivalente como la AnGA sola en término carbohidratos .

La Figura 16 indica que myE es capaz de re a efectiva el aumento de glucosa en la fase de imiento de levadura) de la fermentación. El au sa, típico en la sacarificación por TrGA, se elera la sacarificación adicional por una inhib alimentación. La Figura 17, por otra parte, ind a fermentación de levadura para producción de es capaz de reemplazar aproximadamente al menos ucoamilasa total do de Secuencias encia de señal se muestra en negritas.

MLTFHRIIRK G MFLLAFLL TASLFCPJTGQ HAKAAAPFNG TMMQ PDDGTLWTKV ANEANNLSSL GITALWLPPA YKGTSRSDVG YGVY EFNQKGTVRT YGTKAQYLQ AIQAAHAAGM QVYADWFDH KGGA DAVEVNPSDR NQEISGTYQI QAWTKFDFPG RGNTYSSFKW RWYH DESRKLSRIY KFIGKAWDWE VDTENGNYDY LMYADLDMDH PEW GKWYV TTNI DGFRLDAVKH IKFSFFPDWL SYVRSQTGKP LFTV DINKLHNYIT KTNGTMSLFD APLHNKFYTA SKSGGAFDMR TLMT QPTLAVTFVD NHDTEPGQAL QSWVDPWFKP LAYAFILTRQ EGYP YYGIPQYNIP SLKSKIDPLL IARRDYAYGT QHDYLDHSDI IGWT KPGSGLAALI TDGPGGSK M YVGKQHA KV FYDLTGNRSD TVTI EFKVNGGSVS VWVPRKTT ID NO: 5: Secuencia de aminoácidos de alfa-amilas MEMR XTRA amylasa) de Geobacillus stearothermophi APFNGTMMQ YFEWYLPDDG TLWTKVANEA NNLSSLGITA LWLPP RSDVGYGVY DLYDLGEFNQ KGTVRTKYGT KAQYLQAIQA AHAAG1 WFDHKGGA DGTEWVDAVE VNPSDRNQEI SGTYQIQAWT KFDFP SSFKWRWYH FDGVDWDESR KLSRIYKFRG IGKAWDWEVD TENGN ADLDMDHPE WTELKNWGK WYVNTTNIDG FRLDAVKHIK FSFFP RSQTGKPLF TVGEYWSYDI NKLHNYITKT NGTMSLFDAP LHNKF GGAFDMRTL MTNTLMKDQP TLAVTFVDNH DTEPGQALQS WVDPW AFILTRQEG YPCVFYGDYY GIPQYNIPSL KSKIDPLLIA RRDYA YLDHSDIIG WTREGVTEKP GSGLAALIiTD GPGGSKWMYV GKQHA TTTTTTAAT STSKATTSSS SSSAAATTSS SCTATSTTLP ITFEE GEEVYLSGS ISQLGEWDTS DAVKLSAEDY TSSNPEWSVT VSLPV KFIKVDEGG SVTWESDPNR EYTVPECGSG SGETWDTWR ID N0:7: Secuencia de aminoácidos (SEQ ID 6/060062) de glucoamilasa (TrGA) de Trichoderma o-secuencia está en cursivas.

HVLSTAVLL GSVAVQKVLG RPGSSGLSDV T SVDDFIS TETPI CNVGPDGCR AFGTSAGAVI ASPSTIDPDY YYMWTRDSAL VFK L TYDAGLQRR IEQYITAQVT LQGLSNPSGS LADGSGLGEP KFELT NWGRPQRDG PALRAIALIG YSKWLINNNY QSTVSNVIWP IVRND YWNQTGFDL WEEVNGSSFF TVANQHRALV EGATLAATLG QSGSA QVLCFLQRF WVSSGGYVDS NINTNEGRTG KDVNSVLTSI HTFDP GTFQPGSDK ALSNLKVWD SFRSIYGVNK GIPAGAAVAI GRYAE NPWYLATFA AAEQLYDAIY VWKKTGSITV TATSLAFFQE LVPGV SSSSTFTNI INAVSTYADG FLSEAAKYVP ADGSLAEQFD RNSGT LTWSYASFL TATARRAGIV PPSWA SSAS TIPSTCSGAS WGSY SFPPSQTPK PGVPSGTPYT PLPCATPT'SV AVTFHELVST QFGQT AAALGNWST SAAVALDAV YADNHPLWIG TVNLEAGDW EYKYI SVTWESDPN HTYTVPAVAC VTQWKEDfT QS ID NO: 8: Secuencia de amlinoácidos de alfa ??11? FRED.

NLNGTLMQY FEWYTPNDGQ HWKRLQNEjSA YLAEHGITAV WIPPA ADVGYGAYD LYDLGEFHQK GTVRTKYGTK GELQSAIKSL HSRDI GCCGACATCGTATCAAATTGGCAACCGTTACTTAGGTACTGAACAAGA GTGTGCAGCCGCTGAAGAATATGGCATAAÍTGGTCATTGTTGACGCGGTC CCAGTGATTATGCCGCGATTTCCAATGACIGTTAAGAGTATTCCAAACT CACACAAATTAAAAACTGGTCTGATCGA1'GGGATGTCACGCAGAATTC TATGACTGGAATACACAAAATACACAAGl,ACAGTCCTATCTGAAACGG CATTGAATGACGGGGCAGACGGTTTTCGÍLTTTGATGCCGCCAAACATA TGATGGCAGTTACGGCAGTCAATTTTGGCCGAATATCACAAATACATC TACGGAGAAATCCTTCAGGATAGTGCCTC:CAGAGATGCTGCATATGCG TGACAGCGTCTAACTATGGGCATTCCATÍLAGGTCCGCTTTAAAGAATC GTCGAATATCTCCCACTATGCATCTGATGJTGTCTGCGGACAAGCTAGT TCGCATGATACGTATGCCAATGATGATGÍAGAGTCGACATGGATGAGC CGTTTAGGCTGGGCGGTGATAGCTTCTCGTTCAGGCAGTACGCCTCTTT CTGAGGGAGGCGGAAATGGTGTGAGGTTCC:CGGGGAAAAGCCAAATAGG GCTTTATTTGAAGATCAGGCTATCACTGC!GGTCAATAGATTTCACAAT AGCCTGAGGAACTCTCGAACCCGAATGGÍAACAACCAGATATTTATGA ACATGGCGTTGTGCTGGCAAATGCAGGTTCATCCTCTGTCTCTATCAA TTGCCTGATGGCAGGTATGACAATAAAGG!TGGAGCGGGTTCATTTCAA AACTGACAGGCACGATCAATGCCAGGTCTGTAGCTGTGCTTTATCCTG AGCGCCTCATGTTTTCCTTGAGAATTACÍAAACAGGTGTAACACATTC CTGACGATTACCTTGCGTGCAGATGCGAÍ.TACAACAAAAGCCGTTTAT GACCAGAGACGGCGTTTAAGGATGGAGATCAATTCACAATCGGAAAAG CAAAACATACACCATCATGTTAAAAGGAÍ.CGAACAGTGATGGTGTAAC TACAGTTTTGTTAAAAGAGATCCAGCGTGIGGCCAAAACCATCGGCTAT ATTGGAGCCAGGTAAATGCTTATATCTATAAACATGATGGGAGCCGAG CGGATCTTGGCCTGGAAAACCAATGACTÍAAAATGCAGACGGAATTTA CCTGCGGACACGGATACAACCAACGCAAÍAGTGATTTTTAATAATGGC CCGGTCAGAATCAGCCTGGCTTTGATTAGÍGTGCTAAATGGTTTATATA AAGCGGTTCTCTTCCCCAT CAGGTAAAGCCATGACGAAAAACGCGGATQGCATCTATACCCTGACCCT GGATACCGCAGATGCGAAGGTTATCTTCA TAACGGCTCCGCGCAGGTT CATCCGGGCTTTGACTACGTACAAAATGGL|CTGTATAACAACTCTGGCC TGCCGCAC ID N0 : 12 : Secuencia de nucleót idos que codifica ? eobacillus stearothermophilus (SEQ ID NO : 4 ) .

CACCGTTTAACGGTACCATGATGCAGTATTTTGAATGGTACTTGCCGGA TGGACCAAAGTGGCCAATGAAGCCAACAACTTATCCAGCCTTGGCATC CTGCCGCCCGCTTÁCAAAGGAACAAGCCGCAGCGACGTAGGGTACGGAG TGACCTCGGCGAATTCAATCAAAAAGGGACCGTCCGCACAAAATATGG TATCTTCAAGCCATTCAAGCCGCCCACGCCGCTGGAATGCAAGTGTAC TTCGACCATAAAGGCGGCGCTGACGGCACGGAATGGGTGGACGCCGTCG C CGAC CGC AAC C AAGAAATCT CGGGC AC CT.AT C AAAT C C AAGC ATGGAC CCCGGGCGGGGCAACACCTACTCCAGCTTTAAGTGGCGCTGGTACCAT ACTGGGACGAAAGCCGAAAATTAAGCCGCATTTACAAATTCATCGGCA GGAAGTAGACACAGAAAACGGAAACTATGACTACTTAATGTATGCCGA CATCCCGAAGTCGTGACCGAGCTGAAAAA TGGGGGAAATGGTATGTC TTGATGGGTTCCGGCTTGATGCCGTCAAGCATATTAAGTTCAGTTTTT GTCGTATGTGCGTTCTCAGACTGGCAAGCCGCTATTTACCGTCGGGGA GACATCAACAAGTTGCACAATTACATTACGAAAACAAACGGAACGATG CCCCGTTACACAACAAATTTTATACCGCTjrCCAAATCAGGGGGCGCAT CGTTAATGACCAATACTCTCATGAAAGATCAACCGACATTGGCCGTCAC CATGACACCGAACCCGGCCAAGCGCTGCAGTCATGGGTCGACCCATGG' CTTACGCCTTTATTCTAACTCGGCAGGAAÍBGATACCCGTGCGTCTTTT TGGCATTCCACAATATAACATTCCTTCGCTGAAAAGCAAAATCGATCC CGACCGCAACCAAGAAATCTCGGGCACCTATCkAATCCAAGCATGGAC CCCGGGCGGGGCAACACCTACTCCAGCTTrAAGTGGCGCTGGTACCAT ATTGGGACGAAAGCCGAAAATTAAGCCGCATTTACAAATTCAGGGGCA GGATTGGGAAGTAGACACAGAAAACGGAAACTATGACTACTTAATGTA ATGGATCATCCCGAAGTCGTGACCGAGCT3AAAAACTGGGGGAAATGG CGAACATTGATGGGTTCCGGCTTGATGCC TCAAGCATATTAAGTTCA TTGGTTGTCGTATGTGCGTTCTCAGACTGGCAAGCCGCTATTTACCGT AGCTATGACATCAACAAGTTGCACAATTA ^ATTACGAAAACAAACGGA TTGATGCCCCGTTACACAACAAATTTTATACCGCTTCCAAATCAGGGG GCGCACGTTAATGACCAATACTCTCATGA ^AGATCAACCGACATTGGC GATAATCATGACACCGAACCCGGCCAAGCGCTTCAGTCATGGGTCGAC CCGTTGGCTTACGCCTTTATTCTAACTCGGCAGGAAGGATACCCGTGCG CTATTATGGCATTCCACAATATAACATTcbTTCGCTGAAAAGCAAAAT CATCGCGCGCAGGGATTATGCTTACGGAACGCAACATGATTATCTTGAT A.TCGGGTGGACAAGGGAAGGGGTCACTGAAi AACCAGGATCCGGGCTGG CCGATGGGCCGGGAGGAAGCAAATGGATGTACGTTGGCAAACAACACGC TATGACCTTACCGGCAACCGGAGTGACACCGTCACCATCAACAGTGAT TCAAAGTCAATGGCGGTTCGGTTTCGGTTTGGGTTCCTAGAAAAACGA ID N0:14: Secuencia de nucl ótidos para gen sa (AkAA) de Aspergillus kawahhii (SEQ ID NO: 6).

AGTGTCGACTTCAAGTATTGCCCTTGCTGTGTCCCTTTTTGGGAAGCT TCAGCTGCAGAATGGCGCACTCAATCCATCTACTTCCTTTTGACGGAT CGGACAATTCGACTACAGCTACGTGCAATACGGGTGACCAAATCTACT GCAAGGAATTATCAACCATCTGGACTATA'rCCAGGGCATGGGATTCAG TCGCCTATCACTGAGCAGCTACCCCAGGA^ACTTCGGATGGTGAAGCC GGCAGCAGAAGATATACAATGTGAACTCC;^ACTTCGGCACGGCAGATG TCTTAATGGGACGCTGATGCAGTATTTTGAATGGTACACGCCCAATGA GAAGCGTCTGCAAAACGACTCGGCATATTTGGCTGAACACGGTATTACT CCCCCGGCATATAAGGGAACGAGCCAAGCGGATGTGGGCTACGGTGCTT TTTAGGGGAGTTTCATCAAAAAGGGACGGTTCGGACAAAGTACGGCAC CAATCTGCGATCAAAAGTCTTCATTCCCGCGACATTAACGTTTACGGG ACCACAAAGGCGGCGCTGATGCGACCGAAGATGTAACCGCGGTTGAAG CCGCAACCGCGTAATTTCCGGAGAATACcjrAATTAAAGCCTGGACACA GGGCGCGGCAGCACATACAGCGATTTTAAATGGCATTGGTACCATTTT GGGACGAGTCCCGAAAGCTGAACCGCATC ATAAGTTTCAAGGAAAGG AGTTTCCAGTGAAAACGGCAACTATGATT^TTTGATGTATGCCGACAT CCTGATGTCGTAGCAGAAATTAAGAGATGGGGCACTTGGTATGCCAAT ACGGTTTCCGTCTTGATGCTGTCAAACACATTAAATTTTCTTTTTTGC TCATGTCAGGGAAAAAACGGGGAAGGAAATGTTTACGGTAGCTGAATA CTTGGGCGCGCTGGAAAACTATTTGAACAA^ACAAATTTTAATCATTCA CCGCTTCATTATCAGTTCCATGCTGCATCGACACAGGGAGGCGGCTATG TGCTGAACGGTACGGTCGTTTCCAAGCATCCGTTGAAATCGGTTACATT GATACACAGCCGGGGCAGTCGCTTGAGTCGACTGTCCAAACATGGTTT ACGCTTTTATTCTCACAAGGGAATCTGGA†ACCCTCAGGTTTTCTACG G ACGAAAGG AGACT C C CAGCGC GAAATTC CTGC CTTGAAAC AC AAAAT AAAGCGAGAAAACAGTATGCGTACGGAGCACAGCATGATTATTTCGAC TCGGCTGGACAAGGGAAGGCGACAGCTCGGTTGCAAATTCAGGTTTGG AGACGGACCCGGTGGGGCAAAGCGAATGT^TGTCGGCCGGCAAAACGC C ATGAC ATTAC C GGAAAC CGTT CGGAGCCGGTTGT C AT CAATT CGGAA TTCACGTAAACGGCGGGTCGGTTTCAATTTATGTTCAAAGA ID N0:17: Secuencia de señal nativa de la AmyE d AATCCGTCCTCTGTTAACTCAATGGGGAAGAGAACCGCTTAAGCCCGA ID NO: 22: Cebador HPAIAMYE466-R AATCCGTCCTCTGTTAACTCAATCAGGATAAAGCACAGCTACAGACCT ID NO: 23: Cebador AMYE SEQ-F1 CAAGTACAGTCCTATCTG ID NO: 24: Cebador AMYE SEQ-F2 CTCTGTCTCTATCAATAC ID NO: 25: Secuencia de prote de alfa-amilas 79) de Geobacillus stearothermophilus de leta. La secuencia de señal se muestra en negrita LTFHRIIR G MFLLAFLL TALLFCPTGQ PAKAAAPFNG TMMQY PDDGTLWTKV ANEANNLSSL GITALWLP:?A YKGTSRSDVG YGVYD FNQKGAVRT KYGTKAQYLQ AIQAAHAAGM QVYADWFDH KGGAD AVEVNPSDR NQEISGTYQI QAWTKFDF:?G RGNTYSSFKW RWYHF ESRKLSRIY KFRGIGKAWD WEVDTENGNY DYLMYADLDM DHPE GK YVNTT NIDGFRLDAV KHIKFSFFPD WLSDVRSQTG KPLFT YDINKLHNY I KTNGTMSL FDAPLHNKFY TASKSGGTFD MRTLM DQPTLAVTF VDNHDTEPGQ ALQSWVDP½ KPLAYAFILT RQEGY DYYGIPQYN IPSLKSKIDP LLIARRDYAY GTQHDYLDHS DIIGW EKPGSGLAA LITDGPGGSK WMYVGKQHAG KVFYDLTGNR SDTVT LYQPTSYQI GNRYLGTEQE FKEMCAAAEE YGIKVIVDAV INHTT SNEVKSIPN WTHGNTQIKN WSDRWDVTQN SLLGLYDWNT QNTQV FLDRALNDG ADGFRFDAAK HIELPDDG Y GSQFWPNITN TSAEF QDSASRDAA YANYMDVTAS NYGHSIRSAL KNRNLGVSNI SHYAS LVTWVESHD TYANDDEEST WMSDDDIRLG WAVIASRSGS TPLFF GNGVRFPGK SQIGDRGSAL FEDQAITAVN RFHNVMAGQP EELSN IFMNQRGSH GWLANAGSS SVSINTATKL PDGRYDNKAG AGSFQ TGTINARSV AVLYPDDIAK APHVFLENYK TGVTHSFNDQ LTITL TKAVYQINN GPDDRRLRME INSQSEKE]:Q FGKTYTIMLK GTNSD KYSFVKRDP ASAKTIGYQN PNHWSQVNAY IYKHDGSRVI ELTGS TKNADGIYT LTLPADTDTT NAKVIFNNGS AQVPGQNQPG FDYVL GLSGSLPH ID NO: 28: Alfa-amilasa de Baó Lií.llus subtilis de eta (ArayE; NCBI Acceso No. ABW75769) .

FAKRFKTSL LPLFAGFLLL FHLVLAGPíA. ASAETANKSN ELTAP ILHAWNWSF NTLKHNMKDI HDAGYTAI T SPINQVKEGN QGNKS KLVTWVESHD TYANDDEEST WMSDDDIRÍLG WAVIASRSGS TPLFF GGNGVRFPGK SQIGDRGSAL FEDQAITAVN RFHNVMAGQP EELSN QIFMNQRISH GWLANAGSS SVSINTATKL PDGRYDNKAG AGSFQ LTGTINARSV AVLYPDDIAK APHVFLENYK TGVTHSFNDQ LTITL TFIKSIMDQI NXRXRRLRME INSQSEKEIQ FGKTYTIMLK GTNSD EKYSLPKRDP ASAKTIGYQN PNH SQVNAY IYKHDGSREI ELTGS MTKNADGIYT LTLPADTDTT NAKVIFNNGY AQVPGQNQPG FDYVL ID NO: 34: Alfa-amilasa de Ba illus subtilis de leta (AmyE; NBCI Acceso No. BAA31528) .

MFEKRFKTSL LPLFAGFLLL FHLVLSGP A ANAETANKSN KVTAS TILHAWNWSF NTLTQNMKDI RDAGYAAIQT SPINQVKEGN QGDKS WLYQPTSYQI GNRYLGTEQE FKDMCAAAEK YGVKVIVDAV VNHTT ISDEIKRIPN WTHGNTQIKN WSDRWDITQN ALLGLYDWNT QNTEV GFLERALNDG ADGFRYDAAK HIELPDDGNY GSQFWPNITN TSAEF LQDSASRDTA YANYMNVTAS NYGHSIRSAL KNRILSVSNI SHYAS KLVTWVESHD TYANDDEEST WMSDDDIRLG WAVIGSRSGS TPLFF GGNGVRFPGK SQIGDRGSAL FKDQAITAVN QFHNEMAGQP EELSN QIFMNQRGSK GWLANAGSS SVTINTSTKL PDGRYDNRAG AGSFQ LTGTINARSA AVLYPDDIGN APHVFLENYQ TEAVHSFNDQ LTVTL TTKAVYQINN GQETAFKDGD RLTIGKED I GTTYNVKLTG TNGEG EYTFVKKDPS QTNIIGYQNP DHWGNVNAYI YKHDGGGAIE LTGSW TKNADGIYTL TLPANADTAD AKVIFNNGBA QVPGQNHPGF DYVQN SGLNGYLPH Se hace constar que con relación a esta r método conocido por la solicitante para llev

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como ante ma como propiedad lo contenido en las si indicaciones : 1. Composición para sacarificar un almi rende una glucoamilasa y una alfa-amilasa, carac e la alfa-amilasa es una alfa-amilasa (AmyE) de ilis o una variante de AmyE que tiene una secu ácidos con al menos aproximadamente 80 % de iden ncia a SEQ ID NO: 1. 2. Composición de conformidad con la reivin caracterizada porque la alfa-amilasa compre ncia dé aminoácidos expuesta en SEQ ID NO : 1, SE Q ID NO: 3, SEQ ID NO: 27, SÉQ ID NO: 28, SEQ ID ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID N tividad, perfil de pH/estabilidad, estabilida ción, estabilidad a un bajo nivel de iones d actividad específica, o cualquier combinació s . 5. Composición de conformidad con la reivin aracterizada porque además comprende una fita anasa, una beta-amilasa, una alfa-amilasa fungoi asa, una celulosa, una hemicelulasa, una lip asa, una isoamilasa, o cua ÍLquier combinación s , 6. Método para procesar almidón, carac comprende mezclar la composición de conformida ndicación durante un empo suficient ificar el almidón. 7. Método de conformidad con la reivindic terizado porque además comprende producir jarabe terizado porque la sacarificación y fermenta zan de forma simultánea. Método de conformidad con la reivindic terizado porque además comprende recuperar el et 12. Método de conformidad con la reivindic terizado porque además comprende destilar el obtener el etanol, en donde la fermentació lación se llevan a cabo de forma simultánea, d ada o secuencialmente . 13. Método para sacarificar un terizado porque comprende mezclar una glucoamila amilasa con un oligosacárido un sustrato onde la alfa-amilasa es una alfa-amilasa (A lus subtilis o una variante de AmyE que ti ncia de aminoácidos con al menos aproximadamente idad de secuencia a SEQ ID NO: 1. encia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Método de conformidad con la reivindica eterizado porque la una o más propiedades altera cificidad de sustrato, unión a sustrato, pa sión de sustrato, estabilidad térmica, pe Ctividad, perfil de pH/estabilidad, estabilid ación, estabilidad a un menor nivel de iones d ) , actividad específica, o cualquier combinació as . 17. Método de conformidad con la reivindica eterizado porque la glucóamilasa se usa en una ayor de 0.11 unidades de glucóamilasa por gramo d {GAU/g ds) . 18. Método de conformida.d con la reivindica terizado porque además compresnde mezclar una fit lanasa, una beta-amilasa, una alfa-amilasa fungoi rasa . 21. Método de conformidad con la reivindica terizado porque además comprende fermentar el producir etanol . 22. Método de conformidad con la reivindica terizado porque la sacarificación y fermenta zan de forma simultánea. 23. Método de conformidad con la reivindica terizado porque además comprer.de recuperar el et 24. Método de conformidad con la reivindica terizado porque además comprende destilar el obtener el etanol, en donde la fermentació lación se llevan a cabo de forma sit adamente o de forma secuencial.