CN102112618A - 糖化酶组合物及其糖化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及枯草芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyE)或其变体。AmyE或其变体可用于更有效地由淀粉生产可发酵糖。本发明还公开了包含葡糖淀粉酶和AmyE或其变体的组合物及利用所述酶组合物加工淀粉的方法。

Description

糖化酶组合物及其糖化方法

交叉引用

本申请要求分别于2008年6月6日和2009年4月1日提交的美国临时专利申请序列号61/059,535和61/165,856的优先权，此两篇专利申请均并入本文作为参考。

序列表

附上包括SEQ ID NOs：1-34的序列表，其全部内容并入本文作为参考。

发明领域

本发明公开了，包含葡糖淀粉酶和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)α-淀粉酶(AmyE)或其变体的组合物对例如由淀粉底物生产可发酵糖是有用的。本发明也公开了使用葡糖淀粉酶和AmyE或其变体例如由淀粉生产乙醇的方法。

背景技术

植物淀粉例如玉米淀粉广泛用于产品例如糖浆和生物燃料的工业制造中。例如，高果糖玉米糖浆(HFCS)是玉米糖浆的加工形式，具有高果糖含量和与糖相当的甜度，这使得HFCS可以作为代糖在软饮料和其他加工食品中使用。HFCS生产目前是十亿美元的工业。类似地，从植物淀粉生产乙醇也是个快速扩张的产业。乙醇自身作为工业化学品、汽油添加剂或液体燃料具有广泛的应用。乙醇作为燃料或燃料添加剂的用途明显减少空气排放，同时保持或甚至提高发动机性能。另一方面，乙醇是可再生燃料，以至于其应用可减少对有限的化石燃料源的依赖。此外，乙醇的使用可减少二氧化碳在大气中的净蓄积。

糖浆和生物燃料可以通过催化淀粉分解成葡萄糖的酶促工艺由淀粉生产。该酶促工艺一般涉及一系列酶催化的反应：

(1)液化：α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)首先催化淀粉悬浮液降解为麦芽糖糊精，所述淀粉悬浮液可以包含30-40％w/w干固形物(ds)。α-淀粉酶是内切水解酶，催化内部α-1，4-D-糖苷键的随机断裂。因为液化一般在高温例如90-100℃进行，所以热稳定的α-淀粉酶，例如来自芽孢杆菌属物种(Bacillussp.)的α-淀粉酶优选用于这个步骤。目前用于这个步骤的α-淀粉酶，例如来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(AmyL)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)和嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)(AmyS)的α-淀粉酶，不产生显著量的葡萄糖。相反，所得到的液化物(liquefact)具有低葡萄糖当量(DE)，并且包含麦芽糖和具有高聚合度(DPn)的糖。

(2)糖化：葡糖淀粉酶和/或生麦芽糖α-淀粉酶催化在液化后形成的麦芽糖糊精的非还原末端的水解，释放D-葡萄糖、麦芽糖和异麦芽糖。糖化作用产生富含葡萄糖或高麦芽糖的糖浆。在前面一种情况下，葡糖淀粉酶一般在酸性条件下在升高的温度，例如60℃，pH 4.3催化糖化。在这个过程中使用的葡糖淀粉酶一般得自真菌，例如在

L400中使用的黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖淀粉酶或灰腐质霉(Humicolagrisea)葡糖淀粉酶。脱支酶例如支链淀粉酶可以帮助糖化作用。

生麦芽糖α-淀粉酶可替代地可以催化糖化作用，以形成高麦芽糖糖浆。生麦芽糖α-淀粉酶一般具有比葡糖淀粉酶更高的最适pH和更低的最适温度，并且生麦芽糖淀粉酶一般需要Ca²⁺。目前用于这种应用的生麦芽糖α-淀粉酶包括枯草芽孢杆菌α-淀粉酶、植物淀粉酶和来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的α-淀粉酶，

的活性组分。用于产生各种产物的示例性糖化反应描述如下：

(3)进一步加工：工艺的分支点发生在富含葡萄糖的糖浆产生(在上文反应途径左侧显示)后。如果最终所需产物是生物燃料，那么酵母可以将富含葡萄糖的糖浆发酵为乙醇。另一方面，如果最终所需产物是富含果糖的糖浆，那么葡萄糖异构酶可以催化富含葡萄糖的糖浆转换为果糖。

糖化是富含葡萄糖的糖浆生产中的限速步骤。糖化一般进行48-72小时，经过所述时间许多真菌葡糖淀粉酶丧失显著活性。此外，葡萄糖产率从85％增至96％需要花费很大部分的例如高于70％的糖化时间。这主要是因为葡糖淀粉酶对低分子量寡糖的水解是低效的。因此，葡萄糖生产的最大化将需要相对高剂量的葡糖淀粉酶和/或较长的糖化期。此外，尽管生麦芽糖α-淀粉酶和葡糖淀粉酶两者都可以催化糖化作用，但如上所示，这些酶一般在不同最适pH和温度操作。如果2种酶顺次使用，那么2种酶之间在反应条件上的差异将使调节pH和温度成为必要，这就总体地减慢了该工艺且可能引起不溶性直链淀粉聚集物的形成。

因此，本领域对制造工业产品的改良的淀粉加工方法有需求。尤其是，对提高糖化步骤的效率有需求。

发明概述

淀粉加工可以用于例如生产甜味剂、生产醇用于燃料或饮用(即，可饮用醇)、生产饮料、加工甘蔗糖、或生产所需有机化合物，例如柠檬酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、酮、氨基酸、抗生素、酶、维生素、和激素。为促进淀粉加工，本发明提供来自枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶(AmyE)。AmyE显示不同于Termamyl样α-淀粉酶，例如来自地衣芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，的性质。AmyE具有以前未被认识到的转葡糖苷酶活性，并能够由麦芽糖合成麦芽三糖。此外，AmyE能够将麦芽糖、高DP底物、或甚至未蒸煮过的颗粒淀粉水解成葡萄糖。将AmyE或其变体和葡糖淀粉酶加至糖化中，除了别的之外，还导致较高的可发酵糖水平以及减少的高级糖水平。在补充有AmyE的糖化中葡糖淀粉酶的剂量明显减少。此外，AmyE或其变体能够在由里氏木霉(Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶催化的同时糖化和发酵中减轻“葡萄糖浪涌(glucose surge)”。而且，在糖化中使用AmyE或其变体可以例如显著地改善高果糖玉米糖浆(HFCS)或乙醇自淀粉的生产。

本发明提供了用于糖化淀粉的组合物，其包含葡糖淀粉酶和α-淀粉酶。α-淀粉酶为枯草芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyE)或AmyE变体，具有与具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的AmyE至少约80％、约85％、约90％、约95％、或约98％相同的氨基酸序列。在一方面，该α-淀粉酶可与具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的AmyE具有类似的转葡糖苷酶活性水平。在另一方面，AmyE可包含在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34中显示的氨基酸序列。在又一方面，α-淀粉酶可以是AmyE变体，其与具有SEQID NO：1的氨基酸序列的AmyE酶相比可具有一种或多种改变的性质。所述改变的性质可以是底物特异性、底物结合、底物断裂模式、热稳定性、pH/活性曲线、pH/稳定性曲线、氧化稳定性、在较低的钙离子水平下的稳定性、比活性或其任意组合。组合物还可包含植酸酶、支链淀粉酶、β-淀粉酶、真菌α-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶和/或异淀粉酶。本发明还公开了加工淀粉的方法，其包括混合所述组合物。在一方面，可使用组合物通过进一步混合葡萄糖异构酶在约6.0至约8.0的pH、例如pH 7.5，生产高果糖玉米糖浆。在另一方面，可以使用组合物来生产乙醇。对于乙醇生产，糖化和发酵可同时进行。可回收所生产的乙醇。乙醇生产还可包括蒸馏乙醇。发酵和蒸馏可同时、单独或相继进行。

在另一方面，本发明提供用于加工淀粉的方法，其包括施用葡糖淀粉酶和α-淀粉酶达足以糖化该淀粉的时间。α-淀粉酶为枯草芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyE)或AmyE变体，具有与具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的AmyE至少约80％、约85％、约90％、约95％、或约98％相同的氨基酸序列。在另一方面，AmyE可包含在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：3、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34中显示的氨基酸序列。在一方面，α-淀粉酶可以是AmyE变体，其与具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的AmyE酶相比可具有一种或多种改变的性质。所述改变的性质可以是底物特异性、底物结合、底物断裂模式、热稳定性、pH/活性曲线、pH/稳定性曲线、针对氧化作用的稳定性、在较低的钙离子水平下的稳定性、比活性或其任意组合。葡糖淀粉酶可以以不高于约0.22、约0.19、约0.17、约0.15、约0.13或约0.11葡糖淀粉酶单位每克干固形物(GAU/g ds)的量使用。在另一方面，该方法还可包括将淀粉底物与植酸酶、支链淀粉酶、β-淀粉酶、真菌α-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶和/或异淀粉酶接触。在又一方面，该淀粉糖化方法还可包括生产高果糖玉米糖浆(HFCS)。高果糖玉米糖浆的生产可通过在约6.0至约8.0的pH，例如pH 7.5混合葡萄糖异构酶而实现。在一个实施方案中，该产物包含约40-45％果糖。在另一方面，淀粉糖化方法还可包括发酵糖化后的淀粉以生产乙醇。对于乙醇生产，糖化和发酵可同时进行。本发明还提供了进一步包括回收乙醇的方法。乙醇生产可包括蒸馏乙醇。发酵和蒸馏可同时、单独或相继进行。

附图简述

附图并入本说明书中，提供各种实施方案的非限制性示例。在附图中：

图1显示来自嗜热脂肪地芽孢杆菌(SEQ ID NO：25；AmyS；“B.stear”)、地衣芽孢杆菌(SEQ ID NO：26；AmyL；“B.lich”)、和枯草芽孢杆菌(SEQ ID NO：27；AmyE；“B.sub”)的全长α-淀粉酶(具有完整信号序列)的氨基酸序列比对。

图2显示枯草芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyE；Protein Data Bank登录号1UA7)和嗜热脂肪地芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyS；Protein Data Bank登录号1HVX)之间的三维结构比较。

图3A显示叠合的嗜热脂肪地芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyS；ProteinData Bank登录号1HVX)(灰色阴影)和地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyL；Protein Data Bank登录号1BLI)(深色阴影)的结构。左图显示全面比较，而右图显示所选氨基酸侧链的放大视图。

图3B显示叠合的嗜热脂肪地芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyS；ProteinData Bank登录号1HVX)(灰色阴影)和枯草芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyE；Protein Data Bank登录号1UA7)(深色阴影)的结构的立体视图。

图4显示具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的AmyE(“全长AmyE”)与具有SEQ ID NO：35的氨基酸序列的AmyE(成熟“Amy31A”)之间的序列比对。氨基酸序列的差异以粗字体显示。残基自相应酶的成熟形式的第一个氨基酸开始进行编号。

图5显示了质粒pME630-7，其包含编码AmyE-tr(SEQ ID NO：2)的多核苷酸(标记为“SAMY 425aa”)。该质粒包括与SAMY基因符合读框的编码来自地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的信号序列的多核苷酸(标记为“pre LAT”)。

图6显示在与麦芽糖温育期间由AmyE催化的反应产物的HPLC分析。

图7显示，随着时间的变化，由AmyE介导的麦芽三糖合成的反应物组成(葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖)。

图8显示在pH 4.5和5.6，与嗜热脂肪地芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyS；SEQ ID NO：4)相比，通过AmyE(“全长AmyE”)、AmyE-tr(“截短AmyE”)和Amy 31A的葡萄糖形成。

图9显示在麦芽七糖(DP7)与AmyE-tr温育0h(上图)和72h(下图)后经HPLC检测的分解产物。

图10显示在DP7底物与AmyS温育0h、2h、4h和24h(图从上至下)后经HPLC检测的分解产物。

图11显示在DP7底物与

FRED(“Fred”)温育0h、1h、2h和3h(图从上至下)后经HPLC检测的分解产物。

图12显示在生玉米面淀粉与AmyE(SEQ ID NO：1)温育0min、30min和90min(图从上至下)后经HPLC检测的分解产物。

图13显示在pH 4.3和pH 5.8时在常规发酵中通过AmyE-tr(“截短的AmyE”)和XTRA淀粉酶(“XTRA”)的乙醇形成。

图14显示在pH 4.3和pH 5.8时，与单独河内曲霉(Aspergilluskawachii)α-淀粉酶(AkAA)或河内曲霉α-淀粉酶与里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)的混合物相比，不溶性颗粒(未蒸煮过的)淀粉通过全长AmyE(“AmyE FL”)和AmyE-tr至乙醇的水解。

图15显示，在由单独TrGA或补充了AmyE的TrGA催化的糖化作用中，随着时间的变化，滤液中碘阳性糖(IPS)的存在。

图16显示在由各种酶组合催化的糖化中，随时间的变化，滤液中碘阳性糖(IPS)的存在。对各种糖化反应，将在520nm的吸光度相对于时间作图。

图17显示在由各种酶组合催化的糖化中不溶性残留淀粉(IRS)的检测。

图18显示，在使用(1)HGA(灰腐质霉葡糖淀粉酶)、(2)TrGA(里氏木霉葡糖淀粉酶)和(3)补充有AmyE的TrGA的60分钟糖化反应中高级糖(DP4+)的水平。

图19显示，使用各种葡糖淀粉酶和/或各种葡糖淀粉酶和AmyE的组合的发酵过程中的葡萄糖水平。

图20显示在用各种葡糖淀粉酶和/或各种葡糖淀粉酶和AmyE的组合发酵后存在的乙醇百分比。

发明详述

本发明涉及枯草芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyE)。AmyE或其变体可用于更有效地由淀粉生产可发酵糖。本发明还公开了包含葡糖淀粉酶和所述α-淀粉酶的组合物以及利用补充有所述α-淀粉酶的葡糖淀粉酶加工淀粉的方法。

1.定义和缩写

在此发明详述中，应用下面的缩写和定义。应注意，如本文所使用，除非上下文另有明确指明，否则单数形式“一”、“一个”和“该”涵盖对复数形式的提及。因此，例如，提及“一种酶”包括多个此类酶，而提及“该制剂”包括一个或多个制剂以及本领域技术人员已知的其等同制剂，等等。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。下面提供如下的术语。

1.1.定义

如本文所使用，“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。

本文所使用的“杂交”包括核酸链通过碱基配对与互补链结合的过程，以及如在聚合酶链反应(PCR)技术中进行的扩增过程。杂交的核酸可以以单链或双链DNA或RNA、RNA/DNA异源双链体或RNA/DNA共聚物形式存在。此处所使用的“共聚物”是指，包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸两者的单核酸链。核酸包括可以在“高度严格条件”下与本文所公开的核酸杂交的那些。高度严格条件被定义为于50℃在0.2×SSC中或于65℃在0.1×SSC中(1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M枸橼酸钠，pH 7.0)杂交。

本文所使用的“核苷酸序列”或“核酸序列”是指基因组、合成或重组起源的序列，且可以是双链或单链(不论代表正义链还是反义链)。本文所使用的术语“核酸”可以是指基因组DNA、cDNA、合成的DNA或RNA。核酸的残基可包含本领域中通常已知和使用的任何化学修饰。

“分离的”是指该材料至少基本上不含有至少一种与其天然相伴且天然存在的其它组分。

“纯化的”是指该材料处于相对纯的状态，例如至少约90％纯的，至少约95％纯的，或至少约98％纯的。

“热稳定的”是指酶在暴露于升高的温度后仍保持活性。α-淀粉酶的热稳定性由其半衰期(t_1/2)量度，其中经过半衰期，半数酶活性丧失。半衰期通过如下方式测量：测定在给定的温度下、特别是在用于具体应用的温度下，酶随时间而保留的特定α-淀粉酶活性。

本文所使用的“食品”包括能够向消费者提供任何有益效应的、已经制备的食品以及用于食品的成分，例如面粉。“食品成分”包括其为或能够被加入食品或食物中的制剂，包括在需要例如酸化或乳化的多种产品中以低水平使用的制剂。食品成分可以是溶液或固体的形式，取决于用途和/或应用模式和/或施用模式。

“寡糖”是指由3-20个单糖构成的碳水化合物分子。

“同源物”是指与主题氨基酸序列或主题核苷酸序列具有某种程度同一性或“同源性”的实体。“同源序列”包括与主题序列具有至少85％序列同一性，例如与主题序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。通常，同源物将包括与主题氨基酸序列相同的活性位点。

本文所使用的“转化的细胞”包括已通过重组DNA技术的应用而被转化的细胞。通常通过向细胞插入一个或多个核苷酸序列而进行转化。所插入的核苷酸序列可以是异源核苷酸序列，即对于待转化的细胞而言并非天然的序列，例如融合蛋白。

本文所使用的“可操作连接”是指所述及的组分之间是允许它们以其预期方式发挥功能的关系。例如，与编码序列可操作连接的调节序列以如下方式实现连接，即，以该连接方式，编码序列可以在与该控制序列相容的条件下实现表达。

本文所使用的“生物学活性”是指具有与天然存在的序列相似但不必是相同程度的结构、调节或生化功能的序列。

本文所使用的“淀粉”是指包含植物复杂多糖碳水化合物，包含具有式(C₆H₁₀O₅)_x(其中“X”可以是任意数字)的直链淀粉和支链淀粉，的任何材料。特别地，该术语是指任何基于植物的材料，包括但不限于谷物、草、块茎和根，更特别地，是指小麦、大麦、玉米、黑麦、稻米、高粱、糠、木薯、栗、马铃薯、甘薯和木薯粉。

本文所使用的“颗粒淀粉”是指未经过糊化的未蒸煮过(生)的淀粉。

本文所使用的“淀粉糊化”是指使淀粉分子溶解形成粘性悬液。

本文所使用的“糊化温度”是指淀粉底物发生糊化的最低温度。确切温度取决于具体的淀粉底物，还可取决于淀粉得自的植物物种的具体品种和生长条件。

“DE”或“葡萄糖当量”是指用于量度总还原糖的浓度的行业标准，计算为已转化为还原糖的总固形物百分比。尚未被水解的颗粒淀粉的DE基本上为0，而D-葡萄糖的DE为100。

本文所使用的“淀粉底物”是指使用精制淀粉、全谷粉或分级的谷物的颗粒淀粉或液化后的淀粉。

本文所使用的“液化后的淀粉”是指已经经历过溶解过程，例如常规的淀粉液化过程的淀粉。

本文所使用的“葡萄糖糖浆”是指含有葡萄糖固体的含水组合物。葡萄糖糖浆将具有至少20的DE。在一些实施方案中，葡萄糖糖浆可含水不超过21％并且含以葡萄糖计算的还原糖至少25％。在一个实施方案中，葡萄糖糖浆可包括至少90％D-葡萄糖，且在另一个实施方案中，葡萄糖糖浆可包括至少95％D-葡萄糖。在一些实施方案中，术语葡萄糖和葡萄糖糖浆可互换使用。

本文所使用的“可发酵糖”是指能够在酵母发酵条件下被代谢的糖类。这些糖主要是指葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖(DP1、DP2和DP3)。

本文所使用的“总糖含量”是指淀粉组合物中存在的总糖含量。

本文所使用的“ds”是指溶液中溶解的固体/固形物。

“白利(Brix)”是一种熟知的比重计标度，用于量度在给定温度下溶液的糖含量。白利标度量度每100克含水糖溶液中溶解的蔗糖或溶解的总固体含量的克数。白利常通过使用比重计或折光仪来度量。

本文所使用的“波美度(Baumédegrees)”是指液体的比重。在20℃，比重(s.g.)与波美度之间的关系为：对于比水重的液体：s.g.＝145÷(145-波美度)；而对于比水轻的液体：s.g.＝140÷(波美度+130)。

对于淀粉悬液(例如浆液和淀粉水解物)，波美-干物质关系公开于Cleland J.等人，“Baumé-Dry Substance Tables for Starch Suspensions”Ind.Eng.Chem.anal.Ed.，15：334-36(1943)。还参见，“临界数据表(Critical Data Tables)”Corn Refiners Association，Inc.(1991)。在玉米湿磨工业中，波美度可用于水解产物的工艺控制和商业销售两者。

本文所使用的“淀粉液化酶(starch-liquefying enzyme)”是指催化颗粒淀粉的水解或分解的酶。示例性淀粉液化酶包括α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)。

“淀粉酶”是指例如能够催化淀粉降解的酶。

“α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)”是指以随机方式切割淀粉分子内部的α-D-(1→4)O-糖苷键的内切作用酶。相反，外切作用淀粉分解酶例如β-淀粉酶(EC 3.2.1.2；α-D-(1→4)-葡聚糖麦芽糖水解酶)和一些产物特异性淀粉酶如生麦芽糖α-淀粉酶(EC 3.2.1.133)从底物的非还原端切割淀粉分子。这些酶也被描述成在含有1，4-α-连接的D-葡萄糖单位的多糖中实现1，4-α-D-糖苷键的外切水解或内切水解的酶。用于描述这些酶的另一术语是糖原酶。示例性酶包括α-1，4-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(glucanohydrolase)。

本文所使用的“葡糖淀粉酶”是指淀粉葡糖苷酶类的酶(EC 3.2.1.3，葡糖淀粉酶，α-1，4-D-葡聚糖葡糖水解酶)。这些酶是由直链淀粉和/或支链淀粉分子的非还原端释放葡萄糖残基的外切作用酶。这些酶也能够水解α-1，6和α-1，3键，然而速度却比水解α-1，4键慢得多。

本文所使用的AmyE或其变体的“转葡糖苷酶活性”的特征在于，在与麦芽糖温育时形成麦芽三糖。尤其是，该转葡糖苷酶活性是指α-1，4-葡糖基转移酶活性。

本文所使用的“碘阳性糖(iodine-positive saccharide)”或“IPS”是指在液化和糖化之后未水解的直链淀粉。当用碘对糖化后的淀粉进行测试时，高DPn直链淀粉结合碘并产生特征性蓝色。IPS在淀粉加工应用中是非常不受欢迎的，因为其存在表明淀粉水解不完全。

本文所使用的“不溶性残留淀粉”或“IRS”是指不完全水解的淀粉，其在糖化后表现为沉淀物形式。高水平的沉淀物在甜味剂应用中是不受欢迎的，因为它们可大幅度干扰生产效率且减少产出。IRS还促成含有此类甜味剂的食品的不受欢迎的质地。

本文所使用的“葡萄糖浪涌(glucose surge)”是指在发酵的滞后(酵母生长)期显著增加的葡萄糖水平。

本文所使用的“淀粉的水解”是指加入水分子断裂糖苷键。

“聚合度(DP)”是指给定糖中脱水吡喃葡萄糖单位的数目(n)。DP1的实例是单糖，例如葡萄糖和果糖。DP2的实例是二糖，例如麦芽糖和蔗糖。DP4+(＞DP4)表示聚合度大于4的聚合物。

本文所使用的“接触”或“混合”是指将相应酶放置得足够接近其相应底物，以使该酶能够将底物转化为终产物。本领域技术人员将意识到将酶溶液与相应底物混合可实现接触或混合。

1.2.缩写

除非另有指明，否则应用下述缩写。

AE       醇乙氧基化物

AEO      醇乙氧基化物

AEOS     醇乙氧基硫酸盐

AES      醇乙氧基硫酸盐

GAU      葡糖淀粉酶活性单位

AkAA     河内曲霉α-淀粉酶

AmyE     枯草芽孢杆菌α-淀粉酶

AmyE-tr  截短的AmyE

AmyE FL  全长AmyE

AmyL     地衣芽孢杆菌α-淀粉酶

AmyR    

XTRA淀粉酶

AmyS    嗜热脂肪地芽孢杆菌α-淀粉酶

AS      醇硫酸盐

BAA     细菌α-淀粉酶

cDNA    互补DNA

CMC     羧甲基纤维素

DE      葡萄糖当量

DI      蒸馏的，去离子的

DNA     脱氧核糖核酸

DP3     具有三个亚单位的聚合度

DPn     具有n个亚单位的聚合度

DS或ds  干固形物

DTMPA   二乙基三胺五乙酸

EC      进行酶分类的酶学委员会

EDTA    乙二胺四乙酸

EDTMPA  乙二胺四甲叉膦酸

EO      环氧乙烷

F&HC    织物和家居护理

gpm     加仑每分钟

GAU     葡糖淀粉酶单位

HFCS    高果糖玉米糖浆

HFSS    基于高果糖淀粉的糖浆

HGA     灰腐质霉葡糖淀粉酶

HPLC    高压液相色谱法

IPS     碘阳性糖

IPTG    异丙基β-D-硫代半乳糖苷

IRS     不溶性残留淀粉

kg      千克

LA       Lauria琼脂

LB      Lauria肉汤

L1T     1位的亮氨酸(L)残基被苏氨酸(T)残基替换，其中氨基酸

        由本领域通常已知的单字母缩写表示

LU      脂肪酶单位

MOPS    3-(N-吗啉代)丙磺酸

MT      公吨

MW      分子量

NCBI    美国国家生物技术信息中心

nm      纳米

NOBS    壬酰基氧基苯磺酸盐

NTA     次氮基三乙酸

OD      光密度

PCR     聚合酶链反应

PEG     聚乙二醇

pI      等电点

ppm     百万分之一

PVA     聚(乙烯醇)

PVP     聚(乙烯吡咯烷酮)

RAU     参考淀粉酶单位

RMSD    均方根差

RNA     核糖核酸

rpm     每分钟转数

SAS     仲烷基磺酸盐

1×SSC  0.15M NaCl，0.015M枸橼酸钠，pH 7.0

SSF     同时糖化和发酵

SSU     可溶性淀粉单位，等价于每分钟释放的1mg葡萄糖的

        还原力

TAED    四乙酰基乙二胺

TNBS    三硝基苯磺酸

TrGA     里氏木霉葡糖淀粉酶

w/v      重量/体积

w/w      重量/重量

wt       野生型

μL      微升

μNm     微牛顿×米

XTRA     

XTRA(Danisco US Inc.，Genencor

         Division)

2.α-淀粉酶

2.1.结构和功能

α-淀粉酶是一组存在于动植物的组织和微生物中的酶。它们能够水解糖原、淀粉、相关多糖和一些寡糖的α-1，4-糖苷键。尽管所有α-淀粉酶都具有相同的催化功能，但是它们的氨基酸序列有很大差异。不同淀粉酶之间的序列同一性可以是实质上不存在的，例如落于25％以下。尽管存在相当大的氨基酸序列变异，但是α-淀粉酶具有共同的整体拓扑学方案，该方案在测定了来自不同物种的α-淀粉酶的三维结构后已得以鉴定。该共同的三维结构揭示了三个结构域：(1)“TIM”桶，被称为结构域A，(2)长的环区域，被称为结构域B，其插入于结构域A中，和(3)接近C端的区域，被称为结构域C，其包含具有Greek-key基序的特征性β-结构。

结构域A的TIM桶由沿着肽骨架交替的八个α-螺旋和八个平行β-链，即(β/α)₈，组成。按保守的糖酵解酶磷酸丙糖异构酶命名的该结构，已经已知在保守蛋白质折叠中是普遍的。结构域B是插入到β_A3与α_A3(结构域A中第三个β-链和α-螺旋)之间的环区域。结构域A和结构域B都与α-淀粉酶的催化功能直接相关，因为三维结构显示结构域A在活性位点的侧翼且结构域从一侧覆盖活性位点。而且，结构域A被认为是催化结构域，因为活性位点的氨基酸残基位于连接β-链与邻近的α-螺旋的环中。结构域B被认为通过影响底物结合而确定酶的特异性。MacGregor等人，Biochim.Biophys.Acta.1546：1-20(2001)。

“Termamyl样”α-淀粉酶是指一组广泛用于淀粉加工产业的α-淀粉酶。具有美国专利号6,440,716的SEQ ID NO：2的氨基酸序列的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶可以以

形式市售可得。Termamyl样α-淀粉酶通常是指一组由芽孢杆菌属物种产生的高同源的α-淀粉酶。该组的其它成员包括来自嗜热脂肪地芽孢杆菌(以前称为嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)；两种名称在本发明中可互换使用)和解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶，以及源自芽孢杆菌属物种NCIB 12289、NCIB 12512、NCIB12513和DSM 9375的那些α-淀粉酶，所有这些在美国专利号6,440,716和WO 95/26397(其并入本文作为参考)中详细描述。

尽管α-淀粉酶一般包含上述的三个结构域，但是一些α-淀粉酶例如来自枯草芽孢杆菌的AmyE的三维结构显著不同于Termamyl样α-淀粉酶。这些酶共同地被称为非-Termamyl样α-淀粉酶。图1显示了来自嗜热脂肪地芽孢杆菌(SEQ ID NO：25；AmyS)、地衣芽孢杆菌(SEQ ID NO：26)和枯草芽孢杆菌(SEQ ID NO：27；AmyE)的α-淀粉酶的序列比对。通过Kalign 2.0程序(可在http://www.ebi.ac.uk/Tools/kalign/index.html得到；还参见Lassmann&Sonnhammer，BMC Bioinfomatics 6：298(2005))，产生该序列比对。Termamyl样AmyS和AmyL共享约63％同一性和约77％相似性，而AmyE与AmyL或AmyS共享约15％同一性和低于25％的相似性。

枯草芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyE)或其截短变体的晶体结构已被测定，并且其具有其它α-淀粉酶的共同特征。Fujimoto等人，J.Mol.Biol. 277：393-407(1998)(Protein Data Bank登录号1BAG)；Kagawa等人，J.Bacteriol.185：6981-84(2001)(Protein Data Bank登录号1UA7)。将AmyE的晶体结构与那些“Termamyl样α-淀粉酶”比较是特别有意义的。如图2所示，通过比较AmyE与AmyS之间的三维结构而鉴定共同的拓扑方案(topological scheme)。两种淀粉酶显示相似的具有三个结构域的总体结构。分别参见例如，Protein Data Bank登录号1UA7和1HVX。

然而，对AmyS、AmyL和AmyE的三维结构的仔细检查揭示了AmyE与Termamyl样α-淀粉酶之间存在相当大的结构差异。当将AmyS和AmyL叠合在一起时，这两种淀粉酶在三个结构域之每一个上几乎重叠。显著差异仅存在在氨基酸侧链水平。参见图3A。另一方面，图3B提供了叠合在一起的AmyS和AmyE的三维结构。AmyS与AmyE之间存在相当大的结构差异。最引人注目的差异可能位于结构域B中。由于通常认为结构域B形成催化位点的大部分，所以预期AmyE可显示不同于Termamyl样α-淀粉酶的酶性质。

通过基于给定的三维比对来测定均方根差(RMSD)，可以获得更具定量性的结构相似性的量度。RMSD是叠合的蛋白质的骨架之间的平均距离的量度。通常，可通过在最佳刚体结构叠合(rigid body superposition)后α-碳原子坐标的RMSD来测量三维结构的相似性。当AmyL(Protein DataBank登录号1BLI)的三维结构与AmyS(Protein Data Bank登录号1HVX)的三维结构叠合时，基于PyMOL(可在http://pymol.org得到)，在419个氨基酸残基中RMSD为0.408埃。然而，AmyE(Protein Data Bank登录号1UA7)与AmyS(Protein Data Bank登录号1HVX)之间的三维结构比较在311个氨基酸残基中产生8.134埃的RMSD。

2.2.AmyE和变体

本发明提供了AmyE酶及其变体，其对进行本文所公开的应用是有用的。还提供了编码AmyE及其变体的核酸，以及包含该核酸的载体和宿主细胞。

用于本发明目的的“AmyE”是指，天然存在的来自枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶(EC 3.2.1.1；1，4-α-D-葡聚糖葡聚糖水解酶)。代表性AmyE序列在SEQ ID NO：1或27中列出。示于SEQ ID NO：1中的AmyE的氨基酸序列是不含天然信号序列的成熟形式的氨基酸序列。示于SEQ ID NO：27中的AmyE的氨基酸序列包含41个氨基酸残基的信号序列。此AmyE的天然信号序列的氨基酸序列示于SEQ ID NO：17中。此AmyE的成熟形式在本发明的其它地方被称为“全长AmyE”。使用具有默认比对参数的BLAST序列比对算法，其它AmyE序列与SEQ ID NO：1的AmyE具有至少约80％、约85％、约90％、约95％、或约98％序列同一性。例如，在UniProtKB/TrEMBL登录号O82953(SEQ ID NO：3)中公开的被称为Amy31A的AmyE与SEQ ID NO：1的AmyE具有86％序列同一性。SEQID NO：3的N端45个氨基酸残基是Amy31A的信号序列。AmyE(SEQ IDNO：1)与Amy31A(不含信号序列的SEQ ID NO：3)之间的序列比对在图4中描述。AmyE酶包括但不限于，具有在NCBI登录号ABW75769(SEQ IDNO：28)中公开的氨基酸序列的AmyE。更多的AmyE蛋白质序列包括在NCBI登录号ABK54355(SEQ ID NO：29)、AAF14358(SEQ ID NO：30)、AAT01440(SEQ ID NO：31)、AAZ30064(SEQ ID NO：32)、AAQ83841(SEQID NO：33)和BAA31528(SEQ ID NO：34)中公开的那些AmyE蛋白质序列，所述NCBI登录号的内容并入本文作为参考。

AmyE“变体”包含天然存在的AmyE序列的氨基酸序列修饰。本文所中，天然存在的AmyE也是“亲本酶”、“亲本序列”、“亲本多肽”或“野生型AmyE”。氨基酸修饰可包括氨基酸置换、添加或缺失。AmyE变体中的氨基酸修饰可以是天然突变的结果，或是使用用于此目的的本领域中熟知的任何一种方法对氨基酸序列进行刻意修饰的结果(下面进一步描述)。。代表性AmyE变体在于2008年6月6日提交的美国临时申请61/059,513中公开，其全部内容并入本文作为参考。

除非另有说明，否则AmyE变体具有至少一个氨基酸修饰，但是变体仍保留与SEQ ID NO：1的AmyE的至少约80％、约85％、约90％、约95％、或约98％的氨基酸序列同一性，所述同一性通过具有默认比对参数的蛋白质序列BLAST比对来测量。例如，与SEQ ID NO：1的氨基酸序列相比，变体可以具有一个、两个、三个、至多五个、至多十个或至多20个氨基酸置换。通常，对生物学功能非必需的氨基酸残基进行修饰。待修饰的氨基酸残基的选择可通过AmyE序列之间的序列同源性来指导。一般来说，AmyE序列中高度保守的氨基酸很有可能对生物活性是必需的。相反地，AmyE序列中变化的氨基酸位置不太可能对生物活性是必需的。例如，在AmyE与Amy31A之间的比对中不同的氨基酸残基，在图4中粗字体显示，有可能可以在AmyE变体中被修饰而不丧失生物活性。

变体AmyE可与天然存在的AmyE在B结构域(例如SEQ ID NO：1的氨基酸残基101-151)中显示显著的结构同一性。在一个实施方案中，变体AmyE可包含关于天然存在的AmyE的B结构域的氨基酸残基的1-3个氨基酸置换。在另一个实施方案中，变体AmyE可具有与天然存在的AmyE的三维结构重叠(全部或仅B结构域重叠)，平均在2埃内，的三维结构。

在一些实施方案中，变体AmyE与亲本酶的性质相比可显示一种或多种改变的性质。该改变的性质可导致与其亲本相比改良的变体性能。这些性质可包括底物特异性、底物结合、底物断裂模式、热稳定性、pH/活性曲线、pH/稳定性曲线、针对氧化作用的稳定性、在较低的钙离子(Ca²⁺)水平下的稳定性和/或比活性。

AmyE或其变体可被表示成融合蛋白，在AmyE成熟形式的N端和/或C端包含促进表达、检测和/或纯化的序列(例如信号序列或His-标签)。此类序列包括信号序列，其促进AmyE在宿主生物中的分泌与表达。额外的氨基酸残基可在信号序列断裂之后从AmyE的N端切除，如在Yang等人，“来自枯草芽孢杆菌的淀粉酶基因的核苷酸序列(Nucleotide sequence ofthe amylase gene from Bacillus subtilis)”Nucleic Acids Res.11：237-49(1983)中讨论。AmyE的“成熟形式”被定义为表达的AmyE序列的所有此类翻译后修饰的产物。存在于初级翻译产物的N端、可以被切除以形成成熟AmyE的序列，可以可替代地称作“信号序列”、“前导序列”或“前序列”。

信号序列可与AmyE由相同的基因编码。例如，SEQ ID NO：1中所示的AmyE天然地与信号序列以及具有序列MFAKRFKTSLLPLFAGFL LL FHLVLAGPAAASAETANKSNE(SEQ ID NO：17)的额外N末端氨基酸一起表达。信号序列可替代地可以是来自不同AmyE或甚至不同蛋白质的枯草芽孢杆菌物种信号序列。进一步地，信号序列可以来自不同物种，例如地衣芽孢杆菌。可以选择信号序列，以例如提供AmyE或其变体在特定宿主细胞中的最佳表达。可以通过自N末端蛋白酶解断裂非信号序列的额外序列，而产生成熟AmyE。例如，来自地衣芽孢杆菌的31-氨基酸残基信号序列(“LAT前导序列)可以与AmyE序列在框内融合。

与天然存在的AmyE相比，用于本发明目的的AmyE变体具有至少部分或类似的1，4-α-D-葡聚糖葡聚糖水解酶活性。此外，与具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的AmyE相比，用于本发明目的的AmyE变体还可具有类似的转葡糖苷酶活性水平。基于由实施例2.2中所述的麦芽三糖自麦芽糖的酶促合成，可以测量该转葡糖苷酶活性。变体可具有与野生型AmyE相同的活性和性质，或变体与具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的AmyE相比可具有改变的性质。该改变的性质可以是对麦芽七糖和/或麦芽三糖底物改变的(例如高两倍或三倍)比活性。可替代地或另外地，可以改变蛋白质的热稳定性。例如，变体可以比AmyE具更高热稳定性。该改变的性质可替代地或另外地可以是酶活性的最适pH。例如，变体可具有更酸或更碱的最适pH。

“截短的”AmyE(“AmyE-tr”)是指具有C端淀粉结合结构域的所有或部分的序列缺失的AmyE。例如，在SEQ ID NO：2的AmyE-tr中，SEQID NO：1的AmyE在残基D425处被截短。此AmyE-tr的

分辨率晶体结构可在Protein Databank登录号1BAG中得到，公开于Fujimoto等人，“复合麦芽五糖的枯草芽孢杆菌催化位点突变型α-淀粉酶的晶体结构(Crystal structure of a catalytic-site mutant alpha-amylasefromB.subtilis complexed with maltopentaose)”J.Mol.Biol. 277：393-407(1998)中。AmyE-tr可在其它位置例如SEQ ID NO：1的AmyE的Y423、P424、D426或I427处被截短，前提是所有或部分的C端淀粉结合结构域被移除。

编码AmyE或其变体的核酸包括但不限于公开于SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10中的多核苷酸，其分别编码SEQ ID NO：1的AmyE和AmyE-tr(SEQ ID NO：2)。更多的代表性多核苷酸包括公开于SEQ ID NO：11中的那些，其编码Amy31A(SEQ ID NO：3)。公开于NCBI登录号ABK54355、AAF14358、AAT01440、AAZ30064、NP_388186、AAQ83841和BAA31528的AmyE同样可以由公开于公众可获取的数据库中的多核苷酸编码，所述多核苷酸序列并入本文作为参考。核酸可以是DNA、mRNA或cDNA序列。核酸还包括任何前述的核酸的“简并序列”。简并序列包含至少一个密码子，其与上述核酸序列编码相同氨基酸残基但具有不同的核苷酸序列。例如，核酸包括编码AmyE或其变体的任何核酸序列。为了通过使用特定宿主生物偏好的密码子，可设计简并序列用于最佳表达。

本发明还提供包含编码AmyE或其变体的核酸的载体。提供包含载体的宿主细胞。宿主细胞可表达编码AmyE变体的多核苷酸。该宿主可以是芽孢杆菌属物种，例如枯草芽孢杆菌。

2.3.AmyE变体的表征

AmyE变体可以通过其核酸和一级多肽序列、通过3D结构建模，和/或通过其比活性来表征。AmyE变体的另外特征包括稳定性、Ca²⁺依赖性、pH范围、氧化稳定性和热稳定性。一方面，AmyE变体以比野生型AmyE更高的水平表达，而保留了野生型AmyE的性能特征。可使用本领域技术人员公知的标准测定法，评估表达水平和酶活性。在另一方面，变体表现相对于野生型酶的改良的性能特征，例如在高温下改良的稳定性或在不同pH值(例如pH 4.0至6.0或pH 8.0至11.0)下改良的活性。

与AmyE相比，AmyE变体可在宿主细胞中以改变的水平表达。表达通常涉及，经过给定时间，使用本领域公知的标准技术可从发酵液回收的活性变体的量。表达也可以涉及在宿主细胞内产生的或通过宿主细胞分泌的变体的量或速率。表达也可以涉及编码变体酶的mRNA的翻译速率。

在又一方面，重要的突变呈现改变的稳定性或比活性，尤其在约60℃(例如50-70℃)的温度，例如对于在糖化作用中的使用而言。变体可以具有在其它温度的改变的稳定性或比活性，取决于该变体是否将用于其它应用或组合物。例如，在烘焙产品中，变体可以显示在更高的温度范围的改变的比活性。

与亲本AmyE相比，AmyE变体还可具有改变的氧化稳定性，特别是更高的氧化稳定性。例如，在洗涤组合物中增加的氧化稳定性是有利的，而在用于淀粉液化的组合物中降低的氧化稳定性是有利的。

本文所述的AmyE变体也可以具有突变，所述突变导致与亲本酶相比半衰期延长10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更多，特别是在约55℃至约95℃或更高的升高温度、尤其是在约80℃。在一个实施方案中，AmyE变体可以在80℃或更高的温度加热约1-10分钟。

AmyE变体可以具有外切特异性，例如，通过本文所述的外切特异性指数(exo-specificity indices)所量度的。AmyE变体包括，与其衍生自亲本酶或多肽相比，任选地当在相同条件下测量时，具有更高或增加的外切特异性的那些变体。因此，例如，与其亲本多肽相比，AmyE变体多肽可具有10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、500％、1000％、5000％、10,000％或更高的外切特异性指数。

在一方面，AmyE变体具有与亲本序列相同的pH稳定性。在另一方面，变体包含赋予更高pH稳定性范围的突变或出于该酶的最终商业目的将该pH范围迁移至期望区域的突变。例如，在一个实施方案中，变体可以在约pH 5.0至约pH 10.5降解淀粉。AmyE变体多肽与相同条件下的亲本多肽相比可以具有更长的半衰期或更高的活性(取决于测定试验)，或AmyE变体可具有与亲本多肽相同的活性。在相同pH条件下，与其亲本多肽相比，AmyE变体多肽也可具有约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更长的半衰期。可选择地，或额外地，在相同pH条件下，与亲本多肽相比，AmyE变体可以具有更高的比活性。

在另一方面，本发明提供与编码本文所述任何AmyE变体的核酸互补的核酸。此外，提供了能够与该互补物杂交的核酸。在另一个实施方案中，在本文所述的方法和组合物中使用的序列是合成的序列。其包括但不限于，制备的、对于在特定宿主生物中的表达而言具有最佳密码子使用的序列。

3.α-淀粉酶的生产

使用表达载体，可以以酶形式表达通过本文所述的方法或通过本领域公知的备选方法生产的编码α-淀粉酶的DNA序列，所述表达载体通常包括编码合适的启动子、操纵基因、核糖体结合位点、翻译起始信号和任选地阻抑物基因或多个激活物基因的控制序列。

3.1.载体

带有编码α-淀粉酶的DNA序列的重组表达载体可以是能够方便进行重组DNA操作的任何载体，载体的选择通常取决于其被引入的宿主细胞。因此，该载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如，质粒、噬菌体或染色体外元件、微型染色体或人工染色体。或者，载体可以是当其被引入宿主细胞时被整合进入宿主细胞基因组并与整合其的染色体一起复制的载体。通过使用由抗生素选择或其它选择压力(例如必需的调节基因)驱动的或由对必需代谢途径基因的补充而驱动的可扩增构建体，也可以扩增该整合基因以产生该基因在该染色体中的多个拷贝。

表达载体通常包括克隆载体的组分，例如，在选择的宿主生物中允许载体自主复制的元件和用于选择目的的一个或多个表型可检测标记。表达载体通常包含编码启动子、操纵基因、核糖体结合位点、翻译起始信号的控制核苷酸序列和任选的阻抑物基因或一个或多个激活物基因。一方面，使用的全部信号序列将该物质靶向于细胞培养基以方便酶收集和任选的纯化。用于分别连接编码本文所述α-淀粉酶的DNA构建体、启动子、终止子和其它元件的操作，和用于将它们插入含有复制必需信息的合适载体的操作是本领域众所周知的(例如参见，Sambrook等人，M_OLECULARC_LONING：A L_ABORATORY M_ANUAL，第2版，Cold Spring Harbor，1989和第3版，2001)。

载体中，DNA序列应该被可操作连接于合适的启动子序列。该启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列，并且可以衍生自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。用于指导编码本文所述α-淀粉酶的DNA序列的转录(特别是在细菌宿主中)的合适启动子包括各种芽孢杆菌属源启动子，例如源自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶启动子，大肠杆菌lac操纵子的启动子，天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因dagA或celA启动子和枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。对于真菌宿主中的转录，有用的启动子的实例是源自编码米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白水解酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶或构巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶的基因的启动子。当在诸如大肠杆菌的细菌物种中表达编码本文所述α-淀粉酶的基因时，可以例如从噬菌体启动子(包括T7启动子和λ噬菌体启动子)，选择合适的启动子。适于在酵母物种中表达的启动子的实例包括但不限于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的Gal 1和Gal10启动子以及巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的AOX1和AOX2启动子。

表达载体也可包括与编码α-淀粉酶的DNA序列可操作连接的适宜转录终止子以及，在真核生物中，多腺苷酸化序列。终止序列和多腺苷酸化序列可适宜地源自与启动子相同的来源。载体还可包括允许载体在所讨论的宿主细胞中复制的DNA序列。该序列的实例是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1、pICatH和pIJ702的复制起点。

载体也可包括选择标记，例如其产物能在宿主细胞中弥补缺陷的基因，例如来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的基因。此外，载体可包括曲霉属选择标记，例如amdS、argB、niaD和xxsC(产生潮霉素抗性的标记)，或者可通过诸如本领域已知的共转化实现选择。例如参见，WO 91/17243。

3.2变体表达和宿主生物

当在宿主细胞中表达后α-淀粉酶被分泌到培养基中，通常是有利的。为此目的，α-淀粉酶可包括允许表达的酶分泌到培养基中的信号序列。如果需要，可用不同的信号序列代替原始信号序列，这可以通过编码各自信号序列的DNA序列的置换而方便地实现。例如，编码AmyE的核酸在示于图5的表达载体中与地衣芽孢杆菌信号序列可操作连接。信号序列在上文详细讨论。

有益地，将包括DNA构建体或表达载体的分离的细胞用作重组生产α-淀粉酶的宿主细胞。可用编码α-淀粉酶的DNA构建体，任选地通过将该DNA构建体(以一个或多个拷贝)整合到宿主染色体中，转化细胞。通常认为该整合是有利的，因为DNA序列更有可能稳定地保持在细胞中。可根据常规方法，例如通过同源或异源重组，实现DNA构建体向宿主染色体的整合。或者，可以用与不同类型的宿主细胞相关的上述表达载体对细胞进行转化。

适宜的细菌宿主生物的实例为革兰氏阳性细菌物种，例如芽孢杆菌科(Bacillaceae)，包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)；链霉菌属物种如鼠灰链霉菌(S.murinus)；乳酸细菌物种，包括乳球菌属物种(Lactococcus spp.)，如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)；乳杆菌属物种(Lactobacillus spp.)，包括罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)；明串珠菌属物种(Leuconostoc spp.)，片球菌属物种(Pediococcus spp.)和链球菌属物种(Streptococcus spp.)。其它有用的宿主包括例如，芽孢杆菌属物种A 7-7。或者，可以选择属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(包括大肠杆菌)或者属于假单胞菌科(Pseudomonadaceae)的革兰氏阴性细菌物种的菌株作为宿主生物。

适宜的酵母宿主生物可以选自生物技术相关酵母物种，例如但不限于毕赤酵母属物种、汉逊酵母属物种、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)物种、耶氏酵母属(Yarrowinia)物种，或酵母菌属(Saccharomyces)物种，包括酿酒酵母；或属于裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的物种，如粟酒裂殖酵母(S.pombe)物种。甲基营养酵母物种巴斯德毕赤酵母的菌株可以用作宿主生物。或者，宿主生物可以是汉逊酵母属物种。丝状真菌中适宜的宿主生物包括曲霉属物种，例如黑曲霉、米曲霉、塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)或构巢曲霉。或者，镰孢霉属(Fusarium)物种，如尖镰孢(Fusarium oxysporum)或根毛霉属(Rhizomucor)物种，如米赫根毛霉，可以用作宿主生物。其他适宜的酵母包括嗜热丝孢菌属(Thermomyces)和毛霉属(Mucor)物种。真菌细胞可以通过包括原生质体形成、原生质体转化、接着再生细胞壁的方法以本领域已知的方式进行转化。转化曲霉属宿主细胞的适宜操作描述在例如EP238023中。

再一方面，提供生产α-淀粉酶的方法，所述方法包括在有利于变体生产的条件下培养上述宿主细胞，并从该细胞和/或培养基中回收变体。用于培养细胞的培养基可以是任何适于生长所讨论宿主细胞和获得α-淀粉酶表达的常规培养基。适宜的培养基和培养基组分可获自商品供应商或可根据公开的配方(例如在美国典型培养物保藏中心(ATCC)的目录中所述的配方)制备。示例培养基包括但不限于用于在三千升(3,000L)搅拌式发酵罐中进行补料分批发酵的那些培养基。在该情况下生长培养基可以包括玉米浆固形物和大豆粉作为有机化合物的来源，连同无机盐作为钠、钾、磷酸、镁和硫酸的来源，以及微量元素。通常，碳水化合物来源如葡萄糖也是初始培养基的一部分。一旦培养物自身已经建立并开始生长，则可以如本领域已知的那样向罐中定量供应碳水化合物，以便维持培养物。定期从发酵罐中取样，以便利用例如比色测定法来测量酶滴度。根据测量，当酶生产速率停止增加时，终止发酵过程。

可通过公知的方法从培养基中方便地回收分泌自宿主细胞的α-淀粉酶，所述方法包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，借助于诸如硫酸铵的盐沉淀培养基中的蛋白质组分，随后使用诸如离子交换层析、亲和层析等的层析方法。

可在允许α-淀粉酶表达的适宜条件下培养宿主细胞。蛋白质的表达可以是组成型的，从而它们可以连续生产，或可以是诱导型的，从而需要刺激物来引发表达。在诱导型表达的情况下，例如，可以在需要时通过向培养基中加入诱导物(例如地塞米松或IPTG或Sepharose)来引发蛋白质生产。也可以在体外无细胞体系(例如TnT^TM(Promega)兔网织红细胞体系)中重组生产多肽。

也可以在有氧条件下、在对宿主适合的培养基中培养用于表达α-淀粉酶的宿主。可以提供振荡或搅拌及通风的组合，在对该宿主适合的温度例如约30℃至约75℃进行生产，这取决于宿主的需要以及生产期望α-淀粉酶变体的需要。可以培养约12至约100小时或更长(以及其间的任何时间值)或更具体地为24-72小时。通常，培养液的pH在约5.5至约8.0，这也取决于相对于所需α-淀粉酶的生产、宿主细胞所需的培养条件。

表达的酶的淀粉分解活性可例如使用马铃薯淀粉作为底物来测定。该方法是基于酶对改性马铃薯淀粉的降解，此反应之后将淀粉/酶溶液的样品与碘溶液混合。初始时形成黑蓝色，但在淀粉降解期间，蓝色变淡，并且逐步变成赤褐色(与有色玻璃标准相比)。

4.α-淀粉酶的纯化

可以使用常规方法制备纯化的本文所述α-淀粉酶。发酵后，获得发酵液，可以通过常规分离技术除去微生物细胞和各种悬浮的固体(包括残留的发酵原料)，以获得淀粉酶溶液。通常使用过滤、离心、微量过滤、转鼓真空过滤、随后超滤、提取或层析等。

可能期望浓缩包含本文所述的表达的α-淀粉酶的溶液，因为使用未浓缩的溶液需增加温育时间来收集包含纯化酶的沉淀物。用常规技术浓缩溶液至获得期望的酶水平。可通过上文讨论的任何技术实现含酶溶液的浓缩。在一个实施方案中，使用旋转真空蒸发和/或超滤。备选地，可使用超滤。

用于纯化目的的“沉淀剂”是指有效从溶液中沉淀本文所述α-淀粉酶的化合物，不管沉淀物性质如何，即晶体、无定形或两者混合物。可以使用例如金属卤化物沉淀剂进行沉淀。金属卤化物沉淀剂包括：碱金属氯化物、碱金属溴化物和这些金属卤化物中两种或更多种的混合物。金属卤化物可以选自氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾和这些金属卤化物中两种或更多种的混合物。适合的金属卤化物包含氯化钠和氯化钾，尤其是氯化钠，其还可用作防腐剂。在常规试验后，实现最大回收的沉淀条件(包括温育时间、pH、温度和本文所述α-淀粉酶的浓度)的选择将对本领域普通技术人员是显而易见的。

通常，向浓缩的酶变体溶液中加入至少约5％w/v(重量/体积)至约25％w/v的金属卤化物，且通常是至少8％w/v。通常，向浓缩的酶变体溶液中加入不超过约25％w/v的金属卤化物，且通常是不超过20％w/v。金属卤化物沉淀剂的最适浓度将取决于例如本文所述的具体α-淀粉酶的性质以及其在溶液中的浓度等。

另一可选的实现酶沉淀的方法是采用有机化合物，其可以添加到浓缩的酶变体溶液中。有机化合物沉淀剂可以包括：4-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸的碱金属盐、4-羟基苯甲酸的烷基酯、以及这些有机化合物中两种或更多种的混合物。所述有机化合物沉淀剂的添加可以在金属卤化物沉淀剂的添加之前、与其同时或在其后发生，并且两种沉淀剂(有机化合物和金属卤化物)的添加都可相继进行或同时进行。进一步的描述例如参见DaniscoUS，Inc.，Genencor Division的美国专利号5,281,5260。

通常，有机化合物沉淀剂选自4-羟基苯甲酸的碱金属盐(例如钠或钾盐)，以及4-羟基苯甲酸的直链或支链烷基酯(其中烷基含有1-12个碳原子)，以及这些有机化合物中两种或更多种的混合物。有机化合物沉淀剂可以是例如4-羟基苯甲酸的直链或支链烷基酯(其中烷基含有1-10个碳原子)，以及这些有机化合物中两种或更多种的混合物。适合的有机化合物包含4-羟基苯甲酸的直链烷基酯(其中烷基含有1-6个碳原子)，以及这些有机化合物中两种或更多种的混合物。也可以使用4-羟基苯甲酸的甲基酯、4-羟基苯甲酸的丙基酯、4-羟基苯甲酸的丁基酯、4-羟基苯甲酸的乙基酯以及这些有机化合物中两种或更多种的混合物。其他有机化合物还包括但不限于4-羟基苯甲酸甲酯(称为甲基PARABEN)、4-羟基苯甲酸丙酯(称为丙基PARABEN)，它们也是淀粉酶防腐剂。就pH、温度、酶浓度、沉淀剂浓度和温育时间而论，所述有机化合物沉淀剂的添加提供了沉淀条件高度灵活性的优势。通常，向浓缩的酶变体溶液中加入至少0.01％w/v的有机化合物沉淀剂，且通常至少0.02％w/v。通常向浓缩的酶变体溶液中加入不多于0.3％w/v的有机化合物沉淀剂，且通常不多于0.2％w/v。

可以调整含有金属卤化物沉淀剂和，在一个方面，有机化合物沉淀剂的浓缩酶溶液的pH，该pH必然地将取决于待纯化的酶变体。通常，将pH调整至淀粉酶等电点附近的水平。例如，将pH调整至位于如下范围内：低于等电点(PI)大约2.5个pH单位至高于PI约2.5个pH单位。若变体的pI不同于野生型的pI，则可以相应地调整该pH。

获得纯化的酶沉淀物所需的温育时间取决于具体酶的性质、酶浓度、以及具体的沉淀剂(一种或多种)及其浓度。通常，有效沉淀酶变体的时间为约1至约30小时；通常不超过约25小时。在有机化合物沉淀剂存在下，温育时间还可以减至小于约10小时，且在大多数情况下甚至是约6小时。

通常，温育期间的温度为约4℃至约50℃。通常，在约10℃至约45℃，尤其是约20℃至约40℃的温度进行所述方法。用于诱导沉淀的最佳温度根据溶液条件和酶或所用的沉淀剂而变化。

可以通过搅拌包括酶、添加的金属卤化物和添加的有机化合物的溶液，提高纯化的酶沉淀物的总回收率以及该方法的实施效率。可以在添加金属卤化物和有机化合物期间，以及在随后的温育期均进行搅拌步骤。适宜的搅拌方法包括机械搅拌或振荡、强有力的通风或任何类似的技术。

可以通过常规分离技术，例如过滤、离心、微量过滤、旋转真空过滤、超滤、压滤、交叉膜微量过滤(cross membrane microfiltration)、交叉流膜微量过滤等，进一步对纯化的酶进行纯化。所用方法可以是交叉膜微量过滤。可以通过用水洗涤沉淀物获得对纯化的酶沉淀物的进一步纯化。例如，用包含金属卤化物沉淀剂的水、例如用包含金属卤化物和有机化合物沉淀剂的水来洗涤纯化的酶沉淀物。

培养期间，表达的酶可以蓄积在培养液中。为了分离和纯化表达的酶，离心或过滤培养液以除去细胞，并可利用所得的无细胞液体进行酶纯化。在一个实施方案中，使用约70％饱和度的硫酸铵对无细胞培养液进行盐析；然后将该70％饱和度-沉淀级分溶解在缓冲液中并施加到诸如Sephadex G-100柱中，并洗脱以回收酶活性级分。为了进一步的纯化，可使用诸如离子交换层析等常规方法。

纯化的酶变体可用于通常利用该酶的所有应用中。例如，它们可以用于洗衣洗涤剂和除斑剂(spot remover)，用于食品工业，用于淀粉加工和烘焙，且可作为消化助剂用于药物组合物。可以将它们制成液体(溶液，浆液)或固体(颗粒，粉末)形式的终产品。

可选地，可以回收酶产物，并向培养基中加入絮凝剂(flocking agent)，以便通过过滤或离心除去细胞和细胞碎片，而无需进一步纯化酶。

通过上述方法生产和纯化的α-淀粉酶可用在多种有用的工业应用中。该酶具有便于织物和家居护理(F&HC)相关应用的有价值的特性。例如，本文所述的α-淀粉酶可以用作洗涤、餐具洗涤和硬表面清洁洗涤剂组合物的组分。本文所述的α-淀粉酶也可用于由淀粉生产甜味剂和乙醇，和/或用于纺织品退浆。本文所述α-淀粉酶在淀粉转化工艺(包含淀粉液化和/或糖化工艺)中尤其有用，如在例如WO 2005/111203和于2006年1月19日公开的美国公开申请号2006/0014265(Danisco US，Inc.，Genencor Division)中所述。下文更详细地描述了所述α-淀粉酶的这些用途。

5.用于淀粉加工的组合物

5.1.液化和糖化

一方面，具有α-淀粉酶的组合物可用于淀粉加工，例如液化和/或糖化。该工艺可包括在低于颗粒淀粉初始糊化温度的温度，将糊化的淀粉或颗粒淀粉的浆液，特别是将颗粒淀粉水解成可溶性淀粉水解产物。淀粉加工可用于生产甜味剂、生产用于燃料或饮料的醇(即可饮用醇)、生产饮料、加工蔗糖、或生产所需的有机化合物(例如柠檬酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、酮类、氨基酸、抗生素、酶、维生素和激素)。将淀粉转换为果糖糖浆通常包括三个连续的酶促步骤：液化步骤、糖化步骤以及异构化步骤。

本文所使用的术语“液化”表示将淀粉转化为链长较短且粘性较小的糊精的过程。通常，此过程包括淀粉的糊化，同时或之后添加本文所述的α-淀粉酶。本文所使用的术语“初次液化”是指浆液温度升至或接近其糊化温度时的液化步骤。继温度升高之后，使浆液传送通过热交换器或喷射器达到温度约90-150℃，例如100-110℃。继应用热交换器或喷射器温度之后，使浆液在该温度保持3-10分钟的时间。这种保持浆液处于90-150℃的步骤称为初次液化。

本文所使用的术语“二次液化”是指继初次液化(加热至90-150℃)之后，当浆液被允许冷却至室温时的液化步骤。此冷却步骤可以是30分钟至180分钟，例如90分钟至120分钟。本文所使用的术语“二次液化的分钟数”是指自二次液化开始时起至测量葡萄糖当量(DE)时所过去的时间。

液化步骤后，通常可以通过添加葡糖淀粉酶(例如来自Novozymes，A/S的AMG^TM)和任选的脱支酶(如异淀粉酶或支链淀粉糖(例如来自Novozymes，A/S的

))，将糊精转化为葡萄糖。在此步骤之前，通常将pH降至低于约4.5的值，维持温度在95℃或更高，以使液化α-淀粉酶变体活性发生变性。使温度降至60℃，加入葡糖淀粉酶和脱支酶。糖化步骤通常进行约24至约72小时。

本文所述的α-淀粉酶的一个优势是其催化复杂糖例如麦芽糖、麦芽三糖和麦芽七糖降解的能力。为此，糖化可通过AmyE或其变体与葡糖淀粉酶来催化。本文所述的α-淀粉酶的另一个优势是，通过本文所述的一种或多种α-淀粉酶的作用，可以在适于葡糖淀粉酶的相同反应条件下将糊精转化为葡萄糖。AmyE及其变体的该有利性质在于2008年6日6日提交的美国临时申请61/059,618(其全部内容并入本文作为参考)中公开。因为AmyE及其变体可以与葡糖淀粉酶在相同的pH和温度操作，所以可在用葡糖淀粉酶进行额外催化之前或之后、或通过AmyE或其变体和葡糖淀粉酶的混合物(cocktail)来添加AmyE及其变体。由此可避免因调节pH和温度以适应葡糖淀粉酶的使用而必需的迟滞。

葡糖淀粉酶当单独用于糖化时，通常以不多于或甚至少于0.5葡糖淀粉酶活性单位(GAU)/g DS(即每克干固形物葡糖淀粉酶活性单位)的量存在。葡糖淀粉酶可以以0.02-2.0GAU/g DS或0.1-1.0GAU/g DS，例如0.2GAU/g DS的量添加。葡糖淀粉酶可以源自微生物或植物。例如，葡糖淀粉酶可以是真菌或细菌来源。示例性细菌葡糖淀粉酶有曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等人(1984)，EMBO J.3(5)：1097-1102)或其变体，例如WO 92/00381和WO 00/04136中所公开的；泡盛曲霉葡糖淀粉酶(WO 84/02921)；米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.(1991)，55(4)：941-949)或其变体或片段。在一个实施方案中，本发明方法还包括使用在WO 98/22613中公开的类型的碳水化合物结合结构域。其它可考虑的曲霉属葡糖淀粉酶变体包括增强热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等人(1996)，Prot.Eng.9：499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等人(1995)，Prot.Eng.8：575-582)；N182(Chen等人(1994)，Biochem.J.301：275-281)；二硫键A246C(Fierobe等人(1996)，Biochemistry，35：8698-8704)；以及在A435和S436位置中引入Pro残基(Li等人(1997)Protein Eng.10：1199-1204)。其他考虑的葡糖淀粉酶包括踝节菌属葡糖淀粉酶，特别是来源于埃默森踝节菌属(WO 99/28448)、Talaromycesleycettanus(美国专利No.RE 32,153)、杜邦踝节菌(Talaromyces duponti)、或嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilics)(美国专利No.4,587,215)的葡糖淀粉酶。考虑的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)，特别是C.thermoamylolyticum(EP 135138)和C.thermohydrosulfuricum(WO86/01831)的葡糖淀粉酶。适宜的葡糖淀粉酶包括来源于米曲霉的葡糖淀粉酶，例如与WO 00/04136中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或甚至90％同源性的葡糖淀粉酶。还适宜的是商业葡糖淀粉酶，例如AMG 200L；AMG 300L；SAN^TMSUPER和AMG^TM E(来自Novozymes)；

300(GenencorDivision，Danisco US Inc.)；AMIGASE^TM和AMIGASE^TM PLUS(DSM)；

G900(Enzyme Bio-Systems)；

G990ZR(黑曲霉葡糖淀粉酶且低蛋白酶含量)。

有利地，本文所述的α-淀粉酶可与葡糖淀粉酶组合在用于淀粉加工的组合物中，例如作为在糖化中使用的组合物。因为AmyE或其变体具有有利的性质，所以降低的葡糖淀粉酶量，例如少约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、或约10％，可有效地实现与单独使用葡糖淀粉酶时等价的糖化结果。

在另一个实施方案中，组合其它α-或β-淀粉酶或其它酶以提供具有广谱活性的“混合物”。例如，淀粉可与一种或多种选自下列的酶接触：真菌α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、细菌α-淀粉酶，例如芽孢杆菌α-淀粉酶或非芽孢杆菌α-淀粉酶和/或β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)。在一个实施方案中，还可以向本文所述的α-淀粉酶加入其它淀粉分解酶或脱支酶，例如异淀粉酶(EC 3.2.1.68)或支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)。异淀粉酶水解支链淀粉和β-极限糊精中的α-1，6-D-糖苷分支键，并且可以通过其不能作用于支链淀粉及其对α-极限糊精的有限作用而与支链淀粉酶区分开。可以按本领域技术人员众所周知的有效量加入脱支酶。

植酸酶对本发明有用，因为它们能够在温育和液化步骤的限定条件下水解植酸。在某些实施方案中，植酸酶能够从肌醇六磷酸(植酸)中释放至少一个无机磷酸。根据植酸酶对植酸分子上起始水解的磷酸酯基团的特定位置的偏好性，可以将植酸酶分类(例如，3-植酸酶(EC 3.1.3.8)或6-植酸酶(EC 3.1.3.26))。植酸酶的一个典型例子是肌醇-六磷酸-3-磷酸水解酶。

植酸酶可以得自微生物例如真菌和细菌生物。这些微生物中的一些包括例如曲霉属(例如，黑曲霉、土曲霉(A.terreus)、无花果曲霉(A.ficum)和烟曲霉(A.fumigatus))、毁丝霉属(Myceliophthora)(嗜热毁丝霉(M.thermophila))、踝节菌属(嗜热踝节菌)、木霉属物种(里氏木霉)和嗜热丝孢菌属(Thermomyces)(WO 99/49740)。植酸酶也可从青霉属(Penicillium)物种获得，例如P.hordei(ATCC号22053)、桧状青霉(P.piceum)(ATCC号10519)、或短密青霉(P.brevi-compactum)(ATCC号48944)。参见例如，USP6,475,762。此外，植酸酶可从芽孢杆菌属(例如，枯草芽孢杆菌)、假单胞菌属、Peniophora、大肠杆菌、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Enterbacter)和布丘氏菌属(Buttiauxella)获得(参见WO2006/043178)。

商业化植酸酶是可得的，例如NATUPHOS(BASF)、RONOZYMEP(Novozymes A/S)、PHZYME XP(Danisco A/S)和FINASE(AB Enzymes)。用于测定微生物植酸酶活性的方法和植酸酶单位的定义已由Engelen等人在J.of AOAC Int.，77：760-764(1994)中公开。植酸酶可以是野生型植酸酶、其变体或片段。

在一个实施方案中，植酸酶源自细菌布丘氏菌属物种。布丘氏菌属物种包括乡间布丘氏菌(B.agrestis)、布里纳氏布丘氏菌(B.brennerae)、B.ferragutiase、伽瓦尼布丘氏菌(B.gaviniae)、伊查德氏布丘氏菌(B.izardii)、诺基亚布丘氏菌(B.noackiae)和瓦姆波德布丘氏菌(B.warmboldiae)。布丘氏菌属物种菌株可从DSMZ，German National Resource Center forBiological Material(Inhoffenstrabe 7B，38124Braunschweig，DE)获得。在登记号NCIMB 41248下保藏的布丘氏菌属物种菌株P1-29是可以从其中获得植酸酶并根据本发明进行应用的特别有用的菌株例子。在一些实施方案中，植酸酶可以是BP-野生型、其变体(例如BP-11)(在WO 06/043178中描述)、或如在2008年9月11日公开的US20080220498中描述的变体。例如，BP-野生型及其变体在WO 06/043178的表1中公开，其中编号参考公布的PCT申请的SEQ ID NO：3进行。

β-淀粉酶是产麦芽糖的外切作用淀粉酶，其催化直链淀粉、支链淀粉和相关葡萄糖聚合物中的1，4-α-糖苷键水解，从而释放麦芽糖。β-淀粉酶已从各种植物和微生物中分离(Fogarty等人，P_ROGRESS IN I_NDUSTRIALM_ICROBIOLOGY，第15卷，第112-115页，1979)。这些β-淀粉酶的特征在于具有在40℃-65℃的范围中的最适温度、和在约4.5-约7.0的范围中的最适pH。考虑的β-淀粉酶包括但不限于，来自大麦的β-淀粉酶

BBA 1500、

DBA、OPTIMALT^TM ME、OPTIMALT^TM BBA(Danisco A/S)；和NOVOZYM^TM WBA(NovozymesA/S)。

在糖化步骤后，葡萄糖糖浆可以例如使用固定化葡萄糖异构酶(例如

)转化成高果糖糖浆。在一个方面，将该步骤的可溶性淀粉水解物转化为高果糖淀粉基糖浆(HFSS)，例如高果糖玉米糖浆(HFCS)。这种转化可以使用葡萄糖异构酶达到，特别是在固相载体上固定的葡萄糖异构酶。可以考虑的异构酶包括商业产品

IT(Novozymes A/S)；

IMGI和

G993、

G993液体和

IGI(Danisco US Inc.，Genencor Division)。

尽管通常需要加入1mM或更多的Ca²⁺以确保足够高的α-淀粉酶稳定性，但是游离Ca²⁺强烈地抑制葡萄糖异构酶的活性。因此，通常在异构化之前借助于昂贵的器件操作去除Ca²⁺，以使游离Ca²⁺浓度的水平低于3-5ppm。如果可以避免此类操作，则可节省成本。

本文所述α-淀粉酶有利地需要添加很少的Ca²⁺或不需要添加Ca²⁺用于稳定性。由此，可以减少或完全消除加入液化和/或糖化反应中的Ca²⁺。由此可以避免在反应混合物与葡萄糖异构酶接触之前通过离子交换去除Ca²⁺的步骤，节省时间与成本，并提高生产高果糖糖浆的方法的效率。

待加工的淀粉可以得自块茎、根、茎、豆科植物、谷物或全谷粒。更具体而言，颗粒淀粉可以得自玉米、玉米穗轴、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、木薯粉、高粱、稻、豌豆、豆、香蕉或马铃薯。特别考虑的是蜡质和非蜡质类型的玉米和大麦。淀粉可以是高度精制的淀粉质量，例如至少90％、至少95％、至少97％或至少99.5％纯。可替代地，淀粉可以是较为粗糙的含淀粉物质，包括碾碎的全谷粒，包括非淀粉的级分例如胚芽残留物和纤维。可以研磨原料例如全谷粒，以打开结构和允许进一步加工。

两种研磨方法是合适的：湿磨法和干磨法。在干磨法中，研磨且使用整个籽粒。湿磨法获得胚芽和粗磨粉(淀粉颗粒和蛋白质)的良好分离，并且通常在糖浆生产中使用。湿磨和干磨均是淀粉加工领域所熟知的，并且也考虑与本发明的组合物和方法组合应用。该工艺可以在超滤系统中进行，其中保留物在酶、生淀粉和水的存在下保持再循环，其中渗透物是可溶性淀粉水解物。该工艺还可以在连续膜反应器中用超滤膜进行，其中保留物在酶、生淀粉和水的存在下维持再循环，并且其中渗透物是可溶性淀粉水解物。该工艺还可以考虑在连续膜反应器中用微量过滤膜进行，其中保留物在酶、生淀粉和水的存在下维持再循环，并且其中渗透物是可溶性淀粉水解物。

干磨的谷粒除淀粉外还可以包括显著量的非淀粉碳水化合物化合物。当此非均质材料通过喷射蒸煮加工时，常仅实现淀粉的部分糊化。因此，对未糊化淀粉具有高活性的本文所述α-淀粉酶可以有利地用于包括液化和/或糖化喷射蒸煮的干磨淀粉的方法中。

在上述任何方面中使用的淀粉浆可以具有约20％-约55％干固形物颗粒淀粉，约25％-约40％干固形物颗粒淀粉，或约30％-约35％干固形物颗粒淀粉。酶变体可以以至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的量将颗粒淀粉中的可溶性淀粉转化为可溶性淀粉水解物。

在另一个实施方案中，本文所述的α-淀粉酶用于还包括发酵以产生发酵产物，例如乙醇的淀粉加工中。通过发酵由含淀粉材料生产乙醇的此类方法包括：(i)使含淀粉物质液化；(ii)使获得的液化醪液糖化；和(iii)在发酵生物的存在下使步骤(ii)中获得的物质发酵。任选地该方法进一步包括回收乙醇。在发酵过程中，乙醇含量可以达到至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％，例如至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少15％或至少16％乙醇。

可以以同时糖化和发酵(SSF)工艺，执行糖化和发酵步骤。当发酵与水解同时执行时，温度可以是30℃-35℃，特别是31℃-34℃。该过程可以在超滤系统中进行，其中保留物在酶、生淀粉、酵母、酵母营养物和水的存在下维持再循环，并且其中渗透物是含乙醇液体。还考虑的是在连续膜反应器中用超滤膜进行该过程，其中保留物在酶、生淀粉、酵母、酵母营养物和水的存在下维持再循环，并且其中渗透物是含乙醇液体。

该工艺的可溶性淀粉水解产物还可以用于生产发酵产物，包括将所处理的淀粉发酵成发酵产物，例如柠檬酸、谷氨酸一钠、葡糖酸、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸钾、葡糖酸δ-内酯或异抗坏血酸钠。

5.2.由淀粉生产乙醇

通常，由整个谷粒生产醇(乙醇)可分成四个主要步骤：碾磨、液化、糖化和发酵。可在糖化中使用葡糖淀粉酶和本文所述的α-淀粉酶。

碾磨谷粒以打开其结构，从而允许进一步加工。常用的两种方法是湿磨法或干磨法。在干磨法中，碾磨整个谷粒并用于该工艺的剩余部分。湿磨法提供胚芽和粗磨粉(淀粉颗粒和蛋白质)的良好分离，并且除少数例外情况之外，可以在平行生产糖浆的场所应用。

在液化步骤中，通过将淀粉颗粒水解成大部分具有DP高于4的麦芽糖糊精，溶解淀粉颗粒。可通过酸处理或利用α-淀粉酶的酶法，进行水解。酸水解的使用范围是有限的。原料可以是碾磨的全粒或来自淀粉加工的侧流(side stream)。酶促液化通常以三步骤热浆法进行。加热浆液至约60-95℃，通常约80-85℃，并加入酶。然后将浆液在约95-140℃之间、通常在约105-125℃之间进行喷射蒸煮，冷却至约60-95℃，加入更多的酶以完成最终水解。该液化步骤在约4.5-6.5、通常在约5.0～约6.0的pH进行。经碾磨和液化的谷粒也被称为醪液。

为生产可由酵母代谢的低分子糖DP_1-3，必须进一步水解或糖化由液化得到的麦芽糖糊精。通常使用葡糖淀粉酶(可选地，α-葡糖苷酶或酸性α-淀粉酶)经酶法进行水解。在一个实施方案中，在糖化中使用葡糖淀粉酶和AmyE或其变体。整个糖化步骤可持续多达72小时，然而，通常仅进行预糖化一般40-90分钟、然后在发酵(SSF)期间完成糖化。糖化通常在约30-65℃(通常约60℃)的温度和约pH 4.5进行。

向醪液中加入通常来自酵母菌属的酵母，使发酵进行24-96小时，例如通常35-60小时。温度为约26-34℃，通常为约32℃；pH为约pH 3-6，通常为约pH 4-5。注意，最广泛使用的方法是同时糖化和发酵(SSF)工艺，其中没有糖化占用阶段，意味着一起加入酵母和酶。当进行SSF时，一般临在发酵之前在高于50℃的温度引入预糖化步骤。

发酵后，蒸馏醪液以提取乙醇。根据本发明方法所得的乙醇可用作例如，燃料乙醇；饮用乙醇(即可饮用的中性烈酒)或工业乙醇。发酵剩余物是酒糟，其通常以液体或干燥形式用于动物饲料。关于如何进行液化、糖化、发酵、蒸馏和乙醇回收的进一步细节为技术人员所众所周知。根据本发明的方法，糖化和发酵可同时或分开地进行。

尽管已经参考下面实施例详细地描述了本发明，但是应理解，在不背离本发明的精神下可作出各种修改，并且这些修改对本领域技术人员来说是显而易见的。

5.3.清洁和餐具洗涤组合物及用途

可以将本文讨论的AmyE或其变体配制在例如，用于清洁餐具的洗涤剂组合物中或其他清洁组合物中。这些组合物可以是凝胶、粉末或液体。组合物可以包括单独的a-淀粉酶变体、其他淀粉分解酶、其它清洁酶以及清洁组合物常用的其他组分。

因此，餐具洗涤洗涤剂组合物可以包括表面活性剂。表面活性剂可以是阴离子型、非离子型、阳离子型、两性离子型或这些类型的混合物。洗涤剂可以含有按重量计0％至约90％的非离子表面活性剂，例如低泡沫至无泡沫乙氧基化丙氧基化直链醇。

在洗涤剂应用中，通常将AmyE或其变体用于含有丙二醇的液体组合物中。例如可通过在含有10％氯化钙的25％体积/体积丙二醇溶液中循环，将AmyE或其变体溶解于丙二醇中。

餐具洗涤洗涤剂组合物可含有无机和/或有机类型的洗涤剂助洗剂(detergent builder)盐。洗涤剂助洗剂可细分为含磷和不含磷的类型。洗涤剂组合物通常含有约1％至约90％的洗涤剂助洗剂。当存在含磷的无机碱性洗涤剂助洗剂时，其实例包括水溶性盐，尤其是碱金属焦磷酸盐、正磷酸盐和多磷酸盐。当存在含磷的有机碱性洗涤剂助洗剂时，其实例包括水溶性膦酸盐。当存在不含磷的无机助洗剂时，其实例包括水溶性碱金属碳酸盐、硼酸盐和硅酸盐以及各种类型的水不溶性晶体或无定形硅铝酸盐，其中沸石是最为公知的代表。

适宜的有机助洗剂的实例包括碱金属；铵和取代的铵；柠檬酸盐；琥珀酸盐；丙二酸盐；脂肪酸磺酸盐；羧基甲氧基琥珀酸盐；聚乙酸铵；羧酸盐；聚羧酸盐；氨基聚羧酸盐；聚乙酰基羧酸盐；和多羟基磺酸盐(polyhydroxsulphonate)。

其他适宜的有机助洗剂包括已知具有助洗剂性能的较高分子量的聚合物和共聚物，例如适当的聚丙烯酸、聚马来酸和聚丙烯酸/聚马来酸共聚物，及它们的盐。

清洁组合物可含有氯/溴类型或氧类型的漂白剂。无机氯/溴类型漂白剂的实例是锂、钠或钙的次氯酸盐和次溴酸盐，以及氯化磷酸三钠。有机氯/溴类型漂白剂的实例是杂环N-溴和N-氯酰亚胺类，如三氯异氰脲酸、三溴异氰脲酸、二溴异氰脲酸、和二氯异氰脲酸，及其与水增溶性阳离子(如钾和钠)形成的盐。乙内酰脲化合物也是适宜的。

清洁组合物可含有氧漂白剂，例如以无机过酸盐的形式，任选与漂白前体一起，或以过氧酸化合物的形式。适宜的过氧漂白化合物的典型实例是碱金属过硼酸盐(四水合物和一水合物)，碱金属过碳酸盐、碱金属过硅酸盐和碱金属过磷酸盐。合适的活性剂材料包含四乙酸乙二胺(TAED)和三乙酸甘油酯。酶促漂白活化体系也可以存在，例如过硼酸盐或过碳酸盐、三乙酸甘油酯和过水解酶(perhydrolase)，例如，如WO 2005/056783中所公开的那样。

可使用常规用于酶的稳定剂来稳定清洁组合物，该稳定剂例如多元醇例如丙二醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(例如芳族硼酸酯)。清洁组合物也可含有其它常规洗涤剂成分，例如反絮凝剂材料、填充剂材料、消泡剂、防腐蚀剂、悬污剂、多价螯合剂、防污垢再沉积剂、脱水剂、染料、杀菌剂、荧光剂、增稠剂和香料。

最后，AmyE或其变体可用于常规餐具洗涤洗涤剂中，例如用于任何如下专利公开中描述的任何洗涤剂中，可以理解本文所述AmyE或其变体可以替代如下专利和公布的专利申请中的任何α-淀粉酶或于这些α-淀粉酶之外额外地使用：CA 2006687、GB 2200132、GB 2234980、GB 2228945、DE 3741617、DE 3727911、DE 4212166、DE 4137470、DE 3833047、DE4205071、WO 93/25651、WO 93/18129、WO 93/04153、WO 92/06157、WO 92/08777、WO 93/21299、WO 93/17089、WO 93/03129、EP 481547、EP 530870、EP 533239、EP 554943、EP 429124、EP 346137、EP 561452、EP 318204、EP 318279、EP 271155、EP 271156、EP 346136、EP 518719、EP 518720、EP 518721、EP 516553、EP 561446、EP 516554、EP 516555、EP 530635、EP 414197、美国专利No.5,112,518、美国专利No.5,141,664和美国专利No.5,240,632。

5.4.洗衣洗涤组合物及用途

根据该实施方案，一种或多种AmyE或其变体可为洗涤剂组合物的组分。如此，其可以以无粉尘颗粒、稳定的液体或受保护的酶的形式包括在洗涤剂组合物中。可以例如，如美国专利号4,106,991和4,661,452所公开的那样来生产无粉尘颗粒，并且可任选地由本领域已知的方法进行包衣。蜡质包衣材料的实例是平均分子量为1,000至20,000的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有16-50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有12-20个碳原子，且其中有15-80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯及甘油三酯。例如英国专利号1483591给出了适于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例。可例如通过加入多元醇诸如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸，按照已建立的方法来稳定液态酶制品。其他酶稳定剂是本领域公知的。可按照例如US 5,879,920(Danisco A/S)或EP 238,216公开的方法来制备受保护的酶。长期以来多元醇被公认为蛋白质的稳定剂，和用于提高蛋白质的溶解性。例如参见，Kaushik等人，J.Biol.Chem.278：26458-65(2003)及其中引用的参考文献；和M.Conti等人，J.Chromatography757：237-245(1997)。

洗涤剂组合物可以是任何便利的形式，例如凝胶、粉末、颗粒、糊剂或液体。液体洗涤剂可以是水性的，通常含有高达约70％的水和0％至约30％的有机溶剂，其也可以是只含有约30％水的压缩凝胶(compact gel)类型的形式。

洗涤剂组合物可以包括一种或多种表面活性剂，其中每种都可以是阴离子型、非离子型、阳离子型或两性离子型。洗涤剂将通常包含0％至约50％的阴离子表面活性剂，例如直链烷基苯磺酸盐(LAS)；α-烯烃磺酸盐；烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)(AS)；醇乙氧基硫酸盐(AEOS或AES)；仲烷基磺酸盐(SAS)；α-磺基脂肪酸甲酯；烷基或烯基琥珀酸；或皂。组合物也可包含0％至约40％的非离子表面活性剂，例如醇乙氧基化物(AEO或AE)、羧化的醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷(alkylpolyglycoside)、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、或多羟基烷基脂肪酸酰胺(如例如在WO 92/06154中所述)。

洗涤剂组合物可另外包括一种或多种其他酶，例如脂肪酶、角质酶、蛋白酶、纤维素酶、过氧化物酶、和/或漆酶的任何组合。

洗涤剂可含有约1％到约65％的洗涤剂助洗剂或络合剂，如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTMPA)、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如来自Hoechst的SKS-6)。洗涤剂也可以是无助洗剂的，即基本上不含洗涤剂助洗剂。可以在与酶的稳定性兼容的任何组合物中使用酶。通常可以用已知的包封形式(例如通过造粒或隔离在水凝胶中)来保护酶免于遭遇通常有害的组分。酶尤其是α-淀粉酶(具有或不具有淀粉结合结构域)不局限于洗衣和餐具洗涤应用，而是可以用于表面清洁剂以及用于由淀粉或生物质(biomass)生产乙醇。

洗涤剂可包括一种或多种聚合物。实例包括羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。

洗涤剂可含有漂白系统，这可包括H₂O₂来源(例如过硼酸盐或过碳酸盐)，其可以与形成过酸的漂白活性剂如TAED或壬酰基氧基苯磺酸盐(NOBS)联用。或者，漂白系统可包括过氧酸(例如酰胺、酰亚胺或砜类过氧酸)。漂白系统也可以是酶促漂白系统，其中过水解酶活化过氧化物，例如WO 2005/056783中所述的那些。

可使用常规稳定剂来稳定洗涤剂组合物中的酶，稳定剂例如多元醇，如丙二醇或甘油；糖或糖醇；乳酸；硼酸或硼酸衍生物如硼酸芳香酯；并且可按例如WO 92/19709和WO 92/19708所述配制组合物。

洗涤剂也可含有其它常规洗涤剂成分，例如织物调理剂，包括粘土、增泡剂、抑泡剂、防腐蚀剂、悬污剂、抗污垢再沉积剂、染料、杀细菌剂、荧光增白剂或香料。pH(在使用浓度下于水性溶液中测量)通常是中性或碱性，例如pH约7.0至约11.0。

α-淀粉酶变体可以按常规用于洗涤剂中的浓度掺入。目前认为在洗涤剂组合物中可以按相当于每升洗液0.00001-1.0mg(按纯酶蛋白质计算)α-淀粉酶变体的量加入α-淀粉酶变体。包括α-淀粉酶变体的洗涤剂组合物可以配制成具体形式，包括：

(1)配制为具有堆密度(bulk density)至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约7％至约12％的直链烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约1％至约4％的醇乙氧基硫酸盐(例如C_12-18醇、1-2环氧乙烷(EO))或烷基硫酸盐(例如C_16-18)；约5％至约9％的醇乙氧基化物(例如C_14-15醇，7EO)；约14％至约20％的碳酸钠(例如Na₂CO₃)；约2至约6％的可溶性硅酸盐；约15％至约22％的沸石(例如NaAlSiO₄)；0％至约6％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；约0％至约15％的柠檬酸钠/柠檬酸(例如C₆H₅Na₃O₇/C₆H₈O₇)；约11％至约18％的过硼酸钠(例如NaBO₃·H₂O)；约2％至约6％的TAED；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0-3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％蛋白质的酶(按纯酶计算)；和0-5％的次要成分(例如抑泡剂、香料、荧光增白剂、光漂白剂)。

(2)配制为具有堆密度至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约6％至约11％的直链烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约1％至约3％的醇乙氧基硫酸盐(例如C_12-18醇，1-2EO)或烷基硫酸盐(例如C_16-18)；约5％至约9％的醇乙氧基化物(例如C_14-15醇，7EO)；约15％至约21％的碳酸钠(例如Na₂CO₃)；约1％至约4％的可溶性硅酸盐；约24％至约34％的沸石(例如NaAlSiO₄)；约4％至约10％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；0％至约15％的柠檬酸钠/柠檬酸(例如C₆H₅Na₃O₇/C₆H₈O₇)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；1-6％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；0-5％的次要成分(例如抑泡剂、香料)。

(3)配制为具有堆密度至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约5％至约9％的直链烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约7％至约14％的醇乙氧基化物(例如C_12-15醇，7EO)；约1至约3％的皂如脂肪酸(例如C_16-22脂肪酸)；约10％至约17％的碳酸钠(如Na₂CO₃)；约3％至约9％的可溶性硅酸盐；约23％至约33％的沸石(如NaAlSiO₄)；0％至约4％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；约8％至约16％的过硼酸钠(例如NaBO₃·H₂O)；约2％至约8％的TAED；0％至约1％的膦酸盐(例如EDTMPA)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0-3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；0-5％的次要成分(例如抑泡剂、香料、荧光增白剂)。

(4)配制为具有堆密度至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约8％至约12％的直链烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约10％至约25％的醇乙氧基化物(例如C_12-15醇，7EO)；约14％至约22％的碳酸钠(如Na₂CO₃)；约1％至约5％的可溶性硅酸盐；约25％至约35％的沸石(例如NaAlSiO₄)；0％至约10％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；1-3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如抑泡剂、香料)。

(5)水性液体洗涤剂组合物，包括约15％至约21％的直链烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约12％至约18％的醇乙氧基化物(例如C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO)；约3％至约13％的皂如脂肪酸(例如油酸)；0％至约13％的烯基琥珀酸(C_12-14)；约8％至约18％的氨基乙醇；约2％至约8％的柠檬酸；0％至约3％的膦酸盐；0％至约3％的聚合物(例如PVP，PEG)；0％至约2％的硼酸盐(例如B₄O₇)；0％至约3％的乙醇；约8％至约14％的丙二醇；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如分散剂、抑泡剂、香料、荧光增白剂)。

(6)水性结构型液体洗涤剂组合物，包括约15％至约21％的直链烷基苯磺酸盐(按酸计算)；3-9％的醇乙氧基化物(例如C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO)；约3％至约10％的皂如脂肪酸(例如油酸)；约14％至约22％的沸石(如NaAlSiO₄)；约9％至约18％的柠檬酸钾；0％至约2％的硼酸盐(例如B₄O₇)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0％至约3％的聚合物(例如PEG，PVP)；0％至约3％的锚定聚合物(例如甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物)；摩尔比率25∶1，MW 3800)；0％至约5％的甘油；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如分散剂、抑泡剂、香料、荧光增白剂)。

(7)配制为具有堆密度至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约5％至约10％的脂肪醇硫酸盐；约3％至约9％的乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺；0-3％的皂如脂肪酸；约5％至约10％的碳酸钠(例如Na₂CO₃)；约1％至约4％的可溶性硅酸盐；约20％至约40％的沸石(例如NaAlSiO₄)；约2％至约8％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；约12％至约18％的过硼酸钠(例如NaBO₃·H₂O)；约2％至约7％的TAED；约1％至约5％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如荧光增白剂、抑泡剂、香料)。

(8)以颗粒剂形式配制的洗涤剂组合物，包括约8％至约14％的直链烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约5％至约11％的乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺；0％至约3％的皂如脂肪酸；约4％至约10％的碳酸钠(例如Na₂CO₃)；约1％至约4％的可溶性硅酸盐；约30％至约50％的沸石(例如NaAlSiO₄)；约3％至约11％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；约5％至约12％的柠檬酸钠(例如C₆H₅Na₃O₇)；约1％至约5％的聚合物(例如PVP，马来酸/丙烯酸共聚物，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如抑泡剂、香料)。

(9)以颗粒剂形式配制的洗涤剂组合物，包括约6％至约12％的直链烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约1％至约4％的非离子型表面活性剂；约2％至约6％的皂如脂肪酸；约14％至约22％的碳酸钠(例如Na₂CO₃)；约18％至约32％的沸石(例如NaAlSiO₄)；约5％至约20％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；约3％至约8％的柠檬酸钠(例如C₆H₅Na₃O₇)；约4％至约9％的过硼酸钠(例如NaBO₃·H₂O)；约1％至约5％的漂白活性剂(例如NOBS或TAED)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；约1％至约5％的聚合物(例如聚羧酸盐或PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如荧光增白剂、香料)。

(10)水性液体洗涤剂组合物，包括约15％至约23％的直链烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约8％至约15％的醇乙氧基硫酸盐(例如C_12-15醇，2-3EO)；约3％至约9％的醇乙氧基化物(例如C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO)；0％至约3％的皂如脂肪酸(例如月桂酸)；约1％至约5％的氨基乙醇；约5％至约10％的柠檬酸钠；约2％至约6％的助水溶物(例如甲苯磺酸钠)；0％至约2％的硼酸盐(例如B₄O₇)；0％至约1％的羧甲基纤维素；约1％至约3％的乙醇；约2％至约5％的丙二醇；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如聚合物、分散剂、香料、荧光增白剂)。

(11)水性液体洗涤剂组合物，包括约20％至约32％的直链烷基苯磺酸盐(按酸计算)；6-12％的醇乙氧基化物(例如C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO)；约2％至约6％的氨基乙醇；约8％至约14％的柠檬酸；约1％至约3％的硼酸盐(例如B₄O₇)；0％至约3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，锚定聚合物，例如甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物)；约3％至约8％的甘油；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如助水溶物、分散剂、香料、荧光增白剂)。

(12)配制为具有堆密度至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约25％至约40％的阴离子表面活性剂(直链烷基苯磺酸盐、烷基硫酸盐、α-烯烃磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基磺酸盐、皂)；约1％至约10％的非离子性表面活性剂(例如醇乙氧基化物)；约8％至约25％的碳酸钠(例如Na₂CO₃)；约5％至约15％的可溶性硅酸盐；0％至约5％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；约15％至约28％的沸石(NaAlSiO₄)；0％至约20％的过硼酸钠(例如NaBO₃·H₂O)；约0％至约5％的漂白活性剂(TAED或NOBS)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；0-3％的次要成分(例如香料、荧光增白剂)。

(13)如上述组合物1)-12)所述的洗涤组合物，其中所有或部分的直链烷基苯磺酸盐被(C₁₂-C₁₈)烷基硫酸盐代替。

(14)配制为具有堆密度至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约9％至约15％的(C₁₂-C₁₈)烷基硫酸盐；约3％至约6％的醇乙氧基化物；约1％至约5％的多羟基烷基脂肪酸酰胺；约10％至约20％的沸石(例如NaAlSiO₄)；约10％至约20％的层状焦硅酸盐(例如来自Hoechst的SK56)；约3％至约12％的碳酸钠(例如Na₂CO₃)；0％至约6％的可溶性硅酸盐；约4％至约8％的柠檬酸钠；约13％至约22％的过碳酸盐；约3％至约8％的TAED；0％至约5％的聚合物(例如聚羧酸盐和PVP)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如荧光增白剂、光漂白剂、香料、抑泡剂)。

(15)配制为具有堆密度至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约4％至约8％的(C₁₂-C₁₈)烷基硫酸盐；约11％至约15％的醇乙氧基化物；约1％至约4％的皂；约35％至约45％的沸石MAP或沸石A；约2％至约8％的碳酸钠(如Na₂CO₃)；0％至约4％的可溶性硅酸盐；约13％至约22％的过碳酸盐；1-8％的TAED；0％至约3％的羧甲基纤维素(CMC)；0％至约3％的聚合物(例如聚羧酸盐和PVP)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-3％的次要成分(例如荧光增白剂、膦酸盐、香料)。

(16)上面1)-15)所述的洗涤剂制剂，其含有被稳定化或包封的过酸作为额外组分或作为已经述及的漂白系统的替代物。

(17)上面1)、3)、7)、9)和12)所述的洗涤剂组合物，其中过硼酸盐被过碳酸盐代替。

(18)上面1)、3)、7)、9)、12)、14)和15)所述的洗涤剂组合物，还含有锰催化剂。

(19)以非水性洗涤剂液体形式配制的洗涤剂组合物，包括液态非离子型表面活性剂，例如直链烷氧基化伯醇、助洗剂体系(例如磷酸盐)、酶和碱。该洗涤剂也可包括阴离子表面活性剂和/或漂白系统。

在另一个实施方案中，可将2，6-β-D-果聚糖水解酶掺入洗涤组合物中并用于家居和/或工业纺织品/衣物上存在的生物膜的去除/清洁。

例如，可以将洗涤剂组合物配制成手洗或机洗的洗衣洗涤剂组合物，包括适于预处理污染的织物的洗衣添加剂组合物和漂洗添加的织物软化剂组合物，或者配制成用于一般的家居硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或者配制以用于手洗或机洗的餐具洗涤操作。

在一个具体的方面，洗涤剂组合物可以包括2，6-β-D-果聚糖水解酶，一种或多种α-淀粉酶变体，和一种或多种其它清洁酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、漆酶和/或过氧化物酶和/或其组合。通常，所选酶的特性应与选择的洗涤剂兼容(例如最适pH、与其他酶和非酶成分的兼容性等)，且所述酶应以有效量存在。

蛋白酶：适宜的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。经化学修饰或蛋白质工程的突变体也是适宜的。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶、例如碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)，尤其是源自芽孢杆菌属物种的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309(例如参见美国专利号6,287,841)、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(例如参见，WO 89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如源于猪或牛)和镰孢霉属蛋白酶(例如参见，WO 89/06270和WO 94/25583)。有用的蛋白酶的实例也包括但不限于WO 92/19729和WO 98/20115中所述的变体。合适的市售可得的蛋白酶包括

Primase^TM、Duralase^TM、

和Kannase^TM(Novo Nordisk A/S)；

Maxacal^TM、Maxapem^TM、Properase^TM、PurafectOxP^TM、FN2^TM和FN3TM(Danisco A/S)。

脂肪酶：适宜的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰或蛋白质工程的突变体。有用的脂肪酶的实例包括但不限于来自腐质霉属(与嗜热丝孢菌属同义)的脂肪酶，例如来自疏毛腐质霉(H.lanuginosa)(疏棉状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus))(例如参见，EP 258068和EP 305216)、来自特异腐质霉(H.insolens)(例如参见，WO96/13580)；假单胞菌属脂肪酶(例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)；例如参见EP 218272)，洋葱假单胞菌(P.cepacia)(参见例如EP 331376)、斯氏假单胞菌(P.stutzeri)(参见例如GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属物种菌株SD 705(例如参见，WO95/06720和WO 96/27002)、P.wisconsinensis(例如参见，WO 96/12012)的脂肪酶；芽孢杆菌属脂肪酶(例如来自枯草芽孢杆菌；例如参见，Dartois等人Biochemica Biophysica Acta，1131：253-360(1993))、嗜热脂肪芽孢杆菌(例如参见，JP 64/744992)或短小芽袍杆菌(B.pumilus)(例如参见，WO91/16422)的脂肪酶。其他可以考虑在制剂中使用的脂肪酶变体包括例如在：WO 92/05249、WO 94/01541、WO 95/35381、WO 96/00292、WO95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079、WO 97/07202、EP 407225和EP 260105中描述的那些。一些市售可得的脂肪酶包括

和

Ultra(Novo Nordisk A/S)。

聚酯酶：适宜的聚酯酶包括但不限于WO 01/34899(Danisco A/S)和WO 01/14629(Danisco A/S)中描述的那些，并且可以与本文描述的其他酶包括于任何组合中。

淀粉酶：组合物可与其他α-淀粉酶组合，例如非变体α-淀粉酶。这些酶可包含市售可得的淀粉酶，例如但不限于

Termamyl^TM、

和BAN^TM(Novo Nordisk A/S)、

和

(Danisco A/S)。

纤维素酶：可以向组合物中加入纤维素酶。适宜的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰的或蛋白质工程的突变体。适宜的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢霉属、梭孢壳属(Thielavia)、枝顶孢属(Acremonium)的纤维素酶，例如如美国专利号4,435,307；5,648,263；5,691,178；5,776,757和WO 89/09259中公开的由特异腐质霉(Humicola insolens)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)和尖孢镰孢产生的真菌纤维素酶。可以考虑使用的示例性纤维素酶为对于纺织品具有颜色护理益处的那些。此类纤维素酶的实例是描述于例如EP0495257、EP 531372、WO 99/25846(Danisco A/S)、WO 96/34108(DaniscoA/S)、WO 96/11262、WO 96/29397和WO 98/08940中的纤维素酶。其他实例是纤维素酶变体，例如描述于WO 94/07998、WO 98/12307、WO95/24471、PCT/DK98/00299、EP 531315、美国专利号5,457,046、5,686,593和5,763,254中的那些纤维素酶变体。市售可得的纤维素酶包括

和

(Novo Nordisk A/S)；Clazinase^TM和

HA(Danisco A/S)；和KAC-500(B)^TM(Kao Corporation)。

过氧化物酶/氧化酶：考虑用于组合物中的适合的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的过氧化物酶/氧化酶。其包括化学修饰或蛋白质工程的突变体。有用的过氧化物酶的实例包含描述于WO 93/24618、WO95/10602和WO 98/15257中的来自鬼伞属(Coprinus)(例如灰盖鬼伞(C.cinereus))的过氧化物酶及其变体。市售可得的过氧化物酶类例如包括Guardzyme^TM(Novo Nordisk A/S)。

可通过添加含有一种或多种酶的分开的添加剂，或通过添加包括所有这些酶的组合的添加剂而在洗涤剂组合物中包括洗涤剂酶。可以将洗涤剂添加剂，即分开的添加剂或组合的添加剂配制成例如颗粒、液体、浆液等。适宜的颗粒洗涤剂添加剂制剂包括无粉尘颗粒。

可例如按照美国专利号4,106,991和4,661,452所公开来生产无粉尘颗粒，并且可任选地用本领域已知的方法进行包衣。蜡质包衣材料的实例是平均分子量为1,000至20,000的聚环氧乙烷(聚乙二醇，PEG)；具有16-50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有12-20个碳原子且其中有15-80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯及甘油三酯。例如GB 1483591给出了适于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例。可例如通过加入多元醇诸如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸，按照已建立的方法来稳定液态酶制品。可按照如EP 238,216公开的方法来制备受保护的酶。

洗涤剂组合物可以是任何便利的形式，例如棒、片、凝胶、粉末、颗粒、糊剂或液体。液体洗涤剂可以是水性的，通常含有高达约70％的水，和0％至约30％的有机溶剂。也可以考虑含有约30％或更少水的压缩(compact)洗涤剂凝胶。洗涤剂组合物可以包括一种或多种表面活性剂，该表面活性剂可以是非离子型，包括半极性、阴离子型、阳离子型或两性离子型，或其任何组合。表面活性剂一般按以重量计约0.1％-60％的水平存在。

当包括在洗涤剂中时，洗涤剂通常将含有约1％至约40％的阴离子表面活性剂，例如直链烷基苯磺酸盐、α-烯烃磺酸盐、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)、醇乙氧基硫酸盐、仲烷基磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、或皂。

当包括在洗涤剂中时，洗涤剂通常将含有约0.2％至约40％的非离子表面活性剂，如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡糖胺的N-酰基-N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。

洗涤剂可含有0％至约65％的洗涤剂助洗剂或络合剂(complexingagent)，例如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如来自Hoechst的SKS-6)。

洗涤剂可包括一种或多种聚合物。实例有羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚乙烯基咪唑、聚羧酸酯(如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物)和甲基丙烯酸月桂醋/丙烯酸共聚物。

洗涤剂可含有漂白系统，这可包括H₂O₂来源(例如过硼酸盐或过碳酸盐)，其可以与形成过酸的漂白活性剂(如四乙酰基乙二胺或壬酰基氧基苯磺酸盐)联用。或者，漂白系统可包括过氧酸(例如酰胺、酰亚胺或砜类过氧酸)。漂白系统也可以是酶促漂白系统。

可使用常规的稳定剂来稳定洗涤剂组合物中的酶，所述稳定剂例如：多元醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(例如硼酸芳香酯)、或苯基硼酸衍生物(例如4-甲酰基苯基硼酸)。可按WO 92/19709和WO 92/19708所述配制所述组合物。

洗涤剂也可含有其他常规洗涤剂成分，例如织物调理剂，包括粘土、增泡剂、抑泡剂、防腐蚀剂、悬污剂、抗污垢再沉积剂、染料、杀细菌剂、荧光增白剂、助水溶物、防晦暗剂(tarnish inhibitor)或香料。

认为在洗涤剂组合物中，酶变体可以按相当于每升洗液约0.01至约100mg酶蛋白质(特别是每升洗液约0.05至约5.0mg酶蛋白质，尤其是每升洗液约0.1至约1.0mg酶蛋白质)的量加入。

可用于测试包含AmyE或其变体的清洁组合物的效力的代表性试验包括样片(swatch)试验。“样片”是其上施有污渍的一块材料，诸如织物。该材料可以是例如由棉、聚酯或天然和合成纤维的混合物制成的织物。可选地，该材料还可以是纸，例如滤纸或硝化纤维素，或者是一块硬材料，例如陶瓷、金属或玻璃。对于α-淀粉酶，污渍是基于淀粉的，但是也可以包括血液、乳、墨水、草、茶、酒、菠菜、肉汁、巧克力、蛋、奶酪、粘土、色素、油或这些化合物的混合物。在一个实施方案中，在BMI(血液/乳/墨水)试验中测试AmyE或其变体。

“小样片”是自样片上用单孔穿孔装置切下的部分，或者用定制的96孔穿孔装置(该多孔穿孔模式与标准96孔微滴定板匹配)切下的部分，或者是以其它方式自样片上取下的部分。样片可以是纺织品、纸、金属或其他适宜的材料。小样片可以在放入24孔、48孔或96孔微滴定板孔之前或之后被污渍固着。“小样片”也可以通过向小块材料施加污渍而制成。例如，小样片可以是直径为5/8″或0.25″的具有污渍的织物片。定制的穿孔机经设计可以同时将96个样片递送至96孔板的所有孔中。该装置可以通过简单地向同一96孔板多次上样，而向每孔递送一个以上的样片。可以想到将多孔穿孔装置用于向任何格式的板(包括但不限于24孔、48孔和96孔板)同时递送多个样片。在另一个可想到的方法中，污染的测试平台可以是由金属、塑料、玻璃、陶瓷，或其他适宜材料制成的、被污物载污体包覆的珠。然后将一个或多个污物包覆的珠放入含有适宜缓冲液和酶的96孔、48孔或24孔板或更大版式的板的孔中。这种情况下，可以通过直接吸光度测量或在二级生色反应后在上清液中检测释放的污物。也可以通过质谱分析来进行释放的污物的分析。

在一个实施方案中，处理方案提供对污渍固着(fixation)程度的控制。结果是，可以产生例如当在不存在被检测的酶的情况下进行洗涤时能释放出不等量的污渍的样片。固着的样片的使用导致在洗涤试验中信噪比的显著提高。此外，通过改变固着程度，可以产生在不同清洁条件下给出最佳结果的污渍。

在多种材料类型上具有已知“强度”的污渍的样片是市售可得的(EMPA，St.Gallen，Switzerland；wfk-Testgewebe GmbH，KrefeldGermany；或Center for Test Materials，Vlaardingen，The Netherlands)和/或可以由从业者制得(Morris和Prato，Textile Research Journal52(4)：280-286(1982))。样片可包含例如含棉织物，其含有由血液/乳/墨水(BMI)、菠菜、草或巧克力/乳/烟灰形成的污渍。例如可以用0.0003％至0.3％的过氧化氢将BMI污渍固着在棉上。其他组合包括用0.001％-1％戊二醛固着的草或菠菜、用0.001％-1％戊二醛固着的明胶和考马斯染料、或用0.001％-1％戊二醛固着的巧克力、乳和烟灰。

也可以在用酶和/或洗涤剂制剂温育期间搅拌样片。洗涤性能数据取决于样片在孔中(尤其是在96孔板中)的取向(水平对垂直)。这表明在温育期间混合是不充分的。尽管存在许多方式来保证温育期间充分的搅拌，但可以构建将微滴定板夹在两个铝板之间的板夹。这可以简单地例如在孔上方放置粘性板密封物，然后用任何类型的适合的、市售可得的夹子将两个铝板与96孔板夹紧而实现。然后可以将它放到商品化的培养箱摇床中。将摇床设定为约400rpm可以导致非常有效的混合，而板夹有效地阻止了泄漏或交叉污染。

可以使用三硝基苯磺酸(TNBS)来量化洗液中的氨基基团浓度。这可以用作已从样片中去除的蛋白质量的量度(例如参见Cayot和Tainturier，Anal.Biochem.249：184-200(1997))。然而，如果洗涤剂或酶样品导致异乎寻常小的肽片段的形成(例如，因样品中存在肽酶所致)，那么人们将获得较大的TNBS信号，即更多“噪音”。

另一用于测量对血液/乳/墨水的洗涤性能的手段是基于墨水的释放，这可以通过测量洗液的吸光度而量化。可以在350和800nm之间的任何波长测量吸光度。在一个实施方案中，可以在410nm或620nm处测量波长。也可以检查洗液以确定对于含有草、菠菜、明胶或考马斯染料的污渍的洗涤性能。对于这些污渍，适宜的波长包括对于菠菜或草的670nm和对于明胶或考马斯染料的620nm。例如，移出等份试样的洗液(例如，通常来自96孔微板的100-150μL)并放到比色杯或微孔微板中。然后将它放到分光光度计中并在适当的波长读取吸光度。也可以使用该体系，例如通过使用在诸如布、塑料或陶瓷的适宜载污体上的血液/乳/墨水污渍，来测定用于餐具洗涤的适宜的酶和/或洗涤剂组合物。

一方面，可以通过在25℃将0.3％过氧化氢施加到BMI/棉样片上30分钟或通过在60℃将0.03％过氧化氢施加到BMI/棉样片上30分钟，在棉上固着BMI污渍。从BMI/棉样片上切下约0.25″的小样片并放入96孔微滴定板的孔中。向各孔中放入已知的洗涤剂组合物和酶如变体蛋白质的混合物。向微滴定板顶部放置粘性板密封物后，将微滴定板与铝板夹在一起，并在定轨摇床上以约250rpm搅拌约10-60分钟。这个时间结束后，将上清液转移到新的微滴定板的孔中并测量620nm的墨水吸光度。这可以类似地用通过在25℃向菠菜/棉样片或草/棉样片施加0.01％戊二醛30分钟而固着在棉上的菠菜污渍或草污渍来进行检测。这也可以用巧克力、乳和/或烟灰污渍完成。

5.5.纺织品退浆组合物及用途

还考虑使用一种或多种AmyE或其变体处理织物(例如，使纺织品退浆)的组合物和方法。AmyE或其变体可以用于本领域众所周知的任何织物处理方法(例如参见，美国专利号6,077,316)中。例如，一方面，可以通过包括将织物与酶变体溶液接触的方法，改善该织物的触感和外观。一方面，织物可以用该溶液在压力下进行处理。

一方面，可以在纺织品纺织期间或之后、或在退浆阶段或者一个或多个其他织物加工步骤的过程中施加酶。在纺织品纺织期间，纺线暴露于相当大的机械张力。在机械织机上纺织之前，径纱通常涂上淀粉或淀粉衍生物浆料，以增加其抗张强度并防止断裂。可以施加AmyE或其变体以除去这些淀粉或淀粉衍生物浆料。在纺织品织成之后，织物可以进入退浆阶段。这之后可接着一个或多个其他织物加工步骤。退浆是从纺织品中除去浆料的行为。纺织后必须除去浆料涂层，之后再进一步加工织物，以便确保均一和耐洗效果。本文还提供了包括通过酶变体的作用来酶促水解上浆料的退浆方法。

AmyE或其变体可以单独或与其他退浆化学试剂和/或退浆酶一起用作洗涤剂添加剂(例如在水性组合物中)使织物(包括含棉织物)退浆。AmyE或其变体也可用于在靛蓝染色的粗料棉布织物和衣服上产生石洗外观的组合物和方法中。为生产衣服，织物可以剪裁并缝纫成纺织品或衣物，之后进行整理(finish)。特别是，为生产粗料棉布牛仔服(denim jeans)，已研发了不同的酶促整理方法。粗料棉布衣服的整理通常始于酶促退浆步骤，在此期间淀粉分解酶作用于衣服，以使织物柔软，并使该棉布更易于接受随后的酶促整理步骤。α-淀粉酶变体可用于整理粗料棉布衣服(例如“生物打磨法”(bio-stoning))、酶促退浆及赋予织物柔软度，和/或整理工艺的方法中。

对于本领域技术人员显而易见的是，可以对组合物及其使用方法进行多种修改和变更而不偏离目的用途的精神或范围。因此，所述改变和变动及其等同体落在所附权利要求书范围内。

实施例

实施例1

1.1.质粒构建

将编码SEQ ID NO：1的AmyE或C末端截短的AmyE变体AmyE-tr(SEQ ID NO：2)的核酸克隆到美国专利号5,024,943中描述的枯草芽孢杆菌pHPLT表达载体内。图5描述了包括编码AmyE-tr的核酸的载体。

参考图5，pHPLT载体包含地衣芽孢杆菌LAT启动子(“Plat”)、编码LAT信号肽的序列(“preLAT”)、随后为用于克隆的PstI和HpaI限制位点。其它质粒元件来自在McKenzie等人，Plasmid 15(2)：93-103(1986)中公开的质粒pUB110：“ori-pUB”是来自pUB110的复制起点；“reppUB”是来自pUB110的复制酶基因，“neo”是来自pUB110的新霉素/卡那霉素抗性基因；“bleo”是博来霉素抗性标记，“Tlat”是来自地衣芽孢杆菌淀粉酶的转录终止子。

使用由Yang等人，“Nucleotide sequence of the amylase gene fromBacillus subtilis，”Nucl.Acids Res.11(2)：237-49(1983)描述的AmyE编码序列，装配用于表达AmyE和AmyE-tr的质粒构建体。质粒pME629.5包含编码SEQ ID NO：1的全长AmyE的核酸。与由Yang等人描述的序列比较，该基因具有在编码淀粉结合结构域的序列中的3碱基缺失。

图5中显示的质粒pME630.7包含截短的AmyE序列(即AmyE-tr)。AmyE-tr在SEQ ID NO：1的位置D425截短。AmyE-tr基于缺乏淀粉结合结构域的AmyE变体的晶体结构设计，如Fujimoto等人，“Crystalstructure of a catalytic-site mutant alpha-amylase from Bacillus subtiliscomplexed with maltopentaose，”J.Mol.Biol.277：393-407(1998)中所述。还参见，RCSB Protein Data

登记号1BAG，“Alpha-AmylaseFrom Bacillus Subtilis Complexed With Maltopentaose”。

对于表达质粒构建体，使用

(Stratagene，California)PCR扩增编码AmyE的核酸。PCR产物使用Qiagen QIAQUIK^TM PCR纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，California)中提供的柱纯化，并且重悬浮于50μL MILLI-Q^TM纯化水中。用HpaI(Roche)和PstI(Roche)顺次消化50μL纯化DNA，并且使所得到的DNA片段重悬浮于30μLMILLI-Q^TM纯化水中。使用PstI和HpaI克隆位点，将10-20ng/μL DNA克隆到质粒pHPLT内。将连接混合物直接转化到感受态枯草芽孢杆菌细胞(基因型：ΔaprE，ΔnprE，degUHy32oppA，ΔspoIIE3501，amyE::xylRPxylAcomK-phleo)内。SC6.1枯草芽孢杆菌细胞具有置于木糖诱导型启动子控制下的感受态基因(comK)。通过添加木糖诱导关于DNA结合和摄取的感受态。因为亲本质粒中的amyE基因具有2个PstI位点，执行PCR融合反应以在克隆前去除这些位点。在2个分开PCR反应后执行PCR融合。为了使用HpaI和PstI位点制备pHPLT构建体，使用了下述引物：

SEQ ID NO：18：引物PSTAMYE-F5’

CTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCTTCAGCACTTACAGCACCGTCGATCAAAAGCGGAAC3’

SEQ ID NO：19：引物AMYENOPST-R5’

CTGGAGGCACTATCCTGAAGGATTTCTCCGTATTGAACTCTGCTGATGTATTTGTG3’

SEQ ID NO：20：引物AMYENOPST-F5’

CACAAATACATCAGCAGAGTTCCAATACGGAGAAATCCTTCAGGATAGTGCCTCCAG3’

SEQ ID NO：21：引物HPAIAMYE-R5’

CAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTCAATGGGGAAGAGAACCGCTTAAGCCCGAGTC3’

SEQ ID NO：22：引物HPAIAMYE466-R5’

CAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTCAATCAGGATAAAGCACAGCTACAGACCTGG 3’

SEQ ID NO：23：引物AMYESEQ-F15’TACACAAGTACAGTCCTATCTG 3’

SEQ ID NO：24：引物AMYESEQ-F25’CATCCTCTGTCTCTATCAATAC 3’

质粒pME629.5和pME630.7表达具有31残基信号序列的AmyE，所述信号序列在翻译后被切割。随后按上文Yang等人(1983)所述，分开地对随后的10个N端氨基酸进行加工。

1.2.蛋白质表达

在具有10μg/mL新霉素、1％不溶性淀粉的LA上选择全长和截短克隆的转化体，并且在37℃温育过夜。选择在菌落周围显示透明(或晕圈)的转化体，制备小瓶用于进一步研究。在具有10μg/mL新霉素的LB中生长转化体的预培养物8小时。将30μL预培养物加入装有30mL培养基(下文描述)的250mL烧瓶内，所述培养基补充有10μg/mL新霉素和5mMCaCl₂。该培养基是基于MOPs缓冲液的富集半成分确定培养基，具有尿素作为主要氮源，葡萄糖作为主要碳源，并且补充有1％大豆胨用于茁壮的细胞生长。摇瓶在37℃和250rpm混合下温育60-65小时。通过在5,000rpm离心20分钟，在锥形管中收获培养物。因为AmyE全长和AmyE截短蛋白质两者都以高水平表达，所以培养上清液用于后续测定试验而无进一步纯化。

实施例2

下述测定法用于下文描述的实施例中。与下文提供的方案的偏离在单独的实施例中指出。在这些实验中，分光光度计被用于测量反应完成后形成的产物的吸光度。

2.1.用于96孔微滴定板中进行蛋白质含量测定的Bradford测定法

使用Bradford QUICKSTART^TM Dye Reagent(Bio-Rad，California)测定样品上清液中的蛋白质浓度。通过过滤来自培养物的肉汤获得样品，所述培养物在280rpm振荡和增湿通气下在37℃在微量滴定板(MTPs)中生长了3天。使10μL培养物滤液样品与200μL BradfordQUICKSTART^TM Dye Reagent在第二块MTP的孔中组合。在充分混合后，MTP在室温下温育至少10分钟。去除气泡并且在595nm测量OD(光密度)。为了测定蛋白质浓度，从样品读数中扣除本底读数(来自未接种的孔)。

2.2.AmyE活性的测定

AmyE显示转葡糖苷酶活性，即AmyE催化由麦芽糖形成三糖。图6显示了在用麦芽糖温育AmyE后三糖的HPLC检测。图7显示了随时间变的化，AmyE介导的麦芽三糖合成的反应物组成。根据AmyE的转葡糖苷酶活性测量其酶活性。1个AmyE单位被定义为在检测条件下每分钟由麦芽糖生产1微摩尔三糖所需的酶量。在典型测定中，将0.1ml等份样品的AmyE加到5ml溶于磷酸盐缓冲液(pH 4.5)中的30％麦芽糖中，在60℃下温育60分钟。通过将样品放入沸水浴中10分钟而终止反应。通过HPLC测定样品中存在的三糖量。

2.3.葡糖淀粉酶活性的测定

使用基于葡糖淀粉酶催化对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)水解为葡萄糖和对硝基苯酚的能力的测定法，测量葡糖淀粉酶活性。在碱性pH下，所释放的硝基苯酚显示黄色，这种黄色与葡糖淀粉酶活性成比例，并可以在400nm监控。1个葡糖淀粉酶活性单位(GAU)被定义为在pH 4.2和60℃每小时由可溶性淀粉底物(4％)生产1μmol还原糖(按葡萄糖计算)的酶量。

2.4.支链淀粉酶活性的测定

通过利用可溶性红色普鲁兰(red-pullan)底物的比色法测定支链淀粉酶活性。支链淀粉酶能够催化红色普鲁兰底物的水解，这导致从染色的底物中释放可溶性片段。通过用95％乙醇溶液沉淀底物而终止酶反应。在501nm用分光光度计测量上清液。颜色强度与酶活性成比例。1个酸稳定性支链淀粉酶单位(ASPU)被定义为在pH 4.5和60℃每分钟由支链淀粉释放1当量还原力(以葡萄糖的形式)的酶量。

2.5.常规乙醇发酵

将两批含有400ppm尿素的得自Illinois River Energy的液化液(liquefact)(31％DS)调节至pH 4.3和pH 5.8(使用5N H₂SO₄)。将100g底物加到125ml锥形瓶中。以0.20mg/g DS给予AmyE-tr和

XTRA淀粉酶。用在去离子水中预水化约45min的0.2ml 10％(w/v)RedStar Ethanol Red酵母接种发酵。在32℃和以搅棒320rpm搅拌下温育烧瓶，进行48小时发酵。

2.6.全玉米面粉的乙醇发酵

制备两批在pH 4.3和pH 5.8(用5N H₂SO₄调节)的含有400ppm尿素的32％DS玉米粉底物。将100g底物加到125ml锥形瓶中。以0.20mg/g DS给予全长AmyE(SEQ ID NO：1)和AmyE-tr(SEQ ID NO：2)。以1.5SSU/gDS给予河内曲霉α-淀粉酶(AkAA；SEQ ID NO：6)。AkAA的氨基酸序列在美国专利号7,332,319的SEQ ID NO：4中公开。还将AmyE和AmyE-tr水解全玉米粉的能力与以0.5GAU/g给予的里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA；SEQ ID NO：7)+以1.5SSU/g DS给予的河内曲霉α-淀粉酶的混合物比较。TrGA的氨基酸序列在WO 06/060062的SEQ ID NO：3中公开。用在去离子水中预水化约45min的0.2ml 10％(w/v)Red Star Ethanol Red酵母接种发酵。在32℃和以320rpm搅拌下温育烧瓶，从而进行72小时发酵。

2.7.通过HPLC测量进行葡萄糖形成测定

麦芽糖和麦芽七糖的水解

对于每个实验如所述的，在50mM醋酸钠(pH 4.5或5.6)或50mM苹果酸(pH 5.6)中制备0.5％麦芽糖或麦芽七糖溶液。最初将所有酶样品稀释至1mg/mL。通过使用适宜的底物溶液稀释酶而得到1ppm的终酶浓度，制备了反应混合物，然后将200μL等份试样转移至无菌螺旋盖管，将其放入37℃温箱中。在所示时间处，通过稀释10倍至10mM氢氧化钠中，终止反应。

不溶性淀粉的水解

为了测量不溶性颗粒淀粉的水解，用苹果酸缓冲液(pH 5.6)将纯化的AmyE(24.5g/L)稀释至20.4ppm的终浓度。然后将蛋白质加到5％在苹果酸缓冲液(pH 5.6)中制备的玉米粉溶液中，得到1ppm的终浓度，然后于32℃将混合物在摇床中温育。定时取样，将样品稀释10倍至50mM NaOH中，以淬灭反应。

HPLC检测方法

糖化产品的组成通过HPLC系统(Beckman System Gold 32KaratFullerton，CA)测量。保持在50℃的该系统配置有Rezex 8u8％H单糖柱和折光指数(RI)检测器(ERC-7515A，Anspec Company，Inc.)。以0.6ml/min流速施用稀硫酸(0.01N)作为流动相。将20μl 4.0％反应混合物溶液注射到柱子中。经45分钟得到洗脱曲线。由以前运行的标准，确定了糖的分布和各种糖的量。

2.8.沉降试验

将糖化后的糖浆的样品在60℃水浴中温育10-30分钟，以使它们达到恒温。然而，温育不应超过1小时。如有需要，在试验之前将DS值调节至35％±0.5％。在磁力搅拌器上将样品充分混合，并用注射器转移至离心管中。将样品以2,500rpm(1,350×g)离心10分钟。如有沉淀物，则可见于离心管的底部。

2.9.由糖化淀粉制备滤液

将柱套管维持在60℃。插入两个滤纸圆片，并在装置中旋至紧贴O-环形垫片。将配衡的250ml真空烧瓶放入位后，塞住出口，将100ml水加到柱子中。开启真空泵直到达到23-24英寸的稳定真空。打开管出口，并启动计时器。100ml水应在1分钟10秒至1分钟30秒内滤过。如果时间太长或太短，那么检查滤纸以确保它们是紧的。滤纸抽干后，夹紧出口管。留泵运行，同时以夹子关闭出口管。烧瓶用配衡的250ml抽滤瓶代替。将约2.0g助滤剂与100g测试液体在250ml烧杯中混合。当样品在磁性板上搅拌时，使用注射器取出目标量的样品。上皿式天平可用于此步骤。将颗粒保持在悬液中时，借助于漏斗将全部的量快速转移到柱子上。打开出口管夹，并启动计时器。收集滤液直至液体达到滤床的顶端，记录时间。所收集的滤液适合于进一步测试，如碘试验。

2.10.碘试验

对于糖液碘试验，用10ml去离子水稀释0.2ml糖液。将所稀释的糖液煮沸10分钟，然后在冰浴中冷却。将0.5ml碘溶液(0.02M)加到冷却的糖液样品中。

对于滤液试验，将在实施例2.9中所得的0.5ml滤液用10ml去离子水稀释。将所稀释的滤液煮沸10分钟，然后在冰浴中冷却。将0.5ml碘溶液(0.02M)加到冷却的滤液样品中。

实施例3

使用实施例2.7中所述的葡萄糖形成测定法，对在pH 4.5和5.6(使用醋酸钠缓冲液)时AmyE转化麦芽糖为葡萄糖的能力进行测试。在2天、5天和8天后分析反应。如图8中显示，AmyE(SEQ ID NO：1)、AmyE-tr(SEQID NO：2)和Amy 31A(SEQ ID NO：3)有效地转化麦芽糖为葡萄糖，而嗜热脂肪地芽孢杆菌α-淀粉酶、AmyS(SEQ ID NO：4，显示具有34-氨基酸前导序列)显示在这些条件下仅形成少量葡萄糖。

实施例4

对AmyE(SEQ ID NO：1)和AmyE-tr(SEQ ID NO：2)催化DP7或不溶性的未蒸煮的颗粒淀粉水解的能力进行测试。用于检测由不溶性淀粉生产的糖的HPLC方法在实施例2.7中描述。启动反应后在不同时间点的降解产物通过HPLC分析来定量。

图9显示了在1ppm AmyE-tr的存在下温育0.5％麦芽七糖底物72小时后得到的水解产物。如图9的下图可见，到72小时，AmyE-tr将几乎所有的DP7底物转化为葡萄糖。结果表明，AmyE能够有效地降解DP7底物为葡萄糖。

作为比较，1ppm AmyS(SEQ ID NO：4)或

FRED(“Fred”；SEQ ID NO：8)对DP7底物的降解分别描述于图10和图11中。使用上面实施例2.4中提出的HPLC方法对来自反应的样品进行分析。图10中从上到下表示加入AmyS后0小时、2小时、4小时和24小时时的反应产物。图11中从上到下表示加入

FRED后0小时、1小时、2小时和3小时时的反应产物。结果显示，在AmyS或

FRED的存在下在所示的时间点相当大部分的DP7底物保持DP2或更高的聚合度。

图12显示了根据实施例2.4中提出的方法，在32℃用1ppmAmyE(SEQ ID NO：1)温育5％玉米粉溶液的结果。结果显示，AmyE自己可有效地转化不溶性颗粒淀粉为葡萄糖。

实施例5

使用实施例2.5中所述的常规乙醇发酵测定法，测试常规乙醇发酵中截短的AmyE对Illinois River Energy液化液(31％DS)的性能。在pH 4.3和pH 5.8，将AmyE-tr(SEQ ID NO：2)的性能与

XTRA淀粉酶(Danisco US Inc.，Genencor Division；AmyR；SEQ ID NO：5)比较。将发酵进行48小时。以0.2mg/g DS给予AmyE-tr和XTRA淀粉酶。如图13显示，在pH 5.8时由AmyE-tr产生的最终乙醇产量为12.0％(v/v)。在pH 4.3时由AmyE-tr产生的最终乙醇产量为7.3％(v/v)。

XTRA淀粉酶存在下的最终乙醇产量在pH 4.3时为2.7％(v/v)，在pH 5.8时为3.9％(v/v)。因此，在液化液的常规乙醇发酵中AmyE-tr所产生的乙醇比

XTRA淀粉酶显著更多。此实施例也表明，在pH 5.8时AmyE-tr产生的乙醇比在pH 4.3时多。

实施例6

使用实施例2.7中所述的全玉米粉的乙醇发酵试验，比较了在pH 4.3和pH 5.8AmyE(SEQ ID NO：1)和AmyE-tr(SEQ ID NO：2)催化不溶性颗粒(未蒸煮的)淀粉水解为乙醇的能力。将AmyE和AmyE-tr的乙醇形成性能与以1.5SSU/g给予的河内曲霉α-淀粉酶(AkAA，SEQ ID NO：6)、以0.5GAU/g给予的里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA；SEQ ID NO：7)+以1.5SSU/gDS给予的河内曲霉α-淀粉酶的混合物比较。全长AmyE和截短的AmyE均以0.2mg/g DS给予。

图14显示在pH 4.3和pH 5.8时由酶产生的最终乙醇产量。当在pH5.8进行测试时，AmyE(-●-)和AmyE-tr(-■-)两者的表现与TrGA/AkAA(-▲-)相当，AmyE实际上超过观察到的TrGA/AkAA的乙醇产量。在pH 4.3时AmyE(-○-)和AmyE-tr(-□-)产生了乙醇，但是产量没有用TrGA/AkAA(-△-)获得的产量高。比较起来，在测试的两个pH，AkAA性能差(-◆◇-)。此实施例表明，在糖化反应中，在约pH 5.8，AmyE可完全替代葡糖淀粉酶。也表明，在糖化反应中，在约pH 4.3，AmyE可部分或完全地替代葡糖淀粉酶。

实施例7

通过施加不同的AmyE和TrGA的组合到经液化的淀粉底物中，测试糖化中AmyE作为补充酶的能力。在连续搅拌下将含有32％ds精制淀粉(Cargill，Minneapolis，MN)、10ppm Ca²⁺和100ppm二氧化硫(SO₂)的的水性浆液混合过夜。用碳酸钠(20％w/v)将浆液的pH调节至约5.8。浆液的波美度为约22.3。之后以0.56kg/MT ds玉米加入热稳定性α-淀粉酶

FRED(Danisco US，Inc.，Genencor Division)。将浆液以0.5gpm传送通过配置有M101水热器(Hydroheater)的Pilot Plant Jet(6分钟的停留时间)，并且对于该首次蒸煮，在约107-109℃的平均温度进行蒸煮。在出口处收集样品，并放置于95℃水浴中。无任何附加酶，在95℃进一步进行二次液化。二次液化持续至淀粉底物的最终DE达到10DE。然后通过在95℃将淀粉浆液的pH降至4.5而终止液化。所加工的浆液(也称为淀粉液化液或经液化的淀粉底物)用于下面的糖化实验。

在商品化酵母发酵条件(即pH 5.3和32℃)下用不同水平的TrGA和AmyE以32％固体进行糖化。通过HPLC或碘染色法，由在不同时间间隔所采集的样品测定了糖的组成(可发酵糖和高级糖)。结果汇于表1中。

表1.AmyE对可发酵糖的生产的影响

基于表1中所示的数据，糖化中TrGA和AmyE的组合比单独TrGA更有效率。TrGA和AmyE的组合导致(1)较高水平的可发酵糖(DP1、DP2和DP3总和)，和(2)高级糖(＞DP4+)的水解速率升高。因此，与仅使用葡糖淀粉酶的常规工艺相比，补充AmyE到TrGA中能够生产更多的可发酵糖。

实施例8

在如实施例7所述的糖化中表征其它芽孢杆菌属α-淀粉酶，例如

FRED和GC358(均得自Danisco US Inc.，GenencorDivision)。在pH 5.2和32℃、存在TrGA下进行经液化的淀粉底物的糖化。由在6、18、24和54小时所采集的样品测定糖(可发酵糖和高级糖两者)的组成。结果示于表2中，表明与补充等价量的其它芽孢杆菌属α-淀粉酶相比，补充AmyE到葡糖淀粉酶中能够生产更多的可发酵糖。此观察结果与实施例5-6中关于AmyE转化麦芽糖为葡萄糖和水解DP7的优异能力进行的描述是一致的。因此，AmyE的这些有利性质并不是普遍地被其它芽孢杆菌属α-淀粉酶所共有的。

表2.其它芽孢杆菌属α-淀粉酶对可发酵糖的生产的影响

实施例9

当用碘测试糖化淀粉时，避开水解的任何直链淀粉将与碘结合并产生特征性蓝色。这称为碘阳性糖(IPS)，其是液化/糖化效率的指示剂。IPS在淀粉加工应用中是非常不受欢迎的，因为其存在反映淀粉的不完全水解。图15显示补充AmyE到TrGA中将有效地减少滤液中IPS的存在。

此外，图16显示，随时间的变化，在各种酶组合催化的糖化中IPS的存在(通过在520nm的吸光度反映)。以0.02mg/g补充AmyE到TrGA中，使IPS显著降至与用等价量的Spirizyme Ultra^TM(Novozymes A/S)时的水平类似的水平。

而且，观察到在补充有AmyE的糖化反应中存在较低水平的不溶性残留淀粉(IRS)。不溶性残留淀粉是指不完全水解的淀粉，其在糖化后以沉淀物形式显示。高水平的沉淀物在甜味剂应用中尤其是不受欢迎的，因为它们可实质性地干扰生产效率且减少产出。图17显示在由单独TrGA催化的糖化中存在大量的IRS。补充低到0.0025mg/g ds的AmyE急剧减少IRS的量。因此，由补充有AmyE的TrGA进行的糖化更有效率，糖化后的淀粉适用于本文所述的一系列应用。

实施例10

在pH 4.5和60℃，用不同水平的(1)AmyE、(2)AnGA(OPTDEXL-400，Danisco US，Inc.，Genencor Division)和(3)支链淀粉酶(OPTIMAXTM L-1000，Danisco US，Inc.，Genencor Division)对经液化的淀粉底物(32％ds)进行进一步糖化。通过HPLC或碘染色法，由在6、18、24、48和72小时所采集的样品，测定了糖的组成(可发酵糖和高级糖两者)。结果汇于表3中。

表3.AnGA、AmyE和支链淀粉酶浓度对生产可发酵糖的影响

示于表3中的数据显示，补充0.2单位/g AmyE到0.11GAUs/g AnGA中能够(1)生产较高水平的可发酵糖，和(2)以比用单独0.22GAUs/gAnGA的水解更高的速率减少高级糖。该结果表明，在糖化中AmyE可替代至少50％的葡糖淀粉酶。而且，添加脱支酶到AmyE和葡糖淀粉酶中导致较高的可发酵糖水平和显著降低的非可发酵糖(DP4+)水平，这均表明有效的糖化方法。

实施例11

为了进一步表征AmyE作为可用于糖化的酶的能力，将与不同葡糖淀粉酶、以及葡糖淀粉酶混合物组合的AmyE应用至经液化的淀粉底物中。在pH 5.2和32℃进行糖化。由在6、18、24和48小时所采集的样品，测定了糖的组成(可发酵糖和高级糖两者)。如表4中显示，添加AmyE到其它葡糖淀粉酶或葡糖淀粉酶混合物中导致总可发酵糖水平增加和非可发酵糖水平显著降低。

表4.与各种葡糖淀粉酶组合的AmyE对糖化的影响

另外，计算上面糖化实验的第一斜率(Primary Slope)和第二斜率(secondary slope)，并汇编于表5中。第一斜率和第二斜率分别表示水解较高分子量和较低分子量底物的相对速度。此处所示的数据表明AmyE的补充显著加快低分子量底物的水解，因为当补充AmyE时第二斜率的值显著增加。参见表5和图18。

表5.用AmyE和各种葡糖淀粉酶进行的糖化的第一斜率和第二斜率的比较

实施例12

进一步表征了使用AmyE作为生物燃料生产中的酶的优势。将来自Illinois River Energy(Rochelle，IL)的全玉米粉液化液在75℃解冻，然后至室温。将pH留在5.5。将液化液以150g的量分到250ml锥形瓶中。向每个烧瓶中的液化液加入500μl 20％酵母/水溶液和600μl 10％尿素/水溶液(400ppm终浓度)。对于每个发酵实验所给予的总酶蛋白质为0.16mg/g ds。TrGA的给予量等价于0.325GAU/g ds的标准GA剂量。根据表6中所示的实验设计，给予酶和/或酶组合。

表6.发酵中的酶组合

于32℃在150rpm的鼓风式摇床中温育烧瓶。在计划的时间间隔取样以用于HPLC分析，并在发酵结束时取样以用于淀粉分析。结果汇编于表7中，并示于图19和图20中。

表7.使用不同酶或酶组合的发酵的组成分析

示于表4的数据表明，单独TrGA和AmyE/TrGA(25/75)混合物显示几乎相等的乙醇生产速率和最终乙醇产量。就乙醇生产速率而言，AmyE/TrGA(50/50)混合物的性能比得上单独AnGA，但两者所生产的乙醇显著低于单独TrGA和AmyE/TrGA(25/75)混合物。残留淀粉数据的比较显示，就对总碳水化合物的利用率而言，AmyE/TrGA(25/75)混合物的性能与单独AnGA等价。

图16显示AmyE能够有效地减少在发酵的迟滞(酵母生长)期中的葡萄糖浪涌。葡萄糖浪涌，典型地在以TrGA进行的糖化中，被认为可以通过反馈抑制作用使进一步糖化减慢。另一方面，图17表明在用于醇生产的酵母发酵中AmyE能够替代约至少25％的总葡糖淀粉酶

序列表

SEQ ID NO：1：全长枯草芽孢杆菌AmyE氨基酸序列。天然信号序列未示出。

1   LTAPSIKSGT ILHAWNWSFN TLKHNMKDIH DAGYTAIQTS PINQVKEGNQ

51  GDKSMSNWYW LYQPTSYQIG NRYLGTEQEF KEMCAAAEEY GIKVIVDAVI

101 NHTTSDYAAI SNEVKSIPNW THGNTQIKNW SDRWDVTQNS LLGLYDWNTQ

151 NTQVQSYLKR FLDRALNDGA DGFRFDAAKH IELPDDGSYG SQFWPNITNT

201 SAEFQYGEIL QDSASRDAAY ANYMDVTASN YGHSIRSALK NRNLGVSNIS

251 HYASDVSADK LVTWVESHDT YANDDEESTW MSDDDIRLGW AVIASRSGST

301 PLFFSRPEGG GNGVRFPGKS QIGDRGSALF EDQAITAVNR FHNVMAGQPE

351 ELSNPNGNNQ IFMNQRGSHG VVLANAGSSS VSINTATKLP DGRYDNKAGA

401 GSFQVNDGKL TGTINARSVA VLYPDDIAKA PHVFLENYKT GVTHSFNDQL

451 TITLRADANT TKAVYQINNG PETAFKDGDQ FTIGKGDPFG KTYTIMLKGT

501 NSDGVTRTEK YSFVKRDPAS AKTIGYQNPN HWSQVNAYIY KHDGSRVIEL

551 TGSWPGKPMT KNADGIYTLT LPADTDTTNA KVIFNNGSAQ VPGQNQPGFD

601 YVLNGLYNDS GLSGSLPH

SEQ ID NO：2：截短的枯草芽孢杆菌AmyE(AmyE-tr)氨基酸序列。

天然信号序列未示出。

1   LTAPSIKSGT ILHAWNWSFN TLKHNMKDIH DAGYTAIQTS PINQVKEGNQ

51  GDKSMSNWYW LYQPTSYQIG NRYLGTEQEF KEMCAAAEEY GIKVIVDAVI

101 NHTTSDYAAI SNEVKSIPNW THGNTQIKNW SDRWDVTQNS LLGLYDWNTQ

151 NTQVQSYLKR FLDRALNDGA DGFRFDAAKH IELPDDGSYG SQFWPNITNT

201 SAEFQYGEIL QDSASRDAAY ANYMDVTASN YGHSIRSALK NRNLGVSNIS

251 HYASDVSADK LVTWVESHDT YANDDEESTW MSDDDIRLGW AVIASRSGST

301 PLFFSRPEGG GNGVRFPGKS QIGDRGSALF EDQAITAVNR FHNVMAGQPE

351 ELSNPNGNNQ IFMNQRGSHG VVLANAGSSS VSINTATKLP DGRYDNKAGA

401 GSFQVNDGKL TGTINARSVA VLYPD

SEQ ID NO：3：枯草芽孢杆菌α-淀粉酶变体Amy31A氨基酸序列(UniProtKB/TrEMBL登录号O82953).天然信号序列以粗体显示。

1

VTASSVKNG

51  TILHAWNWSF NTLTQNMKDI RDAGYAAIQT SPINQVKEGN QGDKSMSNWY

101 WLYQPTSYQI GNRYLGTEQE FKDMCAAAEK YGVKVIVDAV VNHTTSDYGA

151 ISDEIKRIPN WTHGNTQIKN WSDRWDITQN ALLGLYDWNT QNTEVQAYLK

201 GFLERALNDG ADGFRYDAAK HIELPDDGNY GSQFWPNITN TSAEFQYGEI

251 LQDSASRDTA YANYMNVTAS NYGHSIRSAL KNRILSVSNI SHYASDVSAD

301 KLVTWVESHD TYANDDEEST WMSDDDIRLG WAVIGSRSGS TPLFFSRPEG

351 GGNGVRFPGK SQIGDRGSAL FKDQAITAVN QFHNEMAGQP EELSNPNGNN

401 QIFMNQRGSK GVVLANAGSS SVTINTSTKL PDGRYDNRAG AGSFQVANGK

451 LTGTINARSA AVLYPDDIGN APHVFLENYQ TEAVHSFNDQ LTVTLRANAK

501 TTKAVYQINN GQETAFKDGD RLTIGKEDPI GTTYNVKLTG TNGEGASRTQ

551 EYTFVKKDPS QTNIIGYQNP DHWGNVNAYI YKHDGGGAIE LTGSWPGKAM

601 TKNADGIYTL TLPANADTAD AKVIFNNGSA QVPGQNHPGF DYVQNGLYNN

651 SGLNGYLPH

SEQ ID NO：4：截短的嗜热脂肪地芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyS，a/k/a“Ethyl3”)蛋白质序列。信号序列以粗体显示。

1

AAPFNG TMMQYFEWYL

51  PDDGTLWTKV ANEANNLSSL GITALWLPPA YKGTSRSDVG YGVYDLYDLG

101 EFNQKGTVRT KYGTKAQYLQ AIQAAHAAGM QVYADVVFDH KGGADGTEWV

151 DAVEVNPSDR NQEISGTYQI QAWTKFDFPG RGNTYSSFKW RWYHFDGVDW

201 DESRKLSRIY KFIGKAWDWE VDTENGNYDY LMYADLDMDH PEVVTELKNW

251 GKWYVNTTNI DGFRLDAVKH IKFSFFPDWL SYVRSQTGKP LFTVGEYWSY

301 DINKLHNYIT KTNGTMSLFD APLHNKFYTA SKSGGAFDMR TLMTNTLMKD

351 QPTLAVTFVD NHDTEPGQAL QSWVDPWFKP LAYAFILTRQ EGYPCVFYGD

401 YYGIPQYNIP SLKSKIDPLL IARRDYAYGT QHDYLDHSDI IGWTREGVTE

451 KPGSGLAALI TDGPGGSKWM YVGKQHAGKV FYDLTGNRSD TVTINSDGWG

501 EFKVNGGSVS VWVPRKTT

SEQ ID NO：5：嗜热脂肪地芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyR；XTRA淀粉酶)氨基酸序列。

1   AAPFNGTMMQ YFEWYLPDDG TLWTKVANEA NNLSSLGITA LWLPPAYKGT

51  SRSDVGYGVY DLYDLGEFNQ KGTVRTKYGT KAQYLQAIQA AHAAGMQVYA

101 DVVFDHKGGA DGTEWVDAVE VNPSDRNQEI SGTYQIQAWT KFDFPGRGNT

151 YSSFKWRWYH FDGVDWDESR KLSRIYKFRG IGKAWDWEVD TENGNYDYLM

201 YADLDMDHPE VVTELKNWGK WYVNTTNIDG FRLDAVKHIK FSFFPDWLSY

251 VRSQTGKPLF TVGEYWSYDI NKLHNYITKT NGTMSLFDAP LHNKFYTASK

301 SGGAFDMRTL MTNTLMKDQP TLAVTFVDNH DTEPGQALQS WVDPWFKPLA

351 YAFILTRQEG YPCVFYGDYY GIPQYNIPSL KSKIDPLLIA RRDYAYGTQH

401 DYLDHSDIIG WTREGVTEKP GSGLAALITD GPGGSKWMYV GKQHAGKVFY

451 DLTGNRSDTV TINSDGWGEF KVNGGSVSVW VPRKTT

SEQ ID NO：6：河内曲霉α-淀粉酶(AkAA)氨基酸序列。

GLSAAEWRTQ SIYFLLTDRF GRTDNSTTAT

51  CNTGDQIYCG GSWQGIINHL DYIQGMGFTA IWISPITEQL PQDTSDGEAY

101 HGYWQQKIYN VNSNFGTADD LKSLSDALHA RGMYLMVDVV PNHMGYAGNG

151 NDVDYSVFDP FDSSSYFHPY CLITDWDNLT MVQDCWEGDT IVSLPDLNTT

201 ETAVRTIWYD WVADLVSNYS VDGLRIDSVE EVEPDFFPGY QEAAGVYCVG

251 EVDNGNPALD CPYQKYLDGV LNYPIYWQLL YAFESSSGSI SNLYNMIKSV

301 ASDCSDPTLL GNFIENHDNP RFASYTSDYS QAKNVLSYIF LSDGIPIVYA

351 GEEQHYSGGD VPYNREATWL SGYDTSAELY TWIATTNAIR KLAISADSDY

401 ITYANDPIYT DSNTIAMRKG TSGSQIITVL SNKGSSGSSY TLTLSGSGYT

451 SGTKLIEAYT CTSVTVDSNG DIPVPMASGL PRVLLPASVV DSSSLCGGSG

501N

LP ITFEELVTTT

551 YGEEVYLSGS ISQLGEWDTS DAVKLSADDY TSSNPEWSVT VSLPVGTTFE

601 YKFIKVDEGG SVTWESDPNR EYTVPECGSG SGETVVDTWR

SEQ ID NO：7：里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)氨基酸序列(WO 2006/060062的SEQ ID NO：3).前序列以斜体字显示。

1

VDDFIS TETPIALNNL

51  LCNVGPDGCR AFGTSAGAVI ASPSTIDPDY YYMWTRDSAL VFKNLIDRFT

100 ETYDAGLQRR IEQYITAQVT LQGLSNPSGS LADGSGLGEP KFELTLKPFT

151 GNWGRPQRDG PALRAIALIG YSKWLINNNY QSTVSNVIWP IVRNDLNYVA

201 QYWNQTGFDL WEEVNGSSFF TVANQHRALV EGATLAATLG QSGSAYSSVA

251 PQVLCFLQRF WVSSGGYVDS NINTNEGRTG KDVNSVLTSI HTFDPNLGCD

301 AGTFQPCSDK ALSNLKVVVD SFRSIYGVNK GIPAGAAVAI GRYAEDVYYN

351 GNPWYLATFA AAEQLYDAIY VWKKTGSITV TATSLAFFQE LVPGVTAGTY

401 SSSSSTFTNI INAVSTYADG FLSEAAKYVP ADGSLAEQFD RNSGTPLSAL

451 HLTWSYASFL TATARRAGIV PPSWANSSAS TIPSTCSGAS VVGSYSRPTA

501 TSFPPSQTPK PGVPSGTPYT PLPCATPTSV AVTFHELVST QFGQTVKVAG

551 NAAALGNWST SAAVALDAVN YADNHPLWIG TVNLEAGDVV EYKYINVGQD

601 GSVTWESDPN HTYTVPAVAC VTQVVKEDTW QS

SEQ ID NO：8：

FRED α-淀粉酶氨基酸序列。

1A  NLNGTLMQY  FEWYTPNDGQ HWKRLQNDSA YLAEHGITAV WIPPAYKGTS

51  QADVGYGAYD LYDLGEFHQK GTVRTKYGTK GELQSAIKSL HSRDINVYGD

101 VVINHKGGAD ATEDVTAVEV DPADRNRVIS GEYLIKAWTH FHFPGRGSTY

151 SDFKWHWYHF DGTDWDESRK LNRIYKFQGK AWDWEVSSEN GNYDYLMYAD

201 IDYDHPDVVA EIKRWGTWYA NELQLDGFRL DAVKHIKFSF LRDWVNHVRE

251 KTGKEMFTVA EYWQNDLGAL ENYLNKTNFN HSVFDVPLHY QFHAASTQGG

301 GYDMRKLLNG TVVSKHPLKS VTFVDNHDTQ PGQSLESTVQ TWFKPLAYAF

351 ILTRESGYPQ VFYGDMYGTK GDSQREIPAL KHKIEPILKA RKQYAYGAQH

401 DYFDHHDIVG WTREGDSSVA NSGLAALITD GPGGAKRMYV GRQNAGETWH

451 DITGNRSEPV VINSEGWGEF HVNGGSVSIY VQR

SEQ ID NO：9：编码SEQ ID NO：1的AmyE的核苷酸序列.

CTTACAGCACCGTCGATCAAAAGCGGAACCATTCTTCATGCATGGAATTGGTCGTTCAATACGTTAAAACACAATATGAAGGATATTCATGATGCAGGATATACAGCCATTCAGACATCTCCGATTAACCAAGTAAAGGAAGGGAATCAAGGAGATAAAAGCATGTCGAACTGGTACTGGCTGTATCAGCCGACATCGTATCAAATTGGCAACCGTTACTTAGGTACTGAACAAGAATTTAAAGAAATGTGTGCAGCCGCTGAAGAATATGGCATAAAGGTCATTGTTGACGCGGTCATCAATCATACCACCAGTGATTATGCCGCGATTTCCAATGAGGTTAAGAGTATTCCAAACTGGACACATGGAAACACACAAATTAAAAACTGGTCTGATCGATGGGATGTCACGCAGAATTCATTGCTCGGGCTGTATGACTGGAATACACAAAATACACAAGTACAGTCCTATCTGAAACGGTTCTTAGACAGGGCATTGAATGACGGGGCAGACGGTTTTCGATTTGATGCCGCCAAACATATAGAGCTTCCAGATGATGGCAGTTACGGCAGTCAATTTTGGCCGAATATCACAAATACATCAGCAGAGTTCCAATACGGAGAAATCCTTCAGGATAGTGCCTCCAGAGATGCTGCATATGCGAATTATATGGATGTGACAGCGTCTAACTATGGGCATTCCATAAGGTCCGCTTTAAAGAATCGTAATCTGGGCGTGTCGAATATCTCCCACTATGCATCTGATGTGTCTGCGGACAAGCTAGTGACATGGGTAGAGTCGCATGATACGTATGCCAATGATGATGAAGAGTCGACATGGATGAGCGATGATGATATCCGTTTAGGCTGGGCGGTGATAGCTTCTCGTTCAGGCAGTACGCCTCTTTTCTTTTCCAGACCTGAGGGAGGCGGAAATGGTGTGAGGTTCCCGGGGAAAAGCCAAATAGGCGATCGCGGGAGTGCTTTATTTGAAGATCAGGCTATCACTGCGGTCAATAGATTTCACAATGTGATGGCTGGACAGCCTGAGGAACTCTCGAACCCGAATGGAAACAACCAGATATTTATGAATCAGCGCGGCTCACATGGCGTTGTGCTGGCAAATGCAGGTTCATCCTCTGTCTCTATCAATACGGCAACAAAATTGCCTGATGGCAGGTATGACAATAAAGCTGGAGCGGGTTCATTTCAAGTGAACGATGGTAAACTGACAGGCACGATCAATGCCAGGTCTGTAGCTGTGCTTTATCCTGATGATATTGCAAAAGCGCCTCATGTTTTCCTTGAGAATTACAAAACAGGTGTAACACATTCTTTCAATGATCAACTGACGATTACCTTGCGTGCAGATGCGAATACAACAAAAGCCGTTTATCAAATCAATAATGGACCAGAGACGGCGTTTAAGGATGGAGATCAATTCACAATCGGAAAAGGAGATCCATTTGGCAAAACATACACCATCATGTTAAAAGGAACGAACAGTGATGGTGTAACGAGGACCGAGAAATACAGTTTTGTTAAAAGAGATCCAGCGTCGGCCAAAACCATCGGCTATCAAAATCCGAATCATTGGAGCCAGGTAAATGCTTATATCTATAAACATGATGGGAGCCGAGTAATTGAATTGACCGGATCTTGGCCTGGAAAACCAATGACTAAAAATGCAGACGGAATTTACACGCTGACGCTGCCTGCGGACACGGATACAACCAACGCAAAAGTGATTTTTAATAATGGCAGCGCCCAAGTGCCCGGTCAGAATCAGCCTGGCTTTGATTACGTGCTAAATGGTTTATATAATGACTCGGGCTTAAGCGGTTCTCTTCCCCAT

SEQ ID NO：10：编码AmyE-tr的核苷酸序列(SEQ ID NO：2).

CTTACAGCACCGTCGATCAAAAGCGGAACCATTCTTCATGCATGGAATTGGTCGTTCAATACGTTAAAACACAATATGAAGGATATTCATGATGCAGGATATACAGCCATTCAGACATCTCCGATTAACCAAGTAAAGGAAGGGAATCAAGGAGATAAAAGCATGTCGAACTGGTACTGGCTGTATCAGCCGACATCGTATCAAATTGGCAACCGTTACTTAGGTACTGAACAAGAATTTAAAGAAATGTGTGCAGCCGCTGAAGAATATGGCATAAAGGTCATTGTTGACGCGGTCATCAATCATACCACCAGTGATTATGCCGCGATTTCCAATGAGGTTAAGAGTATTCCAAACTGGACACATGGAAACACACAAATTAAAAACTGGTCTGATCGATGGGATGTCACGCAGAATTCATTGCTCGGGCTGTATGACTGGAATACACAAAATACACAAGTACAGTCCTATCTGAAACGGTTCTTAGACAGGGCATTGAATGACGGGGCAGACGGTTTTCGATTTGATGCCGCCAAACATATAGAGCTTCCAGATGATGGCAGTTACGGCAGTCAATTTTGGCCGAATATCACAAATACATCAGCAGAGTTCCAATACGGAGAAATCCTTCAGGATAGTGCCTCCAGAGATGCTGCATATGCGAATTATATGGATGTGACAGCGTCTAACTATGGGCATTCCATAAGGTCCGCTTTAAAGAATCGTAATCTGGGCGTGTCGAATATCTCCCACTATGCATCTGATGTGTCTGCGGACAAGCTAGTGACATGGGTAGAGTCGCATGATACGTATGCCAATGATGATGAAGAGTCGACATGGATGAGCGATGATGATATCCGTTTAGGCTGGGCGGTGATAGCTTCTCGTTCAGGCAGTACGCCTCTTTTCTTTTCCAGACCTGAGGGAGGCGGAAATGGTGTGAGGTTCCCGGGGAAAAGCCAAATAGGCGATCGCGGGAGTGCTTTATTTGAAGATCAGGCTATCACTGCGGTCAATAGATTTCACAATGTGATGGCTGGACAGCCTGAGGAACTCTCGAACCCGAATGGAAACAACCAGATATTTATGAATCAGCGCGGCTCACATGGCGTTGTGCTGGCAAATGCAGGTTCATCCTCTGTCTCTATCAATACGGCAACAAAATTGCCTGATGGCAGGTATGACAATAAAGCTGGAGCGGGTTCATTTCAAGTGAACGATGGTAAACTGACAGGCACGATCAATGCCAGGTCTGTAGCTGTGCTTTATCCTGAT

SEQ ID NO：11：编码枯草芽孢杆菌Amy31A的核苷酸序列(SEQ ID NO：3).

TCTGTTAAAAACGGCACTATTCTGCATGCATGGAACTGGAGCTTTAACACGCTGACCCAGAACATGAAAGATATTCGTGACGCGGGCTATGCTGCGATCCAAACCAGCCCTATCAACCAGGTCAAAGAAGGCAACCAAGGCGACAAATCCATGTCCAACTGGTACTGGCTGTATCAACCGACGTCCTATCAGATTGGCAACCGTTATCTGGGCACGGAGCAAGAGTTCAAAGACATGTGTGCTGCGGCTGAGAAATATGGTGTGAAAGTTATCGTGGACGCTGTGGTAAACCACACGACCTCTGATTATGGTGCTATTAGCGACGAGATTAAACGTATTCCAAATTGGACCCATGGTAATACCCAGATCAAAAATTGGAGCGACCGCTGGGACATTACCCAGAATGCGCTGCTGGGTCTGTATGACTGGAACACGCAAAACACCGAAGTACAGGCATATCTGAAGGGCTTCCTGGAACGCGCTCTGAACGATGGTGCTGATGGTTTTCGCTACGACGCCGCAAAGCATATTGAGCTGCCGGATGACGGCAACTACGGTTCCCAATTCTGGCCGAACATCACCAACACCTCTGCCGAATTCCAGTACGGCGAGATCCTGCAAGACTCCGCGAGCCGTGACACCGCTTATGCCAACTATATGAACGTAACTGCCTCTAACTATGGCCATTCCATTCGTTCTGCGCTGAAAAATCGTATCCTGTCCGTGTCCAATATCTCCCACTATGCATCCGACGTTTCTGCTGACAAACTGGTAACTTGGGTCGAGTCTCACGACACCTATGCAAATGATGACGAGGAGAGCACCTGGATGAGCGATGATGATATTCGTCTGGGTTGGGCGGTTATTGGTTCTCGCTCTGGTTCTACTCCGCTGTTCTTTAGCCGTCCGGAAGGTGGCGGCAATGGCGTTCGTTTCCCGGGTAAATCTCAAATTGGTGATCGTGGCTCTGCACTGTTTAAAGATCAAGCTATTACGGCGGTGAATCAGTTCCATAATGAGATGGCAGGTCAACCTGAAGAACTGTCCAATCCAAACGGTAACAACCAAATCTTCATGAACCAGCGTGGCAGCAAAGGCGTCGTCCTGGCGAACGCCGGTAGCTCTTCTGTTACCATCAACACGTCTACCAAACTGCCAGACGGCCGCTATGATAACCGTGCGGGTGCTGGTTCCTTTCAGGTAGCCAACGGCAAGCTGACGGGCACCATCAACGCTCGTTCTGCTGCTGTTCTGTACCCGGACGACATTGGCAACGCTCCGCACGTGTTCCTGGAGAATTACCAGACCGAAGCGGTACATAGCTTTAATGACCAGCTGACCGTCACTCTGCGTGCCAACGCAAAAACCACGAAAGCAGTCTATCAGATCAATAATGGTCAAGAAACTGCTTTCAAGGATGGCGACCGTCTGACTATTGGTAAGGAGGACCCGATTGGCACCACTTATAACGTTAAACTGACTGGCACCAATGGCGAGGGCGCTAGCCGCACTCAAGAGTATACGTTCGTAAAGAAAGACCCGTCTCAAACCAACATCATCGGTTACCAGAATCCTGACCACTGGGGTAATGTGAACGCTTACATCTATAAACATGATGGTGGCGGTGCTATCGAACTGACCGGCTCTTGGCCAGGTAAAGCCATGACGAAAAACGCGGATGGCATCTATACCCTGACCCTGCCGGCCAATGCGGATACCGCAGATGCGAAGGTTATCTTCAATAACGGCTCCGCGCAGGTTCCGGGCCAAAACCATCCGGGCTTTGACTACGTACAAAATGGTCTGTATAACAACTCTGGCCTGAACGGTTACCTGCCGCAC

SEQ ID NO：12：编码嗜热脂肪地芽孢杆菌AmyS的核苷酸序列(SEQID NO：4).

GCCGCACCGTTTAACGGTACCATGATGCAGTATTTTGAATGGTACTTGCCGGATGATGGCACGTTATGGACCAAAGTGGCCAATGAAGCCAACAACTTATCCAGCCTTGGCATCACCGCTCTTTGGCTGCCGCCCGCTTACAAAGGAACAAGCCGCAGCGACGTAGGGTACGGAGTATACGACTTGTATGACCTCGGCGAATTCAATCAAAAAGGGACCGTCCGCACAAAATATGGAACAAAAGCTCAATATCTTCAAGCCATTCAAGCCGCCCACGCCGCTGGAATGCAAGTGTACGCCGATGTCGTGTTCGACCATAAAGGCGGCGCTGACGGCACGGAATGGGTGGACGCCGTCGAAGTCAATCCGTCCGACCGCAACCAAGAAATCTCGGGCACCTATCAAATCCAAGCATGGACGAAATTTGATTTTCCCGGGCGGGGCAACACCTACTCCAGCTTTAAGTGGCGCTGGTACCATTTTGACGGCGTTGACTGGGACGAAAGCCGAAAATTAAGCCGCATTTACAAATTCATCGGCAAAGCGTGGGATTGGGAAGTAGACACAGAAAACGGAAACTATGACTACTTAATGTATGCCGACCTTGATATGGATCATCCCGAAGTCGTGACCGAGCTGAAAAACTGGGGGAAATGGTATGTCAACACAACGAACATTGATGGGTTCCGGCTTGATGCCGTCAAGCATATTAAGTTCAGTTTTTTTCCTGATTGGTTGTCGTATGTGCGTTCTCAGACTGGCAAGCCGCTATTTACCGTCGGGGAATATTGGAGCTATGACATCAACAAGTTGCACAATTACATTACGAAAACAAACGGAACGATGTCTTTGTTTGATGCCCCGTTACACAACAAATTTTATACCGCTTCCAAATCAGGGGGCGCATTTGATATGCGCACGTTAATGACCAATACTCTCATGAAAGATCAACCGACATTGGCCGTCACCTTCGTTGATAATCATGACACCGAACCCGGCCAAGCGCTGCAGTCATGGGTCGACCCATGGTTCAAACCGTTGGCTTACGCCTTTATTCTAACTCGGCAGGAAGGATACCCGTGCGTCTTTTATGGTGACTATTATGGCATTCCACAATATAACATTCCTTCGCTGAAAAGCAAAATCGATCCGCTCCTCATCGCGCGCAGGGATTATGCTTACGGAACGCAACATGATTATCTTGATCACTCCGACATCATCGGGTGGACAAGGGAAGGGGTCACTGAAAAACCAGGATCCGGGCTGGCCGCACTGATCACCGATGGGCCGGGAGGAAGCAAATGGATGTACGTTGGCAAACAACACGCTGGAAAAGTGTTCTATGACCTTACCGGCAACCGGAGTGACACCGTCACCATCAACAGTGATGGATGGGGGGAATTCAAAGTCAATGGCGGTTCGGTTTCGGTTTGGGTTCCTAGAAAAACGACC

SEQIDNO：13：

XTRA淀粉酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：5).

GCCGCACCGTTTAACGGTACCATGATGCAGTATTTTGAATGGTACTTGCCGGATGATGGCACGTTATGGACCAAAGTGGCCAATGAAGCCAACAACTTATCCAGCCTTGGCATCACCGCTCTTTGGCTGCCGCCCGCTTACAAAGGAACAAGCCGCAGCGACGTAGGGTACGGAGTATACGACTTGTATGACCTCGGCGAATTCAATCAAAAAGGGACCGTCCGCACAAAATATGGAACAAAAGCTCAATATCTTCAAGCCATTCAAGCCGCCCACGCCGCTGGAATGCAAGTGTACGCCGATGTCGTGTTCGACCATAAAGGCGGCGCTGACGGCACGGAATGGGTGGACGCCGTCGAAGTCAATCCGTCCGACCGCAACCAAGAAATCTCGGGCACCTATCAAATCCAAGCATGGACGAAATTTGATTTTCCCGGGCGGGGCAACACCTACTCCAGCTTTAAGTGGCGCTGGTACCATTTTGACGGCGTTGATTGGGACGAAAGCCGAAAATTAAGCCGCATTTACAAATTCAGGGGCATCGGCAAAGCGTGGGATTGGGAAGTAGACACAGAAAACGGAAACTATGACTACTTAATGTATGCCGACCTTGATATGGATCATCCCGAAGTCGTGACCGAGCTGAAAAACTGGGGGAAATGGTATGTCAACACAACGAACATTGATGGGTTCCGGCTTGATGCCGTCAAGCATATTAAGTTCAGTTTTTTTCCTGATTGGTTGTCGTATGTGCGTTCTCAGACTGGCAAGCCGCTATTTACCGTCGGGGAATATTGGAGCTATGACATCAACAAGTTGCACAATTACATTACGAAAACAAACGGAACGATGTCTTTGTTTGATGCCCCGTTACACAACAAATTTTATACCGCTTCCAAATCAGGGGGCGCATTTGATATGCGCACGTTAATGACCAATACTCTCATGAAAGATCAACCGACATTGGCCGTCACCTTCGTTGATAATCATGACACCGAACCCGGCCAAGCGCTTCAGTCATGGGTCGACCCATGGTTCAAACCGTTGGCTTACGCCTTTATTCTAACTCGGCAGGAAGGATACCCGTGCGTCTTTTATGGTGACTATTATGGCATTCCACAATATAACATTCCTTCGCTGAAAAGCAAAATCGATCCGCTCCTCATCGCGCGCAGGGATTATGCTTACGGAACGCAACATGATTATCTTGATCACTCCGACATCATCGGGTGGACAAGGGAAGGGGTCACTGAAAAACCAGGATCCGGGCTGGCCGCACTGATCACCGATGGGCCGGGAGGAAGCAAATGGATGTACGTTGGCAAACAACACGCTGGAAAAGTGTTCTATGACCTTACCGGCAACCGGAGTGACACCGTCACCATCAACAGTGATGGATGGGGGGAATTCAAAGTCAATGGCGGTTCGGTTTCGGTTTGGGTTCCTAGAAAAACGACC

SEQ ID NO：14：河内曲霉α淀粉酶(AkAA)基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：6).

ATGAGAGTGTCGACTTCAAGTATTGCCCTTGCTGTGTCCCTTTTTGGGAAGCTGGCCCTTGGGCTGTCAGCTGCAGAATGGCGCACTCAATCCATCTACTTCCTTTTGACGGATCGGTTCGGTAGGACGGACAATTCGACTACAGCTACGTGCAATACGGGTGACCAAATCTACTGTGGTGGAAGTTGGCAAGGAATTATCAACCATCTGGACTATATCCAGGGCATGGGATTCACAGCTATCTGGATCTCGCCTATCACTGAGCAGCTACCCCAGGATACTTCGGATGGTGAAGCCTACCATGGATACTGGCAGCAGAAGATATACAATGTGAACTCCAACTTCGGCACGGCAGATGATCTGAAGTCCCTCTCCGATGCTCTTCACGCCCGCGGAATGTACCTCATGGTCGACGTCGTCCCTAACCACATGGGCTACGCAGGTAACGGCAACGATGTGGATTACAGCGTCTTCGACCCCTTCGACTCCTCCTCCTACTTCCATCCATACTGCCTCATCACAGATTGGGACAACTTGACCATGGTCCAAGACTGTTGGGAGGGTGACACCATCGTGTCTCTGCCAGATCTGAACACCACGGAAACCGCCGTGAGAACCATTTGGTACGATTGGGTAGCCGACCTGGTATCCAACTACTCAGTCGACGGCCTCCGTATCGACAGTGTCGAAGAAGTCGAACCCGACTTCTTCCCGGGCTACCAAGAAGCAGCAGGAGTCTACTGCGTCGGTGAAGTCGACAACGGCAACCCTGCTCTCGACTGCCCATACCAAAAATATCTAGATGGTGTTCTCAACTATCCCATCTACTGGCAACTCCTCTACGCCTTTGAATCCTCCAGCGGCAGCATCAGCAACCTCTACAACATGATCAAATCCGTCGCCAGCGACTGCTCCGATCCGACCCTCCTGGGCAACTTTATCGAAAACCACGACAACCCCCGCTTCGCCTCCTACACATCCGACTACTCCCAAGCCAAAAACGTCCTCAGCTACATCTTCCTCTCCGACGGCATCCCCATCGTCTACGCCGGCGAAGAACAGCACTACTCCGGCGGCGACGTGCCCTACAACCGCGAAGCTACCTGGCTATCAGGCTACGACACCTCCGCGGAGCTCTACACCTGGATAGCCACCACAAACGCGATCCGGAAACTAGCTATCTCAGCAGACTCGGACTACATTACTTACGCGAACGACCCAATCTACACAGACAGCAACACCATCGCGATGCGCAAAGGCACCTCCGGCTCCCAAATCATCACCGTCCTCTCCAACAAAGGCTCCTCCGGAAGCAGCTACACCCTCACCCTCAGCGGAAGCGGCTACACGTCCGGCACGAAGCTCATCGAAGCGTACACCTGCACGTCCGTGACGGTGGACTCGAACGGGGATATCCCTGTGCCGATGGCTTCGGGATTACCTAGAGTTCTCCTCCCTGCTTCGGTGGTTGATAGTTCTTCGCTTTGTGGGGGGAGTGGTAACACAACCACGACCACAACTGCTGCTACCTCCACATCCAAAGCCACCACCTCCTCTTCTTCTTCTTCTGCTGCTGCTACTACTTCTTCATCATGCACCGCAACAAGCACCACCCTCCCCATCACCTTCGAAGAACTCGTCACCACTACCTACGGGGAAGAAGTCTACCTCAGCGGATCTATCTCCCAGCTCGGAGAGTGGGATACGAGTGACGCGGTGAAGTTGTCCGCGGATGATTATACCTCGAGTAACCCCGAGTGGTCTGTTACTGTGTCGTTGCCGGTGGGGACGACCTTCGAGTATAAGTTTATTAAGGTCGATGAGGGTGGAAGTGTGACTTGGGAAAGTGATCCGAATAGGGAGTATACTGTGCCTGAATGTGGGAGTGGGAGTGGGGAGACGGTGGTTGATACGTGGAGGTAG

SEQ ID NO：15：里氏木霉葡糖淀粉酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：7).

1   ATGCACGTCC TGTCGACTGC GGTGCTGCTC GGCTCCGTTG CCGTTCAAAA GGTCCTGGGA

61  AGACCAGGAT CAAGCGGTCT GTCCGACGTC ACCAAGAGGT CTGTTGACGA CTTCATCAGC

121 ACCGAGACGC CTATTGCACT GAACAATCTT CTTTGCAATG TTGGTCCTGA TGGATGCCGT

181 GCATTCGGCA CATCAGCTGG TGCGGTGATT GCATCTCCCA GCACAATTGA CCCGGACTAC

241 TATTACATGT GGACGCGAGA TAGCGCTCTT GTCTTCAAGA ACCTCATCGA CCGCTTCACC

301 GAAACGTACG ATGCGGGCCT GCAGCGCCGC ATCGAGCAGT ACATTACTGC CCAGGTCACT

361 CTCCAGGGCC TCTCTAACCC CTCGGGCTCC CTCGCGGACG GCTCTGGTCT CGGCGAGCCC

421 AAGTTTGAGT TGACCCTGAA GCCTTTCACC GGCAACTGGG GTCGACCGCA GCGGGATGGC

481  CCAGCTCTGC GAGCCATTGC CTTGATTGGA TACTCAAAGT GGCTCATCAA CAACAACTAT

541  CAGTCGACTG TGTCCAACGT CATCTGGCCT ATTGTGCGCA ACGACCTCAA CTATGTTGCC

601  CAGTACTGGA ACCAAACCGG CTTTGACCTC TGGGAAGAAG TCAATGGGAG CTCATTCTTT

661  ACTGTTGCCA ACCAGCACCG AGCACTTGTC GAGGGCGCCA CTCTTGCTGC CACTCTTGGC

721  CAGTCGGGAA GCGCTTATTC ATCTGTTGCT CCCCAGGTTT TGTGCTTTCT CCAACGATTC

781  TGGGTGTCGT CTGGTGGATA CGTCGACTCC AACATCAACA CCAACGAGGG CAGGACTGGC

841  AAGGATGTCA ACTCCGTCCT GACTTCCATC CACACCTTCG ATCCCAACCT TGGCTGTGAC

901  GCAGGCACCT TCCAGCCATG CAGTGACAAA GCGCTCTCCA ACCTCAAGGT TGTTGTCGAC

961  TCCTTCCGCT CCATCTACGG CGTGAACAAG GGCATTCCTG CCGGTGCTGC CGTCGCCATT

1021 GGCCGGTATG CAGAGGATGT GTACTACAAC GGCAACCCTT GGTATCTTGC TACATTTGCT

1081 GCTGCCGAGC AGCTGTACGA TGCCATCTAC GTCTGGAAGA AGACGGGCTC CATCACGGTG

1141 ACCGCCACCT CCCTGGCCTT CTTCCAGGAG CTTGTTCCTG GCGTGACGGC CGGGACCTAC

1201 TCCAGCAGCT CTTCGACCTT TACCAACATC ATCAACGCCG TCTCGACATA CGCCGATGGC

1261 TTCCTCAGCG AGGCTGCCAA GTACGTCCCC GCCGACGGTT CGCTGGCCGA GCAGTTTGAC

1321 CGCAACAGCG GCACTCCGCT GTCTGCGCTT CACCTGACGT GGTCGTACGC CTCGTTCTTG

1381 ACAGCCACGG CCCGTCGGGC TGGCATCGTG CCCCCCTCGT GGGCCAACAG CAGCGCTAGC

1441 ACGATCCCCT CGACGTGCTC CGGCGCGTCC GTGGTCGGAT CCTACTCGCG TCCCACCGCC

1501 ACGTCATTCC CTCCGTCGCA GACGCCCAAG CCTGGCGTGC CTTCCGGTAC TCCCTACACG

1561 CCCCTGCCCT GCGCGACCCC AACCTCCGTG GCCGTCACCT TCCACGAGCT CGTGTCGACA

1621 CAGTTTGGCC AGACGGTCAA GGTGGCGGGC AACGCCGCGG CCCTGGGCAA CTGGAGCACG

1681 AGCGCCGCCG TGGCTCTGGA CGCCGTCAAC TATGCCGATA ACCACCCCCT GTGGATTGGG

1741 ACGGTCAACC TCGAGGCTGG AGACGTCGTG GAGTACAAGT ACATCAATGT GGGCCAAGAT

1801 GGCTCCGTGA CCTGGGAGAG TGATCCCAAC CACACTTACA CGGTTCCTGC GGTGGCTTGT

1861 GTGACGCAGG TTGTCAAGGA GGACACCTGG CAGTCGTAA

SEQ ID NO：16：AmyL基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：8).

ACAAATCTTAATGGGACGCTGATGCAGTATTTTGAATGGTACACGCCCAATGACGGCCAACATTGGAAGCGTCTGCAAAACGACTCGGCATATTTGGCTGAACACGGTATTACTGCCGTCTGGATTCCCCCGGCATATAAGGGAACGAGCCAAGCGGATGTGGGCTACGGTGCTTACGACCTTTATGATTTAGGGGAGTTTCATCAAAAAGGGACGGTTCGGACAAAGTACGGCACAAAAGGAGAGCTGCAATCTGCGATCAAAAGTCTTCATTCCCGCGACATTAACGTTTACGGGGATGTGGTCATCAACCACAAAGGCGGCGCTGATGCGACCGAAGATGTAACCGCGGTTGAAGTCGATCCCGCTGACCGCAACCGCGTAATTTCCGGAGAATACCTAATTAAAGCCTGGACACATTTTCATTTTCCGGGGCGCGGCAGCACATACAGCGATTTTAAATGGCATTGGTACCATTTTGACGGAACCGATTGGGACGAGTCCCGAAAGCTGAACCGCATCTATAAGTTTCAAGGAAAGGCTTGGGATTGGGAAGTTTCCAGTGAAAACGGCAACTATGATTATTTGATGTATGCCGACATCGATTATGACCATCCTGATGTCGTAGCAGAAATTAAGAGATGGGGCACTTGGTATGCCAATGAGCTCCAATTGGACGGTTTCCGTCTTGATGCTGTCAAACACATTAAATTTTCTTTTTTGCGGGATTGGGTTAATCATGTCAGGGAAAAAACGGGGAAGGAAATGTTTACGGTAGCTGAATATTGGCAGAATGACTTGGGCGCGCTGGAAAACTATTTGAACAAAACAAATTTTAATCATTCAGTGTTTGACGTGCCGCTTCATTATCAGTTCCATGCTGCATCGACACAGGGAGGCGGCTATGATATGAGGAAATTGCTGAACGGTACGGTCGTTTCCAAGCATCCGTTGAAATCGGTTACATTTGTCGATAACCATGATACACAGCCGGGGCAGTCGCTTGAGTCGACTGTCCAAACATGGTTTAAGCCGCTTGCTTACGCTTTTATTCTCACAAGGGAATCTGGATACCCTCAGGTTTTCTACGGGGATATGTACGGGACGAAAGGAGACTCCCAGCGCGAAATTCCTGCCTTGAAACACAAAATTGAACCGATCTTAAAAGCGAGAAAACAGTATGCGTACGGAGCACAGCATGATTATTTCGACCACCATGACATTGTCGGCTGGACAAGGGAAGGCGACAGCTCGGTTGCAAATTCAGGTTTGGCGGCATTAATAACAGACGGACCCGGTGGGGCAAAGCGAATGTATGTCGGCCGGCAAAACGCCGGTGAGACATGGCATGACATTACCGGAAACCGTTCGGAGCCGGTTGTCATCAATTCGGAAGGCTGGGGAGAGTTTCACGTAAACGGCGGGTCGGTTTCAATTTATGTTCAAAGA

SEQ ID NO：17：SEQ ID NO：1的AmyE的天然信号序列。

MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASAETANKSNE

SEQ ID NO：18：引物PSTAMYE-F

CTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCTTCAGCACTTACAGCACCGTCGATCAAAAGCGGAAC

SEQ ID NO：19：引物AMYENOPST-R

CTGGAGGCACTATCCTGAAGGATTTCTCCGTATTGGAACTCTGCTGATGTATTTGTG

SEQ ID NO：20：引物AMYENOPST-F

CACAAATACATCAGCAGAGTTCCAATACGGAGAAATCCTTCAGGATAGTGCCTCCAG

SEQ ID NO：21：引物HPAIAMYE-R

CAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTCAATGGGGAAGAGAACCGCTTAAGCCCGAGTC

SEQ ID NO：22：引物HPAIAMYE466-R

CAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTCAATCAGGATAAAGCACAGCTACAGACCTGG

SEQ ID NO：23：引物AMYE SEQ-F1

TACACAAGTACAGTCCTATCTG

SEQ ID NO：24：引物AMYESEQ-F2

CATCCTCTGTCTCTATCAATAC

SEQ ID NO：25：全长嗜热脂肪地芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyS；P06279)蛋白质序列。信号序列以粗体显示。

1

AAPFNG TMMQYFEWYL

51  PDDGTLWTKV ANEANNLSSL GITALWLPPA YKGTSRSDVG YGVYDLYDLG

101 EFNQKGAVRT KYGTKAQYLQ AIQAAHAAGM QVYADVVFDH KGGADGTEWV

151 DAVEVNPSDR NQEISGTYQI QAWTKFDFPG RGNTYSSFKW RWYHFDGVDW

201 DESRKLSRIY KFRGIGKAWD WEVDTENGNY DYLMYADLDM DHPEVVTELK

251 SWGKWYVNTT NIDGFRLDAV KHIKFSFFPD WLSDVRSQTG KPLFTVGEYW

301 SYDINKLHNY IMKTNGTMSL FDAPLHNKFY TASKSGGTFD MRTLMTNTLM

351 KDQPTLAVTF VDNHDTEPGQ ALQSWVDPWF KPLAYAFILT RQEGYPCVFY

401 GDYYGIPQYN IPSLKSKIDP LLIARRDYAY GTQHDYLDHS DIIGWTREGV

451 TEKPGSGLAA LITDGPGGSK WMYVGKQHAG KVFYDLTGNR SDTVTINSDG

501 WGEFKVNGGS VSVWVPRKTT VSTIAWSITT RPWTDEFVRW TEPRLVAWP

SEQ ID NO：26：全长地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyL；P06278)蛋白质序列。信号序列以粗体显示。

1

A NLNGTLMQYF  EWYMPNDGQH

51  WKRLQNDSAY LAEHGITAVW IPPAYKGTSQ ADVGYGAYDL YDLGEFHQKG

101 TVRTKYGTKG ELQSAIKSLH SRDINVYGDV VINHKGGADA TEDVTAVEVD

151 PADRNRVISG EHRIKAWTHF HFPGRGSTYS DFKWHWYHFD GTDWDESRKL

201 NRIYKFQGKA WDWEVSNENG NYDYLMYADI DYDHPDVAAE IKRWGTWYAN

251 ELQLDGFRLD AVKHIKFSFL RDWVNHVREK TGKEMFTVAE YWQNDLGALE

301 NYLNKTNFNH SVFDVPLHYQ FHAASTQGGG YDMRKLLNST VVSKHPLKAV

351 TFVDNHDTQP GQSLESTVQT WFKPLAYAFI LTRESGYPQV FYGDMYGTKG

401 DSQREIPALK HKIEPILKAR KQYAYGAQHD YFDHHDIVGW TREGDSSVAN

451 SGLAALITDG PGGAKRMYVG RQNAGETWHD ITGNRSEPVV INSEGWGEFH

501 VNGGSVSIYV QR

SEQ ID NO：27：全长枯草芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyE；NP_388186).信号序列以粗体显示。

1

LTAPSIKSG

51  TILHAWNWSF NTLKHNMKDI HDAGYTAIQT SPINQVKEGN QGDKSMSNWY

101 WLYQPTSYQI GNRYLGTEQE FKEMCAAAEE YGIKVIVDAV INHTTSDYAA

151 ISNEVKSIPN WTHGNTQIKN WSDRWDVTQN SLLGLYDWNT QNTQVQSYLK

201 RFLDRALNDG ADGFRFDAAK HIELPDDGSY GSQFWPNITN TSAEFQYGEI

251 LQDSASRDAA YANYMDVTAS NYGHSIRSAL KNRNLGVSNI SHYASDVSAD

301 KLVTWVESHD TYANDDEEST WMSDDDIRLG WAVIASRSGS TPLFFSRPEG

351 GGNGVRFPGK SQIGDRGSAL FEDQAITAVN RFHNVMAGQP EELSNPNGNN

401 QIFMNQRGSH GVVLANAGSS SVSINTATKL PDGRYDNKAG AGSFQVNDGK

451 LTGTINARSV AVLYPDDIAK APHVFLENYK TGVTHSFNDQ LTITLRADAN

501 TTKAVYQINN GPDDRRLRME INSQSEKEIQ FGKTYTIMLK GTNSDGVTRT

551 EKYSFVKRDP ASAKTIGYQN PNHWSQVNAY IYKHDGSRVI ELTGSWPGKP

601 MTKNADGIYT LTLPADTDTT NAKVIFNNGS AQVPGQNQPG FDYVLNGLYN

651 DSGLSGSLPH

SEQ ID NO：28：全长枯草芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyE；NCBI登录号ABW75769)

1   MFAKRFKTSL LPLFAGFLLL FHLVLAGPAA ASAETANKSN ELTAPSIKSG

51  TILHAWNWSF NTLKHNMKDI HDAGYTAIQT SPINQVKEGN QGNKSMSNWY

101 WLYQPTSYQI GNRYLGTEQE FKEMCAAAEE YGIKVIVDAV INHTTSDYAA

151 ISNEIKSIPN WTHGNTQIKN WSDRWDVTQN SLLGLYDWNT QNTQVQSYLK

201 RFLERALNDG ADGFRFDAAK HIELPDDGSY GSQFWPNITN TSAEFQYGEI

251 LQDSASRDAA YANYMNVTAS NYGHSIRSAL KNRNLGVSNI SHYASDVSAD

301 KLVTWVESHD TYANDDEEST WMSDDDIRLG WAVIASRSGS TPLFFSRPEG

351 GGNGVRFPGK SQIGDRGSAL FEDQAITAVN RFHNVMAGQP EELSNPNGNN

401 QIFMNQRGSH GVVLANAGSS SVSINTPTKL PDGRYDNKAG AGSFQVNDGK

451 LTGTINARSV AVLYPDDIAK APHVFLENYK TGVTHSFNDQ LTITLRADAN

501 TTKAVYQINN GPETAFKDGD QFTIGKGDPF GKTYTIMLKG TNSNGVTKAE

551 EYSFVKRDPA SAKTIGYQNP NHWSQVNAYI YKHDGSRAIE LTGSWPGKPM

601 TKNADGIYTL TLPADTDTTN AKVIFNNGSA QVPGQNQPGF  DYVQNGLYND

651 SGLSGSLPH

SEQ ID NO：29：全长枯草芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyE；NCBI登录号ABK54355)

1   MFAKRFKTSL LPLFAGFLLL FHLVLAGPAA ASAETANKSN ELTAPSIKSG

51  TILHAWNWSF NTLKHNMKDI HDAGYTAIQT SPINQVKEGN QGDKSMSNWY

101 WLYQPTSYQI GNRYLGTEQE FKEMCAAAEE YGIKVIVDAV INHTTSDYAA

151 ISNEIKSIPN WTHGNTQIKN WSDRWDVTQN SLLGLYDWNT QNTQVQSYLK

201 RFLERALNDG ADGFRFDAAK HIELPDDGSY GSQFWPTITN TSAEFQYGEI

251 LQDSASRDAA YANYMDVTAS NYGHSIRSAL KNRNLGVSNL SHYASDVSAD

301 KLVTWVESHD TYANDDEEST WMSDDDIRLG WAVIASRSGS TPLFFSRPEG

351 GGNGVRFPGK SQIGDRGSAL FEDQAITAVN RFHNVMAGQP EELSNPNGNN

401 QIFMNQRGSH GVVLANAGSS SVSINTATKL PDGRYDNKAG AGSFQVNDGK

451 LTGTINARSV AVLYPDDIAK APHVFLENYK TGVTHSFNDQ LTITLRADAN

501 TTKAVYQINN GPETAFKDGD QFTIGKGDPF GKTYTIMLKG TNSDGVTRAE

551 EYSFVKRDPA SAKTIGYQNP NHWSQVNAYI YKHDGGRAIE LTGSWPGKPM

601 TKNADGIYTL TLPADTDTTN AKVIFNNGSA QVPGQNQPGF DYVQNGLYND

651 SGLSGSLPH

SEQ ID NO：30：全长枯草芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyE；NCBI登录号AAF14358)

1   MFAKRFKTSL LPLFAGFLLL FHLVLAGPAA ASAETANKSN ELTAPSIKSG

51  TILHAWNWSF NTLKHNMKDI HDAGYTAIQT SPINQVKEGN QGDKSMSNWY

101 WLYQPTSYQI GNRYLGTEQE FKEMCAAAEE YGIKVIVDAV INHTTSDYAA

151 ISNEIKSIPN WTHGNTQIKN WSDRWDVTQN SLLGLYDWNT QNTQVQSYLK

201 RFLERALNDG ADGFRFDAAK HIELPDDGSY GSQFWPTITN TSAEFQYGEI

251 LQDSASRDAA YANYMDVTAS NYGHSIRSAL KNRNLGVSNL SHYASDVSAD

301 KLVTWVESHD TYANDDEEST WMSDDDIRLG WAVIASRSGS TPLFFSRPEG

351 GGNGVRFPGK SQIGDRGSAL FEDQAITAVN RFHNVMAGQP EELSNPNGNN

401 QIFMNQRGSH GVVLANAGSS SVSINTATKL PDGRYDNKAG AGSFQVNDGK

451 LTGTINARSV AVLYPDDIAK APHVFLENYK TGVTHSFNDQ LTITLRADAN

501 TTKAVYQINN GPETAFKDGD QFTIGKGDPF GKTYTIMLKG TNSDGVTRAE

551 EYSFVKRDPA SAKTIGYQNP NHWSQVNAYI YKHDGGRAIE LTGSWPGKPM

601 TKNADGIYTL TLPADTDTTN AKVIFNNGSA QVPGQNQPGF DYVQNGLYND

651 SGLSGSLPH

SEQ ID NO：31：全长枯草芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyE；NCBI登录号AAT01440)

1   MFAKRFKTSL LPLFAGFLLL FHLVLAGPAA ASAETANKSN ELTAPSIKSG

51  TILHAWNWSF NTLKHNMKDI HDAGYTAIQT SPINQVKEGN QGDKSMSNWY

101 WLYQPTSYQI GNRYLGTEQE FKEMCAAAEE YGIKVIVDAV INHTTSDYAA

151 ISNEVKSIPN WTHGNTQIKN WSDRWDVTQN SLLGLYDWNT QNTQVQSYLK

201 RFLERALNDG ADGFRFDAAK HIELPDDGSY GSQFWPNITN TSAEFQYGEI

251 LQDSASRDAA YANYMDVTAS NYGHSIRSAL KNRNLGVSNI SHYASDVSAD

301 KLVTWVESHD TYANDDEEST WMSDDDIRLG WAVIASRSGS TPLFFSRPEG

351 GGNGVRFPGK SQIGDRGSAL FEDQAITAVN RFHNVMAGQP EELSNPNGNN

401 QIFMNQRGSH GVVLANAGSS SVSINTPTKL PDGRYDNKAG AGSFQVNDGK

451 LTGTINARSV AVLYPDDIAQ APHVFLENYK TGVTHSFNDQ LTITLRADAN

501 TTKAVYQINN GPETAFKDGD QFTIGKGDPF GKTYTIMLKG TNSDGVTRTE

551 EYSFIKRDPA SAKTIGYQNP NHWSQVNAYI YKHDGGQAIE LTGSWPGKPM

601 TKNADGIYTL TLPADTDTTN AKVIFNNGSA QVPGQNQPGF DYVQNGLYND

651 SGLSGSLPY

SEQ ID NO：32：全长枯草芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyE；NCBI登录号AAZ30064)

1   MFAKRFKTSL LPLFAGFLLL FHLVLAGPNA ANAETANKSN ELTAPSIKSG

51  TILHAWNWSF NTLKHNMKDI HDAGYTAIQT SPINQVKEGN QGNKSMLNWY

101 WLYQPTSYQI GNRYLGTEQE FKEMCAAAEE YGIKVIVDAV INHTTSDYAA

151 ISNEIKSIPN WTHGNTQIKN WSDRWDVTQN SLLGLYDWNT QNTQVQSYLK

201 RFLERALNDG ADGFRFDAAK HIELPDDGSY GSQFWPNITN TSAEFQYGEI

251 LQDSASRDAS YANYMNVTAS NYGHSIRSAL KNRNLGVSNI SHYASDVPAD

301 KLVTWVESHD TYANDDEEST WMSDDDIRLG WAVIASRSGS TPLFFSRPEG

351 GGNGVRFPGK SQIGDRGSAL FEDQAITAVN RFHNVMAGQP EELSNPNGNN

401 QIFMNQRGSH GVVLANAGSS SVSINTPTKL PDGRYDNKAG AGSFQVNDGK

451 LTGTINARSV AVLYPDDIAK APHVFLENYK TGVTHSFNDQ LTITMRADAK

501 TTKAVYQINN GPETAFKDGD QFTIGKGDPF GKTYTIMLKG TNSDGVTRTE

551 EYSFIKRDPA SAKTIGYQNP NHWSQVNAYI YKHDGGQAIE LTGSWPGKPM

601 TKNADGIYTL TLPADTDTTN AKVIFNNGSA QVPGQNQPGF DYVQNGLYND

651 SGLSGSLPH

SEQ ID NO：33：全长枯草芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyE：NCBI登录号AAQ83841)

1   MFAKRFKTSL LPLFAGFLLL FYLVLAGPAA ASAETANKSI ELTAPSIKSG

51  TILHAWNWSF NTLKHNMKDI HDAGYTAIQT SPINQVKEGN QGDKSMSNWY

101 WLYQPTSYQI GNRYLGTEQE FKEMCAAAEE YGIKVIVDAV INHTTSDYAA

151 ISNEVKSIPN WTHGNTQIKN WSDRWDVTQN SLLGLYDWNT QNTQVQSYLK

201 RFLDRALNDG ADGFRFDAAK HIELPDDGSY GSQFWPNITN TSAEFQYGEI

251 LQDSASRDAA YANYMDVTAS NYGHSIRSAL KNRNLGVSNI SHYASDVSAD

301 KLVTWVESHD TYANDDEEST WMSDDDIRLG WAVIASRSGS TPLFFSRPEG

351 GGNGVRFPGK SQIGDRGSAL FEDQAITAVN RFHNVMAGQP EELSNPNGNN

401 QIFMNQRISH GVVLANAGSS SVSINTATKL PDGRYDNKAG AGSFQVNDGK

451 LTGTINARSV AVLYPDDIAK APHVFLENYK TGVTHSFNDQ LTITLRADAN

501 TFIKSIMDQI NXRXRRLRME INSQSEKEIQ FGKTYTIMLK GTNSDGVTRX

551 EKYSLPKRDP ASAKTIGYQN PNHWSQVNAY IYKHDGSREI ELTGSWPGKP

601 MTKNADGIYT LTLPADTDTT NAKVIFNNGY AQVPGQNQPG FDYVLNGLY

SEQ ID NO：34：全长枯草芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyE；NCBI登录号BAA31528)

1   MFEKRFKTSL LPLFAGFLLL FHLVLSGPAA ANAETANKSN KVTASSVKNG

51  TILHAWNWSF NTLTQNMKDI RDAGYAAIQT SPINQVKEGN QGDKSMSNWY

101 WLYQPTSYQI GNRYLGTEQE FKDMCAAAEK YGVKVIVDAV VNHTTSDYGA

151 ISDEIKRIPN WTHGNTQIKN WSDRWDITQN ALLGLYDWNT QNTEVQAYLK

201 GFLERALNDG ADGFRYDAAK HIELPDDGNY GSQFWPNITN TSAEFQYGEI

251 LQDSASRDTA YANYMNVTAS NYGHSIRSAL KNRILSVSNI SHYASDVSAD

301 KLVTWVESHD TYANDDEEST WMSDDDIRLG WAVIGSRSGS TPLFFSRPEG

351 GGNGVRFPGK SQIGDRGSAL FKDQAITAVN QFHNEMAGQP EELSNPNGNN

401 QIFMNQRGSK GVVLANAGSS SVTINTSTKL PDGRYDNRAG AGSFQVANGK

451 LTGTINARSA AVLYPDDIGN APHVFLENYQ TEAVHSFNDQ LTVTLRANAK

501 TTKAVYQINN GQETAFKDGD RLTIGKEDPI GTTYNVKLTG TNGEGASRTQ

551 EYTFVKKDPS QTNIIGYQNP DHWGNVNAYI YKHDGGGAIE LTGSWPGKAM

601 TKNADGIYTL TLPANADTAD AKVIFNNGSA QVPGQNHPGF DYVQNGLYNN

651 SGLNGYLPH

Claims (24)

1.用于糖化淀粉的组合物，其包含葡糖淀粉酶和α-淀粉酶，其中所述α-淀粉酶为枯草芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyE)或AmyE变体，具有与SEQID NO：1有至少约80％序列同一性的氨基酸序列。

2.权利要求1的组合物，其中所述α-淀粉酶包含示于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34的氨基酸序列。

3.权利要求1的组合物，其中所述AmyE变体与具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的AmyE相比具有一种或多种改变的性质。

4.权利要求3的组合物，其中所述一种或多种改变的性质是：底物特异性、底物结合、底物断裂模式、热稳定性、pH/活性曲线、pH/稳定性曲线、针对氧化作用的稳定性、在较低的钙离子(Ca²⁺)水平下的稳定性、比活性或其任意组合。

5.权利要求1的组合物，其还包括植酸酶、支链淀粉酶、β-淀粉酶、真菌α-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶、异淀粉酶或其任意组合。

6.加工淀粉的方法，其包括混合权利要求1的组合物达足以糖化所述淀粉的时间。

7.权利要求6的方法，其还包括生产高果糖玉米糖浆。

8.权利要求7的方法，其中高果糖玉米糖浆生产通过混合葡萄糖异构酶来实现。

9.权利要求6的方法，其还包括发酵所述淀粉以生产乙醇。

10.权利要求9的方法，其中同时进行糖化和发酵。

11.权利要求9的方法，其还包括回收乙醇。

12.权利要求9的方法，其还包括蒸馏所述淀粉以获得乙醇，其中发酵和蒸馏同时地、分开地或相继地进行。

13.糖化淀粉的方法，其包括将葡糖淀粉酶和α-淀粉酶与寡糖或淀粉底物混合，其中所述α-淀粉酶为枯草芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyE)或AmyE变体，具有与SEQ ID NO：1有至少约80％序列同一性的氨基酸序列。

14.权利要求13的方法，其中所述α-淀粉酶包含示于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33，或SEQ ID NO：34的氨基酸序列。

15.权利要求13的方法，其中所述AmyE变体与具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的AmyE相比具有一种或多种改变的性质。

16.权利要求15的方法，其中所述一种或多种改变的性质是：底物特异性、底物结合、底物断裂模式、热稳定性、pH/活性曲线、pH/稳定性曲线、针对氧化作用的稳定性、在较低的钙离子(Ca²⁺)水平下的稳定性、比活性或其任意组合。

17.权利要求13的方法，其中所述葡糖淀粉酶以不高于每克干固形物0.11葡糖淀粉酶单位(GAU/g ds)的量使用。

18.权利要求13的方法，其还包括将植酸酶、支链淀粉酶、β-淀粉酶、真菌α-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶、异淀粉酶或其任意组合与寡糖或淀粉底物混合。

19.权利要求13的方法，其还包括生产高果糖玉米糖浆。

20.权利要求19的方法，其中高果糖玉米糖浆生产通过混合葡萄糖异构酶来实现。

21.权利要求13的方法，其还包括发酵所述淀粉以生产乙醇。

22.权利要求21的方法，其中同时进行糖化和发酵。

23.权利要求21的方法，其还包括回收乙醇。

24.权利要求21的方法，其还包括蒸馏所述淀粉以获得乙醇，其中发酵和蒸馏同时地、分开地或相继地进行。

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