CN104822829A - 具有产麦芽糖特性的淀粉酶 - Google Patents

Abstract

本发明的教导内容提供了一种具有产麦芽糖特性的淀粉酶。还提供了编码所述产麦芽糖淀粉酶及其变体的核酸、表达载体、制剂以及宿主细胞。本发明教导内容的另外的实施例提供了各种使用方法以及制造方法。

Description

具有产麦芽糖特性的淀粉酶

相关专利申请的交叉引用

本专利申请要求于2012年11月20日提交的国际专利申请No.PCT/CN2012/084883的权益，该专利申请的内容据此全文以引用方式并入。

技术领域

本发明的教导内容提供了与新型产麦芽糖淀粉酶相关的组合物和方法。

背景技术

淀粉是直链淀粉(15-30％重量/重量)和支链淀粉(70-85％重量/重量)的混合物。直链淀粉由分子量(MW)为约60,000至约800,000的α-1,4-连接的葡萄糖单元的直链组成。支链淀粉是每24-30个葡萄糖单元含有α-1,6分支点的支链聚合物；其MW可高达一亿。

浓缩右旋糖浆形式的得自淀粉的糖目前通过酶催化法制备，该方法涉及：(1)用α-淀粉酶将固体淀粉液化(或降低粘度)成平均聚合度为约7-10的糊精，以及(2)用淀粉葡糖苷酶(也称为葡糖淀粉酶或GA)将所得的液化淀粉(即淀粉水解物)糖化。所得的糖浆具有高葡萄糖含量。大部分商业生产的葡萄糖浆随后通过酶法异构化为称为异糖浆(isosyrup)的右旋糖/果糖混合物。所得的糖浆也可用微生物(诸如酵母)发酵以产生商品，包括例如乙醇、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、衣康酸、谷氨酸一钠、葡糖酸盐、赖氨酸、其他有机酸、其他氨基酸和其他生物化学品。可同时进行发酵和糖化(即SSF工艺)来实现更大的经济性和效率。

α-淀粉酶通过随机裂解内部的α-1,4-糖苷键来水解淀粉、糖原和相关多糖。α-淀粉酶(特别是来自芽孢杆菌属(Bacilli)的α-淀粉酶)已被用于各种不同的用途，包括淀粉液化和糖化、纺织物退浆、造纸和纸浆工业中的淀粉改性、酿造、烘焙、用于食品工业的糖浆的生产、用于发酵工艺的原料的生产，以及在动物饲料中用于提高消化性。这些酶也可用于在盘碟洗涤和衣物洗涤过程中除去含淀粉污垢和污渍。

麦芽糖是由β-1,4'-糖苷键连接的两种D-吡喃葡萄糖构成的二糖，其在食品/冷冻食品、烘焙、酿造和饮料工业的应用方面具有高商业价值。麦芽糖也是用于制备无热量糖甜味剂麦芽糖醇的底物。高纯度麦芽糖或纯麦芽糖是用于糖尿病患者的静脉注射液的活性组分。用于制备含有不同水平麦芽糖含量(即，<50％麦芽糖(高转化糖浆或低麦芽糖糖浆)、50-55％麦芽糖(高麦芽糖糖浆)、70-75％麦芽糖(非常高麦芽糖)和>80％麦芽糖(超高麦芽糖))的糖浆的商业过程已根据具体应用进行了建立。这些过程的共同因素在于，均涉及具有两个不同步骤(即液化和糖化)的双酶工艺。

以往，淀粉的水解涉及两个酶步骤，以制备葡萄糖糖浆或麦芽糖糖浆。第一个步骤是在高温(>95℃)下的液化步骤，而第二个步骤是糖化步骤。在麦芽糖制备中，第二个步骤被称为麦芽糖糖化并且通常在60℃或60℃以下的温度下发生。在液化步骤中，通常在存在添加的钙的情况下，将不溶性淀粉颗粒在水中浆化，经加热糊化，并由来自芽孢杆菌属物种的热稳定性α-淀粉酶(EC.3.2.1.1，α-1,4’-D-葡聚糖葡聚糖水解酶)水解。来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)(例如，得自杜邦-杰能科(DuPont-Genencor)的FRED或得自诺维信公司(Novozymes)的L-120)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)(例如，得自杜邦-杰能科的XTRA、得自诺维信公司的SC和SUPRA)或地衣芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌的共混物(例如，得自杜邦-杰能科的Clearflow^TMAA或得自诺维信公司的Supra)的细菌衍生的热稳定性α-淀粉酶首先用于在高温(>95℃)、pH 5.2-6.5下将淀粉液化为低DE(右旋糖当量)的可溶性淀粉水解物。在麦芽糖糖化步骤中，通常在低得多的温度下使用产麦芽糖酶，诸如真菌α-淀粉酶(例如，得自杜邦-杰能科的L或得自诺维信公司的800L)、植物β-淀粉酶(例如，得自杜邦-杰能科的BBA或得自Senson公司的Betalase1500L)，以进一步水解可溶性淀粉水解物。对于含有多于60％麦芽糖的麦芽糖糖浆，在液化淀粉的麦芽糖糖化过程中添加诸如支链淀粉酶之类的脱支酶(例如，得自杜邦-杰能科的L-1000、得自诺维信公司的D2或得自诺维信公司的D6)。

发明内容

在一些实施例中，本发明的教导内容提供了一种分离的核酸，该核酸包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的简并变体的核苷酸序列。

在一些实施例中，本发明的教导内容提供了一种分离的核酸，该核酸包含编码由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成的多肽的序列。

在一些实施例中，本发明的教导内容提供了一种分离的核酸，该核酸包含在严格条件下与杂交探针杂交的序列，该杂交探针的核苷酸序列由SEQID NO:1或SEQ ID NO:1的互补序列组成。

在一些实施例中，本发明的教导内容提供了一种分离的核酸，该核酸包含与SEQ ID NO:1至少66％、67％、68％、69％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或99.5％同一的序列。在一些实施例中，本发明的教导内容提供了这样的分离的核酸，其中该核酸编码具有淀粉水解活性的多肽。

在一些实施例中，本发明的教导内容提供了一种分离的核酸，该核酸包含编码与SEQ ID NO:3至少66％、67％、68％、69％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或99.5％同一的多肽的序列，其中所述多肽具有淀粉水解活性。

在一些实施例中，本发明的教导内容提供了一种分离的核酸，该核酸包含编码包含以下的序列的多肽的序列：SEQ ID NO:3或者具有最多至50个保守氨基酸置换的SEQ ID NO:3，其中所述多肽具有淀粉水解活性。

在一些实施例中，本发明的教导内容提供了纯化的多肽，其氨基酸序列包含与SEQ ID NO:3至少66％、67％、68％、69％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或99.5％同一的序列。

在一些实施例中，本发明的教导内容提供了包含SEQ ID NO:3但是具有0至20个保守氨基酸置换的氨基酸序列的纯化多肽。

在一些实施例中，本发明的教导内容提供了包含有效连接至表达控制序列的权利要求1-6中任一项所述的核酸序列的表达载体。在一些实施例中，本发明的教导内容提供了包含这种载体的培养细胞。在一些实施例中，本发明的教导内容提供了包含有效连接至表达控制序列的本发明教导内容的任何核酸的培养细胞。在一些实施例中，本发明的教导内容提供了用由本发明教导内容提供的任何载体转染的培养细胞或所述细胞的子代，其中所述细胞表达核酸以形成多肽。

在一些实施例中，本发明的教导内容提供了制备蛋白质的方法，该方法包括在允许表达多肽的条件下培养由本发明教导内容提供的细胞。

在一些实施例中，本发明的教导内容提供了使用本发明教导内容的多肽的方法，该方法包括在以下任一项中包括所述多肽：淀粉液化、淀粉糖化、纺织物退浆、造纸和纸浆工业中的淀粉改性、酿造、烘焙、用于食品工业的糖浆的生产、用于发酵工艺的原料的生产、动物饲料、以及在盘碟洗涤和/或衣物洗涤过程中除去含淀粉污垢和/或污渍。

在一些实施例中，本发明的教导内容提供了包含本发明教导内容的多肽以及至少一种辅助酶的组合物，所述辅助酶选自植酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、β淀粉酶、异淀粉酶、不同的淀粉酶、α-葡糖苷酶、纤维素酶、木聚糖酶、半纤维素酶、β-葡糖苷酶、转移酶、果胶酶、脂肪酶、角质酶、酯酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶/氧化酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角质酶、漆酶、磷脂酶、溶血磷脂酶、酰基转移酶、过水解酶、芳基酯酶、以及氧化还原酶。

通过本发明的描述和附图，本发明教导内容的组合物和方法的这些方面和其他方面以及实施例将显而易见。

附图说明

图1分图A和分图B示出了根据本发明教导内容的一些实施例的一些示例性数据。

图2分图A和分图B示出了根据本发明教导内容的一些实施例的一些示例性数据。

图3示出了根据本发明教导内容的一些实施例的一些示例性数据。

图4示出了根据本发明教导内容的一些实施例的一些示例性数据。

图5示出了根据本发明教导内容的一些实施例的一些示例性数据。

图6示出了根据本发明教导内容的一些实施例的一些示例性数据。

图7示出了根据本发明教导内容的一些实施例的一些示例性数据。

图8示出了根据本发明教导内容的一些实施例的一些示例性数据。

图9示出了根据本发明教导内容的一些实施例的示例性克隆图谱。

      序列的简要说明

SEQ ID NO:1示出AmyMG的全长核苷酸序列。

SEQ ID NO:2示出AmyMG的天然信号序列的核苷酸序列。

SEQ ID NO:3示出AmyMG的全长氨基酸序列。

SEQ ID NO:4示出天然信号肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:5示出aprE信号核酸序列(带下划线)+AGK核酸序列(斜体)。

SEQ ID NO:6示出aprE信号氨基酸序列(带下划线)+AGK氨基酸序列(斜体)。

具体实施方式

本发明描述了与产麦芽糖淀粉酶相关的组合物和方法。该酶通过实验方法的组合而发现并进行分析，如实例中详细描述的。变体淀粉酶的示例性应用是用于淀粉液化和糖化、用于清洁衣物、盘碟洗涤和其他应用中的含淀粉污渍、用于纺织物处理(例如，退浆)、在动物饲料中用于改善消化性，以及用于烘培和酿造。所述组合物和方法的这些及其他方面在下文详细描述。

在描述本发明组合物和方法的各个方面和实施例之前，描述了如下定义和缩写。

      定义和缩写

根据此“具体实施方式”，应用下面的缩写和定义。注意，除非上下文另有明确指明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指代物。因此，例如，提及“酶”包括多个此种酶，而提及“剂量”，包括提及一个或多个剂量以及本领域技术人员已知的其等同物，等等。

本文档被组织成多个章节，以便于阅读；然而，读者将会知道，在一个章节中进行的陈述可以应用到其他章节。因此，本公开不同章节使用的标题不应理解为限制性的。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。下面提供如下的术语。

      缩写和首字母缩略词

当存在和如果存在时，除非另外指明，否则如下缩写/首字母缩略词具有如下含义：

ABTS        2,2-连氮基-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸

AE或AEO     醇乙氧基化物

AES或AEOS   醇乙氧基硫酸盐

AkAA        白曲霉(Aspergillus kawachii) α-淀粉酶

AnGA        黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖淀粉酶

AOS         α-烯烃磺酸盐

AS          烷基硫酸盐

cDNA        互补DNA

CMC         羧甲基纤维素

DE          右旋糖当量

DNA         脱氧核糖核酸

DPn         具有n个亚单元的多糖聚合度

ds或DS      干固形物

DTMPA       二亚乙基三胺五乙酸

EC          酶学委员会

EDTA        乙二胺四乙酸

EO          环氧乙烷(聚合物片段)

EOF         发酵结束

GA          葡糖淀粉酶

GAU/g ds    葡糖淀粉酶活性单位/克干固形物

HFCS        高果糖玉米糖浆

HgGA        灰腐质霉(Humicola grisea)葡糖淀粉酶

IPTG        异丙基β-D-硫代半乳糖苷

IRS         不溶性残留淀粉

kDa         千道尔顿

LAS         直链烷基苯磺酸盐

LAT、BLA    地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)淀粉酶

MW          分子量

MWU         改良的伍格母单位；1.6×10^-5mg/MWU＝活性单位

NCBI        美国国家生物技术信息中心

NOBS        壬酰基氧基苯磺酸盐

NTA         次氮基乙酸

OxAm        Purastar HPAM 5000L(美国丹尼斯克公司(Danisco US Inc.))

PAHBAH      对羟基苯甲酰肼

PEG         聚乙二醇

pI          等电点

PI          性能指数

ppm         百万分率，例如μg蛋白质/克干固形物

PVA          聚(乙烯醇)

PVP          聚(乙烯吡咯烷酮)

RCF          相对离心/向心力(即x重力)

RNA          核糖核酸

SAS          链烷磺酸盐

SDS-PAGE     十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳

SSF          同时糖化和发酵

SSU/g固形物  可溶性淀粉单位/克干固形物

sp.          物种

TAED         四乙酰乙二胺

Tm           解链温度

TrGA         里氏木霉(Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶

w/v          重量/体积

w/w          重量/重量

v/v          体积/体积

wt％         重量百分比

℃           摄氏度

H₂O          水

dH₂O或DI     去离子水

dIH₂O        去离子水，Milli-Q过滤

g或gm        克

μg           微克

mg           毫克

kg           千克

μL和μl       微升

mL和ml       毫升

mm           毫米

μm           微米

M            摩尔浓度

mM           毫摩尔浓度

μM           微摩尔浓度

U            单位

sec          秒

min          分钟

hr           小时

DO           溶氧

Ncm          牛顿厘米

EtOH         乙醇

eq.          当量

N            当量浓度

uPWA          源自沃氏火球菌(Pyrococcus woesei)的变体α-淀粉酶

PWA           来自沃氏火球菌的α-淀粉酶

MWCO          分子量筛截

SSRL          斯坦福同步加速器辐射光源(Stanford Synchrotron Radiation Lightsource)

PDB           蛋白质数据库

CAZy          碳水化合物活性酶数据库

Tris-HCl      三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐

HEPES         4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸

      定义

术语“产麦芽糖淀粉酶”是指能够从淀粉或水解淀粉产生大量麦芽糖的酶。落入该定义内的有若干种酶。一些例子为：

1)真菌α-淀粉酶，其包括得自丝状真菌菌株的那些，所述菌株包括但不限于曲霉属(Aspergillus)(例如，黑曲霉、白曲霉和米曲霉(A.oryzae))的菌株、木霉属(Trichoderma)物种。(例如，EP 2132307中公开的里氏木霉α-淀粉酶)的菌株、根霉属(Rhisopus)物种的菌株、毛霉属(Mucor)物种的菌株，以及青霉属(Penicillium)物种的菌株。来自米曲霉的商业真菌α-淀粉酶是来自杜邦-杰能科的L和来自诺维信公司的800L。

2)来自黑曲霉的酸稳定真菌淀粉酶(例如，来自新日化公司(ShinNihon Chemicals))。

3)β-淀粉酶可见于如小麦、大麦、黑麦、高粱、大豆、甘薯、水稻之类的植物材料以及如蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymixa)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)之类的微生物、拟南芥(Arabidopsis thaliana)。最常见的商业β-淀粉酶源自大麦，并且以商品名BBA由杜邦-杰能科销售和以商品名Betalase 1500L由Senson公司销售。商业大豆β-淀粉酶是来自长濑产业株式会社(Nagase ChemteX Corporation)的β-淀粉酶#1500S。

4)产麦芽糖淀粉酶(E.C.3.2.1.133)由微生物枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、嗜热嗜碱芽孢杆菌(Bacillus thermoalkalophilus)、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、栖热菌属(Thermus)物种生成。商业产麦芽糖淀粉酶包括但不限于来自诺维信公司的L、来自AB酶制剂公司(AB Enzymes)的XTENDER和来自杜邦-丹尼斯克(DuPont-Danisco)的MAX-LIFE^TMP100。

5)由本发明教导内容提供的产麦芽糖淀粉酶，例如，如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3，以及本文所教导的其变体所示。

如本文所用，术语“酶单位”是指在规定的测定条件下每时间段所形成的产物的量。例如，“葡糖淀粉酶活性单位”(GAU)定义为在60℃、pH 4.2下每小时从可溶性淀粉底物(4％DS)产生1g葡萄糖的酶量。“可溶性淀粉单位”(SSU)是在pH 4.5、50℃下每分钟从可溶性淀粉底物(4％DS)产生1mg葡萄糖的酶量。作为另一个例子，产麦芽糖淀粉酶活性可以糖化力程度(DP°)单位来测量。该测定法基于在pH 4.6和20℃下对淀粉底物进行的30分钟水解。在滴定程序中使用碱性铁氰化物来测量水解时产生的还原糖基。表示为DP程度(DP°)的淀粉糖化酶活性的一个单位被定义为包含在0.1ml 5％样品酶制剂溶液中的酶量，在将样品与100mL底物于20℃下一起孵育1小时时所述酶量将产生足够的还原糖以还原5mL费林溶液。

术语“淀粉”指由植物的复杂多糖碳水化合物构成的任何材料，由具有式(C₆H₁₀O₅)_x(其中X可以是任何数字)的直链淀粉和支链淀粉构成。该术语包括基于植物的材料，诸如谷粒、谷物、草、块茎和根，更具体地讲是从小麦、大麦、玉米、黑麦、水稻、高梁、糠、木薯、小米、蜀黍、马铃薯、甘薯和木薯淀粉获得的材料。术语“淀粉”包括颗粒淀粉。术语“颗粒淀粉”是指生的即未蒸煮过的淀粉，例如尚未经受糊化的淀粉。

关于多肽的术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指不在一个或多个氨基酸位置处包括人为制造的置换、插入或缺失的天然存在的多肽。类似地，关于多核苷酸的术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指不包括人为制造的核苷改变的天然存在的多核苷酸。然而，应注意，编码野生型多肽、亲本多肽或参考多肽的多核苷酸不局限于天然存在的多核苷酸，而涵盖任何编码野生型多肽、亲本多肽或参考多肽的多核苷酸。

对野生型多肽的提及应理解为包括该多肽的成熟形式。“成熟”多肽或其变体是其中信号序列不存在，例如信号序列在该多肽的表达期间或之后从该多肽的不成熟形式切除的多肽或变体。

关于多肽的术语“变体”是指因其包括一个或多个天然存在的或人为制造的氨基酸置换、插入或缺失而不同于指定的野生型多肽、亲本多肽或参考多肽的多肽。类似地，关于多核苷酸的术语“变体”是指核苷酸序列不同于指定的野生型多核苷酸、亲本多核苷酸或参考多核苷酸的多核苷酸。野生型、亲本或参考多肽或多核苷酸的种类从上下文来看将是显而易见的。

就本发明的产麦芽糖淀粉酶而言，“活性”是指产麦芽糖淀粉酶活性，其可如本文所述进行测量。

当关于对象细胞、核酸、蛋白质或载体而使用时，术语“重组”指该对象已从其天然状态经过修饰。因此，例如，重组细胞表达未在天然(非重组)形式的细胞中发现的基因，或者以不同的水平或在不同于自然界中存在的条件下表达天然基因。重组核酸与天然序列相差一个或多个核苷酸和/或有效连接至异源序列，例如表达载体中的异源启动子。重组蛋白可与天然序列相差一个或多个氨基酸和/或与异源序列融合。包含编码淀粉酶的核酸的载体是重组载体。

术语“回收的”、“分离的”和“分开的”是指从如在自然界中发现的那样与其天然相关的至少一种其他材料或组分中移除的化合物、蛋白质(多肽)、细胞、核酸、氨基酸或其他指定的材料或组分。其“分离的”多肽包括但不限于含有异源宿主细胞中表达的分泌多肽的培养发酵液。

术语“纯化的”是指处于相对纯的状态的材料(例如，分离的多肽或多核苷酸)，所述相对纯的状态例如纯度至少约90％、纯度至少约95％、纯度至少约98％或纯度甚至至少约99％。

术语“富集的”是指纯度约50％、纯度至少约60％、纯度至少约70％或纯度甚至至少约70％的材料(例如，分离的多肽或多核苷酸)。

关于酶的术语“热稳定的”和“热稳定性”是指酶在暴露于高温后保持活性的能力。酶(诸如产麦芽糖淀粉酶)的热稳定性是由其半衰期(t_1/2)度量的，所述半衰期以分钟、小时或天为单位给出，在此期间酶活性在限定的条件下损失一半。半衰期可通过测量暴露于(即，经受)高温后残余的淀粉酶活性来计算。

关于酶的“pH范围”是指酶显示出催化活性的pH值范围。

关于酶的术语“pH稳定的”和“pH稳定性”涉及在预定的时间段(例如，15分钟、30分钟、1小时)内酶在宽泛的pH值范围内保持活性的能力。

术语“氨基酸序列”与术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”是同义词，并且可互换使用。当这些氨基酸序列展现活性时，其可称为“酶”。使用氨基酸残基的常规单字母或三字母代码，其中氨基酸序列以标准的氨基端至羧基端取向(即N→C)示出。

术语“核酸”涵盖DNA、RNA、异源双链体和能够编码多肽的合成分子。核酸可为单链或双链的，而且可为化学修饰物。术语“核酸”与“多核苷酸”可互换使用。由于遗传密码具有简并性，故可以使用不止一个密码子来编码特定氨基酸，并且本发明组合物和方法涵盖编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。除非另作说明，否则核酸序列以5'至3'取向示出。

“杂交”是指在印迹杂交技术和PCR技术期间发生的核酸的一条链与互补链形成双链，即与之碱基配对的过程。严格杂交条件的例子有在如下条件下的杂交：65℃和0.1X SSC(其中1X SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸三钠，pH 7.0)。杂交的双链体核酸通过解链温度(T_m)表征，在解链温度下一半杂交的核酸不与互补链配对。双链内的错配核苷酸降低T_m。非常严格的杂交条件包括68℃和0.1X SSC。

“合成”分子通过体外化学合成或酶促合成而生成、而非由生物体生成。

关于细胞使用的术语“转化”、“稳定转化”和“转基因”意指细胞包含整合到其基因组中或作为经多代保留下来的附加体而携带的非天然(例如，异源)核酸序列。

在将核酸序列插入细胞的语境中，术语“引入”意指本领域已知的“转染”、“转化”或“转导”。

“宿主菌株”或“宿主细胞”为已经将表达载体、噬菌体、病毒或其他DNA构建体，包括编码目的多肽(例如，淀粉酶)的多核苷酸引入其中的生物体。示例性宿主菌株是能够表达目的多肽和/或使糖发酵的微生物细胞(例如，细菌、丝状真菌和酵母)。术语“宿主细胞”包括由细胞产生的原生质体。

关于多核苷酸或蛋白质的术语“异源”是指并非天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。

关于多核苷酸或蛋白质的术语“内源”是指天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。

术语“表达”是指基于核酸序列产生多肽的过程。所述过程包括转录和翻译二者。

“选择标记”或“可选标记”是指这样的基因，其能够在宿主中表达以有利于选择携带该基因的宿主细胞。可选标记的例子包括但不限于抗微生物剂(例如，潮霉素、博来霉素或氯霉素)和/或赋予宿主细胞代谢益处(如营养益处)的基因。

“载体”是指设计用来将核酸引入一种或多种细胞类型中的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、盒等等。

“表达载体”是指包含编码目的多肽的DNA序列的DNA构建体，所述编码序列有效连接至能够实现DNA在合适宿主中表达的合适控制序列。这种控制序列可包括实现转录的启动子、任选的控制转录的操纵子序列、编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列、增强子以及控制转录和翻译终止的序列。

术语“有效连接”意指特定组分处于允许它们以预期的方式起作用的关系(包括但不限于并置)。例如，调控序列有效连接至编码序列，使得编码序列的表达受调控序列的控制。

“信号序列”是连接至蛋白质的N-端部分的氨基酸的序列，其促进蛋白质分泌至细胞外。细胞外蛋白质的成熟形式没有信号序列，其在分泌过程期间被切除。

“生物活性”是指具有特定生物活性(如酶活性)的序列。

术语“比活性”是指在特定条件下每单位时间可被酶或酶制剂转化为产物的底物的摩尔数。一般而言，比活性表示为每毫克蛋白质的单位数(U)。

如本文所用，“水硬度”是对存在于水中的矿物质(例如，钙和镁)的量度。

“样片”是其上施有污渍的一块材料，诸如织物。该材料可以是例如由棉、聚酯或天然纤维与合成纤维的混合物制成的织物。该样片还可以是纸，例如滤纸或硝化纤维素，或者是一块硬质材料，诸如陶瓷、金属或玻璃。对于淀粉酶，污渍是基于淀粉的，但是也可以包括血液、乳、墨、草、茶、酒、菠菜、肉汁、巧克力、蛋、奶酪、粘土、颜料、油或这些化合物的混合物。

“小样片”是自样片上用单孔打孔装置切下的部分，或者用定制的96孔打孔装置(其中该多孔打孔模式与标准96孔微量滴定板匹配)切下的部分，或者是以其他方式自样片上取下的部分。样片可以是纺织物、纸、金属或其他合适的材料。小样片可以在其被放入24孔、48孔或96孔微量滴定板的孔之前或之后具有固着的污渍。小样片也可以通过向小块材料施加污渍而制成。例如，小样片可以是直径为5/8英寸或0.25英寸的一块施有污渍的织物。定制的打孔器以使得其同时将96个样片递送至96孔板的所有孔中的方式设计。该装置可以通过简单地向同一96孔板多次上样，而允许向每孔递送不止一个样片。可以设想将多孔打孔装置用于向任何格式的板(包括但不限于24孔、48孔和96孔板)同时递送多个样片。在另一个可设想的方法中，染污的测试平台可以是由金属、塑料、玻璃、陶瓷或另一合适材料制成的、被污物载污体包覆的珠。然后将一个或多个包覆的珠置于含有合适缓冲液和酶的96孔、48孔或24孔板或更大版式的板的孔中。

如本文所用，“包含淀粉酶的培养细胞材料”或类似的用语是指包含淀粉酶作为组分的细胞裂解物或上清液(包含培养基)。细胞材料可以来自出于制备淀粉酶的目的而在培养物中培养的异源宿主。

如本文所用，“序列同一性百分比”意指以默认参数用CLUSTAL W算法比对时，特定序列与指定的参考序列具有至少一定的氨基酸残基同一性百分比。参见Thompson et al.(1994)Nucleic Acids Res.22:4673-4680(Thompson等人，1994年，《核酸研究》，第22卷，第4673-4680页)；CLUSTAL W算法的默认参数为：

空位开放罚分：               10.0

空位延伸罚分：               0.05

蛋白质权重矩阵：             BLOSUM系列

DNA权重矩阵：                IUB

延迟趋异序列％：             40

空位间隔距离：               8

DNA转换权重：                0.50

亲水性残基列表：             GPSNDQEKR

负矩阵使用：                 关闭

残基特异性罚分触发：         打开

亲水性罚分触发：             打开

末端空位间隔罚分触发         关闭。

与参考序列相比，缺失算作非相同残基。任一末端出现的缺失包括在内。例如，缺失成熟的617个残基多肽的C端五个氨基酸的变体相对于该成熟多肽将具有99％的序列同一性百分比(612/617的相同残基×100，四舍五入成最接近的整数)。与成熟多肽具有“至少99％序列同一性”的变体将涵盖这种变体。

“融合”多肽序列经由两个对象多肽序列之间的肽键连接，即有效连接。

术语“丝状真菌”是指真菌亚门(Eumycotina)，特别是盘菌亚门(Pezizomycotina)物种的所有丝状体形式。

术语“聚合度”(DP)是指给定的糖类中无水吡喃葡萄糖单元的数目(n)。DP1的例子是单糖，如葡萄糖和果糖。DP2的例子是二糖，如麦芽糖和蔗糖。术语“DE”或“右旋糖当量”定义为作为糖浆中总碳水化合物的一部分的还原糖即D葡萄糖的百分比。

术语“干固形物含量”(ds)是指以干重百分比计的浆液总固形物。术语“浆液”指含有不溶性固体的水性混合物。

短语“同时糖化和发酵(SSF)”是指生物化学品生产中的工艺，其中在同一工序步骤期间存在微生物有机体诸如产乙醇微生物和至少一种酶诸如淀粉酶。SSF包括在相同反应器容器中同时进行将淀粉底物(颗粒淀粉、液化淀粉或增溶淀粉)水解成糖(包括葡萄糖)和使糖发酵成醇或其他生物化学品或生物材料。

“产乙醇微生物”是指能够将糖或低聚糖转化为乙醇的微生物。

术语“发酵饮料”是指通过包括发酵过程诸如微生物发酵，例如细菌和/或真菌发酵的方法制备的任何饮料。“啤酒”是这种发酵饮料的例子，并且术语“啤酒”意在包含通过含淀粉植物材料的发酵/酿造产生的任何发酵麦芽汁。通常，啤酒专门由麦芽或辅助材料或麦芽和辅助材料的任何组合制备。啤酒的例子包括：完全加麦曲啤酒、在“纯净法”下酿造的啤酒、爱尔啤酒、印度淡啤酒、拉格啤酒、比尔森啤酒、苦啤酒、低麦芽啤酒(第二啤酒)、第三啤酒、干啤酒、薄啤酒、淡啤酒、低酒精啤酒、低卡路里啤酒、波特啤酒、博克啤酒、杜特勃克啤酒(dopplebock)、司陶特啤酒、波特啤酒、麦芽酒、无酒精啤酒、无酒精麦芽酒等，但还有替代形式的谷类和麦芽饮料，如水果味麦芽饮料，例如柑橘味如柠檬、甜橙、酸橙或浆果味麦芽饮料；酒味麦芽饮料，例如伏特加、朗姆酒或龙舌兰味麦芽酒；或咖啡味麦芽饮料，如咖啡因味麦芽酒等。

术语“麦芽”是指任何经制麦(malted)的谷粒，如经制麦的大麦或小麦。

术语“辅助材料”是指不是麦芽如大麦或小麦麦芽的任何含淀粉和/或糖的植物材料。辅助材料的例子包括普通玉米糁、精制玉米糁、酿酒用碾磨酵母、大米、高粱、精制玉米淀粉、大麦、大麦淀粉、去壳大麦、小麦、小麦淀粉、烘焙谷类、谷类薄片、黑麦、燕麦、马铃薯、木薯淀粉、木薯以及糖浆，如玉米糖浆、甘蔗糖浆、转化糖浆、大麦和/或小麦糖浆等。

术语“醪液”是指任何含有淀粉和/或糖的植物材料如制粉用谷物(grist)(例如包括压碎的大麦芽、压碎的大麦)和/或其他辅助材料或它们的组合的水性浆液，随后与水混合以分离成麦芽汁和废糟。

术语“麦芽汁”是指在制浆过程中提取制粉用谷物后的未发酵液体流出物。

“碘阳性淀粉”或“IPS”是指(1)在液化和糖化后未水解的直链淀粉或(2)变陈的淀粉聚合物。当用碘对糖化的淀粉或糖液进行测试时，高DPn直链淀粉或变陈的淀粉聚合物会结合碘并产生特征性蓝色。因而该糖液称为“碘阳性糖”、“蓝色糖”或“蓝糖”。

术语“变陈的淀粉”或“淀粉变陈”是指淀粉糊或凝胶在老化时自发出现的变化。

术语“约”是指参考值±5％。

      另外的突变

在一些实施例中，本发明的产麦芽糖淀粉酶还包含提供进一步的性能或稳定性有益效果的一个或多个突变。示例性的性能有益效果包括但不限于：淀粉底物水解增加、谷粒、谷物或其他淀粉底物液化性能增加、清洁性能增加、热稳定性增加、储存稳定性增加、溶解性增加、pH特征变更、钙依赖性降低、特异性活性增加、底物特异性受到修饰、底物结合受到修饰、pH-依赖性活性受到修饰、pH-依赖性稳定性受到修饰、氧化稳定性增加以及表达增加。在一些情况下，性能有益效果在相对低的温度下实现。在一些情况下，性能有益效果在相对高的温度下实现。

此外，本发明的淀粉酶可包括任何数量的保守性氨基酸置换。示例性的保守性氨基酸置换在下表1中列出。

      表1.保守氨基酸置换

      

读者将会理解，上面提到的保守性突变中的一些可通过遗传操纵来产生，而另一些通过以遗传手段或其他手段将合成的氨基酸引入进多肽中来产生。

本发明的产麦芽糖淀粉酶可以是“前体”、“不成熟的”或“全长的”，在该情形中它们包含信号序列，或“成熟的”，在该情形中它们缺少信号序列。多肽的成熟形式通常是最有用的。除非另有说明，否则本文所用的氨基酸残基编号方式是指各产麦芽糖淀粉酶多肽的成熟形式。本发明的产麦芽糖淀粉酶多肽也可被截短以移除N端或C端，只要所得的多肽保留淀粉酶活性。

本发明的产麦芽糖淀粉酶可以是“嵌合”或“杂合”多肽，因为其包括第一淀粉酶多肽的至少一部分和第二淀粉酶多肽的至少一部分(这种嵌合淀粉酶最近已被“重新发现”为结构域交换淀粉酶)。本发明的淀粉酶还可包含异源信号序列、允许跟踪或纯化的表位等。示例性的异源信号序列来自地衣芽孢杆菌淀粉酶(LAT)、枯草芽孢杆菌(AmyE或AprE)和链霉菌(Streptomyces)CelA。

      编码产麦芽糖淀粉酶多肽的核苷酸

在另一方面，提供了编码产麦芽糖淀粉酶多肽的核酸。该核酸可编码特定的产麦芽糖淀粉酶多肽或与该特定淀粉酶具有指定程度的氨基酸序列同一性的产麦芽糖淀粉酶。

在一个例子中，核酸编码与SEQ ID NO:1具有至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％同一性的产麦芽糖淀粉酶。应当理解，由于遗传密码的简并性，多个核酸可编码相同的多肽。

又如，核酸在严格条件或非常严格条件下与编码下述产麦芽糖淀粉酶的核酸(或与编码下述产麦芽糖淀粉酶的核酸互补的核酸)杂交，所述产麦芽糖淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％同一性。这种严格和非常严格的杂交条件在本文中有所描述。

核酸可编码“全长”(“fl”或“FL”)产麦芽糖淀粉酶(包含信号序列)、仅产麦芽糖淀粉酶的成熟形式(缺少信号序列)或产麦芽糖淀粉酶的截短形式(缺少成熟形式的N端或C端)。

编码产麦芽糖淀粉酶的核酸可在适于在宿主细胞中表达产麦芽糖淀粉酶的载体中有效连接至各种启动子和调节子。示例性启动子来自地衣芽孢杆菌淀粉酶(LAT)、枯草芽孢杆菌(AmyE或AprE)和链霉菌CelA。这种核酸还可连接至其他编码序列，例如用以编码嵌合多肽。

      变体淀粉酶的产生

本发明的产麦芽糖淀粉酶可在宿主细胞中产生，例如通过分泌或细胞内表达来产生。可在产麦芽糖淀粉酶分泌进细胞培养基中后获得包含产麦芽糖淀粉酶的培养细胞材料(例如，全细胞发酵液)。任选地，根据所需的最终产麦芽糖淀粉酶的纯度，可从宿主细胞分离，或甚至从细胞发酵液分离产麦芽糖淀粉酶。可根据本领域所熟知的方法克隆和表达编码产麦芽糖淀粉酶的基因。合适的宿主细胞包括细菌细胞、真菌细胞(包括酵母和丝状真菌)和植物细胞(包括藻类)。特别有用的宿主细胞包括黑曲霉、米曲霉或里氏木霉。其他宿主细胞包括细菌细胞，例如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌，以及链霉菌。

宿主细胞还可表达编码同源或异源葡糖淀粉酶(即，与宿主细胞不是同一物种的葡糖淀粉酶)或一种或多种其他酶的核酸。葡糖淀粉酶可以是变体葡糖淀粉酶，如例如美国专利No.8,058,033(美国丹尼斯克公司)中所公开的葡糖淀粉酶变体中的一者。另外，宿主可表达一种或多种辅助性酶、蛋白质、肽。这些可有益于液化、糖化、发酵、SSF等工艺。此外，宿主细胞除了用于消化各种给料的酶外还可产生生物化学品。这种宿主细胞可用于发酵工艺或同时糖化和发酵工艺以减少或消除对添加酶的需要。

      载体

可构建包含编码产麦芽糖淀粉酶的核酸的DNA构建体以在宿主细胞中表达。编码产麦芽糖淀粉酶的代表性核酸包括SEQ ID NO:1。由于众所周知的遗传密码的简并性，编码相同氨基酸序列的变体多核苷酸可以常规技术进行设计和制备。针对特定宿主细胞来优化密码子使用也是本领域众所周知的。可将编码产麦芽糖淀粉酶的核酸掺入到载体中。可用众所周知的转化技术，如下面公开的那些技术将载体转移至宿主细胞。

载体可以是任何可转化进宿主细胞中并且在宿主细胞内复制的载体。例如，作为使载体增殖和扩增的手段可将包含编码产麦芽糖淀粉酶的核酸的载体转化进细菌宿主细胞中并在细菌宿主细胞中复制。还可将载体转化进表达宿主中，使得编码核酸可表达为功能性产麦芽糖淀粉酶。充当表达宿主的宿主细胞可包括例如丝状真菌。美国真菌遗传资源中心(Fungal Genetics StockCenter,FGSC)菌株目录列出了适于在真菌宿主细胞中表达的载体。参见网址为www.fgsc.net的FGSC,Catalogue of Strains,University of Missouri(密苏里大学菌株目录)(2007年1月17日进行了最后的修改)。代表性的载体是pJG153，其为可在细菌宿主中复制的无启动子Cre表达载体。参见Harrisonet al.(June 2011)Applied Environ.Microbiol.77:3916-22(Harrison等人，2011年6月，《应用和环境微生物学》，第77卷，第3916-3922页)。pJG153可用常规技术修饰以包含和表达编码产麦芽糖淀粉酶的核酸。

可将编码产麦芽糖淀粉酶的核酸有效连接至合适的启动子，这使得能在宿主细胞中进行转录。该启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列，并且可以源自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。用于引导编码产麦芽糖淀粉酶的DNA序列转录，尤其是在细菌宿主中转录的示例性启动子是大肠杆菌(E.coli)lac操纵子的启动子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂水解酶基因dagA或celA启动子、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶(amyQ)的启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。对于在真菌宿主中的转录，可用的启动子的例子为那些衍生自编码米曲霉TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、或构巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶的基因的启动子。当在诸如大肠杆菌之类的细菌物种中表达编码产麦芽糖淀粉酶的基因时，可以例如从噬菌体启动子(包括T7启动子和λ噬菌体启动子)选择合适的启动子。适用于在酵母物种中表达的启动子的例子包括但不限于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的Gal 1和Gal 10启动子，以及巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的AOX1或AOX2启动子。cbh1是来自里氏木酶(T.reesei)的内源性诱导型启动子。参见Liu et al.(2008)“Improved heterologousgene expression in Trichoderma reesei by cellobiohydrolase I gene(cbh1)promoter optimization，”Acta Biochim.Biophys.Sin(Shanghai)40(2):158-65(Liu等人，2008年，“在里氏木霉中通过纤维二糖水解酶I基因(cbh1)启动子优化而改善的异源基因表达”，《生物化学与生物物理学报》(上海)，第40卷第2期，第158-165页)。

可将编码序列与信号序列有效连接。编码信号序列的DNA可以是与待表达的产麦芽糖淀粉酶基因天然相关或来自不同属或种的DNA序列。构成DNA构建体或载体的信号序列和启动子序列可被引入进真菌宿主细胞并且可源自相同来源。例如，该信号序列是与cbh1启动子有效连接的cbh1信号序列。

表达载体也可包含与编码变体淀粉酶的DNA序列有效连接的合适转录终止子以及在真核生物中的多腺苷酸化序列。终止序列和多腺苷酸化序列可适宜地源自与启动子相同的来源。

载体还可包含使得载体能在宿主细胞中复制的DNA序列。这类序列的例子是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。

载体还可包含可选标记，例如其产物能补足分离的宿主细胞中的缺陷的基因，诸如来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性(例如，氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的基因。此外，载体可包含曲霉属选择标记，诸如amdS、argB、niaD和xxsC(产生潮霉素抗性的标记)，或者可通过诸如本领域已知的共转化实现选择。参见例如PCT国际专利申请WO 91/17243。

细胞内表达在一些方面可能是有利的，例如当将某些细菌或真菌用作宿主细胞来产生大量用于后续富集或纯化的产麦芽糖淀粉酶时。淀粉酶细胞外分泌进培养基中也可用于制备包含分离的产麦芽糖淀粉酶的培养细胞材料。

表达载体通常包含克隆载体的组分，例如，在选择的宿主生物中允许载体自主复制的元件和用于选择目的的一个或多个表型可检测标记。表达载体通常包含控制核苷酸序列，诸如启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号和任选的阻遏基因或一个或多个激活基因。另外，表达载体可包含编码能够将产麦芽糖淀粉酶靶向至宿主细胞细胞器(诸如过氧化物酶体)、或靶向至特定宿主细胞区室的氨基酸序列的序列。这种靶向序列包括但不限于序列SKL。对于在控制序列引导下的表达，淀粉酶的核酸序列以就表达而言正确的方式有效连接至控制序列。

用于分别连接编码产麦芽糖淀粉酶的DNA构建体、启动子、终止子和其他元件的操作，和用于将它们插入含有复制必需信息的合适载体的操作是本领域技术人员众所周知的(参见例如Sambrook et al.,MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL,2^nd ed.,Cold Spring Harbor,1989,and 3^rded.,2001(Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》，第2版，冷泉港实验室出版社，1989年，以及第3版，2001年))。

      宿主细胞的转化和培养

包含DNA构建体或表达载体的分离的细胞有利地在产麦芽糖淀粉酶的重组生产中用作宿主细胞。可用编码该酶的DNA构建体，方便地通过将该DNA构建体(以一个或多个拷贝)整合进宿主染色体中来转化该细胞。通常认为这种整合是有利的，因为DNA序列更有可能在细胞中稳定地维持。可根据常规方法，例如通过同源或异源重组，来进行将DNA构建体整合进宿主染色体中。作为另外一种选择，可用与不同类型的宿主细胞有关的上述表达载体转化细胞。

合适的细菌宿主生物体的例子为革兰氏阳性细菌物种，诸如芽孢杆菌科(Bacillaceae)(包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)(之前称为嗜热脂肪芽孢杆菌)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)；链霉菌属物种，诸如鼠灰链霉菌(Streptomycesmurinus)；乳酸菌物种，包括乳球菌属(Lactococcus)物种如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)；乳杆菌属(Lactobacillus)物种，包括罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)；明串珠菌属(Leuconostoc)物种；片球菌属(Pediococcus)物种；以及链球菌属(Streptococcus)物种。作为另外一种选择，可以选择属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(包括大肠杆菌)或者属于假单胞菌科(Pseudomonadaceae)的革兰氏阴性细菌物种的菌株作为宿主生物。

可从生物工艺学相关的酵母物种中选择合适的酵母宿主生物，所述酵母物种诸如但不限于如毕赤酵母属(Pichia)物种、汉逊酵母属(Hansenula)物种，或克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowinia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)物种的酵母物种或酵母属(Saccharomyces)的物种(包括酿酒酵母)，或属于裂殖酵母属的物种，例如粟酒裂殖酵母(S.pombe)物种。甲基营养酵母物种巴斯德毕赤酵母的菌株可以用作宿主生物。作为另外一种选择，宿主生物可以是汉逊酵母属物种。丝状真菌中合适的宿主生物包括曲霉属的物种，例如黑曲霉、米曲霉、塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)或构巢曲霉。作为另外一种选择，镰孢菌属(Fusarium)物种的菌株，例如尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)或根毛霉属(Rhizomucor)物种的菌株，诸如米赫根毛霉可用作宿主生物。其他合适的菌株包括嗜热真菌属(Thermomyces)和毛霉属物种。此外，木霉属物种可用作宿主。适用于转化曲霉属宿主细胞的程序包括例如在EP 238023中所述的程序。由真菌宿主细胞表达的产麦芽糖淀粉酶可以被糖基化，即，将包含糖基部分。糖基化模式可以与野生型产麦芽糖淀粉酶中存在的相同或不同。糖基化的类型和/或程度可赋予酶学特性和/或生化特性的改变。

有利地是从表达宿主缺失基因，其中该基因缺陷可由转化的表达载体补足。可使用已知的方法来获得具有一个或多个失活基因的真菌宿主细胞。可通过完全或部分缺失、通过插入失活或者通过任何其他能使基因对其预定目的而言无功能从而防止该基因表达功能蛋白的手段，来实现基因失活。可缺失来自已被克隆的木霉属物种或其他丝状真菌宿主的任何基因，例如cbh1基因、cbh2基因、egl1基因和egl2基因。可通过用本领域已知的方法将某种形式的待失活的所需基因插入进质粒中来完成基因缺失。

将DNA构建体或载体引入宿主细胞中包括这样的技术，诸如转化、电穿孔、核显微注射、转导、转染(例如，脂质转染介导的或DEAE-糊精介导的转染)、与磷酸钙DNA沉淀物一起孵育、用DNA包被的微粒进行高速轰击，以及原生质体融合。通用的转化技术是本领域已知的。参见例如Sambrook等人，2001年，出处同上。异源蛋白在木霉属中的表达在例如美国专利No.6,022,725中有所描述。关于曲霉属菌株的转化，还可参见Cao etal.(2000)Science 9:991-1001(Cao等人，2000年，《科学》，第9卷，第991页-1001页)。可用载体系统构建遗传上稳定的转化株，从而编码产麦芽糖淀粉酶的核酸稳定地整合进宿主细胞染色体中。然后通过已知的技术选择和纯化转化株。

制备用于转化的木霉属物种，例如可涉及从真菌菌丝体制备原生质体。参见Campbell et al.(1989)Curr.Genet.16:53-56(Campbell等人，1989年，《当代遗传学》，第16卷，第53-56页)。菌丝体可从萌发的营养孢子获得。可用能消化细胞壁的酶处理菌丝体，从而得到原生质体。通过在悬浮介质中存在渗透稳定剂来保护原生质体。这些稳定剂包括山梨醇、甘露糖醇、氯化钾、硫酸镁等。通常，这些稳定剂的浓度在0.8M和1.2M之间变动，例如可将1.2M的山梨醇溶液用于悬浮介质中。

DNA摄取进宿主木霉属物种菌株中取决于钙离子浓度。通常，摄取溶液中使用约10-50mM CaCl₂。另外的合适的化合物包括缓冲体系，诸如TE缓冲液(10mM Tris,pH 7.4；1mM EDTA)或10mM MOPS(pH 6.0)和聚乙二醇。聚乙二醇据信可融合细胞膜，从而允许介质的内容物得以递送进木霉属物种菌株的细胞质中。该融合经常使质粒DNA的多个拷贝整合进宿主染色体中。

通常，木霉属物种的转化通常以10⁵至10⁷/mL、特别是2×10⁶/mL的密度使用已经经历渗透处理的原生质体或细胞。可将100μL体积的在适当溶液(例如，1.2M山梨醇和50mM CaCl₂)中的这些原生质体或细胞与所需的DNA混合。一般而言，向摄取溶液添加高浓度的PEG。可向原生质体悬浮液添加0.1至1体积的25％PEG 4000；然而，向原生质体悬浮液添加约0.25体积是有用的。也可向摄取溶液添加添加剂如二甲基亚砜、肝素、亚精胺、氯化钾等以助于转化。有类似的程序可用于其他的真菌宿主细胞。参见例如美国专利No.6,022,725。

      表达

产生产麦芽糖淀粉酶的方法可包括在有利于产生所述酶的条件下培养如上所述的宿主细胞并从所述细胞和/或培养基回收所述酶。

用于培养细胞的培养基可以是任何适于培养所考虑的宿主细胞和获得产麦芽糖淀粉酶表达的常规培养基。合适的培养基和培养基组分可获自商业供应商或可根据公布的配方(例如，如在美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection)的目录中所述的配方)制备。

从宿主细胞分泌的酶可用于全发酵液制备。在本发明的方法中，使用任何本领域已知的导致产麦芽糖淀粉酶表达的培养方法，可实现重组微生物的耗尽的全发酵液的制备。因此，可将发酵理解为包括在合适培养基中以及在允许淀粉酶表达或分离的条件下进行的在实验室中的摇瓶培养、或在工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批补料发酵或固态发酵)。术语“耗尽的全发酵液”在本文中被定义为发酵材料的未分级分离的内容物，包括培养基、细胞外蛋白(例如酶)和细胞生物质。应当理解，术语“耗尽的全发酵液”还涵盖了已使用本领域熟知的方法裂解的或经透化处理的细胞生物质。

可通过公知的方法从培养基中方便地回收分泌自宿主细胞的酶，所述方法包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，以及借助于诸如硫酸铵之类的盐沉淀培养基中的蛋白质组分，随后使用诸如离子交换层析、亲和色谱等之类的色谱方法。

载体中编码产麦芽糖淀粉酶的多核苷酸可与能够使宿主细胞表达该编码序列的控制序列有效连接，即该载体是表达载体。控制序列可例如通过添加其他转录调控元件进行修饰，从而使控制序列所指导的转录水平对转录调节因子的响应更灵敏。控制序列尤其可包含启动子。

可在允许产麦芽糖淀粉酶表达的合适条件下培养宿主细胞。酶的表达可以是组成型的，使得它们可以连续生产；或可以是诱导型的，从而需要刺激物来引发表达。就诱导型表达而言，蛋白质产生可在需要时通过例如向培养基添加诱导物质(例如地塞米松或IPTG或槐糖)来引发。也可以在体外无细胞体系(诸如TNT^TM(普洛麦格公司(Promega))兔网织红细胞体系)中重组产生多肽。

表达宿主也可在适合该宿主的培养基中、在有氧条件下进行培养。可以提供振荡或者搅拌和通气的组合，在适合该宿主的温度例如约25℃至约75℃(例如30℃至45℃)下进行生产，这取决于宿主的需要以及生产所需产麦芽糖淀粉酶的需要。培养可进行约12至约100小时或更长(以及其间的任何小时值，例如24至72小时)。通常，培养发酵液的pH为约4.0至约8.0，这也取决于与产麦芽糖淀粉酶的生产相关的宿主所需的培养条件。

      用于富集和纯化产麦芽糖淀粉酶的方法

发酵、分离和浓缩技术是本领域熟知的，并且可使用常规方法以制备浓缩的含产麦芽糖淀粉酶多肽的溶液。

发酵后，获得发酵液，并通过常规分离技术除去微生物细胞和各种悬浮的固形物(包括残余的发酵原料)以获得产麦芽糖淀粉酶溶液。通常使用过滤、离心、微滤、转鼓真空过滤、超滤、离心并随后进行超滤、提取或色谱法等。

可取的是浓缩含产麦芽糖淀粉酶多肽的溶液以便优化回收率。使用未浓缩的溶液需要增加的孵育时间以便收集富集或纯化的酶沉淀物。

使用常规的浓缩技术浓缩含酶溶液直到获得所需的酶含量。可通过任何本文论述的技术实现含酶溶液的浓缩。富集和纯化的示例性方法包括但不限于旋转真空过滤和/或超滤。

将酶溶液浓缩成浓缩酶溶液直至浓缩的含产麦芽糖淀粉酶多肽的溶液的酶活性处于所需的水平。

可使用例如沉淀剂(诸如金属卤化物沉淀剂)进行浓缩。金属卤化物沉淀剂包括但不限于：碱金属氯化物、碱金属溴化物和这些金属卤化物中两种或更多种的共混物。示例性的金属卤化物包括氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾和这些金属卤化物中两种或更多种的共混物。金属卤化物沉淀剂氯化钠也可用作防腐剂。

金属卤化物沉淀剂以能有效沉淀产麦芽糖淀粉酶的量使用。在常规测试后选择能有效引起酶沉淀的金属卤化物的至少有效量和最适量，以及最大回收率的沉淀条件(包括孵育时间、pH、温度和酶浓度)，对于本领域中的普通技术人员来说将是显而易见的。

一般而言，向浓缩的酶溶液添加至少约5％w/v(重量/体积)至约25％w/v的金属卤化物，通常是至少8％w/v。一般而言，向浓缩的酶溶液添加不超过约25％w/v的金属卤化物，通常是不超过约20％w/v。除了其他方面，金属卤化物沉淀剂的最适浓度将取决于具体产麦芽糖淀粉酶多肽的性质以及其在浓缩的酶溶液中的浓度。

使酶沉淀的另一备选途径是使用有机化合物。示例性的有机化合物沉淀剂包括：4-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸的碱金属盐、4-羟基苯甲酸的烷基酯以及这些有机化合物中两种或更多种的共混物。所述有机化合物沉淀剂的添加可以在添加金属卤化物沉淀剂之前、与其同时或在其后发生，并且两种沉淀剂(有机化合物和金属卤化物)的添加可相继进行或同时进行。

通常，有机沉淀剂选自4-羟基苯甲酸的碱金属盐(如钠或钾盐)和4-羟基苯甲酸的直链或支链烷基酯(其中烷基基团含有1至12个碳原子)以及这些有机化合物中两种或更多种的共混物。有机化合物沉淀剂可以是(例如)4-羟基苯甲酸的直链或支链烷基酯(其中烷基基团含有1至10个碳原子)以及这些有机化合物中两种或更多种的共混物。示例性的有机化合物为4-羟基苯甲酸的直链烷基酯(其中烷基基团含有1至6个碳原子)以及这些有机化合物中两种或更多种的共混物。也可以使用4-羟基苯甲酸的甲酯、4-羟基苯甲酸的丙酯、4-羟基苯甲酸的丁酯、4-羟基苯甲酸的乙酯以及这些有机化合物中两种或更多种的共混物。另外的有机化合物还包括但不限于4-羟基苯甲酸甲酯(名为对羟基苯甲酸甲酯)和4-羟基苯甲酸丙酯(名为对羟基苯甲酸丙酯)，它们也都是淀粉酶防腐剂。有关进一步的描述，参见例如美国专利No.5,281,526。

就pH、温度、产麦芽糖淀粉酶浓度、沉淀剂浓度和孵育时间而言，添加有机化合物沉淀剂提供了沉淀条件高度灵活性的优势。

有机化合物沉淀剂以能通过金属卤化物沉淀剂有效地改善酶沉淀的量使用。按照本公开，在常规测试后选择有机化合物沉淀剂的至少有效量和最适量，以及最大回收率的沉淀条件(包括孵育时间、pH、温度和酶浓度)，对于本领域中的普通技术人员来说将是显而易见的。

一般而言，向浓缩酶溶液添加至少约0.01％w/v的有机化合物沉淀剂，通常是至少约0.02％w/v。一般而言，向浓缩酶溶液添加不超过约0.3％w/v的有机化合物沉淀剂，通常是不超过约0.2％w/v。

可以调节含有金属卤化物沉淀剂和有机化合物沉淀剂的浓缩多肽溶液的pH，该pH将必然取决于待富集或纯化的酶。通常，将pH调节至淀粉酶等电点附近的水平。可将pH调节在低于等电点(pI)约2.5pH单位至高于等电点约2.5pH单位的范围内的某个pH。

获得富集的或纯化的酶沉淀物所需的孵育时间取决于具体酶的性质、酶浓度以及具体沉淀剂及其浓度。通常，有效沉淀酶的时间介于约1至约30小时之间；通常不超过约25小时。在存在有机化合物沉淀剂的情况下，孵育时间还可以减至低于约10小时，在大多数情况下甚至是约6小时。

通常，孵育期间的温度介于约4℃和约50℃之间。通常，在约10℃和约45℃之间(例如，在约20℃和约40℃之间)的温度下进行该方法。用于诱导沉淀的最佳温度根据溶液条件和酶或所用的沉淀剂而变化。

通过搅拌包含酶、所添加的金属卤化物和所添加的有机化合物的溶液来改善富集的或纯化的酶沉淀物的总回收率以及该方法的实施效率。在添加金属卤化物和有机化合物期间，以及在随后的孵育期过程中进行搅拌步骤。合适的搅拌方法包括机械搅拌或振荡、强力通气或任何类似的技术。

在孵育期后，然后将富集或纯化的酶与解离的色素和其他杂质分离，并通过常规分离技术(如过滤、离心、微滤、旋转真空过滤、超滤、压滤、交叉膜微滤、错流膜微滤等)进行收集。可以通过用水洗涤沉淀物获得对酶沉淀物的进一步富集或纯化。例如，用含有金属卤化物沉淀剂的水、或用含有金属卤化物和有机化合物沉淀剂的水来洗涤富集或纯化的酶沉淀物。

在发酵过程中，产麦芽糖淀粉酶多肽集聚在培养发酵液中。为了分离、富集或纯化所需的产麦芽糖淀粉酶，将培养发酵液离心或过滤以除去细胞，并将所得的无细胞液用于酶富集或纯化。在一个实施例中，使用约70％饱和度的硫酸铵对无细胞培养液进行盐析；然后将70％饱和度沉淀级分溶解于缓冲液中并施加至诸如Sephadex G-100柱之类的柱上，并洗脱以回收酶活性级分。为了进一步富集或纯化，可使用诸如离子交换层析之类的常规方法。

富集或纯化的酶可用于衣物洗涤应用和清洁应用。例如，它们可以用于衣物洗涤剂和去渍剂中。可以将它们制成液体(溶液、浆液)或固体(颗粒、粉末)形式的终产品。

富集或纯化的更具体的例子在Sumitani et al.(2000)“New type ofstarch-binding domain:the direct repeat motif in the C-terminal region ofBacillus sp.195α-amylase contributes to starch binding and raw starchdegrading，”Biochem.J.350:477-484(Sumitani等人，2000年，“新型淀粉结合域：芽孢杆菌属物种195号α-淀粉酶的C端区域中的直接重复基序有助于淀粉结合和生淀粉降解”，《生物化学杂志》，第350卷，第477-484页)中有所描述并在这里进行简要概括。用80％饱和度的(NH₄)₂SO₄处理从4升变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)TK24培养上清液获得的酶。通过在10,000×g(20分钟和4℃)下离心而回收沉淀物，并将其重新溶解于含有5mM CaCl₂的20mM Tris/HCl缓冲液(pH 7.0)中。然后用相同的缓冲液对溶解的沉淀物进行透析。然后将透析过的样品施加到先前已用含5mM CaCl₂的20mM Tris/HCl缓冲液(pH 7.0)平衡的Sephacryl S-200柱上，并用相同缓冲液以7mL/h的线性流速洗脱。收集来自该柱的级分，然后评估其按酶测定法和SDS-PAGE判断的活性。按如下方式进一步纯化蛋白质。ToyopearlHW55柱(宾夕法尼亚州蒙哥马利市东曹生命科学公司(Tosoh Bioscience,Montgomeryville,PA)，目录号19812)用含5mM CaCl₂和1.5M(NH₄)₂SO₄的20mM Tris/HCl缓冲液(pH 7.0)平衡。用在含5mM CaCl₂的20mM Tris/HCL缓冲液(pH 7.0)中线性梯度为1.5至0M的(NH₄)₂SO₄洗脱酶。收集活性级分，并且用80％饱和度的(NH₄)₂SO₄使酶沉淀。如上所述对沉淀物进行回收、重新溶解和透析。然后将透析后的样品以60mL/h的流速施加到Mono Q HR5/5柱(安发玛西亚生物技术公司(Amersham Pharmacia)；目录号17-5167-01)，所述柱先前已用含5mM CaCl₂的20mM Tris/HCl缓冲液(pH 7.0)进行了平衡。收集活性级分，并将其添加到1.5M(NH₄)₂SO₄溶液中。使活性酶级分如前所述在Toyopearl HW55柱上重新层析，得到如通过SDS-PAGE确定的均质酶。参见Sumitani et al.(2000)Biochem.J.350:477-484(Sumitani等人，2000年，《生物化学杂志》，第477-484页)，以了解该方法及其变化的一般性讨论。

对于生产规模的回收，可通过用聚合物进行絮凝移除细胞大致如上所述富集或部分纯化产麦芽糖淀粉酶多肽。作为另外一种选择，可使用可用的膜和设备通过微滤、接下来通过超滤浓缩而对该酶进行富集或纯化。然而，对于某些应用，无需对酶进行富集或纯化，并且无需进一步处理即可对全发酵液培养物进行裂解和使用。然后可将酶加工成(例如)颗粒。

      产麦芽糖淀粉酶的组合物和用途

本发明的教导内容提供的产麦芽糖淀粉酶可用于多种工业应用。例如，产麦芽糖淀粉酶可用于淀粉转化工艺，尤其是用于已经经历液化的淀粉的糖化工艺。所需的终产物可以是可通过淀粉底物的酶促转化产生的任何产物。例如，所需产物可以是富含葡萄糖和麦芽糖的糖浆，其可用于其他工艺中，诸如HFCS的制备，或者其可转化成多种其他有用的产物，诸如抗坏血酸中间体(例如，葡糖酸盐、2-酮基-L-古洛糖酸、5-酮基-葡糖酸盐和2,5-二酮基葡糖酸盐)；1,3-丙二醇；芳族氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)；有机酸(例如，乳酸、丙酮酸、琥珀酸、异柠檬酸和草酰乙酸)；氨基酸(例如，丝氨酸和甘氨酸)；抗生素；抗微生物剂；酶；维生素；以及激素。

淀粉转化工艺可以是设计用于制备燃料用酒精或饮用酒精(即，适于饮用的酒精)的发酵工艺的前面步骤或与发酵工艺同时进行。本领域技术人员知道可用于制备这些终产物的各种发酵条件。变体淀粉酶还可用于食品制备的组合物和方法。变体淀粉酶的这些各种用途在下文更详细地描述。

本领域普通技术人员应当理解，各种辅助酶可与本发明教导内容的产麦芽糖酶一起使用，如将是各种应用和上下文中的情况。

在用于产生麦芽糖糖浆的谷物加工领域中，产麦芽糖淀粉酶可用于多种应用中的任一种中，包括2012年3月28日提交的美国临时申请61/616,990中所述的那些。

      来自植物的淀粉底物的制备

本领域普通技术人员熟知可用于制备在本文公开的工艺中使用的淀粉底物的可用方法。例如，可用的淀粉底物可获自块茎、根、茎、豆类、谷类或全谷。更具体而言，颗粒淀粉可以获自玉米、玉米穗轴、小麦、大麦、黑麦、黑小麦、蜀黍、西米、小米、木薯、木薯粉、高粱、稻、豌豆、豆、香蕉或马铃薯。玉米含有约60-68％淀粉；大麦含有约55-65％淀粉；小米含有约75-80％淀粉；小麦含有约60-65％淀粉；并且精白米含有70-72％淀粉。具体设想到的淀粉底物有玉米淀粉和小麦淀粉。来自谷类的淀粉可以是磨碎的或者是完整的，包括玉米固形物，诸如玉米籽粒、麩皮和/或穗轴。淀粉也可以是来自淀粉精制加工的高度精制的生淀粉或原料。各种淀粉也可市售获得。例如，玉米淀粉可得自赛力斯达公司(Cerestar)、西格玛公司(Sigma)和日本片山化学工业株式会社(Katayama Chemical Industry Co.)；小麦淀粉可得自西格玛公司；甘薯淀粉可得自日本的和光纯药工业株式会社(Wako PureChemical Industry Co.)；并且马铃薯淀粉可得自日本的Nakaari化学制药公司(Nakaari Chemical Pharmaceutical Co.)。

淀粉底物可以是来自经碾磨的全谷的粗淀粉，其含有非淀粉级分例如残胚和纤维。碾磨可包括湿磨或干磨或研磨。在湿磨中，可将全谷浸泡在水或稀酸中以将谷粒分离为其组成部分，例如淀粉、蛋白质、胚芽、油、籽粒纤维。湿磨能有效地分离胚芽和粗粉(即，淀粉颗粒和蛋白质)，并尤其适合于制备糖浆。在干磨或研磨中，将完整籽粒研磨成细粉并通常在不将谷粒分级为其组成部分的情况下进行加工。在一些情况下，回收来自籽粒的油。干磨谷粒因此除了包含淀粉外还将包含大量的非淀粉碳水化合物。干磨淀粉底物可用于制备乙醇和其他生物化学品。待加工的淀粉可以为高度精制的淀粉质量，例如至少95％、至少90％、至少97％或至少99.5％的纯度。

出于所有目的，本文引用的所有参考文献均全文以引用方式并入本文。为了进一步说明组合物和方法以及它们的优点，给出了以下具体实例，应当理解它们是示例性的，而非限制性的。

      发酵

可溶性淀粉水解产物，尤其是富含葡萄糖的糖浆可通过使淀粉水解产物与发酵生物体，通常在约32℃(如对于产酒精酵母为30℃至35℃)的温度下接触来发酵。发酵的温度和pH将取决于发酵生物体。EOF产物包括代谢物，诸如柠檬酸、乳酸、琥珀酸、谷氨酸一钠、葡糖酸、葡糖酸钠、葡糖酸钙、葡糖酸钾、衣康酸和其他羧酸、葡糖酸δ-内酯、异抗坏血酸钠、赖氨酸和其他氨基酸、ω3脂肪酸、丁醇、异戊二烯、1,3-丙二醇和其他生物材料。

产乙醇微生物包括表达乙醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶的酵母诸如酿酒酵母和细菌，例如运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)。产乙醇微生物可表达可将木糖转化为木酮糖的木糖还原酶和木糖醇脱氢酶。产乙醇微生物的改良菌株(例如，可经受较高的温度)是本领域已知的并且可以使用。参见Liu etal.(2011)Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao 27(7):1049-56(Liu等人，2011年，《生物工程学报》，第27卷，第7期，第1049-1056页)。酵母的商业来源包括(乐斯福公司(LeSaffre))、(莱蒙特公司(Lallemand))、(红星公司(Red Star))、(帝斯曼特殊品公司(DSM Specialties))和(奥特奇公司(Alltech))。通过发酵产生其他代谢物如柠檬酸和乳酸的微生物也是本领域已知的。参见例如Papagianni(2007)“Advances in citric acid fermentation by Aspergillusniger:biochemical aspects,membrane transport and modeling，”Biotechnol.Adv.25(3):244-63(Papagianni，2007年，“通过黑曲霉进行柠檬酸发酵的进展：生物化学方面，膜转运和建模”，《生物技术进展》，第25卷，第3期，第244-263页)；John et al.(2009)“Direct lactic acid fermentation:focus onsimultaneous saccharification and lactic acid production，”Biotechnol.Adv.27(2):145-52(John等人，2009年，“直接乳酸发酵：集中于同时糖化和乳酸制备”，《生物技术进展》，第27卷，第2期，第145-152页)。

糖化和发酵过程可作为SSF工艺进行。发酵可包括例如后续的乙醇富集、纯化和回收。在发酵过程中，发酵液或“啤酒”的乙醇含量可以达到约8-18％v/v，例如14-15％v/v。可蒸馏发酵液以生产富集的(例如，96％纯度的)乙醇溶液。另外，由发酵产生的CO₂可用CO₂洗气器收集、压缩并销售以供其他用途，例如使饮料碳酸化或制备干冰。来自发酵过程的固体废物可用作富含蛋白质的产品，例如家畜饲料。

如上面所提及的，可用在整个SSF期间连续表达和分泌淀粉酶的真菌细胞进行SSF工艺。表达淀粉酶的真菌细胞也可以是发酵微生物，如产乙醇微生物。因而可用表达足够淀粉酶的真菌细胞进行乙醇生产使得需要以外源方式添加较少的酶或不需要以外源方式添加酶。真菌宿主细胞可来自经适当工程改造的真菌菌株。也可使用除了淀粉酶外还表达和分泌其他酶的真菌宿主细胞。这类细胞可表达葡糖淀粉酶和/或支链淀粉酶、植酸酶、α-葡糖苷酶、异淀粉酶、β-淀粉酶、纤维素酶、木聚糖酶、其他半纤维素酶、蛋白酶、β-葡糖苷酶、果胶酶、酯酶、氧化还原酶、转移酶或其他酶。

该工艺的一种变型是“补料分批发酵”系统，其中随着发酵进行以增量添加底物。当分解代谢物阻遏可能会抑制细胞的代谢时和在希望在培养基中具有有限量的底物的情况下，补料分批系统是有用的。补料分批系统中实际底物浓度通过诸如pH、溶氧、废气(诸如CO₂)分压之类的可测量因素的变化估计。分批发酵和补料分批发酵是本领域普通且公知的。

连续发酵是开放系统，其中限定的发酵培养基被连续地添加到生物反应器，并同时移取等量的经调理的培养基用于加工。连续发酵通常以恒定的高密度维持培养物，其中细胞主要处于对数生长期。连续发酵使得能调节细胞生长和/或产物浓度。例如，以固定的比率维持限制性营养物如碳源或氮源，并允许所有其他参数调节。因为生长保持处于稳态，由于培养基抽取引起的细胞损失应该相对于发酵中的细胞生长速率保持平衡。优化连续发酵工艺以及使产物形成速率最大化的方法是工业微生物学领域所熟知的。

      包含产麦芽糖淀粉酶的组合物

可将本发明教导内容的产麦芽糖淀粉酶与葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)，例如木霉属葡糖淀粉酶或其变体组合。示例性的葡糖淀粉酶是具有极佳比活性和热稳定性的里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)及其变体。参见已公布的美国专利申请No.2006/0094080、No.2007/0004018和No.2007/0015266(美国丹尼斯克公司)。TrGA的合适变体包括具有葡糖淀粉酶活性且与野生型TrGA具有至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的那些。产麦芽糖淀粉酶可有利地增大由TrGA催化的糖化过程中产生的葡萄糖的收率。

作为另外一种选择，葡糖淀粉酶可以是源自植物(包括藻)、真菌或细菌的另一种葡糖淀粉酶。例如，葡糖淀粉酶可以是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶或其变体(例如Boel et al.(1984)EMBO J.3:1097-1102(Boel等人，1984年，《欧洲分子生物学学会会刊》，第3卷，第1097-1102页)；WO 92/00381；WO 00/04136(诺和诺德公司(Novo Nordisk A/S)))；以及泡盛曲霉葡糖淀粉酶(例如，WO 84/02921(希得公司(Cetus Corp.)))。其他设想的曲霉属葡糖淀粉酶包括具有增强的热稳定性的变体，例如G137A和G139A(Chen etal.(1996)Prot.Eng.9:499-505(Chen等人，1996年，《蛋白质工程》，第9卷，第499-505页))；D257E和D293E/Q(Chen et al.(1995)Prot.Eng.8:575-582(Chen等人，1995年，《蛋白质工程》，第8卷，第575-582页))；N182(Chen et al.(1994)Biochem.J.301:275-281(Chen等人，1994年，《生物化学杂志》，第301卷，第275-281页))；A246C(Fierobe et al.(1996)Biochemistry,35:8698-8704(Fierobe等人，1996年，《生物化学》，第35卷，第8698-8704页))；以及在位置A435和S436中具有Pro残基的变体(Li et al.(1997)Protein Eng.10:1199-1204(Li等人，1997年，《蛋白质工程》，第10卷，第1199-1204页))。其他设想的葡糖淀粉酶包括篮状菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特别是衍生自埃默森篮状菌(T.emersonii)的葡糖淀粉酶(例如，WO 99/28448(诺和诺德公司))、衍生自T.leycettanus的葡糖淀粉酶(例如，美国专利No.RE 32,153(CPC国际有限公司(CPCInternational,Inc.)))、衍生自杜邦篮状菌(T.duponti)或嗜热篮状菌(T.thermophilus)的葡糖淀粉酶(例如，美国专利No.4,587,215)。设想的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)，特别是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(例如，EP 135,138(CPC国际有限公司))和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(例如，WO 86/01831(密西根生物技术研究所(Michigan Biotechnology Institute)))的葡糖淀粉酶。合适的葡糖淀粉酶包括衍生自米曲霉的葡糖淀粉酶，诸如WO 00/04136(诺和诺德公司)中的SEQ ID NO:2中所示的葡糖淀粉酶。市售的葡糖淀粉酶，诸如AMG 200L、AMG 300L、SAN^TMSUPER和AMG^TME(诺维信公司)、300和OPTIDEX L-400(美国丹尼斯克公司)、AMIGASE^TM和AMIGASE^TMPLUS(帝斯曼公司(DSM))、G900(酶生物系统公司(EnzymeBio-Systems))，以及G990ZR(具有低蛋白酶含量的黑曲霉葡糖淀粉酶)也是合适的。其他合适的葡糖淀粉酶包括烟曲霉(Aspergillusfumigatus)葡糖淀粉酶、篮状菌属葡糖淀粉酶、梭孢壳属(Thielavia)葡糖淀粉酶、栓菌属(Trametes)葡糖淀粉酶、嗜热真菌属葡糖淀粉酶、阿太菌属(Athelia)葡糖淀粉酶或腐质霉属(Humicola)葡糖淀粉酶(例如HgGA)。葡糖淀粉酶通常以约0.1-2个葡糖淀粉酶单位(GAU)/g ds，例如约0.16GAU/g ds、0.23GAU/g ds或0.33GAU/g ds的量添加。

可与本发明教导内容的产麦芽糖淀粉酶一起使用的其他合适的酶包括植酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、β淀粉酶、异淀粉酶、不同的α-淀粉酶、α-葡糖苷酶、纤维素酶、木聚糖酶、其他半纤维素酶、β-葡糖苷酶、转移酶、果胶酶、脂肪酶、角质酶、酯酶、氧化还原酶或它们的组合。例如，脱支酶如异淀粉酶(EC 3.2.1.68)可以本领域技术人员熟知的有效量添加。支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)，例如也是合适的。支链淀粉酶通常以100U/kgds添加。另外合适的酶包括蛋白酶，诸如真菌和细菌蛋白酶。真菌蛋白酶包括获自如下的那些：曲霉属，诸如黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉；毛霉属(例如，米赫毛霉(M.miehei))；根霉属；和木霉属。

β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)是外切作用产麦芽糖淀粉酶，其催化1,4-α-糖苷键水解成支链淀粉和相关的葡萄糖聚合物，从而释放麦芽糖。已从多种植物和微生物分离了β-淀粉酶。参见Fogarty et al.(1979)in PROGRESS IN INDUSTRIALMICROBIOLOGY,Vol.15,pp.112-115(Fogarty等人，1979年，《工业微生物学进展》，第15卷，第112-115页)。这些β-淀粉酶具有在40℃至65℃范围内的最佳温度和在约4.5至约7.0范围内的最佳pH。设想的β-淀粉酶包括但不限于来自大麦的β淀粉酶BBA 1500、DBA、Optimalt^TMME、Optimalt^TMBBA(美国丹尼斯克公司)，和Novozym^TMWBA(诺维信公司)。

包含本发明的产麦芽糖淀粉酶的组合物可以是水性或非水性制剂、颗粒、粉末、凝胶、浆液、糊剂等，其还可包含本文所列的另外的酶中的任一者或多者，以及缓冲液、盐、防腐剂、水、共溶剂、表面活性剂等。此类组合物可与已经存在于浆液、水浴、洗涤机器、食品或饮用品等中的内源酶或其他成分(例如内源性植物(包括藻)酶、来自以前的加工步骤的残余酶等)组合发挥作用。

      用于烘焙和食品制备的组合物和方法

本发明的教导内容还涉及包含产麦芽糖淀粉酶的“食品组合物”，包括但不限于食品产品、动物饲料和/或食品/饲料添加剂，以及用于制备这种食品组合物的方法，该方法包括将产麦芽糖淀粉酶与一种或者多种食品成分混合，或该食品组合物和方法的用途。

此外，本发明的教导内容涉及产麦芽糖淀粉酶在制备食品组合物中的用途，其中该食品组合物在添加了本发明的多肽后进行烘焙。如本文所用，术语“烘焙组合物”意指任何在提供烘焙食品产品的工艺中制备的组合物和/或添加剂，包括但不限于烘焙用粉、面团、烘焙添加剂和/或烘焙产品。食品组合物或添加剂可以是液体或固体。

如本文所用，术语“粉(flour)”意指磨碎的或研磨的粮谷。术语“粉”还可意指已经过研磨或捣碎的西米或者块茎产品。在一些实施例中，粉除了磨碎的或者捣碎的谷物或者植物物质外，还可以含有多种组分。另外的组分的一个例子是膨松剂，但这不是对本发明的限制。粮谷包括小麦、燕麦、黑麦和大麦。块茎产品包括木薯(tapioca)粉、木薯(cassava)粉和蛋奶甜羹(custard)粉。术语“粉”还包括研磨的玉米粉、玉蜀黍粗粉、米粉、全粗粉(whole-mealflour)、自起发粉、木薯(tapioca)粉、木薯(cassava)粉、研磨的大米、强化面粉(enriched flower)和蛋奶甜羹粉。

对于粉用于烘焙和食品生产的商业用途和家庭用途而言，重要的是在粉中维持适当水平的α-淀粉酶活性。活性水平过高可能会导致产品粘乎乎和/或粘成团，从而不能上市。α-淀粉酶活性不足的粉可能不含有足够的糖分来使酵母发挥适当功能，从而导致干燥脆性的面包或烘焙产品。因此，可将产麦芽糖淀粉酶本身或者与α淀粉酶组合在一起添加到粉中，以增大粉中的内源α-淀粉酶活性水平。

麦芽糖淀粉酶还可单独添加或者与其他淀粉酶组合在一起添加，以防止或者延缓烘焙产品老化，即内部组织硬化。抗老化淀粉酶的量通常将在0.01-10mg酶蛋白/千克粉的范围内，例如0.5mg/kg ds。可与淀粉酶组合使用的另外的抗老化淀粉酶包括内切淀粉酶，例如来自芽孢杆菌属的细菌内切淀粉酶。另外的淀粉酶可以是另一种产麦芽糖α-淀粉酶(EC 3.2.1.133)，例如来自芽孢杆菌属。是来自脂肪嗜热芽孢杆菌菌株NCIB 11837的示例性产麦芽糖α-淀粉酶，并且在Christophersen et al.(1997)Starch 50:39-45(Christophersen等人，1997年，《淀粉》，第50卷，第39-45页)中有所描述。抗老化内切淀粉酶的其他例子包括源自芽孢杆菌属，如地衣芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌的细菌α-淀粉酶。抗老化淀粉酶可以是外切淀粉酶，诸如β-淀粉酶，例如来自植物来源诸如大豆，或来自细菌来源诸如芽孢杆菌属。

包含产麦芽糖淀粉酶的烘焙组合物还可包含磷脂酶或具有磷脂酶活性的酶。具有磷脂酶活性的酶的活性可用脂肪酶单位(LU)测量。磷脂酶可具有A₁或A₂活性以从磷脂移除脂肪酸，形成溶血磷脂。它可具有或可不具有脂肪酶活性，即对甘油三酯底物的活性。磷脂酶的最适温度通常在30-90℃的范围内，例如30-70℃。添加的磷脂酶可为动物来源，例如来自胰腺例如牛或猪胰腺，蛇毒液或蜂毒液。作为另外一种选择，磷脂酶可为微生物来源，例如来自丝状真菌、酵母或细菌。

磷脂酶以能改进面包在烘焙后的最初时期特别是前24小时的松软性的量添加。磷脂酶的量通常将在0.01-10mg酶蛋白/千克粉的范围内，例如0.1-5mg/kg。也就是说，磷脂酶活性通常将在20-1000LU/kg粉的范围内，其中脂肪酶单位定义为以阿拉伯树胶作为乳化剂和甘油三丁酸酯作为底物，在30℃、pH 7.0下每分钟释放1μmol丁酸所需的酶量。

面团组合物通常包含小麦粗粉或者小麦粉和/或其他类型的粗粉、粉或者淀粉，诸如玉米粉、玉米淀粉、黑麦粗粉、黑麦粉、燕麦粉、燕麦粗粉、大豆粉、高粱粗粉、高粱粉、马铃薯粗粉、马铃薯粉或者马铃薯淀粉。面团可以是新鲜的、冷冻的或者预烘焙的。面团可以是经膨松的面团或者是待进行膨松的面团。面团可以以各种方式进行膨松，诸如通过添加化学膨松剂例如碳酸氢钠，或者通过添加发酵剂，即发酵面团。面团还可通过添加合适的酵母培养物进行膨松，诸如酿酒酵母(面包酵母)的培养物，例如市售的酿酒酵母菌株。

面团还可包含其他常规面团成分，例如蛋白质，诸如乳粉、面筋和大豆；鸡蛋(例如，整只鸡蛋、蛋黄或蛋白)；氧化剂，诸如抗坏血酸、溴酸钾、碘酸钾、偶氮二甲酰胺(ADA)或过硫酸铵；氨基酸，诸如L-半胱氨酸；糖；或者盐，诸如氯化钠、乙酸钙、硫酸钠或硫酸钙。面团还可包含脂肪，例如甘油三酯，诸如颗粒化脂肪或起酥油。面团还可包含乳化剂，诸如甘油单酯或甘油二酯、甘油单酯或甘油二酯的二酰基酒石酸酯、脂肪酸的糖酯、脂肪酸的聚甘油酯、单甘油酯的乳酸酯、单甘油酯的乙酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯或溶血卵磷脂。具体地讲，可不添加乳化剂而制备面团。

面团产品可以是任何经加工的面团产品，包括油炸的、深度油炸的、烘烤的、烘焙的、蒸煮的或煮沸的面团，诸如蒸煮的面包和米饼。在一个实施例中，食品产品是烘焙产品。典型的焙烤(烘焙)产品包括面包，诸如枕形面包、小白面包、奶油小圆甜面包、百吉圈、比萨饼基料等、发面点心、椒盐卷饼、未经发酵的玉米饼、蛋糕、小甜饼、脆饼干、薄脆饼干等。

任选地，可将另外的酶与抗老化淀粉酶和磷脂酶一起使用。另外的酶可以是第二淀粉酶，诸如淀粉葡糖苷酶、β-淀粉酶、环糊精葡聚糖转移酶，或者另外的酶可以是肽酶尤其是外肽酶、转谷氨酰胺酶、脂肪酶、纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、蛋白质二硫键异构酶例如WO 95/00636中公开的蛋白质二硫键异构酶，例如糖基转移酶、分支酶(1,4-α-葡聚糖分支酶)、4-α-葡聚糖转移酶(糊精糖基转移酶)或者氧化还原酶，例如过氧化物酶、漆酶、葡萄糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、脂肪加氧酶、L-氨基酸氧化酶或碳水化合物氧化酶。另外的酶可来自任何来源，包括哺乳动物和植物，特别是微生物(细菌、酵母或者真菌)来源，并且可通过本领域常规使用的技术获得。

木聚糖酶通常来自微生物来源，例如源自细菌或真菌，诸如曲霉属的菌株。木聚糖酶包括例如和其为从里氏木霉生产的市售木聚糖酶制剂。淀粉葡糖苷酶可以为黑曲霉淀粉葡糖苷酶(诸如)。其他可用的淀粉酶产品包括1000或A 5000(丹麦格林斯特公司(Grindsted Products,Denmark))和H或P(帝斯曼公司(DSM))。葡萄糖氧化酶可以是真菌葡萄糖氧化酶，特别是黑曲霉葡萄糖氧化酶(诸如)。示例性的蛋白酶是

该工艺可用于任何种类的从面团制备的烘焙产品，无论是软的还是脆的，无论是白的、浅色的还是深色的。例子有面包，特别是白色的、全粗粉或黑麦面包，通常为枕形面包或小白面包的形式，诸如但不限于法国棍子面包类型的面包、皮塔面包、未经发酵的玉米饼、蛋糕、薄烤饼、脆饼干、小甜饼、大馅饼皮、脆面包、蒸面包、披萨等。

麦芽糖淀粉酶可用于预混合料中，该预混合料包含粉以及抗老化淀粉酶、磷脂酶和/或磷脂。预混合料可含有其他改进面团的和/或改进面包的添加剂，例如任何上述的添加剂，包括酶在内。产麦芽糖淀粉酶可以是包含抗老化淀粉酶和磷脂酶、供用作烘焙添加剂的酶制剂的组分。

酶制剂任选为颗粒或附聚粉末的形式。该制剂可具有窄的粒度分布，超过95％(重量)的颗粒在25-500μm的范围内。颗粒和附聚粉末可通过常规方法制备，例如通过将淀粉酶喷洒到流化床制粒机中的载体上来制备。该载体可由具有合适的粒度的颗粒状芯组成。该载体可以是可溶性的或不溶性的，例如盐(诸如NaCl或硫酸钠)、糖(诸如蔗糖或乳糖)、糖醇(诸如山梨糖醇)、淀粉、大米、玉米糁或大豆。

包封的颗粒，即产麦芽糖淀粉酶颗粒可包含产麦芽糖淀粉酶。为制备包封的产麦芽糖淀粉酶颗粒，可使该酶与食品级脂质接触，该脂质的量足以悬浮全部产麦芽糖淀粉酶颗粒。如本文所用的食品级脂质可以是任何不溶于水但可溶于非极性有机溶剂(诸如烃或二乙醚)的天然有机化合物。合适的食品级脂质包括但不限于饱和或者不饱和的、以脂肪或者油形式存在的甘油三酯。构成饱和甘油三酯的各种脂肪酸及其组合的例子包括但不限于丁酸(衍生自乳脂肪)、棕榈酸(衍生自动物和植物脂肪)和/或硬脂酸(衍生自动物和植物脂肪)。构成不饱和甘油三酯的脂肪酸及其组合的例子包括但不限于棕榈油酸(衍生自动物和植物脂肪)、油酸(衍生自动物和植物脂肪)、亚油酸(衍生自植物油)和/或亚麻酸(衍生自亚麻籽油)。其他合适的食品级脂质包括但不限于衍生自以上所讨论的甘油三酯的甘油单酯和甘油二酯，还有磷脂及糖脂。

将食品级脂质尤其是液体形式的食品级脂质与粉末形式的产麦芽糖淀粉酶颗粒接触，使得脂质材料覆盖至少大多数，例如100％的产麦芽糖淀粉酶颗粒的表面的至少一部分。从而，每个产麦芽糖淀粉酶颗粒单独地被包封在脂质中。例如，全部的或者基本上全部的产麦芽糖淀粉酶颗粒被提供有薄的、连续的脂质包封膜。这可如下来实现：首先将一定量的脂质倒入容器中，然后将产麦芽糖淀粉酶颗粒进行调浆，使得脂质彻底湿润每个产麦芽糖淀粉酶颗粒的表面。短暂搅拌后，回收在其表面上携带有大量脂质的包封产麦芽糖淀粉酶颗粒。如此施加到产麦芽糖淀粉酶颗粒的涂层的厚度，可通过选择所用的脂质类型和当需要时通过重复该操作以形成较厚的膜来进行控制。

可借助于包装混合料来完成该装载的递送介质的保存、处理和掺合。包装混合料可包含包封的产麦芽糖淀粉酶。但是，包装混合料还可含有制造商或者面包师所需的另外成分。在包封的产麦芽糖淀粉酶掺合到面团中后，面包师继续进行该产品的正常生产过程。

包封产麦芽糖淀粉酶颗粒的优点是双重的。首先，对于那些热不稳定的酶，食品级脂质能保护酶免于在烘焙过程中发生热变性。因此，虽然产麦芽糖淀粉酶在醒发和烘焙阶段中得到稳定化和保护，但是它从最终烘焙产品中的保护涂层释放出来，在该产品中水解多葡聚糖中的糖苷键。装载的递送介质还提供活性酶向烘焙产品中的持续释放。也就是说，在烘焙过程之后，活性产麦芽糖淀粉酶继续以能阻碍老化机制从而降低老化机制的速率的速率从保护涂层释放出来。

一般而言，施加到产麦芽糖淀粉酶颗粒的脂质的量可在产麦芽糖淀粉酶总重量的百分之几到该重量的许多倍之间变动，这取决于脂质的性质、脂质被施加到产麦芽糖淀粉酶颗粒的方式、待处理的面团混合物的组成以及所涉及的面团混合操作的激烈程度。

装载的递送介质，即脂质包封的酶以能有效延长烘焙产品的货架期的量添加到用于制备烘焙产品的成分中。面包师会计算为实现期望的抗老化作用而需要的如上所述制备的包封产麦芽糖淀粉酶的量。所需要的包封产麦芽糖淀粉酶的量基于包封的酶的浓度和基于所指定的产麦芽糖淀粉酶与粉的比例来计算。已发现很宽的浓度范围都有效，不过如所讨论的，可观察的抗老化作用的改进与产麦芽糖淀粉酶浓度没有线性对应关系，而在某些最低水平之上，产麦芽糖淀粉酶浓度的大量增加只带来极少的额外改进。在特定烘焙生产中实际使用的产麦芽糖淀粉酶浓度可能比必要的最低量高得多，以给面包师提供一定的保险，防止面包师无意的低测量值误差。酶浓度的下限由面包师希望达到的最低抗老化作用决定。

制备烘焙产品的方法可包括：a)制备脂质包覆的产麦芽糖淀粉酶颗粒，其中基本上全部的产麦芽糖淀粉酶颗粒被包覆；b)混合含粉的面团；c)在混合完成之前将脂质包覆的产麦芽糖淀粉酶添加到面团，并在脂质涂层从产麦芽糖淀粉酶移除之前终止混合；d)让面团醒发；以及e)烘焙面团以提供烘焙产品，其中产麦芽糖淀粉酶在混合、醒发和烘焙阶段中无活性，而在烘焙产品中有活性。

包封的产麦芽糖淀粉酶可在混合循环过程中添加到面团，例如在接近混合循环结束时。包封的产麦芽糖淀粉酶在混合阶段中的能使包封的产麦芽糖淀粉酶充分分布在整个面团中的时间点添加，然而，混合阶段在保护涂层变得从产麦芽糖淀粉酶颗粒脱离下来之前终止。取决于面团的类型和体积以及混合作用和速度，可能需要一分钟到六分钟或者更长时间来将包封的产麦芽糖淀粉酶混合到面团中，但平均为两分钟到四分钟。因此，有几个变量可能决定着精确的程序。首先，包封的产麦芽糖淀粉酶的量应具有这样的总体积，该总体积足以让包封的产麦芽糖淀粉酶遍布在整个面团混合料中。如果包封的产麦芽糖淀粉酶制剂是高度浓缩的，则可能需要在将包封的产麦芽糖淀粉酶添加到面团之前将额外的油添加到预混合料。配方和生产过程可能需要具体的修改；但是，在如下情况下通常可获得良好的结果：将面包面团配料表中指明的油的25％留在面团之外，用作在接近混合循环结束时添加的浓缩包封α-淀粉酶的载体。在面包或者其他烘焙产品中，特别是那些具有低脂肪含量的产品例如法式面包中，占干粉重量大约1％的包封产麦芽糖淀粉酶混合物就足以使包封的α-淀粉酶与面团适当混合。合适的百分比范围很宽，取决于配方、最终产品和每个面包师的生产方法要求。其次，包封的产麦芽糖淀粉酶悬浮物应添加到混合料达足够的时间以便完全混合到面团中，但添加的时间也不要造成过度的机械作用使保护脂质涂层从包封的产麦芽糖淀粉酶颗粒脱离下来。

在本发明的又一个方面，食品组合物是包含产麦芽糖淀粉酶的油、肉、猪油组合物。在此语境中，术语“油/肉/猪油”组合物意指任何分别地基于油、肉或者猪油，从油、肉或者猪油制备和/或含有油、肉或者猪油的组合物。本发明的另一方面涉及制备包含产麦芽糖淀粉酶的油或肉或猪油组合物和/或添加剂的方法，该方法包括将本发明的多肽与油/肉/猪油组合物和/或添加剂成分混合。

在本发明的又一方面，食品组合物是包含产麦芽糖淀粉酶及其变体的动物饲料组合物、动物饲料添加剂和/或宠物食品。本发明还涉及制备这种动物饲料组合物、动物饲料添加剂组合物和/或宠物食品的方法，该方法包括将产麦芽糖淀粉酶及其变体与一种或多种动物饲料成分和/或动物饲料添加剂成分和/或宠物食品成分混合。此外，本发明涉及产麦芽糖淀粉酶在动物饲料组合物和/或动物饲料添加剂组合物和/或宠物食品的制备中的用途。

术语“动物”包括所有非反刍动物和反刍动物。在一个具体的实施例中，动物是非反刍动物，如马和单胃动物。单胃动物的例子包括但不限于猪和豚诸如小猪、生长中的猪、母猪；家禽诸如火鸡、鸭、小鸡、肉鸡、蛋鸡；鱼诸如鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼；以及甲壳类动物如小虾和对虾。在又一个实施例中，动物是反刍动物，包括但不限于牛、小牛、山羊、绵羊、长颈鹿、野牛、驼鹿、麋鹿、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、羚羊、叉角羚和蓝牛。

在本发明的背景下，术语“宠物食品”意在理解为意指以下动物的食品：家养动物，诸如但不限于狗、猫、沙鼠、仓鼠、南美栗鼠、褐鼠、豚鼠；鸟类宠物，诸如金丝雀、长尾小鹦鹉和鹦鹉；爬行类宠物，诸如乌龟、蜥蜴和蛇；以及水生宠物，诸如热带鱼和青蛙。

术语“动物饲料组合物”、“饲料”和“草料”可互换使用并可包含一种或多种选自以下的饲料材料：a)谷类，诸如小粒谷物(例如，小麦、大麦、黑麦、燕麦以及它们的组合)和/或大粒谷物(诸如玉蜀黍或高粱)；b)谷类副产品，诸如玉米蛋白粉、干酒糟及可溶物(DDGS)(尤其是玉米基干酒糟及可溶物(cDDGS))、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)得自诸如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉、鱼粉、干血浆蛋白、肉粉及骨粉、马铃薯蛋白、乳清、椰子核、芝麻之类的来源的蛋白质；d)得自植物和动物来源的油和脂肪；e)矿物质和维生素。

      纺织物退浆组合物及用途

还设想到使用产麦芽糖淀粉酶处理织物(例如，使纺织物退浆)的组合物和方法。织物处理方法是本领域熟知的(参见例如美国专利No.6,077,316)。例如，可通过包括使织物与产麦芽糖淀粉酶在溶液中接触的方法来改善该织物的触感和外观。织物可在压力下用该溶液处理。

可以在纺织物的纺织期间或之后，或在退浆阶段、或一个或多个另外的织物处理步骤期间施加产麦芽糖淀粉酶。在纺织物纺织期间，纺线暴露于相当大的机械张力。在机械织机上纺织之前，经纱通常涂以上浆淀粉或淀粉衍生物以增加其抗张强度以及防止断裂。产麦芽糖淀粉酶可在纺织期间或者之后施加以去除这些上浆淀粉或淀粉衍生物。纺织后，在进一步加工织物之前，可使用产麦芽糖淀粉酶来去除上浆涂层，以确保均匀且耐洗的结果。

产麦芽糖淀粉酶可以单独或与其他退浆化学试剂和/或退浆酶一起用作洗涤添加剂(例如在水性组合物中)以使织物(包括含棉织物)退浆。产麦芽糖淀粉酶也可在用于在靛蓝染色的粗料棉布织物和衣物上产生石洗外观的组合物和方法中使用。为生产衣服，可将织物进行剪裁并缝制成衣服或衣物，之后进行整理。特别是，为生产粗料棉布牛仔服，已开发了不同的酶促整理方法。粗料棉布衣物的整理通常始于酶促退浆步骤，在此期间淀粉分解酶作用于衣服以使织物柔软并使该棉布更易于接受随后的酶促整理步骤。产麦芽糖淀粉酶可用于整理粗料棉布衣物(例如，“生物打磨法”)、酶促退浆及赋予织物柔软性和/或整理工艺的方法中。

      清洁组合物

本发明组合物和方法的一个方面是包含产麦芽糖淀粉酶作为组分的清洁组合物。产麦芽糖淀粉酶多肽可用作用于洗手、衣物洗涤、盘碟洗涤和其他硬质表面清洁的洗涤剂组合物中的组分。

      清洁组合物的综述

优选地，将产麦芽糖淀粉酶以等于或接近淀粉酶在洗涤剂中惯常使用的浓度掺入到洗涤剂中。例如，产麦芽糖淀粉酶多肽可以对应于每升洗涤液/盘碟洗涤液0.00001-1mg(按纯酶蛋白质计算)产麦芽糖淀粉酶的量添加。本文提供示例性配方，如下所示出：

产麦芽糖淀粉酶多肽可作为唯一的酶或与其他酶(包括其他淀粉分解酶)一起成为洗涤剂组合物的组分。照此，其可以无粉尘颗粒、稳定化液体或受保护的酶形式被包含在洗涤剂组合物中。可以例如，如美国专利No.4,106,991和No.4,661,452中所公开的那样来生产无粉尘颗粒，并且可任选地通过本领域已知的方法进行包衣。蜡质包衣材料的例子是平均分子量为1,000至20,000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有12至20个碳原子且其中存在15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯及甘油三酯。例如，GB 1483591中给出了适于通过流化床技术施加的成膜包衣材料的例子。可例如通过添加多元醇(诸如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸，根据已确立的方法来稳定液态酶制剂。其他酶稳定剂是本领域已知的。可根据例如EP 238216中公开的方法来制备受保护的酶。长期以来多元醇被公认为蛋白质的稳定剂，以及用于改善蛋白质的溶解性。

洗涤剂组合物可为任何可用形式，例如作为粉末、颗粒剂、糊剂或液体。液体洗涤剂可以是水性的，通常含有高达约70％的水，以及0％至约30％的有机溶剂。它也可为仅含约30％水的紧致凝胶类型的形式。

洗涤剂组合物包含一种或多种表面活性剂，其中每种都可以是阴离子型、非离子型、阳离子型或两性离子型。洗涤剂将通常含有0％至约50％的阴离子表面活性剂，诸如直链烷基苯磺酸盐(LAS)；α-烯烃磺酸盐(AOS)；烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)(AS)；醇乙氧基硫酸盐(AEOS或AES)；仲链烷磺酸盐(SAS)；α-磺基脂肪酸甲酯；烷基或烯基琥珀酸；或皂。该组合物也可含有0％至约40％的非离子型表面活性剂，诸如醇乙氧基化物(AEO或AE)、羧化的醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺或多羟基烷基脂肪酸酰胺(如例如在WO 92/06154中所述)。

洗涤剂组合物可另外包含一种或多种其他酶，诸如蛋白酶、另一种淀粉分解酶、角质酶、脂肪酶、纤维素酶、果胶酸裂解酶、过水解酶、木聚糖酶、过氧化物酶和/或漆酶，它们可进行任何组合。

洗涤剂可含有约1％至约65％的洗涤剂助洗剂或络合剂，诸如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTMPA)、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)。洗涤剂也可以是无助洗剂的，即基本上不含洗涤剂助洗剂。可以在与酶的稳定性相容的任何组合物中使用酶。通常可以用已知的包封形式(例如通过在水凝胶中造粒或螯合)来保护酶免于遭受有害组分的影响。酶、具体地讲产麦芽糖淀粉酶(具有或不具有淀粉结合域)可在包括衣物洗涤和盘碟洗涤应用、表面清洁剂的多种组合物中使用，以及在用于从淀粉或生物质生成乙醇的组合物中使用。

洗涤剂可包含一种或多种聚合物。例子包括羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯诸如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。

洗涤剂可含有漂白系统，其可包含可与形成过酸的漂白活化剂诸如四乙酰乙二胺(TAED)或壬酰基氧基苯磺酸盐(NOBS)联用的H₂O₂来源(诸如过硼酸盐或过碳酸盐)。作为另外一种选择，漂白系统可包含过氧酸(例如酰胺、酰亚胺或砜类过氧酸)。漂白系统也可为酶漂白系统，例如过水解酶，如在PCT国际专利申请WO 2005/056783中所描述的。

可使用常规的稳定剂来稳定洗涤剂组合物的酶，所述稳定剂为例如多元醇，诸如丙二醇或甘油；糖或糖醇；乳酸；硼酸或硼酸衍生物，诸如芳族硼酸酯；并且可按例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制该组合物。

洗涤剂也可含有其他常规洗涤剂成分，例如织物调理剂，包括粘土、增泡剂、抑泡剂、防腐蚀剂、悬污剂、抗污垢再沉积剂、染料、杀细菌剂、晦暗抑制剂、光亮剂或香料。

pH(在使用浓度下于水性溶液中测量)通常是中性或碱性，例如pH约7.0至约11.0。

以下描述用于包含本发明α-淀粉酶的洗涤剂组合物的具体形式。

      重垢型液体(HDL)衣物洗涤剂组合物

示例性HDL衣物洗涤剂组合物包括去污表面活性剂(10％-40％重量/重量)，其包括阴离子去污表面活性剂(选自直链的或支链的或无规链的、取代的或未取代的烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐和/或它们的混合物)，和任选非离子型表面活性剂(选自直链的或支链的或无规链的、取代的或未取代的烷基烷氧基化醇，例如C₈-C₁₈烷基乙氧基化醇和/或C₆-C₁₂烷基酚烷氧基化物)，其中阴离子去污表面活性剂(亲水指数(HIc)为6.0-9)与非离子型去污表面活性剂的重量比大于1:1。合适的去污表面活性剂还包括阳离子型去污表面活性剂(选自烷基吡啶鎓化合物、烷基季铵化合物、烷基季鏻化合物、烷基三元锍化合物和/或它们的混合物)；两性离子型和/或两亲型去污表面活性剂(选自链烷醇胺硫甜菜碱)；淀粉分解表面活性剂；半极性非离子型表面活性剂以及它们的混合物。

组合物可任选地包括表面活性增强聚合物，该聚合物由两亲型烷氧基化脂清洁聚合物(选自具有支链亲水和疏水性质的烷氧基化聚合物，诸如烷氧基化聚亚烷亚胺，在0.05wt％-10wt％范围内)和/或无规接枝聚合物(通常由亲水主链和疏水侧链构成，所述亲水主链包含选自以下的单体：不饱和C₁-C₆羧酸类、醚类、醇类、醛类、酮类、酯类、糖单元、烷氧基单元、马来酸酐、饱和多元醇诸如甘油以及它们的混合物；所述疏水侧链选自：C₄-C₂₅烷基、聚丙烯、聚丁烯、饱和C₁-C₆单羧酸的乙烯基酯、丙烯酸或甲基丙烯酸的C₁-C₆烷基酯以及它们的混合物)组成。

组合物可包括另外的聚合物，诸如污垢释放聚合物(包括阴离子型封端的聚酯，例如SRP1，呈无规或者嵌段构型的包含至少一个选自糖类、二羧酸、多元醇和它们的组合的单体单元的聚合物，呈无规或者嵌段构型的基于对苯二甲酸乙烯酯的聚合物以及它们的共聚物，例如Repel-o-tex SF、SF-2和SRP6，Texcare SRA100、SRA300、SRN100、SRN170、SRN240、SRN300和SRN325，Marloquest SL)、抗再沉积聚合物(0.1wt％-10wt％，包括羧酸聚合物，诸如包含至少一个选自丙烯酸、马来酸(或马来酸酐)、富马酸、衣康酸、乌头酸、中康酸、柠康酸、亚甲基丙二酸以及它们的任何混合物的单体的聚合物，乙烯吡咯烷酮均聚物和/或聚乙二醇，分子量在500至100,000道尔顿的范围内)；纤维素聚合物(包括那些选自烷基纤维素、烷基烷氧基烷基纤维素、羧基烷基纤维素、烷基羧基烷基纤维素的纤维素聚合物，它们的例子包括羧甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟乙基纤维素、甲基羧甲基纤维素以及它们的混合物)和聚合羧酸酯(诸如马来酸酯/丙烯酸酯无规共聚物或聚丙烯酸酯均聚物)。

组合物还可包括饱和或不饱和的脂肪酸，优选饱和或不饱和的C₁₂-C₂₄脂肪酸(0wt％-10wt％)；沉积助剂(其例子包括多糖，优选呈无规或嵌段构型的纤维素聚合物，聚二烯丙基二甲基卤化铵(DADMAC)以及DAD MAC与乙烯基吡咯烷酮、丙烯酰胺、咪唑、咪唑啉鎓卤化物以及它们的混合物的共聚物，阳离子型瓜耳胶、阳离子型纤维素诸如阳离子型羟乙基纤维素、阳离子型淀粉、阳离子型聚丙烯酰胺以及它们的混合物。

组合物还可包括染料转移抑制剂，其例子包括酞菁锰、过氧化物酶、聚乙烯吡咯烷酮聚合物、聚胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮和N-乙烯咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮和聚乙烯咪唑和/或它们的混合物；螯合剂，其例子包括乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五亚甲基膦酸(DTPMP)、羟基乙烷二膦酸(HEDP)、乙二胺N,N'-二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、丙二胺四乙酸(PDT A)、2-羟基吡啶-N-氧化物(HPNO)、或甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸N,N-二乙酸(N,N-二羧甲基谷氨酸四钠盐(GLDA)、次氮基三乙酸(NTA)、4,5-二羟基-间苯二磺酸、柠檬酸及其任何盐、N-羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、三乙烯四胺六乙酸(TTHA)、N-羟乙基亚氨基二乙酸(HEIDA)、二羟乙基甘氨酸(DHEG)、乙二胺四丙酸(EDTP)以及它们的衍生物。

组合物优选地包含选自以下的酶(通常约0.01wt％活性酶至0.03wt％活性酶)：蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶/氧化酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角质酶、漆酶、磷脂酶、溶血磷脂酶、酰基转移酶、过水解酶、芳基酯酶以及它们的任何混合物。组合物可包括酶稳定剂(其例子包括多元醇诸如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、可逆蛋白酶抑制剂、硼酸或硼酸衍生物，例如芳族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物诸如4-甲酰苯基硼酸)。

组合物任选地包括有机硅或者脂肪酸基抑泡剂；调色染料、钙和镁阳离子、视觉信号成分、抑泡剂(0.001wt％至约4.0wt％)和/或结构剂/增稠剂(0.01wt％至5wt％，选自甘油二酯和甘油三酯、乙二醇二硬脂酸酯、微晶纤维素、纤维素基材料、微纤维纤维素、生物聚合物、黄原胶、结冷胶以及它们的混合物)。

组合物可以是任何液体形式，例如液体或者凝胶形式，或者它们的任何组合。组合物可以是任何单位剂量形式，例如袋剂(pouch)。

      重垢型干/固体(HDD)衣物洗涤剂组合物

示例性HDD衣物洗涤剂组合物包括去污表面活性剂，其包括阴离子去污表面活性剂(例如，直链的或支链的或无规链的、取代的或未取代的烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐和/或它们的混合物)、非离子型去污表面活性剂(例如，直链的或支链的或无规链的、取代的或未取代的C₈-C₁₈烷基乙氧基化物和/或C₆-C₁₂烷基酚烷氧基化物)、阳离子去污表面活性剂(例如烷基吡啶鎓化合物、烷基季铵化合物、烷基季鏻化合物、烷基三元锍化合物以及它们的混合物)、两性离子型和/或两亲型去污表面活性剂(例如链烷醇胺硫甜菜碱)、淀粉分解表面活性剂、半极性非离子型表面活性剂以及它们的混合物；助洗剂，包括无磷助洗剂(例如，沸石助洗剂，其例子包括在0wt％至小于10wt％范围内的沸石A、沸石X、沸石P和沸石MAP)、磷酸盐助洗剂(例如，在0wt％至小于10wt％范围内的三聚磷酸钠)、柠檬酸、柠檬酸盐和次氮基三乙酸、硅酸盐(例如，在0wt％至小于10wt％范围内的硅酸钠或硅酸钾或偏硅酸钠，或者层状硅酸盐(SKS-6))；碳酸盐(例如，在0wt％至小于80wt％范围内的碳酸钠和/或碳酸氢钠)；以及漂白剂，包括光漂白剂(例如，磺化酞菁锌、磺化酞菁铝、呫吨染料以及它们的混合物)、疏水或者亲水漂白活化剂(例如，十二烷酰氧基苯磺酸盐、癸酰氧基苯磺酸盐、癸酰氧基苯甲酸或其盐、3,5,5-三甲基己酰氧基苯磺酸盐、四乙酰基乙二胺-TAED、壬酰氧基苯磺酸盐-NOBS、季腈以及它们的混合物)、过氧化氢源(例如，无机过氧化氢合物盐，其例子包括过硼酸、过碳酸、过硫酸、过磷酸或者过硅酸的单或者四水合钠盐)、预先形成的亲水和/或疏水过酸(例如，过羧酸及盐、过碳酸及盐、过亚胺酸及盐、过氧基一硫酸及盐以及它们的混合物)、和/或漂白催化剂(例如，亚胺漂白促进剂(其例子包括亚胺鎓阳离子和聚离子))、亚胺鎓两性离子、改性胺、改性胺氧化物、N-磺酰亚胺、N-膦酰亚胺、N-酰基亚胺、噻二唑二氧化物、全氟亚胺、环状糖酮以及它们的混合物，以及含金属漂白催化剂(例如，铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子及辅助金属阳离子如锌或铝和螯合剂(sequestrate)诸如乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)和它们的水溶性盐)。

组合物优选地包含酶，例如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶/氧化酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角质酶、漆酶、磷脂酶、溶血磷脂酶、酰基转移酶、过水解酶、芳基酯酶以及它们的任何混合物。

组合物可任选地包括另外的洗涤剂成分，包括香料微胶囊、淀粉包封的调和香料谐香剂(perfume accord)、调色剂(hueing agent)、另外的聚合物，包括织物完整性和阳离子型聚合物、染料锁定成分、织物软化剂、增白剂(例如C.I.荧光增白剂)、絮凝剂、螯合剂、烷氧基化聚胺、织物沉积助剂和/或环糊精。

      自动盘碟洗涤(ADW)洗涤剂组合物

示例性的ADW洗涤剂组合物包括非离子型表面活性剂，包括乙氧基化非离子型表面活性剂、醇烷氧基化表面活性剂、环氧封端的聚(氧基烷基化)醇、或胺氧化物表面活性剂，以0-10重量％的量存在；在5-60％范围内的助洗剂，其包括磷酸盐助洗剂(例如，单磷酸盐、二磷酸盐、三磷酸盐、其他低聚-聚磷酸盐、三聚磷酸钠STPP)和无磷助洗剂(例如，氨基酸基化合物，包括甲基-甘氨酸-二乙酸(MGDA)及其盐和衍生物、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)及其盐和衍生物、亚氨基二琥珀酸(IDS)及其盐和衍生物、羧基甲基菊粉及其盐和衍生物、次氮基三乙酸(NTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、B-丙氨酸二乙酸(B-ADA)及其盐、聚羧酸的均聚物和共聚物及它们的部分或完全中和盐、单聚的聚羧酸和羟基羧酸以及它们的盐，在0.5重量％至50重量％的范围内；磺酸化/羧酸化聚合物，在约0.1重量％至约50重量％范围内，以提供尺寸稳定性；干燥助剂，在约0.1重量％至约10重量％的范围内(例如，聚酯，尤其是阴离子型聚酯，任选地与具有3至6个官能团的另外单体一起——所述官能团通常为有助于缩聚反应的酸、醇或酯官能团，聚碳酸酯-、聚氨酯-和/或聚脲-聚有机硅氧烷化合物或其前体化合物，特别是反应性环状碳酸酯和脲类型)；硅酸盐，在约1重量％至约20重量％的范围内(包括硅酸钠或者硅酸钾，例如二硅酸钠、偏硅酸钠和结晶页硅酸盐；无机漂白剂(例如，过氧化氢合物盐诸如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐)和有机漂白剂(例如，有机过氧酸，包括二酰基和四酰基过氧化物，尤其是二过氧十二烷二酸、二过氧十四烷二酸和二过氧十六烷二酸)；漂白活化剂(即，有机过酸前体，在约0.1重量％至约10重量％的范围内)；漂白催化剂(例如，锰三氮杂环壬烷和相关络合物，Co、Cu、Mn和Fe二吡啶基胺和相关络合物，以及五胺乙酸钴(III)和相关络合物)；金属护理剂，在约0.1重量％至5重量％的范围内(例如，苯并三唑、金属盐和络合物，和/或硅酸盐)；酶，在约0.01mg至5.0mg活性酶/克自动盘碟洗涤剂组合物的范围内(例如，蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶/氧化酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角质酶、漆酶、磷脂酶、溶血磷脂酶、酰基转移酶、过水解酶、芳基酯酶以及它们的混合物)；以及酶稳定剂组分(例如，低聚糖、多糖和无机二价金属盐)。

可以洗涤剂中常规采用的浓度掺入本发明的产麦芽糖淀粉酶多肽。目前设想的是，在洗涤剂组合物中，可以对应于每升洗涤液体0.00001-1.0mg(按纯酶蛋白质计算)淀粉酶多肽的量添加酶。

洗涤剂组合物也可包含其他常规洗涤剂成分，例如抗絮凝剂材料、填充材料、消泡剂、防腐蚀剂、悬污剂、螯合剂、防污垢再沉积剂、脱水剂、染料、杀菌剂、荧光剂、增稠剂和香料。

可以将洗涤剂组合物配制成手洗(人工)或机洗(自动)的衣物洗涤剂组合物，包含适于预处理玷污的织物的洗衣添加剂组合物和漂洗时添加的织物软化剂组合物，或者可配制成用于一般的家居硬质表面清洁操作的洗涤剂组合物，或者配制用于人工或自动的盘碟洗涤操作。

任何本文描述的清洁组合物可以包括任何数目的另外的酶。通常，酶应该与所选择的洗涤剂相容(例如，就最适pH、与其他酶成分或非酶成分的相容性等而言)，并且酶应该以有效量存在。提供如下酶作为例子。

蛋白酶：合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些蛋白酶。包括经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体，以及天然制成的蛋白质。蛋白酶可为丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶、碱性微生物蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶或胰凝乳蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的例子为枯草杆菌蛋白酶，尤其是源自芽孢杆菌属的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(参见例如WO 89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的例子为胰蛋白酶(例如，猪或牛来源的胰蛋白酶)和镰孢菌属(Fusarium)蛋白酶(参见例如WO 89/06270和WO 94/25583)。可用的蛋白酶的例子还包括但不限于WO 92/19729、WO98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946中所述的变体。市售的蛋白酶包括但不限于：PRIMASE^TM、DURALASE^TM、KANNASE^TM和BLAZE^TM(诺和诺德公司和诺维信公司)；MAXACAL^TM、MAXAPEM^TM、PURAFECT OXP^TM、FN2^TM和FN3^TM(美国丹尼斯克公司)。其他示例性蛋白酶包括来自解淀粉酶芽孢杆菌(Bacillus amyloliquifaciens)的NprE和来自纤维单胞菌属(Cellulomonas)物种菌株69B4的ASP。

脂肪酶：合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些脂肪酶。包括经化学修饰、蛋白分解改性或蛋白质工程改造的突变体。可用的脂肪酶的例子包括但不限于来自腐质霉属(同义词为嗜热真菌属)的脂肪酶，例如来自柔毛腐质霉(H.lanuginosa)(疏棉状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus))(参见例如EP258068和EP 305216)、来自特异腐质霉(H.insolens)(参见例如WO 96/13580)的脂肪酶；假单胞菌(Pseudomonas)脂肪酶(例如，来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)的脂肪酶，参见例如EP218272)；洋葱假单胞菌(P.cepacia)脂肪酶(参见例如EP 331376)；施氏假单胞菌(P.stutzeri)脂肪酶(参见例如GB 1,372,034)；荧光假单胞菌(P.fluorescens)脂肪酶；假单胞菌属物种菌株SD 705脂肪酶(参见例如WO95/06720和WO 96/27002)；威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)脂肪酶(参见例如WO 96/12012)；芽孢杆菌属脂肪酶(例如，来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶，参见例如Dartois et al.Biochemica et Biophysica Acta,1131:253-360(1993)(Dartois等人，《生物化学与生物物理学报》，第1131卷，第253-360页，1993年))；嗜热脂肪芽孢杆菌脂肪酶(参见例如JP 64/744992)；或短小芽孢杆菌脂肪酶(参见例如WO 91/16422)。设想用于配方中的另外的脂肪酶变体包括例如在如下专利中所述的那些：WO 92/05249、WO94/01541、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079、WO 97/07202、EP 407225和EP260105。一些市售的脂肪酶包括和LIPOLASE ULTRA^TM(诺和诺德公司和诺维信公司)。

聚酯酶：组合物中可包含合适的聚酯酶，诸如WO 01/34899、WO01/14629和US6933140中所述的那些。

淀粉酶：组合物可与其他淀粉酶(如非生产增强型淀粉酶)组合。这些可包括市售的淀粉酶，诸如但不限于 和BAN^TM(诺和诺德公司和诺维信公司)；和(来自美国丹尼斯克公司)。

纤维素酶：可向组合物添加纤维素酶。合适的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些纤维素酶。包括经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢菌属、梭孢壳属、枝顶孢属(Acremonium)的纤维素酶，例如，美国专利No.4,435,307、No.5,648,263、No.5,691,178、No.5,776,757和WO 89/09259中公开的由特异腐质霉、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)和尖孢镰孢菌产生的真菌纤维素酶。设想使用的示例性纤维素酶为对于纺织物具有颜色护理益处的那些纤维素酶。此类纤维素酶的例子为例如EP 0495257、EP 0531372、WO 96/11262、WO 96/29397和WO 98/08940中所述的纤维素酶。其他例子为纤维素酶变体，诸如WO 94/07998、WO 98/12307、WO 95/24471、PCT/DK98/00299、EP531315、美国专利No.5,457,046、No.5,686,593和No.5,763,254中描述的那些纤维素酶变体。市售的纤维素酶包括和(诺和诺德公司和诺维信公司)，和(美国丹尼斯克公司)，以及KAC-500(B)^TM(花王公司(Kao Corporation))。

过氧化物酶/氧化酶：设想用于组合物中的合适过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。可用的过氧化物酶的例子包括如WO 93/24618、WO 95/10602和WO98/15257中描述的来自鬼伞属(Coprinus)，例如来自灰盖鬼伞(C.cinereus)的过氧化物酶及其变体。市售的过氧化物酶包括例如GUARDZYME^TM(诺和诺德公司和诺维信公司)。

洗涤剂组合物还可以包含2,6-β-D-果聚糖水解酶，其可有效用于移除/清洁家庭和/或工业纺织物/衣物上存在的生物膜。

可通过添加含有一种或多种酶的单独的添加剂，或通过添加包含所有这些酶的组合添加剂而在洗涤剂组合物中包含洗涤剂酶。洗涤添加剂(即单独的添加剂或组合的添加剂)可配制为例如颗粒、液体、浆液等。示例性的洗涤添加剂制剂包括但不限于颗粒，尤其是无粉尘颗粒、液体尤其是稳定的液体或浆液。

可以例如，如美国专利No.4,106,991和No.4,661,452中所公开的那样来生产无粉尘颗粒，并且可任选地通过本领域已知的方法进行包衣。蜡质包衣材料的例子是平均摩尔量为1,000至20,000的聚(环氧乙烷)产品(例如，聚乙二醇(PEG))；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有12至20个碳原子且其中存在15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯、甘油二酯及甘油三酯。例如，GB 1483591中给出了适于通过流化床技术施加的成膜包衣材料的例子。可例如通过添加多元醇(诸如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸，根据已确立的方法来稳定液态酶制剂。可根据EP 238,216中公开的方法来制备受保护的酶。

洗涤剂组合物可以是任何便利的形式，例如条棒状、片、粉末、颗粒、糊状物或液体。液体洗涤剂可以是水性的，通常含有高达约70％的水，以及0％至约30％的有机溶剂。还设想到包含约30％或更少水的紧致洗涤剂凝胶。洗涤剂组合物可任选地包含一种或多种表面活性剂，所述表面活性剂可以是非离子型的，包括半极性和/或阴离子型和/或阳离子型和/或两性离子型的。表面活性剂可以很宽的范围(约0.1重量％至约60重量％)存在。

当包含在洗涤剂中时，洗涤剂通常将含有约1％至约40％的阴离子型表面活性剂，诸如直链烷基苯磺酸盐、α-烯烃磺酸盐、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)、醇乙氧基硫酸盐、仲链烷磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸或皂。

当包含在洗涤剂中时，洗涤剂通常将含有约0.2％至约40％的非离子型表面活性剂，如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺的N-酰基-N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。

洗涤剂可含有0％至约65％的洗涤剂助洗剂或络合剂，诸如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如，来自赫斯特公司的SKS-6)。

洗涤剂可包含一种或多种聚合物。示例性的聚合物包括羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚乙烯基咪唑、聚羧酸酯(例如，聚丙烯酸酯)、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。

可使用常规的稳定剂来稳定洗涤剂组合物的酶，该稳定剂例如多元醇(例如，丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(例如，芳族硼酸酯)或苯基硼酸衍生物(例如，4-甲酰基苯基硼酸)。可如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制所述组合物。

可以设想到，在洗涤剂组合物中，尤其是本发明教导内容的产麦芽糖淀粉酶可以对应于每升洗涤液约0.01至约100mg酶蛋白(例如每升洗涤液约0.05至约5.0mg酶蛋白或每升洗涤液0.1至约1.0mg酶蛋白)的量添加。

      评估洗涤剂组合物中的淀粉酶活性的方法

许多α-淀粉酶清洁测定法是本领域已知的，包括样片测定法和微样片测定法。

      酿造组合物

本发明的产麦芽糖淀粉酶可以是酿造工艺，即制备发酵麦芽饮料中使用的酿造组合物的组分。非可发酵的碳水化合物构成最终啤酒中的溶解固形物的大部分。该残余物保留下来是因为麦芽淀粉酶不能够水解淀粉中的α-1,6-键。非可发酵的碳水化合物贡献约50卡路里/12盎司啤酒。淀粉酶与葡糖淀粉酶和任选与支链淀粉酶和/或异淀粉酶联用，有助于将淀粉转化成糊精和可发酵糖类，从而降低最终啤酒中的残余非可发酵碳水化合物。

用于制备这些饮料的主要原料是水、酒花和麦芽。另外，诸如以下的辅料可用作淀粉源：普通玉米糁、精制玉米糁、酿酒用碾磨酵母、大米、高粱、精制玉米淀粉、大麦、大麦淀粉、去壳大麦、小麦、小麦淀粉、焙烤谷类、谷类薄片、黑麦、燕麦、马铃薯、木薯淀粉以及糖浆，诸如玉米糖浆、甘蔗糖浆、转化糖浆、大麦和/或小麦糖浆等。

出于多种原因，主要从选定的大麦品种生产的麦芽对啤酒的总体特性和质量具有最大的影响。首先，麦芽是啤酒中的主要风味剂。其次，麦芽提供可发酵糖的大部分。第三，麦芽提供蛋白质，蛋白质将有助于啤酒的酒体和泡沫特性。第四，麦芽提供制浆过程中必要的酶活性。酒花也对啤酒质量有重大贡献，包括风味。具体地讲，酒花(或者酒花成分)给啤酒添加期望的苦味物质。此外，酒花充当蛋白质沉淀剂，建立防腐剂并帮助泡沫形成和稳定。

谷物诸如大麦、燕麦、小麦以及植物组分诸如玉米、酒花和水稻也用于酿造，工业酿造和家庭酿造都可使用。用于酿造的组分可以是未经制麦的或者可以是经制麦的，即部分发芽的，导致包括α淀粉酶在内的酶水平提高。对于成功酿造，足够水平的α淀粉酶活性对于确保发酵过程中具有适当水平的糖是必要的。因此，可将淀粉酶本身、或淀粉酶与另一种α淀粉酶的组合添加至用于酿造的组分中。

如本文所用，术语“原材料(stock)”意指被压碎或破碎的谷物和植物组分。例如，用于啤酒生产的大麦是经过粗研磨或者压碎以产生适于生产发酵用醪液的稠度的谷物。本文所用的术语“原材料”包括任何前述类型的压碎或者粗磨形式的植物和谷物。本文描述的方法可用于测定粉和原材料中的产麦芽糖淀粉酶活性水平。

制备啤酒的工艺是本领域熟知的。参见例如Wolfgang Kunze(2004)“Technology Brewing and Malting，”Research and Teaching Institute ofBrewing,Berlin(VLB),3rd edition(Wolfgang Kunze，2004年，《酿造和制麦技术》，酿造研究与教学院，柏林(VLB)，第3版)。简单地讲，该工艺涉及：(a)制备醪液，(b)过滤醪液以制备麦芽汁，以及(c)使麦芽汁发酵以获得发酵饮料，诸如啤酒。通常，将磨碎的或者压碎的麦芽与水混合，并在控制的温度下保持一段时间，以让麦芽中存在的酶将麦芽中存在的淀粉转化为可发酵糖。然后将醪液转移到醪液过滤器，在其中将液体与谷物残余物分离。这种甜液体称为“麦芽汁”，剩余的谷物残余物称为“废糟”。通常将醪液进行提取，其涉及向醪液加水以从废糟回收残余的可溶性提取物。然后将麦芽汁剧烈煮沸，以将麦芽汁灭菌并帮助发展色度、风味和气味。在煮沸过程中的某个时间点加入酒花。将麦芽汁冷却并转移到发酵罐。

然后使麦芽汁在发酵罐中与酵母接触。可将发酵罐冷却以终止发酵。酵母絮凝出来，然后将其去除。最后，将啤酒冷却并保藏一段时间，期间啤酒澄清并发展风味，而任何可能损害啤酒的外观、风味和货架期的物质会沉淀出来。啤酒通常含有约2％至约10％v/v的酒精，不过也可以获得更高酒精含量(例如18％v/v)的啤酒。在包装前，将啤酒充入二氧化碳，并任选地进行过滤和巴氏灭菌。

可将包含产麦芽糖淀粉酶与葡糖淀粉酶组合并任选与支链淀粉酶和/或异淀粉酶组合的酿造组合物添加到以上步骤(a)(即醪液制备过程中)的醪液中。作为另外一种选择，或者除此之外，可将酿造组合物添加到以上步骤(b)(即醪液的过滤过程中)的醪液中。作为另外一种选择，或者除此之外，可将酿造组合物添加到以上步骤(c)(即麦芽汁发酵过程中)的麦芽汁中。

发酵饮料如啤酒可通过以上方法中的一种进行生产。发酵饮料可以是啤酒，诸如完全加麦曲、在“纯净法”下酿造的啤酒、爱尔啤酒、印度淡啤酒(IPA)、拉格啤酒、苦啤酒、低麦芽啤酒(第二啤酒)、第三啤酒、干啤酒、薄啤酒、淡啤酒、低酒精啤酒、低卡路里啤酒、波特啤酒、博克啤酒、司陶特啤酒、麦芽酒、无酒精啤酒、无酒精麦芽酒等，但是还有替代形式的谷类和麦芽饮料，诸如水果味麦芽饮料，例如柑橘味如柠檬、甜橙、酸橙或浆果味麦芽饮料；酒味麦芽饮料，例如伏特加、朗姆酒或龙舌兰味麦芽酒；或咖啡味麦芽饮料，诸如咖啡因味麦芽酒等。

      碘阳性淀粉的降低

当在液化和/或糖化的方法中使用时，本发明教导内容的产麦芽糖淀粉酶可降低碘阳性淀粉(IPS)。IPS的一个来源是来自于逃过水解的直链淀粉和/或来自于变陈的淀粉聚合物。在老化时，淀粉糊或凝胶中会自发出现淀粉变陈，因为淀粉分子有相互结合的趋向，然后结晶度会提高。由于淀粉分子逐渐缔合成更大的粒子，低浓度的溶液变得愈加浑浊。自发沉淀发生，并且沉淀的淀粉看起来回复至其初始的冷水不溶性状态。较高浓度的糊在冷却时凝固成凝胶，其在老化时由于淀粉分子的不断增加缔合而变得不断更坚实。这因为相邻淀粉分子上的羟基之间有强的形成氢键的趋势而引起。参见J.A.Radley,ed.,STARCH AND ITS DERIVATIVES 194-201(Chapman and Hall,London(1968))(J.A.Radley编辑，《淀粉及其衍生物》，第194-201页，伦敦查普曼和霍尔出版社，1968年)。

糖液中存在IPS会不利地影响最终的产品质量，是下游加工的主要问题。IPS会阻塞或减缓过滤系统，并淤塞用于纯化的炭柱。当IPS达到充分高的水平时，其可能渗漏出炭柱而降低生产效率。另外，在储存时其可能会导致浑浊的终产品，这对终产品质量而言是不可接受的。IPS的量可通过隔离糖化罐并将内容物回混来减少。尽管如此，IPS将特别地积聚在炭柱和过滤系统中。本发明教导内容的产麦芽糖淀粉酶的使用预计可通过减少IPS的量来改善总体工艺性能。

      实例

从由常规克隆技术构建的宏基因组文库鉴定推定的新型淀粉酶。蛋白质序列分析表明，该淀粉酶属于糖基水解酶家族13(GH13)，并且显示与公共NCBI数据库中的已知蛋白质的小于66％序列同一性。

在计算机中(in silico)鉴定了推定的淀粉酶之后，使用常规分子生物学PCR技术克隆基因，并且使其在枯草芽孢杆菌中表达。质粒克隆图谱在图9中示出。

      AmyMG的克隆和表达

全基因序列为SEQ ID NO:1。

CACACCCCGACGACCCGGCAGGCCGATTACTACGGCACGCTGGAGCCGTTTGCGCGTGAAGCGGTGTACTTCGTGATGACCGATCGCTTCGTCAACGGCGACCCCGGCAACGACCACCGCGACCAAGGCGGCGCCCTGGGCACGTTCGACATCCCGCTGCCGCCATGCAATGGCGTGTCCGGCAACATCGGCTACCTGGGTGGCGACTTCAAGGGCCTGGCCGATCATCTGGATTACATCCGCGAAATGGGCTTCACCGCGGTGTGGATCACGCCGATCGTGGACAATCCGGACCAGCGCTTCACTGGCGGCAGCGCACCAACCTGCGGCGGCATTCTGGCTGACCAGGGCAAAGCCGGCTATCACGGCTACTGGGGCGTGAATTTCTACCAAGTGGACGAGCACCTGCCCAGCCCAGGCATGGACTTCCGCGACCTGGCGGCGGCGATGCATCGCAAGGGCATGAAGCTGGTGCTGGACATCGTGGGGAACCACGGCTCGCCGGCCTGGGGCATGGCCTTCGACCAGCCCAAGTTCGGCAAGATCTACGACAAGGACGGCACGCTGATTGCCGATCACCAGAACCTGCCGCCGCAGCAGCTGGATCCCGAGCACAACCCGCTGCACCGCTTCTACAACACGGTCGGCCCGGTGGACGGGGCCAAGGGATCGATCTTCGACGGCAATCTGGCCCAGCTGTCGGATCTCAATGAACGCAACCCGGACGTGCTGGACTATCTGGTCGGGGCCTATCTGCAATGGATCGACCAGGGTGCCGATGCGTTTCGCATCGACACCATCGCCTGGATGCCGGACAGCTTCTGGCAGGCCTTCACCACCCGCATCCGGGCAAAGCACCCCGGCTTTTTCATGTTCGGCGAGGCCTTCGACTACGACGCCGCCAGGATTGCCACCCACACCCTGCCCGGCCACGGCGAAACCAGCGTGCTGGACTTCCCGATGAAACAGGCGATGGAAGAGGTCTTCGGGCGCAAGCAGGCCGGTTTTGAACGGATGATACCGGCGCTGCATCTGACTGGCGGCCCGTATGCCAACCCCTACGAGCTGGCCACCTTCTACGACAATCACGACATGCCGCGGCTGGATGCCAGCGATGAAGGCTTCATTGATGCACACAACTGGCTGTTCACCGCGCGTGGCATTCCGGTGGTCTATTACGGCTCGGAAATGGGCTTCATGCGCGGCCGACCCGAGCACGGCGGCAACCGCAACTACTTCGGCACCGAAGGCATTGCCGCCGCCAAGGCAAGCCCGATCCGGGCAGCGCTGACCCGCATTGCGCAGGTGCGTGCCGCTTCACCAGCGCTGCAGCgCGGGCTGCAACTCAATCTGGAGCTGCAAGGCAACCGCGCCGCGTTCTATCGGGTGTACCAGCACGACGGTGTGCACCAGATCGCGCTGGTCCTGCTCAACAAGGGCGACGCCCCGGAACACTTTGCCGTCCAGACGATGCTGCAACCCGGCcGCTGGCATGACGCGATTGGCGGTGAGACGCTGACCATACAGGCTGGCGAGGCGCTGCACGCCGAGGTTCCGGCGCATGGCGTGCGGGTCTTTCTGCTCGACGCCCAGGTGACTGAGCCGACGCTGGCGGCTGCGCTGGATGCCGCCATGGCCGATGCACGCCGGTCACGGTAA

编码天然信号肽的核酸片段为SEQ ID NO:2。

ATGATCACCATGCCCCTGCGTTCTGCCCGCCTCGGCCTGAGTTTGCTTTGCGCGCTTGCCTCGACGGCCTGTGCA

全蛋白质序列为SEQ ID NO:3。

HTPTTRQADYYGTLEPFAREAVYFVMTDRFVNGDPGNDHRDQGGALGTFDIPLPPCNGVSGNIGYLGGDFKGLADHLDYIREMGFTAVWITPIVDNPDQRFTGGSAPTCGGILADQGKAGYHGYWGVNFYQVDEHLPSPGMDFRDLAAAMHRKGMKLVLDIVGNHGSPAWGMAFDQPKFGKIYDKDGTLIADHQNLPPQQLDPEHNPLHRFYNTVGPVDGAKGSIFDGNLAQLSDLNERNPDVLDYLVGAYLQWIDQGADAFRIDTIAWMPDSFWQAFTTRIRAKHPGFFMFGEAFDYDAARIATHTLPGHGETSVLDFPMKQAMEEVFGRKQAGFERMIPALHLTGGPYANPYELATFYDNHDMPRLDASDEGFIDAHNWLFTARGIPVVYYGSEMGFMRGRPEHGGNRNYFGTEGIAAAKASPIRAALTRIAQVRAASPALQRGLQLNLELQGNRAAFYRVYQHDGVHQIALVLLNKGDAPEHFAVQTMLQPGRWHDAIGGETLTIQAGEALHAEVPAHGVRVFLLDAQVTEPTLAAALDAAMADARRSR

天然信号肽为SEQ ID NO:4。

MITMPLRSARLGLSLLCALASTACA

成熟基因序列通过常规程序鉴定，对其进行PCR扩增，通过BssHii/XhoI消化，然后连接到用相同限制性酶消化的p2JM质粒中。如图9的质粒图谱所示，将AmyMG基因置于aprE启动子的控制下。aprE信号序列用于引导蛋白质分泌。此外，将编码三个额外氨基酸(AGK)的核苷酸置于aprE信号序列与成熟AmyMG基因之间以促进靶蛋白的分泌。所得质粒用于转化感受态枯草芽孢杆菌细胞。AmyMG的表达评价显示，该酶在两种菌株中的表达非常好。

aprE信号核酸序列(带下划线)+AGK核酸序列(斜体)为SEQ ID NO:5。

      gtgagaagcaaaaaattgtggatcagcttgttgtttgcgttaacgttaatctttacgatggcgttcagcaacatgagcgc gcaggcagctggtaaa

aprE信号氨基酸序列(带下划线)+AGK氨基酸序列(斜体)为SEQ IDNO:6。

      MRSKKLWISLLFALALIFTMAFGSTSSAQAAGK

      AmyMG的产物分布分析和生化表征

初步产物分布分析显示，AmyMG将DP2展示为其主要产物，其中组成(％)高于90％(如果只考虑从DP1至DP7的产物分布)(图1和表1)。

图1示出A)在pH 5.3、50℃下与麦芽糖糊精(DE10)(0.5％,w/v)一起孵育2小时的AmyMG(10ppm)和B)DP1至DP7的标准化合物的混合物(0.0125％,w/v)的低聚糖产物分布分析的典型色谱图。使用具有AminexHPX-42A柱(300mm×7.8mm)的Agilent 1200系列HPLC系统在85℃下完成HPLC分离。对该样品(10μL)进行HPLC柱层析并且用等梯度的Milli-Q水作为流动相以0.6mL/min的流速对其进行分离。使用折射率检测器检测低聚糖产物。

      表2.AmyMG的低聚糖产物组成(％)

      

      

离子交换层析结果确认，AmyMG显示出麦芽糖作为其主要产物的产麦芽糖活性(图2)。在pH 5.3、50℃下与麦芽糖糊精(DE10)(15％,w/v)一起孵育24小时的AmyMG(10ppm)的低聚糖产物分布分析的典型色谱图。使用具有CarboPac PA 200柱的Dionex ICS-5000离子交换色谱在30℃下完成分离。对该样品(25μL)进行柱层析并且用以下梯度以0.5mL/min的流速进行分离：0-10min，50mM NaOH；10-15min，50-100mM NaOH；15-35min，100mMNaOH，0-200mM NaAc；35-45min，50mM NaOH。使用脉冲安培检测器检测低聚糖产物。

具有不同孵育时间点的更详细的产物分布分析(图3)显示，当孵育时间从0小时延长直到48小时时，DP2的峰面积增加，而DP10+的峰面积减小，这表明麦芽糖是通过水解玛尔特灵040(Maltrin040)产生的AmyMG的主要产物。图中所示的是在pH 5.3、50℃下与玛尔特灵040(30％,w/v)一起孵育的AmyMG(25ppm)的低聚糖产物分布分析的典型色谱图。使用具有Aminex HPX-42A柱(300mm×7.8mm)的Agilent 1200系列HPLC系统在85℃下完成HPLC分离。对该样品(10μL)进行HPLC柱层析并且用等梯度的Milli-Q水作为流动相以0.6mL/min的流速对其进行分离。使用折射率检测器检测低聚糖产物。

为了弄清楚从AmyMG催化的麦芽糖糊精产生的麦芽糖的确切异头物形式，通过分析不同反应时间处的酶产物来完成实时NMR测定(图4)。结果表明，产物为α-麦芽糖，并且AmyMG是产麦芽糖α-淀粉酶。图中所示的是来自与AmyMG一起孵育的玛尔特灵040的产物的¹H-NMR。通过在25℃下孵育溶解于1mL D2O的10mg玛尔特灵040与33ppm AmyMG的混合物来完成该反应。NMR测定由以500MHz在D2O中操作的Bruker NMR波谱仪完成。

对AmyMG进行α-淀粉酶表征测试(支链淀粉/PAHBAH法)，包括剂量依赖性测定(图5，将支链淀粉用作底物的AmyMG的剂量依赖性测定)、pH(图6，示出归一化pH值曲线图)、温度曲线图(图7，示出归一化温度曲线图)，以及热稳定性测定(图8，示出AmyMG的热稳定性)。该酶对支链淀粉的比活性为218.4U/mg，最适pH为7且最适温度为63℃。

因此，在一些实施例中，本发明的教导内容提供了具有产麦芽糖活性的多肽，其中在6-8的pH范围内存在最大酶活性的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％，如通过DP°单位所评估的。

另外，在一些实施例中，本发明的教导内容提供了在60℃-70℃、或62℃-64℃下具有最大活性的多肽，如通过DP°单位所评估的。

另外，在一些实施例中，本发明的教导内容提供了这样的多肽，该多肽产生DP1至DP7产物的至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％DP2，所述产物由根据图3所示的程序进行的水解反应而得到。

最后，在一些实施例中，本发明教导内容的多肽可被工程改造以提供各种改善的特性。这种工程改造工作可由表3中提供的原子坐标结构信息来指导。

      表3

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

      

Claims (16)

1.一种分离的核酸，所述分离的核酸包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的简并变体的核苷酸序列。

2.一种分离的核酸，所述分离的核酸包含编码由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成的多肽的序列。

3.一种分离的核酸，所述分离的核酸包含在严格条件下与杂交探针杂交的序列，所述杂交探针的所述核苷酸序列由SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:1的互补序列组成。

4.一种分离的核酸，所述分离的核酸包含与SEQ ID NO:1至少66％、67％、68％、69％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或99.5％同一的序列。

5.根据权利要求4所述的分离的核酸，其中所述核酸编码具有淀粉水解活性的多肽。

6.一种分离的核酸，所述分离的核酸包含编码与SEQ ID NO:3至少66％、67％、68％、69％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或99.5％同一的多肽的序列，其中所述多肽具有淀粉水解活性。

7.一种分离的核酸，所述分离的核酸包含编码包含以下的序列的多肽的序列：SEQ ID NO:3、或具有最多至50个保守氨基酸置换的SEQ IDNO:3，其中所述多肽具有淀粉水解活性。

8.一种纯化的多肽，所述纯化的多肽的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:3至少66％、67％、68％、69％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或99.5％同一的序列。

9.一种纯化的多肽，所述纯化的多肽包含SEQ ID NO:3但是具有0至20个保守氨基酸置换的氨基酸序列。

10.一种表达载体，所述表达载体包含有效连接至表达控制序列的根据权利要求1-6中任一项所述的核酸序列。

11.一种培养细胞，所述培养细胞包含根据权利要求10所述的载体。

12.一种培养细胞，所述培养细胞包含有效连接至表达控制序列的根据权利要求1-6中任一项所述的核酸。

13.一种用根据权利要求10所述的载体转染的培养细胞或所述细胞的子代，其中所述细胞表达所述核酸以形成多肽。

14.一种制备蛋白质的方法，所述方法包括在允许表达所述多肽的条件下培养根据权利要求11所述的细胞。

15.一种使用根据权利要求8或9中任一项所述的多肽的方法，所述方法包括在以下任一项中包括所述多肽：淀粉液化、淀粉糖化、纺织物退浆、造纸和纸浆工业中的淀粉改性、酿造、烘焙、用于食品工业的糖浆的生产、用于发酵工艺的原料的生产、动物饲料、以及在盘碟洗涤和/或衣物洗涤过程中除去含淀粉污垢和/或污渍。

16.一种包含根据权利要求8或9中任一项所述的多肽以及至少一种辅助酶的组合物，所述辅助酶选自植酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、β淀粉酶、异淀粉酶、不同的淀粉酶、α-葡糖苷酶、纤维素酶、木聚糖酶、半纤维素酶、β-葡糖苷酶、转移酶、果胶酶、脂肪酶、角质酶、酯酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶/氧化酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角质酶、漆酶、磷脂酶、溶血磷脂酶、酰基转移酶、过水解酶、芳基酯酶、以及氧化还原酶。