MX2015004329A - Metodo para usar alfa-amilasa de talaromyces emersonii para sacarificacion. - Google Patents

Metodo para usar alfa-amilasa de talaromyces emersonii para sacarificacion.

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Abstract

Se proporciona una alfa-amilasa fúngica de Talaromyces emersonii (TeAmy1), junto con variantes de esta. La TeAmy1 tiene un pH óptimo de 3.5 y puede usarse en un intervalo de temperatura de al menos 30 - 75 °C, lo cual permite usar la enzima en combinación con una glucoamilasa en una reacción de sacarificación. Esto obvia la necesidad de ejecutar una reacción de sacarificación como un proceso discontinuo, en donde el pH y la temperatura deben reajustarse para un uso óptimo de la alfa-amilasa o glucoamilasa. La TeAmy1 cataliza, además, la sacarificación de sustratos de almidón a una composición de oligosacáridos enriquecidos significativamente en DP2 y (DP1 + DP2) en comparación con los productos de sacarificación catalizados por una alfa-amilasa de Aspergillus kawachii. Esto facilita el uso de la composición de oligosacáridos por un organismo fermentativo en un proceso de sacarificación y fermentación simultáneas, por ejemplo.

Description

MÉTODO PARA USAR ALFA-AMILASA DE TALAROMYCES EMERSONII PARA SACARIFICACIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN Los métodos para usar una a-amilasa de Talaromyces emersonii (TeAmyl) o una variante de esta incluyen la sacarificación de almidón, por ejemplo, sacarificación y fermentación simultáneas (SSF, por sus siglas en inglés).
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El almidón consiste en una mezcla de amilosa (15-30 % p/p) y amilopectina (70-85 % p/p). La amilosa consiste en cadenas lineales de unidades de glucosa a-1,4-enlazadas con un peso molecular (MW) de aproximadamente 60,000 a aproximadamente 800,000. La amilopectina es un polímero ramificado que contiene puntos de ramificación a-1,6 cada 24-30 unidades de glucosa; Su peso molecular puede ser tan alto como 100 millones.
Los azúcares del almidón, en forma de jarabes de dextrosa concentrada se producen, actualmente, por un proceso catalizado por enzimas que incluye: (1) licuación (o reducción de la viscosidad) del almidón sólido con una a-amilasa en dextrinas con un grado de polimerización promedio de aproximadamente 10-12, y (2) sacarificación del almidón licuado resultante (por ejemplo hidrolizado de almidón) con amiloglucosidasa (denominada, además, glucoamilasa o GA). El jarabe resultante tiene un contenido alto de glucosa. Gran Ref.:254853 parte de la jarabe de glucosa que se produce comercialmente se isomeriza posteriormente enzimáticamente a una mezcla dextrosa/fructosa conocida cono isojarabe. El jarabe resultante puede fermentarse, además, con microorganismos, tal como levadura, para producir productos comerciales que incluyen etanol, ácido cítrico, ácido láctico, ácido succínico, ácido itaconico, glutamato monosódico, gluconatos, lisina, otros ácidos orgánicos, otros aminoácidos, y otros bioquímicos, por ejemplo. La fermentación y sacarificación pueden conducirse simultáneamente (por ejemplo, un proceso SSF) para alcanzar una economía y eficacia superiores.
Las a-amilasas hidrolizan el almidón, glucógeno, y polisacáridos relacionados mediante la escisión interna de los enlaces -1,4-glucosídicos al azar. Las a-amilasas, particularmente, de Bacilli, se han usado para una variedad de propósitos diferentes, que incluyen licuefacción y sacarificación del almidón, desaprestado de textiles, modificación de almidón en la industria del papel y la pulpa, fermentación de cerveza, horneado, producción de jarabes para la industria de alimentos, producción de materias primas para los procesos de fermentación y en la alimentación animal para aumentar la digestibilidad. Estas enzimas pueden usarse, además, para eliminar la suciedad de almidón y manchas durante el lavado de vajillas y lavado de ropa.
Se ha aislado una a-amilasa a partir del hongo termofílico Talaromyces emersonii CBS 814.70. Bunni et al. (1989) Enz . Microb . Technol . 11: 370-75. Un ADNc que codifica la a-amilasa se clonó y expresó en Escherichia coli . Bunni et al. (1992) Biotechnol . Lett . 14(12): 1109-14.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN Una a-amilasa de Talaromyces emersonii (TeAmyl; sec. con núm. de ident.: 1) y variantes de esta catalizan la sacarificación por periodos extendidos a un pH acídico. Se proporciona codificación de ácidos nucleicos y células hospederas que expresan los polinucleótidos. La TeAmyl tiene un intervalo de trabajo ácido y contribuye a un alto rendimiento de etanol y bajo almidón residual en una sacarificación y fermentación simultáneas (SSF), por ejemplo, particularmente cuando se usa junto con una glucoamilas . La TeAmyl exhibe alta actividad a temperaturas elevadas y a pH bajo, por lo que la TeAmyl puede usarse eficientemente en un proceso de sacarificación en la presencia de glucoamilasas fúngicas, tales como la glucoamilasa de Aspergillus niger (AnGA). Ventajosamente, la TeAmyl cataliza la sacarificación de almidón a una composición de oligosacáridos enriquecida significativamente en DP2 (es decir, maltosa) en comparación con los productos de sacarificación catalizados por la alfa-amilasa de Aspergillus kawachii (AkAA). La TeAmyl puede usarse en una dosificación más baja que AkAA para producir niveles comparables de etanol.
La TeAmyl puede usarse en combinación con enzimas derivadas de plantas (por ejemplo, de cereales y granos). La TeAmyl puede usarse, además, en combinación con enzimas secretadas por, o endógena de, una célula hospedera. Por ejemplo, la TeAmyl puede añadirse a un proceso de fermentación o SSF durante el cual una o más amilasas, glucoamilasas, proteasas, lipasas, fitasas, esterasas, enzimas de redox, transferasas, u otras enzimas son secretadas por el hospedero de producción. La TeAmyl puede funcionar, además, en combinación con enzimas no secretadas o secretadas de producción endógena del hospedero. En otro ejemplo, la TeAmyl puede secretarse por una célula hospedera de producción con otras enzimas durante la fermentación o SSF. La TeAmyl puede ser eficaz, además, en la hidrólisis directa del almidón para jarabe y/o la producción de biocombustibles, ácidos orgánicos, aminoácidos y otros bioquímicos (por ejemplo, etanol, ácido cítrico, ácido succínico, glutamato monosódico, ácido glucónico, gluconato sódico, gluconato cálcico, gluconato potásico, ácido itaconico y otros ácidos carboxílicos, glucono delta-lactona, eritorbato sódico, lisina, ácido graso de omega 3, butanol, isopreno, 1,3-propanodiol y biodiesel), en donde la temperatura de reacción es menor que la temperatura de gelatinización del sustrato. La TeAmyl puede ser secretada por una célula hospedera con otras enzimas durante la fermentación o SSF.
En consecuencia, se proporciona un método de sacarificación de una composición que comprende almidón para producir una composición que comprende glucosa, en donde el método puede comprender (i) poner en contacto la composición que comprende almidón con una TeAmyl aislada o variante de esta que tiene actividad a-amilasa y que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) los residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) los residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:l; y (ii) sacarificar la composición que comprende almidón para producir la composición que comprende glucosa; en donde la TeAmyl aislada o variante de esta cataliza la sacarificación de la composición de almidón a glucosa.
La TeAmyl o variante de esta puede dosificarse a aproximadamente 17 %-50 % u, opcionalmente, aproximadamente 17 %-34 % de la dosis de AkAA para reducir la misma cantidad de DP3+ en las mismas condiciones.
La composición que comprende glucosa puede enriquecerse en DP2 o (DPI + DP2), cuando se mide como un porcentaje en peso del DPI - DP7 total, comparado con una segunda composición que comprende glucosa producida por AkAA en las mismas condiciones. DP2 puede enriquecerse dos a tres veces en aproximadamente 2 horas. Además, (DPI + DP2) puede enriquecerse aproximadamente 1.9 veces en aproximadamente 2 horas.
La TeAmyl o variante de esta pueden comprender una secuencia de aminoácidos con al menos 90 , , de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) los residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:l o (b) los residuos 1-467 de la sec. con núm. de ident.:l. La TeAmyl o variante de esta puede comprender, además, (a) los residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) los residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1. La TeAmyl o variante de esta pueden consistir en una secuencia de aminoácidos con al menos 80 %, 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1. La TeAmyl o variante de esta pueden consistir, además, en (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident 1.
La composición de almidón puede comprender almidón liquidificado, almidón gelatinizado o almidón granular. La sacarificación puede realizarse en un intervalo de temperatura de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 75 °C. El intervalo de temperatura puede ser, además, 55 °C-74 °C. La sacarificación puede realizarse en un intervalo de pH de pH 2.0-pH 7.5. El intervalo de pH puede ser, además, pH 3.0 -pH 5.8. El intervalo de pH puede ser, además, pH 3.5-pH 4.5.
El método puede comprender, adicionalmente, fermentar la composición de glucosa para producir un producto final de fermentación (EOF). La fermentación puede ser una reacción simultánea de sacarificación y fermentación (SSF). La fermentación puede realizarse por 48-70 horas a pH 2-8 y en un intervalo de temperatura de 25 °C-70 °C. El producto de EOF puede comprender 8 %-18 % (v/v) de etanol. El producto de EOF puede comprender un metabolito. El metabolito puede ser ácidos orgánicos, aminoácidos, biocobustibles y otros bioquímicos que incluyen, pero no se limitan a, etanol, ácido cítrico, ácido succínico, glutamato monosódico, ácido glucónico, gluconato sódico, gluconato cálcico, gluconato potásico, ácido itaconico y otros ácidos carboxílicos, glucono delta-lactona, eritorbato sódico, lisina, ácido graso de omega 3, butanol, isopreno, 1,3-propanodiol y biodiesel.
Se proporciona además, el uso de la TeAmyl, o variante de esta en la producción de una bebida fermentada, así como un método para preparar una bebida fermentada que puede comprender: poner eh contacto una templa y/o un mosto con TeAmyl o variante de esta. Un método de preparar una bebida fermentada; el método puede comprender: (a) preparar una templa; (b) filtrar la templa para obtener un mosto; y (c) fermentar el mosto para obtener una bebida fermentada, en donde TeAmyl o variante de esta se añaden a: (i) la templa de la etapa (a) y/o (ii) el mosto de la etapa (b) y/o (iii) el mosto de la etapa (c). Se proporciona, además, una bebida fermentada producida por los métodos descritos.
La bebida fermentada o producto final de la fermentación puede seleccionarse del grupo que consiste en una cerveza seleccionada tal como malteada de cerveza completa, cerveza elaborada bajo el marco de “Reinheitsgebot”, Ale, IPA, lager, bitter, Happoshu (segunda cerveza), tercera cerveza, cerveza seca, casi cerveza, cerveza ligera, cerveza con bajo contenido en alcohol, cerveza baja en calorías, porter, cerveza bock, stout, licor de malta, cerveza sin alcohol, y licor de malta sin alcohol; o bebidas de maltas o de cereales tales como bebidas de malta con sabor a frutas, bebidas de malta con sabor a licor, y bebidas de malta con sabor a café.
El método puede comprender, además, la adición de glucoamilasa, trehalasa, isoamilasa, hexoquinasa, xilanasa, glucosa isomerasa, xilosa isomerasa, fosfatasa, fitasa, pululanasa, b-amilasa, a-amilasa que no es TeAmyl, proteasa, celulasa, hemicelulasa, lipasa, cutinasa, enzima de redox, esterasa, transferasa, pectinasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, liasa u otras hidrolasas, enzimas de ramificación o una combinación de estas, a la composición de almidón. Ver, por ejemplo, la patente núm. WO 2009/099783. La glucoamilasa puede añadirse a 0.1-2 unidades de glucoamilasa (GAU)/g ds.
La TeAmyl aislada o una variante de esta pueden expresarse y segregarse por una célula hospedera. La composición de almidón puede ponerse en contacto con la célula hospedera. La célula hospedera puede, además, expresar y secretar una glucoamilasa. La célula hospedera puede ser capaz, además, de fermentar la composición de glucosa.
En consecuencia, se proporciona una composición para sacarificar una composición que comprende almidón, que puede comprender una TeAmyl aislada o variante de esta que tiene actividad a-amilasa y que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80 %, 90 %, 95.%, 99 % o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) los residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) los residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1. La TeAmyl o variante de esta puede consistir en una secuencia de aminoácidos con al menos 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) los residuos 1-594 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) los residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1.
La composición puede ser un material celular cultivado. La composición puede comprender, además, una glucoamilasa. La TeAmyl o variante de esta puede, además, purificarse.
La TeAmyl o variante de esta pueden expresarse y segregarse por una célula hospedera. La célula hospedera puede ser una célula fúngica filamentosa, una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula vegetal, algas marinas o una célula de alga. La célula hospedera puede ser una célula de Aspergillus sp., Talaromyces sp. o Trichoderma reesei .
En consecuencia, se proporciona un método de horneado que comprende añadir una composición de hornear a una sustancia para hornear, y hornear la sustancia para producir un producto horneado, en donde la composición de hornear comprende una TeAmyl aislada o variante de esta que tiene actividad a-amilasa y que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80 %, 90%, 95 %, 99 % o 100% de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:l o (b) residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1, en donde la TeAmyl aislada o variante de esta cataliza la hidrólisis de componentes de almidón presentes en la sustancia para producir moléculas de derivados del almidón más pequeñas. La TeAmyl o variante de esta pueden consistir en una secuencia de aminoácidos con al menos 80%, 90%, 95 %, 99%, o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident. :1. La composición de hornear puede comprender, adicionalmente, harina, una amilasa contra el enranciamiento, una fosfolipasa, y/o un fosfolípido.
En consecuencia, se proporciona, además, un método para producir una composición alimenticia; el método comprende combinar (i) uno o más ingredientes alimenticios, y (ii) una TeAmyl aislada o variante de esta que tiene actividad a-amilasa y que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1, en donde la TeAmyl aislada o variante de esta cataliza la hidrólisis de los componentes de almidón presentes en los ingredientes alimenticios para producir glucosa. La TeAmyl o variante de esta pueden consistir en una secuencia de aminoácidos con al menos 80 %, 90 %, 95 %, 99 %, o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1. El método puede comprender, adicionalmente, hornear la composición alimenticia para producir un producto horneado. El método puede comprender, adicionalmente, (i) proporcionar un medio de almidón; (ii) añadir al medio de almidón la TeAmyl o variante de esta; y (iii) aplicar calor al medio de almidón durante o después de la etapa (b) para producir un producto de panadería.
La composición alimenticia puede enriquecerse en DPI, DP2, o (DPI + DP2), cuando se mide como un porcentaje en peso del DP1-DP7 total, comparado con un segundo producto horneado producido por AkAA bajo las mismas condiciones. La composición alimenticia puede seleccionarse del grupo que consiste en un producto alimenticio, una composición de hornear, un aditivo alimenticio, un producto alimenticio animal, un producto de alimentación, un aditivo alimenticio, un aceite, una carne, yy uunnaa mmaanntteeccaa.. La composición alimenticia puede comprender una masa o un producto de masa, preferentemente, un producto de masa procesada.
El uno o más ingredientes alimenticios puede comprender un ingrediente de horneado o un aditivo. El uno o más ingredientes alimenticios puede seleccionarse, además, del grupo que consiste en harina; una amilasa contra el enranciamiento; una fosfolipasa; un fosfolípido; una alfa-amilasa maltogénica o una variante, homólogo, o mutantes de ella que tiene actividad alfa-amilasa maltogénica; una xilanasa de panadería (EC 3.2.1.8); y una lipasa. Uno o más ingredientes alimenticios pueden seleccionarse, adicionalmente, del grupo que consiste en (i) una alfa-amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus, (ii) una xilanasa de panadería de Bacillus, Aspergillus, Thermomyces o Trichoderma, (iii) una glicolipasa de Fusarium heterosporum.
En consecuencia, se proporciona, además, una composición para el uso en producir una composición alimenticia que comprende una TeAmyl aislada o variante de esta que tiene actividad a-amilasa y que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:l o (b) residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1 y uno o más ingredientes alimenticios. Se proporciona, además, un uso de la TeAmyl o variante de esta en la preparación de una composición alimenticia. La composición alimenticia puede comprender una masa o un producto de masa, que incluyen un producto de masa procesado. La composición alimenticia puede ser una composición de panadería. La TeAmyl o variante de esta pueden usarse en un producto de masa para retardar o reducir el endurecimiento, preferentemente, retrogradación perjudicial, del producto de masa.
En consecuencia, se proporciona un método para eliminar manchas de almidón de la ropa sucia, platos, o textiles; el método puede comprender incubar la superficie de la ropa sucia, platos, o textiles en presencia de una composición acuosa que comprende una cantidad eficaz de una TeAmyl aislada o variante de esta que tiene actividad a-amilasa, y que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:l o (b) residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:l, y que permite que la TeAmyl o variante de esta hidrolice los componentes de almidón presentes en la mancha de almidón para producir moléculas de derivados del almidón más pequeñas que se disuelven en la composición acuosa, y enjuagar la superficie y, de esta manera, eliminar la mancha de almidón de la superficie. La TeAmyl o variante de esta pueden consistir en una secuencia de aminoácidos con al menos 80 %, 90 %, 95 %, 99 %, o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:l o (b) residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1 La composición puede ser un detergente para lavandería, un aditivo de detergente para lavandería o un detergente para lavavajillas manual o automático y, opcionalmente, contiene un tensioactivo.
En consecuencia, se proporciona, además, un método para el desaprestado de textiles; el método puede comprender poner en contacto una composición de desaprestado con un textil por un tiempo suficiente para quitar el apresto del textil, en donde la composición de desaprestado puede comprender una TeAmyl aislada o variante de esta que tiene actividad a-amilasa, y que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1 y permitir que la TeAmyl o variante de esta quite el apresto de los componentes de almidón presentes en la mancha de almidón para producir moléculas de derivados del almidón más pequeñas que se disuelven en la composición acuosa, y enjuagar la superficie y, de esta manera, eliminar la mancha de almidón de la superficie. La TeAmyl o variante de esta pueden consistir en una secuencia de aminoácidos con al menos 80 %, 90 %, 95 %, 99 %, o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1.
En consecuencia, se proporciona, además, el uso de la TeAmyl o variante de esta en la producción de una composición de glucosa. Se proporciona, además, la composición de glucosa producida por los métodos descritos. Además, se proporciona el uso de TeAmyl o variante de esta en la producción de un almidón licuado. Y se describe, además, un almidón licuado preparado por los métodos descritos.
Además, se describe el uso de una composición de desaprestado que puede comprender TeAmyl o una variante de esta en el desaprestado de textiles, así como el uso de una composición de hornear que puede comprender TeAmyl o una variante de esta en la producción de un producto horneado.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las figuras adjuntas se incorporan en esta descripción y constituyen una parte de esta, e ilustran varios métodos y composiciones descritos en la presente descripción. En las figuras: La Figura 1A y la Figura IB ilustran un alineamiento ClustalW del núcleo catalítico de la TeAmyl, región conectora simulada y dominio de unión simulado a carbohidratos con los residuos correspondientes de las a-amilasas de: sec. con núm. de ident.: 1 (TeAmyl); sec. con núm. de ident.: 4 ( Aspergillus fumigatus Af293); sec. con núm. de ident.: 5 ( Aspergillus fumigatus A1163); sec. con núm. de ident.: 6 (Neosartorya fischeri NRRL 181); sec. con núm. de ident.: 7 ( Aspergillus terreus N1H2624); sec. con núm. de ident.: 8 ( Aspergillus kawachii) ; y sec. con núm. de ident.: 9 ( Aspergillus awamori) .
Los residuos designados por un asterisco en la Fig.1 son residuos de TeAmyl correspondientes a residuos conservados en las sec. con núms. de ident.: 4-9. El núcleo catalítico de la TeAmyl, el conector simulado y el dominio de unión simulado a carbohidratos se indican con varias barras.
La Figura 2 representa un mapa del plásmido pZZH426, que comprende un vector de expresión de pTrex3gM (solicitud de patente publicada de los EE. UU. núm. 2011/0136197 Al) y comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de TeAmyl.
La Fig.3A representa la dependencia de la actividad a-amilasa (unidades relativas) de la a-amilasa de Aspergillus kawachii (AkAA) con el pH. La Fig. 3B representa la dependencia de la actividad a-amilasa (unidades relativas) de TeAmyl con el pH. La actividad a-amilasa se basó en 2 ppm de enzima y se probó mediante la liberación de azúcar reductor a partir del sustrato de amilopectina de la papa a 50 °C.
La Fig.4A representa la dependencia de la actividad a-amilasa (unidades relativas) de AkAA con la temperatura. La Fig. 4B representa la dependencia de la actividad a-amilasa (unidades relativas) de TeAmyl con la temperatura. La actividad a-amilasa se basó en 2 ppm de enzima y se probó mediante la liberación de azúcar reductor a partir de un sustrato de amilopectina de la papa a pH 4.0 (AkAA) o pH 4.5 (TeAmyl).
Las Figuras 5A-5C representan los resultados de las reacciones SSF de AkAA y TeAmyl, en una misma dosificación, después de la incubación a pH 4.8 por los periodos indicados.
Las Figuras 6A-6C representan los resultados de las reacciones SSF de AkAA y TeAmyl después de la incubación a pH 4.8 por los periodos que indicados, en donde la TeAmyl se suplemento en una dosis reducida (aproximadamente 1/2 y aproximadamente 1/6 de esa dosificación de AkAA).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se proporciona una a-amilasa fúngica de Talaromyces emersonii (TeAmyl). La TeAmyl tiene un pH óptimo de 3.5 y al menos 70 % de actividad en un intervalo de pH de 3 a 5.8. La enzima tiene una temperatura óptima de 70 °C y al menos 70 % de actividad en un intervalo de temperatura de 55-74 °C, cuando se prueba a pH 3.5. Estas propiedades permiten que la enzima se use en combinación con una glucoamilasa bajo las mismas condiciones de reacción. Esto obvia la necesidad de ejecutar una reacción de sacarificación como un proceso discontinuo, en donde el pH y la temperatura deben ajustarse para el uso óptimo de la a-amilasa o la glucoamilasa.
La TeAmyl cataliza, además, la sacarificación de una composición que comprende almidón a glucosa. Por ejemplo, después de dos horas de sacarificación a 50 °C, pH 5.3, mediante el uso de un sustrato de DP7, amilopectina, o maltodextrina, se produce una composición de oligosacáridos. La composición se enriquece en DP2 y (DPI + DP2), cuando se mide como un porcentaje en peso del DPI - DP7 total, en comparación con los productos de la sacarificación catalizada por AkAA en las mismas condiciones. Por ejemplo, DP2 se enriquece de aproximadamente dos a tres veces en aproximadamente 2 horas, y (DPI + DP2) se enriquece aproximadamente 1.9 veces en aproximadamente 2 horas, dependiendo del sustrato. Esto facilita el uso de la composición de oligosacáridos por parte de un organismo termentador en un proceso SSF, por ejemplo. En este papel, la TeAmyl puede producir el mismo rendimiento de etanol que la AkAA con una dosificación menor de la enzima, mientras que reduce el almidón residual insoluble y minimiza cualquier efecto negativo del almidón residual insoluble sobre la calidad del producto final.
Las aplicaciones ilustrativas para TeAmyl y variantes de estas amilasas están en un proceso de sacarificación de almidón, por ejemplo, SSF, la preparación de composiciones de limpieza, tales como composiciones detergentes para la limpieza de lavandería, vajillas, y otras superficies, para el procesamiento textil (por ejemplo, el desaprestado). 1. Definiciones & Abreviaturas De conformidad con esta descripción detallada se aplican las siguientes abreviaturas y definiciones. Nótese que las formas singulares “un,” “una,” y “el/la” incluyen los referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a “una enzima” incluye una pluralidad de tales enzimas y la referencia a “la dosificación” incluye referencia a una o más dosificaciones y equivalentes de estas conocidas para las personas con experiencia en la materia, etc.
A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos científicos y téenicos que se usan en la presente descripción tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por una persona con conocimiento ordinario en la materia. A continuación se proporcionan las definiciones de los términos. 1.1. Abreviaturas y acrónimos Las siguientes abreviaturas/acrónimos tienen los siguientes significados a menos que se especifique claramente de cualquier otra manera: ABTS ácido 2,2-azino-bis-3-etilbenzotiazolina-6- sulfónico AE etoxilato de alcohol AEO etoxilato de alcohol AEOS etoxisulfato de alcohol AES etoxisulfato de alcohol AkAA oí-amilasa de Aspergillus kawachii AnGA glucoamilasa de Aspergillus niger AOS a-olefinsulfonato AS sulfato de alquilo cDNA ADN complementario CMC carboximetilcelulosa DE equivalente de dextrosa DNA ácido desoxirribonucleico DPn grado de polimerización de sacáridos que tienen n subunidades ds o DS sólidos secos DTMPA ácido dietilentriaminapentaacético EC Comisión de enzimas EDTA ácido etilendiaminatetraacético EO óxido de etileno (fragmento del polímero) EOF fin de la fermentación FGSC Fungal Genetics Stock Center GA glucoamilasa GAU/g ds unidad de la actividad de glucoamilasa/gramo de sólidos secos HFCS jarabe de maíz con alto contenido de fructosa HgGA glucoamilasa de Humicola grísea IPTG isopropil b-D-tiogalactosida IRS almidón residual insoluble kDa kiloDalton LAS alquilbencenosulfonato lineal MW peso molecular MWU unidad de Wohlgemuth modificada; 1.6xl05 mg/MWU unidad de actividad NCBI National Center for Biotechnology Information NOBS nonanoiloxibencenosulfonato NTA ácido nitriloacético OxAm Purastar HPAM 5000L (Danisco US Inc.) PAHBAH hidrazida de ácido p-hidroxibenzoico PEG polietilenglicol pi punto isoeléctrico PPm partes por millón, por ejemplo, mg proteína por gramo de sólido seco PVA poli (alcohol vinílico) PVP poli (vinilpirrolidona) RNA ácido ribonucleico SAS alcanosulfonato SDS-PAGE dodecil sulfato de sodio electroforesis en gel de poliacrilamina SSF sacarificación y fermentación simultáneas SSU/g unidad de almidón soluble/gramo de sólidos secos sólido sp. especies TAED tetraacetiletilendiamina TeAmyl a-amilasa de Talaromyces emersonii TrGA glucoamilasa de Trichoderma reesei p/v peso/volumen p/p peso/peso v/v volumen/volumen %p por ciento en peso °C grados centígrados H2 O agua dH20 o DI agua desionizada d1H20 agua desionizada, filtración en Milli-Q g o gm gramos mg microgramos mg miligramos kg kilogramos ml y ml microlitros mi y mi mililitros mm milímetros mm micrómetro M molar M milimolar mM micromolar U unidades s segundos min(s) minuto/minutos h hora/horas DO oxígeno disuelto Ncm newton centímetro EtOH etanol eq. equivalentes N normal 1.2. Definiciones a una enzima que es, entre otras cosas, capaz de catalizar la degradación del almidón. Las a-amilasas son hidrolasas que escinden los enlaces a-D-(14) O-glucosídicos en el almidón. Generalmente, las a-amilasas (EC 3.2.1.1; a-D-(14)-glucano glucanohidrolasa) se definen como endoenzimas que escinden enlaces a-D-(l4) O-glucosídicos dentro de la molécula de almidón de una manera aleatoria lo que produce polisacáridos que contienen tres o más unidades de D-glucosa con enlace (1-4)-a. En contraposición, las exoenzimas amilolíticas, tales como las b-amilasas (EC 3.2.1.2; OÍ-D-(14) glucano maltohidrolasa) y algunas amilasas específicas de productos como la a-amilasa maltogénica (EC 3.2.1.133) escinden la molécula del polisacárido a partir del extremo no reductor del sustrato. Las b-amilasas, a-glucosidasas (EC 3.2.1.20; OÍ-D-glucósido glucohidrolasa), glucoamilasa (EC 3.2.1.3; a-D- (14) glucano glucohidrolasa), y amilasas específicas de productos, como las maltotetraosidasas (EC 3.2.1.60) y las maltohexaosidasas (EC 3.2.1.98) pueden producir malto-oligosacáridos de una longitud específica o jarabes enriquecidos de malto-oligosacáridos específicos.
En la presente descripción “unidades enzimáticas” se refiere a la cantidad de producto formado en un tiempo bajo las condiciones especificadas del ensayo. Por ejemplo, una “unidad de actividad glucoamilasa” (GAU) se define como la cantidad de enzima que produce 1 g de glucosa por hora a partir de un sustrato de almidón soluble (4 % DS) a 60 °C, pH 4.2. Una “unidad de almidón soluble” (SSU) es la cantidad de enzima que produce 1 mg de glucosa por minuto a partir de un sustrato de almidón soluble (4 % DS) a pH 4.5, 50 °C. DS se refiere a “sólidos secos.” Como se usa en la presente descripción, el término “almidón” se refiere a cualquier material que comprende los carbohidratos polisacáridos complejos de las plantas que comprenden amilosa y amilopectina con la fórmula (C6HioC>5)x, en donde X puede ser cualquier número. El término incluye materiales de origen vegetal, tales como granos, cereales, hierbas, tubérculos y raíces y, más específicamente, materiales obtenidos a partir de trigo, cebada, maíz, centeno, arroz, sorgo, salvado, mandioca, mijo, papa, batata, y tapioca. El término “almidón” incluye almidón granular. El término “almidón granular” se refiere a almidón crudo, es decir, no cocido, por ejemplo, almidón que no se ha sometido a gelatinización.
Los términos, “en estado natural”, “parental”, o “referencia”, con respecto a un polipéptido, se refieren a un polipéptido que ocurre naturalmente que no incluye una sustitución hecha por el hombre, inserción o supresión en una o más posiciones de aminoácido. Similarmente, los términos “en estado natural”, “parental” o “referencia”, con respecto a un polinucleótido, se refieren a un polinucleótido que se produce naturalmente y que no incluye un cambio de nucleósido hecho por el hombre. Sin embargo, debe observarse que un polinucleótido que codifica un polipéptido en estado natural, parental o de referencia no está limitado a un polinucleótido que ocurre naturalmente, y abarca los polinucleótidos que codifican el polipéptido en estado natural, parental o de referencia.
Se entiende que una referencia a la proteína silvestre incluye la forma madura de la proteína. Un polipéptido “maduro” significa un polipéptido de TeAmyl o variante de esta del que está ausente una secuencia señal. Por ejemplo, la secuencia señal puede escindirse durante la expresión del polipéptido. La TeAmyl madura es de 603 aminoácidos de longitud que cubren las posiciones 1-603 de la sec. con núm. de ident.: 1, en donde las posiciones se cuentan a partir del extremo N-terminal. La secuencia señal de la TeAmyl silvestre es de 19 aminoácidos de longitud y tiene la secuencia expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3. Una TeAmyl madura o variante de esta puede comprender, alternativamente, una secuencia señal captada a partir de diferentes proteínas. La proteína madura puede ser una proteína de fusión entre el polipéptido maduro y un polipéptido de secuencia señal.
El “núcleo catalítico” de TeAmyl abarca los residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.: 1. El “conector” o “región conectora” simulada de la TeAmyl (sec. con núm. de ident.: 11) abarca los residuos 477-494 de la sec. con núm. de ident.: 1. El “dominio de unión a carbohidratos” simulado de la TeAmyl (sec. con núm. de ident.: 10) abarca los residuos 495-603 de la sec. con núm. de ident.: 1.
El término “variante”, con respecto a un polipéptido, se refiere a un polipéptido que difiere de un polipéptido silvestre específico, parental, o de referencia en que incluye una o más sustituciones, inserciones, o supresiones de un aminoácido de origen natural o producidas por el hombre Similarmente, el término “variante”, con respecto a un polinucleótido, se refiere a un polinucleótido que difiere en la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido silvestre específico, parental, o de referencia. La identidad del polinucleótido o polipéptido silvestre, parental, o de referencia será evidente a partir del contexto. Una “variante” de TeAmyl y una “variante de polipéptido de a-amilasa” son sinónimos en la presente descripción.
En el caso de las presentes a-amilasas, “actividad” se refiere a la actividad a-amilasa, que puede medirse como se describe en la presente descripción.
El término “recombinante”, cuando se usa en referencia a una célula, ácido nucleico, proteína o vector sujetos, indica que el sujeto se ha modificado a partir de su estado nativo. Así, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula, o expresan genes nativos a diferentes niveles o bajo diferentes condiciones que las encontradas en la naturaleza. Los ácidos nucleicos recombinantes difieren de una secuencia nativa en uno o más nucleótidos y/o están unidos operativamente a secuencias heterólogas, por ejemplo, un promotor heterólogo en un vector de expresión. Las proteínas recombinantes pueden diferir de una secuencia natural en uno o más aminoácidos y/o se pueden fusionar con secuencias heterólogas. Un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una TeAmyl o una variante de esta es un vector recombinante.
Los términos “recuperado”, “aislado” y “separado” se refieren a un compuesto, proteína (polipéptidos), célula, ácido nucleico, aminoácido u otro material o componente específico que se extrae de al menos otro material o componente al que está asociado de manera natural tal como se encuentra en la naturaleza, por ejemplo, una TeAmyl aislada de una célula de T. emersonii . Una TeAmyl “aislada” o variante de esta incluye, pero no se limita a, un caldo de cultivo que contiene polipéptidos de TeAmyl o de una variante secretados y polipéptidos de TeAmyl o de una variante expresados en una célula hospedera heteróloga (es decir, una célula hospedera que no es T. emersonii ) .
Como se usa en la presente descripción, el término “purificado” se refiere al material (por ejemplo, un polipéptido o polinucleótido aislados) que está en un estado relativamente puro, por ejemplo, al menos aproximadamente 90 % de pureza, al menos aproximadamente 95 % de pureza, al menos aproximadamente 98 % de pureza, o incluso al menos aproximadamente 99 % de pureza.
Los términos “termoestable” y “termoestabilidad,” con referencia a una enzima, se refieren a la capacidad de la enzima de conservar la actividad después de una exposición a una temperatura elevada. La termoestabilidad de una enzima, tal como una enzima amilasa, se mide por su vida media (ti/2) dada en minutos, horas, o días, durante los que se pierde la mitad de la actividad enzimática bajo condiciones definidas. La vida media puede calcularse al medir la actividad a-amilasa residual después de una exposición a (es decir, reto con) una temperatura elevada.
Un “intervalo de pH”, con referencia a una enzima, se refiere a un intervalo de valores de pH en que la enzima exhibe actividad catalítica.
Como se usa en la presente descripción, los términos “estable en pH” y “estabilidad en pH” con referencia a una enzima, se refieren a la capacidad de la enzima de conservar la actividad en un amplio intervalo de valores de pH por un período de tiempo predeterminado (por ejemplo, 15 min, 30 min, 1 hora).
Como se usa en la presente descripción, el término “secuencia de aminoácidos” es sinónimo de los términos “polipéptido”, “proteína”, y “péptido”, y se usan indistintamente. En donde las secuencias de aminoácido muestran actividad, pueden mencionarse como una “enzima.” Los códigos de una letra o tres letras para residuos de aminoácido se usan con secuencias de aminoácido que se presentan en la orientación terminal estándar amino a carboxi (es decir, N C).
El término “ácido nucleico” abarca ADN, ARN, heterodú lexes, y moléculas sintéticas que puedan codificar un polipéptido. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenario o bicatenario, o pueden ser modificaciones químicas. Los términos “ácido nucleico” y “polinucleótido” se usan indistintamente. Debido a que el código genético es redundante, más de un codón puede usarse para codificar un aminoácido específico y las presentes composiciones y métodos abarcan secuencias de nucleótidos que codifican una secuencia de aminoácido específico. A menos que se indique de cualquier otra manera, las secuencias de ácido nucleico se presentan en una orientación de 5' a 3'.
Como se usa en la presente descripción, “hibridación” se refiere al proceso mediante el que una hebra de ácido nucleico forma un dúplex con, es decir, pares de bases con, una cadena complementaria, como ocurre durante las téenicas de hibridación con transferencia y las técnicas de PCR. Las condiciones de hibridación rigurosas se ejemplifican mediante la hibridación bajo las siguientes condiciones: 65 °C y 0.1 x SSC (en donde 1 x SSC = NaCl 0.15 M, citrato de Na3 0.015 M, pH 7.0). Los ácidos nucleicos dúplex hibridados se caracterizan por una temperatura de fusión (Tra), en donde la mitad de los ácidos nucleicos hibridados no está apareada con la cadena complementaria. Los nucleótidos con error de apareamiento dentro del dúplex bajan la Tm. Un ácido nucleico que codifica una variante de a-amilasa puede tener una Tm reducida en 1 °C - 3 °C o más en comparación con un dúplex formado entre el nucleótido de la sec. con núm. de ident.: 2 y su complemento idéntico.
Como se usa en la presente descripción, una molécula “sintética” se produce por síntesis química o enzimática in vi tro en lugar de por un organismo.
Como se usa en la presente descripción, los términos “transformado”, “transformado de manera estable”, y “transgénico”, usados con referencia a una célula significa que la célula contiene una secuencia de ácido nucleico no nativa (por ejemplo, heteróloga) integrada en su genoma o transportada como un episoma que se mantiene a través de múltiples generaciones.
El término “introducido” en el contexto de insertar una secuencia de ácido nucleico en una célula, significa “transíección” , “transformación” o “transducción”, como se conoce en la materia.
Una “cepa hospedera” o “célula hospedera” es un organismo en el que se ha introducido un vector de expresión, fago, virus, u otro constructo de ADN, que incluye un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés (por ejemplo, TeAmyl o una variante de esta) . Las cepas hospederas ilustrativas son células de microorganismos (por ejemplo, bacterias, hongos filamentosos, y levadura) capaces de expresar el polipéptido de interés y/o sacáridos de fermentación. El término “célula hospedera” incluye protoplastos creados a partir de células.
El término “heterólogo (a)”, con referencia a un polinucleótido o proteína, se refiere a un polinucleótido o proteína que no es de origen natural en una célula hospedera El término “endógeno(a)”, con referencia a un polinucleótido o proteína, se refiere a un polinucleótido o proteína de origen natural en la célula hospedera.
Como se usa en la presente descripción, el término “expresión” se refiere al proceso mediante el cual se produce un polipéptido en base a una secuencia de ácido nucleico. El proceso incluye la transcripción y la traducción.
Una “marcador selectivo” o “marcador seleccionable” se refiere a un gen capaz de expresarse en un hospedero para facilitar la selección de células hospederas que portan el gen. Los ejemplos de marcadores seleccionables incluyen, pero no se limitan a, antimicrobianos (por ejemplo, higromicina, bleomicina, o cloranlenicol) y/o genes que confieren una ventaja metabólica, tal como una ventaja nutricional, en la célula hospedera.
Un “vector” se refiere a una secuencia de polinucleótidos diseñada para introducir ácidos nucleicos en uno o más tipos celulares. Los vectores incluyen vectores de clonación, vectores de expresión, vectores lanzadera, plásmidos, partículas de fagos, casetes y lo similar.
Un “vector de expresión” se refiere a un constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de interés, cuya secuencia codificante está unida operativamente a una secuencia control adecuada capaz de efectuar la expresión del ADN en un hospedero adecuado. Las secuencias de control pueden incluir un promotor para efectuar la transcripción, una secuencia del operador opcional para controlar la transcripción, una secuencia que codifica los sitios de unión del ribosoma adecuados en el ARNm, potenciadores y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y traducción.
El término “unido operativamente” significa que los componentes específicos están en una relación (que incluye, pero no se limita a, la yuxtaposición) que les permite funcionar de una manera prevista. Por ejemplo, una secuencia amortiguadora está unida operativamente a una secuencia codificante de manera que la expresión de la secuencia codificante está bajo el control de las secuencias amortiguadoras.
Una “secuencia señal” es una secuencia de aminoácidos unida a la porción N-terminal de una proteína, lo que facilita la secreción de la proteína fuera de la célula. La forma madura de una proteína extracelular carece de la secuencia señal que es cortada durante el proceso de secreción.
Como se usa en la presente descripción, “biológicamente activo” se refiere a una secuencia que tiene una actividad biológica específica, tal como una actividad enzimática.
Como se usa en la presente descripción una “muestra” es una pieza de material, tal como una tela, en la que se aplicó una mancha. El material puede ser, por ejemplo, telas hechas de algodón, poliéster o mezclas de fibras naturales y sintéticas.
La muestra puede ser adicionalmente papel, tal como papel de filtro o nitrocelulosa, o una pieza de un material duro, tal como cerámica, metal o vidrio. Para las amilasas, la mancha es de base de almidón, pero puede incluir sangre, leche, tinta, pasto, té, vino, espinaca, salsa de carne, chocolate, huevo, queso, arcilla, pigmento, aceite o mezclas de estos compuestos.
Como se usa en la presente descripción, una “muestra más pequeña” es una sección de la muestra que se cortó con un dispositivo perforador de un solo orificio, o que se cortó con un dispositivo perforador de 96-orificios fabricado de manera personalizada, en donde el patrón del perforador de orificios múltiples coincide con las placas de microtitulación de 96 pocilios estándar, o la sección se extrajo de cualquier otra manera de la muestra. La muestra puede ser de tela, papel, metal u otro material adecuado. La mancha en la muestra más pequeña puede fijarse antes o después de que se coloca en el pocilio de una placa de microtitulación de 24, 48 o 96 pocilios. La muestra más pequeña puede elaborarse, además, mediante la aplicación de una mancha en una pieza pequeña de material. Por ejemplo, la muestra más pequeña puede ser una pieza de tela con una mancha de 1.59 cm o 0.64 cm (5/8 pulgadas o 0.25 pulgadas) de diámetro. El perforador fabricado personalizado se diseña de tal manera que suministre 96 muestras simultáneamente a todos los pocilios de una placa de 96 pocilios. El dispositivo permite el suministro de más de una muestra por pocilio con solo cargar la misma placa de 96 pocilios varias veces. Los dispositivos perforadores de orificios múltiples pueden pensarse de manera que suministren simultáneamente muestras a una placa de cualquier formato que incluyen, pero no se limitan a, las placas de 24, 48 y 96 pocilios. En otro método posible, la plataforma de prueba sucia puede ser una cuenta hecha de metal, plástico, vidrio, cerámica u otro material adecuado recubierto con el sustrato de suciedad. Después, la o las cuentas recubiertas se colocan en placas de 96, 48 o 24 pocilios o formatos más grandes que contienen amortiguador y enzima adecuados.
Como se usa en la presente descripción, “un material celular cultivado que comprende una TeAmyl o variante de esta” o un lenguaje similar, se refiere a un lisado celular o sobrenadante (que incluye los medios) que incluye una TeAmyl o variante de esta como un componente. El material celular puede ser de un hospedero heterólogo que se cultiva en cultivo para el propósito de producir la TeAmyl o variante de esta.
El “porcentaje de identidad de secuencia” significa que una variante tiene al menos un cierto porcentaje de residuos de aminoácidos idénticos a una TeAmyl silvestre, cuando se alinean mediante el uso del algoritmo CLUSTAL W con parámetros preestablecidos. Ver Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res . 22:4673-4680. Los parámetros por defecto para el algoritmo CLUSTAL W son penalización de apertura de interrupción: 10.0 penalización de extensión de interrupción: 0.05 matriz de peso de proteínas: serie BLOSUM matriz de peso del ADN: IUB % de secuencias divergentes con retardo: 40 distancia de la separación de interrupción: 8 peso de transiciones de ADN: 0.50 lista de residuos hidrófilos: GPSNDQEKR uso de matriz negativa: desactivado penalizaciones de residuos específicos activado cambiados: penalizaciones de hidrofílicos cambiados: activado penalización por separación de interrupción Desactivado. final cambiada Las supresiones se cuentan como residuos no idénticos, en comparación con una secuencia de referencia. Se incluyen las supresiones que ocurren en cualquiera de los extremos terminales. Por ejemplo, una variante con seis supresiones de aminoácidos del C-terminal del polipéptido de TeAmyl maduro de la sec. con núm. de ident.: 1 tendría un porcentaje de identidad de secuencia de 99 % (597 / 603 residuos idénticos x 100, redondeado al número entero más cercano) con relación al polipéptido maduro. Tal variante se abarcaría por una variante que tiene “al menos 99 % de identidad de secuencia” con un polipéptido TeAmyl maduro.
Las secuencias de polipéptidos “fusionadas” están conectadas, es decir, unidas operativamente, a través de un enlace peptidico entre las dos secuencias de polipéptidos.
El término “hongos filamentosos” se refiere a todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycotina.
El término “grado de polimerización” (DP) se refiere al número (n) de unidades de anhidroglucopiranosa en un sacárido determinado. Los ejemplos de DPI son los monosacáridos glucosa y fructosa. Los ejemplos de DP2 son los disacáridos maltosa y sacarosa. El término “DE,” o “equivalente de dextrosa,” se define como el porcentaje de azúcar reductor, por ejemplo, D-glucosa, como una fracción del carbohidrato total en un jarabe.
Como se usa en la presente descripción, el término “contenido de sólidos secos” (ds) se refiere al total de sólidos de una suspensión en base al por ciento en peso seco. El término “suspensión” se refiere a una mezcla acuosa que contiene sólidos insolubles.
La frase “sacarificación y fermentación simultáneas (SSF)” se refiere a un proceso en la producción de productos bioquímicos en que un organismo microbiano, tal como un microorganismo etanologénico, y al menos una enzima, tal como TeAmyl o una variante de esta, están presentes durante la misma etapa del proceso. SSF incluye la hidrólisis simultánea de sustratos de almidón (granular, licuado, o solubilizado) a sacáridos, que incluyen la glucosa, y la fermentación de los sacáridos a alcohol u otro producto bioquímico o biomaterial en el mismo recipiente reactor.
Como se usa en la presente descripción, “microorganismo etanologénico” se refiere a un microorganismo con la capacidad de convertir un azúcar u oligosacárido en etanol.
El término “bebida fermentada” se refiere a cualquier bebida producida mediante un método que comprende un proceso de fermentación, tal como una fermentación microbiana, por ejemplo, una fermentación bacteriana y/o por levadura.
La “cerveza” es un ejemplo de tal bebida fermentada, y el término “cerveza” pretende comprender cualquier mosto fermentado producido por fermentación/elaboración de cerveza de un material vegetal que contiene almidón. Frecuentemente, la cerveza se produce exclusivamente a partir de malta o agente adicional, o cualquier combinación de malta y agente adicional. Los ejemplos de cervezas incluyen: cerveza malteada completa, cerveza fermentada bajo el marco de la “Reinheitsgebot”, Ale, IPA, lager, bitter, Happoshu (segunda cerveza), tercera cerveza, cerveza seca, casi cerveza, cerveza ligera, cerveza con bajo contenido en alcohol, cerveza baja en calorías, porter, cerveza bock, stout, licor de malta, cerveza sin alcohol, licor de malta sin alcohol y similares pero, además, bebidas alternativas de cereales y de malta tales como bebidas de malta con sabor a frutas, por ejemplo, bebidas de malta con sabor a cítrico, tal como con sabor a limón, naranja, lima, o baya, bebidas de malta con sabor a licor, por ejemplo, licor de malta con sabor a vodka, ron, o tequila, o bebidas de malta con sabor a café, tal como el licor de malta con sabor a cafeína, y similares.
El término “malta” se refiere a cualquier grano de cereal malteado, tal como la cebada o el trigo malteados.
El término “agente adicional” se refiere a cualquier material vegetal que contiene almidón y/o azúcar que no es malteado, tal como la cebada o el trigo malteados. Los ejemplos de agentes adicionales incluyen sémola de maíz común, sémola de maíz refinado, levadura molida de cerveza, arroz, sorgo, almidón de maíz refinado, cebada, almidón de cebada, cebada descascarillada, trigo, almidón de trigo, cereales torrefactados, hojuelas de cereales, centeno, avena, papa, tapioca, mandioca y jarabes, tales como jarabe de maíz, jarabe de caña de azúcar, jarabe de azúcar invertido, jarabes de trigo y/o cebada, y similares.
El término “templa” se refiere a una suspensión acuosa de cualquier material vegetal que contiene almidón y/o azúcar, tal como material para moler, por ejemplo, que comprende cebada malteada aplastada, cebada aplastada, y/u otro agente adicional o una combinación de estos, mezclados con agua después de ser separados en mosto y granos gastados.
El término “mosto” se refiere al licor no fermentado derramado tras la extracción del material para moler durante la maceración.
El “almidón con yodo positivo” o “IPS” se refiere a (1) amilosa que no se hidroliza después de la licuación y sacarificación, o (2) un polímero de almidón retrogradado. Cuando se prueba el almidón sacarificado o el licor de sacáridos con yodo, la amilosa con un DPn alto o el polímero de almidón retrogradado se une al yodo y produce un color azul característico. Así el licor de sacáridos se denomina “sacárido positivo al yodo”, “sacárido azul,” o “sac. azul”.
Los términos “almidón retrogradado” o “retrogradación del almidón” se refieren a los cambios que se producen espontáneamente en una pasta de almidón o en el gel durante el envejecimiento. 2. a-amilasa de Talaromyces emersonii (TeAmyl) y variantes de esta Se proporciona un polipéptido de TeAmyl aislado y/o purificado de T. emersonii o una variante de este que tiene actividad a-amilasa. El polipéptido de TeAmyl puede ser el polipéptido maduro de TeAmyl que comprende los residuos 1-603 de la secuencia de polipéptidos representada en la sec. con núm. de ident.: 1. Los polipéptidos pueden fusionarse con secuencias de aminoácidos adicionales en el extremo N-terminal y/o C-terminal. Las secuencias adicionales N- terminal pueden ser un péptido señal, que puede tener la secuencia mostrada en la sec. con núm. de ident.: 3, por ejemplo. Otras secuencias de aminoácidos fusionados en cualquiera de los extremos terminales incluyen polipéptidos parejas de fusión útiles para marcar o purificar la proteína.
Una a-amilasa de T. emersonii incluye la a-amilasa que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en la sec. con núm. de ident.: 1: LTPAEWRKQSIYFLLTDRFGRADNSTTAACDVTERIYCGGSWQGIINHLDYIQGMGFTAIW ISPVTEQLPQNTGEGEAYHGYWQQEIYTVNSNFGTSDDLLALSKALHDRGMYLMVDW ANH MGYDGDGDSVDYSVFNPFNSSSYFHPYCLITDYSNQTDVEDCWLGDTTVSLPDLNTTETW RTIWYDWVADLVSNYSIDGLRIDTVKHVEKSFWPGYNSAAGVYCVGEVLDGDPSYTCPYQD YLDGVLNYPIYYQLLYAFESSSGSISNLYNMINSVASECSDPTLLGNFIENHDNPRFASYT SDYSLAKNVIAFIFFSDGIPIVYAGQEQHYNGGNDPYNREATWLSGYSTTAELYTFIATTN AIRSLAISVDSEYLTYKNDPFYYDSNTLAMRKGSDGLQVITVLSNLGADGSSYTLTLSGSG YSSGTELVEAYTCTTVTVDSMGDIPVPMESGLPRVFLPASSFSGSSLCSSSPSPTTTTSTS TSTTSTACTTATAVAVLFEELVTTTYGENVYLSGSISQLGDWNTDDAVALSAANYTSSNPL WYVTVTLPVGTSFEYKFIKKEENGDVEWESDPNRSYTVPTACTGATETIVDTWR.
Los aminoácidos destacados en negritas anteriores constituyen el dominio de unión a carbohidratos (CBM) C-terminal simulado (sec. con núm. de ident: 10). Una región conectora glicosilada simulada (aminoácidos resaltados en negritas arriba,· Sec. con núm. de ident.: 11) conecta el núcleo catalítico N-terminal con el dominio CBM simulado. El dominio CBM simulado en TeAmyl es homólogo a un dominio CBM20 encontrado en un gran número de enzimas degradantes de almidón, que incluyen alf -amilasas, beta-amilasas, glucoamilasas y ciclodextrina glucanotransferasas. El CBM20 se pliega como una estructura en barril beta antiparalela con dos sitios 1 y 2 de unión al almidón. Se cree que estos dos sitios difieren funcionalmente: el sitio 1 puede actuar como el sitio de reconocimiento inicial del almidón, mientras que el sitio 2 puede estar implicado en el reconocimiento específico de regiones apropiadas del almidón. Ver Sorimachi et al. (1997) “Solution structure of the granular starch binding domain of Aspergillus niger glucoamylase bound to beta-cyclodextrin,” Structure 5(5): 647-61. Los residuos en el dominio CBM simulado de TeAmyl que se conservan con los sitios de unión al almidón 1 y 2 se indican en la secuencia incluida más abajo por medio de los números 1 y 2, respectivamente: ACTTATAVAVLFEELVTTTYGENVYLSGSISQLGDWNTDDAVALSAANYTSSNPLWYVTVTLPV 222222 1 1 lili 2 2222 22 GTSFEYKFIKKEENGDVEWESDPNRSYTVPTACTGATETIVDTWR (sec . con núm. de ident . : 10) . 1 Una variante de TeAmyl puede comprender algunos o ninguno de los residuos de aminoácidos del dominio CBM simulado de la sec. con núm. de ident.: 10 o el conector simulado de la sec. con núm. de ident.: 11. Una variante puede comprender, alternativamente, un dominio CBM con al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 98 % de identidad de secuencia con el dominio CBM simulado de la sec. con núm. de ident.: 10. Una variante puede comprender un dominio CBM20 heterólogo o diseñado por ingeniería genética.
La TeAmyl o variante de esta pueden expresarse en una célula hospedera eucariota, por ejemplo, una célula fúngica filamentosa, que permite una glicosilación apropiada de la secuencia enlazadora, por ejemplo.
La secuencia de nucleótidos del gen de TeAmyl aislado de Talaromyces emersonii se expone como la sec. con núm. de ident. :2. Los intrones previstos se muestran en letra cursiva y minúscula.
La secuencia de polipéptidos de la TeAmyl es similar a otras alfa-amilasas fúngicas. Por ejemplo, la TeAmyl tiene una alta identidad de secuencia con las siguientes a-amilasas fúngicas: 77 % de identidad de secuencia con la a-amilasa de Aspergillus fumigatus Af293 (sec. con núm. de ident.: 4); 77 % de identidad de secuencia con la a-amilasa simulada de Aspergillus fumigatus A1163 (sec. con núm. de ident.: 5); 77 % de identidad de secuencia con la a-amilasa simulada de Neosartorya fischeri NRRL 181 (sec. con núm. de ident.: 6); 78 % de identidad de secuencia con el precursor de a-amilasa de Aspergillus terreus N1H2624 (sec. con núm. de ident.: 7); 75 % de identidad de secuencia con la a-amilasa de Aspergillus kawachii (sec. con núm. de ident.: 8); y 76 % de identidad de secuencia con la a-amilasa de Aspergillus awamori (sec. con núm. de ident.: 9).
La identidad de secuencia se determinó mediante un alineamiento BLAST, mediante el uso de la forma madura de la TeAmyl de la sec. con núm. de ident.: 1 (es decir, los residuos 1-603) como la secuencia de consulta. Ver Altschul et al. (1990) J. Mol . Biol .215: 403-410.
Se proporciona una variante de un polipéptido de TeAmyl. La variante puede consistir en o comprender un polipéptido con al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, o al menos 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido de los residuos 1-603 o residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1, en donde la variante comprende una o más modificaciones de aminoácidos seleccionadas de una sustitución, inserción, o supresión de uno o más aminoácidos correspondientes en la sec. con núm. de ident.: 4-9. Por ejemplo, una variante que consiste en un polipéptido con al menos 99 % de identidad de secuencia con el polipéptido de los residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 puede tener uno a seis sustituciones, inserciones, o supresiones de aminoácidos, comparado con la TeAmyl de la sec con núm. de ident.: 1. En comparación, una variante que consiste en un polipéptido con al menos 99 % de identidad de secuencia con el polipéptido de los residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.: 1 tendría hasta cinco modificaciones de aminoácidos. Las inserciones o supresiones pueden estar en cualquiera de los terminales del polipéptido, por ejemplo. Alternativamente, la variante puede “comprender” un polipéptido que consiste en un polipéptido con al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido de los residuos 1-603 o los residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.: 1. En una variante tal, pueden fusionarse residuos de aminoácidos adicionales a cualquiera de los extremos terminales del polipéptido. Por ejemplo, la variante puede comprender la secuencia señal de la sec. con núm. de ident.: 3 fusionada en el marco con un polipéptido con una o más sustituciones o supresiones de aminoácidos en comparación con el polipéptido de los residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.: 1. La variante puede estar glicosilada, independientemente de si la variante “comprende” o “consiste” en una secuencia determinada de aminoácidos.
Un alineamiento ClustalW entre TeAmyl (sec. con núm. de ident.: 1) y las a-amylases de Aspergíllus fumigatus Af293 (sec. con núm. de ident.: 4); Aspergíllus fumigatus A1163 (sec. con núm. de ident.: 5); Neosartorya fischeri NRRL 181 (sec. con núm. de ident.: 6); Aspergíllus terreus N1H2624 (sec. con núm. de ident.: 7); Aspergíllus kawachii (sec. con núm. de ident.: 8); y Aspergíllus awamori (sec. con núm. de ident.: 9) se muestran en la Fig.1. Ver Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680. Generalmente, el grado de conservación de un aminoácido en un alineamiento de secuencias de proteínas relacionadas es proporcional a la importancia relativa de la posición del aminoácido con respecto a la función de la proteína. Es decir, los aminoácidos que son comunes en todas las secuencias relacionadas probablemente juegan un papel funcional importante y no pueden sustituirse fácilmente. Igualmente, las posiciones que varían entre las secuencias probablemente pueden sustituirse con otros aminoácidos o modificarse de cualquier otra manera, mientras se mantenga la actividad de la proteína.
Se ha determinado la estructura cristalina de la OÍ-amilasa de A. niger, que incluye un complejo de la enzima con una maltosa unida a su sitio activo. Ver, por ejemplo, Vujicic-Zagar et al. (2006) “Monoclinic crystal form of Aspergillus niger a-amilasa in complex with maltose at 1.8 Á resolution,” Acta Crystallogr. Sect. F: Struct . Biol . Cryst . Commun. 62(8):716-21. La a-amilasa de A. niger descrita en Vujicic-Zagar (2006) se conoce, además, como TAKA-amilasa, un homólogo de la a-amilasa de A. oryzae. La secuencia de aminoácidos de TAKA-amilasa (sec. con núm. de ident.: 12) tiene un 71 % de identidad de secuencia con la TeAmyl, cuando se alinea con el uso del algoritmo BLAST sobre los residuos 2-478 de TeAmyl. Dada la relativamente alta conservación de la secuencia de aminoácidos entre la TAKA-amilasa yTeAmyl, se espera que TeAmyl adopte muchas de las estructuras secundarias y posea relaciones estructura/función similares a la TAKA-amilasa. Por ejemplo, se espera que la TeAmyl tenga un sitio de unión a Ca2+ de alta afinidad y una hendidura de unión a la maltosa como TAKA-amilasa. Consistente con esta expectativa, los tres aminoácidos ácidos que participan en la reacción de hidrólisis catalizada por la TAKA-amilasa, D206, E230, y D297, todos se conservan en la TeAmyl silvestre. Las posiciones Y155, L166, D233, y D235, localizadas cerca de la hendidura de unión, también se conservan en TeAmyl. Otras posiciones conservadas de TeAmyl corresponden a N121, E162, D175, y H210 de la TAKA-amilasa, que constituyen el sitio de unión a Ca2+ de alta afinidad. Ver Vujicic-Zagar (2006).
Las alineaciones mostradas en la Fig.1 y las relaciones estructurales comprobadas a partir de la estructura cristalina de la TAKA-amilasa, por ejemplo, pueden guiar la construcción de polipéptidos variantes de TeAmyl que tienen actividad a-amilasa. Los polipéptidos variantes de TeAmyl incluyen, pero no se limita a, aquellos con una modificación de aminoácidos seleccionada de una sustitución, inserción, o supresión de un aminoácido correspondiente en la sec. con núm. de ident.: 4-9. La correspondencia entre las posiciones en TeAmyl y las a-amilasas de las sec. con núms. de ident.: 4-9 se determina con referencia al alineamiento ilustrado en la Figura 1. Por ejemplo, una variante del polipéptido de TeAmyl puede tener la sustitución E34Q/D, en donde Q y D son aminoácidos correspondientes en las sec. con núms. de ident.: 4-9. Los polipéptidos variantes de TeAmyl incluyen, además, pero no se limitan a, aquellos con 1, 2, 3, o 4 modificaciones de aminoácidos seleccionadas al azar. Las modificaciones de aminoácidos pueden producirse mediante el uso de metodologías muy conocidas, tales como la mutagénesis oligo-dirigida.
Además, se proporcionan ácidos nucleicos que codifican el polipéptido de TeAmyl o variante de esta. Un ácido nucleico que codifica la TeAmyl puede ser ADN genómico, por ejemplo, la sec. con núm. de ident.: 2. Como entiende un experto en la materia, el código genético es redundante, lo que significa que múltiples codones en algunos casos pueden codificar el mismo aminoácido. Los ácidos nucleicos incluyen todas las secuencias de ADN, ARNm y ADNc genómicos que codifican una TeAmyl o variante de esta.
La TeAmyl o variantes de estas puede ser “precursoras”, “inmaduras”, o “de longitud total”, en cuyo caso incluyen una secuencia señal, o “maduras”, en cuyo caso, carecen de una secuencia señal. Las variantes de a-amilasas pueden estar, además, truncadas en los extremos N o C-terminales, siempre que los polipéptidos resultantes conserven la actividad a-amilasa. 2.1. Caracterización de una variante de TeAmyl Los polipéptidos variantes de TeAmyl conservan la actividad a-amilasa. Pueden tener una actividad específica mayor o menor que el polipéptido de TeAmyl silvestre. Las características adicionales de la variante de TeAmyl incluyen estabilidad, intervalo de pH, estabilidad de oxidación y termoestabilidad, por ejemplo. Por ejemplo, la variante puede tener un pH estable por 24-60 horas desde pH 3 a aproximadamente pH 7.5, por ejemplo, pH 3.0-5.8; pH 3.5-5.0; pH 3.5-4.5; pH 3.8-4.8; pH 3.5, pH 3.8, o pH 4.5. Una variante de TeAmyl puede expresarse en niveles más altos que la TeAmyl en estado natural y, al mismo tiempo, conservar las características de rendimiento de la TeAmyl en estado natural. Las variantes de TeAmyl pueden tener, además, una estabilidad a la oxidación modificada en comparación con la a-amilasa parental. Por ejemplo, una disminución de la estabilidad a la oxidación puede ser favorable en una composición para la licuación del almidón. Las variantes de TeAmyl tienen una termoestabilidad modificada en comparación con la a-amilasa silvestre. Tales variantes de TeAmyl son favorables para usarse en el horneado u otros procesos que requieren temperaturas elevadas. Los niveles de expresión y actividad enzimática pueden evaluarse mediante el uso de ensayos estándar conocidos para el experto en este campo, que incluyen los descritos más abajo. 3. Producción de TeAmyl y variantes de esta La TeAmyl o variante de esta pueden aislarse a partir de una célula hospedera, por ejemplo, mediante la secreción de la TeAmyl o una variante a partir de la célula hospedera. Un material celular cultivado que comprende una TeAmyl o variante de esta puede obtenerse después de la secreción de la TeAmyl o una variante a partir de la célula hospedera. La TeAmyl o variante se purifica opcionalmente antes del uso. El gen de TeAmyl puede clonarse y expresarse de conformidad con métodos conocidos en la materia. Las células hospederas adecuadas incluyen células de bacterias, de plantas, algas terrestres, algas marinas, células de levadura o de hongos, por ejemplo, células de hongos filamentosos. Las células hospederas particularmente útiles incluyen levadura, Talaromyces emersonii o Trichoderma reesei . Otras células hospederas incluyen células bacterianas, por ejemplo, Bacillus subtilis o B. licheniformis .
La célula hospedera puede expresar, además, un ácido nucleico que codifica una glucoamilasa homologa o heteróloga, es decir, una glucoamilasa que no es de la misma especie que la célula hospedera, o una o más enzimas. La glucoamilasa puede ser una variante de glucoamilasa, tal como una de las variantes de glucoamilasa descritas en la patente de los Estados Unidos núm.8,058,033 (Danisco US Inc.), por ejemplo. Adicionalmente, el hospedero puede expresar una o más enzimas, proteínas, péptidos accesorios. Estos pueden ser ventajosos para los procesos de licuefacción, sacarificación, fermentación, SSF, etc. Además, la célula hospedera puede producir productos bioquímicos además de las enzimas usadas para digerir la o las diversas materias primas o enzimas usadas para producir los productos bioquímicos o intermedios. Tales células hospederas pueden ser útiles para los procesos de fermentación o de sacarificación y fermentación simultáneos para reducir o eliminar la necesidad de adicionar enzimas. 3.1. Vectores Un constructo de ADN que comprende un ácido nucleico que codifica una TeAmyl o variante de esta puede construirse para expresarse en una célula hospedera. Debido a la degeneración del código genético conocida, pueden diseñarse variantes de polinucleótidos que codifican una secuencia de aminoácidos idéntica y pueden fabricarse con experiencia rutinaria. Además, se conoce en la materia el optimizar el uso de codones para una célula hospedera particular. Los ácidos nucleicos que codifican una TeAmyl o variante de esta pueden incorporarse en un vector. Los vectores pueden transferirse a una célula hospedera mediante el uso de téenicas de transformación muy conocidas, tales como las descritas más abajo.
El vector puede ser cualquier vector que puede transformarse a una célula hospedera y puede replicarse dentro de ella. Por ejemplo, un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una TeAmyl o variante de esta puede transformarse y replicarse en una célula hospedera bacteriana como un medio de propagar y amplificar el vector. Además, el vector puede transformarse en un hospedero de expresión, de manera que los ácidos nucleicos codificantes puedan expresarse como una TeAmyl o variante de esta funcional. Las células hospederas que sirven como hospederos de expresión pueden incluir hongos filamentosos, por ejemplo. El Catálogo de Cepas del Centro Fungal Genetics Stock Center (FGSC) enumera vectores adecuados para la expresión en células hospederases fúngicas. Ver FGSC, Catalogue of Strains, Universidad de Missouri, en www.fgsc.net (última modificación, 17 de enero de 2007). Un vector representativo es el plásmido pZZH426 (Figura 2), que comprende un vector de expresión de pTrex3gM (solicitud de patente publicada de los EE. UU. núm. 2011/0136197 Al). pZZH426 permite, además, la expresión de un ácido nucleico que codifica la TeAmyl bajo el control del promotor de cbhl en una célula hospedera fúngica. pZZH426 puede elaborarse y modificarse de la manera habitual para comprender y expresar un ácido nucleico que codifica una variante de TeAmyl.
Un ácido nucleico que codifica una TeAmyl o una variante de esta puede estar unido operativamente a un promotor adecuado, lo que permite la transcripción en la célula hospedera. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestra actividad de transcripción en la célula hospedera elegida y puede derivarse de genes que codifican proteínas homologas o heterólogas a la célula hospedera. Los promotores ilustrativos para dirigir la transcripción de la secuencia de ADN que codifica una TeAmyl o variante de esta, especialmente en un hospedero bacteriano, son el promotor del operón lac de E. coli , los promotores dagA o celA del gen agarasa de Streptomyces coelicolor, los promotores del gen de -amilasa de Bacillus licheniformis ( amyL), los promotores del gen de la amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus ( amyM), los promotores del gen de la a-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens ( amyQ ) , los promotores de los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, etc. Para la transcripción en un hospedero fúngico, los ejemplos de promotores útiles son aquellos derivados del gen que codifica la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei , la a-amilasa neutra de Aspergillus niger, la a-amilasa estable ácida de A. niger, la glucoamilasa de A. niger, la lipasa de Rhizomucor miehei , la proteasa alcalina de A. oryzae, la triosa fosfato isomerasa de A. oryzae o la acetamidasa de A. nidulans. Cuando un gen que codifica una TeAmyl o variante de esta se expresa en una especie bacteriana, tal como E. coli , puede seleccionarse un promotor adecuado, por ejemplo, de un promotor bacteriófago que incluye un promotor T7 y un promotor lambda del fago. Los ejemplos de promotores adecuados para la expresión en una especie de levadura incluyen, pero no se limitan a, los promotores Gal 1 y Gal 10 de Saccharomyces cerevisiae y los promotores AOX1 o AOX2 de Pichia pastoris . El vector pZZH426 representado en la Figura 2, por ejemplo, contiene un promotor cbhl unido operativamente a TeAmyl . El promotor cbhl es un promotor endógeno inducible de T. reesei . Ver Liu et al. (2008) “Improved heterologous gene expression in Trichoderma reesei by cellobiohydrolase I gene (cbhl) promoter optimization,” Acta Biochim. Biophys . Sin (Shanghai) 40(2): 158-65.
La secuencia codificante puede unirse operativamente a una secuencia señal. El ADN que codifica la secuencia señal puede ser la secuencia de ADN asociada naturalmente con el gen TeAmyl a expresar. Por ejemplo, el ADN puede codificar la secuencia señal de TeAmyl de la sec. con nú . de ident.: 3 unida operativamente a un ácido nucleico que codifica una TeAmyl o una variante de esta. El ADN codifica una secuencia señal procedente de una especie distinta de T. emersonii . Una secuencia señal y una secuencia promotora que comprenden un constructo o vector de ADN pueden introducirse en una célula hospedera fúngica y pueden derivarse de la misma fuente Por ejemplo, la secuencia señal puede ser la secuencia señal cbhl que está unida operativamente a un promotor cbhl.
Un vector de expresión puede comprender, además, un terminador de transcripción adecuado y, en los eucariotas, secuencias de poliadenilación unidas operativamente a la secuencia de ADN que codifica una TeAmyl o variante de esta. Las secuencias de terminación y poliadenilación pueden derivarse adecuadamente de las mismas fuentes que el promotor.
El vector puede comprender, además, una secuencia de ADN que permite la replicación del vector en la célula hospedera. Los ejemplos de tales secuencias son los orígenes de replicación de los plásmidos pUC19, pACYC177, pUBU O, pE194, pAMBl, y mlJ702.
El vector puede comprender, además, un marcador seleccionable, por ejemplo, un gen, el producto del cual complementa un defecto en la célula hospedera aislada, tal como los genes dal de B. subtilis o B . licheniformis, o un gen que confiere resistencia a los antibióticos tales como, por ejemplo, resistencia a la ampicilina, canamicina, cloranlenicol o tetracíclina. Además, el vector puede comprender marcadores de selección de Aspergillus tales como amdS, argB, niaD y sC, un marcador que genera resistencia a la higromicina o la selección puede realizarse por cotransformación, tal como se conoce en la materia. Ver, por ejemplo, la solicitud internacional del PCT núm. WO 91/17243.
La expresión intracelular puede ser favorable en algunos aspectos, por ejemplo, cuando se usan ciertas bacterias u hongos como células hospederas para producir grandes cantidades de una TeAmyl o variante de esta para una purificación posterior. Además, la secreción extracelular de la TeAmyl o variante de esta al medio de cultivo puede usarse para producir un material celular cultivado que comprende la TeAmyl o variante de esta aislada.
El vector de expresión incluye, típicamente, los componentes de un vector de clonación, tal como, por ejemplo, un elemento que permite la replicación autónoma del vector en el organismo hospedero seleccionado y uno o más marcadores detectables fenotípicamente para propósitos de selección. El vector de expresión comprende, generalmente, secuencias de nucleótidos de control, tal como un promotor, operador, sitio de unión al ribosoma, señal de iniciación de traducción y, opcionalmente, un gen represor o uno o más genes activadores. Adicionalmente, el vector de expresión puede comprender una secuencia que codifica una secuencia de aminoácidos capaz de dirigir a la TeAmyl o variante de esta a un organelo de la célula hospedera tal como un peroxisoma, o a un compartimento particular de la célula hospedera. La secuencia de acceso incluye, pero no se limita a, serina-lisina-leucina (SKL), que es una señal objetivo de la peroxisoma conocida. Para la expresión bajo la dirección de secuencias control, la secuencia de ácido nucleico de la TeAmyl o variante de esta está unida operativamente a las secuencias control de manera adecuada con respecto a la expresión.
Los procedimientos usados para ligar el constructo de ADN que codifica una TeAmyl o variante de esta, el promotor, terminador y otros elementos, respectivamente, y para insertarlos en vectores adecuados que contienen la información necesaria para replicación, son muy conocidos para los expertos en la materia {ver, por ejemplo, Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2.° ed., Coid Spring Harbor, 1989, y 3.° ed., 2001). 3.2. Transformación y cultivo de celulas hospederas Una célula aislada, que comprende ya sea un constructo de ADN o un vector de expresión, se usa favorablemente como una célula hospedera en la producción recombinante de una TeAmyl o variante de esta. La célula puede transformarse con el constructo de ADN que codifica la enzima, convenientemente mediante la integración del constructo de ADN (en una o más copias) en el cromosoma hospedero. Esta integración se considera, generalmente, como una ventaja ya que es más probable que la secuencia de ADN se mantenga establemente en la célula. La integración de los constructos de ADN en el cromosoma hospedero puede realizarse de conformidad con métodos convencionales, por ejemplo, por recombinación homologa o heteróloga. Alternativamente, la célula puede transformarse con un vector de expresión tal como se describió anteriormente en relación con los distintos tipos de células hospederas.
Los ejemplos de organismos hospederos bacterianos adecuados son especies de bacterias Gram positiva tales como Bacillaceae que incluyen Bacillus subtilis , Bacillus licheniformis , Bacillus lentus, Bacillus brevis, Geobacillus (anteriormente Bacillus) stearothermophilus , Bacillus alkalophilus , Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, y Bacillus thuringiensis; especies Streptomyces tales como Streptomyces murinus; especies de bacterias de ácido láctico que incluyen Lactococcus sp. tales como Lactococcus lactis; Lactobacillus sp. que incluye Lactobacillus reuteri; Leuconostoc sp.; Pediococcus sp.; y Streptococcus sp. Alternativamente, como organismo hospedero pueden seleccionarse especies bacterianas Gram-negativas que pertenecen a Enterobacteriaceae y que incluyen E. coli o que pertenecen a Pseudomonadaceae .
Un organismo hospedero de levadura adecuado puede seleccionarse de especies de levaduras bioteenológicamente relevantes tales como, pero sin limitarse a, especies de levadura tales como las especies Pichia sp., Hansenula sp., o Kluyveromyces , Yarrowinia, Schizosaccharomyces o una especie de Saccharomyces , que incluye Saccharomyces cerevisiae o una especie que pertenece a Schizosaccharomyces tal como, por ejemplo, la especie S. pombe . Una cepa de la especie de levadura metilotrópica, Pichia pastoris puede usarse como el organismo hospedero. Alternativamente, el organismo hospedero puede ser una especie Hansenula. Los organismos hospedero adecuados entre los hongos filamentosos incluyen las especies de Aspergillus, por ejemplo, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus tubigensis, Aspergillus awamori, o Aspergillus nidulans. Alternativamente, las cepas de una especie Fusarium, por ejemplo, Fusarium oxysporum o de una especie Rhizomucor tal como Rhizomucor miehei pueden usarse como organismo hospedero. Otras cepas adecuadas incluyen las especies Thermomyces y Mucor. Adicionalmente, la Trichoderma sp. puede usarse como un hospedero. Un procedimiento adecuado para la transformación de células hospederas de Aspergillus incluye, por ejemplo, el descrito en EP 238023. La TeAmyl o variante de esta expresadas por una célula hospedera fúngica puede estar glicosilada, es decir, la TeAmyl o variante de esta comprenderán una porción glicosilo. El patrón de glicosilación puede ser el mismo que el presente en la TeAmyl silvestre.
Es favorable eliminar genes de los hospederos de expresión, en donde la deficiencia del gen puede curarse por el vector de expresión transformado. Pueden usarse métodos conocidos para obtener una célula hospedera fúngica que tiene uno o más genes inactivados. La desactivación de genes podría lograrse por la eliminación parcial o total, la desactivación insercional o por cualquier otro método que produce un gen no funcional para su fin previsto de manera que se evite que el gen exprese una proteína funcional . Cualquier gen de Trichoderma sp. u otro hospedero fúngico filamentoso que se clonó puede eliminarse, por ejemplo, los genes cbhl , cbh2, egll , y egl2. La supresión de genes puede llevarse a cabo al insertar una forma del gen que se desea inactivar dentro de un plásmido mediante métodos conocidos en la materia.
La introducción de un vector o constructo de ADN en una célula hospedera incluye téenicas tales como transformación; electroporación; microinyección nuclear; transducción; transfección (por ejemplo, transfección mediada por DEAE-dextrina y lipofección; incubación con precipitado de ADN de fosfato calcico); bombardeo de alta velocidad con microproyectiles revestidos con ADN; y fusión de protoplasto. Las técnicas generales de transformación se conocen en la materia. Ver, por ejemplo, Sambrook et al. (2001), supra. La expresión de la proteína heteróloga en Trichoderma se describe, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos núm. 6,022,725. Se hace referencia a Cao et al. (2000) Science 9:991-1001 para la transformación de cepas de Aspergillus. Pueden construirse transformantes genéticamente estables con sistemas de vectores de manera que el ácido nucleico que codifica una TeAmyl o variante de esta se integra establemente en un cromosoma de la cepa hospedera. Los transformantes se seleccionan y purifican después por técnicas conocidas.
La preparación de Trichoderma sp. para la transformación, por ejemplo, puede implicar la preparación de protoplastos a partir de micelios fúngicos. Ver Campbell et al. (1989) Curr. Genet . 16: 53-56. Los micelios pueden obtenerse a partir de esporas vegetativas germinadas. Los micelios se tratan con una enzima que digiere la pared celular, lo que resulta en protoplastos. Los protoplastos se protegen por la presencia de un estabilizador osmótico en el medio de suspensión. Estos estabilizantes incluyen sorbitol, manitol, cloruro potásico, sulfato magnésico, y similares. Usualmente, la concentración de estos estabilizadores varía entre 0.8 M y 1.2 M, por ejemplo, puede usarse una solución de sorbitol de 1.2 M en el medio de suspensión.
La captación de ADN en la cepa de Trichoderma sp. depende de la concentración de iones de calcio. Generalmente, se usa entre aproximadamente 10-50 mM CaCl2 en una solución de captación. Los compuestos adicionales adecuados incluyen un sistema amortiguador, tal como amortiguador TE (Tris 10 mM, pH 7.4; 1 mM EDTA) o 10 mM MOPS, pH 6.0 y polietilenglicol. Se cree que el polietilenglicol actúa para fusionar las membranas celulares y, así, permite que los contenidos del medio se envíen al citoplasma de la cepa de Trichoderma sp. Esta fusión deja, frecuentemente, múltiples copias del ADN plasmídico integradas en el cromosoma hospedero.
Usualmente, la transformación de Trichoderma sp. usa protoplastos o células que se han sometido a un tratamiento de permeabilidad, típicamente, a una densidad de 105 a 107/ml, particularmente, 2xl06/ml. Un volumen de 100 ml de estos protoplastos o células en una solución adecuada (por ejemplo, sorbitol 1.2 M y CaCl2 50 mM) puede mezclarse con el ADN deseado. Generalmente, se añade una concentración alta de PEG a la solución de captación. De 0.1 a 1 volumen de 25 % de PEG 4000 puede adicionarse a la suspensión de protoplastos; sin embargo, es útil adicionar aproximadamente 0.25 volúmenes a la suspensión de protoplastos. Aditivos, tales como sulfóxido de dimetilo, heparina, spermidina, cloruro de potasio y similares, podrían adicionarse a la solución de captación para facilitar la transformación. Hay disponibles procedimientos similares para otras células hospederas fúngicas. Ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm.6,022,725. 3.3. Expresión Un método para producir una TeAmyl o variante de esta puede comprender cultivar una célula hospedera como se describió anteriormente en condiciones que conducen a la producción de la enzima y la recuperación de la enzima de las células y/o medio de cultivo.
El medio usado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para cultivar la célula hospedera en cuestión y obtener la expresión de una TeAmyl o variante de esta. El medio y los componentes del medio adecuados están disponibles de proveedores comerciales o pueden prepararse de conformidad con recetas publicadas (por ejemplo, como se describe en los catálogos de la American Type Culture Collection).
Una enzima secretada por las células hospederas puede usarse en una preparación de caldo de cultivo completo. En los presentes métodos, la preparación de un caldo de fermentación completo gastado de un microorganismo recombinante puede lograrse mediante el uso de cualquier método de cultivo conocido en la materia que resulte en la expresión de una OÍ-amilasa. Por lo tanto, la fermentación puede comprender el cultivo en un matraz de agitación, fermentación pequeña o gran escala (que incluye fermentaciones continuas, por lote, por lote alimentado, o en estado sólido) en termentadores de laboratorio o industriales realizada en un medio adecuado y bajo condiciones que permitan la expresión o el aislamiento de la celulasa. El término “caldo de fermentación completo gastado” se define en la presente descripción como los contenidos no fraccionados del material de fermentación que incluye medio de cultivo, proteínas extracelulares (por ejemplo, enzimas), y biomasa celular. Se entiende que el término “caldo de fermentación completo gastado” abarca, además, la biomasa celular que se ha U sado o permeabilizado mediante el uso de métodos bien conocidos en la materia.
Una enzima secretada de las células hospederas puede recuperarse convenientemente del medio de cultivo mediante procedimientos muy conocidos que incluyen separar las células del medio por centrifugación o filtración y, en algunos casos, concentrar el caldo de cultivo depurado. Otros procesos pueden incluir precipitar los componentes proteínicos del medio con el uso de una sal, tal como sulfato amónico, seguido de procedimientos cromatográficos, tales como cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de afinidad o similares.
El polinucleótido que codifica la TeAmyl o una variante de esta en un vector puede estar unido operativamente a una secuencia control que es capaz de proporcionar la expresión de la secuencia codificante por parte de la célula hospedera, es decir, el vector es un vector de expresión. Las secuencias control pueden modificarse, por ejemplo mediante la adición de otros elementos amortiguadores de la transcripción para hacer que el nivel de transcripción dirigido por las secuencias control sea más sensible a los moduladores transcripcionales. Las secuencias control pueden comprender, particularmente, promotores.
Las células hospederas pueden cultivarse bajo condiciones adecuadas que permitan la expresión de la TeAmyl o variante de esta. La expresión de enzimas puede ser constitutiva de manera que las proteínas se producen continuamente o inducible, es decir, que se requiere un estímulo para iniciar la expresión. En el caso de la expresión inducible, la producción de proteínas puede comenzar cuando se requiere, por ejemplo, por la adición de una sustancia inductora al medio de cultivo, por ejemplo, dexametasona o IPTG o Sophorose. Además, los polipéptidos pueden producirse de manera recombinante en un sistema libre de células in vitro, tal como el sistema de reticulocitos de conejo TnT™ (Promega).
Un hospedero de expresión puede cultivarse, además, en el medio adecuado para el hospedero, bajo condiciones aerobias. Se puede proporcionar agitación o una combinación de agitación y aireación, y la producción ocurre a la temperatura adecuada para ese hospedero, por ejemplo, de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 75 °C (por ejemplo, 30 °C a 45 °C), dependiendo de las necesidades del hospedero y la producción de TeAmyl deseada o variante de esta. El cultivo puede producirse en aproximadamente 12 a aproximadamente 100 horas o más (y cualquier cantidad de horas entre esos límites, por ejemplo, de 24 a 72 horas). Típicamente, el caldo de cultivo está a un pH de aproximadamente 4.0 a aproximadamente 8.0, otra vez dependiendo de las condiciones de cultivo necesarias para el hospedero con relación a la producción de una TeAmyl o variante de esta. 3.4. Identificación de la actividad TeAmyl Para evaluar la expresión de una TeAmyl o variante de esta en una célula hospedera, los ensayos pueden medir la proteína expresada, el ARNm correspondiente o la actividad a-amilasa. Por ejemplo, los ensayos adecuados incluyen Northern blot, reacción en cadena de la polimerasa transcriptasa inversa, e hibridación in si tu, mediante el uso de una sonda de hibridación marcada apropiadamente. Los ensayos adecuados incluyen, además, medir la actividad de TeAmyl en una muestra, por ejemplo, mediante ensayos que miden directamente azúcares reductores tales como glucosa en los medios de cultivo. Por ejemplo, la concentración de glucosa puede determinarse mediante el uso del reactivo de glucosa del kit núm. 15-UV (Sigma Chemical Co.) o un instrumento, tal como un Autoanalizador Technicon. La actividad a-amilasa puede medirse, además, mediante cualquier método conocido, tal como los ensayos PAHBAH o ABTS descritos más abajo. 3.5. Métodos para purificar TeAmyl y variantes de esta.
Las téenicas de fermentación, separación, y concentración se conocen bien en la materia y los métodos convencionales pueden usarse con el objetivo de preparar una solución que contiene el polipéptido concentrado de TeAmyl o una variante de a-a ilasa.
Después de la fermentación se obtiene un caldo de fermentación, las células microbianas y varios sólidos suspendidos, que incluyen materiales de fermentación crudos residuales, se eliminan por técnicas de separación convencionales para obtener una solución de amilasa. Generalmente, se usa filtración, centrifugación, microfiltración, filtración al vacío con tambor rotatorio. ultrafiltración, centrifugación seguido de ultrafiltración, extracción o cromatografía, o similares.
Es deseable concentrar una solución que contiene el polipéptido de la a-amilasa de TeAmyl o variante con el objetivo de optimizar la recuperación. El uso de soluciones no concentradas requiere mayor tiempo de incubación con el objetivo de recoger el precipitado de la enzima purificada.
La solución que contiene la enzima se concentra mediante el uso de téenicas de concentración convencionales hasta que se obtiene el nivel deseado de la enzima. La concentración de la solución que contiene enzimas puede obtenerse por cualquiera de las técnicas consideradas en la presente descripción. Los métodos ilustrativos de purificación incluyen, pero no se limitan a, la filtración rotatoria al vacío y/o ultrafiltración.
La solución enzimática se concentra en una solución enzimática concentrada hasta que la actividad enzimática de la solución concentrada que contiene el polipéptido de TeAmyl o variante de a-amilasa en un nivel deseado.
La concentración puede llevarse a cabo mediante el uso de, por ejemplo, un agente de precipitación, tal como un agente de precipitación de haluro de metal. Los agentes de precipitación de haluros de metal incluyen, pero no se limitan a, cloruros de metales alcalinos, bromuros de metales alcalinos y mezclas de dos o más de estos haluros de metal. Los haluros de metal ilustrativos incluyen cloruro de sodio, cloruro de potasio, bromuro de sodio, bromuro de potasio y mezclas de dos o más de estos haluros de metal. El agente de precipitación del haluro metálico, cloruro de sodio, puede usarse como un conservante.
El agente de precipitación del haluro metálico se usa en una cantidad eficaz para precipitar la TeAmyl o variante de esta. La selección de al menos una cantidad eficaz y una cantidad óptima del haluro de metal eficaz en provocar la precipitación de la enzima, así como las condiciones de la precipitación para una recuperación máxima que incluyen tiempo de incubación, pH, temperatura y concentración de la enzima, serán fácilmente evidentes para un experto en la materia, después de pruebas de rutina.
Generalmente, una cantidad de al menos aproximadamente 5 % p/v (peso/volumen) a aproximadamente 25 % p/v de haluro de metal se añade a la solución concentrada de enzimas y, usualmente, al menos 8 % p/v. Generalmente, no más de aproximadamente 25 % p/v de haluro de metal se añade a la solución concentrada de enzimas y, usualmente, no más de aproximadamente 20 % p/v. La concentración óptima del agente de precipitación de haluro de metal dependerá, entre otros, de la naturaleza del polipéptido específico de TeAmyl o una variante de a-amilasa y de su concentración en la solución enzimática concentrada.
Otra forma alternativa para precipitar la enzima es el uso de compuestos orgánicos. Los agentes de precipitación de compuestos orgánicos ilustrativos incluyen: ácido 4-hidroxibenzoico, sales de metales alcalinos del ácido 4-hidroxibenzoico, ásteres alquílíeos del ácido 4-hidroxibenzoico y mezclas de dos o más de estos compuestos orgánicos. Esos agentes de precipitación de compuestos orgánicos se pueden añadir antes, simultáneamente o después de la adición del agente de precipitación de haluro de metal y la adición de ambos agentes de precipitación, compuesto orgánico y haluro de metal, puede realizarse secuencialmente o simultáneamente.
Generalmente, los agentes de precipitación orgánicos se seleccionan del grupo que consiste en sales de metales alcalinos del ácido 4-hidroxibenzoico, tales como sales de sodio o potasio y ásteres alquílicos lineales o ramificados del ácido 4-hidroxibenzoico, en donde el grupo alquilo contiene de 1 a 12 átomos de carbono, y mezclas de dos o más de estos compuestos orgánicos. Los agentes de precipitación de compuestos orgánicos pueden ser, por ejemplo, ásteres alquílicos lineales o ramificados del ácido 4-hidroxibenzoico, en donde el grupo alquilo contiene de 1 a 10 átomos de carbono, y mezclas de dos o más de estos compuestos orgánicos. Los compuestos orgánicos ilustrativos son ásteres alquílicos lineales del ácido 4-hidroxibenzoico, en donde el grupo alquilo contiene de 1 a 6 átomos de carbono, y mezclas de dos o más de estos compuestos orgánicos. Además, puede usarse el áster metílico del ácido 4-hidroxibenzoico, ásteres propílico del ácido 4-hidroxibenzoico, áster butílico del ácido 4-hidroxibenzoico, áster etílico del ácido 4-hidroxibenzoico y mezclas de dos o más de estos compuestos orgánicos. Los compuestos orgánicos incluyen, además, pero no se limitan a, metil áster del ácido 4-hidroxibenzoico (denominado metil PARABEN), propilo áster del ácido 4-hidroxibenzoico (denominado propil PARABEN), que son, además, agentes conservantes de amilasa. Para descripciones adicionales, ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm.5,281,526.
La adición del agente de precipitación de compuestos orgánicos proporciona la ventaja una alta flexibilidad de las condiciones de precipitación con respecto al pH, temperatura, concentración del polipéptido de TeAmyl o variante de a-amilasa, concentración del agente de precipitación y tiempo de incubación.
El agente de precipitación de compuestos orgánicos puede usarse en una cantidad eficaz para mejorar la precipitación de la enzima por medio del agente de precipitación de haluro de metal. La selección de al menos una cantidad eficaz y una cantidad óptima del agente de precipitación de un compuesto orgánico, así como las condiciones de la precipitación para una recuperación máxima que incluyen el tiempo de incubación, el pH, la temperatura y la concentración de la enzima, serán fácilmente evidentes para un experto en la materia, a la luz de la presente descripción, después de pruebas de rutina.
Generalmente, al menos aproximadamente 0.01 % p/v del agente de precipitación del compuesto orgánico se añade a la solución concentrada de la solución de enzima y, usualmente, al menos aproximadamente 0.02 % p/v. Generalmente, no más de aproximadamente 0.3 % p/v del agente de precipitación del compuesto orgánico se añade a la solución de enzimas concentrada y usualmente no más de aproximadamente 0.2 % p/v.
La solución concentrada del polipéptido, que contiene el agente de precipitación del haluro de metal, y el agente de precipitación del compuesto orgánico, puede ajustarse a un pH que, por necesidad, dependerá de la enzima a purificar. Generalmente, el pH se ajusta a un nivel cercano al punto isoeléctrico de la amilasa. El pH puede ajustarse a un pH en el intervalo de aproximadamente 2.5 unidades de pH por debajo del punto isoeléctrico (pl) hasta a aproximadamente 2.5 unidades de pH por encima del punto isoeléctrico.
El tiempo de incubación necesario para obtener un precipitado de enzima purificada depende de la naturaleza de la enzima específica, la concentración de la enzima y el o los agentes de precipitación específico(s) y su concentración. Generalmente, el tiempo eficaz para precipitar la enzima es entre aproximadamente 1 a aproximadamente 30 horas; usualmente este no excede de aproximadamente 25 horas. En presencia del agente de precipitación del compuesto orgánico, el tiempo de incubación puede reducirse hasta menos de aproximadamente 10 horas y, en la mayoría de los casos incluso, hasta aproximadamente 6 horas.
Generalmente, la temperatura durante la incubación es de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 50 °C. Usualmente, el método se realiza a una temperatura de aproximadamente 10 °C a aproximadamente 45 °C (por ejemplo, de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 40 °C). La temperatura óptima para inducir la precipitación varía de conformidad con las condiciones de la solución y el o los agentes de precipitación usados.
La recuperación total del precipitado de enzimas purificado y la eficacia con la cual se realiza el proceso mejoran si se agita la solución que comprende la enzima, el haluro de metal añadido y el compuesto orgánico añadido. La etapa de agitación se realiza durante la adición del haluro de metal y el compuesto orgánico y durante el periodo de incubación posterior. Los métodos de agitación adecuados incluyen agitación mecánica, aireación vigorosa o cualquier téenica similar.
Después del período de incubación, la enzima purificada se separa, después, del pigmento disociado y otras impurezas y se recoge mediante técnicas de separación convencionales, tales como filtración, centrifugación, microfiltración, filtración rotatoria al vacío, ultrafiltración, filtración con presión, microf iltración con membrana cruzada, microfiltración con membrana de flujo transversal, o similares. La purificación adicional del precipitado de enzima purificada puede obtenerse al lavar el precipitado con agua. Por ejemplo, el precipitado de enzima purificado puede lavarse con agua que contiene el agente de precipitación de haluro de metal o con agua que contiene el haluro de metal y los agentes de precipitación del compuesto orgánico.
Durante la fermentación, un polipéptido de la a-amilasa de TeAmyl o variante se acumula en el caldo de cultivo. Para el aislamiento y la purificación de la TeAmyl o variante de oí-amilasa deseadas, el caldo de cultivo se centrifuga o se filtra para eliminar las células, y el líquido libre de células resultante se usa para la purificación de la enzima. En una modalidad, el caldo libre de células se somete a un desalado mediante el uso de sulfato amónico a aproximadamente 70 % de saturación; la fracción de saturación-precipitación al 70 % se disuelve después en un amortiguador y se aplica a una columna tal como una columna Sephadex G-100, y se eluye para recuperar la fracción de enzima activa. Para la purificación adicional puede usarse un procedimiento convencional, tal como cromatografía de intercambio de iones.
Las enzimas purificadas son útiles para aplicaciones de lavandería y de limpieza. Por ejemplo, pueden usarse en detergentes y quitamanchas para lavandería. Pueden prepararse como un producto final líquido (solución, suspensión) o sólido (granular, polvo).
Un ejemplo más específico de purificación se describe en Sumitani et al. (2000) “New type of starch-binding domain: the direct repeat motif in the C-terminal región of Bacillus sp. 195 a-amylase contributes to starch binding and raw starch degrading,” Biochem. J. 350: 477-484, y se resume brevemente aquí. La enzima obtenida de 4 litros de un sobrenadante del cultivo de Streptomyces lividans TK24 se trató con (NH4)2SO4 a 80 % de saturación. El precipitado se recuperó mediante centrifugación a 10,000 x g (20 min. y 4 °C) y se volvió a disolver en amortiguador Tris/HCl 20 mM (pH 7.0) que contenía CaCl2 5 mM. Después el precipitado solubilizado se dializó frente al mismo amortiguador. La muestra dializada se aplicó después a una columna Sephacryl S-200, que se había equilibrado previamente con amortiguador Tris/HCl 20 mM, (pH 7.0), CaCl25 mM, y se eluyó a una velocidad de flujo lineal de 7 ml/h con el mismo amortiguador. Las fracciones de la columna se recogieron y su actividad se evaluó mediante un ensayo enzimático y SDS-PAGE. La proteína se purificó adicionalmente como sigue. Una columna Toyopearl HW55 (Tosoh Bioscience, Montgomeryville, PA; cat. núm.19812) se equilibró con 20 mM de amortiguador Tris/HCl (pH 7.0) que contenía 5 mM CaCl2 y 1.5 M (NH4)2S04. La enzima se eluyó con un gradiente lineal del 1.5 a 0 M (NH4)2S04 en amortiguador Tris/HCl 20 mM, pH 7.0 que contenía CaCl2 5 mM. Las fracciones activas se recogieron, y la enzima se precipitó con (NH4)2SO4 a 80 % de saturación. El precipitado se recuperó, se volvió a disolver, y se dializó como se describió anteriormente. Después la muestra dializada se aplicó a una columna Mono Q HR5/5 (Amersham Pharmacia; cat. núm. 17-5167-01) equilibrada previamente con amortiguador Tris/HCl 20 mM (pH 7.0) que contenía CaCl25 mM, a una velocidad de flujo de 60 ml/hora. Las fracciones activas se recogen y se añaden a una solución de (NH4)2S04 1.5 M. Las fracciones activas de la enzima se volvieron a analizar por cromatografía en una columna Toyopearl HW55, como antes, para producir una enzima homogénea como se determinó por SDS-PAGE. Ver Sumitani et al. (2000) Biochem. J. 350: 477-484, para una discusión general del método y las variaciones de este.
Para la recuperación en escala de producción, un polipéptido de la a-amilasa de TeAmyl o variante puede purificarse parcialmente como se describió, generalmente, anteriormente por medio de la eliminación de células a través de floculación con polímeros. Alternativamente, la enzima puede purificarse mediante microfiltración seguida de concentración por ultrafiltración mediante el uso de membranas y equipos disponibles. Sin embargo, para algunas aplicaciones, la enzima no necesita purificarse, y el caldo de cultivo completo puede lisarse y usarse sin tratamiento adicional. La enzima puede procesarse, después, por ejemplo, en gránulos. 4. Composíciones L usos de variantes de esta La TeAmyl y sus variantes son útiles para una variedad de aplicaciones industriales. Por ejemplo, la TeAmyl y sus variantes son útiles en un proceso de conversión del almidón, particularmente en un proceso de sacarificación de un almidón que se ha sometido a licuación. El producto final deseado puede ser cualquier producto que puede producirse mediante la conversión enzimática del sustrato de almidón. Por ejemplo, el producto deseado puede ser un jarabe rico en glucosa y maltosa, que puede usarse en otros procesos, tales como la preparación de HFCS, o que puede convertirse en un número de otros productos útiles, tales como intermedios de ácido ascórbico (por ejemplo, gluconato; ácido 2-ceto-L-gulonico; 5-ceto-gluconato ; y 2,5-dicetogluconato); 1,3-propanodiol; aminoácidos aromáticos (por ejemplo, tirosina, fenilalanina y triptófano); ácidos orgánicos (por ejemplo, lactato, piruvato, succinato, isocitrato, y oxaloacetato); aminoácidos (por ejemplo, serina y glicina); antibióticos; antimicrobianos; enzimas; vitaminas; y hormonas.
El proceso de conversión del almidón puede ser un precursor de, o simultáneamente con, un proceso de fermentación diseñado para producir alcohol para combustible o bebida (es decir, alcohol potable). Un experto en la materia es consciente de las diversas condiciones de fermentación que pueden usarse en la producción de estos productos finales. La TeAmyl y variantes de esta son útiles, además, en composiciones y métodos de preparación de alimentos. Estos diversos usos de TeAmyl y sus variantes se describen con más detalle más abajo. 4.1. Preparación de sustratos de almidón Las personas con experiencia general en la materia conocen los métodos disponibles que podrían usarse para preparar sustratos de almidón para usar en los procesos descritos en la presente descripción. Por ejemplo, un sustrato de almidón útil podría obtenerse de tubérculos, raíces, tallos, legumbres, cereales o granos enteros. Más específicamente, el almidón granular puede obtenerse de maíz, mazorcas, trigo, cebada, centeno, milo, sagú, mijo, mandioca, tapioca, sorgo, arroz, chícharos, frijoles, plátanos o papas. El maíz contiene aproximadamente 60-68 % de almidón; la cebada contiene aproximadamente 55-65 % de almidón; el mijo contiene aproximadamente 75-80 % de almidón; el trigo contiene aproximadamente 60-65 % de almidón; y el arroz pulido contiene 70-72 % de almidón. Los sustratos de almidón contemplados específicamente son almidón de maíz y almidón de trigo. El almidón de un grano podría estar molido o entero e incluye sólidos de maíz, tales como granos, salvado y/o mazorcas. El almidón podría ser almidón sin procesar refinado o materia prima de procesos de refinería de almidón. Se encuentran disponibles comercialmente, además, varios almidones. Por ejemplo, el almidón de maíz está disponible de Cerestar, Sigma y Katayama Chemical Industry Co. (Japón); el almidón de trigo está disponible de Sigma; el almidón de camote está disponible de Wako Pure Chemical Industry Co. (Japón); y el almidón de papa está disponible de Nakaari Chemical Pharmaceutical Co. (Japón).
El sustrato de almidón puede ser un almidón crudo de grano entero molido, el cual contiene fracciones sin almidón, por ejemplo, fibras y residuos de germen. La molienda puede comprender la molienda en húmedo o la molienda en seco o triturado. En la molienda en húmedo, el grano entero puede empaparse en agua o ácido diluido para separar el grano en sus partes componentes, por ejemplo, almidón, proteína, germen, aceite, fibras de granos. La molienda en húmedo separa eficazmente el germen y la harina (por ejemplo, gránulos de almidón y proteína) y es especialmente adecuada para la producción de jarabes. En la molienda en seco o triturado, los granos enteros se trituran para formar un polvo fino y, frecuentemente, se procesan sin fraccionar el grano en sus partes componentes. En algunos casos, el aceite de los granos se recupera. El grano molido en seco, entonces, comprenderá, cantidades significativas de compuestos de carbohidratos sin almidón además del almidón. El triturado en seco del sustrato de almidón puede usarse para la producción de etanol y otros productos bioquímicos. El almidón que se va a procesar podría ser una calidad de almidón altamente refinado, por .ejemplo, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, o al menos 99.5 % puro. 4.2. Gelatinización y licuación del almidón Como se usan en la presente descripción, los términos “licuación” o “licuar” se refieren a un proceso por el cual el almidón se convierte a dextrinas menos viscosas y de cadena más corta. Generalmente, este proceso implica la gelatinización del almidón de manera simultánea con o seguida de la adición de una a-amilasa aunque, opcionalmente, pueden añadirse enzimas inductoras de licuación adicionales. En algunas modalidades, el sustrato de almidón preparado como se describió anteriormente se remoja con agua. La suspensión de almidón puede contener almidón como un por ciento en peso de sólidos secos de aproximadamente 10-55 %, aproximadamente 20-45 %, aproximadamente 30-45 %, aproximadamente 30-40 %, o aproximadamente 30-35 %. La a-amilasa (EC 3.2.1.1) puede añadirse a la suspensión, con una bomba dosificadora, por ejemplo. La -amilasa que se usa típicamente para esta aplicación es una a-amilasa bacteriana, térmicamente estable, tal como una a-amilasa de Geobacillus stearothermophilus. La a-amilasa se suministra usualmente, por ejemplo, a aproximadamente 1500 unidades por kg de materia seca de almidón. Para optimizar la estabilidad y actividad de la a-amilasa, el pH de la suspensión se ajusta, típicamente, a aproximadamente pH 5.5-6.5 y, típicamente, se añade aproximadamente 1 mM de calcio (aproximadamente 40 ppm iones de calcio libres). Las variantes de Geobacillus stearothermophilus u otras a-amilasas pueden requerir condiciones diferentes. La a-amilasa bacteriana restante en la suspensión después de la licuación puede desactivarse a través de un número de métodos, que incluyen la reducción del pH en una etapa de reacción subsecuente o mediante la eliminación de calcio de la suspensión en los casos en que la enzima es dependiente de calcio.
La suspensión de almidón junto con la a-amilasa se puede bombear continuamente a través de un equipo para cocción por chorro de vapor que es vapor de agua calentado hasta 105-110 °C. La gelatinización sucede rápidamente bajo estas condiciones, y la actividad enzimática, combinada con las fuerzas de cizallamiento significativas, comienza la hidrólisis del sustrato de almidón. El tiempo de permanencia en la cocina a chorro es breve. El almidón parcialmente gelatinizado podría pasarse a una serie de tubos de retención mantenidos a 105-110 °C y mantenerse durante 5-8 min para completar el proceso de gelatinización (“licuación primaria”). La hidrólisis al DE requerido se completa en tanques de almacenamiento a 85-95 °C o temperaturas más altas durante aproximadamente 1 a 2 horas (“licuación secundaria”). Estos tanques podrían contener deflectores para desalentar un mezclado posterior. Como se usa en la presente descripción, el término “minutos de licuación secundaria” se refiere al tiempo transcurrido desde el inicio de la licuación secundaria hasta el momento en que se mide el equivalente de dextrosa (DE). La suspensión se deja enfriar después a temperatura ambiente. Esta etapa de enfriamiento puede ser de 30 minutos a 180 minutos, por ejemplo 90 minutos a 120 minutos.
El almidón licuado resultante del proceso anterior contiene, típicamente, aproximadamente 97-98 % de oligosacáridos y aproximadamente 2 % de maltosa y 0.3 % de D-glucosa. El almidón licuado está, típicamente, en la forma de una suspensión que tiene un contenido de sólidos secos (p/p) de aproximadamente 10-50 %; aproximadamente 10-45 %; aproximadamente 15-40 %; aproximadamente 20-40 %; aproximadamente 25-40 %; o aproximadamente 25-35 %.
La TeAmyly variantes de esta pueden usarse en un proceso de licuación en lugar de a-amilasas bacterianas. La licuación con TeAmyl y variantes de esta puede llevarse a cabo favorablemente a un pH bajo, lo que elimina el requisito de ajustar el pH a un pH de aproximadamente 5.5-6.5. La TeAmyl y variantes de esta pueden usarse para la licuación en un intervalo de pH de 2 a 7, por ejemplo, pH 3.0-7.5, pH 4.0-6.0, o pH 4.5-5.8. La TeAmyl y variantes de esta pueden mantener la actividad de licuación en un intervalo de temperatura de aproximadamente 85 °C-95 °C, por ejemplo, 85 °C, 90 °C, o 95 °C. Por ejemplo, la licuación puede realizarse con 800 mg de TeAmyl o una variante de esta en una solución de almidón de maíz DS al 25 % por 10 min a pH 5.8 y 85 °C, o pH 4.5 y 95 °C, por ejemplo. La actividad de licuación puede ensayarse mediante el uso de un número de ensayos de viscosidad conocidos en la materia. 4.3. Sacarificación El almidón licuado puede sacarificarse en un jarabe rico en sacáridos DP más bajos (por ejemplo, DPI + DP2), mediante el uso de la TeAmyl y variantes de esta, opcionalmente, en presencia de otra(s) enzima(s). La composición exacta de los productos de sacarificación depende de la combinación de las enzimas usadas, así como el tipo de almidón granular procesado. Favorablemente, el jarabe obtenible mediante el uso de la TeAmyl y variantes de esta proporcionadas pueden contener un porcentaje en peso de DP2 de los oligosacáridos totales en el almidón sacarificado superior a 30 %, por ejemplo, 45 % - 65 % o 55 % - 65 %. El porcentaje en peso de (DPI + DP2) en el almidón sacarificado puede exceder aproximadamente 70 %, por ejemplo, 75 % - 85 % o 80 % - 85 %. La TeAmyl o sus variantes producen, además, un rendimiento relativamente alto de glucosa, por ejemplo, DPI > 20 %, en el producto jarabe.
Mientras que la licuación se ejecuta, generalmente, como un proceso continuo, la sacarificación se realiza, frecuentemente, como un proceso discontinuo. La sacarificación es, típicamente, más eficaz a temperaturas de aproximadamente 60-65 °C y un pH de aproximadamente 4.0-4.5, por ejemplo, pH 4.3, que necesita refrigeración y ajuste del pH del almidón licuado. La sacarificación puede llevarse a cabo, por ejemplo, a una temperatura entre aproximadamente 40 °C, aproximadamente 50 °C, o aproximadamente 55 °C a aproximadamente 60 °C o aproximadamente 65 °C. La sacarificación se lleva a cabo normalmente en tanques agitados, los que pueden tomar varias horas para llenarse o vaciarse. Las enzimas se añaden, típicamente, ya sea en una relación fija con respecto a los sólidos secos a medida que los tanques se llenan o se añaden como una dosis única al comienzo de la etapa de llenado. Una reacción de sacarificación para hacer un jarabe se ejecuta, típicamente, aproximadamente por 24-72 horas, por ejemplo, 24-48 horas. Cuando se ha alcanzado un DE máximo o deseado, la reacción se detiene mediante calentamiento a 85 °C durante 5 min, por ejemplo. Una incubación adicional resultará en un DE inferior, eventualmente en aproximadamente 90 DE, ya que la glucosa acumulada se vuelve a polimerizar a isomaltosa y/u otros productos de reversión a través de una reacción enzimática de reversión y/o con el enfoque del equilibrio termodinámico. Cuando se usa un polipéptido de TeAmyl o variantes de esta, la sacarificación se lleva a cabo, óptimamente, a un intervalo de temperatura de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 75 °C, por ejemplo, 45 °C-75 °C o 47 °C-74 °C.
La sacarificación puede llevarse a cabo en un intervalo de pH de aproximadamente pH 3 a aproximadamente pH 7, por ejemplo, pH 3.0-pH 7.5, pH 3.0-pH 5.8, pH 3.5, pH 3.8 o pH 4.5.
La TeAmyl o una variante de esta pueden añadirse, además, a la suspensión en forma de una composición. La TeAmyl o una variante de esta pueden añadirse a la suspensión de un sustrato de almidón granular en una cantidad de aproximadamente 0.6-10 ppm ds, por ejemplo, 2 ppm ds. La TeAmyl o variante de esta pueden añadirse como una enzima purificada, parcialmente purificada, clarificada, o en el caldo completo. La actividad específica de la TeAmyl o variante de esta purificadas puede ser de aproximadamente 1700 U/mg de enzima, por ejemplo, medida con el ensayo PAHBAH. La TeAmyl o variante de esta pueden añadirse, además, como un producto de caldo completo.
La TeAmyl o una variante de esta pueden añadirse a la suspensión como una solución de enzima aislada. Por ejemplo, la TeAmyl o una variante de esta pueden añadirse en la forma de un material celular cultivado producido por células hospederases que TeAmyl expresan la o variante de esta. La TeAmyl o una variante de esta pueden ser secretadas, además, por una célula hospedera en el medio de reacción durante el proceso de fermentación o SSF, de manera que la enzima se proporciona de manera continua en la reacción. La célula hospedera que produce y secreta la TeAmyl o una variante puede expresar, además, una enzima adicional, tal como una glucoamilasa. Por ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 5,422,267 describe el uso de una glucoamilasa en levadura para la producción de bebidas alcohólicas. Por ejemplo, una célula hospedera, por ejemplo, Trichoderma reesei o Aspergillus niger, puede diseñarse para coexpresar la TeAmyl o una variante de esta y una glucoamilasa, por ejemplo, una variante de la GA, GA de Aspergillus niger, variante de GA de Aspergillus niger, HgGA, variante de HgGA, TrGA o una variante de TrGA durante la sacarificación. La célula hospedera puede modificarse por ingeniería genética para no expresar su glucoamilasa endógena y/u otras enzimas, proteínas u otros materiales. La célula hospedera puede modificarse por ingeniería genética para expresar un amplio espectro de diversas enzimas sacarolíticas. Por ejemplo, la célula hospedera de levadura recombinante puede comprender ácidos nucleicos que codifican una glucoamilasa, una alfa-glucosidasa, una enzima que usa el azúcar pentosa, una a-amilasa, una pululanasa, una isoamilasa y/o una isopululanasa. Ver, por ejemplo, la patente núm., WO 2011/153516 A2. 4.4. Isomerización El hidrolizado de almidón soluble producido por el tratamiento con TeAmyl o variantes de esta puede convertirse en jarabe a base de almidón con alto contenido de fructosa (HFSS), tal como el jarabe de maíz de alto contenido de fructosa (JMAF). Para esta conversión puede usarse una glucosa isomerasa, particularmente, una glucosa isomerasa inmovilizada sobre un soporte sólido. En algunas modalidades, el pH aumenta hasta aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0, por ejemplo, pH 7.5 y el Ca2+ se elimina por intercambio de iones. Las isomerasas adecuadas incluyen Sweetzyme®, IT (Novozymes A/S); G-zyme® IMGI, y G-zyme® G993, Ketomax®, G-zyme® G993, G-zyme® G993 líquido, y GenSweet® IGI. Después de la isomerización, la mezcla contiene, típicamente, aproximadamente 40-45 % de fructosa, por ejemplo, 42 % de fructosa. 4.5. Fermentación El hidrolizado de almidón soluble, particularmente un jarabe rico en glucosa, puede fermentarse al poner en contacto el hidrolizado de almidón con un organismo fermentativo, típicamente, a una temperatura de aproximadamente 32 °C, tal como de 30 °C a 35 °C. Los productos de EOF incluyen metabolitos. El metabolito puede ser ácidos orgánicos, aminoácidos, biocombustibles y otros bioquímicos que incluyen, pero no se limitan a, etanol, ácido cítrico, ácido succínico, glutamato monosódico, ácido glucónico, gluconato sódico, gluconato cálcico, gluconato potásico, ácido itaconico y otros ácidos carboxílicos, glucono delta-lactona, eritorbato sódico, lisina, ácido graso de omega 3, butanol, isopreno, 1,3-propanodiol y biodiesel.
Los microorganismos etanologénicos incluyen levadura, tales como Saccharomyces cerevisiae y bacterias, por ejemplo, Zymomonas moblis, que expresan alcohol deshidrogenasa y piruvato decarboxilasa. Los microorganismos etanologénicos pueden expresar xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa, que convierten la xilosa a xilulosa. Las cepas mejoradas de microorganismos etanologénicos, que pueden soportar temperaturas más altas, por ejemplo, se conocen en la materia y pueden usarse. Ver Liu et al. (2011) Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao 27(7): 1049-56. Las fuentes comerciales de levadura incluyen ETHANOL RED® (LeSaffre); Thermosacc® (Lallemand); RED STAR® (Red Star) ; FERMIOL® (DSM Specialties); y SUPERSTART® (Alltech). Los microorganismos útiles pueden ser butanologénicos. Los microorganismos butanologénicos pueden incluir, por ejemplo, Clostridia butanologénico, tal como Clostridium acetobutylicum, Clostridium beij erinckii , Clostridium saccharobutylicum y Clostridium saccharobutylacetonicum. Ver, por ejemplo, Ezeji et al. (2007) “Bioproduction of butanol from biomass: from genes to bioreactors”, Curr . Opin. Biotechnol . 18(3): 220-27. Los microorganismos que producen otros metabolitos, tales como ácido cítrico y ácido láctico, por fermentación se conocen en la materia. Ver, por ejemplo, Papagianni (2007) “Advances in citric acid fermentation by Aspergillus niger: biochemical aspects, membrane transport and modeling,” Biotechnol . Adv. 25(3): 244-63; John et al. (2009) “Direct lactic acid fermentation: focus on simultaneous saccharification and lactic acid production,” Biotechnol . Adv. 27(2): 145-52.
Los procesos de sacarificación y fermentación pueden llevarse a cabo como un proceso de SSF. La fermentación puede comprender una subsecuente purificación y recuperación de etanol, por ejemplo. Durante la fermentación, el contenido de etanol del caldo o la “cerveza” puede alcanzar aproximadamente 8-18 % v/v, por ejemplo, 14-15 % v/v. El caldo puede destilarse para producir soluciones enriquecidas de etanol, por ejemplo, 96 % de pureza. Adicionalmente, el CO2 generado por la fermentación puede recogerse con un depurador de CO2, comprimirse, y comercializarse para otros usos, por ejemplo, bebidas carbonatadas o producción de hielo seco. Los residuos sólidos a partir del proceso de fermentación pueden usarse como productos ricos en proteínas, por ejemplo, para la alimentación del ganado.
Como se mencionó anteriormente, un proceso SSF puede llevarse a cabo con células fúngicas que expresan y secretan TeAmyl o sus variantes continuamente a lo largo de SSF. Además, las células fúngicas que expresan TeAmyl o sus variantes pueden ser el microorganismo fermentativo, por ejemplo, un microorganismo etanologénico. Así, la producción de etanol puede llevarse a cabo mediante el uso de una célula fúngica que expresa suficiente TeAmyl o sus variantes de manera que menos o ninguna enzima tenga que añadirse exógenamente . La célula hospedera fúngica puede ser a partir de una cepa fúngica diseñada apropiadamente. Pueden usarse, además, las células hospederases fúngicas que expresan y secretan otras enzimas, además de TeAmyl o sus variantes. Tales células pueden expresar glucoamilasa y/o una trehalasa, isoamilasa, hexoquinasa, xilanasa, glucosa isomerasa, xilosa isomerasa, fosfatasa, fitasa, pululanasa, b-amilasa, a-amilasa que no es TeAmyl, proteasa, celulasa, hemicelulasa, lipasa, cutinasa, isoamilasa, enzima de redox, esterasa, transferasa, enzima de ramificación, pectinasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, liasa u otras hidrolasas.
Una variación de este proceso es un sistema de “fermentación semicontinua”, en donde el sustrato se añade en incrementos a medida que la fermentación progresa. Los sistemas semicontinuos son útiles cuando la represión por catabolito puede inhibir el metabolismo de las células, y en donde se prefiere tener cantidades limitadas de sustrato en el medio. La concentración real de sustrato en los sistemas semicontinuos se estima por los cambios de los factores medibles tales como pH, oxígeno disuelto y presión parcial de los gases de desecho, tales como COå. Las fermentaciones discontinuas y semicontinuas son comunes y muy conocidas en la materia.
La fermentación continua es un sistema abierto en donde un medio de fermentación definido se agrega continuamente en un biorreactor, y una cantidad igual de medio acondicionado se elimina simultáneamente para el procesamiento. La fermentación continua, generalmente, mantiene los cultivos a una densidad alta constante, en donde las células se encuentran, principalmente, en crecimiento de fase logarítmica. La fermentación continua permite la modulación del crecimiento de la célula y/o la concentración del producto. Por ejemplo, un nutriente limitante, tal como la fuente de carbono o la fuente de nitrógeno, se mantiene a una velocidad fija y esto permite moderar todos los otros parámetros. Debido a que el crecimiento se mantiene en un estado de equilibrio, la pérdida de células debido a la retirada de medio debe balancearse con la tasa de crecimiento celular en la fermentación. Los métodos para optimizar los procesos de fermentación continua y maximizar la tasa de formación de producto se conocen en la materia de la microbiología industrial. 4.6. Composiciones que comprenden TeAmyl o variantes de esta La TeAmyl o variantes de esta pueden combinarse con una glucoamilasa (EC 3.2.1.3), por ejemplo, una glucoamilasa de Trichoderma o variante de esta. Una glucoamilasa ilustrativa es la glucoamilasa de Trichoderma reesei (TrGA) y variantes de esta que poseen actividad específica y estabilidad térmica superiores. Ver las solicitudes publicadas núms.2006/0094080, 2007/0004018, y 2007/0015266 (Danisco US Inc.). Las variantes adecuadas de TrGA incluyen aquellas con actividad glucoamilasa y al menos 80 %, al menos 90 %, o al menos 95 % de identidad de secuencia con la TrGA silvestre. La TeAmyl y sus variantes aumentan favorablemente el rendimiento de glucosa producida en un proceso de sacarificación catalizada por TrGA.
Alternativamente, la glucoamilasa puede ser otra glucoamilasa derivada de plantas, hongos, algas terrestres, algas marinas o bacterias. Por ejemplo, las glucoamilasas pueden ser la glucoamilasa G1 o G2 de Aspergillus niger o sus variantes (por ejemplo, Boel et al. (1984) EMBO J. 3: 1097-1102; patente núm. WO 92/00381; patente núm. WO 00/04136 (Novo Nordisk A/S)); y una glucoamilasa de A. awamori (por ejemplo, patente núm. WO 84/02921 (Cetus Corp.)) . Otras glucoamilasas de Aspergillus contempladas incluyen las variantes con estabilidad térmica mejorada, por ejemplo, G137A y G139A (Chen et al. (1996) Profc. Eng. 9: 499-505); D257E y .D293E/Q (Chen et al. (1995) Prot . Eng . 8: 575-582); N182 (Chen et al. (1994) Biochem. J. 301: 275-281); A246C (Fierobe et al. (1996) Biochemistry, 35: 8698-8704); y las variantes con residuos de Pro en las posiciones A435 y S436 (Li et al. (1997) Protein Eng. 10: 1199-1204). Otras glucoamilasas contempladas incluyen las glucoamilasas de Talaromyces, particularmente derivadas de T. emersonii (por ejemplo, patente núm. WO 99/28448 (Novo Nordisk A/S), de T. leycettanus (por ejemplo, patente de Estados Unidos núm. RE 32,153 (CPC International, Inc.)), de T. duponti , o T. thermophilus (por ejemplo, patente de Estados Unidos núm. 4,587,215). Las glucoamilasas bacterianas contempladas incluyen glucoamilasas del género Clostridium, particularmente, C. thermoamylolyticum (por ejemplo, EP 135,138 (CPC International, Inc). y C. thermohydrosulfuricum (por ejemplo, patente núm. WO 86/01831 (Michigan Biotechnology Institute)). Las glucoamilasas adecuadas incluyen las glucoamilasas derivadas de Aspergillus oryzae, tal como una glucoamilasa que se muestra en la sec. con núm. de ident.:2 en la patente núm. WO 00/04136 (Novo Nordisk A/S) . Además, son adecuadas las glucoamilasas comerciales, tales como AMG 200L; AMG 300 L; SAN™ SUPER y AMG™ E (Novozymes); OPTIDEX® 300 y OPTIDEX L-400 (Danisco US Inc.); AMIGASE™ y AMIGASE™ PLUS (DSM); G-ZYME® G900 (Enzyme Bio-Systems); y G-ZYME® G990 ZR (glucoamilasa de A. niger con un bajo contenido de proteasa). Todavía otras glucoamilasas adecuadas incluyen glucoamilasa de Aspergillus fumigatus, glucoamilasa de Talaromyces, glucoamilasa de Thielavia, glucoamilasa de Trametes , glucoamilasa de Thermomyces, glucoamilasa de Athelia, o glucoamilasa de Humicola (por ejemplo, HgGA). Las glucoamilasas típicamente se añaden en una cantidad de aproximadamente 0.1-2 unidades de glucoamilasa (GAU)/g ds , por ejemplo, aproximadamente 0.16 GAU/g ds, 0.23 GAU/g ds, o 0.33 GAU/g ds.
Otras enzimas adecuadas que pueden usarse con TeAmyl o variantes de esta incluyen una trehalasa, isoamilasa, hexoquinasa, xilanasa, glucosa isomerasa, xilosa isomerasa, fosfatasa, fitasa, pululanasa, b-amilasa, a-amilasa que no es TeAmyl, proteasa, celulasa, hemicelulasa , lipasa, cutinasa, isoamilasa, enzima de redox, esterasa, transferasa, pectinasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, enzima de ramificación, liasa u otras hidrolasas o una combinación de estas. Por ejemplo, una enzima desramificante, tal como una isoamilasa (EC 3.2.1.68), puede agregarse en cantidades efectivas muy conocidas para un experimentado en la materia. Además, es adecuada una pululanasa (EC 3.2.1.41), por ejemplo, Promozyme®. Típicamente la pululanasa se añade a 100 U/kg ds. Las enzimas adecuadas adicionales incluyen proteasas, tales como proteasas fúngicas y bacterianas. Las proteasas fúngicas incluyen aquellas obtenidas a partir de Aspergillus, tales como A. niger, A. awamori , A. oryzae,-Mucor (por ejemplo, M. miehei) ; Rhizopus; y Trichoderma .
Las b-amilasas (EC 3.2.1.2) son exoamilasas maltogénicas, que catalizan la hidrólisis de enlaces 1,4-a-glucosídicos a amilopectina y polímeros de glucosa relacionados, que de esta manera libera la maltosa. Las b amilasas se han aislado a partir de varias plantas y microorganismos. Ver Fogarty et al. (1979) in PROGRESS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, Vol. 15, págs. 112-115. Estas b-amilasas tienen temperaturas óptimas en el intervalo de 40 °C a 65 °C y pH óptimo en el intervalo de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 7.0. Las b-amilasas contempladas incluyen, pero no se limitan a, b-amilasas de cebada Spezyme® BBA 1500, Spezyme® DBA, Optimalt™ ME, Optimalt™ BBA (Danisco US Inc.); y Novozym™ WBA (Novozy es A/S). 5. Composiciones y metodos para hornear y preparación de alimentos La presente invención se refiere, además, a una “composición alimenticia” que incluye, pero no se limita a, un producto alimenticio, pienso para animales y/o aditivos para alimentos/piensos, que comprende una TeAmyl o una variante de esta, y a métodos para preparar tal composición alimenticia; los métodos comprenden mezclar TeAmyl o una variante de esta con uno o más ingredientes alimenticios, o a los usos de estos.
Además, la presente invención se refiere al uso de una TeAmyl o variante de esta en la preparación de una composición alimenticia, en donde la composición alimenticia se hornea después de la adición del polipéptido de la invención. Como se usa en la presente descripción, el término “composición de hornear” significa cualquier composición y/o aditivo preparado en el proceso de proporcionar un producto alimenticio horneado, que incluye, pero no se limita a, harina de panadería, una masa, un aditivo para hornear y/o un producto horneado. La composición alimenticia o aditivo pueden ser líquidos o sólidos.
Como se usa en la presente descripción, el término “harina” significa grano de cereal molido o triturado. El término “harina” puede significar, además, productos de Sago o de tubérculos que se han molido o hecho templa. Además, en algunas modalidades, la harina puede contener componentes, además, de la materia vegetal o de cereal molido o hecho puré. Un ejemplo de un componente adicional, aunque no pretende ser limitante, es un agente fermentador. Los granos de cereales incluyen trigo, avena, centeno y cebada. Los productos de tubérculo incluyen harina de tapioca, harina de mandioca, y polvo de cremas. El término “harina” incluye, además, harina de maíz molido, harina gruesa de maíz, harina de arroz, harina integral, harina con levadura, harina de tapioca, harina de mandioca, arroz molido, flor enriquecida, y polvo de cremas.
Para el uso comercial y doméstico de la harina para hornear y la producción de alimentos, es importante mantener un nivel adecuado de actividad a-amilasa en la harina. Un nivel de actividad que es demasiado alto puede resultar en un producto que es pegajoso y/o pastoso y, por lo tanto, no comercializable. La harina con insuficiente actividad a-amilasa puede no contener suficiente azúcar para una función adecuada de levadura, lo que resulta en pan desmenuzable, o productos horneados, secos. En consecuencia, una TeAmyl o variante de esta, por sí misma o en combinación con otra(s) a-amilasa (s), puede añadirse a la harina para aumentar el nivel de actividad a-amilasa endógena en la harina.
Adicionalmente, una TeAmyl o variante de esta puede añadirse sola o en combinación con otras amilasas para prevenir o retardar el enranciamiento, es decir, la dureza de las migas de productos horneados. La cantidad de amilasa contra el enranciamiento estará, típicamente, en el intervalo de 0.01-10 mg de proteína enzimática por kg de harina, por ejemplo, 0.5 mg/kg ds. Las amilasas contra el enranciamiento adicionales que pueden usarse en combinación con una TeAmyl o variante de esta incluyen una endo-amilasa, por ejemplo, una endo-amilasa bacteriana de Bacillus . La amilasa adicional puede ser otra a-amilasa maltogénica (EC 3.2.1.133), por ejemplo, a partir de Bacillus. Novamyl® es una a-amilasa maltogénica ilustrativa de B. stearothermophilus cepa NCIB 11837 y se describe en Christophersen et al. (1997) Starch 50: 39-45. Otros ejemplos de endo-amilasas contra el enranciamiento incluyen a-amilasas bacterianas derivadas de Bacillus , tal como B . licheniformis o B . amyloliquefaciens . La amilasa contra el enranciamiento puede ser una exo-amilasa, tal como una b-amilasa, por ejemplo, de fuentes vegetales, tales como el frijol de soja, o de fuentes microbianas, tal como Bacillus.
La composición de hornear que comprende una TeAmyl o variante de esta puede comprender, además, una fosfolipasa o enzima con actividad fosfolipasa. Una enzima con actividad fosfolipasa tiene una actividad que puede medirse en unidades de lipasa (LU). La fosfolipasa puede tener una actividad Ai o A2 para eliminar los ácidos grasos de los fosfolípidos, lo que forma un lisofosfolípido. Puede o puede no tener actividad de lipasa, es decir, actividad sobre sustratos de triglicéridos. La fosfolipasa tiene, típicamente, una temperatura óptima en el intervalo de 30-90 °C, por ejemplo, 30-70 °C. Las fosfolipasas adicionadas pueden ser de origen animal, por ejemplo, del páncreas, por ejemplo, páncreas bovino o porcino, de veneno de serpiente o de veneno de abeja. Alternativamente, la fosfolipasa puede ser de origen microbiano, por ejemplo, a partir de hongos filamentosos, levaduras o bacterias, por ejemplo.
La fosfolipasa se añade en una cantidad que mejora la suavidad del pan durante el período inicial después del horneado, particularmente las primeras 24 horas. La cantidad de fosfolipasa estará, típicamente, en el intervalo de 0.01-10 mg de proteína enzimática por kg de harina, por ejemplo, 0.1-5 mg/kg. Es decir, la actividad fosfolipasa estará, generalmente, en el intervalo de 20-1000 LU/kg de harina, en donde una unidad de lipasa se define como la cantidad de enzima requerida para liberar 1 pmol de ácido butírico por minuto a 30 °C, pH 7.0, con goma arábiga como emulsionante y tributirina como sustrato.
Las composiciones de masa comprenden, generalmente, harina gruesa de trigo o harina de trigo y/u otros tipos de harina gruesa, harina o almidón tal como harina de maíz, almidón de maíz, harina gruesa de centeno, harina de centeno, harina de avena, harina gruesa de avena, harina de soja, harina gruesa de sorgo, harina de sorgo, harina gruesa de papa, harina de papa o almidón de papa. La masa puede estar fresca, congelada o parcialmente horneada. La masa puede ser una masa fermentada o una masa que se va a someter a fermentación. La masa puede ser fermentada de varias maneras, tal como por adición de agentes químicos de fermentación, por ejemplo, bicarbonato sódico o por adición de un fermentador, es decir, una masa fermentadora. La masa puede fermentarse, además, por adición de un cultivo de levadura adecuado, tal como un cultivo de Saccharomyces cerevisiae (levadura de panadero), por ejemplo, una cepa disponible comercialmente de S. cerevisiae.
La masa puede comprender, además, otros ingredientes de masa convencionales, por ejemplo, proteínas, tales como leche en polvo, gluten y soja; huevos (por ejemplo, huevos enteros, yemas de huevo o claras de huevo); un oxidante, tal como ácido ascórbico, bromato potásico, yodato potásico, azodicarbonamida (ADA) o persulfato amónico; un aminoácido tal como L-cisteína; un azúcar; o una sal, tal como cloruro sódico, acetato cálcico, sulfato sódico o sulfato cálcico. La masa puede comprender además, por ejemplo, triglicéridos, tales como grasa granulada o manteca. La masa adicionalmente puede comprender un emulsionante tal como mono o diglicéridos, ásteres de ácido diacetil tartárico y mono o diglicéridos, ásteres de azúcar y ácidos grasos, ásteres de poliglicerol y ácidos grasos, ásteres de ácido láctico y monoglicéridos, ásteres de ácido acético y monoglicéridos, estearatos de polioxietileno, o lisolecitina. Particularmente, la masa puede obtenerse sin adición de emulsionantes.
El producto de masa puede ser cualquier producto de masa procesada, que incluye masas fritas, refritas, asadas, horneadas, al vapor y cocidas, tales como tortas de pan y arroz al vapor. En una modalidad, el producto alimenticio es un producto de panadería. Los productos típicos de panadería (horneados) incluyen pan, tales como barras de pan, bollos, panecillos, roscos, bases de pizza, etc. pasteles, galletas saladas, tortillas, tortas, galletas dulces, bizcochos, galletitas, etc.
Opcionalmente, una enzima adicional puede usarse junto con la amilasa contra el enranciamiento y la fosfolipasa. La enzima adicional puede ser una segunda amilasa, tal como una amiloglucosidasa, una b-amilasa, una ciclodextrina glucanotransferasa, o la enzima adicional puede ser una peptidasa, particularmente, una exopeptidasa, una transglutaminasa, una 1ipasa, una celulasa, una xilanasa, una proteasa, una proteína disulfuro isomerasa, por ejemplo, una proteína disulfuro isomerasa como se describe en la patente núm. WO 95/00636, por ejemplo, una glicosiltransferasa, una enzima ramificadora (enzima ramificadora 1,4-a-glucano), una 4- a-glucanotransferasa (dextrina glicosiltransferasa) o una oxidorreductasa, por ejemplo, una peroxidasa, una lacasa, una glucosa oxidasa, una piranosa oxidasa, una lipoxigenasa, una L-aminoácido oxidasa o una carbohidrato oxidasa. La(s) enzima(s) adicional(es) puede(n) ser de cualquier origen, que incluye mamífero y vegetal, y particularmente de origen microbiano (bacteriano, de levadura o fúngico) y puede(n) obtenerse mediante téenicas usadas convencionalmente en la materia.
Típicamente, la xilanasa es de origen microbiano, por ejemplo, derivada de una bacteria o un hongo, tal como una cepa de Aspergillus . Además, se contempla la xilanasa derivada de mamíferos o plantas. Las xilanasas incluyen Pentopan® y Novozym 384®, por ejemplo, que son preparaciones de xilanasa disponibles comercialmente producidas a partir de Trichoderma reesei . La amiloglucosidasa puede ser una amiloglucosidasa de A. niger (tal como AMG®). Otros productos de amilasa útiles incluyen Grindamyl® A 1000 o A 5000 (Grindsted Products, Dinamarca) y Amylase® H o Amylase® P (DSM). La glucosa oxidasa puede ser una glucosa oxidasa fúngica, particularmente, una glucosa oxidasa de Aspergillus niger (tal como Gluzyme®). Una proteasa ilustrativa es Neutrase®.
El proceso puede usarse para cualquier tipo de producto horneado preparado a partir de una masa, ya sea de un carácter suave o crujiente, ya sea de tipo blanco, claro u oscuro. Los ejemplos son el pan, particularmente blanco, integral o pan de centeno, típicamente, en la forma de barras de pan o bollos, tales como, pero sin limitarse a, pan francés de tipo baguette, pan de pita, tortillas, tortas, panqueques, bizcochos, galletitas, costra del pastel, pan crujiente, pan al vapor, pizza y similares.
La TeAmyl o variante de esta pueden usarse en una premezcla, que comprende harina junto con una amilasa contra el enranciamiento, una fosfolipasa, y/o un fosfolípido. La premezcla puede contener otros aditivos para mejorar la masa y/o para mejorar el pan, por ejemplo, cualquiera de los aditivos, que incluyen las enzimas, mencionados anteriormente. La TeAmyl o variante de esta pueden ser un componente de una preparación enzimática que comprende una amilasa contra el enranciamiento y una fosfolipasa, para usarse como un aditivo para hornear.
La preparación enzimática está, opcionalmente, en la forma de un polvo granulado o aglomerado. La preparación puede tener una distribución estrecha del tamaño de partículas con más de 95 % (en peso) de las partículas en el intervalo de 25 a 500 pm. Los polvos granulados y aglomerados pueden prepararse mediante métodos convencionales, por ejemplo, al rociar la TeAmyl o variante de esta sobre un vehículo en un granulador de lecho fluidizado. Los vehículos pueden consistir en núcleos particulados que tienen un tamaño de partícula adecuado. El vehículo puede ser soluble o insoluble, por ejemplo, una sal (tal como NaCl o sulfato de sodio), un azúcar (tal como sacarosa o lactosa), un alcohol de azúcar (tal como sorbitol), almidón, arroz, sémola de maíz, o soja.
Las partículas envueltas, es decir, las partículas de a-amilasa, pueden comprender una TeAmyl o variantes de esta. Para preparar partículas de a-amilasa envueltas, la enzima se pone en contacto con un lípido de grado alimenticio en cantidad suficiente para suspender todas las partículas de a-amilasa. Los lípidos de grado alimenticio, como se usa en la presente descripción, pueden ser cualquier compuesto orgánico natural que es insoluble en agua, pero es soluble en solventes orgánicos no polares tales como hidrocarburos o éter dietílico. Los lípidos de grado alimenticio adecuados incluyen, pero no se limitan a, triglicéridos ya sea en la forma de grasas o aceites que son saturados o insaturados. Los ejemplos de ácidos grasos y combinaciones de estos que componen los triglicéridos saturados incluyen, pero no se limitan a, butírico (derivado de la grasa de la leche), palmítico (derivado de la grasa animal y vegetal), y/o esteárico (derivado de la grasa animal y vegetal). Los ejemplos de ácidos grasos y combinaciones de estos, que componen los triglicéridos insaturados incluyen, pero no se limitan a, palmitoleico (derivado de la grasa animal y vegetal), oleico (derivado de la grasa animal y vegetal), linoleico (derivado de aceites vegetales), y/o linolénico (derivado del aceite de linaza). Otros lípidos de grado alimenticio adecuados incluyen, pero no se limitan a, monoglicéridos y diglicéridos derivados de los triglicéridos discutidos anteriormente, fosfolípidos y glicolípidos.
El lípido de grado alimenticio, particularmente en forma líquida, puede ponerse en contacto con una forma en polvo de las partículas de a-amilasa de una manera tal que el material lipídico cubra al menos una porción de la superficie de al menos la mayoría, por ejemplo, 100 % de las partículas de a-amilasa. Así, cada partícula de a-amilasa está envuelta individualmente en un lípido. Por ejemplo, todas o sustancialmente todas las partículas de a-amilasa se proporcionan con una película de lípidos, fina, continua, envolvente. Esto puede lograrse, primero, al verter una cantidad de lípido en un recipiente y, después, suspender las partículas de a-amilasa de manera que el lípido humedezca totalmente la superficie de cada partícula de a-amilasa. Después de un corto periodo de agitación, se recuperan las partículas de a-amilasa envueltas, que portan una cantidad sustancial de los lípidos en sus superficies. El espesor del revestimiento así aplicado a las partículas de a-amilasa puede controlarse mediante la selección del tipo de lípido usado y al repetir la operación con el objetivo de crear una película más gruesa, cuando se desee.
El almacenamiento, la manipulación y la incorporación del vehículo de suministro cargado pueden lograrse por medio de una mezcla de envasado. La mezcla de envasado puede comprender la a-amilasa envuelta. Sin embargo, la mezcla de envasado puede contener, además, ingredientes adicionales según se requiera por el fabricante o el panadero. Después que la a-amilasa envuelta se ha incorporado en la masa, el panadero continúa a través del proceso normal de producción del producto.
Las ventajas de envolver las partículas de a-amilasa son de dos tipos. Primero, el lípido de grado alimenticio protege a la enzima de la desnaturalización térmica durante el proceso de horneado para aquellas enzimas que son lábiles al calor. Consecuentemente, mientras la a-amilasa se estabiliza y se protege durante las etapas de prueba y horneado, se libera del revestimiento protector en el producto horneado final, en donde hidroliza los enlaces glucosídicos en los poliglucanos. El vehículo de suministro cargado proporciona, además, una liberación sostenida de la enzima activa en el producto horneado. Es decir, tras el proceso de horneado, la oí-amilasa activa se libera de manera continua del revestimiento protector a una velocidad que contrarresta y, por lo tanto reduce la velocidad de, los mecanismos de enranciamiento.
Generalmente, la cantidad de lípido aplicado a las partículas de a-amilasa puede variar de un pequeño porcentaje del peso total de la a-amilasa a muchas veces ese peso, en dependencia de la naturaleza del lípido, la manera en que se aplica a las partículas de a-amilasa, la composición de la mezcla de masa a tratar, y la severidad de la operación de mezcla de la masa en cuestión.
El vehículo de suministro cargado, es decir, la enzima con envoltura lipídica, se añade a los ingredientes usados para preparar un producto horneado en una cantidad eficaz para prolongar la vida en estante del producto horneado. El panadero calcula la cantidad de a-amilasa envuelta, preparada como se discutió anteriormente, que se requerirá para lograr el efecto contra el ranciamiento deseado. La cantidad de la a-amilasa envuelta requerida se calcula en base a la concentración de la enzima envuelta y a la proporción de a-amilasa con respecto a la harina especificada. Se ha encontrado que es eficaz en un amplio intervalo de concentraciones, aunque, como se ha discutido, las mejoras observables en contra del enranciamiento no se corresponden linealmente con la concentración de a-amilasa, pero por encima de ciertos niveles mínimos, grandes aumentos en la concentración de la a-amilasa produce poca mejora adicional. La concentración de a-amilasa usada realmente en una producción de panadería podría ser mucho más alta que el mínimo necesario para proporcionar al panadero con un seguro contra errores de baja medida inadvertidos por el panadero. El límite inferior de concentración de la enzima se determina por el mínimo efecto contra el enranciamiento que el panadero desea alcanzar.
Un método para preparar un producto horneado puede comprender: a) preparar partículas de a-amilasa revestidas con lípido, en donde sustancialmente todas las partículas de a-amilasa están revestidas; b) mezclar una masa que contiene harina; c) añadir la a-amilasa revestida con lípido a la masa antes que se complete la mezcla y terminar el mezclado antes de que se elimine el revestimiento lipídico de la a-amilasa; d) probar la masa; y e) hornear la masa para proporcionar el producto horneado, en donde la a-amilasa está inactiva durante las etapas de mezcla, de prueba y de horneado y está activa en el producto horneado.
La a-amilasa envuelta puede añadirse a la masa durante el ciclo de mezclado, por ejemplo, cerca del final del ciclo de mezclado. La a-amilasa envuelta se añade en un punto en la etapa de mezclado que permite la distribución suficiente de la a-amilasa envuelta en toda la masa; sin embargo, la etapa de mezclado se termina antes que el revestimiento protector se despoje de la(s) partícula(s) de a-amilasa. En dependencia del tipo y el volumen de la masa, y de la acción mezcladora y la velocidad, podrían requerirse de uno a seis minutos o más para mezclar la a-amilasa envuelta en la masa, pero el promedio es de dos a cuatro minutos. Así, algunas variables pueden determinar el procedimiento preciso. En primer lugar, la cantidad de a-amilasa envuelta debe tener un volumen total suficiente para permitir que la a-amilasa envuelta se disperse en toda la mezcla de la masa. Si la preparación de a-amilasa envuelta está muy concentrada, puede necesitarse añadir aceite adicional a la premezcla antes de añadir la a-amilasa envuelta a la masa. Las recetas y los procesos de producción pueden requerir modificaciones específicas; sin embargo, generalmente pueden lograrse buenos resultados cuando el 25 % del aceite especificado en una fórmula de masa de pan se lleva a cabo fuera de la masa y se usa como un vehículo para un a-amilasa envuelta concentrada cuando se añade cerca del final del ciclo de mezclado. En el pan u otros productos horneados, particularmente aquellos que tienen un bajo contenido en grasa, por ejemplo, panes de estilo francés, una mezcla de a-amilasa envuelta de aproximadamente 1 % del peso de harina seca es suficiente para mezclar apropiadamente la a-amilasa envuelta con la masa. El intervalo de porcentajes adecuados es amplio y depende de la fórmula, del producto terminado, y de los requisitos de la metodología de producción del panadero individual. En segundo lugar, la suspensión de a-amilasa envuelta debe añadirse a la mezcla con tiempo suficiente para el mezclado completo en la masa, pero no por un tiempo tal que la acción mecánica excesiva despoje del revestimiento protector lipídico a las partículas envueltas de a-amilasa.
En un aspecto adicional de la invención, la composición alimenticia es una composición de aceite, carne, manteca que comprende una TeAmyl o una variante de esta. En este contexto, el término “composición de aceite/carne/manteca” significa cualquier composición, basada en, preparada a partir de y/o que contiene aceite, carne o manteca, respectivamente. Otro aspecto de la invención se refiere a un método de preparación de una composición de aceite o carne o manteca y/o un aditivo que comprende una TeAmyl o una variante de esta, que comprende mezclar el polipéptido de la invención con una composición de aceite/carne/manteca y/o ingredientes aditivos.
En un aspecto adicional de la invención, la composición alimenticia es una composición de pienso animal, un aditivo para la alimentación animal y/o un alimento para mascotas que comprende una TeAmyl y variantes de esta. La presente invención se refiere, además, a un método para preparar tal composición de pienso animal, composición aditiva para la alimentación animal y/o alimentos para mascotas que comprende mezclar una TeAmyl y variantes de esta con uno o más ingredientes de pienso animal y/o ingredientes aditivos para pienso animal y/o ingredientes para alimentos de mascotas. Además, la presente invención se refiere al uso de una TeAmyl y variantes de esta en la preparación de una composición de pienso animal y/o composición aditiva para pienso animal y/o alimentos para mascotas.
El término “animal” incluye todos los animales no rumiantes y rumiantes. En una modalidad particular, el animal es un animal no rumiante, tal como un caballo y un animal onogástrico. Los ejemplos de animales monogástricos incluyen, pero no se limitan a, cerdos y puercos, tales como lechones, cerdos en crecimiento, cerdas; aves tales como pavos, patos, pollos, pollos de engorde, ponedoras, peces tales como salmón, trucha, tilapia, pez gato y carpas; y crustáceos tales como camarones y langostinos. En una modalidad adicional, el animal es un animal rumiante, que incluye, pero no se limita a, vacas, terneros, cabras, ovejas, jirafas, bisontes, alces, wapití, yaks, búfalos de agua, ciervos, camellos, alpacas, llamas, antílopes, berrendo y nilgai.
En el presente contexto, se pretende que el término “alimento de mascotas” se entienda que signifique un alimento para un animal doméstico tal como, pero sin limitarse a perros, gatos, gerbos, hámsteres, chinchillas, ratas de lujo, cobayas; aves de compañía, tales como canarios, periquitos, y loros; mascotas reptiles, tales como tortugas, lagartos y serpientes; y animales acuáticos, tales como peces tropicales y ranas.
Los términos “composición de pienso animal”, “alimento” y “pienso” se usan indistintamente y pueden comprender una o varias materias primas seleccionadas del grupo que comprende a) cereales, tales como granos pequeños (por ejemplo, trigo, cebada, centeno, avena y combinaciones de estos) y/o granos grandes tales como el maíz o el sorgo, b) subproductos a partir de cereales, tales como harina de gluten de maíz, granos de destilería secos con solubles (DDGS) (particularmente, granos de destilería secos con solubles basados en maíz (cDDGS), salvado de trigo, harinilla de trigo, subproducto de la molienda de trigo, salvado de arroz, cáscaras de arroz, cáscaras de avena, almendra de palma, y pulpa de cítricos; c) proteína obtenida a partir de fuentes tales como soja, girasol, cacahuate, altramuz, chícharos, habas, algodón, cañóla, harina de pescado, proteína de plasma seca, harina de carne y hueso, proteína de papa, suero, copra, ajonjolí; d) aceites y grasas obtenidos a partir de fuentes vegetales y animales; e) minerales y vitaminas. 6. Composiciones de desaprestado de telas y uso Además, se contemplan composiciones y métodos para tratar telas (por ejemplo, para desaprestar una tela) con el uso de una TeAmyl o una variante de esta. Los métodos de tratamiento de telas se conocen bien en la materia (ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 6,077,316). Por ejemplo, la sensación que imparte una tela y la apariencia de esta pueden mejorarse mediante un método que comprende poner en contacto la tela con una TeAmyl o una variante de esta en una solución. Opcionalmente la tela puede tratarse con la solución bajo presión.
Una TeAmyl o una variante de esta puede aplicarse durante o después del tejido de una tela o durante la etapa de desaprestado o una o más etapas de procesamiento adicional de las telas. Durante el tejido de las telas, los hilos se exponen a una deformación mecánica considerable. Antes de tejer en telares mecánicos, los hilos de urdimbre se recubren, frecuentemente, con almidón del apresto o derivados de almidón para aumentar su resistencia a la tracción y para evitar la rotura. Una TeAmyl o una variante de esta puede aplicarse durante o después del proceso de tejido para eliminar este almidón del apresto o los derivados del almidón. Después de tejer, puede usarse una TeAmyl o una variante de esta para eliminar el revestimiento del apresto antes del procesamiento posterior de la tela para asegurar un resultado homogéneo y a prueba de lavado.
Una TeAmyl o una variante de esta puede usarse sola o con otros reactivos químicos de desaprestado y/o enzimas de desaprestado para desaprestar telas que incluyen telas que contienen algodón, como aditivos detergentes, por ejemplo, en composiciones acuosas. Una TeAmyl o una variante de esta puede usarse, además, en composiciones y métodos para producir una apariencia de lavado a la piedra en telas y prendas de mezclilla índigo. Para la fabricación de prendas de vestir, la tela se puede cortar y coser en prendas de vestir que, después, se terminan. Particularmente, para la fabricación de pantalones vaqueros de mezclilla se han desarrollado diferentes métodos de acabado enzimático. El acabado de la prenda de mezclilla se inicia, normalmente, con una etapa de desaprestado enzimático durante la cual las prendas se exponen a la acción de enzimas amilolíticas para proporcionar suavidad a la tela y hacer que el algodón sea más accesible a las etapas de acabado enzimático posteriores. Una TeAmyl o una variante de esta puede usarse en métodos de acabado de prendas de mezclilla (por ejemplo, un “proceso de destinción”), desaprestado enzimático y de suministro de suavidad a las telas, y/o proceso de acabado. 7. Composiciones de limpieza Un aspecto de las presentes composiciones y métodos es una composición de limpieza que incluye una TeAmyl o una variante de esta como un componente. Un polipéptido de amilasa puede usarse como un componente en composiciones detergentes para el lavado de manos, lavado de ropa, lavado de vajillas, y para la limpieza de otras superficies duras. 7.1. Descripción general Preferentemente, la TeAmyl o variante de esta se incorporan en los detergentes en o cerca de una concentración usada convencionalmente para la amilasa en detergentes. Por ejemplo, un polipéptido de amilasa puede añadirse en una cantidad correspondiente a 0.00001 - 1 mg (calculada como proteína enzimática pura) de amilasa por litro de solución de lavado/lavavajillas. Las formulaciones ilustrativas se proporcionan en la presente descripción, como se ejemplifican por lo siguiente: Un polipéptido de amilasa puede ser un componente de una composición detergente, como la única enzima o con otras enzimas que incluyen otras enzimas amilolíticas. Como tal, pueden incluirse en la composición detergente en la forma de un granulado que no forma polvo, un líquido estabilizado o una enzima protegida. Los granulados que no forman polvo pueden producirse, por ejemplo, tal como se describe en las patentes de los EE. UU. núms.4,106,991 y 4,661,452 y, opcionalmente, pueden recubrirse por métodos conocidos en la materia. Los ejemplos de materiales de revestimiento ceroso son productos de poli(óxido de etileno) (polietilenglicol, PEG) con pesos molares promedio de 1,000 a 20,000; nonilfenoles etoxilados que tienen de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos etoxilados, en donde el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de carbono, y en donde hay de 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono, di y triglicéridos de ácidos grasos. Los ejemplos de materiales de revestimiento adecuados que forman una película para la aplicación por medio de téenicas de lecho fluidizado se proporcionan, por ejemplo, en la patente de Gran Bretaña núm. GB 1483591. Las preparaciones enzimáticas líquidas pueden estabilizarse, por ejemplo, mediante la adición de un poliol tal como propilenglicol, un azúcar o alcohol sacaroso, ácido láctico o ácido bórico de conformidad con métodos establecidos. En la materia se conocen otros estabilizantes de enzimas. Las enzimas protegidas pueden prepararse de conformidad con el método descrito por ejemplo en la patente europea núm. EP 238 216. Los polioles se conocen desde hace tiempo como estabilizantes de proteínas, así como mejoradores de la solubilidad de las proteínas.
La composición detergente puede estar en cualquier forma útil, por ejemplo, como polvos, gránulos, pastas, o líquido. Un detergente líquido puede ser acuoso, típicamente, con un contenido de hasta aproximadamente 70 % de agua y 0 % a aproximadamente 30 % de solvente orgánico. Además, puede estar en la forma de un tipo de gel compacto que contiene solo aproximadamente 30 % de agua.
La composición detergente comprende uno o más tensioactivos, cada uno de los cuales puede ser aniónico, no iónico, catiónico o zwiteriónico. El detergente usualmente contendrá de 0 % a aproximadamente 50 % de tensioactivo aniónico, tal como alquilbencenosulfonato lineal (LAS); a-olefinsulfonato (AOS), sulfato de alquilo (sulfato de alcohol graso) (AS); etoxisulfato de alcohol (AEOS o AES); alcanosulfonatos secundarios (SAS); a-sulfo metil ásteres de ácidos grasos; ácido alquil o alquenilsuccínico; o jabón. Además, la composición puede contener de 0 % a aproximadamente 40 % de tensioactivo no iónico tal como etoxilato de alcohol (AEO o AE), etoxilatos de alcohol carboxilado, etoxilato de nonilfenol, alquilpoliglicósido, óxido de alquildimetilamina, monoetanolamida de ácidos grasos etoxilados, monoetañolamída de ácidos grasos, o amida de ácidos grasos polihidroxialquilados (como se describe por ejemplo, en la patente núm. WO 92/06154).
La composición detergente puede comprender, adicionalmente, una o más de otras enzimas, tales como proteasas, otra enzima amilolítica, cutinasa, lipasa, celulasa, pectato liasa, perhidrolasa, xilanasa, peroxidasa, y/o lacasa en cualquier combinación.
El detergente puede contener de aproximadamente 1 % a aproximadamente 65 % de un aditivo detergente o agente formador de complejos, tales como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato, citrato, ácido nitrilotriacético (NTA), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido dietilentriaminapentaacético (DTMPA), ácido alquil o alquenil succínico, silicatos solubles o silicatos estratificados ( por ejemplo, SKS-6 de Hoechst). Además, el detergente puede no contener aditivos, es decir, puede estar esencialmente libre de aditivo de detergente. Las enzimas pueden usarse en cualquier composición compatible con la estabilidad de la enzima. Las enzimas pueden protegerse, generalmente, contra componentes perjudiciales por medio de formas de encapsulación conocidas, por ejemplo, mediante granulación o secuestro en hidrogeles. Las enzimas y, específicamente, las amilasas, ya sea con o sin dominios de unión al almidón, pueden usarse en una variedad de composiciones que incluyen aplicaciones para lavandería y lavavajillas, limpiadores de superficies, así como en composiciones para la producción de etanol a partir de almidón o biomasa.
El detergente puede comprender uno o más polímeros. Los ejemplos incluyen carboximetilcelulosa (CMC), poli (vinilpirrolidona) (PVP), polietilenglicol (PEG), poli(alcohol vinílico) (PVA), policarboxilatos, tales como poliacrilatos, copolímeros de ácido maleico/ácido acrílico y copolímeros de metacrilato de laurilo/ácido acrílico.
El detergente puede contener un sistema blanqueador que puede comprender una fuente de H2O2 tal como perborato o percarbonato que se puede combinar con un activador de blanqueo formador de perácido, tal como tetraacetiletilendiamina (TAED) o nonanoiloxibencenosulfonato (NOBS). Alternativamente, el sistema blanqueador puede comprender peroxiácidos (por ejemplo, los peroxiácidos del tipo amida, imida o sulfona). El sistema blanqueador puede ser, además, un sistema blanqueador enzimático, por ejemplo, perhidrolasa, tal como el descrito en la solicitud internacional del PCT núm. WO 2005/056783.
Las enzimas de la composición detergente pueden estabilizarse mediante el uso de agentes estabilizantes convencionales, por ejemplo, un poliol tal como propilenglicol o glicerol; un azúcar o alcohol de azúcar; ácido láctico; ácido bórico o un derivado de ácido bórico tal como, por ejemplo, un áster de borato aromático; y la composición puede formularse tal como se describe por ejemplo, en las patentes núms. WO 92/19709 y WO 92/19708.
El detergente puede contener, además, otros ingredientes detergentes convencionales tales como, por ejemplo, acondicionadores de telas que incluyen arcillas, reforzadores de espuma, supresores de espuma, agentes anticorrosión, agentes de suspensión de suciedad, agentes contra el redepósito de suciedad, tintes, bactericidas, inhibidores de deslustre, abrillantadores ópticos, o perfumes.
El pH (medido en solución acuosa en la concentración de uso) es, usualmente, neutro o alcalino, por ejemplo, un pH de aproximadamente 7.0 a aproximadamente 11.0.
Más abajo se describen formas particulares de las composiciones detergentes para la inclusión de la presente a-amilasa. 7.2. ición de lavandería lí ida de gran rendimiento (HDL) Las composiciones detergentes de lavandería HDL ilustrativas incluyen un tensioactivo detersivo (10 % -40 % p/p), que incluye un tensioactivo detersivo aniónico (seleccionado de un grupo de cadena lineal o ramificada o aleatoria, sulfatos de alquilo sustituidos o no sustituidos, sulfonatos de alquilo, sulfato alquil alcoxilado, fosfatos de alquilo, fosfonatos de alquilo, carboxilatos de alquilo y/o mezclas de estos) y, opcionalmente, un tensioactivo no iónico (seleccionado de un grupo de cadena lineal o ramificada o aleatoria, alcohol alquil alcoxilado sustituido o no sustituido, por ejemplo, un alcohol alquil etoxilado de Cs-Cis y/o alquil fenol alcoxilatos de C6-C12), en donde la relación en peso del tensioactivo detersivo aniónico (con un índice hidrófilo (HIc) de 6.0 a 9) con respecto al tensioactivo detersivo no iónico es mayor que 1:1. Los tensioactivos detersivos adecuados incluyen, además, tensioactivos detersivos catiónicos (seleccionados de un grupo de compuestos de alquil piridinio, compuestos de amonio cuaternario de alquilo, compuestos de fosfonio cuaternario de alquilo, compuestos de sulfonio ternarios de alquilo, y/o mezclas de estos); tensioactivos detersivos zwitteriónicos y/o anfóteros (seleccionados de un grupo de alcanolamina sulfo-betaínas); tensioactivos anfolíticos, tensioactivos semipolares no iónicos y mezclas de estos.
La composición puede incluir, opcionalmente, un polímero impulsor de surfactancia que consiste en polímeros de limpieza de grasa alcoxilados anfifílicos (seleccionados de un grupo de polímeros alcoxilados que tiene propiedades hidrófilas e hidrófobas ramificadas, tales como polialquileniminas alcoxiladas en el intervalo de 0.05 % en peso-10 % en peso) y/o polímeros de injerto aleatorios (que comprenden, típicamente, una cadena principal hidrófila que comprende monómeros seleccionados del grupo que consiste en: ácidos carboxílicos insaturados C1-C6, éétteerreess,, alcoholes, aldehidos, cetonas, ésteres, unidades de azúcar, unidades alcoxi, anhídrido maleico, polialcoholes saturados tales como glicerol, y mezclas de estos; y cadena (s) lateral(es) hidrófoba(s) seleccionadas del grupo que consiste en: grupo alquilo C4-C25, polipropileno, polibutileno, áster de vinilo de un ácido monocarboxílico saturado de C1-C6, alquil áster de C1-C6 de ácido acrílico o metacrílico, y mezclas de estos.
La composición puede incluir polímeros adicionales tales como polímeros de liberación de suciedad (incluyen poliésteres con remate aniónico, por ejemplo SRP1, polímeros que comprenden al menos una unidad monomérica seleccionada de un sacárido, ácido dicarboxílico, poliol y combinaciones de estos, en una configuración aleatoria o en bloque, polímeros basados en tereftalato de etileno y copolímeros de estos en una configuración aleatoria o en bloque, por ejemplo, Repel-o-tex SF, SF-2 y SRP6, Texcare SRA100, SRA300, SR 100, SRN170, SRN240, SRN300 y SRN325, Marloquest SL), polímeros contra el redepósito (0.1 % en peso a 10 % en peso, incluyen polímeros de carboxilato, tales como polímeros que comprenden al menos un monómero seleccionado de ácido acrílico, ácido maleico (o anhídrido maleico), ácido fumárico, ácido itacónico, ácido aconítico, ácido mesacónico, ácido citracónico, ácido metilenmalónico, y cualquier mezcla de estos, homopolímero de vinilpirrolidona, y/o polietilenglicol, con peso molecular en el intervalo de 500 a 100,000 Da); polímero celulósico (que incluye aquellos seleccionados de alquil celulosa, alcoxialquil celulosa, carboxialquil celulosa, alquil carboxialquil celulosa ejemplos de los cuales incluyen carboximetilcelulosa, metil celulosa, metil hidroxietil celulosa, metil carboximetilcelulosa, y mezclas de estos) y carboxilato polimérico (tal como copolímero de maleato/acrilato aleatorio u homopolímero de poliacrilato).
La composición puede incluir, además, ácido graso saturado o insaturado, preferentemente, ácidos grasos C12-C24 saturados o insaturados (0 % en peso a 10 % en peso); agentes de depósito (ejemplos de los cuales incluyen polisacáridos, preferentemente, polímeros celulósicos, haluros de poli dialil dimetil amonio (DADMAC), y copolímeros de DAD MAC con vinil pirrolidona, acrilamidas, imidazoles, haluros de imidazolinio, y mezclas de estos, en una configuración aleatoria o de bloque, goma de guar catiónica, celulosa catiónica tal como hidroxietil celulosa catiónica, almidón catiónico, policilamidas catiónicas, y mezclas de estos.
La composición puede incluir, adicionalmente, agentes inhibidores de la transferencia de colorantes, ejemplos de los cuales incluyen ftalocianina de manganeso, peroxidasas, polímeros de polivinilpirrolidona, polímeros de N-óxido de poliamina, copolímeros de N-vinilpirrolidona y N-vinilimidazol , poliviniloxazolidonas y polivinilimidazoles y/o mezclas de estos; agentes quelantes, ejemplos de los cuales incluyen ácido etilen-diamino-tetraacético (EDTA), ácido dietilen triamino penta metilenofosfónico (DTPMP), ácido hidroxi-etano difosfónico (HEDP), ácido etilendiamina N,N '-disuccínico (EDDS), ácido metil glicina diacético (MGDA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), ácido propilendiamino tetraacético (PDT A), N-óxido de la 2-hidroxipiridina (HPNO), o ácido metil glicina diacético (MGDA), ácido glutámico ácido N,N diacético (sal tetrasódica del ácido N,N-dicarboximetil glutámico (GLDA), ácido nitrilotriacético (NTA), ácido 4,5-dihidroxi-m-bencenodisulfónico, ácido cítrico y cualquier sal de estos, ácido N-hidroxietiletilendiaminetri-acético (HEDTA), ácido trietilentetraaminohexaacético (TTHA), ácido N-hidroxietiliminodiacético (HEIDA), dihidroxietilglicina (DHEG), ácido etilendiaminotetrapropiónico (EDTP), y derivados de estos.
La composición incluye, preferentemente, enzimas (generalmente, de aproximadamente 0.01 % en peso de enzima activa a 0.03 % en peso de enzima activa) seleccionadas de proteasas, amilasas, lipasas, celulasas, colina oxidasas, peroxidasas/oxidasas, pectato liasas, mananasas, cutinasas, lacasas, fosfolipasas, lisofosfolipasas, aciltransferasas, perhidrolasas, arilesterasas, y cualquier mezcla de estas. La composición puede incluir un estabilizador de enzima (ejemplos de los cuales incluyen polioles tales como propilenglicol o glicerol, azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico, inhibidor de proteasa reversible, ácido bórico, o un derivado de ácido bórico, por ejemplo, un áster de borato aromático, o un derivado de ácido fenil borónico tal como ácido -formilfenil borónico).
La composición incluye, opcionalmente, silicona o supresores de jabonaduras basados en ácidos grasos; colorantes de matizado, cationes calcio y magnesio, ingredientes de señalización visual, antiespuma (de 0.001 % en peso a aproximadamente 4.0 % en peso), y/o un agente de estructuración/espesante (de 0.01 % en peso a 5 % en peso, seleccionado del grupo que consiste en diglicéridos y triglicéridos, diestearato de etilenglicol, celulosa microcristalina, materiales a base de celulosa, celulosa de microfibra, biopolímeros, goma de xantano, goma gelana, y mezclas de estos).
La composición puede ser de cualquier forma líquida, por ejemplo una forma líquida o gel, o cualquier combinación de estas. La composición puede estar en cualquier forma de dosis unitaria, por ejemplo, una bolsa. 7.3. Composición detergente de lavandería seca/sólida de gran rendimiento (HDD) Las composiciones detergentes de lavandería HDD ilustrativas incluyen un tensioactivo detersivo, que incluye tensioactivos detersivos aniónicos (por ejemplo, de cadena lineal o ramificada o aleatorio, sulfatos de alquilo sustituidos o no sustituidos, sulfonatos de alquilo, sulfato de alquilo alcoxilado, fosfatos de alquilo, fosfonatos de alquilo, carboxilatos de alquilo y/o mezclas de estos), tensioactivo detersivo no iónico (por ejemplo, de cadena lineal o ramificada o aleatoria, etoxilatos de alquilo de Cs-Cis sustituidos o no sustituidos, y/o alquil alcoxilatos de fenol de C6-C12), tensioactivos detersivos catiónicos (por ejemplo, compuestos de alquil piridinio, compuestos de amonio cuaternario, compuestos de alquil fosfonio cuaternario, compuestos de alquil sulfonio ternario, y mezclas de estos), tensioactivos detersivos zwitteriónicos y/o anfóteros (por ejemplo, alcanolamina sulfo-betaínas), tensioactivos anfolíticos, tensioactivos semipolares no iónicos, y mezclas de estos; aditivos que incluyen aditivos libres de fosfato (por ejemplo, aditivos de zeolita, ejemplos de los cuales incluyen zeolita A, zeolita X, zeolita P y zeolita MAP en el intervalo de 0 % en peso a menos de 10 % en peso), aditivos de fosfato (por ejemplo, tripolifosfato de sodio en el intervalo de 0 % en peso a menos de 10 % en peso), ácido cítrico, sales de citrato y ácido nitrilotriacético, sal de silicato (por ejemplo, silicato sódico o potásico o metasilicato sódico en el intervalo de 0 % en peso a menos de 10 % en peso o silicato estratificado (SKS-6)); sal de carbonato (por ejemplo, carbonato sódico y/o bicarbonato sódico en el intervalo de 0 % en peso a menos de 80 % en peso); y agentes blanqueadores que incluyen fotoblanqueadores (por ejemplo, ftalocianinas de zinc sulfonadas, ftalocianinas de aluminio sulfonadas, colorantes de xantenos, y mezclas de estos) activadores de blanqueo hidrófobos o hidrófilos (por ejemplo, sulfonato de dodecanoil oxibenceno, sulfonato de decanoil oxibenceno, ácido decanoil oxibenzoico o sales de estos, sulfonato de 3,5,5-trimetil hexanoil oxibenceno, tetraacetil etilendiamina TAED, sulfonato de nonanoiloxibenceno -NOBS, nitrilo quats, y mezclas de estos), fuentes de peróxido de hidrógeno (por ejemplo, sales de perhidrato inorgánicas ejemplos de los cuales incluyen la sal de mono o tetrahidrato de sodio de perborato, percarbonato, persulfato, perfosfato, o persilicato), perácidos hidrófilos y/o hidrófobos preformados (por ejemplo, ácidos y sales percarboxílicos, ácidos y sales percarbónicos, ácidos y sales perimídicos, ácidos y sales peroximonosulfúricos, y mezclas de estos), y/o catalizadores de blanqueo (por ejemplo, reforzadores de blanqueo de imina (ejemplos de los cuales incluyen cationes iminio y poliiones), zwitteriones de iminio, aminas modificadas, óxidos de aminas modificadas, N-sulfoniloiminas, N-fosfoniloiminas, N-aciloiminas, dióxidos de tiadiazol, perfluoroiminas, cetonas de azúcar cíclicas, y mezclas de estos, y catalizadores de blanqueo que contienen metales (por ejemplo, cationes de cobre, hierro, titanio, rutenio, tungsteno, molibdeno, o manganeso junto con cationes de un metal auxiliar tal como zinc o aluminio y un secuestrador tal como ácido etilendiaminotetraacético, etilendiaminotetra(ácido metilenfosfónico), y sales solubles en agua de estos).
La composición incluye, preferentemente, las enzimas, por ejemplo, proteasas, amilasas, lipasas, celulasas, colina oxidasas, peroxidasas/oxidasas, pectato liasas, mananasas, cutinasas, lacasas, fosfolipasas, lisofosfolipasas, aciltransferasa, perhidrolasa, arilesterasa, y cualquier mezcla de estas.
La composición puede incluir, opcionalmente, ingredientes detergentes adicionales que incluyen microcápsulas de perfume, perfume acorde encapsulado con almidón, agentes de matizado, polímeros adicionales, que incluyen polímeros catiónicos y para la integridad de la tela, ingredientes de bloqueo de tintes, agentes suavizantes de telas, abrillantadores (por ejemplo abrillantadores fluorescentes C.I.), agentes floculantes, agentes quelantes, poliaminas alcoxiladas, agentes de depósito de las telas, y/o ciclodextrina. 7.4. Composiciones detergentes líquidas para el lavado automático de vajillas (ADW) Un detergente ADW ilustrativo incluye tensioactivos no iónicos, que incluyen tensioactivos etoxilados no iónicos, tensioactivos de alcohol alcoxilado, polialcoholes (oxialquilados) terminado en epoxi, o tensioactivos de óxido de amina presentes en cantidades de 0 a 10 % en peso; aditivos en el intervalo de 5-60 % que incluyen aditivos de fosfato (por ejemplo, mono-fosfatos, di-fosfatos, tripolifosfatos, otros polifosfatos oligoméricos, tripolifosfato sódico-STPP) y aditivos libres de fosfatos (por ejemplo, compuestos a base de aminoácidos que incluyen ácido metil-glicina-diacético (MGDA) y sales y derivados de estos, ácido glutámico N,N-diacético (GLDA) y sales y derivados de este, ácido iminodisuccínico (IDS) y sales y derivados de este, carboxietil inulina y sales y derivados de esta, ácido nitrilotriacético (NTA), ácido dietilen-triamino pentaacético (DTPA), ácido B-alaninadiacético (B-ADA) y sus sales, homopolímeros y copolímeros de ácidos policarboxílicos y sus sales parcialmente o totalmente neutralizadas, ácidos policarboxílicos monoméricos y ácidos hidroxicarboxílicos, y sus sales en el intervalo de 0.5 % a 50 % en peso; polímeros sulfonados/carboxilados en el intervalo de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 50 % en peso para proporcionar estabilidad dimensional; agentes de secado en el intervalo de 0.1 % a aproximadamente 10 % en peso (por ejemplo, poliésteres, especialmente poliésteres aniónicos, opcionalmente junto con otros monómeros con 3 a 6 funcionalidades, típicamente, funcionalidades de ácido, alcohol o éster propicias para la policondensación, compuestos de poliorganosiloxano de policarbonato, poliuretano y/o poliurea, o compuestos precursores, de estos, particularmente del carbonato cíclico reactivo y de tipo urea); silicatos en el intervalo de aproximadamente 1 % a aproximadamente 20 % en peso (que incluyen silicatos de sodio o potasio, por ejemplo, disilicato de sodio, metasilicato de sodio y filosilicatos cristalinos); blanqueador inorgánico (por ejemplo, sales de perhidrato, tales como sales de perborato, percarbonato, perfosfato, persulfato y persilicato) y blanqueador orgánico (por ejemplo, peroxiácidos orgánicos, que incluyen diacil y tetraacilperóxidos, especialmente, ácido diperoxidodecanodioico, ácido diperoxitetradecanodioico y ácido diperoxihexadecanodioico); activadores de blanqueo (es decir, precursores de perácidos orgánicos en el intervalo de 0.1 % a aproximadamente un 10 % en peso); catalizadores de blanqueo (por ejemplo, triazaciclononano de manganeso y complejos relacionados, bispiridilamina de Co, Cu, Mn y Fe y complejos relacionados, y acetato de cobalto de pentamina (III) y complejos relacionados); agentes para el cuidado del metal en el intervalo de aproximadamente 0.1 % a 5 % en peso (por ejemplo, benzatriazoles, sales metálicas y complejos, y/o silicatos); enzimas en el intervalo de aproximadamente 0.01 a 5.0 mg de enzima activa por gramo de la composición detergente para lavavajillas automáticos (por ejemplo, proteasas, amilasas, lipasas, celulasas, oxidasas de colina, peroxidasas/oxidasas, liasas de pectato, mananasas, cutinasas, lacasas, fosfolipasas, lisofosfolipasas, aciltransferasa, perhidrolasa, arilesterasa, y mezclas de estas); y componentes del estabilizador de enzima (por ejemplo, oligosacáridos, polisacáridos, y sales de metales divalentes inorgánicos). 7.5. Composiciones detergentes adicionales Formulaciones detergentes ilustrativas a las que se puede añadir la presente amilasa se describen, más abajo, en los párrafos numerados. 1) Una composición detergente formulada como un granulado que tiene una densidad global de al menos 600 g/1 que comprende alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido) : aproximadamente 7 % a aproximadamente 12 %; etoxisulf to de alcohol (por ejemplo, alcohol de C12-18, 1-2 óxido de etileno (EO)) o sulfato de alquilo ( por ejemplo, Ci6-ie): aproximadamente 1 % a aproximadamente 4 %; etoxilato de alcohol (por ejemplo, alcohol de C14-15, 7 EO): aproximadamente 5 % a aproximadamente 9 %; carbonato sódico (por ejemplo, Na2CC>3): aproximadamente 14 % a aproximadamente 20 %; silicato soluble (por ejemplo, Na20, 2Si02): aproximadamente 2 a aproximadamente 6 %; zeolita (por ejemplo, NaAlSiO-i): aproximadamente 15 % a aproximadamente 22 %; sulfato sódico (por ejemplo, Na2SO4): 0 % a aproximadamente 6 %; citrato sódico/ácido cítrico (por ejemplo, CeHsNasC/CeHsOv): aproximadamente 0 % a aproximadamente 15 %; perborato sódico (por ejemplo, NaB03H2O): aproximadamente 11 % a aproximadamente 18 %; TAED: aproximadamente 2 % a aproximadamente 6 %; carboximetilcelulosa (CMC) y 0 a aproximadamente 2 %; polímeros (por ejemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, PVP, PEG) 0-3 %; enzimas (calculadas como enzima pura) 0.0001-0.1 % de proteína; e ingredientes menores (por ejemplo, supresores de las jabonaduras, perfumes, abrillantador óptico, fotoblanqueador) 0-5 %. 2) Una composición detergente formulada como un granulado que tiene una densidad global de al menos 600 g/1 que comprende alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido) : aproximadamente 6 % a aproximadamente 11 %; etoxisulfato de alcohol (por ejemplo, alcohol de C12-18, 1-2 EO) o sulfato de alquilo (por ejemplo, Ci6-ie): aproximadamente 1 % a aproximadamente 3 %,- etoxilato de alcohol (por ej mplo, alcohol de C14-15, 7 EO): aproximadamente 5 % a aproximadamente 9 %; carbonato sódico (por ejemplo, Na2C03): aproximadamente 15 % a aproximadamente 21 %; silicato soluble (por ejemplo, Na20, 2Si02): aproximadamente 1 % a aproximadamente 4 %; zeolita (por ejemplo, NaAlSi04): aproximadamente 24 % a aproximadamente 34 %; sulfato sódico (por ejemplo, Na2SO4): aproximadamente 4 % a aproximadamente 10 %; citrato sódico/ácido cítrico (por ejemplo, CeHsNasCb/ OdHbOn): 0 % a aproximadamente 15 %; carboximetilcelulosa (CMC): 0 % a aproximadamente 2 %; polímeros (por ejemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, PVP, PEG) 1-6 %; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0.0001-0.1 %; ingredientes menores (por ejemplo, supresores de las jabonaduras, perfume) 0-5 %. 3) Una composición detergente formulada como un granulado que tiene una densidad global de al menos 600 g/1 que comprende alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido): aproximadamente 5 % a aproximadamente 9 %; etoxilato de alcohol (por ejemplo, alcohol de C12-15, 7 EO): aproximadamente 7 % a aproximadamente 14 %; jabón como ácido graso (por ejemplo, ácido graso de C16-22): aproximadamente 1 a aproximadamente 3 %,-carbonato sódico (como Na2CC>3): aproximadamente 10 % a aproximadamente 17 %; silicato soluble (por ejemplo, Na20, 2Si02): aproximadamente 3 % a aproximadamente 9 %; zeolita (como NaAlSi04): aproximadamente 23 % a aproximadamente 33 %; sulfato sódico (por ejemplo, Na2SO4): 0 % a aproximadamente 4 %; perborato sódico (por ejemplo, NaBC>3H2O): aproximadamente 8 % a aproximadamente 16 %; TAED: aproximadamente 2 % a aproximadamente 8 %; fosfonato (por ejemplo, EDTMPA): 0 % a aproximadamente 1 %; carboximeti1celulosa (CMC): 0 % a aproximadamente 2 %,- polímeros (por ejemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, PVP, PEG) 0-3 %; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0.0001-0.1 %; ingredientes menores (por ejemplo, supresores de las jabonaduras, perfume, abrillantador óptico) 0-5 %. 4) Una composición detergente formulada como un granulado que tiene una densidad global de al menos 600 g/1 que comprende alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido): aproximadamente 8 % a aproximadamente 12 %; etoxilato de alcohol (por ejemplo, alcohol de C12-15, 7 EO): aproximadamente 10 % a aproximadamente 25 %; carbonato sódico (como Na2C03): aproximadamente 14 % a aproximadamente 22 %; silicato soluble (por ejemplo, Na2Ü, 2S1O2): aproximadamente 1 % a aproximadamente 5 %; zeolita (por ejemplo, NaAlSi04): aproximadamente 25 % a aproximadamente 35 %; sulfato sódico (por ejemplo, Na2SO4): 0 % a aproximadamente 10 %,-carboximetilcelulosa (CMC): 0 % a aproximadamente 2 %; polímeros (por ejemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, PVP, PEG) 1-3 %; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0.0001-0.1 %; e ingredientes menores (por ejemplo, supresores de las jabonaduras, perfume) 0-5 %. 5) Una composición detergente líquida acuosa que comprende alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido): aproximadamente 15 % a aproximadamente 21 %; etoxilato de alcohol (por ejemplo, alcohol de C12-15, 7 EO o alcohol de C12-15, 5 EO): aproximadamente 12 % a aproximadamente 18 %; jabón como ácido graso (por ejemplo, ácido oléico): aproximadamente 3 % a aproximadamente 13 %,-ácido alquenilsuccínico (Ci2-i4): 0 % a aproximadamente 13 %; aminoetanol : aproximadamente 8 % a aproximadamente 18 %; ácido cítrico: aproximadamente 2 % a aproximadamente 8 %; fosfonato: 0 % a aproximadamente 3 %; polímeros (por ejemplo, PVP, PEG): 0 % a aproximadamente 3 %; borato (or ejemplo, B407): 0 % a aproximadamente 2 %; etanol: 0 % a aproximadamente 3 %; propilenglicol: aproximadamente 8 % a aproximadamente 14 %; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0.0001-0.1 %; e ingredientes menores (por ejemplo, dispersantes, supresores de las jabonaduras, perfume, abrillantador óptico) 0-5 %. 6) Una composición detergente líquida acuosa estructurada que comprende alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido): aproximadamente 15 % a aproximadamente 21 %; etoxilato de alcohol ( por ejemplo, alcohol de C12-15, 7 EO, o alcohol de C12-15, 5 EO): 3-9 %; jabón como ácido graso (por ejemplo, ácido oléico): aproximadamente 3 % a aproximadamente 10 %,-zeolita (como NaAlSiO-i): aproximadamente 14 % a aproximadamente 22 %; citrato potásico: aproximadamente 9 % a aproximadamente 18 %; borato ( por ejemplo, B4O7): 0 % a aproximadamente 2 %; carboximetilcelulosa (CMC): 0 % a aproximadamente 2 %; polímeros ( por ejemplo, PVP, PEG): 0 % a aproximadamente 3 %; polímeros de anclaje tales como, por ejemplo, copolímero de metacrilato de laurilo/ácido acrílico; relación molar 25:1, peso molecular 3800) 0 % a aproximadamente 3 %; glicerina: 0 % a aproximadamente 5 %; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0.0001-0.1 %; e ingredientes menores (por ejemplo, dispersantes, supresores de las jabonaduras, perfume, abrillantadores ópticos) 0-5 %. 7) Una composición detergente formulada como un granulado que tiene una densidad global de al menos 600 g/1 que comprende sulfato de alcohol graso aproximadamente 5 % a aproximadamente 10 %; monoetanolamida de ácido graso etoxilado: aproximadamente 3 % a aproximadamente 9 %; jabón como ácido graso 0-3 %; carbonato sódico (por ejemplo, Na2CC>3): aproximadamente 5 % a aproximadamente 10 %; silicato soluble (por ejemplo, Na20, 2Si02): aproximadamente 1 % a aproximadamente 4 %; zeolita (por ejemplo, NaAlSiO-i): aproximadamente 20 % a aproximadamente 40 %; sulfato sódico (por ejemplo, Na2SC>4): aproximadamente 2 % a aproximadamente 8 %; perborato sódico (por ejemplo, NaB03H2O): aproximadamente 12 % a aproximadamente 18 %; TAED: aproximadamente 2 % a aproximadamente 7 %; polímeros (por ejemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, PEG): aproximadamente 1 % a aproximadamente 5 %; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0.0001-0.1 %; e ingredientes menores (por ejemplo, abrillantador óptico, supresores de las jabonaduras, perfume) 0-5 %. 8) Una composición detergente formulada como un granulado que comprende alquilbencenosulfonato lineal(calculado como ácido): aproximadamente 8 % a aproximadamente 14 %; monoetanolamida de ácido graso etoxilado: aproximadamente 5 % a aproximadamente 11 %; jabón como ácido graso 0 % a aproximadamente 3 %; carbonato sódico (por ejemplo, Na2C03): aproximadamente 4 % a aproximadamente 10 %; silicato soluble (Na20, 2Si02): aproximadamente 1 % a aproximadamente 4 %; zeolita (por ejemplo, NaAlSÍ04): aproximadamente 30 % a aproximadamente 50 %; sulfato sódico (por ejemplo, Na2SO4): aproximadamente 3 % a aproximadamente 11 %; citrato sódico (por ejemplo, C6H5Na307): aproximadamente 5 % a aproximadamente 12 %; polímeros (por ejemplo, PVP, copolímero de ácido maleico/acrílico, PEG): aproximadamente 1 % a aproximadamente 5 %; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0.0001-0.1 %; e ingredientes menores (por ejemplo, supresores de las jabonaduras, perfume) 0-5 %. 9) Una composición detergente formulada como un granulado que comprende alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido): aproximadamente 6 % a aproximadamente 12 %; tensioactivo no iónico: aproximadamente 1 % a aproximadamente 4 %; jabón como ácido graso: aproximadamente 2 % a aproximadamente 6 %; carbonato sódico (por ejemplo, Na2C03): aproximadamente 14 % a aproximadamente 22 %; zeolita (por ejemplo, NaAlSi04): aproximadamente 18 % a aproximadamente 32 %; sulfato sódico (por ejemplo, Na2S04): aproximadamente 5 % a aproximadamente 20 %; citrato sódico (por ejemplo, C6H5Na307): aproximadamente 3 % a aproximadamente 8 %; perborato sódico (por ejemplo, NaBC>3H2O): aproximadamente 4 % a aproximadamente 9 %; activador de blanqueo (por ejemplo, NOBS o TAED): aproximadamente 1 % a aproximadamente 5 %; carboximetilcelulosa (CMC): 0 % a aproximadamente 2 %; polímeros (por ejemplo, policarboxilato o PEG): aproximadamente 1 % a aproximadamente 5 %; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0.0001-0.1 %; e ingredientes menores (por ejemplo, abrillantador óptico, perfume) 0-5 %. 10) Una composición detergente líquida acuosa que comprende alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido): aproximadamente 15 % a aproximadamente 23 %; etoxisulfato de alcohol (por ej mplo, alcohol de C12-15, 2-3 EO): aproximadamente 8 % a aproximadamente 15 %; etoxilato de alcohol (por ejemplo, alcohol de C12-15, 7 EO, o alcohol de C12-15, 5 EO): aproximadamente 3 % a aproximadamente 9 %; jabón como ácido graso (por ejemplo, ácido láurico): 0 % a aproximadamente 3 %; aminoetanol: aproximadamente 1 % a aproximadamente 5 %; citrato sódico: aproximadamente 5 % a aproximadamente 10 %; hidrótropo (por ejemplo, toluensulfonato de sodio): aproximadamente 2 % a aproximadamente 6 %; borato (por ejemplo, B4O7): 0 % a aproximadamente 2 %; carboximetilcelulosa 0 % a aproximadamente 1 %; etanol: aproximadamente 1 % a aproximadamente 3 %; propilenglicol: aproximadamente 2 % a aproximadamente 5 %; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0.0001-0.1 %; e ingredientes menores (por ejemplo, polímeros, dispersantes, perfume, abrillantadores ópticos): 0-5 %. 11) Una composición detergente líquida acuosa que comprende alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido): aproximadamente 20 % a aproximadamente 32 %; etoxilato de alcohol ( por ejemplo, alcohol de C12-15, 7 EO, o alcohol de C12-15, 5 EO): 6-12 %; aminoetanol: aproximadamente 2 % a aproximadamente 6 %; ácido cítrico: aproximadamente 8 % a aproximadamente 14 %; borato (por ejemplo, B4O7): aproximadamente 1 % a aproximadamente 3 %; polímero (por ejemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, polímero de anclaje tales como, por ejemplo, copolímero de metacrilato de laurilo/ácido acrílico): 0 % a aproximadamente 3 %; glicerol: aproximadamente 3 % a aproximadamente 8 %; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0.0001-0.1 %; e ingredientes menores (por ejemplo, hidrótropos, dispersantes, perfume, abrillantadores ópticos): 0-5 %. 12) Una composición detergente formulada como un granulado que tiene una densidad global de al menos 600 g/1 que comprende tensioactivo aniónico (alquilbencenosulfonato lineal, sulfato de alquilo, a-olefinsulfonato, metil esteres de ácidos grasos a-sulfo, alcanosulfonatos, jabón): aproximadamente 25 % a aproximadamente 40 %; tensioactivo no iónico: (por ejemplo, etoxilato de alcohol): aproximadamente 1 % a aproximadamente 10 %; carbonato sódico (por ejemplo, Na2CÜ3): aproximadamente 8 % a aproximadamente 25 %; silicatos solubles: (por ejemplo, Na2Ü, 2S1O2): aproximadamente 5 % a aproximadamente 15 %; sulfato sódico (por ejemplo, Na2SO4): 0 % a aproximadamente 5 %; zeolita (NaAlSiC) : aproximadamente 15 % a aproximadamente 28 %; perborato sódico (por ejemplo, NaB03-4H20): 0 % a aproximadamente 20 %; activador de blanqueo (TAED o NOBS): aproximadamente 0 % a aproximadamente 5 %; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0.0001-0.1 %; ingredientes menores (por ejemplo, perfume, abrillantadores ópticos): 0-3 %. 13) Composiciones detergentes tal como se describieron en las composiciones 1)-12) supra, en donde todo o parte del alquilbencenosulfonato lineal se reemplaza por sulfato de alquilo de (Ci2-Ci8). 14) Una composición detergente formulada como un granulado que tiene una densidad global de al menos 600 g/1 que comprende sulfato de alquilo de (Ci2-Cie): aproximadamente 9 % a aproximadamente 15 %; etoxilato de alcohol: aproximadamente 3 % a aproximadamente 6 %; amida de ácido graso de polihidroxilo alquilo: aproximadamente 1 % a aproximadamente 5 %; zeolita (por ejemplo, NaAlSi04): aproximadamente 10 % a aproximadamente 20 %; disilicato en capas (por ejemplo, SK56 de Hoechst): aproximadamente 10 % a aproximadamente 20 %; carbonato sódico (por ejemplo, Na2CC>3): aproximadamente 3 % a aproximadamente 12 %; silicato soluble (por ejemplo, Na20, 2S1O2): 0 % a aproximadamente 6 %; citrato sódico: aproximadamente 4 % a aproximadamente 8 %; percarbonato sódico: aproximadamente 13 % a aproximadamente 22 %; TAED: aproximadamente 3 % a aproximadamente 8 %; polímeros (por ejemplo, policarboxilatos y PVP): 0 % a aproximadamente 5 %; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0.0001-0.1 %; e ingredientes menores (por ejemplo, abrillantador óptico, fotoblanqueador, perfume, supresores de las jabonaduras) 0-5 %. 15) Una composición detergente formulada como un granulado que tiene una densidad global de al menos 600 g/1 que comprende sulfato de alquilo de (Ci2-Cie): aproximadamente 4 % a aproximadamente 8 %; etoxilato de alcohol: aproximadamente 11 % a aproximadamente 15 %; jabón: aproximadamente 1 % a aproximadamente 4 %; zeolita MAP o zeolita A: aproximadamente 35 % a aproximadamente 45 %; carbonato sódico (como Na2CC>3): aproximadamente 2 % a aproximadamente 8 %; silicato soluble (por ejemplo, Na20, 2S1O2): 0 % a aproximadamente 4 %; percarbonato sódico: aproximadamente 13 % a aproximadamente 22 %; TAED 1-8 %; carboximetilcelulosa (CMC): 0 % a aproximadamente 3 %; polímeros (por ejemplo, policarboxilatos y PVP): 0 % a aproximadamente 3 %; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0.0001-0.1 %; e ingredientes menores (por ejemplo, abrillantador óptico, fosfonato, perfume): 0-3 %. 16) Formulaciones detergentes tal como se describieron en 1)-15), supra, que contienen perácido estabilizado o encapsulado ya sea como un componente adicional o como un sustituto para sistemas blanqueadores ya especificados. 17) Composiciones detergentes tal como se describieron supra en 1), 3), 7), 9), y 12), en donde el perborato se reemplaza por percarbonato. 18) Composiciones detergentes tal como se describieron supra en 1), 3), 7), 9), 12), 14) y 15), además, contienen un catalizador de manganeso. El manganeso ejemplo Por catalizador es uno de los compuestos descritos en “catalizadores eficientes para el blanqueo de manganeso de baja temperatura,” Naturaleza 369: 637-639 (1994). 19) composición detergente formulada como un detergente líquido no acuoso que comprende un tensioactivo no iónico líquido, tal como, por ejemplo, alcohol primario alcoxilado lineal, un sistema aditivo ( por ejemplo, fosfato), una o varias enzimas y álcali. El detergente puede comprender, además, tensioactivo aniónico y/o un sistema blanqueador.
Como anteriormente, el presente polipéptido de amilasa puede incorporarse a una concentración convencionalmente empleada en los detergentes. Actualmente, se contempla que en la composición detergente, la enzima puede añadirse en una cantidad correspondiente a 0.00001-1.0 mg (calculada como proteína enzimática pura) de polipéptido de amilasa por litro de licor de lavado.
La composición detergente puede contener, además, otros ingredientes detergentes convencionales, por ejemplo, material desfloculante, material rellenador, depresores de espuma, agentes anticorrosión, agentes de suspensión de suciedad, agentes secuestrantes, agentes antirredepósito de suciedad, agentes deshidratantes, tintes, bactericidas, agentes fluorescentes, espesantes y perfumes.
La composición detergente puede formularse como una composición detergente para lavandería a mano (manual) o en máquina (automática), que incluye una composición aditiva para lavandería adecuada para el tratamiento previo de telas manchadas y una composición suavizante de telas añadida en el enjuague o puede formularse como una composición detergente para usar en operaciones generales de limpieza de superficies duras en el hogar, o formularse para operaciones de lavado de vajillas manual o automático.
Cualquiera de las composiciones de limpieza descritas en la presente descripción pueden incluir cualquier número de enzimas adicionales. Generalmente, la o las enzimas deberían ser compatibles con el detergente seleccionado, (por ejemplo, con respecto al pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos o no enzimáticos, y similares), y la o las enzima deberían estar presentes en cantidades eficaces. Las siguientes enzimas se proporcionan como ejemplos.
Proteasas : Las proteasas adecuadas incluyen las de origen animal, vegetal o microbiano. Se incluyen mutantes modificados químicamente o de proteínas diseñados por ingeniería genética, así como proteínas procesadas naturalmente. La proteasa puede ser una serina proteasa o una metaloproteasa, una proteasa microbiana alcalina, una proteasa de tipo tripsina, o una proteasa de tipo quimotripsina. Los ejemplos de proteasas alcalinas son las subtilisinas, especialmente las derivadas de Bacillus, por ejemplo, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147, y subtilisina 168 (ver, por ejemplo , la patente núm. WO 89/06279). Los ejemplos de proteasas de tipo tripsina son la tripsina ( por ejemplo, de origen porcino o bovino) y las proteasas de Fusarium (ver, por ejemplo, la patente núm. WO 89/06270 y la patente núm. WO 94/25583). Además, los ejemplos de proteasas útiles incluyen, pero no se limitan a, las variantes descritas en las patentes núm. WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116, y WO 98/34946. Las enzimas proteasas comercialmente disponibles incluyen, pero no se limitan a: ALCALASE®, SAVINASE®, PRIMASE™, DURALASE™, ESPERASE®, KANNASE™, y BLAZE™ (Novo Nordisk A/S y Novozymes A/S); MAXATASE®, MAXACAL™, MAXAPEM™, PROPERASE®, PURAFECT®, PURAFECT OXP™, FN2™, y FN3™ (Danisco US Inc.). Otros ejemplos de proteasas incluyen NprE de Bacillus amyloliquifaciens y ASP de Cellulomonas sp., cepa 69B4.
Lipasas . Las lipasas adecuadas incluyen las de origen bacteriano, vegetal, animal o fúngico. Se incluyen las modificadas químicamente, modificadas proteolíticamente, o mutantes manipulados de proteína. Los ejemplos de lipasas útiles incluyen, pero no se limitan a, lipasas de Humicola (sinónimo Thermomyces ) , por ejemplo , de H. lanug inosa (T. lanuginosus) (ver por ejemplo, EP 258068 y EP 305216), de H. insolens ( ver , por ejemplo, patente núm. WO 96/13580); una lipasa de Pseudomonas {por ejemplo, de P. alcaligenes o P. pseudoalcaligenes ; ver, por ejemplo, EP 218272), P. cepacia (ver, por ejemplo, EP 331376), P. stutzeri (ver, por ejemplo, GB 1,372,034), P. fluorescens , cepa SD 705 de Pseudomonas ( ver por ejemplo, patentes núm. WO 95/06720 y WO 96/27002), P. wisconsinensis (ver por ejemplo, patente núm. WO 96/12012); una lipasa de Bacillus ( por ejemplo, de B . subtilis; ver por ejemplo, Dartois et al . Biochemica et Biophysica Acta, 1131: 253-360 (1993)), B. stearothermophilus (ver por ejemplo, patente núm. JP 64/744992), o B . pumilus (ver, por ejemplo, patente núm. WO 91/16422). Variantes de lipasa adicionales contempladas para usarse en las formulaciones incluyen las descritas por ejemplo en: las patentes núm. WO 92/05249, WO 94/01541, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202, EP 407225, y EP 260105. Algunas enzimas lipasa comercialmente disponibles incluyen LIPOLASE® y LIPOLASE ULTRA™ (Novo Nordisk A/S y Novozymes A/S).
Poliesterasas. Las poliesterasas adecuadas pueden incluirse en la composición, tales como las descritas, por ejemplo, en las patentes núms. WO 01/34899, WO 01/14629 y la patente de los EE. UU. núm.6,933,140.
Amilasas Las composiciones pueden combinarse con otras amilasas, tales como amilasa mejorada de no producción. Estas pueden incluir las amilasas disponibles comercialmente, tal como, pero sin limitarse a, STAINZYME®, NATALASE®, DURAMYL®, TERMAMYL®, FUNGAMYL® y BAN™ (Novo Nordisk A/S y Novozymes A/S); RAPIDASE®, POWERASE®, y PURASTAR® (de Danisco US Inc.).
Celulasas. Las celulasas pueden añadirse a las composiciones. Las celulasas adecuadas incluyen las de origen bacteriano o fúngico. Además, se contempla las celulasas derivadas de mamíferos o 'plantas. Se incluyen los mutantes diseñados por ingeniería de proteínas o modificados químicamente. Las celulasas adecuadas incluyen celulasas de los géneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por ejemplo, las celulasas fúngicas producidas de Humicola insol ens , Myceliophthora thermophila y Fusarium oxysporum que se describen, por ejemplo, en las patentes de los EE. UU. núms.4,435,307; 5,648,263; 5,691,178; 5,776,757; y la patente núm. WO 89/09259. Las celulasas ilustrativas adecuadas para el uso son las que proporcionan a la tela un beneficio de cuidado del color. Los ejemplos de tales celulasas son las celulasas descritas por ejemplo en las patentes núm. EP 0495257, EP 0531372, WO 96/11262, WO 96/29397, y WO 98/08940. Otros ejemplos son las variantes de celulasas, tales como las descritas en la patente núm. WO 94/07998; la patente núm. WO 98/12307; la patente núm. WO 95/24471; PCT/DK98/00299; patente núm. EP 531315; las patentes de los Estados Unidos núm. 5,457,046; 5,686,593; y 5,763,254. Las celulasas comercialmente disponibles incluyen CELLUZYME® y CAREZYME® (Novo Nordisk A/S y Novozy es A/S); CLAZINASE® y PURADAX HA® (Danisco US Inc.); y KAC-500(B)™ (Kao Corporation).
Peroxidasas/oxidasas . Las peroxidasas/oxidasas adecuadas contempladas para usar en las composiciones incluyen aquellas de origen vegetal, bacteriano o fúngico. Se incluyen los mutantes diseñados por ingeniería de proteínas o modificados químicamente. Los ejemplos de peroxidasas útiles incluyen las peroxidasas de Coprinus, por ejemplo, de C. cinereus, y variantes de estas tales como las descritas en las patentes núm. WO 93/24618, WO 95/10602 y WO 98/15257. Las peroxidasas comercialmente disponibles incluyen GUARDZYME™ (Novo Nordisk A/S y Novozymes A/S).
La Composición detergente puede comprender, además, 2,6-b-D-fructano hidrolasa, que es eficaz para la eliminación/limpieza de la biopelícula presente en hogares y/o industrial textil/ropa.
La o las enzimas detergentes pueden incluirse en una composición detergente mediante la adición de aditivos separados que contienen una o más enzimas o mediante la adición de un aditivo combinado que comprende todas estas enzimas. Un aditivo detergente, es decir, un aditivo separado o un aditivo combinado, puede formularse por ejemplo, como un granulado, un líquido, una suspensión, y similares formulaciones de aditivos de detergentes a manera de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, granulados, particularmente granulados no pulverulentos, líquidos, particularmente líquidos estabilizados o suspensiones.
Los granulados que no forman polvo pueden producirse, por ejemplo, tal como se describe en las patentes de los Estados Unidos núms. 4,106,991 y 4,661,452 y, opcionalmente, pueden recubrirse por métodos conocidos en la materia. Los ejemplos de materiales de revestimiento ceroso son productos de poli(óxido de etileno) (por ejemplo, polietilenglicol, PEG) con pesos molares promedio de 1,000 a 20,000; nonilfenoles etoxilados que tienen de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos etoxilados, en donde el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de carbono, y en donde hay de 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono, di y triglicéridos de ácidos grasos. Los ejemplos de materiales de revestimiento adecuados que forman una película para la aplicación por medio de téenicas de lecho fluidizado se proporcionan, por ejemplo, en la patente de Gran Bretaña núm. GB 1483591. Las preparaciones enzimáticas líquidas pueden estabilizarse, por ejemplo, mediante la adición de un poliol tal como propilenglicol, un azúcar o alcohol sacaroso, ácido láctico o ácido bórico de conformidad con métodos establecidos. Las enzimas protegidas pueden prepararse de conformidad con el método descrito en la patente europea núm. EP 238,216.
La composición detergente puede estar en cualquier forma convencional, por ejemplo, una barra, una tableta, un polvo, un gránulo, una pasta, o un líquido. Un detergente líquido puede ser acuoso, típicamente, con un contenido de hasta aproximadamente 70 % de agua y de 0 % a aproximadamente 30 % de solvente orgánico. Además, se contemplan los geles detergentes compactos que contienen aproximadamente 30 % o un porcentaje menor de agua. La composición detergente puede, opcionalmente, comprender uno o más tensioactivos adicionales, que pueden ser no iónicos, que incluyen semipolares y/o aniónicos y/o catiónicos y/o anfotéricos. Los tensioactivos pueden estar presentes en una amplia variedad, de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 60 % en peso.
Cuando se incluye en ella, el detergente contendrá, típicamente, de aproximadamente 1 % a aproximadamente 40 % de un tensioactivo aniónico, tal como alquilbencenosulfonato lineal, a-olefinsulfonato, sulfato de alquilo (sulfato de alcohol graso), etoxisulfato de alcohol, alcanosulfonato secundario, éster metílico del ácido a-sulfo graso, ácido alquil o alquenilsuccínico o jabón.
Cuando se incluye en ella, el detergente contendrá, usualmente, de aproximadamente 0.2 % a aproximadamente 40 % de un tensioactivo no iónico, tal como etoxilato de alcohol, etoxilato de nonilfenol, alquilpoliglicósido, óxido de alquildimetilamina, monoetanolamida de ácido graso etoxilado, monoetanolamida de ácido graso, amida de ácidos grasos polihidroxialquilados o derivados de N-acil -N-alquilo de glucosamina (“glucamidas”) .
El detergente puede contener de 0 % a aproximadamente 65 % de un aditivo detergente o agente for ador de complejos tal como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacetico, ácido etilendiaminatetraacético (EDTA) , ácido dietilentriaminapentaacético, ácido alquil o alquenilsuccínico, silicatos solubles o silicatos estratificados (por ejemplo, SKS-6 de Hoechst) .
El detergente puede comprender uno o más polímeros . Los polímeros ilustrativos incluyen carboximetilcelulosa (CMC) , poli (vinilpirrolidona) (PVP) , poli () (PEG) , poli (alcohol vinílico) (PVA) , poli (vinilpiridina-N-óxido) , poli (vinilimidazol) , policarboxilatos, por ejemplo, poliacrilatos, copolímeros de maleico/ácido acrílico) y copolímeros de metacrilato de laurilo/ácido acrílico .
La o las enzimas de la composición detergente pueden estabilizarse con agentes estabilizadores convencionales , por ejemplo, como poliol (por ejemplo, propilenglicol o glicerina) , un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido bórico, o un derivado de ácido bórico (por ejemplo, un áster de borato aromático) , o un derivado de ácido fenil borónico (por ejemplo, ácido 4 - f ormilf enil borónico) . La composición puede formularse tal como se describe en las patentes núm. WO 92/19709 y WO 92/19708.
Se contempla que en las composiciones detergentes, particularmente, las variantes de enzimas, pueden añadirse en una cantidad correspondiente a aproximadamente 0.01 a aproximadamente 100 mg de proteína enzimática por litro de licor de lavado ( por ejemplo, aproximadamente 0.05 a aproximadamente 5.0 mg de proteína enzimática por litro de licor de lavado o 0.1 a aproximadamente 1.0 mg de proteína enzimática por litro de licor de lavado).
Aunque las presentes composiciones y métodos se han descrito con referencia a los datos más abajo, debería entenderse que pueden hacerse varias modificaciones. 7.6. Métodos de evaluación de la actividad amilasa en composiciones detergentes Numerosos ensayos de limpieza con a-amilasa se conocen en la materia, incluidos los ensayos de muestras y micromuestras . Los ejemplos agregados describen solamente unos pocos de tales ensayos.
Para ilustrar, además, las composiciones y métodos y ventajas de ellos, los siguientes ejemplos específicos se dan con el entendimiento de que son ilustrativos más bien que limitantes. 8. Composiciones de fermentación de cerveza Una TeAmyl o variante de esta puede ser un componente de una composición de fermentación de cerveza usada en un proceso adecuado para proporcionar una bebida fermentada, tal como fermentación de cerveza. Se cree que los carbohidratos no fermentables forma la mayoría de los sólidos disueltos en la cerveza final. Este residuo permanece como la causa de la incapacidad de amilasas de malta para hidrolizar las uniones alfa-l,6-del almidón. Los carbohidratos no fermentables aportan aproximadamente 50 calorías por 12 onzas (aproximadamente 340 gramos) de cerveza. La TeAmyl o variante de esta, usualmente en combinación con una glucoamilasa y, opcionalmente, una pululanasa y/o isoamilasa, ayuda en la conversión del almidón en dextrinas y azúcares fermentables, para reducir los carbohidratos no fermentables residuales en la cerveza final.
Las principales materias primas usadas en la fabricación de estas bebidas son agua, lúpulo y malta. Adicionalmente, pero, además, exclusivamente, los adjuntos tales como granos comunes de maíz, sémola de maíz refinado, levadura molida de cerveza, arroz, sorgo, almidón de maíz refinado, cebada, almidón de cebada, cebada descascarillada, trigo, almidón de trigo, cereales torrificados, copos de cereales, centeno, avena, papa, tapioca, y jarabes, tales como jarabe de maíz, jarabe de caña de azúcar, jarabe de azúcar invertido, jarabe de cebada y/o de trigo y lo similar pueden usarse como una fuente de almidón.
Por diversas razones, la malta, que se produce principalmente a partir de variedades seleccionadas de cebada, tiene un efecto importante sobre el carácter general y la calidad de la cerveza. En primer lugar, la malta es el agente aromatizante primario en la cerveza. En segundo lugar, la malta proporciona la mayor parte de la azúcar fermentable. En tercer lugar, la malta proporciona las proteínas, lo que contribuirá a la calidad del cuerpo y la espuma de la cerveza. En cuarto lugar, la malta proporciona la actividad enzimática necesaria durante la maceración. El lúpulo contribuye, además, significativamente, a la calidad de la cerveza, incluida la condimentación. Particularmente, el lúpulo (o sus constituyentes) añade sustancias deseables de amargor a la cerveza. Además, el lúpulo puede actuar como precipitante de proteínas, determinar agentes conservantes y ayudar en la formación de la espuma y la estabilización.
Los cereales, tales como cebada, avena, trigo, pero, además, maíz y arroz se usan, frecuentemente, para la fermentación de cerveza, tanto en la fermentación de cerveza industrial como casera pero, además, se añaden, frecuentemente, otros componentes vegetales, tal como lúpulo. Los componentes usados en la elaboración de la cerveza pueden estar sin maltear o pueden ser malteados, es decir, parcialmente germinados, resultando en un aumento en los niveles de enzimas, incluyendo a-amilasa. Para la elaboración de la cerveza con éxito, niveles adecuados de actividad de la enzima a-amilasa son necesarios para garantizar niveles adecuados de azúcares para la fermentación. Una TeAmyl o variante de esta, por sí misma o en combinación con otra(s) a-amilasa(s), en consecuencia, pueden añadirse a los componentes usados para la fermentación de cerveza.
En la presente descripción, el término “reserva”, significa los granos y los componentes de la planta que son triturados o rotos. Por ejemplo, la cebada usada en la producción de cerveza es un grano que ha sido ordinariamente molido o triturado para dar una consistencia apropiada para producir una templa para la fermentación. Como se usa en la presente descripción, el término “materia prima” incluye cualquiera de los tipos de plantas y granos triturados u ordinariamente molidos. Los métodos descritos en la presente descripción pueden usarse para determinar los niveles de actividad a-amilasa en ambos harinas y reserva.
Los procesos para la fabricación de cerveza son muy conocidos en la materia. Ver, por ejemplo, Wolfgang Kunze (2004) “Technology Brewing and Malting”, Research and Teaching Institute of Brewing, Berlín (VLB), 3.° edición. Brevemente, el proceso implica: (a) preparar una templa, (b) filtrar la templa para preparar un mosto, y (c) fermentar el mosto para obtener una bebida fermentada, tal como la cerveza. Típicamente, la malta molida o triturada, la malta y el adjunto, o el adjunto se mezclan y mantienen por un periodo bajo temperaturas controladas para permitir que las enzimas presentes en la malta y/o adjunto conviertan el almidón presente en la malta en azúcares fermentables. La templa se transfiere, después, a un filtro de mosto, en donde el líquido se separa del residuo del grano. Este líquido dulce se llama “mosto”, y el residuo de grano dejado se llama “grano agotado.” La masa se somete, típicamente, a una extracción, que implica la adición de agua al templa con el objetivo de recuperar el extracto soluble residual del grano agotado. El mosto se hierve, después, vigorosamente para esterilizar el mosto y ayudar a desarrollar el color, sabor y olor. Los lúpulos se añaden en algún momento durante la ebullición. El mosto se enfría y se transfiere a un termentador.
El mosto se pone en contacto con la levadura en un termentador. El termentador puede enfriarse para detener la fermentación. La levadura que puede flocularse se elimina. Finalmente, la cerveza se enfría y se almacena durante un período de tiempo, durante el cual se aclara la cerveza y su sabor se desarrolla, y se elimina cualquier material que pueda perjudicar la apariencia, el sabor y la conservación de la cerveza. La cerveza contiene, usualmente, de aproximadamente 2 % a aproximadamente 10 % v/v de alcohol, aunque puede obtenerse cerveza con un mayor contenido de alcohol, por ejemplo, 18 % v/v. Antes del envasado, la cerveza es carbonatada y, opcionalmente, se filtra y se pasteuriza.
La composición de fermentación de cerveza que comprende la TeAmyl o variante de esta, frecuentemente, pero no necesariamente, en combinación con una o más enzimas exógenas, tales como glucoamilasa(s), pululanasa(s) y/o isoamilasa(s) y cualquiera combinación de estas, pueden añadirse al templa de la etapa (a) anterior, tal como durante la preparación de templa. Alternativamente, o adicionalmente, la composición de fermentación puede añadirse al templa de la etapa (b) anterior, es decir, durante la filtración de la templa. Alternativamente o adicionalmente, la composición de fermentación de cerveza puede añadirse al mosto de la etapa (c) anterior, tal como durante la fermentación del mosto.
Un aspecto de la invención se refiere al uso de la TeAmyl o variante de esta de conformidad con la invención en la producción de una bebida fermentada, tal como una cerveza.
Otro aspecto se refiere a un método para proporcionar una bebida fermentada; el método comprende la etapa de poner en contacto una templa y/o un mosto con la TeAmyl o variante de esta.
Otro aspecto se refiere a un método para proporcionar una bebida fermentada que comprende las etapas de: (a) preparar una templa, (b) filtrar la templa para preparar un mosto y (c) fermentar el mosto para obtener una bebida fermentada, tal como una cerveza, en donde la TeAmyl o variante de esta se añade en: (i) la templa de la etapa (a) y/o (ii) el mosto de la etapa (b) y/o (iii) el mosto de la etapa (c).
De conformidad con aun otro aspecto, se produce o proporciona una bebida fermentada, tal como una cerveza, por medio de un método que comprende la(s) etapa(s) de (1) poner en contacto una templa y/o un mosto con la TeAmyl o variante de esta; y/o (2) (a) preparar una templa, (b) filtrar la templa para preparar un mosto y (c) fermentar el mosto para obtener una bebida fermentada, tal como una cerveza, en donde la TeAmyl o variante de esta se añade en: (i) la templa de la etapa (a) y/o (ii) el mosto de la etapa (b) y/o (iii) el mosto de la etapa (c).
Las modalidades particulares se relacionan con el uso, método o bebida fermentada mencionadas anteriormente, en donde esa bebida fermentada es una cerveza, tal como una cerveza malteada completa, cerveza elaborada bajo el marco de la “Reinheitsgebot”, ale, IPA, lager, bitter (amarga), Happoshu (segunda cerveza), tercera cerveza, cerveza seca, casi cerveza, cerveza ligera, cerveza con bajo contenido de alcohol, cerveza baja en calorías, porter, cerveza bock, cerveza negra (stout), licor de malta, cerveza sin alcohol, licor de malta sin alcohol y lo similar pero, además, bebidas alternativas de cereales y malta tales como bebidas de malta con sabor a frutas, por ejemplo, con sabor a círticos, tales como bebidas de malta con sabor a limón, naranja, lima o bayas, bebidas de malta con sabor a licor, por ejemplo, licor de malta con sabor a vodka, ron o tequila, o bebidas de malta con sabor a café, tal como licor de malta con sabor a cafeína y lo similar. 9. Reducción de almidón positivo a yodo La TeAmyl y variantes de esta pueden reducir el almidón positivo a yodo (IPS), cuando se usan en un método de licuación y/o de sacarificación. Una fuente de IPS es de la amilosa que escapa a la hidrólisis y/o de polímero de almidón retrogradado. La retrogradación del almidón ocurre espontáneamente en una pasta de almidón, o gel en envejecimiento, debido a la tendencia de las moléculas de almidón de unirse unas a otras seguido por un aumento de la cristalinidad. Las soluciones de baja concentración se vuelven cada vez más turbias debido a la asociación progresiva de las moléculas de almidón en artículos más grandes. Se produce la precipitación espontánea y el almidón precipitado regresa, aparentemente, a su condición original de insolubilidad en agua fría. Las pastas de concentración más alta en el enfriamiento se gelifican y, durante el añejamiento, se vuelven más firmes debido a la asociación creciente de las moléculas de almidón. Esto se debe a una marcada tendencia para formar enlaces de hidrógeno entre los grupos hidroxi en moléculas de almidón adyacentes. Ver J.A. Radlcy, ed., STARCH AND ITS DERIVATIVES 194-201 (Chapman y Hall, Londres (1968)).
La presencia de IPS en el licor de sacáridos afecta negativamente la calidad del producto final y representa una cuestión importante con respecto al procesamiento corriente abajo. El IPS tapona o reduce la velocidad del sistema de filtración y obstruye las columnas de carbono usadas para la purificación. Cuando el IPS alcanza niveles suficientemente altos, puede filtrarse a través de las columnas de carbono y reducir la eficacia de la producción. Además, el producto final obtenido se puede volver turbio en el almacenamiento, de manera que la calidad final del producto sea inaceptable. La cantidad de IPS puede reducirse al aislar el tanque de sacarificación y mezclar los contenidos de vuelta. Sin embargo el IPS se acumulará en columnas de carbono y sistemas de filtro, entre otras cosas. Así, se espera que el uso de TeAmyl o variantes de esta mejoren el rendimiento global del proceso al reducir la cantidad de IPS.
EJEMPLOS Ejemplo 1. Clonación de TeAmyl .
El ADN genómico de la cepa de Talaromyces emersonii ATCC16479 codifica una glicosil hidrolasa con homología a otra alfa-amilasa fúngica, tal como se determina a partir de una búsqueda en BLAST. Ver la Fig. 1. La secuencia de nucleótidos del gen de TeAmyl, que comprende ocho intrones, se expone más adelante (sec. con núm. de ident.: 2). Las secuencias de intrones están en minúsculas y cursiva.
ATGACGCCTTTCGTCCTCACGGCCGTGCTGTTCTTGCTGGGGAATGCCGTGTTGGCCTTGACC CCGGCCGAATGGCGCAAACAATCTATCTACTTTCTCCTCACGGACCGCTTTGGCAGGGCAGAT AACTCGACCACTGCTGCCTGCGATGTCACTGAGAGGgtaagttaagaaagcatcagctggacg atcattgtct ctgagtgatga tggc tacagATCTACTGTGGCGGGAGTTGGCAAGGAATCATC AACCATgtacgcgaagttgcctgctttcccttgctaatgcacggaaatgtctaaattgttctt tct t tct t tctcttcagCTCGACTATATCCAAGGCATGGGGTTCACGGCCATCTGGATTTCAC CGGTGACCGAGCAGCTGCCGCAAAATACGGGTGAGGGAGAAGCCTATCATGGGTATTGGCAGc aggaaatgtgagataccagttgtgctgtcattctacattctttttttgatatatatgatgcat aattattgctttactatgatctccactta c tCAAGGCAGATACACGGTCAACTCCAACTTTGG GACATCAGACGATCTCTTAGCCCTGTCAAAGGCGCTCCATGACCGTGGCATGTACCTCATGGT CGATGTGGTTGCGAATCACATGgt cagtga cctggt tttcttcctcctccttga caagaacga acga t tctaagcccaacttagGGATACGATGGAGATGGCGACTCCGTTGATTACAGCGTCTTC AATCCATTTAATTCCTCGAGTTATTTCCATCCCTATTGCCTGATTACAGACTACAGCAATCAG ACCGATGTGGAAGACTGTTGGCTGGGCGATACGACTGTCTCGTTGCCCGATCTCAACACCACG GAGACTGTTGTGAGGACTATATGGTATGACTGGGTGGCGGATCTCGTCTCCAATTACTCTAgt atggctgatgctttctctacttttctttttgtcttttcccttgaagtatacagctaatactat ccaatagTTGATGGGCTTCGCATCGACACGGTGAAACACGTAGAAAAGTCATTCTGGCCTGGT TACAAGAGTGCTGCGGGTGTCTACTGTGTTGGCGAGGTCCTCGATGGAGATCCGTCTTACACT TGTCCCTACCAGGATTATCTGGACGGTGTATTAAACTATCCAATgtgagga tccctttctgaa aaaagaaaa t tgt ttct tgactgacaaca tccagATACTATCAACTACTGTATGCGTTTGAAT CCTCTAGCGGCAGCATCAGCAATCTTTACAACATGATCAACTCTGTCGCCTCTGAATGTTCCG ATCCCACTCTGTTGGGCAACTTTATCGAGAACCATGACAACCCTAGATTTGCCTCgtacgtag tctcagctggacgaacatgaagtcctcgaacgagattagagaggtaacctgagtcgagactga cttttttttcttctagCTATACAAGTGATTATTCTCTTGCTAAAAATGTGATTGCTTTCATCT TCTTCTCTGACGGCATCCCTATCGTCTATGCCGGTCAGGAGCAGCATTACAACGGGGGAAATG ACCCCTACAACCGCGAGGCCACCTGGCTGTCAGGATACTCGACGACGGCCGAACTGTACACGT TCATTGCGACCACCAACGCGATCCGTAGCTTGGCGATCTCCgt cgact cggagt attt ga cgt acaaggtatgttatgtgcttatgtgatcgtgatggaaaccgaactcacctcgtctccagAATG ACCCATTCTACTACGACAGCAATACCCTCGCTATGCGCAAGGGTTCGGATGGCCTGCAGGTCA TCACTGTTCTGTCCAATCTGGGCGCCGATGGTAGCTCGTACACGTTGACTCTGAGTGGCAGTG GCTATTCGTCAGGCACGGAGCTGGTGGAAGCTTACACCTGCACAACGGTCACTGTTGACTCTA ATGGCGATATTCCAGTTCCCATGGAGTCCGGACTGCCGCGCGTTTTCCTACCAGCATCCTCAT TCAGTGGTAGCAGTCTATGCAGTTCTTCTCCTAGCCCTACTACTACAACATCGACATCGACAT CGACAACGTCGACGGCCTGCACCACCGCCACCGCTGTGGCGGTCCTCTTCGAAGAGTTGGTGA CAACGACCTACGGTGAAAATGTCTACCTCAGCGGATCGATCAGCCAACTCGGGGACTGGAACA CGGACGACGCCGTGGCCCTGTCCGCAGCTAATTACACTTCTTCGAATCCCCTGTGGTATGTGA CAGTCACATTGCCGGTTGGGACGTCCTTTGAGTACAAGTTCATCAAGAAGGAAGAGAACGGCG ATGTCGAGTGGGAGAGCGATCCCAATCGGTCGTATACTGTGCCGACGGCCTGCACGGGAGCGA CGGAGACGATTGTCGACACATGGAGATAG (sec. con núm. de ident.: 2).
El gen de TeAmyl se amplificó a partir de ADN genómico de Talaromyces emersonii con el uso de los siguientes cebadores: cebador 1 (Not I) 5'-ccgcggccgcaccATGACGCCTTTCGTCCTCAC-3' (sec. con núm. de ident.: 13) e cebador 2 (Ase I) 5'-ccggcgcgcccttaCTATCTCCATGTGTCGACAAT -3' (sec. con núm. de ident.: 14). Después de la digestión con Not I y Ase I, el producto de PCR se clonó en el vector de expresión pTrex3gM (descrito en la solicitud de patente de los EE. UU. publicada núm. 2011/0136197 Al), se digirió con las mismas enzimas de restricción y se marcó como pZZH426. Un mapa de plásmidos de pZZH426 se proporciona en la Fig. 2. La secuencia del gen TeAmyl se confirmó por secuenciación de ADN. j l ió ificación de El plásmido pZZH426 se transformó en una cepa de Trichoderma reesei sin quad (que se describe en la patente núm. WO 05/001036) con el uso del método biolístico (Te'o et al. (2002) J. Microbiol . Methods 51:393-99). La proteína se secretó al medio extracelular, y el medio de cultivo filtrado se usó para realizar un SDS-PAGE y un ensayo de actividad de alfa-amilasa para confirmar la expresión de la enzima.
La TeAmyl se purificó con el uso de cromatografía en Sepharose 6B acoplada con beta-ciclodextrina (bCD), aprovechando su dominio CBM20. Aproximadamente 700 mi de caldo de cultivo del matraz de agitación se ajustaron hasta un pH 4.3 y se cargaron en una columna de 10 mi de bCD-Sepharose preequilibrada con acetato de Na 25 mM, pH 4.3 (amortiguador A). Después de cargar la muestra, la columna se lavó con los volúmenes de dos columnas del mismo amortiguador. La proteína objetivo se eluyó con el amortiguador A con alfa-ciclodextrina 10 mM (amortiguador B) en los volúmenes de dos columnas. Las fracciones se analizaron por medio de SDS-PAGE y se ensayaron para determinar la actividad a-amilasa. Las fracciones que contenían la proteína objetivo se combinaron y desalaron para eliminar la alfa-ciclodextrina. La muestra exhibió una pureza mayor que 95 % y se concentró con el uso de un dispositivo 10K Amicon Ultra-15 antes del almacenamiento en glicerol al 40 % a -80 °C.
Ejemplo 3. Determinación de la actividad a-amilasa de TeAmyl.
La actividad a-amilasa se analizó en función de su liberación de azúcares reductores a partir del sustrato de amilopectina de papa. La formación de azúcares reductores se controló colorimétricamente mediante un ensayo PAHBAH. El número de actividad se informa como equivalentes de glucosa liberada por minuto.
El sustrato de amilopectina de papa al 2.5 % (AP, Fluka, cat. núm. 10118) se preparó con 1.25 g ds en total de 50 g de agua/Tween al 0.005 % seguido de calentamiento durante 1 min con un horno de microondas a intervalos de 15 s y agitación. Un cóctel de amortiguadores se preparó al mezclar 5 mi de 0.5 M de acetato de Na, pH 5.8; 2.5 mi de 1 M NaCl; 0.2 mi de 0.5 M CaCl2; y 7.3 mi de agua/Tween (167 mM acetato de Na, 167 mM NaCl, 6.67 mM CaCl2).
La enzima purificada se diluyó a 0.4 mg/ml (400 ppm) en agua/Tween como solución estándar. En la primera fila de una placa de microtitulación sin unión (Corning 3641), se añadió 195 ml de agua y se colocaron 100 ml de agua/Tween en todos los pocilios restantes. Se añadió 5 m? de 400 ppm de enzima a la primera fila de manera que la concentración de enzima es 10 ppm en el pocilio y la concentración de enzima final en la reacción es de 2 ppm. Un doble dilución en serie se llevó a cabo (40 m? + 40 m?), a través del séptimo pocilio, y se dejó el octavo pocilio como un blanco libre de enzima. Se dispensó 15 ml de cóctel de amortiguadores, seguido por 25 ml de amilopectina, en una placa de PCR mediante el uso de una pipeta automática. Las reacciones se iniciaron al dispensar 10 m? de la dilución enzimática en serie a la placa de PCR, se mezclaron rápidamente con un agitador de vórtice, e incubaron durante 10 minutos en un bloque de calor de PCR a 50 °C con una tapa calentada (80 °C). Después de exactamente 10 minutos, se añadió 20 m? de NaOH 0.5 N a la placa seguido por agitación con vórtice para terminar la reacción.
Los azúcares reductores totales presentes en los tubos se analizaron a través de un método PAHBAH: 80 m? de NaOH 0.5 N se dividieron en alícuotas en una placa de microtubo de PCR seguido por 20 m? del reactivo de PAHBAH (hidrazida de ácido 4-hidroxibenzoico 5 % p/v en HCl 0.5 N). Se añadió 10 m? de las reacciones terminadas a cada fila mediante el uso de una pipeta multicanal y se mezcló brevemente con pipeteo hacia arriba y hacia bajo. La placa cargada se incubó a 95 °C durante 2 min sellada con papel de estaño. Se transfirieron 80 m? de las reacciones desarrolladas a una placa de microtitulación de poliestireno (Costar 9017), y se determinó la OD a 410 nm. Los valores de OD resultantes se representaron contra la concentración de enzima mediante el uso de Microsoft Excel. La regresión lineal se usó para determinar la pendiente de la parte lineal del gráfico. La actividad amilasa se cuantificó mediante el uso de la Ecuación 1:.
Actividad específica (unidad/mg) = pendiente (enzima)/pendiente (est.) x 100 (1), en donde 1 unidad = 1 pmol de eq. glucosa/min.
Una actividad específica representativa de TeAmyl y la amilasa de referencia AkAA se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1. Actividad específica de alfa-amilasas purificadas en amilopectina.
Ejemplo 4. Efecto del pH sobre la actividad a-amilasa de El efecto del pH sobre la actividad amilasa de TeAmyl se controló mediante el uso del protocolo de ensayo de alfa-amilasa como se describió en el Ejemplo 3 en un intervalo de pH de 3.0 a 10.0. Las soluciones estándar de amortiguadores se prepararon como soluciones estándar de amortiguador de acetato sódico 1 M con pH 3.0 a 6.0, solución estándar de amortiguador de HEPES 1 M con pH 6.0 a pH 9.0, y solución estándar de amortiguador de CAPS 1 M, pH 10.0. El amortiguador de trabajo contiene 2.5 mi de acetato Na 1 M (pH 3.5-6.5) o HEPES 1 M (pH 7 - 9), cada mitad de unidades de pH, con 2.5 mi de NaCl 1 M y 50 ml de CaCl22 M, 10 mi de agua/Tween (167 mM de cada amortiguador y NaCl , CaCl2 6.67 mM), de manera que la mezcla de reacción enzimática final contiene 50 mM de cada amortiguador y NaCl, CaCl22 mM Las soluciones estándar de enzimas se prepararon en agua/Tween 0.005 % a concentraciones en el intervalo lineal del ensayo PAHBAH. Se dispensaron 15 ml de amortiguador de trabajo (pH 3.5-7.0 mediante el uso de acetato sódico, pH 6.0-9.0 mediante el uso de HEPES), seguido por 25 ml de amilopectina, en una placa de PCR mediante el uso de una pipeta automática Los amortiguadores de acetato sódico y HEPES se usaron por separado a valores de pH de 6.0, 6.5, y 7.0 para confirmar que no hay efectos de los amortiguadores sobre la actividad enzimática. Las reacciones se iniciaron por medio del suministro de 10 m? de solución estándar enzimática a la placa de PCR, el mezclado rápido en un agitador con vórtice y la incubación durante 10 minutos en un bloque de calor de PCR a 50 °C con una tapa calentada (80 °C). Las reacciones se realizaron en réplicas de tres. Se incluyeron muestras blanco con el uso de los diferentes amortiguadores de pH solos. Después de exactamente 10 min, se añadió 20 m? de NaOH 0.5 N a la placa, seguido por agitación con vórtice para terminar la reacción. Los azúcares reductores totales presentes en los pocilios se analizaron con el método PAHBAH descrito anteriormente. Los valores resultantes de OD se convirtieron a un porcentaje de la actividad relativa al definir el pH óptimo como 100 % de actividad. El porcentaje de actividad relativa, representado gráficamente como una función del pH, se muestra en la Fig. 3A (AkAA de referencia) y la Fig.3B (TeAmyl). El pH óptimo y el intervalo de pH a > 70 % de la actividad máxima cuando la hidrólisis se mide a 50 °C se enumeran en la Tabla 2. Tabla 2. pH óptimo e intervalo de pH (>70 % de actividad) a 50 °C para las alf -amilasas purificadas.
Ejemplo 5. Efecto de la temperatura sobre la actividad a-amilasa de TeAmyl.
La actividad de la alfa-amilasa fúngica se controló mediante el uso del protocolo de ensayo de alfa-amilasa como se describió en el Ejemplo 4 en un intervalo de temperatura de 30 °C a 95 °C. Un solución estándar de amortiguador del pH óptimo de cada enzima se prepara como 2.5 mi del amortiguador 1 M (acetato sódico o HEPES, en dependencia del pH óptimo de la enzima), 2.5 mi de NaCl 1 M y 50 ml de CaCl2 2M, 10 mi de agua/Tween (167 mM de cada amortiguador y NaCl, CaCl2 6.67 mM), de manera que la mezcla de reacción final contenía 50 mM de cada amortiguador y NaCl, CaCl22 mM.
Las soluciones estándar de enzimas se prepararon como se describió anteriormente. Se dispensaron 15 ml del solución estándar de amortiguador (pH óptimo, predeterminado), seguido de 25 ml de la amilopectina, en una placa de PCR mediante el uso de una pipeta automática. Las reacciones se iniciaron al dispensar 10 ml de enzima a la placa de PCR, mezclar rápidamente en un agitador de vórtice, e incubar durante 10 minutos en un bloque de calor de PCR, a 30 - 95 °C (cada 5-10 °C) con la tapa calentada a la misma temperatura o mayor que la de incubación. Las reacciones se realizaron en réplicas de tres. Se incluyeron muestras blanco mediante el uso de los diferentes amortiguadores solos. Después de exactamente 10 min, se añadió 20 m? de NaOH 0.5 N a la placa, seguido por agitación con vórtice para terminar las reacciones. Los azúcares reductores totales presentes en los tubos se analizaron con un método PAHBAH como se describió anteriormente. Los valores de OD resultantes se convirtieron a un porcentaje de actividad relativa al definir la temperatura óptima como 100 % de actividad. Los perfiles de temperatura de las alfa-amilasas fúngicas se muestran en la Fig.4A (AkAA de referencia) y la Fig. 4B (TeAmyl). La temperatura óptima y el intervalo de temperatura a> 70 % de la actividad máxima se enumeran en la Tabla 3, cuando se miden en el pH óptimo indicado de la enzima.
Tabla 3. Temperatura óptima e intervalo de temperatura (>70 % de actividad) para las alfa-amilasas en sus respectivos pH óptimos.
Ejemplo 6. Análisis del perfil de productos de TeAmyl.
Para ensayar los productos de la catálisis de a-amilasa fúngica de polisacáridos, las amilasas se incubaron con tres sustratos diferentes, DP7, amilopectina, y licuefacto de DE10 de maltodextrina, a 50 °C, pH 5.3 durante 2 horas. Los oligosacáridos liberados por las enzimas se analizaron mediante HPLC.
Una concentración final de 10 ppm de amilasa se incubó con 0.5 % (p/v) de sustrato en amortiguador de citrato sódico 50 mM, pH 5.3, que contenía NaCl 50 mM y CaCl22 mM durante 120 min a 50 °C. Después la reacción se detuvo al añadir el mismo volumen de etanol y centrifugar 10 min a 14,000 rpm. El sobrenadante se diluyó por un factor de 10 mediante el uso de agua MilliQ, y se cargaron 10 ml en una columna de HPLC Aminex HPX-42A, 300 mm x 7.8 mm, equipada con un detector de índice de refracción. La fase móvil fue agua MilliQ, y la velocidad de flujo fue de 0.6 ml/min a 85 °C.
La Tabla 4 muestra el perfil de oligosacáridos sacarificados por TeAmyl y de referencia AkAA para varios sustratos. Solo se muestran los oligosacáridos con DPI- DP7. Los números en la tabla reflejan el porcentaje en peso de cada DPn como una fracción del total de DPI - DP7. La TeAmyl generó mayormente DP2 como el producto principal para todos los sustratos ensayados. La TeAmyl produjo una composición de azúcares que contenían al menos 55 % p/p de DP2 con relación a las cantidades combinadas de DP1-DP7. La AkAA, por otro lado, produjo un perfil de productos más uniformemente distribuido de DPI a DP4.
Tabla 4. Perfil de productos de alfa-amilasas fúngicas sobre tres sustratos.
Ejemplo 7. Fermentación de etanol con SSF La capacidad de la TeAmyl para producir etanol se probó en SSF. Los resultados muestran que la TeAmyl puede generar efectos comparables con AkAA, pero a una dosis reducida (Figuras 5-6).
La SSF se llevó a cabo a pH 4.8 con AkAA o TeAmyl en presencia de una variante de glucoamilasa de Trichoderma que tiene un índice de rendimiento de DP7 de al menos 1.15 medido con el uso de FPLC (ver la patente de EE. UU. núm. 8,058,033 B2, Danisco US Inc .), de acuerdo con el procedimiento incluido más abajo. En varios puntos de tiempo durante la SSF, las muestras se analizaron para determinar: (i) el rendimiento de etanol, (2) la reducción de DP3+ y (3) la producción de DP2 con el uso de HPLC. Los niveles de DP3+ se monitorean como parte del pico de volumen de vacíos, y comúnmente se interpreta que la reducción de estos refleja la eficacia de la sacarificación de los licuefactos.
Preparación de licuefacto. El licuefacto congelado (30 % DS) se incubó durante la noche a 4 °C, después, se colocó en baño de agua a 70 °C hasta la descongelación completa (1-3 horas). La temperatura del licuefacto se ajustó a 32 °C. El licuefacto se pesó, y se añadió urea sólida a 600 ppm. El pH del licuefacto se ajustó con ácido sulfúrico 6 N o hidróxido amónico al 28 %.
Fermentación. Se usó levadura ETHANOL RED® (Lesaffre) para convertir la glucosa en etanol. La levadura seca se añadió a 0.1 % p/p al lote de licuefacto, y la composición se mezcló bien y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se pesó 100 g +/- 0.2 g de licuefacto (32 % DS) en matraces Erlenmcyer de 150 mi etiquetados individualmente. Se añadió glucoamilasa a cada matraz a dosificaciones variables de 0.325 GAU/g sólidos, 0.2275 GAU/g sólidos, y 0.1625 GAU/g sólidos. Las alfa -amilasas AkAA o TeAmyl se añadieron a cada matraz en dosificaciones variables, con la dosificación más alta en 20 mg de proteína/g sólidos (dosis 100 %). La mezcla se incubó en una incubadora de aire forzado con mezclado a 200 rpm durante aproximadamente 70 horas a pH 4.8, 32 °C. Se extrajo aproximadamente 1 mi de muestras de la suspensión de EOF de maíz en aproximadamente t = 0, 3, 19, 27, 43, 52 y/o 70 horas y se almacenaron en congelación. Las muestras de EOF se analizaron para determinar el rendimiento de etanol y la reducción de DP3+ y el rendimiento de DP2.
Para determinar el rendimiento de etanol y la reducción de DP3+, las muestras de cada punto de tiempo se descongelaron a 4 °C y se centrifugaron durante 2 min a 15,000 rpm. Se mezcló 100 ml de los sobrenadantes de las muestras en tubos de microcentrífuga individuales con 10 ml de ácido sulfúrico 1.1 N y se incubaron 5 min a temperatura ambiente. Se añadió 1 mi de agua en cada tubo y los tubos se centrifugaron durante 1 min a 15,000 rpm. Se filtraron 200 m? sobre una placa de HPLC. La placa se analizó en un HPLC Agilent mediante el uso de una columna Rezex Fast Fruit RFQ con 8 min de elución. Las curvas de calibración para los componentes anteriores se prepararon mediante el uso de un Etanol Supelco Fuel (Sigma cat. núm. 48468-U). Las concentraciones de DPI, DP2, DP3+, glicerol, ácido acético, ácido láctico, y etanol (g/1) se determinaron mediante el uso del software ChemStation. La producción de etanol se convirtió al por ciento v/v de la mezcla de reacción.
Como se muestra en las Figuras 5A-C, en donde la TeAmyl y AkAA se dosificaron al mismo nivel (20 mg de proteína / g de sólido), los índices de producción de etanol obtenidos con la TeAmyl y una glucoamilasa fueron comparables con los obtenidos con AkAA y una glucoamilasa. Ambos produjeron aproximadamente 8 % v/v de etanol en alrededor de 20 horas (Figura 5A). A las 70 horas, el rendimiento de etanol era de aproximadamente 12 % v/v para el control y TeAmyl como la a-amilasa (Figura 5A). Se obtuvieron resultados similares para el índice de hidrólisis de DP3+ (Figura 5B). La hidrólisis de DP3+ por parte de la TeAmyl ciertamente produjo niveles de DP3+ ligeramente menores dentro de las primeras 15 horas. Adicionalmente, el rendimiento de DP2 por parte de la TeAmyl resultó ser más eficaz dentro de las primeras 20 horas, y alcanzó un porcentaje de aproximadamente 4 % p/v aproximadamente a las 10 horas (Figura 5C). Después de aproximadamente 30 horas se observó niveles de DP2 similares para AkAA y TeAmyl (Figura 5C).
Como se muestra en las Figuras 6A-B, en donde la TeAmyl se dosificó a niveles reducidos (50 % o 17 % de la dosis de AkAA), el índice de producción de etanol e hidrólisis de DP3+ eran comparables entre la TeAmyl y AkAA (100 % de la dosis). Por ejemplo, tanto el nivel de 17 % como el de 50 % de TeAmyl produjeron aproximadamente 12 % v/v de etanol en aproximadamente 70 horas, mientras que el índice de producción de etanol fue casi idéntico dentro de las primeras 27 horas (Figura 6A). Similarmente, la hidrólisis de DP3+ por medio de dosis reducidas de TeAmyl (17 % y 50 % de la dosis de AkAA) resultó ser comparable con la AkAA (100 % de la dosis), con respecto a los niveles finales de DP3+ y el índice de reducción de DP3+ (Figura 6B). Con respecto al rendimiento de DP2, se encontró que la dosis de 50 % de TeAmyl produjo un nivel de DP2 comparable con AkAA (100 % de la dosis) (Figura 6C). La AkAA, en una de las dosificaciones menores que 100 %, es decir, 50 % y 17 %, produjo velocidades significativamente menores de producción de etanol, formación de DP2, hidrólisis de DP3+ y niveles de etanol finales menores que la AkAA al 100 % de la dosis (los datos no se muestran).
Estos resultados indican que la TeAmyl parece ser (1) hasta 6 veces más eficaz que la AkAA para producir etanol e hidrolizar DP3+, y (2) al menos dos veces más eficaz que la AkAA para producir DP2. Por lo tanto, la TeAmyl puede usarse en una dosificación reducida (aproximadamente 17 % o 50 %) en comparación con la AkAA, y al mismo tiempo se obtienen resultados comparables.
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AATTGTTCTTTCTTTCTTTCTCTTCAGCTCGACTATATCCAAGGCATGGGGTTCACGGCCA TCTGGATTTCACCGGTGACCGAGCAGCTGCCGCAAAATACGGGTGAGGGAGAAGCCTATCA TGGGTATTGGCAGCAGGAAATGTGAGATACCAGTTGTGCTGTCATTCTACATTCTTTTTTT GATATATATGATGCATAATTATTGCTTTACTATGATCTCCACTTACTCAAGGCAGATACAC GGTCAACTCCAACTTTGGGACATCAGACGATCTCTTAGCCCTGTCAAAGGCGCTCCATGAC CGTGGCATGTACCTCATGGTCGATGTGGTTGCGAATCACATGGTCAGTGACCTGGTTTTCT TCCTCCTCCTTGACAAGAACGAACGATTCTAAGCCCAACTTAGGGATACGATGGAGATGGC GACTCCGTTGATTACAGCGTCTTCAATCCATTTAATTCCTCGAGTTATTTCCATCCCTATT GCCTGATTACAGACTACAGCAATCAGACCGATGTGGAAGACTGTTGGCTGGGCGATACGAC TGTCTCGTTGCCCGATCTCAACACCACGGAGACTGTTGTGAGGACTATATGGTATGACTGG GTGGCGGATCTCGTCTCCAATTACTCTAGTATGGCTGATGCTTTCTCTACTTTTCTTTTTG TCTTTTCCCTTGAAGTATACAGCTAATACTATCCAATAGTTGATGGGCTTCGCATCGACAC GGTGAAACACGTAGAAAAGTCATTCTGGCCTGGTTACAACAGTGCTGCGGGTGTCTACTGT GTTGGCGAGGTCCTCGATGGAGATCCGTCTTACACTTGTCCCTACCAGGATTATCTGGACG GTGTATTAAACTATCCAATGTGAGGATCCCTTTCTGAAAAAAGAAAATTGTTTCTTGACTG ACAACATCCAGATACTATCAACTACTGTATGCGTTTGAATCCTCTAGCGGCAGCATCAGCA 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GTGGTATGTGACAGTCACATTGCCGGTTGGGACGTCCTTTGAGTACAAGTTCATCAAGAAG GAAGAGAACGGCGATGTCGAGTGGGAGAGCGATCCCAATCGGTCGTATACTGTGCCGACGG CCTGCACGGGAGCGACGGAGACGATTGTCGACACATGGAGATAG Sec. con núm. de ident.: 3 Secuencia de aminoácidos del péptido señal de TeAmyl en estado natural: MTPFVLTAVLFLLGNAVLA Sec. con núm. de ident.: 4 >gi |709887031ref|XP 749208.l[ alfa-amilasa [Aspergillus fumigatus Af293] LTPAEWRSQSIYFLLTDRFGREDNSTTAACDVTQRLYCGGSWQGIINHLDYIQGMGFTAIW ITPVTEQFYENTGDGTSYHGYWQQN1HEVNANYGTAQDLRDLANALHARGMYLMVDW ANH MGYNGAGNSVNYGVFTPFDSATYFHPYCLITDYNNQTAVEDCWLGDTTVSLPDLDTTSTAV RSIWYDWVKGLVANYSIDGLRIDTVKHVEKDFWPGYNDAAGVYCVGEVFSGDPQYTCPYQN YLDGVLNYPIYYQLLYAFQSTSGSISNLYNMISSVASDCADPTLLGNFIENHDNPRFASYT SDYSQAKNVISFMFFSDGIPIVYAGQEQHYSGGADPANREAVWLSGYSTSATLYSWIASTN KIRKLAISKDSAYITSKNNPFYYDSNTLAMRKGSVAGSQVITVLSNKGSSGSSYTLSLSGT GYSAGATLVEMYTCTTLTVDSSGNLAVPMVSGLPRVFVPSSWVSGSGLCGDSISTTATAPS ATTSATATRTACAAATAIPILFEELVTTTYGESIYLTGSISQLGNWDTSSAIALSASKYTS SNPEWYVTVTLPVGTSFEYKFVKKGSDGSIAWESDPNRSYTVPTGCAGTTVTVSDTWR Sec. con núm. de ident.: 5 >gi |159128622|gb 1EDP53736.1| alfa-amilasa, simulada [Aspergillus fumigatus A1163] LTPAEWRSQSIYFLLTDRFGREDNSTTAACDVTQRLYCGGSWQGIINHLDYIQGMGFTAIW ITPVTEQFYENTGDGTSYHGYWQQN1HEVNANYGTAQDLRDLANALHARGMYLMVDW ANH MGYNGAGNSVNYGVFTPFDSATYFHPYCLITDYN QTAVEDCWLGDTTVSLPDLDTTSTAV RSIWYDWVKGLVANYSIDGLRIDTVKHVEKDFWPGYNDAAGVYCVGEVFSGDPQYTCPYQN YLDGVLNYPIYYQLLYAFQSTSGSISNLYNMISSVASDCADPTLLGNFIENHDNPRFASYT SDYSQAKNVISFMFFSDGIPIVYAGQEQHYSGGADPANREAVWLSGYSTSATLYSWIASTN KIRKLAISKDSAYITSKNNPFYYDSNTLAMRKGSVAGSQVITVLSNKGSSGSSYTLSLSGT GYSAGATLVEMYTCTTLTVDSSGNLAVPMVSGLPRVFVPSSWVSGSGLCGDSISTTATAPS ATTSATATRTACAAATAIPILFEELVTTTYGESIYLTGSISQLGNWDTSSAIALSASKYTS SNPEWYVTVTLPVGTSFEYKFVKKGSDGSIAWESDPNRSYTVPTGCAGTTVTVSDTWR Sec. con núm. de ident.: 6 >gi |119497741|ref1XP 001265628.l| alfa-amilasa, simulada [Neosartorya fischeri NRRL 181] LTPAEWRSQSIYFLLTDRFGREDNSTTAACDVTQRLYCGGSWQGIINHLDYIQGMGFTAIW ITPVTQQFYENTGDGTSYHGYWQQNIYEVNSNYGTAQDLRKLADALHARGMYLMVDW ANH MGYDGAGNSVDYSVFTPFDSSTYFHTYCLISDYNNQNNVEDCWLGDTTVSLPDLDTTNTAV R IWYDWVKGLVANYSIDGLRIDTVKHVEKDFWPDYNDAAGVYCVGEVFSGDPSY CPYQN YMDGVLNYPIYYQLLYAFQSTSGSISNLYNMISSVDSDCADPTLLGNFIENHDNPRFASYT SDYSQAKNVISFMFFSDGIPIVYAGQEQHYSGGADPANREAVWLSGYSTSATLYSWIASTN KIRKLAISKDSAYITSKNNPFYYDSNTLAMRKGSVAGSQVITVLSNKGSSGSSYTLSLSGT GYSAGATLVEMYTCTTLTVDSSGNLAVPMASGLPRVLVPSSWVSGSGLCGDSISTIATTTT STTKTTTVATTTACASATALPILFEELVTTTYGETIYLTGSISQLGNWDTSSAIALSASKY TSSNPEWYATVTLPVGTSFQYKFFKKESDGSIVWESDPNRSYTVPAGCAGTTVTVSDTWR Sec. con núm. de ident.: 7 >gi |1153857171ref|XP 001209405.l[ precursor de alfa-amilasa terreus N1H2624] LTPAEWRSQSIYFLLTDRFGRTDNSTTAACDTSDRVY CGGSWQGIINQLDYIQGMGFTAI WITPVTGQFYENTGDGTSYHGYWQQDIYDLNYNYGTAQDLKNLANALHERGMYLMVDW A NHMGYDGAGNTVDYSVFNPFSSSSYFHPYCLISNYDNQTNVEDCWLGDTTVSLPDLDTTS TAVRNIWYDWVADLVANYSIDGLRVDTVKHVEKDFWPGYNSAAGVYCVGEVYSGDPAYTC PYQNYMDGVLNYPIYYQLLYAFESSSGSISDLYNMISSVASSCKDPTLLGNFIENHDNPR FASYTSDYSQAKNVITFIFLSDGIPIVYAGQEQHYSGGSDPANREATWLSGYSTSATLYT WIATTNQIRSLAISKDAGYVQAKNP FYSDSNT IAMRKGTTAGAQVITVLSNKGASGSSY TLSLSGTGYSAGATLVETYTCTTVTVDSSGNLPVPMTSGLPRVFVPSSWVNGSALCNTEC TAATSISVLFEELVTTTYGENIYLSGSISQLGSWNTASAVALSASQYTSSNPEWYVSVTL PVGTSFQYKFIKKGSDGSW WESDPNRSYTVPAGCEGATVTVADTWR Sec. con núm. de ident 8 >gi |2570150|dbj|BAA22993.1| alfa-amilasa estable en ácidos [Aspergillus kawachii] LSAAEWRTQSIYFLLTDRFGRTDNSTTATCNTGDQIYCGGSWQGIINHLDYIQGMGFTAIWI SPITEQLPQDTSDGEAYHGYWQQKIYYVNSNFGTADDLKSLSDALHARGMYLMVDW PNHMG YAGNGNDVDYSVFDPFDSSSYFHPYCLITDWDNLTMVQDCWEGDTIVSLPDLNTTETAVRTI WYDWVADLVSNYSVDGLRIDSVEEVEPDFFPGYQEAAGVYCVGEVDNGNPALDCPYQKYLDG VLNYPIYWQLLYAFESSSGSISNLY MIKSVASDCSDPTLLGNFIENHDNPRFASYTSDYSQ AKNVLSYIFLSDGIPIVYAGEEQHYSGGDVPYNREATWLSGYDTSAELYTWIATTNAIRKLA ISADSDYITYKNDPIYTDSNTIAMRKGTSGSQIITVLSNKGSSGSSYTLTLSGSGYTSGTKL IEAYTCTSVTVDSNGDIPVPMASGLPRVLLPASWDSSSLCGGSGNTTTTTTAATSTSKATT SSSSSSAAATTSSSCTATSTTLPITFEELVTTTYGEEVYLSGSISQLGEWHTSDAVKLSADD YTS SNPEW S VTV S LPVGTTFE YKF I KVDEGGS VTWESDPNRE YTVPECGSGSGETWDTWR Sec . con núm . de ident . : 9 >gi | 40313278 | dbj | BAD06 Q03 . l | alfa-amilasa [Aspergillus awamori] LSAAEWRSQSIYFLLTDRFGRTDNSTTATCDTGDQIYCGGSWQGIINHLDYIQGMGFTAIWI SPITEQLPQDTSDGEAYHGYWQQKIYDVNSNFGTADDLKSLSDALHARGMYLMVDW PNHMG YAGNGNDVDYSVFDPFDSSSYFHPYCLITDWDNLTMVQDCWEGDTIVSLPDLNTTETAVRTI WYDWVADLVSNYSVDGLRIDSVLEVEPDFFPGYQEAAGVYCVGEVDNGNPALDCPYQDYLDG VLNYPIYWQLLYAFESSSGSISDLYNMIKSVASDCSDPTLLGNFIENHDNPRFASYTSDYSQ AKNVLSYIFLSDGIPIVYAGEEQHYSGGDVPYNREATWLSGYDTSAELYTWIATTNAIRKLA ISADSDYITYANDPIYTDSNTIAMRKGTSGSQVITVLSNKGSSGSSYTLTLSGSGYTSGTEL IEAYTCTSVTVDSNGDIPVPMASGLPRVLLPAWW DSSSSLWGGSTTTTTSSSTSTSTSKAT SSSSTTTSSSCTATSTTLPITLEELVTTTYGEEIYLSGSISQLGEWDTSDAVKLSADDYTSS NPEWYVTVSLPVGTTFEYKFIKVEEDGSVTWESDPNREYTVPECGSGETW DTWR Sec. con núm. de ident.: 10 Dominio de unión simulado a carbohidratos de TeAmyl ACTTATAVAVLFEELVTTTYGENVYLSGS ISQLGDWNTDDAVALSAANYTSSNPLWYVTV TLPVGTSFEYKFIKKEENGDVEWESDPNRSYTVPTACTGATET IVDTWR Sec. con núm. de ident.: 11 Conector simulado de TeAmyl (región conectora) SSPSPTTTTSTSTSTTST Sec. con núm. de ident.: 12 a-amilasa de Aspergillus niger (entrada de la base de datos de proteínas 2GUY|A) ATPADWRSQS IYFLLTDRFA RTDGSTTATC NTADQKYCGG TWQGIIDKLD YIQGMGFTAI WITPVTAQLP QTTAYGDAYH GYWQQDIYSL NENYGTADDL KALSSALHER GMYLMVDW A NHMGYDGAGS SVDYSVFKPF SSQDYFHPFC FIQNYEDQTQ VEDCWLGDNT VSLPDLDTTK DWKNEWYDW VGSLVSNYSI DGLRIDTVKH VQKDFWPGYN KAAGVYCIGE VLDGDPAYTC PYQNVMDGVL NYPIYYPLLN AFKSTSGSMD DLYNMINTVK SDCPDSTLLG TFVENHDNPR FASYTNDIAL AKNVAAFIIL NDGIPIIYAG QEQHYAGGND PANREATWLS GYPTDSELYK LIASANAIRN YAISKDTGFV TYKNWPIYKD DTTIAMRKGT DGSQIVTILS NKGASGDSYT LSLSGAGYTA GQQLTEVIGC TTVTVGSDGN VPVPMAGGLP RVLYPTEKLA GSKICSSS Sec. con núm. de ident.: 13 Cebador 1 5 '-ccgcggccgcaccATGACGCCTTTCGTCCTCAC-3' Sec. con núm. de ident.: 14 Cebador 2 5'- ccggcgcgcccttaCTATCTCCATGTGTCGACAAT -3' Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. 0 5 0 5

Claims (107)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Una a-amilasa aislada de Talaromyces emersonii (TeAmyl) o variante de esta caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) los residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) los residuos 1-476 de la sec con núm. de ident.:1, en donde la variante tiene actividad a-amilasa.
2. La variante de a-amilasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la TeAmyl o variante de esta comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) los residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) los residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1.
3. La variante de a-amilasa de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque la TeAmyl o variante de esta comprende (a) los residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) los residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1.
4. La variante de a-amilasa de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque la TeAmyl o variante de esta consiste en una secuencia de aminoácidos con al menos 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) los residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) los residuos 1-476 de la sec con núm. de ident.:1.
5. La variante de a-amilasa de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la TeAmyl o variante de esta consiste en (a) los residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) los residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1.
6. Un método para la sacarificación de una composición que comprende almidón para producir una composición que comprende glucosa, caracterizado porque comprende: (i) poner en contacto la composición que comprende almidón con una TeAmyl aislada o variante de esta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5; y (ii) sacarificar la composición que comprende almidón para producir la composición que comprende glucosa; en donde la TeAmyl aislada o variante de esta cataliza la sacarificación de la composición de almidón a glucosa.
7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la TeAmyl o variante de esta se dosifica a aproximadamente 17 %-50 % la dosis de AkAA, para reducir la misma cantidad de DP3+ en las mismas condiciones.
8. El método de conformidad con las reivindicaciones 6 o 7, caracterizado porque la TeAmyl o variante de esta se dosifica a aproximadamente 17 %-34 % la dosis de AkAA, para reducir la misma cantidad de DP3+ en las mismas condiciones.
9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-8, caracterizado porque la composición que comprende glucosa se enriquece en DP2 o (DPI + DP2), cuando se mide como un porcentaje en peso del DPI - DP7 total, comparado con una segunda composición que comprende glucosa producida por la AkAA en las mismas condiciones.
10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque DP2 se enriquece dos a tres veces a aproximadamente 2 horas.
11. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque (DPI + DP2) se enriquece aproximadamente 1.9 veces aproximadamente 2 horas.
12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-11, caracterizado porque la TeAmyl o variante de esta comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:l o (b) residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1.
13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la TeAmyl o variante de esta comprende (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1.
14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-11, caracterizado porque la TeAmyl o variante de esta consiste en una secuencia de aminoácidos con al menos 80 %, 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:l o (b) residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1.
15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la TeAmyll4 o variante de esta consiste en (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident 1.
16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-15, caracterizado porque la composición que comprende almidón comprende almidón liquidificado, almidón gelatinizado, o almidón granular.
17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-16, caracterizado porque la sacarificación se lleva a cabo a un intervalo de temperatura de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 75 °C.
18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el intervalo de temperatura es de 55 °C a 74 °C.
19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-18, caracterizado porque la sacarificación se realiza en un intervalo de pH de pH 2.0 -pH 7.5.
20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el intervalo de pH es pH 3.0-pH 5.8.
21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el intervalo de pH es pH 3.5-pH 4.5.
22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-21, caracterizado porque comprende además fermentar la composición de glucosa para producir un producto final de fermentación (EOF).
23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la fermentación es una reacción de sacarificación y fermentación (SSF) simultánea.
24. El método de conformidad con las reivindicaciones 22 o 23, caracterizado porque la fermentación se lleva a cabo por 48 - 70 horas a pH 2 - 8 y en un intervalo de temperatura de 25 °C - 70 °C.
25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22-24, caracterizado porque el producto de EOF comprende etanol.
26. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22-25, caracterizado porque el producto de EOF comprende 8 % - 18 % (v/v) de etanol.
27. Un método para proporcionar una bebida fermentada, tal como una cerveza, que comprende, opcionalmente, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22-26, caracterizado porque el método comprende el uso de TeAmyl o variante de esta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque además el método comprende: (a) preparar una templa; (b) filtrar la templa para obtener un mosto; y (c) fermentar el mosto para obtener una bebida fermentada, tal como una cerveza, en donde porque TeAmyl o variante de esta se añade a: (i) la templa de la etapa (a) y/o (ii) el mosto de la etapa (b) y/o (iii) el mosto de la etapa (c).
29. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22-28, caracterizado porque el producto de EOF comprende un metabolito.
30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el metabolito es ácido cítrico, ácido láctico, ácido succínico, glutamato monosódico, ácido glucónico, gluconato sódico, gluconato cálcico, gluconato potásico, glucono delta-lactona, eritorbato sódico, ácido graso omega 3, butanol, un aminoácido, lisina, ácido itaconico, 1,3-propanodiol, isopreno o biodiesel.
31. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-30, caracterizado porque comprende además añadir glucoamilasa, hexoquinasa, xilanasa, glucosa isomerasa, xilosa isomerasa, fosfatasa, fitasa, pululanasa, b-amilasa, a-amilasa que no es TeAmyl, proteasa, celulasa, hemicelulasa, lipasa, cutinasa, isoamilasa, enzima de redox, esterasa, transferasa, pectinasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, liasa, trehalasa, enzima de ramificación, hidrolasa o una combinación de estas, a la composición de almidón.
32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la glucoamilasa se añade a 0.1-2 unidades de glucoamilasa (GAU)/g ds.
33. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-32, caracterizado porque la TeAmyl o una variante de esta se expresa y secreta a través de una célula hospedera.
34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la composición que comprende almidón se pone en contacto con la célula hospedera.
35. El método de conformidad con la reivindicación 33 o 34, caracterizado porque la célula hospedera expresa y secreta, además, una glucoamilasa.
36. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33-35, caracterizado porque la célula hospedera es capaz de fermentar la composición de glucosa.
37. Una composición caracterizada porque comprende glucosa producida por el método de conformidad con la reivindicación 6.
38. Un almidón licuado caracterizado porque es producido por el método de conformidad la reivindicación 6.
39. Una bebida fermentada, tal como una cerveza, caracterizada porque es producida por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22-36.
40. Una composición para el uso de para sacarificar una composición que comprende almidón, caracterizada porque comprende una TeAmyl aislada o variante de esta que tiene actividad a-amilasa, y que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:l o (b) residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident. :1.
41. La composición de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque la TeAmyl o variante de esta comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1.
42. La composición de conformidad con las reivindicaciones 40 o 41, caracterizada porque la TeAmyl o variante de esta comprende (a) los residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) los residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1.
43. La composición de conformidad con las reivindicaciones 40 o 41, caracterizada porque la TeAmyl o variante de esta consiste en una secuencia de aminoácidos con al menos 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) los residuos 1-603 de la sec. con nú . de ident.:1 o (b) los residuos 1-476 de la sec con núm. de ident 1.
44. La composición de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque la TeAmyl o variante de esta consiste en (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1.
45. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40-44, caracterizada porque es un material celular cultivado.
46. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40-45, caracterizada porque comprende, adicionalmente, una glucoamilasa.
47. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40-45, caracterizada porque la TeAmyl o variante de esta se purifica.
48. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40-47, caracterizada porque la TeAmyl o variante de esta se expresa y secreta a través de una célula hospedera .
49. La composición de conformidad con la reivindicación 48, caracterizada porque la célula hospedera es una célula fúngica filamentosa.
50. La composición de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada porque la célula hospedera es una célula de Aspergillus sp. o Trichoderma reesei.
51. Uso de la TeAmyl o variante de esta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-50, en la producción de una composición que comprende glucosa.
52. Uso de la TeAmyl o variante de esta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-50, en la producción de un almidón liquidificado.
53. Uso de la TeAmyl o variante de esta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-50, en la producción de una bebida fermentada.
54. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22-36, la bebida fermentada de conformidad con la reivindicación 39, o el uso de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque la bebida fermentada o producto final de la fermentación se selecciona del grupo que consiste en: i) una cerveza seleccionada del grupo que consiste en cerveza malteada completa, cerveza elaborada bajo la “Reinheitsgebot”, ale, IPA, lager, bitter (amarga), Happoshu (segunda cerveza), tercera cerveza, cerveza seca, casi cerveza, cerveza ligera, cerveza con bajo contenido de alcohol, cerveza baja en calorías, porter, cerveza bock, cerveza negra (stout), licor de malta, cerveza sin alcohol, y licor de malta sin alcohol; y/o ii) bebidas de cereales o malta seleccionados del grupo que consiste en bebidas de malta con sabor a frutas, bebidas de malta con sabor a licor, y bebidas de malta con sabor a café.
55. Un método de producir una composición alimenticia, caracterizado porque comprende combinar: (i) uno o más ingredientes alimenticios, y (ii) una TeAmyl aislada o variante de esta que tiene actividad a-amilasa y que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:l o (b) residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1, en donde la TeAmyl aislada o variante de esta cataliza la hidrólisis de componentes de almidón presentes en los ingredientes alimenticios para producir glucosa.
56. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque la TeAmyl o variante de esta se dofisica a aproximadamente 17 %-50 % de la dosis de AkAA, para reducir la misma cantidad de DP3+ en las mismas condiciones.
57. El método de conformidad con las reivindicaciones 55 o 56, caracterizado porque la TeAmyl o variante de esta se dosifica a aproximadamente 17 %-34 % de la dosis de AkAA, para reducir la misma cantidad de DP3+ en las mismas condiciones.
58. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque la composición alimenticia se enriquece en DP2 o (DPI + DP2), cuando se mide como un porcentaje en peso del DPI - DP7 total, comparado con un segundo producto horneado producido por AkAA en las mismas condiciones .
59. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque DP2 se enriquece dos a tres veces a aproximadamente 2 horas.
60. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque (DPI + DP2) se enriquece aproximadamente 1.9 veces aproximadamente 2 horas.
61. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 55-60, caracterizado porque la TeAmyl o variante de esta comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:l o (b) residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1.
62. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque la TeAmyl o variante de esta comprende (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1.
63. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 55-60, caracterizado porque la TeAmyl o variante de esta consiste en una secuencia de aminoácidos con al menos 80 %, 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:l o (b) residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1.
64. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque la TeAmyl o variante de esta consiste en (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1.
65. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 58-64, caracterizado porque la composición alimenticia se selecciona del grupo que consiste en un producto alimenticio, una composición de hornear, un aditivo alimenticio, un producto alimenticio animal, un producto alimenticio, un aditivo alimenticio, un aceite, una carne, y una manteca.
66. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 58-65, caracterizado porque el uno o más ingredientes alimenticios comprender un ingrediente de horneado o un aditivo.
67. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 55-66, caracterizado porque el uno o más ingredientes alimenticios se seleccionan del grupo que consiste en harina; una amilasa contra el enranciamiento; una fosfolipasa; un fosfolípido; una alfa-amilasa maltogénica o una variante, homólogo, o mutantes de esta que tiene actividad alfa-amilasa maltogénica; una xilanasa de panadería (EC 3.2.1.8); y una lipasa.
68. El método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque el uno o más ingredientes alimenticios se seleccionan del grupo que consiste en (i) una alfa-amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus , (ii) una xilanasa de panadería es de Bacillus, Aspergillus , Thermomyces o Trichoderma , (iii) una glicolipasa de Fusarium heterosporum.
69. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 55-68, caracterizado además porque la composición alimenticia comprende una masa o un producto de masa, preferentemente, un producto de masa procesado.
70. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 55-69, caracterizado porque comprende hornear la composición alimenticia para producir un producto horneado .
71. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 55-70, caracterizado porque comprende, adicionalmente : (i) proporcionar un medio de almidón; (ii) añadir al medio de almidón la TeAmyl o variante de esta; y (iii) aplicar calor al medio de almidón durante o después de la etapa (b) para producir un producto de panadería.
72. Una composición para usarse en la producción de una composición alimenticia, que comprende una TeAmyl aislada o variante de esta que tiene actividad a-amilasa y que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 1-476 de la sec con núm. de ident.:1 y uno o más ingredientes alimenticios.
73. La composición de conformidad con la reivindicación 72, en donde la TeAmyl o variante de esta comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1.
74. La composición de conformidad con la reivindicación 73, en donde la TeAmyl o variante de esta comprende (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1.
75. La composición de conformidad con la reivindicación 72, en donde la TeAmyl o variante de esta consiste en una secuencia de aminoácidos con al menos 80 %, 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 1-603 de la sec . con núm . de ident . : 1 o (b) residuos 1-476 de la sec . con núm. de ident . : 1.
76. La composición de conformidad con la reivindicación 72, en donde la TeAmyl o variante de esta consiste en (a) residuos 1-603 de la sec . con núm. de ident. :1 o (b) residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident. :1.
77. Uso de la TeAmyl o variante de esta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 72-76, para preparar una composición alimenticia.
78. El uso de conformidad con reivindicación 77, en donde la composición alimenticia comprende una masa o un producto de masa, preferentemente, un producto de masa procesado.
79. El uso de conformidad con reivindicación 77 o 78, en donde la composición alimenticia es una composición de panadería .
80. Uso de la TeAmyl o variante de esta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 72-76, en un producto de masa para retardar o reducir el endurecimiento, preferentemente, la retrogradación perjudicial, del producto de masa .
81. Un metodo para eliminar manchas de almidón de la ropa sucia, platos, o textiles, caracterizado porque comprende incubar una superficie de la ropa sucia, platos, o textiles en presencia de una composición acuosa que comprende una cantidad eficaz de una TeAmyl aislada o variante de esta que tiene actividad a-amilasa y que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:l, y que permite que la TeAmyl o variante de esta hidrolice los componentes de almidón presentes en la mancha de almidón para producir moléculas de derivados del almidón más pequeñas que se disuelven en la composición acuosa, y enjuagar la superficie y, de esta manera, eliminar la mancha de almidón de la superficie.
82. El método de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque la TeAmyl o variante de esta se dosifica a aproximadamente 17 %-50 % de la dosis de AkAA, para reducir la misma cantidad de DP3+ en las mismas condiciones.
83. El método de conformidad con las reivindicaciones 81 o 82, caracterizado porque la TeAmyl o variante de esta se dosifica a aproximadamente 17 %-34 % de la dosis de AkAA, para reducir la misma cantidad de DP3+ en las mismas condiciones.
84. El método de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque las moléculas derivadas de almidón se enriquecen en DP2 o (DPI + DP2), cuando se mide como un porcentaje en peso del DP1-DP7 total, comparado con moléculas derivadas de almidón producidas por AkAA en las mismas condiciones.
85. El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque DP2 se enriquece dos a tres veces a aproximadamente 2 horas.
86. El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque (DPI + DP2) se enriquece aproximadamente 1.9 veces aproximadamente 2 horas.
87. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 81-86, caracterizado porque la TeAmyl o variante de esta comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1.
88. El método de conformidad con la reivindicación 87, caracterizado porque la TeAmyl o variante de esta comprende (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1.
89. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 81-87, caracterizado porque la TeAmyl o variante de esta consiste en una secuencia de aminoácidos con al menos 80 %, 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1.
90. El método de conformidad con la reivindicación 89, caracterizado porque la TeAmy o variante de esta consiste en (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 1-476 de la seo. con núm. de ident.:1.
91. Una composición para uso en eliminar manchas de almidón de la ropa sucia, platos, o textiles, caracterizada porque comprende una TeAmyl aislada o variante de esta que tiene actividad a-amilasa y comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident. :1 o (b) residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1 y un tensioactivo.
92. La composición de conformidad con la reivindicación 91, caracterizada porque la TeAmyl o variante de esta comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1.
93. La composición de conformidad con las reivindicaciones 91 o 92, caracterizada porque la TeAmyl o variante de esta comprende (a) los residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) los residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1.
94. La composición de conformidad con las reivindicaciones 91 o 92, caracterizada porque la TeAmyl o variante de esta consiste en una secuencia de aminoácidos con al menos 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) los residuos 1-603 de la sec . con núm. de ident.:l o (b) los residuos 1-476 de la sec con núm. de ident.:1.
95. La composición de conformidad con la reivindicación 94, caracterizada porque la TeAmyl o variante de esta consiste en (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1.
96. La composición de cualquier reivindicación 91-95, caracterizada porque es un detergente para lavandería, un aditivo de detergente para lavandería, o un detergente para lavavajillas manual o automático.
97. Un método para el desaprestado de un textil, caracterizado porque comprende poner en contacto una composición de desaprestado con un textil por un tiempo suficiente para quitarle el apresto al textil, en donde la composición de desaprestado comprende una TeAmyl aislada o variante de esta que tiene actividad a-amilasa y que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1 y permitir que la TeAmyl o variante de esta quite el apresto de los componentes de almidón presentes en la mancha de almidón para producir moléculas de derivados del almidón más pequeñas que se disuelven en la composición acuosa, y enjuagar la superficie y, de esta manera, eliminar la mancha de almidón de la superficie.
98. El método de conformidad con la reivindicación 97, caracterizado porque la TeAmyl o variante de esta se dosifica a aproximadamente 17 %-50 % de la dosis de AkAA, para reducir la misma cantidad de DP3+ en las mismas condiciones.
99. El método de conformidad con las reivindicaciones 97 o 98, caracterizado porque la TeAmyl o variante de esta se dosifica a aproximadamente 17 %-34 % de la dosis de AkAA, para reducir la misma cantidad de DP3+ en las mismas condiciones.
100. El método de conformidad con la reivindicación 97, caracterizado porque las moléculas derivadas de almidón se enriquecen en DP2 o (DPI + DP2), cuando se mide como un porcentaje en peso del DP1-DP7 total, comparado con moléculas derivadas de almidón producidas por AkAA en las mismas condiciones.
101. El método de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado porque DP2 se enriquece dos a tres veces a aproximadamente 2 horas.
102. El método de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado porque (DPI + DP2) se enriquece aproximadamente 1.9 veces aproximadamente 2 horas.
103. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 97-102, caracterizado porque la TeAmyl o variante de esta comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:l o (b) residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1.
104. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 97-103, caracterizado porque la TeAmyl o una variante de esta comprende (a) los residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) los residuos 1-476 de la sec con núm. de ident.:1.
105. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 97-102, caracterizado porque la TeAmyl o una variante de esta consiste en una secuencia de aminoácidos con al menos 80 %, 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1.
106. El método de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado porque la TeAmyl o una variante de esta consiste en (a) residuos 1-603 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 1-476 de la sec. con núm. de ident.:1.
107. Uso de una composición de desaprestado que comprende TeAmyl o una variante de esta para el desaprestado de textiles.
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