CN104130989B - 中温酸性淀粉酶Amya及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及中温酸性淀粉酶Amya及其基因和应用，其具有如SEQ ID NO.1或2所示的氨基酸序列。本发明的淀粉酶具有以下性质:Amya的最适作用pH为4.5，在pH4.5‑5.5能保持80％以上的酶活；在pH范围为4‑10间都很稳定；最适作用温度60℃；在50℃和55℃条件下，Amya热稳定性良好。

Description

中温酸性淀粉酶Amya及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及中温酸性淀粉酶Amya及其基因和应用。

背景技术

淀粉酶(Amyalase,E.C.3.2.1.1)，是可对支链淀粉、直链淀粉或其他葡聚糖分子内部糖苷键以随机的方式进行水解，生成长度不等的直链和支链寡糖的一类酶的总称(Gupta R et al.2003)。淀粉酶的来源非常广泛，包括动物植物和微生物，其中微生物来源的淀粉酶具有来源丰富性能多样和易于工业化生产的特点，可满足多种工业应用需求，在工业上的应用也最为广泛(Gupta R et al.2003,Swetha S et al.2006)。在现代工业的淀粉质处理过程中，微生物淀粉酶的水解方法已经彻底取代传统的化学水解方法(van derMaarel MJ et al.2002)。虽然有多种微生物可以产生淀粉酶，包括丝状真菌酵母、细菌和放线菌等。但是，目前能够满足工业应用需求的淀粉酶主要来源于细菌和丝状真菌(GuptaR et al.2003)，其中由真菌产生的淀粉酶即称为真菌淀粉酶。

与大多数淀粉酶类似，真菌淀粉酶通常含有三个结构域，分别称为A、B和C。结构域A为酶的催化反应中心区域，其典型结构为(α/β)₈桶状结构，结构域B和结构域C基本上位于结构域的对立两端(Jens et al.2000)。目前工业上应用的真菌淀粉酶几乎全部来源于丝状真菌中的曲霉属微生物，如黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillusoryzae)等。随着基因工程技术的广泛应用，很多糖化酶基因已被克隆并进行了异源表达。报道的淀粉酶多属于糖苷水解酶13家族。已报道有多种淀粉酶基因在不同宿主中得到表达，其中真菌淀粉酶基因的异源表达主要集中在真核表达系统。

真菌淀粉酶从20世纪50年代开始相继在英国和美国作为食品添加剂应用于面包生产行业，在现代的淀粉糖浆、焙烤制品、啤酒酿制和生料酒精等行业已得到广泛的应用随着现代制糖工业与发酵工业的发展及其对真菌淀粉酶的使用需求，使得真菌淀粉酶在现代工业酶制剂中占有显著地位。但淀粉酶表达一直也是一难题。真菌来源的淀粉酶主要集中在真核表达系统，如：A.oryzae分别在B.brevis HPD31(Shogo et al.1993)、S.cerevisiae(Kasper et al.2004)、S.kluyveri(Kasper et al.2004)和Baker’s yeast(Randez etal.1995)中得到了表达。

不同微生物所产生的淀粉酶的pH适性、耐热性、催化特性等也不相同。目前对淀粉酶性质的测定主要集中在最适温度和最适pH值的研究上，工业上应用的淀粉酶主要来源于芽孢杆菌，多是应用它的耐高温。而大多数真菌淀粉酶的最适反应pH值为4.5-5.5，在酸性条件下稳定，最适反应温度为40-60℃，分别来源于Aspergillus oryzae ATCC76080(ChangCT et al.1995,Biochem Mol Biol Int.36:185–193)、Sclerotinia sclerotiorum(Imenet al.2008,J.Microbiol.Biotechnol18:1555–1563)、Fusicoccum sp.BCC4124(Champreda V et al.2007,Biosci Biotechnol Biochem71:2010–2020)等，但该酶的pH稳定区间较宽，且最适作用温度和pH与糖化酶的最适最适作用条件(4.0-4.5，60-65℃)相当，可完成一步酶法制糖。

筛选耐热淀粉酶或克隆表达耐热淀粉酶基因，提高淀粉酶的耐热性,会使淀粉制糖过程简化，从而降低能源消耗及生产成本，将给淀粉酶在工业中的应用开辟更为广阔的前景，具有重要的商业价值。

发明内容

本发明目的是提供一种中温酸性淀粉酶。

本发明的再一目的是提供上述编码上述淀粉酶的基因。

本发明的再一目的是提供包含上述淀粉酶编码基因的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述淀粉酶基因的重组菌株。

本发明的再一目的是提供一种制备中温酸性淀粉酶的方法。

本发明的再一目的是提供上述中温酸性淀粉酶的应用。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种中温、酸性的性质优良的新酶。本发明人从Talaromyces emernionii得到一个新的中温、酸性、作用pH广的淀粉酶。它所产生的淀粉酶适合于在葡萄糖、麦芽糖、麦芽四糖糖浆、不规则连接低聚糖混合物和高分子量支链糊精的生产以及纺织和废水处理等多个行业中使用。

本发明从上述菌株中获得了一种中温酸性淀粉酶Amya，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示：

其中，该酶蛋白全长495个氨基酸和一个终止密码子，N端18个氨基酸为信号肽序列“MKLPLFIASTALTSAVLA”。

因此，成熟的淀粉酶Amya的氨基酸序列如SEQ ID NO.2：

成熟蛋白由477个氨基酸和一个终止密码子组成，理论分子量为53.8kDa，该酶属于糖基水解酶第13家族。将推导出的淀粉酶氨基酸序列在NCBI中进行BLAST比对发现，该基因与来源于ByssochlAmyas spectabilis No.5的淀粉酶序列一致性最高为69％。说明该酶是一种新的淀粉酶。

本发明提供了编码上述中温酸性淀粉酶的基因。

该酶基因全长1724bp，序列如SEQ ID NO.3所示：

本发明提供了编码上述中温酸性淀粉酶的cDNA序列，全长1488bp，如SEQ ID NO.4所示:

其中，信号肽的碱基序列为：

“ATGAAGTTGCCCCTGTTTATTGCAAGTACAGCCTTGACTAGTGCTGTCCTGGCT”

去除信号肽的cDNA序列如SEQ ID NO.5所示：

DNA序列与cDNA序列比对分析结果表明：中温酸性淀粉酶Amya的结构基因Amya全长1724bp，含有4个内含子，其序列分别为：232-288bp,448–505bp，768–831bp和995–1051bp，cDNA长1488bp。

本发明还提供了包含上述淀粉酶基因Amya的重组载体。优选为pPIC9-Amya。将本发明的淀粉酶成熟蛋白编码基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列，及载体信号肽序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将去除信号肽的淀粉酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-Amya。

本发明还提供了包含上述淀粉酶基因的重组菌株，优选为重组菌株GS115/Amya。

本发明还提供了一种制备中温酸性真菌来源淀粉酶的方法，包括以下步骤：

1)用权利要求重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组淀粉酶基因的表达；

3)回收并纯化所表达的淀粉酶。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞、大肠杆菌细胞或丝状真菌细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/Amya。

本发明还提供了上述淀粉酶的应用。

本发明提供了一个新的淀粉酶基因，其编码的淀粉酶具有温和的作用温度，作用pH范围广，耐酸性，可在葡萄糖、麦芽糖、麦芽四糖糖浆、不规则连接低聚糖混合物和高分子量支链糊精的生产以及纺织和废水处理等多个行业中使用。

附图说明

图1重组淀粉酶的SDS-PAGE分析，1：毕赤酵母表达的未纯化的淀粉酶Amya；2：纯化的淀粉酶Amya；3：endoH脱糖基化后的淀粉酶Amya；4：低分子量蛋白质Marker。

图2淀粉酶Amya的最适pH曲线。

图3淀粉酶Amya的pH稳定性曲线。

图4淀粉酶Amya作用的最适温度曲线。

图5淀粉酶Amya的热稳定性曲线。

具体实施方式

实验条件：

1、菌株及载体：Talaromyces emernionii。毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。可溶性淀粉购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(1)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl,pH7.0)。

(2)Talaromyces emernionii JCM23024培养基为马铃薯汁培养基：1000mL马铃薯汁，10g葡萄糖，25g琼脂，pH2.5。

(3)MM固体培养基：1.34％YNB，0.00004％Biotin，0.5％甲醇，1.5％琼脂糖。

(4)MD固体培养基：1.34％YNB，0.00004％Biotin，2％葡萄糖，1.5％琼脂糖。

(5)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(V/V)。

(6)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油,其余成份均与BMGY相同。

说明：本发明中所用到重组遗传学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中未作详细介绍的技术，均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分来进行，包括：Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第3版.2001)；Kriegler,GeneTransfer and Expression:A Laboratory Manual(1990)；和Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等人编,1994)。

实施例1 Talaromyces emernionii CBS23024淀粉酶编码基因Amya的克隆

提取Talaromyces emernionii CBS23024基因组DNA：

将液体培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中，加入2mL提取液，研磨5min，然后将研磨液置于50mL离心管中，65℃水浴锅裂解20min，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。

根据第13家族淀粉酶基因的保守ASYHGYW和TSACGTW序列设计合成了简并引物P1(5′-GMT KCC TWC CAY GGN TAY TGG-3′)，P2(5′-GTG TCG ATN CGN AGN CCR TC-3′)(其中：Y＝C/T,R＝A/G,M＝A/C,H＝A/C/T,N＝A/T/G/C)。

以Talaromyces emernionii总DNA为模板利用简并引物P1和P2进行PCR扩增。PCR反应参数为：95℃5min；94℃30sec，60-50℃30sec(其中每个循环后复性温度下降1℃)，72℃1min，10个循环，然后进入第二个循环程序：94℃30sec，50℃30sec，72℃1min，25个循环后；72℃10min，琼脂糖电泳检测。得到约500bp的片段，回收后与pEASY-T₃载体相连，送北京睿博兴科生物技术有限公司进行序列测定。

根据测定序列结果，在NCBI的GenBank中利用BLASTX[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST]进行序列比对，初步判断该基因片段是淀粉酶基因片段，并进行该片段的相似性研究。该片段长513bp，与ByssochlAmyas spectabilis No.5来源的淀粉酶的序列一致性最高为66％。

根据测序得到的核甘酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22～26nt，退火温度在55～65℃。并将它们分别命名为GAmyausp1,GAmyausp2,GAmyausp3(上游特异性引物),GAmyadsp1,GAmyadsp2,GAmya dsp3(下游特异性引物)见表1。

表1.淀粉酶Amya TAIL-PCR特异性引物

通过反向TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送睿博兴科生物技术有限公司测序。将简并引物得到的核心片段与经TAIL-PCR得到的侧翼序列进行拼接得到Amya全长基因。经序列分析表明，该基因DNA全长为一个长1724bp的基因片段。

实施例2 淀粉酶基因的RT-PCR分析

提取Talaromyces emernionii的总RNA,利用反转录酶得到cDNA的一条链,然后设计恰当的引物(Amya F：5′-GGAATTATTCCATTGTTTGTGAGGC-3′，Amya R：5′-GTCTAGTTGAATCAGATTTTGCGGC-3′)扩增该单链cDNA,获得淀粉酶的cDNA序列,扩增得到产物回收后送睿博兴科技术有限公司测序。

淀粉酶的基因组DNA序列和cDNA序列分析结果表明,中温酸性淀粉酶Amya的结构基因全长1，724bp，cDNA长1，488bp。含有4个内含子，其序列分别为：232-288bp,448–505bp，768–831bp和995–1051bp。N端18个氨基酸为其信号肽序列。

实施例3 重组淀粉酶的制备。

将表达载体pPIC9进行双酶切(EcoRI+NotI)，同时将编码淀粉酶的基因pgI通过PCR去掉信号肽序列并加入酶切位点EcoRI和NotI，所用引物为(Amya F com-s：CATGAATTCGCTGATGCGGCCGATTGGCGCTCGAG；Amya R com：GACGCGGCCGCTTACAGGTCACACAACCCCGAACCTCGAAGC)，产物经(EcoRI+NotI)双酶切，得到编码成熟淀粉酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得含有淀粉酶基因Amya的重组质粒pPIC-Amya并转化毕赤酵母GS115，涂布MD平板，3天后待菌落长出，用灭过菌的牙签从长有转化子的MD板上挑取单菌落，按照编号先点到MM上，再点到相应编号的MD平板上30℃培养1～2天，至菌落长出。MD平板上能正常生长转化子接种于装有5mL BMGY培养基的离心管中，30℃、260rpm摇床培养48h后离心去上清，离心管中再加入1mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基，在30℃、260rpm诱导培养48h后，离心取上清用于酶活性检测，从中筛选出具有淀粉酶活性的转化子。获得重组毕赤酵母菌株GS115/Amya。共筛选转化子96个，其中有淀粉酶活性的有80个。

同样构建含信号肽序列的表达载体，并获得重组毕赤酵母菌株，筛选得到有淀粉酶活性的转化子。

将酶活高的菌株重新接种于装有400mL BMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后,离心收集菌体。然后于200mL BMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导48h后，每隔24小时测定上清中淀粉酶的活力并补加甲醇。SDS-PAGE结果(图1)表明，重组淀粉酶在毕赤酵母中得到了表达。诱导96小时后重组淀粉酶的表达量为5.6U/mL。

实施例4 重组淀粉酶的活性分析

在pH4.5，60℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL1％可溶性淀粉，反应10min，加入1.5mL的DNS沸水浴5min测定其活性，1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol葡萄糖的酶量。

实施例5 重组淀粉酶Amya的性质测定

经纯化的淀粉酶Amya在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH2.0～8.0的0.1mol/L的McIlvaine缓冲液。纯化的淀粉酶Amya在不同pH的缓冲体系，60℃下测定的pH适性结果(图2)表明：Amya的最适作用pH为4.5，在pH3.5-5.5能保持60％以上的酶活。

将酶液在不同pH值的缓冲液中于37℃下处理1h，再测定酶活性以研究酶的pH稳定性。结果表明(图3)，Amya在pH范围为4.0-10.0间都很稳定。

最适温度的测定在pH4.5的0.1mol/L的McIlvaine缓冲液体系及不同的温度(30～80℃)下进行酶促反应。酶反应最适温度测定结果(图4)表明，Amya的最适作用温度60℃，在50℃和70℃之间，保持80％以上的酶活。

测定淀粉酶在50℃、55℃和60℃条件下分别保温不同时间测定相对酶活力，绘制酶的热稳定性曲线。在50℃下，Amya热稳定性很好，处理60min后仍能保留近100％的酶活。55℃下处理30min，保留90％的酶活，处理60min后，仍然保留76％的酶活(图5)。

Claims (9)

1.一种中温酸性淀粉酶Amya，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2所示。

2.一种中温酸性淀粉酶基因Amya，其特征在于，编码权利要求1所述的淀粉酶。

3.如权利要求2所述的中温酸性淀粉酶基因Amya，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。

4.包含权利要求2所述的中温酸性淀粉酶基因Amya的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其中，将核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的淀粉酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-Amya。

6.包含权利要求2所述中温酸性淀粉酶基因Amya的重组菌株。

7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为毕赤酵母细胞、酿酒酵母细胞、大肠杆菌、曲霉或木霉细胞。

8.一种制备中温酸性淀粉酶Amya的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求4重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组淀粉酶的表达；

3)回收并纯化所表达的中温酸性淀粉酶Amya。

9.根据权利要求1所述中温酸性淀粉酶Amya用于水解可溶性淀粉的应用。