CN102719419B - 一种可以降解生淀粉的糖化酶glad3及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新的可以降解生淀粉的糖化酶及其应用。具体的，其具有如SEQ ID NO.1或2所示的氨基酸序列，提供了编码上述糖化酶的基因，其具有如SEQ IDNO.3或4所示的核苷酸序列，以及包含该基因的重组载体、重组菌株和重组酶及其应用。本发明的糖化酶具有以下性质:GLAD3的最适作用pH为5.0，在pH4.0-7.0能保持60%以上的酶活；在pH范围为2.0-12.0间都很稳定；最适作用温度60℃；热稳定性好。

Description

一种可以降解生淀粉的糖化酶GLAD3及其基因和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明提供了一种可以降解生淀粉的糖化酶GLAD3及其基因和应用。

背景技术

糖化酶，即葡萄糖淀粉酶（glucoamylase,E.C.3.2.1.3），是淀粉水解过程中的重要酶。其功能在于从淀粉、糊精或糖原等碳水化合物的非还原性末端释放β-D-葡萄糖，是世界上生产量最大、应用范围最广的酶制剂。在酿造、食品和纺织等工业中得以广泛的应用（Bui DM et al.,1996,Applied Microbiology and Biotechnology,44:610-619）。

微生物是糖化酶的重要来源(Marín-Navarro J et al.,2011,Appl MicrobiolBiotechnol 89:1267–1273;Pardeep K and Satyanarayana T,2009,Crit Rev Biotechnol 29:225–255)。工业中应用的糖化酶主要是从曲霉属（Aspergillus）、根霉属（Rhizopus）等丝状真菌和酵母属（Saccharmyces）中获得的（Svensson B et al.,1986,Eur J Biochem154:497-502;Liu YN et al.,2007,Biochem J 403:21-30;Adam AC et al.,2004,Yeast21:379-388;Pardeep K and Satyanarayana T,2009,Crit Rev Biotechnol 29:225-255）。随着基因工程技术的广泛应用，很多糖化酶基因已被克隆并进行了异源表达（PardeepK and Satyanarayana T,2009,Crit Rev Biotechnol 29:225-255）。报道的糖化酶多属于糖苷水解酶15家族（Henrissat B et al.1991,Biochem J）。糖化酶多为糖蛋白，一般由催化域(catalytic domain，CD)、淀粉结合域(starch-binding domain，SBD)以及连接CD与SBD的O-糖基化连接域(O-glycosylated linker domain)组成。

大多数真菌糖化酶的最适反应pH值为4.0-5.0，在酸性条件下稳定。最适反应温度为40-60℃(Norouzian D et al.2006,Biotechnol Adv 24:80-85)。淀粉液化pH一般在5.5-6.2，液化后加糖化酶进行糖化作用，所以开发在pH5.5-6.5之间有高活性的糖化酶更适合工业应用。糖化酶可以水解88.5-100％的可溶性淀粉，但并不是所有的糖化酶都可水解生淀粉。具有生淀粉水解能力的糖化酶在淀粉加工工业中具有明显的应用优势。

筛选耐热、在pH5.5-6.5之间有高活性、有生淀粉水解能力的糖化酶，会使淀粉糖化过程有效完成,从而降低能源消耗及生产成本，将给糖化酶在工业中的应用开辟更为广阔的前景，具有重要的商业价值。

发明内容

本发明目的是提供一种耐热、在pH5.5-6.5之间有高活性、有生淀粉水解能力的糖化酶。

本发明的再一目的是提供上述编码上述糖化酶的基因。

本发明的再一目的是提供包含上述糖化酶编码基因的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述糖化酶基因的重组菌株。

本发明的再一目的是提供一种制备糖化酶的方法。

本发明的再一目的是提供上述糖化酶的应用。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种耐酸碱、作用pH在酸中性范围、有生淀粉水解能力的性质优良的新酶。它所产生的糖化酶适合于在酒类和燃料酒精的生产、葡萄糖、果糖浆、有机酸、味精等食品工业的等多个行业中使用。

本发明从上述菌株中获得了一种耐热糖化酶GLAD3，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示：

1   MYFGSSAFLL GSFALQSVLG RPAFDERSLV QERQSSVDSF IKSETPIALN

51  NLLCNVGPDG CRAFGTSSGA VIASPSRTDP DYYYMWTRDS ALVFKLVIDR

101 FTNQYNSGLQ RRIEQYITAQ ARLQGISNPS GSLADGAGLG EPKFELDMSQ

151 FTGAWGRPQR DGPPLRAIAL ITYAKWLIAN GYSSTASDIV WPIVRNDLSY

201 AAQYWNQTGF DLWEEVNGSS FFTTGSQYRA LIEGAALAKK LGKSGDNYSN

251 IAPQVLCFQQ SFWISSGKYI DSNINVNEGR SGKDVNSVLT SIHNFDPALS

301 CDSATFQPCS DKALSNHKVV VDSFRSWNVN KGISQGSAVA IGRYAEDVYY

351 NGNPWYLATM AAAEQLYDAI YVWKKQGSIT VSDVSLSFFK DLVSSISTGT

401 YASDSATFTS LINAVSKYAD GFVAIVAKYA GTDGHLAEQF DRNNGHPLSA

451 TDLTWSYSAF PTATARRAGI VPPSWAGGVA AVPNQCATNS VVGSYSSATA

501 TSLPASQTPK GGVPTPTGTQ TSTSSSSTST SCPIATSVLV TFEEVVSTNF

551 GQTIKIVGNA AALGNWSTSA AVALDASNYT SSNPLWIATV SLTAGQSIEY

601 KYINVGSDGS VTWERDPNRS TLFPQPHYTV PKTCASTATL DDTWQS*

其中，该酶蛋白全长646氨基酸和一个终止密码子，N端20个氨基酸为其预测的信号肽序列“MYFGSSAFLL GSFALQSVLG”。

因此，成熟的糖化酶GLAD3的氨基酸序列如SEQ ID NO.2：

1   RPAFDERSLV QERQSSVDSF IKSETPIALN NLLCNVGPDG CRAFGTSSGA

51  VIASPSRTDP DYYYMWTRDS ALVFKLVIDR FTNQYNSGLQ RRIEQYITAQ

101 ARLQGISNPS GSLADGAGLG EPKFELDMSQ FTGAWGRPQR DGPPLRAIAL

151 ITYAKWLIAN GYSSTASDIV WPIVRNDLSY AAQYWNQTGF DLWEEVNGSS

201 FFTTGSQYRA LIEGAALAKK LGKSGDNYSN IAPQVLCFQQ SFWISSGKYI

251 DSNINVNEGR SGKDVNSVLT SIHNFDPALS CDSATFQPCS DKALSNHKVV

301 VDSFRSWNVN KGISQGSAVA IGRYAEDVYY NGNPWYLATM AAAEQLYDAI

351 YVWKKQGSIT VSDVSLSFFK DLVSSISTGT YASDSATFTS LINAVSKYAD

401 GFVAIVAKYA GTDGHLAEQF DRNNGHPLSA TDLTWSYSAF PTATARRAGI

451 VPPSWAGGVA AVPNQCATNS VVGSYSSATA TSLPASQTPK GGVPTPTGTQ

501 TSTSSSSTST SCPIATSVLV TFEEVVSTNF GQTIKIVGNA AALGNWSTSA

551 AVALDASNYT SSNPLWIATV SLTAGQSIEY KYINVGSDGS VTWERDPNRS

601 TLFPQPHYTV PKTCASTATL DDTWQS*

成熟蛋白由626个氨基酸和一个终止密码子组成，理论分子量为67.3kDa，该酶属于糖基水解酶第15家族。将推导出的糖化酶氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对发现，该基因与来源于Gibberella moniliformis的假定的糖化酶序列一致性最高为78%。说明GLAD3是一种新的糖化酶。

本发明提供了编码上述糖化酶的基因。

该酶基因全长2103bp，序列如SEQ ID NO.3所示：

1    ATGTACTTTG GGTCTTCTGC CTTTCTTCTC GGCTCATTCG CTCTTCAAAG CGTCTTGGGC

61   CGACCAGCCT TCGATGAGAG GAGTCTCGTA CAAGAGAGAC AATCTTCGGT CGACTCCTTT

121  ATCAAGTCTG AGACACCAAT TGCTCTTAAC AACCTCCTCT GCAATGTCGG CCCTGATGGC

181  TGCCGCGCCT TCGGCACATC CAGCGGTGCT GTCATCGCTT CACCATCCCG CACGGATCCT

241  GACTGTAAGT CGACGAGATA GACAACCAGG ACTAAGAACA TTTACTGACA CACGCTAGAC

301  TATTACATGT GGACTCGAGA TTCCGCTCTA GTCTTCAAGC TGGTCATCGA TAGGTTCACC

361  AACCAGTATA ACTCTGGCTT GCAGAGGCGC ATCGAGCAAT ATATCACCGC CCAAGCCCGC

421  CTCCAGGGTA TTTCCAACCC TTCTGGGTCG CTTGCTGATG GCGCCGGTCT AGGAGAGCCC

481  AAGTTCGAAC TTGATATGAG CCAGTTCACT GGCGCTTGGG GTGAGTATTC ATGTTTTGGC

541  GCCCCTGAAT GAGAACCGTT GACTAAAGGT TGTCAAGGTC GACCCCAACG AGATGGTCCA

601  CCTCTGCGTG CGATCGCTCT GATCACGTAC GCCAAGTGGC TGATTGCCAA CGGCTACTCA

661  TCCACGGCCA GCGACATTGT GTGGCCTATT GTTCGCAACG ATCTTAGCTA CGCGGCTCAA

721  TATTGGAACC AAACCGGATT TGACTTATGG GAAGAGGTCA ACGGCAGTTC GTTCTTTACA

781  ACTGGCTCCC AGTATCGAGG TTAGTTTGCT GGGTGGTTCA CGAGTAAGAT GATGTATTCA

841  CATTTTAAAG CTCTCATTGA AGGTGCCGCT CTGGCCAAGA AGCTCGGCAA GTCAGGAGAC

901  AACTACTCCA ACATCGCTCC TCAGGTTCTC TGCTTCCAGC AGTCTTTCTG GATCTCTTCC

961  GGCAAATACA TCGACTCAAA CATCAATGTC AACGAGGGCC GCAGCGGCAA GGACGTCAAC

1021 AGTGTCCTGA CATCCATCCA CAATTTTGAC CCTGCTCTGA GCTGTGATTC CGCCACATTC

1081 CAGCCATGCA GCGACAAGGC CCTCTCCAAC CACAAGGTTG TTGTCGACTC TTTCCGCTCA

1141 TGGAACGTCA ACAAGGGTAT CTCTCAAGGC TCAGCTGTCG CCATTGGACG ATACGCTGAA

1201 GATGTCTACT ACAATGGCAA CCCCTGGTAC CTCGCTACGA TGGCCGCGGC AGAGCAACTC

1261 TACGATGCCA TTTACGTCTG GAAGAAGCAG GGATCCATCA CTGTGTCGGA CGTCTCTCTT

1321 TCGTTTTTCA AGGACCTCGT CTCTTCAATC TCTACCGGAA CCTACGCCAG CGATTCCGCC

1381 ACCTTCACCA GCCTCATTAA CGCCGTCTCC AAGTACGCTG ATGGGTTTGT TGCTATCGTT

1441 GCAAAGTATG CCGGCACAGA TGGCCACCTC GCAGAGCAAT TTGACCGCAA CAACGGCCAT

1501 CCTCTTTCTG CTACAGACTT GACTTGGTCA TATTCCGCAT TCCCCACCGC TACTGCTCGT

1561 CGAGCTGGTA TTGTTCCTCC TTCTTGGGCT GGTGGCGTGG CTGCTGTTCC CAACCAATGC

1621 GCTACCAATT CTGTTGTTGG TTCGTACTCA TCGGCCACTG CAACTTCGCT CCCGGCATCG

1681 CAAACACCCA AGGGTGGTGT GCCCACTCCA ACTGGCACCC AGACTTCCAC TTCCAGCTCG

1741 TCCACTAGCA CCAGTTGCCC TATTGCAACT TCTGTGCTCG TCACTTTCGA AGAGGTTGTC

1801 TCCACCAACT TTGGTCAAAC CATCAAGATC GTTGGCAACG CCGCTGCTCT CGGTAACTGG

1861 TCGACATCCG CCGCTGTTGC CCTGGACGCC TCAAACTATA CCTCCTCGAA CCCTCTGTGG

1921 ATCGCTACCG TTTCCCTAAC TGCAGGACAG TCTATTGAGT ATAAGTACAT TAACGTCGGG

1981 TCCGACGGCT CTGTGACCTG GGAGAGAGAC CCCAACCGCT CTACACTGTT CCCCCAACCG

2041 CACTACACTG TTCCCAAGAC ATGCGCCAGT ACTGCTACCC TCGATGACAC CTGGCAGTCT

2101 TGA

本发明提供了编码上述糖化酶的cDNA序列，全长1941bp，如SEQ ID NO.4所示。

1    ATGTACTTTG GGTCTTCTGC CTTTCTTCTC GGCTCATTCG CTCTTCAAAG CGTCTTGGGC

61   CGACCAGCCT TCGATGAGAG GAGTCTCGTA CAAGAGAGAC AATCTTCGGT CGACTCCTTT

121  ATCAAGTCTG AGACACCAAT TGCTCTTAAC AACCTCCTCT GCAATGTCGG CCCTGATGGC

181  TGCCGCGCCT TCGGCACATC CAGCGGTGCT GTCATCGCTT CACCATCCCG CACGGATCCT

241  GACTACTATT ACATGTGGAC TCGAGATTCC GCTCTAGTCT TCAAGCTGGT CATCGATAGG

301  TTCACCAACC AGTATAACTC TGGCTTGCAG AGGCGCATCG AGCAATATAT CACCGCCCAA

361  GCCCGCCTCC AGGGTATTTC CAACCCTTCT GGGTCGCTTG CTGATGGCGC CGGTCTAGGA

421  GAGCCCAAGT TCGAACTTGA TATGAGCCAG TTCACTGGCG CTTGGGGTCG ACCCCAACGA

481  GATGGTCCAC CTCTGCGTGC GATCGCTCTG ATCACGTACG CCAAGTGGCT GATTGCCAAC

541  GGCTACTCAT CCACGGCCAG CGACATTGTG TGGCCTATTG TTCGCAACGA TCTTAGCTAC

601  GCGGCTCAAT ATTGGAACCA AACCGGATTT GACTTATGGG AAGAGGTCAA CGGCAGTTCG

661  TTCTTTACAA CTGGCTCCCA GTATCGAGCT CTCATTGAAG GTGCCGCTCT GGCCAAGAAG

721  CTCGGCAAGT CAGGAGACAA CTACTCCAAC ATCGCTCCTC AGGTTCTCTG CTTCCAGCAG

781  TCTTTCTGGA TCTCTTCCGG CAAATACATC GACTCAAACA TCAATGTCAA CGAGGGCCGC

841  AGCGGCAAGG ACGTCAACAG TGTCCTGACA TCCATCCACA ATTTTGACCC TGCTCTGAGC

901  TGTGATTCCG CCACATTCCA GCCATGCAGC GACAAGGCCC TCTCCAACCA CAAGGTTGTT

961  GTCGACTCTT TCCGCTCATG GAACGTCAAC AAGGGTATCT CTCAAGGCTC AGCTGTCGCC

1021 ATTGGACGAT ACGCTGAAGA TGTCTACTAC AATGGCAACC CCTGGTACCT CGCTACGATG

1081 GCCGCGGCAG AGCAACTCTA CGATGCCATT TACGTCTGGA AGAAGCAGGG ATCCATCACT

1141 GTGTCGGACG TCTCTCTTTC GTTTTTCAAG GACCTCGTCT CTTCAATCTC TACCGGAACC

1201 TACGCCAGCG ATTCCGCCAC CTTCACCAGC CTCATTAACG CCGTCTCCAA GTACGCTGAT

1261 GGGTTTGTTG CTATCGTTGC AAAGTATGCC GGCACAGATG GCCACCTCGC AGAGCAATTT

1321 GACCGCAACA ACGGCCATCC TCTTTCTGCT ACAGACTTGA CTTGGTCATA TTCCGCATTC

1381 CCCACCGCTA CTGCTCGTCG AGCTGGTATT GTTCCTCCTT CTTGGGCTGG TGGCGTGGCT

1441 GCTGTTCCCA ACCAATGCGC TACCAATTCT GTTGTTGGTT CGTACTCATC GGCCACTGCA

1501 ACTTCGCTCC CGGCATCGCA AACACCCAAG GGTGGTGTGC CCACTCCAAC TGGCACCCAG

1561 ACTTCCACTT CCAGCTCGTC CACTAGCACC AGTTGCCCTA TTGCAACTTC TGTGCTCGTC

1621 ACTTTCGAAG AGGTTGTCTC CACCAACTTT GGTCAAACCA TCAAGATCGT TGGCAACGCC

1681 GCTGCTCTCG GTAACTGGTC GACATCCGCC GCTGTTGCCC TGGACGCCTC AAACTATACC

1741 TCCTCGAACC CTCTGTGGAT CGCTACCGTT TCCCTAACTG CAGGACAGTC TATTGAGTAT

1801 AAGTACATTA ACGTCGGGTC CGACGGCTCT GTGACCTGGG AGAGAGACCC CAACCGCTCT

1861 ACACTGTTCC CCCAACCGCA CTACACTGTT CCCAAGACAT GCGCCAGTAC TGCTACCCTC

1921 GATGACACCT GGCAGTCTTG A

其中，信号肽的碱基序列为：ATGTACTTTG GGTCTTCTGC CTTTCTTCTC GGCTCATTCGCTCTTCAAAG CGTCTTGGGC

DNA序列与cDNA序列比对分析结果表明：糖化酶GLAD3的结构基因glaD3全长2,103bp，含有3个内含子，其序列分别为：245–298bp,521–576bp和800–850bp，cDNA长1941bp。

本发明还提供了包含上述糖化酶基因glaD3的重组载体。优选为pPIC9-glaD3。将本发明的糖化酶成熟蛋白编码基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列，及载体信号肽序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将去除信号肽的糖化酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-glaD3。

本发明还提供了包含上述糖化酶基因的重组菌株，优选为重组菌株GS115/glaD3。

本发明还提供了一种制备糖化酶的方法，包括以下步骤：

1）用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2）培养重组菌株，诱导重组糖化酶基因的表达；以及

3）回收并纯化所表达的糖化酶。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞、大肠杆菌细胞或丝状真菌细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞（Pichic pastoris）GS115，得到重组菌株GS115/glaD3。

本发明还提供了上述糖化酶的应用。

本发明提供了一个新的糖化酶基因，其编码的糖化酶具有极好的耐热性，作用pH范围广，耐酸碱性，可在酒类和燃料酒精的生产、葡萄糖、果糖浆、有机酸、味精等食品工业的等多个行业中使用。

附图说明

图1重组糖化酶的SDS-PAGE分析，1：蛋白质Marker；2：毕赤酵母表达的未纯化的糖化酶GLAD3；3：纯化的糖化酶GLAD3；4：endoH脱糖基化后的糖化酶GLAD3

图2糖化酶GLAD3的最适pH曲线。

图3糖化酶GLAD3的pH稳定性曲线。

图4糖化酶GLAD3作用的最适温度曲线。

图5糖化酶GLAD3的热稳定性曲线。

具体实施方式

实验条件：

1、毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。可溶性淀粉购自Sigma公司，其它都为国产试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。

2、培养基：

（1）大肠杆菌培养基LB(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl,pH7.0)。

（2）MM固体培养基：1.34%YNB，0.00004%Biotin，0.5%甲醇，1.5%琼脂糖。

（3）MD固体培养基：1.34%YNB，0.00004%Biotin，2%葡萄糖，1.5%琼脂糖。

（4）BMGY培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%YNB，0.00004%Biotin，1%甘油(V／V)。

（5）BMMY培养基：除以0.5%甲醇代替甘油,其余成份均与BMGY相同。

说明：本发明中所用到重组遗传学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中未作详细介绍的技术，均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分来进行，包括：Sambrook等人,Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第3版.2001)；Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(1990)；和CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel等人编,1994)。

实施例1糖化酶编码基因glaD3的克隆

提取Gibberella sp.D3基因组DNA：

将液体培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中，加入2mL提取液，研磨5min，然后将研磨液置于50mL离心管中，65℃水浴锅裂解20min，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70%的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。

根据第15家族糖化酶基因的保守WGRPQRDG和YDAV(I/L)YQ(V)W序列设计合成了简并引物FP（5'-TGGGGHCGTCCDCARMGNGAYGG-3'），RP（5'-CCACTRRTARAYNGCRTCRTA-3'）（其中：Y=C/T,R=A／G,M=A／C,H=A／C/T,N=A／T/G／C）。

以Gibberella sp.D3总DNA为模板利用简并引物FP和RP进行PCR扩增，得到约800bp的片段，回收后与pEASY-T3载体相连，送北京三博生物技术有限公司进行序列测定。

根据测定序列结果，在NCBI的GenBank中利用BLASTX[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST]进行序列比对，初步判断该基因片段是糖化酶基因片段，并进行该片段的相似性研究。该片段长780bp，与Gibberella moniliformis来源的糖化酶的序列一致性最高为80%。根据测序得到的核甘酸序列，利用TAIL-PCR的方法，得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。将简并引物得到的核心片段与经TAIL-PCR得到的侧翼序列进行拼接得到glaD3全长基因。经序列分析表明，该基因DNA为一个全长2103bp（SEQIN No.3）的基因片段。

实施例2糖化酶基因的RT-PCR分析

提取Gibberella sp.D3的总RNA,利用反转录酶得到cDNA的一条链,然后设计恰当的引物（GLAD3 F：5'-ATGTACTTTGGGTCTTCTGCCTTTCTTCTCGGC-3'，GLAD3 R：5'-TCAAGACTGCCAGGTGTCATCGAGGGTAG-3′）扩增该单链cDNA,获得糖化酶的cDNA序列（SEQ IN No.4）,扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。

糖化酶的基因组DNA序列和cDNA序列分析结果表明,糖化酶GLAD3的结构基因全长2,103bp，cDNA长1,941bp。含有3个内含子，其序列分别为：245298bp,521-576bp和800-850bp。N端20个氨基酸为其预测的信号肽序列。glaD3 cDNA序列编码蛋白与GeneBank上的糖化酶序列进行同源比较，同Gibberella moniliformis的假定的糖化酶序列一致性最高，为78%。与Hypocrea Jecorina来源的糖化酶的一致性为72%。

实施例3重组糖化酶的制备。

将表达载体pPIC9进行双酶切（EcoRI+NotI），同时将编码糖化酶的基因glaD3通过PCR去掉信号肽序列并加入酶切位点EcoRI和NotI，所用引物为（D3 F-s：5'-CAAGAATTCCGACCAGCCTTCGATGAGAGGAGTCTCGTAC-3'；D3 R：5'-CAAGCGGCCGCTCAAGACTGCCAGGTGTCATCGAGG-3'），产物经EcoRI和NotI双酶切，得到编码成熟糖化酶的基因片段，并与表达载体pPIC9连接，获得含有糖化酶基因glaD3的重组质粒pPIC-GLAD3并转化毕赤酵母GS115，涂布MD平板，3天后待菌落长出，用灭过菌的牙签从长有转化子的MD板上挑取单菌落，按照编号先点到MM上，再点到相应编号的MD平板上30℃培养1~2天，至菌落长出。MD平板上能正常生长转化子接种于装有5mL BMGY培养基的离心管中，30℃、260rpm摇床培养48h后离心去上清，离心管中再加入1mL含有0.5%甲醇的BMMY培养基，在30℃、260rpm诱导培养48h后，离心取上清用于酶活性检测，从中筛选出具有糖化酶活性的转化子。获得重组毕赤酵母菌株GS115/GLAD3。

将酶活高的菌株重新接种于装有400mL BMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后,离心收集菌体。然后于200mL BMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导48h后，每隔24小时测定上清中糖化酶的活力并补加甲醇。SDS-PAGE结果（图1）表明，重组糖化酶在毕赤酵母中得到了表达。按照上述过程构建含未去除信号肽的序列的表达载体，重组毕赤酵母菌株，检测到的重组糖化酶表达量较低。

实施例4重组糖化酶的活性分析

在pH5.0，60℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL 1%可溶性淀粉，反应10min，沸水煮3min。至冰上冷却。释放的葡萄糖的量用葡萄糖氧化酶的方法测定。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol葡萄糖的酶量。

实施例5重组糖化酶GLAD3的性质测定

经纯化的糖化酶GLAD3在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH 2.0~8.0的0.1mol/L的McIlvaine缓冲液，pH 8.0-9.0的0.1mol/L Tris-HCl缓冲液,pH 9.0-12.0的0.1M glycine-NaOH缓冲液。纯化的糖化酶GLAD3在不同pH的缓冲体系，60℃下测定的pH适性结果（图2）表明：GLAD3的最适作用pH为5.0，在pH4.0-7.0能保持60%以上的酶活。

将酶液在不同pH值的缓冲液中于37℃下处理1h，再测定酶活性以研究酶的pH稳定性。结果表明（图3），GLAD3在pH范围为2.0-12.0间都很稳定。

最适温度的测定在pH5.0的0.1mol／L的McIlvaine缓冲液体系及不同的温度（30~80℃）下进行酶促反应。酶反应最适温度测定结果（图4）表明，GLAD3的最适作用温度60℃。

测定糖化酶在60℃和70℃条件下分别保温不同时间测定相对酶活力，绘制酶的热稳定性曲线。在60℃下，GLAD3热稳定性很好，处理60min后仍能保留近80%的酶活。70℃下处理10min，保留50%的酶活（图5）。

实施例6重组糖化酶GLAD3的水解生淀粉能力测定

将生淀粉（红薯，玉米，土豆），分别配置成1%(终浓度，pH 5.0)的底物.。同时，分别以底物（红薯，玉米，土豆）进行熟化处理，配置成1%(终浓度,pH 5.0)底物。4.5mL底物中加入500uL酶液，在40℃的水浴摇床反应4h，将反应产物进行12000rpm,5min离心处理。将其上清液进行100℃灭活，处理5min。通过葡萄糖试剂盒对其进行葡萄糖含量的检测。测定生淀粉的转化率。

生淀粉转化率（RDA）=A／B%

A：降解生淀粉的活力

B：降解熟淀粉的活力

GLAD3对玉米和红薯生淀粉的转化率为11.23%和7.56，对土豆生淀粉的转化率为5.64。具有很强的生淀粉水解能力。

本发明通过PCR首先获得了该糖化酶的DNA序列，然后根据DNA序列设计引物，通过反转录获得其cDNA序列，DNA和cDNA序列经比对发现除3个内含子区外完全一致。根据本领域的公知常识，真核生物蛋白的编码基因在转录后经过修饰（即内含子的剪切和外显子的拼接）才能够编码蛋白。而DNA序列不能在异源宿主中直接表达。所以本发明获得的cDNA序列及DNA在转录后经过剪切加工后形成的。

Claims (11)

1.一种可以降解生淀粉的糖化酶GLAD3，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2所示。

2.一种糖化酶基因glaD3，其特征在于，编码权利要求1所述的糖化酶。

3.如权利要求2所述的糖化酶基因glaD3，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

4.包含有权利要求2所述糖化酶基因序列的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，将去除信号肽的糖化酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，得到重组酵母表达载体pPIC9-glaD3。

6.包含权利要求2所述糖化酶基因的重组菌株。

7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述宿主细胞选自毕赤酵母细胞、酿酒酵母细胞、大肠杆菌、曲霉或木霉细胞。

8.根据权利要求7所述的重组菌株，其特征在于，所述宿主细胞为毕赤酵母细胞。

9.权利要求1酶GLAD3用于水解淀粉的应用。

10.权利要求2所述糖化酶基因glaD3用于水解淀粉的应用。

11.权利要求2所述糖化酶基因glaD3在工业化生产糖化酶中的应用。

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