CN102363774B - 一种具有宽pH范围的β-甘露聚糖酶BA-Man5A及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种宽pH范围的β-甘露聚糖酶BA-Man5A及其基因和应用。本发明提供了一种宽pH范围的β-甘露聚糖酶BA-Man5A，其具有如SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列，且本发明还提供了编码上述宽pH范围的β-甘露聚糖酶BA-Man5A的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3、或4所示，以及包含该基因的重组载体和重组菌株及其应用。本发明的β-甘露聚糖酶BA-Man5A在酸性、中性及碱性范围内均具有高活性，作用pH范围广，且具有强的耐酸碱性及很好的耐热性和优良的抗蛋白酶能力，可作应用于动物及鱼类的饲料、食品、医药、造纸等工业。根据本发明的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产甘露聚糖酶。

Description

一种具有宽pH范围的β-甘露聚糖酶BA-Man5A及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种具有宽pH范围的β-甘露聚糖酶BA-Man5A及其基因和应用。 

背景技术

甘露聚糖是植物半纤维素的主要成份，是以1，4-β-D-吡喃甘露糖苷键连接而成的线性多糖。β-甘露聚糖酶(β-1，4-D-mannan mannohydrolase，EC3.2.1.78)是一种能降解甘露聚糖主链的水解酶，属于半纤维素酶类。β-甘露聚糖酶来源广泛，许多微生物，植物和一些低等动物中都存在β-甘露聚糖酶(Millward-Sadler，et al FEMS Microbiol.Lett.1996.141：183-188)。微生物是β-甘露聚糖酶的重要来源，具有活力高、成本低、来源稳定、提取方便等明显优点。但天然菌株所产的甘露聚糖酶产量低，不能满足工业化生产的需要。采用微生物反应器生产β-甘露聚糖酶是目前获得该酶的最为理想的途径。β-甘露聚糖酶已被广泛应用于食品、饲料、保健和医药、造纸、纺织印染、石油开采、精细化工及生物技术等诸多领域，是一种新型的工业酶，具有很大的潜在应用价值。 

不同来源的甘露聚糖酶因性质上的差别，其应用范围和价值也不尽相同。国内外研究和报道较多的细菌产甘露聚糖酶多为中性或碱性酶，包括芽孢杆菌、假单胞菌、弧菌、放线菌等。而真菌来源的β-甘露聚糖酶多为酸性，它们作用的最适pH值在2.4～5.0。其中有些甘露聚糖酶能够pH 8.0，但高于pH 8.0后不再有活性(Dhawan and Kaur，Crit.Rev.Biotechnol.2007.27：197-216)。 

随着分子生物学的发展，部分甘露聚糖酶的编码基因已被克隆并进行了异源表达(Dhawan and Kaur，Crit.Rev.Biotechnol.2007.27：197-216；Moreira and Filho，Appl.Microbiol.Biotechnol.2008.79：165-178.)根据催化域氨基酸序列及结构的相似性，β-甘露聚糖酶多被划分为糖苷水解酶家族5，11或113(Henrissat and Bairoch，Biochem.J.1993.293：781-788)。 

本发明得到了一个新的甘露聚糖酶基因，其编码的甘露聚糖酶在酸性、中性及碱性条件下均具有高活性，并具有强酸碱稳定性，同时，该甘露聚糖酶具有较好的耐热性和极好的抗蛋白酶能力，可应用于动物及鱼类的饲料，应用于食品、医药等工业，同时还可以应用于造纸及纺织印染行业。 

发明内容

本发明的目的是提供一种具有宽pH范围的β-甘露聚糖酶BA-Man5A。 

本发明的另一目的是提供编码上述宽pH范围的β-甘露聚糖酶的基因ba-man5A。 

本发明的另一目的是提供包含上述宽pH范围的β-甘露聚糖酶基因的重组载体。 

本发明的另一目的是提供包含上述宽pH范围的β-甘露聚糖酶基因的重组菌株。 

本发明的另一目的是提供制备上述宽pH范围的β-甘露聚糖酶的方法。 

本发明的另一目的是提供上述宽pH范围的β-甘露聚糖酶的应用。 

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、食品、酿酒、造纸以及能源工业中应用新的β-甘露聚糖酶。从Bispora antennata CBS 126.38中获得了一种β-甘露聚糖酶BA-Man5A，其氨基酸序列如SEQID NO.1： 

MKLSTLLSIS SAVAIASAQQ PAYAQCGGVN WSGGSICVSG FYCFKQNEFY 

SQCIPGTATT                    60 

TAATTTATSG SPATSTIAPP VASITSFAKA AGNVFNINGK SQYFMGTNSY 

WIGFFTSNDD                   120 

VDLVFSHLAS TGLKVLRVWG FNDVTTIPSA GNVWFQSFVK GSTPTINTGA 

DGLQRLDYVV                   180 

ESAGKHGVSL IINFVNNWSD YGGMAAYRSY YNLSTTDQSQ 

WYTSAAVQAQ YQKYIATVVA        240 

RYKDNPTVFS WELANEPRCN GCATSVVTNW IKTTSAYIKS LDSKHMVCIG 

DEGFGIDGGT                   300 

DTSYPFGPGE GIDWVANLKI STIDFGTAHL YPESWGETDA WGTSWINIHA 

AAAKTIGKPV                   360 

ILEEYGTATK ANILVWQKAV MDSGTAADMY WQYGDTFSWG 

QTHNDGHSIY YGTAEYKTYV        420 

EDHAAAMAAK AV                432 

该酶氨基酸序列全长包括432个氨基酸和一个终止密码子，N端18个氨基酸为其预测的信号肽序列“MKLSTLLSIS SAVAIASA”。 

因此，成熟的β-甘露聚糖酶BA-Man5A的理论分子量为46.6kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2： 

QQPAYAQCGG VNWSGGSICV SGFYCFKQNE FYSQCIPGTA TTTAATTTAT 

SGSPATSTIA                   60 

PPVASITSFA KAAGNVFNIN GKSQYFMGTN SYWIGFFTSN DDVDLVFSHL 

ASTGLKVLRV                  120 

WGFNDVTTIP SAGNVWFQSF VKGSTPTINT GADGLQRLDY VVESAGKHGV 

SLIINFVNNW                  180 

SDYGGMAAYR SYYNLSTTDQ SQWYTSAAVQ AQYQKYIATV 

VARYKDNPTV FSWELANEPR       240 

CNGCATSVVT NWIKTTSAYI KSLDSKHMVC IGDEGFGIDG GTDTSYPFGP 

GEGIDWVANL                  300 

KISTIDFGTA HLYPESWGET DAWGTSWINI HAAAAKTIGK PVILEEYGTA 

TKANILVWQK                  360 

AVMDSGTAAD MYWQYGDTFS WGQTHNDGHS IYYGTAEYKT 

YVEDHAAAMA AKAV             414 

本发明还提供了编码上述β-甘露聚糖酶的基因ba-man5A。DNA全序列分析结果表明，β-甘露聚糖酶BA-Man5A结构基因全长1760bp。 

该酶的全基因序列如SEQ ID NO.3所示： 

atgaagctct ctactttgct gtctatttct agcgccgtcg ctattgcgag tgcacagcaa     60 

cccgcctacg cacaatgtga gctttctgct gggtcgagat aaagtttatg ctgatgaaat    120 

taaggtggag gagttaattg gagcggaggg agtatctgtg tttcgggctt ctattgcttc    180 

aaacaaaacg agttttattc tcagtgtatc ccaggaactg gtatgtttct ccagttaaat    240 

ttctattccg gctatcgaat aacgtggatt tctagcaact acaactgcag ccaccacaac    300 

cgctacaagt ggatccccag caacatccac cattgcacct ccggtagcca gcatcacaag    360 

cttcgccaaa gctgctggga atgtcttcaa tatcaatggg aaatcgcagt atttcatggg    420 

aacgaattcc tactggattg gtttctttac aagcaacgat gatgttgatc tcgttttcag    480 

ccatcttgcc tcagtatgtt cttatttacg ccataaaaca aacacaaagc tgatgtaata    540 

tcctagacag gtcttaaggt ccttcgtgtc tggggcttca acgatgtaac aaccattccc    600 

agcgcaggga atgtttggtt ccaatctttc gtcaagggtt ccacgccaac tataaacaca    660 

ggcgcagatg gtctgcaacg cctcgactat gtcgttgaat cagccggaaa acatggcgtc    720 

tcgctcatta taaactttgt caacaattgg gtaagcaaca tttttctttg ttccgaaacc    780 

aggaatcatc gcagcaaaca tctgccatct gccatccgca aatgaccccg aggcacaaac    840 

acgcccacac tcggcgagat ggagagcagt tcgtcaaaga gctagatact tcccccaaaa    900 

cacctagctt tcctctgagt ggctcggagg acattttgtt ttcttgcctc ctttcggctc    960 

ccctttcgtt gaaaaaactc cgtactaatt tgtttacagt ctgactatgg cggcatggcg    1020 

gcttacagat cttactacaa tctgtccacc actgatcagt ctcaatggta tacatccgct    1080 

gctgttcaag cccagtatca gaaatacatt gccactgttg tggcgagata caaggacaat    1140 

ccaacggtct tctcctggga actcgccaat gaacccagat gtaatggatg cgcaacctca    1200 

gttgtcacaa actggatcaa gactacatcc gcttatatca aatctctcga ctcaaaacac    1260 

atggtctgca ttggtgacga aggattcggg atcgatggtg gtactgacac gagctaccct    1320 

ttcgggccag gagaaggcat agattgggtc gcgaatctca aaatctcaac aattgatttt    1380 

ggtacagcac acttgtaccc cgaatcttgg ggagagacag atgcctgggg tactagttgg    1440 

ataaatatcc atgctgctgc tgccaaaact attgggaaac cagtgatttt ggaagagtat    1500 

gggactgcga ccaaagcaaa tattttggtt tggcagaaag ctgtcatgga tagcggaacg    1560 

gccgcggaca tgtattggca gtacggtgat actttctctt ggggccaaac tcataacgat    1620 

gggcactcga tttactatgg cactgccgag tacaaaactt atgtaagttt tccacttgtc    1680 

tttggttgca agcagctagc taatagtttt atttataggt tgaggatcat gcagctgcaa    1740 

tggccgcaaa agcagtttga                                                1760 

本发明提供了编码上述β-甘露聚糖酶的基因ba-man5A的cDNA序列，全长1299bp，如SEQ ID NO.4所示： 

atgaagctct ctactttgct gtctatttct agcgccgtcg ctattgcgag tgcacagcaa     60 

cccgcctacg cacaatgtgg aggagttaat tggagcggag ggagtatctg tgtttcgggc    120 

ttctattgct tcaaacaaaa cgagttttat tctcagtgta tcccaggaac tgcaactaca    180 

actgcagcca ccacaaccgc tacaagtgga tccccagcaa catccaccat tgcacctccg    240 

gtagccagca tcacaagctt cgccaaagct gctgggaatg tcttcaatat caatgggaaa    300 

tcgcagtatt tcatgggaac gaattcctac tggattggtt tctttacaag caacgatgat    360 

gttgatctcg ttttcagcca tcttgcctca acaggtctta aggtccttcg tgtctggggc    420 

ttcaacgatg taacaaccat tcccagcgca gggaatgttt ggttccaatc tttcgtcaag    480 

ggttccacgc caactataaa cacaggcgca gatggtctgc aacgcctcga ctatgtcgtt    540 

gaatcagccg gaaaacatgg cgtctcgctc attataaact ttgtcaacaa ttggtctgac    600 

tatggcggca tggcggctta cagatcttac tacaatctgt ccaccactga tcagtctcaa    660 

tggtatacat ccgctgctgt tcaagcccag tatcagaaat acattgccac tgttgtggcg    720 

agatacaagg acaatccaac ggtcttctcc tgggaactcg ccaatgaacc cagatgtaat    780 

ggatgcgcaa cctcagttgt cacaaactgg atcaagacta catccgctta tatcaaatct    840 

ctcgactcaa aacacatggt ctgcattggt gacgaaggat tcgggatcga tggtggtact    900 

gacacgagct accctttcgg gccaggagaa ggcatagatt gggtcgcgaa tctcaaaatc    960 

tcaacaattg attttggtac agcacacttg taccccgaat cttggggaga gacagatgcc    1020 

tggggtacta gttggataaa tatccatgct gctgctgcca aaactattgg gaaaccagtg    1080 

attttggaag agtatgggac tgcgaccaaa gcaaatattt tggtttggca gaaagctgtc    1140 

atggatagcg gaacggccgc ggacatgtat tggcagtacg gtgatacttt ctcttggggc    1200 

caaactcata acgatgggca ctcgatttac tatggcactg ccgagtacaa aacttatgtt    1260 

gaggatcatg cagctgcaat ggccgcaaaa gcagtttga                           1299 

其中，信号肽的碱基序列为：ATGAAGCTCT CTACTTTGCT GTCTATTTCTAGCGCCGTCGCTATTGCGAGTGCA。DNA序列与cDNA序列比对分析结果表明：β-甘露聚糖酶的结构基因，含有5个内含子，其序列分别为：80～126bp，221～275bp，494～546bp，751～999bp和1,662～1,718bp。 

该酶属于糖基水解酶第5家族。将β-甘露聚糖酶基因ba-man5AcDNA序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对发现，该基因与来源于Botryotinia fuckeliana一假定蛋白有最高的序列一致性为60％，而与来源于Aspergillus aculeatus的甘露聚糖酶序列一致性最高为57％，说明BA-Man5A是一种新的甘露聚糖酶。 

本发明还提供了包含上述β-甘露聚糖酶基因的重组载体，优选为pPIC9-ba-man5A。将本发明的β-甘露聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将β-甘露聚糖酶基因插入到质粒pPIC9上的SnaBI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-ba-man5A。 

本发明还提供了包含上述β-甘露聚糖酶基因的重组菌株，优选为重组毕赤酵母菌GS115/ba-man5A。 

本发明还提供了一种制备宽pH范围的β-甘露聚糖酶BA-Man5A的方法，包括以下步骤： 

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株； 

2)培养重组菌株，诱导重组β-甘露聚糖酶BA-Man5A的表达；以及 

3)回收并纯化所表达的β-甘露聚糖酶BA-Man5A。 

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/ba-man5A。 

本发明还提供了上述β-甘露聚糖酶的应用，优选该酶在水解β-甘露聚糖及在动物及鱼类的饲料、食品、医药、造纸等工业中的应用。 

本发明提供了一个新的甘露聚糖酶基因，其编码的甘露聚糖酶在酸性、中性及 碱性范围内均具有高活性，作用pH范围广，且具有强的耐酸碱性及很好的耐热性和优良的抗蛋白酶能力，可作应用于动物及鱼类的饲料、食品、医药、造纸等工业。根据本发明的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产甘露聚糖酶。 

附图说明

图1β-甘露聚糖酶基因ba-man5A在毕赤酵母中表达的β-甘露聚糖酶的SDS-PAGE分析，1、分子量标准；2、发酵培养上清；3、纯化的重组β-甘露聚糖酶；4、脱糖基后的β-甘露聚糖酶。 

图2本发明重组β-甘露聚糖酶的最适pH值。 

图3本发明β-甘露聚糖酶的pH稳定性。 

图4本发明β-甘露聚糖酶最适反应温度。 

图5本发明β-甘露聚糖酶热稳定性。 

图6本发明β-甘露聚糖酶化学试剂抗性。 

图7本发明β-甘露聚糖酶蛋白酶抗性。 

具体实施方式

试验材料和试剂 

1、菌株及载体：Bispora antennataCBS 126.38购自皇家荷兰生物科技研究所培养物保藏中心(Centraalbureau voor Schimmelcultures，Netherlands)，毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。 

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。角豆胶，瓜尔豆胶购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。 

3、培养基： 

(1)Bispora antennata CBS 126.38培养基为麦芽提取物培养基：在1L水中加入30g麦芽提取物(BD)，自然pH值，培养温度28℃。 

(2)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH 7.0)。 

(3)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(V/V)。 

(4)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH 4.0。 

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。 

实施例1 真菌Bispora antennata CBS 126.38产酶特性 

将Bispora antennataCBS 126.38经麦芽提取物培养基培养后，接种于诱导培养基中(0.2％MgSO₄·7H₂O，0.1％KH₂PO₄，0.1％CuSO₄·5H₂O，0.1％CaCl₂，0.5％蛋白胨，1％玉米芯粉，1％麸皮，0.5％魔芋粉，pH 5.0)，30℃培养3～4d，测定其产纤维素和半纤维素酶的活性。经测定该菌为高产甘露聚糖酶菌株。 

实施例2 真菌Bispora antennata CBS 126.38β-甘露聚糖酶编码基因ba-man5A的克隆 

将液体培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中，加入2mL提取液，研磨5min，然后将研磨液置于50mL离心管中，65℃水浴锅裂解20min，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。 

根据已发表的甘露聚糖酶基因保守序列设计合成了兼并引物P1，P2。以Bispora antennataCBS 126.38总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：95℃变性5min后冷却至4℃；然后94℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸30sec，32个循环后72℃保温10min。得到一约180bp片段，将该片段回收后送三博生物技术有限公司测序。 

根据测序得到的核甘酸序列设计TAIL-PCR引物U1，U2，U3；D1，D2，D3(见表1)。通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。测序正确的片断经拼接后获得全长基因。 

表1.甘露聚糖酶基因克隆的简并引物及TAIL-PCR特异性引物 

实施例3 β-甘露聚糖酶基因的RT-PCR分析 

提取Bispora antennata CBS 126.38的总RNA，利用反转录酶得到cDNA的一条链，然后设计恰当的引物M5AF和M5AR(表1)扩增该单链cDNA，获得甘露聚糖酶的cDNA序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。 

通过比较甘露聚糖酶酶的基因组序列和cDNA序列后发现该基因有5个内含子，cDNA长1299bp(SEQ ID NO.4)，编码432个氨基酸(SEQ ID NO.1)和一个终止密码子，N端18个氨基酸为其预测的信号肽序列，所测出的基因ba-man5A的成熟蛋白部分核甘酸序列与GeneBank上的甘露聚糖酶基因序列进行同源比较，该基因与来源于Botryotinia fuckeliana一假定蛋白有最高的序列一致性为60％，而与来源于Aspergillus aculeatus的甘露聚糖酶序列一致性最高为57％，证明从Bispora antennataCBS 126.38中分离克隆得到的编码甘露聚糖酶的基因为新基因。 

实施例4 重组β-甘露聚糖酶的制备 

利用反转录酶得到cDNA的一条链，设计恰当的引物M5AF、M5AF-S和M5AR(表1)扩增β-甘露聚糖酶蛋白的编码序列，将表达载体pPIC9进行双酶切(SnaBI+NotI)，同时将甘露聚糖酶编码的基因ba-man5A及甘露聚糖酶成熟蛋白的编码基因ba-man5A-1(不含信号肽序列)双酶切(SnaBI+NotI)，分别与表达载体pPIC9连接，获得含有Bispora antennata CBS 126.38甘露聚糖酶基因的重组质粒pPIC9-ba-man5A或pPIC9-ba-man5A-1并转化毕赤酵母GS115，涂布MD平板，3天后待菌落长出，用灭过菌的牙签从长有转化子的MD板上挑取单菌落，按照编号先点到MM上，再点到相应编号的MD平板上30℃培养1～2天，至菌落长出。MD平板上能正常生长转化子接种于装有5mL BMGY培养基的离心管中，30℃、260rpm摇床培养48h后离心去上清，离心管中再加入1mL含有0.5％甲醇的BMMY培养 基，在30℃、260rpm诱导培养48h后，离心取上清用于酶活性检测，从中筛选出具有甘露聚糖酶活性的转化子。获得重组毕赤酵母菌株GS115/ba-man5A和GS115/ba-man5A-1。 

将酶活高的菌株重新接种于装有400mL BMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于200mL BMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导48h后，每隔24小时测定上清中甘露聚糖酶的活力并补加甲醇。SDS-PAGE结果(图1)表明，重组甘露聚糖酶在毕赤酵母中得到了表达。诱导96小时后，经pPIC9-ba-man5A-1转化的转化子所产重组β-甘露聚糖酶摇床水平的表达量为78U/mL，相比之下，经pPIC9-ba-man5A化的转化子所产重组β-甘露聚糖酶摇床水平的表达量低于前者。 

取重组毕赤酵母菌株GS115/ba-man5A-1，接种于400mL BMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于200mL BMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清。SDS-PAGE结果(图1)表明，重组甘露聚糖酶在毕赤酵母中得到了表达。 

实施例5 重组β-甘露聚糖酶的活性分析 

纯化重组菌株GS115/ba-man5A和GS115/ba-man5A-1所产β-甘露聚糖酶，并采用DNS法对所产甘露聚糖酶进行活性分析。具体方法如下：在pH 6.0，70℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。 

甘露聚糖酶活性单位定义：在一定条件下，每分钟分解甘露聚糖生成1μmol还原糖所需的酶量为1个活性单位(IU)。 

实施例6 甘露聚糖酶BA-Man5A的酶学性质 

经纯化的甘露聚糖酶BA-Man5A在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH 2.2～8.0的柠檬酸-磷酸氢二钠系列缓冲液，pH 8.0～10.0Tris-HCl系列缓冲液及pH 10.0～12.0的Gly-NaOH系列缓冲液。纯化的甘露聚糖酶BA-Man5A在不同pH的缓冲体系，70℃下测定的pH适性结果(图2)表明：BA-Man5A的最适pH为6.0，在pH 3.0～8.0范围内，酶活性维持在60％以上，而在pH 2.0和10.0，酶活性均能维持在20％以上。 

将酶液在不同pH值的缓冲液中于37℃下处理60min，再测定酶活性以研究酶的pH稳定性。结果表明(图3)，在pH 4.0～11.0之间稳定，此酶具有较好的耐酸及耐碱特性。 

最适温度的测定在pH 6.0缓冲体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为 甘露聚糖酶在不同温度下处理不同时间，再在70℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图4)表明，其最适温度为70℃。酶的热稳定性试验表明(图5)，Man5A在60℃下稳定。 

实施例7 不同化学试剂甘露聚糖酶BA-Man5A酶活性的影响。 

在酶促反应体系中加入不同的化学试剂(终浓度为1或5mmol/L)，研究不同化学试剂对酶活性的影响。结果表明(图6)：1mM的Co²⁺，Cr³⁺，Ni²⁺或β-巯基乙醇对酶活有激活作用或没有影响；1mM的其它离子对酶活有轻微的抑制作用(＜20％)。5mM的Na⁺，Co²⁺，或β-巯基乙醇对酶活有轻微激活作用或没有影响；5mM的SDS对BA-Man5A有极强的抑制作用；5mM的其他离子对BA-Man5A有部分抑制作用(＜30％)。 

实施例8 甘露聚糖酶BA-Man5A的蛋白酶能力。 

将纯化的BA-Man5A(100μg ml^-1)与不同的蛋白酶，包括：糜蛋白酶(pH 7.8，25℃)，枯草杆菌蛋白酶A(pH 7.4，37℃)，胶原蛋白酶(pH 7.4，37℃)，蛋白酶K(pH 7.5，37℃)和胰蛋白酶(pH 7.6，25℃)，按1∶10(蛋白酶：Man5A，w/w)的比例混合温浴。温浴60分钟后，在pH 6.0及70℃条件下测定酶活性。实验结果表明甘露聚糖酶BA-Man5A用糜蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶A，胶原蛋白酶和胰蛋白酶处理60min后，甘露聚糖酶的活力均维持在90％以上。而对蛋白酶K的抗性较差，处理60min后酶活仅为原来的30％(图7)。 

Claims (9)

1.一种具有宽pH范围的β-甘露聚糖酶BA-Man5A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或2所示，其中所述宽pH范围为pH 4.0～11.0。

2.一种具有宽pH范围的β-甘露聚糖酶基因ba-man5A，其特征在于，编码权利要求1所述的β-甘露聚糖酶，其中所述宽pH范围为pH 4.0～11.0。

3.根据权利要求2所述具有宽pH范围的β-甘露聚糖酶基因ba-man5A，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.3或4所示。

4.包含权利要求2或3所述具有宽pH范围的β-甘露聚糖酶基因ba-man5A的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为pPIC9-ba-man5A，将权利要求2所述β-甘露聚糖酶基因ba-man5A插入到质粒pPIC9上的SnaBI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组载体pPIC9-ba-man5A。

6.包含权利要求2或3所述宽pH范围的β-甘露聚糖酶基因ba-man5A的重组菌株。

7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为毕赤酵母菌（Pichia pastoris）。

8.一种制备宽pH范围的β-甘露聚糖酶BA-Man5A的方法，其中所述宽pH范围为pH 4.0～11.0，其特征在于，包括以下步骤：

1）用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2）培养重组菌株，诱导重组β-甘露聚糖酶BA-Man5A的表达；以及

3）回收并纯化所表达的β-甘露聚糖酶BA-Man5A。

9.权利要求1所述宽pH范围的β-甘露聚糖酶BA-Man5A在降解甘露聚糖的应用。 

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