KR101276755B1

KR101276755B1 - 페니실리움 푸니쿨로섬의 ａｂｆＢ-2 유전자

Info

Publication number: KR101276755B1
Application number: KR1020077028351A
Authority: KR
Inventors: 쟝 마리 프랑수와; 쟝-뤽 빠루; 올리비에 뚜라쓰; 올리비에 노르
Original assignee: 아디쎄오 프랑스 에스에이에스
Priority date: 2005-05-04
Filing date: 2006-05-03
Publication date: 2013-06-20
Also published as: EP1877560B1; CA2606766C; US20100003367A1; JP5053999B2; KR20080011427A; MX2007013607A; US8003114B2; JP2008539707A; AU2006243137B2; CN101171335A; WO2006117481A1; AR053267A1; TWI367948B; CN101171335B; AU2006243137A1; HUE025458T2; RU2007140567A; FR2885365A1; EP1877560A1; ZA200709271B

Abstract

본 발명은 타입 B α-L-아라비노푸라노시다제를 코딩하고 셀룰로스 결합 도메인을 갖는 페니실리움 푸니쿨로섬의 abfB -2 유전자에 관한 것이다. 상기 효소 α-L-아라비노푸라노시다제는 동물용 영양 첨가제 및 사료에 사용되어 그 소화성 및 영양학적 가치를 개선시킬 수 있다.

페니실리움 푸니쿨로섬, abfB-2 유전자, 타입 B α-L-아라비노푸라노시다제

Description

페니실리움 푸니쿨로섬의 ａｂｆＢ-2 유전자{abfB-2 gene of Penicillium funiculosum}

본 발명은 페니실리움 푸니쿨로섬(Penicillium funiculosum)에서 분리한 abfB-2 유전자 및 상기 유전자가 코딩하는 α-L-아라비노푸라노시다제 B 활성을 갖는 ABFB-2 폴리펩티드에 관한 것이다.

페니실리움 푸니쿨로섬은 아스퍼질리아 패밀리에 속하는 탈라로미세스(Talaromyces) 이다. 공기오염 또는 수성 오염된 수많은 유기 기질에서 이 미생물이 분리되는 것은 이 진균이 놀라울 정도로 풍부한 가수분해 효소들을 가지고 있음을 나타낸다. 동물 사료에서 이들 효소 칵테일의 사용은 천연 유기 물질의 탈중합화에 기여하며 이들의 소화성을 개선시킨다. 따라서, WO　99/57325는 특히 동물 사료로 적합한 효소 혼합물을 생산하는 IMI378536로 지칭되는 페니실리움 푸니쿨로섬 균주를 개시한다. 그러나, 페니실리움 푸니쿨로섬에 의해 생산되는 이 효소 칵테일들은 생화학적으로 거의 규명되어 있지 않다. 실제, 크실라나제 및 베타-글루카나제와 같은 오직 제한적인 수의 효소 활성만이 그 수득된 발효액상에서 통상적 으로 측정되고 있을 뿐이다. 이들 활성은 칵테일내 존재하는 효소 집단의 단지 일부만을 반영할 뿐이다.

농작물에서 유래된 헤미셀룰로스분해 화합물은 식물 조직에서 셀룰로스 다음으로 많은 폴리사카라이드 저장량을 나타낸다. 이 그룹은 다양한 헤테로폴리사카라이드들이며, 대표적으로 크실란, 아라비난, 갈락탄, 글루칸 및 만난을 들 수 있다. 푸르푸랄형태의 아라비노스는 대표적으로 아라비난 및 아라비노크실란과 같은 헤테로폴리사카라이드에 존재한다. 아라비난은 아라비노푸라노스 잔기가 α-1-5 결합에 의해 연결된 폴리머이며, O-2 또는 O-3 위치에 하나 또는 두개의 아라비노스 잔기로 치환될 수 있다. 아라비노크실란은 a-L-아라비노푸라노실 잔기가 β-1-4-크실로피라노실 주사슬에 α-1-3 및 α-1-2 결합으로 연결된 것이다. 이들 측쇄에 아라비노스 잔기의 존재는 수많은 산업적 응용 예를 들면 동물 사료의 소화성 증강 등에 있어서 헤미셀로로스분해 화합물의 효소적 가수분해를 제한할 수 있다. α-L-아라비노푸라노사이드 결합을 분해하는 효소는 크실라나제와 상승적으로 작용하여 아라비노크실란 및 아라비난을 가수분해시킬 수 있다.

아라비나제 활성(엔도-, 엑소-아라비나제 및 주로 α-L-아라비노푸라노시다제 활성)은 따라서 크실라나제와 활동적으로 그리고 상승적으로 헤미셀룰로스분해 화합물의 탈중합에 기여할 수 있다. 헤미셀룰로스분해 및 펙틴 화합물은 식물에 존재하는 전체 탄수화물의 50%에 달하며 동물을 위한 주 에너지 공급원이다. 이들 화합물의 소화성 증강은 헤미셀룰로스분해 화합물내의 아라비노실 잔기의 치환도 감소와 상관관계가 있다(Brice, R.E., Morrison, I.M. 1982, Carbohydr. Res. 101: 93-100).

L-아라비노스 잔기간의 결합을 가수분해하는 효소는 박테리아 또는 사상균(filamentous fungi)과 같은 미생물에서 분리되었다. 아라비노시다제는 주로 α-L-아라비노푸라노시다제 (EC　3.2.1.55)로 이루어지며, 이는 L-아라비노크실란 또는 아라비난 및 아라비노갈락탄과 같은 화합물에서 유래하는 비환원성 a-L-아라비노푸라노실 잔기를 가수분해할 수 있다.

α-L-아라비노푸라노시다제 (EC　3.2.1.55)는 그 단백질 서열의 유사성에 따라 두 패밀리의 글리코시드 하이드로라제(GH　51 및 GH　54)로 분류된다. 이들 두 패밀리는 폴리사카라이드내 함유된 기질에 대한 이들의 특이성에 의해 구분된다. 첫번째 그룹(GH　51)은 α-1-5 결합 아라비노푸라노실 올리고사카라이드의 작은 선형 구조에만 작용하는 타입 A 아라비노푸라노시다제를 포함한다. 두번째 그룹은 아라비노푸라노실 올리고사카라이드 화합물내 함유된 α-1,5, α-1,3 및 α-1,2 결합 측쇄의 가수분해를 촉매하는 타입 B 아라비노푸라노시다제(GH 54)로 이루어진다.

상기 타입 B 아라비노푸라노시다제(ABFB)는 많은 박테리아 및 사상균에서 분리되었다. 아스퍼질리아속이 가장 대표적이며, 트리코더마, 페니실리움 및 푸사리 움속에서도 분리되었다.

WO　96/29416, WO　96/06935 및 US　5,989,887은 아스퍼질러스 나이거 아라비노푸라노시다제 유전자를 개시한다.

Gielkens 등. (Microbiology, 145, 735-741, 1999)은 아스퍼질루스 니둘란스 abfB 유전자를 개시한 바 있다.

WO　96/29416, WO　96/06935, WO　2004/018662 및 US　5,989,887는 아스퍼질루스 나이거 아라비노푸라노시다제 유전자를 개시하였다. 단백질 서열 정렬 결과 A. 나이거 abfB 단백질은 P. 푸니쿨로섬 ABFB-2 단백질과 50.9% 동일하였다. 이 출원에서는 동물 영양에 이들 폴리펩티드의 사용에 대한 필수적인 특징이 개시되어 있지 않다.

Clinche 등 (J. Agric. Food Chem., 45, 2379-2383, 1997)은 아스퍼질러스 테레우스에서 유래된, 양조학에서 응용될 수 있는 세개의 α-L-아라비노푸라노시다제에 대해 기술하고 있다.

아스퍼질러스 가와치 및 아스퍼질러스 아와모리 abfB 유전자는 Koseki 등. (J. of Bioscience and Bioengineering, Vol.　96, No.　3, 232-241, 2003)에 의해 개시된 바 있다. 이들 효소들은 일본 술 소주의 발효에 응용된다.

사상균 트리코더마 레세이의 abfB 유전자는 Margolles-Clark 등. (Applied and Environmental Microbiology, 3840-3846, 1996)에 의해 개시되었다

Panagiotou 등은 푸사리움 옥시스포룸에서 유래된 두개의 세포외 알파-L-아라비노푸라노시다제를 개시하였다(Can J Microbiol. 2003: 49(10): 639-4).

Carvallo 등은(Mycol. Res., 107 (4), 388-394, 2003) 페니실리움 푸르푸로게눔에서 유래된 B α-L-아라비노푸라노시다제를 개시하였다. 단백질 서열 정렬 결과 P.　푸르푸로게눔 abf-1 단백질은 P. 푸니쿨로섬 ABFB-2 단백질과 51.2% 동일하였다. 상기 간행물은 이 폴리펩타이드의 동물 영양에서의 사용에 필수적인 특징에 대해서는 아무것도 개시한 바 없다.

Sakamoto 등은 (FEBS Letters 560, 199-204, 2004) ABFB 활성과 구별되는 아라비나제 활성을 코딩하는 페니실리움 크리소게눔 abnx 유전자를 개시하였다.

그러나 이들 ABFB 효소는 동물 사료에 응용되는데 요구되는 적합한 성질을 가지고 있지 않다.

실제 동물 사료에 사용되기 위해서는 ABFB는 사료로 되기 위해 시행되는 처리를 견딜 수 있는 성질을 갖추어야 한다. 특히 사용되는 효소의 활성이 공정 온도 및 pH 조건에서 안정하여야 하며, 가능하다면 이들 사료의 제조 및 이들 사료를 섭취하는 동물의 소화시스템 내의 조건에서 적정하여야한다.

또한, 이들 효소들은 동물들이 효과적으로 사료를 소화할 수 있도록, 헤테로폴리사카라이드(아라비난, 아라비노크실란 및 아라비노갈락탄)에 대하여 광범위한 활성 스펙트럼(분해)를 가져야 한다. 이러한 사료의 소화성 증강은 그 영양학적 가치를 증가시킨다. 따라서, 증강된 특이성(입체 특이성, 비대칭 선택성), 천연 기질 아라비노크실란 및 아라비난에 대한 활성 또는 친화성을 가진 효소가 동물 사료로서 매우 적합하다.

또한, 아라비노푸라노실 결합을 가수분해하기 전에, 먼저 셀룰로스와 같은 복합 물질을 탈중합하는 것이 절대적으로 필요하다. 진균 셀룰로스분해효소(셀룰라제)는 통상적으로 fCDB 도메인(진균 타입 셀룰로스-결합 도메인)을 가지며, 이는 셀룰로스의 탈중합에 있어서 주도적인 역할을 한다.

본 발명은 동물 사료에 응용되기에 적합한 페니실리움 푸니쿨로섬 L-아라비노푸라노시다제 B (ABFB-2) 및 상기 효소를 코딩하는 유전자를 개시한다. 본 발명은 또한 동일한 촉매 성질을 보유하는 ABFB-2의 동족체, 변이체 및 단편에 관한 것이다.

바람직하게, 본 발명에 따른 ABFB 효소는 매우 산성의 적정 pH (pH 2.6)를 가지며, pH 1.5에서 그 활성의 55%를 보존한다.

또한, 유용하게도 본 발명에 따른 ABFB-2 효소는 진균 타입 셀룰로스-결합 도메인(fCBD)을 포함한다. 이러한 타입의 도메인은 다른 효소에서는 개시된 바 있으나, 진균 아라비노푸라노시다제에 대해서는 지금까지 전혀 개시된 바 없다. 페니실리움 푸니쿨로섬 ABFB-2 효소의 이 셀룰로스-결합 도메인의 기능을 실험적으로 검증하였다. 이 결합 도메인의 존재는 상기 효소의 기질에 대한 친화성을 증가시키며 결과적으로 불용성 셀룰로스의 분해를 증강시킬 수 있다.

따라서, 이러한 촉매적 성질 및 셀룰로스에 대한 친화성 때문에, 페니실리움 푸니쿨로섬 ABFB-2 효소는 동물 사료로서 응용되기에 특히 적합하다.

그러나 본 발명에 따른 효소는 다른 산업 또는 농업에 응용될 수도 있다. 예로서, 특히 과일 주스의 처리, 종이 생산, 헤미셀룰로스분해 바이오매스(biomass)의 연료 또는 화학제품으로의 전환, 발효에 의한 알코올 음료의 제조 등을 들 수 있다.

서열에 대한 설명

서열번호 1: 페니실리움 푸니쿨로섬 ABFB-2 유전자의 게놈 서열.

서열번호 2: 타입 B α-L-아라비노푸라노시다제 활성을 갖는 페니실리움 푸 니쿨로섬 ABFB-2 폴리펩티드의 서열.

서열번호 3: 페니실리움 푸니쿨로섬 ABFB-2의 fCBD 도메인.

서열번호 4: 페니실리움 푸니쿨로섬 ABFB-2 의 하부 복합체 도메인.

서열번호 5: 페니실리움 푸니쿨로섬 시아노밀에스테라제의 fCBD 도메인.

서열번호 6: 페니실리움 푸니쿨로섬 엔도-1,4-D-크실라나제의 fCBD 도메인.

서열번호 7: 페니실리움 푸니쿨로섬 크실라나제 셀로바이오하이드로라제의 fCBD 도메인.

서열번호　8: XbaI-abfB-2 PCR 프라이머.

서열번호　9: HindIII-abfB-2 PCR 프라이머.

본 발명은 하기 폴리펩티드에서 선택되는 하나의 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다:

- 서열번호: 2의 폴리펩티드,

- 서열번호: 2의 28 내지 400의 서열로 된 폴리펩티드,

- α-L-아라비노푸라노시다제 B활성을 갖는 서열번호: 2의 폴리펩티드 단편,

- α-L-아라비노푸라노시다제 B활성을 가지며, 서열번호: 2의 폴리펩티드와 80% 이상의 동일성을 나타내는 폴리펩티드.

본 발명은 또한 하기 폴리뉴클레오티드에서 선택되는 α-L-아라비노푸라노시다제 B 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다:

- 서열번호: 1의 268 내지 1470의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,

- 서열번호: 1의 349 내지 1470의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,

- 제1항의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.

본 발명은 또한 서열번호: 1의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호: 1의 서열에 상보적인 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

본 발명은 또한

- 숙주 유기체에서 기능적인 프로모터;

- 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드; 및

- 상기 동일한 숙주 유기체에서 기능적인 종결 서열;을 전사 방향으로 포함하는 발현 카세트에 관한 것이다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 발명에 따른 발현 카세트를 포함하는 벡터에 관한 것이다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 본 발명에 따른 발현 카세트 및/또는 본 발명에 따른 벡터에 의해 형질전환된 숙주 유기체에 관한 것이다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 숙주 유기체는 효모 또는 사상균에서 선택된다.

바람직하게, 상기 숙주 유기체는 페니실리움 푸니쿨로섬 균주이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리펩티드, 본 발명에 따른 숙주 유기체 또는 본 발명에 다른 숙주 유기체의 발효액을 포함하는 동물용 영양 첨가제에 관한 것이다.

바람직하게 상기 영양 첨가제는 액상 또는 분말 형태이다.

본 발명의 다른 측면은 동물용 영양 기초사료 및 본 발명에 따른 동물용 영양 첨가제를 포함하는 사료에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 ABFB 폴리펩티드 또는 본 발명에 따른 숙주 유기체를 동물용 영양 첨가제 또는 사료의 제조에 사용하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 ABFB 폴리펩티드 또는 본 발명에 따른 숙주 유기체를 아라비노푸라노실-올리고사카라이드 화합물의 α-L-아라비노푸라노실 결합의 가수분해에 사용하는 방법에 관한 것이다.

폴리펩티드

본 발명은 α-L-아라비노푸라노시다제B 활성을 갖는 ABFB 폴리펩티드에 관한 것이다. 바람직하게 이들 폴리펩티드는 페니실리움 푸니쿨로섬에서 분리된다.

본 발명에서 "α-L-아라비노푸라노시다제 B"는 아라비노푸라노실-올리고사카라이드 화합물내 포함된 측쇄의 α-1,5, α-1,3 및 α-1,2 결합의 가수분해를 촉매하는 α-L-아라비노푸라노시다제(EC　3.2.1.55) 타입 B(GH　54)를 의미한다.

본 발명의 폴리펩티드는 동물 영양에 사용되기 적합하다.

본 발명에서 "동물 영양에 사용되기 적합한 폴리펩티드"는 그 특성이 동물 영양에 적합한 폴리펩티드를 의미한다. 동물 영양에 사용되는데 필수적인 특성은 특히 효소가 활성인 pH 및 온도이다. 실제 동물의 소화관 시스템의 pH는 산성이며, 따라서 L-아라비노스 잔기를 가수분해하는 활성이 보존되기 위해서는 반드시 이 pH에서 효소의 활성이 유지되어야 한다. 또한, 영양 첨가물 또는 동물 사료에 효소를 조건화하는 것은 실온보다 훨씬 높은 온도 및 처리가 관련된다. 따라서 사용되는 효소 활성은 이러한 공정 조건, 특히 온도 조건에 안정하여야 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 폴리펩티드는 산성 pH, 예를 들면 4.5 이하, 바람직하게는 4 이하에서 α-L-아라비노푸라노시다제 활성을 나타낸다. 또한 본 발명의 일 실시예에 따르면 본 폴리펩티드는 pH 1.5 내지 3.5에서 적정 α-L-아라비노푸라노시다제 활성을 갖는다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 본 폴리펩티드는 실온보다 훨씬 높은 온도에서 α-L-아라비노푸라노시다제 활성을 나타낸다. 바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드는 30℃내지 70℃, 보다 바람직하게는 40℃ 내지 60℃의 온도에서 적정 α-L-아라비노푸라노시다제 활성을 갖는다.

페니실리움 푸니쿨로섬 균주 IMI378536의 α-L-아라비노푸라노시다제 B는 서열번호: 2에 나타내었다.

바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 당화(glycosylated)되어 있다. 서열번호 2:의 폴리펩티드는 특히 123번의 아미노산 및 127번의 아미노산에 N-당화 부위를 갖는다. 바람직한 실시예에서, 서열번호: 2의 폴리펩티드의 123 및 127번의 아스파라긴 잔기가 당화되어 있다.

페니실리움 푸니쿨로섬의 α-L-아라비노푸라노시다제 B는 상기 진균에 의하여 그 세포외 환경으로 분비되는 효소이다. 서열번호: 2의 폴리펩티드는 따라서 27개 아미노산의 시그널 펩티드를 포함한다. 본 발명은 또한 시그널 펩티드 분해후 수득되는 성숙 폴리펩티드를 제공한다. 특히 본 발명은 서열번호 2의 28번 내지 400번 사이의 서열을 갖는 폴리펩티드를 제공한다. 다른 실시예에서, 서열번호: 2의 폴리펩티드의 시그널 펩티드는 이종 숙주 유기체에 의한 서열번호:2의 폴리펩티드 발현 및 분비용 이종 시그널 펩티드로 대체될 수 있다.

본 발명은 또한 α-L-아라비노푸라노시다제 B 활성을 갖는 서열번호: 2의 폴리펩티드 단편을 제공한다.

본 발명에서 폴리펩티드의 "단편"은 그것이 유래한 폴리펩티드 전체가 아니라 일부를 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 따라서 본 발명은 서열번호: 2의 폴리펩티드의 100개 이상, 200개 이상 또는 300개 이상의 아미노산 단편을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다.

이러한 서열번호:2의 폴리펩티드 단편은 그 또한 α-L-아라비노푸라노시다제활성을 보존한다. 따라서 본 발명은 서열번호:2의 생물학적으로 활성인 폴리펩티드 단편에 관한 것이다. 본 발명에서 "생물학적으로 활성인 단편"은 그것이 유래된 폴리펩티드의 기능을 보존하는 폴리펩티드 단편을 의미한다. 생물학적으로 활성인 서열번호: 2의 폴리펩티드 단편은 따라서 페니실리움 푸니쿨로섬 ABFB-2 폴리펩티드의 기능을 보존한다. 이러한 생물학적 활성인 단편은 α-L-아라비노푸라노시다제 B 활성을 가진다. 바람직하게 본 발명에 따른 ABFB 단편은 셀룰로스-결합 도메인을 가진다. 바람직한 실시형태에서, 상기 셀룰로스 결합 도메인은 서열번호: 3에 기재된 서열을 갖는다. 바람직하게, 이들 단편은 pH 2.6에서 적정 α-L-아라비노푸라노시다제 활성을 나타낸다.

상기 폴리펩티드 단편의 제조 방법 및 α-L-아라비노푸라노시다제 B 활성을 측정하는 기술은 본 기술분야에 잘 알려져 있다.

본 발명은 또한 L-아라비노푸라노시다제 B 활성을 가지며, 서열번호: 2의 폴리펩티드와 90% 이상의 동일성을 나타내는 폴리펩티드에 관한 것이다. 바람직하게 이들 폴리펩티드는 서열번호: 2의 폴리펩티드와 동일한 성질, 특히 동일한 촉매 성질을 갖는다. 바람직하게 이들 폴리펩티드는 페니실리움 푸니쿨로섬의 다른 균주 또는 다른 사상균에서 분리된다. 또는 이들 폴리펩티드는 예를 들면 지정부위 돌연변이(site-directed mutagenesis) 기술에 의해 수득될 수 있다.

본 발명은 또한 서열번호: 2의 폴리펩티드와 동일한 아미노산을 최소한 80%, 90%, 95%, 98% 및 바람직하게는 최소한 99% 갖는 폴리펩티드에 관한 것이다.

본 발명에서 동일한 아미노산들이란 두 서열 간에 불변이거나 변경되지 않는 아미노산을 의미한다. 이러한 폴리펩티드는 서열번호: 2의 폴리펩티드와 비교시 최소한 하나의 아미노산이 결실, 부가 또는 치환된 것이다.

본 발명은 또한 서열번호: 2의 폴리펩티드와 최소한 90%, 95%, 98% 및 바람직하게는 최소한 99%의 유사성을 나타내는 폴리펩티드에 관한 것이다.

본 발명에서 유사성은 단백질 서열간 또는 핵산 서열간 닮음의 척도를 의미한다. 이러한 폴리펩티드는 서열번호: 2의 폴리펩티드와 비교시 최소한 하나의 아미노산이 결실, 부가 또는 치환된 것이다. 두 서열간 유사성의 정도는 서열 동일성 퍼센트 및/또는 서열-보존적 치환에 기초하여 점수로 정량화된다.

폴리펩티드간 동일성 및 유사성의 정도를 측정하고 동정하는 방법은 본 기술분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어 정렬 프로그램 AlignX (Clustal W algorithm)인 Vector NTi　9.1.0(Invitrogen INFORMAX, http://www.invitrogen.com)를 사용할 수 있다. 바람직하게 디폴트 파라미터가 사용된다.

본 발명에 따른 폴리펩티드는 천연 환경으로부터 분리 또는 정제된다. 상기 폴리펩티드는 다양한 방법으로 제조될 수 있다. 상기 제조 방법으로는 특히 천연적으로 이들 폴리펩티드를 발현하는 세포와 같은 천연 공급원에서의 정제, 적합한 숙주 세포에 의한 재조합 폴리펩티드의 제조 및 이들의 후속 정제, 화학적 합성에 의한 제조 또는, 최종적으로 이들 다양한 접근의 조합이다. 이러한 다양한 제조 방법은 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 따라서 본 발명의 ABFB 폴리펩티드는 페니실리움 푸니쿨로섬에서 분리할 수 있다. 다른 실시예에서 본 발명의 ABFB 폴리펩티드는 본 발명에 따른 ABFB 폴리펩티드를 발현하는 재조합 숙주 유기체에서 분리할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질, 재조합 단백질 또는 키메라 단백질에 관한 것이다. 여기에서 "폴리펩티드"는 개질된 단백질 및 폴리펩티드를 지칭한다.

본 발명에 따른 폴리펩티드는 ABFB 활성을 갖는다. 바람직하게 본 발명에 따른 폴리펩티드는 셀룰로스-결합 도메인을 갖는다. 바람직한 실시예에서, 상기 셀룰로스 결합 도메인은 서열번호: 3의 서열을 갖는다. 바람직하게, 상기 폴리펩티드는 pH 2.6에서 적정 α-L-아라비노푸라노시다제 B 활성을 나타낸다. 바람직하게, 상기 폴리펩티드는 50℃에서 적정 α-L-아라비노푸라노시다제 B 활성을 나타낸다.

폴리뉴클레오티드

본 발명은 또한 α-L- 아라비노푸라노시다제 B 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 폴리뉴클레오티드는 페니실리움 푸니쿨로섬 α-L- 아라비노푸라노시다제 B를 코딩한다.

본 발명에 있어서, "폴리뉴클레오티드"는 단일-가닥 뉴클레오티드 사슬 또는 이의 상보적 DNA 또는 RNA 가닥, 또는 상보적 또는 게놈 DNA 타입의 이중 가닥 뉴클레오티드 사슬을 의미한다. 바람직하게 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA 타입, 특히 이중 가닥 DNA이다. "폴리뉴클레오티드"는 또한 개질된 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 그 천연 환경에서 분리 또는 정제한다. 바람직하게, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989)에 기재된 바와 같은 일반적인 종래의 분자 생물학적 기술 또는 화학 합성에 의해 제조될 수 있다.

첫번째 실시형태로서, 본 발명은 서열번호: 1의 268 내지 1470의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 2의 페니실리움 푸니쿨로섬 ABFB-2 효소를 코딩한다.

두번째 실시형태로서, 본 발명은 서열번호: 1의 349 내지 1470의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이 폴리뉴클레오티드는 시그널 펩티드 분해후 성숙 페니실리움 푸니쿨로섬 ABFB-2 효소를 코딩한다.

본 발명은 서열번호: 1의 268 내지 1470의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및/또는 서열번호: 1의 349 내지 1470의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 및 바람직하게는 최소한 99% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 이들 폴리뉴클레오티드는 α-L-아라비노푸라노시다제 B 활성을 코딩한다. 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드는 페니실리움 푸니쿨로섬 α-L-아라비노푸라노시다제 B를 코딩한다.

동일한 뉴클레오티드는 두 서열간에 불변이거나 변경되지 않는 뉴클레오티드를 의미한다. 이러한 뉴클레오티드는 기준 폴리뉴클레오티드와 비교시 최소한 하나의 뉴클레오티드가 결실, 부가 또는 치환된 것이다.

본 발명은 또한 서열번호: 1의 268 내지 1470의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및/또는 서열번호: 1의 349 내지 1470의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 및 바람직하게는 최소한 99%의 유사성을 나타내는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 이들 폴리뉴클레오티드는 α-L-아라비노푸라노시다제 B 활성을 코딩한다. 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드는 페니실리움 푸니쿨로섬 α-L-아라비노푸라노시다제 B를 코딩한다.

본 발명에서 유사성이란 단백질 또는 핵산 서열간 닮음의 척도를 의미한다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 기준 폴리뉴클레오티드와 비교시 최소한 하나의 뉴클레오티드가 결실, 부가 또는 치환된 것이다. 두 서열간 유사성의 정도는 서열 동일성 퍼센트 및/또는 서열-보존적 치환에 기초하여 점수로 정량화된다.

핵산서열간 동일성 및 유사성의 정도를 측정하고 동정하는 방법은 본 기술분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어 정렬 프로그램 AlignX (Clustal W algorithm)인 Vector NTi　9.1.0(Invitrogen INFORMAX, http://www.invitrogen.com)를 사용할 수 있다. 바람직하게 디폴트 파라미터가 사용된다.

바람직하게 기준 폴리뉴클레오티드와 일정 정도의 유사성을 나타내는 폴리뉴클레오티드는 기준 서열의 기능을 보유한다. 본 발명의 경우 폴리뉴클레오티드는 α-L-아라비노푸라노시다제 B 활성을 코딩한다.

본 발명은 또한 서열번호: 1의 268 내지 1470 서열의 폴리뉴클레오티드및/또는 서열번호: 1의 349 내지 1470 서열의 폴리뉴클레오티드과 선택적으로 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 선택적 혼성화는 평균 스트린전시, 바람직하게는 높은 스트린전시의 조건하에서 수행된다. 이들 폴리뉴클레오티드는 α-L-아라비노푸라노시다제 B 활성을 코딩한다. 바람직하게 이들 폴리뉴클레오티드는 페니실리움 푸니쿨로섬 α-L- 아라비노푸라노시다제 B를 코딩한다.

본 발명에서 "선택적으로 혼성화할 수 있는 서열"은 배경 노이즈보다 상당히 높은 수준으로 기준 서열과 혼성화하는 서열을 의미한다. 선택적으로 혼성화할 수 있는 서열과 기준 서열 간의 상호작용에서 발생되는 시그널의 수준은 일반적으로 배경 노이즈를 생성하는 다른 DNA 서열들의 상호작용에서 발생되는 시그널보다 약 10배, 바람직하게 100배 이상 강력하다. 선택적 혼성화를 가능하게 하는 엄격한 혼성화 방법은 본 분야에서 잘 알려져 있다. 일반적으로 혼성화 및 세척 온도는 주어진 pH 및 이온 강도에서 기준 서열의 Tm 보다 최소한 5℃ 더 낮다. 통상적으로 혼성화 온도는 15 내지 50 뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드에 대해서는 30℃ 이상, 50 뉴클레오티드 초과의 폴리뉴클레오티드의 경우 60℃ 이상이다. 예시로서, 혼성화는 하기 버퍼에서 수행된다: 6×SSC, 50　mM Tris-HCl (pH　7.5), 1　mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% BSA, 500　mg/ml 변성 새먼 스펌 DNA. 예를 들어 세척은 차례로 2×SSC, 0.1% SDS 버퍼의 낮은 스트린전시에서, 0.5×SSC, 0.1% SDS 버퍼의 중간 스트린전시에서, 0.1×SSC, 0.1% SDS 버퍼의 높은 스트린전시에서 수행된다. 혼성화는 물론 본 기술분야의 기술자에 잘 알려져 있는 기타 일반적 방법에 따라 수행될 수 있다(특히 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989 참조). 바람직하게, 상기 폴리뉴클레오티드는 기준 서열의 기능을 보존하는 기준 폴리뉴클레오티드와 선택적으로 혼성화한다. 본 경우에서, 서열번호: 1의 268 내지 1470의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및/또는 서열번호: 1의 349 내지 1470의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 선택적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드는 α-L-아라비노푸라노시다제 B 활성을 코딩한다.

본 발명은 통상적으로 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 유전자 코드의 축퇴성(degeneracy)으로 인해, 다양한 폴리뉴클레오티드가 동일한 폴리펩티드를 코딩할 수 있다.

본 발명은 또한 서열번호: 1의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 서열번호: 1의 폴리뉴클레오티드는 페니실리움 푸니쿨로섬 abfB -2 유전자의 플랭킹 해독틀(flanking the open reading frame (ORF))서열을 포함한다. 이들은 특히 abfB -2 유전자의 프로모터 및 종결 서열이다. abfB 유전자는 특히 페니실리움 푸니쿨로섬 또는 기타 다른 사상균에서의 과발현을 위한 이들의 동종성 조절 서열에서 발현될 수 있다.

다른 실시 형태에서, abfB 유전자는 예를 들면 박테리아, 효모 및 진균 등의 다양한 숙주 유기체에서 발현될 수 있다. abfB 유전자는 본 발명의 서열번호: 1의 프로모터의 조절하 또는 이종 프로모터의 조절하에서 숙주 유기체 내에서 발현될 수 있다.

발현 카세트(Expression cassettes)

본 발명의 한 실시형태에 따라, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 본 기술분야에 공지된 클로닝 기술을 사용하여 발현 카세트내로 삽입된다. 이러한 발현 카세트는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 서열의 전사 및 번역에 필요한 요소를 포함한다.

바람직하게, 본 발현 카세트는 두가지 요소를 포함하며, 이들은 숙주 세포가 폴리펩티드 및 이 발현을 조절하는데 필요한 요소를 생산하게 한다.

본 발현 카세트는 전사 방향으로

- 숙주 유기체에서 기능적인 프로모터;

- 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드; 및

- 상기 동일한 숙주 유기체에서 기능적인 종결 서열;을 포함한다.

어떠한 형태의 프로모터 서열도 본 발명에 따른 발현 카세트내에 사용될 수 있다. 프로모터의 선택은 특히 관심 유전자의 발현을 위해 선택된 숙주 유기체에 따라 결정된다. 어떤 프로모터는 구성적 발현을 가능하게 하는 반면, 다른 프로모터는 반대로 유도성이다. 진균에서 기능적인 프로모터 중 특히 아스퍼질러스 니듈란스 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제에 대한 프로모터(Roberts et al., Current Genet. 15: 177-180, 1989)를 들 수 있다. 박테리아에서 기능적인 프로모터 중에 특히 T7 박테리아파지 RNA 폴리머라제에 대한 프로모터(Studier et al., Methods in enzymology 185: 60-89, 1990)를 들 수 있다. 효모에서 기능적인 프로모터 중, GAL1 유전자에 대한 프로모터 (Elledge et al., Proc Natl Acad Sciences, USA. 88: 1731-1735, 1991) 또는 S.　 cerevisiae GAL4 및 ADH 프로모터를 들 수 있다. 이러한 모든 프로모터는 문헌에 기재되어 있으며 본 분야에 잘 공지되어있다.

페니실리움 푸니쿨로섬에서의 발현을 위해, 발현 카세트는 예를 들면 히스톤 H4.B 프로모터, 아스파틸산 프로테아제 프로모터 또는 csl13 프로모터(WO　00/68401)에서 선택할 수 있다.

본 발명에 따른 발현 카세트는 추가적으로 예를 들면 숙주 유기체에 의해 생산되는 폴리펩티드를 배출시키는 시그널 서열 또는 조절 인자 등의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 발현에 필요한 기타 다른 서열을 포함할 수 있다. 특히 발현 카세트내로 삽입된 코딩 서열의 발현 수준을 증가시키는 조절 서열을 사용하는 것도 가능하다. 본 발명에 따르면, 특히 전사 활성화제("인핸서")와 같이, 프로모터와 코딩서열 사이에 위치되는 조절 프로모터 서열, 기타 조절 서열을 조합하여 사용할 수 있다.

광범위한 종결 서열이 본 발명에 따른 발현 카세트에 사용될 수 있으며, 이들 서열은 전사의 종결 및 mRNA의 폴리아데닐화를 허용한다. 선택된 숙주 유기체에 기능적인 어떠한 종결 서열도 사용될 수 있다.

페니실리움 푸니쿨로섬에서의 발현을 위해, 발현 카세트는 예를 들면 히스톤 H4.B 종결자, 아스파틸산 프로테아제 종결자 또는 csl13 종결자(WO　00/68401)에서 선택할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 발현 카세트, 바람직하게는 벡터 내로 삽입된 본 발명에 따른 발현 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

벡터

본 발명은 본 발명에 따른 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명에 따른 하나의 발현 카세트를 포함하는, 숙주 유기체를 형질전환시키기 위한 복제 또는 발현 벡터에 관한 것이다. 본 발명의 벡터는 특히 플라스미드, 코스미드(cosmid), 박테리오파지 또는 바이러스이며 이들내에 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 발현 카세트가 삽입되어 있다. 이들 벡터를 구축하는 기술 및 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 이들 벡터내로 삽입시키는 기술은 본 기술분야에 잘 공지되어 있다. 일반적으로, 숙주 세포내에서 그 자신을 유지하거나, 자기 복제, 또는 특히 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현을 유도하기 위해 전파할 수 있는 벡터를 사용할 수 있다. 당업자는 형질 전환될 숙주 유기체 및 사용되는 형질전환 기술에 따라 적절한 벡터를 선택할 수 있다.

본 발명의 벡터는 특히 본 발명에 따른 벡터의 복제 및/또는 숙주유기체내에서 본 발명에 따른 폴리펩티드의 발현을 위해, 숙주 유기체를 형질전환시키는 데 사용된다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이며, 하기 단계를 포함한다:

- 본 발명에 따른 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터 및/또는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드로 숙주 유기체를 형질전환시키는 단계,

- 숙주 유기체에 의해 제조된 폴리펩티드를 분리하는 단계.

숙주 유기체

본 발명은 또한 숙주 유기체를 형질전환시키는 방법에 관한 것이며, 이는 상기 숙주 유기체내에 본 발명에 따른 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 발현 카세트 또는 벡터를 통합하는 것을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 숙주 유기체의 게놈내로 통합될 수 있으며, 숙주 유기체내에서 안정적으로 복제될 수 있다. 숙주 유기체의 형질전환시키는 방법은 본 기술분야에 잘 공지되어 있으며, 문헌에 상세히 기재되어 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 발현 카세트 또는 벡터로 형질전환된 숙주 유기체에 관한 것이다. 발현 숙주 유기체는 본 발명에 있어서 특히 박테리아, 효모, 및 진균류에서 선택되는 모든 모노-세포 또는 복수-세포, 저급 또는 고급 유기체를 지칭한다. 발현 숙주 유기체는 비인간 유기체를 의미한다. 바람직하게, 상기 효모는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris ), 사카로마이세 스 세레비시아(Saccharomyces cerevisae), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 및 스와니오마이세스 오시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis) 중에서 선택된다. 진균류는 아스퍼질러스 및 페니실리움, 바람직하게는 페니실리움 푸니쿨로섬, 트리코더마 레세이 ( Trichoderma reesei ), 아스퍼질러스 나이거 , 아스퍼질러스 아와모리 , 아스퍼질러스 가와치 및 트리코더마 코닌키(Trichoderma koningii) 중에서 선택된다. 바람직한 실시형태로서, 상기 숙주 유기체는 본 발명에 따른 ABFB 폴리펩티드가 발현 또는 과발현되는 페니실리움 푸니쿨로섬 균주이다.

벡터의 구축, 숙주 유기체의 형질전환 및 이러한 유기체에서 이종 단백질을 발현시키는 기술들은 문헌에 상세히 기재되어 있다(Ausubel F.M. et al., "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1 and 2, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, 1989; T.　Maniatis, E.F.　Fritsch, J.　Sambrook, Molecular Cloning A laboratory Handbook, 1982).

음식 첨가제 및 사료

본 발명은 또한 α-L-아라비노푸라노시다제 B 활성을 제공하는 음식 첨가제에 관한 것이다. 이러한 형태의 효소 활성의 섭취는 음식의 소화성을 증강시키고 그 영양학적 가치를 증가시킨다.

본 발명에서 영양 첨가제는 음식의 소화성 또는 영양학적 특성을 개선하기 위하여, 음식에 소량으로 첨가한 물질을 지칭한다. 동물을 위한 영양 첨가제는 예를 들면, 비타민, 미네랄염, 아미노산 및 효소 등을 포함한다.

일반적으로 동물을 위한 영양첨가제는 본 발명에 따른 폴리펩티드, 본 발명에 따른 숙주 유기체, 또는 본 발명에 따른 숙주 유기체의 발효액을 포함한다. 따라서, 본 발명에 따른 α-L-아라비노푸라노시다제 B 활성을 갖는 폴리펩티드는 페니실리움 푸니쿨로섬 균주 또는 동물용 영양 첨가제 제조를 위한 재조합 숙주 유기체에서 분리 또는 정제된다. 또는 AbfB 폴리펩티드를 생산하는 페니실리움 푸니쿨로섬 균주 또는 숙주 유기체를 직접 동물용 영양 첨가제 제조에 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 페니실리움 푸니쿨로섬 균주 또는 숙주 유기체의 배양 상등액 또는 발효액을 동물에 대한 영양 첨가제의 제조에 사용한다. 상기 실시형태는 특히 ABFB 폴리펩티드가 상기 페니실리움 푸니쿨로섬 균주 또는 숙주 유기체에 의해 분비되는 경우 유리하다. 보통 이 배양 상등액은 농출 또는 동결건조되어 동물용 첨가제의 제조에 사용된다.

또한 본 발명은 ABFB 효소를 제조하는 방법에 관한 것이며, 이는 하기 단계를 포함한다:

a) 페니실리움 푸니쿨로섬 균주 또는 본 발명에 따른 형질 전환된 숙주 유기체를 ABFB의 발현을 유도하는 조건하에서 배양하는 단계,

b) ABFB 효소를 포함하는 배양 상등액을 분리하는 단계.

상기 배양 상등액 또는 발효액은 이후 농축 또는 동결 건조되어 음식 첨가제 또는 사료의 제형화에 사용된다.

만약 숙주 유기체가 ABFB 효소를 배양 배지에 분비하지 않는 경우에는 세포를 개방하고 세포 추출물을 정제하는 단계가 부가적으로 필요할 수 있다.

본 발명의 영양 첨가제는 α-L-아라비노푸라노시다제 B 활성을 포함하며, 또한 비타민, 아미노산 또는 미네랄염과 같은 다른 영양 물질을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 첨가제는 사료의 소화성을 증가시키고, 따라서 곡물 사료(밀, 보리, 옥수수, 귀리, 호밀 등) 및 오일케이크(oilcake; 콩, 해바라기, 평지씨(rapeseed) 등)에 기초한 식단의 영양적 가치를 훨씬 더 증가시킬 수 있다.

본 발명은 또한 영양 기초사료 및 본 발명에 따른 영양 첨가제를 포함하는 사료에 관한 것이다. 이들 사료는 보통 본 발명에 따른 첨가제가 포함된 식사 또는 과립의 형태로 제공된다.

본 발명에서 사료는 동물을 위해 음식으로 제공되는 모든 것을 의미한다.

상기 사료는 본 발명에 따른 폴리펩티드, 본 발명에 따른 숙주 유기체, 또는 본 발명에 따른 숙주 유기체의 발효액을 포함한다.

동물 번식 증강용으로 사용하기 위해서, 이들 사료는 보통 영양 기초사료 및 영양 첨가제를 포함한다.

본 발명에서 영양 기초 사료는 동물 사료의 주부분을 구성하는 것들을 의미하며, 예로서 곡류, 단백질, 및 동물 및/또는 식물 기원의 지방으로 이루어져 있다.

동물용 영양 기초사료는 동물에 공급하기에 적당하며 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 보통 이들 영양 기초 사료는 예를 들면, 옥수수, 밀, 완두콩 및 콩 등을 포함한다. 이들 영양 기초사료는 다양한 동물 종의 필요를 충족시킨다. 이러한 동물 기초사료는 이미 비타민, 미네랄염 및 아미노산과 같은 영양 첨가제들을 포함한 것일 수 있다.

바람직한 실시형태에서, 본 발명은 단위(monogastric) 동물용, 특히 가금 및 돼지용 사료에 관한 것이다. 가금은 특히 암닭, 브로일러(broilers), 칠면조 및 오리를 포함한다. 돼지는 특히 막 성장을 마친 돼지나 새끼돼지를 포함한다.

도 1은 진균 셀룰로스-결합 도메인(fCBD)의 조직도이고,

도 2는 5　mM PNPAF 존재하 40℃에서 McIlvaine 버퍼 시리즈(pH　2.2 내지 8)내의 ABFB-2 효소의 적정 pH의 측정을 나타낸 것이며,

도 3은 5　mM PNPAF 존재하 적정 pH에서 상기 ABFB-2 효소의 적정온도를 측정한 것이며,

도 4는 pH 2.6 및 50℃에서, 0.5　mM 내지 5　mM PNPAF 존재하 ABFB-2 효소에 대한 반응속도 상수 K_m 및 V_m을 산출한 것을 도시한 것이며(1/Vi　=　f(1/S),

도 5는 P.　 funiculosum 성장 조건에 따른 abfB -1 및 abfB -2 유전자의 상이한 발현을 도시한 것이며,

도 6은 반응 상등액에서 ABFB-2 효소가 없어지는 반응 속도를 도시한 것으로서, 세포에 대한 상기 효소의 부착은 ABFB-의 자유 잔여 α-L-아라비노푸라노시다제 B 활성을 측정함으로써 모니터된다.

ABFB-2 유전자 구조 분석

ABFB-2는 일반적으로 이 효소들이 잘 보전되어 있음에 불구하고 사상균의 다른 ABFB 효소들과 62% 이하의 동일성을 나타낸다. 이러한 동일성의 차이는 두개의 구별되는 영역에 의해 설명된다. 상기 영역은 N-말단의 아라비노푸라노시다제에 특이적인 영역(10 내지 341 아미노산 위치) 및 SMART (Simple Modular Architectural Research Tool)분석에 의해 예측되었던 C-말단의 진균 타입 셀룰로스 결합 도메인 fCBD(367 내지 400 아미노산 위치)이다. 문헌에 따르면 이러한 형태의 결합 도메인은 엔도글루카나제(EC 3.2.1.4), 셀로바이오하이드로라제(EC 3.2.1.91)(엑소글루카나제) 또는 크실라나제(EC 3.2.1.8)와 같은, 셀룰로스 분해에 관련된 효소들에서 일반적으로 발견된다. CBD 도메인이 아라비노푸라노시다제에 대해 발견된 것은 이것이 처음이다.

구조적(1차 서열) 관점에서 보면, 셀룰라제 및 크실라제는 두개의 구별되는 도메인, 즉 촉매 도매인과 CBD 도메인이 프롤라인 및/또는 하이드록실화 아미노산(세린 및 트레오닌)이 풍부한 소위 낮은 복잡성의 짧은 서열로 연결되어 구성된다. 셀룰로스-결합 도메인은 많은 진균 셀룰라제에서 연구되었으며, 이들은 36개까지의 아미노산 서열이 단백질의 N-말단 (cbh-II 또는 egl2) 또는 C-말단 (cbh-I, egl1 또는 egl5)에 존재하는 특징이 있다. 또한 이 형태의 도메인은 도 1과 같이 4개의 시스테인의 보존을 특징으로 하고, 이는 디설파이드 가교를 형성한다.

페니실리움 푸니쿨로섬 ABFB-2의 예측된 fCBD 도메인은 4개의 보존된 시스테인을 포함하는 34개의 아미노산으로 구성된다 (THWGQCGGSGYSGPTSCVAPYACTTANPYYAQCL).

하이드록실기를 갖는 아미노산(10개의 트레오닌 및 6개의 세린)이 풍부한 낮은 복잡성의 특징적인 짧은 23개의 아미노산 서열 (STSPGSHTTSTTLTTITSTTAVS)이 상기 도메인에 선행한다. 페니실리움 푸니쿨로섬에서, 이러한 형태의 도메인은 3개의 다른 효소, 엔도-1,4-크실라나제(endo-1,4-xylanase), 셀로바이오하이드로라제(cellobiohydrolase) 및 페룰산 에스테라제(ferulic acid esterase ;시아노밀 에스테라제)에서 개시되었다. 이들 4개의 도메인의 정렬은 fCBD내에서 4개의 시스테인의 보존 및 위치를 확인해준다.

페니실리움 푸니쿨로섬에서 알려진 fCBD의 정렬

이러한 형태의 결합 도메인은 셀룰로스분해 효소(셀룰라제)에서 광범위하게 개시되었다. 공지된 fCBD서열에 대한 블라스트 정렬에 의한 fCBD의 1차 서열의 분석 결과 트리코더마 레세이 및 아스퍼질러스 나이거 유래의 셀로바이오하이드로라제 타입 I 및 II의 셀룰로스 결합 도메인과 엔도글루카나제 타입 I, II 및 V의 도 메인과 매우 강한 동종성이 있다. 상기 도메인의 기능에 있어서 필수적인 것으로 동정된 3개의 티로신 잔기, 및 아스파라긴 및 글루타민 잔기는 ABFB-2 서열내에 보존된다. 구조/기능 관계에 대한 연구 결과 이러한 형태의 도메인은 이들 효소들의 기질에 대한 결합 친화성을 증가시킴으로써, 셀룰로스의 탈중합에 주도적인 역할을 하는 것으로 나타났다(Linder, M. & Teeri, T. T. (1997) The roles and function of cellulose-binding domains, J. Biotechnol. 57 15-28). T. 레세이에서, 셀로바이오하이드로라제 I (CBH I)은 fCBD 도메인이 없는 경우 촉매활성은 보존되었으나, 셀룰로스에 대한 효소의 결합 친화성은 상당한 정도로 경감되었다.

이러한 형태의 결합 도메인이 사상균내 아라비노푸라노시다제 타입 B에서 동정된 것은 처음이다. 이러한 결합 도메인의 존재는 이 효소의 기질에 대한 친화성을 증가시키고, 그 결과 불용성 셀룰로스의 분해를 증강시킨다.

L-아라비노푸라노시다제 B 활성의 분석

0.15% 프로바소이 및 0.3% 셀룰로스로 구성된 혼합 첨가제가 첨가된 M2 배지에 P.　 푸니쿨로섬을 40시간 배양한 후, L-아라비노푸라노시다제 활성을 측정하였다. 시료는 배양 48시간 및 72시간 후 채집하였다. 배양은 유효용량 50ml의 엘렌마이이어 200ml 플라스크에서 수행하였다. 활성은 50　mM 소듐아세테이트 버퍼(pH　5) 내 5　mM 파라-니트로페닐-(L-아라비노푸라노사이드)(PNPAF)를 가수분해하는 것으로 측정하였다. 50㎕의 배양 상등액을 50℃에서 15분간 미리 가열한 250㎕의 기질과 함께 인큐베이션하였다. 0.5　M NaOH 500㎕을 가하여 반응을 중지시켰다. p-니트로페닐(PNP)의 방출을 몰흡광상수 17　000　M^-1.cm^-1로 405　nm에서 측정하였다. 효소 단위는 전술한 조건하에서 분당 1 μmol의 PNPAF를 가수분해시키는 효소량으로 정의한다. P.　 푸니쿨로섬의 배양액에 대하여, 배양 48시간 후 20　mU.ml^-1 및 배양 72시간 후 112　mU.ml^-1의 값을 수득하였다. 이 결과는 아스퍼질러스 나이거 활성에 대한 문헌과 일치하며, 상기 균주의 활성은 배양에 사용한 유도제에 따라 100 내지 600　mU.ml^-1 로 개시되어 있다.

P.　 푸니쿨로섬 abfB -2 ORF 클로닝 및 사카로마이세스 세레비시아 에서의 형질전환

P.　 푸니쿨로섬의 게놈 DNA를 출발물질로 하여, abfB -2 유전자를 한쌍의 프라이머(HindIII-abfB-2/XbaI-abfB-2)를 사용하여 PCR로 증폭하였다. 하기 PCR 조건이 적용되었다(94℃ 30초; 62℃ 30초; 72℃에서 1분 30초) 30사이클. 1215 bp의 PCR 산물을 시판 벡터pGEM-T(tm)easy내로 클로닝하였다.

PCR 프라이머쌍의 서열

XbaI-abfB-2: 5'-TCTAGAATGACGTCCAAACATAGTT-3'

HindIII-abfB-2: 5'-AAGCTTCTAGAGACATTGAGCGTA-3'

1215 bp의 HindIII/XbaI단편을 벡터 pGEM-T에서 절단해내어 셔틀벡터(plac195-PGK/CYC1)내 HindIII/XbaI 부위에 서브클로닝하였다. 이종 발현을 위하여 abfB -2 유전자는 포스포글리세레이트 키나제를 인코딩하는 유전자의 구성 PGK 프로모터 (S.　 cerevisiae) 및 사이토크롬 C 옥시다제 활성을 코딩하는 유전자의 CYC1 종결자(S.　 cerevisiae)의 조절하에 두었다. 이 새로운 발현 벡터를 pOT-02로 지칭하였다.

ura　3-52 옥소트로피를 갖는 CEN.PK　122 균주에서 유래된 클론, S.　 세레비시 아 균주 JF　#1194 (CEN.PK113-5D)를 상기 발현 벡터 pOT-02로 형질전환하였다(리튬 아세테이트/열 충격법). 형질전환된 균주는 우라실이 없는 선택 플레이트상에서 표현형 상보성(phenotype complementation)에 의해 선택되었다(URA3 marker).

6개의 형질전환체을 선택하여 그 배양 상등액내 아라비노푸라노시다제 B 활성의 존재 유무를 시험하였다. 형질전환체는 50ml의 우라실이 없는 최소 배지(야생형 대조 균주 제외)내에서 24시간 동안 배양되었다. 아라비노푸라노시다제 활성은 전술된 방법으로 배양 상등액에서 분석되었다.

적정 pH 의 측정

P.　 푸니쿨로섬에서 유래된 아라비노푸라노시다제 B 활성을 코딩하는 abfB -2 유전자를 S.　 세레비시아내로 클로닝하였다. 수개의 형질전환체에서 아라비노푸라노시다제 B 활성의 존재를 확인한 후, 한 형질전환체를 선택하여 성장 24시간 후 배 양 상등액에서 ABFB 활성을 분석하였다. 배양은 유효용량 50ml의 엘렌마이이어 200ml 플라스크에서 수행하였다. 활성은 McIlvaine 버퍼 시리즈(pH　2.2 내지 8.0)내 5　mM 파라-니트로페닐-(L-아라비노퓨라노사이드)(PNPAF)의 존재하에서 측정되었다. 80㎕의 배양 상등액을 40℃에서 10분간 미리 가열한 320㎕의 기질과 함께 인큐베이션하였다. 1　M Na₂CO₃ 1　ml을 가하여 반응을 중지시켰다. 방출된 p-니트로페닐(PNP)을 405　nm에서 측정하였다. 1 효소 단위는 전술한 조건하에서 분당 1 μmol의 PNPAF를 가수분해시키는 효소량으로 정의한다. 활성 곡선을 도 2에 도시하였다. ABFB-2 는 pH 2.6에서 적정 활성을 나타내었으며, pH 3.8에서 그 활성의 55%를 보존한다. 아라비노푸라노시다제에 대해 이렇게 낮은 적정 pH가 관찰된 것은 처음이며 또한 50mH HCL 용액내 pH 1.5에서 68% 활성을 나타내었다.

적정 온도의 측정

동일한 프로토콜을 사용하여 ABFB-2 활성의 적정 온도를 측정하였다. 상기 효소를 pH　2.6 McIlvaine 버퍼내에서 각 온도에서 10분간 인큐베이션하였으며, 그 활성 곡선은 도 3에 도시하였다.

ABFB에 대한 적정 온도 범위는 문헌에 40 내지 60℃로 기재되어 있다. P.　 푸 니쿨로섬 ABFB-2는 50℃에서 적정 활성을 나타내었다. 이 효소에 대한 적정 pH 및 적정 온도(pH　2.6 및 50℃)가 선택되는 경우, ABFB-2 활성은 pH　5의 아세테이트 버퍼 및 40℃에서 측정된 활성보다 20배 더 높다(305　mU 대 15　mU).

K _m 및 V _m 의 측정

ABFB-2의 두 반응속도 상수 (K_m 및 V_m)은 상기 전술한 적정 조건하에서 시간에 따른 PNPAF의 가수분해를 측정하여 결정하였다.

기질 (PNPAF)농도는 pH 2.6 버퍼 내에서 0.5 내지 5　mM로 하였다. 가수분해 반응속도는 50℃에서 10분간 모니터 되었다. 양 효소에 대한 운동 속도 상수를 얻기 위해, 수득된 결과를 이중 반전법(Lineweark and Burk)에 따라 처리하고 그 결과를 도 4에 도시하였다.

상기 속도 상수는 적정 조건하에서 PNPAF의 가수분해에 의해 측정된 것이다. ABFB-2에 대한 Km치는 0.7　mM이었다. 비교로, 문헌에는 이런 타입의 효소의 Km치는 연구된 진균의 종 및 속에 따라 0.05 내지 1.2　mM로 다양하다. ABFB-2는 전술한 조건하에서, 최대 가수분해 속도 (V_m)가 328　mol PNPAF/효소mol/분이었다.

ABFB -2 효소의 분자량 결정

ABFB-2 효소의 분자량을 결정하기 위하여, 최소배지내 돌연변이주(S.　 cerevisiae)의 성장에서 유래된 배양 상등액을 200배 농축하고, 100℃에서 5분간 끓여 변성시킨 후, 이후 SDS-폴리아크릴아미드겔에 위치시켰다.

야생주의 경우, 세포외 단백질의 양이 극히 적었다. 돌연변이주의 경우 ABFB-2 효소를 배양 상등액내로 분비하였다. 이는 S.　 세레비시아 세포외 단백질의 기저치에 비할 때 상당히 현저하다. ABFB 효소에 대해 수득된 전기영동 밴드는 확산성이었으며 이는 이 효소가 매우 강하게 당화되었음을 제시한다.

분자량의 결정은 크기 마커 SeeBlue (Invitrogen)를 사용하여 수행되었다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.

[표 1] ABFB-2 분자량(단위:KDa)

	예측치 MW	겔상에서 측정된 MW
ABFB-2	41	55

알고리즘 벡터 NTi에 의해 예측되었던 분자량과 변성 SDS-PAGE겔상에서 전기영동 이동에 의해 얻어진 분자량을 비교하였다. SDS-PAGE겔상의 효소 분자량이 더 크다. 또한 겔상에서 확산성 전기영동 밴드의 가시화를 기초해 볼 때 이 효소가 고도로 당화되었을 것을 제시한다(O 및 N 당화). 당화는 발현 유기체내 단백질 프로세싱 동안 일어난다.

페니실리움 푸니쿨로섬 abfB -2 유전자 발현 프로파일 분석

페니실리움 푸니쿨로섬은 B α-L-아라비노푸라노시다제를 코딩하는 두개의 유전자를 갖고 있다: abfB-1 및 abfB-2 유전자. 다양한 페니실리움 푸니쿨로섬 배양 조건하에서 이들 유전자의 발현 프로파일을 비교하였다.

P.　 푸니쿨로섬을 셀룰로스분해 및 헤미셀룰로스분해 효소를 유도하는 조건(타입 M2 산업 성장 배지) 및 유도하지 않는 조건(최소 글루코스 배지 M0)에서 배 양하였다. 40시간 성장시킨 후, 배양을 중지하고, 균사를 회수하고, 전체 RNA를 추출하였다. RNA의 양과 질을 260　nm 및 280　nm (260/280 비율 >　1.8)에서 흡광도를 측정하여 평가하였다. B-타입 아라비노푸라노시다제 (ABFB-1 및 ABFB-2)활성을 코딩하는 전사체 수준을 상기 두 조건(M0 및 M2)에서 각각 실시간 정량 PCR에 의해 정량화하였다.

P.　 푸니쿨로섬 튜블린을 코딩하는 유전자(tub-1)를 상기 두 조건하 대조로서 사용하였다. 상기 유전자는 세포의 통합성을 유지하는데 필수적인 구조 단백질을 코딩한다. 상기 유전자는 대조 유전자로 통상적으로 사용되는데 사용된 배양 조건에 관계없이 일정한 수준의 발현을 나타내기 때문이다(유비쿼투스).

정량적 PCR을 위해 특정 프라이머를 각 유전자(abfB-1, abfB-2 및 tub-1)에 대하여 디자인하였다. 두 성장 조건(M0 및 M2)에 대해, 2　㎍의 전체 RNA가 역전사되었다. 역전사에서 유래된 상보적 DNA의 희석 시리즈에 대해 수행하여 표적 유전자의 증폭에 대해 적정 조건을 결정하였다(정량적 PCR 방법의 제약 및 이들 프라이머 쌍의 효율에 대해). 얻어진 정상화 결과를 표 2 및 도 5에 나타내었다.

[표 2] P.　 푸니쿨로섬 성장 조건의 함수로서 abfB-1 및 abfB-2 유전자의 상이한 발현치

	M0	M2
abfb_1	1	107
abfb_2	1	1.27

셀룰로스분해 및 헤미셀룰로스 분해 활성을 코딩하는 유전자들의 전사조절은 이미 개시되었다. 이들 유전자의 발현은 미생물이 배양되는 탄소원 및 질소원의 성질 및/또는 복합성에 매우 의존적이다. 이들 유전자는 글루코스 존재시 매우 높은 전사 억제가 일어나는 것이 보고되었다. 이러한 조절은 이들 유전자의 프로모터에 특이적으로 결합하여 그 전사를 차단하는 이화 대사억제 단백질 CreA을 통해 수행된다. PCR에 의한 abfB-1 및 abfB-2 메신저 정량화 실험에서, 글루코스(M0) 조건하에서 이들 두 유전자의 발현 수준은 매우 낮았다. 이는 문헌과 일치하며, 문헌은 이들 유전자가 바람직하지 않은 조건(셀룰로스 분해 및/또는 셀룰로스분해 기질이 존재하지 않는)하에서 기저 수준의 발현을 나타낸다고 개시하였다. M0 조건에 대해 수득된 결과는 문헌과 일치한다. abfB -1 유전자와 달리 abfB-2 유전자의 발현은 산업적 조건하에서 유도되지 않는다. 이는 페니실리움 푸니쿨로섬에 의해 생산된 효소 칵테일은 산업적 조건하에서 진균에 의해 얻어지는 ABFB-2의 발현을 수득하거나 또는 생산된 효소 칵테일에 외인성 ABFB-2를 추가함으로써 개선할 수 있음을 제시한다.

fCBD 의 기능성 결정

fCBD 도메인의 기능을 검증하기 위하여, 상기 ABFB-2 효소의 결합 시험을 미세결정 셀룰로스상에서 수행하였다.

상기 효소를 4℃에서 100　mM Tris-HCl 버퍼(pH 7.5)내 0.5% 미세결정 셀룰로 스와 부피내 부피로 혼합하였다. 단백질의 부착은 이미 결정된 적정 가수분해 조건하에서 PNPAF 존재하 잔여 아라비노푸라노시다제 B 활성을 측정함으로써 모니터하였다. 효소와 셀룰로스를 다양한 기간동안 접촉시킨 후, 혼합물을 원심분리하고 ABFB-2 단백질 농도 감소를 상등액에서의 아라비노푸라노시다제 B 활성을 측정함으로써 모니터하였다. 결합 시험은 미세결정 셀룰로스를 포함하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 실험 조건하에서 ABFB-2 효소를 포함하는 대조 반응을 수행하였다. 미세결정 셀룰로스 존재하에서 상기와 동일한 반응조건하에 ABFB-1 효소를 인큐베이션하여 제2의 대조 시험을 수행하였다. 얻어진 결과를 도 6에 도시하였다.

P. 푸니쿨로섬에서 유래된 효소 ABFB-2의 진균 타입 셀룰로스 결합 도메인(fCBD)이 기능적임을 확인할 수 있었다. 상기 효소의 부착은 접촉 10분 및 45분 후 모니터되었다. 10분 동안 인큐베이션한 후, 초기 존재하였던 상기 효소의 전체량의 70%가 미세결정 셀룰로스에 부착되었다. 45분 후에는, 반응에 존재한 전체 효소의 80%가 상기 셀룰로스에 부착되었다. 이러한 결과는 접촉 반응의 평형이 매우 신속하게 도달함을 의미하며 상기 대부분의 효소의 부착 반응 속도가 처음 10분내에 상기 기질에 대하여 1차 반응법칙에 따름을 보여준다.

SEQUENCE LISTING <110> ADISSEO FRANCE SAS <120> abfB-2 gene of Penicillium funiculosum <130> IP20071014/FR <140> <141> <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1639 <212> DNA <213> Penicillium funiculosum <220> <221> promoter <222> (1)..(267) <220> <221> TATA_signal <222> (167)..(172) <220> <221> CDS <222> (268)..(1470) <220> <221> sig_peptide <222> (268)..(348) <220> <221> misc_binding <222> (1366)..(1467) <223> fCBD cellulose binding domain <220> <221> misc_feature <222> (1285)..(1353) <223> Domain of low complexity <220> <221> terminator <222> (1471)..(1639) <220> <221> polyA_signal <222> (1620)..(1625) <400> 1 ctagtgattg atcaagcacc atacccctct tccattctgg gataatatga cggcatatac 60 gttacatcag catacaatat agtcaaatta tcggttaaaa ggatgtattt gaattatttg 120 aattatccga ttttaaagac tccttcatag tgtgcgttag aagcagtata aagcccgctt 180 caatagctag cagttgaatc gatacccact cgaacaacat ttttgaaacg caattgatac 240 ttgtatagtc tcacaaaacg attcaac atg acg tcc aaa cat agt ttc gaa cga 294 Met Thr Ser Lys His Ser Phe Glu Arg 1 5 gcc ggc ata ctt gca ttg ggc ctt att gct acg agc tct ctt gtt gcc 342 Ala Gly Ile Leu Ala Leu Gly Leu Ile Ala Thr Ser Ser Leu Val Ala 10 15 20 25 gcc ggc cct tgt gac atc tac tct tca ggt ggc aca cca tgc gtt gcc 390 Ala Gly Pro Cys Asp Ile Tyr Ser Ser Gly Gly Thr Pro Cys Val Ala 30 35 40 gcg cac agt acc act cgc gca ctc tat gat gct tat act ggc ccg cta 438 Ala His Ser Thr Thr Arg Ala Leu Tyr Asp Ala Tyr Thr Gly Pro Leu 45 50 55 tac caa gtg aca cgg agt tct gat agc agc aag aaa gat atc gcg cca 486 Tyr Gln Val Thr Arg Ser Ser Asp Ser Ser Lys Lys Asp Ile Ala Pro 60 65 70 ttg gcc gcc ggc ggc gtt gct aat gct gcc acg caa gac tcc ttt tgt 534 Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala Ala Thr Gln Asp Ser Phe Cys 75 80 85 tca gga aca acc tgc ctc ata tct atc atc tac gac caa tct gga aag 582 Ser Gly Thr Thr Cys Leu Ile Ser Ile Ile Tyr Asp Gln Ser Gly Lys 90 95 100 105 ggg aac cat ctc acc caa gct ccg aaa ggt ggc tgg agt gga cct gga 630 Gly Asn His Leu Thr Gln Ala Pro Lys Gly Gly Trp Ser Gly Pro Gly 110 115 120 cca aat ggt tca gat aat tta tcc agt gcg acc gcc gcc cca atc tat 678 Pro Asn Gly Ser Asp Asn Leu Ser Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ile Tyr 125 130 135 ctg aac gga caa aag gcg tac ggc gtg ttt att gca cct ggt gac ggc 726 Leu Asn Gly Gln Lys Ala Tyr Gly Val Phe Ile Ala Pro Gly Asp Gly 140 145 150 tac cgt aat gat aag act tct ggt ata gcc aca ggc gat caa ccc gag 774 Tyr Arg Asn Asp Lys Thr Ser Gly Ile Ala Thr Gly Asp Gln Pro Glu 155 160 165 gga atg tac gcc atc ttt gac gga acg cac tac aac ggc ggc tgc tgc 822 Gly Met Tyr Ala Ile Phe Asp Gly Thr His Tyr Asn Gly Gly Cys Cys 170 175 180 185 ttc gac tac ggt aat gct gaa acc agt ggt acc gat aca ggc gct ggc 870 Phe Asp Tyr Gly Asn Ala Glu Thr Ser Gly Thr Asp Thr Gly Ala Gly 190 195 200 cac atg gag gct atc tac ttc ggt aac tgt aat gtc tgg ggt tct ggt 918 His Met Glu Ala Ile Tyr Phe Gly Asn Cys Asn Val Trp Gly Ser Gly 205 210 215 tct gga tca ggc cct tgg att atg gct gat ttg gag aat ggt ctc ttc 966 Ser Gly Ser Gly Pro Trp Ile Met Ala Asp Leu Glu Asn Gly Leu Phe 220 225 230 tcc ggt tat aac gcc aaa caa aac acc gcc gat gca tcc atc aac tgg 1014 Ser Gly Tyr Asn Ala Lys Gln Asn Thr Ala Asp Ala Ser Ile Asn Trp 235 240 245 cga ttc gtc act gca att gtg aag ggc gag cca aac aat tgg gca atc 1062 Arg Phe Val Thr Ala Ile Val Lys Gly Glu Pro Asn Asn Trp Ala Ile 250 255 260 265 cgt ggt ggc aat gcc caa tct ggt tct ctc tcg aca tac tat aat ggc 1110 Arg Gly Gly Asn Ala Gln Ser Gly Ser Leu Ser Thr Tyr Tyr Asn Gly 270 275 280 ata cgc cca tca ggc tac aat ccg atg cac aaa gaa ggc gcc att atc 1158 Ile Arg Pro Ser Gly Tyr Asn Pro Met His Lys Glu Gly Ala Ile Ile 285 290 295 ctc ggc acg ggt ggt gac aac agt aac ggt gct caa ggc act ttt tac 1206 Leu Gly Thr Gly Gly Asp Asn Ser Asn Gly Ala Gln Gly Thr Phe Tyr 300 305 310 gag ggt gtg atg act tct ggg tac cct tct gac tca act gag aat tcc 1254 Glu Gly Val Met Thr Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Ser Thr Glu Asn Ser 315 320 325 gtt caa gcc aat atc gtt gcc gcc ggt tat tcc act tcg cct ggt agc 1302 Val Gln Ala Asn Ile Val Ala Ala Gly Tyr Ser Thr Ser Pro Gly Ser 330 335 340 345 cac acc act tcc acc acc ctt acc acc atc act agt acc aca gca gta 1350 His Thr Thr Ser Thr Thr Leu Thr Thr Ile Thr Ser Thr Thr Ala Val 350 355 360 tct gga gct ggc cag aca cac tgg ggt cag tgt gga ggt agc gga tac 1398 Ser Gly Ala Gly Gln Thr His Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ser Gly Tyr 365 370 375 tcc ggt cca acg agc tgt gtt gca ccc tac gct tgt aca acc gct aac 1446 Ser Gly Pro Thr Ser Cys Val Ala Pro Tyr Ala Cys Thr Thr Ala Asn 380 385 390 cct tac tac gct caa tgt ctc tag aatataggcg ctcattcgtt ctatgactga 1500 Pro Tyr Tyr Ala Gln Cys Leu 395 400 agttggacaa gtatcaaaag ctctctggag gcagggagtg tatttttgat gattataccg 1560 tctggagaaa gtgtatatag cttctcataa cccagacaat cagatatttc taacagagca 1620 ataaatgaga gatgatcaa 1639 <210> 2 <211> 400 <212> PRT <213> Penicillium funiculosum <400> 2 Met Thr Ser Lys His Ser Phe Glu Arg Ala Gly Ile Leu Ala Leu Gly 1 5 10 15 Leu Ile Ala Thr Ser Ser Leu Val Ala Ala Gly Pro Cys Asp Ile Tyr 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Thr Pro Cys Val Ala Ala His Ser Thr Thr Arg Ala 35 40 45 Leu Tyr Asp Ala Tyr Thr Gly Pro Leu Tyr Gln Val Thr Arg Ser Ser 50 55 60 Asp Ser Ser Lys Lys Asp Ile Ala Pro Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala 65 70 75 80 Asn Ala Ala Thr Gln Asp Ser Phe Cys Ser Gly Thr Thr Cys Leu Ile 85 90 95 Ser Ile Ile Tyr Asp Gln Ser Gly Lys Gly Asn His Leu Thr Gln Ala 100 105 110 Pro Lys Gly Gly Trp Ser Gly Pro Gly Pro Asn Gly Ser Asp Asn Leu 115 120 125 Ser Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ile Tyr Leu Asn Gly Gln Lys Ala Tyr 130 135 140 Gly Val Phe Ile Ala Pro Gly Asp Gly Tyr Arg Asn Asp Lys Thr Ser 145 150 155 160 Gly Ile Ala Thr Gly Asp Gln Pro Glu Gly Met Tyr Ala Ile Phe Asp 165 170 175 Gly Thr His Tyr Asn Gly Gly Cys Cys Phe Asp Tyr Gly Asn Ala Glu 180 185 190 Thr Ser Gly Thr Asp Thr Gly Ala Gly His Met Glu Ala Ile Tyr Phe 195 200 205 Gly Asn Cys Asn Val Trp Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Pro Trp Ile 210 215 220 Met Ala Asp Leu Glu Asn Gly Leu Phe Ser Gly Tyr Asn Ala Lys Gln 225 230 235 240 Asn Thr Ala Asp Ala Ser Ile Asn Trp Arg Phe Val Thr Ala Ile Val 245 250 255 Lys Gly Glu Pro Asn Asn Trp Ala Ile Arg Gly Gly Asn Ala Gln Ser 260 265 270 Gly Ser Leu Ser Thr Tyr Tyr Asn Gly Ile Arg Pro Ser Gly Tyr Asn 275 280 285 Pro Met His Lys Glu Gly Ala Ile Ile Leu Gly Thr Gly Gly Asp Asn 290 295 300 Ser Asn Gly Ala Gln Gly Thr Phe Tyr Glu Gly Val Met Thr Ser Gly 305 310 315 320 Tyr Pro Ser Asp Ser Thr Glu Asn Ser Val Gln Ala Asn Ile Val Ala 325 330 335 Ala Gly Tyr Ser Thr Ser Pro Gly Ser His Thr Thr Ser Thr Thr Leu 340 345 350 Thr Thr Ile Thr Ser Thr Thr Ala Val Ser Gly Ala Gly Gln Thr His 355 360 365 Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ser Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Ser Cys Val 370 375 380 Ala Pro Tyr Ala Cys Thr Thr Ala Asn Pro Tyr Tyr Ala Gln Cys Leu 385 390 395 400 <210> 3 <211> 34 <212> PRT <213> Penicillium funiculosum <400> 3 Thr His Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ser Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Ser 1 5 10 15 Cys Val Ala Pro Tyr Ala Cys Thr Thr Ala Asn Pro Tyr Tyr Ala Gln 20 25 30 Cys Leu <210> 4 <211> 23 <212> PRT <213> Penicillium funiculosum <400> 4 Ser Thr Ser Pro Gly Ser His Thr Thr Ser Thr Thr Leu Thr Thr Ile 1 5 10 15 Thr Ser Thr Thr Ala Val Ser 20 <210> 5 <211> 34 <212> PRT <213> Penicillium funiculosum <400> 5 Ala His Trp Ala Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Cys Thr Ala 1 5 10 15 Cys Ala Ser Pro Tyr Thr Cys Gln Lys Ala Asn Asp Tyr Tyr Ser Gln 20 25 30 Cys Leu <210> 6 <211> 34 <212> PRT <213> Penicillium funiculosum <400> 6 Ala His Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Trp Ser Gly Pro Thr Ile 1 5 10 15 Cys Val Ser Pro Tyr Thr Cys Gln Val Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln 20 25 30 Cys Leu <210> 7 <211> 34 <212> PRT <213> Penicillium funiculosum <400> 7 Ala His Trp Gly Gln Cys Gly Gly Gln Gly Trp Thr Gly Pro Thr Thr 1 5 10 15 Cys Ala Ser Gly Thr Thr Cys Thr Val Val Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln 20 25 30 Cys Leu <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: XbaI-abfB-2 primer <400> 8 tctagaatga cgtccaaaca tagtt 25 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: HindIII-abfB-2 primer <400> 9 aagcttctag agacattgag cgta 24

Claims

하기 폴리펩티드에서 선택되는 하나의 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드:

- 서열번호: 2의 폴리펩티드,

- 서열번호: 2의 28 내지 400의 서열로 된 폴리펩티드,

- α-L-아라비노푸라노시다제 B활성을 갖는 서열번호: 2의 폴리펩티드 단편.
하기 폴리뉴클레오티드에서 선택되는 것을 특징으로 하는 α-L-아라비노푸라노시다제 B 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드:

- 서열번호: 1의 268 내지 1470의 서열로 된 폴리뉴클레오티드,

- 서열번호: 1의 349 내지 1470의 서열로 된 폴리뉴클레오티드,

- 제1항의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
서열번호: 1의 서열 또는 서열번호: 1의 서열에 상보적인 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
- 숙주 유기체에서 기능적인 프로모터;

- 제2항에 따른 폴리뉴클레오티드; 및

- 상기 동일한 숙주 유기체에서의 종결 서열;을 전사 방향으로 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
제2항 또는 제3항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 제4항에 따른 발현 카세트를 포함하는 벡터.
제2항 또는 제3항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 제4항에 따른 발현 카세트에 의해 형질전환된 숙주 유기체.
제6항에 있어서,

효모 또는 사상균인 것을 특징으로 하는 숙주 유기체.
제7항에 있어서,

페니실리움 푸니쿨로섬 균주인 것을 특징으로 하는 숙주 유기체.
제1항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 동물용 영양 첨가제.
제6항에 따른 숙주 유기체 또는 상기 숙주 유기체의 발효액을 포함하는 것을 특징으로 하는 동물용 영양 첨가제.
제9항에 있어서,

액상 또는 분말 형태인 것을 특징으로 하는 동물용 영양 첨가제.
동물용 영양 기초사료 및 제9항에 따른 동물용 영양 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 하는 사료.
제1항에 따른 폴리펩티드를 동물용 영양 첨가제의 제조 또는 사료의 제조에 사용하는 방법.
제6항에 따른 숙주 유기체를 동물용 영양 첨가제의 제조 또는 사료의 제조에 사용하는 방법.
제1항에 따른 폴리펩티드를 아라비노푸라노실-올리고사카라이드 화합물의 α-L-아라비노푸라노실 결합의 가수분해에 사용하는 방법.