MX2007013607A - Gen abfb-2 de penicillium funiculosum. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere al gen abfB-2 de Penicillium funiculosum que codifica una (-L-arabinofuranosidasa de tipo B y que presenta un dominio de fijacion a la celulosa. Esta enzima, la (-L-arabinofuranosidasa, puede incorporarse a los aditivos nutricionales o a los alimentos para animales, de los que mejora la digestibilidad y, por lo tanto, el valor nutricional.

Description

GEN abfB-2 DE PENICXLLIÜM FÜNICULO UM Campo d® la Invención i La invención se refiere al gen abfB-2 aislado de Penicillium funiculosum y al polipéptido ABFB-2 codificado por éste gen, que tiene una actividad de <x-L-arabinófuranosidasa B. Antecedentes de la Invención El Penicillium funiculosum es un talaro ices que pertenece a la familia de las Aspergilleae . El aislamiento de este imicroorganismo a partir de numerosos sustratos orgánicos, sujetos a una contaminación aérea o acuosa, indica que este hongo posee un conjunto de enzimas hidrolíticas de una riqueza sorprendente. La utilización de este cóctel enzimájtico en la alimentación animal contribuye a la despolimerización de sustancias orgánicas naturales y permite mejorar su digestibilidad. En el documento WO 99/57325 se describe una cepa de Penicillium funiculosum denominada IMI378536, que produce una mezcla de enzimas particularmente adaptada para la alimentación animal. Sin embargo, los cóctel s enzimáticos producidos por el Penicillium funicu\losum están poco caracterizados desde el punto de vista bioquímico . En efecto, únicamente un número restringido de activi ades enzimáticas, como las xilanasas, las ß-glucartasas, se mide en general en los mostos de fermentación Ref. 186988 obteníaos. Estas actividades reflejan solamente una fracción de la población enzimática presente en el cóctel . I Los compuestos emicelulolíticos procedentes de la I agricultura constituyen una segunda reserva de polisacáridos, después; de la celulosa contenida en los tejidos vegetales. Este ¡grupo se caracteriza por una gran variedad de heteropolisacáridos, cuyos principales representantes son los xilano?, los arabinanos, los galactanos, los glucanos y los mananof. La arabinosa en forma de furfural está ampliamente representada entre los heteropolisacáridos, por ejemplo los arabin nos y los arabinoxilanos . El arabinano es un polímero de residuo arabinofuranosa unidos mediante enlaces a-1-5 y puede ¡sustituirse por 1 ó 2 residuos de arabinosa en la posición 0-2 u 0-3. En lo que respecta a los arabinoxilanos, los residuos a-L-arabinofura-nosilo están unidos a la cadena principal ß-l-4-xilopiranosilo por enlaces a-1-3 y a-1-2. La presencia de residuos arabinosa en las cadenas laterales i puede ¡restringir la hidrólisis enzimática de los compuestos hemicelulolíticos en numerosas aplicaciones industriales, por ejempl la mejora de la digestibilidad de la alimentación animal. Las enzimas que rompen los enlaces a-L-arabinofuranosídicos pueden actuar sinergóticamente con las xilanasas para efectuar la hidrólisis de los arabinoxilanos y los arabinanos. Las actividades de las arabinasas (endo-, exo-arabinásas y mayormente las actividades de las a-L-arabinófuranosidasas) pueden contribuir, pues, activamente y de modo sinergético con las xilanasas a la despolimerización de los compuestos hemicelulolíticos. Los compuestos hemicelulolíticos y pectínicos pueden representar hasta un 50 I % de los carbohidratos totales presentes en las plantas y constituyen una fuente importante de energía para los animales. La mejora de la digestibilidad de estos compuestos guarda! relación con la disminución del grado de sustitución de loa residuos arabinosilos existentes en los compuestos hemicelulolíticos (Brice, R.E., Morrison, I.M., 1982, Carbohydr. Res. 101, 93-100). Las enzimas que hidrolizan los enlaces entre los residuos L-arabinosa se han aislado a partir de microorganismos, por ejemplo las bacterias o los hongos filamen Itosos. Las arabinosidasas están constituidas principalmente por a-L-arabinofuranosidasas (EC 3.2.1.55), que pon capaces de hidrolizar los residuos a-L-arabinofuranosilo no reductores, procedentes del L-arabin?xilano o de compuestos tales como los arabinanos, y los arábinogalactanos . Se han clasificado las a-L-arabinofuranosidasas (EC 3.2.1.55) en dos familias de Glucósidos Hidrolasas -(GH 51 y GH 54), en función de las similitudes de secuencia proteica. Estas dos familias difieren en su especificidad de sustrato contenido en los polisacáridos. El primer grupo (GH 51) contiene las arabinofuranosidasas de tipo A, que actúan solamente en pequeñas estructuras lineales de arabinofuranosil-oligosacáridos unidos en a-1-5. El segundo grupo está formado por arabinofuranosidasas de tipo B (GH 54) que catalizan la hidrólisis de los enlaces a-1,5; a-1,3 y a-1,2 de las cadenas laterales contenidas en los compuestos arabinofuranosil-oligosacáridos. Las arabinofuranosidasas B (ABFB) se han aislado a i partir de numerosas bacterias, pero también a partir de hongos filamentosos. El género Aspergillue es el más representado, pero se han aislado también a partir de los géneros Trichoderma , Penicillium y Fusarium. En los documentos WO 96/29416, WO 96/06935 y US 5 989 887 se describen géneros de arabinofuranosidasa del Aspergíllus niger. Gielkens et al. (Microbiology 145, 735-741, 1999) han descrito el gen abfB de Aspergill us nidulane . En los documentos W096/29416, WO 96/06935, WO 2004/018662 y US 5,989,887 se describen géneros de arabinofuranosidasa del Aspergill us niger. La alineación de las secuencias proteicas indica que la proteína abfB del A . niger s idéntica en un 50.9% a la proteína ABFB-2 del P. funiculoeum . En estas solicitudes de patente no se describe ninguna de las características esenciales de la utilización del polipéptido en nutrición animal. i Clinche et al. (J. Agrie. Food Chem. 45, 2379-2383, 1997) han descrito tres a-L-arabinofuranosidasas procedentes del Aspergillus terreus, que tienen una aplicación potencial en enología. I Koseki et al. (J. of Bioscience and Bioengineering, vol. 96, ns 3, 232-241, 2003) han descrito los genes abfB del Aspergillus kawachii y del Aspergillus awamori . Estas enzimas tienen; aplicaciones en la fermentación del licor japonés llamado shochu. Margolles-Clark et al. (Applied and Environmental I Microbiology, 3840-3846, 1996) han descrito el gen abfB del hongo filamentoso Trichoderma reesei . Panagiotou et al., han descrito también dos alfa-L-arabinofuranosidasas extracelulares, procedentes del Fusarium oxysporum (Can. J. Microbiol. 2003: 49(10): 639-4). Carvallo et al., (Mycol. Res., 107(4), 388-394, 2003) han descrito la a-L-arabinofuranosidasa B de Penici lium purpurogenum. La alineación de las secuencias proteicas indica que la proteína abf-1 del P. purpurogenum es idéntica en un 51.2% a la proteína ABFB-2 de P. funiculosum.

En este artículo no se describe ninguna de las características esenciales de la utilización del polipéptido en nutrición animal . Sakamoto et al., (FEBS Letters 560, 199-204, 2004) han delscrito el gen abnx del Penicillium chrysogenum, sin embargo este codifica una actividad de arabinanasa distinta de la a Ictividad de la ABFB. No obstante, estas enzimas ABFB no tienen las cualid des óptimas requeridas para una aplicación en alimentación animal. En efecto, para poder utilizarse en alimentación animal, las ABFB deberían poseer propiedades compatibles con los tratamientos, a los que se someten los alimentos destinados a esta alimentación. En particular, la actividad de las; enzimas utilizadas debe ser estable en las condiciones I de temperatura y de pH de los procedimientos y, si es posible, debería ser óptima para la preparación de estos alimentos y para las condiciones existentes en el sistema digestivo de los animales que ingieren estos alimentos. Además, estas enzimas deben tener un amplio espectro de acción (disgregación) en los heteropolisacáridos (arabinanos, arabinoxilanos y arabinogalacta os) para permitlir una mejora eficaz de la digestibilidad de los animaljes por parte de los animales. Esta mejora de la digestíbilidad de los alimentos por los animales permite au ent'ar su valor nutritivo. Por lo tanto, las enzimas que tienen una especificidad (estéreo-especificidad, enantiloselectividad) , una actividad o una afinidad mejorada con los sustratos naturales arabinoxilanos y arabinanos presentan un gran interés para la alimentación animal. 1 Además, antes de la hidrólisis de los enlaces arabinffuranosilo, es indispensable ante todo despolimerizar las moléculas complejas, como son la celulosa. Las enzimas celuloííticas (celulasas) del hongo poseen un general un i dominio fCDB (dominio de fijación sobre la celulosa del tipo fúngico) , que desempeña un papel preponderante en esta í despolimerización de la celulosa. En la presente invención se describe una L-arabinófuranosidasa B (ABFB-2) de Penicillium funiculosum, idónea Ipara una aplicación en la nutrición animal así como el gen que codifica a esta enzima. La invención se refiere además ¡ a los homólogos, las variantes y los fragmentos de la ABFB-2 que conservan las mismas propiedades catalíticas. De forma ventajosa, las enzimas ABFB según la invención presentan un pH óptimo muy ácido (pH 2.6) y conservan un 55% de su actividad a pH 1.5. De forma ventajosa, la enzima ABFB-2 posee un dominio de fijación sobre la celulosa de tipo fúngico (fCBD) . Este tipo de dominio se ha descrito en otras enzimas, pero jamás se había descrito para una arabinofuranosidasa fúngica. La funcionalidad de este dominio de fijación a la celulosa de la enzima ABFB-2 de Penicillium funiculOSum se ha podido verificar experimentalmente. La presencia de este dominio de fijación aumenta la afinidad de la enzima con su sustrato y permite por tanto mejorar la degradación de la celulosa insoluble. ¡ Así, gracias a sus propiedades catalíticas y a su afinidad por la celulosa, la ABFB-2 del Penicilli um funiculosum es especialmente indicada para una aplicación en alimentiación sobre todo animal. Las enzimas según la invención tienen además otras aplicaciones industriales y agro-industriales. Cabe citar en particular el tratamiento del jugo de frutas, la fabricación de papel, la conversión de biomasas hemicelulolíticas en carburantes o en productos químicos, la fabricación de bebidas alcohólicas por fermentación. Descripción de las secuencias SEC ID No . 1 : Secuencia genómica del gen abfB-2 de Penicillium funiculosum. SEC ID No . 2 : Secuencia del polipéptido ABFB-2 de Penicillium funiculosum que tiene una actividad de a-L-arabinófuranosidasa de tipo B. i SEC ID No . 3 : Dominio fCBD de la ABFB-2 de Penicillium funiculosum. SEC ID No. 4: Dominio de baja complejidad de la ABFB-2¡de Penicillium funiculosum. SEC ID No. 5: Dominio fCBD die la cianomil-esterasa de Penicillium funicul-osum. SEC ID No . 6 : Dominio fCBD de la endo-1, 4-xilanasa D de P nicilli um funiculosum. SEC ID No . 7 : Dominio fCBD de la xilanasa celobifhidrolasa de Penicilli um funiculosum . SEC ID No. 8: cebador Xbal-abfB-2 para PCR. SEC ID No. 9: cebador HindIII-abfB-2 para PCR. Breve Descripción de la invención La presente invención se refiere a un polipéptido que cotnprende un polipéptido elegido entre los polipéptidos siguientes : i - el polipéptido de la SEC ID NO. 2, - el polipéptido, cuya secuencia está comprendida entre la posición 28 y la posición 400 de la SEC ID No. 2, - un fragmento de polipéptido de la SEC ID No . 2, que tiene una actividad de a-L-arabinofuranosidasa B, - un polipéptido que tiene una actividad de a-L-arabinofuranosidasa B y presenta por lo menos una identidad del 80 con el polipéptido de la SEC ID No. 2. La invención se refiere además a un polinucleótido, que codifica una actividad de a-L-arabinofuranosidasa B, elegido entre los polinucleótidos siguientes: - el polinucleótido cuya secuencia está comprendida entre l|a posición 268 y la posición 1470 de la SEC ID No. 1, - el polinucleótido cuya secuencia está comprendida entre l¡a posición 349 y la posición 1470 de la SEC ID No. 1, - un polinucleótido que codifica a un polipéptido según la reivindicación 1. Otro objeto de la presente invención es un polinucleótido que tiene la secuencia representada por la SEC ID No.11 o la secuencia complementaria de la SEC ID No. 1. La invención se refiere además a casetes de expresión que en el sentido de la transcripción constan de: - un promotor funcional en un organismo hospedero; - un polinucleótido según la invención; y - una secuencia terminadora funcional en el mismo organismo hospedero. Otro objeto de la invención es un vector que comprende un polinucleótido según la invención y/o un cásete de expresión según la invención. i La invención se refiere además a un organismo hospedero transformado con un polinucleótido según la invención, un cásete de expresión según la invención y/o un vector según la invención. En un modo de realización de la invención, el organismo hospedero se elige entre las levaduras y los hongos filamentosos. El organismo hospedero es preferentemente una cepa de Penlcilliu funiculosum. La invención se refiere igualmente a un aditivo nutricional para animales que comprende un polipéptido según la invención, un organismo hospedero según la invención o un mosto |de fermentación de un organismo hospedero según la invención. | Preferiblemente, este aditivo nutricional se presentía bajo la forma líquida o bajo la forma de polvo. , Otro aspecto de la invención es un alimento para animales que contiene una base nutritiva para animales y un aditivo nutricional para animales según la invención. La invención se refiere además a la utilización de un polipéptido ABFB según la invención o de un organismo hospedero según la invención para la fabricación de un aditivo nutricional para animales o de un alimento para i animales . Otro objeto de la invención es la utilización de un polipéptido ABFB según la invención o de un organismo hospedero según la invención para la hidrólisis de los enlaces, de a-L-arabinofuranosilo de compuestos arabinófuranosi1-oligosacáridos . Polipépjtidos La presente invención se refiere a polipéptidos ABFB que tienen una actividad de a-L-arabinofuranosidasa B.

De preferencia, estos polipéptidos se aislan de Penicillium funicul\osum . Se entiende por "a-L-arabinofuranosidasa B" las a- L-arabinofuranosidasas (EC 3.2.1.55) de tipo B (GH 54) que catalizan la hidrólisis de los enlaces a-1,5; a-1,3 y a-1,2 de late cadenas laterales contenidas en los compuestos arabinbfuranosil-oligosacáridos . I ! Los polipéptidos de la presente invención están adaptados para la utilización en nutrición animal. Se entiende por "polipéptido adaptado a la utilización en la nutrición animal" un polipéptido, cuyas características son las idóneas para la nutrición animal. Las ¡ características esenciales para una utilización en nutrición animal] son sobre todo el pH y la temperatura, en los que la enzimai es activa. En efecto, el pH del sistema digestivo de I los animales es ácido y es esencial que la enzima continúe siendo activa a este pH, con el fin de conservar su actividad para la hidrólisis de los residuos L-arabinosa. Por lo demás, la utilización de la enzima en un aditivo nutricional o en un alimento del animal implica tratamientos y una temperatura superior a la temperatura ambiente. La actividad de las enzimajs utilizadas deberá ser estable en las condiciones de los procedimientos, en particular, las condiciones de temperatura . Según un modo de realización de la presente invenc¡ión, el polipéptido presenta una actividad de a-L-arabinofuranosidasa B a un pH ácido, por ejemplo inferior a 4.5, de preferencia inferior a 4. De igual manera, según un modo de realización de la presente invención, el polipéptido i presenta una actividad de a-L-arabinofuranosidasa óptima entre jpK 1.5 y pH 3.5. Según un modo de realización preferido de la presente invención, el polipéptido presenta una actividad de a-L-arabinofuranosidasa a temperaturas superiores a la temperatura ambiente. De preferencia, el polipéptido de la invención posee una actividad de a-L-arabinofuranosidasa óptima| a una temperatura comprendida entre 30SC y 7 SC, con mayor preferencia entre 40SC y 60SC. La a-L-arabinofuranosidasa B-2 de la cepa IMI378536 de Pe?icillium funiculosum se representa con la SEC ID No. 2. En un modo de realización preferido, los polipéptidos según la invención son glicosilados. El polipéptido de la SEC ID No. 2 posee por ejemplo sitios de N-glicosilación en el aminoácido 123 y en el aminoácido 127. En un modo de realización preferido, los residuos asparagina de la pofición 123 y 127 del polipéptido de la SEC ID No. 2 están glicosilados. i La a-L-arabinofuranosidasa B del Penicilli um funicülosum es una enzima secretada por el hongo en su entorn extracelular. El polipéptido de la SEC ID No . 2 consta de un péptido señal de 27 aminoácidos. La invención tiene ¡ por objeto además el polipéptido maduro obtenido después de la rotura del péptido señal . La invención se refiere en particular al polipéptido, cuya secuencia está comprendida entre la posición 28 y la posición 400 de la SEC ID No.; 2. En otro modo de realización, el péptido señal del I polipéptido de la SEC ID No. 2 puede reemplazarse por un péptido señal heterólogo por la expresión y la secreción del polipéptido de la SEC ID No . 2 en un organismo hospedero ! I I hetero rlogo La invención se refiere además a fragmentos del polipéptido de la SEC ID No. 2 que tienen una actividad de a-L-arabinofuranosidasa B. El término "fragmento" de un polipéptido indica un polipéptido que contiene una parte, pero no la totalidad, del I polipéptido del que se deriva. La invención se refiere así a un polipéptido que contiene un fragmento por lo menos de 100, 200 ó ¿00 aminoácidos del polipéptido de la SEC ID No. 2. Este fragmento del polipéptido de la SEC ID No. 2 conserva su actividad de a-L-arabinofuranosidasa. La invención se refiere a los fragmentos biológicamente activos del po¡lipéptido de la SEC ID No. 2. El término "fragmento biológicamente activo" indica un fragmento de un polipéptido que conserva la función del polipéptido del que se deriva. Los fragmentos biológicamente activos del polipéptido de la SEC ID No. 2 conservan así la función del polipéptido ABFB-2 de Penicillium funiculosum . Estos fragmentos biológicamente activo? tienen una actividad de a-L-arabinofuranosidasa B. De preferencia, los fragmentos de la ABFB según la invención poseen un dominio de fijación sobre la celulosa. En un modo de realización preferido, el dominio de fijación sobre la celulosa tiene la secuencia descrita en la SEC ID No. 3. Preferiblemente, estos fragmentos presentan una actividad de a-L-arabinofuranosidasa óptima a pH 2.6. Los expertos en la técnica ya conocen los métodos de preparación de fragmentos de un polipéptido así como las técnica Is de medición de la actividad de la a-L-arabinófuranosidasa B. i La invención tiene también por objeto los y sobre todo las mismas propiedades catalíticas que los I polipéptidos de la SEC ID No. 2. Preferiblemente, estos polipéptidos se aislan de otras cepas de Penicillium funiculosum o de otros hongos filamentosos. Como alternativa, estos >olipéptidos pueden obtenerse por ejemplo por técnicas de muta1génesis dirigida. La invención tiene por objeto a polipéptidos que presentían por lo menos 80%, 90%, 95%, 98% y preferiblemente por lo j menos 99% de aminoácidos idénticos con el polipéptido i de la SEC ID No. 2. i Se entiende por aminoácidos idénticos los aminoácidos invariables o no alterados entre dos secuencias.

Estos polipéptidos pueden presentar una deleción, una adición un aminoácido con respecto tiene por objeto a los polipéptidos que presentan por lo menos 90%, 95%, 98% y preferiblemente por lo menos 99% de similitud con el polipéptido de la SEC ID No. 2. Por similitud, se entiende el grado de semejanza entre ¡secuencias proteicas o nucleicas. Estos polipéptidos pueden) presentar una deleción, una adición o una sustitución por lo| menos de un aminoácido con respecto al polipéptido de la SEC| ID No. 2. El grado de similitud entre dos secuencias, cuantiEicada en una puntuación, se basa en el porcentaje de identidades y/o de sustituciones conservadoras de las secuencias. Los expertos en la técnica ya conocen los métodos de medición y de identificación del grado de identidad y del grado de similitud entre polipéptidos. Se puede utilizar por ejemplo el Vector NTi 9.1.0, programa de alineación AlignX i (Clust;al W algorithm) (Invitrogen INFORMAX, http:// i www.inivitrogen.com). De preferencia, se utilizan los parámetros por defecto. Los polipéptidos según la invención se aislan o se purifican de su ambiente natural. Los polipéptidos pueden obtenerse mediante diferentes procedimientos. Estos procedimientos son por ejemplo la purificación a partir de fuentes naturales, por ejemplo células que se expresan de forma natural en polipéptidos, la producción de polipéptidos recombinantes por parte de células hospederos apropiadas y su purificación ulterior, la producción por síntesis química o, por fin, una combinación de estas diferentes estrategias. Los expertos en la técnica ya conocen estos procedimientos de produc'ción diferentes. Así, los polipéptidos ABFB de la presenjte invención pueden aislarse a partir del Penicillium funiculosum. En otro modo de realización, los polipéptidos ABFB de la presente invención se aislan a partir de i organismos hospederos recombinantes que se expresan en un polipé tido ABFB según la invención. I Otro objeto de la invención son las proteínas de fusión, las proteínas recombinantes o las proteínas quiméricas que contienen los polipéptidos de la invención. El términb "polipéptido" designa tanto a proteínas como a polipéptidos modificados. i Los polipéptidos según la presente invención tienen una actividad de ABFB. De preferencia, los polipéptidos según la inv¡ención poseen un dominio de fijación sobre la celulosa. En un ' modo de realización preferido, el dominio de fijación sobre la celulosa tiene la secuencia descrita en la SEC ID No. 3. Preferiblemente, los polipéptidos presentan una actividad de a-L-arabinofuranosidasa B óptima a pH 2.6.

Preferiblemente, los polipéptidos presentan una actividad a-L-arabinofuranosidasa B óptima a 50aC. Polinu¿leótidos La invención se refiere además a polinucleótidos i que codifican para una actividad de a-L-arabinofuranosidasa B. De preferencia, estos polinucleótidos que codifican para i una actividad de a-L-arabinofuranosidasa B de Penicilli um funiculosum. Según la presente invención se entiende por "polinucleótido" una cadena nucleótida de hebra simple o su complementario, que pueden ser de tipo ADN o ARN, o una cadena j nucleótida de hebra doble, que puede ser de tipo AD? complementario o genómico. De preferencia, los polinucleótidos de la invención son de tipo AD?, en especial AD? dé doble hebra. El término "polinucleótido" designa también a los polinucleótidos modificados. Los polinucleótidos de la presente invención se aislan o purifican de su ambiente natural. De preferencia, los pojinucleótidos de la presente invención pueden obtenerse por técnicas clásicas de la biología molecular, descritas por Sambrook et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989) o por síntesis química. En un primer modo de realización, la invención se refiere al polinucleótido, cuya secuencia está comprendida entre la posición 268 y la posición 1470 de la SEC ID ?o. 1.

Este pjolinucleótido codifica a la enzima ABFB-2 de la SEC ID No. 2 de Penicilli um funiculosum . En el segundo modo de realización, la invención se refiere al polinucleótido, cuya secuencia está comprendida entre la posición 349 y la posición 1470 de la SEC ID No. 1.

Este polinucleótido codifica al polipéptido maduro ABFB-2 de I Peniciíli um funi culosum después de la rotura del péptido señal . La invención se refiere además a polinucleótidos que presentan por lo menos una identidad del 70%, del 75%, I del 80%, del 85%, del 90%, del 95%, del 98% y de preferencia por lo menos del 99% con el polinucleótido, cuya secuencia está comprendida entre la posición 268 y la posición 1470 de la SEC ID No. 1 y/o con el polinucleótido, cuya secuencia está comprendida entre la posición 349 y la posición 1470 de la SEC ID No. 1. Estos polinucleótidos codifican una actividad de a-L-arabinofuranosidasa B. De preferencia, estos polinucleótidos codifican una actividad de a-L-arabino Ifuranosidasa B de Penicillium funiculosum. Se entiende por nucleótidos idénticos los nucleótidos invariables o no alterados entre dos secuencias. Estos polinucleótidos pueden presentar una deleción, una adición! o una sustitución de por lo menos un nucleótido, con respecto al polinucleótido de referencia. La invención se refiere además a polinucleótidos que tienen por lo menos una similitud del 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% y de preferencia por lo menos del 99% con el polinusleótido, cuya secuencia está comprendida entre la I posición 268 y la posición 1470 de la SEC ID No. 1 y/o con el polinuéleótido, cuya secuencia está comprendida entre la posición 349 y la posición 1470 de la SEC ID No. 1. Estos polinucleótidos codifican una actividad de a-L-arabinffuranosidasa B. De preferencia, estos polinucleótidos codififan para una a-L-arabinofuranosidasa B de Penicillium funicuíiosum. Se entiende por similitud el grado de parecido entre secuencias proteicas o nucleicas. Estos polinucleótidos pueden presentar una deleción, una adición o una sustitución de por1 lo menos un nucleótido, con respecto al polinucleótido de referencia. El grado de similitud entre dos secuencias, cuantificado mediante una puntuación, se basa en el I porcentaje de identidades y/o de sustitución conservadoras de secuencias . Los métodos para medir e identificar el grado de identidad y el grado de similitud entre las secuencias de ácidos; nucleicos son bien conocidas por los expertos en la técnica. Se puede emplear por ejemplo el Vector NTi Vector Ti 9.1.0, programa de alineación AlignX (Clustal W algoribh ) (Invitrogen INFORMAX, http://www.invitrogen.com). De preferencia, se utilizan los parámetros por defecto.

Preferentemente, los polinucleótidos que presentan un grado de similitud con un polinucleótido de referencia I conservan la función de la secuencia de referencia. En el presente caso, los polinucleótidos codifican para una actividad de a-L-arabinofuranosidasa B. La invención se refiere además a polinucleótidos capaces de hibridarse de manera selectiva con el polinucleótido, cuya secuencia está comprendida entre la posición 268 y la posición 1470 de la SEC ID No. 1 y/o con el polinucleótido, cuya secuencia está comprendida entre la posición 349 y la posición 1470 de la SEC ID No. 1. De preferencia, la hibridación selectiva se efectúa en condiciones de restricción media y en especial en condiciones de restricción fuerte. Estos polinucleótidos codifican para una actividad de a-L-arabinofuranosidasa B. De preferencia, estos polinucleótidos codifican para una a-L-arabinpfuranosidasa B de Penicillium funiculosum. Se entiende según la invención por "secuencia capaz de hibridarse de manera selectiva" las secuencias que se hibridan con la secuencia de referencia a un nivel superior al ruido de fondo de manera significativa. El nivel de señal i generado por la interacción entre la secuencia capaz de hibridarse de manera selectiva y las secuencias de referencia es por lo general 10 veces más intenso, con preferencia 100 veces más intenso que el de la interacción de las demás secuencias de ADN que generan el ruido de fondo. Las I condiciones de hibridación restrictivas, que permiten una hibridación selectiva, ya son conocidas por el experto en la técnica. En general, la temperatura de hibridación y de lavado es inferior por lo menos en 5BC a la Tm de la secuencia de referencia a un pH determinado y para una fuerza iónica determinada. La temperatura de hibridación es por ejemplo por lo menos de 30SC para un polinucleótido de 15 a 50 nucleótidos y por lo menos de 60SC para un nucleótido que tenga ¡más de 50 nucleótidos. A título de ejemplo, la hibridación se realiza en el amortiguador siguiente: 6X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% ; BSA, 500 µg/ml de esperma de salmón de DNA desnaturalizado. Los lavados se realizan por ejemplo de forma sucesiva con restricción débil en un amortiguador 2X SSC, 0.1% SDS; con restricción media en un amortiguador 0,5X SSC, 01% SDS; y con restricción fuerte en un amortiguador 0. IX SSC, 0.1% SDS. La hibridación puede realizarse también, como es obvio, con arreglo a otros métodos habituales, ya conocidos por el expertos en la técnica (véase por ejemplo Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ¡ 1989) . ¡De preferencia, los polinucleótidos que se hibridan de manera i selectiva con un polinucleótido de referencia conservan la función de la secuencia de referencia. En el presentie caso, los polinucleótidos, que se hibridan de manera selectiva con el polinucleótido, cuya secuencia está comprendida entre la posición 268 y la posición 1470 de la SEC ID No. 1 y/o con el polinucleótido, cuya secuencia está comprendida entre la posición 349 y la posición 1470 de la SEC ID No. 1, codifican para una actividad de a-L-arabin^>furanosidasa B. La invención se refiere de manera general a los polinucleótidos que codifican para los polipéptidos según la invención . Teniendo en cuenta la degeneración del código genético, diferentes polinucleótidos pueden codificar a un mismo ¡polipéptido. Otro objeto de la presente invención es un polinucleótido, cuya secuencia está representada por la SEC ID No. 1. El polinucleótido de la SEC ID No. 1 consta de secuenlcias que flanquean el marco abierto de lectura (ORF) del gen abfB-2 del Penicilli um funiculoeum. Se trata por ejemplo de secuencias promotoras y terminadoras del gen abfB-2. El gen abfB puede expresarse a partir de sus secuencias reguladoras homologas, principalmente para una sobreexpresión en el ''Penicillium funiculosum o en otros hongos filamentosos. En otro modo de realización, el gen abfB puede expresarse en diferentes organismos hospederos, por ejemplo bacterias, levaduras y hongos. El gen abfB puede expresarse en un organismo hospedero bajo el control del promotor de la SEC ID No. 1 de la presente invención o bajo el control de un promotor heterólogo. Casetejs de expresión l Según un modo de realización de la invención, un polinucleótido que codifica a un polipéptido según la invención se inserta en un cásete de expresión utilizando técnic s de clonación que el experto en la técnica conocen perfectamente. Este cásete de expresión contiene los elementos necesarios para la transcripción y la traducción de secuencias codificadoras de polipéptidos de la invención. De modo ventajoso, el cásete de expresión contiene a la vez elementos que permiten la producción de un polipéptido en una célula hospedero y los elementos i necesarios para la regulación de esta expresión. Estos casetes de expresión contienen en el sentido de la transcripción: - un promotor funcional en un organismo hospedero; - un polinucleótido según la invención; - una secuencia terminadora funcional en el mismo organijsmo hospedero. En los casetes de expresión según la invención puede utilizarse cualquier tipo de secuencia de iniciación. La elección del promotor dependerá por ejemplo del organismo hospedero elegido para la expresión del gen de interés. Algunos promotores permiten una expresión constitutiva, mientras que otros promotores por el contrario son inducibles. Entre los promotores funcionales de los hongos, cabe citar por ejemplo el de la gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa del Aepergillue nidulane (Roberts et al., Current Genet. 15, 177-180, 1989) . Entre los promotores funcionales de las bacterias cabe citar por ejemplo el de la RNA polimerasa del bacteriófago T7 (Studier et al., Methods in Enzymology 185:60-89, 1990). Entre los promotores funcionales de las levaduras cabe mencionar el promotor del gen GALl (Elledge et al., Proc. Nati. Acad. Sciences USA, 88:1731-1735, 1991) o los promotores GAL4 y ADH del S. cerevieiae. Todos estos promotores se han descrito en la literatura y los expertos en la técnica los conocen bien. Para la expresión en el Penicillium funiculoeum, se elegirán por ejemplo los casetes de expresión que contienen un promotor histona H4.B, un promotor ácido aspartil proteasa o un promotor csll3 (WO 00/68401) . Los casetes de expresión según la invención pueden incluir además cualquier otra secuencia necesaria para la expreeión de los polipéptidos o de polinucléotidos por ejemplo como elementos de regulación o secuencias señal que permitan la secreción de polipéptidos producidos en el organismo hospedero. Se puede utilizar por ejemplo cualquier secuencia de regulación que permita aumentar el nivel de expresión de la secuencia codificadora insertada en el cásete de expresión. Según la invención se pueden utilizar principalmente, en asociación con la secuencia reguladora promotora, otras secuencias reguladoras, las cuales se sitúan entre ¡el promotor y la secuencia codificadora, como son los activadores de transcripción ("mejorador"). En los casetes de expresión según la invención se pueden utilizar una gran variedad de secuencias .terminadoras, estas secuencias permiten la terminación de la transcripción y la poliadenilación del ARNm. Puede utilizarse cualquier secuencia terminadora funcional del organismo hospedero seleccionado. Para la expresión en el Penicillium funiculoeum se elegirán por ejemplo casetes de expresión que contengan un terminador histona H4.B, un terminador ácido aspartil-proteaea o un terminador csl13 (WO 00/68401) . La presente invención tiene también por objeto un polinujcleótido que contiene un cásete de expresión según la invención, de forma ventajosa los casetes de expresión según la prebente invención se insertan en un vector. Vectores La presente invención se refiere además a vectores de replicación o de expresión para la transformación de un organismo hospedero, que contienen por lo menos un polinu-cleótiblo o un cásete de expresión según la presente invención. Este vector puede corresponder principalmente a un plásmido, un cósmido, un bacteriófago o un virus, en el que está insertado un polinucleótido o un cásete de expresión según la invención. Los expertos en la técnica ya conocen las i técnicas de construcción de estos vectores y de inserción de un pol¡inucleótido de la invención en estos vectores . De modo ! general puede utilizarse cualquier vector capaz de mantenerse, de autor replicarse o de propagarse en una célula hospedero con el fin de inducir por ejemplo la expresión de un polinucleótido o de un polipéptido. Los expertos en la técniéa sabrán elegir los vectores apropiados en función del organismo hospedero a transformar y en función de la técnica de transformación que se ponga en práctica. Los vectores de la presente invención se utilizan en particular para transformar un organismo hospedero con vistas; a la replicación del vector y/o de la expresión de un polipéptido según la invención en el organismo hospedero. La invención se refiere además a un método para preparar un polipéptido según la invención, que consiste en las etapas siguientes: - se transforma un organismo hospedero con un vector de expresión que contiene un cásete de expresión según la invención y/o con un polinucleótido según la invención, - se aislan los polipéptidos producidos en el organismo hospedero.

Organismos hospederos La presente invención tiene también como objeto a un procedimiento de transformación de un organismo hospedero por integración en el organismo hospedero por lo menos de un polinucleótido o de un cásete de expresión o de un vector según ¡la invención. El polinucleótido puede integrarse en el genoma^ del organismo hospedero o replicarse de manera estable en el organismo hospedero. Los métodos de transformación de organismos hospederos son bien conocidos de los expertos en la técnica y se han descrito en múltiples ocasiones en la i literatura. La presente invención se refiere además a un organismo hospedero transformado con un polinucleótido, un cásete de expresión o un vector según la invención. Se entiende por organismo hospedero en particular según la invenqión cualquier organismo mono- o pluricelular, inferior o superior, elegido en particular entre las bacterias, levaduras y hongos. Se entiende por organismo hospedero un organijsmo no humano. De manera ventajosa, las levaduras se eligen1 entre la Pichia paetorie, Saccharomycee cerevieae, Yarrowia lipolytica y Schwanniomycee occidentali . Los hongos se eligen entre los Aspergillus y los Penicillium, preferiblemente entre Penicillium funiculoeum, Trichoderma reesel , Aepergillue niger, Aepergillue awamori , Aspergillus kawachii y Trichoderma koningii . En un modo de realización preferido, el organismo hospedero es una cepa de Penicillium I funiculoeum, en la que se expresa o se sobreexpresa un polipéptido ABFB según la invención. Las técnicas de construcción de vectores, de i transformación de organismos hospederos y de expresión de proteínas heterólogas en estos organismos se han descrito en múltipjles ocasiones en la literatura (Ausubel, F.M. et al., i "Curreht Protocols in Molecular Biology", volúmenes 1 y 2, Greenel Publishing Associates y Wiley-Interscience, 1989; T. Maniatjis, E.F. Fritsch, J. Sambrook, Molecular Cloning, A I Laboratory Handbook, 1982). Aditiv¡os alimentarios y alimentos para animales i La presente invención se refiere a aditivos alimentarios que tienen una actividad a-L-arabinofuranosidasa B. La ¡aportación de este tipo de actividad enzimática permite mejorair la digestibilidad del alimento y aumentar su valor nutritivo. Se entiende por aditivo nutricional una sustancia adicionada intencionadamente a un alimento, por lo general en cantidades pequeñas, para mejorar las características nutritivas o la digestibilidad. Los aditivos nutricionales para animales pueden contener por ejemplo vitaminas, sales minerailes, aminoácidos y enzimas. Típicamente, los aditivos nutricionales para animales contienen un polipéptido según la invención, un organismo hospedero según la invención o un mosto de fermentación de un organismo hospedero según la invención. Por lo tanto, los polipéptidos que tienen una actividad de a-L-arabinofuranosidasa B según la invención pueden purificarse o aislarse de una cepa de Penicillium funiculosum o de un organismo hospedero recombinante para destinarse a la fabricación de un aditivo nutricional para animales. Como alternativa, para la fabricación de un aditivo nutricional para animales puede utilizarse directamente una cepa de Penici llium funiculosum o un organismo hospedero que produce polipé¿»tidos AbfB. En una forma preferida de realización de la inyención, para la fabricación de aditivos nutricionales para animales se utiliza el líquido sobrenadante del cultivo o el mosto de fermentación de una cepa de Penicilli um funiculosum o de otro organismo hospedero según la invención. Este r?odo de realización es particularmente ventajoso cuando los polipéptidos ABFB se secretan en la cepa de Penicillium funiculosum o en el organismo hospedero. Habitualmente se concentra el líquido sobrenadante del cultivo o se liofiliza para la fabricación del aditivo nutricional. Por consiguiente, la invención se refiere además a un procedimiento de preparación de la enzima ABFB que consiste las etapas siguientes: a) cultivar una cepa de Penicillium funiculosum o de un ¡organismo hospedero transformado según la invención en condic ones de inducción de la expresión de los ABFB, b) separación del líquido sobrenadante del cultivo que contiene la enzima ABFB. Este líquido sobrenadante del cultivo o el mosto de I fermentación pueden concentrarse o liofilizarse a continuación para la formulación de un aditivo alimentario o de un jumento para animales. I Si el organismo hospedero no secreta la enzima ABFB en el ¡ medio de cultivo, puede ser necesaria una etapa suplementaria de disgregación celular y de purificación del extracto celular. i ¡ Los aditivos nutricionales de la presente invención que tienen una actividad de a-L-arabinofuranosidasa B, pero pueden contener también otras sustancias nutricionales, como vitaminas, aminoácidos o sales minerales. Los aditivos según la invención aumentan la digestibilidad de los alimentos, contribuyendo de este modo a una mejor asimilación nutricional sobre todo en regímenes í basados en cereales (trigo, cebada, maíz, avena, centeno,...) y de tortas oleaginosas (soja, girasol, colza,...). La presente invención se refiere también a los alimentos para animales que contienen una base nutritiva y un aditivo nutricional según la invención. Estos alimentos se presentan habitualmente en forma de harinas o de granulados, a los que se incorporan los aditivos según la invención.

Se entiende por alimento todo lo que pueda servir para alimentar a los animales. | Los alimentos para animales contienen un polipéptido según la invención, un organismo hospedero según la invención o un mosto de fermentación de un organismo hospedero según la invención. Para la explotación ganadera intensiva de animales, estos alimentos contienen habitualmente una base nutricional y aditivos nutricionales. base nutricional, lo que constituye la parte esencial de la ración alimentaria del animal, i formado en calidad de ejemplo por una mezcla de cereales, proteínas y materias grasas de origen animal y/o vegetal . Las bases nutricionales para animales se adaptan a la alimentación de dichos animales y son bien conocidas por el experto en la técnica. Habitualmente, estas bases nutricionales contienen por ejemplo maíz, trigo, guisantes y soja. ¡Estas bases nutricionales se adaptan a las necesidades de las diferentes especies animales, a las que van destin das. Estas bases nutricionales ya pueden contener aditivos nutricionales, por ejemplo vitaminas, sales minerales y aminoácidos. En un modo de ejecución preferido, la invención se refiere a alimentos para animales monogástricos y sobre todo aves de corral y cerdos. Las aves comprenden por ejemplo las gallinas ponedoras, los pollos para carne, los pavos y los patos. Los cerdos incluyen por ejemplo los cerdos de engorda y de c nsumo así como los lechones . Breve ¡Descripción de las figuras Figura 1 : Esquema organizativo del dominio fúngico de fijación sobre la celulosa (fCBD) . Figura 2 : Determinación del pH óptimo de la enzima ABFB-2¡ en una serie de amortiguadores Me Ilvaine (pH de 2.2 a 8) a 40SC en presencia de 5 mM de PNPAF. ¡ Figura 3 : Determinación de la temperatura óptima de la enii a ABFB-2 en su pH óptimo en presencia de 5 mM de PNPAF . Figura 4 : Determinación de las constantes cinéticas Km y Vm (I/Vi = f(l/S)) para la ABFB-2 para una serie de PNPAF que van de 0.5 mM a 5 M, a un pH de 2.6 y 50aC . Figura 5 : Valores cuantitativos de expresión diferencial, relativos a los genes abfB-1 y abfB-2 en función de las condiciones de cultivo del P. funi cül oeum . Figura 6 : Cinética de desaparición de la ABFB-1 en el líquido sobrenadante de reacción. El seguimiento de la adhesión de la enzima a la celulosa se hace midiendo la actividad de a-L-arabirkofuranosidasa B residual libre de la ABFB-2.

Descripción detallada de la Invención Ejemplos Análisis de la estructura del gen ABFB=2 La ABFB-2 presenta menos del 62% de identidad con otras enzimas ABFB de hongos filamentosos, cuando estas enzimas están por lo general bien conservadas. Esta diferencia de identidad se explica mediante la identificación de dosi regiones distintas. En la parte N-terminal, una región específica de las arabinofuranosidasas (de 10 aminoácidos a 341 aminoácidos) y en la región C-terminal, un dominio de fijación sobre la celulosa, de tipo fúngico fCBD (fungal-type cellulose-binding domain) , que con un análisis SMART (Simple Modular Architecture Research Tool) se ha previsto entre la posición 367 y 400 aminoácidos. Según la literatura, este tipo de dominio de fijación se encuentra por lo general en enzimafe implicadas en la degradación de la celulosa, como son las endoglucanasas (EC 3.2.1.4), las celobiohidrolasas (EC 3.2.1.91) (exoglucanasas) , o las xilanasas (EC 3.2.1.8). Es la primera vez que se describe un dominio CBD para una arabinofuranosidasa. Desde el punto de vista estructural (secuencia primaria) , las celulasas y las xilanasas están constituidas por dos dominios distintos, un dominio catalítico y un dominio CBD, unidos mediante una secuencia corta, llamada de complejidad baja, rica en prolina y/o en aminoácidos hidroxilados (serina y treonina) . Los dominios de fijación a la celulosa se han estudiado en un cierto número de celulasas fúngicas y se caracterizan por un secuencia que llega hasta los 361 aminoácidos, presente en el extremo N-terminal (cbh-II o egl2) o en la C-terminal de la proteína (cbh-I, egll o egl5) . Este tipo de dominio se caracteriza además por la conservación de 4 cisteínas según la figura 1, que permiten la formación de enlaces (puentes) disulfuro. El dominio fCBD previsto para la ABFB-2 de Penicillium funiculoeum está compuesto por 34 aminoácidos que incluy n 4 cisteínas conservadas (THWGQJCGGSGYSGPTSCVAPYACTTANPYYAQCL) . Este dominio está precedido por un secuencia corta de 23 aminoácidos de complejidad baja (STSPG'SHTTST LTTITST AVS) característica, rica en aminoácidos que lleva un hidroxilo (10 treoninas y 6 serinas) . Este tipo de dominio se ha descrito en otras tres enzimas de Penicilli um funiculoeum, la endo-1, 4-xilanasa, la celobiphidrolasa, y la ácido ferúlico-esterasa (cianomil-esteraba) . La alineación de estos cuatro dominios confirma la conservación y el posicionamiento de las 4 cisteínas dentro del fC¡BD. 496 529 AEFB_2 de P. funiculosum (367) T?W3QCXX3SGYSGPISCVAPYACTIANPy^^ cianonarhil-esterasa (320) AHWAQCQG?GYSGCTACASPYTCQKAlTOYYSQCL endo-l-4¡-xilanasa D_P. f (374) 777 AHWGQCGGIOTSGPTICVSP?TCQVINPYYSQai xilanasa •celobiohidrolasa (496) AHVCQCOGQGWIOPTICASGTrcTWNPYYSQCL Alineación de los fCBD conocidos del Penicillium funiculosum. Este tipo de dominio de fijación se ha descrito ampliamente en las enzimas celulolíticas (celulasas) . El análisis de la secuencia primaria del fCBD por voladura de alineación (alignement blast) , frente a secuencias fCBD conocidas permite identificar una gran homología con los dominios de fijación a la celulosa de la celobiohidrolasa de tipo I, y II así como con los dominios de las endo-glucanasas de tipo I, II y V procedentes del Trichoderma reesei y del Aepergillue niger. Los tres residuos tirosina y los residuos asparagina y glutamina, identificados como esenciales para la funcionalidad del dominio, se conservan dentro de la secuencia de la ABFB-2. Los estudios de la relación entre la estructura y la función ponen de manifiesto que este tipo de dominip desempeña un papel preponderante en la despolimerización de la celulosa (Linder, M. & Teeri, T.T., (1997)' The roles and function of cellulosa-binding domains, J. Biotechnol. 57 15-28) aumentan la afinidad de enlace de la enzimai con su sustrato. En Chez T. reeeei , la celobiohidrolasa I (CBH I), en ausencia de su dominio fCBD, despliega una actividad catalítica conservada, pero sufre una disminución muy significativa la afinidad de enlace de la enzima, para la celulosa. j Es la primera vez que se identifica un dominio de fijación de este tipo en una arabinofuranosidasa de tipo B en un hongo filamentoso. La presencia de este dominio de fijación aumenta la afinidad de la enzima con su sustrato y, por consiguiente permite mejorar la degradación de la celulosa insoluble. Puesta en práctica de la dosificación de la actividad de la -arabinofuranosidasa B Se mide la actividad de L-arabinofuranosidasa B a i partir1 de un cultivo de P. funiculoeum en un medio M2 con un aditiyo mixto, compuesto por un 0,15 % de Provasoy y un 0.3% de celiulosa, al cabo de 40 h. Se realiza una toma de muestras al cabo de 48 h y de 72 h de cultivo. Se determina la actividad en un erlenmeyer de 200 ml con un volumen útil de 50 ml . Se determina la actividad por hidrólisis de 5 mM de para-riitrofenil- (L-arabinofuranosida) (PNPAF) en un amortiguador 50 mM acetato sódico, pH 5. Se incuban 50 µl de líquido sobrenadante del cultivo con 250 µl de sustrato precalentado a 50SC durante 15 min. Se interrumpe la reacción por adición de 500 µl de NaOH 0.5 M. Se mide la liberación del p-nitrofenilo (PNP) a 405 nm con un coeficiente de extinción molar de 17000 M-l x cm-1. Se define una unidad I enzimática como la cantidad de enzima .que hidroliza 1 µmol de PNPAF por min en las condiciones descritas anteriormente. Para el cultivo del P. funiculosum hemos obtenido 20 mU x ml-1 al cabo de 48 h y 112 mU x ml-1 al cabo de 72 h de cultivo. Estos resultados concuerdan con la literatura, en efecto para el Ae^ergill ue niger se han encontrado actividades del orden de 100¡ a 600 mU x ml-1, en función del inductor empleado para el cultivo. Clonación del ORF abfB~2 del P» funiculosum y transformación en gacjcharojnyces cerevisiae ; A partir del ADN genómico del P. funiculoeum se ha i amplificado el gen abfB-2 mediante una PCR con la ayuda de un par de cebadores (Hind III-abfB-2/Xba I-abfB-2) . Las condiciones de PCR siguientes se han aplicado (94aC durante 30 s; 622C durante 30 s; 72 SC durante 1 min y 30 s; se repite este ciclo 30 veces. Se clona el producto de PCR de 1215 pb en un vector comercial pGEM-T(tm) easy. Secuencia del par de cebadores de PCR Xba I-abfB-2: >5'-TCTAGAATGACGTCCAAACATAGTT-3 ' < Hind III-abfB-2: >5 ' -AAGCTTCTAGAGACATTGAGCGTA-3 ' < Se escinde el fragmento Hind III/Xba I de 1215 bp del vector pGEM-T y se subclona en los sitios Hind III/Xba I en un ¡vector lanzadera (placl95-PGK/CYCl) . Para la expresión heterólloga, el gen abfB-2 se encuentra bajo la dependencia del promotor constitutivo PGK del gen que codifica a la fosfo-glicerato-quinasa ( S. cerevieiae) y del terminador CYC1 ( S. c revieiae) del gen que codifica una actividad de C-oxidasá citocrómica. El nuevo vector de expresión se denomina pOT-02. ¡ Se transforma (método del acetato de litio/choque térmico) la cepa de S. cerevieiae JF #1194 (CEN.PK113-5D) , clon procedente de la cepa CEN.PK 122 y que lleva la auxotrpfia ura 3-52, con el vector de expresión pOT-02. Se seleccionan las cepas transformantes por complementación fenotípica en cajas selectivas sin uracilo (marcador: URA3) . t Se seleccionan seis transformantes para verificar la presencia de una actividad de arabinofuranosidasa B en el liquidó sobrenadante del cultivo. Se cultivan los transformantes en 50 ml de medio mínimo sin uracilo (excepto la cepa control silvestre) durante 24 horas. Se dosifica la actividad de arabinofuranosidasa en los líquidos I sobrenadantes de cultivo aplicando el método descrito en el párrafo anterior. Determ _i|nación del pH óptimo I Se clona el gen abfB-2, que codifica la actividad de arabinofuranosidasa B derivada del P. funiculoeum, en el S. cerevieiae . Después de verificar la presencia de una actividad de arabinofuranosidasa B en varios transformantes I se elige un transformante y se dosifica la actividad ABFB en el líquido sobrenadante deepués de un cultivo después de 24 h de crecimiento. Los cultivos se realizan en matraces erlenmeyer de 200 ml (volumen útil: 50 ml) . Se determina la actividad en presencia de 5 mM de p-nitrofenil-a-L-arabinlofuranosida (PNPAF) en una serie de tampones Me Ilvaine (pH dé 2.2 a 8.0). Se incuban 80 µl de líquido sobrenadante de cultivo con 320 µl de sustrato precalentado a 40SC durante 10 iri. Se interrumpe la reacción con la adición de 1 ml de Na2C03:lM. Se mide la liberación del p-nitrofenilo a 405 nm"1. f Se define como unidad enzimática la cantidad de enzima que hidrolliza 1 µmol de PNPAF por min en las condiciones definidas anteriormente. La curva de actividad se representa en la figura 2. Para el ABFB-2, el óptimo de actividad se sitúa |en pH 2.6 y la enzima conserva un 55% de actividad a pH 3.8. Es la primera vez que se observa un pH óptimo tan bajo para una arabinofuranosidasa y que dicha enzima presenta una actividad del 68% a pH 1.5 en una solución 50 mM de HCl. Determinación de la temperatura óptima Según el mismo protocolo, se ha determinado la temperatura óptima de actividad de la ABFB-2. Se incuba la enzima a cada una de las temperaturas en un amortiguador Me Ilvaine a pH 2.6 durante 10 min. La curva de actividad se represienta en la figura 3. En la literatura se describe una serie de temper¡aturas óptimas para las ABFB, comprendida entre 40 y 60aC. La ABFB-2 del P. funiculosum presenta una actividad óptima a 50aC. Cuando se sitúa al pH y a las temperaturas óptimas! (pH 2.6 y 502C) , hemos observado que la actividad de la ABFE-2 es 20 veces mayor que la actividad determinada en un amortiguador acetato de pH 5 y 40aC (305 mU frente a 15 mU) . Determinación del Kp, y del VTO Se determinan las constantes cinéticas (Km y Vm) de la ABFÉ-2 midiendo la hidrólisis del PNPAF a lo largo del tiempo jen las condiciones óptimas determinadas anteriormente. i Se establecen las series de concentraciones de eustratlo (PNPAF) entre 0.5 y 5 mM en un amortiguador de pH 2.6. Se hace el seguimiento de la cinética de la hidrólisis a I 50 aC durante 10 min. A fin de obtener las constantes cinéticas de cada una de las enzimas los resultados se han tratado según el método de los dobles inversos (Lineweark y Burk) y se presentan en la figura 4. Se determinan las constantes cinéticas por hidrólisis del PNPAF en condiciones óptimas. El valor de Km ¡para la ABFB-2 es de 0.7 mM. Por comparación con los datoe de la literatura, loe valoree de Km de eete tipo de enzima varían entre 0.05 a 1.2 M según el género! y la especie de hongo estudiados . La ABFB-2 presenta una velocidad de hidrólisie máxima (Vm) de 328 moles de PNPAF/mol de enzima/min., en las condiciones descritas anteriormente.

Determinación del peso molecular de la enzima ABFB-2 Con el fin de determinar el peeo molecular de la I enzima j ABFB-2 ee concentra 200 vecee el líquido eobrenadante de un óultivo, obtenido por cultivo en un medio mínimo de un mutante ( S. cerevieiae) , se desnaturaliza por ebullición a i 100SC ¡durante 5 min y después se deposita sobre un gel de poliactilamida-SDS . Se observa que la cantidad de proteínas extracjslulares ee extremadamente pequeña en la cepa silveejtre. Para loe mutantee, la enzima ABFB-2 ee eecreta en I el líduido eobrenadante del cultivo. Es mayoritaria con respec|to al nivel baeal de proteínae extracelularee de S. cerevieiae . En el caeo de la enzima ABFB-2, la vieualización de una banda electroforética obtenida ee difuea lo que eugierie una fuerte glucoeilación de la enzima. Se efectúa la determinación del peeo molecular mediante un marcador de tamaño SeeBlue (Invitrogen) . Los reeultíadoe ee recogen en la tabla 1.

Tabla 1. Peso molecular de la ABFB-2 en kDa Se ha comparado el peeo molecular previeto por el algoritmo de Vector NTi y el peeo molecular obtenido por migración electroforética a través de un gel desnaturalizador de SDS-PAGE. Se ha obeervado una eobrevaloración del peso molecular de la enzima en el gel SDS-PAGE. En efecto, la visualización de una banda electroforética difusa a través del gel eugiere una fuerte glicoeilación de la enzima (glicoeilación de 0 y de N) . Estas glicoeilacionee ee producen a raíz de la maduración de lae proteínae en el organismo de expresión. i Análisis del perfil de expresión del gen abfB°2 esa el PenicjilJiua funi cul osum El Peni ci l l i um funi cul oeum posee dos genes que codifican la a-L-arabinofuranosidasa B: el gen perfilee de expresión de estoe genes en diferentee condiciones de cultiivo del P. funi cul oe um . Se cultiva el P . funi cul oeum en condiciones de inducción de enzimae celulolí ticae y hemicélulolí ticas (medio de cultivo induetrial de tipo M2 ) y en condicionee de no producción (medio mínimo de gluco¡ea MO) . Deepués de 40 h de cultivo ee interrumpe la operación, se recuperan los micelios y se extraen los ARN totales. Se aprecian la cantidad y la calidad de los ARN por medición de la absorbancia a 260 nm y a 280 rim (proporción 260/280 > 1.8). Se cuantifica el nivel de tranecritos que codifican lae actividades de arabinofuranosidasa de tipo B (ABFB-1 y ABFB-2) en I cada una de las dos condiciones (MO y M2 ) mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utiliza el gen codificador de la tubulina (tub-1 I) del P . funi cul oe um como control para ambas condiciones. Este gen codifica una proteína de estructura indispeneable para la integridad de la célula. Se utiliza eete gen de forma corriente como gen de referencia, porque preeenta un nivel de expreeión constante, sea cual sea la condición de cultivo aplicada (ubiqui tario) . Se diseñan cebadores específicoe para la PCR cuantitativa de cada uno de loe genes (abfB-1, abfB-2 y tub-1). Para lae doe condiciones de cultivo (MO y M2 ) se han retrotranscri to 2 µg de ARN total. Se realiza una eerie de dilucionee de loe ADN complementarios reeultantes de la retrotranscripción con el fin de determinar las condiciones óptimas de amplificación de loe genes diana (obligadas en el método de la PCR cuantitativa y para la eficacia de estos pares de cebadores ) . Loe resultados normalizados se recogen en la tabla 2 y en la figura 5.

Tabla 2 : Valores de expreeión diferencial de loe genee abfB-1 y abfB-2 en función de lae condicionee de cultivo de P. funiculoeum Se han deecrito las regulacionee tranecripcionalee de lo{s genee que codifican actividadee celulolíticae y hemicelulolíticas . La expreeión de eetos genes depende en gran manera de la naturaleza y/o de la complejidad de la fuentei de carbono y de nitrógeno, en la que ee cultiva el microorganismo. Se ha conetatado una fuerte repreeión tranecripcional de eetoe genee en preeencia de glucoea. Eeta regulación ee efectúa mediante una proteína de represión catabólica CreA que se fija eepecíficamente sobre el promotor de eetos genes y bloquea su transcripción. Por nuestra experiencia de cuantificación mediante la PCR de los mensajeros de abfB-1 y abfB-2 sabemoe que el nivel de expreeión de eetoe 2 genee en la condición de glucoea (MO) ee muy débil. Eeto eetá de acuerdo con la bibliografía técnica, porgue ee ha demostrado que estos genes preeentan un nivel baeal de expreeión inclueo en condicionee deefavorablee (aueencia de sustratoe celulolíticos y/o hemicelulolíticos) .

Loe resIultadoe obtenidoe en la condición MO están de acuerdo con la bibliografía técnica. A diferencia del gen abfB-1, la expreei.ón del gen abfB-2 no ee induce en condiciones induetrjialee. Eeto sugiere que los cóctelee enzimáticoe producidoe por el Penicillium funiculosum podrían mejoraree haeta lograr la expreeión de la ABFB-2 en el hongo en condiciones industriales o incluso añadiendo la ABFB-2 exógena al cóctel enzimático producido. Determinación de la funcionalidad del fCBD Para verificar la funcionalidad del dominio fCBD se realizan ensayoe de fijación de la enzima ABFB-2 sobre la celulosa microcrietalina. Se mezcla la enzima en volúmenes igualee con un 0.5% de I celulosa microcrietalina en un amortiguador 100 mM Trie-HCl, pH 7.5¡, a 4aC. Se hace el seguimiento de la adhesión de la proteína midiendo la actividad de la arabinofuranosidasa B i residual en preeencia de PNPAF en condicionee de hidrólisie óptimajs predeterminadae . Deepuée de diferentee tiempoe de contacto entre la enzima y la celuloea ee centrifuga la mezcla y se hace el seguimiento de la disminución de la concenjtración de la proteína ABFB-2 midiendo la actividad de arabinjofuranosidasa B del líquido sobrenadante. Se efectúan los ensayoe de fijación frente a una mezcla de reacción de control que contiene la enzima ABFB-2, en lae miemae condiciones experimentales, pero en ausencia de celulosa microcristalina. Se efectúa un segundo control incubando la enzima 7?BFB-1 en las mismae condicionee de reacción, pero en presencia de celulosa microcristalina. Los resultados obtenidoe ee repreeentan en la figura 6. Se ha conetatado que es funcional el dominio de fijación de tipo fúngico (fCBD) , procedente del P. funicuioeum, de la enzima ABFB-2 eobre la celuloea. Se hace el seg imiento de la adhesión de la enzima al cabo de 10 y 45 minutos de haberee puesto en contacto. Deepuée de una incubación de 10 min, un 70% de la cantidad total de la enzima preeente en el instante inicial se ha adherido a la celuloeja microcristalina. Al cabo de 45 minutos, un 80% de la totalidad de la enzima presente en la reacción se ha adherido a la celulosa. Este dato sugiere que el equilibrio de la reacción de contacto se eetablece con gran rapidez y que la cinética de adheeión de la enzima obedece muy probablemente a una ley cinética de orden 1 en lo que reepecta al suetrato durante loe 10 primeroe minutoe. Se hace conetar que con relación a eeta fecha, el mejor método conocido por la eolicitante para llevar a la práctida la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (14)

REIVINDICACIONES Habiéndose deecrito la invención como antecede ee reclama como propiedad lo contenido en lae eiguientee re ¡iivviinnddiicacionee :

1. Polipéptido caracterizado porque consta de un polipéptido elegido entre los polipéptidos siguientee : - el polipéptido de la SEC ID No. 2, - el polipéptido, cuya secuencia eetá comprendida entre la poeición 28 y la poeición 400 de la SEC¡ ID No. 2 , - un fragmento del polipéptido de la SEC ID No. >2 , que tiene una actividad de a-L-arabinófuranoeidaea B, i - un polipéptido que tiene una actividad de a-L-arkbinofuranoeidaea B y preeenta por lo menoe una identidad del 80% con el polipéptido de la SEC ID No. 2. 2. Polinucleótido codificador de la actividad de a-L-arabinofuranoeidasa B, caracterizado porque ee elige entre loe polinucleótidoe eiguientee: el polinucleótido, cuya eecuencia eetá comprendida entre la poeición 268 y la poeición 1470

I de la SEC ID No. 1, el polinucleótido, cuya secuencia está comprendida entre la poeición 349 y la poeición 1470 de la ¡SEC ID No. 1, el polinucleótido que codifica a un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1.

3. Polinucleótido caracterizado porque tiene la secuencia representada por la SEC ID No. 1 o la secuenbia complementaria de la SEC ID No. 1.

4. Cásete de expresión caracterizado porque contiene en el sentido de la transcripción: un promotor funcional en un organismo hospedero ; un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 2; y - una eecuencia terminadora en el miemo organi?mo hoepedero.

5. Vector caracterizado porque contiene un polinu<leótido de conformidad con una de las reivindicacionee 2-3 y/o un caeete de expreeión de conformidad con la reivindicación 4.

6. Organiemo hoepedero caracterizado porque ee traneformado con un polinucleótido de conformidad con una de lae reivindicacionee 2-3, un caeete de expresión de conformidad con la reivindicación 4 y/o un vectjor de conformidad con la reivindicación 5.

7. Organiemo hoepedero de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque ee elige entre levaduras y hongos filamentosos.

8. Organiemo hoepedero de conformidad con la i reivindicación 7, caracterizado porque ee trata de una cepa de Peni cill i um funi culoeum .

9. Aditivo nutricional para animales, caracterizado porque contiene un polipéptido de conformiidad con la reivindicación 1. ¡

10. Aditivo nutricional para animales, caracterizado porque contiene un organismo hospedero de conformidad con una de lae reivindicaciones 6-8 y/o un mosto de fermentación de un organiemo hospedero de conformidad con una de las reivindicaciones 6-8.

11. Aditivo nutricional para animalee de conformidad con una de las reivindicaciones 9-10, caracterizado porque se presenta en forma líquida o en forma de polvo.

12. Alimento para animales caracterizado porque contiene una base nutritiva para animales y un aditivo nutricional para animales de conformidad con una de ¡las reivindicaciones 9-11.

13. Uso de un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 o de un organismo hospedero de conformidad con una de las reivindicaciones 6-8 para la fab icación de un aditivo nutricional para animalee o de un alimento para animalee.

14. Uso de un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 o de un organiemo hoepedero de conformidad con una de las reivindicaciones 6-8 para la hidriólisis de loe enlaces del a-L-arabinofuranosilo de compuestos arabinofuranosil-oligoeacáridoe .