KR102152138B1

KR102152138B1 - 활성이 개선된 자일라나제 변이체 및 이의 생산방법

Info

Publication number: KR102152138B1
Application number: KR1020170169344A
Authority: KR
Inventors: 손정훈; 김미진; 배정훈; 성봉현
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2017-12-11
Filing date: 2017-12-11
Publication date: 2020-09-04
Also published as: KR20190069014A

Abstract

본 발명은 사료첨가용 효소제인 고활성의 자일라나제를 효모를 이용하여 대량생산하기 위하여 자연형(wild type) 보다 활성이 개선된 자일라나제 변이체를 개발하고 이를 효모 TFP 기술을 이용하여 재조합 대량 분비 생산하는 것이다. 또한 재조합 생산된 자일라나제의 열안정성을 향상 시키기 위하여 바이오폴리머인 레반을 첨가제로 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

활성이 개선된 자일라나제 변이체 및 이의 생산방법{An activity-improved xylanase mutant and a method for producing the same}

본 발명은 활성이 개선된 자일라나제 변이체, TFP 기술을 이용한 상기 변이체의 생산방법, 상기 변이체를 포함한 사료 조성물 및 상기 사료 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

자일라나제(Xylanase)는 자일란(xylan)을 자일로올리고당(xylo-oligosaccharide)나 자일로스(Xylose)로 가수분해하는 효소로서 바이오에너지, 식품, 섬유, 제지 및 펄프 산업에 사용되고 있는 효소이다. 지구상에서 가장 풍부한 생물자원인 식물성 섬유소를 분해하고 당화하여 바이오에탄올 생산하는 분야에서 연구가 활발히 진행되고 있으며 고급 용지의 생산 및 폐지재생, 과일음료 및 맥주의 혼탁물 제거, 커피와 식물성 기름 및 전분의 추출 그리고 단위동물의 사료이용 효율 증대와 같은 용도로 이미 산업적으로 널리 사용되고 있는 효소이다.

사료용 곡물에는 대부분의 단위동물이 이용하지 못하는 섬유질을 함유하고 있다. 사료에 포함된 식이섬유는 식물 세포벽을 구성하는 셀룰로스 층과 그 내부의 알곡 전체를 감싸는 헤미셀룰로스 및 베타-글루칸으로 구성된 비전분성 다당류와 리그닌이 합쳐져서 이루어진다. 이 비전분성 다당류는 가축의 소화효소에 의해 분해되지도 않을 뿐만 아니라 곡물중의 전분이나 단백질을 감싸고 있기 때문에 가축이 영양소를 이용하는 효율을 떨어뜨리고 있다. 자일라나제를 곡물 사료에 첨가하면 알곡을 감싸고 있는 헤미셀룰로스 층을 가수분해하여 알곡내에 있는 영양분의 이용성을 높일 뿐만 아니라 가축의 장내 소화물의 상태가 개선될 수 있기 때문에 사료첨가용 효소로 널리 이용되고 있다.

헤미셀룰로스의 주 성분인 자일란을 완전하게 분해하여 당화하기 위해서는 일반적으로 세가지 종류의 효소 즉 엔도 자일라나제(endo-β-xylanase), 엑소자일라나제(exo-β-xylanase) 및 자일로시다제(β-xylosidase)가 함께 작용해야 하는 것으로 알려져 있으며 이들을 자일라나제 효소로 통칭한다. 이들 효소 중 사료첨가제로 가장 많이 사용되고 있는 엔도자일라나제를 생산하는 연구가 많이 진행되었다. 한편, 물소 반추위에서 네오칼리마스티갈스(Neocallimastigales) 유래 자일라나제 유전자 XynR8가 클로닝된 것으로 보고된 바 있다(FEMS Microbiol Lett. 2005. 251(2): 233-41).

자일라나제를 생산하기 위한 방법은 천연적으로 자일라나제를 생산하는 미생물이나 곰팡이를 배양하여 생산하는 방법과 재조합단백질 발현이 용이한 대장균이나 효모 균주를 이용하여 생산하는 방법이 이용되고 있다. 이러한 사료첨가용 자일라나제는 저가로 대량 소비되는 효소이므로 그 생산성이 매우 중요하다.

또한, 사료 조성물을 제조하기 위한 사료 펠릿 제조공정은 고온의 처리과정이 필요하기 때문에 자일라나제의 열안정성을 개선하기 위한 연구와 단위동물 위의 산성조건에서도 활성을 유지하기 위한 내산성 개선에 관한 연구가 광범위하게 진행되고 있다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 자일라나제를 대량생산할 수 있는 기술을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 활성이 증가된 자이라나제 변이체를 개발하였고, 상기 변이체를 단백질 분비 융합 인자를 이용하여 대량 생산할 수 있으며, 레반이 자일라나제의 열안정성을 증가시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 서열번호 2의 아미노산 서열의 C 말단으로부터 1개 내지 60개의 아미노산이 제거된, 자일라나제 변이체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 자일라나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 자일라나제 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 배양된 형질전환체 또는 이의 배양물로부터 자일라나제 변이체를 회수하는 단계를 포함하는, 자일라나제 변이체의 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) 상기 자일라나제 변이체; (b) 상기 자일라나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환체; 또는 (c) 상기 형질전환체의 배양물을 포함하는, 사료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) 상기 자일라나제 변이체; (b) 상기 자일라나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환체; 또는 (c) 상기 형질전환체의 배양물을 배합사료와 혼합하는 단계를 포함하는 사료 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 서열번호 2의 아미노산 서열의 C 말단으로부터 1개 내지 60개의 아미노산이 제거된, 자일라나제 변이체를 제공한다. 상기 자일라나제 변이체는 C-말단에 추가적으로 6 내지 9개의 아미노산을 포함할 수 있다.

본 발명의 자일라나제 변이체는 천연형/야생형 자일라나제에 비해 활성이 증가되거나, birchwood 자일란의 가수분해 활성이 증가되어, 사료 제조에 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 용어, "자일라나제(xylanase)"는 자일란(xylan)을 가수분해하는 효소의 총칭이다. 구체적으로, 자일라나제는 엔도 자일라나제(endo-β-xylanase), 엑소자일라나제(exo-β-xylanase) 및 자일로시다제(β-xylosidase) 등을 포함할 수 있다. 상기 자일라나제는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 그 예로, 난배양성 네오칼리마스티갈리스(Uncultured Neocallimastigales) 유래 자일라나제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 서열번호 2의 아미노산 서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 자일라나제는, "xynR8" 또는 "xynR8 단백질"과 혼용될 수 있다.

또한, 본 발명에서 자일라나제는, 서열번호 2 및 상기 서열번호 2와 적어도 50%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 이러한 상동성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 보조 단백질도 본 발명의 자일라나제로 사용될 수 있음은 자명하다.

본 발명에서 "자일라나제 변이체"는 천연형/야생형 자일라나제와 비교하여 아미노산 서열에 하나 이상의 차이가 있는 펩타이드; 천연형/야생형 자일라나제 서열을 개질(modification)을 통하여 변형시킨 펩타이드를 포함한다.

구체적으로, 자일라나제 변이체는 천연형/야생형 자일라나제에서 하나 이상의 아미노산이 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion) 및 수식(modification) 중 어느 하나의 방법 또는 이러한 방법들의 조합을 통하여 변형된 것일 수 있다.

또한, 본 발명에서 자일라나제 변이체는 천연형/야생형 자일라나제에 비해 활성이 증가되거나, birchwood 자일란의 가수분해 활성이 증가된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 자일라나제 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 자일라나제의 C-말단으로부터 1개 내지 60개의 아미노산이 제거된 변이체일 수 있다. 또한, 상기 C-말단으로부터 제거된 아미노산의 수는 10개 내지 60개, 20개 내지 60개, 또는 30개 내지 60개일 수 있으며, 구체적으로, 31, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 57개일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에서 자일라나제 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 자일라나제 또는 이의 C-말단으로부터 1개 내지 60개의 아미노산이 제거된 자일라나제 변이체의 C-말단에 추가적으로 6 내지 9개의 아미노산을 포함할 수 있다. 구체적으로, C-말단에 추가되는 아미노산 서열은 '발린(Valine)-아스파르트산(Aspartic acid)-류신(Leucine)-아스파라진(Asparagine)-글루타민산(Glutamic acid)-트레오닌(Threonine)'일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 상기 자일라나제 변이체는 서열번호 48 내지 51로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열 및 상기 아미노산 서열과 적어도 50%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 이러한 상동성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 보조 단백질도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

또한, 코돈 축퇴성 (codon degeneracy)에 의해 상기 서열번호 48 내지 51로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 단백질 또는 이와 상동성을 가지는 단백질로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 포함될 수 있음은 자명하다. 또는 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 서열번호 48 내지 51로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 동일/유사한 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 서열이라면 제한 없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성이 높은 유전자끼리, 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60, 1 X SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60, 0.1 X SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68, 0.1 X SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.

혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 발명은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60, 63 또는 65일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.

폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).

상기 "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 모이어티(moiety) 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 하나의 모이어티로부터 다른 하나의 모이어티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley& Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.

또한, 본 발명의 자일라나제 변이체는 추가적으로 N-말단, C-말단, 또는 양 말단에 정제용 태그(tag)를 포함할 수 있다. 상기 정제용 태그는 His tag, GST tag, Trx tag, Ubiquitin tag, 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 자일라나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.

본 발명에서 자일라나제의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 네오칼리마스티갈스 유래, 구체적으로 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 유전 암호의 축퇴성(genetic code degeneracy)에 기인하여 동일 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열 및 이의 변이체 또한 본 발명에 포함되며, 구체적으로 서열번호 1로 표시될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 자일라나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 구체적으로 서열번호 52 내지 55로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들 조합에 의해 용이하게 변형될 수 있다. 따라서, 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 1의 염기서열과 적어도 50%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드도 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 자일라나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 자일라나제 발현 카세트를 제공한다. 구체적으로 상기 자일라나제 발현 카세트는 단백질 분비 융합 인자(Translational fusion partner, TFP)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 자일라나제 발현 카세트는 자일라나제 변이체를 발현시키거나/발현시키고, 발현된 자이라나제 변이체를 세포 밖으로 분비시킬 수 있다.

본 발명의 용어, "발현 카세트"는 세포 내에서 구조 유전자의 발현에 영향을 줄 수 있는 핵산 요소를 지닌다. 자연적으로 발생되거나 합성된 핵산구조로서 일반적으로 발현 카세트는 전사되는 핵산과 프로모터를 포함한다. 본 발명의 목적상 상기 발현 카세트는 단백질 융합인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 자일라나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 자일라나제 변이체의 분비를 유도하는 자알라나제 분비 발현 카세트일 수 있다.

상기 발현 카세트는, 상기 단백질 융합인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 자일라나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에 Kex2p 인식 부위인 Lys-Arg를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 발현 카세트가 코딩하는 융합 단백질이 Kex2p에 의해 프로세싱되어 자일라나제 변이체가 세포 밖으로 분비되도록 제작된 발현 카세트일 수 있다. 상기 Kex2p는 Lys-Arg를 인식하고 절단하여, 효모에서 분비 과정 중 자일라나제 변이체만 세포 밖으로 분비되도록 할 수 있다.

본 발명의 자알라나제 분비 발현 카세트에 있어서, 상기 자일라나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 단백질 분비 융합인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 링커로 서로 연결된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어, "단백질 융합인자(Translational fusion partner, TFP)"는 목적 단백질의 분비 생산에 유용한 아미노산 또는 핵산으로서, 재조합 발현 시스템 하에서 발현되지 않거나 발현율이 매우 낮은 목적 단백질을 포함하여 어떤 단백질이라도 숙주 세포로부터 분비가 유도되도록 도와주는 역할을 하는 것을 말한다. 본 발명에서 사용하는 단백질 융합인자는 대한민국 등록특허 제10-0975596호에 개시된 것을 사용하였고, 구체적으로 서열번호 8 내지 27으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 본 발명에서 상기 서열번호 8 내지 27의 TFP는 각각 TFP 1 내지 TFP 20으로 명명되었다. 또한, 상기 TFP의 염기서열은 서열번호 28 내지 47일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 상기 단백질 융합인자는 서열번호 8의 TFP 1, 서열번호 11의 TFP 4, 서열번호 15의 TFP 8, 서열번호 17의 TFP 10 또는 서열번호 20의 TFP 13일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 단백질 융합인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 구체적으로 서열번호 28 내지 47로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 염기서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 자일라나제 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현 시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pRB58, pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.

또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 발명의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 발현 벡터에는, 목적 유전자의 발현의 억제 또는 증폭, 또는 유도를 위한 각종의 기능을 가진 발현 억제용의 단편이나, 형질전환체의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성 유전자, 균체 밖으로의 분비를 목적으로 한 시그널을 코딩하는 유전자, 난발현성 단백질에 적합한 맞춤형 융합인자 등을 추가로 포함할 수 있다. 특히, 상기 난발현성 단백질에 적합한 맞춤형 융합 인자로서, 상기 단백질 융합인자를 사용함이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 자일라나제 발현 카세트를 포함하는 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다. 본 발명의 형질전환체는 생산된 자일라나제 변이체를 세포 내에 가지고 있거나, 생산된 자일라나제 변이체를 세포 밖으로 분비할 수 있다.

본 발명에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다. 상기 형질전환 하는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, EAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 형질전환에 사용되는 숙주 세포는 당업계에 널리 알려져 있는 숙주세포는 어떤 것이나 사용할 수 있으나, 본 발명의 자일라나제 유전자의 도입효율과 발현효율이 높은 숙주를 사용할 수 있는데, 예를 들면 박테리아, 곰팡이, 효모, 식물 또는 동물(예컨대, 포유동물 또는 곤충) 세포를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 숙주세포는 효모를 사용할 수 있으며, 상기 효모는 캔디다 (Candida), 디베리오마이세스 (Debaryomyces), 한세눌라 (Hansenula), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 피키아 (Pichia), 스키조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces), 야로이야 (Yarrowia), 사카로마이시스 (Saccharomyces), 슈완니오마이세스 (Schwanniomyces) 및 아르술라 (Arxula) 속으로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있고, 구체적으로 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시양태에서 형질전환체는 자일라나제 변이체 및 TFP의 폴리뉴클레오티드를 포함하고 있어, 자일라나제 변이체를 대량으로 분비 생산할 수 있다. 따라서, 상기 형질전환체는 활성이 개선된 자일라나제를 대량생산할 수 있어 사료 제조에 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 (a) 본 발명의 형질전환체를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 배양된 형질전환체 또는 이의 배양물로부터 자일라나제 변이체를 회수하는 단계를 포함하는, 자일라나제 변이체의 생산방법을 제공한다.

상기 형질전환체, 자일라나제 변이체는 전술한 바와 같다.

본 발명에서 (a) 단계는 본 발명의 자일라나제 발현 카세트를 포함하는 형질전환체를 배양하여, 본 발명의 자일라나제 변이체를 생산하는 단계이다.

본원에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 방법에 있어서, 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 본원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 구체적으로는 본원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.

본원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스, 만니톨, 소르비톨 등과 같은 탄수화물; 당 알코올, 글리세롤, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 알코올; 유기산, 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2종 이상이 조합되어 사용될 수 있다.

상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2종 이상이 조합되어 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본원에서, 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다.

배양물의 온도는 25℃ 내지 37℃일 수 있으며, 보다 구체적으로는 27 내지 35일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 배양 기간은 원하는 유용 물질의 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 10시간 내지 100시간일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는, 상기 형질전환체를 이용해 유가식 배양을 수행하여, 자일라나제 변이체를 확보하였다.

본 발명의 용어, "유가식 배양"은 생산물의 높은 최종 농도와 생산성을 가지는 배양 방법으로서, 고농도 세포배양에 매우 자주 이용되며, 초기에 한 번 배지를 채운 후, 새로운 배양액이나 성장제한 기질용액 또는 생산물의 전구체 등을 추가로 공급하지만 반응 생성물은 발효조에 남아있게 하는 방법이다.

유가식 배양의 구체적인 일 실시양태는 50ml의 최소 액체 배지(0.67% 아미노산이 결여된 효모 질소원 기질, 0.5% 카사미노산, 2% 포도당)에 1단계 종균 배양한 후, 다시 200ml의 YPD 액체배지(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 포도당)에서 배양하여 활성화시킨 후, 본 배양액에 접종하여 30에서 48시간 동안 배양하면서 세포 성장 속도에 따라 유가 배양식 배지(15% 효모 추출물, 30% 포도당)를 추가 공급하는 것이다.

다음으로, (b) 단계는 상기 (a) 단계에서 배양된 형질전환체 또는 이의 배양물로부터 자일라나제 변이체를 회수하는 단계이다. 숙주세포에 따라 적절한 배양 조건을 조성해주면 본 발명에 따른 형질전환체는 자일라나제 변이체를 생산하게 되며, 벡터의 구성 및 숙주세포의 특징에 따라 생산된 자일라나제 변이체는 숙주세포의 세포질 내, 원형질막 공간(periplasmic space) 또는 세포 외로 분비될 수 있다.

또한, 상기 배양 단계에서 생산된 자일라나제를 회수하는 방법은 배양방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양된 형질전환체 또는 이의 배양물로부터 목적하는 생산물을 수집할 수 있다.

상기 회수 단계는 분리 공정 및/또는 정제 공정을 포함할 수 있다.

숙주세포 내 또는 외에서 발현된 단백질은 통상의 방식으로 정제될 수 있다. 정제 방법의 예로는 염석(예: 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전 등), 용매 침전(예: 아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전 등), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합하여 적용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 (a) 본 발명의 자일라나제 변이체; (b) 상기 자일라나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환체; 또는 (c) 상기 형질전환체의 배양물을 포함하는, 사료 조성물을 제공하는 것이다. 상기 자일라나제 변이체, 형질전환체에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명에서 "배양물"은 자일라나제 변이체가 포함된 배지를 의미하며, 배양물에는 형질전환체가 포함되거나 포함되지 않을 수 있다. 구체적으로, 상기 배양물은 형질전환체가 배양된 배지 또는 배양 상등액을 포함한다.

본 발명의 사료 조성물은 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미할 수 있으며, 당업계의 공지된 다양한 형태로 제조 가능하다.

또한, 본 발명의 사료 조성물은 레반을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 용어, "레반(levan)"이란, 과당 중합체의 일종으로서, β 26로 결합한 프룩토오스로 이루어진 다당이다. 식물에서는 단자엽식물, 특히 볏과의 잎이나 줄기에서 볼 수 있으며, 가장 잘 알려져 있는 레반으로는 돼지감자 또는 그 밖의 식물에서 얻을 수 있는 이눌린이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 레반은 자연 유래이거나 또는 화학적으로 합성된 것을 모두 포함한다.

또한, 본 발명의 사료 조성물은 자일라나제 및 레반을 중량 대비 1:0.02 내지 1로 포함할 수 있고, 구체적으로 레반은 사료 조성물 전제 중량대비 2% 포함될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 사료 조성물은 음수제일 수 있다. 음수제란 액체 형상의 투여 가능한 형태를 의미하며, 사료관리법상의 보조사료에 해당한다.

본 발명의 사료 조성물은 영양소 보충 및 체중감소 예방, 사료 내 섬유소의 소화 이용성 증진, 유질 개선, 번식장애 예방 및 수태율 향상, 하절기 고온 스트레스 예방 등 다양한 효과를 나타내는 물질을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어 탄산수소나트륨, 벤토나이트(bentonite), 산화마그네슘, 복합광물질 등의 광물질제제, 아연, 구리, 코발트, 셀레늄 등의 미량 광물질인 미네랄제제, 케로틴, 비타민 E, 비타민 A, D, E, 니코틴산, 비타민 B 복합체 등의 비타민제, 메티오닌, 리이산 등의 보호아미노산제, 지방산 칼슘염 등의 보호지방산제, 생균제(유산균제), 효모 배양물, 곰팡이 발효물 등의 생균, 효모제 등이 추가로 포함될 수 있다.

본 발명의 사료 조성물은 포유류, 가금류를 포함하는 다수의 동물 식이 즉, 사료 및 음용수에 적용할 수 있다. 구체적으로, 상업용으로 중요한 돼지, 소, 염소 등의 포유류, 코끼리, 낙타 등의 동물원 동물, 개, 고양이 등의 가축에게 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 (a) 본 발명의 자일라나제 변이체; (b) 상기 자일라나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환체; 또는 (c) 상기 형질전환체의 배양물을 배합사료와 혼합하는 단계를 포함하는 사료 조성물의 제조방법을 제공한다. 상기 자일라나제 변이체, 형질전환체, 배양물에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명의 '배합사료'는 가축의 사육목적에 맞는 영양소를 고르게 공급할 수 있도록 배합하여 만든 사료로서, 구체적으로 조사료, 부산물사료, 농후사료 및 사료 첨가제 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 '조사료(roughage)'는 목초, 건초, 사일리지, 옥수수, 파, 씨 있는 과일의 껍데기 등 섬유질로, 에너지함량(가소화양분함량)이 적은 사료를 의미한다. 가축, 특히 초식동물의 사료이다. 반추위를 갖는 가축에서는 생리적으로 어느 정도의 양은 유지되어야 한다. 또 근채류는 그 자체가 수분함량이 높기 때문에 조사료(租飼料)로 취급되고 있지만, 건조하면 농후사료로 취급된다.

상기 '부산물사료(by-product feed)'는 농산물 또는 식품의 제조 과정에서 나오는 각종 강피류(糠皮類), 박류(粕類) 등 사료로 이용되는 2차 산물을 의미한다.

또한, 상기 '농후사료(concentrated feed stuff)'는 곡류, 겨류, 깻묵류가 이에 속한다. 이 사료는 가소화 성분은 많으나 그 성분이 한쪽으로 치우친 것이 많으며, 성질도 각각 다른 것이 많으므로, 실제 사료를 배합할 때에는 여러 종류의 농후사료를 배합하여야 한다. 농후사료는 주로 비육(肥肉)하는 가축과 젖, 알 등을 생산하는 가축에게 많이 쓰인다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 자일라나제 변이체를 포함하는, 사료 첨가제 조성물을 제공하는 것이다. 상기 자일라나제 및 자일라나제 변이체에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명의 사료첨가제 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 성분 이외에 추가로 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산 등의 유기산이나 인산칼륨, 인산나트륨, 중합 인산염 등의 인산염이나 폴리페놀, 카테친, 토코페롤, 비타민 C, 녹차 추출물, 키토산, 탄니산 등의 천연 항산화제 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화 할 수 있다.

또한, 본 발명의 사료첨가제 조성물 및 이를 포함하는 사료 조성물은 보조성분으로 아미노산, 무기염류, 비타민, 항산화, 항곰팡이, 미생물 제제 등과 같은 각종 보조제 및 분쇄 또는 파쇄된 밀, 보리, 옥수수 등의 식물성 단백질사료, 혈분, 육분, 생선분 등의 동물성 단백질 사료, 동물성 지방 및 식물성 지방 같은 주성분 이외에도 영양 보충제, 성장 촉진제, 소화 흡수 촉진제, 질병 예방제와 함께 사용될 수 있다.

상기 동물 사료용 사료 첨가제는 동물의 사료에 직접 혼합하거나 사료와 별도로 단독으로 경구 제형, 주사 또는 경피로 다른 성분과 조합하여 쉽게 투여 할 수 있다. 투여량은 동물의 체중, 건강상태, 식이, 투여방법 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 당 업계에서 잘 알려진 바와 같이 일일 투여량은 약 0.1~10㎎/g, 구체적으로 0.05~1㎎/g이며, 하루 일회 내지 수회 에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 사료 첨가제 조성물은 포유류, 가금류를 포함하는 다수의 동물 식이 즉, 사료에 적용할 수 있다. 구체적으로, 상업용으로 중요한 돼지, 소, 염소 등의 포유류, 코끼리, 낙타 등의 동물원 동물, 개, 고양이 등의 가축에게 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 사료 첨가제 조성물을 포함하는 동물용 사료 배합 방법은 사료 첨가제 조성물을 동물사료에 건조 중량 기준으로 1kg 당 약 10g 내지 500g, 구체적으로는 10g 내지 100g의 양으로 혼합하는 것이다. 또한 사료 혼합물을 완전히 혼합한 후, 매쉬로 공급하거나, 추가가공 공정을 통하여 팰렛화, 팽창화, 압출공정을 거치는 것이 바람직하다.

또한 본 발명의 사료 첨가제 조성물은 레반을 추가로 포함할 수 있다. 상기 레반에 대한 설명은 전술한 바와 같다. 또한, 본 발명의 사료첨가제 조성물은 자일라나제 및 레반을 중량 대비 1:0.02 내지 1로 포함할 수 있고, 구체적으로 레반은 사료 첨가제 조성물 전제 중량대비 2% 포함될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 사료 조성물 또는 사료첨가제 조성물을 포함하는, 사료를 제공하는 것이다.

본 발명의 자일라나제 변이체는 활성이 증가되고, birchwood 자일란의 가수분해 활성이 증가되며, 자일라나제 대량 생산에 효과적으로 활용될 수 있는 바, 사료 제조에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 난배양성 네오칼리마스티갈리스(Uncultured Neocallimastigales) 유래 xynR8 유전자를 20종의 효모 단백질 분비융합인자(TFP)와 GAL10 프로모터에 연결하여, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 균주에 도입을 위한 PCR 및 in vivo 재조합 과정을 나타내는 모식도이다. 단백질 융합인자와 xynR8 사이에는 효모 Kex2p 프로테아제가 인식하는 서열을 삽입하여 분비과정에서 자연적으로 효모 단백질 분비융합인자가 제거되어 활성형의 자일라나제가 분비되도록 고안되었다.
도 2는 효모 유래의 20개 TFP 벡터에 xynR8이 도입되어 형성된 20종의 형질전환체를 각각 YPD 배지에서 배양하고 배양 상등액을 농축하여 SDS-PAGE로 확인(A)하고 배양액의 자일라나제 활성을 분석한 결과(B)이다. 1 내지 20은 1번 내지 20번의 TFP를 나타내고, M은 마커를 나타낸다.
도 3은 선별된 xynR8 분비발현 벡터(TFP 1, 4, 8, 10, 및 13)가 도입되어 제조된 형질전환체들을 YPD 배지에서 배양하고, 상기 배양 상등액을 농축한 후 탈당화효소(endo-H)로 처리한 후 SDS-PAGE(A) 및 Western blotting(B)으로 분석한 결과이다.
도 4은 xynR8의 C 말단에 무작위적으로 아미노산을 추가하여 제작한 변이주를 YPD 배지에서 배양하여, 상기 배양 상등액을 SDS-PAGE로 확인(A)하고, 자일라나제 활성을 분석한 결과(B)이다.
도 5의 A는 야생형 xynR8과 4종의 xynR8 변이체의 아미노산 서열을 비교한 도이고, B는 4종의 xynR8 변이체를 포함하는 형질변환체의 배양 상등액에 분비된 자일라나제를 SDS-PAGE로 분석한 결과이고, C는 4종의 xynR8 변이체의 자일라나제 활성을 분석한 결과이다.
도 6은 xynR8(A)와 xynR8Δ57 변이체(B)를 발현하는 형질전환체를 5L 발효조에서 유가식 배양한 후, 배양 상등액 10ul를 SDS-PAGE 분석한 결과(위) 및 시간별 세포성장 및 자일라나제 활성을 보여주는 그래프(아래)이다.
도 7는 야생형 xynR8과 xynR8Δ57 변이체의 기질 특이성과 열안정성을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 열안정 보조제의 xynR8Δ57의 열안정성 증진 효과를 확인한 결과이다: (A) 무처리 xynR8Δ57의 온도별 열안정 분석 결과, (B) 보조제 첨가 후 xynR8Δ57의 열안정 분석 결과, (C) 2% 레반 첨가 유무에 따른 80도 열처리 시간별 잔여 활성 비교 결과.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 자일라나제 ( Xylanase , xynR8 ) 유전자 합성

물소 반추위에서 직접 클로닝된 난배양성 네오칼리마스티갈리스(uncultured Neocallimastigales) 유래의 자일라나제는 전체 유전자가 아닌 부분적인 서열이 공개되어 있다(FEMS Microbiol Lett. 2005 Oct 15;251(2):233-41). 공개된 295개의 아미노산 서열을 효모 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)에 적합한 코돈으로 교체하고, ㈜바이오니아에 의뢰하여 유전자를 합성하였다(서열번호 1 및 2). 합성된 자일라나제(xynR8)는 글리코사이드 하이드로라제 패밀리 11(Glycoside hydrolase family 11)에 해당한다.

실시예 2: XynR8에 각각의 20종의 단백질 융합인자(TFP)가 도입된 형질전환체 제작

합성된 자일라나제 유전자(xynR8)의 분비 발현 벡터를 제작하기 위해 다음과같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, LNK39(서열번호 3)와 HisGT50R(서열번호 4)를 프라이머로 이용하여 xynR8을PCR 증폭(94에서 5분간 1회; 94 30초간, 55 30초간, 72 1분간 25회, 72 7분간 1회)하였다. 그 후 상기 PCR 산물을 단백질 분비발현을 도와주는 20종의 단백질 분비 융합인자(한국등록특허 제10-0975596호)를 함유한 선형의 벡터와 함께 효모 균주 Y2805Δgal80(Mat a pep4::HIS3 prb1 can1 his3-200 ura3-52, gal80)에 도입하여, 세포 내 재조합을 통하여 형질전환체가 형성되도록 하였다(도 1).

상기의 LNK39와 HisGT50R 프라이머로 증폭한 PCR 산물은 벡터의 링커(linker) 말단과 40개의 염기가 동일하고, GAL7 전사 종결자 말단과 50개의 염기가 동일하다. 따라서, 상기의 PCR 산물을 선형화된 벡터와 함께 효모 세포로 도입하면, 세포 내에서 교차가 일어나서 xynR8 유전자와 단백질 분비융합인자 벡터가 일정한 방향으로 연결되어 재조합 벡터가 제작된다.

상기의 재조합 벡터가 도입된 효모세포를 우라실(Urasil)이 없는 선택배지인 SD-Ura 배지(0.67% 아미노산이 결여된 효모기질, 0.77% 우라실이 결핍된 영양보충물, 2% 포도당)에서 선별하였다. 상기 방법을 통해, 대장균을 이용한 벡터 제작 과정 없이, 곧바로 발현벡터가 도입된 형질전환체를 제작하였다.

실시예 3. 단백질 분비 융합인자를 이용한 xynR8의 분비 생산

xynR8의 분비-생산이 가능하고, 높은 분비율을 보이는 단백질 융합 인자를 선별하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 실시예 2에서 제작한 형질전환체를 YPD(1% 효모추출물, 2% 펩톤, 1% 포도당)에서 40시간 배양한 후 원심분리하여 균체를 제거하고 배양상등액 0.6ml을 0.4ml 아세톤(acetone)으로 침전시켜 SDS-PAGE을 이용하여 발현된 자일라나제의 양을 비교하였고, 동시에 자일라나제의 활성을 비교하였다(도 2).

분비된 자일라나제의 활성 확인은 beechwood 자일란(Sigma)을 기질로 하여 효소 반응 후 유리된 환원당을 3,5-디나이트로살리사이클릭산(3,5-dinitrosalicylic acid: DNS) 방법으로 정량하였다. 구체적으로, 1.2%(w/w) 자일란 용액 250㎕와 50mM 소듐 아세테이트 버퍼(pH6.0)에 현탁시킨 효소 용액 250μl를 혼합하여 60℃에서 반응시켰다. 10분 반응 후 750μl DNS를 첨가하여 반응을 정지시키고, 끓는 물에서 5분 동안 방치하여 발색시킨 후 540nm 에서 흡광도를 측정하였다. 자일로스를 표준시료로 사용하여 동일조건에서 상기와 같은 방법으로 발색시켜 측정한 흡광도와 비교함으로써 유리된 환원당의 양을 결정하였다. 효소 활성은 1분 동안 위 조건에서 자일란으로부터 1μmol의 자일로스에 상응하는 환원당을 생성할 수 있는 효소의 양으로 정의하였다.

그 결과, 도 2에서 보는 바와 같이 38kDa 부근에서 xynR8 단백질 밴드가 확인되었으며, 아울러 당쇄가 첨가된 xynR8 단백질로 추정되는 고분자량 밴드가 관찰되었다. 또한, 분비 발현된 단백질량에 비례하여 효소 활성에서도 차이를 보였고, 20종의 TFP를 갖는 형질전환체 중에서, 비교적 높은 활성을 보이는 TFP 1, 4, 8, 10 및 13번을 갖는 형질전환체를 1차 선별하였다.

또한, 상기의 높은 분비율을 보이는 TFP 1, 4, 8, 10, 13번을 갖는 형질전환체에 의하여 분비된 xynR8 단백질에 엔도에이치(Endo-H)효소를 처리하여 당쇄를 제거한 후, SDS-PAGE와 웨스턴 블랏팅(Western blotting)으로 분석을 하였다.

구체적으로, 웨스턴 블랏팅을 위해 SDS-PAGE 젤(gel)로 전개된 단백질을 전기이동(electrotransfer, Invitrogen)를 이용하여 PVDF 멤브레인(membrane)으로 전이시켰다. 그 후, 상기 멤브레인을 TBST 완충액(buffer, 10mM Tris-HCl pH8.0, 0.15M NaCl, tween 20 ml/L)으로 세척한 뒤 상온에서 1시간 동안 3% 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)을 함유한 TBST로 비특이적 결합 가능성을 차단하였다. 이 후 상기 멤브레인을 TBST로 3회, 5분씩 상온에서 세척하고, 1차 마우스(mouse) 유래의 항-His 항체(Sigma)를 0.5% BSA를 함유한 TBST로 3000배 희석한 용액으로 상온에서 1시간 반응시켰다. 이 후 상기 멤브레인을 TBST 완충액으로 5분 간격으로 3번 반복 세척하여 비 특이적인 항체 결합을 제거하였다. 세척된 멤브레인을 2차 항-마우스 IgG 항체(Sigma)를 2000배 희석한 용액으로 상온에서 1시간 반응시킨 후, 다시 TBST 완충액으로 5분 간격으로 3번 세척하였다. 이 후 멤브레인에 BCIP 용액(Sigma)을 도말하여 발현된 자일라나제 단백질 밴드를 확인하였다(도 3).

그 결과, 당쇄가 결합된 고분자량의 단백질은 제거되고 38kDa의 단백질의 양이 증가한 것으로 확인되어 분비 발현된 단백질 일부는 당쇄가 부가되어 있음을 확인하였다(도 3).

실시예 4. 자일라나제 변이주 선별

실시예 3에서 확보한 HHDPITKST 아미노산 서열보다 자일라나제의 활성을 더욱 개선할 수 있는 아미노산 서열을 개발하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 자일라나제의 C 말단에 무작위적으로 아미노산이 도입된 라이브러리를 제작하기 위해, LNK39(서열번호 3)와 9개의 무작위적 아미노산 서열을 포함하는 MJ627 프라이머(서열번호 5)로 PCR을 수행하여, xynR8 유전자를 증폭하였다. 상기의 PCR은 94에서 5분간 1회; 94 30초간, 55 30초간, 72 2분간 반응을 25회; 72에서 7분간 1회 반응조건으로 수행하였다. 아가로스젤 전기영동을 통해 회수된 PCR 산물은 선형화된 TFP13 벡터와 함께, YNB+RBB-자일란(0.67% 아미노산이 결여된 효모기질, 0.77% 우라실이 결핍된 영양보충물, 1% Remazol Brilliant Blue 자일란) 평판배지에서 in vivo 재조합을 통해 사카로마이세스 세레비지에 Y2805Δgal80 균주에 도입하였다. 상기 균주를 48시간 배양하여 약 400개의 형질전환체를 선별하였다. 이들 형질전환체가 증식하면서 발현된 자일라나제에 의해 배지에 포함된 RBB 자일란이 분해되어 투명환이 형성되는데, 자일라나제의 발현량 또는 활성에 비례하여 투명환의 반경이 증가하므로, 투명환의 크기를 기준으로 우수한 자일라나제 활성을 나타내는 29개의 형질전환체를 선별하였다.

선별된 29개의 형질전환체를 3ml YPD 액체 배지에 접종하고 30℃, 230rpm으로 40시간 배양하였다. 배양 후, 배양 상등액을 실시예 3과 같이 SDS-PAGE(도 4A)와 자일라나제 활성 분석(도 4B)으로 자일라나제의 발현여부를 확인하였다.

그 결과, 1번 형질전환체는 자일라나제 유전자 크기로부터 유추되는 단백질보다 작은 28kDa 위치에서 발현되는 단백질이 확인되었고, 스크리닝된 균주들 중에서 가장 높은 활성을 보였으며, 대조군 대비 143%의 활성 증가가 확인되었다. 상기 형질전환체로부터 플라스미드를 회수하여 염기서열을 분석한 결과, xynR8의 C 말단의 아미노산 57개가 결실됨과 동시에 아미노산 서열 VDLNET(서열번호 56)이 추가 도입된 xynR8의 변이체가 만들어졌음을 확인하였고, 상기 자일라나제 변이체를 xynR8Δ57(서열번호 49)로 명명하였다.

상기 변이체를 발현하는 벡터(YGaT13xynR8Δ57)로 사카로마이세스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae) 를 형질전환시킨 균주를 Saccharomyces cerevisiae Y2805ga180/Yga-T13-xynR8△57라고 명명하여, 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 2017년 8월 17일자로 기탁하고, 수탁번호 KCTC18594P를 부여받았다.

실시예 5. C 말단이 결실된 자일라나제 변이체 발현 및 활성 비교

상기 실시예 4에서 확보한 xynR8Δ57의 활성이 개선된 이유가 C 말단 결실에 의한 효과인지, 또는 VDLNET 아미노산 서열 추가에 의한 것인지를 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 도 5A에 나타낸 바와 같이, 4개의 자일라나제 변이체를 제작하고, 이들의 발현량과 활성을 비교하였다. 2번 변이체는 상기 실시예 4에서 확보한 xynR8Δ57이며, 1번 변이체는 2번과 동일한 수의 아미노산이 결실되었지만 VDLNET 아미노산 서열 대신 6개 히스티딘 아미노산이 추가된 변이체이다. 3번과 4번 변이체는 C 말단 31개 아미노산을 제거한 후 6개 히스티딘 아미노산과 VDLNET 아미노산 서열이 각각 추가된 변이체이다. 상기 4개의 자일라나제 변이체는 하기의 표 1에 기재하였다.

이 름	설 명	서열번호
1번 변이체	xynR8 C 말단의 57개 아미노산 결실	48
2번 변이체	xynR8 C 말단의 57개 아미노산 결실 + VDLNET	49
3번 변이체	xynR8 C 말단의 31개 아미노산 결실	50
4번 변이체	xynR8 C 말단의 31개 아미노산 결실 + VDLNET	51
5번	야생형 xynR8	2

상기 각각의 자일라니제 변이체를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 균주를 YPD(1% 효모추출물, 2% 펩톤, 2% 포도당) 배지에서 40시간 배양하고, 상기 배양 상등액을 실시예 3과 같은 방법으로 SDS-PAGE 분석(도 5B) 및 활성 분석(도 5C)을 수행하였다.

그 결과, 야생형 xynR8인 5번에 비해 다른 모든 변이체들의 자일라나제 발현량이 2배 정도 증가하였고 활성은 180% 이상 증가하였다(도 5B 및 8C). 따라서 이러한 활성증가는 자일라나제 C 말단의 아미노산의 결실에 의한 것임을 알 수 있었다. 또한, 1, 3번 변이체에 비해 2, 4번 변이체가 10 내지 20% 높은 활성을 나타내는 것을 확인하였는 바, 이는 C 말단에 추가된 VDLNET 아미노산 서열에 의한 효과임을 알 수 있었다.

따라서, xynR8 유전자를 효과적으로 발현하기 위해서는 C 말단의 아미노산을 결실시키고, C 말단에 VDLNET 서열을 도입하는 것이 바람직하다.

실시예 6. 야생형 XynR8과 XynR8Δ57의 대량 생산

상기 실시예 5에서 제작한 자일라나제 생산 균주인 2805gal80/TFP13-xynR8(5번 야생형)과 2805gal80/TFP13-xynR8Δ57(2번 변이체)을 대량생산 후, 분비량 및 특이활성을 비교하기 위해 상기의 자일라나제 생산 균주를 5L 발효조에서 유가식 배양을 수행하였다.

구체적으로, 본 배양에 들어가기 전에 50㎖의 최소 액체배지(0.67% 아미노산이 결여된 효모 질소원 기질, 0.5% 카사미노산, 2% 포도당)에서 상기 자일라나제 생산 균주를 1단계 초기 배양하였다. 이 후, 상기 자일라나제 생산 균주를 다시 200 ㎖의 YPD 액체배지(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 포도당)에서 배양하여 활성화시킨 후, 본 배양액에 접종하여 30에서 48시간 동안 배양하였다. 세포 성장 속도에 따라 유가 배양식 배지(15% 효모 추출물, 30% 포도당)를 추가 공급하였다.

상기 배양 방법을 통해 배양한 결과, 도 6에 나타낸 것처럼 48시간 배양 동안 세포는 약 150 OD까지 성장하였음을 확인하였다. 또한, 배양시간 별 농축하지 않은 발효 배양배지 샘플을 10㎕를 채취하여 SDS-PAGE 분석한 결과, 자일라나제가 배지로 분비되는 것을 확인하였다. 분비된 자일라나제의 전체 양은 야생형 xynR8의 경우 1.06mg/ml, xynR8Δ57은 1.26mg/ml로 큰 차이를 보이지 않았으나, 자일라나제 활성은 xynR8Δ57가 9,669u/ml로 야생형 xynR8 (3,167u/ml)에 비해 약 2.8배 높은 활성을 보였다. 따라서, C 말단이 결실된 자일라나제의 경우 효소 활성이 증가한 것으로 확인하였다.

실시예 7. 기질 특이성과 열안정성 분석

야생형 xynR8과 xynR8Δ57의 기질 특이적 활성을 2가지 종류의 기질인, birchwood 자일란과 beechwood 자일란에 대한 분해능을 DNS 정량법을 이용하여 확인하였다(도 7A).

그 결과, 야생형 xynR8의 경우 beechwood 자일란의 가수분해 활성은 우수했으나, birchwood 자일란의 가수분해 활성은 beechwood 자일란 가수분해 활성의 20% 수준으로 매우 낮은 것으로 확인되었다. 반면, xynR8Δ57의 경우 birchwood 자일란 뿐만 아니라 beechwood 자일란에 대한 가수분해 활성이 높아, 기질 특이적 활성이 증가한 것으로 확인하였다.

또한, GH 패밀리 11 그룹의 자일라나제의 열안정성은 다소 떨어지는 것으로 알려져 있는 바, xynR8과 xynRΔ57의 열안정성을 확인해 보기 위해 80℃에서 20분간 열처리 후 잔존 활성을 확인하였다(도 7B).

그 결과, xynR8과 xynR8Δ57 모두 80℃에서 5분 이내의 아주 짧은 시간 안에 효소 활성이 실활되었다. 따라서 xynR8Δ57 변이체는 열안정성의 개선에 대한 효과는 없는 것으로 확인되었다.

실시예 8. 열안정 보조제를 이용한 열안정성 증가

자일라나제를 사료첨가제로 사용하기 위해서는 펠릿화 공정이 필요하고, 이러한 공정은 80℃ 이상의 온도에서 열처리 과정이 수반된다. 따라서 80℃ 이상의 온도에서 열안정성을 확보하는 것이 필수적이다. 일반적으로 글리세롤이나 소르비톨 같은 당을 단백질과 혼합하면 단백질의 열안정성을 높인다고 알려져 있기 때문에, 자일라나제의 열안정성을 증가시킬 수 있는 열안정 보조제를 확인하였다.

구체적으로, 먼저 xynR8Δ57 변이체의 온도별 안정성을 확인하기 위하여 70, 80, 90℃에서 2분간 처리한 후 잔여활성을 비교한 결과(도 8A), 70℃에서는 70% 정도의 활성이 유지되었지만 80℃ 이상에서는 급격하게 활성이 실활되었다.

과당 (fructose) 중합체로 알려진 레반(levan)은 일부 식물체와 미생물에서 극소량으로 발견되는 천연 물질이며 정장 및 면역증강 효과가 있기 때문에 사료첨가제로서 수요가 확대되고 있는 기능성 물질이다. 레반의 열안정 증진 효과를 확인하기 위해, 1M 소르비톨, 2% 레반 또는 4% 레반을 자일라나제 효소 용액에 첨가하여 80℃에서 2분간 열처리한 후 잔여 활성을 측정하였다.

그 결과, 소르비톨에서는 약간의 열안정성 개선이 확인된 반면, 2% 레반을 사용한 경우 열안정성이 3배정도 증가되었음을 확인하였다(도 8B).

또한 효소액에 2%의 레반을 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우를 80℃에서 시간별로 비교한 결과, 레반을 첨가한 경우 3분까지도 30% 이상의 효소 활성이 유지됨을 확인하였다(도 8C).

따라서 자일라나제와 함께 레반을 사료첨가제로 사용하면 레반 고유의 기능과 함께 자일라나제의 열안정성 개선효과도 기대할 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국생명공학연구원 생물자원센터

KCTC18594P

20170817

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> An activity-improved xylanase mutant and a method for producing the same <130> KPA171054-KR <160> 56 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 906 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized xylR8 derived from Neocallimastigales <400> 1 acagtcgcta aagcacaatg gggtggtaac ggtggtgccc cagctggtca aaaactatct 60 gttggtggtg gtcaaaatca gcataaaggt gtattcgatg gtttttctta tgagatctgg 120 ttggacaata ctggtggttc aggatcaatg actttaggca agggagctac ttttaaggct 180 gaatggtctg cagctgtgaa taggggtaat ttcctggcaa gaagaggttt ggattttggt 240 tctactaaga aagctactga ctatgagtat ataggaatgg attatgaagc gtcttataga 300 caaacagctt cagcaagcgg caactctaga ttgtgtgttt atggttggtt tcaaaataga 360 ggagttcaag gtgttccatt agtggaatat tacatcatag aagattgggt tgactgggtt 420 cctgatgccc aaggtaaaat ggtcactatt gatggtgcgc aatacaaaat cttccagatg 480 gatcatacag gtccgactat taacggtggt aatgaaactt tcaaacaata ctttagcgtt 540 agacagcaaa agcgtacaag tggacatata actgtatctg 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aacggtactt ctactgctgc tccagttacc tctactgaag ctccaaagaa caccacctct 300 gctgctccaa ctcactctgt cacctcttac actggtgctg ctgctaaggc tttgccagct 360 gctggtgctt tgctggccgc ctcggcctct gctggcctcg ccttagataa aaga 414 <210> 44 <211> 528 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TFP-17-nt <400> 44 atgaaattct cttccgcttt ggttctatct gctgttgccg ctactgctct tgctgagagt 60 atcaccacca ccatcactgc caccaagaac ggtcatgtct acactaagac tgtcacccaa 120 gatgctactt ttgtttgggg tggtgaagac tcttacgcca gcagcacttc tgccgctgaa 180 tcttctgccg ccgaaacttc tgccgccgaa acctctgctg ccgctaccac ttctgctgcc 240 gctaccactt ctgctgctga gacttcttct gctgctgaga cttcttctgc tgatgaaggt 300 tctggttcta gtatcactac cactatcact gccaccaaga acggtcacgt ctacactaag 360 actgtcaccc aagatgctac ttttgtctgg actggtgaag gcagcagcaa cacctggtct 420 ccaagtagta cctctaccag ctcagaagct gctacctctt ctgcttcaac cactgcaacc 480 accctgctgg ccgcctcggc ctctgctggc ctcgccttag ataaaaga 528 <210> 45 <211> 414 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TFP-18-nt <400> 45 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<213> Artificial Sequence <220> <223> TFP-20-nt <400> 47 atgaaattat caactgtcct attatctgcc ggtttggcct cgactacttt ggcccaattt 60 tccaacagta catctgcttc ttccaccgat gtcacttcct cctcttccat ctccacttcc 120 tctggctcag taactatcac atcttctgaa gctccagaat ccgacaacgg taccagcaca 180 gctgcaccaa ctgaaacctc aacagaggct ccaaccactg ctatcccaac taacggtacc 240 tctactgaag ctccaaccac tgctatccca actaacggta cctctactga agctccaact 300 gatactacta ctgaagctcc aaccaccgct cttccaacta acggtacttc tactgaagct 360 ccaactgata ctactactga agctccaacc accggtcttc caaccaacgg taccacttca 420 gctttcccac caactacatc tttgccacca agcaacacta ccaccactct ggccgcctcg 480 gcctctgctg gcctcgcctt agataaaaga 510 <210> 48 <211> 238 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> xylR8 variant 1 aa derived from Neocallimastigales <400> 48 Thr Val Ala Lys Ala Gln Trp Gly Gly Asn Gly Gly Ala Pro Ala Gly 1 5 10 15 Gln Lys Leu Ser Val Gly Gly Gly Gln Asn Gln His Lys Gly Val Phe 20 25 30 Asp Gly Phe Ser Tyr Glu Ile Trp Leu Asp Asn Thr Gly Gly Ser Gly 35 40 45 Ser Met Thr 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Claims

삭제
서열번호 48 또는 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 자일라나제 변이체.
서열번호 2의 아미노산 서열의 C 말단으로부터 31개 내지 60개의 아미노산이 제거된 자일라나제 변이체로서,
상기 자일라나제 변이체는 추가적으로 C 말단에 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 자일라나제 변이체.
제3항에 있어서, 상기 자일라나제 변이체는 서열번호 49 또는 51인 것인, 자일라나제 변이체.
제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 자일라나제 변이체는 추가적으로 N-말단, C-말단, 또는 양 말단에 정제용 태그(tag)를 포함하는, 자일라나제 변이체.
제2항 또는 제3항의 자일라나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제6항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 자일라나제 발현 카세트.
제7항에 있어서, 상기 자일라나제 발현 카세트는 단백질 분비 융합 인자(Translational fusion partner, TFP)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 자일라나제 발현 카세트.
제8항에 있어서, 상기 단백질 분비 융합 인자는 서열번호 8의 TFP1, 서열번호 11의 TFP4, 서열번호 15의 TFP8, 서열번호 17의 TFP10 또는 서열번호 20의 TFP13인, 자일라나제 발현 카세트.
제8항에 있어서, 상기 자일라나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 단백질 분비 융합인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 링커로 서로 연결된 것인, 자일라나제 발현 카세트.
제7항의 자일라나제 발현 카세트를 포함하는 벡터.
제11항의 벡터를 포함하는 형질전환체.
제12항에 있어서, 상기 형질전환체는 효모인 것인, 형질전환체.
제13항에 있어서, 상기 효모는 캔디다 (Candida), 디베리오마이세스 (Debaryomyces), 한세눌라 (Hansenula), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 피키아 (Pichia), 스키조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces), 야로이야 (Yarrowia), 사카로마이시스 (Saccharomyces), 슈완니오마이세스 (Schwanniomyces) 및 아르술라 (Arxula) 속으로 이루어진 그룹에서 선택되는 것인, 형질전환체.
(a) 제2항 또는 제3항의 자일라나제 변이체; (b) 상기 자일라나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환체; 또는 (c) 상기 형질전환체의 배양물을 포함하는, 사료 조성물.
제15항에 있어서, 상기 사료 조성물은 레반을 추가로 포함하는, 사료 조성물.