CN111757931B - 变体g6p g7p葡糖淀粉酶组合物及方法 - Google Patents

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Abstract

提供了变体G6P G7P葡糖淀粉酶组合物及方法。本发明涉及新的变体葡糖淀粉酶，其具有SEQ ID NO:15的序列。本发明涉及编码该变体葡糖淀粉酶的多核苷酸、用于产生该变体葡糖淀粉酶的方法以及使用该变体葡糖淀粉酶的方法。还描述了本发明的葡糖淀粉酶用于改变淀粉转化以生产发酵产物(例如乙醇)和糖浆(例如葡萄糖)以及动物原料的用途。本发明还涉及包含本发明的一种或更多种变体葡糖淀粉酶的组合物。本发明提供了热活性和热稳定的葡糖淀粉酶。

Description

变体G6P G7P葡糖淀粉酶组合物及方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年12月21日提交的美国临时专利申请号62/784,193的优先权，其整体通过引用明确地并入本文。
序列表
本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交并且在此通过引用整体并入本文。所述ASCII副本于2019年10月30日创建，命名为114095-5008_ST25.txt且大小为92千字节。
技术领域
本发明涉及变体葡糖淀粉酶、编码该变体葡糖淀粉酶的多核苷酸、用于产生该变体葡糖淀粉酶的方法以及使用该变体葡糖淀粉酶的方法。还描述了本发明的葡糖淀粉酶用于改变淀粉转化以生产发酵产物(例如乙醇)和糖浆(例如葡萄糖)以及动物原料的用途。本发明还涉及包含本发明的一种或更多种变体葡糖淀粉酶的组合物。
技术背景
葡糖淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC 3.2.1.3)是一种酶，其催化D-葡萄糖从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放。葡糖淀粉酶是由多种丝状真菌和酵母产生的，出于商业目的，来自曲霉属(Aspergillus)的那些葡糖淀粉酶通常是最重要的。
商业上，葡糖淀粉酶用于将已经被α-淀粉酶部分水解的含淀粉物质转化为葡萄糖。然后可以使用发酵生物体将葡萄糖直接或间接转化为发酵产物。商业发酵产物的实例包括醇类(例如乙醇、甲醇、丁醇、1,3-丙二醇)；有机酸(例如柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡萄糖酸、葡糖酸盐(gluconate)、乳酸、琥珀酸、2,5-二酮-D-葡萄糖酸)；酮(例如丙酮)；氨基酸(例如谷氨酸)；气体(例如H2和CO2)以及更复杂的化合物，包括例如抗生素(例如青霉素和四环素)、酶、维生素(例如核黄素、B12、β-胡萝卜素)、激素和其他难以合成产生的化合物。发酵过程也常用于消耗醇类(例如啤酒和葡萄酒)、乳制品(例如酸奶和奶酪的生产)工业中。
终产物也可以是糖浆。例如，终产物可以是葡萄糖，但是也可以例如通过葡萄糖异构酶转化为果糖或几乎相等地由葡萄糖和果糖构成的混合物。该混合物或进一步富含果糖的混合物是全世界商业上最常用的高果糖玉米糖浆(HFCS)。
终产物也可以是喂给农业动物的商业原料。此外，葡糖淀粉酶在食品、纺织和制药工业中具有重要的应用。例如在食品工业中，葡糖淀粉酶用于改善面包皮的颜色和生产低热量啤酒。葡糖淀粉酶的另一个关键应用是与其他酶的混合物一起用作消化助剂。
然而，在本领域中仍然需要具有增加的活性、热活性、热稳定性和pH稳定性的变体葡糖淀粉酶。本发明满足了这种需求并提供了与亲本葡糖淀粉酶相比具有改善特性的变体葡糖淀粉酶。
本发明的目的是提供具有葡糖淀粉酶活性的变体葡糖淀粉酶和编码该变体葡糖淀粉酶的多核苷酸，以及在多种过程中使用该变体葡糖淀粉酶的方法。
发明内容
因此，本发明提供了分离的野生型葡糖淀粉酶和变体葡糖淀粉酶及使用其的方法。本发明的氨基酸序列号和核酸序列号列于表1中。
表1.氨基酸序列号和核酸序列号。变体1包含氨基酸取代Y321F。变体2包含氨基酸取代S188H/Y321W/Q419P。w.r.t.表示“相对于”。
在一些方面，本发明提供了包含变体葡糖淀粉酶的组合物，其中该变体葡糖淀粉酶表现出与SEQ ID NO:15至少95％的同一性，其中所述变体葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:25相比在选自以下的条件下具有至少1.1倍更好的活性：在约30℃下热活性、在约35℃下的热活性，在约40℃下的热活性、在约50℃下的热活性、在约60℃下的热活性和在约70℃下的热活性。
在一些方面，本发明提供了包含具有SEQ ID NO:15的变体葡糖淀粉酶的组合物。
在一个另外的方面，本发明提供了包含变体葡糖淀粉酶的组合物，该变体葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:15相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代位于选自以下的位置编号处：5、27、36、38、39、46、47、50、65、68、79、89、98、108、121、122、124、158、161、188、192、212、215、258、262、264、298、321、400、412、419、420、422、423、457、491、497、498、503、508、509、510、7、9、11、19、26、31、42、44、49、53、55、57、69、72、73、78、85、86、88、92、93、94、97、103、106、118、119、125、141、145、149、150、153、155、168、170、171、178、179、186、195、204、205、208、209、213、214、219、220、224、227、246、247、256、261、306、307、309、311、317、342、347、348、352、353、355、362、364、370、374、381、382、388、391、394、395、399、407、418、434、436、437、440、446、452、453、460、469、470、472、475、476、478和492，其中所述变体酶与SEQ ID NO:15至少95％相同。
在另一方面，本发明提供了包含变体葡糖淀粉酶的组合物，该变体葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:15相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代位于选自以下的位置编号处：5、27、36、38、39、46、47、50、65、68、79、89、98、108、121、122、124、158、161、188、192、212、215、258、262、264、298、321、400、412、419、420、422、423、457、491、497、498、503、508、509、510、7、9、11、19、26、31、42、44、49、53、55、57、69、72、73、78、85、86、88、92、93、94、97、103、106、118、119、125、141、145、149、150、153、155、168、170、171、178、179、186、195、204、205、208、209、213、214、219、220、224、227、246、247、256、261、306、307、309、311、317、342、347、348、352、353、355、362、364、370、374、381、382、388、391、394、395、399、407、418、434、436、437、440、446、452、453、460、469、470、472、475、476、478和492，其中所述变体葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:15相比在选自以下的条件下具有至少1.1倍更好的活性：在约30℃下热活性、在约35℃下的热活性，在约40℃下的热活性、在约50℃下的热活性、在约60℃下的热活性和在约70℃下的热活性；并且所述变体酶与SEQ ID NO:15至少95％相同。
在一个另外的方面，本发明提供了包含本文所述的变体葡糖淀粉酶的组合物，该变体葡糖淀粉酶表现出与SEQ ID NO:15至少96％、97％、98％或99％的同一性。
在另一方面，本发明提供了包含本文所述的变体葡糖淀粉酶的组合物，其中所述氨基酸取代发生在所述位置中的一个、所述位置中的两个、所述位置中的三个、所述位置中的四个、所述位置中的五个、所述位置中的六个、所述位置中的七个、所述位置中的八个、所述位置中的九个、所述位置中的十个、所述位置中的十一个、所述位置中的十二个、所述位置中的十三个或所述位置中的十四个。
在一些方面，本发明提供了包含本文所述的变体葡糖淀粉酶的组合物，其中所述氨基酸取代位于选自以下的位置编号处：5、68、188、321、419、422、7、11、19、26、31、42、44、49、53、55、57、69、72、73、78、79、85、86、88、89、92、93、94、97、98、103、106、118、119、125、141、145、149、150、153、155、161、168、170、171、178、179、186、195、204、205、208、209、213、214、219、220、224、227、246、247、256、261、262、306、307、309、311、317、342、347、348、352、353、355、362、364、370、374、381、382、388、391、394、395、399、400、407、412、418、434、436、437、440、446、452、453、460、469、470、472、475、476、478和492。
在一个另外的方面，本发明提供了包含本文所述的变体葡糖淀粉酶的组合物，其中所述氨基酸取代选自以下：N27A、S36P、A38V、A39F、S46T、P47T、S50Q、V65I、E68N、L79F、T89N、T98S、A108S、P121S、F122M、G124P、G124S、G124T、G158S、Q161P、S188P、S188W、T192A、K212Y、S215A、T258S、A262S、H264M、I298V、Y321L、T400L、Y412F、L420K、A422G、P423G、P423R、P423V、G457S、A491V、K5P、K5S、K5T、K5Y、K5Q、K5N、K5H、E68K、E68Y、E68S、S188T、S188H、Y321F、Y321W、Q419P、A422S、R7C、E11S、L19I、C26N、T31N、V42I、I44V、R49H、D53N、Y55F、T57S、I69L、S72A、V73F、T78K、L79D、L79Y、E85Q、N86Q、V88I、T89S、A92T、Y93K、L94V、V97I、S103D、D106T、D118N、M119E、A125P、M141L、Y145A、L149I、N150D、A153S、T155A、N168S、V170I、A171T、G178T、Y179F、P186E、A195V、S204N、T205A、A208T、K209R、S213T、H214C、T219S、V220Q、I224V、Y227F、A246S、S247G、A256V、T261A、T261G、S306A、A307E、D309S、L311V、A317P、V342I、L347N、E348I、T352S、V353I、S355D、T362Q、L364I、T370V、A374N、E381N、S382D、T388Q、A391G、F394Y、V395L、Q399E、T400K、A407S、Q418T、S434T、T436S、E437A、D440Q、G446S、S452A、V453S、A460S、A469S、A470T、S472T、G475V、T476W、G478S、L492P和L9P。
在另一方面，本发明提供了包含本文所述的变体葡糖淀粉酶的组合物，其中所述氨基酸取代选自以下：K5P、K5S、K5T、K5Y、K5Q、K5N、K5H、E68K、E68Y、E68S、S188T、S188H、Y321F、Y321W、Q419P、A422S、R7C、E11S、L19I、C26N、T31N、V42I、I44V、R49H、D53N、Y55F、T57S、I69L、S72A、V73F、T78K、L79D、L79Y、E85Q、N86Q、V88I、T89S、A92T、Y93K、L94V、V97I、T98S、S103D、D106T、D118N、M119E、A125P、M141L、Y145A、L149I、N150D、A153S、T155A、Q161P、N168S、V170I、A171T、G178T、Y179F、P186E、A195V、S204N、T205A、A208T、K209R、S213T、H214C、T219S、V220Q、I224V、Y227F、A246S、S247G、A256V、T261A、T261G、A262S、S306A、A307E、D309S、L311V、A317P、V342I、L347N、E348I、T352S、V353I、S355D、T362Q、L364I、T370V、A374N、E381N、S382D、T388Q、A391G、F394Y、V395L、Q399E、T400K、A407S、Y412F、Q418T、S434T、T436S、E437A、D440Q、G446S、S452A、V453S、A460S、A469S、A470T、S472T、G475V、T476W、G478S、L492P。
在一个另外的方面，本发明提供了包含本文所述的变体葡糖淀粉酶的组合物，其中所述氨基酸取代选自以下：S188H/Y321W/Q419P、K5T/S188T、K5T/E68K/S188H、K5Y/S188H、K5Q/E68K/S188T、K5N/E68Y/S188T、K5H/S188H、K5S/E68Y/S188H、K5S/E68Y/S188T、K5Y/E68Y、K5S/E68S/S188T、K5H/E68S/S188H、K5H/E68K/S188T、K5P/S188H、K5Y/E68K、K5T/S188H、K5S/S188H、E68Y/S188H、E68Y/S188T、K5T/Y321F、K5Q/S188H/Q419P、K5P/E68Y/S188T/A422S、K5N/S188H/Q419P、Y321W/A422S、E68K/Q419P、E68S/S188T/Y321W/A422S、K5Q/Q419P/A422S、S188T/Y321F、S188T/Q419P/A422S、K5H/S188T/Q419P/A422S、K5H/A422S、S188H/Y321W、Q419P/A422S、K5N/A422S、E68Y/S188H/Y321F/Q419P、K5Q/S188H、E11S/Y55F/M141L/N168S/T388Q、E11S/T31N/Y55F/M141L/N168S/T388Q、L19I/A195V、M141L/N168S/Y227F/T362Q/T388Q/D440Q、E11S/M141L、E11S/L19I/I44V/Y145A/T155A/D309S/L311V/Y412F/S472T、D309S/L311V、E11S/L19I/T31N/Y55F/A125P/N168S/Y227F、L19I/D309S/L311V/Y412F/A460S/S472T、E11S/L19I/N168S/Y227F/D309S/L311V/D440Q、L19I/Y412F、E11S/L19I/Y145A/A460S/S472T、E11S/M141L/N168S/D309S/L311V/T362Q/L364I/Y412F/A460S/S472T、E11S/Y55F/M141L/N168S/L311V/T362Q/L364I/A460S/S472T、E11S/L19I/Y55F/M141L/N168S/Y227F、L19I/T155A/A407S/Y412F/S472T、D53N/L149I/N150D/P186E/A317P、V42I/S103D/D106T/P186E/A317P/S434T/G478S、A317P/G478S、C26N/V42I/L149I/A317P/S355D/A374N、V42I/S103D/D106T/A317P、D53N/S434T、/S103D/A317P/V342I、A256V/A317P、V42I/P186E、A317P/V342I/G478S、I224V/A256V/A317P/G478S、V42I/L149I/N150D/A317P/G478S、V42I/S103D/P186E/A317P/V342I/S355D/A374N/A391G、P186E/A317P/G478S、D53N/G446S、A256V/A317P/G478S、V42I/D53N/T57S/L149I/A317P/G478S、C26N/V42I/D53N/T57S/N150D/P186E/A317P/V342I/G478S、V42I/S355D、V42I/N150D/P186E/A317P、V42I/S434T/G478S、C26N/D53N/T57S/S103D/Q161P/A317P/G478S、V42I/A256V/A317P/S434T、V42I/S103D/A317P/A391G/G478S、E68Y/I69L/G178T/Y179F/S213T/H214C、E68Y/I69L/E85Q/N86Q/F394Y/V395L、E68Y/I69L、D118N/M119E、E68Y/I69L/V97I/T98S/A246S/S247G/T261G/A262S/L347N/E348I、E68Y/I69L/S452A/V453S、E68Y/I69L/S452A/V453S、E68Y/I69L/E85Q/N86Q/L347N/E348I/Q418T/Q419P、E68Y/I69L/E85Q/N86Q/S204N/T205A、A208T/K209R/E381N/S382D/Q418T/Q419P/A469S/A470T、E381N/S382D/Q418T/Q419P/T436S/E437A/A469S/A470T、Q418T/Q419P/A469S/A470T、V170I/A171T/E381N/S382D/Q418T/Q419P/A469S/A470T、F394Y/V395L/Q418T/Q419P/T436S/E437A/A469S/A470T、T78K/L79D/Q418T/Q419P/A469S/A470T、E68Y/I69L/V88I/T89S/T352S/V353I/Q399E/T400K/A469S/A470T、S72A/V73F/A153S/S306A/T476W、T370V/G475V、R49H/S72A/V73F/A92T/Y93K/A153S/S306A/T476W、E68Y/I69L/T219S/V220Q/A307E/S355D/L492P、E11S/V42I/L149I/I224V/A317P/T388Q/A460S/G478S、Y412F/Q418T/Q419P/A469S/A470T/、L19I/D53N/I69L/V88I/S188H/A195V/Y321W/Y412F、V42I/D118N/M119E/T261A/L311V/Y321W/S355D、E11S/T57S/T89S、E11S/V42I/L79Y/D118N/M141L/L311V/A317P/Y321F、V42I/D53N/E68Y/A317P/L347N、I69L/S188H/A195V/A317P/Y321F/L364I/S434T、T57S/A195V/T261A/L311V/Y321F/L347N/E348I/S434T、E11S/V42I/T57S/E68Y/S188H/A195V/T261A、T57S/N168S/T261A/A317P/Y321W/V395L/Y412F、E11S/D53N/E68Y/D118N/S188H/A195V/Y412F/Q419P、E11S/V42I/D118N/M141L/N168S/Y321W/Y412F、E11S/D53N/T57S/E68Y/T89S/E381N/Y412F/Q419P/S434T、E11S/D53N/T57S/V88I/T89S/S188H/A195V/L311V/L347N/Y412F、A317P/Y412F、I69L/T89S/L311V/A317P/Y321F/Y412F/S434T、V42I/D53N/T57S/E68Y/V88I/Y412F、E11S/T57S/V88I/M141L/T261A/Y321W/L364I/Y412F、V42I/I69L/S188H/A317P/Y321W/Y412F、E11S/V42I/D53N/T57S/L79Y/T89S/L311V/Y321W/Y412F、L19I/M141L/N168S/S188H/A195V/L311V/S355D/S434T、S188H/A195V/T261A/L311V/Y321F/L347N/E348I、E11S/L19I/D53N/T57S/N168S/L347N、E11S/I69L/M119E/A195V/T261A/A317P/Y321W/L347N/Y412F、L79Y/V88I/T261A/A317P/Y321F/L364I/Y412F、E11S/V42I/E68Y/T89S/L311V/Y321F/T388Q/F394Y/V395L/Q419P、D53N/E68Y/V88I/M141L/N168S/Y321W/Y412F、E11S/I69L/L311V/A317P/Y321F/L347N/Y412F、D53N/T57S/M141L、D53N/V88I/T89S/D118N/E348I/S355D、E11S/S188H/A195V/A317P/L347N/E348I/Y412F/Q419P/S434T、E11S/D53N/I69L/V88I/A317P/Q419P、E68Y/I69L/V88I/N168S/L364I/Q419P、E11S/V42I/V88I/T261A/Y321F/E348I/S355D、E11S/V42I/T57S/I69L/A195V/L347N/E348I/S355D、L19I/T89S/A317P/Y321F/S434T、E11S/V42I/L79Y/L311V/A317P/Y321W/L347N/E348I/L364I/Y412F、D53N/T57S/L347N/E348I/Y412F、D53N/T57S/E68Y/L79Y/Y412F/S434T、L19I/V88I/T89S/A317P、M119E/M141L/N168S/L311V/Y321F、E11S/T89S/Y321W、E11S/M141L/T261A/A317P/Y412F/S434T、V42I/L79Y/S188H/A195V/L311V/Y321F/S355D、V42I/E68Y/V88I/T261A/Y321W/L347N/E348I、L19I/E68Y/I69L/M141L/Y321F/L347N/S355D/E381N/Y412F、V42I/D53N/I69L/L79Y/D118N/T261A/L311V/A317P/Y321F/L347N/Y412F、E68Y/S355D/L364I/S382D/T388Q/Q419P、E11S/L19I/V42I/E68Y/I69L/D118N/M141L/Y321W/L347N、/E11S/V42I/E68Y/M141L/A317P/Y321F/E348I/S355D、E11S/V42I/E68Y/I69L/V88I/T89S/D118N/M119E/S188H/A195V/A317P/L347N/Y412F/Q419P、V42I/V88I/L311V/A317P/Y321F/L347N/E348I/T388Q/V395L/S434T、T261A/A317P/Y321W/E348I、E11S/V42I/E68Y/I69L/D118N/M119E/Y412F、E11S/V42I/T57S/I69L/L311V、V42I/Y412F、E11S/L19I/E68Y/M119E/N168S/Y412F/Q419P、L19I/L311V/Y412F、E11S/V42I/M119E/Y412F、E11S/L19I/V42I/D53N/S188H/A195V/L311V/Y321F/Y412F、E11S/L19I/V42I/T57S/D118N/N168S/L311V/Y412F、L19I/V42I/D53N/T57S/N168S/A317P/Y321W/Y412F、D53N/T57S/E68Y/N168S/S188H/A195V/L311V/Y321W/Y412F/Q419P、L19I/D53N/T57S/L311V/Y321W/Y412F、E11S/T57S/Y321W/Y412F/Q419P、D53N/S188H/A195V/L311V/Y412F、V42I/D53N/S188H/A195V/L311V/Y321F/Y412F、L19I/M119E/N168S/S188H/A195V/L311V/Y412F/Q419P、E11S/V42I/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/V42I/M119E/N168S/L311V/Y412F、E11S/V42I/N168S/L311V/A317P/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/V42I/D53N/E68Y/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F/Y412F、E11S/L19I/D53N/N168S/A195V/Y412F/Q419P、E11S/L19I/V42I/L311V/Y412F、V42I/D53N/N168S/L311V/Y412F、E11S/L311V/Y412F、E11S/D53N/T57S/L311V/Y321W/Y412F、E11S/L311V/Y321W/Y412F、E11S/V42I/I69L/D118N/N168S/L311V/A317P/Y412F/Q419P、E11S/L19I/V42I/E68Y/Y412F/Q419P、E11S/L19I/D53N/L311V、E11S/L19I/V42I/L311V/Y412F/Q419P、L19I/V42I/D53N/T57S/I69L/N168S/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321W、E11S/L19I/V42I/T57S/L311V/A317P/Y321F/Y412F、L19I/V42I/I69L/D118N/N168S/L311V/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/V42I/D53N/E68Y/S188H/A195V/Y412F、E11S/L19I/V42I/D53N/T57S/N168S/L311V/Y321W/Y412F、E11S/V42I/L311V/Y412F、E11S/L19I/V42I/N168S/A195V/L311V/Y321F/Y412F、E11S/V42I/S188H/L311V/Y412F、L19I/V42I/T57S/E68Y/M119E/S188H/A195V/L311V/Y321F/Y412F、E11S/L19I/V42I/D53N/N168S/S188H/A195V、E11S/L19I/V42I/T57S/E68Y/A195V/L311V/Y321W和E11S/L19I/V42I。
在另一方面，本发明提供了包含本文所述的变体葡糖淀粉酶的组合物，其中所述氨基酸取代为Y321F。
在一个另外的方面，本发明提供了包含本文所述的变体葡糖淀粉酶的组合物，其中所述氨基酸取代为S188H/Y321W/Q419P。
在另一方面，本发明提供了包含本文所述的变体葡糖淀粉酶的组合物，其中所述组合物包含氨基酸取代Y321F并且还包含选自以下的至少一个氨基酸取代：N27A、S36P、A38V、A39F、S46T、P47T、S50Q、V65I、E68N、L79F、T89N、T98S、A108S、P121S、F122M、G124P、G124S、G124T、G158S、Q161P、S188P、S188W、T192A、K212Y、S215A、T258S、A262S、H264M、I298V、Y321L、T400L、Y412F、L420K、A422G、P423G、P423R、P423V、G457S、A491V、K5P、K5S、K5T、K5Y、K5Q、K5N、K5H、E68K、E68Y、E68S、S188T、S188H、Y321W、Q419P、A422S、R7C、E11S、L19I、C26N、T31N、V42I、I44V、R49H、D53N、Y55F、T57S、I69L、S72A、V73F、T78K、L79D、L79Y、E85Q、N86Q、V88I、T89S、A92T、Y93K、L94V、V97I、S103D、D106T、D118N、M119E、A125P、M141L、Y145A、L149I、N150D、A153S、T155A、N168S、V170I、A171T、G178T、Y179F、P186E、A195V、S204N、T205A、A208T、K209R、S213T、H214C、T219S、V220Q、I224V、Y227F、A246S、S247G、A256V、T261A、T261G、S306A、A307E、D309S、L311V、A317P、V342I、L347N、E348I、T352S、V353I、S355D、T362Q、L364I、T370V、A374N、E381N、S382D、T388Q、A391G、F394Y、V395L、Q399E、T400K、A407S、Q418T、S434T、T436S、E437A、D440Q、G446S、S452A、V453S、A460S、A469S、A470T、S472T、G475V、T476W、G478S、L492P和L9P。
在一个另外的方面，本发明提供了包含本文所述的变体葡糖淀粉酶的组合物，其中所述组合物包含氨基酸取代S188H/Y321W/Q419P，并且还包含选自以下的至少一个氨基酸取代：N27A、S36P、A38V、A39F、S46T、P47T、S50Q、V65I、E68N、L79F、T89N、T98S、A108S、P121S、F122M、G124P、G124S、G124T、G158S、Q161P、S188P、S188W、T192A、K212Y、S215A、T258S、A262S、H264M、I298V、Y321L、Y321F、T400L、Y412F、L420K、A422G、P423G、P423R、P423V、G457S、A491V、K5P、K5S、K5T、K5Y、K5Q、K5N、K5H、E68K、E68Y、E68S、S188T、A422S、R7C、E11S、L19I、C26N、T31N、V42I、I44V、R49H、D53N、Y55F、T57S、I69L、S72A、V73F、T78K、L79D、L79Y、E85Q、N86Q、V88I、T89S、A92T、Y93K、L94V、V97I、S103D、D106T、D118N、M119E、A125P、M141L、Y145A、L149I、N150D、A153S、T155A、N168S、V170I、A171T、G178T、Y179F、P186E、A195V、S204N、T205A、A208T、K209R、S213T、H214C、T219S、V220Q、I224V、Y227F、A246S、S247G、A256V、T261A、T261G、S306A、A307E、D309S、L311V、A317P、V342I、L347N、E348I、T352S、V353I、S355D、T362Q、L364I、T370V、A374N、E381N、S382D、T388Q、A391G、F394Y、V395L、Q399E、T400K、A407S、Q418T、S434T、T436S、E437A、D440Q、G446S、S452A、V453S、A460S、A469S、A470T、S472T、G475V、T476W、G478S、L492P和L9P。
在一个另外的方面，本发明提供了编码本文所述的所述变体葡糖淀粉酶的核酸。
在一些方面，本发明提供了本文所述的核酸，其中所述核酸针对宿主生物体进行密码子优化以在所述生物体中表达变体葡糖淀粉酶。
在一些另外的方面，本发明提供了包含选自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:22或SEQID NO:24的序列的核酸。
在另一些方面，本发明提供了包含本文所述的核酸的表达载体。
在另一方面，本发明提供了包含本文所述的核酸的宿主细胞。
在另一方面，本发明提供了包含本文所述的表达载体的宿主细胞。
在一个另外的方面，本发明提供了本文所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自细菌细胞、真菌细胞、或酵母细胞。
在一些方面，本发明提供了一种用于制备变体葡糖淀粉酶的方法，该方法包括：a)在其中表达所述变体葡糖淀粉酶的条件下培养本文所述的宿主细胞；以及b)回收所述变体葡糖淀粉酶。
在一些另外的方面，本发明提供了编码包含信号肽的前蛋白和成熟蛋白的核酸，
其中所述信号肽为SEQ ID NO:26或与SEQ ID NO:26相比的变体信号肽，并且所述变体信号肽在选自-20、-18、-17、-15、-13、-12、-10、-9、和-1的位置编号处具有至少一个氨基酸取代；并且
其中所述成熟蛋白具有SEQ ID NO:15，或为与SEQ ID NO:15相比的变体葡糖淀粉酶，其中所述变体葡糖淀粉酶在选自以下的位置编号处具有至少一个氨基酸取代：5、27、36、38、39、46、47、50、65、68、79、89、98、108、121、122、124、158、161、188、192、212、215、258、262、264、298、321、400、412、419、420、422、423、457、491、497、498、503、508、509、510、7、9、11、19、26、31、42、44、49、53、55、57、69、72、73、78、85、86、88、92、93、94、97、103、106、118、119、125、141、145、149、150、153、155、168、170、171、178、179、186、195、204、205、208、209、213、214、219、220、224、227、246、247、256、261、306、307、309、311、317、342、347、348、352、353、355、362、364、370、374、381、382、388、391、394、395、399、407、418、434、436、437、440、446、452、453、460、469、470、472、475、476、478和492；并且
其中所述前蛋白与SEQ ID NO:3至少95％相同。
在另一些方面，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述前蛋白表现出与SEQ ID NO:3至少96％、97％、98％或99％的同一性。
在另一方面，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述变体信号肽在所述位置中的一个、所述位置中的两个、所述位置中的三个、所述位置中的四个或所述位置中的五个处具有氨基酸取代。
在另一方面，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，所述变体葡糖淀粉酶在所述位置中的一个、所述位置中的两个、所述位置中的三个、所述位置中的四个、所述位置中的五个、所述位置中的六个、所述位置中的七个、所述位置中的八个、所述位置中的九个、所述位置中的十个、所述位置中的十一个、所述位置中的十二个、所述位置中的十三个或所述位置中的十四个处具有氨基酸取代。
在一个另外的方面，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述变体信号肽在位置编号-20或-15处具有至少一个氨基酸取代。
在一个另外的方面，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述变体信号肽具有选自以下的氨基酸取代：V-20A、V-20F、V-20G、V-20I、V-20K、V-20L、V-20M、V-20Q、V-20R、V-20T、V-20W、L-18F、L-18I、L-18Y、K-17F、K-17N、K-17Y、A-15F、A-15I、A-15L、A-15V、A-13T、A-12V、T-10F、T-10V、W-9Y和V-1F。
在另一方面，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述变体葡糖淀粉酶具有选自以下的氨基酸取代：N27A、S36P、A38V、A39F、S46T、P47T、S50Q、V65I、E68N、L79F、T89N、T98S、A108S、P121S、F122M、G124P、G124S、G124T、G158S、Q161P、S188P、S188W、T192A、K212Y、S215A、T258S、A262S、H264M、I298V、Y321L、T400L、Y412F、L420K、A422G、P423G、P423R、P423V、G457S、A491V、K5P、K5S、K5T、K5Y、K5Q、K5N、K5H、E68K、E68Y、E68S、S188T、S188H、Y321F、Y321W、Q419P、A422S、R7C、E11S、L19I、C26N、T31N、V42I、I44V、R49H、D53N、Y55F、T57S、I69L、S72A、V73F、T78K、L79D、L79Y、E85Q、N86Q、V88I、T89S、A92T、Y93K、L94V、V97I、S103D、D106T、D118N、M119E、A125P、M141L、Y145A、L149I、N150D、A153S、T155A、N168S、V170I、A171T、G178T、Y179F、P186E、A195V、S204N、T205A、A208T、K209R、S213T、H214C、T219S、V220Q、I224V、Y227F、A246S、S247G、A256V、T261A、T261G、S306A、A307E、D309S、L311V、A317P、V342I、L347N、E348I、T352S、V353I、S355D、T362Q、L364I、T370V、A374N、E381N、S382D、T388Q、A391G、F394Y、V395L、Q399E、T400K、A407S、Q418T、S434T、T436S、E437A、D440Q、G446S、S452A、V453S、A460S、A469S、A470T、S472T、G475V、T476W、G478S、L492P和L9P。
在一些方面，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述变体葡糖淀粉酶在选自以下的位置编号处具有氨基酸取代：5、68、188、321、419、420、422、7、11、19、26、31、42、44、49、53、55、57、69、72、73、78、79、85、86、88、89、92、93、94、97、98、103、106、118、119、125、141、145、149、150、153、155、161、168、170、171、178、179、186、195、204、205、208、209、213、214、219、220、224、227、246、247、256、261、262、306、307、309、311、317、342、347、348、352、353、355、362、364、370、374、381、382、388、391、394、395、399、400、407、412、418、434、436、437、440、446、452、453、460、469、470、472、475、476、478和492。
在另一些方面，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述变体葡糖淀粉酶具有选自以下的氨基酸取代：K5P、K5S、K5T、K5Y、K5Q、K5N、K5H、E68K、E68Y、E68S、S188T、S188H、Y321F、Y321W、Q419P、A422S、R7C、E11S、L19I、C26N、T31N、V42I、I44V、R49H、D53N、Y55F、T57S、I69L、S72A、V73F、T78K、L79D、L79Y、E85Q、N86Q、V88I、T89S、A92T、Y93K、L94V、V97I、T98S、S103D、D106T、D118N、M119E、A125P、M141L、Y145A、L149I、N150D、A153S、T155A、Q161P、N168S、V170I、A171T、G178T、Y179F、P186E、A195V、S204N、T205A、A208T、K209R、S213T、H214C、T219S、V220Q、I224V、Y227F、A246S、S247G、A256V、T261A、T261G、A262S、S306A、A307E、D309S、L311V、A317P、V342I、L347N、E348I、T352S、V353I、S355D、T362Q、L364I、T370V、A374N、E381N、S382D、T388Q、A391G、F394Y、V395L、Q399E、T400K、A407S、Y412F、Q418T、S434T、T436S、E437A、D440Q、G446S、S452A、V453S、A460S、A469S、A470T、S472T、G475V、T476W、G478S和L492P。
在另一方面，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述前蛋白具有选自以下的氨基酸取代：S188H/Y321W/Q419P、K5T/S188T、K5T/E68K/S188H、K5Y/S188H、K5Q/E68K/S188T、K5N/E68Y/S188T、K5H/S188H、K5S/E68Y/S188H、K5S/E68Y/S188T、K5Y/E68Y、K5S/E68S/S188T、K5H/E68S/S188H、K5H/E68K/S188T、K5P/S188H、K5Y/E68K、K5T/S188H、K5S/S188H、E68Y/S188H、E68Y/S188T、A-15F/K5T/Y321F、V-20F/A-15I、V-20F/K5Q/S188H/Q419P、A-15I/Y321F、V-20F/A422S、A-15F/K5P/E68Y/S188T/A422S、V-20F/A-15I/A422S、V-20T/A-15I/Q419P、V-20F/K5N/S188H/Q419P、V-20F/Y321W/A422S、V-20F/E68K/Q419P、A-15F/S188H/Y321W/Q419P、V-20F/Y321F、A-15F/Y321F、V-20F/E68S/S188T/Y321W/A422S、V-20F/A-15F/K5Q/Q419P/A422S、V-20I/A-15I/Y321F、S188T/Y321F、S188T/Q419P/A422S、V-20T/A-15I/K5Q、A-15I/Y321W、V-20F/A-15F/K5Q、V-20F/K5H/S188T/Q419P/A422S、V-20T/A-15I/K5H/A422S、A-15F/S188H/Y321W、A-15F/Q419P/A422S、V-20F/K5N/A422S、V-20F/A-15I/S188H、E68Y/S188H/Y321F/Q419P、V-20F/A-15F/K5N/A422S、V-20F/A-15I/Y321F、V-20F/K5Q/S188H、E11S/Y55F/M141L/N168S/T388Q、E11S/T31N/Y55F/M141L/N168S/T388Q、L19I/A195V、M141L/N168S/Y227F/T362Q/T388Q/D440Q、E11S/M141L、E11S/L19I/I44V/Y145A/T155A/D309S/L311V/Y412F/S472T、D309S/L311V、E11S/L19I/T31N/Y55F/A125P/N168S/Y227F、L19I/D309S/L311V/Y412F/A460S/S472T、E11S/L19I/N168S/Y227F/D309S/L311V/D440Q、L19I/Y412F、E11S/L19I/Y145A/A460S/S472T、E11S/M141L/N168S/D309S/L311V/T362Q/L364I/Y412F/A460S/S472T、E11S/Y55F/M141L/N168S/L311V/T362Q/L364I/A460S/S472T、E11S/L19I/Y55F/M141L/N168S/Y227F、L19I/T155A/A407S/Y412F/S472T、D53N/L149I/N150D/P186E/A317P、V42I/S103D/D106T/P186E/A317P/S434T/G478S、A317P/G478S、C26N/V42I/L149I/A317P/S355D/A374N、V42I/S103D/D106T/A317P、D53N/S434T、/S103D/A317P/V342I、A256V/A317P、V42I/P186E、A317P/V342I/G478S、I224V/A256V/A317P/G478S、V42I/L149I/N150D/A317P/G478S、V42I/S103D/P186E/A317P/V342I/S355D/A374N/A391G、P186E/A317P/G478S、D53N/G446S、A256V/A317P/G478S、V42I/D53N/T57S/L149I/A317P/G478S、C26N/V42I/D53N/T57S/N150D/P186E/A317P/V342I/G478S、V42I/S355D、V42I/N150D/P186E/A317P、V42I/S434T/G478S、C26N/D53N/T57S/S103D/Q161P/A317P/G478S、V42I/A256V/A317P/S434T、V42I/S103D/A317P/A391G/G478S、E68Y/I69L/G178T/Y179F/S213T/H214C、E68Y/I69L/E85Q/N86Q/F394Y/V395L、E68Y/I69L、D118N/M119E、E68Y/I69L/V97I/T98S/A246S/S247G/T261G/A262S/L347N/E348I、E68Y/I69L/S452A/V453S、E68Y/I69L/S452A/V453S、E68Y/I69L/E85Q/N86Q/L347N/E348I/Q418T/Q419P、E68Y/I69L/E85Q/N86Q/S204N/T205A、A208T/K209R/E381N/S382D/Q418T/Q419P/A469S/A470T、E381N/S382D/Q418T/Q419P/T436S/E437A/A469S/A470T、Q418T/Q419P/A469S/A470T、V170I/A171T/E381N/S382D/Q418T/Q419P/A469S/A470T、F394Y/V395L/Q418T/Q419P/T436S/E437A/A469S/A470T、T78K/L79D/Q418T/Q419P/A469S/A470T、E68Y/I69L/V88I/T89S/T352S/V353I/Q399E/T400K/A469S/A470T、S72A/V73F/A153S/S306A/T476W、T370V/G475V、R49H/S72A/V73F/A92T/Y93K/A153S/S306A/T476W、E68Y/I69L/T219S/V220Q/A307E/S355D/L492P、E11S/V42I/L149I/I224V/A317P/T388Q/A460S/G478S、Y412F/Q418T/Q419P/A469S/A470T/、L19I/D53N/I69L/V88I/S188H/A195V/Y321W/Y412F、V42I/D118N/M119E/T261A/L311V/Y321W/S355D、E11S/T57S/T89S、E11S/V42I/L79Y/D118N/M141L/L311V/A317P/Y321F、V42I/D53N/E68Y/A317P/L347N、I69L/S188H/A195V/A317P/Y321F/L364I/S434T、T57S/A195V/T261A/L311V/Y321F/L347N/E348I/S434T、E11S/V42I/T57S/E68Y/S188H/A195V/T261A、T57S/N168S/T261A/A317P/Y321W/V395L/Y412F、E11S/D53N/E68Y/D118N/S188H/A195V/Y412F/Q419P、E11S/V42I/D118N/M141L/N168S/Y321W/Y412F、E11S/D53N/T57S/E68Y/T89S/E381N/Y412F/Q419P/S434T、E11S/D53N/T57S/V88I/T89S/S188H/A195V/L311V/L347N/Y412F、A317P/Y412F、I69L/T89S/L311V/A317P/Y321F/Y412F/S434T、V42I/D53N/T57S/E68Y/V88I/Y412F、E11S/T57S/V88I/M141L/T261A/Y321W/L364I/Y412F、V42I/I69L/S188H/A317P/Y321W/Y412F、E11S/V42I/D53N/T57S/L79Y/T89S/L311V/Y321W/Y412F、L19I/M141L/N168S/S188H/A195V/L311V/S355D/S434T、S188H/A195V/T261A/L311V/Y321F/L347N/E348I、E11S/L19I/D53N/T57S/N168S/L347N、E11S/I69L/M119E/A195V/T261A/A317P/Y321W/L347N/Y412F、L79Y/V88I/T261A/A317P/Y321F/L364I/Y412F、E11S/V42I/E68Y/T89S/L311V/Y321F/T388Q/F394Y/V395L/Q419P、D53N/E68Y/V88I/M141L/N168S/Y321W/Y412F、E11S/I69L/L311V/A317P/Y321F/L347N/Y412F、D53N/T57S/M141L、D53N/V88I/T89S/D118N/E348I/S355D、E11S/S188H/A195V/A317P/L347N/E348I/Y412F/Q419P/S434T、E11S/D53N/I69L/V88I/A317P/Q419P、E68Y/I69L/V88I/N168S/L364I/Q419P、E11S/V42I/V88I/T261A/Y321F/E348I/S355D、E11S/V42I/T57S/I69L/A195V/L347N/E348I/S355D、L19I/T89S/A317P/Y321F/S434T、E11S/V42I/L79Y/L311V/A317P/Y321W/L347N/E348I/L364I/Y412F、D53N/T57S/L347N/E348I/Y412F、D53N/T57S/E68Y/L79Y/Y412F/S434T、L19I/V88I/T89S/A317P、M119E/M141L/N168S/L311V/Y321F、E11S/T89S/Y321W、E11S/M141L/T261A/A317P/Y412F/S434T、V42I/L79Y/S188H/A195V/L311V/Y321F/S355D、V42I/E68Y/V88I/T261A/Y321W/L347N/E348I、L19I/E68Y/I69L/M141L/Y321F/L347N/S355D/E381N/Y412F、V42I/D53N/I69L/L79Y/D118N/T261A/L311V/A317P/Y321F/L347N/Y412F、E68Y/S355D/L364I/S382D/T388Q/Q419P、E11S/L19I/V42I/E68Y/I69L/D118N/M141L/Y321W/L347N、/E11S/V42I/E68Y/M141L/A317P/Y321F/E348I/S355D、E11S/V42I/E68Y/I69L/V88I/T89S/D118N/M119E/S188H/A195V/A317P/L347N/Y412F/Q419P、V42I/V88I/L311V/A317P/Y321F/L347N/E348I/T388Q/V395L/S434T、T261A/A317P/Y321W/E348I、E11S/V42I/E68Y/I69L/D118N/M119E/Y412F、E11S/V42I/T57S/I69L/L311V、V42I/Y412F、E11S/L19I/E68Y/M119E/N168S/Y412F/Q419P、L19I/L311V/Y412F、E11S/V42I/M119E/Y412F、E11S/L19I/V42I/D53N/S188H/A195V/L311V/Y321F/Y412F、E11S/L19I/V42I/T57S/D118N/N168S/L311V/Y412F、L19I/V42I/D53N/T57S/N168S/A317P/Y321W/Y412F、D53N/T57S/E68Y/N168S/S188H/A195V/L311V/Y321W/Y412F/Q419P、L19I/D53N/T57S/L311V/Y321W/Y412F、E11S/T57S/Y321W/Y412F/Q419P、D53N/S188H/A195V/L311V/Y412F、V42I/D53N/S188H/A195V/L311V/Y321F/Y412F、L19I/M119E/N168S/S188H/A195V/L311V/Y412F/Q419P、E11S/V42I/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/V42I/M119E/N168S/L311V/Y412F、E11S/V42I/N168S/L311V/A317P/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/V42I/D53N/E68Y/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F/Y412F、E11S/L19I/D53N/N168S/A195V/Y412F/Q419P、E11S/L19I/V42I/L311V/Y412F、V42I/D53N/N168S/L311V/Y412F、E11S/L311V/Y412F、E11S/D53N/T57S/L311V/Y321W/Y412F、E11S/L311V/Y321W/Y412F、E11S/V42I/I69L/D118N/N168S/L311V/A317P/Y412F/Q419P、E11S/L19I/V42I/E68Y/Y412F/Q419P、E11S/L19I/D53N/L311V、E11S/L19I/V42I/L311V/Y412F/Q419P、L19I/V42I/D53N/T57S/I69L/N168S/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321W、E11S/L19I/V42I/T57S/L311V/A317P/Y321F/Y412F、L19I/V42I/I69L/D118N/N168S/L311V/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/V42I/D53N/E68Y/S188H/A195V/Y412F、E11S/L19I/V42I/D53N/T57S/N168S/L311V/Y321W/Y412F、E11S/V42I/L311V/Y412F、E11S/L19I/V42I/N168S/A195V/L311V/Y321F/Y412F、E11S/V42I/S188H/L311V/Y412F、L19I/V42I/T57S/E68Y/M119E/S188H/A195V/L311V/Y321F/Y412F、E11S/L19I/V42I/D53N/N168S/S188H/A195V、E11S/L19I/V42I/T57S/E68Y/A195V/L311V/Y321W和E11S/L19I/V42I.
在另一方面，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述变体葡糖淀粉酶具有氨基酸取代Y321F。
在一个另外的方面，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述变体葡糖淀粉酶具有氨基酸取代S188H/Y321W/Q419P。
在另一方面，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述变体葡糖淀粉酶包含氨基酸取代Y321F并且还包含选自以下的至少一个氨基酸：N27A、S36P、A38V、A39F、S46T、P47T、S50Q、V65I、E68N、L79F、T89N、T98S、A108S、P121S、F122M、G124P、G124S、G124T、G158S、Q161P、S188P、S188W、T192A、K212Y、S215A、T258S、A262S、H264M、I298V、Y321L、T400L、Y412F、L420K、A422G、P423G、P423R、P423V、G457S、A491V、K5P、K5S、K5T、K5Y、K5Q、K5N、K5H、E68K、E68Y、E68S、S188T、S188H、Y321W、Q419P、A422S、R7C、E11S、L19I、C26N、T31N、V42I、I44V、R49H、D53N、Y55F、T57S、I69L、S72A、V73F、T78K、L79D、L79Y、E85Q、N86Q、V88I、T89S、A92T、Y93K、L94V、V97I、S103D、D106T、D118N、M119E、A125P、M141L、Y145A、L149I、N150D、A153S、T155A、N168S、V170I、A171T、G178T、Y179F、P186E、A195V、S204N、T205A、A208T、K209R、S213T、H214C、T219S、V220Q、I224V、Y227F、A246S、S247G、A256V、T261A、T261G、S306A、A307E、D309S、L311V、A317P、V342I、L347N、E348I、T352S、V353I、S355D、T362Q、L364I、T370V、A374N、E381N、S382D、T388Q、A391G、F394Y、V395L、Q399E、T400K、A407S、Q418T、S434T、T436S、E437A、D440Q、G446S、S452A、V453S、A460S、A469S、A470T、S472T、G475V、T476W、G478S、L492P和L9P。
在一个另外的方面，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述变体葡糖淀粉酶包含氨基酸取代S188H/Y321W/Q419P并且还包含选自以下的至少一个氨基酸：N27A、S36P、A38V、A39F、S46T、P47T、S50Q、V65I、E68N、L79F、T89N、T98S、A108S、P121S、F122M、G124P、G124S、G124T、G158S、Q161P、S188P、S188W、T192A、K212Y、S215A、T258S、A262S、H264M、I298V、Y321L、Y321F、T400L、Y412F、L420K、A422G、P423G、P423R、P423V、G457S、A491V、K5P、K5S、K5T、K5Y、K5Q、K5N、K5H、E68K、E68Y、E68S、S188T、A422S、R7C、E11S、L19I、C26N、T31N、V42I、I44V、R49H、D53N、Y55F、T57S、I69L、S72A、V73F、T78K、L79D、L79Y、E85Q、N86Q、V88I、T89S、A92T、Y93K、L94V、V97I、S103D、D106T、D118N、M119E、A125P、M141L、Y145A、L149I、N150D、A153S、T155A、N168S、V170I、A171T、G178T、Y179F、P186E、A195V、S204N、T205A、A208T、K209R、S213T、H214C、T219S、V220Q、I224V、Y227F、A246S、S247G、A256V、T261A、T261G、S306A、A307E、D309S、L311V、A317P、V342I、L347N、E348I、T352S、V353I、S355D、T362Q、L364I、T370V、A374N、E381N、S382D、T388Q、A391G、F394Y、V395L、Q399E、T400K、A407S、Q418T、S434T、T436S、E437A、D440Q、G446S、S452A、V453S、A460S、A469S、A470T、S472T、G475V、T476W、G478S、L492P和L9P。
在一些方面，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述前蛋白包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11的序列。
在一些另外的方面，本发明提供了包含本文所述的核酸的表达载体。
在另一些方面，本发明提供了包含本文所述的核酸的宿主细胞。
在另一些方面，本发明提供了包含本文所述的表达载体的宿主细胞。
在一个另外的方面，本发明提供了本文所述的宿主细胞，其中所宿主细胞选自细菌细胞、真菌细胞或酵母细胞。
在另一方面，本发明提供了一种用于制备变体葡糖淀粉酶的方法，该方法包括：a)在其中表达所述变体葡糖淀粉酶的条件下培养本文所述的宿主细胞；以及b)回收所述变体葡糖淀粉酶。
在另一方面，本发明提供了包含SEQ ID NO:13的C-末端截短的变体葡糖淀粉酶的组合物，其中所述截短位置位于选自以下的位置编号处：493、500、502、503、506、509、510、513、514、519、520、522、524、525、544、549、550、551、556、558、560、563、564和569。
在一个另外的方面，本发明提供了包含变体葡糖淀粉酶的组合物，该变体葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:13相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代位于选自以下的位置处：5、27、36、38、39、46、47、50、65、68、79、89、98、108、121、122、124、158、161、188、192、212、215、258、262、264、298、321、400、412、419、420、422、423、457、491、497、498、503、508、509、510、516、518、521、522、526、533、534、535、540、542、544、545、549、550、551、555、556、557、559、563、564、569、570、581584、7、9、11、19、26、31、42、44、49、53、55、57、69、72、73、78、85、86、88、92、93、94、97、103、106、118、119、125、141、145、149、150、153、155、168、170、171、178、179、186、195、204、205、208、209、213、214、219、220、224、227、246、247、256、261、306、307、309、311、317、342、347、348、352、353、355、362、364、370、374、381、382、388、391、394、395、399、407、418、434、436、437、440、446、452、453、460、469、470、472、475、476、478和492，并且其中所述变体酶与SEQ ID NO:13至少95％相同。
在一些方面，本发明提供了包含变体葡糖淀粉酶的组合物，该变体葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:13相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代位于选自以下的位置处：5、27、36、38、39、46、47、50、65、68、79、89、98、108、121、122、124、158、161、188、192、212、215、258、262、264、298、321、400、412、419、420、422、423、457、491、497、498、503、508、509、510、516、518、521、522、526、533、534、535、540、542、544、545、549、550、551、555、556、557、559、563、564、569、570、581 584、7、9、11、19、26、31、42、44、49、53、55、57、69、72、73、78、85、86、88、92、93、94、97、103、106、118、119、125、141、145、149、150、153、155、168、170、171、178、179、186、195、204、205、208、209、213、214、219、220、224、227、246、247、256、261、306、307、309、311、317、342、347、348、352、353、355、362、364、370、374、381、382、388、391、394、395、399、407、418、434、436、437、440、446、452、453、460、469、470、472、475、476、478和492，其中所述变体葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:13相比在选自以下的条件下具有至少1.1倍更好的活性：在约30℃下热活性、在约35℃下的热活性，在约40℃下的热活性、在约50℃下的热活性、在约60℃下的热活性和在约70℃下的热活性；并且所述变体酶与SEQ ID NO:13至少95％相同。
在一些另外的方面，本发明提供了包含本文所述的变体葡糖淀粉酶的组合物，其中所述变体酶与SEQ ID NO:13至少96％、97％、98％或99％相同。
在另一些方面，本发明提供了包含本文所述的变体葡糖淀粉酶的组合物，其中所述氨基酸取代发生在所述位置中的一个、所述位置中的两个、所述位置中的三个、所述位置中的四个、所述位置中的五个、所述位置中的六个、所述位置中的七个、所述位置中的八个、所述位置中的九个、所述位置中的十个、所述位置中的十一个、所述位置中的十二个或所述位置中的十三个处。
在另一方面，本发明提供了包含本文所述的变体葡糖淀粉酶的组合物，其中所述氨基酸取代选自以下：K5H、K5N、K5P、K5Q、K5S、K5T、K5Y、N27A、S36P、A38V、A39F、S46T、P47T、S50Q、V65I、E68K、E68N、E68S、E68Y、L79F、T89N、T98S、A108S、P121S、F122M、G124P、G124S、G124T、G158S、Q161P、S188H、S188P、S188T、S188W、T192A、K212Y、S215A、T258S、A262S、H264M、I298V、Y321F、Y321L、Y321W、T400L、Y412F、Q419P、L420K、A422G、A422S、P423G、P423R、P423V、G457S、A491V、E497V、L498T、Y503D、Y503E、Y503G、Y503K、Y503L、Y503N、Y503S、Y503T、K508N、K508S、K508T、L509P、V510G、V510S、F516L、S518I、S518L、S518M、P521S、S522G、L526I、L526N、L526S、T533R、A534T、S535Y、T540N、T542N、S544E、S544N、S544Q、V545A、V545D、S549D、S549E、T550D、V551D、V551R、V551S、F555D、F555K、F555L、F555N、F555R、F555S、I556D、I556P、I556R、R557P、G559N、G559S、S563L、I564N、I564S、I564T、G569I、N570P、T581N、T584N、R7C、E11S、L19I、C26N、T31N、V42I、I44V、R49H、D53N、Y55F、T57S、I69L、S72A、V73F、T78K、L79D、L79Y、E85Q、N86Q、V88I、T89S、A92T、Y93K、L94V、V97I、S103D、D106T、D118N、M119E、A125P、M141L、Y145A、L149I、N150D、A153S、T155A、N168S、V170I、A171T、G178T、Y179F、P186E、A195V、S204N、T205A、A208T、K209R、S213T、H214C、T219S、V220Q、I224V、Y227F、A246S、S247G、A256V、T261A、T261G、S306A、A307E、D309S、L311V、A317P、V342I、L347N、E348I、T352S、V353I、S355D、T362Q、L364I、T370V、A374N、E381N、S382D、T388Q、A391G、F394Y、V395L、Q399E、T400K、A407S、Q418T、S434T、T436S、E437A、D440Q、G446S、S452A、V453S、A460S、A469S、A470T、S472T、G475V、T476W、G478S、L492P、和L9P。
在一个另外的方面，本发明提供了包含本文所述的变体葡糖淀粉酶的组合物，其中所述氨基酸取代选自以下：K5H、K5N、K5P、K5Q、K5S、K5T、K5Y、N27A、S36P、A38V、A39F、S46T、P47T、S50Q、V65I、E68K、E68N、E68S、E68Y、L79F、T89N、T98S、A108S、P121S、F122M、G124P、G124S、G124T、G158S、Q161P、S188H、S188P、S188T、S188W、T192A、K212Y、S215A、T258S、A262S、H264M、I298V、Y321F、Y321L、Y321W、T400L、Y412F、Q419P、L420K、A422G、A422S、P423G、P423R、P423V、G457S、A491V、E497V、L498T、Y503D、Y503E、Y503G、Y503K、Y503L、Y503N、Y503S、Y503T、K508N、K508S、K508T、L509P、V510G、V510S、F516L、S518I、S518L、S518M、P521S、S522G、L526I、L526N、L526S、T533R、A534T、S535Y、T540N、T542N、S544E、S544N、S544Q、V545A、V545D、S549D、S549E、T550D、V551D、V551R、V551S、F555D、F555K、F555L、F555N、F555R、F555S、I556D、I556P、I556R、R557P、G559N、G559S、S563L、I564N、I564S、I564T、G569I、N570P、T581N、T584N、L9P、E11S、L19I、V42I、D53N、T57S、I69L、L79Y、V88I、T89S、D118N、M119E、M141L、N168S、A195V、T261A、L311V、A317P、L347N、E348I、S355D、L364I、E381N、S382D、T388Q、F394Y、V395L和S434T。
在另一方面，本发明提供了包含本文所述的变体葡糖淀粉酶的组合物，其中所述氨基酸取代选自以下：S188H/Y321W/Q419P、T98S/Q161P/F516L、T98S/Q161P/N570P、T98S/Q161P、T550D/F555S、V65I/Y412F/Y503S/S518I、Y412F/Y503S/I564T、Y412F/Y503E、Y412F/Y503E/S518I、V65I/Y412F/Y503S、V65I/Y503E、Y503D/S518I/I564N、Y503E/S518L、V65I/Y503E/S544Q、V65I/Y503S、Y503E/S544E、V65I/Y503E/S544E/I564N、V65I/Y412F/Y503E、Y503E/S518I/S544Q、V65I/Y503E/S518M、Y412F/S518L、Y503E/S544Q、V65I/Y412F/Y503E/S544E/I564T/G569I、Y412F/Y503S、Y503E/I564T、S549D/F555D/G559N、S549D/F555R、K508T/L526N/S549D/G559N、K508T/G559N、F555D/I556P/G559N、S549D/F555R/I556P/G559N、F555R/I556P、L526I/F555R/I556P、F555R/I556P/G559N、K508T/I556P/G559N、F555D/I556P、K508T/L526N/A534T/S549D/I556P、K508T/L526I/S549D/G559N、K508N/L526I/S549E/F555L/G559N、L526N/S549D/F555D/I556P、L526I/F555D/G559N、A38V/F555R、A39F/T540N/T542N、L498T/T542N/T581N/T584N、T542N/T581N/T584N、S535Y/T542N、T540N/T584N、T540N/T542N/T581N/T584N、L498T/T581N/T584N、L498T/T584N、L498T/T542N/T581N、P121S/T542N/T584N、L498T/T542N、S535Y/T540N/T542N/T581N、Q419P/P423R、L79F/Q419P、Q419P/P423V、Q419P/P423R/T533R、S36P/Q419P、Q419P/P423G、S36P/T400L/Q419P/P423G、S50Q/Q419P/P423R、S50Q/Q419P/P423R/G457S/E497V/P521S、Y321F/A422S、S188H/Q419P、K5H/Y321W、K5N/Y321F、K5P/S188H、E68S/S188H/A422S、S188T/Y321F/Q419P/A422S、K5H/S188H/Y321F/A422S、S188H/Y321W/Q419P、S188H/A422S、S188H/A422S/V545A、K5Q/A422S、K5S/E68K/Y321W、K5H/Y321F/A422S、S188H/Y321W/Q419P、K5Y/A422S、Q419P/A422S、K5Y/S188H/A422S、K5T/A422S、K5T/Y321W、Y321W/A422S、Q419P/A422S、K5P/Y321F、K5H/S188H/Y321F/A422S、E68K/A422S、Y321F/A422S、K5H/Y321F、K5T/Y321F/Q419P/A422S、K5T/E68Y/S188T、K5S/E68Y/S188H、K5N/S188H、K5T/E68S/S188T、K5H/E68Y/S188P、K5P/E68Y/S188T、K5T/E68K/S188H、K5P/E68K/S188T、K5H/E68Y/S188T、K5T/S188H、K5T/E68N/S188T、K5Y/E68Y/S188T、K5S/E68Y/S188T、K5Q/E68K/S188H、K5P/E68N/S188H、K5P/E68N/S188T、K5P/E68Y/S188H、K5Y/E68Y/S188H、K5S/S188T、K5H/E68N/S188H、K5P/S188H、K5H/S46T/E68K/S188H、K5H/E68K/S188T、K5Q/E68Y/S188T、K5Y/E68N/S188H、V42I/S188H/A195V/Y412F/Q419P、L19I/V42I/E68Y/N168S/S188H/A195V/Y412F、E11S/V42I/T57S/D118N/N168S/S188H/A195V/L311V、E11S/V42I/D53N/E68Y/N168S/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/L19I/V42I/I69L/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/L19I/V42I/E68Y/D118N/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/L19I/T57S/M119E/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/V42I/A317P/Y412F/Q419P、L19I/T57S/I69L/D118N/N168S/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F/Y412F/Q419P、E11S/E68Y/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/L19I/V42I/E68Y/I69L/D118N/N168S/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/L19I/V42I/S188H/A195V/L311V/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/L19I/N168S/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F/Y412F、E11S/V42I/E68Y/Y412F、E11S/L19I/V42I/E68Y/Y412F、E11S/V42I/E68Y/S188H/A195V/Y412F、E11S/L19I/V42I/T57S/I69L/S188H/A195V/L311V/Y321W/Y412F、E11S/L19I/D53N/E68Y/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/V42I/E68Y/S188H/A195V/L311V/Y321W/Y412F、E11S/V42I/E68Y/S188H/L311V/Y412F/Q419P、E11S/L19I/V42I/E68Y/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/L19I/D53N/I69L/S188H/A195V/L311V/Q419P、E11S/V42I/E68Y/N168S/L311V/A317P/Y321W/Y412F、E11S/E68Y/I69L/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F/Y412F、E11S/V42I/T57S/E68Y/I69L/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F、E11S/D53N/T57S/L311V/Y321F/Y412F/Q419P、E11S/L19I/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/L19I/I69L/S188H/A195V/L311V/A317P、E11S/V42I/I69L/N168S/S188H/A195V/L311V/A317P/Y412F/Q419P、E11S/V42I/E68Y/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/V42I/I69L/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F/Y412F、E11S/Y412F、E11S/L19I/V42I/E68Y/I69L/S188H/A195V/Y412F、E11S/L19I/V42I/D53N/T57S/S188H/A195V/L311V/Y321W/Y412F、V42I/E68Y/Y412F、E11S/L19I/V42I/D53N/T57S/E68Y/I69L/N168S/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F、E11S/L19I/V42I/D53N/T57S/I69L/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321W/Y412F、E11S/V42I/A317P/Y321F、E11S/V42I/T57S/E68Y/D118N/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/L19I/V42I/E68Y/I69L/D118N/N168S/S188H/A195V/L311V/Y412F/Q419P、E11S/V42I/D53N/E68Y/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/I69L/D118N/S188H/A195V/L311V/Y412F、V42I/D53N/T57S/E68Y/M141L/N168S/T261A/Y321W/E381N/Y412F、E11S/V42I/S188H/L347N/Y412F/S434T、D53N/T57S/E68Y/D118N/M119E/L311V/E348I/Y412F、D118N/N168S/S188H/L347N/E348I/S382D/T388Q/V395L、E68Y/I69L/N168S/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/E68Y/V88I/A317P/Y321F/S355D、D53N/I69L/L79Y/M119E/T261A/L311V/L347N/E348I/Q419P、V42I/E68Y/I69L/D118N/M119E/M141L/L311V/A317P/Y321F/L347N、E11S/L19I/E68Y/I69L/L79Y/M141L/N168S/T261A/A317P/Y321W/L347N、E11S/V42I/E68Y/I69L/L311V/Y321W/S434T、E11S/V42I/D53N/N168S/L311V/A317P/Y321W、E11S/E68Y/I69L/D118N/N168S/Y321F/Y412F、V42I/D53N/T57S/L311V/Y321W/S355D/Y412F/Q419P、V42I/E68Y/L311V/L347N/L364I/Y412F、E11S/D118N/M119E/M141L/L311V/Y321W/L347N、V42I/D53N/T57S/M119E/M141L/A317P/Y321F/Q419P、T57S/I69L/T89S/S188H/A195V/T261A/L311V/A317P/Y321W/F394Y/Y412F、Y321F/Y412F、V42I/T57S/E68Y/I69L/T89S/M119E/T261A/A317P/Y412F/S434T、E11S/V42I/E68Y/L311V/A317P/S434T、V42I/D53N/T57S/E68Y/I69L/S434T、V42I/E68Y/Y321W、L311V/L347N/E348I/S355D/L364I/S434T、E11S/D53N/T57S/E68Y/V88I/T89S/M119E/A317P/Y321W、D53N/E68Y/I69L/T89S/L311V/A317P/S355D/Q419P、V42I/E68Y/A317P/Y321F/Y412F、L19I/I69L/T89S/L311V/A317P/Y321F/S355D/L364I/Y412F、V42I/D53N/T57S/E68Y/I69L/M141L/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F/Y412F/S434T、T57S/V88I/A317P/Y321W/Q419P、E11S/L19I/V42I/D53N/E68Y/L311V/A317P/Y321W/Y412F、E11S/V42I/D53N/E68Y/I69L/S188H/A195V/E348I、L19I/V42I/T57S/I69L/V88I/M119E/T261A/A317P/Y321F/Y412F、D53N/E68Y/D118N/M119E/M141L/T261A/L347N/E348I/S355D/L364I/S434T、E11S/T261A/L347N/E348I/S355D/S434T、M119E/S188H/E348I、E11S/A317P/Y321F/L347N、E11S/E68Y/I69L/T261A/L364I、D118N/M119E/N168S/S188H/A195V/L311V/Y321W/L347N/F394Y、E11S/L311V/Y321W/E348I/S355D/L364I/Y412F、V42I/D53N/T57S/I69L/V88I/L347N/E348I/F394Y/V395L/S434T、E11S/D53N/T89S/N168S/S188H/T261A/L311V/A317P/Y321W/S355D/Y412F、L19I/V42I/D53N/L79Y/T89S/N168S/T261A/L311V/Y321W/Y412F/Q419P/S434T、L79Y/V88I/D118N/M119E/T261A/Y321F/L364I/Y412F、V42I/E68Y/T89S/M141L/T261A/L311V/Y321F/E348I/L364I、V42I/E68Y/D118N/S188H/T261A/Y412F/S434T、E11S/D53N/E68Y/I69L/T89S/Y321W/E348I/S355D、M119E/L311V/Y321F、L311V/L347N/E348I、E11S/V42I/A317P/Y321F/L347N/Y412F、E11S/L19I/V42I/E68Y/A317P/Y321F/L364I/Y412F、D53N/E68Y/T89S/T261A、I69L/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321W/V395L/Y412F、V42I/D53N/E68Y/V88I/T89S/D118N/L311V/Y412F/S434T、E11S/V42I/E68Y/I69L/L311V/E348I、V42I/Y321W、E68Y/T261A/L311V/L347N/E348I/S434T、E11S/E68Y/I69L/L79Y、V42I/D53N/E68Y/S188H/A195V/T261A/L311V/Y321F/S355D/S434T、L19I/V42I/S188H/A195V/S382D/V395L/Q419P、E11S/L19I/V42I/D53N/T57S/M119E/L311V/Y321W/L347N/F394Y/Y412F、L9P/E11S/D53N/T57S/E68Y/M119E/M141L/E348I/Y412F和L19I/V42I/I69L/L311V/Y321W/L347N。
在一个另外的方面，本发明提供了包含本文所述的变体葡糖淀粉酶的组合物，其中所述氨基酸取代为Y321F。
在一些方面，本发明提供了包含本文所述的变体葡糖淀粉酶的组合物，其中所述氨基酸取代为S188H/Y321W/Q419P。
在另一方面，本发明提供了包含本文所述的至少一种变体葡糖淀粉酶的组合物，其中所述氨基酸取代包含Y321F，并且还包含选自以下的至少一个氨基酸取代：K5H、K5N、K5P、K5Q、K5S、K5T、K5Y、N27A、S36P、A38V、A39F、S46T、P47T、S50Q、V65I、E68K、E68N、E68S、E68Y、L79F、T89N、T98S、A108S、P121S、F122M、G124P、G124S、G124T、G158S、Q161P、S188H、S188P、S188T、S188W、T192A、K212Y、S215A、T258S、A262S、H264M、I298V、Y321L、Y321W、T400L、Y412F、Q419P、L420K、A422G、A422S、P423G、P423R、P423V、G457S、A491V、E497V、L498T、Y503D、Y503E、Y503G、Y503K、Y503L、Y503N、Y503S、Y503T、K508N、K508S、K508T、L509P、V510G、V510S、F516L、S518I、S518L、S518M、P521S、S522G、L526I、L526N、L526S、T533R、A534T、S535Y、T540N、T542N、S544E、S544N、S544Q、V545A、V545D、S549D、S549E、T550D、V551D、V551R、V551S、F555D、F555K、F555L、F555N、F555R、F555S、I556D、I556P、I556R、R557P、G559N、G559S、S563L、I564N、I564S、I564T、G569I、N570P、T581N、T584N、R7C、E11S、L19I、C26N、T31N、V42I、I44V、R49H、D53N、Y55F、T57S、I69L、S72A、V73F、T78K、L79D、L79Y、E85Q、N86Q、V88I、T89S、A92T、Y93K、L94V、V97I、S103D、D106T、D118N、M119E、A125P、M141L、Y145A、L149I、N150D、A153S、T155A、N168S、V170I、A171T、G178T、Y179F、P186E、A195V、S204N、T205A、A208T、K209R、S213T、H214C、T219S、V220Q、I224V、Y227F、A246S、S247G、A256V、T261A、T261G、S306A、A307E、D309S、L311V、A317P、V342I、L347N、E348I、T352S、V353I、S355D、T362Q、L364I、T370V、A374N、E381N、S382D、T388Q、A391G、F394Y、V395L、Q399E、T400K、A407S、Q418T、S434T、T436S、E437A、D440Q、G446S、S452A、V453S、A460S、A469S、A470T、S472T、G475V、T476W、G478S、L492P和L9P。
在一个另外的方面，本发明提供了包含本文所述的至少一种变体葡糖淀粉酶的组合物，其中所述氨基酸取代包含S188H/Y321W/Q419P，并且还包含选自以下的至少一个氨基酸取代：K5H、K5N、K5P、K5Q、K5S、K5T、K5Y、N27A、S36P、A38V、A39F、S46T、P47T、S50Q、V65I、E68K、E68N、E68S、E68Y、L79F、T89N、T98S、A108S、P121S、F122M、G124P、G124S、G124T、G158S、Q161P、S188P、S188T、S188W、T192A、K212Y、S215A、T258S、A262S、H264M、I298V、Y321F、Y321L、T400L、Y412F、L420K、A422G、A422S、P423G、P423R、P423V、G457S、A491V、E497V、L498T、Y503D、Y503E、Y503G、Y503K、Y503L、Y503N、Y503S、Y503T、K508N、K508S、K508T、L509P、V510G、V510S、F516L、S518I、S518L、S518M、P521S、S522G、L526I、L526N、L526S、T533R、A534T、S535Y、T540N、T542N、S544E、S544N、S544Q、V545A、V545D、S549D、S549E、T550D、V551D、V551R、V551S、F555D、F555K、F555L、F555N、F555R、F555S、I556D、I556P、I556R、R557P、G559N、G559S、S563L、I564N、I564S、I564T、G569I、N570P、T581N、T584N、R7C、E11S、L19I、C26N、T31N、V42I、I44V、R49H、D53N、Y55F、T57S、I69L、S72A、V73F、T78K、L79D、L79Y、E85Q、N86Q、V88I、T89S、A92T、Y93K、L94V、V97I、S103D、D106T、D118N、M119E、A125P、M141L、Y145A、L149I、N150D、A153S、T155A、N168S、V170I、A171T、G178T、Y179F、P186E、A195V、S204N、T205A、A208T、K209R、S213T、H214C、T219S、V220Q、I224V、Y227F、A246S、S247G、A256V、T261A、T261G、S306A、A307E、D309S、L311V、A317P、V342I、L347N、E348I、T352S、V353I、S355D、T362Q、L364I、T370V、A374N、E381N、S382D、T388Q、A391G、F394Y、V395L、Q399E、T400K、A407S、Q418T、S434T、T436S、E437A、D440Q、G446S、S452A、V453S、A460S、A469S、A470T、S472T、G475V、T476W、G478S、L492P和L9P。
在一些另外的方面，本发明提供了包含变体葡糖淀粉酶的组合物，其中所述变体葡糖淀粉酶与本文所述的SEQ ID NO:13相比包含至少一个氨基酸取代，并且还包含在选自以下的位置编号处的C-末端氨基酸截短：493、500、502、503、506、509、510、513、514、519、520、522、524、525、544、549、550、551、556、558、560、563、564和569。
在一些方面，本发明提供了编码本文所述的所述变体葡糖淀粉酶的核酸。
在另一些方面，本发明提供了本文所述的核酸，其中所述核酸针对宿主生物体进行密码子优化以在所述生物体中表达变体葡糖淀粉酶。
在一些另外的方面，本发明提供了包含选自SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的序列的核酸。
在另一些方面，本发明提供了包含本文所述的核酸的表达载体。
在另一方面，本发明提供了包含本文所述的核酸的宿主细胞。
在另一方面，本发明提供了包含本文所述的表达载体的宿主细胞。
在一个另外的方面，本发明提供了本文所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自细菌细胞、真菌细胞、或酵母细胞。
在一些方面，本发明提供了一种用于制备变体葡糖淀粉酶的方法，该方法包括：a)在其中表达所述变体葡糖淀粉酶的条件下培养本文所述的宿主细胞；以及b)回收所述变体葡糖淀粉酶。
在一个另外的方面，本发明提供了编码包含信号肽的前蛋白和成熟蛋白的核酸，其中所述信号肽为SEQ ID NO:26或与SEQ ID NO:26相比的变体信号肽，并且所述变体信号肽在选自-20、-18、-17、-15、-13、-12、-10、-9、和-1的位置编号处具有至少一个氨基酸取代；并且
其中所述成熟蛋白具有SEQ ID NO:13，或为与SEQ ID NO:13相比的变体葡糖淀粉酶，其中所述变体葡糖淀粉酶在选自以下的位置编号处具有至少一个氨基酸取代：5、27、36、38、39、46、47、50、65、68、79、89、98、108、121、122、124、158、161、188、192、212、215、258、262、264、298、321、400、412、419、420、422、423、457、491、497、498、503、508、509、510、516、518、521、522、526、533、534、535、540、542、544、545、549、550、551、555、556、557、559、563、564、569、570、581、584；7、9、11、19、26、31、42、44、49、53、55、57、69、72、73、78、85、86、88、92、93、94、97、103、106、118、119、125、141、145、149、150、153、155、168、170、171、178、179、186、195、204、205、208、209、213、214、219、220、224、227、246、247、256、261、306、307、309、311、317、342、347、348、352、353、355、362、364、370、374、381、382、388、391、394、395、399、407、418、434、436、437、440、446、452、453、460、469、470、472、475、476、478和492，并且其中所述前蛋白与SEQ ID NO:1至少95％相同；并且其中所述前蛋白不是SEQ ID NO:1。
在另一方面，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述前蛋白表现出与SEQ ID NO:1至少96％、97％、98％或99％同一性。
在另一方面，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，所述变体信号肽在所述位置中的一个、所述位置中的两个、所述位置中的三个、所述位置中的四个或所述位置中的五个处具有氨基酸取代。
在另一方面，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，所述变体葡糖淀粉酶在所述位置中的一个、所述位置中的两个、所述位置中的三个、所述位置中的四个、所述位置中的五个、所述位置中的六个、所述位置中的七个、所述位置中的八个、所述位置中的九个、所述位置中的十个、所述位置中的十一个、所述位置中的十二个或所述位置中的十三个处具有氨基酸取代。
在一些另外的方面，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述变体信号肽具有选自以下的氨基酸取代：V-20A、V-20F、V-20G、V-20I、V-20K、V-20L、V-20M、V-20Q、V-20R、V-20T、V-20W、L-18F、L-18I、L-18Y、K-17F、K-17N、K-17Y、A-15F、A-15I、A-15L、A-15V、A-13T、A-12V、T-10F、T-10V、W-9Y和V-1F。
在另一些方面，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述变体葡糖淀粉酶具有选自以下的氨基酸取代：K5H、K5N、K5P、K5Q、K5S、K5T、K5Y、N27A、S36P、A38V、A39F、S46T、P47T、S50Q、V65I、E68K、E68N、E68S、E68Y、L79F、T89N、T98S、A108S、P121S、F122M、G124P、G124S、G124T、G158S、Q161P、S188H、S188P、S188T、S188W、T192A、K212Y、S215A、T258S、A262S、H264M、I298V、Y321F、Y321L、Y321W、T400L、Y412F、Q419P、L420K、A422G、A422S、P423G、P423R、P423V、G457S、A491V、E497V、L498T、Y503D、Y503E、Y503G、Y503K、Y503L、Y503N、Y503S、Y503T、K508N、K508S、K508T、L509P、V510G、V510S、F516L、S518I、S518L、S518M、P521S、S522G、L526I、L526N、L526S、T533R、A534T、S535Y、T540N、T542N、S544E、S544N、S544Q、V545A、V545D、S549D、S549E、T550D、V551D、V551R、V551S、F555D、F555K、F555L、F555N、F555R、F555S、I556D、I556P、I556R、R557P、G559N、G559S、S563L、I564N、I564S、I564T、G569I、N570P、T581N、T584N、R7C、E11S、L19I、C26N、T31N、V42I、I44V、R49H、D53N、Y55F、T57S、I69L、S72A、V73F、T78K、L79D、L79Y、E85Q、N86Q、V88I、T89S、A92T、Y93K、L94V、V97I、S103D、D106T、D118N、M119E、A125P、M141L、Y145A、L149I、N150D、A153S、T155A、N168S、V170I、A171T、G178T、Y179F、P186E、A195V、S204N、T205A、A208T、K209R、S213T、H214C、T219S、V220Q、I224V、Y227F、A246S、S247G、A256V、T261A、T261G、S306A、A307E、D309S、L311V、A317P、V342I、L347N、E348I、T352S、V353I、S355D、T362Q、L364I、T370V、A374N、E381N、S382D、T388Q、A391G、F394Y、V395L、Q399E、T400K、A407S、Q418T、S434T、T436S、E437A、D440Q、G446S、S452A、V453S、A460S、A469S、A470T、S472T、G475V、T476W、G478S、L492P和L9P。
在一个另外的方面，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述变体葡糖淀粉酶具有选自以下的氨基酸取代：K5H、K5N、K5P、K5Q、K5S、K5T、K5Y、N27A、S36P、A38V、A39F、S46T、P47T、S50Q、V65I、E68K、E68N、E68S、E68Y、L79F、T89N、T98S、A108S、P121S、F122M、G124P、G124S、G124T、G158S、Q161P、S188H、S188P、S188T、S188W、T192A、K212Y、S215A、T258S、A262S、H264M、I298V、Y321F、Y321L、Y321W、T400L、Y412F、Q419P、L420K、A422G、A422S、P423G、P423R、P423V、G457S、A491V、E497V、L498T、Y503D、Y503E、Y503G、Y503K、Y503L、Y503N、Y503S、Y503T、K508N、K508S、K508T、L509P、V510G、V510S、F516L、S518I、S518L、S518M、P521S、S522G、L526I、L526N、L526S、T533R、A534T、S535Y、T540N、T542N、S544E、S544N、S544Q、V545A、V545D、S549D、S549E、T550D、V551D、V551R、V551S、F555D、F555K、F555L、F555N、F555R、F555S、I556D、I556P、I556R、R557P、G559N、G559S、S563L、I564N、I564S、I564T、G569I、N570P、T581N、T584N、L9P、E11S、L19I、V42I、D53N、T57S、I69L、L79Y、V88I、T89S、D118N、M119E、M141L、N168S、A195V、T261A、L311V、A317P、L347N、E348I、S355D、L364I、E381N、S382D、T388Q、F394Y、V395L和S434T。
在另一方面，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述前蛋白具有选自以下的氨基酸取代：S188H/Y321W/Q419P、T98S/Q161P/F516L、T98S/Q161P/N570P、T98S/Q161P、T550D/F555S、V-20A/T258S、V65I/Y412F/Y503S/S518I、Y412F/Y503S/I564T、Y412F/Y503E、Y412F/Y503E/S518I、V65I/Y412F/Y503S、V65I/Y503E、Y503D/S518I/I564N、Y503E/S518L、V65I/Y503E/S544Q、V65I/Y503S、Y503E/S544E、V65I/Y503E/S544E/I564N、V65I/Y412F/Y503E、Y503E/S518I/S544Q、V65I/Y503E/S518M、Y412F/S518L、Y503E/S544Q、V65I/Y412F/Y503E/S544E/I564T/G569I、Y412F/Y503S、Y503E/I564T、S549D/F555D/G559N、S549D/F555R、K508T/L526N/S549D/G559N、K508T/G559N、F555D/I556P/G559N、S549D/F555R/I556P/G559N、F555R/I556P、L526I/F555R/I556P、F555R/I556P/G559N、K508T/I556P/G559N、F555D/I556P、K508T/L526N/A534T/S549D/I556P、K508T/L526I/S549D/G559N、K508N/L526I/S549E/F555L/G559N、L526N/S549D/F555D/I556P、L526I/F555D/G559N、A38V/F555R、A39F/T540N/T542N、L498T/T542N/T581N/T584N、T542N/T581N/T584N、S535Y/T542N、T540N/T584N、T540N/T542N/T581N/T584N、L498T/T581N/T584N、L498T/T584N、L498T/T542N/T581N、P121S/T542N/T584N、L498T/T542N、S535Y/T540N/T542N/T581N、Q419P/P423R、L79F/Q419P、Q419P/P423V、Q419P/P423R/T533R、S36P/Q419P、Q419P/P423G、S36P/T400L/Q419P/P423G、S50Q/Q419P/P423R、S50Q/Q419P/P423R/G457S/E497V/P521S、V-20R/A-15I、A-15F/S188T、V-20F/A-15I/Y321F/A422S、V-20F/A-15F/S188H/Q419P、A-15F/K5H/Y321W、A-15F/K5N/Y321F、V-20F/Y321F、V-20F/A-15I、A-15F/K5P/S188H、V-20F/E68S/S188H/A422S、V-20F/S188T/Y321F/Q419P/A422S、V-20F/K5H/S188H/Y321F/A422S、V-20F/A422S、A-15I/S188H/Y321W/Q419P、A-15F/S188H/A422S、V-20F/S188H/A422S/V545A、V-20F/A-15I/Q419P、V-20F/K5Q/A422S、V-20R/A-15I/K5S/E68K/Y321W、A-15F/K5H/Y321F/A422S、V-20F/A-15F/K5N、V-20F/S188H/Y321W/Q419P、A-15I/Y321F、A-15F/K5Y/A422S、V-20F/A-15F/Q419P/A422S、V-20F/K5Y/S188H/A422S、V-20T/A-15I/K5T/A422S、V-20T/A-15I/K5T/Y321W、V-20R/A-15F/Y321W/A422S、A-15F/A-13T、V-20F/Q419P/A422S、A-15I/K5P/Y321F、V-20F/A-15F/Y321W、V-20F/A-15F/K5H/S188H/Y321F/A422S、A-15I/E68K/A422S、Y321F/A422S、V-20T/A-15F/K5H/Y321F、V-20T/A-15I/K5T/Y321F/Q419P/A422S、K5T/E68Y/S188T、K5S/E68Y/S188H、K5N/S188H、K5T/E68S/S188T、K5H/E68Y/S188P、K5P/E68Y/S188T、K5T/E68K/S188H、K5P/E68K/S188T、K5H/E68Y/S188T、K5T/S188H、K5T/E68N/S188T、K5Y/E68Y/S188T、K5S/E68Y/S188T、K5Q/E68K/S188H、K5P/E68N/S188H、K5P/E68N/S188T、K5P/E68Y/S188H、K5Y/E68Y/S188H、K5S/S188T、K5H/E68N/S188H、K5P/S188H、K5H/S46T/E68K/S188H、K5H/E68K/S188T、K5Q/E68Y/S188T、K5Y/E68N/S188H、V42I/S188H/A195V/Y412F/Q419P、L19I/V42I/E68Y/N168S/S188H/A195V/Y412F、E11S/V42I/T57S/D118N/N168S/S188H/A195V/L311V、E11S/V42I/D53N/E68Y/N168S/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/L19I/V42I/I69L/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/L19I/V42I/E68Y/D118N/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/L19I/T57S/M119E/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/V42I/A317P/Y412F/Q419P、L19I/T57S/I69L/D118N/N168S/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F/Y412F/Q419P、E11S/E68Y/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/L19I/V42I/E68Y/I69L/D118N/N168S/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/L19I/V42I/S188H/A195V/L311V/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/L19I/N168S/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F/Y412F、E11S/V42I/E68Y/Y412F、E11S/L19I/V42I/E68Y/Y412F、E11S/V42I/E68Y/S188H/A195V/Y412F、E11S/L19I/V42I/T57S/I69L/S188H/A195V/L311V/Y321W/Y412F、E11S/L19I/D53N/E68Y/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/V42I/E68Y/S188H/A195V/L311V/Y321W/Y412F、E11S/V42I/E68Y/S188H/L311V/Y412F/Q419P、E11S/L19I/V42I/E68Y/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/L19I/D53N/I69L/S188H/A195V/L311V/Q419P、E11S/V42I/E68Y/N168S/L311V/A317P/Y321W/Y412F、E11S/E68Y/I69L/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F/Y412F、E11S/V42I/T57S/E68Y/I69L/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F、E11S/D53N/T57S/L311V/Y321F/Y412F/Q419P、E11S/L19I/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/L19I/I69L/S188H/A195V/L311V/A317P、E11S/V42I/I69L/N168S/S188H/A195V/L311V/A317P/Y412F/Q419P、E11S/V42I/E68Y/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/V42I/I69L/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F/Y412F、E11S/Y412F、E11S/L19I/V42I/E68Y/I69L/S188H/A195V/Y412F、E11S/L19I/V42I/D53N/T57S/S188H/A195V/L311V/Y321W/Y412F、V42I/E68Y/Y412F、E11S/L19I/V42I/D53N/T57S/E68Y/I69L/N168S/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F、E11S/L19I/V42I/D53N/T57S/I69L/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321W/Y412F、E11S/V42I/A317P/Y321F、E11S/V42I/T57S/E68Y/D118N/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/L19I/V42I/E68Y/I69L/D118N/N168S/S188H/A195V/L311V/Y412F/Q419P、E11S/V42I/D53N/E68Y/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/I69L/D118N/S188H/A195V/L311V/Y412F、V42I/D53N/T57S/E68Y/M141L/N168S/T261A/Y321W/E381N/Y412F、E11S/V42I/S188H/L347N/Y412F/S434T、D53N/T57S/E68Y/D118N/M119E/L311V/E348I/Y412F、D118N/N168S/S188H/L347N/E348I/S382D/T388Q/V395L、E68Y/I69L/N168S/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/E68Y/V88I/A317P/Y321F/S355D、D53N/I69L/L79Y/M119E/T261A/L311V/L347N/E348I/Q419P、V42I/E68Y/I69L/D118N/M119E/M141L/L311V/A317P/Y321F/L347N、E11S/L19I/E68Y/I69L/L79Y/M141L/N168S/T261A/A317P/Y321W/L347N、E11S/V42I/E68Y/I69L/L311V/Y321W/S434T、E11S/V42I/D53N/N168S/L311V/A317P/Y321W、E11S/E68Y/I69L/D118N/N168S/Y321F/Y412F、V42I/D53N/T57S/L311V/Y321W/S355D/Y412F/Q419P、V42I/E68Y/L311V/L347N/L364I/Y412F、E11S/D118N/M119E/M141L/L311V/Y321W/L347N、V42I/D53N/T57S/M119E/M141L/A317P/Y321F/Q419P、T57S/I69L/T89S/S188H/A195V/T261A/L311V/A317P/Y321W/F394Y/Y412F、Y321F/Y412F、V42I/T57S/E68Y/I69L/T89S/M119E/T261A/A317P/Y412F/S434T、E11S/V42I/E68Y/L311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在另一方面，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述变体葡糖淀粉酶具有氨基酸取代Y321F。
在一个另外的方面，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述变体葡糖淀粉酶具有氨基酸取代S188H/Y321W/Q419P。
在另一方面，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述变体葡糖淀粉酶包含氨基酸取代Y321F，并且还包含K5H、K5N、K5P、K5Q、K5S、K5T、K5Y、N27A、S36P、A38V、A39F、S46T、P47T、S50Q、V65I、E68K、E68N、E68S、E68Y、L79F、T89N、T98S、A108S、P121S、F122M、G124P、G124S、G124T、G158S、Q161P、S188H、S188P、S188T、S188W、T192A、K212Y、S215A、T258S、A262S、H264M、I298V、Y321L、Y321W、T400L、Y412F、Q419P、L420K、A422G、A422S、P423G、P423R、P423V、G457S、A491V、E497V、L498T、Y503D、Y503E、Y503G、Y503K、Y503L、Y503N、Y503S、Y503T、K508N、K508S、K508T、L509P、V510G、V510S、F516L、S518I、S518L、S518M、P521S、S522G、L526I、L526N、L526S、T533R、A534T、S535Y、T540N、T542N、S544E、S544N、S544Q、V545A、V545D、S549D、S549E、T550D、V551D、V551R、V551S、F555D、F555K、F555L、F555N、F555R、F555S、I556D、I556P、I556R、R557P、G559N、G559S、S563L、I564N、I564S、I564T、G569I、N570P、T581N、T584N、R7C、E11S、L19I、C26N、T31N、V42I、I44V、R49H、D53N、Y55F、T57S、I69L、S72A、V73F、T78K、L79D、L79Y、E85Q、N86Q、V88I、T89S、A92T、Y93K、L94V、V97I、S103D、D106T、D118N、M119E、A125P、M141L、Y145A、L149I、N150D、A153S、T155A、N168S、V170I、A171T、G178T、Y179F、P186E、A195V、S204N、T205A、A208T、K209R、S213T、H214C、T219S、V220Q、I224V、Y227F、A246S、S247G、A256V、T261A、T261G、S306A、A307E、D309S、L311V、A317P、V342I、L347N、E348I、T352S、V353I、S355D、T362Q、L364I、T370V、A374N、E381N、S382D、T388Q、A391G、F394Y、V395L、Q399E、T400K、A407S、Q418T、S434T、T436S、E437A、D440Q、G446S、S452A、V453S、A460S、A469S、A470T、S472T、G475V、T476W、G478S、L492P和L9P。
在一个另外的方面，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述变体葡糖淀粉酶包含氨基酸取代S188H/Y321W/Q419P，并且还包含K5H、K5N、K5P、K5Q、K5S、K5T、K5Y、N27A、S36P、A38V、A39F、S46T、P47T、S50Q、V65I、E68K、E68N、E68S、E68Y、L79F、T89N、T98S、A108S、P121S、F122M、G124P、G124S、G124T、G158S、Q161P、S188P、S188T、S188W、T192A、K212Y、S215A、T258S、A262S、H264M、I298V、Y321F、Y321L、T400L、Y412F、L420K、A422G、A422S、P423G、P423R、P423V、G457S、A491V、E497V、L498T、Y503D、Y503E、Y503G、Y503K、Y503L、Y503N、Y503S、Y503T、K508N、K508S、K508T、L509P、V510G、V510S、F516L、S518I、S518L、S518M、P521S、S522G、L526I、L526N、L526S、T533R、A534T、S535Y、T540N、T542N、S544E、S544N、S544Q、V545A、V545D、S549D、S549E、T550D、V551D、V551R、V551S、F555D、F555K、F555L、F555N、F555R、F555S、I556D、I556P、I556R、R557P、G559N、G559S、S563L、I564N、I564S、I564T、G569I、N570P、T581N、T584N、R7C、E11S、L19I、C26N、T31N、V42I、I44V、R49H、D53N、Y55F、T57S、I69L、S72A、V73F、T78K、L79D、L79Y、E85Q、N86Q、V88I、T89S、A92T、Y93K、L94V、V97I、S103D、D106T、D118N、M119E、A125P、M141L、Y145A、L149I、N150D、A153S、T155A、N168S、V170I、A171T、G178T、Y179F、P186E、A195V、S204N、T205A、A208T、K209R、S213T、H214C、T219S、V220Q、I224V、Y227F、A246S、S247G、A256V、T261A、T261G、S306A、A307E、D309S、L311V、A317P、V342I、L347N、E348I、T352S、V353I、S355D、T362Q、L364I、T370V、A374N、E381N、S382D、T388Q、A391G、F394Y、V395L、Q399E、T400K、A407S、Q418T、S434T、T436S、E437A、D440Q、G446S、S452A、V453S、A460S、A469S、A470T、S472T、G475V、T476W、G478S、L492P和L9P。
在一些方面，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中前蛋白包含具有SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的序列。
在一些另外的方面，本发明提供了包含本文所述的核酸的表达载体。
在另一些方面，本发明提供了包含本文所述的核酸的宿主细胞。
在另一些方面，本发明提供了包含本文所述的表达载体的宿主细胞。
在一个另外的方面，本发明提供了本文所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自细菌细胞、真菌细胞或酵母细胞。
在另一方面，本发明提供了一种用于制备变体葡糖淀粉酶的方法，该方法包括：a)在其中表达所述变体葡糖淀粉酶的条件下培养本文所述的宿主细胞；以及b)回收所述变体葡糖淀粉酶。
在另一方面，本发明提供了本文所述的组合物，其中所述组合物为饲料补充剂。
在一个另外的方面，本发明提供了适用于动物消耗的制剂，其中所述制剂包含本文所述的变体葡糖淀粉酶和至少一种可消耗组分。
在一些方面，本发明提供了一种用于淀粉底物的糖类糖化的方法，该方法包括使所述底物与本文所述的变体葡糖淀粉酶接触，其中所述淀粉降解。
附图说明
图1提供了G6P和G7P前蛋白的氨基酸序列比对。信号肽区域以黑体和斜体显示。淀粉结合结构域(SBD)用黑体加下划线标出。
图2提供了在40℃下巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)产生的G6P和G7P的热活性比较数据。
图3A至图3S提供了多种G6P变体葡糖淀粉酶的热活性改善数据。这些变体相对于(w.r.t.)如SEQ ID NO:1所示的G6P显示。*表示C-末端氨基酸截短。w.r.t.表示“相对于”。
图4A至图4K提供了所种G7变体葡糖淀粉酶的热活性改善数据。这些变体相对于(w.r.t.)如SEQ ID NO:3所示的G7P显示。w.r.t.表示“相对于”。
图5A至图5C描绘了变体表，示出了本发明的一些实施方案中G6P和G7P的一些优选变体。如本文所述，这些可以以任意组合以及与本文概述的变体集组合。*表示C-末端氨基酸截短。
图6提供了关于巴斯德毕赤酵母产生的变体(Y321F和S188HG/Y321W/Q419P)和G6P在40℃下的比活性比较数据。
图7A描绘了G6P前蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)和编码G6P前蛋白的核酸序列(SEQ ID NO:2)；图7B描绘了G7P前蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)和编码G7P前蛋白的核酸序列(SEQ ID NO:4)；图7C描绘了具有淀粉结合结构域(SBD)的变体1前蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)和编码具有SBD的变体1前蛋白的核酸序列(SEQ ID NO:6)；图7D描绘了具有SBD的变体2前蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)和编码具有SBD的变体2前蛋白的核酸序列(SEQ ID NO:8)；图7E描绘了不具有SBD的变体1前蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)和编码不具有SBD的变体1前蛋白的核酸序列(SEQ ID NO:10)；图7F描绘了不具有SBD的变体2前蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)和编码不具有SBD的变体2前蛋白的核酸序列(SEQ IDNO:12)；图7G描绘了G6P成熟蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:13)和编码G6P成熟蛋白的核酸序列(SEQ ID NO:14)；图7H描绘了G7P成熟蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:15)和编码G7P成熟蛋白的核酸序列(SEQ ID NO:16)；图7I描绘了具有SBD的变体1成熟蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:17)和编码具有SBD的变体1成熟蛋白的核酸序列(SEQ ID NO:18)；图7J描绘了具有SBD的变体2成熟蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:19)和编码具有SBD的编码变体2成熟蛋白的核酸序列(SEQ ID NO:20)；图7K描绘了不具有SBD的变体1成熟蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:21)和编码不具有SBD的变体1成熟蛋白的核酸序列(SEQ ID NO:22)；图7L描绘了不具有SBD的变体2成熟蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:23)和编码不具有SBD的变体2成熟蛋白的核酸序列(SEQ ID NO:24)；图7M描绘了具有SBD的野生型葡糖淀粉酶成熟蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:25)和野生型信号肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:26)。
具体实施方式
I.引言
淀粉是在许多重要食品植物来源中发现的主要糖类储备聚合物，包括玉米、小麦、马铃薯、米、木薯、燕麦等。淀粉用作产生葡萄糖的底物，葡萄糖进而用于生产许多产品，包括液体燃料(有时被称为“生物燃料”)、蛋白质、糖和化学品，并且广泛用于食品工业。淀粉向葡萄糖的常规转化需要液化(将固体淀粉底物转化为更有用的醪液)和糖化(将醪液分解成简单的糖)两步过程。葡糖淀粉酶用于糖化反应以释放出葡萄糖作为最终产物，葡萄糖进而可以用于生产食品、饮料和生物燃料。葡糖淀粉酶通常具有两个结构域，即用于实际转化的催化结构域和淀粉结合结构域(SBD)，淀粉结构域允许可溶性酶相转移到不溶性淀粉底物。
然而，许多利用葡糖淀粉酶的工业过程在通常苛刻的条件(例如高温)下进行；因此，本文期望并提供热活性和热稳定的葡糖淀粉酶。
II.定义
在本文的核酸序列的上下文中，“外源”意指外源元件通常与天然第二元件不相关，因此是人工或合成的构建体。在许多实施方案中，本发明提供了核酸构建体，其包含与外源构建体序列(例如外源启动子)相似的葡糖淀粉酶的编码序列。为了清楚起见，通常提及“外源”是指葡糖淀粉酶，而不是宿主细胞。例如，如果宿主细胞是黑曲霉(A.niger)细胞，则与葡糖淀粉酶基因可操作连接的启动子可以是黑曲霉内源性的，但是葡糖淀粉酶外源性的(例如，黑曲霉α-淀粉酶的启动子可以与本发明的葡糖淀粉酶连接)。因此，在一些实施方案中，本发明提供了核酸构建体，其编码可操作连接至外源构建体核酸序列的葡糖淀粉酶(无论是野生型还是变体)。在本文中，“外源构建体序列”意指构建体序列(无论是氨基酸序列还是核酸序列，尽管如使用该术语的上下文所理解的那样，但是通常是指核酸序列)，其通常与编码葡糖淀粉酶的核酸不相关。
可以包含在染色体外或整合表达载体中的合适构建体序列包括但不限于选择标志物、纯化标签、复制起点和调控序列(包括但不限于启动子(诱导型和组成型))、增强子、核糖体结合位点、起始密码子、终止密码子、Shine-Dalgarno序列等。
在本文中，“选择标志物”或“可选择标志物”或“选择蛋白”意指被引入宿主细胞的蛋白质，其在宿主细胞的生长过程中赋予适于人工选择的特性，使得仅那些包含选择标志物的细胞生长。因此，选择标志物是这种基因，该基因的产物提供了生物杀灭剂或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养等。选择标志物的实例概述如下。因此，“选择基因”是编码选择蛋白的核酸。
在本文中，“染色体外表达载体”(通常也被称为“质粒”)意指携带目的基因的自我复制表达载体(通常是质粒)，其保留在细胞内并且不整合入宿主细胞的基因组中。
在本文中，“整合表达载体”意指被设计成插入宿主细胞的基因组中的载体，有时被称为“附加体”。
在本文中，“修饰”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入、截短和/或缺失或者与蛋白质化学连接的部分的改变。例如，修饰可以是附着于蛋白质的糖类或PEG结构的改变。在本文中，“氨基酸修饰”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入、截短和/或缺失。为了清楚起见，除非另有说明，否则氨基酸修饰始终是DNA编码的氨基酸，例如在DNA和RNA中具有密码子的20个氨基酸。
在本文中，“氨基酸取代”或“取代”意指用不同的氨基酸替代亲本多肽序列中特定位置的氨基酸。特别地，在一些实施方案中，取代是针对在特定位置不是天然存在的，也不是在生物体内或在任何有机体中天然存在的氨基酸。例如，取代E75D是指变体多肽，在这种情况下是葡糖淀粉酶，其中位置75处的谷氨酸被天冬氨酸替代。多个突变用正斜杠(“/”)，例如“A114G/I190V/S204A”隔开，分别表示在位置114、190和204处的取代(在一些情况下，可以使用“+”)。为了清楚起见，经过工程改造以改变核酸编码序列但不改变起始氨基酸的蛋白质(例如，将CGG(编码精氨酸)交换为CGA(仍编码精氨酸)以增加宿主有机体表达水平)不是“氨基酸取代”；也就是说，尽管创建了编码相同蛋白质的新基因，但是如果该蛋白质在其起始的特定位置具有相同的氨基酸，则不是氨基酸取代。
如本文所用，“沉默突变”或“沉默核酸突变”意指构成DNA的核苷酸碱基的序列的改变，而氨基酸或整个蛋白质的功能随后没有改变。
如本文所用，“氨基酸插入”或“插入”意指在亲本多肽序列的特定位置处添加氨基酸序列。例如，-233E或233E表示在位置233之后和234之前插入谷氨酸。此外，-233E或A233ADE表示在位置233之后和234之前插入AlaAspGlu。
如本文所用，“氨基酸截短”意指从亲本多肽序列的特定位置消除氨基酸序列的N-末端或C-末端部分。“C-末端氨基酸截短”意指从亲本多肽的C-末端开始到特定位置的氨基酸序列的消除。“N-末端氨基酸截短”意指从亲本多肽的N-末端开始到特定位置的氨基酸序列的消除。“C-末端截短的变体多肽”意指从亲本多肽的特定位置到C-末端的氨基酸序列被消除的变体多肽。例如，具有C-末端氨基酸截短V551*的变体多肽表示从亲本多肽的位置551到C-末端的氨基酸序列被消除的变体多肽，这意味着该变体多肽终止于位置550。
如本文所用，“氨基酸缺失”或“缺失”意指在亲本多肽序列的特定位置处的氨基酸序列的除去。例如，E233-或E233#、E233()或E233del表示在位置233处的谷氨酸的缺失。此外，EDA233-或EDA233#表示从位置233开始的序列GluAspAla的缺失。
如本文所用，“亲本多肽”意指随后被修饰以产生变体的起始多肽。亲本多肽可以为天然存在的多肽，或天然存在的多肽的变体或工程化版本。亲本多肽可以是指多肽本身、包含亲本多肽的组合物、或编码该多肽的氨基酸序列。在当前情况下，一些实施方案利用野生型、G6P或G7P作为亲本多肽。
如本文所用，“变体蛋白质”或“蛋白质变体”、或者“变体”意指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本蛋白的蛋白质。蛋白质变体可以是指蛋白质本身、包含该蛋白质的组合物或编码该蛋白质的氨基序列。优选地，与亲本蛋白相比，蛋白质变体具有至少一个氨基酸修饰，例如与亲本相比，具有约1至约70个氨基酸修饰，优选约1至约10个氨基酸修饰。如下所述，在一些实施方案中，亲本多肽是如SEQ ID NO:25所示的野生型序列。如下进一步讨论的，本文的蛋白质变体序列优选与亲本蛋白序列具有至少约80％的同一性，最优选至少约90％的同一性，更优选至少约95％、96％、97％、98％或99％的同一性。变体蛋白可以是指变体蛋白本身、包含该蛋白变体的组合物或编码该变体蛋白的DNA序列。因此，本文的“变体葡糖淀粉酶”意指与亲本葡糖淀粉酶相比，在氨基酸序列上具有至少一个氨基酸修饰的新的葡糖淀粉酶。如本文所述，在一些情况下，亲本葡糖淀粉酶为野生型葡糖淀粉酶(SEQ IDNO:25)。在一些情况下，亲本葡糖淀粉酶为变体葡糖淀粉酶，例如G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)蛋白。除非另有说明或从上下文中显而易见，否则本发明的变体葡糖淀粉酶具有酶促活性，即，使用实施例和下文所述的葡糖淀粉酶测定法可检测到的葡糖淀粉酶活性。
如本文所用，本文的“蛋白质”意指至少两个共价附着的氨基酸，其包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。肽基通常包含天然存在的氨基酸和肽键。此外，多肽可以包含一个或更多个侧链或末端的合成衍生化、糖基化、聚乙二醇化、环状排列、环化、与其他分子的接头、与蛋白质或蛋白质结构域融合以及添加肽标签或标记。
如本文所用，“残基”意指蛋白质中的位置及其相关的氨基酸同一性。例如，缬氨酸3(也被称为Val3或V3)是野生型亲本酶(SEQ ID NO:25)的位置3处的残基，其序列编号从成熟区开始。
本文所用的“非天然存在的修饰”意指在野生型酶中未发现的氨基酸修饰。
如本文所用，“氨基酸”和“氨基酸同一性”意指由DNA和RNA编码的20种天然存在的氨基酸之一。
如本文所用，“位置”意指蛋白质序列中的位置。通常，正位置编号是相对于成熟葡糖淀粉酶序列的第一个氨基酸而言的，例如不包括信号肽。例如，G6P的K5(SEQ ID NO:13)表示从成熟区向前计数的G6P的第五个氨基酸是赖氨酸。在包含信号肽的前蛋白的情况下，编号从成熟蛋白的第一个氨基酸的位置“1”开始倒数，信号肽的C-末端为“零”或“0”，并且倒数第二个氨基酸为“-1”等。也就是说，用“X”作为氨基酸的10个氨基酸的信号肽是“X-9/X-8/X-7/X-6/X-5/X-4/X-3/X-2/X-1/X0/X+1(成熟蛋白质的起始)”。例如，G6P前蛋白的W-9(SEQ ID NO:1)表示从信号肽的最后一个氨基酸倒数的第十个氨基酸(或从成熟区的第一个氨基酸倒数的第十一个氨基酸)是色氨酸。
术语“葡糖淀粉酶”(1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC 3.2.1.3)被定义为一种酶，其催化D-葡萄糖从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放。为了本发明的目的，根据本文的实施例中所述的程序确定葡糖淀粉酶活性，例如实施例3中的淀粉测定法以确定葡糖淀粉酶活性。
术语“编码序列”是指多核苷酸，其直接指定变体的氨基酸序列。编码序列的边界通常由开放阅读框确定，阅读框以起始密码子(例如ATG、GTG或TTG)开始，以终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)终止。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
术语“控制序列”意指编码本发明的变体的多核苷酸表达所需的核酸序列。每种控制序列对于编码变体的多核苷酸可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)或彼此是天然的或外源的。这种控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，控制序列包含启动子、转录和翻译终止信号。为了引入特异性限制性位点以促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区的连接，可以为控制序列提供接头。
术语“表达”包括涉及本文所述的变体葡糖淀粉酶的产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
术语“表达载体”是指线性或环状DNA分子，其包含编码变体的多核苷酸并且可操作连接至提供其表达的控制序列。
术语“片段”意指从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或更多个(例如，多个)氨基酸的多肽。本文的“葡糖淀粉酶片段”意指本文所述的氨基酸序列的一部分，其维持维持葡糖淀粉酶活性。如图1所示，本发明的亲本葡糖淀粉酶(G6P)包含SBD和催化结构域。在一些应用中，特别是在淀粉加工中，两个结构域都是期望的。在另一些应用中，仅需要催化结构域。在一个方面，片段包含至少250个、至少300个、至少350个或至少400个氨基酸残基，其包含催化结构域并且具有根据本发明的一个或更多个取代/截短。在一些实施方案中，片段为至少380个、至少390个、至少400个、至少410个或至少420个氨基酸残基。在一些实施方案中，片段为至少405、至少406、至少407、至少408、至少409、至少410、至少411、至少412、至少413、至少414、或至少415个氨基酸残基。
术语“宿主细胞”是指易于被包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的细胞类型，并且允许其表达酶。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。在许多实施方案中，宿主细胞不是Thielaviopsis punctual细胞。即，本发明的葡糖淀粉酶(包括SEQ ID NO:25的野生型序列和本文所述的变体酶二者)在内源性宿主中不产生。
术语“改善的特性”是指与本文所述的变体葡糖淀粉酶相关的特征，其与亲本葡糖淀粉酶相比有所改善。这种改善的特性包括但不限于热活性、比活性、减少的葡萄糖抑制、减少的异麦芽糖形成活性、对麦芽糖糊精DE11-14的活性增加、热稳定性增加(例如，在较高温度下的稳定性增加)和pH稳定性增加(例如，在较高的pH值下的稳定性增加)。当将变体葡糖淀粉酶应用于糖化，然后在液化醪液上发酵时，另一个改善特性是EtOH产率增加。
术语“分离的”是指天然不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质；(2)任何物质，包括但不限于其天然相关的天然存在的成分中的一种或更多种或全部被至少部分除去的任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于天然发现的物质的经人工修饰的任何物质；(4)相对于其天然相关的其他组分，通过增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；使用比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子等)。具体参考具有SEQ ID NO:25的分离的葡糖淀粉酶，该分离的葡糖淀粉酶通常是：a)从通常与其相关的其他蛋白质中纯化出来，例如当其在T.punctuala中产生但是除去至少一些其他分泌的蛋白质或除去宿主细胞时；b)当该酶处于天然未发现的浓度时；或c)当该酶在非T.punctuala的宿主细胞中产生时。
术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰(例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等)后处于其最终形式的多肽。
短语“编码成熟多肽的序列”是指编码具有葡糖淀粉酶活性的成熟多肽的多核苷酸。
术语“核酸构建体”是指单链或双链的核酸分子，其与天然存在的基因分离或者被修饰成以天然不存在的或合成的方式包含核酸片段，并且包含一个或更多个控制序列。
术语“可操作连接”是指这样的构型，其中将构建体序列放置在相对于多核苷酸的编码序列的适当位置使得控制序列指导、允许或促进编码序列的表达。
术语“亲本”或“亲本葡糖淀粉酶”是指对其进行改变以产生本发明的变体葡糖淀粉酶的葡糖淀粉酶。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或者其变体或片段。本发明的示例性亲本多肽是SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:25。
两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“序列同一性”描述。为了本发明的目的，两个氨基酸序列之间的序列同一性是使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)确定的，该算法是在EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等人,2000,Trends Genet.16:276-277，优选版本5.0.0或最新版本)的Needle程序中执行的。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。标记为“最高同一性”的Needle的输出(使用-nobrief选项获得)用作同一性百分比，计算如下：
(相同残基x 100)/(比对长度-比对中空位的总数)
为了清楚起见，使用较短序列的长度进行比对，并且在进行序列比对后计算序列同一性。
术语“子序列”是指从编码成熟多肽序列的5'-和/或3'-端缺失一个或更多个(例如，多个)核苷酸的多核苷酸；其中该子序列编码具有葡糖淀粉酶活性的片段。在一方面，子序列至少编码根据本发明的变体的催化结构域。
术语“变体”是指具有葡糖淀粉酶活性且在一个或更多个(例如，多个)位置处包含改变(即，取代、插入、截短和/或缺失)的多肽。取代意指将占据位置的氨基酸替换为不同氨基酸；截短意指消除从特定位置开始至C-末端的氨基酸序列；缺失意指除去占据位置的氨基酸；插入意指在占据位置的氨基酸附近并紧接添加该氨基酸。
术语“野生型”葡糖淀粉酶意指由天然存在的微生物(例如细菌、酵母或丝状真菌)表达的葡糖淀粉酶。通常，本文最感兴趣的野生型葡糖淀粉酶为SEQ ID NO:25。
III.本发明的葡糖淀粉酶
本发明提供了用于多种应用的热稳定和/或热活性的葡糖淀粉酶，包括饲料补充剂和淀粉加工。本发明提供了使用Thielaviopsis punctuala葡糖淀粉酶、SEQ ID NO:25及其变体的组合物和方法，如以下更详细描述的。
IV.本发明的变体葡糖淀粉酶
因此，本发明提供了具有改善活性的变体葡糖淀粉酶，其可以用于多种应用，包括糖化反应、动物和人营养产品及饲料产品以及生物燃料(例如生物乙醇)的生产。
通常，与野生型亲本G16葡糖淀粉酶(SEQ ID NO:25)、G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)葡糖淀粉酶相比，本发明的变体葡糖淀粉酶具有改变的改善的生化特性。本发明的野生型G16葡糖淀粉酶(SEQ ID NO:25)是野生型葡糖淀粉酶或“G1P”，如美国专利申请公开US 2018/0037879的SEQ ID NO:1所示，在此通过引用整体并入本文。本发明的G6P成熟蛋白(SEQ ID NO:13)是美国专利申请公开US 2018/0037879的的“G6P”(其与野生型G16葡糖淀粉酶相比包含
K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/Q121P/T309D/N413S/A415Y/Q423P的氨基酸取代集)，在此通过引用整体并入本文。本文可以改善的变体葡糖淀粉酶的生化特性包括但不限于pH活性、pH稳定性、热稳定性、比活性、活性和热活性、表达、分泌、制剂稳定性(包括液体剂、固体剂和丸剂)、在动物和/或动物饲料中的性能及蛋白酶稳定性。
与亲本葡糖淀粉酶(例如野生型(SEQ ID NO:25)、G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQID NO:15)葡糖淀粉酶)相比，本发明的变体葡糖淀粉酶具有一种或更多种改善特性。本文的“改善”意指至少一种生化特性期望的变化。“改善的功能”可以测量为比活性的增加或降低的百分比，或者作为“倍数”变化，具有期望特性的增加(例如，热活性、pH稳定性、热稳定性)或非期望特性的降低(例如，蛋白酶敏感性)。也就是说，与亲本葡糖淀粉酶相比，变体葡糖淀粉酶的热稳定性可增加10％，蛋白酶敏感性可降低10％。或者，变体葡糖淀粉酶的pH稳定性可增加2倍，蛋白酶敏感性降低3倍。通常，百分比变化用于描述生化活性的变化小于100％，倍数变化用于描述生化活性变化大于100％(与亲本酶相比，在许多情况下G6P或G7P)。在本发明中，可以实现生化活性的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％和99％的百分比变化(通常增加)。在本发明中，测量与起始或亲本酶相比的“倍数增加”(或降低)。例如，如图3B所示，与G6P相比，变体G6P蛋白(F555R)的热活性改善增加了1.70倍：这是通过[(变体的热活性)/(亲本的热活性)]计算的。在许多实施方案中，改善为至少十分之一(1.1倍)、一半(1.5倍)、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更高。
本发明的变体葡糖淀粉酶可以具有许多生化特性中的一种或更多种改善，包括但不限于pH活性、pH稳定性、热稳定性、比活性、活性和热活性、表达、分泌、制剂稳定性(包括液体剂、固体剂和丸剂)、在动物和/或动物饲料中的性能和/或蛋白酶稳定性。通常，在对亲本酶挑战变体葡糖淀粉酶的条件下使用如下所述的葡糖淀粉酶活性测定来测量相比于亲本野生型、G6P或G7P酶的改善量。
A.淀粉测定以确定葡糖淀粉酶热活性
在一些实施方案中，采用淀粉测定来确定葡糖淀粉酶的热活性，例如在实施例部分中所述的。具体地，将在pH 4.3缓冲液中的115μl2％经加热的可溶性淀粉(最终淀粉浓度为1.5％)添加到96深孔板中。向淀粉反应板中添加10μl上清酶(参见，例如，实施例6)。将板在30℃或60℃、400rpm下孵育72h。在72h时，将10μL的孵育样品添加到90μL的水中，用以在30℃和60℃下孵育的反应板的10倍检测稀释。从10x检测稀释板转移10μL稀释样品，然后添加190μL GOPOD(葡萄糖氧化酶/过氧化物酶)，并在50℃下以400rpm的搅拌孵育30分钟。在510nm处读取吸光度，以确定由于淀粉裂解而释放的葡萄糖。在相同条件下，将葡糖淀粉酶变体的活性与亲本葡糖淀粉酶进行比较以确定活性改善。在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶为SEQ ID NO:25的多肽。在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶为SEQ ID NO:13的多肽。在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶为SEQ ID NO:15的多肽。
因此，如图3和图4所示，本发明的许多变体葡糖淀粉酶表现出增加的热活性。
B.热稳定性
在许多实施方案中，本发明的变体葡糖淀粉酶具有增加的热稳定性，特别是在淀粉加工中使用的条件(例如糖化)下，如以下更详细概述的。在动物和人饲料的生产中，热稳定性也是要考虑的因素，例如在制粒过程中经常使用高温持续一段时间，通常使野生型葡糖淀粉酶失活。在该上下文中，“热稳定性”意指在相同的热挑战条件下，变体酶比亲本葡糖淀粉酶(例如野生型、G6P或G7P)更稳定，即变体的活性在在相同条件下(通常使用本文概述和实施例所示的葡糖淀粉酶测定)比亲本酶更高。
合适的热稳定性测定如下。将裂解液板中的50μl酶添加到96孔Biorad PCR板中，并在热循环仪中在57℃(对于G1)、59℃(对于G2)、62℃(对于G3)、67℃(对于G4)和72℃(对于G5)下挑战10分钟。孵育10分钟后，将20μl挑战的裂解液添加到96深孔淀粉反应板中，该板中含有在0.1M乙酸钠(在0.1M乙酸钠)中150μl 2％玉米淀粉(最终淀粉浓度为1.5％)。使用0.1M乙酸钠缓冲液(pH 4.5)将最终体积调节到200μl。将板在40℃，800rpm下孵育21-48h。在21-48h时，将板以4000rpm离心5分钟，将20μl反应上清液取出到96孔浅微量滴定板，将180μl D-葡萄糖测定试剂(来自Megazyme的GOPOD测定试剂盒，目录号#K-GLUC)添加到每个孔中。然后将板在50℃下孵育30分钟。孵育后，在510nm处读取板，以监测由于淀粉裂解而释放的葡萄糖。在相同条件下将葡糖淀粉酶变体的活性与亲本比较以确定热稳定性的改善。
在一些另外的实施方案中，当该酶用于糖类加工(例如糖化)中时，在淀粉底物的存在下，酶通常更稳定。因此，在这些实施方案中，反应通常以天为单位进行测量，如下概述的，在底物的存在下变体葡糖淀粉酶在60℃下在24小时、48小时和72小时时显示出显著的稳定性。
综上所述，本发明的变体葡糖淀粉酶在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、58℃、60℃、65℃、66℃、70℃、75℃、80℃和/或85℃下在一段时间内(通常约10分钟至72h，在本发明中特别使用24h、45h、48h和72h)与亲本葡糖淀粉酶(例如野生型、G6P或G7P)相比可以表现出增加的热稳定性。
C.pH稳定性
在许多实施方案中，与亲本葡糖淀粉酶相比，本发明的变体葡糖淀粉酶具有改变的pH活性或稳定性。在该上下文中，“增加的pH稳定性”意指在相同的pH挑战条件下变体酶比亲本葡糖淀粉酶(例如野生型、G6P或G7P)更稳定，也就是说，在相同条件下(通常使用本文概述和实施例所示的葡糖淀粉酶测定)变体的活性比亲本的活性更高。例如，淀粉加工可以在各种pH值具体取决于原料底物和反应条件(取决于原料底物和反应条件)下进行。
D.比活性测定
在一些实施方案中，与亲本葡糖淀粉酶(例如野生型、G6P或G7P)相比，本发明的变体葡糖淀粉酶具有增加的比活性。本文的“比活性”意指单位量的酶的活性，通常通过将样品的酶活性(有时以“葡糖淀粉酶单位”测量)除以葡糖淀粉酶的量(通常如本领域已知的进行确定)来确定。
E.蛋白酶敏感性
在一些实施方案中，在相同条件下，本发明的变体葡糖淀粉酶比亲本酶更不易发生蛋白酶降解。在一些情况下，在产生宿主生物体中在产生变体葡糖淀粉酶的过程中由于宿主生物体产生的蛋白酶而发生的蛋白酶降解可能是一个问题，从而导致活性酶的产率降低。类似地，根据变体酶的用途，例如在淀粉加工中，原料底物中可能存在其他蛋白酶，或者可能存在可以在淀粉加工过程中降解葡糖淀粉酶的组合使用的其他酶。
这通常如本领域已知的进行确定，例如通过允许蛋白水解降解，然后对所得片段进行N-末端测序以确定切割位点。在一些情况下，根据变体和宿主产生生物体，可能不会发生显著的蛋白水解降解。
根据需要，如本领域技术人员将理解的，可以进行的特定突变取决于宿主生物体产生的内源蛋白酶，并且通常也发生在表面暴露的环结构或转折中，因此可接近蛋白酶。例如，在黑曲霉真菌产生生物体中葡糖淀粉酶的产生会导致蛋白水解降解；参见Wyss等，Appl.And Environ.Microbiol.Feb.1999:359-366，在此通过引用整体并入本文。
V.特定变体葡糖淀粉酶
本发明提供了变体葡糖淀粉酶，与亲本葡糖淀粉酶相比其包含至少一个氨基酸取代和/或氨基酸截短。在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶为野生型葡糖淀粉酶(SEQ IDNO:25)。在一个实施方案中，变体葡糖淀粉酶为与野生型葡糖淀粉酶(SEQ ID NO:25相比包含氨基酸取代
K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/Q121P/T309D/N413S/A415Y/Q423P的G6P。在另一个实施方案中，变体葡糖淀粉酶为与野生型葡糖淀粉酶(SEQ IDNO:25相比包含氨基酸取代
K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/Q121P/T309D/N413S/A415Y/Q423P且在位置493处还包含C-末端氨基酸截短的G7P。在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶为G6P。在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶为G7P。
本发明提供了变体葡糖淀粉酶，该变体葡糖淀粉酶在选自以下的位置编号处的氨基酸截短：493、500、502、503、506、509、510、513、514、515、519、520、522、524、525、544、549、550、551、556、558、560、563、564和569。在一些实施方案中，本文所述的氨基酸截短为在选自以下的位置编号处的C-末端氨基酸截短：493、500、502、503、506、509、510、513、514、515、519、520、522、524、525、544、549、550、551、556、558、560、563、564和569。在一个实施方案中，变体葡糖淀粉酶在位置493处包含C-末端氨基酸截短，形成如SEQ ID NO:15所示的不具有SBD的G7P成熟蛋白。
在一些实施方案中，本发明提供了包含变体葡糖淀粉酶的组合物，其中该变体葡糖淀粉酶表现出与SEQ ID NO:15至少95％的同一性，其中所述变体葡糖淀粉酶与SEQ IDNO:25相比在选自以下的条件下具有至少1.1倍更好的活性：在约30℃下热活性、在约35℃下的热活性，在约40℃下的热活性、在约50℃下的热活性、在约60℃下的热活性和在约70℃下的热活性。在一些实施方案中，该变体葡糖淀粉酶表现出与SEQ ID NO:15至少96％、97％、98％、99％或100％的同一性，其中所述变体葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:25相比在选自以下的条件下具有至少1.1倍更好的活性：在约30℃下热活性、在约35℃下的热活性，在约40℃下的热活性、在约50℃下的热活性、在约60℃下的热活性和在约70℃下的热活性。
在一些实施方案中，本发明提供了与亲本变体葡糖淀粉酶相比在一个或更多个(例如多个)位置处包含氨基酸取代的变体葡糖淀粉酶，该位置对应于位置5、27、36、38、39、46、47、50、65、68、79、89、98、108、121、122、124、158、161、188、192、212、215、258、262、264、298、321、400、412、419、420、422、423、457、491、497、498、503、508、509、510、7、9、11、19、26、31、42、44、49、53、55、57、69、72、73、78、85、86、88、92、93、94、97、103、106、118、119、125、141、145、149、150、153、155、168、170、171、178、179、186、195、204、205、208、209、213、214、219、220、224、227、246、247、256、261、306、307、309、311、317、342、347、348、352、353、355、362、364、370、374、381、382、388、391、394、395、399、407、418、434、436、437、440、446、452、453、460、469、470、472、475、476、478和492。在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶具有与亲本葡糖淀粉酶(例如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:25)至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶为SEQID NO:15。
在一些实施方案中，本发明提供了与SEQ ID NO:15相比包含至少一个氨基酸取代的变体葡糖淀粉酶，其中所述氨基酸取代位于选自以下的位置编号处：5、27、36、38、39、46、47、50、65、68、79、89、98、108、121、122、124、158、161、188、192、212、215、258、262、264、298、321、400、412、419、420、422、423、457、491、497、498、503、508、509、510、7、9、11、19、26、31、42、44、49、53、55、57、69、72、73、78、85、86、88、92、93、94、97、103、106、118、119、125、141、145、149、150、153、155、168、170、171、178、179、186、195、204、205、208、209、213、214、219、220、224、227、246、247、256、261、306、307、309、311、317、342、347、348、352、353、355、362、364、370、374、381、382、388、391、394、395、399、407、418、434、436、437、440、446、452、453、460、469、470、472、475、476、478和492，其中所述变体酶与SEQ ID NO:15至少95％相同。在一些情况下，变体酶在这些位置可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代。
在一些实施方案中，本发明提供了与SEQ ID NO:15相比包含至少一个氨基酸取代的变体葡糖淀粉酶，其中所述氨基酸取代位于选自以下的位置编号处：5、27、36、38、39、46、47、50、65、68、79、89、98、108、121、122、124、158、161、188、192、212、215、258、262、264、298、321、400、412、419、420、422、423、457、491、497、498、503、508、509、510、7、9、11、19、26、31、42、44、49、53、55、57、69、72、73、78、85、86、88、92、93、94、97、103、106、118、119、125、141、145、149、150、153、155、168、170、171、178、179、186、195、204、205、208、209、213、214、219、220、224、227、246、247、256、261、306、307、309、311、317、342、347、348、352、353、355、362、364、370、374、381、382、388、391、394、395、399、407、418、434、436、437、440、446、452、453、460、469、470、472、475、476、478和492，其中所述变体葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:15相比在选自以下的条件下具有至少1.1倍更好的活性：在约30℃下热活性、在约35℃下的热活性，在约40℃下的热活性、在约50℃下的热活性、在约60℃下的热活性和在约70℃下的热活性；并且其中所述变体酶与SEQ ID NO:15至少95％相同。在一些情况下，变体酶在这些位置可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代。
在一些实施方案中，本发明提供了本文所述的变体葡糖淀粉酶，其表现出与SEQID NO:15至少96％、97％、98％或99％的同一性。
在一些实施方案中，本发明提供了本文所述的变体葡糖淀粉酶，其中所述氨基酸取代发生在所述位置中的一个、所述位置中的两个、所述位置中的三个、所述位置中的四个、所述位置中的五个、所述位置中的六个、所述位置中的七个、所述位置中的八个、所述位置中的九个、所述位置中的十个、所述位置中的十一个、所述位置中的十二个、所述位置中的十三个或所述位置中的十四个。
在另一些实施方案中，本发明提供了本文所述的变体葡糖淀粉酶，其中所述氨基酸取代位于选自以下的位置编号处：5、68、188、321、419、422、7、11、19、26、31、42、44、49、53、55、57、69、72、73、78、79、85、86、88、89、92、93、94、97、98、103、106、118、119、125、141、145、149、150、153、155、161、168、170、171、178、179、186、195、204、205、208、209、213、214、219、220、224、227、246、247、256、261、262、306、307、309、311、317、342、347、348、352、353、355、362、364、370、374、381、382、388、391、394、395、399、400、407、412、418、434、436、437、440、446、452、453、460、469、470、472、475、476、478和492。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了本文所述的变体葡糖淀粉酶，其中所述氨基酸取代选自以下：N27A、S36P、A38V、A39F、S46T、P47T、S50Q、V65I、E68N、L79F、T89N、T98S、A108S、P121S、F122M、G124P、G124S、G124T、G158S、Q161P、S188P、S188W、T192A、K212Y、S215A、T258S、A262S、H264M、I298V、Y321L、T400L、Y412F、L420K、A422G、P423G、P423R、P423V、G457S、A491V、K5P、K5S、K5T、K5Y、K5Q、K5N、K5H、E68K、E68Y、E68S、S188T、S188H、Y321F、Y321W、Q419P、A422S、R7C、E11S、L19I、C26N、T31N、V42I、I44V、R49H、D53N、Y55F、T57S、I69L、S72A、V73F、T78K、L79D、L79Y、E85Q、N86Q、V88I、T89S、A92T、Y93K、L94V、V97I、S103D、D106T、D118N、M119E、A125P、M141L、Y145A、L149I、N150D、A153S、T155A、N168S、V170I、A171T、G178T、Y179F、P186E、A195V、S204N、T205A、A208T、K209R、S213T、H214C、T219S、V220Q、I224V、Y227F、A246S、S247G、A256V、T261A、T261G、S306A、A307E、D309S、L311V、A317P、V342I、L347N、E348I、T352S、V353I、S355D、T362Q、L364I、T370V、A374N、E381N、S382D、T388Q、A391G、F394Y、V395L、Q399E、T400K、A407S、Q418T、S434T、T436S、E437A、D440Q、G446S、S452A、V453S、A460S、A469S、A470T、S472T、G475V、T476W、G478S、L492P和L9P。
在一些实施方案中，本发明提供了本文所述的变体葡糖淀粉酶，其中所述氨基酸取代选自以下：K5P、K5S、K5T、K5Y、K5Q、K5N、K5H、E68K、E68Y、E68S、S188T、S188H、Y321F、Y321W、Q419P、A422S、R7C、E11S、L19I、C26N、T31N、V42I、I44V、R49H、D53N、Y55F、T57S、I69L、S72A、V73F、T78K、L79D、L79Y、E85Q、N86Q、V88I、T89S、A92T、Y93K、L94V、V97I、T98S、S103D、D106T、D118N、M119E、A125P、M141L、Y145A、L149I、N150D、A153S、T155A、Q161P、N168S、V170I、A171T、G178T、Y179F、P186E、A195V、S204N、T205A、A208T、K209R、S213T、H214C、T219S、V220Q、I224V、Y227F、A246S、S247G、A256V、T261A、T261G、A262S、S306A、A307E、D309S、L311V、A317P、V342I、L347N、E348I、T352S、V353I、S355D、T362Q、L364I、T370V、A374N、E381N、S382D、T388Q、A391G、F394Y、V395L、Q399E、T400K、A407S、Y412F、Q418T、S434T、T436S、E437A、D440Q、G446S、S452A、V453S、A460S、A469S、A470T、S472T、G475V、T476W、G478S、L492P。
在一些实施方案中，本发明提供了本文所述的变体葡糖淀粉酶，其中变体葡糖淀粉酶包含选自以下的一个或更多个(例如多个)取代：S188H/Y321W/Q419P、K5T/S188T、K5T/E68K/S188H、K5Y/S188H、K5Q/E68K/S188T、K5N/E68Y/S188T、K5H/S188H、K5S/E68Y/S188H、K5S/E68Y/S188T、K5Y/E68Y、K5S/E68S/S188T、K5H/E68S/S188H、K5H/E68K/S188T、K5P/S188H、K5Y/E68K、K5T/S188H、K5S/S188H、E68Y/S188H、E68Y/S188T、K5T/Y321F、K5Q/S188H/Q419P、K5P/E68Y/S188T/A422S、K5N/S188H/Q419P、Y321W/A422S、E68K/Q419P、E68S/S188T/Y321W/A422S、K5Q/Q419P/A422S、S188T/Y321F、S188T/Q419P/A422S、K5H/S188T/Q419P/A422S、K5H/A422S、S188H/Y321W、Q419P/A422S、K5N/A422S、E68Y/S188H/Y321F/Q419P、K5Q/S188H、E11S/Y55F/M141L/N168S/T388Q、E11S/T31N/Y55F/M141L/N168S/T388Q、L19I/A195V、M141L/N168S/Y227F/T362Q/T388Q/D440Q、E11S/M141L、E11S/L19I/I44V/Y145A/T155A/D309S/L311V/Y412F/S472T、D309S/L311V、E11S/L19I/T31N/Y55F/A125P/N168S/Y227F、L19I/D309S/L311V/Y412F/A460S/S472T、E11S/L19I/N168S/Y227F/D309S/L311V/D440Q、L19I/Y412F、E11S/L19I/Y145A/A460S/S472T、E11S/M141L/N168S/D309S/L311V/T362Q/L364I/Y412F/A460S/S472T、E11S/Y55F/M141L/N168S/L311V/T362Q/L364I/A460S/S472T、E11S/L19I/Y55F/M141L/N168S/Y227F、L19I/T155A/A407S/Y412F/S472T、D53N/L149I/N150D/P186E/A317P、V42I/S103D/D106T/P186E/A317P/S434T/G478S、A317P/G478S、C26N/V42I/L149I/A317P/S355D/A374N、V42I/S103D/D106T/A317P、D53N/S434T、/S103D/A317P/V342I、A256V/A317P、V42I/P186E、A317P/V342I/G478S、I224V/A256V/A317P/G478S、V42I/L149I/N150D/A317P/G478S、V42I/S103D/P186E/A317P/V342I/S355D/A374N/A391G、P186E/A317P/G478S、D53N/G446S、A256V/A317P/G478S、V42I/D53N/T57S/L149I/A317P/G478S、C26N/V42I/D53N/T57S/N150D/P186E/A317P/V342I/G478S、V42I/S355D、V42I/N150D/P186E/A317P、V42I/S434T/G478S、C26N/D53N/T57S/S103D/Q161P/A317P/G478S、V42I/A256V/A317P/S434T、V42I/S103D/A317P/A391G/G478S、E68Y/I69L/G178T/Y179F/S213T/H214C、E68Y/I69L/E85Q/N86Q/F394Y/V395L、E68Y/I69L、D118N/M119E、E68Y/I69L/V97I/T98S/A246S/S247G/T261G/A262S/L347N/E348I、E68Y/I69L/S452A/V453S、E68Y/I69L/S452A/V453S、E68Y/I69L/E85Q/N86Q/L347N/E348I/Q418T/Q419P、E68Y/I69L/E85Q/N86Q/S204N/T205A、A208T/K209R/E381N/S382D/Q418T/Q419P/A469S/A470T、E381N/S382D/Q418T/Q419P/T436S/E437A/A469S/A470T、Q418T/Q419P/A469S/A470T、V170I/A171T/E381N/S382D/Q418T/Q419P/A469S/A470T、F394Y/V395L/Q418T/Q419P/T436S/E437A/A469S/A470T、T78K/L79D/Q418T/Q419P/A469S/A470T、E68Y/I69L/V88I/T89S/T352S/V353I/Q399E/T400K/A469S/A470T、S72A/V73F/A153S/S306A/T476W、T370V/G475V、R49H/S72A/V73F/A92T/Y93K/A153S/S306A/T476W、E68Y/I69L/T219S/V220Q/A307E/S355D/L492P、E11S/V42I/L149I/I224V/A317P/T388Q/A460S/G478S、Y412F/Q418T/Q419P/A469S/A470T/、L19I/D53N/I69L/V88I/S188H/A195V/Y321W/Y412F、V42I/D118N/M119E/T261A/L311V/Y321W/S355D、E11S/T57S/T89S、E11S/V42I/L79Y/D118N/M141L/L311V/A317P/Y321F、V42I/D53N/E68Y/A317P/L347N、I69L/S188H/A195V/A317P/Y321F/L364I/S434T、T57S/A195V/T261A/L311V/Y321F/L347N/E348I/S434T、E11S/V42I/T57S/E68Y/S188H/A195V/T261A、T57S/N168S/T261A/A317P/Y321W/V395L/Y412F、E11S/D53N/E68Y/D118N/S188H/A195V/Y412F/Q419P、E11S/V42I/D118N/M141L/N168S/Y321W/Y412F、E11S/D53N/T57S/E68Y/T89S/E381N/Y412F/Q419P/S434T、E11S/D53N/T57S/V88I/T89S/S188H/A195V/L311V/L347N/Y412F、A317P/Y412F、I69L/T89S/L311V/A317P/Y321F/Y412F/S434T、V42I/D53N/T57S/E68Y/V88I/Y412F、E11S/T57S/V88I/M141L/T261A/Y321W/L364I/Y412F、V42I/I69L/S188H/A317P/Y321W/Y412F、E11S/V42I/D53N/T57S/L79Y/T89S/L311V/Y321W/Y412F、L19I/M141L/N168S/S188H/A195V/L311V/S355D/S434T、S188H/A195V/T261A/L311V/Y321F/L347N/E348I、E11S/L19I/D53N/T57S/N168S/L347N、E11S/I69L/M119E/A195V/T261A/A317P/Y321W/L347N/Y412F、L79Y/V88I/T261A/A317P/Y321F/L364I/Y412F、E11S/V42I/E68Y/T89S/L311V/Y321F/T388Q/F394Y/V395L/Q419P、D53N/E68Y/V88I/M141L/N168S/Y321W/Y412F、E11S/I69L/L311V/A317P/Y321F/L347N/Y412F、D53N/T57S/M141L、D53N/V88I/T89S/D118N/E348I/S355D、E11S/S188H/A195V/A317P/L347N/E348I/Y412F/Q419P/S434T、E11S/D53N/I69L/V88I/A317P/Q419P、E68Y/I69L/V88I/N168S/L364I/Q419P、E11S/V42I/V88I/T261A/Y321F/E348I/S355D、E11S/V42I/T57S/I69L/A195V/L347N/E348I/S355D、L19I/T89S/A317P/Y321F/S434T、E11S/V42I/L79Y/L311V/A317P/Y321W/L347N/E348I/L364I/Y412F、D53N/T57S/L347N/E348I/Y412F、D53N/T57S/E68Y/L79Y/Y412F/S434T、L19I/V88I/T89S/A317P、M119E/M141L/N168S/L311V/Y321F、E11S/T89S/Y321W、E11S/M141L/T261A/A317P/Y412F/S434T、V42I/L79Y/S188H/A195V/L311V/Y321F/S355D、V42I/E68Y/V88I/T261A/Y321W/L347N/E348I、L19I/E68Y/I69L/M141L/Y321F/L347N/S355D/E381N/Y412F、V42I/D53N/I69L/L79Y/D118N/T261A/L311V/A317P/Y321F/L347N/Y412F、E68Y/S355D/L364I/S382D/T388Q/Q419P、E11S/L19I/V42I/E68Y/I69L/D118N/M141L/Y321W/L347N、/E11S/V42I/E68Y/M141L/A317P/Y321F/E348I/S355D、E11S/V42I/E68Y/I69L/V88I/T89S/D118N/M119E/S188H/A195V/A317P/L347N/Y412F/Q419P、V42I/V88I/L311V/A317P/Y321F/L347N/E348I/T388Q/V395L/S434T、T261A/A317P/Y321W/E348I、E11S/V42I/E68Y/I69L/D118N/M119E/Y412F、E11S/V42I/T57S/I69L/L311V、V42I/Y412F、E11S/L19I/E68Y/M119E/N168S/Y412F/Q419P、L19I/L311V/Y412F、E11S/V42I/M119E/Y412F、E11S/L19I/V42I/D53N/S188H/A195V/L311V/Y321F/Y412F、E11S/L19I/V42I/T57S/D118N/N168S/L311V/Y412F、L19I/V42I/D53N/T57S/N168S/A317P/Y321W/Y412F、D53N/T57S/E68Y/N168S/S188H/A195V/L311V/Y321W/Y412F/Q419P、L19I/D53N/T57S/L311V/Y321W/Y412F、E11S/T57S/Y321W/Y412F/Q419P、D53N/S188H/A195V/L311V/Y412F、V42I/D53N/S188H/A195V/L311V/Y321F/Y412F、L19I/M119E/N168S/S188H/A195V/L311V/Y412F/Q419P、E11S/V42I/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/V42I/M119E/N168S/L311V/Y412F、E11S/V42I/N168S/L311V/A317P/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/V42I/D53N/E68Y/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F/Y412F、E11S/L19I/D53N/N168S/A195V/Y412F/Q419P、E11S/L19I/V42I/L311V/Y412F、V42I/D53N/N168S/L311V/Y412F、E11S/L311V/Y412F、E11S/D53N/T57S/L311V/Y321W/Y412F、E11S/L311V/Y321W/Y412F、E11S/V42I/I69L/D118N/N168S/L311V/A317P/Y412F/Q419P、E11S/L19I/V42I/E68Y/Y412F/Q419P、E11S/L19I/D53N/L311V、E11S/L19I/V42I/L311V/Y412F/Q419P、L19I/V42I/D53N/T57S/I69L/N168S/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321W、E11S/L19I/V42I/T57S/L311V/A317P/Y321F/Y412F、L19I/V42I/I69L/D118N/N168S/L311V/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/V42I/D53N/E68Y/S188H/A195V/Y412F、E11S/L19I/V42I/D53N/T57S/N168S/L311V/Y321W/Y412F、E11S/V42I/L311V/Y412F、E11S/L19I/V42I/N168S/A195V/L311V/Y321F/Y412F、E11S/V42I/S188H/L311V/Y412F、L19I/V42I/T57S/E68Y/M119E/S188H/A195V/L311V/Y321F/Y412F、E11S/L19I/V42I/D53N/N168S/S188H/A195V、E11S/L19I/V42I/T57S/E68Y/A195V/L311V/Y321W和E11S/L19I/V42I。
在一个实施方案中，本发明提供了本文所述的变体葡糖淀粉酶，其中所述氨基酸取代为Y321F。
在另一实施方案中，本发明提供了本文所述的变体葡糖淀粉酶，其中所述氨基酸取代为S188H/Y321W/Q419P。
在另一实施方案中，本发明提供了本文所述的变体葡糖淀粉酶，其中所述氨基酸取代包含Y321F，并且还包含选自以下的至少一个氨基酸：N27A、S36P、A38V、A39F、S46T、P47T、S50Q、V65I、E68N、L79F、T89N、T98S、A108S、P121S、F122M、G124P、G124S、G124T、G158S、Q161P、S188P、S188W、T192A、K212Y、S215A、T258S、A262S、H264M、I298V、Y321L、T400L、Y412F、L420K、A422G、P423G、P423R、P423V、G457S、A491V、K5P、K5S、K5T、K5Y、K5Q、K5N、K5H、E68K、E68Y、E68S、S188T、S188H、Y321W、Q419P、A422S、R7C、E11S、L19I、C26N、T31N、V42I、I44V、R49H、D53N、Y55F、T57S、I69L、S72A、V73F、T78K、L79D、L79Y、E85Q、N86Q、V88I、T89S、A92T、Y93K、L94V、V97I、S103D、D106T、D118N、M119E、A125P、M141L、Y145A、L149I、N150D、A153S、T155A、N168S、V170I、A171T、G178T、Y179F、P186E、A195V、S204N、T205A、A208T、K209R、S213T、H214C、T219S、V220Q、I224V、Y227F、A246S、S247G、A256V、T261A、T261G、S306A、A307E、D309S、L311V、A317P、V342I、L347N、E348I、T352S、V353I、S355D、T362Q、L364I、T370V、A374N、E381N、S382D、T388Q、A391G、F394Y、V395L、Q399E、T400K、A407S、Q418T、S434T、T436S、E437A、D440Q、G446S、S452A、V453S、A460S、A469S、A470T、S472T、G475V、T476W、G478S、L492P和L9P。
在另一实施方案中，本发明提供了本文所述的变体葡糖淀粉酶，其中所述氨基酸取代包含S188H/Y321W/Q419P并且还包含选自以下的至少一个氨基酸：N27A、S36P、A38V、A39F、S46T、P47T、S50Q、V65I、E68N、L79F、T89N、T98S、A108S、P121S、F122M、G124P、G124S、G124T、G158S、Q161P、S188P、S188W、T192A、K212Y、S215A、T258S、A262S、H264M、I298V、Y321L、Y321F、T400L、Y412F、L420K、A422G、P423G、P423R、P423V、G457S、A491V、K5P、K5S、K5T、K5Y、K5Q、K5N、K5H、E68K、E68Y、E68S、S188T、A422S、R7C、E11S、L19I、C26N、T31N、V42I、I44V、R49H、D53N、Y55F、T57S、I69L、S72A、V73F、T78K、L79D、L79Y、E85Q、N86Q、V88I、T89S、A92T、Y93K、L94V、V97I、S103D、D106T、D118N、M119E、A125P、M141L、Y145A、L149I、N150D、A153S、T155A、N168S、V170I、A171T、G178T、Y179F、P186E、A195V、S204N、T205A、A208T、K209R、S213T、H214C、T219S、V220Q、I224V、Y227F、A246S、S247G、A256V、T261A、T261G、S306A、A307E、D309S、L311V、A317P、V342I、L347N、E348I、T352S、V353I、S355D、T362Q、L364I、T370V、A374N、E381N、S382D、T388Q、A391G、F394Y、V395L、Q399E、T400K、A407S、Q418T、S434T、T436S、E437A、D440Q、G446S、S452A、V453S、A460S、A469S、A470T、S472T、G475V、T476W、G478S、L492P和L9P。
在一些实施方案中，本发明提供了SEQ ID NO:13的C-末端截短的变体葡糖淀粉酶，其中所述截短位置位于选自以下的位置编号处：493、500、502、503、506、509、510、513、514、519、520、522、524、525、544、549、550、551、556、558、560、563、564和569。
在一个另外的实施方案中，本发明提供了与SEQ ID NO:13相比包含至少一个氨基酸取代的变体葡糖淀粉酶，其中所述氨基酸取代位于选自以下的位置：5、27、36、38、39、46、47、50、65、68、79、89、98、108、121、122、124、158、161、188、192、212、215、258、262、264、298、321、400、412、419、420、422、423、457、491、497、498、503、508、509、510、516、518、521、522、526、533、534、535、540、542、544、545、549、550、551、555、556、557、559、563、564、569、570、581 584、7、9、11、19、26、31、42、44、49、53、55、57、69、72、73、78、85、86、88、92、93、94、97、103、106、118、119、125、141、145、149、150、153、155、168、170、171、178、179、186、195、204、205、208、209、213、214、219、220、224、227、246、247、256、261、306、307、309、311、317、342、347、348、352、353、355、362、364、370、374、381、382、388、391、394、395、399、407、418、434、436、437、440、446、452、453、460、469、470、472、475、476、478和492，并且其中所述变体酶与SEQ ID NO:13至少95％相同。在一些情况下，变体酶在这些位置可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代。
在另一实施方案中，本发明提供了与SEQ ID NO:13相比包含至少一个氨基酸取代的变体葡糖淀粉酶，其中所述氨基酸取代位于选自以下的位置：5、27、36、38、39、46、47、50、65、68、79、89、98、108、121、122、124、158、161、188、192、212、215、258、262、264、298、321、400、412、419、420、422、423、457、491、497、498、503、508、509、510、516、518、521、522、526、533、534、535、540、542、544、545、549、550、551、555、556、557、559、563、564、569、570、581584、7、9、11、19、26、31、42、44、49、53、55、57、69、72、73、78、85、86、88、92、93、94、97、103、106、118、119、125、141、145、149、150、153、155、168、170、171、178、179、186、195、204、205、208、209、213、214、219、220、224、227、246、247、256、261、306、307、309、311、317、342、347、348、352、353、355、362、364、370、374、381、382、388、391、394、395、399、407、418、434、436、437、440、446、452、453、460、469、470、472、475、476、478和492，其中所述变体葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:13相比在选自以下的条件下具有至少1.1倍更好的活性：在约30℃下热活性、在约35℃下的热活性，在约40℃下的热活性、在约50℃下的热活性、在约60℃下的热活性和在约70℃下的热活性；并且其中所述变体酶与SEQ ID NO:13至少95％相同。在一些情况下，变体酶在这些位置可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代。
在一些实施方案中，本发明提供了本文所述的变体葡糖淀粉酶，其表现出与SEQID NO:13至少96％、97％、98％或99％的同一性。
在一些实施方案中，本发明提供了本文所述的变体葡糖淀粉酶，其中所述氨基酸取代发生在所述位置中的一个、所述位置中的两个、所述位置中的三个、所述位置中的四个、所述位置中的五个、所述位置中的六个、所述位置中的七个、所述位置中的八个、所述位置中的九个、所述位置中的十个、所述位置中的十一个、所述位置中的十二个或所述位置中的十三个。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了本文所述的变体葡糖淀粉酶，其中所述氨基酸取代选自以下：K5H、K5N、K5P、K5Q、K5S、K5T、K5Y、N27A、S36P、A38V、A39F、S46T、P47T、S50Q、V65I、E68K、E68N、E68S、E68Y、L79F、T89N、T98S、A108S、P121S、F122M、G124P、G124S、G124T、G158S、Q161P、S188H、S188P、S188T、S188W、T192A、K212Y、S215A、T258S、A262S、H264M、I298V、Y321F、Y321L、Y321W、T400L、Y412F、Q419P、L420K、A422G、A422S、P423G、P423R、P423V、G457S、A491V、E497V、L498T、Y503D、Y503E、Y503G、Y503K、Y503L、Y503N、Y503S、Y503T、K508N、K508S、K508T、L509P、V510G、V510S、F516L、S518I、S518L、S518M、P521S、S522G、L526I、L526N、L526S、T533R、A534T、S535Y、T540N、T542N、S544E、S544N、S544Q、V545A、V545D、S549D、S549E、T550D、V551D、V551R、V551S、F555D、F555K、F555L、F555N、F555R、F555S、I556D、I556P、I556R、R557P、G559N、G559S、S563L、I564N、I564S、I564T、G569I、N570P、T581N、T584N、R7C、E11S、L19I、C26N、T31N、V42I、I44V、R49H、D53N、Y55F、T57S、I69L、S72A、V73F、T78K、L79D、L79Y、E85Q、N86Q、V88I、T89S、A92T、Y93K、L94V、V97I、S103D、D106T、D118N、M119E、A125P、M141L、Y145A、L149I、N150D、A153S、T155A、N168S、V170I、A171T、G178T、Y179F、P186E、A195V、S204N、T205A、A208T、K209R、S213T、H214C、T219S、V220Q、I224V、Y227F、A246S、S247G、A256V、T261A、T261G、S306A、A307E、D309S、L311V、A317P、V342I、L347N、E348I、T352S、V353I、S355D、T362Q、L364I、T370V、A374N、E381N、S382D、T388Q、A391G、F394Y、V395L、Q399E、T400K、A407S、Q418T、S434T、T436S、E437A、D440Q、G446S、S452A、V453S、A460S、A469S、A470T、S472T、G475V、T476W、G478S、L492P和L9P。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了本文所述的变体葡糖淀粉酶，其中所述氨基酸取代选自以下：K5H、K5N、K5P、K5Q、K5S、K5T、K5Y、N27A、S36P、A38V、A39F、S46T、P47T、S50Q、V65I、E68K、E68N、E68S、E68Y、L79F、T89N、T98S、A108S、P121S、F122M、G124P、G124S、G124T、G158S、Q161P、S188H、S188P、S188T、S188W、T192A、K212Y、S215A、T258S、A262S、H264M、I298V、Y321F、Y321L、Y321W、T400L、Y412F、Q419P、L420K、A422G、A422S、P423G、P423R、P423V、G457S、A491V、E497V、L498T、Y503D、Y503E、Y503G、Y503K、Y503L、Y503N、Y503S、Y503T、K508N、K508S、K508T、L509P、V510G、V510S、F516L、S518I、S518L、S518M、P521S、S522G、L526I、L526N、L526S、T533R、A534T、S535Y、T540N、T542N、S544E、S544N、S544Q、V545A、V545D、S549D、S549E、T550D、V551D、V551R、V551S、F555D、F555K、F555L、F555N、F555R、F555S、I556D、I556P、I556R、R557P、G559N、G559S、S563L、I564N、I564S、I564T、G569I、N570P、T581N、T584N、L9P、E11S、L19I、V42I、D53N、T57S、I69L、L79Y、V88I、T89S、D118N、M119E、M141L、N168S、A195V、T261A、L311V、A317P、L347N、E348I、S355D、L364I、E381N、S382D、T388Q、F394Y、V395L和S434T。
在一些实施方案中，本发明提供了本文所述的变体葡糖淀粉酶，其中变体葡糖淀粉酶包含选自以下的一个或更多个(多个)取代：
S188H/Y321W/Q419P、T98S/Q161P/F516L、T98S/Q161P/N570P、T98S/Q161P、T550D/F555S、V65I/Y412F/Y503S/S518I、Y412F/Y503S/I564T、Y412F/Y503E、Y412F/Y503E/S518I、V65I/Y412F/Y503S、V65I/Y503E、Y503D/S518I/I564N、Y503E/S518L、V65I/Y503E/S544Q、V65I/Y503S、Y503E/S544E、V65I/Y503E/S544E/I564N、V65I/Y412F/Y503E、Y503E/S518I/S544Q、V65I/Y503E/S518M、Y412F/S518L、Y503E/S544Q、V65I/Y412F/Y503E/S544E/I564T/G569I、Y412F/Y503S、Y503E/I564T、S549D/F555D/G559N、S549D/F555R、K508T/L526N/S549D/G559N、K508T/G559N、F555D/I556P/G559N、S549D/F555R/I556P/G559N、F555R/I556P、L526I/F555R/I556P、F555R/I556P/G559N、K508T/I556P/G559N、F555D/I556P、K508T/L526N/A534T/S549D/I556P、K508T/L526I/S549D/G559N、K508N/L526I/S549E/F555L/G559N、L526N/S549D/F555D/I556P、L526I/F555D/G559N、A38V/F555R、A39F/T540N/T542N、L498T/T542N/T581N/T584N、T542N/T581N/T584N、S535Y/T542N、T540N/T584N、T540N/T542N/T581N/T584N、L498T/T581N/T584N、L498T/T584N、L498T/T542N/T581N、P121S/T542N/T584N、L498T/T542N、S535Y/T540N/T542N/T581N、Q419P/P423R、L79F/Q419P、Q419P/P423V、Q419P/P423R/T533R、S36P/Q419P、Q419P/P423G、S36P/T400L/Q419P/P423G、S50Q/Q419P/P423R、S50Q/Q419P/P423R/G457S/E497V/P521S、Y321F/A422S、S188H/Q419P、K5H/Y321W、K5N/Y321F、K5P/S188H、E68S/S188H/A422S、S188T/Y321F/Q419P/A422S、K5H/S188H/Y321F/A422S、S188H/Y321W/Q419P、S188H/A422S、S188H/A422S/V545A、K5Q/A422S、K5S/E68K/Y321W、K5H/Y321F/A422S、S188H/Y321W/Q419P、K5Y/A422S、Q419P/A422S、K5Y/S188H/A422S、K5T/A422S、K5T/Y321W、Y321W/A422S、Q419P/A422S、K5P/Y321F、K5H/S188H/Y321F/A422S、E68K/A422S、Y321F/A422S、K5H/Y321F、K5T/Y321F/Q419P/A422S、K5T/E68Y/S188T、K5S/E68Y/S188H、K5N/S188H、K5T/E68S/S188T、K5H/E68Y/S188P、K5P/E68Y/S188T、K5T/E68K/S188H、K5P/E68K/S188T、K5H/E68Y/S188T、K5T/S188H、K5T/E68N/S188T、K5Y/E68Y/S188T、K5S/E68Y/S188T、K5Q/E68K/S188H、K5P/E68N/S188H、K5P/E68N/S188T、K5P/E68Y/S188H、K5Y/E68Y/S188H、K5S/S188T、K5H/E68N/S188H、K5P/S188H、K5H/S46T/E68K/S188H、K5H/E68K/S188T、K5Q/E68Y/S188T、K5Y/E68N/S188H、V42I/S188H/A195V/Y412F/Q419P、L19I/V42I/E68Y/N168S/S188H/A195V/Y412F、E11S/V42I/T57S/D118N/N168S/S188H/A195V/L311V、E11S/V42I/D53N/E68Y/N168S/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/L19I/V42I/I69L/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/L19I/V42I/E68Y/D118N/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/L19I/T57S/M119E/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/V42I/A317P/Y412F/Q419P、L19I/T57S/I69L/D118N/N168S/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F/Y412F/Q419P、E11S/E68Y/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/L19I/V42I/E68Y/I69L/D118N/N168S/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/L19I/V42I/S188H/A195V/L311V/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/L19I/N168S/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F/Y412F、E11S/V42I/E68Y/Y412F、E11S/L19I/V42I/E68Y/Y412F、E11S/V42I/E68Y/S188H/A195V/Y412F、E11S/L19I/V42I/T57S/I69L/S188H/A195V/L311V/Y321W/Y412F、E11S/L19I/D53N/E68Y/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/V42I/E68Y/S188H/A195V/L311V/Y321W/Y412F、E11S/V42I/E68Y/S188H/L311V/Y412F/Q419P、E11S/L19I/V42I/E68Y/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/L19I/D53N/I69L/S188H/A195V/L311V/Q419P、E11S/V42I/E68Y/N168S/L311V/A317P/Y321W/Y412F、E11S/E68Y/I69L/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F/Y412F、E11S/V42I/T57S/E68Y/I69L/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F、E11S/D53N/T57S/L311V/Y321F/Y412F/Q419P、E11S/L19I/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/L19I/I69L/S188H/A195V/L311V/A317P、E11S/V42I/I69L/N168S/S188H/A195V/L311V/A317P/Y412F/Q419P、E11S/V42I/E68Y/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/V42I/I69L/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F/Y412F、E11S/Y412F、E11S/L19I/V42I/E68Y/I69L/S188H/A195V/Y412F、E11S/L19I/V42I/D53N/T57S/S188H/A195V/L311V/Y321W/Y412F、V42I/E68Y/Y412F、E11S/L19I/V42I/D53N/T57S/E68Y/I69L/N168S/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F、E11S/L19I/V42I/D53N/T57S/I69L/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321W/Y412F、E11S/V42I/A317P/Y321F、E11S/V42I/T57S/E68Y/D118N/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/L19I/V42I/E68Y/I69L/D118N/N168S/S188H/A195V/L311V/Y412F/Q419P、E11S/V42I/D53N/E68Y/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/I69L/D118N/S188H/A195V/L311V/Y412F、V42I/D53N/T57S/E68Y/M141L/N168S/T261A/Y321W/E381N/Y412F、E11S/V42I/S188H/L347N/Y412F/S434T、D53N/T57S/E68Y/D118N/M119E/L311V/E348I/Y412F、D118N/N168S/S188H/L347N/E348I/S382D/T388Q/V395L、E68Y/I69L/N168S/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/E68Y/V88I/A317P/Y321F/S355D、D53N/I69L/L79Y/M119E/T261A/L311V/L347N/E348I/Q419P、V42I/E68Y/I69L/D118N/M119E/M141L/L311V/A317P/Y321F/L347N、E11S/L19I/E68Y/I69L/L79Y/M141L/N168S/T261A/A317P/Y321W/L347N、E11S/V42I/E68Y/I69L/L311V/Y321W/S434T、E11S/V42I/D53N/N168S/L311V/A317P/Y321W、E11S/E68Y/I69L/D118N/N168S/Y321F/Y412F、V42I/D53N/T57S/L311V/Y321W/S355D/Y412F/Q419P、V42I/E68Y/L311V/L347N/L364I/Y412F、E11S/D118N/M119E/M141L/L311V/Y321W/L347N、V42I/D53N/T57S/M119E/M141L/A317P/Y321F/Q419P、T57S/I69L/T89S/S188H/A195V/T261A/L311V/A317P/Y321W/F394Y/Y412F、Y321F/Y412F、V42I/T57S/E68Y/I69L/T89S/M119E/T261A/A317P/Y412F/S434T、E11S/V42I/E68Y/L311V/A317P/S434T、V42I/D53N/T57S/E68Y/I69L/S434T、V42I/E68Y/Y321W、L311V/L347N/E348I/S355D/L364I/S434T、E11S/D53N/T57S/E68Y/V88I/T89S/M119E/A317P/Y321W、D53N/E68Y/I69L/T89S/L311V/A317P/S355D/Q419P、V42I/E68Y/A317P/Y321F/Y412F、L19I/I69L/T89S/L311V/A317P/Y321F/S355D/L364I/Y412F、V42I/D53N/T57S/E68Y/I69L/M141L/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F/Y412F/S434T、T57S/V88I/A317P/Y321W/Q419P、E11S/L19I/V42I/D53N/E68Y/L311V/A317P/Y321W/Y412F、E11S/V42I/D53N/E68Y/I69L/S188H/A195V/E348I、L19I/V42I/T57S/I69L/V88I/M119E/T261A/A317P/Y321F/Y412F、D53N/E68Y/D118N/M119E/M141L/T261A/L347N/E348I/S355D/L364I/S434T、E11S/T261A/L347N/E348I/S355D/S434T、M119E/S188H/E348I、E11S/A317P/Y321F/L347N、E11S/E68Y/I69L/T261A/L364I、D118N/M119E/N168S/S188H/A195V/L311V/Y321W/L347N/F394Y、E11S/L311V/Y321W/E348I/S355D/L364I/Y412F、V42I/D53N/T57S/I69L/V88I/L347N/E348I/F394Y/V395L/S434T、E11S/D53N/T89S/N168S/S188H/T261A/L311V/A317P/Y321W/S355D/Y412F、L19I/V42I/D53N/L79Y/T89S/N168S/T261A/L311V/Y321W/Y412F/Q419P/S434T、L79Y/V88I/D118N/M119E/T261A/Y321F/L364I/Y412F、V42I/E68Y/T89S/M141L/T261A/L311V/Y321F/E348I/L364I、V42I/E68Y/D118N/S188H/T261A/Y412F/S434T、E11S/D53N/E68Y/I69L/T89S/Y321W/E348I/S355D、M119E/L311V/Y321F、L311V/L347N/E348I、E11S/V42I/A317P/Y321F/L347N/Y412F、E11S/L19I/V42I/E68Y/A317P/Y321F/L364I/Y412F、D53N/E68Y/T89S/T261A、I69L/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321W/V395L/Y412F、V42I/D53N/E68Y/V88I/T89S/D118N/L311V/Y412F/S434T、E11S/V42I/E68Y/I69L/L311V/E348I、V42I/Y321W、E68Y/T261A/L311V/L347N/E348I/S434T、E11S/E68Y/I69L/L79Y、V42I/D53N/E68Y/S188H/A195V/T261A/L311V/Y321F/S355D/S434T、L19I/V42I/S188H/A195V/S382D/V395L/Q419P、E11S/L19I/V42I/D53N/T57S/M119E/L311V/Y321W/L347N/F394Y/Y412F、L9P/E11S/D53N/T57S/E68Y/M119E/M141L/E348I/Y412F和L19I/V42I/I69L/L311V/Y321W/L347N。
在一个实施方案中，本发明提供了本文所述的变体葡糖淀粉酶，其中所述氨基酸取代为Y321F。
在另一实施方案中，本发明提供了本文所述的变体葡糖淀粉酶，其中所述氨基酸取代为S188H/Y321W/Q419P。
在另一实施方案中，本发明提供了本文所述的变体葡糖淀粉酶，其中所述氨基酸取代包含Y321F，并且还包含选自以下的至少一个氨基酸取代：K5H、K5N、K5P、K5Q、K5S、K5T、K5Y、N27A、S36P、A38V、A39F、S46T、P47T、S50Q、V65I、E68K、E68N、E68S、E68Y、L79F、T89N、T98S、A108S、P121S、F122M、G124P、G124S、G124T、G158S、Q161P、S188H、S188P、S188T、S188W、T192A、K212Y、S215A、T258S、A262S、H264M、I298V、Y321L、Y321W、T400L、Y412F、Q419P、L420K、A422G、A422S、P423G、P423R、P423V、G457S、A491V、E497V、L498T、Y503D、Y503E、Y503G、Y503K、Y503L、Y503N、Y503S、Y503T、K508N、K508S、K508T、L509P、V510G、V510S、F516L、S518I、S518L、S518M、P521S、S522G、L526I、L526N、L526S、T533R、A534T、S535Y、T540N、T542N、S544E、S544N、S544Q、V545A、V545D、S549D、S549E、T550D、V551D、V551R、V551S、F555D、F555K、F555L、F555N、F555R、F555S、I556D、I556P、I556R、R557P、G559N、G559S、S563L、I564N、I564S、I564T、G569I、N570P、T581N、T584N、R7C、E11S、L19I、C26N、T31N、V42I、I44V、R49H、D53N、Y55F、T57S、I69L、S72A、V73F、T78K、L79D、L79Y、E85Q、N86Q、V88I、T89S、A92T、Y93K、L94V、V97I、S103D、D106T、D118N、M119E、A125P、M141L、Y145A、L149I、N150D、A153S、T155A、N168S、V170I、A171T、G178T、Y179F、P186E、A195V、S204N、T205A、A208T、K209R、S213T、H214C、T219S、V220Q、I224V、Y227F、A246S、S247G、A256V、T261A、T261G、S306A、A307E、D309S、L311V、A317P、V342I、L347N、E348I、T352S、V353I、S355D、T362Q、L364I、T370V、A374N、E381N、S382D、T388Q、A391G、F394Y、V395L、Q399E、T400K、A407S、Q418T、S434T、T436S、E437A、D440Q、G446S、S452A、V453S、A460S、A469S、A470T、S472T、G475V、T476W、G478S、L492P和L9P。
在另一实施方案中，本发明提供了本文所述的变体葡糖淀粉酶，其中所述氨基酸取代包含S188H/Y321W/Q419P，并且还包含选自以下的至少一个氨基酸取代：K5H、K5N、K5P、K5Q、K5S、K5T、K5Y、N27A、S36P、A38V、A39F、S46T、P47T、S50Q、V65I、E68K、E68N、E68S、E68Y、L79F、T89N、T98S、A108S、P121S、F122M、G124P、G124S、G124T、G158S、Q161P、S188P、S188T、S188W、T192A、K212Y、S215A、T258S、A262S、H264M、I298V、Y321F、Y321L、T400L、Y412F、L420K、A422G、A422S、P423G、P423R、P423V、G457S、A491V、E497V、L498T、Y503D、Y503E、Y503G、Y503K、Y503L、Y503N、Y503S、Y503T、K508N、K508S、K508T、L509P、V510G、V510S、F516L、S518I、S518L、S518M、P521S、S522G、L526I、L526N、L526S、T533R、A534T、S535Y、T540N、T542N、S544E、S544N、S544Q、V545A、V545D、S549D、S549E、T550D、V551D、V551R、V551S、F555D、F555K、F555L、F555N、F555R、F555S、I556D、I556P、I556R、R557P、G559N、G559S、S563L、I564N、I564S、I564T、G569I、N570P、T581N、T584N、R7C、E11S、L19I、C26N、T31N、V42I、I44V、R49H、D53N、Y55F、T57S、I69L、S72A、V73F、T78K、L79D、L79Y、E85Q、N86Q、V88I、T89S、A92T、Y93K、L94V、V97I、S103D、D106T、D118N、M119E、A125P、M141L、Y145A、L149I、N150D、A153S、T155A、N168S、V170I、A171T、G178T、Y179F、P186E、A195V、S204N、T205A、A208T、K209R、S213T、H214C、T219S、V220Q、I224V、Y227F、A246S、S247G、A256V、T261A、T261G、S306A、A307E、D309S、L311V、A317P、V342I、L347N、E348I、T352S、V353I、S355D、T362Q、L364I、T370V、A374N、E381N、S382D、T388Q、A391G、F394Y、V395L、Q399E、T400K、A407S、Q418T、S434T、T436S、E437A、D440Q、G446S、S452A、V453S、A460S、A469S、A470T、S472T、G475V、T476W、G478S、L492P和L9P。
在一个另外的实施方案中，本发明提供了本文所述的变体葡糖淀粉酶，该变体葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:13相比包含至少一个氨基酸取代，并且在选自以下的位置编号处还包含C-末端氨基酸截短：493、500、502、503、506、509、510、513、514、519、520、522、524、525、544、549、550、551、556、558、560、563、564和569。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P或G7P相比在位置-20处包含缬氨酸的氨基酸取代(参见图1的序列)。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为V-20A、V-20F、V-20G、V-20I、V-20K、V-20L、V-20M、V-20Q、V-20R、V-20T或V-20W。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P或G7P相比在位置-18处包含亮氨酸的氨基酸取代(参见图1的序列)。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为L-18F、L-18I或L-18Y。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P或G7P相比在位置-17处包含赖氨酸的氨基酸取代(参见图1的G6P/G7P序列)。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为K-17F、K-17N或K-17Y。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P或G7P相比在位置-15处包含丙氨酸的氨基酸取代the variant glucoamylase comprises an amino acid substitution ofthe Alanine at position-15 as compared to G6P or G7P(参见图1的G6P/G7P序列)。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为A-15F、A-15I、A-15L或A-15V。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P或G7P相比在位置-13处包含丙氨酸的氨基酸取代(参见图1的G6P/G7P序列)。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为A-13T。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P或G7P相比在位置-12处包含丙氨酸的氨基酸取代(参见图1的G6P/G7P序列)。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为A-12V。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P或G7P相比在位置-10处包含苏氨酸的氨基酸取代(参见图1的G6P/G7P序列)。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为T-10F或T-10V。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P或G7P相比在位置-9处包含色氨酸的氨基酸取代(参见图1的G6P/G7P序列)。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为W-9Y。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P或G7P相比在位置-1处包含缬氨酸的氨基酸取代(参见图1的G6P/G7P序列)。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为V-1F。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置5处包含赖氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)。在一些实施方案中，氨基酸取代为K5H、K5N、K5P、K5Q、K5S、K5T或K5Y。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置7处包含精氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为R7C.
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置9处包含亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)。在一些实施方案中，氨基酸取代为L9P。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置11处包含谷氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为E11S。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置19处包含亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为L19I。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置26处包含半胱氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为C26N。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置27处包含天冬酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为N27A。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置31处包含苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为T31N。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置36处包含丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)。在一些实施方案中，氨基酸取代为S36P。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置38处包含丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为A38V。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置39处包含丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为A39F。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置42处包含缬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为V42I。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置44处包含异亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为I44V。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置46处包含丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为S46T。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置47处包含脯氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)。在一些实施方案中，氨基酸取代为P47T。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置49处包含精氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为R49H。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置50处包含丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为S50Q。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置53处包含天冬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为D53N。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置55处包含酪氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为Y55F。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置57处包含苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为T57S。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置65处包含缬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为V65I。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置68处包含谷氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为E68K、E68N、E68S或E68Y。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置69处包含异亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为I69L。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置72处包含丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为S72A。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置73处包含缬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为V73F。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置78处包含苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为T78K。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置79处包含亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为L79F、L79Y或L79D。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置85处包含谷氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为E85Q。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置86处包含天冬酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为N86Q。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置88处包含缬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为V88I。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置89处包含苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为T89N或T89S。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置92处包含丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为A92T。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置92处包含酪氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为Y93K。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置94处包含亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为L94V。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置97处包含缬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为V97I。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置98处包含苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为T98S。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置103处包含丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为S103D。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置106处包含天冬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为D106T。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置108处包含丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为A108S。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置118处包含天冬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为D118N。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置119处包含蛋氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为M119E。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置121处包含脯氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)。在一些实施方案中，氨基酸取代为P121S。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置122处包含苯丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为F122M。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置124处包含甘氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)。在一些实施方案中，氨基酸取代为G124P、G124S或G124T。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置125处包含丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)。在一些实施方案中，氨基酸取代为A125P。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置141处包含蛋氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为M141L。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置145处包含酪氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为Y145A。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置149处包含亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为L149I。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置150处包含天冬酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为N150D。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置153处包含丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为A153S。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置155处包含苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为T155A。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置158处包含甘氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为G158S。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置161处包含谷氨酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)。在一些实施方案中，氨基酸取代为Q161P。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置168处包含天冬酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为N168S。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置170处包含缬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为V170I。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置171处包含丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为A171T。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置178处包含甘氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为G178T。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置179处包含酪氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为Y179F。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置186处包含脯氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)。在一些实施方案中，氨基酸取代为P186E。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置188处包含丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)。在一些实施方案中，氨基酸取代为S188H、S188P、S188T或S188W。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置192处包含苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为T192A。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置195处包含丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为A195V。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置204处包含丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为S204N。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置205处包含苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为T205A。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置208处包含丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为A208T。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置209处包含赖氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为K209R。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置212处包含赖氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为K212Y。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置213处包含丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为S213T。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置214处包含组氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为H214C。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置215处包含丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为S215A。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置219处包含苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为T219S。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置220处包含缬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为V220Q。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置224处包含异亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为I224V。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置227处包含酪氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为Y227F。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置246处包含丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为A246S。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置247处包含丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为S247G。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置256处包含丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为A256V。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置258处包含苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为T258S。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置261处包含苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为T261A或T261G。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置262处包含丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为A262S。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置264处包含组氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为H264M。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置298处包含异亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为I298V。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置306处包含丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为S306A。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置307处包含丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为A307E。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置309处包含天冬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为D309S。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置311处包含亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为L311V。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置317处包含丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)。在一些实施方案中，氨基酸取代为A317P。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置321处包含酪氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为Y321F、Y321L或Y321W。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置342处包含缬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为V342I。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置347处包含亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为L347N。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置348处包含谷氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为E348I。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置352处包含苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为T352S。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置353处包含缬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为V353I。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置355处包含丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为S355D。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置362处包含苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为T362Q。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置364处包含亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为L364I。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置370处包含苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为T370V。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置374处包含丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为A374N。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置381处包含谷氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为E381N。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置382处包含丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为S382D。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置388处包含苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为T388Q。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置391处包含丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为A391G。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置394处包含苯丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为F394Y。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置395处包含缬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为V395L。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置399处包含谷氨酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为Q399E。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置400处包含苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为T400L或T400K。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置407处包含丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为A407S。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置412处包含酪氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为Y412F。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置418处包含谷氨酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为Q418T。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置419处包含谷氨酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)。在一些实施方案中，氨基酸取代为Q419P。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置420处包含亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为L420K。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置422处包含丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为A422G或A422S。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置423处包含脯氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)。在一些实施方案中，氨基酸取代为P423G、P423R或P423V。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置434处包含丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为S434T。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置436处包含苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为T436S。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置437处包含谷氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为E437A。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置440处包含天冬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为D440Q。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置446处包含甘氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为G446S。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置452处包含丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为S452A。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置453处包含缬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为V453S。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置457处包含甘氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为G457S。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置460处包含丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为A460S。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置469处包含丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为A469S。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置470处包含丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为A470T。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置472处包含丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为S472T。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置475处包含甘氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为G475V。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置476处包含苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为T476W。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置478处包含甘氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为G478S。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置491处包含丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为A491V。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)或G7P(SEQ ID NO:15)成熟蛋白相比在位置492处包含亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)。在一些实施方案中，氨基酸取代为L492P。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)成熟蛋白相比在位置497处包含谷氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为E497V。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)成熟蛋白相比在位置498处包含亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为L498T。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)成熟蛋白相比在位置503处包含酪氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为Y503D、Y503E、Y503G、Y503K、Y503L、Y503N、Y503S或Y503T。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)成熟蛋白相比在位置508处包含赖氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为K508N、K508S或K508T。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)成熟蛋白相比在位置509处包含亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)。在一些实施方案中，氨基酸取代为L509P。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)成熟蛋白相比在位置510处包含缬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为V510G或V510S。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)成熟蛋白相比在位置516处包含苯丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为F516L。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)成熟蛋白相比在位置518处包含酪氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为S518I、S518L或S518M。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)成熟蛋白相比在位置521处包含脯氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)。在一些实施方案中，氨基酸取代为P521S。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)成熟蛋白相比在位置522处包含丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为S522G。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)成熟蛋白相比在位置526处包含亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为L526I、L526N或L526S。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)成熟蛋白相比在位置533处包含苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为T533R。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)成熟蛋白相比在位置534处包含丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为A534T。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)成熟蛋白相比在位置535处包含丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为S535Y。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)成熟蛋白相比在位置540处包含苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为T540N。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)成熟蛋白相比在位置542处包含苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为T542N。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)成熟蛋白相比在位置544处包含丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为S544E、S544N或S544Q。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)成熟蛋白相比在位置545处包含缬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为V545A或V545D。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)成熟蛋白相比在位置549处包含丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为S549D或S549E。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)成熟蛋白相比在位置550处包含苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为T550D。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)成熟蛋白相比在位置551处包含缬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为V551D、V551R或V551S。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)成熟蛋白相比在位置555处包含苯丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为F555D、F555K、F555L、F555N、F555R或F555S。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)成熟蛋白相比在位置556处包含异亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)。在一些实施方案中，氨基酸取代为I556D、I556P或I556R。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)成熟蛋白相比在位置557处包含精氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)。在一些实施方案中，氨基酸取代为R557P。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)成熟蛋白相比在位置559处包含甘氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为G559N或G559S。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)成熟蛋白相比在位置563处包含丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为S563L。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)成熟蛋白相比在位置564处包含异亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为I564N、I564S或I564T。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)成熟蛋白相比在位置569处包含甘氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为G569I。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)成熟蛋白相比在位置570处包含天冬酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)。在一些实施方案中，氨基酸取代为N570P。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)成熟蛋白相比在位置581处包含苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为T581N。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与G6P(SEQ ID NO:13)成熟蛋白相比在位置584处包含苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代使用任何其他的19种天然存在的氨基酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代为T584N。
除了本文所述的特定取代之外，可存在的氨基酸变化可以是较少天然的，保守氨基酸取代或插入不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；小的缺失，通常缺失1至约30个氨基酸；小的氨基或羧基末端的延伸部分，例如氨基末端的蛋氨酸残基；至多约20至约25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其他功能(例如多组氨酸束、抗原表位或结合结构域)助于纯化的小的延伸。
保守取代的实例为碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和蛋氨酸)。通常不改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的，例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979在The Proteins,Academic Press,New York中所述的。常见的取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、LeuA al、Ala/Glu和Asp/Gly。
A.亲本葡糖淀粉酶
亲本葡糖淀粉酶可以为(a)与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15具有至少85％序列同一性的多肽；(b)在中高严格条件下由与(i)SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的编码成熟多肽的序列或(ii)(i)的全长互补序列杂交的多核苷酸编码的多肽；或者(c)由与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的编码成熟多肽的序列具有至少70％序列同一性的多核苷酸编码的多肽。关于杂交方法和条件，参见例如Sambrook等,1989,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor,New York。
在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:25的野生型多肽的序列同一性为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％，并且具有葡糖淀粉酶活性。在一个方面，本发明的氨基酸序列与SEQ ID NO:25的野生型多肽相差至多20个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在一些方面，亲本葡糖淀粉酶具有包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在一些方面，亲本葡糖淀粉酶具有包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶由与编码成熟野生型多肽的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽编码。
在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶为Thielaviopsis punctuala葡糖淀粉酶，例如SEQ ID NO:25的葡糖淀粉酶。在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶是在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中产生的。在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶为是在Saccharomycescerevisiaein中产生的。在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶是在黑曲霉(Aspergillusniger)中产生的。
在一个实施方案中，当暴露于30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、52℃、55℃、56℃、58℃、60℃、65℃、66℃、70℃、75℃、80℃和85℃的温度一段时间(根据使用变体葡糖淀粉酶的极端条件，通常约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10分钟或更久)时，变体葡糖淀粉酶比亲本葡糖淀粉酶更稳定，对于一些实施方案采用5分钟至10分钟、5分钟至15分钟、5分钟至60分钟的热挑战时间，所有均在本发明中使用。在一些实施方案中，使用85℃、5分钟的挑战。
因此，在一些实施方案中，对于在50℃下至少5分钟，在52℃下至少5-10分钟，在55℃下至少5-10分钟，在58℃下至少5-10分钟，在56℃下至少5-10分钟，在60℃下至少5-10分钟，在66℃中至少5-10分钟，与亲本葡糖淀粉酶(例如野生型、G6P或G7P成熟葡糖淀粉酶蛋白)相比，变体葡糖淀粉酶具有增加的热稳定性，在一些实施方案中，在70℃下至少5-10分钟。
此外，pH也可以是热稳定性的考虑因素。因此，在一些实施方案中，对于在52℃、pH4.5下至少5分钟或者在56℃、pH 4.5下至少5分钟，与亲本葡糖淀粉酶相比，变体葡糖淀粉酶具有增加的热稳定性。因此，在一些实施方案中，对于在52℃、pH 4.5下至少10分钟或者在56℃、pH 4.5下至少10分钟，与亲本葡糖淀粉酶相比，变体葡糖淀粉酶具有增加的热稳定性。
因此，如图2、3、4和6所示，大量的本发明的变体葡糖淀粉酶表现出增加的热活性。
B.核酸组合物
本发明还提供了包含本发明的编码变体葡糖淀粉酶的核酸的组合物。这样的编码变体葡糖淀粉酶的核酸可以编码本申请中记录的任何变体葡糖淀粉酶，包括上文“本发明的变体葡糖淀粉酶”部分的那些。在一些实施方案中，该组合物包含选自SEQ ID NO:2至SEQID NO:24的偶数编号序列的核酸。
在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:2的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:4的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:6的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:8的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:10的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:12的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:14的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:16的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:18的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:20的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:22的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:24的核酸。
在一些实施方案中，本发明提供了编码包含信号肽的前蛋白和成熟蛋白的核酸，
其中所述信号肽为SEQ ID NO:26或与SEQ ID NO:26相比的变体信号肽，并且所述变体信号肽在选自-20、-18、-17、-15、-13、-12、-10、-9、和-1的位置编号处具有至少一个氨基酸取代；并且
其中所述成熟蛋白具有SEQ ID NO:15，或为与SEQ ID NO:15相比的变体葡糖淀粉酶，其中所述变体葡糖淀粉酶在选自以下的位置编号处具有至少一个氨基酸取代：5、27、36、38、39、46、47、50、65、68、79、89、98、108、121、122、124、158、161、188、192、212、215、258、262、264、298、321、400、412、419、420、422、423、457、491、497、498、503、508、509、510、7、9、11、19、26、31、42、44、49、53、55、57、69、72、73、78、85、86、88、92、93、94、97、103、106、118、119、125、141、145、149、150、153、155、168、170、171、178、179、186、195、204、205、208、209、213、214、219、220、224、227、246、247、256、261、306、307、309、311、317、342、347、348、352、353、355、362、364、370、374、381、382、388、391、394、395、399、407、418、434、436、437、440、446、452、453、460、469、470、472、475、476、478和492；并且
其中所述前蛋白与SEQ ID NO:3至少95％相同。
在另一些实施方案中，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述前蛋白表现出与SEQ ID NO:3至少96％、97％、98％或99％的同一性。
在一个另外的实施方案中，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述变体信号肽在所述位置中的一个、所述位置中的两个、所述位置中的三个、所述位置中的四个或所述位置中的五个处具有氨基酸取代。
在另一实施方案中，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述变体葡糖淀粉酶在所述位置中的一个、所述位置中的两个、所述位置中的三个、所述位置中的四个、所述位置中的五个、所述位置中的六个、所述位置中的七个、所述位置中的八个、所述位置中的九个、所述位置中的十个、所述位置中的十一个、所述位置中的十二个、所述位置中的十三个或所述位置中的十四个处具有氨基酸取代。
在一个另外的实施方案中，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述变体信号肽在位置编号-20或-15处具有至少一个氨基酸取代。
在一个另外的实施方案中，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述变体信号肽具有选自以下的氨基酸取代：V-20A、V-20F、V-20G、V-20I、V-20K、V-20L、V-20M、V-20Q、V-20R、V-20T、V-20W、L-18F、L-18I、L-18Y、K-17F、K-17N、K-17Y、A-15F、A-15I、A-15L、A-15V、A-13T、A-12V、T-10F、T-10V、W-9Y和V-1F。
在另一实施方案中，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述变体葡糖淀粉酶具有选自以下的氨基酸取代：N27A、S36P、A38V、A39F、S46T、P47T、S50Q、V65I、E68N、L79F、T89N、T98S、A108S、P121S、F122M、G124P、G124S、G124T、G158S、Q161P、S188P、S188W、T192A、K212Y、S215A、T258S、A262S、H264M、I298V、Y321L、T400L、Y412F、L420K、A422G、P423G、P423R、P423V、G457S、A491V、K5P、K5S、K5T、K5Y、K5Q、K5N、K5H、E68K、E68Y、E68S、S188T、S188H、Y321F、Y321W、Q419P、A422S、R7C、E11S、L19I、C26N、T31N、V42I、I44V、R49H、D53N、Y55F、T57S、I69L、S72A、V73F、T78K、L79D、L79Y、E85Q、N86Q、V88I、T89S、A92T、Y93K、L94V、V97I、S103D、D106T、D118N、M119E、A125P、M141L、Y145A、L149I、N150D、A153S、T155A、N168S、V170I、A171T、G178T、Y179F、P186E、A195V、S204N、T205A、A208T、K209R、S213T、H214C、T219S、V220Q、I224V、Y227F、A246S、S247G、A256V、T261A、T261G、S306A、A307E、D309S、L311V、A317P、V342I、L347N、E348I、T352S、V353I、S355D、T362Q、L364I、T370V、A374N、E381N、S382D、T388Q、A391G、F394Y、V395L、Q399E、T400K、A407S、Q418T、S434T、T436S、E437A、D440Q、G446S、S452A、V453S、A460S、A469S、A470T、S472T、G475V、T476W、G478S、L492P和L9P。
在一些实施方案中，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述变体葡糖淀粉酶在选自以下的位置编号处具有氨基酸取代：5、68、188、321、419、420、422、7、11、19、26、31、42、44、49、53、55、57、69、72、73、78、79、85、86、88、89、92、93、94、97、98、103、106、118、119、125、141、145、149、150、153、155、161、168、170、171、178、179、186、195、204、205、208、209、213、214、219、220、224、227、246、247、256、261、262、306、307、309、311、317、342、347、348、352、353、355、362、364、370、374、381、382、388、391、394、395、399、400、407、412、418、434、436、437、440、446、452、453、460、469、470、472、475、476、478和492。
在另一些实施方案中，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述变体葡糖淀粉酶具有选自以下的氨基酸取代：K5P、K5S、K5T、K5Y、K5Q、K5N、K5H、E68K、E68Y、E68S、S188T、S188H、Y321F、Y321W、Q419P、A422S、R7C、E11S、L19I、C26N、T31N、V42I、I44V、R49H、D53N、Y55F、T57S、I69L、S72A、V73F、T78K、L79D、L79Y、E85Q、N86Q、V88I、T89S、A92T、Y93K、L94V、V97I、T98S、S103D、D106T、D118N、M119E、A125P、M141L、Y145A、L149I、N150D、A153S、T155A、Q161P、N168S、V170I、A171T、G178T、Y179F、P186E、A195V、S204N、T205A、A208T、K209R、S213T、H214C、T219S、V220Q、I224V、Y227F、A246S、S247G、A256V、T261A、T261G、A262S、S306A、A307E、D309S、L311V、A317P、V342I、L347N、E348I、T352S、V353I、S355D、T362Q、L364I、T370V、A374N、E381N、S382D、T388Q、A391G、F394Y、V395L、Q399E、T400K、A407S、Y412F、Q418T、S434T、T436S、E437A、D440Q、G446S、S452A、V453S、A460S、A469S、A470T、S472T、G475V、T476W、G478S和L492P。
在另一实施方案中，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述前蛋白具有选自以下的氨基酸取代：S188H/Y321W/Q419P、K5T/S188T、K5T/E68K/S188H、K5Y/S188H、K5Q/E68K/S188T、K5N/E68Y/S188T、K5H/S188H、K5S/E68Y/S188H、K5S/E68Y/S188T、K5Y/E68Y、K5S/E68S/S188T、K5H/E68S/S188H、K5H/E68K/S188T、K5P/S188H、K5Y/E68K、K5T/S188H、K5S/S188H、E68Y/S188H、E68Y/S188T、A-15F/K5T/Y321F、V-20F/A-15I、V-20F/K5Q/S188H/Q419P、A-15I/Y321F、V-20F/A422S、A-15F/K5P/E68Y/S188T/A422S、V-20F/A-15I/A422S、V-20T/A-15I/Q419P、V-20F/K5N/S188H/Q419P、V-20F/Y321W/A422S、V-20F/E68K/Q419P、A-15F/S188H/Y321W/Q419P、V-20F/Y321F、A-15F/Y321F、V-20F/E68S/S188T/Y321W/A422S、V-20F/A-15F/K5Q/Q419P/A422S、V-20I/A-15I/Y321F、S188T/Y321F、S188T/Q419P/A422S、V-20T/A-15I/K5Q、A-15I/Y321W、V-20F/A-15F/K5Q、V-20F/K5H/S188T/Q419P/A422S、V-20T/A-15I/K5H/A422S、A-15F/S188H/Y321W、A-15F/Q419P/A422S、V-20F/K5N/A422S、V-20F/A-15I/S188H、E68Y/S188H/Y321F/Q419P、V-20F/A-15F/K5N/A422S、V-20F/A-15I/Y321F、V-20F/K5Q/S188H、E11S/Y55F/M141L/N168S/T388Q、E11S/T31N/Y55F/M141L/N168S/T388Q、L19I/A195V、M141L/N168S/Y227F/T362Q/T388Q/D440Q、E11S/M141L、E11S/L19I/I44V/Y145A/T155A/D309S/L311V/Y412F/S472T、D309S/L311V、E11S/L19I/T31N/Y55F/A125P/N168S/Y227F、L19I/D309S/L311V/Y412F/A460S/S472T、E11S/L19I/N168S/Y227F/D309S/L311V/D440Q、L19I/Y412F、E11S/L19I/Y145A/A460S/S472T、E11S/M141L/N168S/D309S/L311V/T362Q/L364I/Y412F/A460S/S472T、E11S/Y55F/M141L/N168S/L311V/T362Q/L364I/A460S/S472T、E11S/L19I/Y55F/M141L/N168S/Y227F、L19I/T155A/A407S/Y412F/S472T、D53N/L149I/N150D/P186E/A317P、V42I/S103D/D106T/P186E/A317P/S434T/G478S、A317P/G478S、C26N/V42I/L149I/A317P/S355D/A374N、V42I/S103D/D106T/A317P、D53N/S434T、/S103D/A317P/V342I、A256V/A317P、V42I/P186E、A317P/V342I/G478S、I224V/A256V/A317P/G478S、V42I/L149I/N150D/A317P/G478S、V42I/S103D/P186E/A317P/V342I/S355D/A374N/A391G、P186E/A317P/G478S、D53N/G446S、A256V/A317P/G478S、V42I/D53N/T57S/L149I/A317P/G478S、C26N/V42I/D53N/T57S/N150D/P186E/A317P/V342I/G478S、V42I/S355D、V42I/N150D/P186E/A317P、V42I/S434T/G478S、C26N/D53N/T57S/S103D/Q161P/A317P/G478S、V42I/A256V/A317P/S434T、V42I/S103D/A317P/A391G/G478S、E68Y/I69L/G178T/Y179F/S213T/H214C、E68Y/I69L/E85Q/N86Q/F394Y/V395L、E68Y/I69L、D118N/M119E、E68Y/I69L/V97I/T98S/A246S/S247G/T261G/A262S/L347N/E348I、E68Y/I69L/S452A/V453S、E68Y/I69L/S452A/V453S、E68Y/I69L/E85Q/N86Q/L347N/E348I/Q418T/Q419P、E68Y/I69L/E85Q/N86Q/S204N/T205A、A208T/K209R/E381N/S382D/Q418T/Q419P/A469S/A470T、E381N/S382D/Q418T/Q419P/T436S/E437A/A469S/A470T、Q418T/Q419P/A469S/A470T、V170I/A171T/E381N/S382D/Q418T/Q419P/A469S/A470T、F394Y/V395L/Q418T/Q419P/T436S/E437A/A469S/A470T、T78K/L79D/Q418T/Q419P/A469S/A470T、E68Y/I69L/V88I/T89S/T352S/V353I/Q399E/T400K/A469S/A470T、S72A/V73F/A153S/S306A/T476W、T370V/G475V、R49H/S72A/V73F/A92T/Y93K/A153S/S306A/T476W、E68Y/I69L/T219S/V220Q/A307E/S355D/L492P、E11S/V42I/L149I/I224V/A317P/T388Q/A460S/G478S、Y412F/Q418T/Q419P/A469S/A470T/、L19I/D53N/I69L/V88I/S188H/A195V/Y321W/Y412F、V42I/D118N/M119E/T261A/L311V/Y321W/S355D、E11S/T57S/T89S、E11S/V42I/L79Y/D118N/M141L/L311V/A317P/Y321F、V42I/D53N/E68Y/A317P/L347N、I69L/S188H/A195V/A317P/Y321F/L364I/S434T、T57S/A195V/T261A/L311V/Y321F/L347N/E348I/S434T、E11S/V42I/T57S/E68Y/S188H/A195V/T261A、T57S/N168S/T261A/A317P/Y321W/V395L/Y412F、E11S/D53N/E68Y/D118N/S188H/A195V/Y412F/Q419P、E11S/V42I/D118N/M141L/N168S/Y321W/Y412F、E11S/D53N/T57S/E68Y/T89S/E381N/Y412F/Q419P/S434T、E11S/D53N/T57S/V88I/T89S/S188H/A195V/L311V/L347N/Y412F、A317P/Y412F、I69L/T89S/L311V/A317P/Y321F/Y412F/S434T、V42I/D53N/T57S/E68Y/V88I/Y412F、E11S/T57S/V88I/M141L/T261A/Y321W/L364I/Y412F、V42I/I69L/S188H/A317P/Y321W/Y412F、E11S/V42I/D53N/T57S/L79Y/T89S/L311V/Y321W/Y412F、L19I/M141L/N168S/S188H/A195V/L311V/S355D/S434T、S188H/A195V/T261A/L311V/Y321F/L347N/E348I、E11S/L19I/D53N/T57S/N168S/L347N、E11S/I69L/M119E/A195V/T261A/A317P/Y321W/L347N/Y412F、L79Y/V88I/T261A/A317P/Y321F/L364I/Y412F、E11S/V42I/E68Y/T89S/L311V/Y321F/T388Q/F394Y/V395L/Q419P、D53N/E68Y/V88I/M141L/N168S/Y321W/Y412F、E11S/I69L/L311V/A317P/Y321F/L347N/Y412F、D53N/T57S/M141L、D53N/V88I/T89S/D118N/E348I/S355D、E11S/S188H/A195V/A317P/L347N/E348I/Y412F/Q419P/S434T、E11S/D53N/I69L/V88I/A317P/Q419P、E68Y/I69L/V88I/N168S/L364I/Q419P、E11S/V42I/V88I/T261A/Y321F/E348I/S355D、E11S/V42I/T57S/I69L/A195V/L347N/E348I/S355D、L19I/T89S/A317P/Y321F/S434T、E11S/V42I/L79Y/L311V/A317P/Y321W/L347N/E348I/L364I/Y412F、D53N/T57S/L347N/E348I/Y412F、D53N/T57S/E68Y/L79Y/Y412F/S434T、L19I/V88I/T89S/A317P、M119E/M141L/N168S/L311V/Y321F、E11S/T89S/Y321W、E11S/M141L/T261A/A317P/Y412F/S434T、V42I/L79Y/S188H/A195V/L311V/Y321F/S355D、V42I/E68Y/V88I/T261A/Y321W/L347N/E348I、L19I/E68Y/I69L/M141L/Y321F/L347N/S355D/E381N/Y412F、V42I/D53N/I69L/L79Y/D118N/T261A/L311V/A317P/Y321F/L347N/Y412F、E68Y/S355D/L364I/S382D/T388Q/Q419P、E11S/L19I/V42I/E68Y/I69L/D118N/M141L/Y321W/L347N、/E11S/V42I/E68Y/M141L/A317P/Y321F/E348I/S355D、E11S/V42I/E68Y/I69L/V88I/T89S/D118N/M119E/S188H/A195V/A317P/L347N/Y412F/Q419P、V42I/V88I/L311V/A317P/Y321F/L347N/E348I/T388Q/V395L/S434T、T261A/A317P/Y321W/E348I、E11S/V42I/E68Y/I69L/D118N/M119E/Y412F、E11S/V42I/T57S/I69L/L311V、V42I/Y412F、E11S/L19I/E68Y/M119E/N168S/Y412F/Q419P、L19I/L311V/Y412F、E11S/V42I/M119E/Y412F、E11S/L19I/V42I/D53N/S188H/A195V/L311V/Y321F/Y412F、E11S/L19I/V42I/T57S/D118N/N168S/L311V/Y412F、L19I/V42I/D53N/T57S/N168S/A317P/Y321W/Y412F、D53N/T57S/E68Y/N168S/S188H/A195V/L311V/Y321W/Y412F/Q419P、L19I/D53N/T57S/L311V/Y321W/Y412F、E11S/T57S/Y321W/Y412F/Q419P、D53N/S188H/A195V/L311V/Y412F、V42I/D53N/S188H/A195V/L311V/Y321F/Y412F、L19I/M119E/N168S/S188H/A195V/L311V/Y412F/Q419P、E11S/V42I/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/V42I/M119E/N168S/L311V/Y412F、E11S/V42I/N168S/L311V/A317P/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/V42I/D53N/E68Y/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F/Y412F、E11S/L19I/D53N/N168S/A195V/Y412F/Q419P、E11S/L19I/V42I/L311V/Y412F、V42I/D53N/N168S/L311V/Y412F、E11S/L311V/Y412F、E11S/D53N/T57S/L311V/Y321W/Y412F、E11S/L311V/Y321W/Y412F、E11S/V42I/I69L/D118N/N168S/L311V/A317P/Y412F/Q419P、E11S/L19I/V42I/E68Y/Y412F/Q419P、E11S/L19I/D53N/L311V、E11S/L19I/V42I/L311V/Y412F/Q419P、L19I/V42I/D53N/T57S/I69L/N168S/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321W、E11S/L19I/V42I/T57S/L311V/A317P/Y321F/Y412F、L19I/V42I/I69L/D118N/N168S/L311V/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/V42I/D53N/E68Y/S188H/A195V/Y412F、E11S/L19I/V42I/D53N/T57S/N168S/L311V/Y321W/Y412F、E11S/V42I/L311V/Y412F、E11S/L19I/V42I/N168S/A195V/L311V/Y321F/Y412F、E11S/V42I/S188H/L311V/Y412F、L19I/V42I/T57S/E68Y/M119E/S188H/A195V/L311V/Y321F/Y412F、E11S/L19I/V42I/D53N/N168S/S188H/A195V、E11S/L19I/V42I/T57S/E68Y/A195V/L311V/Y321W和E11S/L19I/V42I。
在另一实施方案中，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述变体葡糖淀粉酶具有氨基酸取代Y321F。
在一个另外的实施方案中，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述变体葡糖淀粉酶具有氨基酸取代S188H/Y321W/Q419P。
在另一实施方案中，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述变体葡糖淀粉酶包含氨基酸取代Y321F，并且还包含选自以下的至少一个氨基酸：N27A、S36P、A38V、A39F、S46T、P47T、S50Q、V65I、E68N、L79F、T89N、T98S、A108S、P121S、F122M、G124P、G124S、G124T、G158S、Q161P、S188P、S188W、T192A、K212Y、S215A、T258S、A262S、H264M、I298V、Y321L、T400L、Y412F、L420K、A422G、P423G、P423R、P423V、G457S、A491V、K5P、K5S、K5T、K5Y、K5Q、K5N、K5H、E68K、E68Y、E68S、S188T、S188H、Y321W、Q419P、A422S、R7C、E11S、L19I、C26N、T31N、V42I、I44V、R49H、D53N、Y55F、T57S、I69L、S72A、V73F、T78K、L79D、L79Y、E85Q、N86Q、V88I、T89S、A92T、Y93K、L94V、V97I、S103D、D106T、D118N、M119E、A125P、M141L、Y145A、L149I、N150D、A153S、T155A、N168S、V170I、A171T、G178T、Y179F、P186E、A195V、S204N、T205A、A208T、K209R、S213T、H214C、T219S、V220Q、I224V、Y227F、A246S、S247G、A256V、T261A、T261G、S306A、A307E、D309S、L311V、A317P、V342I、L347N、E348I、T352S、V353I、S355D、T362Q、L364I、T370V、A374N、E381N、S382D、T388Q、A391G、F394Y、V395L、Q399E、T400K、A407S、Q418T、S434T、T436S、E437A、D440Q、G446S、S452A、V453S、A460S、A469S、A470T、S472T、G475V、T476W、G478S、L492P和L9P。
在一个另外的实施方案中，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述变体葡糖淀粉酶包含氨基酸取代S188H/Y321W/Q419P并且还包含选自以下的至少一个氨基酸：N27A、S36P、A38V、A39F、S46T、P47T、S50Q、V65I、E68N、L79F、T89N、T98S、A108S、P121S、F122M、G124P、G124S、G124T、G158S、Q161P、S188P、S188W、T192A、K212Y、S215A、T258S、A262S、H264M、I298V、Y321L、Y321F、T400L、Y412F、L420K、A422G、P423G、P423R、P423V、G457S、A491V、K5P、K5S、K5T、K5Y、K5Q、K5N、K5H、E68K、E68Y、E68S、S188T、A422S、R7C、E11S、L19I、C26N、T31N、V42I、I44V、R49H、D53N、Y55F、T57S、I69L、S72A、V73F、T78K、L79D、L79Y、E85Q、N86Q、V88I、T89S、A92T、Y93K、L94V、V97I、S103D、D106T、D118N、M119E、A125P、M141L、Y145A、L149I、N150D、A153S、T155A、N168S、V170I、A171T、G178T、Y179F、P186E、A195V、S204N、T205A、A208T、K209R、S213T、H214C、T219S、V220Q、I224V、Y227F、A246S、S247G、A256V、T261A、T261G、S306A、A307E、D309S、L311V、A317P、V342I、L347N、E348I、T352S、V353I、S355D、T362Q、L364I、T370V、A374N、E381N、S382D、T388Q、A391G、F394Y、V395L、Q399E、T400K、A407S、Q418T、S434T、T436S、E437A、D440Q、G446S、S452A、V453S、A460S、A469S、A470T、S472T、G475V、T476W、G478S、L492P和L9P。
在一些实施方案中，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中前蛋白包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11的序列。
在另一个实施方案中，本发明提供了编码包含信号肽的前蛋白和成熟蛋白的核酸，
其中所述信号肽为SEQ ID NO:26或与SEQ ID NO:26相比的变体信号肽，并且所述变体信号肽在选自-20、-18、-17、-15、-13、-12、-10、-9、和-1的位置编号处具有至少一个氨基酸取代；并且
其中所述成熟蛋白具有SEQ ID NO:13或为与SEQ ID NO:13相比的变体葡糖淀粉酶，其中所述变体葡糖淀粉酶在选自以下的位置编号处具有至少一个氨基酸取代：5、27、36、38、39、46、47、50、65、68、79、89、98、108、121、122、124、158、161、188、192、212、215、258、262、264、298、321、400、412、419、420、422、423、457、491、497、498、503、508、509、510、516、518、521、522、526、533、534、535、540、542、544、545、549、550、551、555、556、557、559、563、564、569、570、581、584；7、9、11、19、26、31、42、44、49、53、55、57、69、72、73、78、85、86、88、92、93、94、97、103、106、118、119、125、141、145、149、150、153、155、168、170、171、178、179、186、195、204、205、208、209、213、214、219、220、224、227、246、247、256、261、306、307、309、311、317、342、347、348、352、353、355、362、364、370、374、381、382、388、391、394、395、399、407、418、434、436、437、440、446、452、453、460、469、470、472、475、476、478和492；并且所述前蛋白与SEQ ID NO:1至少95％相同；并且其中所述前蛋白不为SEQ ID NO:1。
在另一实施方案中，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述前蛋白表现出与SEQ ID NO:1至少96％、97％、98％或99％的同一性。
在另一实施方案中，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述变体信号肽在所述位置中的一个、所述位置中的两个、所述位置中的三个、所述位置中的四个或所述位置中的五个处具有氨基酸取代。
在另一实施方案中，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述变体葡糖淀粉酶在所述位置中的一个、所述位置中的两个、所述位置中的三个、所述位置中的四个、所述位置中的五个、所述位置中的六个、所述位置中的七个、所述位置中的八个、所述位置中的九个、所述位置中的十个、所述位置中的十一个、所述位置中的十二个或所述位置中的十三个处具有氨基酸取代。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述变体信号肽具有选自以下的氨基酸取代：V-20A、V-20F、V-20G、V-20I、V-20K、V-20L、V-20M、V-20Q、V-20R、V-20T、V-20W、L-18F、L-18I、L-18Y、K-17F、K-17N、K-17Y、A-15F、A-15I、A-15L、A-15V、A-13T、A-12V、T-10F、T-10V、W-9Y和V-1F。
在另一些实施方案中，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述变体葡糖淀粉酶具有选自以下的氨基酸取代：K5H、K5N、K5P、K5Q、K5S、K5T、K5Y、N27A、S36P、A38V、A39F、S46T、P47T、S50Q、V65I、E68K、E68N、E68S、E68Y、L79F、T89N、T98S、A108S、P121S、F122M、G124P、G124S、G124T、G158S、Q161P、S188H、S188P、S188T、S188W、T192A、K212Y、S215A、T258S、A262S、H264M、I298V、Y321F、Y321L、Y321W、T400L、Y412F、Q419P、L420K、A422G、A422S、P423G、P423R、P423V、G457S、A491V、E497V、L498T、Y503D、Y503E、Y503G、Y503K、Y503L、Y503N、Y503S、Y503T、K508N、K508S、K508T、L509P、V510G、V510S、F516L、S518I、S518L、S518M、P521S、S522G、L526I、L526N、L526S、T533R、A534T、S535Y、T540N、T542N、S544E、S544N、S544Q、V545A、V545D、S549D、S549E、T550D、V551D、V551R、V551S、F555D、F555K、F555L、F555N、F555R、F555S、I556D、I556P、I556R、R557P、G559N、G559S、S563L、I564N、I564S、I564T、G569I、N570P、T581N、T584N、R7C、E11S、L19I、C26N、T31N、V42I、I44V、R49H、D53N、Y55F、T57S、I69L、S72A、V73F、T78K、L79D、L79Y、E85Q、N86Q、V88I、T89S、A92T、Y93K、L94V、V97I、S103D、D106T、D118N、M119E、A125P、M141L、Y145A、L149I、N150D、A153S、T155A、N168S、V170I、A171T、G178T、Y179F、P186E、A195V、S204N、T205A、A208T、K209R、S213T、H214C、T219S、V220Q、I224V、Y227F、A246S、S247G、A256V、T261A、T261G、S306A、A307E、D309S、L311V、A317P、V342I、L347N、E348I、T352S、V353I、S355D、T362Q、L364I、T370V、A374N、E381N、S382D、T388Q、A391G、F394Y、V395L、Q399E、T400K、A407S、Q418T、S434T、T436S、E437A、D440Q、G446S、S452A、V453S、A460S、A469S、A470T、S472T、G475V、T476W、G478S、L492P和L9P。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述变体葡糖淀粉酶具有选自以下的氨基酸取代：K5H、K5N、K5P、K5Q、K5S、K5T、K5Y、N27A、S36P、A38V、A39F、S46T、P47T、S50Q、V65I、E68K、E68N、E68S、E68Y、L79F、T89N、T98S、A108S、P121S、F122M、G124P、G124S、G124T、G158S、Q161P、S188H、S188P、S188T、S188W、T192A、K212Y、S215A、T258S、A262S、H264M、I298V、Y321F、Y321L、Y321W、T400L、Y412F、Q419P、L420K、A422G、A422S、P423G、P423R、P423V、G457S、A491V、E497V、L498T、Y503D、Y503E、Y503G、Y503K、Y503L、Y503N、Y503S、Y503T、K508N、K508S、K508T、L509P、V510G、V510S、F516L、S518I、S518L、S518M、P521S、S522G、L526I、L526N、L526S、T533R、A534T、S535Y、T540N、T542N、S544E、S544N、S544Q、V545A、V545D、S549D、S549E、T550D、V551D、V551R、V551S、F555D、F555K、F555L、F555N、F555R、F555S、I556D、I556P、I556R、R557P、G559N、G559S、S563L、I564N、I564S、I564T、G569I、N570P、T581N、T584N、L9P、E11S、L19I、V42I、D53N、T57S、I69L、L79Y、V88I、T89S、D118N、M119E、M141L、N168S、A195V、T261A、L311V、A317P、L347N、E348I、S355D、L364I、E381N、S382D、T388Q、F394Y、V395L和S434T。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述前蛋白具有选自以下的氨基酸取代：S188H/Y321W/Q419P、T98S/Q161P/F516L、T98S/Q161P/N570P、T98S/Q161P、T550D/F555S、V-20A/T258S、V65I/Y412F/Y503S/S518I、Y412F/Y503S/I564T、Y412F/Y503E、Y412F/Y503E/S518I、V65I/Y412F/Y503S、V65I/Y503E、Y503D/S518I/I564N、Y503E/S518L、V65I/Y503E/S544Q、V65I/Y503S、Y503E/S544E、V65I/Y503E/S544E/I564N、V65I/Y412F/Y503E、Y503E/S518I/S544Q、V65I/Y503E/S518M、Y412F/S518L、Y503E/S544Q、V65I/Y412F/Y503E/S544E/I564T/G569I、Y412F/Y503S、Y503E/I564T、S549D/F555D/G559N、S549D/F555R、K508T/L526N/S549D/G559N、K508T/G559N、F555D/I556P/G559N、S549D/F555R/I556P/G559N、F555R/I556P、L526I/F555R/I556P、F555R/I556P/G559N、K508T/I556P/G559N、F555D/I556P、K508T/L526N/A534T/S549D/I556P、K508T/L526I/S549D/G559N、K508N/L526I/S549E/F555L/G559N、L526N/S549D/F555D/I556P、L526I/F555D/G559N、A38V/F555R、A39F/T540N/T542N、L498T/T542N/T581N/T584N、T542N/T581N/T584N、S535Y/T542N、T540N/T584N、T540N/T542N/T581N/T584N、L498T/T581N/T584N、L498T/T584N、L498T/T542N/T581N、P121S/T542N/T584N、L498T/T542N、S535Y/T540N/T542N/T581N、Q419P/P423R、L79F/Q419P、Q419P/P423V、Q419P/P423R/T533R、S36P/Q419P、Q419P/P423G、S36P/T400L/Q419P/P423G、S50Q/Q419P/P423R、S50Q/Q419P/P423R/G457S/E497V/P521S、V-20R/A-15I、A-15F/S188T、V-20F/A-15I/Y321F/A422S、V-20F/A-15F/S188H/Q419P、A-15F/K5H/Y321W、A-15F/K5N/Y321F、V-20F/Y321F、V-20F/A-15I、A-15F/K5P/S188H、V-20F/E68S/S188H/A422S、V-20F/S188T/Y321F/Q419P/A422S、V-20F/K5H/S188H/Y321F/A422S、V-20F/A422S、A-15I/S188H/Y321W/Q419P、A-15F/S188H/A422S、V-20F/S188H/A422S/V545A、V-20F/A-15I/Q419P、V-20F/K5Q/A422S、V-20R/A-15I/K5S/E68K/Y321W、A-15F/K5H/Y321F/A422S、V-20F/A-15F/K5N、V-20F/S188H/Y321W/Q419P、A-15I/Y321F、A-15F/K5Y/A422S、V-20F/A-15F/Q419P/A422S、V-20F/K5Y/S188H/A422S、V-20T/A-15I/K5T/A422S、V-20T/A-15I/K5T/Y321W、V-20R/A-15F/Y321W/A422S、A-15F/A-13T、V-20F/Q419P/A422S、A-15I/K5P/Y321F、V-20F/A-15F/Y321W、V-20F/A-15F/K5H/S188H/Y321F/A422S、A-15I/E68K/A422S、Y321F/A422S、V-20T/A-15F/K5H/Y321F、V-20T/A-15I/K5T/Y321F/Q419P/A422S、K5T/E68Y/S188T、K5S/E68Y/S188H、K5N/S188H、K5T/E68S/S188T、K5H/E68Y/S188P、K5P/E68Y/S188T、K5T/E68K/S188H、K5P/E68K/S188T、K5H/E68Y/S188T、K5T/S188H、K5T/E68N/S188T、K5Y/E68Y/S188T、K5S/E68Y/S188T、K5Q/E68K/S188H、K5P/E68N/S188H、K5P/E68N/S188T、K5P/E68Y/S188H、K5Y/E68Y/S188H、K5S/S188T、K5H/E68N/S188H、K5P/S188H、K5H/S46T/E68K/S188H、K5H/E68K/S188T、K5Q/E68Y/S188T、K5Y/E68N/S188H、V42I/S188H/A195V/Y412F/Q419P、L19I/V42I/E68Y/N168S/S188H/A195V/Y412F、E11S/V42I/T57S/D118N/N168S/S188H/A195V/L311V、E11S/V42I/D53N/E68Y/N168S/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/L19I/V42I/I69L/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/L19I/V42I/E68Y/D118N/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/L19I/T57S/M119E/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/V42I/A317P/Y412F/Q419P、L19I/T57S/I69L/D118N/N168S/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F/Y412F/Q419P、E11S/E68Y/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/L19I/V42I/E68Y/I69L/D118N/N168S/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/L19I/V42I/S188H/A195V/L311V/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/L19I/N168S/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F/Y412F、E11S/V42I/E68Y/Y412F、E11S/L19I/V42I/E68Y/Y412F、E11S/V42I/E68Y/S188H/A195V/Y412F、E11S/L19I/V42I/T57S/I69L/S188H/A195V/L311V/Y321W/Y412F、E11S/L19I/D53N/E68Y/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/V42I/E68Y/S188H/A195V/L311V/Y321W/Y412F、E11S/V42I/E68Y/S188H/L311V/Y412F/Q419P、E11S/L19I/V42I/E68Y/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/L19I/D53N/I69L/S188H/A195V/L311V/Q419P、E11S/V42I/E68Y/N168S/L311V/A317P/Y321W/Y412F、E11S/E68Y/I69L/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F/Y412F、E11S/V42I/T57S/E68Y/I69L/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F、E11S/D53N/T57S/L311V/Y321F/Y412F/Q419P、E11S/L19I/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/L19I/I69L/S188H/A195V/L311V/A317P、E11S/V42I/I69L/N168S/S188H/A195V/L311V/A317P/Y412F/Q419P、E11S/V42I/E68Y/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/V42I/I69L/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F/Y412F、E11S/Y412F、E11S/L19I/V42I/E68Y/I69L/S188H/A195V/Y412F、E11S/L19I/V42I/D53N/T57S/S188H/A195V/L311V/Y321W/Y412F、V42I/E68Y/Y412F、E11S/L19I/V42I/D53N/T57S/E68Y/I69L/N168S/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F、E11S/L19I/V42I/D53N/T57S/I69L/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321W/Y412F、E11S/V42I/A317P/Y321F、E11S/V42I/T57S/E68Y/D118N/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/L19I/V42I/E68Y/I69L/D118N/N168S/S188H/A195V/L311V/Y412F/Q419P、E11S/V42I/D53N/E68Y/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/I69L/D118N/S188H/A195V/L311V/Y412F、V42I/D53N/T57S/E68Y/M141L/N168S/T261A/Y321W/E381N/Y412F、E11S/V42I/S188H/L347N/Y412F/S434T、D53N/T57S/E68Y/D118N/M119E/L311V/E348I/Y412F、D118N/N168S/S188H/L347N/E348I/S382D/T388Q/V395L、E68Y/I69L/N168S/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/E68Y/V88I/A317P/Y321F/S355D、D53N/I69L/L79Y/M119E/T261A/L311V/L347N/E348I/Q419P、V42I/E68Y/I69L/D118N/M119E/M141L/L311V/A317P/Y321F/L347N、E11S/L19I/E68Y/I69L/L79Y/M141L/N168S/T261A/A317P/Y321W/L347N、E11S/V42I/E68Y/I69L/L311V/Y321W/S434T、E11S/V42I/D53N/N168S/L311V/A317P/Y321W、E11S/E68Y/I69L/D118N/N168S/Y321F/Y412F、V42I/D53N/T57S/L311V/Y321W/S355D/Y412F/Q419P、V42I/E68Y/L311V/L347N/L364I/Y412F、E11S/D118N/M119E/M141L/L311V/Y321W/L347N、V42I/D53N/T57S/M119E/M141L/A317P/Y321F/Q419P、T57S/I69L/T89S/S188H/A195V/T261A/L311V/A317P/Y321W/F394Y/Y412F、Y321F/Y412F、V42I/T57S/E68Y/I69L/T89S/M119E/T261A/A317P/Y412F/S434T、E11S/V42I/E68Y/L311V/A317P/S434T、V42I/D53N/T57S/E68Y/I69L/S434T、V42I/E68Y/Y321W、L311V/L347N/E348I/S355D/L364I/S434T、E11S/D53N/T57S/E68Y/V88I/T89S/M119E/A317P/Y321W、D53N/E68Y/I69L/T89S/L311V/A317P/S355D/Q419P、V42I/E68Y/A317P/Y321F/Y412F、L19I/I69L/T89S/L311V/A317P/Y321F/S355D/L364I/Y412F、V42I/D53N/T57S/E68Y/I69L/M141L/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F/Y412F/S434T、T57S/V88I/A317P/Y321W/Q419P、E11S/L19I/V42I/D53N/E68Y/L311V/A317P/Y321W/Y412F、E11S/V42I/D53N/E68Y/I69L/S188H/A195V/E348I、L19I/V42I/T57S/I69L/V88I/M119E/T261A/A317P/Y321F/Y412F、D53N/E68Y/D118N/M119E/M141L/T261A/L347N/E348I/S355D/L364I/S434T、E11S/T261A/L347N/E348I/S355D/S434T、M119E/S188H/E348I、E11S/A317P/Y321F/L347N、E11S/E68Y/I69L/T261A/L364I、D118N/M119E/N168S/S188H/A195V/L311V/Y321W/L347N/F394Y、E11S/L311V/Y321W/E348I/S355D/L364I/Y412F、V42I/D53N/T57S/I69L/V88I/L347N/E348I/F394Y/V395L/S434T、E11S/D53N/T89S/N168S/S188H/T261A/L311V/A317P/Y321W/S355D/Y412F、L19I/V42I/D53N/L79Y/T89S/N168S/T261A/L311V/Y321W/Y412F/Q419P/S434T、L79Y/V88I/D118N/M119E/T261A/Y321F/L364I/Y412F、V42I/E68Y/T89S/M141L/T261A/L311V/Y321F/E348I/L364I、V42I/E68Y/D118N/S188H/T261A/Y412F/S434T、E11S/D53N/E68Y/I69L/T89S/Y321W/E348I/S355D、M119E/L311V/Y321F、L311V/L347N/E348I、E11S/V42I/A317P/Y321F/L347N/Y412F、E11S/L19I/V42I/E68Y/A317P/Y321F/L364I/Y412F、D53N/E68Y/T89S/T261A、I69L/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321W/V395L/Y412F、V42I/D53N/E68Y/V88I/T89S/D118N/L311V/Y412F/S434T、E11S/V42I/E68Y/I69L/L311V/E348I、V42I/Y321W、E68Y/T261A/L311V/L347N/E348I/S434T、E11S/E68Y/I69L/L79Y、V42I/D53N/E68Y/S188H/A195V/T261A/L311V/Y321F/S355D/S434T、L19I/V42I/S188H/A195V/S382D/V395L/Q419P、E11S/L19I/V42I/D53N/T57S/M119E/L311V/Y321W/L347N/F394Y/Y412F、L9P/E11S/D53N/T57S/E68Y/M119E/M141L/E348I/Y412F和L19I/V42I/I69L/L311V/Y321W/L347N。
在另一实施方案中，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述变体葡糖淀粉酶具有氨基酸取代Y321F。
在一个另外的实施方案中，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述变体葡糖淀粉酶具有氨基酸取代S188H/Y321W/Q419P。
在另一实施方案中，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述变体葡糖淀粉酶包含氨基酸取代Y321F，并且还包含选自以下的至少一个氨基酸取代：K5H、K5N、K5P、K5Q、K5S、K5T、K5Y、N27A、S36P、A38V、A39F、S46T、P47T、S50Q、V65I、E68K、E68N、E68S、E68Y、L79F、T89N、T98S、A108S、P121S、F122M、G124P、G124S、G124T、G158S、Q161P、S188H、S188P、S188T、S188W、T192A、K212Y、S215A、T258S、A262S、H264M、I298V、Y321L、Y321W、T400L、Y412F、Q419P、L420K、A422G、A422S、P423G、P423R、P423V、G457S、A491V、E497V、L498T、Y503D、Y503E、Y503G、Y503K、Y503L、Y503N、Y503S、Y503T、K508N、K508S、K508T、L509P、V510G、V510S、F516L、S518I、S518L、S518M、P521S、S522G、L526I、L526N、L526S、T533R、A534T、S535Y、T540N、T542N、S544E、S544N、S544Q、V545A、V545D、S549D、S549E、T550D、V551D、V551R、V551S、F555D、F555K、F555L、F555N、F555R、F555S、I556D、I556P、I556R、R557P、G559N、G559S、S563L、I564N、I564S、I564T、G569I、N570P、T581N、T584N、R7C、E11S、L19I、C26N、T31N、V42I、I44V、R49H、D53N、Y55F、T57S、I69L、S72A、V73F、T78K、L79D、L79Y、E85Q、N86Q、V88I、T89S、A92T、Y93K、L94V、V97I、S103D、D106T、D118N、M119E、A125P、M141L、Y145A、L149I、N150D、A153S、T155A、N168S、V170I、A171T、G178T、Y179F、P186E、A195V、S204N、T205A、A208T、K209R、S213T、H214C、T219S、V220Q、I224V、Y227F、A246S、S247G、A256V、T261A、T261G、S306A、A307E、D309S、L311V、A317P、V342I、L347N、E348I、T352S、V353I、S355D、T362Q、L364I、T370V、A374N、E381N、S382D、T388Q、A391G、F394Y、V395L、Q399E、T400K、A407S、Q418T、S434T、T436S、E437A、D440Q、G446S、S452A、V453S、A460S、A469S、A470T、S472T、G475V、T476W、G478S、L492P和L9P。
在一个另外的实施方案中，本发明提供了编码本文所述的前蛋白的核酸，其中所述变体葡糖淀粉酶包含氨基酸取代S188H/Y321W/Q419P，并且还包含选自以下的至少一个氨基酸取代：K5H、K5N、K5P、K5Q、K5S、K5T、K5Y、N27A、S36P、A38V、A39F、S46T、P47T、S50Q、V65I、E68K、E68N、E68S、E68Y、L79F、T89N、T98S、A108S、P121S、F122M、G124P、G124S、G124T、G158S、Q161P、S188P、S188T、S188W、T192A、K212Y、S215A、T258S、A262S、H264M、I298V、Y321F、Y321L、T400L、Y412F、L420K、A422G、A422S、P423G、P423R、P423V、G457S、A491V、E497V、L498T、Y503D、Y503E、Y503G、Y503K、Y503L、Y503N、Y503S、Y503T、K508N、K508S、K508T、L509P、V510G、V510S、F516L、S518I、S518L、S518M、P521S、S522G、L526I、L526N、L526S、T533R、A534T、S535Y、T540N、T542N、S544E、S544N、S544Q、V545A、V545D、S549D、S549E、T550D、V551D、V551R、V551S、F555D、F555K、F555L、F555N、F555R、F555S、I556D、I556P、I556R、R557P、G559N、G559S、S563L、I564N、I564S、I564T、G569I、N570P、T581N、T584N、R7C、E11S、L19I、C26N、T31N、V42I、I44V、R49H、D53N、Y55F、T57S、I69L、S72A、V73F、T78K、L79D、L79Y、E85Q、N86Q、V88I、T89S、A92T、Y93K、L94V、V97I、S103D、D106T、D118N、M119E、A125P、M141L、Y145A、L149I、N150D、A153S、T155A、N168S、V170I、A171T、G178T、Y179F、P186E、A195V、S204N、T205A、A208T、K209R、S213T、H214C、T219S、V220Q、I224V、Y227F、A246S、S247G、A256V、T261A、T261G、S306A、A307E、D309S、L311V、A317P、V342I、L347N、E348I、T352S、V353I、S355D、T362Q、L364I、T370V、A374N、E381N、S382D、T388Q、A391G、F394Y、V395L、Q399E、T400K、A407S、Q418T、S434T、T436S、E437A、D440Q、G446S、S452A、V453S、A460S、A469S、A470T、S472T、G475V、T476W、G478S、L492P和L9P。
在一些实施方案中，本发明提供了本文所述的编码前蛋白的核酸，其中前蛋白包含具有SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的序列。
在该上下文中，针对特定宿主生物体及其通常优选的氨基酸密码子进行“密码子优化”；也就是说，与酵母产生生物体相比，宿主产生生物体(例如曲霉属(Aspergillus)物种)使用曲霉属优选的密码子可以得到更高的翻译和/或分泌。
在一些实施方案中，本发明提供了本文所述的核酸，其中所述核酸针对宿主生物体进行密码子优化以在所述生物体中表达变体葡糖淀粉酶。
在一些实施方案中，组合物富含本发明的这样的编码变体葡糖淀粉酶的核酸。术语“富含”表示能够从该组合物获得的葡糖淀粉酶活性已经增加，例如，富集因子为至少1。在一些实施方案中，组合物被配制以提供期望的特性，例如色浅、气味低、可接受的储存稳定性。
1.变体的制备
通常可以使用熟知的技术通过构建编码蛋白质序列的基因来制备变体，包括亲本基因的定点诱变和合成基因构建。
i.调控序列
本发明还涉及核酸构建体，其包含可操作连接至一个或更多个控制序列的编码本发明变体的多核苷酸，该一个或更多个控制序列在合适的宿主细胞中在与控制序列相容的条件下指导编码序列的表达。控制序列可以包括启动子，被宿主细胞识别以表达多核苷酸的多核苷酸。启动子包含介导变体表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。如本领域技术人员将理解的，启动子的确切长度是未知的，启动子通常位于基因的转录位点附近，并且可以在约100至1000个碱基对长的任何位置上。因此，出于本文概述的目的，启动子包括图中所示序列的至少100个上游碱基对。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适的启动子的实例是从曲霉属物种基因(如本领域已知的，包括构巢曲霉(A.nidulans)、黑曲霉和米曲霉(A.oryzae))及根毛霉属(Rhizomucor)物种基因(例如米黑根毛霉(R.miehei))、木霉属(Trichoderma)物种基因(包括里氏木霉(T.reesei))、镰孢属(Fusarium)物种基因(包括镶片镰孢(F.venenatum))获得的启动子。来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的包含酵母控制序列的启动子也是熟知的。
来自这些物种的合适的启动子序列(及其他控制序列)包括来自如本领域中已知的的淀粉酶(特别是α-淀粉酶)、葡糖淀粉酶、蛋白酶、磷酸酶、内切葡聚糖酶、纤维素酶等的启动子。此外，对于密码子优化，可以期望使用宿主产生菌株内源的与编码变体葡糖淀粉酶的核酸可操作连接的启动子(及其他控制序列)。在许多实施方案中，可操作附着至编码序列的启动子不是天然的Thielaviopsis punctuala启动子序列。
控制序列也可以是转录终止子，其被宿主细胞识别以终止转录。终止子序列可操作连接至编码变体的多核苷酸的3'-末端。可以使用在宿主细胞中起作用的任何终止子。
在一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞的终止子(及其他控制序列，例如启动子)是从构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖孢镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶的基因获得的。
在一些实施方案中，酵母宿主细胞的终止子是从酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因获得的。
控制序列也可以是在基因的启动子下游和编码序列上游的mRNA稳定剂区域，其增加了该基因的表达。
合适的mRNA稳定剂区域的实例从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensi)cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SP82基因(Hue等,1995,Journal of Bacteriology 177:3465-3471)获得。
控制序列也可以是前导序列，对宿主细胞的翻译很重要的mRNA的非翻译区。前导序列与编码变体的多核苷酸的5'-末端可操作连接。可以使用在宿主细胞中起作用的任何前导序列。
在一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞的前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉三糖磷酸异构酶的基因获得的。
在一些实施方案中，酵母宿主细胞的合适的前导序列是从酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母酒精脱氢酶/甘油醛3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因获得的。
控制序列也可以是多腺苷酸化序列，与编码变体的序列的3'-末端可操作连接的序列，并且在转录时被宿主细胞识别为向转录的mRNA中添加多腺苷残基的信号。可以使用在宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列。
在一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞的多腺苷酸化序列是从构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶的基因获得的。
控制序列也可以是信号肽编码区，其编码与变体的N-末端连接的信号肽并且指导变体葡糖淀粉酶表达到细胞的分泌途径中。在一些实施方案中，信号肽序列为如SEQ IDNO:26所示的野生型信号肽序列。在一些实施方案中，信号肽为与SEQ ID NO:26相比的变体信号肽，并且该变体信号肽表现出与SEQ ID NO:26至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性。在一些实施方案中，信号肽为与SEQ ID NO:26相比的变体信号肽，并且该变体信号肽包含位于选自以下位置编号处的至少一个氨基酸取代：-20、-18、-17、-15、-13、-12、-10、-9和-1。在一些实施方案中，信号肽为与SEQ ID NO:26相比的变体信号肽，并且该变体信号肽在所述位置中的一个、所述位置中的两个、所述位置中的三个、所述位置中的四个、所述位置中的五个、所述位置中的六个、所述位置中的七个或所述位置中的八个处具有氨基酸取代。在一些实施方案中，信号肽为与SEQ ID NO:26相比的变体信号肽，并且该变体信号肽具有选自以下的氨基酸取代：V-20A、V-20F、V-20G、V-20I、V-20K、V-20L、V-20M、V-20Q、V-20R、V-20T、V-20W、L-18F、L-18I、L-18Y、K-17F、K-17N、K-17Y、A-15F、A-15I、A-15L、A-15V、A-13T、A-12V、T-10F、T-10V、W-9Y和V-1F。
丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、胎毛腐质霉(Humicola lanuginosa)脂酶和米黑根毛菌(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶的基因获得的。
用于酵母宿主细胞的有用信号肽是从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得的。其他有用的信号肽编码序列由Romanos等,1992描述的，同上。
在同时存在信号肽和前肽序列的情况下，前肽序列位于变体的N-末端附近，而信号肽序列位于前肽序列的N-末端附近。
还可以期望添加调控序列，其相对于宿主细胞的生长来调节变体的表达。调控系统的实例为响应化学或物理刺激(包括调控化合物的存在)而导致基因表达开启或关闭的那些系统。原核系统中的调控系统包括lac、tac、trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用来自子囊菌(例如曲霉)的Gpd(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调控序列的其他实例为允许基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调控序列包括在氨甲蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因和在重金属下扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该变体的多核苷酸与调控序列可操作连接。
2.表达载体
本发明还涉及重组表达载体，其包含编码本发明变体、启动子及转录和翻译终止信号的多核苷酸。多种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或更多个方便的限制性位点，以允许在这样的位点插入或取代编码该变体的多核苷酸。或者，可以通过将多核苷酸或包含多核苷酸的核酸构建体插入适当的表达载体中来表达多核苷酸。在创建表达载体时，编码序列位于载体中，从而使编码序列与适当的表达控制序列可操作连接。
重组表达载体可以是可以方便地进行重组DNA程序并可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择通常取决于载体与将载体引入其中的宿主细胞的相容性。载体可以为线性或封闭的环状质粒。
载体可以是自主复制的载体，即以染色体外实体存在的载体，其复制与染色体复制无关，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以包含确保自我复制的任何工具。或者，该载体可以是当引入宿主细胞时整合到基因组中并与整合它的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单个载体或质粒，或者两个或更多个载体或质粒，其一起包含待引入宿主细胞的基因组或转座子中的总DNA。考虑与本发明的方法一起使用的载体包括整合载体和非整合载体。
在一些实施方案中，载体包含一个或更多个选择标志物，其允许轻松选择经转化的、经转染的、经转导的等细胞。在许多实施方案中，选择基因编码对抗生素(例如氨苄青霉素、氨苄青霉素、氯霉素、潮霉素、四环素或卡那霉素等)的抗性。
在一些实施方案中，本发明提供了包含本文所述的核酸的表达载体。
用于酵母宿主细胞的合适的标志物包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择标志物包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨基甲酰基转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(奥罗替丁-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合成酶)及其等效物。优选用于曲霉细胞的为构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌bar基因。
在一些实施方案中，载体包含允许将载体整合到宿主细胞基因组中或使载体在细胞中独立于基因组自主复制的元件。
为了整合到宿主细胞基因组中，载体可以依靠编码变体的多核苷酸序列或载体的任何其他元件用以通过同源或非同源重组整合到基因组中。或者，载体可以包含另外的多核苷酸，用于通过同源重组在染色体中的精确位置处指导整合到宿主细胞的基因组中。为了增加在精确位置进行整合的可能性，整合元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对以及800至10,000个碱基对，其与相应的靶序列具有高度的序列同一性，以提高同源重组的可能性。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码的或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，载体还可以包含复制起点，使载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制。复制起点可以是任何介导在细胞中起作用的自主复制的质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例为2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合以及ARS4和CEN6的组合。
用于丝状真菌细胞的复制起点的实例为AMA1和ANSI(Gems等,1991,Gene 98:61-67；Cullen等,,1987,Nucleic Acids Res.15:9163-9175；WO 00/24883)。可以根据WO 00/24883中公开的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。
本发明的多核苷酸的多于一个拷贝可以插入宿主细胞中以增加变体的产生，包括在载体中使用编码变体葡糖淀粉酶的多个基因，将多个载体转化到细胞中，或载体多次整合到基因组中。可以通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或通过将可扩增的选择标志物基因与多核苷酸一起包含在其中包含选择标志物基因的扩增拷贝的细胞中来获得多核苷酸的拷贝数的增加，因此可以通过在合适的选择剂存在下培养细胞来选择多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等，1989，同上)。
C.特定构建体
为了在酿酒酵母中表达，我们使用了酿酒酵母INSCV1菌株(ThermoFisherScientific，美国：目录号V8251-20)和pYES2/CT载体(ThermoFisher Scientific，美国：目录号V8251-20)。为了在巴斯德毕赤酵母中表达，我们使用了X33毕赤酵母菌株和pPiCZαA载体(EasySelect Pichia表达试剂盒，life technologies的Invitrogen)。全部都可商购，并且也在以下实施例中讨论。
1.密码子优化
为了优化在所用宿主细胞中的表达，密码子优化可以与本发明的任何变体葡糖淀粉酶一起使用。这样的方法是本领域熟知的，并且在例如WO 2007/142954中描述。在异源表达系统中，优化步骤可以提高宿主产生期望变体葡糖淀粉酶的能力。蛋白质表达受宿主因素控制，包括影响转录、mRNA加工、翻译的稳定性和起始的那些。多核苷酸优化步骤可以包括提高宿主产生外源蛋白的能力的步骤，以及协助研究人员有效设计表达构建体的步骤。优化策略可以包括，例如，翻译起始区的修饰、mRNA结构元件的改变以及使用不同的密码子偏倚。
在一些实施方案中，降低的异源蛋白表达通过干扰二级结构发生。二级结构可以隔离RBS序列或起始密码子，并且已经与蛋白质表达的降低相关。Stemloop结构也可以参与转录暂停和减弱。优化的多核苷酸序列可以在RBS和核苷酸序列的基因编码区中包含最小的二级结构以允许改善的转录和翻译。
在一些实施方案中，限制性位点可以影响异源蛋白质表达。通过修饰可干扰转录单位随后亚克隆到宿主表达载体中的限制性位点，可以优化多核苷酸序列。
在一些实施方案中，优化的核酸序列可以表达本发明的变体葡糖淀粉酶，其水平为通过未优化的核酸序列表达的水平的至少110％、150％、200％、500％、1,000％、5,000％或甚至10,000％。
D.宿主细胞和产生菌株
如本领域技术人员将理解的，存在用于重组产生本发明的变体葡糖淀粉酶的各种各样的产生宿主生物体，包括但不限于细菌细胞和真菌细胞(包括酵母)。
本发明还涉及重组宿主细胞，其包含编码本发明的变体葡糖淀粉酶的多核苷酸，该多核苷酸可操作连接至指导本发明的变体产生的一个或更多个控制序列。如前所述，将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞，使得该构建体或载体保持为染色体整合体或自我复制的染色体外载体。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码变体的基因和宿主产生生物体得到经表达和/或分泌的蛋白的高蛋白滴度的能力。在一些实施方案中，宿主细胞表现出变体葡糖淀粉酶的瞬时表达。在一些实施方案中，宿主细胞为经稳定转染的宿主或稳定地(即永久地)表达变体葡糖淀粉酶的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞为产生宿主细胞。如本领域所熟知的，用包含本发明的变体葡糖淀粉酶的编码区的表达载体对宿主细胞进行转化和/或转染(参见Sambrook等)。
在一些实施方案中，本发明提供了包含本文所述的核酸的宿主细胞。在一些实施方案中，本发明提供了包含本文所述的表达载体的宿主细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了本文所述的宿主细胞，其中宿主细胞选自细菌细胞、真菌细胞核酵母细胞。
宿主细胞可以为可用于重组产生变体(例如原核生物或真核生物)的任何细胞。这样的宿主细胞包括但不限于细菌、真菌和酵母细胞。宿主细胞也可以为真核生物，例如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
宿主细胞可以为真菌细胞。如本文所用，“真菌”包括子囊菌门(phylaAscomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有丝孢真菌(如Hawksworth在Ainsworth andBisby's Dictionary of The Fungi,第8版,1995,CAB International,UniversityPress,Cambridge,UK中所定义的)。在许多情况下，宿主细胞包括曲霉属物种，包括构巢曲霉、黑曲霉和米曲霉以及根毛霉属物种(例如米黑根毛霉)、木霉属物种(包括里氏木霉)和镰饱属物种基因(包括镶片镰孢)。丝状真菌宿主细胞可以为顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管菌属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)、或木霉属细胞。例如，丝状真菌宿主细胞可以为泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、卡盖尔拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡菌(Ceriporiopsis gilvescens)、培宁辛达拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、Ceriporiopsis rivulosa、浅红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、Chrysosporiuminops、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、带纹金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusariumreticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusariumtrichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、特异腐质霉、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebiaradiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、长柔毛栓孔菌(Trametes villosa)、云芝栓孔菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。
在一些实施方案中，真菌宿主细胞可以为酵母细胞。如本文所用，“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenousyeast)(内孢霉目(Endomycetales)、产担子酵母(basidiosporogenousyeast)和属于半知菌类(FungiImperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。酵母宿主细胞可以为假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)细胞，例如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔斯伯酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
E.蛋白质组合物
本发明还提供了包含本发明的变体葡糖淀粉酶的组合物。在一些实施方案中，组合物包含载体和/或赋形剂。在一些实施方案中，组合物富含本发明的这样的变体葡糖淀粉酶。术语“富含”表示组合物的葡糖淀粉酶活性已经增加，例如富集因子为至少1。在一些实施方案中，组合物被配制以提供期望的特性，例如色浅、气味低、可接受的储存稳定性。
在一些实施方案中，组合物包含本发明的变体葡糖淀粉酶作为主要酶组分，例如单组分组合物。
在一些实施方案中，根据最终用途，组合物可以包含一种或更多种另外的酶，包括但不限于氨基肽酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、异淀粉酶、糖水解酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、卤代过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、葡糖淀粉酶、多酚氧化酶、短梗霉多糖酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶和/或木聚糖酶。
在一些实施方案中，组合物包含α-淀粉酶和根据本发明的变体葡糖淀粉酶。在一些实施方案中，组合物包含异淀粉酶和根据本发明的变体葡糖淀粉酶。在另一个实施方案中，组合物包含α-淀粉酶、异淀粉酶和根据本发明的变体葡糖淀粉酶。
在一些实施方案中，组合物包含与短梗霉多糖酶组合的本发明的变体葡糖淀粉酶。在一些实施方案中，组合物包含与短梗霉多糖酶和异淀粉酶组合的本发明的变体葡糖淀粉酶。在一些实施方案中，组合物包含与短梗霉多糖酶和α-淀粉酶组合的本发明的变体葡糖淀粉酶。
在一些实施方案中，组合物包含本发明的变体葡糖淀粉酶，还包含酸性、中性和/或碱性蛋白酶。在另一个实施方案中，组合物包含根据本发明的变体葡糖淀粉酶和酶混合物，该酶混合物包括α-淀粉酶、蛋白酶、肽酶、脂酶、纤维素、胰酶等。
F.变体葡糖淀粉酶的制剂
在一些实施方案中，本发明提供了适用于动物消耗的制剂，其中所述制剂包含本文所述的变体葡糖淀粉酶和至少一种可消耗组分。
在一些实施方案中，组合物可以根据本领域已知的方法制备，并且可以是液体或干组合物的形式。例如，组合物可以是颗粒或微颗粒形式。变体可以根据本领域已知的方法稳定。
在一些实施方案中，本发明的酶组合物(即多肽组合物)可以是适用作酶来源的任何形式，例如，去除或不去除细胞的粗发酵液、带有或不带有细胞碎片的细胞裂解液、半纯化或纯化的酶组合物、或宿主细胞。
在一些实施方案中，酶的组成可以是干粉或颗粒、无尘颗粒、液体、稳定的液体或稳定的受保护的酶。根据已建立的方法，液体酶组合物可以例如通过添加稳定剂(例如糖、糖醇或另一种多元醇和/或乳酸或另一种有机酸)来稳定。
在一些实施方案中，可以基于本领域已知的方法确定本发明的多肽组合物的剂量以及使用该组合物的其他条件。
上述组合物适用于液化、糖化和/或发酵过程，在一些实施方案中，用于淀粉转化。在一些实施方案中，组合物可用于生产食品(糖浆)及发酵产品(例如乙醇)。在一些实施方案中，组合物可用于制药工业，例如用于消化助剂中。
此外，如下概述，本发明的新的葡糖淀粉酶可以与其他酶组合，包括但不限于α-淀粉酶、短梗霉多糖酶、纤维素酶(木聚糖酶、木质素酶等)，如下文更全面描述的。
G.产生方法
本发明还涉及一种用于产生变体葡糖淀粉酶的方法，其包括：(a)在适用于表达变体葡糖淀粉酶多肽的条件下培养如本文所述的本发明的宿主细胞；以及(b)任选地回收变体葡糖淀粉酶多肽。
使用本领域已知的方法将宿主细胞在适用于产生变体葡糖淀粉酶多肽的营养培养基中培养。例如，可以通过在合适的培养基中在允许表达和/或分离变体的条件下进行的摇瓶培养，或者实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在包含碳和氮源及无机盐的合适的营养培养基中进行培养。合适的培养基可以从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果变体葡糖淀粉酶多肽分泌到营养培养基中，则可以直接从培养基中回收变体葡糖淀粉酶多肽。如果该变体不被分泌，则可以从细胞裂解物中回收该变体。
可以使用本领域已知的对变体特异的方法来检测变体葡糖淀粉酶多肽。这些检测方法包括但不限于特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定变体葡糖淀粉酶多肽的活性。
可以使用本领域已知的方法回收变体葡糖淀粉酶多肽。例如，可以通过常规程序从营养培养基中回收变体葡糖淀粉酶多肽，该常规程序包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
该变体可以通过本领域已知的多种程序纯化，包括但不限于色谱法(例如，离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦和尺寸排阻)、电泳法(例如，制备型等电聚焦)、差示溶解度(例如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见例如Protein Purification,Janson和Ryden,editors,VCH Publishers,New York,1989)以获得基本纯的变体。
在一个替代方面，不回收变体，而是将表达该变体的本发明的宿主细胞用作该变体的来源。
H.使用变体葡糖淀粉酶的方法
葡糖淀粉酶通常在食品和发酵工业中用于将淀粉糖化为葡萄糖。
糖化过程可以单独使用葡糖淀粉酶。或者，糖化过程可以是多种酶的协同作用，包括与淀粉酶(特别是α-淀粉酶)、其他支链酶(例如短梗霉多糖酶或异淀粉酶)组合的葡糖淀粉酶。葡萄糖异构酶还可以用于将葡萄糖转化为果糖，这是传统上优选的，因为其较高的甜度和更容易的代谢能力。例如，葡糖淀粉酶可以用于面团中以改善面包皮的颜色并产生低热量的啤酒。葡糖淀粉酶的另一个关键应用是当与其他酶的混合物一起使用时用作消化助剂。
在一些实施方案中，葡糖淀粉酶用于动物饲料原料或动物饲料原料的生产中，包括以下详细描述的组分和用途。
在一些实施方案中，本发明提供了一种淀粉底物的糖类糖化的方法，其包括使所述底物与本文所述的变体葡糖淀粉酶接触，其中所述淀粉降解。
如本文所讨论的，在动物饲料中使用葡糖淀粉酶具有许多益处，包括节省饲料成本，例如减少饮食中无机磷酸盐、能量和氨基酸，包括快速高效地分解饮食中的葡萄糖和葡萄糖的养分利用率增加、以及对于非反刍动物受试者的生长益处(例如体重增加)。在一些实施方案中，本发明的变体葡糖淀粉酶被配制并添加到饲料中，或者可以制成饲料的组分。在前一种情况下，可以通过在载体饲料(例如小麦粉)上配制变体葡糖淀粉酶来在饲料原料中添加葡糖淀粉酶。在一些实施方案中，动物饲料原料或补充剂饲喂给牲畜，包括但不限于牛、猪、羊、鸟、猫、鱼、狗、马、宠物、家禽等。在一些实施方案中，本发明的变体葡糖淀粉酶可以饲喂给人(参见例如
http://www.globalhealingcenter.com/natural-health/glucoamylase/)以及供人消耗的其他可商购产品，例如
在一些实施方案中，可以基于本领域已知的方法来确定本发明的多肽组合物的剂量以及使用该组合物的其他条件。
上述组合物适用于液化、糖化和/或发酵过程，在一些实施方案中，用于淀粉转化。在一些实施方案中，组合物用于生产食品(包括糖浆)及发酵产品(例如乙醇)。在一些实施方案中，组合物用于制药工业，例如消化助剂。
在一个实施方案中，如本领域已知的，将变体葡糖淀粉酶添加到动物饲料原料中并制粒，使得饲料与其中的葡糖淀粉酶一起成形。在另一些实施方案中，可以将变体葡糖淀粉酶以液体形式喷雾或配量到动物饲料中。
1.工业应用
本发明的变体葡糖淀粉酶具有有价值的特性，允许用于多种工业应用。在一些实施方案中，葡糖淀粉酶可用于饲料原料生产、啤酒制造、乙醇生产、生物燃料生产以及淀粉转化过程。
通常，葡糖淀粉酶的主要商业应用是催化淀粉糖化以产生葡萄糖，该葡萄糖可用于食品和发酵过程。通常，这是两步过程，第一步使用干燥的固体淀粉浆料(30％-35％，任选地研磨)，使用α-淀粉酶通过在60℃至90℃下热处理及在95℃至105℃下的液化(通常pH6.5)使其糊化。α-淀粉酶是一种内在作用酶，产生短链糊精。然后将这些糊精用葡糖淀粉酶糖化以释放葡萄糖，该步骤通常在60℃下进行2至4天。正是这最后一步导致需要热稳定的葡糖淀粉酶。
在一些实施方案中，本发明提供了通过使用变体葡糖淀粉酶制备的生物燃料，该变体葡糖淀粉酶产生葡萄糖，然后进行发酵步骤以产生乙醇(通常使用酵母)。
变体葡糖淀粉酶可用于淀粉加工，特别是淀粉转化，尤其是淀粉的液化(参见例如美国专利号3,912,590、EP 252730和EP 063909、WO 99/19467及WO 96/28567，其全部内容通过引用整体并入本文)。还考虑了用于淀粉转化目的的组合物，除了本发明的葡糖淀粉酶之外，其还可以包含α-淀粉酶、短梗霉多糖酶和/或蛋白酶。
此外，本发明的葡糖淀粉酶特别可用于从淀粉或全谷物生产甜味剂和乙醇(参见，例如美国专利号5,231,017，其通过引用整体并入本文)，例如燃料、饮料和工业乙醇。
在一些实施方案中，本发明涉及根据本发明的葡糖淀粉酶在从含淀粉材料产生糖浆和/或发酵产物中的用途。在一个实施方案中，淀粉材料可以是糊化的。在另一个实施方案中，淀粉材料是未糊化的。
2.淀粉加工
如本文所讨论，本发明的新的葡糖淀粉酶在淀粉加工中具有特别用途。天然淀粉由微小颗粒组成，在室温下不溶于水。当加热淀粉水溶液时，颗粒溶胀并最终破裂，将淀粉分子分散到溶液中。在高至约50℃至75℃的温度下，溶胀可以是可逆的。然而，在较高温度下，开始发生不可逆溶胀，称为“糊化”。在这种“糊化”过程期间，粘度急剧增加。待加工的颗粒淀粉可以是高度精制的淀粉品质，优选至少90％、至少95％、至少97％或至少99.5％的纯度，也可以是较粗的含淀粉材料，包含含非淀粉级分(例如胚芽残余物和纤维)的(例如，经研磨的)全谷物。可以例如通过研磨来减小(例如全谷物)原料的粒径，以打开结构并允许进一步加工。在干法研磨中，将整个籽粒研磨并使用。湿法研磨很好地分离胚芽和粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)，经常用于使用淀粉水解产物生产例如糖浆或其他饲料补充剂的场所。干法研磨和湿法研磨都在淀粉加工领域中是熟知的，并且可以用于本发明的方法中。用于减小含淀粉材料的粒径的方法是本领域技术人员熟知的。
由于在典型的工业加工中固体含量为30％至40％，淀粉必须细化或“液化”，使得其可以进行适当的加工。粘度的这种降低主要通过目前商业实践中的酶促降解来实现。
液化可以在α-淀粉酶的存在下进行，并且在一些实施方案中，α-淀粉酶为细菌α-淀粉酶和/或酸性真菌α-淀粉酶。在一个实施方案中，在液化期间还存在葡糖淀粉酶。在一些实施方案中，在液化期间还存在降低粘度的酶，例如木聚糖酶和/或β-葡聚糖酶。在一些实施方案中，还存在酸性蛋白酶。在一些实施方案中，还存在酸性蛋白酶以减少玉米浸泡时间。
在一些实施方案中，本发明的方法还包括在将含淀粉材料转化为糖/糊精之前的步骤：(i)减小含淀粉材料的粒径；(ii)形成包含含淀粉材料和水的浆料。
3.啤酒制造
变体葡糖淀粉酶还可以用于啤酒制造过程和类似的发酵。
I.蒸馏
任选地，在发酵之后，可以通过例如蒸馏并任选地随后进行一个或更多个处理步骤来提取醇(例如，乙醇)。
1.酶
下文所述的酶和多肽以“有效量”用于本发明的方法中，或者可以与本发明的变体葡糖淀粉酶组合。在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶可以与包括但不限于以下的酶组合：α-淀粉酶、细菌α-淀粉酶、细菌杂合α-淀粉酶、真菌α-淀粉酶、真菌杂合α-淀粉酶、糖源生成酶(糖化酶)、葡糖淀粉酶、β-淀粉酶、产麦芽糖淀粉酶、葡糖淀粉酶、短梗霉多糖酶和蛋白酶。
a.α-淀粉酶
可以使用任何α-淀粉酶，例如真菌、细菌或植物来源。在一些实施方案中，α-淀粉酶为酸性α-淀粉酶，例如，酸性真菌或酸性细菌α-淀粉酶。术语“酸性α-淀粉酶”意指以有效量添加的α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)在3至7、3.5至6、或4至5的pH范围内具有最佳活性。
b.细菌α-淀粉酶
用于本发明的α-淀粉酶可以为细菌α-淀粉酶，例如，源自芽孢杆菌(Bacillus)。在一个优选的实施方案中，芽孢杆菌α-淀粉酶源自解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的菌株，但也可以源自其他芽孢杆菌属。
c.细菌杂合α-淀粉酶
α-淀粉酶可以为杂合α-淀粉酶，例如，包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的445个C-末端氨基酸残基和源自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的37个N-末端氨基酸残基的α-淀粉酶。
d.真菌α-淀粉酶
真菌α-淀粉酶包括但不限于源自曲霉属菌株的α-淀粉酶，例如白曲霉(Aspergillus kawachii)、黑曲霉和米曲霉α-淀粉酶。在一些实施方案中，α-淀粉酶源自白曲霉(Kaneko等,1996,J.Ferment.Bioeng.81:292-298,“Molecular-cloning anddetermination of the nucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stablealpha-amylase from Aspergillus kawachii”；还作为EMBL:#AB008370)。
真菌α-淀粉酶还可以为包含淀粉结合结构域(SBD)和α-淀粉酶催化结构域的野生型酶或其变体。
2.真菌杂合α-淀粉酶
在一些实施方案中，真菌酸性α-淀粉酶为杂合α-淀粉酶。杂合α-淀粉酶可以包含α-淀粉酶催化结构域(CD)和糖类结合结构域/模块(CBM)(例如SBD)以及任选的接头。
3.商用α-淀粉酶产品
在一些实施方案中，包含α-淀粉酶的商用组合物包括MYCOLASETM(DSM)、BANTM、TERMAMYLTM SC、FUNGAMYLTM、LIQUOZYMETM X、LIQUOZYMETM SC和SANTM SUPER、SANTM EXTRA L(Novozymes A/S)和CLARASETM L-40,000、DEX-LOTM、SPEZYMETM FRED、SPEZYMETM AA、SPEZYMETM ALPHA、SPEZYMETM DELTA AA、GC358、GC980、SPEZYMETM CL和SPEZYMETM RSL(DuPont Industrial Biosciences)，黑曲霉的酸性真菌α-淀粉酶提及SP288(获得自Novozymes A/S，Denmark)。
4.糖源生成酶(糖化酶)
术语“糖源生成酶”包括葡糖淀粉酶(葡萄糖生成剂)、β-淀粉酶和产麦芽糖淀粉酶(都是麦芽糖生成剂)，也包括α-葡糖苷酶、异淀粉酶和短梗霉多糖酶。糖源生成酶能够产生糖类，该糖类可以被所讨论的发酵生物体用作能源，例如，当用于本发明的生产发酵产物(例如乙醇)的方法时。生成的糖类可以直接或间接转化为期望的发酵产物，优选乙醇。可以使用糖源生成酶的混合物。在一些实施方案中，共混物包括至少包含葡糖淀粉酶和α-淀粉酶(特别是酸性淀粉酶，甚至更优选酸性真菌α-淀粉酶)的混合物。
在常规的淀粉-乙醇过程(即，包括液化步骤)中，比例可以如本领域中已知的那样进行，特别是当糖化和发酵同时进行时。
5.β-淀粉酶
在一些实施方案中，β-淀粉酶可以包含在本发明的组合物中。β-淀粉酶(E.C3.2.1.2)是外切作用的产麦芽糖淀粉酶的传统名称，它催化直链淀粉、支链淀粉和相关葡萄糖聚合物中的1,4-α-糖苷键水解。
β-淀粉酶已经从多种植物和微生物中分离出(Fogarty和Kelly,1979,Progressin Industrial Microbiology 15:1 12-1 15)。这些β-淀粉酶的特征在于最适温度为40℃至65℃，最适pH为4.5至7。可商购的来自大麦的β-淀粉酶为Novozymes A/S(Denmark)的NOVOZYMTM WBA和DuPont Industrial Biosciences(USA)的SPEZYMETM BBA 1500。
6.产麦芽糖淀粉酶
在一些实施方案中，产麦芽糖淀粉酶可以包含在本发明的组合物中和/或用于本发明的方法中。淀粉酶可以是产麦芽糖α-淀粉酶(葡聚糖1,4-α-麦芽水解酶，EC3.2.1.133)，其催化直链淀粉和支链淀粉水解为α构型的麦芽糖。来自嗜热脂肪地芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)菌株NCIB 1 1837的产麦芽淀粉酶可商购自NovozymesA/S.Maltogenic。
产麦芽糖淀粉酶可以以0.05mg至5mg总蛋白质/克DS或0.05MANU/g至5MANU/g DS的量添加。
7.植酸酶
在一些实施方案中，葡糖淀粉酶可以包含在本发明的组合物中。任何葡糖淀粉酶均可用于本发明的方法中。植酸酶是通过特异性水解肌醇与磷之间的酯键来降解植酸酯和/或植酸的酶。植酸酶的活性归功于许多成分中的磷和离子可用性。在一些实施方案中，葡糖淀粉酶能够从肌醇六磷酸(例如植酸)中释放至少一种无机磷酸。植酸酶可以根据植酸酶对植酸酯分子上磷酸酯基团在水解开始时的特定位置的偏好进行分组(例如3-植酸酶(EC 3.1.3.8)或6-植酸酶(EC 3.1.3.26)。植酸酶的实例为肌醇六磷酸磷酸水解酶。植酸酶还可以包括于2016年6月30日提交的PCT申请号PCT/US2016/040555中的那些，在此通过引用整体并入，特别是其中所描述的植酸酶的序列。
在一些实施方案中，葡糖淀粉酶为可商购的植酸酶，这种可商购的植酸酶包括但不限于NATUPHOS(BASF)、RONOZYME P(Novozymes A/S)、PHYZYME(Danisco A/S、Verenium)和FINASE(AB Enzymes)。用于确定微生物植酸酶活性的方法和植酸酶单位的定义中Engelen等,1994,Journal of AOAC International 77:760-764中公开。在一些实施方案中，植酸酶可以为野生型植酸酶、其活性变体或活性片段。
8.短梗霉多糖酶
在一些实施方案中，产麦芽糖淀粉酶可以包含在本发明的组合物中和/或用于本发明的方法中。短梗霉多糖酶(E.C.3.2.1.41，支链淀粉6-葡聚糖水解酶)是脱支酶，其特征在于其水解支链淀粉和短梗霉聚糖中的α-1,6-糖苷键的能力。
在一些实施方案中，短梗霉多糖酶为可商购的短梗霉多糖酶，这种可商购的短梗霉多糖酶包括但不限于PROMOZYME D、PROMOZYMETM D2(Novozymes A/S、Denmark)、OPTIMAXL-1000、OPTIMAX L-300和AMANO 8(Amano、Japan)。
9.蛋白酶
在糖化、发酵、同时糖化和发酵期间可以添加蛋白酶。蛋白酶可以为任何蛋白酶。在一些实施方案中，蛋白酶为微生物来源的酸性蛋白酶，例如真菌或细菌来源。在一些实施方案中，蛋白酶为酸性真菌蛋白酶，但是也可以使用其他蛋白酶。
适用的蛋白酶包括但不限于微生物蛋白酶，例如真菌和细菌蛋白酶。
在一些实施方案中，蛋白酶为酸性蛋白酶，即具有在低于pH 7的酸性条件下水解蛋白质的能力的蛋白酶。
蛋白酶可以为中性或碱性蛋白酶，例如源自芽孢杆菌属菌株的蛋白酶。在一些实施方案中，特定的蛋白酶源自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，并且具有可在Swissprot数据库(登录号P06832)中获得的序列。
在一些实施方案中，蛋白酶为源自曲霉属(例如米曲霉)菌株的蛋白酶。在另一个实施方案中，蛋白酶源自根毛霉属(例如米黑根毛霉)菌株。在一些实施方案中，蛋白酶为蛋白酶制剂，例如源自曲霉属(例如米曲霉)菌株的蛋白水解制剂和源自根毛霉属(例如米黑根毛霉)菌株的蛋白酶的混合物。
在一些实施方案中，蛋白酶为可商购的蛋白酶，这种可商购的蛋白酶包括但不限于ESPERASETM、FLAVOURZYMETM、/>NOVOZYMTM FM 2.0L和iZyme BA(可商购自Novozymes A/S，Denmark)和来自DuPont Industrial Biosciences(USA)的GC106TM和SPEZYMETM FAN及来自DSM的RENNI/>
VI.实施例
实施例1:葡糖淀粉酶G7P的设计与构建
起始基因为如SEQ ID NO:1所示的G16G6P。为了提高G16的整体活性，合理设计G7P以截短G6P的SBD。G6P和G7P的序列比对如图1所示。随后，使用具有5'EcoR1和3'Not1克隆位点的基因特异性引物构建G7P。经PCR和限制性酶切之后，将其克隆到pPiCZαA载体(EasySelect Pichia表达试剂盒，life technologies的Invitrogen)。使用Pme1限制性内切酶使重组质粒线性化，并从前文提到的相同表达试剂盒中转化到X33毕赤酵母属菌株中。然后在30℃下生长3天后，在YPD+Zeocine琼脂板上选择转化体。
实施例2:HTP中巴斯德毕赤酵母产生的葡糖淀粉酶G6P和G7P的制备
根据ThermoFisher Scientific配方，将来自单个菌落的编码葡糖淀粉酶的基因接种到包含2000μlBMGY培养基的24孔板的各个孔中。将培养物在30℃、200rpm和85％湿度下生长18小时。18小时后，将24孔板离心并倒出液体培养基。根据ThermoFisherScientific配方，将2000μl BMMY培养基添加到沉淀中。将200μl的10％甲醇添加到各个板中。将板在30℃，200rpm和85％湿度的培养箱中孵育。每隔24小时，将200μl 10％的甲醇添加到各个板中。通过将板在4℃下以4,000rpm离心10分钟，来在72小时时收获板。将上清液转移到costar深孔板中，并在活性测定之前在-20℃下储存。
实施例3:确定巴斯德毕赤酵母产生的葡糖淀粉酶G6P和G7P在40℃下的热活性的淀粉测定
将115μL的2％经加热的可溶性淀粉(最终浓度为1.5％淀粉)、10μL的4×稀释的酶上清液和25μL的pH 4.3缓冲液在40℃下以400rpm搅拌孵育0.5小时。将20μL的经孵育的样品添加到90μL的水中，用于在40℃下孵育的反应板的10x检测稀释。从5x检测稀释板中转移10μL稀释样品，与190μL GOPOD(葡萄糖氧化酶/过氧化物酶)混合，然后在50℃下以400RPM搅拌孵育30分钟。在510nm处读取吸光度以确定释放的葡萄糖。
如图2所示，G7P表现出比G6P高>3倍的改善的热活性。
实施例4:葡糖淀粉酶G6和G7突变体库的设计和构建
为了提高G16 G6和G7的整体活性，在分析G16的序列、结构和实验数据的基础上，在G6改善期间设计了多个突变体库，在G7改善期间设计了多个突变体库。每个突变体的设计包括一个至更多个特定突变。随后使用Lightning试剂盒(AgilentTechnologies，Santa Clara，California)构建突变体库，然后将其克隆到pYES2/CT载体中(ThermoFisher Scientific，USA：目录号V8251-20)。
实施例5:HTP中酿酒酵母产生的葡糖淀粉酶的制备
将含有来自单个菌落的编码重组葡糖淀粉酶的基因的酿酒酵母INSCV1菌株(ThermoFisher Scientific，USA：目录号V8251-20)接种到96孔板的各个孔中，该孔中含有300μl具有2％葡萄糖且没有尿嘧啶补充剂的合成最低限度培养基(SC)。将培养物在30℃、200rpm和85％的湿度下生长过夜。将获得0.4OD600所需的适当体积的来自各个孔的过夜培养物添加到含有350μl诱导培养基(含2％半乳糖的SC选择性培养基)的新96孔板的对应孔中。然后将板在30℃、250rpm和85％湿度下孵育48小时。然后在4℃下以4000rpm离心10分钟使细胞沉淀。将上清液转移到圆底板并在活性测定之前在-20℃下储存。
实施例6:确定酿酒酵母产生的葡糖淀粉酶在30℃和60℃下的热活性的淀粉测定
将115μL的2％经加热的可溶性淀粉(最终浓度为1.5％淀粉)、10μL的上清液酶和25μL的pH 4.3缓冲液在30℃或60℃下以400rpm搅拌孵育72小时。将10μL的经孵育的样品添加到90μL的水中，用于在30℃和60℃下孵育的反应板的10x检测稀释。从10x检测稀释板中转移10μL稀释样品，并与190μL GOPOD(葡萄糖氧化酶/过氧化物酶)混合，然后在50℃下以400RPM搅拌孵育30分钟。在510nm处读取吸光度以确定释放的葡萄糖。
在30℃和/或60℃下鉴定具有改善的热活性的G6变体示于图3A至图3S中，在30℃和/或60℃下鉴定具有改善的热活性的G7变体示于图4A至图4K中。
实施例7:2种葡糖淀粉酶变体的设计和构建
基于酿酒酵母中鉴定的有益变体和结构分析设计2种变体以改善具有SBD的葡糖淀粉酶G6P与SBD的比活性。随后使用具有5'EcoR1和3'Not1克隆位点的基因特异性引物构建变体。经PCR和限制性酶切之后，将其克隆到pPiCZαA载体(EasySelect Pichia表达试剂盒，life technologies的Invitrogen)。使用Pme1限制性内切酶使重组质粒线性化，并从前文提到的相同表达试剂盒中转化到X33毕赤酵母菌株中。然后在30℃下生长3天后，在YPD+Zeocine琼脂板上选择转化体。
实施例8:HTP中巴斯德毕赤酵母产生的葡糖淀粉酶变体的制备
根据ThermoFisher Scientific配方，将来自单个菌落的编码葡糖淀粉酶的基因接种到包含2000μlBMGY培养基的24孔板的各个孔中。将培养物在30℃、200rpm和85％的湿度下生长18小时。18小时后，将24孔板离心并倒出液体培养基。根据ThermoFisherScientific配方，将2000μl BMMY培养基添加到沉淀中。将200μl的10％甲醇添加到各个板中。将板在30℃、200rpm和85％湿度下孵育。每隔24小时，将200μl 10％的甲醇添加到各个板中。通过将板在4℃下以4,000rpm离心10分钟，来在72小时时收获板。将上清液转移到costar深孔板中，并在活性测定之前在-20℃下储存。
实施例9:确定巴斯德毕赤酵母产生的葡糖淀粉酶变体在40℃下的比活性的淀粉测定
使用SDS-PAGE蛋白质定量参照G6P使所有蛋白质样品归一化。将115μL 2％经加热的可溶性淀粉(最终浓度为1.5％淀粉)、10μL 4x稀释的酶上清液和25μL pH 4.3缓冲液在40℃下以400rpm搅拌孵育0.5小时。将20μL经孵育的样品添加到90μL的水中，用于40℃下孵育的反应板的10x检测稀释。从5x检测稀释板中转移10μL稀释样品，与190μL GOPOD(葡萄糖氧化酶/过氧化物酶)混合，并在50℃下以400RPM搅拌孵育30分钟。在510nm处读取吸光度以确定释放的葡萄糖。
如图6所示，两种变体表现出比G6P高＞1.4-1.5倍的改善比活性。尽管对具有SBD的变体进行了实验，但不具有SBD的相同变体可比G7P具有相似的比活性改善。
提供上述实施例是为了给本领域普通技术人员提供关于如何制备和使用本发明的组合物、系统和方法的实施方案的完整公开内容和描述，并且不旨在限制发明人认为本发明的范围。对于本领域技术人员显而易见的，用于实施本发明的上述实施方式的修改旨在落入所附权利要求书的范围内。本说明书中提到的所有专利和出版物显示了本发明所属领域技术人员的技术水平。本公开内容中引用的所有参考文献通过引用整体并入本文，其程度如同每个参考文献已单独通过引用整体并入本文。
所有标题和章节名称仅出于清楚和参考目的而使用，并且不应视为以任何方式限制。例如，本领域技术人员将理解根据本文所述的本发明的精神和范围适当组合来自不同标题和部分的各个方面的有用性。
本文所引用的所有参考文献均通过引用在此整体并入本文，出于所有目的，其程度如同出于所有目的，各个单独的出版物、专利或专利申请特地单独地通过引用整体并入本文。
如本领域技术人员显而易见的，可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下对本申请进行许多修改和改变。本文所述的特定实施方案和实施例仅通过示例的方式提供。
序列表
<110> 福尼亚生物处理股份有限公司
Zhang, Xiyun
Yang, Jie
Banerjee, Goutami
Oo, Khin
Palatino, Marielle De Jesus
Hu, Eric Lin
Sawaya, Imad N.
Fukushima, Tatsuya
Zeng, Jijiao
Lu, Wenhua
<120> 变体G6P G7P葡糖淀粉酶组合物及方法
<130> 114095-5008
<150> US 62/784,193
<151> 2018-12-21
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 620
<212> PRT
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<211> 1866
<212> DNA
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<223> 编码G6P前蛋白的核酸序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G7P前蛋白氨基酸序列
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gacgtctact acaacggcaa cccctggtac ctgtgcactt tggctgttgc agagcagctt 1080
tacgatgcag tttacacttg gaagctcgag ggctccatca ccgtcacctc tgtctcgctg 1140
cccttcttca ctgacctgct gccctcgctg accactggca cctacgcttc gggctcgacc 1200
accttcgaat ccatcatctc tgctgtgact acctacgctg atggctttgt cagtattgtc 1260
cagacctaca ctccctctga cggcgctctg tctgagcagt actccaagta caacggccag 1320
cagctgtcgg ctcccgacct gacctggtcg tacgccgctt tcctatctgc cactgagcgc 1380
cgtgacagcg ttgtccctgc cggctgggct ggtgcctcgt ctgtctctgt gcccggcgcc 1440
tgcgctgcta ccaccgttgt cggaacctac gctgctgcct ccaactgcgg tactcctggc 1500
tctggctcgg gcggcaacgg tggctcgagc ggtaacgccc tgtaatag 1548
<210> 5
<211> 620
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 变体1（具有淀粉结合域的Y321F）前蛋白氨基酸序列
<400> 5
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Ala Thr Gly Val Val Ala Ser Pro Val Ser Lys Arg Ala Thr Leu Asp
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Gly Ser Thr Leu Ala Ala Lys Leu Gly Lys Ser His Ser Ala Tyr Asp
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Val Pro Ala Gly Trp Ala Gly Ala Ser Ser Val Ser Val Pro Gly Ala
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Cys Ala Ala Thr Thr Val Val Gly Thr Tyr Ala Ala Ala Ser Asn Cys
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Gly Thr Pro Gly Ser Gly Ser Gly Gly Asn Gly Gly Ser Ser Gly Asn
500 505 510
Ala Leu Val Thr Phe Asn Glu Leu Ala Thr Thr Tyr Tyr Gly Glu Asn
515 520 525
Ile Lys Leu Val Gly Ser Thr Ala Ala Phe Gly Ser Trp Ser Pro Ser
530 535 540
Ala Gly Ile Leu Leu Ser Ala Ser Ser Tyr Thr Ala Ser Asn Pro Leu
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Trp Thr Thr Thr Val Ser Val Pro Gln Gly Ser Thr Val Glu Phe Lys
565 570 575
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<210> 6
<211> 1866
<212> DNA
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<220>
<223> 编码变体1（具有淀粉结合域的Y321F）前蛋白的核酸序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 变体2（具有淀粉结合域的S188H/Y321W/Q419P）前蛋白氨基酸序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码变体2（具有淀粉结合域的S188H/Y321W/Q419P）前蛋白的核酸序列
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<220>
<223> 变体1（不具有淀粉结合域的Y321F）前蛋白氨基酸序列
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<213> 人工序列
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<223> 编码变体1（不具有淀粉结合域的Y321F）前蛋白的核酸序列
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Met Val Phe Leu Lys Ser Ala Ile Ala Ala Ser Thr Trp Leu Leu Ala
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<210> 13
<211> 598
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G6P成熟蛋白氨基酸序列
<400> 13
Ser Pro Val Ser Lys Arg Ala Thr Leu Asp Glu Phe Ile Ser Thr Glu
1 5 10 15
Arg Pro Leu Ala Leu Glu Arg Leu Leu Cys Asn Ile Gly Pro Thr Gly
20 25 30
Cys Arg Ala Ser Gly Ala Ala Ser Gly Val Val Ile Ala Ser Pro Ser
35 40 45
Arg Ser Asp Pro Asp Tyr Tyr Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ala Ala Leu
50 55 60
Val Phe Lys Glu Ile Val Asp Ser Val Glu Thr Asn Thr Thr Leu Leu
65 70 75 80
Leu Pro Glu Ile Glu Asn Tyr Val Thr Ala Gln Ala Tyr Leu Gln Thr
85 90 95
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Pro Lys Phe Asn Val Asp Met Thr Pro Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg
115 120 125
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130 135 140
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Lys Ser Ala Gly Asp Ala Leu Ala Val Gly Arg Tyr Ala Glu Asp Val
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Tyr Tyr Asn Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Cys Thr Leu Ala Val Ala Glu
325 330 335
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340 345 350
Val Thr Ser Val Ser Leu Pro Phe Phe Thr Asp Leu Leu Pro Ser Leu
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
Leu Ser Ala Thr Glu Arg Arg Asp Ser Val Val Pro Ala Gly Trp Ala
435 440 445
Gly Ala Ser Ser Val Ser Val Pro Gly Ala Cys Ala Ala Thr Thr Val
450 455 460
Val Gly Thr Tyr Ala Ala Ala Ser Asn Cys Gly Thr Pro Gly Ser Gly
465 470 475 480
Ser Gly Gly Asn Gly Gly Ser Ser Gly Asn Ala Leu Val Thr Phe Asn
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
Val Pro Gln Gly Ser Thr Val Glu Phe Lys Phe Ile Arg Val Gly Ser
545 550 555 560
Asp Gly Ser Ile Thr Trp Glu Ser Gly Asn Asn Lys Val Leu Thr Val
565 570 575
Gly Ser Ser Ala Thr Ser Val Thr Val Ser Ala Ser Trp Asn Gly Ala
580 585 590
Tyr Ser Val Ser Ser Ser
595
<210> 14
<211> 1800
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码G6P成熟蛋白的核酸序列
<400> 14
tcgcctgttt ccaagcgcgc tacgctggac gagttcatca gcaccgagcg tcccttggct 60
ctggagcgcc tgctctgcaa cattggtcct actggttgcc gtgcttcggg agctgcctcg 120
ggagtcgtta tcgcctcgcc gtcccgcagc gatccggact actactacac ttggacccgt 180
gatgctgctc tggtctttaa ggagattgtc gactctgtcg agactaacac cactctgctg 240
ctgccagaga ttgagaacta cgttactgcc caggcttacc tgcagaccgt gacgaacccc 300
tcgggttcgc tgtcggatgg tgctggtctg ggcgagccca agttcaacgt cgatatgact 360
cccttcactg gtgcctgggg tcgtcctcag cgtgatggtc cggctctgcg tgctacggct 420
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cagattatcc agaacgacct gaattacgtc gctcagtact ggaaccaaac tggttacgac 540
ctgtgggagg aggttccggg ttcatccttt ttcactgttg ctgctcagta cagagctctc 600
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gctccgcaga ttctgtgcta cttgcagagc ttctggtcat ccagcaaggg ctacattgtc 720
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gcagtttaca cttggaagct cgagggctcc atcaccgtca cctctgtctc gctgcccttc 1080
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agcgttgtcc ctgccggctg ggctggtgcc tcgtctgtct ctgtgcccgg cgcctgcgct 1380
gctaccaccg ttgtcggaac ctacgctgct gcctccaact gcggtactcc tggctctggc 1440
tcgggcggca acggtggctc gagcggtaac gccctggtga ctttcaacga gctggctact 1500
acctactacg gcgagaacat taagcttgtc ggcagcacag ctgctttcgg ttcgtggtcg 1560
ccctcagctg gtattctcct gtctgcctcg tcgtacacgg ccagcaaccc tctgtggact 1620
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acgagcgtca ctgtttctgc cagctggaac ggcgcctact cggtgtctag ctcttaatag 1800
<210> 15
<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G7P成熟蛋白氨基酸序列
<400> 15
Ser Pro Val Ser Lys Arg Ala Thr Leu Asp Glu Phe Ile Ser Thr Glu
1 5 10 15
Arg Pro Leu Ala Leu Glu Arg Leu Leu Cys Asn Ile Gly Pro Thr Gly
20 25 30
Cys Arg Ala Ser Gly Ala Ala Ser Gly Val Val Ile Ala Ser Pro Ser
35 40 45
Arg Ser Asp Pro Asp Tyr Tyr Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ala Ala Leu
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Leu Pro Glu Ile Glu Asn Tyr Val Thr Ala Gln Ala Tyr Leu Gln Thr
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Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile Ala Tyr
130 135 140
Tyr Asn Tyr Leu Leu Asn Asn Asn Ala Thr Thr Asp Cys Gly Leu Trp
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Gln Ile Ile Gln Asn Asp Leu Asn Tyr Val Ala Gln Tyr Trp Asn Gln
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Leu Cys Tyr Leu Gln Ser Phe Trp Ser Ser Ser Lys Gly Tyr Ile Val
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Ala Asn Thr Gln Thr Ala Ser Trp Val Ser Arg Ser Gly Leu Asp Ala
245 250 255
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275 280 285
Lys Lys Leu Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Ala Ile Asn Ser Gly
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485 490
<210> 16
<211> 1482
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码G7P成熟蛋白的核酸序列
<400> 16
tcgcctgttt ccaagcgcgc tacgctggac gagttcatca gcaccgagcg tcccttggct 60
ctggagcgcc tgctctgcaa cattggtcct actggttgcc gtgcttcggg agctgcctcg 120
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gatgctgctc tggtctttaa ggagattgtc gactctgtcg agactaacac cactctgctg 240
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<210> 17
<211> 598
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 变体1（具有淀粉结合域的Y321F）成熟蛋白氨基酸序列
<400> 17
Ser Pro Val Ser Lys Arg Ala Thr Leu Asp Glu Phe Ile Ser Thr Glu
1 5 10 15
Arg Pro Leu Ala Leu Glu Arg Leu Leu Cys Asn Ile Gly Pro Thr Gly
20 25 30
Cys Arg Ala Ser Gly Ala Ala Ser Gly Val Val Ile Ala Ser Pro Ser
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Tyr Asn Tyr Leu Leu Asn Asn Asn Ala Thr Thr Asp Cys Gly Leu Trp
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Gln Ile Ile Gln Asn Asp Leu Asn Tyr Val Ala Gln Tyr Trp Asn Gln
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Tyr Thr Pro Ser Asp Gly Ala Leu Ser Glu Gln Tyr Ser Lys Tyr Asn
405 410 415
Gly Gln Gln Leu Ser Ala Pro Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Phe
420 425 430
Leu Ser Ala Thr Glu Arg Arg Asp Ser Val Val Pro Ala Gly Trp Ala
435 440 445
Gly Ala Ser Ser Val Ser Val Pro Gly Ala Cys Ala Ala Thr Thr Val
450 455 460
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Tyr Ser Val Ser Ser Ser
595
<210> 18
<211> 1800
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码变体1（具有淀粉结合域的Y321F）成熟蛋白的核酸序列
<400> 18
tcgcctgttt ccaagcgcgc tacgctggac gagttcatca gcaccgagcg tcccttggct 60
ctggagcgcc tgctctgcaa cattggtcct actggttgcc gtgcttcggg agctgcctcg 120
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actgccatcc acctatttga ccctgaactt ggctgcgatg actcgacttt ccagccctgc 840
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acgagcgtca ctgtttctgc cagctggaac ggcgcctact cggtgtctag ctcttaatag 1800
<210> 19
<211> 598
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 变体2（具有淀粉结合域的S188H/Y321W/Q419P）成熟蛋白氨基酸序列
<400> 19
Ser Pro Val Ser Lys Arg Ala Thr Leu Asp Glu Phe Ile Ser Thr Glu
1 5 10 15
Arg Pro Leu Ala Leu Glu Arg Leu Leu Cys Asn Ile Gly Pro Thr Gly
20 25 30
Cys Arg Ala Ser Gly Ala Ala Ser Gly Val Val Ile Ala Ser Pro Ser
35 40 45
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145 150 155 160
Gln Ile Ile Gln Asn Asp Leu Asn Tyr Val Ala Gln Tyr Trp Asn Gln
165 170 175
Thr Gly Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Pro Gly His Ser Phe Phe Thr
180 185 190
Val Ala Ala Gln Tyr Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser Thr Leu Ala Ala
195 200 205
Lys Leu Gly Lys Ser His Ser Ala Tyr Asp Thr Val Ala Pro Gln Ile
210 215 220
Leu Cys Tyr Leu Gln Ser Phe Trp Ser Ser Ser Lys Gly Tyr Ile Val
225 230 235 240
Ala Asn Thr Gln Thr Ala Ser Trp Val Ser Arg Ser Gly Leu Asp Ala
245 250 255
Asn Thr Pro Leu Thr Ala Ile His Leu Phe Asp Pro Glu Leu Gly Cys
260 265 270
Asp Asp Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro Lys Gln Leu Ile Thr Thr
275 280 285
Lys Lys Leu Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Ala Ile Asn Ser Gly
290 295 300
Lys Ser Ala Gly Asp Ala Leu Ala Val Gly Arg Tyr Ala Glu Asp Val
305 310 315 320
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325 330 335
Gln Leu Tyr Asp Ala Val Tyr Thr Trp Lys Leu Glu Gly Ser Ile Thr
340 345 350
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355 360 365
Thr Thr Gly Thr Tyr Ala Ser Gly Ser Thr Thr Phe Glu Ser Ile Ile
370 375 380
Ser Ala Val Thr Thr Tyr Ala Asp Gly Phe Val Ser Ile Val Gln Thr
385 390 395 400
Tyr Thr Pro Ser Asp Gly Ala Leu Ser Glu Gln Tyr Ser Lys Tyr Asn
405 410 415
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Val Pro Gln Gly Ser Thr Val Glu Phe Lys Phe Ile Arg Val Gly Ser
545 550 555 560
Asp Gly Ser Ile Thr Trp Glu Ser Gly Asn Asn Lys Val Leu Thr Val
565 570 575
Gly Ser Ser Ala Thr Ser Val Thr Val Ser Ala Ser Trp Asn Gly Ala
580 585 590
Tyr Ser Val Ser Ser Ser
595
<210> 20
<211> 1800
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码变体2（具有淀粉结合域的S188H/Y321W/Q419P）成熟蛋白的核酸序列
<400> 20
tcgcctgttt ccaagcgcgc tacgctggac gagttcatca gcaccgagcg tcccttggct 60
ctggagcgcc tgctctgcaa cattggtcct actggttgcc gtgcttcggg agctgcctcg 120
ggagtcgtta tcgcctcgcc gtcccgcagc gatccggact actactacac ttggacccgt 180
gatgctgctc tggtctttaa ggagattgtc gactctgtcg agactaacac cactctgctg 240
ctgccagaga ttgagaacta cgttactgcc caggcttacc tgcagaccgt gacgaacccc 300
tcgggttcgc tgtcggatgg tgctggtctg ggcgagccca agttcaacgt cgatatgact 360
cccttcactg gtgcctgggg tcgtcctcag cgtgatggtc cggctctgcg tgctacggct 420
atgatcgcct actacaacta cctgctcaac aacaacgcca ctaccgactg tggtctgtgg 480
cagattatcc agaacgacct gaattacgtc gctcagtact ggaaccaaac tggttacgac 540
ctgtgggagg aggttccggg tcactccttt ttcactgttg ctgctcagta cagagctctc 600
gttgagggtt ctacccttgc tgccaagctc ggcaagtctc actcggccta cgacactgtc 660
gctccgcaga ttctgtgcta cttgcagagc ttctggtcat ccagcaaggg ctacattgtc 720
gccaacaccc agactgccag ctgggtctcg cggtccggtc ttgatgccaa cactcccttg 780
actgccatcc acctatttga ccctgaactt ggctgcgatg actcgacttt ccagccctgc 840
tcgcccaagc agcttatcac tactaagaag ctcgttgact cgttccgctc catctatgcc 900
atcaactcgg gcaagtctgc tggtgatgct ttggctgttg gtcgttacgc cgaggacgtc 960
tggtacaacg gcaacccctg gtacctgtgc actttggctg ttgcagagca gctttacgat 1020
gcagtttaca cttggaagct cgagggctcc atcaccgtca cctctgtctc gctgcccttc 1080
ttcactgacc tgctgccctc gctgaccact ggcacctacg cttcgggctc gaccaccttc 1140
gaatccatca tctctgctgt gactacctac gctgatggct ttgtcagtat tgtccagacc 1200
tacactccct ctgacggcgc tctgtctgag cagtactcca agtacaacgg ccagcccctg 1260
tcggctcccg acctgacctg gtcgtacgcc gctttcctat ctgccactga gcgccgtgac 1320
agcgttgtcc ctgccggctg ggctggtgcc tcgtctgtct ctgtgcccgg cgcctgcgct 1380
gctaccaccg ttgtcggaac ctacgctgct gcctccaact gcggtactcc tggctctggc 1440
tcgggcggca acggtggctc gagcggtaac gccctggtga ctttcaacga gctggctact 1500
acctactacg gcgagaacat taagcttgtc ggcagcacag ctgctttcgg ttcgtggtcg 1560
ccctcagctg gtattctcct gtctgcctcg tcgtacacgg ccagcaaccc tctgtggact 1620
accaccgtgt cggttcccca gggctcgacc gttgagttca agttcatccg tgttggctcc 1680
gacggcagca tcacgtggga gagcggcaac aacaaggtgt tgacggttgg ctcttcggcc 1740
acgagcgtca ctgtttctgc cagctggaac ggcgcctact cggtgtctag ctcttaatag 1800
<210> 21
<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 变体1（不具有淀粉结合域的Y321F）成熟蛋白氨基酸序列
<400> 21
Ser Pro Val Ser Lys Arg Ala Thr Leu Asp Glu Phe Ile Ser Thr Glu
1 5 10 15
Arg Pro Leu Ala Leu Glu Arg Leu Leu Cys Asn Ile Gly Pro Thr Gly
20 25 30
Cys Arg Ala Ser Gly Ala Ala Ser Gly Val Val Ile Ala Ser Pro Ser
35 40 45
Arg Ser Asp Pro Asp Tyr Tyr Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ala Ala Leu
50 55 60
Val Phe Lys Glu Ile Val Asp Ser Val Glu Thr Asn Thr Thr Leu Leu
65 70 75 80
Leu Pro Glu Ile Glu Asn Tyr Val Thr Ala Gln Ala Tyr Leu Gln Thr
85 90 95
Val Thr Asn Pro Ser Gly Ser Leu Ser Asp Gly Ala Gly Leu Gly Glu
100 105 110
Pro Lys Phe Asn Val Asp Met Thr Pro Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg
115 120 125
Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile Ala Tyr
130 135 140
Tyr Asn Tyr Leu Leu Asn Asn Asn Ala Thr Thr Asp Cys Gly Leu Trp
145 150 155 160
Gln Ile Ile Gln Asn Asp Leu Asn Tyr Val Ala Gln Tyr Trp Asn Gln
165 170 175
Thr Gly Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Pro Gly Ser Ser Phe Phe Thr
180 185 190
Val Ala Ala Gln Tyr Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser Thr Leu Ala Ala
195 200 205
Lys Leu Gly Lys Ser His Ser Ala Tyr Asp Thr Val Ala Pro Gln Ile
210 215 220
Leu Cys Tyr Leu Gln Ser Phe Trp Ser Ser Ser Lys Gly Tyr Ile Val
225 230 235 240
Ala Asn Thr Gln Thr Ala Ser Trp Val Ser Arg Ser Gly Leu Asp Ala
245 250 255
Asn Thr Pro Leu Thr Ala Ile His Leu Phe Asp Pro Glu Leu Gly Cys
260 265 270
Asp Asp Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro Lys Gln Leu Ile Thr Thr
275 280 285
Lys Lys Leu Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Ala Ile Asn Ser Gly
290 295 300
Lys Ser Ala Gly Asp Ala Leu Ala Val Gly Arg Tyr Ala Glu Asp Val
305 310 315 320
Phe Tyr Asn Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Cys Thr Leu Ala Val Ala Glu
325 330 335
Gln Leu Tyr Asp Ala Val Tyr Thr Trp Lys Leu Glu Gly Ser Ile Thr
340 345 350
Val Thr Ser Val Ser Leu Pro Phe Phe Thr Asp Leu Leu Pro Ser Leu
355 360 365
Thr Thr Gly Thr Tyr Ala Ser Gly Ser Thr Thr Phe Glu Ser Ile Ile
370 375 380
Ser Ala Val Thr Thr Tyr Ala Asp Gly Phe Val Ser Ile Val Gln Thr
385 390 395 400
Tyr Thr Pro Ser Asp Gly Ala Leu Ser Glu Gln Tyr Ser Lys Tyr Asn
405 410 415
Gly Gln Gln Leu Ser Ala Pro Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Phe
420 425 430
Leu Ser Ala Thr Glu Arg Arg Asp Ser Val Val Pro Ala Gly Trp Ala
435 440 445
Gly Ala Ser Ser Val Ser Val Pro Gly Ala Cys Ala Ala Thr Thr Val
450 455 460
Val Gly Thr Tyr Ala Ala Ala Ser Asn Cys Gly Thr Pro Gly Ser Gly
465 470 475 480
Ser Gly Gly Asn Gly Gly Ser Ser Gly Asn Ala Leu
485 490
<210> 22
<211> 1482
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码变体1（不具有淀粉结合域的Y321F）成熟蛋白的核酸序列
<400> 22
tcgcctgttt ccaagcgcgc tacgctggac gagttcatca gcaccgagcg tcccttggct 60
ctggagcgcc tgctctgcaa cattggtcct actggttgcc gtgcttcggg agctgcctcg 120
ggagtcgtta tcgcctcgcc gtcccgcagc gatccggact actactacac ttggacccgt 180
gatgctgctc tggtctttaa ggagattgtc gactctgtcg agactaacac cactctgctg 240
ctgccagaga ttgagaacta cgttactgcc caggcttacc tgcagaccgt gacgaacccc 300
tcgggttcgc tgtcggatgg tgctggtctg ggcgagccca agttcaacgt cgatatgact 360
cccttcactg gtgcctgggg tcgtcctcag cgtgatggtc cggctctgcg tgctacggct 420
atgatcgcct actacaacta cctgctcaac aacaacgcca ctaccgactg tggtctgtgg 480
cagattatcc agaacgacct gaattacgtc gctcagtact ggaaccaaac tggttacgac 540
ctgtgggagg aggttccggg ttcatccttt ttcactgttg ctgctcagta cagagctctc 600
gttgagggtt ctacccttgc tgccaagctc ggcaagtctc actcggccta cgacactgtc 660
gctccgcaga ttctgtgcta cttgcagagc ttctggtcat ccagcaaggg ctacattgtc 720
gccaacaccc agactgccag ctgggtctcg cggtccggtc ttgatgccaa cactcccttg 780
actgccatcc acctatttga ccctgaactt ggctgcgatg actcgacttt ccagccctgc 840
tcgcccaagc agcttatcac tactaagaag ctcgttgact cgttccgctc catctatgcc 900
atcaactcgg gcaagtctgc tggtgatgct ttggctgttg gtcgttacgc cgaggacgtc 960
ttctacaacg gcaacccctg gtacctgtgc actttggctg ttgcagagca gctttacgat 1020
gcagtttaca cttggaagct cgagggctcc atcaccgtca cctctgtctc gctgcccttc 1080
ttcactgacc tgctgccctc gctgaccact ggcacctacg cttcgggctc gaccaccttc 1140
gaatccatca tctctgctgt gactacctac gctgatggct ttgtcagtat tgtccagacc 1200
tacactccct ctgacggcgc tctgtctgag cagtactcca agtacaacgg ccagcagctg 1260
tcggctcccg acctgacctg gtcgtacgcc gctttcctat ctgccactga gcgccgtgac 1320
agcgttgtcc ctgccggctg ggctggtgcc tcgtctgtct ctgtgcccgg cgcctgcgct 1380
gctaccaccg ttgtcggaac ctacgctgct gcctccaact gcggtactcc tggctctggc 1440
tcgggcggca acggtggctc gagcggtaac gccctgtaat ag 1482
<210> 23
<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 变体2（不具有淀粉结合域的S188H/Y321W/Q419P）成熟蛋白氨基酸序列
<400> 23
Ser Pro Val Ser Lys Arg Ala Thr Leu Asp Glu Phe Ile Ser Thr Glu
1 5 10 15
Arg Pro Leu Ala Leu Glu Arg Leu Leu Cys Asn Ile Gly Pro Thr Gly
20 25 30
Cys Arg Ala Ser Gly Ala Ala Ser Gly Val Val Ile Ala Ser Pro Ser
35 40 45
Arg Ser Asp Pro Asp Tyr Tyr Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ala Ala Leu
50 55 60
Val Phe Lys Glu Ile Val Asp Ser Val Glu Thr Asn Thr Thr Leu Leu
65 70 75 80
Leu Pro Glu Ile Glu Asn Tyr Val Thr Ala Gln Ala Tyr Leu Gln Thr
85 90 95
Val Thr Asn Pro Ser Gly Ser Leu Ser Asp Gly Ala Gly Leu Gly Glu
100 105 110
Pro Lys Phe Asn Val Asp Met Thr Pro Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg
115 120 125
Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile Ala Tyr
130 135 140
Tyr Asn Tyr Leu Leu Asn Asn Asn Ala Thr Thr Asp Cys Gly Leu Trp
145 150 155 160
Gln Ile Ile Gln Asn Asp Leu Asn Tyr Val Ala Gln Tyr Trp Asn Gln
165 170 175
Thr Gly Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Pro Gly His Ser Phe Phe Thr
180 185 190
Val Ala Ala Gln Tyr Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser Thr Leu Ala Ala
195 200 205
Lys Leu Gly Lys Ser His Ser Ala Tyr Asp Thr Val Ala Pro Gln Ile
210 215 220
Leu Cys Tyr Leu Gln Ser Phe Trp Ser Ser Ser Lys Gly Tyr Ile Val
225 230 235 240
Ala Asn Thr Gln Thr Ala Ser Trp Val Ser Arg Ser Gly Leu Asp Ala
245 250 255
Asn Thr Pro Leu Thr Ala Ile His Leu Phe Asp Pro Glu Leu Gly Cys
260 265 270
Asp Asp Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro Lys Gln Leu Ile Thr Thr
275 280 285
Lys Lys Leu Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Ala Ile Asn Ser Gly
290 295 300
Lys Ser Ala Gly Asp Ala Leu Ala Val Gly Arg Tyr Ala Glu Asp Val
305 310 315 320
Trp Tyr Asn Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Cys Thr Leu Ala Val Ala Glu
325 330 335
Gln Leu Tyr Asp Ala Val Tyr Thr Trp Lys Leu Glu Gly Ser Ile Thr
340 345 350
Val Thr Ser Val Ser Leu Pro Phe Phe Thr Asp Leu Leu Pro Ser Leu
355 360 365
Thr Thr Gly Thr Tyr Ala Ser Gly Ser Thr Thr Phe Glu Ser Ile Ile
370 375 380
Ser Ala Val Thr Thr Tyr Ala Asp Gly Phe Val Ser Ile Val Gln Thr
385 390 395 400
Tyr Thr Pro Ser Asp Gly Ala Leu Ser Glu Gln Tyr Ser Lys Tyr Asn
405 410 415
Gly Gln Pro Leu Ser Ala Pro Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Phe
420 425 430
Leu Ser Ala Thr Glu Arg Arg Asp Ser Val Val Pro Ala Gly Trp Ala
435 440 445
Gly Ala Ser Ser Val Ser Val Pro Gly Ala Cys Ala Ala Thr Thr Val
450 455 460
Val Gly Thr Tyr Ala Ala Ala Ser Asn Cys Gly Thr Pro Gly Ser Gly
465 470 475 480
Ser Gly Gly Asn Gly Gly Ser Ser Gly Asn Ala Leu
485 490
<210> 24
<211> 1482
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码变体2（不具有淀粉结合域的S188H/Y321W/Q419P）成熟蛋白的核酸序列
<400> 24
tcgcctgttt ccaagcgcgc tacgctggac gagttcatca gcaccgagcg tcccttggct 60
ctggagcgcc tgctctgcaa cattggtcct actggttgcc gtgcttcggg agctgcctcg 120
ggagtcgtta tcgcctcgcc gtcccgcagc gatccggact actactacac ttggacccgt 180
gatgctgctc tggtctttaa ggagattgtc gactctgtcg agactaacac cactctgctg 240
ctgccagaga ttgagaacta cgttactgcc caggcttacc tgcagaccgt gacgaacccc 300
tcgggttcgc tgtcggatgg tgctggtctg ggcgagccca agttcaacgt cgatatgact 360
cccttcactg gtgcctgggg tcgtcctcag cgtgatggtc cggctctgcg tgctacggct 420
atgatcgcct actacaacta cctgctcaac aacaacgcca ctaccgactg tggtctgtgg 480
cagattatcc agaacgacct gaattacgtc gctcagtact ggaaccaaac tggttacgac 540
ctgtgggagg aggttccggg tcactccttt ttcactgttg ctgctcagta cagagctctc 600
gttgagggtt ctacccttgc tgccaagctc ggcaagtctc actcggccta cgacactgtc 660
gctccgcaga ttctgtgcta cttgcagagc ttctggtcat ccagcaaggg ctacattgtc 720
gccaacaccc agactgccag ctgggtctcg cggtccggtc ttgatgccaa cactcccttg 780
actgccatcc acctatttga ccctgaactt ggctgcgatg actcgacttt ccagccctgc 840
tcgcccaagc agcttatcac tactaagaag ctcgttgact cgttccgctc catctatgcc 900
atcaactcgg gcaagtctgc tggtgatgct ttggctgttg gtcgttacgc cgaggacgtc 960
tggtacaacg gcaacccctg gtacctgtgc actttggctg ttgcagagca gctttacgat 1020
gcagtttaca cttggaagct cgagggctcc atcaccgtca cctctgtctc gctgcccttc 1080
ttcactgacc tgctgccctc gctgaccact ggcacctacg cttcgggctc gaccaccttc 1140
gaatccatca tctctgctgt gactacctac gctgatggct ttgtcagtat tgtccagacc 1200
tacactccct ctgacggcgc tctgtctgag cagtactcca agtacaacgg ccagcccctg 1260
tcggctcccg acctgacctg gtcgtacgcc gctttcctat ctgccactga gcgccgtgac 1320
agcgttgtcc ctgccggctg ggctggtgcc tcgtctgtct ctgtgcccgg cgcctgcgct 1380
gctaccaccg ttgtcggaac ctacgctgct gcctccaact gcggtactcc tggctctggc 1440
tcgggcggca acggtggctc gagcggtaac gccctgtaat ag 1482
<210> 25
<211> 598
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有淀粉结合域的野生型葡糖淀粉酶成熟蛋白的氨基酸序列
<400> 25
Ser Pro Val Ser Lys Arg Ala Thr Leu Asp Glu Phe Ile Ser Thr Glu
1 5 10 15
Arg Pro Leu Ala Leu Glu Lys Leu Leu Cys Asn Ile Gly Ser Thr Gly
20 25 30
Cys Arg Ala Ser Gly Ala Ser Ser Gly Val Val Leu Ala Ser Pro Ser
35 40 45
Thr Ser Asn Pro Asp Tyr Tyr Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ala Ala Leu
50 55 60
Val Phe Lys Glu Ile Val Asp Ser Val Glu Thr Asn Thr Thr Leu Leu
65 70 75 80
Leu Pro Glu Ile Glu Asn Tyr Val Thr Ala Gln Ala Tyr Leu Gln Thr
85 90 95
Val Thr Asn Pro Ser Gly Ser Leu Ser Asp Gly Ala Gly Leu Ala Glu
100 105 110
Pro Lys Phe Asn Ala Asp Leu Thr Gln Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg
115 120 125
Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile Ala Tyr
130 135 140
Tyr Asn Tyr Leu Leu Asn Asn Asn Ala Thr Thr Asp Cys Gly Leu Trp
145 150 155 160
Gln Ile Ile Gln Asn Asp Leu Asn Tyr Val Ala Gln Tyr Trp Asn Gln
165 170 175
Thr Gly Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Pro Gly Ser Ser Phe Phe Thr
180 185 190
Val Ala Ala Gln Tyr Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser Thr Leu Ala Ala
195 200 205
Lys Leu Gly Lys Ser His Ser Ala Tyr Asp Thr Val Ala Pro Gln Ile
210 215 220
Leu Cys Tyr Leu Gln Ser Phe Trp Ser Ser Ser Lys Gly Tyr Ile Val
225 230 235 240
Ala Asn Thr Gln Thr Ala Ser Trp Val Ser Arg Ser Gly Leu Asp Ala
245 250 255
Asn Thr Pro Leu Thr Ala Ile His Leu Phe Asp Pro Glu Leu Gly Cys
260 265 270
Asp Asp Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro Lys Gln Leu Ile Thr Thr
275 280 285
Lys Lys Leu Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Ala Ile Asn Ser Gly
290 295 300
Lys Ser Ala Gly Thr Ala Leu Ala Val Gly Arg Tyr Ala Glu Asp Val
305 310 315 320
Tyr Tyr Asn Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Cys Thr Leu Ala Val Ala Glu
325 330 335
Gln Leu Tyr Asp Ala Val Tyr Thr Trp Lys Leu Glu Gly Ser Ile Thr
340 345 350
Val Thr Ser Val Ser Leu Pro Phe Phe Thr Asp Leu Leu Pro Ser Leu
355 360 365
Thr Thr Gly Thr Tyr Ala Ser Gly Ser Thr Thr Phe Glu Ser Ile Ile
370 375 380
Ser Ala Val Thr Thr Tyr Ala Asp Gly Phe Val Ser Ile Val Gln Thr
385 390 395 400
Tyr Thr Pro Ser Asp Gly Ala Leu Ser Glu Gln Tyr Asn Lys Ala Asn
405 410 415
Gly Gln Gln Leu Ser Ala Gln Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Phe
420 425 430
Leu Ser Ala Thr Glu Arg Arg Asp Ser Val Val Pro Ala Gly Trp Ala
435 440 445
Gly Ala Ser Ser Val Ser Val Pro Gly Ala Cys Ala Ala Thr Thr Val
450 455 460
Val Gly Thr Tyr Ala Ala Ala Ser Asn Cys Gly Thr Pro Gly Ser Gly
465 470 475 480
Ser Gly Gly Asn Gly Gly Ser Ser Gly Asn Ala Leu Val Thr Phe Asn
485 490 495
Glu Leu Ala Thr Thr Tyr Tyr Gly Glu Asn Ile Lys Leu Val Gly Ser
500 505 510
Thr Ala Ala Phe Gly Ser Trp Ser Pro Ser Ala Gly Ile Leu Leu Ser
515 520 525
Ala Ser Ser Tyr Thr Ala Ser Asn Pro Leu Trp Thr Thr Thr Val Ser
530 535 540
Val Pro Gln Gly Ser Thr Val Glu Phe Lys Phe Ile Arg Val Gly Ser
545 550 555 560
Asp Gly Ser Ile Thr Trp Glu Ser Gly Asn Asn Lys Val Leu Thr Val
565 570 575
Gly Ser Ser Ala Thr Ser Val Thr Val Ser Ala Ser Trp Asn Gly Ala
580 585 590
Tyr Ser Val Ser Ser Ser
595
<210> 26
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 野生型信号肽的氨基酸序列
<400> 26
Met Val Phe Leu Lys Ser Ala Ile Ala Ala Ser Thr Trp Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Thr Gly Val Val Ala
20

Claims (25)

1.包含变体葡糖淀粉酶的组合物，其中所述变体葡糖淀粉酶的序列为SEQ ID NO:15。
2.包含变体葡糖淀粉酶的组合物，其中所述变体葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:15相比发生选自由以下组成的组的任一氨基酸取代：S188H/Y321W/Q419P、K5T/S188T、K5T/E68K/S188H、K5Y/S188H、K5Q/E68K/S188T、K5N/E68Y/S188T、K5H/S188H、K5S/E68Y/S188H、K5S/E68Y/S188T、K5Y/E68Y、K5S/E68S/S188T、K5H/E68S/S188H、K5H/E68K/S188T、K5P/S188H、K5Y/E68K、K5T/S188H、K5S/S188H、E68Y/S188H、E68Y/S188T、K5T/Y321F、K5Q/S188H/Q419P、K5P/E68Y/S188T/A422S、K5N/S188H/Q419P、Y321W/A422S、E68K/Q419P、E68S/S188T/Y321W/A422S、K5Q/Q419P/A422S、S188T/Y321F、S188T/Q419P/A422S、K5H/S188T/Q419P/A422S、K5H/A422S、S188H/Y321W、Q419P/A422S、K5N/A422S、E68Y/S188H/Y321F/Q419P、K5Q/S188H、E11S/Y55F/M141L/N168S/T388Q、E11S/T31N/Y55F/M141L/N168S/T388Q、L19I/A195V、M141L/N168S/Y227F/T362Q/T388Q/D440Q、E11S/M141L、E11S/L19I/I44V/Y145A/T155A/D309S/L311V/Y412F/S472T、D309S/L311V、E11S/L19I/T31N/Y55F/A125P/N168S/Y227F、L19I/D309S/L311V/Y412F/A460S/S472T、E11S/L19I/N168S/Y227F/D309S/L311V/D440Q、L19I/Y412F、E11S/L19I/Y145A/A460S/S472T、E11S/M141L/N168S/D309S/L311V/T362Q/L364I/Y412F/A460S/S472T、E11S/Y55F/M141L/N168S/L311V/T362Q/L364I/A460S/S472T、E11S/L19I/Y55F/M141L/N168S/Y227F、L19I/T155A/A407S/Y412F/S472T、D53N/L149I/N150D/P186E/A317P、V42I/S103D/D106T/P186E/A317P/S434T/G478S、A317P/G478S、C26N/V42I/L149I/A317P/S355D/A374N、V42I/S103D/D106T/A317P、D53N/S434T、/S103D/A317P/V342I、A256V/A317P、V42I/P186E、A317P/V342I/G478S、I224V/A256V/A317P/G478S、V42I/L149I/N150D/A317P/G478S、V42I/S103D/P186E/A317P/V342I/S355D/A374N/A391G、P186E/A317P/G478S、D53N/G446S、A256V/A317P/G478S、V42I/D53N/T57S/L149I/A317P/G478S、C26N/V42I/D53N/T57S/N150D/P186E/A317P/V342I/G478S、V42I/S355D、V42I/N150D/P186E/A317P、V42I/S434T/G478S、C26N/D53N/T57S/S103D/Q161P/A317P/G478S、V42I/A256V/A317P/S434T、V42I/S103D/A317P/A391G/G478S、E68Y/I69L/G178T/Y179F/S213T/H214C、E68Y/I69L/E85Q/N86Q/F394Y/V395L、E68Y/I69L、D118N/M119E、E68Y/I69L/V97I/T98S/A246S/S247G/T261G/A262S/L347N/E348I、E68Y/I69L/S452A/V453S、E68Y/I69L/E85Q/N86Q/L347N/E348I/Q418T/Q419P、E68Y/I69L/E85Q/N86Q/S204N/T205A、A208T/K209R/E381N/S382D/Q418T/Q419P/A469S/A470T、E381N/S382D/Q418T/Q419P/T436S/E437A/A469S/A470T、Q418T/Q419P/A469S/A470T、V170I/A171T/E381N/S382D/Q418T/Q419P/A469S/A470T、F394Y/V395L/Q418T/Q419P/T436S/E437A/A469S/A470T、T78K/L79D/Q418T/Q419P/A469S/A470T、E68Y/I69L/V88I/T89S/T352S/V353I/Q399E/T400K/A469S/A470T、S72A/V73F/A153S/S306A/T476W、T370V/G475V、R49H/S72A/V73F/A92T/Y93K/A153S/S306A/T476W、E68Y/I69L/T219S/V220Q/A307E/S355D/L492P、E11S/V42I/L149I/I224V/A317P/T388Q/A460S/G478S、Y412F/Q418T/Q419P/A469S/A470T/、L19I/D53N/I69L/V88I/S188H/A195V/Y321W/Y412F、V42I/D118N/M119E/T261A/L311V/Y321W/S355D、E11S/T57S/T89S、E11S/V42I/L79Y/D118N/M141L/L311V/A317P/Y321F、V42I/D53N/E68Y/A317P/L347N、I69L/S188H/A195V/A317P/Y321F/L364I/S434T、T57S/A195V/T261A/L311V/Y321F/L347N/E348I/S434T、E11S/V42I/T57S/E68Y/S188H/A195V/T261A、T57S/N168S/T261A/A317P/Y321W/V395L/Y412F、E11S/D53N/E68Y/D118N/S188H/A195V/Y412F/Q419P、E11S/V42I/D118N/M141L/N168S/Y321W/Y412F、E11S/D53N/T57S/E68Y/T89S/E381N/Y412F/Q419P/S434T、E11S/D53N/T57S/V88I/T89S/S188H/A195V/L311V/L347N/Y412F、A317P/Y412F、I69L/T89S/L311V/A317P/Y321F/Y412F/S434T、V42I/D53N/T57S/E68Y/V88I/Y412F、E11S/T57S/V88I/M141L/T261A/Y321W/L364I/Y412F、V42I/I69L/S188H/A317P/Y321W/Y412F、E11S/V42I/D53N/T57S/L79Y/T89S/L311V/Y321W/Y412F、L19I/M141L/N168S/S188H/A195V/L311V/S355D/S434T、S188H/A195V/T261A/L311V/Y321F/L347N/E348I、E11S/L19I/D53N/T57S/N168S/L347N、E11S/I69L/M119E/A195V/T261A/A317P/Y321W/L347N/Y412F、L79Y/V88I/T261A/A317P/Y321F/L364I/Y412F、E11S/V42I/E68Y/T89S/L311V/Y321F/T388Q/F394Y/V395L/Q419P、D53N/E68Y/V88I/M141L/N168S/Y321W/Y412F、E11S/I69L/L311V/A317P/Y321F/L347N/Y412F、D53N/T57S/M141L、D53N/V88I/T89S/D118N/E348I/S355D、E11S/S188H/A195V/A317P/L347N/E348I/Y412F/Q419P/S434T、E11S/D53N/I69L/V88I/A317P/Q419P、E68Y/I69L/V88I/N168S/L364I/Q419P、E11S/V42I/V88I/T261A/Y321F/E348I/S355D、E11S/V42I/T57S/I69L/A195V/L347N/E348I/S355D、L19I/T89S/A317P/Y321F/S434T、E11S/V42I/L79Y/L311V/A317P/Y321W/L347N/E348I/L364I/Y412F、D53N/T57S/L347N/E348I/Y412F、D53N/T57S/E68Y/L79Y/Y412F/S434T、L19I/V88I/T89S/A317P、M119E/M141L/N168S/L311V/Y321F、E11S/T89S/Y321W、E11S/M141L/T261A/A317P/Y412F/S434T、V42I/L79Y/S188H/A195V/L311V/Y321F/S355D、V42I/E68Y/V88I/T261A/Y321W/L347N/E348I、L19I/E68Y/I69L/M141L/Y321F/L347N/S355D/E381N/Y412F、V42I/D53N/I69L/L79Y/D118N/T261A/L311V/A317P/Y321F/L347N/Y412F、E68Y/S355D/L364I/S382D/T388Q/Q419P、E11S/L19I/V42I/E68Y/I69L/D118N/M141L/Y321W/L347N、/E11S/V42I/E68Y/M141L/A317P/Y321F/E348I/S355D、E11S/V42I/E68Y/I69L/V88I/T89S/D118N/M119E/S188H/A195V/A317P/L347N/Y412F/Q419P、V42I/V88I/L311V/A317P/Y321F/L347N/E348I/T388Q/V395L/S434T、T261A/A317P/Y321W/E348I、E11S/V42I/E68Y/I69L/D118N/M119E/Y412F、E11S/V42I/T57S/I69L/L311V、V42I/Y412F、E11S/L19I/E68Y/M119E/N168S/Y412F/Q419P、L19I/L311V/Y412F、E11S/V42I/M119E/Y412F、E11S/L19I/V42I/D53N/S188H/A195V/L311V/Y321F/Y412F、E11S/L19I/V42I/T57S/D118N/N168S/L311V/Y412F、L19I/V42I/D53N/T57S/N168S/A317P/Y321W/Y412F、D53N/T57S/E68Y/N168S/S188H/A195V/L311V/Y321W/Y412F/Q419P、L19I/D53N/T57S/L311V/Y321W/Y412F、E11S/T57S/Y321W/Y412F/Q419P、D53N/S188H/A195V/L311V/Y412F、V42I/D53N/S188H/A195V/L311V/Y321F/Y412F、L19I/M119E/N168S/S188H/A195V/L311V/Y412F/Q419P、E11S/V42I/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/V42I/M119E/N168S/L311V/Y412F、E11S/V42I/N168S/L311V/A317P/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/V42I/D53N/E68Y/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F/Y412F、E11S/L19I/D53N/N168S/A195V/Y412F/Q419P、E11S/L19I/V42I/L311V/Y412F、V42I/D53N/N168S/L311V/Y412F、E11S/L311V/Y412F、E11S/D53N/T57S/L311V/Y321W/Y412F、E11S/L311V/Y321W/Y412F、E11S/V42I/I69L/D118N/N168S/L311V/A317P/Y412F/Q419P、E11S/L19I/V42I/E68Y/Y412F/Q419P、E11S/L19I/D53N/L311V、E11S/L19I/V42I/L311V/Y412F/Q419P、L19I/V42I/D53N/T57S/I69L/N168S/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321W、E11S/L19I/V42I/T57S/L311V/A317P/Y321F/Y412F、L19I/V42I/I69L/D118N/N168S/L311V/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/V42I/D53N/E68Y/S188H/A195V/Y412F、E11S/L19I/V42I/D53N/T57S/N168S/L311V/Y321W/Y412F、E11S/V42I/L311V/Y412F、E11S/L19I/V42I/N168S/A195V/L311V/Y321F/Y412F、E11S/V42I/S188H/L311V/Y412F、L19I/V42I/T57S/E68Y/M119E/S188H/A195V/L311V/Y321F/Y412F、E11S/L19I/V42I/D53N/N168S/S188H/A195V、E11S/L19I/V42I/T57S/E68Y/A195V/L311V/Y321W、E11S/L19I/V42I、S188H、E68K、K5N、S188T、K5T、K5P、A-15F/K5T/Y321F、V-20F/A-15I、V-20F/K5Q/S188H/Q419P、A-15I/Y321F、V-20F/A422S、A-15F/K5P/E68Y/S188T/A422S、V-20F/A-15I/A422S、V-20T/A-15I/Q419P、V-20F/K5N/S188H/Q419P、V-20F/Y321W/A422S、V-20F/E68K/Q419P、Y321F、A-15F/S188H/Y321W/Q419P、V-20F/Y321F、A-15F/Y321F、V-20F/E68S/S188T/Y321W/A422S、V-20F/A-15F/K5Q/Q419P/A422S、V-20I/A-15I/Y321F、V-20T/A-15I/K5Q、A-15I/Y321W、V-20F/A-15F/K5Q、V-20F/K5H/S188T/Q419P/A422S、V-20T/A-15I/K5H/A422S、A-15F/S188H/Y321W、A-15F/Q419P/A422S、V-20F/K5N/A422S、V-20F/A-15I/S188H、V-20F/A-15F/K5N/A422S、V-20F/A-15I/Y321F、V-20F/K5Q/S188H、V-20F、E11S、E11S/L19I/Y55F/A108-、S472T、R7C和L94V。
3.核酸，其编码根据权利要求1-2中任一项所述的变体葡糖淀粉酶。
4.根据权利要求3所述的核酸，其中所述核酸针对宿主生物体进行密码子优化以在所述生物体中表达所述变体葡糖淀粉酶。
5.根据权利要求4所述的核酸，其选自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24的序列。
6.表达载体，其包含根据权利要求3-5中任一项所述的核酸。
7.宿主细胞，其包含根据权利要求3-5中任一项所述的核酸。
8.宿主细胞，其包含根据权利要求6所述的表达载体。
9.根据权利要求7或权利要求8所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自细菌细胞或真菌细胞。
10.根据权利要求7或权利要求8所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为酵母细胞。
11.一种用于制备变体葡糖淀粉酶的方法，其包括：a)在表达所述变体葡糖淀粉酶的条件下培养根据权利要求7-9中任一项所述的宿主细胞；以及b)回收所述变体葡糖淀粉酶。
12.包含SEQ ID NO:13的C-末端截短的变体葡糖淀粉酶的组合物，其中所述截短位置位于选自下组的任一位置编号处：493、500、502、503、506、509、510、513、514、519、520、522、524、525、544、549、550、551、556、558、560、563、564和569。
13.包含变体葡糖淀粉酶的组合物，所述变体葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:13相比发生选自由以下组成的组的任一氨基酸取代：
S188H/Y321W/Q419P、T98S/Q161P/F516L、T98S/Q161P/N570P、T98S/Q161P、T550D/F555S、V65I/Y412F/Y503S/S518I、Y412F/Y503S/I564T、Y412F/Y503E、Y412F/Y503E/S518I、V65I/Y412F/Y503S、V65I/Y503E、Y503D/S518I/I564N、Y503E/S518L、V65I/Y503E/S544Q、V65I/Y503S、Y503E/S544E、V65I/Y503E/S544E/I564N、V65I/Y412F/Y503E、Y503E/S518I/S544Q、V65I/Y503E/S518M、Y412F/S518L、Y503E/S544Q、V65I/Y412F/Y503E/S544E/I564T/G569I、Y412F/Y503S、Y503E/I564T、S549D/F555D/G559N、S549D/F555R、K508T/L526N/S549D/G559N、K508T/G559N、F555D/I556P/G559N、S549D/F555R/I556P/G559N、F555R/I556P、L526I/F555R/I556P、F555R/I556P/G559N、K508T/I556P/G559N、F555D/I556P、K508T/L526N/A534T/S549D/I556P、K508T/L526I/S549D/G559N、K508N/L526I/S549E/F555L/G559N、L526N/S549D/F555D/I556P、L526I/F555D/G559N、A38V/F555R、A39F/T540N/T542N、L498T/T542N/T581N/T584N、T542N/T581N/T584N、S535Y/T542N、T540N/T584N、T540N/T542N/T581N/T584N、L498T/T581N/T584N、L498T/T584N、L498T/T542N/T581N、P121S/T542N/T584N、L498T/T542N、S535Y/T540N/T542N/T581N、Q419P/P423R、L79F/Q419P、Q419P/P423V、Q419P/P423R/T533R、S36P/Q419P、Q419P/P423G、S36P/T400L/Q419P/P423G、S50Q/Q419P/P423R、S50Q/Q419P/P423R/G457S/E497V/P521S、Y321F/A422S、S188H/Q419P、K5H/Y321W、K5N/Y321F、K5P/S188H、E68S/S188H/A422S、S188T/Y321F/Q419P/A422S、K5H/S188H/Y321F/A422S、S188H/A422S、S188H/A422S/V545A、K5Q/A422S、K5S/E68K/Y321W、K5H/Y321F/A422S、K5Y/A422S、Q419P/A422S、K5Y/S188H/A422S、K5T/A422S、K5T/Y321W、Y321W/A422S、K5P/Y321F、E68K/A422S、K5H/Y321F、K5T/Y321F/Q419P/A422S、K5T/E68Y/S188T、K5S/E68Y/S188H、K5N/S188H、K5T/E68S/S188T、K5H/E68Y/S188P、K5P/E68Y/S188T、K5T/E68K/S188H、K5P/E68K/S188T、K5H/E68Y/S188T、K5T/S188H、K5T/E68N/S188T、K5Y/E68Y/S188T、K5S/E68Y/S188T、K5Q/E68K/S188H、K5P/E68N/S188H、K5P/E68N/S188T、K5P/E68Y/S188H、K5Y/E68Y/S188H、K5S/S188T、K5H/E68N/S188H、K5H/S46T/E68K/S188H、K5H/E68K/S188T、K5Q/E68Y/S188T、K5Y/E68N/S188H、V42I/S188H/A195V/Y412F/Q419P、L19I/V42I/E68Y/N168S/S188H/A195V/Y412F、E11S/V42I/T57S/D118N/N168S/S188H/A195V/L311V、E11S/V42I/D53N/E68Y/N168S/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/L19I/V42I/I69L/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/L19I/V42I/E68Y/D118N/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/L19I/T57S/M119E/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/V42I/A317P/Y412F/Q419P、L19I/T57S/I69L/D118N/N168S/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F/Y412F/Q419P、E11S/E68Y/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/L19I/V42I/E68Y/I69L/D118N/N168S/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/L19I/V42I/S188H/A195V/L311V/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/L19I/N168S/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F/Y412F、E11S/V42I/E68Y/Y412F、E11S/L19I/V42I/E68Y/Y412F、E11S/V42I/E68Y/S188H/A195V/Y412F、E11S/L19I/V42I/T57S/I69L/S188H/A195V/L311V/Y321W/Y412F、E11S/L19I/D53N/E68Y/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/V42I/E68Y/S188H/A195V/L311V/Y321W/Y412F、E11S/V42I/E68Y/S188H/L311V/Y412F/Q419P、E11S/L19I/V42I/E68Y/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/L19I/D53N/I69L/S188H/A195V/L311V/Q419P、E11S/V42I/E68Y/N168S/L311V/A317P/Y321W/Y412F、E11S/E68Y/I69L/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F/Y412F、E11S/V42I/T57S/E68Y/I69L/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F、E11S/D53N/T57S/L311V/Y321F/Y412F/Q419P、E11S/L19I/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/L19I/I69L/S188H/A195V/L311V/A317P、E11S/V42I/I69L/N168S/S188H/A195V/L311V/A317P/Y412F/Q419P、E11S/V42I/E68Y/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/V42I/I69L/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F/Y412F、E11S/Y412F、E11S/L19I/V42I/E68Y/I69L/S188H/A195V/Y412F、E11S/L19I/V42I/D53N/T57S/S188H/A195V/L311V/Y321W/Y412F、V42I/E68Y/Y412F、E11S/L19I/V42I/D53N/T57S/E68Y/I69L/N168S/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F、E11S/L19I/V42I/D53N/T57S/I69L/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321W/Y412F、E11S/V42I/A317P/Y321F、E11S/V42I/T57S/E68Y/D118N/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/L19I/V42I/E68Y/I69L/D118N/N168S/S188H/A195V/L311V/Y412F/Q419P、E11S/V42I/D53N/E68Y/S188H/A195V/L311V/Y412F、E11S/I69L/D118N/S188H/A195V/L311V/Y412F、V42I/D53N/T57S/E68Y/M141L/N168S/T261A/Y321W/E381N/Y412F、E11S/V42I/S188H/L347N/Y412F/S434T、D53N/T57S/E68Y/D118N/M119E/L311V/E348I/Y412F、D118N/N168S/S188H/L347N/E348I/S382D/T388Q/V395L、E68Y/I69L/N168S/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321W/Y412F/Q419P、E11S/E68Y/V88I/A317P/Y321F/S355D、D53N/I69L/L79Y/M119E/T261A/L311V/L347N/E348I/Q419P、V42I/E68Y/I69L/D118N/M119E/M141L/L311V/A317P/Y321F/L347N、E11S/L19I/E68Y/I69L/L79Y/M141L/N168S/T261A/A317P/Y321W/L347N、E11S/V42I/E68Y/I69L/L311V/Y321W/S434T、E11S/V42I/D53N/N168S/L311V/A317P/Y321W、E11S/E68Y/I69L/D118N/N168S/Y321F/Y412F、V42I/D53N/T57S/L311V/Y321W/S355D/Y412F/Q419P、V42I/E68Y/L311V/L347N/L364I/Y412F、E11S/D118N/M119E/M141L/L311V/Y321W/L347N、V42I/D53N/T57S/M119E/M141L/A317P/Y321F/Q419P、T57S/I69L/T89S/S188H/A195V/T261A/L311V/A317P/Y321W/F394Y/Y412F、Y321F/Y412F、V42I/T57S/E68Y/I69L/T89S/M119E/T261A/A317P/Y412F/S434T、E11S/V42I/E68Y/L311V/A317P/S434T、V42I/D53N/T57S/E68Y/I69L/S434T、V42I/E68Y/Y321W、L311V/L347N/E348I/S355D/L364I/S434T、E11S/D53N/T57S/E68Y/V88I/T89S/M119E/A317P/Y321W、D53N/E68Y/I69L/T89S/L311V/A317P/S355D/Q419P、V42I/E68Y/A317P/Y321F/Y412F、L19I/I69L/T89S/L311V/A317P/Y321F/S355D/L364I/Y412F、V42I/D53N/T57S/E68Y/I69L/M141L/S188H/A195V/L311V/A317P/Y321F/Y412F/S434T、T57S/V88I/A317P/Y321W/Q419P、E11S/L19I/V42I/D53N/E68Y/L311V/A317P/Y321W/Y412F、E11S/V42I/D53N/E68Y/I69L/S188H/A195V/E348I、L19I/V42I/T57S/I69L/V88I/M119E/T261A/A317P/Y321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14.根据权利要求1-2和12-13中任一项所述的组合物，其中所述组合物为饲料补充剂。
15.核酸，其编码根据权利要求12-13中任一项所述的所述变体葡糖淀粉酶。
16.根据权利要求15所述的核酸，其中所述核酸针对宿主生物体进行密码子优化以在所述生物体中表达所述变体葡糖淀粉酶。
17.根据权利要求15所述的核酸，其中所述核酸为SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20。
18.表达载体，其包含根据权利要求15-17中任一项所述的核酸。
19.宿主细胞，其包含根据权利要求15-17中任一项所述的核酸。
20.宿主细胞，其包含根据权利要求18所述的表达载体。
21.根据权利要求19或权利要求20所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自细菌细胞或真菌细胞。
22.根据权利要求19或权利要求20所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为酵母细胞。
23.一种用于制备变体葡糖淀粉酶的方法，其包括：a)在表达所述变体葡糖淀粉酶的条件下培养根据权利要求19-22中任一项所述的宿主细胞；以及b)回收所述变体葡糖淀粉酶。
24.适用于动物消耗的制剂，其中所述制剂包含根据权利要求1-2和12-13中任一项所述的变体葡糖淀粉酶和至少一种可消耗组分。
25.一种淀粉底物的糖类糖化的方法，其包括使所述底物与根据权利要求1-2和12-13中任一项所述的变体葡糖淀粉酶接触，其中所述淀粉被降解。
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