CN110651048A - 葡糖淀粉酶变体和编码它们的多核苷酸 - Google Patents

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CN110651048A CN201880020667.4A CN201880020667A CN110651048A CN 110651048 A CN110651048 A CN 110651048A CN 201880020667 A CN201880020667 A CN 201880020667A CN 110651048 A CN110651048 A CN 110651048A
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Abstract

本发明涉及葡糖淀粉酶变体，与如SEQ ID NO:2披露的葡糖淀粉酶相比，其具有增加的生淀粉活性，该变体包含选自以下的、催化结构域中的一个或多个修饰和/或淀粉结合结构域中的一个或多个修饰：a)以下至少一项、优选地至少两项、优选地至少三项、优选地至少四项：V18M、T43K、N112L、T116R、A117Q、G120S、A271F、Y295W、Q318Y；和/或b)引入选自下组的至少三个、优选地至少四个取代：S458C、S458SCGG、S458SGGC、A493V、A518K、E520Q、N527M、S540K,R、S(G)546P、T(V)549W、N503R、N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A。本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、和宿主细胞；以及使用这些变体的方法。

Description

葡糖淀粉酶变体和编码它们的多核苷酸
序列表的引用
本申请包含处于计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。
发明背景
技术领域
本发明涉及葡糖淀粉酶变体、编码这些变体的多核苷酸、产生这些变体的方法、以及使用这些变体的方法。还描述了本发明的葡糖淀粉酶变体用于淀粉转化以产生发酵产物(例如乙醇)和糖浆(例如葡萄糖)的用途。本发明还涉及包括本发明的葡糖淀粉酶变体的组合物。
背景技术
葡糖淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC 3.2.1.3)是催化D-葡萄糖从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放的一种酶。葡糖淀粉酶由若干丝状真菌和酵母产生，其中来自曲霉属(Aspergillus)的那些在商业上最为重要。
在商业上，葡糖淀粉酶用于将已经由α-淀粉酶部分水解的含淀粉材料转化成葡萄糖。然后可以使用发酵生物将葡萄糖直接或间接地转化成发酵产物。商业发酵产物的实例包括醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇、1,3-丙二醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、葡糖酸盐、乳酸、丁二酸、2,5-二酮-D-葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)，和更复杂的化合物，包括例如抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；激素和其他难以合成生产的化合物。发酵过程通常还用于可食用酒精(例如，啤酒和酒)工业、乳制品(例如，在酸乳和奶酪的生产中)工业中。
最终产物还可以是糖浆。例如，最终产物可以是葡萄糖，但是还可以被葡萄糖异构酶转化成果糖或由几乎均等的葡萄糖与果糖组成的一种混合物。这种混合物或进一步富含果糖的一种混合物是全世界最常用的商业化高果糖玉米糖浆(HFCS)。
本发明的目的是提供具有葡糖淀粉酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸，并且这些多肽和多核苷酸在发酵产物的生产过程(例如乙醇生产过程)中提供高产量。
WO 2011/068803披露了从真菌粘褶菌(Gloeophyllum)，特别是从篱边粘褶菌(Gloeophyllum sepiarium)和密粘褶菌(Gloeophyllum trabeum)分离的葡糖淀粉酶。
本发明提供了与其亲本相比具有改进的特性的葡糖淀粉酶变体。
WO 2014/177546、WO 2016/062875和WO 2017/066255披露了具有增加的热稳定性和增加的比活性的褐褶菌属物种(Gloeophyllum sp.)的葡糖淀粉酶变体。
具体地，令人希望的是提供针对生淀粉(非糊化淀粉)具有良好热稳定性和高水解活性二者的葡糖淀粉酶变体。
发明内容
在第一方面，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，与SEQ ID NO:2中披露的葡糖淀粉酶相比，其在pH＝4.0，T＝32℃下，具有增加的生淀粉水解活性，其中该变体源自以下葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶具有：包含SEQ ID NO:2的氨基酸1-454或SEQ ID NO:4的1-454的催化结构域，包含SEQ ID NO:2的氨基酸455-462或SEQ ID NO:4的氨基酸455-465的接头，以及包含SEQ ID NO:2的氨基酸463-556或SEQ ID NO:4的氨基酸466-559的淀粉结合结构域，并且其中该变体进一步包含选自由以下组成的组的具体取代的组合：
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
S95P+A121P+Y295W+T116R+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+G120S+A121P+Y295W+Q318Y+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+S458SCGG+N527M+T(V)549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+S458SCGG+N527M+T(V)549W+N503R；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+Q318Y+S95P+A121P+Y295W+S458SCGG+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+G120S+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+S458SCGG+N527M T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
S95P+T116R+A121P+Y295W+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N527M+T(V)549W+N503R；
S95P+A121P+Y295W+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
V18M+T43K+S95P+A121P+A518K+N527M+T549W；
T43K+S95P+G120S+A121P+Y295W+Q318Y+A518K+N527M+T(V)549W；
T43K+S95P+A121P+Q318Y+A493V+A518K+N527M+T549W；
S95P+G120S+A121P+Y295W+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
V18M+T43K+S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N527M+T(V)549W；
T43K+S95P+A121P+Q318Y+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+N527M+T549W；
S95P+A121P+Y295W+T116R+N527M+T(V)549W；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+A493V+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A493V+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+A518K+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+A117Q+N527M+T(V)549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A493V+A518K+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Q318Y+A493V+N527M+T549W；
S95P+T116R+A121P+Y295W+A518K+N527M+T(V)549W；
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T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+A518K+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+A518K+T549W；
S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N527M+T(V)549W；
S95P+G120S+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
S95P+N112L+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N527M+T549W；
S95P+G120S+A121P+Y295W+A518K+N527M+T(V)549W；
S95P+N112L+A121P+Y295W+A518K+N527M+T(V)549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+T549W；
S95P+A121P+Y295W+A493V+A518K+E520Q+T549W；
S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M+T549W；
S95P+A121P+Y295W+A518K+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M；
S95P+A121P+Y295W+S458C+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
S95P+A121P+Y295W+N527M+T549W；
S95P+A121P+A271F+Y295W+A518K+N527M+T549W；
S95P+A121P+Y295W+A493V；
S95P+A121P+Y295W+S540K；
S95P+A121P+Y295W+S540R；
S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M；
S95P+A121P+Y295W+S458SGGC+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+S458SCGG+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；其中位置编号对应于SEQ ID NO:2中阐明的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在第二方面，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，与SEQ ID NO:2中披露的葡糖淀粉酶相比，其在pH＝4.0，T＝32℃下，具有增加的生淀粉水解活性，其中该变体包含选自以下的修饰：
(i)用SEQ ID NO:4的氨基酸466-559替换SEQ ID NO:2的淀粉结合结构域氨基酸463-556；和/或
(ii)引入以下取代和插入：N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A，使用SEQ ID NO:2进行编号；
其中该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性，并且其中与SEQID NO:2相比，生淀粉水解活性的增加是至少10％，例如至少15％。
在第三方面，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，与SEQ ID NO:4中披露的葡糖淀粉酶相比，其在pH＝4.0，T＝32℃下，具有增加的生淀粉水解活性，其中该变体包含引入以下取代和插入的修饰：N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A，使用SEQ IDNO:2进行编号；其中该变体与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性，并且其中与SEQ ID NO:4相比，生淀粉水解活性的增加是至少15％。
在第四方面，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，与SEQ ID NO:2中披露的葡糖淀粉酶相比，其在pH＝4.0，T＝32℃下，具有增加的生淀粉水解活性，其中该变体包含选自以下的修饰：
(i)用SEQ ID NO:4的氨基酸466-559替换SEQ ID NO:2的淀粉结合结构域氨基酸463-556；和/或
(ii)引入取代G459C+N527M+T(V)549W，使用SEQ ID NO:2进行编号；其中该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性，并且其中与SEQ ID NO:2相比，生淀粉水解活性的增加是至少10％，例如至少15％。
在第五方面，本发明涉及用于增加葡糖淀粉酶的生淀粉水解活性的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供杂合葡糖淀粉酶，该杂合葡糖淀粉酶包含：由SEQ ID NO:2的氨基酸1-454组成的第一氨基酸序列，选自SEQ ID NO:2的氨基酸455-462或SEQ ID NO:4的氨基酸455-465的第二氨基酸序列，以及选自SEQ ID NO:2的氨基酸463-556或SEQ ID NO:4的氨基酸466-559的第三氨基酸序列；和/或
(b)引入选自以下中的至少一项、优选地至少两项、优选地至少三项、优选地至少四项的取代的组合：V18M、T43K、N112L、T116R、A117Q、G120S、A271F、Y295W、Q318Y；和/或
(c)引入选自下组的至少三个、优选地至少四个取代：S458C、S458SCGG、S458SGGC、A493V、A518K、E520Q、N527M、S540K,R、S(G)546P、T(V)549W、N503R、
N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A。
在第六方面，本发明涉及用于增加葡糖淀粉酶的生淀粉水解活性的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供杂合葡糖淀粉酶，该杂合葡糖淀粉酶包含：由SEQ ID NO:2的氨基酸1-454组成的第一氨基酸序列，选自SEQ ID NO:4的氨基酸455-465的第二氨基酸序列，以及选自SEQ ID NO:4的氨基酸466-559的第三氨基酸序列；和/或
(b)引入选自以下中的至少一项的取代的组合：V18M、T43K、T116R、G120S、Y295W、Q318Y；和/或
(c)引入以下3个选项之一：i)N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；ii)N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；iii)选自下组的至少三个取代：S458SCGG、N527M、T(V)549W、和N503R。
本发明还涉及编码本发明的变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、和宿主细胞；以及产生这些变体的方法。
本发明进一步涉及包括本发明的葡糖淀粉酶变体的组合物。
在另一个方面，本发明涉及该葡糖淀粉酶变体用于生产糖浆或发酵产物的用途。
仍在另一个方面，本发明涉及一种由含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)在α-淀粉酶存在下使含淀粉材料液化；
(b)使所液化的材料糖化；以及
(c)使用发酵生物进行发酵；
其中使用本发明的至少一种葡糖淀粉酶变体进行步骤(b)。
在另一个方面，本发明涉及由含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)在低于含淀粉材料的初始糊化温度的温度下使所述含淀粉材料糖化；以及
(b)使用发酵生物进行发酵，
其中使用本发明的至少一种葡糖淀粉酶变体进行步骤(a)。
在另外的方面，本发明涉及由含淀粉材料生产糖浆产物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)在α-淀粉酶存在下使含淀粉材料液化；
(b)在本发明的葡糖淀粉酶变体的存在下，使液化的材料糖化。
在另一个实施例中，本发明涉及由含淀粉材料生产糖浆产物的方法，该方法包括以下步骤：在本发明的葡糖淀粉酶变体的存在下，在低于含淀粉材料的初始糊化温度的温度下使所述含淀粉材料糖化。
定义
葡糖淀粉酶：术语葡糖淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC 3.2.1.3)被定义为催化D-葡萄糖从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放的一种酶。出于本发明的目的，根据本文实例中所述的程序确定葡糖淀粉酶活性。葡糖淀粉酶单位(AGU)被定义为在标准条件下(37℃，pH 4.3，底物：23.2mM麦芽糖，缓冲液：0.1M乙酸盐，反应时间：5分钟)每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶的量。
等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变而自然产生，并且可以导致群体内部的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工，然后呈现为成熟的剪接的mRNA。
编码序列：术语“编码序列”意指多核苷酸，该多核苷酸直接规定了变体的氨基酸序列。编码序列的边界通常由可读框确定，该可读框以起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。这类控制序列包括但不限于前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、和转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区域连接的特异性限制位点的目的，控制序列可以提供有接头。
表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，该分子包括编码变体的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
片段：术语“片段”意指具有在成熟多肽的氨基和/或羧基末端不存在的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中该片段具有葡糖淀粉酶活性。
高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。
改进的特性：术语“改进的特性”意指与相对于亲本有所改进的变体相关的特征。此类改进的特性包括但不限于增加的生淀粉水解活性、和增加的热稳定性。
分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。
低严格条件：术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃、于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并且变性的鲑鱼精子DNA以及25％甲酰胺中预杂交和杂交12小时至24小时。最后在50℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，该成熟多肽是SEQID NO:2的氨基酸1至556。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:4的氨基酸1至559。在本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或多种不同的成熟多肽(即，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有葡糖淀粉酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸52至1719。SEQID NO:1的核苷酸1至51编码信号肽。在另一个方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:3的核苷酸52至1728。SEQ ID NO:3的核苷酸1至51编码信号肽。
中严格条件：术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在55℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。
中-高严格条件：术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。
突变体：术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链核酸分子，其分离自天然存在的基因，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段，或是合成的，所述核酸分子包含一个或多个控制序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列引导该编码序列的表达。
亲本或亲本葡糖淀粉酶术语“亲本”或“亲本葡糖淀粉酶”意指对其作出改变以产生本发明的这些酶变体的具有葡糖淀粉酶活性的任何多肽。
生淀粉水解活性：术语“生淀粉水解活性”意指在实例中披露的条件下，在pH＝4.0和T＝32℃下测量水解活性。
序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人,2000,TrendsGenet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用非简化(-nobrief)选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：
(同一的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来确定两个脱氧核苷酸序列之间的序列同一性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人,2000,见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序所实施的。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用非简化(-nobrief)选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：
(同一的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
变体：术语“变体”意指具有葡糖淀粉酶活性的、包含一个改变(即在一个或多个(例如，若干)位置处的一个取代、插入和/或缺失)的一种多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占用某一位置的氨基酸；缺失意指去除占用某一位置的氨基酸；并且插入意指在邻接并且紧随占用某一位置的氨基酸之后添加氨基酸。与SEQ ID NO:2的多肽的葡糖淀粉酶相比，本发明的这些变体具有至少5％，例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、或至少50％的生淀粉水解活性的增加。
非常高严格条件：术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。
非常低严格条件：术语“非常低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在45℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。
野生型葡糖淀粉酶：术语“野生型”葡糖淀粉酶意指由在自然界中发现的天然存在的微生物(如细菌、酵母或丝状真菌)表达的葡糖淀粉酶。在一个实施例中，野生型葡糖淀粉酶源自篱边粘褶菌。在本披露中，其也被命名为Gs-AMG。在另一个方面，野生型葡糖淀粉酶源自密褐褶菌。在本披露中，其也被命名为Gt-AMG。
变体命名惯例
出于本发明的目的，在SEQ ID NO:2中披露的多肽用于确定另一种葡糖淀粉酶中对应的氨基酸残基。将另一种葡糖淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2中披露的多肽进行比对，并且基于该比对，使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定与SEQ ID NO:2中所披露的成熟多肽中的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。
可以通过使用若干计算机程序，使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种葡糖淀粉酶中的对应氨基酸残基的鉴定，这些计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数预期的多序列比较；版本3.5或更新版本；Edgar,2004,Nucleic Acids Research[核酸研究]32:1792-1797)，MAFFT(版本6.857或更新版本；Katoh和Kuma,2002,Nucleic AcidsResearch[核酸研究]30:3059-3066；Katoh等人,2005,Nucleic Acids Research[核酸研究]33:511-518；Katoh和Toh,2007,Bioinformatics[生物信息学]23:372-374；Katoh等人,2009,Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]537:39-64；Katoh和Toh,2010,Bioinformatics[生物信息学]26:1899-1900)，以及采用ClustalW(1.83或更新版本；Thompson等人,1994,Nucleic Acids Research[核酸研究]22:4673-4680)的EMBOSS EMMA。
当其他酶与SEQ ID NO:2的多肽相背离这样使得传统的基于序列的比较方法不能检测其关系时(Lindahl和Elofsson,2000,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]295:613-615)，可使用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中较高的敏感度可使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表现(谱)来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(Atschul等人,1997,Nucleic Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族具有在蛋白结构数据库中的一个或多个代表，可以实现甚至更高的敏感度。程序如GenTHREADER(Jones,1999,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]287:797-815；McGuffin和Jones,2003,Bioinformatics[生物信息学]19:874-881)利用来自多种来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱、以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，Gough等人,2000,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]313:903-919的方法可用于将未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型进行比对。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评估此类模型的准确度。
对于已知结构的蛋白质，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白质的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(Holm和Sander,1998,Proteins[蛋白质]33:88-96)或组合延伸(Shindyalov和Bourne,1998,Protein Engineering[蛋白质工程]11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以发现可能的结构同源物(例如，Holm和Park,2000,Bioinformatics[生物信息学]16:566-567)。
在描述本发明的变体中，为了便于参考，对以下所述的命名法进行了改编。采用了已接受的IUPAC单字母或三字母的氨基酸缩写。
取代.对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、被取代的氨基酸。因此，将在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或“T226A”。多个突变通过加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表在位置205和位置411处的甘氨酸(G)和丝氨酸(S)分别被精氨酸(R)和苯丙氨酸(F)取代。
缺失.对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。因此，将在位置195处的甘氨酸的缺失表示为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失由加号(“+”)分开，例如，“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
插入.对于氨基酸插入，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。因此，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸表示为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2；等]。例如，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸表示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。
在此类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号而对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此会是：
<u>亲本：</u> <u>变体：</u>
195 195 195a 195b
G G-K-A
多种改变.包含多种改变的变体由加号(“+”)分开，例如，“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。
不同改变.在可于一个位置处引入不同改变的情况下，不同的改变由逗号分开，例如，“Arg170Tyr,Glu”代表用酪氨酸或谷氨酸取代在位置170处的精氨酸。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”表示以下变体：
“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”、和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。
具体实施方式
本发明涉及相比于亲本葡糖淀粉酶具有改进的特性的葡糖淀粉酶变体。在一个具体实施例中，亲本葡糖淀粉酶是源自篱边粘褶菌的葡糖淀粉酶，例如在本文中如SEQ IDNO:2披露的葡糖淀粉酶，或源自密褐褶菌，例如本文中如SEQ ID NO:4披露的葡糖淀粉酶。在一个具体实施例中，改进的特性选自与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中披露的亲本葡糖淀粉酶相比，增加的生淀粉水解活。在一个实施例中，通过在pH＝4.0，T＝32℃(详细条件参见实例1)下孵育葡糖淀粉酶变体与真菌α-淀粉酶(例如SEQ ID NO:6中披露的真菌α-淀粉酶)的组合后，从颗粒状淀粉释放葡萄糖，通过变体的生淀粉降解性能来测量生淀粉水解的增加。在另一个实施例中，与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中披露的亲本葡糖淀粉酶相比，根据本发明的变体具有增加的热稳定性。
变体
本发明提供了葡糖淀粉酶变体，其相比于野生型亲本葡糖淀粉酶具有增加的生淀粉水解活性。具体地，亲本葡糖淀粉酶选自以下：获得自篱边粘褶菌的葡糖淀粉酶，例如在本文中如SEQ ID NO:2披露的葡糖淀粉酶，或源自密褐褶菌，例如本文中如SEQ ID NO:4披露的葡糖淀粉酶。通过在如本文披露的催化结构域和/或接头和/或淀粉结合结构域(SBD)中引入取代/插入(使用SEQ ID NO:2进行编号)，提供根据本发明的变体。在不同亲本葡糖淀粉酶，例如像SEQ ID NO:4的情况下，将亲本葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:2的葡糖淀粉酶进行比对，并且如本文所披露地鉴定和修饰与SEQ ID NO:2中位置相对应的位置。
在一个具体实施例中，引入催化结构域中的取代选自由以下组成的组：V18M、T43K、N112L、T116R、A117Q、G120S、A271F、Y295W、Q318Y；特别是Y295W；T116R+Y295W；T43K+Y295W+Q318Y；V18M+T43K+Q318Y；V18M+T43K+T116R+Q318Y。这些变体可以进一步包含取代S95P+A121P。在接头和SBD中引入的取代/插入优选地选自下组：S458C、S458SCGG、S458SGGC、A493V、A518K、E520Q、N527M、S540K,R、S(G)546P、T(V)549W、N503R、
N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A。
更确切地，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，与SEQ ID NO:2中披露的葡糖淀粉酶相比，其在pH＝4.0，T＝32℃下，具有增加的生淀粉水解活性，其中该变体源自以下葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶具有：包含SEQ ID NO:2的氨基酸1-454或SEQ ID NO:4的1-454的催化结构域，包含SEQ ID NO:2的氨基酸455-462或SEQ ID NO:4的氨基酸455-465的接头，以及包含SEQ ID NO:2的氨基酸463-556或SEQ ID NO:4的氨基酸466-559的淀粉结合结构域，并且其中该变体进一步包含选自由以下组成的组的具体取代的组合：
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
S95P+A121P+Y295W+T116R+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+G120S+A121P+Y295W+Q318Y+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+S458SCGG+N527M+T(V)549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+S458SCGG+N527M+T(V)549W+N503R；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+Q318Y+S95P+A121P+Y295W+S458SCGG+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+G120S+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+S458SCGG+N527M T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
S95P+T116R+A121P+Y295W+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N527M+T(V)549W+N503R；
S95P+A121P+Y295W+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
V18M+T43K+S95P+A121P+A518K+N527M+T549W；
T43K+S95P+G120S+A121P+Y295W+Q318Y+A518K+N527M+T(V)549W；
T43K+S95P+A121P+Q318Y+A493V+A518K+N527M+T549W；
S95P+G120S+A121P+Y295W+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
V18M+T43K+S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N527M+T(V)549W；
T43K+S95P+A121P+Q318Y+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+N527M+T549W；
S95P+A121P+Y295W+T116R+N527M+T(V)549W；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+A493V+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A493V+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+A518K+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+A117Q+N527M+T(V)549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A493V+A518K+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Q318Y+A493V+N527M+T549W；
S95P+T116R+A121P+Y295W+A518K+N527M+T(V)549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+T(V)549W；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+A518K+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+A518K+T549W；
S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N527M+T(V)549W；
S95P+G120S+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
S95P+N112L+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N527M+T549W；
S95P+G120S+A121P+Y295W+A518K+N527M+T(V)549W；
S95P+N112L+A121P+Y295W+A518K+N527M+T(V)549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+T549W；
S95P+A121P+Y295W+A493V+A518K+E520Q+T549W；
S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M+T549W；
S95P+A121P+Y295W+A518K+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M；
S95P+A121P+Y295W+S458C+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
S95P+A121P+Y295W+N527M+T549W；
S95P+A121P+A271F+Y295W+A518K+N527M+T549W；
S95P+A121P+Y295W+A493V；
S95P+A121P+Y295W+S540K；
S95P+A121P+Y295W+S540R；
S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M；
S95P+A121P+Y295W+S458SGGC+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+S458SCGG+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
其中位置编号对应于SEQ ID NO:2中阐明的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在另一个实施例中，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，与SEQ ID NO:2中披露的葡糖淀粉酶相比，其在pH＝4.0，T＝32℃下，具有增加的生淀粉水解活性，其中该变体源自以下葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶具有：包含SEQ ID NO:2的氨基酸1-454的催化结构域，包含SEQ IDNO:4的氨基酸455-465的接头，以及包含SEQ ID NO:4的氨基酸466-559的淀粉结合结构域，并且其中该变体包含选自由以下组成的组的具体取代的组合：
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
S95P+A121P+Y295W+T116R+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+G120S+A121P+Y295W+Q318Y+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+S458SCGG+N527M+T(V)549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+S458SCGG+N527M+T(V)549W+N503R；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+S458SCGG+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+G120S+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+S458SCGG+N527M T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
S95P+T116R+A121P+Y295W+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N527M+T(V)549W+N503R；
S95P+A121P+Y295W+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；其中位置编号对应于SEQ ID NO:2中阐明的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性；并且其中与SEQ ID NO:2相比，生淀粉水解活性的增加是至少30％、至少35％，例如至少40％。
特别地，这些变体可以进一步包含取代G456S+P461S+E472Q+L481I+E489S+A493P+E520Q。
在一个具体实施例中，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，与SEQ ID NO:2中披露的葡糖淀粉酶相比，其在pH＝4.0，T＝32℃下，具有增加的生淀粉水解活性，其中该变体源自SEQID NO:2的葡糖淀粉酶，并且其中该变体包含选自由以下组成的组的具体取代的组合：
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+A518K+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Q318Y+A493V+A518K+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Q318Y+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+A493V+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A493V+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A493V+A518K+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Q318Y+A493V+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+A518K+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+A518K+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+T549W；
S95P+A121P+Y295W+A493V+A518K+E520Q+T549W；
S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M+T549W；
S95P+A121P+Y295W+N527M+T549W；
S95P+A121P+A271F+Y295W+A518K+N527M+T549W；
S95P+A121P+Y295W+A493V；
S95P+A121P+Y295W+S540K；
S95P+A121P+Y295W+S540R；
S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M；其中位置编号对应于SEQ ID NO:2中阐明的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性；并且其中与SEQ ID NO:2相比，生淀粉水解活性的增加是至少5％。
在另一个具体实施例中，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，与SEQ ID NO:2中披露的葡糖淀粉酶相比，其在pH＝4.0，T＝32℃下，具有增加的生淀粉水解活性，其中该变体源自SEQID NO:2的葡糖淀粉酶，并且其中该变体包含选自由以下组成的组的具体取代的组合：
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+A518K+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Q318Y+A493V+A518K+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Q318Y+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+A493V+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A493V+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A493V+A518K+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Q318Y+A493V+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+A518K+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+A518K+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+T549W；
S95P+A121P+Y295W+A493V+A518K+E520Q+T549W；
S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M+T549W；
其中位置编号对应于SEQ ID NO:2中阐明的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性；并且其中与SEQ ID NO:2相比，生淀粉水解活性的增加是至少20％。
在另一个具体实施例中，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，与SEQ ID NO:2中披露的葡糖淀粉酶相比，其在pH＝4.0，T＝32℃下，具有增加的生淀粉水解活性，其中该变体源自SEQID NO:2的葡糖淀粉酶，并且其中该变体包含选自以下的具体取代的组合：
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+N527M+T549W；其中位置编号对应于SEQ IDNO:2中阐明的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性；并且其中与SEQ ID NO:2相比，生淀粉水解活性的增加是至少5％、至少10％，至少15％、特别是至少20％。
在另一个具体实施例中，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，与SEQ ID NO:2中披露的葡糖淀粉酶相比，其在pH＝4.0，T＝32℃下，具有增加的生淀粉水解活性，其中该变体源自以下葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶具有：包含SEQ ID NO:2的氨基酸1-454的催化结构域，包含SEQ ID NO:4的氨基酸455-465的接头，以及包含SEQ ID NO:4的氨基酸466-559的淀粉结合结构域，并且其中该变体包含选自由以下组成的组的具体取代的组合：
T43K+S95P+G120S+A121P+Y295W+Q318Y+A518K+N527M+T(V)549W；
S95P+G120S+A121P+Y295W+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+T116R+N527M+T(V)549W；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+A518K+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+A117Q+N527M+T(V)549W；
S95P+T116R+A121P+Y295W+A518K+N527M+T(V)549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N527M+T(V)549W；
S95P+G120S+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M+T(V)549W；
S95P+N112L+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
S95P+G120S+A121P+Y295W+A518K+N527M+T(V)549W；
S95P+N112L+A121P+Y295W+A518K+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+A518K+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M；
S95P+A121P+Y295W+S458C+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
S95P+A121P+Y295W+S458SGGC+N539R+I541Y+T543V+A545S+
S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+S458SCGG+N539R+I541Y+T543V+A545S+
S546GCGV+G547S+S548T+T549A；其中位置编号对应于SEQ ID NO:2中阐明的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性；并且其中与SEQ ID NO:2相比，生淀粉水解活性的增加是至少2％。
在另一个具体实施例中，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，与SEQ ID NO:2中披露的葡糖淀粉酶相比，其在pH＝4.0，T＝32℃下，具有增加的生淀粉水解活性，其中该变体源自以下葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶具有：包含SEQ ID NO:2的氨基酸1-454的催化结构域，包含SEQ ID NO:4的氨基酸455-465的接头，以及包含SEQ ID NO:4的氨基酸466-559的淀粉结合结构域，并且其中该变体包含选自由以下组成的组的具体取代的组合：
T43K+S95P+G120S+A121P+Y295W+Q318Y+A518K+N527M+T(V)549W；
S95P+G120S+A121P+Y295W+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+T116R+N527M+T(V)549W；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+A518K+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+A117Q+N527M+T(V)549W；
S95P+T116R+A121P+Y295W+A518K+N527M+T(V)549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N527M+T(V)549W；
S95P+G120S+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M+T(V)549W；
S95P+N112L+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
S95P+G120S+A121P+Y295W+A518K+N527M+T(V)549W；
S95P+N112L+A121P+Y295W+A518K+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+A518K+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M；
S95P+A121P+Y295W+S458C+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；其中位置编号对应于SEQ ID NO:2中阐明的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性；
并且其中与SEQ ID NO:2相比，生淀粉水解活性的增加是至少15％，例如至少20％。
在另一个方面，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，与SEQ ID NO:2中披露的葡糖淀粉酶相比，其在pH＝4.0，T＝32℃下，具有增加的生淀粉水解活性，其中该变体包含选自以下的修饰：
i)用SEQ ID NO:4的氨基酸466-559替换SEQ ID NO:2的淀粉结合结构域氨基酸463-556；和/或
ii)引入以下取代和插入：N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A，使用SEQ ID NO:2进行编号；
其中该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性，并且其中与SEQID NO:2相比，生淀粉水解活性的增加是至少10％，例如至少15％。
具体地，这些变体可以进一步包含以下取代中的任一项：
V18M、T43K、T116R、A271F、Y295W、Q318Y；特别是Y295W；T116R+Y295W；T43K+Y295W+Q318Y；V18M+T43K+Q318Y；V18M+T43K+T116R+Q318Y。
在另一个方面，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，与SEQ ID NO:4中披露的葡糖淀粉酶相比，其在pH＝4.0，T＝32℃下，具有增加的生淀粉水解活性，其中该变体包含引入以下取代和插入的修饰：N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A，使用SEQ IDNO:2进行编号；其中该变体与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性，并且其中与SEQ ID NO:4相比，生淀粉水解活性的增加是至少15％。
具体地，这些变体可以进一步包含以下取代中的任一项：
V18M、T43K、T116R、A271F、Y295W、Q318Y；特别是Y295W；T116R+Y295W；T43K+Y295W+Q318Y；V18M+T43K+Q318Y；V18M+T43K+T116R+Q318Y。
在另一个方面，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，与SEQ ID NO:2中披露的葡糖淀粉酶相比，其在pH＝4.0，T＝32℃下，具有增加的生淀粉水解活性，其中该变体包含选自以下的修饰：
i)用SEQ ID NO:4的氨基酸466-559替换SEQ ID NO:2的淀粉结合结构域氨基酸463-556；和/或
ii)引入取代G459C+N527M+T(V)549W，使用SEQ ID NO:2进行编号；其中该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性，并且其中与SEQ ID NO:2相比，生淀粉水解活性的增加是至少10％，例如至少15％。
具体地，这些变体可以进一步包含以下取代中的任一项：
V18M、T43K、T116R、A271F、Y295W、Q318Y；特别是Y295W；T116R+Y295W；T43K+Y295W+Q318Y；V18M+T43K+Q318Y；V18M+T43K+T116R+Q318Y。
优选地，本发明的所有变体包含S95P+A121P。
在另一个方面，本发明涉及通过在如本文披露的催化结构域和/或接头和/或淀粉结合结构域(SBD)中引入取代/插入(使用SEQ ID NO:2进行编号)来增加亲本葡糖淀粉酶的生淀粉水解活性的方法。在不同亲本葡糖淀粉酶，例如像SEQ ID NO:4的情况下，将亲本葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:2的葡糖淀粉酶进行比对，并且如本文所披露地鉴定和修饰与SEQID NO:2中位置相对应的位置。
因此，在一个实施例中，本发明涉及用于增加葡糖淀粉酶的生淀粉水解活性的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供杂合葡糖淀粉酶，该杂合葡糖淀粉酶包含：由SEQ ID NO:2的氨基酸1-454组成的第一氨基酸序列，选自SEQ ID NO:2的氨基酸455-462或SEQ ID NO:4的氨基酸455-465的第二氨基酸序列，以及选自SEQ ID NO:2的氨基酸463-556或SEQ ID NO:4的氨基酸466-559的第三氨基酸序列；和/或
(b)引入选自以下中的至少一项、优选地至少两项、优选地至少三项、优选地至少四项的取代的组合：V18M、T43K、N112L、T116R、A117Q、G120S、A271F、Y295W、Q318Y；和/或
(c)引入选自下组的至少三个、优选地至少四个取代：S458C、S458SCGG、S458SGGC、A493V、A518K、E520Q、N527M、S540K,R、S(G)546P、T(V)549W、N503R、N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A。
优选地，还引入取代S95P+A121P。
在另一个实施例中，本发明涉及用于增加葡糖淀粉酶的生淀粉水解活性的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供杂合葡糖淀粉酶，该杂合葡糖淀粉酶包含：由SEQ ID NO:2的氨基酸1-454组成的第一氨基酸序列，选自SEQ ID NO:4的氨基酸455-465的第二氨基酸序列，以及选自SEQ ID NO:4的氨基酸466-559的第三氨基酸序列；和/或
(b)引入选自以下中的至少一项的取代的组合：V18M、T43K、T116R、G120S、Y295W、Q318Y；和/或
(c)引入以下3个选项之一：i)N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；ii)N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；iii)选自下组的至少三个取代：S458SCGG、N527M、T(V)549W、和N503R。
优选地，还引入取代S95P+A121P。
这些变体在一个或多个(例如，若干个)其他位置上可进一步包括一个或多个另外的改变。例如，根据本发明的变体可以与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，改变的数目是1-20个，例如，1-10和1-5个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。
这些氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-末端或羧基末端延伸，例如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一官能(如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。
保守取代的实例是在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins[蛋白质],学术出版社(Academic Press),纽约中描述。常见取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
可替代地，这些氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等。
可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,1989,Science[科学]244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一种技术中，在分子中的每个残基上引入单一丙氨酸突变，并且测试所得的突变型分子的葡糖淀粉酶活性以鉴别对分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，Hilton等人,1996,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性部位还可通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点(contract site)氨基酸进行突变。参见，例如，de Vos等人,1992,Science[科学]255:306-312；Smith等人,1992,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人,1992,FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。
在一个实施例中，与亲本葡糖淀粉酶相比，这些变体具有增加的生淀粉活性。在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有增加的比活性。
在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有增加的热稳定性。
亲本葡糖淀粉酶
在一个实施例中，该亲本葡糖淀粉酶源自褐褶菌属，具体地是篱边粘褶菌。该亲本葡糖淀粉酶可以是(a)与SEQ ID NO:2的多肽具有至少85％序列同一性的多肽；(b)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，或(ii)(i)的全长互补体杂交；或(c)由如下的多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少85％序列同一性。
在一个方面，该亲本与SEQ ID NO:2的多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性，所述多肽具有葡糖淀粉酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的多肽相差多达10个氨基酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个。
在另一方面，该亲本包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成。
在另一个方面，该亲本由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在高严格条件下、或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(ii)或(i)的全长互补体杂交(Sambrook等人,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第二版,Cold Spring Harbor,New York[冷泉港，纽约])。
在一个实施例中，该亲本葡糖淀粉酶源自褐褶菌属，具体地是密褐褶菌。该亲本葡糖淀粉酶可以是(a)与SEQ ID NO:4的多肽具有至少85％序列同一性的多肽；(b)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在高严格条件下与(i)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列，或(ii)(i)的全长互补体杂交；或(c)由如下的多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ IDNO:3的成熟多肽编码序列具有至少85％序列同一性。
在一个方面，该亲本与SEQ ID NO:4的多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性，所述多肽具有葡糖淀粉酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:4的多肽相差多达10个氨基酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个。
在另一方面，该亲本包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由其组成。
在另一个方面，该亲本由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在高严格条件下、或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列、(ii)或(i)的全长互补体杂交(Sambrook等人,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第二版,Cold Spring Harbor,New York[冷泉港，纽约])。
在另一个实施例中，该亲本是由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。
该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域在另一种多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。
该亲本可以是融合多肽或可切割融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，且包括连接编码多肽的编码序列使得它们符合读框，而且融合多肽的表达处于一个或多个相同的启动子和终止子的控制之下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(Cooper等人,1993,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人,1994,Science[科学]266:776-779)。
融合多肽可进一步包含两个多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：Martin等人,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物生物技术杂志]3:568-576；Svetina等人,2000,J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人,1997,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:498-503；和Contreras等人,1991,Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人,1986,Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人,1995，Biotechnology[生物技术]13:982-987；Carter等人,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics[蛋白质：结构、功能以及遗传学]6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World[世界药物发现]4:35-48。
该亲本可以是真菌性葡糖淀粉酶。例如，该亲本可以是褐褶菌属葡糖淀粉酶。
在另一个方面，该亲本是密褐褶菌、或篱边粘褶菌。
在另一个方面，该亲本是篱边粘褶菌葡糖淀粉酶(Gs AMG)，例如SEQ ID NO:2的葡糖淀粉酶，或密褐褶菌葡糖淀粉酶(Gt AMG)，例如SEQ ID NO:4的葡糖淀粉酶。
这些物种的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection,Northern Regional Research Center，NRRL)。
可以使用以上探针，鉴定亲本并从其他来源包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物获得该亲本，或从天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)直接获得DNA样品。用于从天然生境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可通过类似地筛选另一种微生物或混合DNA样品的基因组DNA或cDNA文库来获得编码亲本的多核苷酸。一旦已经用一种或多种探针检测到编码亲本的多核苷酸，则可以通过利用对本领域的普通技术人员来说已知的技术来分离或克隆该多核苷酸(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)。
变体的制备
可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备变体，如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。
定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。
通过涉及使用包含所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，所述盒式诱变涉及由限制酶在包括编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将包含突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化质粒和寡核苷酸的限制性酶是相同的，从而允许质粒和插入物的粘性末端彼此连接。参见例如，Scherer和Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]76:4949-4955；和Barton等人,1990,Nucleic Acids Res.[核酸研究]18:7349-4966。
还可以通过本领域中已知的方法在体内实现定点诱变。参见例如，美国专利申请公开号2004/0171154；Storici等人,2001,Nature Biotechnol.[自然生物技术]19:773-776；Kren等人,1998,Nat.Med.[自然医学]4:285-290；以及Calissano和Macino,1996,Fungal Genet.Newslett.[真菌遗传学时事通讯]43:15-16。
可以在本发明中使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的许多可商购的试剂盒。
合成基因构建需要设计的多核苷酸分子的体外合成以编码感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，如由Tian等人(2004,Nature[自然]432:1050-1054)所述的基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。
使用已知的诱变、重组和/或改组方法、随后进行一个相关的筛选程序可以做出单或多氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，这些相关的筛选程序例如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625所披露的那些。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人,1991,Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等人,1986,Gene[基因]46:145；Ner等人,1988,DNA 7:127)。
诱变/改组方法可以与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等人,1999,Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中各个氨基酸残基的重要性。
通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是利用合成的多核苷酸片段的过程结合PCR技术。因此，基因的限定区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以进行易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的变体的多核苷酸。
核酸构建体
本发明还涉及包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中表达。在一个具体实施例中，至少一种控制序列与编码本发明的变体的多核苷酸是异源的。因此，该核酸构建体在自然界中是不可见的。
可以按多种方式来操纵多核苷酸以提供变体的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操作可以是理想的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
控制序列可以是启动子，即由宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的多核苷酸。启动子包含介导变体的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型和杂合型启动子，并且可以是从编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的适合启动子的实例是从以下酶的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的修饰的启动子，其中已经用来自构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替换未翻译的前导序列)；及其突变型、截短型及杂合型启动子。
控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。终止子序列被可操作地连接至编码变体的多核苷酸的3’-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何终止子。
丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下酶的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区域，其增加该基因的表达。
控制序列也可以是前导序列，即对宿主细胞翻译很重要的mRNA的非翻译区域。前导子序列可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的5’-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
该控制序列还可以是多腺苷酸化序列，即被可操作地连接至该变体编码序列的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别成将多腺苷酸残基添加到所转录的mRNA上的信号的序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。
丝状真菌宿主细胞的优选多聚腺苷酸化序列从以下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸酯合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉-α葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、和尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
控制序列还可以是信号肽编码区，该信号肽编码区编码与变体的N-末端连接的信号肽，并且指导变体进入细胞的分泌通路。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地含有信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，该编码序列的5’末端可以包含对于该编码序列来说是外来的信号肽编码序列。在编码序列天然地不包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地替代天然信号肽编码序列，以便增强变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。
用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码序列是从以下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
所述控制序列还可以是编码位于变体的N-末端的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以例如从以下酶的基因获得：嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，前肽序列定位成紧邻变体的N-末端并且信号肽序列定位成紧邻前肽序列的N-末端。
还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节变体的表达的调节序列。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调控化合物的存在。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKA α-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该变体的多核苷酸将与该调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包含编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个合宜的限制位点以允许在此类位点处插入或取代编码变体的多核苷酸。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该用于表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以包含用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同包含待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。
载体优选地包含允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标志。选择性标志是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。
优选用于曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因。
载体优选地包含允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
为了整合至宿主细胞基因组中，载体可以依赖于编码变体的多核苷酸序列或用于借助同源或非同源重组整合至基因组中的任何其他载体元件。可替代地，该载体可包含用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的染色体中的精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当包含足够数目的核酸，如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对，这些核酸与对应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体还可以另外包含复制起点，该复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、及ARS4与CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人,1991,Gene[基因]98:61-67；Cullen等人,1987,Nucleic Acids Res.[核酸研究]15:9163-9175；WO00/24883)。可以根据WO 00/24883中公开的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。
可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞中以增加变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标志基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标志基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。
用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的核酸构建体，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持，如较早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码变体的基因及其来源。
宿主细胞可以是在变体的重组产生中有用的任何细胞，例如真核细胞。
宿主细胞可以是真核生物，如真菌细胞。如本文所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如由Hawksworth等人在以下文献中所定义：Ainsworth and Bisby’sDictionary of The Fungi[Ainsworth和Bisby氏真菌字典],第8版,1995,国际应用生物科学中心(CAB International),英国剑桥大学出版社(University Press,Cambridge,UK))。
真菌宿主细胞可以为酵母细胞。如本文所用的“酵母”包括产子嚢酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌类(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类可在将来变化，出于本发明的目的，酵母应当如Biology and Activities of Yeast[酵母的生物学与活性](Skinner,Passmore和Davenport编,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9[应用细菌学学会专题论文集系列9],1980)中所描述的那样定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁弗酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
在一个具体实施例中，将表达本发明的葡糖淀粉酶变体的宿主酵母细胞用于本发明的方法中，用于从含淀粉材料生产发酵产物，更具体地，宿主细胞是酿酒酵母细胞。
真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)的亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人,1995,见上文)所定义的)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳多糖、甘露聚糖和其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长来进行的，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)来进行的，而碳分解代谢可以是发酵性的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、毡金孢子菌、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢菌、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢菌、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢菌、硫色镰孢菌、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
产生方法
本发明还涉及产生变体的方法，这些方法包括：(a)在适合该变体的表达的条件下培养本发明的宿主细胞；以及(b)回收该变体。
使用本领域已知的方法在适合于产生变体的营养介质中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养细胞。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的适合的营养介质中。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)制备。如果变体被分泌到营养介质中，则变体可以直接从培养基中回收。如果变体没有分泌，则它可以从细胞裂解液中回收。
可以使用本领域已知的方法回收该变体。例如，可以通过多种常规程序从营养介质中回收该变体，这些常规方法包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
可以通过本领域中已知的多种程序来纯化变体以获得基本上纯的变体，这些程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见例如，Protein Purification[蛋白质纯化],Janson和Ryden编辑,VCH出版社(VCH Publishers),纽约,1989)。
在可替代的方面，没有回收变体，而是将表达变体的本发明的宿主细胞用作变体的来源。
组合物
本发明还涉及包括本发明的葡糖淀粉酶变体的组合物。优选地，该组合物还包括运载体和/或赋形剂。更优选地，这些组合物富含这样一种多肽。术语“富集”指示，该组合物的葡糖淀粉酶活性已经增加，例如富集因子为至少1.1。优选地，配制这些组合物以提供所希望的特性，如浅颜色、低气味、以及可接受的储存稳定性。
组合物可以包括本发明的葡糖淀粉酶变体作为主要的酶组分，例如单组分组合物。可替代地，该组合物可以包括多种酶活性，如氨肽酶、α-淀粉酶、异淀粉酶、碳水化合物酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、支链淀粉酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
在一个具体实施例中，该组合物包括α-淀粉酶和根据本发明的葡糖淀粉酶变体。在另一个实施例中，该组合物包括异淀粉酶和根据本发明的葡糖淀粉酶变体。在另一个实施例中，该组合物包括α-淀粉酶、异淀粉酶和根据本发明的葡糖淀粉酶变体。
在另一方面，该组合物包括与支链淀粉酶组合的本发明的葡糖淀粉酶变体。在另一方面，该组合物包括与支链淀粉酶、和异淀粉酶组合的本发明的葡糖淀粉酶变体。在另一方面，该组合物包括与支链淀粉酶、和α-淀粉酶组合的本发明的葡糖淀粉酶变体。
在一个具体实施例中，该组合物进一步包括蛋白酶。
除了根据本发明的葡糖淀粉酶变体之外，该组合物可以进一步包括α-淀粉酶。具体地，该α-淀粉酶是酸性真菌α-淀粉酶。真菌酸性稳定的α-淀粉酶是在3.0至7.0的pH范围内，并且优选地在3.5至6.5的pH范围内具有活性的α-淀粉酶，包括在约4.0、4.5、5.0、5.5、和6.0的pH时的活性。
优选地，酸性真菌α-淀粉酶源自曲霉属，具体是土曲霉、黑曲霉、米曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、或白曲霉的菌株；或者源自根毛霉属，优选地微小根毛霉的菌株；或亚灰树花菌属，优选地大型亚灰树花菌的菌株。
在一个优选实施例中，该α-淀粉酶源自根毛霉属的菌株，优选的是菌株微小根毛霉，例如示于WO 2013/006756中的SEQ ID NO:3中的一种，例如具有黑曲霉接头和淀粉结合结构域的微小根毛霉α-淀粉酶杂合体，例如示于本文的SEQ ID NO:5中的一种，或其变体。
在一个实施例中，该α-淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含SEQ ID NO:5的多肽的α-淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的α-淀粉酶，该氨基酸序列与SEQ ID NO:5的多肽具有至少60％、至少70％，如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。
在一个实施例中，该α-淀粉酶是示于SEQ ID NO:5中的具有以下取代或取代的组合中的至少一个的α-淀粉酶的变体：D165M；Y141W；Y141R；K136F；K192R；P224A；P224R；S123H+Y141W；G20S+Y141W；A76G+Y141W；G128D+Y141W；G128D+D143N；P219C+Y141W；N142D+D143N；Y141W+K192R；Y141W+D143N；Y141W+N383R；Y141W+P219C+A265C；Y141W+N142D+D143N；Y141W+K192R+V410A；G128D+Y141W+D143N；Y141W+D143N+P219C；Y141W+D143N+K192R；G128D+D143N+K192R；Y141W+D143N+K192R+P219C；G128D+Y141W+D143N+K192R；或G128D+Y141W+D143N+K192R+P219C(使用SEQ ID NO:5进行编号)。
在一个实施例中，源自具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉的α-淀粉酶，优选如SEQ ID NO:5披露的，优选具有一个或多个以下取代：G128D、D143N、优选G128D+D143N(使用SEQ ID NO:5用于编号)，并且其中该α-淀粉酶变体与SEQ IDNO:5的多肽具有至少75％同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％同一性。
在一个实施例中，在糖化和/或发酵期间存在的和/或添加的葡糖淀粉酶与α-淀粉酶之间的比率优选地可以在500:1至1:1，如从250:1至1:1、如从100:1至1:1、如从100:2至100:50、如从100:3至100:70的范围内。
可以根据本领域已知的方法来制备多肽组合物，并且这些多肽组合物可以处于液体或干组合物的形式。例如，多肽组合物可以处于颗粒或微粒的形式。可以根据本领域已知的方法将包括于该组合物中的多肽稳定化。
以下给出了本发明的多肽或多肽组合物的优选用途的实例。本发明的多肽组合物的剂量以及使用该组合物的其他条件可以基于本领域中已知的方法进行确定。
以上组合物适合在液化、糖化、和/或发酵过程中使用，优选在淀粉转化中使用，尤其是用于产生糖浆和发酵产物，如乙醇。
以下给出了本发明的多肽组合物的优选用途的实例。本发明的多肽组合物的剂量以及使用该组合物的其他条件可以基于本领域中已知的方法进行确定。
使用本发明的葡糖淀粉酶变体的方法-工业应用
本发明的葡糖淀粉酶变体具有允许各种工业应用的有价值特性。具体而言，这些葡糖淀粉酶变体可以用于乙醇生产以及淀粉转化过程中。
这些葡糖淀粉酶变体可以用于淀粉过程，具体地，淀粉转化。还考虑了用于淀粉转化目的的组合物，除了本发明的葡糖淀粉酶以外，这些组合物还包括α-淀粉酶、支链淀粉酶和/或蛋白酶。
此外，本发明的葡糖淀粉酶特别适用于从淀粉或全谷粒中生产甜味剂以及乙醇(参见，例如，美国专利号5,231,017，该专利通过引用结合在此)，如燃料乙醇、饮用乙醇以及工业乙醇。
在一个实施例中，本发明涉及根据本发明的葡糖淀粉酶用于由含淀粉材料生产糖浆和/或发酵产物的用途。在一个实施例中，该淀粉材料可以是经糊化的。在另一个实施例中，该淀粉材料是未经糊化的。
淀粉加工
天然淀粉由室温下不溶于水的微观颗粒组成。加热水性淀粉浆料时，颗粒膨胀并且最后破裂，将淀粉分子分散至溶液中。在高达约50℃至75℃的温度时，膨胀可以是可逆的。然而，在更高温度，开始不可逆膨胀，称为“糊化”。在此“糊化”过程中，黏度有显著地增加。有待加工的颗粒状淀粉可以具有高度精制的淀粉质量，优选地至少90％、至少95％、至少97％或至少99.5％纯，或它可以为含更粗糙的淀粉的材料，这些材料包括(例如，经碾磨的)全谷物，全谷物包含非淀粉部分，如胚芽残留物和纤维。该原材料(如全谷物)可以例如经过碾磨减少粒度，以便展开结构并且允许进一步加工。在干式碾磨中，整个谷粒被碾磨并且使用。湿磨使胚芽与粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)很好分离并且时常应用于在例如糖浆的生产中使用淀粉水解物的场所。干式和湿式碾磨两者是本领域中熟知的淀粉加工法并且可以用于本发明的方法中。用于减少该含淀粉材料的粒度的方法为本领域的普通技术人员所熟知。
由于典型工业过程中的固体水平为30％-40％，因此不得不稀释或“液化”淀粉以使其能够被适当加工。在当前商业实践中，这种黏度的降低主要通过酶促降解来实现。
在α-淀粉酶，优选细菌α-淀粉酶和/或酸性真菌α-淀粉酶的存在下进行液化。在一个实施例中，在液化过程中还存在植酸酶。在一个实施例中，在液化过程中还存在降低黏度的酶如木聚糖酶和/或β-葡聚糖酶。
在液化过程中，α-淀粉酶将长链淀粉降解为支链以及直链的较短单元(麦芽糊精)。液化可以作为一个三步热浆料方法进行。将浆料加热至60℃-95℃之间(例如70℃-90℃，如77℃-86℃、80℃-85℃、83℃-85℃)并且添加α-淀粉酶以开始液化(稀释)。
在一个实施例中，可以将浆料在95℃-140℃(例如，105℃-125℃)之间喷射蒸煮约1-15分钟，例如约3-10分钟，尤其是5分钟左右。然后，将浆料冷却至60℃-95℃并且添加更多的α-淀粉酶，以获得最终水解(二次液化)。在pH 4.5-6.5，典型地在5与6之间的pH时进行喷射蒸煮过程。可以例如在喷射蒸煮之前，将α-淀粉酶以单一剂量添加。
在70℃-95℃之间，如80℃-90℃，如85℃左右，将液化过程进行约10分钟至5小时，典型地是1小时-2小时。pH在4与7之间，如在5.5与6.2之间。为了确保这些条件下最佳的酶稳定性，可以任选地添加钙(以提供1ppm-60ppm游离钙离子，如约40ppm游离钙离子)。如此处理之后，液化淀粉将典型地具有10-15的“右旋糖当量”(DE)。
通常，液化和液化条件在本领域是熟知的。
可以使用本领域熟知的条件，用产碳水化合物源的酶，特别是葡糖淀粉酶或β-淀粉酶以及任选地去分支酶(如异淀粉酶或支链淀粉酶)进行糖化。例如，全部糖化步骤可以持续从约24至约72小时。然而，常见地在30℃-65℃之间的温度(典型地约60℃)进行典型地40-90分钟的预糖化，随后在同时糖化和发酵(SSF)方法中，在发酵期间进行完全糖化。典型地在20℃-75℃的范围内的温度(例如，25℃-65℃和40℃-70℃，典型地60℃左右)，并且在约4与5之间的pH，一般在约pH 4.5时进行糖化。
糖化步骤和发酵步骤可以依序或同时进行。在一个实施例中，糖化和发酵是同时进行的(称为“SSF”)。然而，通常，在30℃至65℃、典型地约60℃的温度处执行一个预糖化步骤约30分钟至2小时(例如，30分钟至90分钟)，随后在被称为同时糖化和发酵(SSF)的发酵期间进行一个完全糖化。pH通常在4.2-4.8之间，例如，pH 4.5。在同时糖化和发酵(SSF)过程中，没有糖化的保持阶段，而实际上是，酵母和酶是一起添加的。
在典型糖化过程中，通过添加葡糖淀粉酶以及任选地去分支酶，如异淀粉酶(美国专利号4,335,208)或支链淀粉酶，来将液化期间产生的麦芽糊精转化成右旋糖。添加葡糖淀粉酶以及去分支酶之前使温度降低至60℃。糖化过程进行24-72小时。在添加糖化酶之前，使pH降低至低于4.5，同时维持高温(高于95℃)，以便使液化α-淀粉酶失活。此过程减少了称为“潘糖前体”的短低聚糖的形成，这种短低聚糖不能通过去分支酶来适当水解。正常地，约0.2％-0.5％的糖化产物是分支三糖潘糖(Glc pα1-6Glc pα1-4Glc)，它不能由支链淀粉酶降解。如果糖化过程中仍然存在来自液化步骤的活性淀粉酶(即未变性)，潘糖的量可以高至1％-2％，这是高度不希望的，因为它显著降低了糖化产率。
其他发酵产物可以在本领域的普通技术人员熟知的、适于所讨论的发酵生物的条件和温度下发酵。
可以通过本领域熟知的方法(例如，通过蒸馏)回收发酵产物。
在一个具体实施例中，本发明的方法在将含淀粉材料转化为糖/糊精之前进一步包括以下步骤：
(x)减少该含淀粉材料的粒度；以及
(y)形成包含该含淀粉材料和水的浆料。
在一个实施例中，将该含淀粉材料碾磨，以减少粒度。在一个实施例中，该粒度被减少至0.05-3.0mm、优选0.1-0.5mm之间，或使得至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％的含淀粉材料适合通过一个具有0.05-3.0mm筛网、优选0.1-0.5mm筛网的筛子。
该水性浆料可以包含含淀粉材料的10wt.％-55wt.％干固体(DS)，优选25wt.％-45wt.％干固体(DS)，更优选30wt.％-40wt.％干固体(DS)。
常规淀粉转化过程如液化以及糖化过程描述于例如美国专利号3,912,590、EP252730以及EP 063909中，这些专利通过引用结合在此。
在一个实施例中，转化方法将淀粉降解为较低分子量的碳水化合物成分，如糖或脂肪替代物，该方法包括一个脱支步骤。
当将淀粉转化为糖时，淀粉被解聚。这类解聚过程由例如预处理步骤以及两个或三个连续过程步骤组成，即，液化过程、糖化过程并且取决于所需最终产物，任选的异构化过程。
当所希望的最终糖产物是例如高果糖糖浆时，右旋糖糖浆可以被转化为果糖。糖化过程之后，将pH值增加至6-8范围内的值，例如pH 7.5，并且通过离子交换去除钙。然后，使用例如固定化葡萄糖异构酶将右旋糖糖浆转化成高果糖糖浆。
发酵产物的生产
可发酵的糖类(例如，糊精类、单糖类，特别是葡萄糖)由酶法糖化产生。这些可发酵的糖类可进一步纯化和/或转化成有用的糖产物。另外，这些糖可在微生物发酵过程中用作发酵进料来产生最终产物，如醇(例如，乙醇以及丁醇)、有机酸(例如，丁二酸，3-HP以及乳酸)、糖醇(例如，甘油)、抗坏血酸中间物(例如，葡萄糖酸盐、2-酮基-D-葡萄糖酸盐、2,5-二酮基-D-葡萄糖酸盐以及2-酮基-L-古洛糖酸)、氨基酸(例如，赖氨酸)、蛋白质(例如，抗体及其片段)。
在一个实施例中，将液化工艺步骤期间获得的可发酵的糖用于产生醇，并且特别是乙醇。在乙醇生产中，通常使用SSF过程，其中糖化酶以及发酵生物(例如，酵母)一起添加，并且然后在30℃-40℃温度下执行。
发酵中所使用的生物取决于所需最终产物。典型地，如果乙醇是所需最终产物，则将酵母用作发酵生物。在一些优选实施例中，产乙醇微生物是酵母，并且尤其是酵母属如酿酒酵母菌株(美国专利号4,316,956)。各种酿酒酵母是可商购的并且这些包括但不局限于FALI(弗莱希曼酵母公司(Fleischmann's Yeast))、SUPERSTART(奥泰公司(Alltech))、FERMIOL(帝斯曼公司食品配料部(DSM Specialties))、RED STAR(乐斯福公司(Lesaffre))以及Angel醇酵母(天使酵母公司(Angel Yeast Company)，中国)。这些方法中所使用的起始酵母的量是在适合时间内有效产生商业上有效量乙醇的量(例如，在小于72小时内从具有25％-40％之间DS的底物产生至少10％乙醇)。酵母细胞通常以约104至约1012、并且优选地从约107至约1010活酵母计数/mL发酵液的量来供应。在将酵母添加至醪液之后，使它典型地经受发酵约24-96小时，例如，35-60小时。温度在约26℃-34℃之间，典型地约32℃，并且pH是从pH 3-6，例如，pH 4-5左右。
除了发酵微生物(例如，酵母)以外，发酵还可包括营养物以及额外酶，这些另外的酶包括植酸酶。酵母在发酵中的使用在本领域中是熟知的。
在另外的实施例中，如本领域中已知的，适当发酵微生物的使用可产生发酵最终产物，包括例如甘油、1,3-丙二醇、葡萄糖酸盐、2-酮基-D-葡萄糖酸盐、2,5-二酮基-D-葡萄糖酸盐、2-酮基-L-古洛糖酸、丁二酸、乳酸、氨基酸及其衍生物。更具体地说，当乳酸是所需最终产物时，可使用乳酸杆菌物种(干酪乳杆菌(L.casei))；当甘油或1,3-丙二醇是所需最终产物时，可使用大肠杆菌；并且当2-酮基-D-葡萄糖酸盐、2,5-二酮基-D-葡萄糖酸盐以及2-酮基-L-古洛糖酸是所需最终产物时，柠檬泛菌可用作发酵微生物。以上列举的列表只是实例并且本领域技术人员知道可用于获得所需最终产物的许多发酵微生物。
用于由含未经糊化淀粉的材料生产发酵产物的方法
本发明涉及在含淀粉材料没有糊化(即，没有蒸煮)的情况下从含淀粉材料生产发酵产物的方法(通常被称为“粗淀粉水解”方法)。可在不使包含含淀粉材料以及水的水性浆料液化的情况下生产发酵产物如乙醇。在一个实施例中，本发明的方法包括：在低于初始糊化温度下、优选地在α-淀粉酶和/或产碳水化合物源的酶，例如葡糖淀粉酶的存在下将(例如碾磨的)含淀粉的材料(例如颗粒状淀粉)糖化，以产生可以通过适合的发酵生物发酵成发酵产物的多种糖。在此实施例中，所希望的发酵产物例如乙醇是从未经糊化的(即，未蒸煮)、优选地经碾磨的谷粒如玉米中产生的。
因此，在一个方面，本发明涉及从含淀粉的材料生产发酵产物的方法，这些方法包括：使用产生碳水化合物源的酶以及发酵生物，在低于所述含淀粉的材料的初始糊化温度的温度下将含淀粉的材料同时糖化和发酵。糖化和发酵还可以是分开的。因而，在另一方面，本发明涉及生产发酵产物的方法，这些方法包括以下步骤：
(i)在低于起始糊化温度的温度下使含淀粉的材料糖化；以及
(ii)使用发酵生物进行发酵；
其中使用本发明的至少一种葡糖淀粉酶变体进行步骤(i)。
在一个实施例中，在步骤(i)中添加α-淀粉酶。在另一个实施例中，步骤(i)和(ii)同时进行。
在一个优选实施例中，发酵产物是乙醇并且发酵生物是酵母，特别是酵母属物种，更特别是酿酒酵母。在另一个实施例中，酿酒酵母可以表达葡糖淀粉酶，优选地褐褶菌属物种葡糖淀粉酶，更优选地来自篱边粘褶菌或密褐褶菌的葡糖淀粉酶，最优选地如本文SEQID NO:2或SEQ ID NO:4披露的葡糖淀粉酶。在一个具体实施例中，本发明的变体葡糖淀粉酶，特别是GSA202，是在糖化期间添加/存在，并且酿酒酵母表达SEQ ID NO:2中披露的葡糖淀粉酶，或与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的葡糖淀粉酶。
在一个实施例中，还存在蛋白酶。蛋白酶可以是任何酸性真菌蛋白酶或金属蛋白酶。发酵之后，可以任选地例如通过蒸馏来回收发酵产物(例如乙醇)。典型地，在发酵期间存在一种或多种淀粉酶如葡糖淀粉酶、和/或其他产碳水化合物源的酶、和/或一种或多种α-淀粉酶。葡糖淀粉酶以及其他产碳水化合物源的酶的实例包括使原料淀粉水解的葡糖淀粉酶。一种或多种α-淀粉酶的实例包括酸性α-淀粉酶如酸性真菌α-淀粉酶。发酵生物的实例包括酵母例如，酿酒酵母的菌株。在一个优选实施例中，酵母表达本发明的葡糖淀粉酶变体。术语“初始糊化温度”指淀粉的糊化发生的最低温度。通常，在水中加热的淀粉在约50℃与75℃之间开始糊化；糊化的准确温度依赖于具体的淀粉，并能够由本领域的技术人员容易地确定。因此，初始糊化温度可以根据植物物种、植物物种的具体品种、以及生长条件而变化。在本发明的上下文中，给定的含淀粉材料的初始糊化温度是使用Gorinstein和Lii，1992，
Figure BDA0002212605550000471
[淀粉]44(12):461-466所描述的方法，使5％的淀粉颗粒丧失双折射的温度。在开始该方法之前，可以制备具有10w/w％-55w/w％干固体(DS)、优选25w/w％-45w/w％干固体、更优选30w/w％-40w/w％干固体的含淀粉材料(例如颗粒状淀粉)的浆料。该浆料可以包括水和/或工艺用水，如釜馏物(逆流)、洗涤器水、蒸发器冷凝物或馏出物、由蒸馏得到的侧流汽提器水，或来自其他发酵产物设备的工艺用水。由于本发明的工艺是在低于该初始糊化温度下进行的并且因此没有发生显著的黏度增加，所以如果希望的话，可以使用高水平的釜馏物。在一个实施例中，水性浆料含有约1vol.％至约70vol.％、优选15vol.％-60vol.％、尤其是约30vol.％至50vol.％的水和/或工艺用水，如釜馏物(逆流)、洗涤器水、蒸发器冷凝物或馏出物、由蒸馏得到的侧线汽提器水，或来自其他发酵产物设备的工艺用水，或其组合等。含淀粉材料可以优选地通过干式或湿式碾磨来将粒度降低至0.05至3.0mm，优选地0.1-0.5mm而制备。在经受本发明的方法之后，含淀粉材料中至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或优选地至少99％的干固体被转化成可溶的淀粉水解产物。本发明此方面中的方法是在低于初始糊化温度的温度下进行的，意味着温度典型地在30℃-75℃之间、优选地在45℃-60℃之间的范围内。在一个实施例中，该方法在从25℃至40℃，如从28℃至35℃，如从30℃至34℃，优选地约32℃的温度下进行。在一个实施例中，执行该方法以使得糖水平，如葡萄糖水平保持在低水平，如低于6w/w％，如低于约3w/w％，如低于约2w/w％，如低于约1w/w％，如低于约0.5w/w％，或低于0.25w/w％，如低于约0.1w/w％。通过简单地采用调节量的酶和发酵生物就可以实现这样的低水平的糖。本领域的普通技术人员可容易地确定有待使用的酶和发酵生物的剂量/数量。还可以选择酶和发酵生物的所采用的量以在发酵液中维持低麦芽糖浓度。例如，麦芽糖水平可保持低于约0.5w/w％，如低于约0.2w/w％。本发明的方法可以在从约3与7之间、优选地从pH 3.5到6、或更优选地从pH 4到5的pH下进行。在一个实施例中，发酵进行6至120小时，特别是24至96小时。
由含经糊化淀粉的材料生产发酵产物的方法
在这一方面，本发明涉及由含淀粉材料生产发酵产物、尤其是乙醇的方法，这些方法包括：液化步骤，以及依序地或同时地进行的糖化和发酵步骤。因此，本发明涉及从含淀粉材料生产发酵产物的方法，这些方法包括以下步骤：
(a)在α-淀粉酶存在下使含淀粉材料液化；
(b)使在步骤(a)中获得的液化材料糖化；
(c)使用发酵生物进行发酵；
其中在根据本发明所述的葡糖淀粉酶的存在下进行步骤(b)。
在一个优选实施例中，发酵产物是乙醇并且发酵生物是酵母，特别是酵母属物种，更特别是酿酒酵母。在另一个实施例中，酿酒酵母可以表达葡糖淀粉酶，优选地褐褶菌属物种葡糖淀粉酶，更优选地来自篱边粘褶菌或密褐褶菌的葡糖淀粉酶，最优选地如本文SEQID NO:2或SEQ ID NO:4披露的葡糖淀粉酶。在一个具体实施例中，本发明的变体葡糖淀粉酶，特别是GSA202，是在糖化期间添加/存在，并且酿酒酵母表达SEQ ID NO:2中披露的葡糖淀粉酶，或与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的葡糖淀粉酶。
在一个实施例中，在液化之前、期间和/或之后，添加蛋白酶，如酸性真菌蛋白酶或金属蛋白酶。在一个实施例中，金属蛋白酶来自嗜热子囊菌属菌株，例如，橙色嗜热子囊菌菌株，尤其是橙色嗜热子囊菌CGMCC No.0670。在另一个实施例中，蛋白酶是细菌蛋白酶，特别是来源于热球菌属的菌株的蛋白酶，更特别是来自披露于US 6,358,726中的强烈热球菌。
可以添加另外的葡糖淀粉酶。在一个实施例中，另外的葡糖淀粉酶源自曲霉属的菌株，例如黑曲霉或泡盛曲霉，篮状菌属的菌株，特别是埃默森篮状菌；或阿太菌属(Athelia)菌株，具体是罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)；栓菌属(Trametes)菌株，例如，瓣环栓菌(Trametes cingulata)；或其混合物。糖化步骤(b)和发酵步骤(c)可依次或同时进行。当该方法作为依次糖化和发酵过程来进行时，支链淀粉酶和/或蛋白酶可在糖化和/或发酵期间添加，并且当步骤(b)与(c)同时进行时(SSF过程)，在发酵之前或期间添加。支链淀粉酶和/或蛋白酶还可有利地在液化之前(预液化处理)(即在步骤(a)之前或期间)和/或在液化之后(液化后处理)(即在步骤(a)之后添加)。支链淀粉酶最有利地是在液化之前或期间(即在步骤(a)之前或期间)添加。发酵产物，如尤其是乙醇，可以可任选地在发酵之后，例如通过蒸馏来回收。发酵生物优选地是酵母，优选地是酿酒酵母菌株。在一个优选实施例中，酵母表达本发明的葡糖淀粉酶变体。在特别的实施例中，本发明的方法在步骤(a)之前进一步包括以下步骤：
x)优选地通过碾磨(例如，使用锤磨机)来减小含淀粉材料的粒度；
y)形成包含该含淀粉材料和水的浆料。
在一个实施例中，粒度是小于#7筛，例如#6筛。#7筛通常用于常规现有技术过程中。水性浆料可包含从10w/w％-55w/w％，例如25w/w％-45w/w％以及30w/w％-40w/w％干固体(DS)的含淀粉材料。将浆料加热至高于糊化温度并且可添加α-淀粉酶变体以开始液化(稀释)。在一个实施例中，该浆料在步骤(a)中经受α-淀粉酶之前可以进行喷射蒸煮以进一步使该浆料糊化。在一个实施例中，液化可作为三步骤热浆料方法来执行。在pH 4-6、优选地4.5-5.5下，将浆料加热至60℃-95℃之间、优选地70℃-90℃之间、如优选地80℃-85℃之间，并且任选地连同支链淀粉酶和/或蛋白酶、优选地金属蛋白酶一起添加α-淀粉酶变体以开始液化(稀释)。在一个实施例中，然后，可将浆料在95℃-140℃、优选地100℃-135℃、如105℃-125℃之间的温度处喷射蒸煮约1-15分钟、优选地约3-10分钟、尤其是约5分钟。浆料冷却至60℃-95℃并且添加更多α-淀粉酶以及任选地支链淀粉酶和/或蛋白酶、优选地金属蛋白酶，以完成水解(二次液化)。通常在pH 4.0-6、特别是在从4.5至5.5之间的pH下进行液化过程。可使用本领域熟知的条件来进行糖化步骤(b)。例如，全部糖化过程可以持续从约24到约72小时，然而，通常仅在介于30℃到65℃之间的温度处，典型地约60℃处进行典型地40-90分钟的预糖化，随后在同时糖化和发酵过程(SSF过程)中，在发酵期间进行完全糖化。糖化典型地在从20℃-75℃、优选地从40℃-70℃，典型地约60℃的温度处并且在4与5之间的pH下、一般在约pH 4.5下进行。在发酵产物，尤其是乙醇的生产中最广泛使用的方法是同时糖化和发酵(SSF)方法，在该方法中，该糖化不存在保持阶段，意味着发酵生物(如酵母)和酶可以一起添加。SSF可典型地在从25℃至40℃、如从28℃至35℃、如从30℃至34℃、优选地约32℃的温度处执行。在一个实施例中，发酵进行6至120小时，特别是24至96小时。
含淀粉材料
可以在本发明的方法中使用任何适合的含淀粉起始材料。通常基于所希望的发酵产物来选择起始材料。适于在本发明的方法中使用的含淀粉起始材料的实例包括大麦、豆类、树薯(cassava)、谷物、玉米、买罗高梁(milo)、豌豆、马铃薯、稻、黑麦、西米、高粱、甘薯、木薯(tapioca)、小麦以及全谷物或其任何混合物。该含淀粉材料还可以是蜡质或非蜡质类型的玉米和大麦。在一个实施例中，含淀粉材料是玉米。在一个实施例中，含淀粉材料是小麦。
发酵产物
术语“发酵产物”意指通过包括使用发酵生物的发酵方法或过程生产的产品。发酵产物包括醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、丁二酸、葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)；抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；和激素。在一个优选实施例中，该发酵产物是乙醇，例如燃料乙醇；饮用乙醇，即中性饮用酒精；或用于消费性醇工业(例如，啤酒和酒)、乳品工业(例如，发酵的乳制品)、皮革工业和烟草工业的工业乙醇或产物。优选的啤酒类型包含爱尔啤酒(ale)、烈性黑啤酒(stout)、波特啤酒(porter)、拉格啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、麦芽酒(malt liquor)、低麦芽啤酒(happoushu)、高醇啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒或清淡啤酒。在一个实施例中，该发酵产物是乙醇。
在以下编号的段落中进一步披露本发明：
[1].一种葡糖淀粉酶变体，与SEQ ID NO:2中披露的葡糖淀粉酶相比，其在pH＝4.0，T＝32℃下，具有增加的生淀粉水解活性，其中该变体源自以下葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶具有：包含SEQ ID NO:2的氨基酸1-454或SEQ ID NO:4的1-454的催化结构域，包含SEQID NO:2的氨基酸455-462或SEQ ID NO:4的氨基酸455-465的接头，以及包含SEQ ID NO:2的氨基酸463-556或SEQ ID NO:4的氨基酸466-559的淀粉结合结构域，并且其中该变体进一步包含在选自由以下组成的组的一个或多个位置处的取代：
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
S95P+A121P+Y295W+T116R+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+G120S+A121P+Y295W+Q318Y+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+S458SCGG+N527M+T(V)549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+S458SCGG+N527M+T(V)549W+N503R；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+Q318Y+S95P+A121P+Y295W+S458SCGG+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+G120S+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+S458SCGG+N527M T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
S95P+T116R+A121P+Y295W+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N527M+T(V)549W+N503R；
S95P+A121P+Y295W+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
V18M+T43K+S95P+A121P+A518K+N527M+T549W；
T43K+S95P+G120S+A121P+Y295W+Q318Y+A518K+N527M+T(V)549W；
T43K+S95P+A121P+Q318Y+A493V+A518K+N527M+T549W；
S95P+G120S+A121P+Y295W+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
V18M+T43K+S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N527M+T(V)549W；
T43K+S95P+A121P+Q318Y+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+N527M+T549W；
S95P+A121P+Y295W+T116R+N527M+T(V)549W；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+A493V+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A493V+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+A518K+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+A117Q+N527M+T(V)549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A493V+A518K+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Q318Y+A493V+N527M+T549W；
S95P+T116R+A121P+Y295W+A518K+N527M+T(V)549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+T(V)549W；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+A518K+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+A518K+T549W；
S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N527M+T(V)549W；
S95P+G120S+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
S95P+N112L+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N527M+T549W；
S95P+G120S+A121P+Y295W+A518K+N527M+T(V)549W；
S95P+N112L+A121P+Y295W+A518K+N527M+T(V)549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+T549W；
S95P+A121P+Y295W+A493V+A518K+E520Q+T549W；
S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M+T549W；
S95P+A121P+Y295W+A518K+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M；
S95P+A121P+Y295W+S458C+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
S95P+A121P+Y295W+N527M+T549W；
S95P+A121P+A271F+Y295W+A518K+N527M+T549W；
S95P+A121P+Y295W+A493V；
S95P+A121P+Y295W+S540K；
S95P+A121P+Y295W+S540R；
S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M；
S95P+A121P+Y295W+S458SGGC+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+S458SCGG+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
其中位置编号对应于SEQ ID NO:2中阐明的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
[2].如段落1所述的葡糖淀粉酶变体，其中该变体源自以下葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶具有：包含SEQ ID NO:2的氨基酸1-454的催化结构域，包含SEQ ID NO:4的氨基酸455-465的接头，以及包含SEQ ID NO:4的氨基酸466-559的淀粉结合结构域，并且其中该变体包含选自由以下组成的组的具体取代的组合：
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
S95P+A121P+Y295W+T116R+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+G120S+A121P+Y295W+Q318Y+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+S458SCGG+N527M+T(V)549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+S458SCGG+N527M+T(V)549W+N503R；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+S458SCGG+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+G120S+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+S458SCGG+N527M T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
S95P+T116R+A121P+Y295W+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N527M+T(V)549W+N503R；
S95P+A121P+Y295W+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
并且其中与SEQ ID NO:2相比，生淀粉水解活性的增加是至少30％、至少35％，例如至少40％。
[3].如段落2所述的葡糖淀粉酶变体，这些变体进一步包含取代G456S+P461S+E472Q+L481I+E489S+A493P+E520Q。
[4].如段落1所述的葡糖淀粉酶变体，其中该变体源自SEQ ID NO:2的葡糖淀粉酶，并且其中该变体包含选自由以下组成的组的具体取代的组合：
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+A518K+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Q318Y+A493V+A518K+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Y295W
+A518K+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Q318Y+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+A493V+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A493V+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A493V+A518K+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Q318Y+A493V+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+A518K+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+A518K+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+T549W；
S95P+A121P+Y295W+A493V+A518K+E520Q+T549W；
S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M+T549W；
S95P+A121P+Y295W+N527M+T549W；
S95P+A121P+A271F+Y295W+A518K+N527M+T549W；
S95P+A121P+Y295W+A493V；
S95P+A121P+Y295W+S540K；
S95P+A121P+Y295W+S540R；
S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M；
并且其中与SEQ ID NO:2相比，生淀粉水解活性的增加是至少5％。
[5].如段落4所述的葡糖淀粉酶变体，其中该变体包含选自由以下组成的组的具体取代的组合：
V18M+T43K+S95P+A121P+A518K+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Q318Y+A493V+A518K+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Q318Y+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+A493V+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A493V+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A493V+A518K+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Q318Y+A493V+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+A518K+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+A518K+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+T549W；
S95P+A121P+Y295W+A493V+A518K+E520Q+T549W；
S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M+T549W；
并且其中与SEQ ID NO:2相比，生淀粉水解活性的增加是至少20％。
[6].如段落1所述的葡糖淀粉酶变体，其中该变体源自以下葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶具有：包含SEQ ID NO:2的氨基酸1-454的催化结构域，包含SEQ ID NO:4的氨基酸455-465的接头，以及包含SEQ ID NO:4的氨基酸466-559的淀粉结合结构域，并且其中该变体进一步包含在选自由以下组成的组的一个或多个位置处的取代：
T43K+S95P+G120S+A121P+Y295W+Q318Y+A518K+N527M+T(V)549W；
S95P+G120S+A121P+Y295W+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+T116R+N527M+T(V)549W；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+A518K+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+A117Q+N527M+T(V)549W；
S95P+T116R+A121P+Y295W+A518K+N527M+T(V)549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N527M+T(V)549W；
S95P+G120S+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M+T(V)549W；
S95P+N112L+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
S95P+G120S+A121P+Y295W+A518K+N527M+T(V)549W；
S95P+N112L+A121P+Y295W+A518K+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+A518K+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M；
S95P+A121P+Y295W+S458C+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
S95P+A121P+Y295W+S458SGGC+N539R+I541Y+T543V+A545S+
S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+S458SCGG+N539R+I541Y+T543V+A545S+
S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
并且其中与SEQ ID NO:2相比，生淀粉水解活性的增加是至少2％。
[7].如段落6所述的葡糖淀粉酶变体，其中该变体包含选自由以下组成的组的具体取代的组合：
T43K+S95P+G120S+A121P+Y295W+Q318Y+A518K+N527M+T(V)549W；
S95P+G120S+A121P+Y295W+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+T116R+N527M+T(V)549W；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+A518K+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+A117Q+N527M+T(V)549W；
S95P+T116R+A121P+Y295W+A518K+N527M+T(V)549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N527M+T(V)549W；
S95P+G120S+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M+T(V)549W；
S95P+N112L+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
S95P+G120S+A121P+Y295W+A518K+N527M+T(V)549W；
S95P+N112L+A121P+Y295W+A518K+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+A518K+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M；
S95P+A121P+Y295W+S458C+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
并且其中与SEQ ID NO:2相比，生淀粉水解活性的增加是至少15％，例如至少20％。
[8].一种葡糖淀粉酶变体，与SEQ ID NO:2中披露的葡糖淀粉酶相比，其在pH＝4.0，T＝32℃下，具有增加的生淀粉水解活性，其中该变体包含选自以下的修饰：
i)用SEQ ID NO:4的氨基酸466-559替换SEQ ID NO:2的淀粉结合结构域氨基酸463-556；和/或
ii)引入以下取代和插入：N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A，使用SEQ ID NO:2进行编号；
其中该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性，并且其中与SEQID NO:2相比，生淀粉水解活性的增加是至少10％，例如至少15％。
[9].一种葡糖淀粉酶变体，与SEQ ID NO:4中披露的葡糖淀粉酶相比，其在pH＝4.0，T＝32℃下，具有增加的生淀粉水解活性，其中该变体包含引入以下取代和插入的修饰：N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A，使用SEQ ID NO:2进行编号；其中该变体与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性，并且其中与SEQ IDNO:4相比，生淀粉水解活性的增加是至少15％。
[10].一种葡糖淀粉酶变体，与SEQ ID NO:2中披露的葡糖淀粉酶相比，其在pH＝4.0，T＝32℃下，具有增加的生淀粉水解活性，其中该变体包含选自以下的修饰：
i)用SEQ ID NO:4的氨基酸466-559替换SEQ ID NO:2的淀粉结合结构域氨基酸463-556；和/或
ii)引入取代G459C+N527M+T(V)549W，使用SEQ ID NO:2进行编号；其中该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性，并且其中与SEQ ID NO:2相比，生淀粉水解活性的增加是至少10％，例如至少15％。
[11].如段落8-10中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，该变体进一步包含以下取代中的任一项：
V18M、T43K、T116R、A271F、Y295W、Q318Y；特别是Y295W；T116R+Y295W；T43K+Y295W+Q318Y；V18M+T43K+Q318Y；V18M+T43K+T116R+Q318Y。
[12].如段落11所述的葡糖淀粉酶变体，该变体进一步包含S95P+A121P。
[13].如段落1-12中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中取代或插入的数目是1-20个，例如1-10个和1-5个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10个取代或插入。
[14].一种用于增加葡糖淀粉酶的生淀粉水解活性的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供杂合葡糖淀粉酶，该杂合葡糖淀粉酶包含：由SEQ ID NO:2的氨基酸1-454组成的第一氨基酸序列，选自SEQ ID NO:2的氨基酸455-462或SEQ ID NO:4的氨基酸455-465的第二氨基酸序列，以及选自SEQ ID NO:2的氨基酸463-556或SEQ ID NO:4的氨基酸466-559的第三氨基酸序列；和/或
(b)引入选自以下中的至少一项、优选地至少两项、优选地至少三项、优选地至少四项的取代的组合：V18M、T43K、N112L、T116R、A117Q、G120S、A271F、Y295W、Q318Y；和/或
(c)引入选自下组的至少三个、优选地至少四个取代：S458C、S458SCGG、S458SGGC、A493V、A518K、E520Q、N527M、S540K,R、S(G)546P、T(V)549W、N503R、N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A。
[15].如段落14所述的方法，该方法进一步包括引入取代S95P+A121P。
[16].一种用于增加葡糖淀粉酶的生淀粉水解活性的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供杂合葡糖淀粉酶，该杂合葡糖淀粉酶包含：由SEQ ID NO:2的氨基酸1-454组成的第一氨基酸序列，选自SEQ ID NO:4的氨基酸455-465的第二氨基酸序列，以及选自SEQ ID NO:4的氨基酸466-559的第三氨基酸序列；和/或
(b)引入选自以下中的至少一项的取代的组合：V18M、T43K、T116R、G120S、Y295W、Q318Y；和/或
(c)引入以下3个选项之一：i)N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；ii)N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；iii)选自下组的至少三个取代：S458SCGG、N527M、T(V)549W、和N503R。
[17].如段落16所述的方法，该方法进一步包括引入取代S95P+A121P。
[18].一种组合物，该组合物包括如段落1-13中任一项所述的葡糖淀粉酶变体。
[19].一种如段落1-13中任一项所述的葡糖淀粉酶变体用于生产糖浆和/或发酵产物的用途。
[20].一种由含淀粉的材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)在α-淀粉酶存在下使含淀粉材料液化；
(b)使所液化的材料糖化；以及
(c)使用发酵生物进行发酵；
其中使用如段落1-13中任一项所述的至少一种葡糖淀粉酶变体进行步骤(b)。
[21].如段落20所述的方法，其中步骤(b)和步骤(c)同时进行。
[22].一种由含淀粉的材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)在低于含淀粉材料的初始糊化温度的温度下使所述含淀粉材料糖化；以及
(b)使用发酵生物进行发酵，
其中使用如段落1-13中任一项所述的至少一种葡糖淀粉酶变体进行步骤(a)。
[23].一种由含淀粉材料生产糖浆产物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)在α-淀粉酶存在下使含淀粉材料液化；
(b)在如段落1-13中任一项所述的葡糖淀粉酶变体存在下，使液化的材料糖化。
[24].如段落20-22中任一项所述的方法，其中该发酵产物是乙醇。
[25].如段落24所述的方法，其中在糖化步骤中存在的变体葡糖淀粉酶选自以下葡糖淀粉酶变体，与SEQ ID NO:2中披露的葡糖淀粉酶相比，其在pH＝4.0，T＝32℃下，具有增加的生淀粉水解活性，其中该变体源自SEQ ID NO:2的葡糖淀粉酶，并且其中该变体包含选自以下的具体取代的组合：V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+N527M+T549W；其中位置编号对应于SEQ ID NO:2中阐明的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该变体与SEQID NO:2的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性；并且其中与SEQ ID NO:2相比，生淀粉水解活性的增加是至少5％、至少10％，至少15％、特别是至少20％。
[26].如段落20-22、和24-25中任一项所述的方法，其中该发酵生物是酵母，特别是酵母菌属，更特别是酿酒酵母。
[27].如段落26所述的方法，其中该酵母表达葡糖淀粉酶，优选地褐褶菌属物种葡糖淀粉酶，更优选地来自篱边粘褶菌或密褐褶菌的葡糖淀粉酶，最优选地如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4披露的葡糖淀粉酶，或与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4具有至少90％同一性的葡糖淀粉酶。
[28].一种从含淀粉的材料生产糖浆产物的方法，该方法包括以下步骤：在如段落1-13中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的存在下，在低于含淀粉的材料的初始糊化温度的温度下，使该含淀粉的材料糖化。
[29].一种多核苷酸，该多核苷酸编码如段落1-13中任一项所述的葡糖淀粉酶变体。
[30].一种核酸构建体，该核酸构建体包含如段落29所述的多核苷酸。
[31].一种表达载体，该表达载体包含如段落29所述的多核苷酸。
[32].一种宿主细胞，该宿主细胞包含如段落29所述的多核苷酸、如段落30所述的核酸构建体或如段落31所述的表达载体。
[33].如段落32所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是酵母细胞，特别是酵母属，例如酿酒酵母。
[34].如段落20-22和24中任一项所述的方法，其中如段落32或33所述的宿主细胞在所述发酵步骤中应用。
[35].如段落20-22中任一项的方法，其中在步骤糖化步骤期间存在真菌酸性α-淀粉酶。
[36].如段落35所述的方法，其中该酵母表达真菌酸性α-淀粉酶。
[37].如段落35或36所述的方法，其中该真菌酸性α-淀粉酶源自毛霉属或曲霉属，特别是微小根毛霉、土曲霉、或烟曲霉，特别是选自以下源自微小根毛霉的α-淀粉酶的α-淀粉酶：该α-淀粉酶具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)，优选地披露为SEQID NO:5，优选地具有以下取代中的一个或多个：G128D、D143N、优选G128D+D143N(使用SEQID NO:5用于编号)，并且其中该α-淀粉酶变体与SEQ ID NO:5的多肽具有至少75％同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％同一性。
[38].一种产生如段落1-13中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的方法，该方法包括：
(a)在适合于表达该变体的条件下培养如段落28所述的宿主细胞；以及
(b)任选地回收该变体。
本发明进一步通过以下实例进行描述。
实例
用于确定葡糖淀粉酶活性的测定
葡糖淀粉酶活性(AGU)
葡糖淀粉酶单位(AGU)被定义为在标准条件下(37℃，pH 4.3，底物：100mM麦芽糖，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间：6分钟，如以下葡糖淀粉酶孵育中所说明的)每分钟水解1微摩尔麦芽糖由此产生葡萄糖的酶的量。
<u>葡糖淀粉酶孵育：</u>
底物： 麦芽糖100mM
缓冲液： 乙酸盐0.1M
pH： 4.30±0.05
孵育温度： 37℃±1℃
反应时间： 6分钟
酶工作范围： 0.5-4.0AGU/mL
通过3个反应步骤描述分析原理：
步骤1是一个酶反应：
葡糖淀粉酶(AMG)EC 3.2.1.3(外切-α-1,4-葡聚糖-葡糖淀粉酶)水解麦芽糖以形成α-D-葡萄糖。孵育之后，用NaOH来停止该反应。
步骤2和步骤3引起终点反应：
在由己糖激酶催化的反应中，葡萄糖被ATP磷酸化。形成的葡萄糖-6-磷酸被葡萄糖-6-磷酸脱氢酶氧化成6-磷酸葡萄糖酸。在这个相同的反应中，等摩尔量的NAD+被还原成NADH，导致在340nm处的吸光度增加。可以使用自动分析仪系统例如Konelab 30分析仪(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))。
Figure BDA0002212605550000631
Figure BDA0002212605550000641
用于测定方案的试剂：
通过将44.4g三水合乙酸钠(默克公司(Merck)目录号61751805001730)和37.5ml乙酸(飞世尔公司(Fisher)目录号11007)溶解在Milli Q水中来制备1M乙酸钠缓冲液的储备溶液。将pH调节至4.3并且将缓冲液的最终体积补充至1000ml。将这一缓冲储备溶液储存在4℃直到使用。通过将100ml的1M储备溶液添加至900ml的Milli Q水中来制备100mM工作溶液。
通过将100mg的4-硝基苯基-α-D-葡萄吡喃糖苷(西格玛公司(Sigma)目录号N1377)溶解在100ml的100mM乙酸钠缓冲液(pH 4.3)中制备新鲜的0.1％的4-硝基苯基-α-D-葡萄吡喃糖苷(pNPG)的底物溶液。
通过将38.1g的硼砂(飞世尔公司(Fisher)目录号27965)溶解在1000ml的Milli Q水中来制备0.1M硼砂(四硼酸二钠)终止溶液的储备溶液。将这一终止溶液储存在室温下直到使用。
通过将1g麦芽糖(西格玛公司(Sigma)目录号M5885)溶解在100ml的100mM乙酸钠缓冲液(pH 4.3)中制备新鲜的1％麦芽糖的底物溶液。
通过将64.6mg的阿卡波糖(西格玛公司(Sigma)目录号A8980)溶解在100ml的Milli Q水中制备1000μM阿卡波糖溶液的储备溶液。将这一储备溶液储存在4℃下直到使用。通过将336μl的1000μM储备溶液添加至59.66ml的Milli Q水中来制备5.6μM工作溶液。
比活性(SA)的确定：
使用阿卡波糖测定方法用于确定在培养上清液中的比活性。该方法使用已知浓度的阿卡波糖，导致50％的蛋白质活性抑制。基于相对淀粉葡糖苷酶活性计算(RAG)将培养上清液的活性归一化，并确定已知浓度的阿卡波糖的抑制。然后将所得残余活性用于计算培养上清液中淀粉葡糖苷酶的比活性。比活性使用以下等式计算。
Vsa＝Vmx(1-Va/Vdw)
Vm＝使用麦芽糖底物的变体的A505
Va＝使用阿卡波糖的变体的A400
Vdw＝不使用阿卡波糖的变体的A400
葡糖淀粉酶比活性(SA)
通过由Konelab仪器确定的AGU测定来确定纯化的蛋白质的比活性。
酸性α-淀粉酶活性
当根据本发明使用时，可以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)或FAU-F来测量酸性α-淀粉酶的活性。
酸性α-淀粉酶活性(AFAU)
能以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)测量酸性α-淀粉酶活性，其相对于酶标准品确定。1AFAU定义为在下述标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶量。
酸性α-淀粉酶，其为内切α-淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)，水解淀粉分子内部区域中的α-1,4-糖苷键以形成具有不同链长的糊精和寡糖。与碘形成的颜色的强度和淀粉浓度成正比。使用反向比色法在指定的分析条件下确定淀粉浓度的降低作为酶活性。
Figure BDA0002212605550000651
λ＝590nm
蓝色/紫色 t＝23sec 脱色
标准条件/反应条件：
Figure BDA0002212605550000652
更详细地描述这种分析方法的文件夹EB-SM-0259.02/01可以从丹麦的诺维信公司索取得到，通过引用将该文件夹包括在此。
FAU-F的测定
相对于具有声明强度的酶标准品测量FAU-F真菌α-淀粉酶单位(Fungal Alpha-Amylase Units(Fungamyl))。
Figure BDA0002212605550000661
更详细描述这种标准方法的文件夹(EB-SM-0216.02)可以从丹麦的诺维信公司要求得到，特此通过援引将该文件夹包括在此。
酶和酶共混物
蛋白酶PfuS：源自强烈火球菌的蛋白酶，示于SEQ ID NO:7中。
α-淀粉酶BE369(AA369)：本文中披露为SEQ ID NO:8并且其进一步具有以下突变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶：I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V，截短至491个氨基酸(使用SEQ ID NO:8进行编号)。
α-淀粉酶共混物A：包括以下项的共混物：α-淀粉酶AA369和蛋白酶PfuS(剂量：2.1μg EP/g DS AA369，3.0μg EP/g DS PfuS，其中EP是酶蛋白并且DS是总干固体)。
α-淀粉酶B：本文中披露为SEQ ID NO:8并且其进一步具有以下突变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶：I181*+G182*+N193F。
实例1.具有改进的生淀粉水解的根据本发明的变体
通过结合本文中披露为SEQ ID NO:6真菌α-淀粉酶从颗粒状淀粉释放葡萄糖来测量变体的生淀粉降解性能。用50mM乙酸盐缓冲液(pH 4.0)将纯化的葡糖淀粉酶稀释至12.5μg/ml。将三十微升的酶溶液转移到2.0ml深孔板的孔中，并且添加270μl底物溶液(0.2％分散在50mM乙酸盐缓冲液中的生淀粉，pH 4.0，1mM CaCl2，0.16μg/ml的本文中披露为SEQ IDNO:6的真菌α-淀粉酶)以起始该反应。搅拌底物溶液，直到刚好被添加。在32℃，在1200rpm振荡下孵育120min后，离心样品从而离心分离残余淀粉颗粒，并且通过混合20ul等分试样与200ul基于商业葡萄糖氧化酶-过氧化物酶方法的葡萄糖检测溶液(葡萄糖C2测试，和光株式会社(Wako Chemical.Co))(其中在使用前，已经将作为葡糖淀粉酶抑制剂的阿卡波糖溶解至0.5mM)混合，测量上清液的葡萄糖浓度。测量在505nm的吸光度并且计算相对性能。
本发明的变体
Figure BDA0002212605550000671
Figure BDA0002212605550000681
Figure BDA0002212605550000691
Figure BDA0002212605550000701
Figure BDA0002212605550000711
loop2＝N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A，使用SEQ IDNO:2进行编号；
实例2：结合葡糖淀粉酶表达酵母，变体GSA202的同时糖化和发酵(SSF)性能的评估
将与命名为PE096的酸性真菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:6)共混的、包括现有技术葡糖淀粉酶(来自埃默森篮状菌的葡糖淀粉酶T-AMG(SEQ ID NO:9)和来自瓣环栓菌的葡糖淀粉酶Tc-AMG(SEQ ID NO:10))的酶共混物用作参考共混物，从而评估含有葡糖淀粉酶变体GSA202的类似酶共混物的性能。由于与含有T-AMG和Tc-AMG两者的参考共混物相比，GSA202具有更高生淀粉水解活性，所以仅40％的PE096补充有(60％降低)GSA202。酶共混物和比率如下表所示。在所有含有0.36AGU/g DS的总剂量的两种葡糖淀粉酶的参考共混物中，0.290AGU/g DS源自T-AMG，并且另外0.0670AGU/g DS源自Tc-AMG。GSA202是根据本发明的葡糖淀粉酶变体，基于本文SEQ ID NO:2，并且具有如实例1中披露的取代。α-淀粉酶PE096是具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)并且在SEQ ID NO:6中披露的变体微小根毛霉α-淀粉酶。
Figure BDA0002212605550000712
表1：在两种工业植物醪液的SSF中的酶处理
Figure BDA0002212605550000713
使用两种代表α-淀粉酶共混物A(醪液1)和α-淀粉酶B(醪液2)两者的液化工业植物玉米醪液，在SSF中评估这4种共混物。这些醪液补充有3ppm青霉素。添加至醪液1和醪液2尿素的量分别为400ppm和1000ppm。在将醪液分散到烧瓶之前，使用40％H2SO4将两种植物醪液调节至pH 5.1。将大约55g(55±0.03)的醪液添加到每个在盖上具有0.048”孔用于排气的125mL康宁一次性锥形瓶中。每个烧瓶加入根据表1的酶和5x106个细胞/g DS的剂量的葡糖淀粉酶表达酵母。葡糖淀粉酶表达酵母表达本文中披露为SEQ ID NO:2的野生型葡糖淀粉酶，并且与如PCT/US2017/063159中描述的yMHCT471类似描述的酵母菌株相似。将水添加到每个烧瓶中，使得每种醪液类型的每种样品中，酶和水的总添加体积相等。为了在加入前制备酵母，将150uL甘油储备培养物接种到125mL锥形瓶中的50mL的6％YPD培养基(1％(w/v)酵母提取物、2％(w/v)蛋白胨和6％(w/v)右旋糖)中。将烧瓶在33℃下孵育大约16hr，同时在130rpm下振荡。然后，通过在3500xg下离心10分钟收集酵母。通过将沉淀重悬在45mL去离子水中随后离心，在去离子水中洗涤酵母沉淀两次。在两次洗涤后，将沉淀重悬于约45mL水中，并且根据制造商的说明书，使用化学计量学NucleoCounter YC-100，确定酵母滴度。
将烧瓶在32℃下孵育总计54hr，同时在120rpm下振荡。在6、24、48和54hr时收集样品。在每个时间点，通过去除大约4克的发酵样品并且将其与40uL的40％H2SO4混合，制备样品用于HPLC。将混合物在3500x g下离心10分钟，并且通过0.2uM沃特曼尼龙过滤器过滤。在具有化学工作站(Chemstattion)软件的Agilent HPLC 1100/1200系列上分析过滤的样品。在具有阳离子H保护柱的Bio-Rad HPX-87H离子排阻柱(300mmx 7.8mm)上分离样品。在65℃下按0.8ml/min运行流动相5mM H2SO4，并且RI检测器温度设置在55℃。该方法使用针对糊精(DP4+)、麦芽三糖(DP3)、麦芽糖(DP2)、葡萄糖(DP1)、果糖、乙酸、乳酸、甘油以及乙醇的校准标准品(具有强制过零4点校准)对若干种分析物进行定量。针对乙醇、甘油、DP3(麦芽三糖)、DP2(麦芽糖)的HPLC结果示于表2和表3中。
相对于参考T-AMG/Tc-AMG葡糖淀粉酶，含有GSA202的共混物一致地表现出更高乙醇产率。在三种差异类型的GA共混物(Ultra T、Excel T和Achieve T)和两种不同类型的植物醪液中，这是真实的。使用GSA202的乙醇增加的范围是从0.1％至1.28％。
表2：在两种植物醪液中SSF持续54Hr后的乙醇水平
Figure BDA0002212605550000731
除了乙醇增加，用GSA202看到的另一种益处是相对于参考葡糖淀粉酶，更低积累水平的甘油。这可以表明，当GSA202用于SSF时，酵母压力更小。用GSA202观察到其他期望的特性，例如更低水平的DP3、DP2和乙酸。
表3：在两种植物醪液中SSF持续54hr后，感兴趣的选择的分析物的HPLC结果
Figure BDA0002212605550000732
实例3：使用商业酵母乙醇红，变体GSA202的同时糖化和发酵(SSF)性能
用乙醇红酵母进行类似实例2的研究，从而比较参考葡糖淀粉酶和含有GSA202的GA的SSF性能。在所有含有0.6AGU/g DS的总剂量的两种葡糖淀粉酶(T/Tc)的参考共混物中，0.483AGU/g DS源自T-AMG，并且另外0.117AGU/g DS源自Tc-AMG。在表4中使用的所有酶已经描述于实例2中。
表4.液化后SSF中的酶剂量
Figure BDA0002212605550000733
Figure BDA0002212605550000741
使用两种代表α-淀粉酶共混物A(醪液1和醪液2)的液化工业植物玉米醪液，在SSF中评估这4种共混物。这些醪液补充有3ppm青霉素。添加至醪液的尿素的量是400ppm。在将醪液分散到烧瓶之前，使用40％H2SO4将所有植物醪液调节至pH 5.1。将大约60g(55±0.03)的醪液添加到每个在盖上具有0.048”孔用于排气的125mL康宁一次性锥形瓶中。每个烧瓶添加有根据表4的酶，并且按0.066g干乙醇红酵母加入乙醇红酵母(在32℃下再水化30分钟后；将2.2g干酵母加入40mL水中)。将水添加到每个烧瓶中，使得每种醪液类型的每种样品中，酶和水的总添加体积相等。
将烧瓶在32℃下孵育总计54hr，同时在120rpm下振荡。在6、24、48和54hr时收集样品。还制备每种醪液的起始材料的样品用于HPLC分析，从而确定每种植物醪液的时间零点。如实例1中描述，在每个时间点，制备样品并且通过HPLC方法进行分析。针对乙醇、甘油、DP2(麦芽糖)和乙酸(乙酸盐)的HPLC结果示于表5和表6中。
相对于参考T-AMG/Tc-AMG葡糖淀粉酶，含有GSA202的共混物表现出更高乙醇产率。使用GSA202的乙醇增加示于下表5。
表5：在三种植物醪液中SSF持续54Hr后的乙醇水平
Figure BDA0002212605550000742
除了乙醇增加，用GSA202看到的另一种益处是相对于参考GA，更低积累水平的甘油。用GSA202最多地观察到其他期望的特性，例如更低水平的DP2和乙酸。
表6：在三种植物醪液中SSF持续54Hr后，感兴趣的选择的分析物的HPLC结果
Figure BDA0002212605550000751
序列表
<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）
<120> 葡糖淀粉酶变体和编码它们的多核苷酸
<130> 14457-WO-PCT
<160> 10
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 1722
<212> DNA
<213> 篱边粘褶菌
<400> 1
atgtaccgct tccttgtctg tgcgctgggg cttgcggcat cagttctcgc ccagtcggtc 60
gacagctatg ttagcagcga aggtcccata gccaaggcgg gcgtccttgc taacattggg 120
ccgaacggct ccaaggcctc tggcgcatcc gctggtgttg tggtcgcgag ccctagcacg 180
tcggaccccg actattggta cacttggacg cgtgactcgt ccctcgtatt caagtcactt 240
attgaccagt acaccaccgg catcgacagc acgagctctc tgaggactct catcgacgat 300
ttcgtaactg ccgaggctaa tctccagcaa gtctctaacc ctagtggtac cctcaccacc 360
ggtggcttgg gagagcccaa gttcaacgtc gacgaaactg catttactgg tgcatggggt 420
cgaccccaac gcgacggacc tgccctccgc tcgactgcat tgatcacgta cggtaactgg 480
ctgttgtcca acggaaatac gagctatgtt acgagcaatc tgtggccgat catccagaac 540
gaccttggtt atgtcgtgtc atactggaac cagtctacct acgacctctg ggaggaagta 600
gactcgtcat cgttcttcac tactgcagta cagcaccgtg ctctccgtga aggtgcggcc 660
ttcgctaccg ccatcggtca gacttcgcag gtcagcagct atacgactca ggcggacaat 720
cttctgtgct tcttgcagtc ttactggaac ccgagcggtg gttacatcac tgctaacact 780
ggcggcggcc gttccggcaa ggatgccaac acacttctgg catccattca cacgtacgac 840
cccagcgcgg gctgcgacgc tgcgactttc cagccctgct ctgacaaggc actgtcgaac 900
ctgaaggtct acgtcgactc tttccgctcg gtctactcca tcaacagtgg tgtcgcctct 960
aacgctgccg tcgccacggg tcgttatccc gaggatagct accagggtgg aaacccttgg 1020
tacctcacca catttgcggt cgccgagcaa ctctatgatg ctctcaatgt ctgggagtcg 1080
cagggttccc tcgaggtcac ctccacctcc cttgccttct tccagcagtt ctcatccggc 1140
gtcactgctg gcacctactc ttctagctcc agcacataca gcaccctcac gtctgccatc 1200
aagaactttg ccgatggatt tgtcgctatc aatgctaagt acacgccatc caacggtggc 1260
ctggcggaac aatacagcaa gagcgacggt tctcccctta gcgcggtgga cttgacgtgg 1320
agctacgctt cggctttgac ggcgtttgaa gcaaggaaca atactcagtt cgccggctgg 1380
ggcgctgcag gcctgactgt gccttcctct tgctccggca actctggtgg gccgaccgtt 1440
gctgtcacat tcaacgtgaa cgccgagact gtgtggggag agaacatcta tcttactggt 1500
tccgtcgatg ctctggagaa ctggtcggcc gacaatgccc tcctgctctc atcggctaat 1560
tacccgacct ggagtatcac cgtcaacttg ccggcgagca ctgctattga gtacaagtac 1620
atccgcaaaa ataatggggc cgttacctgg gagtcagacc ccaacaatag catcactact 1680
ccggccagcg gctcgacgac cgagaatgac acttggcgtt ga 1722
<210> 2
<211> 556
<212> PRT
<213> 篱边粘褶菌
<400> 2
Gln Ser Val Asp Ser Tyr Val Ser Ser Glu Gly Pro Ile Ala Lys Ala
1 5 10 15
Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ser Lys Ala Ser Gly Ala
20 25 30
Ser Ala Gly Val Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Ser Asp Pro Asp Tyr
35 40 45
Trp Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Ser Leu Ile
50 55 60
Asp Gln Tyr Thr Thr Gly Ile Asp Ser Thr Ser Ser Leu Arg Thr Leu
65 70 75 80
Ile Asp Asp Phe Val Thr Ala Glu Ala Asn Leu Gln Gln Val Ser Asn
85 90 95
Pro Ser Gly Thr Leu Thr Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn
100 105 110
Val Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp
115 120 125
Gly Pro Ala Leu Arg Ser Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Gly Asn Trp Leu
130 135 140
Leu Ser Asn Gly Asn Thr Ser Tyr Val Thr Ser Asn Leu Trp Pro Ile
145 150 155 160
Ile Gln Asn Asp Leu Gly Tyr Val Val Ser Tyr Trp Asn Gln Ser Thr
165 170 175
Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asp Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala
180 185 190
Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Ala Phe Ala Thr Ala Ile
195 200 205
Gly Gln Thr Ser Gln Val Ser Ser Tyr Thr Thr Gln Ala Asp Asn Leu
210 215 220
Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Ser Gly Gly Tyr Ile Thr
225 230 235 240
Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu Leu
245 250 255
Ala Ser Ile His Thr Tyr Asp Pro Ser Ala Gly Cys Asp Ala Ala Thr
260 265 270
Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr Val
275 280 285
Asp Ser Phe Arg Ser Val Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Val Ala Ser Asn
290 295 300
Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Gln Gly Gly
305 310 315 320
Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr Asp
325 330 335
Ala Leu Asn Val Trp Glu Ser Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr Ser Thr
340 345 350
Ser Leu Ala Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Gly Val Thr Ala Gly Thr
355 360 365
Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Thr Leu Thr Ser Ala Ile Lys
370 375 380
Asn Phe Ala Asp Gly Phe Val Ala Ile Asn Ala Lys Tyr Thr Pro Ser
385 390 395 400
Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Tyr Ser Lys Ser Asp Gly Ser Pro Leu
405 410 415
Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Ala Leu Thr Ala Phe
420 425 430
Glu Ala Arg Asn Asn Thr Gln Phe Ala Gly Trp Gly Ala Ala Gly Leu
435 440 445
Thr Val Pro Ser Ser Cys Ser Gly Asn Ser Gly Gly Pro Thr Val Ala
450 455 460
Val Thr Phe Asn Val Asn Ala Glu Thr Val Trp Gly Glu Asn Ile Tyr
465 470 475 480
Leu Thr Gly Ser Val Asp Ala Leu Glu Asn Trp Ser Ala Asp Asn Ala
485 490 495
Leu Leu Leu Ser Ser Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ile Thr Val Asn
500 505 510
Leu Pro Ala Ser Thr Ala Ile Glu Tyr Lys Tyr Ile Arg Lys Asn Asn
515 520 525
Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser Ile Thr Thr Pro
530 535 540
Ala Ser Gly Ser Thr Thr Glu Asn Asp Thr Trp Arg
545 550 555
<210> 3
<211> 1731
<212> DNA
<213> 密褐褶菌
<400> 3
atgtaccgct tccttgtctg tgctctcggg cttctgggga cagtcctcgc tcagtcagtc 60
gacagttatg tcggcagcga aggccccata gcaaaggccg gcgtccttgc caacattggg 120
ccgaacggct caaaggcctc tggtgcagcc gccggcgtgg tggtggctag ccccagcaag 180
tcggatcccg actattggta cacttggacg cgtgactcgt cactcgtttt caagtctctc 240
attgatcagt acaccactgg tatcgacagc acgagttcgt tgaggtctct gatagacagt 300
ttcgttattg ccgaggccaa cattcagcag gtctctaatc ccagcggcac tcttactacc 360
ggcggcttgg gagagccaaa attcaatgtc gatgaaactg cattcaccgg tgcatggggt 420
cgaccccagc gcgacggacc tgcgctccgt gcgactgctt tgatcaccta cggtaactgg 480
ctcttgtcaa acgggaacac gacctgggtt accagtacgc tgtggccgat catccagaac 540
gatctcaact acgtcgttca gtactggaac cagaccacct tcgacctctg ggaagaagtg 600
aactcttcct cgttcttcac cactgcagtg cagcaccgtg ccttgcgcga aggcgcagca 660
ttcgctacca agatcggtca gacctcctcg gtcagcagct acacaaccca agcggcgaat 720
ctactttgct ttttgcagtc ttactggaac cccacttccg gatatatcac cgctaacact 780
ggcggtggtc ggtccggcaa ggacgccaac accctcttgg catccatcca cacttacgac 840
cccagcgcgg gctgcgatgc cacgaccttc cagccctgct ccgacaaagc cctctcgaat 900
ctgaaggttt acgtcgactc cttccgttct gtctactcca tcaacagcgg tattgcctct 960
aacgccgctg tcgccactgg tcgctacccg gaagacagct accagggcgg gaacccatgg 1020
tacctcacta cgttcgccgt cgccgagcag ctctatgacg ccctcaatgt ctgggctgct 1080
cagggctccc tcaatgtcac ctccatctcc ctccccttct tccagcagtt ctcctctagt 1140
gtcactgccg gcacttacgc ttcgagctcc accacttaca cgactctgac ctccgccatt 1200
aagagcttcg cggatggatt cgtcgctatc aacgcccagt acacgccgtc caacggtggc 1260
ctcgctgagc agttcagcag gagcaacggc gctcccgtca gcgctgttga tttgacatgg 1320
agctatgcat ctgcattgac cgcgtttgaa gcgaggaata atactcagtt cgccggctgg 1380
ggcgcggtag gtttgactgt gccgacctcg tgctccagca acagtggtgg aggcggagga 1440
tcgactgtcg ccgtgacgtt caacgtgaac gcccaaacgg tttggggcga aaacatctac 1500
atcactggct cggttgacgc tctgagtaac tggtctcccg acaacgccct cttgctctcg 1560
tctgccaact acccgacctg gagcattacc gtgaatttac ccgcgagcac tgccattcag 1620
tataagtata tccgcaagaa caacggagct gtcacctggg aatccgatcc caacaacagc 1680
ataactactc cagccagcgg ctccgtgacc gagaatgaca cttggcgtta a 1731
<210> 4
<211> 559
<212> PRT
<213> 密褐褶菌
<400> 4
Gln Ser Val Asp Ser Tyr Val Gly Ser Glu Gly Pro Ile Ala Lys Ala
1 5 10 15
Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ser Lys Ala Ser Gly Ala
20 25 30
Ala Ala Gly Val Val Val Ala Ser Pro Ser Lys Ser Asp Pro Asp Tyr
35 40 45
Trp Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Ser Leu Ile
50 55 60
Asp Gln Tyr Thr Thr Gly Ile Asp Ser Thr Ser Ser Leu Arg Ser Leu
65 70 75 80
Ile Asp Ser Phe Val Ile Ala Glu Ala Asn Ile Gln Gln Val Ser Asn
85 90 95
Pro Ser Gly Thr Leu Thr Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn
100 105 110
Val Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp
115 120 125
Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Gly Asn Trp Leu
130 135 140
Leu Ser Asn Gly Asn Thr Thr Trp Val Thr Ser Thr Leu Trp Pro Ile
145 150 155 160
Ile Gln Asn Asp Leu Asn Tyr Val Val Gln Tyr Trp Asn Gln Thr Thr
165 170 175
Phe Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala
180 185 190
Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Ala Phe Ala Thr Lys Ile
195 200 205
Gly Gln Thr Ser Ser Val Ser Ser Tyr Thr Thr Gln Ala Ala Asn Leu
210 215 220
Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Thr Ser Gly Tyr Ile Thr
225 230 235 240
Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu Leu
245 250 255
Ala Ser Ile His Thr Tyr Asp Pro Ser Ala Gly Cys Asp Ala Thr Thr
260 265 270
Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr Val
275 280 285
Asp Ser Phe Arg Ser Val Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Ile Ala Ser Asn
290 295 300
Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Gln Gly Gly
305 310 315 320
Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr Asp
325 330 335
Ala Leu Asn Val Trp Ala Ala Gln Gly Ser Leu Asn Val Thr Ser Ile
340 345 350
Ser Leu Pro Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Ser Val Thr Ala Gly Thr
355 360 365
Tyr Ala Ser Ser Ser Thr Thr Tyr Thr Thr Leu Thr Ser Ala Ile Lys
370 375 380
Ser Phe Ala Asp Gly Phe Val Ala Ile Asn Ala Gln Tyr Thr Pro Ser
385 390 395 400
Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Phe Ser Arg Ser Asn Gly Ala Pro Val
405 410 415
Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Ala Leu Thr Ala Phe
420 425 430
Glu Ala Arg Asn Asn Thr Gln Phe Ala Gly Trp Gly Ala Val Gly Leu
435 440 445
Thr Val Pro Thr Ser Cys Ser Ser Asn Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser
450 455 460
Thr Val Ala Val Thr Phe Asn Val Asn Ala Gln Thr Val Trp Gly Glu
465 470 475 480
Asn Ile Tyr Ile Thr Gly Ser Val Asp Ala Leu Ser Asn Trp Ser Pro
485 490 495
Asp Asn Ala Leu Leu Leu Ser Ser Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ile
500 505 510
Thr Val Asn Leu Pro Ala Ser Thr Ala Ile Gln Tyr Lys Tyr Ile Arg
515 520 525
Lys Asn Asn Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser Ile
530 535 540
Thr Thr Pro Ala Ser Gly Ser Val Thr Glu Asn Asp Thr Trp Arg
545 550 555
<210> 5
<211> 583
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 具有来自微小根毛霉的催化核心的杂合α-淀粉酶
<400> 5
Ala Thr Ser Asp Asp Trp Lys Gly Lys Ala Ile Tyr Gln Leu Leu Thr
1 5 10 15
Asp Arg Phe Gly Arg Ala Asp Asp Ser Thr Ser Asn Cys Ser Asn Leu
20 25 30
Ser Asn Tyr Cys Gly Gly Thr Tyr Glu Gly Ile Thr Lys His Leu Asp
35 40 45
Tyr Ile Ser Gly Met Gly Phe Asp Ala Ile Trp Ile Ser Pro Ile Pro
50 55 60
Lys Asn Ser Asp Gly Gly Tyr His Gly Tyr Trp Ala Thr Asp Phe Tyr
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Asn Phe Gly Asp Glu Ser Gln Leu Lys Ala Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Ala His Glu Arg Asp Met Tyr Val Met Leu Asp Val Val Ala
100 105 110
Asn His Ala Gly Pro Thr Ser Asn Gly Tyr Ser Gly Tyr Thr Phe Gly
115 120 125
Asp Ala Ser Leu Tyr His Pro Lys Cys Thr Ile Asp Tyr Asn Asp Gln
130 135 140
Thr Ser Ile Glu Gln Cys Trp Val Ala Asp Glu Leu Pro Asp Ile Asp
145 150 155 160
Thr Glu Asn Ser Asp Asn Val Ala Ile Leu Asn Asp Ile Val Ser Gly
165 170 175
Trp Val Gly Asn Tyr Ser Phe Asp Gly Ile Arg Ile Asp Thr Val Lys
180 185 190
His Ile Arg Lys Asp Phe Trp Thr Gly Tyr Ala Glu Ala Ala Gly Val
195 200 205
Phe Ala Thr Gly Glu Val Phe Asn Gly Asp Pro Ala Tyr Val Gly Pro
210 215 220
Tyr Gln Lys Tyr Leu Pro Ser Leu Ile Asn Tyr Pro Met Tyr Tyr Ala
225 230 235 240
Leu Asn Asp Val Phe Val Ser Lys Ser Lys Gly Phe Ser Arg Ile Ser
245 250 255
Glu Met Leu Gly Ser Asn Arg Asn Ala Phe Glu Asp Thr Ser Val Leu
260 265 270
Thr Thr Phe Val Asp Asn His Asp Asn Pro Arg Phe Leu Asn Ser Gln
275 280 285
Ser Asp Lys Ala Leu Phe Lys Asn Ala Leu Thr Tyr Val Leu Leu Gly
290 295 300
Glu Gly Ile Pro Ile Val Tyr Tyr Gly Ser Glu Gln Gly Phe Ser Gly
305 310 315 320
Gly Ala Asp Pro Ala Asn Arg Glu Val Leu Trp Thr Thr Asn Tyr Asp
325 330 335
Thr Ser Ser Asp Leu Tyr Gln Phe Ile Lys Thr Val Asn Ser Val Arg
340 345 350
Met Lys Ser Asn Lys Ala Val Tyr Met Asp Ile Tyr Val Gly Asp Asn
355 360 365
Ala Tyr Ala Phe Lys His Gly Asp Ala Leu Val Val Leu Asn Asn Tyr
370 375 380
Gly Ser Gly Ser Thr Asn Gln Val Ser Phe Ser Val Ser Gly Lys Phe
385 390 395 400
Asp Ser Gly Ala Ser Leu Met Asp Ile Val Ser Asn Ile Thr Thr Thr
405 410 415
Val Ser Ser Asp Gly Thr Val Thr Phe Asn Leu Lys Asp Gly Leu Pro
420 425 430
Ala Ile Phe Thr Ser Ala Thr Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Pro
435 440 445
Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr Ala
450 455 460
Ser Lys Thr Ser Thr Ser Thr Ser Ser Thr Ser Cys Thr Thr Pro Thr
465 470 475 480
Ala Val Ala Val Thr Phe Asp Leu Thr Ala Thr Thr Thr Tyr Gly Glu
485 490 495
Asn Ile Tyr Leu Val Gly Ser Ile Ser Gln Leu Gly Asp Trp Glu Thr
500 505 510
Ser Asp Gly Ile Ala Leu Ser Ala Asp Lys Tyr Thr Ser Ser Asp Pro
515 520 525
Leu Trp Tyr Val Thr Val Thr Leu Pro Ala Gly Glu Ser Phe Glu Tyr
530 535 540
Lys Phe Ile Arg Ile Glu Ser Asp Asp Ser Val Glu Trp Glu Ser Asp
545 550 555 560
Pro Asn Arg Glu Tyr Thr Val Pro Gln Ala Cys Gly Thr Ser Thr Ala
565 570 575
Thr Val Thr Asp Thr Trp Arg
580
<210> 6
<211> 583
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 变体α-淀粉酶
<400> 6
Ala Thr Ser Asp Asp Trp Lys Gly Lys Ala Ile Tyr Gln Leu Leu Thr
1 5 10 15
Asp Arg Phe Gly Arg Ala Asp Asp Ser Thr Ser Asn Cys Ser Asn Leu
20 25 30
Ser Asn Tyr Cys Gly Gly Thr Tyr Glu Gly Ile Thr Lys His Leu Asp
35 40 45
Tyr Ile Ser Gly Met Gly Phe Asp Ala Ile Trp Ile Ser Pro Ile Pro
50 55 60
Lys Asn Ser Asp Gly Gly Tyr His Gly Tyr Trp Ala Thr Asp Phe Tyr
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Asn Phe Gly Asp Glu Ser Gln Leu Lys Ala Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Ala His Glu Arg Asp Met Tyr Val Met Leu Asp Val Val Ala
100 105 110
Asn His Ala Gly Pro Thr Ser Asn Gly Tyr Ser Gly Tyr Thr Phe Asp
115 120 125
Asp Ala Ser Leu Tyr His Pro Lys Cys Thr Ile Asp Tyr Asn Asn Gln
130 135 140
Thr Ser Ile Glu Gln Cys Trp Val Ala Asp Glu Leu Pro Asp Ile Asp
145 150 155 160
Thr Glu Asn Ser Asp Asn Val Ala Ile Leu Asn Asp Ile Val Ser Gly
165 170 175
Trp Val Gly Asn Tyr Ser Phe Asp Gly Ile Arg Ile Asp Thr Val Lys
180 185 190
His Ile Arg Lys Asp Phe Trp Thr Gly Tyr Ala Glu Ala Ala Gly Val
195 200 205
Phe Ala Thr Gly Glu Val Phe Asn Gly Asp Pro Ala Tyr Val Gly Pro
210 215 220
Tyr Gln Lys Tyr Leu Pro Ser Leu Ile Asn Tyr Pro Met Tyr Tyr Ala
225 230 235 240
Leu Asn Asp Val Phe Val Ser Lys Ser Lys Gly Phe Ser Arg Ile Ser
245 250 255
Glu Met Leu Gly Ser Asn Arg Asn Ala Phe Glu Asp Thr Ser Val Leu
260 265 270
Thr Thr Phe Val Asp Asn His Asp Asn Pro Arg Phe Leu Asn Ser Gln
275 280 285
Ser Asp Lys Ala Leu Phe Lys Asn Ala Leu Thr Tyr Val Leu Leu Gly
290 295 300
Glu Gly Ile Pro Ile Val Tyr Tyr Gly Ser Glu Gln Gly Phe Ser Gly
305 310 315 320
Gly Ala Asp Pro Ala Asn Arg Glu Val Leu Trp Thr Thr Asn Tyr Asp
325 330 335
Thr Ser Ser Asp Leu Tyr Gln Phe Ile Lys Thr Val Asn Ser Val Arg
340 345 350
Met Lys Ser Asn Lys Ala Val Tyr Met Asp Ile Tyr Val Gly Asp Asn
355 360 365
Ala Tyr Ala Phe Lys His Gly Asp Ala Leu Val Val Leu Asn Asn Tyr
370 375 380
Gly Ser Gly Ser Thr Asn Gln Val Ser Phe Ser Val Ser Gly Lys Phe
385 390 395 400
Asp Ser Gly Ala Ser Leu Met Asp Ile Val Ser Asn Ile Thr Thr Thr
405 410 415
Val Ser Ser Asp Gly Thr Val Thr Phe Asn Leu Lys Asp Gly Leu Pro
420 425 430
Ala Ile Phe Thr Ser Ala Thr Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Pro
435 440 445
Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr Ala
450 455 460
Ser Lys Thr Ser Thr Ser Thr Ser Ser Thr Ser Cys Thr Thr Pro Thr
465 470 475 480
Ala Val Ala Val Thr Phe Asp Leu Thr Ala Thr Thr Thr Tyr Gly Glu
485 490 495
Asn Ile Tyr Leu Val Gly Ser Ile Ser Gln Leu Gly Asp Trp Glu Thr
500 505 510
Ser Asp Gly Ile Ala Leu Ser Ala Asp Lys Tyr Thr Ser Ser Asp Pro
515 520 525
Leu Trp Tyr Val Thr Val Thr Leu Pro Ala Gly Glu Ser Phe Glu Tyr
530 535 540
Lys Phe Ile Arg Ile Glu Ser Asp Asp Ser Val Glu Trp Glu Ser Asp
545 550 555 560
Pro Asn Arg Glu Tyr Thr Val Pro Gln Ala Cys Gly Thr Ser Thr Ala
565 570 575
Thr Val Thr Asp Thr Trp Arg
580
<210> 7
<211> 412
<212> PRT
<213> 强烈火球菌
<400> 7
Ala Glu Leu Glu Gly Leu Asp Glu Ser Ala Ala Gln Val Met Ala Thr
1 5 10 15
Tyr Val Trp Asn Leu Gly Tyr Asp Gly Ser Gly Ile Thr Ile Gly Ile
20 25 30
Ile Asp Thr Gly Ile Asp Ala Ser His Pro Asp Leu Gln Gly Lys Val
35 40 45
Ile Gly Trp Val Asp Phe Val Asn Gly Arg Ser Tyr Pro Tyr Asp Asp
50 55 60
His Gly His Gly Thr His Val Ala Ser Ile Ala Ala Gly Thr Gly Ala
65 70 75 80
Ala Ser Asn Gly Lys Tyr Lys Gly Met Ala Pro Gly Ala Lys Leu Ala
85 90 95
Gly Ile Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly Ser Gly Ser Ile Ser Thr Ile
100 105 110
Ile Lys Gly Val Glu Trp Ala Val Asp Asn Lys Asp Lys Tyr Gly Ile
115 120 125
Lys Val Ile Asn Leu Ser Leu Gly Ser Ser Gln Ser Ser Asp Gly Thr
130 135 140
Asp Ala Leu Ser Gln Ala Val Asn Ala Ala Trp Asp Ala Gly Leu Val
145 150 155 160
Val Val Val Ala Ala Gly Asn Ser Gly Pro Asn Lys Tyr Thr Ile Gly
165 170 175
Ser Pro Ala Ala Ala Ser Lys Val Ile Thr Val Gly Ala Val Asp Lys
180 185 190
Tyr Asp Val Ile Thr Ser Phe Ser Ser Arg Gly Pro Thr Ala Asp Gly
195 200 205
Arg Leu Lys Pro Glu Val Val Ala Pro Gly Asn Trp Ile Ile Ala Ala
210 215 220
Arg Ala Ser Gly Thr Ser Met Gly Gln Pro Ile Asn Asp Tyr Tyr Thr
225 230 235 240
Ala Ala Pro Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ile Ala
245 250 255
Ala Leu Leu Leu Gln Ala His Pro Ser Trp Thr Pro Asp Lys Val Lys
260 265 270
Thr Ala Leu Ile Glu Thr Ala Asp Ile Val Lys Pro Asp Glu Ile Ala
275 280 285
Asp Ile Ala Tyr Gly Ala Gly Arg Val Asn Ala Tyr Lys Ala Ile Asn
290 295 300
Tyr Asp Asn Tyr Ala Lys Leu Val Phe Thr Gly Tyr Val Ala Asn Lys
305 310 315 320
Gly Ser Gln Thr His Gln Phe Val Ile Ser Gly Ala Ser Phe Val Thr
325 330 335
Ala Thr Leu Tyr Trp Asp Asn Ala Asn Ser Asp Leu Asp Leu Tyr Leu
340 345 350
Tyr Asp Pro Asn Gly Asn Gln Val Asp Tyr Ser Tyr Thr Ala Tyr Tyr
355 360 365
Asp Phe Glu Lys Val Gly Tyr Tyr Asn Pro Thr Asp Gly Thr Trp Thr
370 375 380
Ile Lys Val Val Ser Tyr Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Gln Val Asp Val
385 390 395 400
Val Ser Asp Gly Ser Leu Ser Gln Pro Gly Ser Ser
405 410
<210> 8
<211> 515
<212> PRT
<213> 嗜热脂肪芽孢杆菌
<400> 8
Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu
1 5 10 15
Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala Asn Glu Ala Asn Asn
20 25 30
Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys
35 40 45
Gly Thr Ser Arg Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr Asp
50 55 60
Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr
65 70 75 80
Lys Ala Gln Tyr Leu Gln Ala Ile Gln Ala Ala His Ala Ala Gly Met
85 90 95
Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asp His Lys Gly Gly Ala Asp Gly
100 105 110
Thr Glu Trp Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg Asn Gln
115 120 125
Glu Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe
130 135 140
Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His
145 150 155 160
Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg Ile Tyr
165 170 175
Lys Phe Arg Gly Ile Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu
180 185 190
Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met Asp His
195 200 205
Pro Glu Val Val Thr Glu Leu Lys Asn Trp Gly Lys Trp Tyr Val Asn
210 215 220
Thr Thr Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys
225 230 235 240
Phe Ser Phe Phe Pro Asp Trp Leu Ser Tyr Val Arg Ser Gln Thr Gly
245 250 255
Lys Pro Leu Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Ser Tyr Asp Ile Asn Lys
260 265 270
Leu His Asn Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Gly Thr Met Ser Leu Phe Asp
275 280 285
Ala Pro Leu His Asn Lys Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly Gly Ala
290 295 300
Phe Asp Met Arg Thr Leu Met Thr Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln Pro
305 310 315 320
Thr Leu Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro Gly Gln
325 330 335
Ala Leu Gln Ser Trp Val Asp Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala
340 345 350
Phe Ile Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp
355 360 365
Tyr Tyr Gly Ile Pro Gln Tyr Asn Ile Pro Ser Leu Lys Ser Lys Ile
370 375 380
Asp Pro Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His
385 390 395 400
Asp Tyr Leu Asp His Ser Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Val
405 410 415
Thr Glu Lys Pro Gly Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro
420 425 430
Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly Lys Val
435 440 445
Phe Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn Ser
450 455 460
Asp Gly Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp
465 470 475 480
Val Pro Arg Lys Thr Thr Val Ser Thr Ile Ala Arg Pro Ile Thr Thr
485 490 495
Arg Pro Trp Thr Gly Glu Phe Val Arg Trp Thr Glu Pro Arg Leu Val
500 505 510
Ala Trp Pro
515
<210> 9
<211> 591
<212> PRT
<213> 埃默森篮状菌
<400> 9
Ala Thr Gly Ser Leu Asp Ser Phe Leu Ala Thr Glu Thr Pro Ile Ala
1 5 10 15
Leu Gln Gly Val Leu Asn Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ala Asp Val Ala
20 25 30
Gly Ala Ser Ala Gly Ile Val Val Ala Ser Pro Ser Arg Ser Asp Pro
35 40 45
Asn Tyr Phe Tyr Ser Trp Thr Arg Asp Ala Ala Leu Thr Ala Lys Tyr
50 55 60
Leu Val Asp Ala Phe Ile Ala Gly Asn Lys Asp Leu Glu Gln Thr Ile
65 70 75 80
Gln Gln Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Lys Val Gln Thr Ile Ser Asn Pro
85 90 95
Ser Gly Asp Leu Ser Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val
100 105 110
Asn Glu Thr Ala Phe Thr Gly Pro Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly
115 120 125
Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Leu Ile Ala Tyr Ala Asn Tyr Leu Ile
130 135 140
Asp Asn Gly Glu Ala Ser Thr Ala Asp Glu Ile Ile Trp Pro Ile Val
145 150 155 160
Gln Asn Asp Leu Ser Tyr Ile Thr Gln Tyr Trp Asn Ser Ser Thr Phe
165 170 175
Asp Leu Trp Glu Glu Val Glu Gly Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala Val
180 185 190
Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Asn Ala Leu Ala Thr Arg Leu Asn
195 200 205
His Thr Cys Ser Asn Cys Val Ser Gln Ala Pro Gln Val Leu Cys Phe
210 215 220
Leu Gln Ser Tyr Trp Thr Gly Ser Tyr Val Leu Ala Asn Phe Gly Gly
225 230 235 240
Ser Gly Arg Ser Gly Lys Asp Val Asn Ser Ile Leu Gly Ser Ile His
245 250 255
Thr Phe Asp Pro Ala Gly Gly Cys Asp Asp Ser Thr Phe Gln Pro Cys
260 265 270
Ser Ala Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Val Val Thr Asp Ser Phe Arg
275 280 285
Ser Ile Tyr Ala Ile Asn Ser Gly Ile Ala Glu Gly Ser Ala Val Ala
290 295 300
Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Val Tyr Gln Gly Gly Asn Pro Trp Tyr
305 310 315 320
Leu Ala Thr Ala Ala Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Ile Tyr Gln
325 330 335
Trp Lys Lys Ile Gly Ser Ile Ser Ile Thr Asp Val Ser Leu Pro Phe
340 345 350
Phe Gln Asp Ile Tyr Pro Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr Asn Ser Gly
355 360 365
Ser Thr Thr Phe Asn Asp Ile Ile Ser Ala Val Gln Thr Tyr Gly Asp
370 375 380
Gly Tyr Leu Ser Ile Val Glu Lys Tyr Thr Pro Ser Asp Gly Ser Leu
385 390 395 400
Thr Glu Gln Phe Ser Arg Thr Asp Gly Thr Pro Leu Ser Ala Ser Ala
405 410 415
Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ser Ala Arg Arg Gln
420 425 430
Ser Val Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu Ser Ser Ala Ser Ser Val Pro
435 440 445
Ala Val Cys Ser Ala Thr Ser Ala Thr Gly Pro Tyr Ser Thr Ala Thr
450 455 460
Asn Thr Val Trp Pro Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Thr Ser
465 470 475 480
Ser Ala Pro Cys Thr Thr Pro Thr Ser Val Ala Val Thr Phe Asp Glu
485 490 495
Ile Val Ser Thr Ser Tyr Gly Glu Thr Ile Tyr Leu Ala Gly Ser Ile
500 505 510
Pro Glu Leu Gly Asn Trp Ser Thr Ala Ser Ala Ile Pro Leu Arg Ala
515 520 525
Asp Ala Tyr Thr Asn Ser Asn Pro Leu Trp Tyr Val Thr Val Asn Leu
530 535 540
Pro Pro Gly Thr Ser Phe Glu Tyr Lys Phe Phe Lys Asn Gln Thr Asp
545 550 555 560
Gly Thr Ile Val Trp Glu Asp Asp Pro Asn Arg Ser Tyr Thr Val Pro
565 570 575
Ala Tyr Cys Gly Gln Thr Thr Ala Ile Leu Asp Asp Ser Trp Gln
580 585 590
<210> 10
<211> 556
<212> PRT
<213> 瓣环栓菌
<400> 10
Gln Ser Ser Ala Ala Asp Ala Tyr Val Ala Ser Glu Ser Pro Ile Ala
1 5 10 15
Lys Ala Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Ser Gly Ser Lys Ser Asn
20 25 30
Gly Ala Lys Ala Gly Ile Val Ile Ala Ser Pro Ser Thr Ser Asn Pro
35 40 45
Asn Tyr Leu Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Ala
50 55 60
Leu Ile Asp Gln Phe Thr Thr Gly Glu Asp Thr Ser Leu Arg Thr Leu
65 70 75 80
Ile Asp Glu Phe Thr Ser Ala Glu Ala Ile Leu Gln Gln Val Pro Asn
85 90 95
Pro Ser Gly Thr Val Ser Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn
100 105 110
Ile Asp Glu Thr Ala Phe Thr Asp Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp
115 120 125
Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Ile Ile Thr Tyr Ala Asn Trp Leu
130 135 140
Leu Asp Asn Lys Asn Thr Thr Tyr Val Thr Asn Thr Leu Trp Pro Ile
145 150 155 160
Ile Lys Leu Asp Leu Asp Tyr Val Ala Ser Asn Trp Asn Gln Ser Thr
165 170 175
Phe Asp Leu Trp Glu Glu Ile Asn Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala
180 185 190
Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Thr Phe Ala Asn Arg Ile
195 200 205
Gly Gln Thr Ser Val Val Ser Gly Tyr Thr Thr Gln Ala Asn Asn Leu
210 215 220
Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Thr Gly Gly Tyr Ile Thr
225 230 235 240
Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Val Leu
245 250 255
Thr Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Ala Ala Gly Cys Asp Ala Val Thr
260 265 270
Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr Val
275 280 285
Asp Ala Phe Arg Ser Ile Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Ile Ala Ser Asn
290 295 300
Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Met Gly Gly
305 310 315 320
Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Ser Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr Asp
325 330 335
Ala Leu Ile Val Trp Asn Lys Leu Gly Ala Leu Asn Val Thr Ser Thr
340 345 350
Ser Leu Pro Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Gly Val Thr Val Gly Thr
355 360 365
Tyr Ala Ser Ser Ser Ser Thr Phe Lys Thr Leu Thr Ser Ala Ile Lys
370 375 380
Thr Phe Ala Asp Gly Phe Leu Ala Val Asn Ala Lys Tyr Thr Pro Ser
385 390 395 400
Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Tyr Ser Arg Ser Asn Gly Ser Pro Val
405 410 415
Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Ala Leu Thr Ser Phe
420 425 430
Ala Ala Arg Ser Gly Lys Thr Tyr Ala Ser Trp Gly Ala Ala Gly Leu
435 440 445
Thr Val Pro Thr Thr Cys Ser Gly Ser Gly Gly Ala Gly Thr Val Ala
450 455 460
Val Thr Phe Asn Val Gln Ala Thr Thr Val Phe Gly Glu Asn Ile Tyr
465 470 475 480
Ile Thr Gly Ser Val Pro Ala Leu Gln Asn Trp Ser Pro Asp Asn Ala
485 490 495
Leu Ile Leu Ser Ala Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ile Thr Val Asn
500 505 510
Leu Pro Ala Ser Thr Thr Ile Glu Tyr Lys Tyr Ile Arg Lys Phe Asn
515 520 525
Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser Ile Thr Thr Pro
530 535 540
Ala Ser Gly Thr Phe Thr Gln Asn Asp Thr Trp Arg
545 550 555

Claims (21)

1.一种葡糖淀粉酶变体，与SEQ ID NO:2中披露的葡糖淀粉酶相比，其在pH＝4.0，T＝32℃下，具有增加的生淀粉水解活性，其中该变体源自以下葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶具有：包含SEQ ID NO:2的氨基酸1-454或SEQ ID NO:4的1-454的催化结构域，包含SEQ IDNO:2的氨基酸455-462或SEQ ID NO:4的氨基酸455-465的接头，以及包含SEQ ID NO:2的氨基酸463-556或SEQ ID NO:4的氨基酸466-559的淀粉结合结构域，并且其中该变体进一步包含在选自由以下组成的组的一个或多个位置处的取代：
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
S95P+A121P+Y295W+T116R+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+G120S+A121P+Y295W+Q318Y+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+S458SCGG+N527M+T(V)549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+S458SCGG+N527M+T(V)549W+N503R；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+Q318Y+S95P+A121P+Y295W+S458SCGG+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+G120S+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+S458SCGG+N527M T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
S95P+T116R+A121P+Y295W+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N527M+T(V)549W+N503R；
S95P+A121P+Y295W+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
V18M+T43K+S95P+A121P+A518K+N527M+T549W；
T43K+S95P+G120S+A121P+Y295W+Q318Y+A518K+N527M+T(V)549W；
T43K+S95P+A121P+Q318Y+A493V+A518K+N527M+T549W；
S95P+G120S+A121P+Y295W+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
V18M+T43K+S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N527M+T(V)549W；
T43K+S95P+A121P+Q318Y+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+N527M+T549W；
S95P+A121P+Y295W+T116R+N527M+T(V)549W；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+A493V+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A493V+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+A518K+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+A117Q+N527M+T(V)549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A493V+A518K+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Q318Y+A493V+N527M+T549W；
S95P+T116R+A121P+Y295W+A518K+N527M+T(V)549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+T(V)549W；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+A518K+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+A518K+T549W；
S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N527M+T(V)549W；
S95P+G120S+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
S95P+N112L+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N527M+T549W；
S95P+G120S+A121P+Y295W+A518K+N527M+T(V)549W；
S95P+N112L+A121P+Y295W+A518K+N527M+T(V)549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+T549W；
S95P+A121P+Y295W+A493V+A518K+E520Q+T549W；
S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M+T549W；
S95P+A121P+Y295W+A518K+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M；
S95P+A121P+Y295W+S458C+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
S95P+A121P+Y295W+N527M+T549W；
S95P+A121P+A271F+Y295W+A518K+N527M+T549W；
S95P+A121P+Y295W+A493V；
S95P+A121P+Y295W+S540K；
S95P+A121P+Y295W+S540R；
S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M；
S95P+A121P+Y295W+S458SGGC+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+S458SCGG+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
其中位置编号对应于SEQ ID NO:2中阐明的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
2.如权利要求1所述的葡糖淀粉酶变体，其中该变体源自以下葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶具有：包含SEQ ID NO:2的氨基酸1-454的催化结构域，包含SEQ ID NO:4的氨基酸455-465的接头，以及包含SEQ ID NO:4的氨基酸466-559的淀粉结合结构域，并且其中该变体包含选自由以下组成的组的具体取代的组合：
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
S95P+A121P+Y295W+T116R+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+G120S+A121P+Y295W+Q318Y+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+S458SCGG+N527M+T(V)549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+S458SCGG+N527M+T(V)549W+N503R；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+S458SCGG+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+G120S+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+S458SCGG+N527M T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
S95P+T116R+A121P+Y295W+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N527M+T(V)549W+N503R；
S95P+A121P+Y295W+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
并且其中与SEQ ID NO:2相比，生淀粉水解活性的增加是至少30％、至少35％，例如至少40％。
3.如权利要求1所述的葡糖淀粉酶变体，其中该变体源自SEQ ID NO:2的葡糖淀粉酶，并且其中该变体包含选自由以下组成的组的具体取代的组合：
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+A518K+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Q318Y+A493V+A518K+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Y295W
+A518K+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Q318Y+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+A493V+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A493V+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A493V+A518K+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Q318Y+A493V+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+A518K+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+T116R+A121P+Q318Y+A518K+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+N527M+T549W；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N527M+T549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+T549W；
S95P+A121P+Y295W+A493V+A518K+E520Q+T549W；
S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M+T549W；
S95P+A121P+Y295W+N527M+T549W；
S95P+A121P+A271F+Y295W+A518K+N527M+T549W；
S95P+A121P+Y295W+A493V；
S95P+A121P+Y295W+S540K；
S95P+A121P+Y295W+S540R；
S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M；
并且其中与SEQ ID NO:2相比，生淀粉水解活性的增加是至少5％。
4.如权利要求1所述的葡糖淀粉酶变体，其中该变体源自以下葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶具有：包含SEQ ID NO:2的氨基酸1-454的催化结构域，包含SEQ ID NO:4的氨基酸455-465的接头，以及包含SEQ ID NO:4的氨基酸466-559的淀粉结合结构域，并且其中该变体包含选自由以下组成的组的一个或多个位置处的取代：
T43K+S95P+G120S+A121P+Y295W+Q318Y+A518K+N527M+T(V)549W；
S95P+G120S+A121P+Y295W+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+T116R+N527M+T(V)549W；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y+A518K+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+A117Q+N527M+T(V)549W；
S95P+T116R+A121P+Y295W+A518K+N527M+T(V)549W；
V18M+T43K+S95P+A121P+Q318Y+A518K+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+Q318Y+N527M+T(V)549W；
S95P+G120S+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M+T(V)549W；
S95P+N112L+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
S95P+G120S+A121P+Y295W+A518K+N527M+T(V)549W；
S95P+N112L+A121P+Y295W+A518K+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+A518K+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+A518K+N527M；
S95P+A121P+Y295W+S458C+N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
S95P+A121P+Y295W+S458SGGC+N539R+I541Y+T543V+A545S+
S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
T43K+S95P+A121P+Y295W+N527M+T(V)549W；
S95P+A121P+Y295W+S458SCGG+N539R+I541Y+T543V+A545S+
S546GCGV+G547S+S548T+T549A；
并且其中与SEQ ID NO:2相比，生淀粉水解活性的增加是至少2％。
5.如权利要求1-4中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中取代或插入的数目是1-20个，例如，1-10个和1-5个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代或插入。
6.一种用于增加葡糖淀粉酶的生淀粉水解活性的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供杂合葡糖淀粉酶，该杂合葡糖淀粉酶包含：由SEQ ID NO:2的氨基酸1-454组成的第一氨基酸序列，选自SEQ ID NO:2的氨基酸455-462或SEQ ID NO:4的氨基酸455-465的第二氨基酸序列，以及选自SEQ ID NO:2的氨基酸463-556或SEQ ID NO:4的氨基酸466-559的第三氨基酸序列；和/或
(b)引入选自以下中的至少一项、优选地至少两项、优选地至少三项、优选地至少四项的取代的组合：V18M、T43K、N112L、T116R、A117Q、G120S、A271F、Y295W、Q318Y；和/或
(c)引入选自下组的至少三个、优选地至少四个取代：S458C、S458SCGG、S458SGGC、A493V、A518K、E520Q、N527M、S540K,R、S(G)546P、T(V)549W、N503R、
N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A。
7.一种用于增加葡糖淀粉酶的生淀粉水解活性的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供杂合葡糖淀粉酶，该杂合葡糖淀粉酶包含：由SEQ ID NO:2的氨基酸1-454组成的第一氨基酸序列，选自SEQ ID NO:4的氨基酸455-465的第二氨基酸序列，以及选自SEQID NO:4的氨基酸466-559的第三氨基酸序列；和/或
(b)引入选自以下中的至少一项的取代的组合：V18M、T43K、T116R、G120S、Y295W、Q318Y；和/或
(c)引入以下3个选项之一：i)N539R+I541Y+T543V+A545S+S546GCGV+G547S+S548T+T549A；ii)N539R+I541Y+T543V+A545S+S546PCGV+G547S+S548T+T549A；iii)选自下组的至少三个取代：S458SCGG、N527M、T(V)549W、和N503R。
8.一种组合物，该组合物包括如权利要求1-5中任一项所述的葡糖淀粉酶变体。
9.如权利要求1-5中任一项所述的葡糖淀粉酶变体用于生产糖浆和/或发酵产物的用途。
10.一种由含淀粉的材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)在α-淀粉酶存在下使含淀粉材料液化；
(b)使所液化的材料糖化；以及
(c)使用发酵生物进行发酵；
其中使用如权利要求1-5中任一项所述的至少一种葡糖淀粉酶变体进行步骤(b)。
11.如权利要求10所述的方法，其中步骤(b)和步骤(c)同时进行。
12.一种由含淀粉的材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)在低于含淀粉材料的初始糊化温度的温度下使所述含淀粉材料糖化；以及
(b)使用发酵生物进行发酵，
其中使用如权利要求1-5中任一项所述的至少一种葡糖淀粉酶变体进行步骤(a)。
13.一种由含淀粉材料生产糖浆产物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)在α-淀粉酶存在下使含淀粉材料液化；
(b)在如权利要求1-5中任一项所述的葡糖淀粉酶变体存在下，使液化的材料糖化。
14.如权利要求10-12中任一项所述的方法，其中该发酵生物选自酵母，特别是酵母属，更特别是酿酒酵母。
15.如权利要求14所述的方法，其中该酵母表达葡糖淀粉酶，优选地褐褶菌属物种葡糖淀粉酶，更优选地来自篱边粘褶菌或密褐褶菌的葡糖淀粉酶，最优选地如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4披露的葡糖淀粉酶，或与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4具有至少90％同一性的葡糖淀粉酶。
16.一种多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求1-5中任一项所述的葡糖淀粉酶变体。
17.一种核酸构建体，该核酸构建体包含如权利要求16所述的多核苷酸。
18.一种表达载体，该表达载体包含如权利要求16所述的多核苷酸。
19.一种宿主细胞，该宿主细胞包含如权利要求16所述的多核苷酸、如权利要求17所述的核酸构建体或如权利要求18所述的表达载体。
20.如权利要求10-12中任一项所述的方法，其中将如权利要求19所述的宿主细胞在所述发酵步骤中应用。
21.一种产生如权利要求1-5中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的方法，该方法包括：
(a)在适合于表达该变体的条件下培养如权利要求19所述的宿主细胞；以及
(b)任选地回收该变体。
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