BR112014000143B1 - Variante de alfa-amilase, polinucleotídeo isolado, vetor de expressão, célula hospedeira, métodos de produzir uma variante de alfa-amilase, para produzir um produto de fermentação a partir de um material contendo amido, e, para a produção um derivado de amido enzimaticamente modificado - Google Patents

Abstract

variante de alf a-amilase, polinucleotídeo isolado,construção de ácido nucleico, vetor de expressão,célula hospedeira, métodos de produzir uma variante de alfa-amilase, para produzir um produto de fermentação a partir de um material contendo amido, e, para a produção um derivado de amido enzimaticamente modificado. a presente invenção refere-se a variantes de alfa-amilase. apresente invenção também se refere a polinucleotídeos codificando as variantes; construtos de ácido nucleico, vetores, e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos; e métodos de usar as variantes.

Description

VARIANTE DE ALFA-AMILASE, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODOS DE PRODUZIR UMA VARIANTE DE ALFA-AMILASE, PARA PRODUZIR UM PRODUTO DE FERMENTAÇÃO A PARTIR DE UM MATERIAL CONTENDO AMIDO, E, PARA A PRODUÇÃO UM DERIVADO DE AMIDO ENZIMATICAMENTE MODIFICADO Referência à Listagem de Sequências

[001] Este pedido contém uma Listagem de Sequências em formato legível por computador, que é aqui incorporada por referência.

Antecedentes da Invenção Campo da Invenção

[002] A presente invenção refere-se a variantes de uma alfa-amilase, os polinucleotídeos codificando as variantes, os métodos de produção de variantes, e métodos de usar as variantes.

Descrição da Técnica Relacionada

[003] A presente invenção provê variantes de uma alfa-amilase parental com propriedades melhoradas em comparação com o seu parental. As alfa-amilases (1,4-a-D-glucano glucanohidrolase, EC 3.2.1.1) constituem um grupo de enzimas que catalisam a hidrólise de amido e outros oligo- e polissacarídeos 1,4 glucosidícos lineares e ramificados.

[004] Existe um corpo muito extenso de patentes e literatura científica relativa a esta classe de enzimas industrialmente muito importante. Um número de alfa-amilases referidas como “alfa-amilases de tipo Termamyl®, e suas variantes, são conhecidos a partir de, por exemplo, WO 90/11352, WO 95/10603, WO 95/26397, WO 96/23873 e WO 96/23874. As alfa-amilases de tipo Termamyl® são muito termoestáveis e, portanto, apropriadas para processos realizados em temperaturas elevadas, tais como liquefação de amido em processos de produção de dextrose.

[005] As alfa-amilases de outro grupo são referidas como ”alfa-amilases de tipo Fungamyl™'', que são alfa-amilases relacionadas ou homólogas para as alfa-amilases derivadas de Aspergillus oryzae. As alfa-amilases de tipo Fungamyl têm uma termoestabilidade relativamente baixa, por exemplo, o produto comercial vendido sob o nome comercial Fungamyl™ pela Novozymes A/S, Dinamarca, tem um valor ótimo em torno de 55°C, e não é apropriada para processos conduzidos em altas temperaturas. As alfa-amilases de tipo Fungamyl® são usadas hoje em dia para fazer xaropes para, por exemplo, a indústria de fabricação de cerveja.

[006] Uma alfa-amilase com aumentada termoestabilidade, preferivelmente a um pH ácido, foi previamente isolada com sucesso. O documento WO 2004/055178 divulga um gene de Rhizomucor pusillus codificando para uma alfa-amilase denotada AM782. Caracterização desta amilase tem mostrado ser uma alfa-amilase altamente termoacidofílica que tem uma atividade muito interessante, como demonstrado pelo perfil de açúcar a partir de hidrólise de maltodextrina pela amilase AM782. A amilase AM782 pode trabalhar em uma temperatura muito elevada, pelo menos, até 70°C. No entanto, esta alfa amilase tem uma estabilidade de armazenamento fraca, se armazenada sem refrigeração. É um objeto da presente invenção proporcionar variantes de armazenamento estáveis de AM782 como SEQ ID NO: 3 (polipeptídeo maduro), que retiveram uma boa atividade de hidrólise de amido cru.

Sumário da Invenção

[007] A presente invenção refere-se a variantes de alfa-amilase, compreendendo uma substituição, em uma ou mais posições correspondentes às posições 128, 143, 141, 192, 20, 76, 123, 136, 142, 165, 219, 224, 265, 383, e 410 do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, em que a variante tem uma atividade de alfa-amilase.

[008] A presente invenção também se refere aos polinucleotídeos isolados codificando as variantes; construtos de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos, e métodos de produção de variantes.

[009] A presente invenção também se refere a métodos de produção de um produto de fermentação a partir de um material contendo amido usando as variantes da invenção.

Descrição Detalhada da Invenção

[0010] A presente invenção refere-se a variantes de uma alfa-amilase parental, compreendendo uma substituição de uma ou mais (várias) posições correspondentes às posições 128, 143, 141, 192, 20, 76, 123, 136, 142, 165, 219, 224, 265, 383, e 410 do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, em que a variante tem uma atividade de alfa-amilase.

Definições

[0011] Atividade da alfa-amilase: O termo "atividade de alfa-amilase'' significa uma 1,4-alfa D-glucano glucanohidrolase, CE. 3.2.1.1, que catalisa a hidrólise de amido e outros oligo e polissacarídeos 1,4 glucosidícos lineares e ramificados. Para os fins da presente invenção, a atividade de alfa-amilase pode ser determinada usando um kit de ensaio de alfa-amilase, por exemplo, disponível de Kikkoman Biochemifa Company, Número de Catálogo 60213. Ver seção de Materiais e método para detalhes. 1U = μmol CNP liberado/min a 30°C, pH 4,0. Podem ser usados em alternativa outros métodos apropriados para a determinação da atividade de alfa-amilases.

[0012] As variantes de polipeptídeos da presente invenção têm pelo menos 20%, por exemplo, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, e, pelo menos, 100% da atividade de alfa amilase do polipeptídeo maduro da alfa-amilase parental contida na SEQ ID NO: 2. Em uma forma de realização, a alfa-amilase madura consiste de SEQ ID NO: 3.

[0013] Variante: O termo "variante" significa que um polipeptídeo com atividade de alfa-amilase compreendendo uma alteração, isto é, uma substituição, inserção e/ou deleção, em uma ou mais (várias) posições. Uma substituição significa uma substituição de um aminoácido ocupando uma posição com um aminoácido diferente, uma deleção significa a remoção de um aminoácido ocupando uma posição, e uma inserção significa que a adição de um ou vários, por exemplo, 1-3, os aminoácidos adjacentes u um aminoácido ocupando uma posição. Preferivelmente, a alteração é uma substituição. Os polipeptídeos variantes da presente invenção têm pelo menos 20%, por exemplo, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, e, pelo menos, 100% da atividade da alfa-amilase do polipeptídeo maduro da alfa-amilase parental, por exemplo, SEQ ID NO: 3.

[0014] Mutante: O termo "mutante" designa um polinucleotídeo codificando uma variante.

[0015] Enzima de tipo selvagem: O termo alfa-amilase "de tipo selvagem" significa uma alfa-amilase expressa por um microrganismo ocorrendo naturalmente, tal como uma bactéria, levedura, fungos filamentosos encontrados na natureza.

[0016] Parental ou alfa amilase parental: O termo "parental" ou "alfa-amilase-parental" significa uma alfa-amilase em que uma alteração é efetuada para produzir as variantes das enzimas da presente invenção. O parental pode ser um polipeptídeo (tipo selvagem) de ocorrência natural ou uma sua variante.

[0017] Isolada: O termo "isolado" significa uma substância em uma forma ou meio que não ocorre na natureza. Exemplos não limitativos de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância não ocorrendo naturalmente, (2) qualquer substância, incluindo, mas não limitada a, qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo, ou cofator, que é pelo menos parcialmente removido a partir de um ou mais ou de todos os constituintes que ocorrem naturalmente com os quais está associada na natureza, (3) qualquer substância modificada pela mão do homem em relação à substância que se encontra na natureza, ou (4) qualquer substância modificada, aumentando a quantidade da substância com relação a outros componentes com os quais está naturalmente associada (por exemplo, cópias múltiplas de um gene codificando a substância, utilização de um promotor mais forte do que o promotor naturalmente associado com o gene codificando a substância). Uma substância isolada pode estar presente em uma amostra de caldo de fermentação.

[0018] Variante substancialmente pura: O termo "variante substancialmente pura" significa uma preparação que contém no máximo 10%, no máximo 8%, no máximo, 6%, no máximo, 5%, no máximo 4%, no máximo 3%, no máximo 2%, no máximo, 1 %, e no máximo 0,5% em peso de outro material de polipeptídeo com o qual está associada de forma nativa ou recombinante. Preferivelmente, a variante é pelo menos 92% pura, por exemplo, pelo menos 94% pura, pelo menos 95% pura, pelo menos 96% pura, pelo menos 97% pura, pelo menos 98% pura, pelo menos 99%, pelo menos 99,5% pura, ou 100% pura em peso, do material polipeptídeo total presente na preparação. As variantes da presente invenção estão preferivelmente em uma forma substancialmente pura. Isto pode ser conseguido, por exemplo, através da preparação da variante por métodos recombinantes bem conhecidos ou por métodos de purificação clássicos.

[0019] Polipeptídeo maduro: O termo "polipeptídeo maduro" significa um polipeptídeo na sua forma final após a tradução e quaisquer modificações pós-translacionais, tais como o processamento do N-terminal, truncagem do C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc. Em uma forma de realização, o polipeptídeo maduro consiste nos aminoácidos 34 a 471 de SEQ ID NO: 2, com base no programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6) que prevê que os aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO: 2 são um peptídeo de sinal, os aminoácidos 22 a 33 são um pró-peptídeo. O polipeptídeo maduro é divulgado como SEQ ID NO: 3.

[0020] Sequência de codificação de polipeptídeo maduro: O termo "sequência de codificação de polipeptídeo maduro” significa um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo maduro tendo uma atividade de alfa-amilase. Em um aspecto, a sequência de codificação de polipeptídeo maduro é nucleotídeos 100-1416 (incluindo o códon de parada) de SEQ ID NO: 1 com base em SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 16) prevendo que os nucleotídeos 1 e 63 de SEQ ID NO: 1 codificam um peptídeo de sinal e os nucleotídeos 64-99 codificam um propeptídeo.

[0021] Sequência de identidade: O relacionamento entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências nucleotídicas é descrito pelo parâmetro "identidade de sequência". Para os fins da presente invenção, o grau de identidade de sequências entre duas sequências de aminoácidos é determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferivelmente na versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros opcionais usados são penalidade de abertura de espaço de 10, penalidade de extensão de espaço de 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). A produção de saída de Needle rotulada "identidade mais longa" (obtida usando a opção -nobrief) é usada como a percentagem de identidade e é calculada como se segue:

[0022] (resíduos idênticos x 100)/(comprimento de alinhamento -número total de espaços em alinhamento)

[0023] Para os fins da presente invenção, o grau de identidade de sequências entre duas sequências de desoxirribonucleotídeos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferivelmente na versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros opcionais usados são penalidade de abertura de espaço de 10, penalidade de extensão de espaço de 0,5, e a matriz de substituição de EDNAFULL (EMBOSS versão de NCBI NUC4.4). A produção de saída de Needle rotulada "identidade mais longa” (obtida usando a opção nobrief) é usada como a percentagem de identidade e é calculada como se segue:

[0024] (desoxirribonucleotídeos idênticos x 100)/(comprimento de alinhamento - número total de espaços em alinhamento)

[0025] Fragmento: O termo "fragmento" significa um polipeptídeo tendo uma ou mais (vários) aminoácidos deletados a partir do término amino e/ou carboxila de um polipeptídeo maduro, em que o fragmento tem uma atividade de alfa-amilase.

[0026] Variante alélica: O termo "variante alélica" designa qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo locus cromossômico. Variação alélica surge naturalmente através de mutação, e pode resultar em polimorfismo dentro de populações. As mutações de genes podem ser silentes (nenhuma alteração no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos tendo as sequências de aminoácidos alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.

[0027] Polinucleotídeo substancialmente puro: O termo "polinucleotídeo substancialmente puro" significa uma preparação de polinucleotídeos livres de outros nucleotídeos estranhos ou indesejados e em uma forma apropriada para uso em sistemas de produção de polipeptídeos geneticamente engenheirados. Assim, um polinucleotídeo substancialmente puro contém no máximo 10%, no máximo 8%, no máximo, 6%, no máximo, 5%, no máximo 4%, no máximo 3%, no máximo 2%, no máximo, 1%, ou, no máximo, 0,5%, em peso, de outro material de polinucleotídeo com o qual está associado de forma nativa ou recombinante. Um polinucleotíde substancialmente puro pode, contudo, incluir regiões 5' e 3' não traduzidas ocorrendo naturalmente, como promotores e terminadores. É preferível que o polinucleotídeo substancialmente puro seja pelo menos 90% puro, por exemplo, pelo menos 92% puro, pelo menos 94% puro, pelo menos 95% puro, pelo menos 96% puro, pelo menos 97% puro, pelo menos 98 % puro, pelo menos 99% puro, ou, pelo menos 99,5% puro em peso. Os polinucleotídeos da presente invenção estão, preferivelmente em uma forma substancialmente pura.

[0028] Sequência de codificação: O termo "sequência de codificação” significa um polinucleotídeo, que especifica diretamente a sequência de aminoácidos do seu produto polipeptídico. Os limites da sequência de codificação são geralmente determinados por um quadro de leitura aberta, que normalmente começa com o códon de partida ATG ou códons de partida alternativos tais como GTG e TTG e termina com um códon de para TAA, tais como, TAG, TGA e. A sequência de codificação pode ser um polinucleotídeo sintético, ou recombinante, DNA ou cDNA.

[0029] cDNA: O termo "cDNA" significa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa a partir de uma molécula de mRNA madura, emendada, obtida a partir de uma célula eucariótica. cDNA carece de sequências de íntrons que podem estar presentes no DNA genômico correspondente. O transcrito de inicial principal é um precursor de mRNA que é processado através de uma série de etapas, incluindo a emenda, antes de aparecer como mRNA emendado maduro.

[0030] Construto de ácido nucleico: O termo "construto de ácido nucleico" significa uma molécula de ácido nucleico, quer de cadeia simples ou dupla, o qual é isolado a partir de um gene que ocorre naturalmente, ou é modificado para conter segmentos de ácidos nucleicos de um modo que não iria, de outra forma, existir na natureza ou que é sintético. O construto de ácido nucleico de expressão é sinônimo com o termo "cassete de expressão" quando o construto de ácido nucleico contém as sequências de controle necessárias para a expressão de uma sequência de codificação da presente invenção.

[0031] Sequências de controle: O termo "sequências de controle" significa todos os componentes necessários para a expressão de um polinucleotídeo codificando uma variante da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser nativa ou estranha para o polinucleotídeo codificando a variante ou nativa ou estranha para o outro. Tais sequências de controle incluem, mas não estão limitados a, um líder, sequência de poliadenilação, sequência de propeptídeo, promotor, sequência de peptídeo de sinal, e terminador da transcrição. Em um mínimo, as sequências de controle incluem um promotor, e sinais de parada de transcrição e de tradução. As sequências de controle podem ser fornecidas com ligadores com o objetivo de introduzir sítios de restrição específicos facilitando a ligação das sequências de controle com a região codificadora do polinucleotídeo codificando uma variante.

[0032] Operativamente ligado: O termo "operativamente ligado" significa uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação à sequência codificante de um polinucleotídeo de modo que a sequência de controle dirige a expressão da sequência de codificação.

[0033] Expressão: O termo "expressão" inclui qualquer etapa envolvida na produção da variante, incluindo, mas não limitado a, transcrição, modificação pós-transcrição, tradução, modificação pós-tradução, e secreção.

[0034] Vetor de expressão: O termo "vetor de expressão" designa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo codificando uma variante e está operativamente ligado aos nucleotídeos adicionais que fornecem a sua expressão.

[0035] Célula hospedeira: O termo "célula hospedeira" significa qualquer tipo de célula que é susceptível à transformação, transfecção, transdução, e semelhantes, com um vetor de expressão de construtor de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção. O termo "célula hospedeira" engloba qualquer progênie de uma célula parental que não é idêntica à célula parental devida a mutações que ocorrem durante a replicação.

[0036] Propriedade melhorada: O termo "propriedade melhorada" significa uma característica associada com uma variante que é melhorada em relação ao parental. Estas propriedades melhoradas incluem, mas não estão limitadas a, atividade térmica, termoestabilidade, atividade de pH, estabilidade de pH, especificidade do substrato/cofator, propriedades de superfície melhoradas, especificidade do produto, estabilidade aumentada, estabilidade melhorada em condições de armazenamento, e estabilidade química.

[0037] Termoestabilidade melhorada: O termo "termoestabilidade melhorada" significa uma variante apresentando uma atividade de alfa-amilase residual melhorada após um período de incubação a temperatura elevada em relação ao parental, ou em um tampão, ou sob condições tais como as que existem, durante o armazenamento /transporte do produto ou condições semelhantes àquelas que existem durante o uso industrial da variante. Uma variante pode ou não exibir um perfil de atividade térmica alterado em relação ao parental. Por exemplo, uma variante pode ou não ter uma melhor capacidade de reduplicar após a incubação a uma temperatura elevada em relação ao parental. Uma variante de acordo com a presente invenção exibe uma atividade residual melhorada em comparação com a alfa-amilase de Rhizomucor pusilus parental, descrita como o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, após incubação durante 1 hora a 65°C a pH 3,5. A atividade residual foi medida tal como descrito nos exemplos.

[0038] Em um aspecto, a termoestabilidade da variante tendo atividade de alfa-amilase é, pelo menos, 1,05 vezes, por exemplo, pelo menos 1,1 vezes, pelo menos, 1,5 vezes, pelo menos de 1,8 vezes, pelo menos, 2 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 15 vezes, pelo menos de 20 vezes, ou pelo menos 25 vezes mais termoestável do que o parental quando a atividade residual é comparada usando, por exemplo, o kit de atividade de amilase disponível de Kikkoman Biochemifa Company, Cat. 60213). Outros ensaios apropriados de amilase também podem ser usados.

[0039] Estabilidade em pH melhorada: O termo "estabilidade em pH melhorada" significa uma variante, que apresenta a retenção de atividade de alfa-amilase, após um período de incubação, a um pH específico, o que reduz a atividade enzimática do parental. As variantes de acordo com a presente invenção podem ter melhorada tolerância a um pH abaixo de 4,7, tal como abaixo de 4,5, em especial abaixo de 4,0, mais particularmente abaixo de 3,8, tal como pH 3,5.

[0040] Estabilidade em armazenamento melhorada: O termo "estabilidade de armazenamento melhorada" significa uma variante apresentando uma atividade de alfa-amilase residual melhorada em relação a uma alfa-amilase parental após a incubação durante um período de tempo a um pH e temperatura específicos. As condições testadas foram: pH 4,0, a 40°C durante 3 a 10 dias.

Convenções para designação de variantes

[0041] Para os fins da presente invenção, o polipeptídeo maduro compreendido em SEQ ID NO: 2 é usado para determinar o resíduo de aminoácido correspondente em outra alfa-amilase. Em uma forma de realização particular, o polipeptídeo maduro consiste em polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 e as posições específicas substituídas de acordo com a invenção referem-se às posições de SEQ ID NO 3. A sequência de aminoácidos de outra alfa-amilase é, portanto, alinhada com o polipeptídeo maduro compreendido na SEQ ID NO: 2, e com base no alinhamento, o número da posição de aminoácidos correspondendo a qualquer resíduo de aminoácido no polipeptídeo maduro compreendido em SEQ ID NO: 2 é determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferivelmente na versão 5.0.0 ou mais recente.

[0042] Identificação do resíduo de aminoácido correspondente em outra alfa-amilase pode ser confirmada por um alinhamento de sequências de polipeptídeos múltiplas usando vários programas de computador, incluindo, mas não limitados a, MUSCLE(multiple sequence comparison by log-expectation; versão 3,5 ou posterior; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), MAFFT (versão 6.857 ou posterior; Katoh e Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh e Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh e Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900), e EMBOSS EMMA empregando ClustalW (1.83 ou posterior; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 46734680), usando seus respectivos parâmetros de default padrão.

[0043] Quando a outra enzima divergiu do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de modo que a comparação tradicional à base de sequência de falha ao detectar a sua relação (Lindahl e Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615), outros algoritmos de comparação de sequências aos pares podem ser usados. Maior sensibilidade em busca baseada em sequência pode ser alcançada usando programas de busca que utilizam representações probabilísticas de famílias de polipeptídeos (perfis) para pesquisa em bancos de dados. Por exemplo, o programa PSI- BLAST gera perfis por meio de um processo iterativo de pesquisa em bancos de dados e é capaz de detectar homólogos remotos (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Mesmo uma maior sensibilidade, pode ser alcançada se a família ou superfamília para o polipeptídeo tem um ou mais representantes nas bases de dados de estrutura de proteína. Programas como GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin e Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) utilizam as informações a partir de uma variedade de fontes (PSI-BLAST, previsão de estrutura secundária, perfis de alinhamento estrutural, e potenciais de solvatação) como entrada para uma rede neural que prevê a duplicação estrutural para uma sequência de consulta. Da mesma forma, o método de Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919 pode ser usado para alinhar uma sequência de estrutura desconhecida com os modelos da superfamília presentes na base de dados SCOP. Estes alinhamentos por sua vez podem ser usados para gerar modelos de homologia para o polipeptídeo, e tais modelos podem ser avaliados quanto à precisão usando uma variedade de ferramentas desenvolvidas para esse fim.

[0044] Para as proteínas de estrutura conhecida, várias ferramentas e recursos estão disponíveis para recuperar e gerar alinhamentos estruturais. Por exemplo, as superfamílias SCOP de proteínas têm sido estruturalmente alinhadas, e esses alinhamentos são acessíveis e podem ser adquiridos por download. Duas ou mais estruturas de proteínas pode ser alinhadas usando uma variedade de algoritmos, como a matriz de alinhamento de distância (Holm e Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) ou extensão combinatória (Shindyalov e Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747), e implementações destes algoritmos podem ainda ser usadas para consultar bancos de dados de estrutura com uma estrutura de interesse, a fim de descobrir possíveis homólogos estruturais (por exemplo, Holm e Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).

[0045] Ao descrever as variantes de alfa-amilase da presente invenção, a nomenclatura abaixo descrita é adaptada para facilidade de referência. As abreviaturas aceitas por IUPAC de letra única ou de três letras de aminoácidos são empregadas.

[0046] Substituições. Para uma substituição de aminoácidos, a seguinte nomenclatura é usada: aminoácido original, posição, aminoácido substituído. Deste modo, a substituição de treonina por alanina na posição 226 é designada como “Thr226Ala” ou “T226A”. Várias substituições estão separadas por marcas de adição (“+”), por exemplo, “Gly205Arg + Ser411Phe” ou “G205R + S411F”, representando as substituições nas posições 205 e 411 de glicina (G) com arginina (R) e serina (S) por fenilalanina (F), respectivamente.

[0047] Deleções. Para uma deleção de aminoácidos, a seguinte nomenclatura é usada: aminoácido original, posição *. Assim sendo, a deleção de glicina na posição 195 é designada como “Gly195*” ou “G195*”. Várias deleções são separadas por marcas de adição (“+”), por exemplo, “Gly195* + Ser411*” ou “G195* + S411*”.

[0048] Inserções. Para uma inserção de aminoácidos, a seguinte nomenclatura é usada: aminoácido original, posição, aminoácido original, aminoácido inserido. Deste modo, a inserção de lisina após glicina na posição 195 é designada “Gly195GlyLys” ou “G195GK”. Uma inserção de múltiplos aminoácidos é designada [aminoácido original, posição, aminoácido original, aminoácido inserido # 1, aminoácido inserido # 2; etc]. Por exemplo, a inserção de lisina e alanina depois de glicina na posição 195 é indicada como “Gly195GlyLysAla” ou “G195GKA”.

[0049] Em tais casos, o(s) resíduo(s) de aminoácido(s) inserido (s) são numerados por meio da adição de letras minúsculas para o número da posição do resíduo de aminoácido que precede o(s) resíduo(s) de aminoácido(s) inserido (s). No exemplo acima, a sequência seria assim:

[0050] Alterações múltiplas. Variantes compreendendo múltiplas alterações são separados por marcas de adição (“+”), por exemplo, “Arg170Tyr+Gly195Glu” ou “R170Y+G195E” que representa uma substituição de tirosina e o ácido glutâmico por arginina e glicina nas posições 170 e 195, respectivamente.

[0051] Diferentes substituições. Onde substituições diferentes podem ser introduzidas em uma posição, as substituições diferentes são separadas por uma vírgula, por exemplo, ”Arg170Tyr, Glu” representa uma substituição de arginina por tirosina ou ácido glutâmico na posição 170. Assim, “Tyr167Gly,Ala + Arg170Gly,Ala” designa as seguintes variantes: “Tyr167Gly+Arg170Gly”, “Tyr167Gly+Arg170Ala”, “Tyr167Ala+Arg170Gly”, e “Tyr167Ala+Arg170Ala”.

Alfa-amilase parental

[0052] A alfa-amilase parental pode ser (a) um polipeptídeo com pelo menos 60 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 60 % de identidade de sequência com a sequência de codificação do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (c) um fragmento do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, que tem atividade de alfa-amilase.

[0053] Em uma forma de realização, o parental tem uma identidade de sequência para o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 60 %, por exemplo, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %, que tem atividade de alfa-amilase. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos parental difere por não mais do que dez aminoácidos, por exemplo, por cinco aminoácidos, por quatro aminoácidos, por três aminoácidos, por dois aminoácidos, e/ou por um aminoácido do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. O parental preferivelmente compreende ou consiste da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, o parental compreende ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, o parental compreende ou consiste dos aminoácidos 34-471 de SEQ ID NO: 2. Aminoácidos 34-471 de SEQ ID NO: 2 também são aqui descritos como SEQ ID NO: 3.

[0054] Em outra forma de realização, o parental é uma variante alélica do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[0055] Em outra forma de realização, o parental é codificado por um polinucleotídeo com a identidade de sequência para a sequência de codificação do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 de pelo menos 60 %, por exemplo, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %, codificando um polipeptídeo contendo a atividade da alfa-amilase. Em um aspecto, a sequência de codificação de polipeptídeo maduro é nucleotídeos 100-1413 de SEQ ID NO: 1. Em uma forma de realização, o parental é codificado por um polinucleotídeo que compreende ou consiste nos nucleotídeos 100 a 1413 de SEQ ID NO: 1.

[0056] O parental pode ser obtido a partir de microorganismos de qualquer gênero. Para os fins da presente invenção, o termo "obtido a partir de”, como aqui usado em ligação com uma dada fonte deve significar que o parental codificado por um polinucleotídeo é produzido pela fonte ou por uma célula em que o polinucleotídeo a partir da fonte foi inserido. Em um aspecto, o parental é secretado extracelularmente.

[0057] O parental pode ser uma alfa-amilase fúngica. Por exemplo, o parental pode ser uma alfa-amilase de fungo filamentoso, tal como uma alfa-amilase de Rhizomucor.

[0058] Em outro aspecto, o parental é uma alfa-amilase de Rhizomucor pusillus, por exemplo, a alfa-amilase de SEQ ID NO: 2 ou o polipeptídeo maduro da mesma. Em outra forma de realização, o parental é a sequência de codificação de polipeptídeo maduro de alfa amilase depositada no DSM 15334.

[0059] Deve entender-se que para as espécies acima mencionadas, o invenção abrange ambos os estados perfeitos e imperfeitos, e outros equivalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos, independentemente do nome pelo qual as espécies são conhecidas. Os versados na arte irão prontamente reconhecer a identidade de equivalentes apropriados.

[0060] Cepas destas espécies são prontamente acessíveis ao público em uma série de coleções de culturas, tais como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von und Mikroorganismen Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[0061] O parental pode ser identificado e obtido a partir de outras fontes, incluindo microrganismos isolados a partir da natureza (por exemplo, solo, adubos compostos, água, etc), ou amostras de DNA obtidas diretamente a partir de materiais naturais (por exemplo, solo, adubos compostos, água, etc) usando as sondas acima mencionadas. As técnicas para isolamento de microrganismos e DNA diretamente a partir de habitats naturais são bem conhecidas na técnica. O polinucleotídeo codificando um parental pode em seguida ser obtido por triagem similarmente de uma biblioteca genômica ou de cDNA de outro microrganismo ou uma amostra mista de DNA. Uma vez que tenha sido detectado um polinucleotídeo codificando um parental com uma sonda(s), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado usando técnicas que são conhecidas pelos versados na técnica (ver, por exemplo, Sambrook, Fritsch, e Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor, New York).

[0062] O parental pode ser um polipeptídeo híbrido em que uma porção de um polipeptídeo é fusionada no N-terminal e/ou C-terminal de uma porção de outro polipeptídeo(s).

[0063] O parental pode também ser um polipeptídeo fusionado ou polipeptídeo de fusão clivável, em que um polipeptídeo é fusionado no N-terminal e/ou C-terminal de outro polipeptídeo(s). Um polipeptídeo fusionado pode ser produzido por fusão de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo para um polinucleotídeo codificando outro polipeptídeo. As técnicas para a produção de polipeptídeos de fusão são conhecidas na técnica, e incluem ligação das sequências de codificação codificando os polipeptídeos de modo a que eles estão em quadro e que a expressão do polipeptídeo de fusão está sob controle do(s) mesmo(s) promotor(es) e terminador. Polipeptídeos de fusão podem também ser construídos usando tecnologia intein em que as fusões são criados de modo de pós-tradução (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).

[0064] Um polipeptídeo de fusão pode compreender ainda um sítio de clivagem entre os dois polipeptídeos. Após a secreção da proteína de fusão, o sítio é clivado liberando os dois polipeptídeos. Exemplos de sítios de clivagem incluem, mas não estão limitados a, os sítios descritos em Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; e Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240248; e Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.

[0065] Em uma forma de realização mais particular, o polipeptídeo híbrido da invenção é uma variante de alfa amilase da invenção conectada a um módulo de ligação de carboidratos (CBM), através de um ligador. Esses híbridos, compreendendo um polipeptídeo tendo atividade de alfa-amilase e um módulo de ligação de carboidratos, tendo principalmente afinidade para amido, tem a vantagem sobre as alfa-amilases existentes que por seleção de um domínio catalítico com propriedades desejadas, por exemplo o perfil de pH, o perfil de temperatura, a resistência à oxidação, a estabilidade a cálcio, a afinidade com o substrato ou o perfil do produto podem ser combinados com um módulo de ligação de carboidratos com afinidades de ligação mais fortes ou mais fracas, como por exemplo, as afinidades específicas para amilose, afinidades específicas para amilopectina ou afinidades para estrutura específica no carboidrato.

Sequência de ligador

[0066] A sequência de ligador pode ser qualquer sequência de ligador apropriada, por exemplo, uma sequência de ligador derivada de uma alfa-amilase ou de uma glucoamilase (GA) (também referida como uma amiloglucosidase (AMG)). O ligador pode ser uma ligação, ou um grupo de ligação curto, compreendendo de cerca de 2 a cerca de 100 átomos de carbono, em particular de 2 a 40 átomos de carbono. No entanto, o ligador é preferivelmente uma sequência de cerca de 2 a cerca de 100 resíduos de aminoácidos, com maior preferência de 4 a 40 resíduos de aminoácidos, tal como de 6 a 15 resíduos de aminoácidos.

[0067] Preferivelmente, um polipeptídeo híbrido compreende uma sequência de ligador derivada de qualquer espécie selecionada dentre o grupo consistindo de Acremonium, Aspergillus, Athelia, Coniochaeta, Leucopaxillus, Meripilus, Pachykytospora, Penicillium, Sublispora, Trametes, Trichophaea, e Valsaria. O ligador pode também ser derivado a partir de uma bactéria, por exemplo, a partir de uma cepa dentro de Bacillus sp. Mais preferivelmente, o ligador é derivado de uma espécie selecionada dentre o grupo consistindo de Acremonium sp., Coniochaeta sp., Meripilus giganteus, Penicillium sp., Sublispora provurvata, Trametes corrugata, Trichophaea saccata, Valsaria rubricosa, Valsario spartii, Aspergillus kawachii, Aspergillus niger, Athelia rolfsii, Leucopaxillus gigantus, Pachykytospora papayracea, Trametes cingulata e Bacillus flavothermus.

[0068] Ainda mais preferivelmente, o ligador é um ligador de uma glucoamilase selecionada dentre o grupo consistindo de Pachykytospora papayracea (por exemplo SEQ ID NO: 8), Trametes cingulata (por exemplo SEQ ID NO: 9), Leucopaxillus gigantus (por exemplo SEQ ID NO: 10), Athelia rolfsii (por exemplo SEQ ID NO: 19), Aspergillus kawachii (por exemplo SEQ ID NO: 20), Aspergillus niger (por exemplo SEQ ID NO: 21) ou um ligador de uma alfa-amilase selecionada dentre o grupo consistindo de Sublispora provurvata (por exemplo SEQ ID NO: 12), Valsaria rubricosa (por exemplo SEQ ID NO: 13), Acremonium sp. (por exemplo SEQ ID NO: 14), Meripilus giganteus (por exemplo SEQ ID NO: 15), Bacillus flavothermus (por exemplo SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 18), Coniochaeta sp. AM603 (por exemplo SEQ ID NO: 22), Coniochaeta sp. (por exemplo SEQ ID NO: 23), Trametes corrugata (por exemplo SEQ ID NO: 24), Valsario spartii (por exemplo SEQ ID NO: 25), Penicillium sp. (por exemplo SEQ ID NO: 26), Trichophaea saccata (por exemplo SEQ ID NO: 11).

[0069] Também preferida para a invenção é qualquer sequência de aminoácido ligador tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou mesmo pelo menos 95% de identidade com qualquer sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26.

[0070] Em outra forma de realização preferida, o polipeptídeo híbrido tem uma sequência de ligador que é diferente de um sequências de aminoácidos selecionadas dentre o grupo consistindo de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26 em não mais do que 10 posições, não mais de 9 posições, não mais de 8 posições, não mais do que 7 posições, não mais de 6 posições, não mais do que 5 posições, não mais de 4 posições, não mais de 3 posições, não mais do que duas posições, ou até mesmo não mais do que uma posição.

[0071] Para maiores detalhes sobre a codificação de DNA desses ligadores ver WO 06/069290.

Módulos de ligação de carboidrato

[0072] Um módulo de ligação de carboidratos (CBM), ou como frequentemente referido, um domínio de ligação de carboidratos (CDB), é uma sequência de aminoácidos do polipeptídeo que se liga preferivelmente a um poli - ou oligossacarídeo (carboidratos), frequentemente - mas não necessariamente de forma exclusiva - em uma sua forma insolúvel em água (incluindo cristalina).

[0073] CBMs derivados de enzimas degradantes de amido são muitas vezes referidos como módulos de ligação de amido (SBM) ou domínios de ligação de amido (SBD). Os CBMs podem ocorrer em determinadas enzimas amilolíticas, tais como certas glucoamilases (GA), ou em enzimas tais como glucanotransferases de ciclodextrina, ou em alfa-amilases. Da mesma forma, outras sublcasses de CBMS iriam englobar, por exemplo, módulos de ligação de celulose (CBMs a partir de enzimas celulolíticas), os módulos de ligação de quitina (CBMs que tipicamente ocorrem em quitinases), módulos de ligação a quitina (CBMs que tipicamente ocorrem em xilanases), módulos de ligação a manano (CBMs que tipicamente ocorrem em mananases). SBMs são muitas vezes referidos como SBDs (domínios de ligação de amido).

[0074] Os CBMs são encontrados como partes integrantes de grandes polipeptídeos ou proteínas consistindo de duas ou mais regiões de sequências de aminoácidos do polipeptídeo, especialmente das enzimas hidrolíticas (hidrolases) que, tipicamente, compreendem um módulo de catalisador contendo o sítio ativo para a hidrólise de substrato e um módulo de ligação de carboidratos (CBM) para a ligação com o substrato de carboidrato em questão. Tais enzimas podem compreender mais do que um módulo de catalisador e um, dois ou três CBMs e, opcionalmente, compreender ainda uma ou mais regiões da sequência de aminoácidos do polipeptídeo ligando o(s) CBM(s) com o módulo de catalisador(es), uma região deste último tipo sendo geralmente denotada como um "ligador". Exemplos de enzimas hidrolíticas que compreendem CBM - alguns dos quais já foram mencionados acima - são celulases, xilanases, mananases, arabinofuranosidases, acetilesterases e quitinases. CBMs também foram encontrados em algas, por exemplo, na alga vermelha Porphyra purpurea sob a forma de uma proteína de ligação de polissacarídeo não hidrolítica.

[0075] Nas proteínas/polipeptídeos em que ocorrem CBMs (por exemplo, enzimas, tipicamente enzimas hidrolíticas), CBM pode estar localizado no N-terminal ou C- terminal ou em uma posição interna.

[0076] Essa parte de um polipeptídeo ou proteína (por exemplo, enzima hidrolítica), que constitui CBM por si tipicamente consiste em mais do que cerca de 30 e menos do que cerca de 250 resíduos de aminoácidos.

[0077] O "módulo de ligação de carboidratos de Família 20" ou módulo CBM-20 está no contexto da presente invenção definido como uma sequência de aproximadamente 100 aminoácidos tendo pelo menos 45% de identidade com o módulo de ligação de carboidratos (CBM) do polipeptídeo representado na Figura 1 por Joergensen et al., 1997, Biotechnol. Lett. 19:1027-1031. CBM compreende os últimos 102 aminoácidos do polipeptídeo, ou seja, a subsequência do aminoácido 582 ao aminoácido 683. A numeração das famílias de glicosídeo hidrolase segue o conceito de Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (1999) CAZy - Carbohydrate-Ative enzymes server a URL: afmb.cnrs-mrs.fr/~cazy/CAZY/index.html ou alternativamente Coutinho & Henrissat, 1999, The modular structure of cellulases and other carbohydrate-active enzimas: an integrated database approach. Em “ Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation", K. Ohmiya, K. Hayashi, K. Sakka, Y. Kobayashi, S. Karita e T. Kimura eds., Uni Publishers Co., Tokyo, pp. 15-23 e Bourne e Henrissat, 2001, Glycoside hidrolases and glycosyltransferases: families and functional modules, Current Opinion in Structural Biology 11:593-600.

[0078] Exemplos de enzimas que compreendem um CBM apropriado para uso no contexto da invenção, são as alfa-amilases, alfa-amilases maltogênicas, celulases, xilanases, mananases, arabinofuranosidases, acetilesterases e quitinases. Outros CBMs de interesse em relação à presente invenção incluem CBMs decorrentes de glucoamilases (EC 3.2.1.3) ou de CGTases (CE 2.4.1.19).

[0079] CBMs derivando de fontes fúngicas, bacterianas ou de plantas serão geralmente apropriados para uso no híbrido da invenção. Os preferidos são os CBMs de origem fúngica. Neste contexto, as técnicas apropriadas para o isolamento de genes relevantes são bem conhecidas na técnica.

[0080] São preferidos os híbridos compreendendo um CBM de módulo de ligação de carboidratos Família 20, 21 ou 25. Os CBMs de módulo de ligação de carboidratos Família 20 apropriados para a presente invenção que pode ser derivados a partir de glucoamilases de Aspergillus awamori (SWISSPROT Q12537), Aspergillus kawachii (SWISSPROT P23176), Aspergillus niger (SWISSPROT P04064), Aspergillus oryzae (SWISSPROT P36914), a partir de alfa-amilases de Aspergillus kawachii (EMBL:#AB008370), Aspergillus nidulans (NCBI AAF17100.1), de beta-amilases de Bacillus cereus (SWISSPROT P36924), de CGTases de Bacillus circulans (SWISSPROT P43379).

[0081] Preferivelmente, o híbrido compreende um CBM que é derivado a partir de qualquer família ou espécie selecionada dentre o grupo consistindo de Acremonium, Aspergillus, Athelia, Coniochaeta, Cryptosporiopsis, Dichotomocladium, Dinemasporium, Diplodia, Gliocladium, Leucopaxillus, Malbranchea, Meripilus, Nectria, Pachykytospora, Penicillium, Rhizomucor, Rhizomucor pusillus, Streptomyces, Subulispora, Thermomyces, Trametes, Trichophaea saccata e Valsaria. O CBM também pode ser derivado de uma planta, por exemplo, a partir do milho (por exemplo, Zea mays) ou uma bactéria, por exemplo, Bacillus. Mais preferivelmente, o híbrido compreende um CBM, derivado de qualquer espécie selecionada dentre o grupo consistindo de Acremonium sp., Aspergillus kawachii, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Athelia rolfsii, Bacillus flavothermus, Coniochaeta sp., Cryptosporiopsis sp., Dichotomocladium hesseltinei, Dinemasporium sp., Diplodia sp., Gliocladium sp., Leucopaxillus gigantus, Malbranchea sp, Meripilus giganteus, Nectria sp., Pachykytospora papayracea, Penicillium sp., Rhizomucor pusillus, Streptomyces thermocyaneoviolaceus, Streptomyces limosus, Subulispora provurvata, Thermomyces lanuginosus, Trametes cingulata, Trametes corrugata, Trichophaea saccata,Valsaria rubricosa, Valsario spartii e Zea mays.

[0082] Mais preferivelmente, o híbrido compreende um CBM de uma glucoamilase selecionada dentre o grupo consistindo de Pachykytospora papayracea (SEQ ID NO: 28), Trametes cingulata (SEQ ID NO: 29), Leucopaxillus gigantus (SEQ ID NO: 30), Athelia rolfsii (SEQ ID NO: 36), Aspergillus kawachii (SEQ ID NO: 37), Aspergillus niger (SEQ ID NO: 38) ou a partir de uma alfa-amilase selecionada dentre o grupo consistindo de Trichopheraea saccata (SEQ ID NO: 27), Subulispora provurvata (SEQ ID NO: 31), Valsaria rubricosa (SEQ ID NO: 32), Acremonium sp. (SEQ ID NO: 33), Meripilus giganteus (SEQ ID NO: 34), Bacillus flavothermus (SEQ ID NO: 35), Coniochaeta sp. (SEQ ID NO: 39), Zea mays (SEQ ID NO: 40), Coniochaeta sp. (SEQ ID NO: 41), Trametes corrugata (SEQ ID NO: 42), Valsario spartii (SEQ ID NO: 43) e Penicillium sp. (SEQ ID NO: 44).

[0083] Em outra forma de realização preferida, a enzima híbrida tem uma sequência de CBM que difere de uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo de SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO: 44 em não mais do que 10 posições, não mais de 9 posições, não mais de 8 posições, não mais do que 7 posições, não mais de 6 posições, não mais do que 5 posições, não mais de 4 posições, não mais de 3 posições, não mais do que duas posições, ou até mesmo não mais do que uma posição.

[0084] Também preferidos são os CBMs tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou mesmo pelo menos 95% de identidade com qualquer sequência selecionada dentre o grupo consistindo de SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO: 44.

[0085] Em uma forma de realização particularmente preferida, a variante de alfa amilase da invenção é fusionada com o ligador (SEQ ID NO: 19) e CBM (ID SEQ NO: 36) de Athelia rolfsii AMG (glucoamylase). Este construto é mostrado em SEQ ID N°5, exceto que o núcleo catalítico incluído em SEQ ID N°5 não tem nenhuma das substituições de acordo com a invenção e, portanto, é idêntico ao da alfa-amilase parental mostrada como SEQ ID NO: 2. O DNA codificando SEQ ID NO: 5 é aqui descrito como SEQ ID NO: 4. Mais particularmente, a variante de alfa-amilase da invenção, é condensada com um ligador e CBM tendo, pelo menos, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou mesmo pelo menos 95% de identidade com o ligador e CBM compreendido em SEQ ID NO: 5.

[0086] Em outra forma de realização particularmente preferida, a variante de alfa amilase da invenção está fusionada ao ligador (SEQ ID NO: 21) e CBM (SEQ ID NO: 38) de AMG de Aspergillus niger. Este construto é apresentado em SEQ ID NO: 7, exceto que o núcleo catalítico incluído em SEQ ID NO: 7 não tem qualquer uma das substituições de acordo com a invenção e, portanto, é idêntico ao da alfa-amilase parental mostrada como SEQ ID NO: 2. A sequência de DNA codificando o polipeptídeo de SEQ ID NO: 7 é aqui descrita como SEQ ID NO: 6. Mais particularmente, a variante de alfa-amilase da invenção é condensada com um ligador e CBM tendo, pelo menos, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou mesmo pelo menos 95% de identidade com o ligador e CBM compreendido em SEQ ID NO: 7.

[0087] Para maiores detalhes sobre DNA codificando os CBMs ver WO 06/069290.

Preparação de Variantes

[0088] A mutagênese sítio-dirigida é uma técnica em que uma ou mais (várias) mutações são criadas em um ou mais sítios definidos em um polinucleotídeo codificando a parental.

[0089] A mutagênese sítio-dirigida pode ser realizada in vitro por PCR que envolve o uso de iniciadores oligonucleotídicos contendo a mutação desejada. A mutagênese sítio-dirigida, também podem ser realizada in vitro por mutagênese com cassete envolvendo a clivagem por uma enzima de restrição em um sítio no plasmídeo compreendendo um polinucleotídeo codificando a parental e subsequente ligação de um oligonucleotídeo contendo a mutação no polinucleotídeo. Geralmente, a enzima de restrição que digere o plasmídeo e o oligonucleotídeo é a mesma, permitindo que as extremidades pegajosas do plasmídeo e do inserto sem liguem uma na outra. Ver, por exemplo, Scherer e Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955; e Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966.

[0090] A mutagênese sítio-dirigida pode também ser realizada in vivo, por métodos conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Publicação do Pedido de Patente US 2004/0171154; Storici et al., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773776; Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290; e Calissano e Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16.

[0091] Qualquer procedimento de mutagênese sítio-dirigida pode ser usado na presente invenção. Existem muitos kits comerciais disponíveis que podem ser usados para preparar as variantes.

[0092] Construção do gene sintético envolve a síntese in vitro de uma molécula de polinucleotídeo projetada para codificar um polipeptídeo de interesse. Síntese de genes pode ser realizada usando uma série de técnicas, tais como a tecnologia baseada em microchip multiplex descrita por Tian et al. (2004, Nature 432: 1050-1054) e tecnologias similares em que os oligonucleotídeos são sintetizados e montados sobre chips microfluídicos foto-programáveis.

[0093] As substituições simples ou múltiplas, de aminoácidos, deleções e/ou inserções podem ser feitas e testadas usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação e/ou embaralhamento, seguido por um processo de triagem relevante, tal como os revelados por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR passível de erro, exibição de fagos (por exemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; Patente US No. 5.223.409; WO 92/06204) e mutagênese sítio-dirigida (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

[0094] Métodos de mutagênese/embaralhamento podem ser combinados com métodos de triagem automatizados de elevado rendimento, para detectar a atividade de polipeptídeos mutagenizados clonados, expressados por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). As moléculas de DNA mutagenizadas que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas a partir das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas usando métodos padrões na técnica. Estes métodos permitem a determinação rápida da importância de resíduos de aminoácidos individuais em um polipeptídeo.

[0095] Construção do gene semi-sintético pode ser conseguida através da combinação de aspectos da construção do gene sintético, e/ou de mutagênese sítio-dirigida, e/ou mutagênese aleatória e/ou embaralhamento. Construção semissintética pode ser tipificada por um processo de utilização de fragmentos de polinucleotídeos que são sintetizadas, em combinação com técnicas de PCR. Regiões definidas de genes podem, assim, ser sintetizados de novo, enquanto que outras regiões podem ser amplificadas usando os iniciadores mutagênicos sítio-específicos, enquanto que ainda outras regiões podem ser submetidas a amplificação de PCR propenso a erro ou de PCR não propenso a erro. Subsequências de polinucleotídeos podem então ser embaralhadas.

Variantes

[0096] A presente invenção provê variantes de alfa-amilase compreendendo uma alteração em uma mais (várias) posições correspondendo às posições 20, 76, 123, 128, 136, 141, 142, 143, 165, 192, 219, 224, 265, 383, e 410 do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, em que a variante tem atividade de alfa-amilase. Particularmente a alteração é uma substituição. Além disso, a variante pode ser selecionada dentre o grupo consistindo de:

[0097] a) um polipeptídeo tendo pelo menos 60% identidade de sequência para o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2;

[0098] b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de baixa severidade com (i) a sequência de codificação do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (ii) o filamento complementar de comprimento completo de (i);

[0099] c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 60% de identidade com a sequência de codificação do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1; ou

[00100] d) um fragmento do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, que tem atividade de alfa-amilase.

[00101] Em uma forma de realização, a variante tem pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, e/ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em um aspecto, o número de substituições nas variantes da presente invenção é 1-20, por exemplo, 1-10 e 1-5, como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substituições.

[00102] Em outra forma de realização, a variante é codificada por um polinucleotídeo tendo a identidade de sequência de pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, para a sequência de codificação do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.

[00103] Em outra forma de realização, a variante é codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de muito baixa severidade, condições de baixa severidade, condições de média severidade, condições de média-alta severidade, condições de alta severidade, ou condições de muito alta severidade com (i) a sequência de codificação do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (ii) o filamento complementar de comprimento completo de (i) (Sambrook, Fritsch, e Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a. ed, Cold Spring Harbor, New York).

[00104] O polinucleotídeo de SEQ ID NO: 1 ou uma subsequência do mesmo, assim como a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou um fragmento da mesma, pode ser usado para projetar sondas de ácido nucleico para identificar e clonar DNA codificando um parental a partir de cepas de diferentes gêneros ou espécies de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, estas sondas podem ser usadas para hibridação com o genômico ou cDNA do gênero ou espécie de interesse, seguindo procedimentos padrões de Southern blotting, a fim de identificar e isolar o gene correspondente no mesmo. Tais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a sequência completa, mas devem ter pelo menos 14, por exemplo, pelo menos 25, pelo menos 35, ou pelo menos 70 nucleotídeos de comprimento. Preferivelmente, a sonda de ácido nucleico é pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, ou pelo menos 900 nucleotídeos de comprimento. Ambas as sondas de DNA e RNA podem ser usadas. As sondas são tipicamente rotuladas para a detecção do gene correspondente (por exemplo, com 32P, 3H, 35S, biotina, ou avidina). Tais sondas são englobadas pela presente invenção.

[00105] Uma biblioteca de DNA ou cDNA genômico preparada a partir de tais outros organismos pode ser triada para DNA que hibridiza com as sondas descritas acima e codifica um parental. DNA genômico ou outro a partir de tais outros organismos pode ser separado por agarose ou eletroforese de poliacrilamida gel, ou outras técnicas de separação. DNA das bibliotecas ou o DNA separado pode ser transferido e imobilizado em nitrocelulose ou outro material veículo apropriado. A fim de identificar um clone ou DNA que é homólogo com SEQ ID NO: 1 ou uma subsequência do mesmo, o material veículo é usado em um Southern blot.

[00106] Para fins da presente invenção, hibridação indica que o polinucleotídeo hibridiza em uma sonda rotulada de nucleotídeo correspondendo ao polinucleotídeo mostrado em SEQ ID NO: 1, seu filamento complementar, ou uma subsequência do mesmo, sob condições de muito baixa a muito alta severidade. Moléculas às quais a sonda hibridiza podem ser detectadas usando, por exemplo, película de raios-X ou qualquer outro meio de detecção conhecido na técnica.

[00107] Em um aspecto, a sonda de ácido nucleico é a sequência de codificação do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1. Em outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é nucleotídeos 100 a 1413 de SEQ ID NO: 1. Em outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou um fragmento da mesma. Em outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é SEQ ID NO: 1.

[00108] Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, condições de muito baixa a muito alta severidade são definidas como pré-hibridação e hibridação a 42°C em 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 microgramas/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e ou 25% formamida para severidades muito baixas e baixas, 35% formamida para severidades médias e médias-altas, ou 50% formamida para severidades altas e muito altas, seguindo procedimentos padrões de Southern blotting durante 12 a 24 horas de modo ótimo. O material é finalmente lavado três vezes cada durante 15 minutos usando 2X SSC, 0.2% SDS a 45°C (severidade muito baixa), 50°C (severidade baixa), 55°C (severidade média), 60°C (severidade média-alta), 65°C (severidade alta), ou 70°C (severidade muito alta).

[00109] Para sondas curtas que tem cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 70 nucleotídeos de comprimento, condições de severidade são definidas como prehibridação e hibridação em cerca de 5°C a cerca de 10°C abaixo do Tm calculado usando o cálculo de acordo com Bolton e McCarthy (1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 1390) em 0,.9 M NaCl, 0,09 M Tris-HCl pH 7,6, 6 mM EDTA, 0,5% NP-40, solução de 1X Denhardt, 1 mM pirofosfato de sódio, 1 mM fosfato de sódio monobásico, 0,1 mM ATP, e 0,2 mg de RNA de levedura por ml seguindo procedimentos padrões de Southern blotting durante 12 a 24 horas de modo ótimo. O material de veículo é finalmente lavado uma vez em 6X SSC mais 0,1% SDS durante 15 minutes e duas vezes cada durante 15 minutos usando 6X SSC a 5°C a 10°C abaixo do Tm calculado.

[00110] Em outra forma de realização a variante é um fragmento do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 tendo uma substituição em uma ou mais posições correspondendo a posições 128, 143, 141, 192, 20, 76, 123, 136, 142, 165, 219, 224, 265, 383 e 410, que tem atividade de alfa-amilase contendo por exemplo pelo menos 435 resíduos de aminoácidos, por exemplo, pelo menos 433 ou por exemplo pelo menos 431 resíduos de aminoácidos.

[00111] Em um aspecto, uma variante compreende uma substituição em uma ou mais (várias) posições correspondendo às posições selecionadas dentre 20, 76, 123, 128, 136, 141, 142, 143, 165, 192, 219, 224, 265, 383, e 410. Em outro aspecto, uma variante compreende uma substituição em duas posições correspondendo a qualquer uma das posições selecionadas dentre 20, 76, 123, 128, 136, 141, 142, 143, 165, 192, 219, 224, 265, 383, e 410. Em outro aspecto, uma variante compreende uma substituição em três posições correspondendo a qualquer uma das posições selecionadas dentre 20, 76, 123, 128, 136, 141, 142, 143, 165, 192, 219, 224, 265, 383, e 410. Em outro aspecto, uma variante compreende uma substituição em quatro posições correspondendo a qualquer uma das posições 2 selecionadas dentre 0, 76, 123, 128, 136, 141, 142, 143, 165, 192, 219, 224, 265, 383, e 410. Em outro aspecto, uma variante compreende uma substituição em cinco posições correspondendo a qualquer uma das posições selecionadas dentre 20, 76, 123, 128, 136, 141, 142, 143, 165, 192, 219, 224, 265, 383, e 410. Em outro aspecto, uma variante compreende uma substituição em seis posições correspondendo a qualquer uma das posições selecionadas dentre 20, 76, 123, 128, 136, 141, 142, 143, 165, 192, 219, 224, 265, 383, e 410. Em outro aspecto, uma variante compreende uma substituição a sete posições correspondendo a qualquer uma das posições selecionadas dentre 20, 76, 123, 128, 136, 141, 142, 143, 165, 192, 219, 224, 265, 383, e 410. Em outro aspecto, uma variante compreende uma substituição em oito posições correspondendo a qualquer uma das posições selecionadas dentre 20, 76, 123, 128, 136, 141, 142, 143, 165, 192, 219, 224, 265, 383, e 410. Em outro aspecto, uma variante compreende uma substituição em nove posições correspondendo a qualquer uma das posições selecionadas dentre 20, 76, 123, 128, 136, 141, 142, 143, 165, 192, 219, 224, 265, 383, e 410. Em outro aspecto, uma variante compreende uma substituição em dez posições correspondendo a qualquer uma das posições selecionadas dentre 20, 76, 123, 128, 136, 141, 142, 143, 165, 192, 219, 224, 265, 383, e 410. Em outro aspecto, uma variante compreende uma substituição em onze posições correspondendo a qualquer uma das posições selecionadas dentre 20, 76, 123, 128, 136, 141, 142, 143, 165, 192, 219, 224, 265, 383, e 410. Em outro aspecto, uma variante compreende uma substituição em doze posições correspondendo a qualquer uma das posições selecionadas dentre 20, 76, 123, 128, 136, 141, 142, 143, 165, 192, 219, 224, 265, 383, e 410. Em outro aspecto, uma variante compreende uma substituição em treze posições correspondendo a qualquer uma das posições selecionadas dentre 20, 76, 123, 128, 136, 141, 142, 143, 165, 192, 219, 224, 265, 383, e 410. Em outro aspecto, uma variante compreende uma substituição em quatorze posições correspondendo a qualquer uma das posições selecionadas dentre 20, 76, 123, 128, 136, 141, 142, 143, 165, 192, 219, 224, 265, 383, e 410. Em outro aspecto, uma variante compreende uma substituição em cada posição correspondendo a posições selecionadas dentre 20, 76, 123, 128, 136, 141, 142, 143, 165, 192, 219, 224, 265, 383, e 410.

[00112] Em uma forma de realização particular a variante compreende substituições em posições 128 e 143. Em outra forma de realização particular a variante compreende substituições em posições 128 e 141. Em outra forma de realização particular a variante compreende substituições em posições 141 e 143.

[00113] Em uma forma de realização particular a variante compreende substituições em posições 128, 141, e 143. Em outra forma de realização particular a variante compreende substituições em posições 128, 141, e 192. Em outra forma de realização particular a variante compreende substituições em posições 128, 143 e 192. Em outra forma de realização particular a variante compreende substituições em posições 141, 143 e 192.

[00114] Em outra forma de realização particular a variante compreende substituições em posições 128, 141, 143 e 192.

[00115] Em um aspecto, a variante compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 20. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 20 é substituído com Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, ou Val, preferivelmente com Ser.

[00116] Em um aspecto, a variante compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 76. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 76 é substituído com Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, ou Val, preferivelmente com Gly.

[00117] Em um aspecto, a variante compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 123. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 123 é substituído com Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, ou Val, preferivelmente com His.

[00118] Em um aspecto, a variante compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 128. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 128 é substituído com Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, ou Val, preferivelmente com Asp.

[00119] Em um aspecto, a variante compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 136. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 136 é substituído com Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, ou Val, preferivelmente com Phe.

[00120] Em outro aspecto, a variante compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 141. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 141 é substituído com Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, ou Val, preferivelmente com Trp.

[00121] Em um aspecto, a variante compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 141. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 141 é substituído com Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, ou Val, preferivelmente com Arg.

[00122] Em outro aspecto, a variante compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 142. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 142 é substituído com Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, ou Val, preferivelmente com Asp.

[00123] Em outro aspecto, a variante compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 143. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 143 é substituído com Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, ou Val, preferivelmente com Asn.

[00124] Em um aspecto, a variante compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 165. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 165 é substituído com Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, ou Val, preferivelmente com Met.

[00125] Em outro aspecto, a variante compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 192. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 192 é substituído com Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, ou Val, preferivelmente com Arg.

[00126] Em outro aspecto, a variante compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 219. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 219 é substituído com Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, ou Val, preferivelmente com Cys.

[00127] Em um aspecto, a variante compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 224. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 224 é substituído com Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, ou Val, preferivelmente com Ala.

[00128] Em um aspecto, a variante compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 224. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 224 é substituído com Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, ou Val, preferivelmente com Arg.

[00129] Em um aspecto, a variante compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 265. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 265 é substituído com Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, ou Val, preferivelmente com Cys.

[00130] Em um aspecto, a variante compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 383. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 383 é substituído com Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, ou Val, preferivelmente com Arg.

[00131] Em outro aspecto, a variante compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 410. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 410 é substituído com Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, ou Val, preferivelmente com Ala.

[00132] Em outro aspecto, a variante compreende a substituição G20S do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, a variante compreende a substituição A76G do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, a variante compreende a substituição S123H do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, a variante compreende a substituição G128D do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, a variante compreende a substituição K136F do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, a variante compreende a substituição Y141W do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, a variante compreende a substituição Y141R do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, a variante compreende a substituição N142D do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, a variante compreende a substituição D143N do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, a variante compreende a substituição D165M do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, a variante compreende a substituição K192R do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, a variante compreende a substituição P219C do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, a variante compreende a substituição P224A do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, a variante compreende a substituição P224R do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, a variante compreende a substituição A265C do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, a variante compreende a substituição N383R do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, a variante compreende a substituição V410A do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00133] Em outro aspecto, a variante compreende a substituição Y141W do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00134] Em outro aspecto, a variante compreende a substituição Y141R do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00135] Em outro aspecto, a variante compreende a substituição K136F do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00136] Em outro aspecto, a variante compreende a substituição K192R do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00137] Em outro aspecto, a variante compreende a substituição P224A do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00138] Em outro aspecto, a variante compreende a substituição P224R do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00139] Em outro aspecto, a variante compreende as substituições S123H + Y141W do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00140] Em outro aspecto, a variante compreende as substituições G20S + Y141W do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00141] Em outro aspecto, a variante compreende as substituições A76G + Y141W do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00142] Em outro aspecto, a variante compreende as substituições G128D + Y141W do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00143] Em outro aspecto, a variante compreende as substituições G128D + D143N do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00144] Em outro aspecto, a variante compreende as substituições Y141W + D143N do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00145] Em outro aspecto, a variante compreende as substituições Y141W + K192R do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00146] Em outro aspecto, a variante compreende as substituições Y141W + P219C do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00147] Em outro aspecto, a variante compreende as substituições Y141W + N383R do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00148] Em outro aspecto, a variante compreende as substituições N142D + D143N do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00149] Em outro aspecto, a variante compreende as substituições G128D + Y141W + D143N do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00150] Em outro aspecto, a variante compreende as substituições Y141W + N142D + D143N do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00151] Em outro aspecto, a variante compreende as substituições Y141W + D143N + K192R do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00152] Em outro aspecto, a variante compreende as substituições Y141W + D143N + P219C do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00153] Em outro aspecto, a variante compreende as substituições Y141W + K192R + V410A do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00154] Em outro aspecto, a variante compreende as substituições Y141W + P219C + A265C do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00155] Em outro aspecto, a variante compreende as substituições G128D + D143N + K192R do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00156] Em outro aspecto, a variante compreende as substituições G128D + Y141W + D143N + K192R do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00157] Em outro aspecto, a variante compreende as substituições G128D + D143N + K192R + P219C + Y141W do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00158] Em outro aspecto, a variante compreende as substituições Y141W + D143N + K192R + P219C do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00159] As variantes podem ainda compreender uma ou mais alterações adicionais em uma ou mais (por exemplo, várias) outras posições.

[00160] As mudanças de aminoácidos podem ser de uma natureza pequena, isto é, substituições de aminoácidos conservativas, deleções ou inserções que não afetam de modo significante a duplicação e/ou atividade da proteína; deleções pequenas, tipicamente de 1-30 aminoácidos; extensões pequenas de amino- ou carboxil-terminal, como um resíduo de metionina amino-terminal; um peptídeo ligador pequeno de até 20-25 resíduos; ou uma extensão pequena que facilita a purificação por mudança de uma carga líquida ou outra função, como um trato poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

[00161] Exemplos de substituições conservativas estão dentro do grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e aminoácidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). As substituições de aminoácidos que não alteram geralmente a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York. As substituições comuns são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, e Asp/Gly.

[00162] Os aminoácidos essenciais em um parental podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, como mutagenese sítio- dirigida ou mutagenese de varredura de alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na última técnica, mutações de alanina única são introduzidas em cada resíduo na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas para atividade de alfa-amilase para identificar resíduos de aminoácidos que são críticos para a atividade da molécula. Ver também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O sítio ativo da alfa-amilase ou outra interação biológica também pode ser determinada por análise física da estrutura, como determinado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons ou rotulação de fotoafinidade em conjunto com mutação de aminoácidos de sítio de contato putativo. Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. As identidades de aminoácidos essenciais também podem ser deduzidas de análise de identidades com polipeptídeos que são aparentados com o parental.

[00163] Em uma forma de realização, a variante tem estabilidade ao pH melhorada comparada com a enzima parental.

[00164] Em uma forma de realização, a variante tem estabilidade ao armazenamento melhorada comparada com a enzima parental.

[00165] Em uma forma de realização, a variante tem termoestabilidade melhorada comparada com a enzima parental.

[00166] Polinucleotídeos

[00167] A presente invenção também se refere a polinucleotídeos isolados codificando qualquer uma das variantes da presente invenção.

[00168] Construtos de ácido nucleico

[00169] A presente invenção também se refere a construtos de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo codificando uma variante da presente invenção ligado operativamente a uma ou mais (várias) sequências de controle que dirigem expressão da sequência de codificação em uma célula hospedeira apropriada sob condições compatíveis com as sequências de controle.

[00170] Um polinucleotídeo pode ser manipulado de vários modos para proporcionar a expressão de uma variante. Manipulação do polinucleotídeo antes de sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificar os polinucleotídeos usando métodos de DNA recombinante são bem conhecidos na técnica.

[00171] A sequência de controle pode ser uma sequência de promotor, que é reconhecida por uma célula hospedeira para expressão do polinucleotídeo. A sequência de promotor contém sequências transcripcionais de controle que mediam a expressão da variante. O promotor pode ser qualquer de sequência ácido nucleico que mostra uma atividade transcripcional na célula hospedeira incluindo promotores mutantes, truncados e híbridos, e pode ser obtida a partir de genes codificando polipeptídeos extracelulares ou intracelulares ou homólogos ou heterólogos para a célula hospedeira.

[00172] Exemplos de promotores apropriados para dirigir a transcrição dos construtos de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira bacteriana são os promotores obtidos a partir de gene alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), gene alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amyL), gene penicillinase de Bacillus licheniformis (penP), gene amilase maltogênica de Bacillus stearothermophilus (amyM), gene levansucrase de Bacillus subtilis (sacB), genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, E. coli lac operon, gene agarase de Streptomyces coelicolor (dagA), e gene beta-lactamase procariótico (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), assim como o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Outros promotores são descritos em "Useful proteins from recombinant bacteria” em Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; e em Sambrook et al., 1989, supra.

[00173] Exemplos de promotores apropriados para dirigir a transcrição dos construtos de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira fúngica filamentosa são os promotores obtidos a partir dos genes para acetamidase de Aspergillus nidulans, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase estável em ácido em Aspergillus niger, glucoamilase em Aspergillus niger ou Aspergillus awamori (glaA), amilase Aspergillus oryzae TAKA, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, protease tipo tripsina em Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglucosidase em Fusarium venenatum (WO 00/56900), Fusarium venenatum Daria (WO 00/56900), Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900), lipase Rhizomucor miehei, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glucosidase de Trichoderma reesei, celobiohidrolase I em Trichoderma reesei, celobiohidrolase II em Trichoderma reesei, endoglucanase I em Trichoderma reesei, endoglucanase II deTrichoderma reesei, endoglucanase III em Trichoderma reesei, endoglucanase IV sw Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase I em Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reesei, assim como o promotor NA2-tpi (um promotor modificado incluindo um gene codificando uma alfa-amilase neutra em Aspergilli em que o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido a partir de um gene codificando triose fosfato isomerase em Aspergilli; exemplos não limitativos incluem promotores modificados incluindo o gene codificando alfa-amilase neutra em Aspergillus niger em que o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido a partir do gene codificando triose fosfato isomerase em Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae); e promotores mutantes, truncados, e híbridos dos mesmos.

[00174] Em um hospedeiro de levedura, promotores utilizáveis são obtidos a partir dos genes para enolase em Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), galactocinase em Saccharomyces cerevisiae (GAL1), álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase em Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2/GAP), triose fosfato isomerase em Saccharomyces cerevisiae (TPI), metalotioneína em Saccharomyces cerevisiae (CUP1), e 3-fosfoglicerato cinase em Saccharomyces cerevisiae. Outros promotores utilizáveis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

[00175] A sequência de controle também pode ser uma sequência de terminador de transcrição, que é reconhecida por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. A sequência de terminador é operavelmente ligada ao 3’-término do polinucleotídeo codificando a variante. Qualquer terminador que é funcional na célula hospedeira pode ser usado.

[00176] Terminadores preferidos para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos a partir dos genes para antranilato sintase de Aspergillus nidulans, alfa-glucosidase de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae, e protease tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

[00177] Terminadores preferidos para células hospedeiras de levedura são obtidos a partir dos genes para enolase de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C de Saccharomyces cerevisiae (CYC1), e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae. Outros terminadores para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, supra.

[00178] A sequência de controle também pode ser uma sequência líder apropriada, uma região não traduzida de um mRNA que é importante para tradução pela célula hospedeira. A sequência líder é operavelmente ligada ao 5’-término do polinucleotídeo codificando a variante. Qualquer sequência líder que é funcional na célula hospedeira pode ser usada.

[00179] Os líderes preferidos para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos a partir dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.

[00180] Os líderes apropriados para células hospedeiras de levedura são obtidos a partir dos genes para enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, 3-fosfoglicerato cinase de Saccharomyces cerevisiae, alfa-fator de Saccharomyces cerevisiae, e álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.

[00181] A sequência de controle também pode ser uma sequência de poliadenilação, uma sequência operavelmente ligada ao 3’-término da sequência codificando a variante e, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar os resíduos de poliadenosina ao mRNA transcrito. Qualquer sequência de poliadenilação que é funcional na célula hospedeira pode ser usada.

[00182] As sequências de poliadenilação preferidas para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidas a partir dos genes para antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glucoamilase de Aspergillus niger, alfa-glucosidase de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae, e protease tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

[00183] As sequências de poliadenilação utilizáveis para células hospedeiras de levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.

[00184] A sequência de controle também pode ser uma região de codificação de peptídeo de sinal codificando um peptídeo de sinal ligado ao N-término de uma variante e dirige a variante na via secretória da célula. A extremidade 5’ da sequência de codificação do polinucleotídeo pode conter inerentemente uma região de codificação de peptídeo de sinal naturalmente ligada em quadro de leitura de tradução com o segmento da região de codificação codificando a variante Alternativamente, a extremidade 5’ da sequência de codificação pode conter uma região de codificação de peptídeo de sinal que é estranha para a sequência de codificação. A região de codificação do peptídeo de sinal estranho pode ser requerida onde a sequência de codificação não contém naturalmente uma região de codificação de peptídeo de sinal. Alternativamente, a região de codificação do peptídeo de sinal estranho pode simplesmente substituir a região de codificação do peptídeo de sinal natural a fim de acentuar a secreção da variante. No entanto, qualquer região de codificação do peptídeo de sinal que dirige uma variante expressada na via secretória de uma célula hospedeira pode ser usada.

[00185] As sequências de codificação de peptídeo de sinal eficazes para as células hospedeiras bacterianas são as sequências de codificação de peptídeo de sinal obtidas a partir dos genes para amilase maltogênica de Bacillus NCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamase de Bacillus licheniformis, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, proteases neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM), e Bacillus subtilis prsA. Outros peptídeos de sinal são descritos por Simonen e Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

[00186] As sequências de codificação de peptídeo de sinal eficazes para células hospedeiras fúngicas filamentosas são as sequências de codificação de peptídeo de sinal obtidas a partir dos genes para amilase neutra de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae, celulase de Humicola insolens, endoglucanase V de Humicola insolens, lipase de Humicola lanuginosa, e proteinase aspártica de Rhizomucor miehei.

[00187] Os peptídeos de sinal utilizáveis para células hospedeiras de levedura são obtidos a partir dos genes para alfa-fator de Saccharomyces cerevisiae e invertase de Saccharomyces cerevisiae. Outras sequências de codificação de peptídeo de sinal utilizáveis são descritas por Romanos et al., 1992, supra.

[00188] A sequência de controle também pode ser uma região de codificação de propeptídeo codificando um propeptídeo posicionado no N-término de uma variante. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma proenzima ou propolipeptídeo (um zimogene em alguns casos). Um propolipeptídeo é geralmente inativo e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo por clivagem catalítica ou autocatalítica do propeptídeo a partir do propolipeptídeo. A região de codificação do propeptídeo pode ser obtida a partir dos genes para protease alcalina de Bacillus subtilis (aprE), protease neutra de Bacillus subtilis (nprT), laccase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, e alfa-fator de Saccharomyces cerevisiae.

[00189] Onde ambas as regiões de peptídeo de sinal e propeptídeo estão presentes no N-término de uma variante, a região de propeptídeo está posicionada próxima do N-término de uma variante e a região do peptídeo de sinal está posicionada próxima do N-término da região do propeptídeo.

[00190] Também pode ser desejável adicionar sequências regulatórias que permitem a regulação da expressão de uma variante relativa ao crescimento da célula hospedeira. Exemplos de sistemas regulatórios são os que causam a expressão do gene a ser ligado ou desligado em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulatório. Os sistemas regulatórios em sistemas procarióticos incluem os sistemas de operador lac, tac, e trp. Em levedura, o sistema ADH2 ou o sistema GAL1 podem ser usados. Em fungos filamentosos, o promotor glucoamilase de Aspergillus niger, promotor TAKA alfa-amilase de Aspergillus oryzae, e promotor glucoamilase de Aspergillus oryzae podem ser usados. Outros exemplos de sequências regulatórias são os que permitem a amplificação do gene. Em sistemas eucarióticos, estas sequências regulatórias incluem o gene di-hidrofolato redutase que é amplificado na presença de metotrexato, e os genes de metalotioneína que são amplificados com metais pesados. Nestes casos, o polinucleotídeo codificando a variante deve ser operavelmente ligado com a sequência regulatória.

Vetores de Expressão

[00191] A presente invenção também se refere a vetores de expressão recombinantes compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção, um promotor, e sinais de parada transcripcional e de tradução. Os vários nucleotídeos e sequências de controle podem ser unidos juntos para formar um vetor de expressão recombinante que pode incluir um ou mais (vários) sítios de restrição convenientes para permitir a inserção ou a substituição do polinucleotídeo codificando uma variante em tais sítios. Alternativamente, o polinucleotídeo pode ser expressado por inserção do polinucleotídeo ou um construto de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo em um vetor apropriado para expressão. Ao criar o vetor de expressão, a sequência de codificação está localizada no vetor de modo que a sequência de codificação é operavelmente ligada com as sequências apropriadas de controle para expressão.

[00192] O vetor de expressão recombinant pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que pode ser convenientemente submetido a procedimentos de DNA recombinante e pode ocasionar a expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor irá tipicamente depende da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira em que o vetor deve ser introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo circular linear ou fechado.

[00193] O vetor pode ser um vetor de replicação autônomo, isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo, ou cromossomo artificial. O vetor pode conter qualquer meio para assegurar a autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, é integrado no genoma e replicado junto com o(s) cromossomo(s) em que ele foi integrado. Além disso, um vetor único ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que juntos contém o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transposon, pode ser usado.

[00194] O vetor preferivelmente contém um ou mais (vários) marcadores selecionáveis que permitem a fácil seleção de células transformadas, transfectadas, transduzidas, ou similares. Um marcador selecionável é um gene cujo produto proporcionar a resistência biocida ou viral, resistência a metias pesadas, prototrofia para auxótrofos e similares.

[00195] Exemplos de marcadores selecionáveis bacterianos são genes dal de Bacillus licheniformis ou Bacillus subtilis, ou marcadores que conferem resistência a antibióticos como resistência a ampicilina, cloranfenicol, canamicina, ou tetraciclina. Os marcadores apropriadas para células hospedeiras de levedura são ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, e URA3. Os marcadores selecionáveis para uso nas células hospedeiras fúngicas filamentosas incluem, mas não são limitados a, amdS (acetamidase), argB (ornitina carbamoiltransferase), bar (fosfinotricina acetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato redutase), pyrG (orotidina-5’-fosfato decarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase), e trpC (antranilato sintase), assim como equivalentes dos mesmos. São preferidos para uso em uma célula de Aspergillus os genes amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e o gene bar de Streptomyces hygroscopicus.

[00196] O vetor preferivelmente contém elemento(s) que permite(m) a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do na célula independente do genoma.

[00197] Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode se basear na sequência do polinucleotídeo codificando a variante ou qualquer outro elemento do vetor para integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor pode conter sequências de nucleotídeo adicionais para dirigira a integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em um local(ais) preciso(s) no(s) cromossomo(s). Para aumentar a possibilidade de integração em um local preciso, os elementos integracionais deveriam contar um número suficiente de ácidos nucleicos, como 100 a 10.000 pares de base, 400 a 10.000 pares de base, e/ou 800 a 10.000 pares de base, que tem um alto grau de identidade para a sequência alvo correspondente para acentuar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos integracionais podem ser qualquer sequência que é homóloga com a sequência alvo no genoma da célula hospedeira. Além disso, os elementos integracionais podem ser sequências de nucleotídeo não codificando ou codificando. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.

[00198] Para replicação autônoma, o vetor pode ainda compreender uma origem de replicação permitindo ao vetor replicar de modo autônomo na célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquer replicador de plasmídeo mediando a replicação autônoma que funciona em uma célula. O termo “origem de replicação” ou “replicado de plasmídeo” significa uma sequência de nucleotídeo que permite a um plasmídeo ou vetor replicar in vivo.

[00199] Exemplos de origens de replicação bacterianas são as origens de replicação de plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177, e pACYC184 permitindo a replicação em E. coli, e pUB110, pE194, pTA1060, e pAMB1 permitindo a replicação em Bacillus.

[00200] Exemplos de origens de replicação para uso em uma célula hospedeira de levedura são a origem de replicação de 2 micron, ARS1, ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3, e a combinação de ARS4 e CEN6.

[00201] Exemplos de origens de replicação utilizáveis em uma célula de fungo filamentoso são AMA1 e ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acid Res.15: 9163-9175; WO 00/24883). Isolamento do gene AMA1 e construção de plasmídeos ou vetores compreendendo o gene pode ser obtido de acordo com métodos descritos em WO 00/24883.

[00202] Mais do que uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção pode ser inserida na célula hospedeira para aumentar a produção de uma variante. Um aumento no número de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido por integração de pelo menos uma cópia adicional de uma sequência no genoma da célula hospedeira ou incluindo um marcador selecionável de um gene amplificável com o polinucleotídeo onde as células contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável, e assim cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas por cultivo das células na presença do agente selecionável apropriado.

[00203] Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos para os versados na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra) de modo a obter as variantes substancialmente puras.

Células hospedeiras

[00204] A presente invenção também se refere a células hospedeiras recombinantes compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção operavelmente ligada a uma ou mais (várias) sequências de controle que dirigem a produção de uma variante da presente invenção. Um construto ou vetor compreendendo um polinucleotídeo é introduzido em uma célula hospedeira de modo que o construto ou vetor é mantido como um integrante cromossômico ou como autorreplicando o vetor extracromossômico, como descrito acima. O termo "célula hospedeira" engloba qualquer progênie de uma célula parental que não é idêntica a uma célula parental devido às mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira irá, em uma grande extensão, depender do gene codificando a variante e sua fonte.

[00205] A célula hospedeira pode ser qualquer célula utilizável na produção recombinante de uma variante, por exemplo, um procarióte ou um eucarióte.

[00206] A célula hospedeira procariótica pode ser qualquer bactéria gram-positiva ou gram-negativa. As bactérias Gram-positivas incluem, mas não são limitadas a, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, e Streptomyces. A bactérias Gram-negativas incluem, mas não são limitadas a, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, e Ureaplasma.

[00207] A célula hospedeira bacteriana pode ser qualquer célula de Bacillus cell, incluindo, mas não limitada a, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, e Bacillus thuringiensis.

[00208] A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula de Streptococcus, incluindo, mas não limitada a, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, e Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

[00209] A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula de Streptomyces, incluindo, mas não limitada a, células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, e Streptomyces lividans.

[00210] A introdução de DNA em uma célula de Bacillus pode, por exemplo, ser efetuada por transformação do cloroplasto (ver, por exemplo, Chang e Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), usando células competentes (ver, por exemplo, Young e Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), por eletroporação (ver, por exemplo, Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), ou por conjugação (ver, por exemplo, Koehler e Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). A introdução de DNA em célula de E. coli pode, por exemplo, ser efetuada por transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) ou eletroporação (ver, por exemplo, Dower et al., 1988, Nucleic Acid Res. 16: 6127-6145). A introdução de DNA em uma célula de Streptomyces pode, por exemplo, ser efetuada por transformação de protoplasto e eletroporação (ver, por exemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), por conjugação (ver, por exemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 35833585), ou por transdução (ver, por exemplo, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294). A introdução de DNA em uma célula de Pseudomonas pode, por exemplo, ser efetuada por eletroporação (ver, por exemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) ou por conjugação (ver, por exemplo, Pinedo e Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). A introdução de DNA em uma célula de Streptococcus pode, por exemplo, ser efetuada por competência natural (ver, por exemplo, Perry e Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), por transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Catt e Jollick, 1991, Microbios 68: 1892070, por eletroporação (ver, por exemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) ou por conjugação (ver, por exemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). No entanto, qualquer método conhecido na técnica para introduzir DNA em uma célula hospedeira pode ser usado.

[00211] A célula hospedeira também pode ser um eucarióte, como uma célula de mamífero, inseto, planta ou fungo.

[00212] A célula hospedeira pode ser uma célula de fungo. “Fungos” como usados aqui incluem os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, e Zygomycota assim como Oomycota e todos os fungos mitospóricos (como definido por Hawksworth et al., In, Ainsworth e Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8a. ed, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK).

[00213] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula de levedura. “Levedura” como usado aqui inclui a levedura ascosporogenosa (Endomycetales), levedura basidiosporogenosa, e levedura pertencendo a Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Porque a classificação de levedura pode mudar no future, para os fins desta invenção, a levedura deve ser definida como descrito em Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., e Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).

[00214] A célula hospedeira de levedura pode ser uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia como a célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, ou Yarrowia lipolytica.

[00215] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula fúngica filamentosa. Os “fungos filamentosos” incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (como definido por Hawksworth et al., 1995, supra). Os fungos filamentosos são geralmente caracterizados por uma parede miceliana composta de quitina, celulose, glucano, quitosano, mannano, e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo é por alongamento das hifas e catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Em contraste, o crescimento vegetativo por leveduras como Saccharomyces cerevisiae é por formação de brotos a partir de um talo unicelular e o catabolismo de carbono pode ser fermentativo.

[00216] As células hospedeiras fúngicas filamentosas podem ser uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, ou Trichoderma.

[00217] Por exemplo, as células hospedeiras fúngicas filamentosas podem ser uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.

[00218] As células fúngicas podem ser transformadas por um processo envolvendo a formação de protoplastos, a transformação dos protoplastos, e regeneração da parede celular em um modo conhecido per se. Os procedimentos apropriados para a transformação de células hospedeiras de Aspergillus e Trichoderma são descritos em EP 238023 e Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474. Os métodos apropriados para transformar as espécies de Fusarium são descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, e WO 96/00787. A levedura pode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, In Abelson, J.N. e Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920.

Métodos de produção

[00219] A presente invenção também se refere a métodos de produzir uma variante, compreendendo: (a) cultivar uma célula hospedeira da presente invenção sob condições apropriadas para a expressão da variante; e (b) recuperar a variante.

[00220] As células hospedeiras são cultivadas em um meio nutriente apropriado para a produção de uma variante usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultivo em frasco agitado, ou fermentação em pequena ou larga escala (incluindo fermentações contínua, descontínua, descontínua alimentada ou em estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industrial realizados em um meio apropriado e sob condições permitindo que o polipeptídeo seja expressado e/ou isolado. O cultivo ocorre em um meio nutriente apropriado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Os meios apropriados são disponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com as composições publicadas (por exemplo, nos catálogos do American Type Culture Collection). Se uma variante for secretada no meio nutriente, uma variante pode ser recuperada diretamente do meio. Se uma variante não for secretada, ela pode ser recuperada dos lisados celulares.

[00221] A variante pode ser detectada usando métodos conhecidos na técnica que são específicos para as variantes. Estes métodos de detecção podem incluir o uso de anticorpos específicos, formação de um produto de enzima, ou desaparecimento de um substrato de enzima. Por exemplo, um teste de enzima pode ser usado para determinar a atividade da variante.

[00222] A variante pode ser recuperada por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a variante pode ser recuperada do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas não limitada a, coleta, centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação, ou precipitação.

[00223] A variante pode ser purificada por vários procedimentos conhecidos na técnica incluindo, mas não limitados a, cromatografia (por exemplo, troca iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocalização e exclusão por tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focalização isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação de sulfato de amônio), SDS-PAGE, ou extração (ver, por exemplo, Protein Purification, J.-C. Janson e Lars Ryden, editores, VCH Publishers, New York, 1989) para obter variantes substancialmente puras.

[00224] Em um aspecto alternativo, a variante não é recuperada, mas ao contrário uma célula hospedeira da presente invenção expressando uma variante é usada como uma fonte da variante.

Composições

[00225] A presente invenção também se refere a composições compreendendo uma variante da presente invenção. Preferivelmente, as composições são enriquecidas em tal variante. O termo "enriquecido" significa que a atividade de alfa-amilase da composição foi aumentada, por exemplo, com um fator de enriquecimento de 1.1.

[00226] A composição pode compreender uma variante como o componente enzimático principal, por exemplo, uma composição monocomponente. Alternativamente, a composição pode compreender atividades enzimáticas múltiplas, como uma aminopeptidase, amilase, carbohidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, deoxiribonuclease, esterase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, glucoamilase, alfa-glucosidase, beta-glucosidase, haloperoxidase, invertase, laccase, lipase, mannosidase, oxidase, enzima pectinolítica, peptidoglutaminase, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase, ou xilanase. Em uma forma de realização particular a composição compreende uma variante de amilase de acordo com a invenção e uma ou mais enzimas selecionadas dentre o grupo consistindo de uma protease, uma glucoamilase.

[00227] A(s) enzima(s) adicional(ais) pode(m) ser produzida(s), por exemplo, por um microorganismo pertencendo ao gênero Aspergillus, por exemplo, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, ou Aspergillus oryzae; Fusarium, por exemplo, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium arcochroum, Fusarium sulphureum, Fusarium toruloseum, Fusarium trichothecioides, ou Fusarium venenatum; Humicola, por exemplo, Humicola insolens ou Humicola lanuginosa; ou Trichoderma, por exemplo, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.

[00228] As composições podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de uma composição líquida ou seca. Por exemplo, a composição pode estar na forma de um granulado ou a microgranulado. A variante pode ser estabilizada de acordo com métodos conhecidos na técnica.

Plantas

[00229] A presente invenção também se refere a plantas, por exemplo, uma planta transgênica, parte de planta, ou célula de planta, compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção de modo a expressar e produzir uma variante em quantidades recuperáveis. A variante pode ser recuperada a partir da planta ou parte de planta. Alternativamente, a planta ou parte de planta contendo uma variante pode ser usada como tal para melhorar a qualidade de um alimento ou ração, por exemplo, melhorando o valor nutricional, palatabilidade, e propriedades reológicas, ou para destruir um fator antinutritivo.

[00230] A planta transgênica pode ser dicotiledônea (dicot) ou monocotiledônea (monocot). Exemplos de plantas monocotiledôneas são gramíneas, como grama do prado (grama azul, Poa), grama de forragem como Festuca, Lolium, grama temperada, como Agrostis, e cereais, por exemplo, trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, sorgo e maize (milho).

[00231] Exemplos de plantas dicotiledônea são tabaco, legumes, como tremoços, batata, beterraba de açúcar, ervilha, feijão e soja, e plantas crucíferas (família Brassicaceae), como couve-flor, semente de colza e o organismo de modelo intimamente aparentado Arabidopsis thaliana.

[00232] Exemplos de partes de plantas são tronco, calo, folhas, raiz, frutas, sementes e tubérculos, assim como os tecidos individuais, compreendendo estas partes, por exemplo, epiderme, mesófilo, parênquima, tecidos vasculares, meristemas. Os compartimentos de células de planta específicos são cloroplastos, apoplastos, mitocôndria, vacúolos, peroxissomas, e citoplasma são também considerados como sendo uma parte da planta. Além disso, qualquer célula de planta, qualquer que seja a origem do tecido, é considerada como sendo uma parte da planta. Do mesmo modo, partes de plantas de tecidos e células específicos isoladas para facilitar a utilização da invenção são também considerados como partes de plantas, por exemplo, embriões, endospermas, aleurona e capas de sementes.

[00233] Também está incluída dentro do escopo da presente invenção a progênie de tais plantas, partes de plantas, e células de plantas.

[00234] A planta transgênica ou célula de planta expressando uma variante pode ser construída de acordo com métodos conhecido na técnica. Em resumo, a planta ou célula de planta é construída incorporando ou mais (vários) construtos de expressão codificando uma variante no genoma hospedeiro da planta ou genoma do cloroplasto e propagando a planta ou célula de planta resultante modificada em uma planta transgênica ou célula de planta.

[00235] O construto de expressão é convenientemente uma construção de ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo codificando uma variante operavelmente ligada com sequências regulatórias apropriadas requeridas para expressão do polinucleotídeo na planta ou parte de planta de escolha. Além disso, o construto de expressão pode compreender um marcador selecionável utilizável para identificar as células de plantas em que o construto de expressão foi integrado e sequências de DNA necessárias para a introdução do construto na planta em questão (a última incluir o método de introdução do DNA a ser usado).

[00236] A escolha de sequências regulatórias, como sequências de promotor e terminador e opcionalmente sequências de sinal ou trânsito, é determinada, por exemplo, com base em quando, onde e como uma variante é desejada a ser expressada. Por exemplo, expressão do gene codificando uma variante pode ser constitutiva ou indutível, ou pode ser específica do desenvolvimento, estágio ou tecido e o produto de gene pode ser alvo-marcado para um tecido específico ou parte de planta como sementes ou folhas. As sequências regulatórias são, por exemplo, descritas por Tague et al., 1988, Plant Physiol. 86: 506.

[00237] Para a expressão constitutiva, o 35S-CaMV, a ubiquitina de maize 1, e o promotor de actina 1 de arroz podem ser usados (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294; Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Os promotores específicos de órgãos podem ser, por exemplo, um promotor de tecidos de imersão de armazenamento como sementes, tubérculos de batata, e frutas (Edwards e Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), ou de tecidos de imersão metabólica como os meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863878), um promotor específico de semente como promotor glutelina, prolamina, globulina, ou albumina de arroz (Wu et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 885-889), um promotor Vicia faba de legumina B4 e o gene de proteína de semente desconhecido de Vicia faba (Conrad et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 708-711), um promotor de uma proteína de corpo de óleo de semente (Chen et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 935-941), promotor napA da proteína de armazenamento de Brassica napus, ou qualquer outro promotor específico de semente conhecido na técnica, por exemplo, como descrito em WO 91/14772. Além disso, o promotor pode ser um promotor específico de folha como o promotor rbcs de arroz ou tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiol. 102: 991-1000), o promotor do gene metiltransferase de adenina de vírus de cólera (Mitra e Higgins, 1994, Plant Mol. Biol. 26: 8593), o promotor do gene aldP de arroz (Kagaya et al., 1995, Mol. Gen. Genet. 248: 668-674), ou um promotor indutível por ferida como o promotor pin2 de batata (Xu et al., 1993, Plant Mol. Biol. 22: 573-588). Do mesmo modo, o promotor pode ser indutível por tratamentos abióticos como temperatura, seca, ou alterações na salinidade ou induzido por substâncias exogenamente aplicadas que ativam o promotor, por exemplo, etanol, estrogênio, hormônios de plantas como etileno, ácido abscísico e ácido gibberélico, e metais pesados.

[00238] Um elemento melhorador do promotor também pode ser usado para alcançar uma maior expressão de uma variante na planta. Por exemplo, o elemento melhorador do promotor pode ser um intron que é colocado entre o promotor e o polinucleotídeo codificando uma variante. Por exemplo, Xu et al., 1993, supra, descrevem o uso do primeiro íntron do gene de actina 1 de arroz para melhorar a expressão.

[00239] O marcador selecionável do gene e quaisquer outras partes do construto de expressão pode ser escolhido a partir dos conhecidos na técnica.

[00240] O construto de ácido nucleico é incorporado no genoma da planta de acordo com técnicas convencionais conhecidas na técnica, incluindo transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por vírus, microinjeção, bombardeio de partículas, transformação biolística e eletroporação (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).

[00241] Atualmente, transferência de genes mediada por Agrobacterium tumefaciens é o método de escolha para gerar dicotiledôneas transgênicas (para uma revisão, ver Hooykas e Schilperoort, 1992, Plant Mol. Biol. 19: 15-38) e também pode ser usado para transformar monocotiledôneas, apesar de outros métodos de transformação serem usados com frequência para estas plantas. Atualmente, o método de escolha para gerar monocotiledôneas transgênicas é o bombardeio de partículas (partículas microscópicas de ouro ou tungstênio revestidas com DNA transformante) de calos embriônicos ou embriões em desenvolvimento (Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Um método alternativo para a transformação de monocotiledôneas é baseado em transformação de protoplastos como descrito por Omirulleh et al., 1993, Plant Mol. Biol. 21: 415-428. Os métodos de transformação adicionais para uso de acordo com a presente descrição incluem os descritos em patentes US Nos. 6.395.966 e 7.151.204 (ambas sendo aqui incorporadas por referência em sua totalidade).

[00242] Seguindo a transformação, os transformantes tendo incorporado o construto de expressão são selecionados e regenerados em plantas completas de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Uma vez que o procedimento de transformação é projetado para a eliminação seletiva dos genes de seleção seja durante a regeneração ou nas gerações seguintes usando, por exemplo, co-transformação com dois construtos separados de T-DNA excisão sítio-específica do gene de seleção por uma recombinase específica.

[00243] Além de dirigir a transformação para um genótipo de planta particular com um construto preparado de acordo com a presente invenção, plantas transgênicas podem ser feitas por cruzamento de uma planta tendo o construto para uma segunda planta faltando o construto. Por exemplo, um construto codificando uma variante pode ser introduzido em uma variedade de planta particular por cruzamento, sem a necessidade para cada vez diretamente transformar uma planta da dada variedade. Assim, a presente invenção engloba não somente uma planta diretamente regenerada a partir de células que foram transformadas de acordo com a presente invenção, mas também a progênie de tais plantas. Como usado aqui, a progênie pode fazer referência à descendência de qualquer geração de uma planta parental preparada de acordo com a presente invenção. Esta progênie pode incluir um construto de DNA preparado de acordo com a presente invenção, ou uma porção de um construto de DNA preparado de acordo com a presente invenção. Os resultados do cruzamento da introdução de um transgene em uma linhagem de planta por polinização cruzada de uma linha de partida com uma linhagem de planta do doador. Os exemplos não limitativos de tais etapas são ainda articulados na in patente US No. 7.151.204.

[00244] Plantas podem ser geradas a partir de um processo de conversão retrocruzado. Por exemplo, as plantas incluem as plantas referidas como o genótipo convertido retrocruzado, linhagem, congênito, ou híbrido.

[00245] Os marcadores genéticos podem ser usados para auxiliar na introgressão de um ou mais transgenes da invenção a partir de um fundo genético no outro. A seleção auxiliada por marcador oferece vantagens com relação ao cruzamento convencional em que pode ser usado para evitar erros causados por variações fenotípicas. Além disso, os marcadores genéticos podem fornecer dados com relação ao grau relativo do germplasma de elite na progênie individual de um cruzamento particular. Por exemplo, quando uma planta com um traço desejado que de outra forma tenha um fundo genético não agronomicamente desejável é cruzada com um parental de elite, os marcadores genéticos podem ser usados para selecionar a progênie que não somente possui o traço de interesse, mas também tem uma proporção relativamente grande do germplasma desejado. Deste modo, o número de gerações requerido para introgredir um ou mais traços em um fundo genético particular é minimizado.

[00246] A presente invenção também se refere a métodos de produzir uma variante da presente invenção compreendendo: (a) cultivar uma planta transgênica ou a célula de planta compreendendo um polinucleotídeo codificando a variante sob condições conduzindo à produção da variante; e (b) recuperar a variante.

Usos

[00247] A presente invenção é também dirigida a processos/métodos usando os polipeptídeos tendo atividade de alfa-amilase da invenção.

[00248] Usos de acordo com a invenção incluem conversão de amido em, por exemplo, xarope e produtos de fermentações, incluindo etanol e bebidas. Exemplos de processos em que uma alfa-amilase da invenção pode ser usada incluem os descritos abaixo e outros processos para a produção do etanol conhecidos na técnica que requerem a hidrólise do material contendo amido.

Produção de produtos de fermentação Processo para produzir produtos de fermentação a partir de material contendo amido gelatinizado

[00249] Neste aspecto a presente invenção refere-se a um processo para produzir um produto de fermentação, especialmente etanol, a partir de material contendo amido, cujo processo inclui uma etapa de liquefação e sacarificação realizados sequencialmente ou simultaneamente e as etapas de fermentação.

[00250] A invenção refere-se a um método para produzir um produto de fermentação a partir de material contendo amido compreendendo as etapas de:

[00251] (a) liquefazer material contendo amido usando uma alfa-amilase da invenção;

[00252] (b) sacarificar o material liquefeito obtido na etapa (a) usando uma glucoamilase; e

[00253] (c) fermentar o material sacarificado usando um organismo de fermentação.

[00254] O produto de fermentação, como especialmente etanol, pode ser opcionalmente recuperado após fermentação, por exemplo, por destilação. Os materiais de partida contendo amido apropriados são listados na seção “materiais contendo amido” seção abaixo. As enzimas contempladas são listadas nas “enzimas” seção abaixo. A liquefação é preferivelmente realizada na presença de uma alfa-amilase. A fermentação é preferivelmente realizada na presença de levedura, preferivelmente uma cepa de Saccharomyces. Os organismos de fermentação apropriados são listados nos “organismos de fermentação” seção abaixo. Nas formas de realização preferidas a etapa (b) e (c) são realizadas sequencialmente ou simultaneamente (isto é, como processo SSF).

[00255] Em uma forma de realização particular, o processo da invenção ainda compreende, antes da etapa (a), as etapas de:

[00256] x) reduzir o tamanho de partícula do material contendo amido, preferivelmente por moagem; e

[00257] y) formar uma suspensão compreendendo o material contendo amido e água.

[00258] A suspensão aquosa pode conter de 10-40 % em peso, preferivelmente de 25-35 % em peso de material contendo amido. A suspensão é aquecida acima sua temperatura de gelatinização e alfa-amilase, preferivelmente alfa-amilase bacteriana e/ou fúngica ácida, pode ser adicionada para iniciar a liquefação (diluição). A pasta fluida pode em uma forma de realização ser cozida para ainda gelatinizar a pasta fluida antes de ser submetida a uma alfa-amilase na etapa (a) da invenção.

[00259] Mais especificamente a liquefação pode ser realizada como um processo de colocação em suspensão quente em três etapas. A suspensão é aquecida entre 60-95°C, preferivelmente 80-85°C, e alfa-amilase é adicionado para iniciar a liquefação (diluição). Então a suspensão pode ser cozida de modo rápido em uma temperatura entre 95-140°C, preferivelmente 105-125°C, durante 1-15 minutos, preferivelmente durante 3-10 minutos, especialmente em torno de 5 minutos. A suspensão é resfriada a 60-95°C e mais alfa-amilase é adicionado para finalizar a hidrólise (liquefação secundária). O processo de liquefação é geralmente realizado a pH 4,5-6,5, em particular, a um pH entre 5 e 6. Os grãos completos moídos e liquefeitos são conhecidos como farelo ensopado tipo mash.

[00260] A sacarificação na etapa (b) pode ser realizada usando condições bem conhecidas na técnica. Por exemplo, um processo de sacarificação completo pode durar de cerca de 24 e a cerca de 72 horas, no entanto, é comum apenas para fazer uma pré-sacarificação de tipicamente 4090 minutos em uma temperatura entre 30-65°C, tipicamente cerca de 60°C, seguido por sacarificação completa durante fermentação em uma sacarificação simultânea e processo de fermentação (processo SSF). A sacarificação é tipicamente realizada em temperaturas de 30-65°C, tipicamente em torno de 60°C, e em um pH entre 4 e 5, normalmente a cerca de pH 4,5.

[00261] O processo o mais amplamente usado na produção do produto de fermentação, especialmente etanol, é o processo simultâneo de sacarificação e fermentação (SSF), em que não se tem um estágio de retenção para a sacarificação, significando que o organismo de fermentação, como levedura, e enzima(s) pode(m) ser adicionado(s) junto(s). SSF pode tipicamente ser realizado em uma temperatura entre 25°C e 40°C, como entre 29°C e 35°C, como entre 30°C e 34°C, como em torno de 32°C. De acordo com a invenção a temperatura pode ser ajustada para cima ou para baixo durante a fermentação.

[00262] De acordo com a presente invenção a etapa de fermentação (c) pode incluir, sem limitação, processos de fermentação usados para produzir alcoóis (por exemplo, etanol, metanol, butanol); ácidos orgânicos (por exemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido itacônico, ácido láctico, ácido glucônico); cetonas (por exemplo, acetona); aminoácidos (por exemplo, ácido glutâmico); gases (por exemplo, H2 e CO2); antibióticos (por exemplo, penicilina e tetraciclina); enzimas; vitaminas (por exemplo, riboflavina, B12, beta-caroteno); e hormônios. Os processos de fermentação preferidos incluem processos de fermentação do álcool, como são bem conhecidos na técnica. Os processos de fermentação preferidos são processos de fermentação anaeróbica, como são bem conhecidos na técnica.

Processos para produzir produtos de fermentação a partir de contendo amido não gelatinizado

[00263] Neste aspecto a invenção refere-se um processo para produzir um produto de fermentação a partir de material contendo amido sem gelatinização do material contendo amido (isto é, material contendo amido não cozido). De acordo com a invenção o produto de fermentação desejado, como etanol, pode ser produzido sem liquefazer a suspensão aquosa contendo o material contendo amido. Em uma forma de realização um processo da invenção inclui sacarificar (moído) material contendo amido, por exemplo, amido granular, abaixo sua temperatura de gelatinização na presença de uma alfa-amilase da invenção para produzir açúcares que podem ser fermentados no produto de fermentação desejado por um organismo de fermentação apropriado. Em outra forma de realização uma glucoamilase e uma alfa-amilase da invenção são usadas durante sacarificação e fermentação. Particularmente a glucoamilase é Trametes cingulata AMG e a alfa amilase é a amilase da invenção preferivelmente incluindo um ligador e um CBD. Em ainda outra forma de realização a protease, uma alfa-amilase e uma enzima de desramificação (por exemplo, uma pululanase ou uma glucoamilase) são usadas antes da sacarificação e da fermentação.

[00264] Consequentemente, em um aspecto a invenção refere-se a um método para produzir um produto de fermentação a partir de material contendo amido compreendendo:

[00265] (a) sacarificar material contendo amido com uma glucoamilase e uma alfa-amilase de acordo com a invenção, em uma temperatura abaixo da temperatura inicial de gelatinização do referido material contendo amido,

[00266] (b) fermentar usando um organismo de fermentação.

[00267] Etapas (a) e (b) do processo da invenção podem ser realizadas sequencialmente ou simultaneamente. Em uma forma de realização, uma suspensão compreendendo água e material contendo amido, é preparada antes da etapa (a).

[00268] O processo de fermentação pode ser realizado durante um período de 1 a 250 horas, preferivelmente de 25 a 190 horas, mais preferivelmente de 30 a 180 horas, mais preferivelmente de 40 a 170 horas, ainda mais preferivelmente de 50 a 160 horas, ainda mais preferivelmente de 60 a 150 horas, e mesmo mais preferivelmente de 70 a 140 horas, e o mais preferivelmente de 80 a 130 horas.

[00269] O termo “temperatura inicial de gelatinização” significa que a temperatura menor em que a gelatinização do amido começa. Amido aquecido em água começa a gelatinizar entre 50°C e 75°C; a temperatura exata de gelatinização depende do amido específico, e pode ser prontamente determinado pelo versado. Assim, a temperatura inicial de gelatinização pode variar de acordo com as espécies de plantas a partir das quais o material contendo amido é obtido, assim como, com as condições de crescimento. No contexto desta invenção a temperatura inicial de gelatinização de um dado material contendo amido é a temperatura em que a birrefringência é perdida em 5% dos grânulos de amido usando o método descrito por Gorinstein e Lii, 1992, Starch/Stãrke 44(12): 461-466.

[00270] Antes da etapa (a) uma suspensão de material contendo amido, como amido granular, tendo de 10-55 % em peso de sólidos secos, preferivelmente de 25-40 % em peso de sólidos secos, mais preferivelmente de 30-35 % em peso de sólidos secos de material contendo amido pode ser preparada. A suspensão pode incluir água e/ou águas de processo, como resíduos de grãos (restos), depurador de água, condensado do evaporador ou destilado, água da destilação de extrator lateral, ou outra água de processo da instalação de produto de fermentação. Porque o processo da invenção é realizado abaixo da temperatura de gelatinização e assim não ocorre um aumento significante de viscosidade, níveis elevados de resíduos de grãos podem ser usados se desejado. Em uma forma de realização a suspensão aquosa contém de cerca de 1 e a cerca de 70 vol. % de resíduos de grãos, preferivelmente de 15-60% vol. % de resíduos de grãos, especialmente de cerca de 30 a 50 vol. % de resíduos de grãos.

[00271] O material contendo amido pode ser preparado por reduzir o tamanho de partícula, preferivelmente por moagem a seco ou molhado, para 0,05 a 3,0 mm, preferivelmente 0,1-0,5 mm. Após ser submetido a um processo da invenção pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou preferivelmente pelo menos 99% dos sólidos secos do material contendo amido é convertido em um hidrolisado de amido solúvel.

[00272] O processo da invenção é conduzido em uma temperatura abaixo a temperatura inicial de gelatinização. Preferivelmente a temperatura em que a etapa (a) é realizada está entre 30-75°C, preferivelmente entre 45-60°C.

[00273] Em uma forma de realização preferida a etapa (a) e a etapa (b) são realizadas como uma sacarificação sequencial ou simultânea e processo de fermentação. Em tal forma de realização preferida o processo é tipicamente realizado em uma temperatura entre 25°C e 40°C, como entre 29°C e 35°C, como entre 30°C e 34°C, como em torno de 32°C. De acordo com a invenção a temperatura pode ser ajustada para cima ou para baixo durante fermentação.

[00274] Em uma forma de realização, a sacarificação e a fermentação simultâneas são realizadas de modo que o nível de açúcar, como o nível de glicose, é mantido a um nível baixo como abaixo de 6 % em peso, preferivelmente abaixo de cerca de 3 % em peso, preferivelmente abaixo de cerca de 2 % em peso, mais preferido abaixo de cerca de 1 % em peso, ainda mais preferido abaixo de cerca de 0,5 % em peso, ou ainda mais preferido 0,25 % em peso, como abaixo de cerca de 0,1 % em peso. Tais níveis baixos de açúcar podem ser obtidos simplesmente empregando quantidades ajustadas de enzima e organismo de fermentação. Um versado na técnica pode facilmente determinar quais as quantidades de enzima e organismo de fermentação para usar. As quantidades de enzima empregadas e organismo de fermentação também podem ser selecionadas para manter as concentrações baixas de maltose no caldo de fermentação. Por exemplo, o nível de maltose pode ser mantido abaixo de cerca de 0,5 % em peso ou abaixo de cerca de 0,2 % em peso.

[00275] O processo da invenção pode ser realizado a um pH na faixa entre 3 e 7, preferivelmente de pH 3,5 a 6, ou mais preferivelmente pH 4 a 5.

Materiais contendo amido

[00276] Qualquer material de partida contendo amido apropriado, incluindo amido granular, pode ser usado de acordo com a presente invenção. O material de partida é geralmente selecionado com base no produto de fermentação desejado. Exemplos de materiais de partida contendo amido, apropriado para uso em um processo da presente invenção, incluem tubérculos, raízes, hastes, grãos integrais, milhos, espigas, trigo, cevada, centeio, milo, sagu, mandioca, tapioca, sorgo, ervilhas, arroz, feijões, ou batata-doce, ou misturas dos mesmos, ou cereais, matérias primas contendo açúcar, como melaços, materiais de frutas, cana de açúcar ou beterraba de açúcar, batatas, e materiais contendo celulose, como madeira ou resíduos de plantas, ou misturas dos mesmos. Contemplados são tanto os tipos cerosos como tipos não cerosos de milho e cevada.

[00277] O termo “amido granular” significa amido cru não cozido, isto é, amido em sua forma natural encontrado em cereais, tubérculos ou grãos. Amido é formado dentro de células de plantas como grânulos finos insolúveis em água. Quando colocados em água fria, os grânulos de amido podem absorver uma quantidade pequena do líquido e intumescer. Em temperaturas de até 50°C a 75°C o intumescimento pode ser reversível. No entanto, com temperaturas maiores um intumescimento irreversível chamado “gelatinização” começa. Amido granular a ser processado pode ser uma qualidade de amido altamente refinado, preferivelmente pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99,5% puro ou pode ser um material mais bruto contendo amido compreendendo grão integral moído incluindo frações não amido como resíduos de germes e fibras. A matéria prima, como grão integral, é moído a fim de abrir a estrutura e permitindo para outro processamento. Dois processos de moagem são preferidos de acordo com a invenção: moagem úmida e seca. Na moagem a seco caroços inteiros são moídos e usados. Moagem úmida dá uma boa separação de germe e farinha (grânulos de amido e proteína) e é com frequência aplicado em locais onde o hidrolisado de amido é usado na produção de xaropes. Ambos as moagens a seco e a molhada são bem conhecidas na técnica de processamento de amido e é igualmente contemplado para o processo da invenção.

[00278] O material contendo amido é reduzido em tamanho de partícula, preferivelmente por moagem a seco ou molhado, a fim de expor mais área de superfície. Em uma forma de realização o tamanho de partícula está entre 0,05 a 3,0 mm, preferivelmente 0,1-0,5 mm, ou de modo que pelo menos 30%, preferivelmente pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 70%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90% do material contendo amido passam através de uma peneira com uma tela de 0,05 a 3,0 mm, preferivelmente uma tela de 0,1-0,5 mm.

Produtos de fermentação

[00279] O termo “produto de fermentação” significa um produto produzido por um processo incluindo uma etapa de fermentação usando um organismo de fermentação. Produtos de fermentação contemplados de acordo com a invenção incluem alcoóis (por exemplo, etanol, metanol, butanol); ácidos orgânicos (por exemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido itacônico, ácido láctico, ácido glucônico); cetonas (por exemplo, acetona); aminoácidos (por exemplo, ácido glutâmico); gases (por exemplo, H2 e CO2); antibióticos (por exemplo, penicilina e tetraciclina); enzimas; vitaminas (por exemplo, riboflavina, B12, beta-caroteno); e hormônios. Em uma forma de realização preferida o produto de fermentação é etanol, por exemplo, etanol combustível; etanol para bebidas, isto é, álcool neutro potável; ou etanol industrial ou produtos usados na indústria de álcool consumível (por exemplo, cerveja e vinho), indústria de laticínios (por exemplo, produtos de laticínios fermentados), indústria de couro e indústria de tabaco. Tipos de cerveja preferidos compreendem ales, stouts, porters, lagers, bitters, licores de malte, happoushu, cerveja com elevado teor de álcool, cerveja com baixo teor de álcool, cerveja de baixa caloria ou cerveja tipo light. Os processos de fermentação preferidos usados incluem processos de fermentação do álcool, como são bem conhecidos na técnica. Os processos de fermentação preferidos são processos de fermentação anaeróbicos, como são bem conhecidos na técnica.

Organismos de fermentação

[00280] “Organismo de fermentação” refere-se a qualquer organismo, incluindo organismos bacterianos e fúngicos, apropriado para uso em um processo de fermentação e capaz de produzir um produto de fermentação desejado. Especialmente os organismos de fermentação apropriados são capazes de fermentar, isto é, converter, açúcares, como glicose ou maltose, diretamente ou indiretamente no produto de fermentação desejado. Exemplos de organismos de fermentação incluem organismos fúngicos, como levedura. Levedura preferida inclui cepas de Saccharomyces spp., em particular, Saccharomyces cerevisiae. Levedura comercialmente disponível inclui, por exemplo, Red Star™/Lesaffre Etanol Red (disponível de Red Star/Lesaffre, USA) FALI (disponível de Fleischmann’s Yeast, uma divisão de Burns Philp Food Inc., USA), SUPERSTART (disponível de Alltech), GERT STRAND (disponível de Gert Strand AB, Suécia) e FERMIOL (disponível de DSM Specialties).

ENZIMAS Glucoamilases

[00281] O termo “glucoamilase” (1,4-alfa-D-glucano glucohidrolase, EC 3.2.1.3) é uma enzima, que catalisa a liberação de D-glucose a partir das extremidades não redutoras de amido ou moléculas de oligo- e polissacarídeos relacionadas.

[00282] A glucoamilase pode ser derivada de qualquer fonte apropriada, por exemplo, derivada de um microorganismo ou uma planta. As glucoamilases preferidas são as de origem fúngica ou bacteriana. Exemplos de glucoamilases apropriadas incluem Aspergillus glucoamilases, em particular Aspergillus niger G1 ou G2 glucoamilase (Boel et al., 1984, EMBO J. 3(5): 1097-1102), ou variante das mesmas, como as descritas em WO 92/00381, WO 00/04136 e WO 01/04273 (de Novozymes, Dinamarca); a glucoamilase de A. awamori descrita em WO 84/02921, glucoamilase de Aspergillus oryzae (Hata et al., 1991, Agric. Biol. Chem. 55(4): 941-949), ou variantes ou fragmentos das mesmas. Outras variantes de glucoamilase de Aspergillus incluem variantes com melhorada termoestabilidade: G137A e G139A (Chen et al., 1996, Prot. Eng. 9: 499-505); D257E e D293E/Q (Chen et al., 1995, Prot. Eng. 8: 575-582); N182 (Chen et al., 1994, Biochem. J. 301: 275-281); ligações dissulfeto, A246C (Fierobe et al., 1996, Biochemistry 35: 8698-8704; e introdução de pro resíduos em posições A435 e S436 (Li et al., 1997, Prot. Eng. 10: 1199-1204.

[00283] Outras glucoamilases incluem Athelia rolfsii (previamente denotada glucoamilase de Corticium rolfsii) (ver patente US No. 4.727.026 e Nagasaka et al., 1998, Appl. Microbiol. Biotechnol. 50: 323-330), glucoamilases de Talaromyces, em particular derivadas de Talaromyces duponti, Talaromyces emersonii (WO 99/28448), Talaromyces leycettanus (patente US No. Re. 32,153), e Talaromyces thermophilus (patente US No. 4,587,215), Trametes cingulata, Pachykytospora papyracea, e Leucopaxillus giganteus, todas descritas em WO 2006/069289; ou Peniophora rufomarginata descrita em PCT/US2007/066618; ou uma mistura das mesmas.

[00284] As composições de glucoamilase comercialmente disponíveis incluem AMG 200L; AMG 300L; SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L, SPIRIZYME™ PLUS, SPIRIZYME™ FUEL, SPIRIZYME™ B4U, SPIRIZYME ULTRA™, e AMG™ E (de Novozymes A/S, Dinamarca); OPTIDEX™ 300, GC480™ e GC147™ (de Genencor Int., USA); AMIGASE™ e AMIGASE™ PLUS (de DSM); G-ZYME™ G900, G-ZYME™ e G990 ZR (de Genencor Int.).

Alfa-Amilases

[00285] A variante alfa-amilase de acordo com a invenção foi descrita em detalhes acima. Outras alfa-amilases de origem fúngica ou bacteriana também pode ser relevantes em combinação com a alfa-amilase da invenção.

[00286] Em uma forma de realização preferida, uma alfa-amilase adicional é uma alfa-amilase de ácido, por exemplo, alfa-amilase acida fúngica ou alfa-amilase ácida bacteriana. O termo “alfa-amilase ácida” significa uma alfa-amilase (EC 3.2.1.1) que adicionada em uma quantidade efetiva tem um ótimo de atividade a pH na faixa de 3 a 7, preferivelmente de 3,5 a 6, ou mais preferivelmente de 4-5.

Alfa-Amilases Bacterianas

[00287] A alfa-amilase bacteriana pode ser preferivelmente derivada do gênero Bacillus.

[00288] Em uma forma de realização preferida a alfa-amilase de Bacillus é derivada de uma cepa de B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis ou B. stearothermophilus, mas também pode ser derivada de outras Bacillus sp. Os exemplos específicos de alfa-amilases contempladas incluem a alfa-amilase de Bacillus licheniformis (BLA) mostrada em SEQ ID NO: 4 em WO 99/19467, alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (BAN) mostrada em SEQ ID NO: 5 em WO 99/19467, e a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus (BSG) mostrada em SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467. Em uma forma de realização da invenção a alfa-amilase é uma enzima tendo um grau de identidade de pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 70%, mais preferido pelo menos 80%, ainda mais preferido pelo menos 90%, como pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de qualquer uma das sequências mostradas como SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, ou 5, respectivamente em WO 99/19467.

[00289] A alfa-amilase de Bacillus também pode ser uma variante e/ou híbrido, especialmente um descrito em qualquer um dentre WO 96/23873, WO 96/23874, WO 97/41213, WO 99/19467, WO 00/60059, e WO 02/10355 (todos os documentos incorporados aqui por referência). As variantes de alfa-amilase especificamente contempladas são descritas em patentes US Nos. 6.093.562, 6.187.576, e 6.297.038 (aqui incorporadas aqui por referência) e incluem variantes de alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus (BSG alfa-amilase) tendo uma deleção de um ou dois aminoácidos em posição 179 a 182, preferivelmente uma deleção dupla descrita em WO 96/23873 - ver, por exemplo, pag. 20, linhas 1-10 (aqui incorporado aqui por referência), preferivelmente correspondendo a delta(181-182) comparado com a sequência de aminoácidos de alfa-amilase de BSG de tipo selvagem especificada em SEQ ID NO: 3 descrita em WO 99/19467 ou deleção de aminoácidos 179 e 180 usando SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467 para numeração (cuja referência é aqui incorporada por referência). Ainda mais preferidas são alfa-amilases de Bacillus, especialmente alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, que tem uma dupla deleção correspondendo a delta(181-182) e ainda compreende uma substituição N193F (também denotada I181* + G182* + N193F) comparada com a sequência de aminoácidos de alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus de tipo selvagem especificada em SEQ ID NO: 3 descrita em WO 99/19467.

[00290] A alfa-amilase também pode ser uma alfa-amilase maltogênica. Uma “alfa-amilase maltogênica” (glucano 1,4-alfa-maltohidrolase, EC 3.2.1.133) é capaz de hidrolisar a amilose e amilopectina em maltose na alfa-configuração. Uma alfa-amilase maltogênica de Bacillus stearothermophilus cepa NCIB 11837 é comercialmente disponível de Novozymes A/S, Dinamarca. A alfa-amilase maltogênica é descrita na patente US Nos. 4.598.048, 4.604.355 e 6.162.628, que são aqui incorporados por referência.

Alfa-Amilases híbridas bacterianas

[00291] Uma alfa-amilase específica especificamente contemplada compreende 445 resíduos de aminoácidos C-terminais da alfa-amilase de Bacillus licheniformis (mostrada como SEQ ID NO: 3 in WO 99/19467) e os 37 resíduos de aminoácidos N-terminais da alfa-amilase derivada de Bacillus amyloliquefaciens (mostradas como SEQ ID NO: 5 em WO 99/19467), com uma ou mais, especialmente todas as seguintes substituições:

[00292] G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V +Q264S (usando a numeração de Bacillus licheniformis). Também preferidas são as variantes tendo uma ou mais das seguintes mutações (ou mutações correspondentes em outras estruturas dorsais de alfa-amilase de Bacillus): H154Y, A181T, N190F, A209V e Q264S e/ou deleção de dois resíduos entre posições 176 e 179, preferivelmente deleção de E178 e G179 (usando SEQ ID NO: 5 numeração de WO 99/19467).

[00293] A alfa-amilase bacteriana pode ser adicionada em quantidades que são bem conhecidas na técnica.

Alfa-Amilases fúngicas

[00294] As alfa-amilases ácidas fúngicas incluem as alfa-amilases ácidas derivadas de uma cepa do gênero Aspergillus, como alfa-amilases de Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, ou Aspergillus kawachii.

[00295] Uma alfa-amilase ácida fúngica preferida é a alfa-amilase de tipo Fungamyl que é preferivelmente derivada de uma cepa de Aspergillus oryzae. Na presente descrição, o termo ” alfa-amilase Fungamyl ” indica uma alfa-amilase que exibe uma elevada identidade, i.e., mais do que 70%, mais do que 75%, mais do que 80%, mais do que 85% mais do que 90%, mais do que 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98%, mais do que 99% ou mesmo 100% de identidade para a parte madura da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 10 em WO 96/23874.

[00296] Outra alfa-amilase ácida preferida é derivada de uma cepa de Aspergillus niger. Em uma preferida forma de realização a alfa-amilase fúngica ácida é uma de A. niger descrita como “AMYA_ASPNG” na base de dados Swiss-prot/TrEMBL sob o número de acesso primário P56271 e descrita em detalhes em WO 89/01969 (Exemplo 3). A alfa-amilase ácida de Aspergillus niger é também mostrada como SEQ ID NO: 1 em WO 2004/080923 (Novozymes) que é incorporada aqui por referência. Também variantes de referida amilase ácida fúngica tendo pelo menos 70% de identidade, como pelo menos 80% ou mesmo pelo menos 90% de identidade, como pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade para SEQ ID NO: 1 em WO 2004/080923 são contempladas.

[00297] Em uma forma de realização preferida a alfa-amilase é derivada de Aspergillus kawachii e descrita por Kaneko et al., 1996, J. Ferment. Bioeng. 81:292-298, Molecular-cloning and determination of the nucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stable alpha-amylase from Aspergillus kawachii” e ainda como EMBL:#AB008370.

[00298] A alfa-amilase ácida fúngica também pode ser uma enzima de tipo selvagem compreendendo um módulo de ligação a carboidrato (CBM) e um domínio de alfa-amilase catalítica (i.e., uma não híbrida ), ou uma variante da mesma. Em uma forma de realização a alfa-amilase ácida de tipo selvagem é derivada de uma cepa de Aspergillus kawachii.

Alfa-Amilases fúngicas híbridas

[00299] Em uma forma de realização preferida a alfa-amilase fúngica ácida é uma alfa-amilase híbrida. Os exemplos preferidos de alfa-amilases fúngicas híbridas incluem as descritas em WO 2005/003311 ou Publicação de pedido US 2005/0054071 (Novozymes) ou pedido de patente US 60/638,614 (Novozymes) que é incorporada aqui por referência. A alfa-amilase híbrida pode compreender um domínio de alfa-amilase catalítica (CD) e um domínio/ módulo de ligação de carboidrato - (CBM) e ligador opcional

[00300] Os exemplos específicos de alfa-amilases híbridas contempladas incluem as descritas em pedido U.S. 60/638,614 incluindo variante Fungamyl com domínio catalítico JA118 e Athelia rolfsii SBD (SEQ ID NO: 100 em pedido US no. 60/638.614), alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com Athelia rolfsii ligador AMG e SBD (SEQ ID NO: 101 em pedido US no. 60/638,614) e alfa-amilase de Meripilus giganteus com ligador glucoamilase Athelia rolfsii e SBD (SEQ ID NO: 102 em pedido U.S. no. 60/638,614).

[00301] Outros exemplos específicos de alfa-amilases híbridas contempladas incluem as descritas em publicação de pedido U.S. no. 2005/0054071, incluindo as descritas em Tabela 3 em página 15, como alfa-amilase de Aspergillus niger com ligador de Aspergillus kawachii e domínio de ligação de amido.

Produtos Alfa-Amilase comerciais

[00302] As composições comerciais preferidas compreendendo alfa-amilase incluem MYCOLASE from DSM (Gist Brocades), BAN™, TERMAMYL™ SC, FUNGAMYL™, LIQUOZYME™ X e SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L (Novozymes A/S) e CLARASE™ L-40,000, DEX-LO™, SPEZYME™ FRED, SPEZYME™ AA, SPEZYME™ Ethyl, GC358, GC980, SPEZYME™ RSL, e SPEZYME™ DELTA AA (Genencor Int.).

[00303] A invenção descrita e aqui reivindicada não deve ser limitada em escopo pelas formas de realização específicas aqui descritas, porque estas formas de realização são destinadas como ilustrações dos vários aspectos da invenção. Quaisquer formas de realização equivalentes são destinadas a estar dentro do escopo da invenção. De fato, várias modificações da invenção além das mostradas e descritas aqui serão evidentes para o versado na técnica a partir da descrição acima. Estas modificações também se destinam a estar dentro do escopo das reivindicações anexas. No caso de conflito, a presente descrição incluindo as definições servirá de controle.

Lista das formas de realização preferidas

[00304] 1. Variante de alfa-amilase, compreendendo uma substituição, em uma ou mais posições correspondendo a posições 128, 143, 141, 192, 20, 76, 123, 136, 142, 165, 219, 224, 265, 383, e 410 do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, em que a variante tem atividade de alfa-amilase.

[00305] 2. Variante de acordo com a reivindicação 1, selecionada dentre o grupo consistindo de:

[00306] a) um polipeptídeo tendo pelo menos 60% identidade de sequência para o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2;

[00307] b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de baixa severidade com (i) a sequência de codificação do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (ii) o filamento complementar de comprimento completo de (i);

[00308] c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 60% de identidade com a sequência de codificação do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1; ou

[00309] d) um fragmento do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, que tem atividade de alfa-amilase.

[00310] 3. A variante de forma de realização 2, em que a variante de alfa-amilase tem pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00311] 4. A variante de qualquer uma das formas de realização 2-3, em que a variante de alfa-amilase é codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de baixa severidade, condições de média severidade, condições de média-alta severidade, condições de alta severidade, ou condições de muito alta severidade com (i) a sequência de codificação do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou (ii) o filamento complementar de comprimento completo de (i).

[00312] 5. A variante de qualquer uma das formas de realização 2-4, em que a variante de alfa-amilase é codificada por um polinucleotídeo com pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% identidade de sequência com a sequência de codificação do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.

[00313] 6. A variante de qualquer uma das formas de realização 2-5, em que a variante de alfa-amilase consiste do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 tendo uma substituição, em uma ou mais posições correspondendo a posições 128, 143, 141, 192, 20, 76, 123, 136, 142, 165, 219, 224, 265, 383, e 410 do polipeptídeo maduro de SEQ id no: 2, e em que a variante tem atividade de alfa-amilase.

[00314] 7. A variante de qualquer uma das formas de realização 2-6, em que a variante de alfa-amilase é um fragmento do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, em que o fragmento tem atividade de alfa-amilase.

[00315] 8. A variante de qualquer uma das formas de realização 1-7, que é uma variante de uma alfa-amilase parental selecionada dentre o grupo consistindo de:

[00316] a) um polipeptídeo tendo pelo menos 60% identidade de sequência para o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2;

[00317] b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 60% de identidade com a sequência de codificação do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1; ou

[00318] c) um fragmento do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, que tem atividade de alfa-amilase.

[00319] 9. A variante de qualquer uma das formas de realização 2-8, em que a alfa-amilase parental tem pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100%, identidade de sequência para a sequência de codificação do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.

[00320] 10. A variante de qualquer uma das formas de realização 2-9, em que a parental tem pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, e/ou pelo menos 99%, mas menos do que 100% identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00321] 11. A variante de qualquer uma das formas de realização precedentes, em que o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 é o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[00322] 12. A variante de qualquer uma das formas de realização 1-11, em que o número de alterações é 1-20, por exemplo, 1-10 e/ou 1-5, como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 alterações.

[00323] 13. A variante de acordo com qualquer uma das formas de realização 1-12, em que a variante ainda compreende um ligador e um módulo de ligação de carboidrato.

[00324] 14. A variante de qualquer uma das formas de realização 1-13, que compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 20.

[00325] 15. A variante de forma de realização 14, em que a alteração é uma substituição com Ser.

[00326] 16. A variante de qualquer uma das formas de realização 1-15, que compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 76.

[00327] 17. A variante de forma de realização 16, em que a alteração é uma substituição com Gly.

[00328] 18. A variante de qualquer uma das formas de realização 1-17, que compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 123.

[00329] 19. A variante de forma de realização 18, em que a alteração é uma substituição com His.

[00330] 20. A variante de qualquer uma das formas de realização 1-19, que compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 128.

[00331] 21. A variante de forma de realização 20, em que a alteração é uma substituição com Asp.

[00332] 22. A variante de qualquer uma das formas de realização 1-21, que compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 136.

[00333] 23. A variante de forma de realização 22, em que a alteração é uma substituição com Phe.

[00334] 24. A variante de qualquer uma das formas de realização 1-23, que compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 141.

[00335] 25. A variante de forma de realização 24, em que a alteração é uma substituição com Trp ou Arg.

[00336] 26. A variante de qualquer uma das formas de realização 1-25, que compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 142.

[00337] 27. A variante de forma de realização 26, em que a alteração é uma substituição com Asp.

[00338] 28. A variante de qualquer uma das formas de realização 1-27, que compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 143.

[00339] 29. A variante de forma de realização 28, em que a alteração é uma substituição com Asn.

[00340] 30. A variante de qualquer uma das formas de realização 1-29, que compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 165.

[00341] 31. A variante de forma de realização 30, em que a alteração é uma substituição com Met.

[00342] 32. A variante de qualquer uma das formas de realização 1-31, que compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 192.

[00343] 33. A variante de forma de realização 32, em que a alteração é uma substituição com Arg.

[00344] 34. A variante de qualquer uma das formas de realização 1-33, que compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 219.

[00345] 35. A variante de forma de realização 34, em que a alteração é uma substituição com Cys.

[00346] 36. A variante de qualquer uma das formas de realização 1-35, que compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 224.

[00347] 37. A variante de forma de realização 36, em que a alteração é uma substituição com Ala ou Arg.

[00348] 38. A variante de qualquer uma das formas de realização 1-37, que compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 265.

[00349] 39. A variante de forma de realização 38, em que a alteração é uma substituição com Cys.

[00350] 40. A variante de qualquer uma das formas de realização 1-39, que compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 383.

[00351] 41. A variante de forma de realização 40, em que a alteração é uma substituição com Arg.

[00352] 42. A variante de qualquer uma das formas de realização 1-41, que compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 410.

[00353] 43. A variante de forma de realização 42, em que a alteração é uma substituição com Ala.

[00354] 44. A variante de qualquer uma das formas de realização 1-43, que compreende uma substituição em duas posições correspondendo a qualquer uma das posições 20, 76, 123, 128, 136, 141, 142, 143, 165, 192, 219, 224, 265, 383, e 410.

[00355] 45. A variante de qualquer uma das formas de realização 1-44, que compreende uma substituição em três posições correspondendo a qualquer uma das posições 20, 76, 123, 128, 136, 141, 142, 143, 165, 192, 219, 224, 265, 383, e 410.

[00356] 46. A variante de qualquer uma das formas de realização 1-45, que compreende uma substituição em quatro posições correspondendo a qualquer uma das posições 20, 76, 123, 128, 136, 141, 142, 143, 165, 192, 219, 224, 265, 383, e 410.

[00357] 47. A variante de qualquer uma das formas de realização 1-46, que compreende uma substituição em cinco posições correspondendo a qualquer uma das posições 20, 76, 123, 128, 136, 141, 142, 143, 165, 192, 219, 224, 265, 383, e 410.

[00358] 48. A variante de qualquer uma das formas de realização 1-47, que compreende uma substituição em seis posições correspondendo a qualquer uma das posições 20, 76, 123, 128, 136, 141, 142, 143, 165, 192, 219, 224, 265, 383, e 410.

[00359] 49. A variante de qualquer uma das formas de realização 1-48, que compreende uma substituição em cada posição correspondendo a posições 20, 76, 123, 128, 136, 141, 142, 143, 165, 192, 219, 224, 265, 383, e 410.

[00360] 50. A variante de qualquer uma das formas de realização 1-49, que compreende uma ou mais (várias) substituições selecionadas dentre o grupo consistindo de G20S, A76G, S123H, G128D, K136F, Y141W, Y141R, N142D, D143N, D165M, K192R, P219C, P224A, P224R, A265C, N383R, e V410A.

[00361] 51. A variante de forma de realização 50, em que a variante compreende pelo menos uma das seguintes substituições ou combinações de substituições:
D165M; ou
Y141W; ou
Y141R; ou
K136F; ou
K192R; ou
P224A; ou
P224R; ou
S123H + Y141W; ou
G20S + Y141W; ou
A76G + Y141W; ou
G128D + Y141W; ou
G128D + D143N; ou
141W + P219C; ou
N142D + D143N; ou
Y141W + K192R; ou
Y141W + D143N; ou
Y141W + N383R; ou
Y141W + P219C + A265C; ou
Y141W + N142D + D143N; ou
Y141W + K192R + V410A; ou
G128D + Y141W + D143N; ou
Y141W + D143N + P219C; ou
Y141W + D143N + K192R; ou
G128D + D143N+ K192R; ou
Y141W + D143N + K192R + P219C; ou
G128D + Y141W + D143N + K192R; ou
G128D + Y141W + D143N + K192R + P219C.

[00362] 52. A variante de acordo com qualquer uma das formas de realização 13-51, em que o módulo de ligação a carboidrato é um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 60% de identidade com uma sequência selecionada dentre o grupo consistindo de SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO: 44.

[00363] 53. A variante de acordo com a forma de realização 52, em que o ligador e CBM é de Athelia rolfsii por exemplo, SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 36 ou uma sequência tendo 60% identidade para a mesma.

[00364] 54. A variante de acordo com a forma de realização 52, em que o ligador e CBM é de Aspergillus niger por exemplo, SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 38 ou uma sequência tendo 60% identidade para a mesma.

[00365] 55. Um polinucleotídeo isolado codificando a variante de qualquer uma das formas de realização 1-54.

[00366] 56. Uma construção de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo de forma de realização 55.

[00367] 57. Um vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo de forma de realização 56.

[00368] 58. Uma célula hospedeira compreendendo o polinucleotídeo de forma de realização 57.

[00369] 59. Método de produzir uma variante de alfa-amilase, compreendendo:

[00370] a) cultivar a célula hospedeira de forma de realização 57 sob condições apropriadas para a expressão da variante; e

[00371 ] b) recuperar a variante.

[00372] 60. Uma planta transgênica, parte de planta ou célula de planta compreendendo o polinucleotídeo de forma de realização 55.

[00373] 61. Método de produzir uma variante de qualquer uma das formas de realização 1-54, compreendendo:

[00374] a) cultivar uma planta transgênica ou a célula de planta compreendendo um polinucleotídeo codificando a variante sob condições conduzindo à produção da variante; e

[00375] b) recuperar a variante.

[00376] 62. Um método para produzir um produto de fermentação a partir de um material contendo amido compreendendo as etapas de:

[00377] (a) liquefazer o material contendo amido usando uma variante de alfa-amilase de acordo com qualquer uma das formas de realização 1-54;

[00378] (b) sacarificar o material liquefeito obtido em etapa (a) usando uma glucoamilase; e

[00379] (c) fermentar o material sacarificado usando um organismo de fermentação.

[00380] 63. Um método para a produção de um produto de fermentação a partir de um material contendo amido compreendendo:

[00381] (a) sacarificar material contendo amido com uma variante de alfa-amilase de acordo com qualquer uma das formas de realização 1-54, e uma glicoamilase a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial de referido material contendo amido,

[00382] (b) fermentar usando um organismo de fermentação.

[00383] 64. O método de acordo com qualquer uma das formas de realização 62 e 63, em que o organismo de fermentação é um organismo de levedura, particularmente Saccharomyces spp, mais particularmente Saccharomyces cerevisiae.

[00384] 65. O método de acordo com qualquer uma das formas de realização 62-64, em que o produto de fermentação é um álcool, particularmente etanol.

[00385] 66. Um método para a produção de um derivado de amido enzimaticamente modificado, em que um polipeptídeo tendo atividade de alfa-amilase de acordo com qualquer uma das formas de realização 1-54 é usado para liquefazer e/ou sacarificar amido.

[00386] Várias referências são citadas aqui, cujas descrições são incorporados aqui por referência em suas totalidades. A presente invenção é ainda descrita pelos seguintes exemplos que não devem ser construídos como limitando o escopo da invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1: Preparação de variantes, e teste para termoestabilidade Cepas e plasmídeos

[00387] E. coli DH12S (disponível de Gibco BRL) foi usado para resgatar plasmídeo de levedura.

[00388] pLAV019 é um vetor shuttle de S. cerevisiae e E. coli sob o controle de promotor TPI, descrito em WO06069290, tendo a sequência de sinal de alfa-amilase ácida de Aspergillus niger, o gene de alfa-amilase de Rhizomucor pusilus e a sequência de gene glucoamilase parcial de Athelia rolfsii compreendendo apenas o ligador e o CBM. O vetor foi usado para construir bibliotecas de engenharia de proteínas e variantes sítio-dirigidas.

[00389] Saccharomyces cerevisiae YNG318: MATa Dpep4[cir+] ura3-52, leu2-D2, his 4-539 foi usado para expressão de variantes de alfa-amilase. É descrito em J. Biol. Chem. 272(15): 9720-9727 (1997).

Meios e substratos

[00390] Solução 10X Basal: aminoácidos w /o de base nitrogênio de levedura de (DIFCO) 66,8 g/l, sucinato 100 g/l, NaOH 60 g/l.

[00391] SC-glicose: 20% glicose (isto é, uma concentração final de 2% = 2 g/100 ml)) 100 ml/l, 5% de treonina 4 ml/l, 1% de triptofano 10 ml/l, 20% de casaminoácidos 25 ml/l, solução basal 10 X a 100 ml/l. A solução é esterilizada usando um filtro de um tamanho de poro de 0,20 micrômetro. Agar e H2O (aproximadamente 761 ml) são autoclavados juntos, e a solução de SC-glicose esterilizada separadamente adicionada à solução de agar.

[00392] placa SC-glicose+amido: 0,5-0,8% de amido de milho é adicionado ao meio de SC-glicose acima contendo 2% de agar.

[00393] YPD: Bacto peptona 20 g/l, extrato de levedura 10 g/l, 20% glicose 100 ml/l.
Solução PEG/LiAc: 40% PEG4000 50 ml, 5 M de acetato de lítio 1 ml

Manipulações de DNA

[00394] Salvo descrito em contrário, as manipulações de DNA e transformações foram realizadas usando métodos padrões de biologia molecular como descrito em Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab. Cold Spring Harbor, NY.

Transformação de levedura

[00395] A transformação de levedura foi realizada por método de acetato de lítio. Misturar 0,5 microL de vetor (digerido por endonucleases de restrição) e 1 microL de fragmentos de PCR. Descongelar células competentes YNG318 no gelo. Misturar 100 microL das células, a mistura de DNA e 10 microL de DNA carreador YEAST MAKER (Clontech) em 12 ml de tubos de polipropileno (Falcon 2059). Adicionar 0,6ml de solução PEG/LiAc e misturar suavemente. Incubar durante 30 min a 30°C, e 200 rpm. Incubar durante 30 min a 42°C (choque de calor). Transferir para um tubo de microcentrífuga e centrifugar durante 5 sec. Remover o sobrenadante e resolver em 3 ml de YPD. Incubar a suspensão de célula durante 45 min a 200 rpm a 30°C. Despejar a suspensão em placas de SC-glicose e incubar 30°C durante 3 dias para fazer colônias. DNA total levedura foi extraído por Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep Kit (ZYMO research).

Sequenciamento de DNA

[00396] Transformação por E. coli para sequenciamento de DNA foi realizada por eletroporação (BIO-RAD Gene Pulser). Plasmídeos de DNA foram preparados por método alcalino (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, Sambrook et al., 1989, supra) ou com o kit Qiagen® Plasmid. Fragmentos de DNA foram recuperados a partir de gel agarose pelo kit de extração de gel Qiagen. PCR foi realizado usando um PTC-200 DNA Engine. O analisador genético ABI PRISMTM 310 foi usado para determinação de todas as sequências de DNA.

Construção de biblioteca de levedura e variantes sítio-dirigidas

[00397] Bibliotecas em levedura e variantes sítio-dirigidas foram construídas por método SOE PCR (Splicing Overlap Extension, ver “PCR: A practical approach”, p. 207-209, Oxford University press, 1991, eds. McPherson, Quirke, Taylor), seguido por levedura na recombinação in vivo.

[00398] Os iniciadores abaixo são usados para fazer fragmentos de DNA contendo quaisquer fragmentos mutados pelo método SOE junto com iniciadores degenerados (AM34 + iniciador reverso e AM35 + iniciador direto) ou apenas para amplificar um gene amilase total (AM34 + AM35). AM34 e AM35 são iniciadores localizados à montante e à jusante do gene da amilase.
AM34 TAGGAGTTTAGTGAACTTGC (SEQ ID NO: 45)
AM35 TTCGAGCGTCCCAAAACC (SEQ ID NO: 46)

[00399] Fragmentos de DNA foram recuperados a partir de gel agarose pelo kit de extração de gel Qiagen. Os fragmentos purificados resultantes foram misturados com o digesto do vetor. A solução misturada foi introduzida em Saccharomyces cerevisiae para construir bibliotecas ou variantes sítio-dirigidas por recombinação in vivo.

Construção de híbridos de amilase com outro ligador e CBM

[00400] Híbridos de amilase compreendendo o núcleo catalítico de Rhizomucor pusilus fusionado com ligadores e CBMs diferentes dos de glucoamilase de Athelia rolfsii foram construídos pelo método SOE usando recombinação in vivo de levedura.

[00401] A sequência parcial codificando a região CBM de Athelia rolfsii foi removida a partir dos plasmídeos variantes tendo o ligador de glucoamilase de Athelia rolfsii e CBM por digestão com as enzimas de restrição, SacI e NotI, e o vetor resultante foi misturado com o fragmento PCR amplificado usando um par de iniciadores abaixo a partir do gene glucoamilase de Aspergillus niger. Eles foram introduzidos em levedura para construir híbridos com o ligador e CBM a partir de glucoamilase de Aspergillus niger.
AN ligador F CGGCTATCTTCACCTCTGCTACTGGCGGCACCACTACG (SEQ ID NO: 47)
AN ligador
RCTAATTACATGATGCGGCCCGCGGCCGCCTACCGCCAGGTGTCA GTC (SEQ ID NO: 48)

Expressão de amilases com CBM em Aspergillus niger

[00402] Os construtos compreendendo os genes de variantes de alfa-amilase incluindo um ligador e um CBM foram usados para construir vetores de expressão. O plasmídeo parental, pAspV019, consiste de um cassete de expressão com base no promotor de amilase neutra II de Aspergillus niger fusionado para a sequência líder não traduzida de triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans tr (Pna2/tpi) e o terminador amiloglicosidase de Aspergillus niger (Tamg). Também presente no plasmídeo foi o marcador seletivo de amdS de Aspergillus a partir de Aspergillus nidulans permitindo o crescimento em acetamida como única fonte de nitrogênio. Os plasmídeos de expressão Aspergillus foram transformados em Aspergillus como descrito em Lassen et al., 2001, Applied and Environmental Microbiology 67: 4701-4707. Transformantes expressando variantes V019 foram isolados, purificados e cultivados em frascos agitados. Os caldos de cultura de fermentações de Aspergillus niger expressando amilase com CBM foram purificados por purificação por afinidade (Biochem. J. 372: 905-910 (2003)).

Triagem de bibliotecas engenheiradas por proteínas e variantes de mutagenese sítio-dirigidas

[00403] Clones de levedura em SC-glicose foram re-inoculados sobre placas de SC-glicose contendo amido e os clones mostrando zonas de depuração foram inoculados em uma cavidade de uma placa de microtitulação de 24-cavidades contendo meio YPD, e cultivados a 28°C durante 3 dias. 2 M de tampão de acetato de sódio, pH 3,5, foi adicionado nos sobrenadantes de cultura na concentração final a 100 mM, e incubado a 4 e 65°C durante 1 hora. As atividades alfa-amilase residuais foram medidas por kit de teste alfa-amilase (Kikkoman Biochemifa Company, número de Catálogo 60213), de acordo com o protocolo do fornecedor. O teste é com base na degradação de N3-G5-β-CNP (2 cloro-4 nitrofenil 65 -azida-65-deóxi-b-maltopentosídeo) pela alfa-amilase para liberar G3-β-CNP e G2-β-CNP, que são ainda degradados por glucoamilase e beta-glucosidase providas nas soluções no kit para CNP. 1U de atividade de alfa-amilase foi definido como 1 qmol CNP liberado /min a pH 4,0 e 30°C.

[00404] Unidade/ml de cada amostra foi calculada após incubação de parte da amostra 1 h a 4°C e outra parte da amostra após incubação de 1 h a 65°C. Na tabela abaixo a relação entre estas duas atividades para cada amostra é mostrada como % atividade residual. U/ml foi calculado como: atividade de alfa-amilase = (Eamostra-Ebranco) X 0,179 X fator de diluição, em que CPN liberado foi detectado por espectrofotometria a A400.

[00405] Os clones com relação superior da atividade após incubar a 65oC/atividade após incubar a 4°C do que a variante parental foram selecionados e a sequência foi determinada.
Tabela 1. Atividade de alfa-amilase residual de variantes

[00406] Como visto a partir da tabela todas variantes testadas mostraram termoestabilidade melhorada comparado à alfa amilase de tipo selvagem.

Exemplo 2: Estabilidade de armazenamento de variantes

[00407] Uma das variantes, PE16, foi expressa em Aspergillus niger e os sobrenadantes de cultura foram purificados por um procedimento cromatográfico de três etapas: troca aniônica a pH 7,0 e pH 5,0 seguido por cromatografia de exclusão de tamanho. Duas frações com atividade amilase, tendo Mw a cerca de 50kDa e 60kDa que são correspondentes às moléculas com clivado de CBM (parte do núcleo) e ligador intacto e CBM, foram coletados e testados para estabilidade de armazenamento. As amostras foram incubadas a pH 3,8, a 4°C e 40°C durante 6 dias e as atividades restantes foram medidas cada dia.
Tabela 2. Os resultados são dados como atividade residual relativa

[00408] Os dados demonstram que a presença de um ligador e CBM não afeta as melhorias obtidas por introduzir as substituições de acordo com a invenção na região do núcleo.

Exemplo 3. Termoestabilidade a pH 3,5

[00409] A termoestabilidade de fusões de variantes selecionadas incluindo um ligador e um CBD foi avaliada usando as seguintes condições.

[00410] 1/20 (v/v) de 2 M de tampão de acetato de sódio, pH 3,5, foi adicionado nos sobrenadantes de culturas de levedura de clones expressando as variantes de alfa-amilase selecionadas e as amostras foram incubadas a 4, 60, 65 e 70°C durante 1 h.

[00411] As atividades residuais foram medidas pelo kit de teste alfa-amilase (Kikkoman #60123) como descrito acima e as atividades residuais resultantes são relativas à atividade a 4°C.
Tabela 3. Atividade de alfa amilase residual relativa às amostras 4°C.

[00412] Sob as condições testadas todas as variantes mostraram termoestabilidade melhorada.

Exemplo 4. Estabilidade de armazenamento de variantes a pH 4.0

[00413] Variantes de alfa-amilase purificadas expressas em Aspergillus oryzae foram incubadas a 40°C durante 3 dias e 10 dias (4°C como um controle) sob as seguintes condições:

[00414] 50 mM de tampão de NaOAc (pH4.0)

[00415] 0,5 mM de CaCl2

[00416] 0,005% Triton X-100

[00417] As atividades residuais foram medidas pelo kit de teste alfa-amilase (Kikkoman #60123) como descrito acima.
Tabela 4. Atividade de alfa amilase residual

Sob as condições testadas todas variantes mostraram atividade de armazenamento melhorada.

Exemplo 5. Teste de variantes selecionadas em um processo de etanol com base em hidrólise de amido cru

[00418] Aproximadamente 405 g milho de grão amarelo (obtido a partir de vários milhos do Meio-Oeste para produtores de etanol; triturados na instalação com uma configuração de trituração tipo turco) foi adicionado a 595 g de água da bica. Esta mistura foi suplementada com 3 ppm de penicilina e 1000 ppm de uréia. A suspensão foi ajustada a pH 4,5 com 40% de H2SO4. Aproximadamente 5 g desta suspensão foram adicionados a 15 mL de tubos. Cada tubo foi dosado com 0,0801 mg/gDS de glucoamilase de Tramets cingulata e 0,0225mg/g alfa-amilase DS, seguido por 200 μL de propagado de levedura (0,024 g de levedura Red de Fermentis Ethanol, incubada durante a noite a 32°C em 50 mL de farelo ensopado de milho / liquefeito filtrado e 5,1 μL Sprizyme Plus AMG). Água foi adicionada em cada tubo para levar o volume adicional total (enzima + água) a 1,2% do peso inicial do farelo ensopado.

[00419] Tubos foram incubados a 32°C e seis fermentações em duplicatas de cada tratamento foram realizadas. Todos os tubos foram submetidos a vórtice a 24, 48 e 70 horas. Uma amostra foi sacrificada para análise de HPLC a 24 horas, duas a 48 horas, e três a 70 horas. A preparação de HPLC consistiu de parar a reação por adição de 50 μL de 40% de H2SO4, centrifugando durante 10 min a 1462xg, e filtrando através de um filtro de 0,45 μm. As amostras foram armazenadas a 4°C.
Análise HPLC para etanol
Sistema de HPLC - série 1100/1200 de Agilent com software Chem station
Desgaseificador
Bomba quaternária
Auto-amostrador
Compartimento de coluna /com aquecedor
Detector do índice de refração (RI)
Coluna - coluna de exclusão de íons Bio-Rad HPX- 87H 300mm x 7,8 mm partes# 125-0140
Partes H de cátion de cartucho Bio-Rad guard # 125-0129, partes do suporte # 125-0131
Método - 0,005M de fase móvel H2OSO4
Taxa de fluxo de 0,6 ml/min
Temperatura da coluna - 65°C
Temperatura do detector RI - 55°C
Tabela 5. Rendimento de etanol relativo.

[00420] Os resultados mostram que todas as variantes testadas de acordo com a invenção reterem a sua aplicabilidade em um processo de hidrólise do amido cru.

[00421] A invenção descrita e aqui reivindicada não deve ser limitada em escopo pelos aspectos específicos aqui descritos, porque estes aspectos são destinados como ilustrações dos vários aspectos da invenção. Quaisquer aspectos equivalentes são destinados a estar dentro do escopo da invenção. De fato, várias modificações da invenção além das mostradas e descritas aqui serão evidentes para o versado na técnica a partir da descrição acima. Estas modificações também se destinam a estar dentro do escopo das reivindicações anexas. No caso de conflito, a presente descrição incluindo as definições servirá de controle.

Claims (13)

1. Variante de alfa-amilase de uma alfa-amilase parental revelada como SEQ ID NO: 3, caracterizada pelo fato de que a variante possui termoestabilidade melhorada, medida como a atividade amilase residual após a incubação por 1 hora a 65°C a pH 3,5, comparado à alfa-amilase parental, e a variante compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 143, e compreendendo ainda uma ou mais substituições nas posições correspondendo a posições 128, 141, 192, 20, 76, 123, 136, 142, 165, 219, 224, 265, 383, e 410 do polipeptídeo da SEQ ID NO: 3, e em que a variante de alfa-amilase ou fragmento da mesma compreende pelo menos uma das seguintes combinações ou substituições:
   G128D + D143N; ou
   N142D + D143N; ou
   Y141W + D143N; ou
   Y141W + N142D + D143N; ou
   G128D + Y141W + D143N; ou
   Y141W + D143N + P219C; ou
   Y141W + D143N + K192R; ou
   G128D + D143N + K192R; ou
   Y141W + D143N + K192R + P219C; ou
   G128D + Y141W + D143N + K192R; ou
   G128D + Y141W + D143N + K192R + P219C.
2. Variante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a variante ainda compreende um ligador e um módulo de ligação de carboidrato.
3. Variante de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o módulo de ligação a carboidrato é um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo de SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO: 44.
4. Variante de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o ligador e CBM é de Athelia rolfsii por exemplo, SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 36.
5. Variante de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o ligador e CBM é de Aspergillus niger por exemplo, SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 38.
6. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que consiste na SEQ ID NO: 6.
7. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de compreender o polinucleotídeo como definido na reivindicação 6.
8. Célula hospedeira de microrganismo transgênica, caracterizada pelo fato de compreender o polinucleotídeo como definido na reivindicação 6.
9. Método de produzir uma variante de alfa-amilase, caracterizado pelo fato de compreender:

   • a) cultivar a célula hospedeira como definida na reivindicação 9 sob condições apropriadas para a expressão da variante; e
   • b) recuperar a variante.
10. Método para produzir um produto de fermentação a partir de um material contendo amido, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:

    • (a) liquefazer o material contendo amido usando uma variante de alfa-amilase como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5;
    • (b) sacarificar o material liquefeito obtido em etapa (a) usando a glucoamilase; e
    • (c) fermentar o material sacarificado usando um organismo de fermentação.
11. Método para produzir um produto de fermentação a partir de um material contendo amido, caracterizado pelo fato de compreender:

    • (a) sacarificar material contendo amido com uma variante de alfa-amilase como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e uma glicoamilase a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial de referido material contendo amido,
    • (b) fermentar usando um organismo de fermentação.
12. Método de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o produto de fermentação é um álcool, particularmente etanol.
13. Método para a produção um derivado de amido enzimaticamente modificado, caracterizado pelo fato de compreender usar uma variante tendo atividade de alfa-amilase como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 para liquefazer e/ou sacarificar amido.