CN115210369A - α-淀粉酶变体以及编码它们的多核苷酸 - Google Patents

α-淀粉酶变体以及编码它们的多核苷酸 Download PDF

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Abstract

本发明涉及亲本α‑淀粉酶的分离的α‑淀粉酶变体，这些α‑淀粉酶变体在对应于SEQ ID NO:1的多肽的位置196、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、28、38、39、43、54、56、57、64、67、68、70、71、86、89、90、94、96、99、101、103、107、108、110、113、114、117、127、134、138、142、150、151、152、156、169、171、174、179、183、193、199、200、204、205、207、208、209、212、218、221、222、224、233、241、245、259、275、278、281、282、283、284、285、308、323、335、348、359、382、386、388、392、394、396、412、414、417、424、428、457、459、466、479、489、511、533、534、542、543、545、547、549、550、551、560、566、570、574、575、576、577、578、580、581、582、589、592、599、603、605、608、614、619或626的一个或多个位置处包含改变，其中该变体具有α‑淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性，但小于100％序列同一性。本发明的α‑淀粉酶变体与亲本α‑淀粉酶相比，在pH 4.0和32℃下具有增加的稳定性。

Description

α-淀粉酶变体以及编码它们的多核苷酸
序列表的引用
本申请含有计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。
发明背景
技术领域
本发明涉及α-淀粉酶变体、编码这些变体的多核苷酸、产生这些变体的方法、以及使用这些变体的方法。
背景技术
α-淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖葡聚糖水解酶，EC 3.2.1.1)构成催化淀粉以及其他直链和支链1,4-糖苷寡糖和多糖的水解的一组酶。
α-淀粉酶在工业应用中(例如，在生产糖浆或乙醇中)是熟知的。已知一种已知的属于GH13_28家族的、衍生自芽孢杆菌属物种的α-淀粉酶具有某些工业应用的缺点，因为在低pH下(例如，在低于5的pH下)的稳定性差。因此，需要提高属于GH13_28家族的淀粉酶的pH稳定性，进而提高工业实用性，例如，在从含淀粉材料生产乙醇的工艺中；在常规淀粉生产乙醇的工艺中或在生淀粉水解工艺中。
通常将从生淀粉生产乙醇作为一步工艺(one step process)进行，在该工艺中同时进行淀粉水解和发酵，典型地使用α-淀粉酶和葡糖淀粉酶水解生淀粉和酵母以发酵葡萄糖，从而生产乙醇。工艺条件典型地在约32℃，并且pH为4-5。
WO 17/037614(US 2018265853 AA)披露了与本披露的SEQ ID NO:1具有约99％序列同一性的α-淀粉酶(SEQ ID NO:6)。
US 2019010473披露了与本披露的SEQ ID NO:1具有87％序列同一性的α-淀粉酶(SEQ ID NO:34)。
US 9090887 BB披露了α-淀粉酶(AmyE/SEQ ID NO:2)的变体，其中AmyE与本披露的SEQ ID NO:1共享约92％序列同一性。
WO 17/133974披露了与本披露的SEQ ID NO:1具有约97％序列同一性的α-淀粉酶(SEQ ID NO:1)。
WO 18/002360披露了与本披露的SEQ ID NO:1具有约98％序列同一性的α-淀粉酶(SEQ ID NO:2)。
本发明提供了与其亲本相比具有改善的特性的α-淀粉酶变体。
发明内容
本发明涉及亲本α-淀粉酶的分离的α-淀粉酶变体，这些α-淀粉酶变体在对应于SEQ ID NO:1的多肽的位置196、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、28、38、39、43、54、56、57、64、67、68、70、71、86、89、90、94、96、99、101、103、107、108、110、113、114、117、127、134、138、142、150、151、152、156、169、171、174、179、183、193、199、200、204、205、207、208、209、212、218、221、222、224、233、241、245、259、275、278、281、282、283、284、285、308、323、335、348、359、382、386、388、392、394、396、412、414、417、424、428、457、459、466、479、489、511、533、534、542、543、545、547、549、550、551、560、566、570、574、575、576、577、578、580、581、582、589、592、599、603、605、608、614、619或626的一个或多个位置处包含改变，其中该变体具有α-淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性，但小于100％序列同一性。
本发明还涉及编码这些变体的分离的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及产生这些变体的方法。
本发明还涉及从含淀粉材料生产发酵产物的工艺，该工艺包括以下步骤：(a)在α-淀粉酶的存在下，在高于含淀粉材料的初始糊化温度下，将所述含淀粉材料液化；(b)将该液化的材料糖化；以及(c)用发酵生物体进行发酵；其中在至少一种本发明的变体α-淀粉酶和任选地葡糖淀粉酶的存在下进行步骤(b)。
本发明还涉及从含淀粉材料生产糖浆产物的工艺，该工艺包括以下步骤：(a)在α-淀粉酶的存在下，在高于含淀粉材料的初始糊化温度的温度下，将所述含淀粉材料液化；(b)在至少一种本发明的变体α-淀粉酶和任选地葡糖淀粉酶的存在下，将该液化的材料糖化。
在另外的方面，本发明涉及包含变体α-淀粉酶的组合物以及变体α-淀粉酶用于生产糖浆和/或发酵产物的用途。
定义
α-淀粉酶：α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)是催化淀粉以及其他直链和支链1,4糖苷寡糖和多糖的水解的一组酶。本领域技术人员将知道如何确定α-淀粉酶活性。它可以根据实例中描述的程序来确定，例如，通过使用商业α-淀粉酶活性测定试剂盒(例如含有G7-pNP底物和α-葡糖苷酶的试剂盒，例如，由罗氏公司/日立公司(Roche/Hitachi)(目录号11876473)或西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)(目录号MAK009)制造)在pH 4.0对样品进行应激后测量残余活性。
等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变而自然产生，并且可以导致群体内部的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
碳水化合物结合模块：术语“碳水化合物结合模块”意指优先结合至多糖或寡糖(碳水化合物)，通常(但不必然唯一地)结合至其水不溶性(包括结晶)形式的多肽氨基酸序列。碳水化合物结合模块(CBM)通常被称为碳水化合物结合结构域(CBD)。
衍生自淀粉降解酶的CBM通常被称为淀粉结合模块或SBM(可出现在某些淀粉分解酶(如某些葡糖淀粉酶(GA))中、或酶(如环糊精葡聚糖转移酶)中、或α-淀粉酶中)。SBM通常被称为SBD(淀粉结合结构域)。
本发明的亲本α-淀粉酶和变体淀粉酶优选包含CBM，并且在一个实施例中，CBM包含SEQ ID NO:1的氨基酸527-626或由其组成。
SEQ ID NO:1的氨基酸439-526包含接头区域或由其组成。
在一个实施例中，根据本发明的变体包含异源CBM，即，对于用作本发明变体的起始点的亲本α-淀粉酶而言CBM是外源的(不是天然存在于亲本wt淀粉酶中)。这种异源CBM优选为家族20的CBM或CBM-20模块。可替代地，异源CBM可以选自家族21、25、26、34、41或48的碳水化合物结合模块。
“家族20的碳水化合物结合模块”或CBM-20模块在本披露的上下文中被定义为与Joergensen等人(1997)在Biotechnol.Lett.[生物技术通讯]19:1027-1031的图1中披露的多肽的碳水化合物结合模块(CBM)具有至少45％同源性的约100个氨基酸的序列。CBM包含多肽的约100个氨基酸，即，从氨基酸582至氨基酸683的子序列。在本披露中应用的糖苷水解酶家族的编号遵循Coutinho,P.M.和Henrissat,B.(1999)在URL：http://afmb.cnrs- mrs.fr/～cazy/CAZY/index.html的CAZy-碳水化合物活性酶(Carbohydrate-ActiveEnzymes)服务器，或可替代地，Coutinho,P.M.和Henrissat,B.1999；The modularstructure of cellulases and other carbohydrate-active enzymes:an integrateddatabase approach[纤维素酶和其他碳水化合物活性酶的模块化结构：综合数据库方法]，于“Genetics,Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation[纤维素降解的遗传学、生物化学和生态学]”,K.Ohmiya,K.Hayashi,K.Sakka,Y.Kobayashi,S.Karita和T.Kimura编辑,Uni Publishers Co.[联合出版公司],东京,第15-23页，以及Bourne,Y.和Henrissat,B.2001；Glycoside hydrolases and glycosyltransferases:families andfunctional modules[糖苷水解酶和糖基转移酶：家族和官能分子],Current Opinion inStructural Biology[结构生物学新见]11:593-600的概念。
适用于本发明上下文的包含CBM的酶的实例是α-淀粉酶、产麦芽糖α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、β-淀粉酶、支链淀粉酶、纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶和几丁质酶。
在一个实施例中，CBM包含SEQ ID NO:1的氨基酸527-626或由其组成。该CBM属于家族26或CBM-26。
催化结构域：术语“催化结构域”意指含有酶的催化机构的该酶的区域。在一个实施例中，催化结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸12-438或由其组成。
cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工，然后呈现为成熟的剪接的mRNA。
编码序列：术语“编码序列”意指多核苷酸，该多核苷酸直接规定了变体的氨基酸序列。编码序列的边界通常由可读框确定，该可读框以起始密码子(例如ATG、GTG、或TTG)开始并且以终止密码子(例如TAA、TAG、或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区域连接的特异性限制位点的目的，控制序列可以提供有接头。
表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，该分子包含编码变体的多核苷酸并且可操作地连接到提供用于其表达的控制序列。
片段：术语“片段”意指在成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如，几个)氨基酸的多肽；其中该片段具有α-淀粉酶活性。在一个实施例中，片段包含SEQ IDNO:1的氨基酸12-438或由其组成。在另一个实施例中，片段包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-438或由其组成。
融合多肽：术语“融合多肽”是其中一种多肽在本发明变体的N-末端或C-末端融合的多肽。通过将编码另一种多肽的多核苷酸与本发明的多核苷酸融合来产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，且包括连接编码多肽的编码序列使得它们符合读框，而且融合多肽的表达处于一个或多个相同的启动子和终止子的控制之下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(Cooper等人,1993,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人,1994,Science[科学]266:776-779)。融合多肽可进一步包含两个多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：Martin等人,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物生物技术杂志]3:568-576；Svetina等人,2000,J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人,1997,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:498-503；和Contreras等人,1991,Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人,1986,Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:982-987；Carter等人,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics[蛋白质：结构、功能以及遗传学]6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World[药物发现世界]4:35-48。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不相同的任何亲本细胞子代。
杂合多肽：术语“杂合多肽”意指包含来自两个或更多个多肽的结构域的多肽，例如，来自一个多肽的结合模块和来自另一个多肽的催化结构域。结构域可以在N-末端或C-末端融合。
杂交：术语“杂交”意指使用标准DNA印迹程序将核酸的基本上互补的链配对。杂交可以在中、中-高、高或非常高严格条件下进行。中严格条件意指在42℃，于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时，随后在55℃使用0.2X SSC、0.2％SDS洗涤三次，每次15分钟。中-高严格条件意指在42℃，于5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时，随后在60℃使用0.2X SSC、0.2％SDS洗涤三次，每次15分钟。高严格条件意指在42℃，于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时，随后在65℃使用0.2X SSC、0.2％SDS洗涤三次，每次15分钟。非常高严格条件意指在42℃，于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时，随后在70℃使用0.2X SSC、0.2％SDS洗涤三次，每次15分钟。
半衰期：对于本发明的给定变体，将应激样品的酶活性(测量为样品在pH 4.0、37℃下孵育18-24小时后的残余活性)除以未应激样品的酶活性来计算残余活性(参见精确程序的实例)。据此，将酶候选物的以小时为单位的半衰期计算为以小时为单位的孵育时间的负数除以残余活性的log2。
改善因子(IF)：由估计的半衰期(T
Figure BDA0003789758780000071
)计算改善因子(IF)，即通过将变体的估计的T
Figure BDA0003789758780000072
除以野生型酶(SEQ ID NO:1)的T
Figure BDA0003789758780000073
。
改善的特性：术语“改善的特性”意指与相对于亲本有所改善的变体相关的特征，例如增加的稳定性。此类改善的特性包括但不限于pH稳定性。增加的pH稳定性可以确定为通过在低pH(例如，pH 4.0)、37℃下孵育18-24小时对酶进行应激后，根据本发明的变体的残余活性％。增加的pH稳定性还可以确定为通过在低pH(例如，pH 4.0)、32℃下孵育24小时或96小时对酶进行应激后，根据本发明的变体的残余活性％。与SEQ ID NO:1的亲本α-淀粉酶相比，针对本发明的变体测定的残余活性可以确定为改善因子。
分离的：术语“分离的”是指多肽、核酸、细胞或其他特定材料或组分，其与在自然界中发现的与其天然相关联的至少一种其他材料或组分(包括但不限于，例如，其他蛋白质，核酸，细胞等)分离。分离的多肽包括但不限于含有分泌的多肽的培养液。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在N-末端加工(例如，信号肽的去除)后处于其成熟形式的多肽。在一个实施例中，成熟多肽是披露为SEQ ID NO:1的多肽的氨基酸1-626。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有α-淀粉酶活性的成熟多肽的多核苷酸。
突变体：术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以原本不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或者是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。一个或多个控制序列对于编码本发明的变体多肽的多核苷酸可以是异源的或外源的。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列指导该编码序列的表达。
亲本或亲本α-淀粉酶：术语“亲本”或“亲本α-淀粉酶”意指进行变化以产生本发明的酶变体的α-淀粉酶。该亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。
纯化的：术语“纯化的”意指基本上不含其他组分的核酸或多肽，如通过本领域熟知的分析技术(例如，在电泳凝胶、色谱洗脱液和/或经过密度梯度离心的培养基中，纯化的多肽或核酸可形成离散的条带)所确定。纯化的核酸或多肽是至少约50％纯的，通常是至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％、约99.6％、约99.7％、约99.8％或更加纯的(例如，以摩尔计的重量百分比)。在相关意义上，当在应用纯化或富集技术之后存在分子的浓度的大幅度增加时，组合物富集了分子。术语“富集”是指化合物、多肽、细胞、核酸、氨基酸或其他指定材料或组分以高于起始组合物的相对或绝对浓度存在于组合物中。
重组：当用于提及细胞、核酸、蛋白质或载体时，术语“重组”意指已经从其天然状态经修饰。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞内未发现的基因，或与在自然界中发现的相比，以不同水平表达或在不同条件下表达天然基因。重组核酸与天然序列的差异在于一个或多个核苷酸和/或与异源序列(例如，表达载体中的异源启动子)可操作地连接。重组蛋白与天然序列的差异可以在于一个或多个氨基酸和/或与异源序列融合。包含编码多肽的核酸的载体是重组载体。术语“重组”与“遗传修饰的”和“转基因的”同义。
序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性作为“最长同一性”的输出，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite[欧洲分子生物学开放软件套件],Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277，优选6.6.0版本或更新版本)的尼德尔(Needle)程序所实施的。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。为了使尼德尔程序报告最长同一性，必须在命令行中指定非简化(nobrief)选项。尼德尔标记的“最长同一性”的输出计算如下：
(相同的残基×100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,同上)来确定两个多核苷酸序列之间的序列同一性作为“最长同一性”的输出，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite[欧洲分子生物学开放软件套件],Rice等人,2000,同上)(优选6.6.0版本或更新版本)的尼德尔程序所实施的。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。为了使尼德尔程序报告最长同一性，必须在命令行中指定非简化选项。尼德尔标记的“最长同一性”的输出计算如下：
(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
可以使用尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,同上)来确定两个多核苷酸序列之间的序列同一性，该算法如EMBOSS包(EMBOSS：The European Molecular BiologyOpen Software Suite[欧洲分子生物学开放软件套件],Rice等人,2000,同上)(优选6.6.0版本或更新版本)的尼德尔程序所实施的。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。序列同一性百分比计算如下：
(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度)
子序列：术语“子序列”意指使一个或多个核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸；其中该子序列编码具有α-淀粉酶活性的片段。
变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如，几个)位置处包含改变(例如，取代、插入和/或缺失)的具有α-淀粉酶活性的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占据某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；而插入意指在邻接并且紧随占据某一位置的氨基酸之后添加氨基酸。本发明的变体具有亲本α-淀粉酶的α-淀粉酶活性的至少20％，例如，至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％。根据本发明的变体α-淀粉酶与亲本α-淀粉酶相比在pH 4.0下具有增加的稳定性，并且其中在pH 4.0下的增加的pH稳定性可以确定为变体淀粉酶在pH 4.0、32℃下孵育18-24小时后的％残余α-淀粉酶活性(％RA)。通过将应激样品的活性除以未应激样品的活性再乘以100来计算应激后的残余活性(RA％)。α-淀粉酶活性可以例如，使用如实例中以及材料和方法部分中描述的pNP-G7α-淀粉酶活性测定进行确定。
在一个实施例中，亲本α-淀粉酶优选地选自SEQ ID NO:1的多肽。
生淀粉材料：术语“生淀粉材料”意指未经受超过57℃的温度超过10分钟的初级淀粉基谷物(primary starch-based grain)。
生淀粉水解(RSH)：术语“生淀粉水解”意指将未经受超过57℃的温度超过10分钟的初级淀粉基谷物中的淀粉降解成多糖。
生淀粉水解和发酵工艺：术语“生淀粉水解和发酵工艺”意指将未经受超过57℃的温度超过10分钟的初级淀粉基谷物中的淀粉发酵成乙醇。
野生型：提及氨基酸序列或核酸序列时术语“野生型”意指该氨基酸序列或核酸序列是天然或天然存在的序列。如本文所用，术语“天然存在的”是指在自然界中发现的任何物质(例如蛋白质、氨基酸或核酸序列)。相反，术语“非天然存在的”是指在自然界中未发现的任何物质(例如，在实验室中产生的重组核酸和蛋白质序列、或野生型序列的修饰)。
变体命名惯例
出于本发明的目的，使用在SEQ ID NO:1中披露的多肽来确定另一种α-淀粉酶中的对应氨基酸位置。另一种α-淀粉酶的氨基酸序列与在SEQ ID NO:1中披露的多肽进行比对，并且基于该比对，使用尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定对应于在SEQ ID NO:1中披露的多肽中的任何氨基酸残基的氨基酸位置编号，该算法如EMBOSS包(EMBOSS：The European Molecular Biology OpenSoftware Suite[欧洲分子生物学开放软件套件],Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277，优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序所实施的。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。
在描述本发明的变体时，为了便于参考，以下描述的命名法经过了调整。采用了已接受的IUPAC单字母或三字母的氨基酸缩写。
如本文所用的改变包括如下所述的取代、缺失和插入。
取代.对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。相应地，将在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或“T226A”。多个突变通过加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表在位置205和位置411处的甘氨酸(G)和丝氨酸(S)分别被精氨酸(R)和苯丙氨酸(F)取代。
缺失.对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。相应地，将在位置195处的甘氨酸的缺失表示为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失通过加号(“+”)分开，例如“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
插入.对于氨基酸插入，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。相应地，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸表示为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入被描述为：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2；等等。例如，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸表示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。
在此类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号而对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此会是：
<u>亲本：</u> <u>变体：</u>
195 195 195a 195b
G G-K-A
多个改变.包含多个改变的变体通过加号(“+”)分开，例如，“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”代表在位置170处和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。
不同改变.在可于一个位置处引入不同改变的情况下，不同的改变通过逗号分开，例如，“Arg170Tyr,Glu”代表在位置170处的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”表示以下变体：
“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”、和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。
具体实施方式
变体
本发明涉及与亲本α-淀粉酶相比在酸性pH下(例如在pH 4.0-5.5下)具有增加的pH稳定性的变体α-淀粉酶。在一个实施例中，亲本α-淀粉酶是本文披露为SEQ ID NO:1的成熟多肽。在本发明的其他实施例中，亲本多肽选自本文披露为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:4的α-淀粉酶。
本发明涉及亲本α-淀粉酶的分离的α-淀粉酶变体，这些α-淀粉酶变体在对应于SEQ ID NO:1的多肽的位置196、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、28、38、39、43、54、56、57、64、67、68、70、71、86、89、90、94、96、99、101、103、107、108、110、113、114、117、127、134、138、142、150、151、152、156、169、171、174、179、183、193、199、200、204、205、207、208、209、212、218、221、222、224、233、241、245、259、275、278、281、282、283、284、285、308、323、335、348、359、382、386、388、392、394、396、412、414、417、424、428、457、459、466、479、489、511、533、534、542、543、545、547、549、550、551、560、566、570、574、575、576、577、578、580、581、582、589、592、599、603、605、608、614、619或626的一个或多个位置处包含改变，其中该变体具有α-淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性，但小于100％序列同一性。
在另一特别的实施例中，本发明涉及分离的α-淀粉酶变体，这些变体在对应于SEQID NO:1的多肽的位置64、96、150、179、196、199、207、222、284和603的一个或多个位置处包含取代，其中该变体具有α-淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、或SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性，但小于100％序列同一性。
根据本发明的变体α-淀粉酶与亲本α-淀粉酶相比在pH 4.0下具有增加的pH稳定性，并且其中在pH 4.0下的增加的pH稳定性可以确定为变体淀粉酶在pH 4.0、32℃下孵育18-24小时后的％残余α-淀粉酶活性(％RA)。通过将应激样品的活性除以未应激样品的活性再乘以100来计算应激后的残余活性(RA％)。α-淀粉酶活性可以例如，使用如实例中以及材料和方法部分中描述的pNP-G7α-淀粉酶活性测定进行确定。
特别地，这些改变选自如下选自由以下组成的组的改变：E1*、T2*、A3*、N4*、K5*、S6*、N7*、K8*、V9*、V9D、V9L、T10*、T10I、A11*、S12*、S12P、S13*、V14*、V14I、K15*、N16*、N16S、N28R、N28W、R38H、R38Y、D39R、A43D、A43T、A43V、K54I、G56P、G56W、N57P、R64S、Y67T、Y67W、W68S、W68Y、Y70F、Q71E、Q71N、Q86R、K89R、D90E、A94D、E96H、E96K、G99N、K101R、I103Y、V107T、I108L、I108P、H110D、S113D、S113F、S113G、S113H、S113Q、S113W、S113Y、D114Q、A117T、N127D、Q134E、Q134L、Q134M、Q134N、Q134T、Q134W、W138Y、W142E、L150F、L150H、L150M、L150S、L150V、L150W、L150Y、G151F、G151S、G151W、G151Y、L152M、N156K、N156R、F169H、E171Q、L174I、D179G、D179S、Y183F、Y183I、D193S、D193DQ、D193DY、D193DQY、D193SQY、N196W、S199G、Q200W、N204D、I205Y、N207W、T208N、T208S、S209L、F212W、L218F、L218W、S221N、A222E、A222I、A222V、R224K、N233S、H241N、S245N、H259Y、S275L、S275N、T278N、T278W、T278Y、N281Q、N281S、D282P、D283*、D283A、D283P、E284Q、E285V、T308M、T308Y、R323K、S335K、S335Q、S335R、T348K、E359Y、A382T、S386D、S388W、N392R、N392W、S394K、K396S、Q412W、A414K、K417W、K417Y、A424P、A428S、Q457L、Q457R、T459M、A466V、Q479QP、L489Q、E511D、G533H、Y534H、Q542K、V543P、A545P、I547Y、K549*、K549Y、H550*、H550Y、D551*、G560P、A566P、N570H、M574MW、M574W、Y575W、T576Y、L577Y、T578Y、P580*、E581*、N582*、K589F、F592FK、V599W、N603W、P605S、D608Y、L614W、G619W、和H626*，使用SEQID NO:1进行编号或对应于在另一个亲本α-淀粉酶中的取代。
在一个实施例中，改变(例如取代)选自R64S、E96K、L150Y、L150W、L150H、L150M、L150F、D179S、N196W、S199G、N207W、A222E、A222I,A222V、E284Q和N603W，使用SEQ ID NO:1进行编号或对应于在另一个亲本α-淀粉酶中的取代。
在亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:1不同的情况下，在给定位置中的氨基酸可能与在SEQ ID NO:1的对应位置中存在的氨基酸不同。然而，这被理解为在本发明的范围内，因为唯一的基本特征是取代后在给定位置中的氨基酸。
在实施例中，变体与亲本α-淀粉酶的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。
在另一个实施例中，变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列同一性。
在一方面，本发明变体中的改变数目是1-20个，例如，1-10个和1-5个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个改变。
在另一个实施例中，变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列同一性。
在另一个实施例中，变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列同一性。
在另一个实施例中，变体与SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列同一性。
在另一方面，变体在对应于SEQ ID NO:1的多肽的位置64、96、150、179、196、199、207、222、284和603的一个或多个位置处包含取代。
在另一方面，变体在对应于位置196的位置处包含取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置196的位置处的氨基酸被Trp取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代N196W或由其组成。
在另一方面，变体在对应于位置199的位置处包含取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置199的位置处的氨基酸被Gly取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代S199G或由其组成。
在另一方面，变体在对应于位置222的位置处包含取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置222的位置处的氨基酸被Val取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代A222V或由其组成。
在另一方面，变体在对应于位置222的位置处包含取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置222的位置处的氨基酸被Ile取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代A222I或由其组成。
在另一方面，变体在对应于位置222的位置处包含取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置222的位置处的氨基酸被Glu取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代A222E或由其组成。
在另一方面，变体在对应于位置207的位置处包含取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置207的位置处的氨基酸被Trp取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代N207W或由其组成。
在另一方面，变体在对应于位置603的位置处包含取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置603的位置处的氨基酸被Trp取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代N603W或由其组成。
在另一方面，变体在对应于位置150的位置处包含取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置150的位置处的氨基酸被Tyr取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代L150Y或由其组成。
在另一方面，变体在对应于位置150的位置处包含取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置150的位置处的氨基酸被Trp取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代L150W或由其组成。
在另一方面，变体在对应于位置150的位置处包含取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置150的位置处的氨基酸被His取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代L150H或由其组成。
在另一方面，变体在对应于位置150的位置处包含取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置150的位置处的氨基酸被Met取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代L150M或由其组成。
在另一方面，变体在对应于位置150的位置处包含取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置150的位置处的氨基酸被Phe取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代L150F或由其组成。
在另一方面，变体在对应于位置64的位置处包含取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置64的位置处的氨基酸被Ser取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代R64S或由其组成。
在另一方面，变体在对应于位置96的位置处包含取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置96的位置处的氨基酸被Lys取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代E96K或由其组成。
在另一方面，变体在对应于位置179的位置处包含取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置179的位置处的氨基酸被Ser取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代D179S或由其组成。
在另一方面，变体在对应于位置284的位置处包含取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置284的位置处的氨基酸被Gln取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代E284Q或由其组成。
在另一方面，变体包含一个或多个选自由以下组成的组的取代或由其组成：R64S、E96K、L150Y、L150W、L150H、L150M、L150F、D179S、N196W、S199G、N207W、A222E、A222I、A222V、E284Q和N603W，使用SEQ ID NO:1进行编号。
在一个特定的实施例中，本发明涉及α-淀粉酶变体，这些变体在对应于SEQ IDNO:1的多肽的位置150、196、199、207、222和603的一个或多个位置处包含取代，这些变体包含选自以下的取代或取代的组合：
A222I；
A222V；
A222E；
S199G；
N196W；
N207W；
N603W；
L150Y；
L150W；
L150H；
L150M；
L150F；
R64S：
E96K；
D179S；
E284Q；
N207W+N603W；
N196W+N207W；
N196W+N603W；
N196W+N207W+N603W；
A222I+S199G+N196W；
A222V+S199G+N196W；
A222E+S199G+N196W；
A222V+S199G+N196W+L150Y；
L150H+S199G+A222I；
L150M+S199G+A222V；
N196W+S199G+A222V+N603W；
L150F+N196W+S199G+A222I；
L150M+N196W+S199G+A222V；
L150W+S199G+A222V；
L150H+N196W+S199G+A222V；
L150W+N196W+S199G+A222I；
L150Y+S199G+A222V；
E96K+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
R64S+E96K+N196W+S199G+A222V；
其中该变体具有α-淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性，但小于100％序列同一性，并且其中该变体α-淀粉酶与披露为SEQ ID NO:1的α-淀粉酶相比在pH 4.0、32℃或37℃下具有增加的pH稳定性。
在一个特定的实施例中，本发明涉及α-淀粉酶变体，这些变体在对应于SEQ IDNO:1的多肽的位置150、196、199、207、222和603的一个或多个位置处包含取代，这些变体包含选自以下的取代或取代的组合：
A222I；
A222V；
A222E；
S199G；
N196W；
N207W；
N603W：
L150Y；
L150W；
L150H；
L150M；
L150F；
R64S：
E96K；
D179S；
E284Q；N207W+N603W；
N196W+N207W；
N196W+N603W；
N196W+N207W+N603W；
A222I+S199G+N196W；
A222V+S199G+N196W；
A222E+S199G+N196W；
A222V+S199G+N196W+L150Y；
L150H+S199G+A222I；
L150M+S199G+A222V；
N196W+S199G+A222V+N603W；
L150F+N196W+S199G+A222I；
L150M+N196W+S199G+A222V；
L150W+S199G+A222V；
L150H+N196W+S199G+A222V；
L150W+N196W+S199G+A222I；
L150Y+S199G+A222V；
E96K+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
R64S+E96K+N196W+S199G+A222V；
其中该变体具有α-淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性，但小于100％序列同一性，并且其中该变体α-淀粉酶与披露为SEQ ID NO:2的α-淀粉酶相比在pH 4.0、37℃下具有增加的pH稳定性。
在一个特定的实施例中，本发明涉及α-淀粉酶变体，这些变体在对应于SEQ IDNO:1的多肽的位置150、196、199、207、222和603的一个或多个位置处包含取代，这些变体包含选自以下的取代或取代的组合：
A222I；
A222V；
A222E；
S199G；
N196W；
N207W；
N603W：
L150Y；
L150W；
L150H；
L150M；
L150F；
R64S：
E96K；
D179S；
E284Q；
N207W+N603W；
N196W+N207W；
N196W+N603W；
N196W+N207W+N603W；
A222I+S199G+N196W；
A222V+S199G+N196W；
A222E+S199G+N196W；
A222V+S199G+N196W+L150Y；
L150H+S199G+A222I；
L150M+S199G+A222V；
N196W+S199G+A222V+N603W；
L150F+N196W+S199G+A222I；
L150M+N196W+S199G+A222V；
L150W+S199G+A222V；
L150H+N196W+S199G+A222V；
L150W+N196W+S199G+A222I；
L150Y+S199G+A222V；
E96K+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
R64S+E96K+N196W+S199G+A222V；
其中该变体具有α-淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性，但小于100％序列同一性，并且其中该变体α-淀粉酶与披露为SEQ ID NO:3的α-淀粉酶相比在pH 4.0、37℃下具有增加的pH稳定性。
在一个特定的实施例中，本发明涉及α-淀粉酶变体，这些变体在对应于SEQ IDNO:1的多肽的位置150、196、199、207、222和603的一个或多个位置处包含取代，这些变体包含选自以下的取代或取代的组合：
A222I；
A222V；
A222E；
S199G；
N196W；
N207W；
N603W：
L150Y；
L150W；
L150H；
L150M；
L150F；
R64S：
E96K；
D179S；
E284Q；
N207W+N603W；
N196W+N207W；
N196W+N603W；
N196W+N207W+N603W；
A222I+S199G+N196W；
A222V+S199G+N196W；
A222E+S199G+N196W；
A222V+S199G+N196W+L150Y；
L150H+S199G+A222I；
L150M+S199G+A222V；
N196W+S199G+A222V+N603W；
L150F+N196W+S199G+A222I；
L150M+N196W+S199G+A222V；
L150W+S199G+A222V；
L150H+N196W+S199G+A222V；
L150W+N196W+S199G+A222I；
L150Y+S199G+A222V；
E96K+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
R64S+E96K+N196W+S199G+A222V；
其中该变体具有α-淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性，但小于100％序列同一性，并且其中该变体α-淀粉酶与披露为SEQ ID NO:4的α-淀粉酶相比在pH 4.0、37℃下具有增加的pH稳定性。
本发明的变体是基于改善的pH 4稳定性选择的。更特别地，这些变体与亲本α-淀粉酶、特别是披露为SEQ ID NO:1的α-淀粉酶相比在pH 4.0、32℃或37℃下具有增加的pH稳定性。
在pH 4.0下的增加的pH稳定性可以确定为变体淀粉酶在pH 4.0、32℃或37℃下孵育18-24小时，并且以小时为单位计算酶的半衰期后的残余α-淀粉酶活性或％残余α-淀粉酶活性。在另一个实施例中，pH稳定性的增加可以在pH 4.0、32℃下持续24小时或96小时进行确定。因此，在这一实施例中，本发明的变体α-淀粉酶相对于亲本具有改善的特性，其中该改善的特性是与亲本α-淀粉酶、特别是披露为SEQ ID NO:1的α-淀粉酶相比在pH 4.0、32℃下的增加的pH稳定性。同样在这种情况下，改善的稳定性可以计算为以小时为单位的酶的半衰期。
在特别的方面，与SEQ ID NO:1的淀粉酶相比，半衰期增加了至少1.2、1.3、1.4、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0倍，例如至少8.0倍。
本领域中熟知的是，信号肽的加工可能导致不同形式的成熟多肽的分布，因此在一个实施例中，成熟多肽将从SEQ ID NO:1的位置1以外的其他位置开始。例如，本发明的α-淀粉酶变体可包含N-末端缺失，更特别地包含SEQ ID NO:1的至少氨基酸11至626、SEQ IDNO:1的至少氨基酸12至626、例如SEQ ID NO:1的至少氨基酸13至626。
本发明的变体还可以包含C-末端缺失。例如，在一个实施例中，本发明的α-淀粉酶变体包含C-末端缺失，特别是H626*。
更特别地，变体α-淀粉酶可以包含选自以下的取代的组合：
S199G+H626*；
N196W+S199G+A222V+H626*；
N196W+H626*
N196W+N207W+H626*：
L150Y+N196W+S199G+A222V
E96K+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
R64S+E96K+N196W+S199G+A222V；
并且其中该变体具有α-淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性，但小于100％序列同一性。
在另一个特别的实施例中，本发明的变体α-淀粉酶包含选自以下的改变或改变的组合：
N28W；
N196W；
S199G；
N196W+V599W；
N196W+H550Y+P605S；
N196W+A545P+T576Y；
N196W+K549Y+G560P；
I108P+Y183I+N196W+I205Y；
N196W+R323K；
N196W+D283P；
W138Y+N196W；
L150W；
N196W+N392W+K417W；
N196W+N392R+K417W；
N196W+K549*+H550*+D551*；
N196W+P580*+E581*+N582*；
N196W+F592FK；
N28W+N196W+N207W+S386D+N603W；
R38Y+N196W；
N196W+H259Y；
N196W+Q412W；
N196W+F212W；
N196W+V599W；
N196W+H550Y+P605S；
N196W+H550Y+K589F；
N196W+H550Y+D608Y；
N196W+M574W+L614W；
N196W+G533H+M574W+L614W；
N196W+V543P+N570H；
N196W+G533H+Y575W+L614W；
N196W+A545P+T576Y；
N196W+A566P+T578Y；
N196W+K549Y+G560P；
N196W+A566P+L577Y；
N196W+I547Y+G560P；
N196W+M574MW；
N196W+K549*+H550*+D551*+M574MW+P580*+E581*+N582*+F592FK；
N196W+L614W+G619W；
N28W+I108P+N196W+N207W+S386D+A466V+Q542K+N603W；
N28W+I108P+N196W+N207W+S386D+N603W；
N196W+D282P+D283*；
W138Y+N196W；
N28W+N196W+N207W+S386D+N603W；
N196W+S388W+A424P；
N196W+S388W+A424P+L489Q；
A117T+N196W+H550Y+D608Y；
N196W+Q457R+Y575W+L614W；
N196W+S199G；
N196W+A222V；
N196W+A222E；
N196W+A222I；
S199G+A222V；
S199G+A222E；
S199G+A222I；
N196W+S199G+A222I；
Q134L；
L150W+N156K+N196W+S199G+A222V；
L150Y+N156K+N196W+S199G+A222I；
L150W+N196W+S199G+A222I+A428S；
L150F+N156K+N196W+S199G+A222I；
L150Y+N156R+N196W+A222V；
L150M+N156R+N196W+S199G+A222I；
L150M+N156R+N196W+A222V；
L150Y+N156R+N196W+S199G+A222V；
L150M+N156K+N196W+S199G+A222V；
L150Y+N156R+N196W+A222I；
L150H+N156R+N196W+S199G+A222I；
L150H+N156K+N196W+A222V；
L150W+N156R+N196W+A222I；
L150F+N156R+N196W+A222I；
L150F+N156K+N196W+S199G+A222V；
L150H+N156K+N196W+S199G+A222V；
L150F+N156R+S199G+A222I；
L150M+N156K+N196W+A222V；
L150W+N156K+N196W+S199G+A222I；
N156K+N196W+S199G+A222V；
L150Y+N156R+S199G+A222I；
L150M+N156R+S199G+A222I；
L150W+N156K+S199G+A222V；
L150W+N156R+N196W+S199G+A222V；
L150Y+N156R+N196W；
N156K+N196W+A222V；
N156K+N196W+S199G；
N156R+S199G+A222V；
S113H+N196W+S199G+A222V；
Q71E+S113H+N196W+S199G+A222V；
N196W+S199G+A222V+D283A；
N196W+S199G+A222V+D283P；
W142E+D193SQY+N196W+S199G+A222V+R224K；
E96K+K101R+L150W+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V；
E96K+K101R+L150Y+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V+E284Q；
E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V+E284Q；
S113Q+Q134E+N196W+S199G+A222V；
S113D+Q134N+N196W+S199G+A222V；
S113F+N196W+S199G+A222V；
E171Q+N196W+S199G+N204D+A222V；
N196W+S199G+A222V+H241N+S245N+T278N+E284Q+E285V；
N196W+S199G+A222V+S394K+A414K+K417Y；
N196W+S199G+A222V+E359Y+S394K+K396S+A414K+K417Y；
R38H+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
R38H+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
V107T+H110D+N196W+S199G+A222V；
Q134T+L150Y+N196W+S199G+A222V；
S113F+L150W+N196W+S199G+A222V；
S113F+L150Y+N196W+S199G+A222V；
E96K+K101R+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V；
E96K+K101R+L150Y+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V；
E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V；
E96K+K101R+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V+E284Q；
E96K+K101R+L150W+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V+E284Q；
N28R+Q86R+N196W+S199G+A222V；
N28R+Q86R+K89R+N196W+S199G+A222V；
G56P+N196W+S199G+S209L+A222V；
E96K+N196W+S199G+A222V；
T10I+N196W+S199G+A222V；
D39R+N196W+S199G+A222V；
R64S+N196W+S199G+A222V；
T10I+D39R+R64S+N196W+S199G+A222V；
T10I+D39R+N196W+S199G+A222V；
D39R+E96K+N196W+S199G+A222V；
R64S+D90E+E96K+N196W+S199G+A222V；
R38H+D39R+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
R38H+R64S+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
T10I+R38H+R64S+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
T10I+R38H+R64S+D90E+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
T10I+R38H+D39R+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
R38H+D39R+R64S+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
T10I+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+N196W+S199G+A222V+E284Q；
R64S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
T10I+D39R+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D193SQY+N196W+S199G+A222V；
Q134T+N196W+S199G+A222V；
L174I+N196W+S199G+T208N+A222V；
Y183F+N196W+S199G+T208S+A222V；
N127D+N156R+N196W+S199G+A222V；
Q134T+L150W+N196W+S199G+A222V；
N57P+N196W+S199G+A222V；
N196W+S199G+Q200W+A222V；
T10I+D39R+R64S+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
T10I+D39R+R64S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
T10I+R64S+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+R64S+D90E+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
T10I+R64S+E96K+N196W+S199G+A222V；
T10I+D39R+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+R64S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
R64S+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+R64S+N196W+S199G+A222V；
S12*+S13*+V14*+K15*+N16*+I103Y+N196W+S199G+A222V+N233S+T308Y；
S12*+S13*+V14*+K15*+N16*+A43D+I103Y+N196W+S199G+A222V+N233S+T308M；
V9L+S12P+V14I+N16S+A43T+N196W+S199G+A222V；
S12*+S13*+V14*+K15*+N16*+N196W+S199G+A222V；
N28W+N196W+S199G+A222V；
N196W+S199G+A222V+N392W+K417W；
T10I+D39R+E96K+N196W+S199G+A222V；
V9D+R38H+N196W+S199G+A222V+T348K；
S113F+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V；
S113Y+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V；
S113W+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V；
S113F+N156K+N196W+S199G+A222V；
S113Y+N156K+N196W+S199G+A222V；
S113W+N156K+N196W+S199G+A222V；
W138Y+L150V+N196W+S199G+A222V；
W138Y+L150V+D179G+N196W+S199G+A222V；
W138Y+L150V+N196W+S199G+L218W+A222V；
E96K+Q134L+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
E96K+Q134L+L150Y+N156R+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
E96K+L150Y+N156R+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
R38H+E96K+G99N+K101R+Q134L+D179S+N196W+S199G+S221N+A222V；
R38H+E96K+G99N+K101R+Q134L+D179S+N196W+S199G+A222V；
R38H+E96K+G99N+K101R+Q134L+L150Y+N156R+D179S+N196W+S199G+A222V；
R38H+E96K+G99N+K101R+L150Y+N156R+D179S+N196W+S199G+A222V；
L150F+N196W+S199G+A222I；
Q134L+L150F+N156R+N196W+S199G+A222I；
Q134L+L150H+N156R+N196W+S199G+A222I；
Q134L+L150M+N156K+N196W+S199G+A222I；
Q134L+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222I+Q457L；
Q134M+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I；
Q134W+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I；
L150W+L152M+N156K+N196W+S199G+A222I；
S113F+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I；
S113Y+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I；
L150W+G151W+N156K+N196W+S199G+A222I；
L150W+G151S+N156K+N196W+S199G+A222I；
S113F+L150W+G151S+N156K+N196W+S199G+A222I；
Y67W+W68Y+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I；
A43V+L150M+G151F+N156R+N196W+S199G+A222I；
L150M+G151Y+N156R+N196W+S199G+A222I；
L150M+G151W+N156R+N196W+S199G+A222I；
L150M+G151S+N156R+N196W+S199G+A222I+Y534H；
S113F+L150M+G151S+N156R+N196W+S199G+A222I；
Q134L+L150F+N156K+N196W+S199G+A222I；
L150W+G151F+N156K+N196W+S199G+A222I；
L150W+G151Y+N156K+N196W+S199G+A222I；
Y67W+W68Y+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I；
G56W+N57P+Y67W+W68Y+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I；
K54I+Y67W+W68S+S113G+N196W+S199G+A222V+A382T；
K54I+Y67W+W68S+S113G+D114Q+L150V+N196W+S199G+A222V；
K54I+Y67W+W68S+S113G+W138Y+N196W+S199G+A222V；
K54I+Y67W+W68S+S113G+D114Q+W138Y+L150V+N196W+S199G+A222V；
Q134L+N196W+S199G+A222V；
V107T+I108L+H110D+F169H+N196W+S199G+A222V；
N196W+S199G+A222V+N392W+K417W；
V9D+R38H+N196W+S199G+A222V+T348K；
E96H+L150Y+N156R+N196W+S199G+A222V+E284Q；
Q134L+L150Y+N196W+S199G+A222V；
L150Y+N196W+S199G+A222V；
Q134L+L150Y+N196W+S199G+A222V；
L150F+N156R+N196W+S199G+A222V；
L150H+N156R+N196W+S199G+A222V；
Q134L+L150F+N156R+N196W+S199G+A222V；
Q134L+L150H+N156R+N196W+S199G+A222V；
Q134L+L150F+N156K+N196W+S199G+A222V；
Q134L+L150H+N156K+N196W+S199G+A222V；
Q134L+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V；
L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V；
Q134L+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V；
Q134W+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V；
Q134M+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V；
Q134M+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V+A466V；
L150Y+L152M+N156K+N196W+S199G+A222V；
L150S+N196W+S199G+A222V；
N196W+S199G+A222V+N281S；
Y67T+N196W+S199G+A222V；
Q71N+N196W+S199G+A222V；
Q71N+A94D+N196W+S199G+A222V；
N196W+S199G+L218F+A222V；
N196W+S199G+L218W+A222V；
N196W+S199G+A222V+T278W；
N196W+S199G+A222V+T278W+T459M；
N196W+S199G+A222V+T278Y；
N196W+S199G+A222V+S275N；
N196W+S199G+A222V+S275L；
N196W+S199G+A222V+S335Q；
N196W+S199G+A222V+S335K；
N196W+S199G+A222V+S335R；
N196W+S199G+L218W+A222V+S335K；
N196W+S199G+L218W+A222V+S335Q；
Y67W+N196W+S199G+A222V；
N196W+S199G+A222V+N281Q；
L150M+N156R+N196W+S199G+A222V；
Q134L+L150M+N156R+N196W+S199G+A222V；
Q134L+L150M+N156K+N196W+S199G+A222V；
D39R+N196W+S199G+A222V+N281Q+E284Q；
D39R+N196W+S199G+A222V+E284Q+Q479QP；
D39R+Y70F+N196W+S199G+A222V+E284Q；
N28W+D39R+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+N196W+S199G+N207W+A222V+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+D39R+N196W+S199G+N207W+A222V+E284Q；
N196W+N207W；
N196W+N207W+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+N196W+N207W+E284Q；
L150Y+N196W+S199G+A222V；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+L150Y+N196W+S199G+A222V；
E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+N207W+T208N+A222V；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V；
Q134L+L150H+N156R+N196W+S199G+A222I+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+Q134L+L150H+N156R+N196W+S199G+A222I；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+Q134L+L150H+N156R+N196W+S199G+N207W+A222I+E284Q；
E96K+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+E96K+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
R64S+E96K+N196W+S199G+N207W+A222V；
N28W+D39R+N196W+S199G+N207W+A222V+E284Q；
D39R+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+N196W+S199G+N207W+A222V+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+D39R+N196W+S199G+A222V+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+N196W+N207W+E511D；
L150Y+N196W+S199G+N207W+A222V；
E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V；
E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+N207W+T208N+A222V+E284Q；
Q134L+L150H+N156R+N196W+S199G+A222I；
N28W+E96K+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
R64S+E96K+N196W+S199G+A222V；
R64S+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+R64S+E96K+N196W+S199G+A222V；
并且其中该变体具有α-淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性，但小于100％序列同一性，并且其中该变体与亲本α-淀粉酶、特别是披露为SEQ ID NO:1的α-淀粉酶相比在pH 4.0、32℃下具有增加的pH稳定性，并且任选地该变体进一步包含C-末端缺失H626*。
在另一个特别的实施例中，本发明的α-淀粉酶变体包含选自以下的改变的组合：
N28W+H626*；
S199G+H626*；
N196W+V599W+H626*；
N196W+H550Y+P605S+H626*；
N196W+A545P+T576Y+H626*；
N196W+K549Y+G560P+H626*；
I108P+Y183I+N196W+I205Y+H626*；
N196W+R323K+H626*；
N196W+D283P+H626*；
W138Y+N196W+H626*；
L150W+H626*；
N196W+N392W+K417W+H626*；
N196W+N392R+K417W+H626*；
N196W+K549*+H550*+D551*+H626*；
N196W+P580*+E581*+N582*+H626*；
N196W+F592FK+H626*；
N28W+N196W+N207W+S386D+N603W+H626*；
R38Y+N196W+H626*；
N196W+H259Y+H626*；
N196W+Q412W+H626*；
N196W+F212W+H626*；
N196W+V599W+H626*；
N196W+H550Y+P605S+H626*；
N196W+H550Y+K589F+H626*；
N196W+H550Y+D608Y+H626*；
N196W+M574W+L614W+H626*；
N196W+G533H+M574W+L614W+H626*；
N196W+V543P+N570H+H626*；
N196W+G533H+Y575W+L614W+H626*；
N196W+A545P+T576Y+H626*；
N196W+A566P+T578Y+H626*；
N196W+K549Y+G560P+H626*；
N196W+A566P+L577Y+H626*；
N196W+I547Y+G560P+H626*；
N196W+M574MW+H626*；
N196W+K549*+H550*+D551*+M574MW+P580*+E581*+N582*+F592FK+H626*；
N196W+L614W+G619W+H626*；
N28W+I108P+N196W+N207W+S386D+A466V+Q542K+N603W+H626*；
N28W+I108P+N196W+N207W+S386D+N603W+H626*；
N196W+D282P+D283*+H626*；
W138Y+N196W+H626*；
N28W+N196W+N207W+S386D+N603W+H626*；
N196W+S388W+A424P+H626*；
N196W+S388W+A424P+L489Q+H626*；
A117T+N196W+H550Y+D608Y+H626*；
N196W+Q457R+Y575W+L614W+H626*；
N196W+S199G；
N196W+A222V；
N196W+A222E；
N196W+A222I；
S199G+A222V；
S199G+A222E；
S199G+A222I；
N196W+S199G+A222I；
Q134L+H626*；
L150W+N156K+N196W+S199G+A222V；
L150Y+N156K+N196W+S199G+A222I；
L150W+N196W+S199G+A222I+A428S；
L150F+N156K+N196W+S199G+A222I；
L150Y+N156R+N196W+A222V；
L150M+N156R+N196W+S199G+A222I；
L150M+N156R+N196W+A222V；
L150Y+N156R+N196W+S199G+A222V；
L150M+N156K+N196W+S199G+A222V；
L150Y+N156R+N196W+A222I；
L150H+N156R+N196W+S199G+A222I；
L150H+N156K+N196W+A222V；
L150W+N156R+N196W+A222I；
L150F+N156R+N196W+A222I；
L150F+N156K+N196W+S199G+A222V；
L150H+N156K+N196W+S199G+A222V；
L150F+N156R+S199G+A222I；
L150M+N156K+N196W+A222V；
L150W+N156K+N196W+S199G+A222I；
N156K+N196W+S199G+A222V；
L150Y+N156R+S199G+A222I；
L150M+N156R+S199G+A222I；
L150W+N156K+S199G+A222V；
L150W+N156R+N196W+S199G+A222V；
L150Y+N156R+N196W；
N156K+N196W+A222V；
N156K+N196W+S199G；
N156R+S199G+A222V；
S113H+N196W+S199G+A222V；
Q71E+S113H+N196W+S199G+A222V；
N196W+S199G+A222V+D283A；
N196W+S199G+A222V+D283P；
W142E+D193SQY+N196W+S199G+A222V+R224K；
E96K+K101R+L150W+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V；
E96K+K101R+L150Y+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V+E284Q；
E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V+E284Q；
S113Q+Q134E+N196W+S199G+A222V；
S113D+Q134N+N196W+S199G+A222V；
S113F+N196W+S199G+A222V；
E171Q+N196W+S199G+N204D+A222V；
N196W+S199G+A222V+H241N+S245N+T278N+E284Q+E285V；
N196W+S199G+A222V+S394K+A414K+K417Y；
N196W+S199G+A222V+E359Y+S394K+K396S+A414K+K417Y；
R38H+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
R38H+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
V107T+H110D+N196W+S199G+A222V；
Q134T+L150Y+N196W+S199G+A222V；
S113F+L150W+N196W+S199G+A222V；
S113F+L150Y+N196W+S199G+A222V；
E96K+K101R+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V；
E96K+K101R+L150Y+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V；
E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V；
E96K+K101R+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V+E284Q；
E96K+K101R+L150W+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V+E284Q；
N28R+Q86R+N196W+S199G+A222V；
N28R+Q86R+K89R+N196W+S199G+A222V；
G56P+N196W+S199G+S209L+A222V；
E96K+N196W+S199G+A222V；
T10I+N196W+S199G+A222V；
D39R+N196W+S199G+A222V；
R64S+N196W+S199G+A222V；
T10I+D39R+R64S+N196W+S199G+A222V；
T10I+D39R+N196W+S199G+A222V；
D39R+E96K+N196W+S199G+A222V；
R64S+D90E+E96K+N196W+S199G+A222V；
R38H+D39R+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
R38H+R64S+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
T10I+R38H+R64S+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
T10I+R38H+R64S+D90E+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
T10I+R38H+D39R+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
R38H+D39R+R64S+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
T10I+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+N196W+S199G+A222V+E284Q；
R64S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
T10I+D39R+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D193SQY+N196W+S199G+A222V；
Q134T+N196W+S199G+A222V；
L174I+N196W+S199G+T208N+A222V；
Y183F+N196W+S199G+T208S+A222V；
N127D+N156R+N196W+S199G+A222V；
Q134T+L150W+N196W+S199G+A222V；
N57P+N196W+S199G+A222V；
N196W+S199G+Q200W+A222V；
T10I+D39R+R64S+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
T10I+D39R+R64S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
T10I+R64S+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+R64S+D90E+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
T10I+R64S+E96K+N196W+S199G+A222V；
T10I+D39R+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+R64S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
R64S+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+R64S+N196W+S199G+A222V；
S12*+S13*+V14*+K15*+N16*+I103Y+N196W+S199G+A222V+N233S+T308Y；
S12*+S13*+V14*+K15*+N16*+A43D+I103Y+N196W+S199G+A222V+N233S+T308M；
V9L+S12P+V14I+N16S+A43T+N196W+S199G+A222V；
S12*+S13*+V14*+K15*+N16*+N196W+S199G+A222V；
N28W+N196W+S199G+A222V；
N196W+S199G+A222V+N392W+K417W；
T10I+D39R+E96K+N196W+S199G+A222V；
V9D+R38H+N196W+S199G+A222V+T348K；
S113F+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
S113Y+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
S113W+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
S113F+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
S113Y+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
S113W+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
W138Y+L150V+N196W+S199G+A222V+H626*；
W138Y+L150V+D179G+N196W+S199G+A222V+H626*；
W138Y+L150V+N196W+S199G+L218W+A222V+H626*；
E96K+Q134L+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q+H626*；
E96K+Q134L+L150Y+N156R+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q+H626*；
E96K+L150Y+N156R+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q+H626*；
R38H+E96K+G99N+K101R+Q134L+D179S+N196W+S199G+S221N+A222V+H626*；
R38H+E96K+G99N+K101R+Q134L+D179S+N196W+S199G+A222V+H626*；
R38H+E96K+G99N+K101R+Q134L+L150Y+N156R+D179S+N196W+S199G+A222V+H626*；
R38H+E96K+G99N+K101R+L150Y+N156R+D179S+N196W+S199G+A222V+H626*；
L150F+N196W+S199G+A222I+H626*；
Q134L+L150F+N156R+N196W+S199G+A222I+H626*；
Q134L+L150H+N156R+N196W+S199G+A222I+H626*；
Q134L+L150M+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
Q134L+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222I+Q457L+H626*；
Q134M+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
Q134W+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
L150W+L152M+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
S113F+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
S113Y+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
L150W+G151W+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
L150W+G151S+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
S113F+L150W+G151S+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
Y67W+W68Y+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
A43V+L150M+G151F+N156R+N196W+S199G+A222I；
L150M+G151Y+N156R+N196W+S199G+A222I；
L150M+G151W+N156R+N196W+S199G+A222I；
L150M+G151S+N156R+N196W+S199G+A222I+Y534H；
S113F+L150M+G151S+N156R+N196W+S199G+A222I；
Q134L+L150F+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
L150W+G151F+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
L150W+G151Y+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
Y67W+W68Y+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I；
G56W+N57P+Y67W+W68Y+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
K54I+Y67W+W68S+S113G+N196W+S199G+A222V+A382T+H626*；
K54I+Y67W+W68S+S113G+D114Q+L150V+N196W+S199G+A222V+H626*；
K54I+Y67W+W68S+S113G+W138Y+N196W+S199G+A222V+H626*；
K54I+Y67W+W68S+S113G+D114Q+W138Y+L150V+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134L+N196W+S199G+A222V+H626*；
V107T+I108L+H110D+F169H+N196W+S199G+A222V+H626*；
N196W+S199G+A222V+N392W+K417W+H626*；
V9D+R38H+N196W+S199G+A222V+T348K+H626*；
E96H+L150Y+N156R+N196W+S199G+A222V+E284Q+H626*；
Q134L+L150Y+N196W+S199G+A222V+H626*；
L150Y+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134L+L150Y+N196W+S199G+A222V+H626*；
L150F+N156R+N196W+S199G+A222V+H626*；
L150H+N156R+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134L+L150F+N156R+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134L+L150H+N156R+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134L+L150F+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134L+L150H+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134L+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134L+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134W+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134M+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134M+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V+A466V+H626*；
L150Y+L152M+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
L150S+N196W+S199G+A222V+H626*；
N196W+S199G+A222V+N281S+H626*；
Y67T+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q71N+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q71N+A94D+N196W+S199G+A222V+H626*；
N196W+S199G+L218F+A222V+H626*；
N196W+S199G+L218W+A222V+H626*；
N196W+S199G+A222V+T278W+H626*；
N196W+S199G+A222V+T278W+T459M+H626*；
N196W+S199G+A222V+T278Y+H626*；
N196W+S199G+A222V+S275N+H626*；
N196W+S199G+A222V+S275L+H626*；
N196W+S199G+A222V+S335Q+H626*；
N196W+S199G+A222V+S335K+H626*；
N196W+S199G+A222V+S335R+H626*；
N196W+S199G+L218W+A222V+S335K+H626*；
N196W+S199G+L218W+A222V+S335Q+H626*；
Y67W+N196W+S199G+A222V+H626*；
N196W+S199G+A222V+N281Q+H626*；
L150M+N156R+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134L+L150M+N156R+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134L+L150M+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
D39R+N196W+S199G+A222V+N281Q+E284Q；
D39R+N196W+S199G+A222V+E284Q+Q479QP；
D39R+Y70F+N196W+S199G+A222V+E284Q；
N28W+D39R+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+N196W+S199G+N207W+A222V+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+D39R+N196W+S199G+N207W+A222V+E284Q+H626*；
N196W+N207W；
N196W+N207W+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+N196W+N207W+E284Q；
L150Y+N196W+S199G+A222V+H626*；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+L150Y+N196W+S199G+A222V；
E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+N207W+T208N+A222V；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V；
Q134L+L150H+N156R+N196W+S199G+A222I+E284Q+H626*；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+Q134L+L150H+N156R+N196W+S199G+A222I+H626*；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+Q134L+L150H+N156R+N196W+S199G+N207W+A222I+E284Q；
E96K+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q+H626*；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+E96K+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
R64S+E96K+N196W+S199G+N207W+A222V；
N28W+D39R+N196W+S199G+N207W+A222V+E284Q；
D39R+N196W+S199G+A222V+E284Q+H626*；
D39R+N196W+S199G+N207W+A222V+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+D39R+N196W+S199G+A222V+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+N196W+N207W+E511D；
L150Y+N196W+S199G+N207W+A222V；
E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V+H626*；
E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+N207W+T208N+A222V+E284Q+H626*；
Q134L+L150H+N156R+N196W+S199G+A222I；
N28W+E96K+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
R64S+E96K+N196W+S199G+A222V+H626*；
R64S+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+R64S+E96K+N196W+S199G+A222V；
并且其中该变体具有α-淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性，但小于100％序列同一性，并且其中该变体与亲本α-淀粉酶、特别是披露为SEQ ID NO:1的α-淀粉酶相比在pH 4.0、32℃下具有增加的pH稳定性。
在特别的实施例中，本发明的变体可以进一步包含对应于K8N的取代，更特别地，当在酵母宿主细胞中表达这些变体时。
氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基末端或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一功能(如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。
保守取代的实例在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins[蛋白质],Academic Press[学术出版社],纽约中描述。常见取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
可替代地，这些氨基酸改变具有使多肽的物理化学性质改变的这样一种性质。
可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,1989,Science[科学]244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一种技术中，在分子中的每个残基处引入单丙氨酸突变，并测试所得的突变分子的α-淀粉酶活性以鉴定对分子活性关键的氨基酸残基。还参见，Hilton等人,1996,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性位点还可通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点氨基酸进行突变。参见例如，de Vos等人,1992,Science[科学]255:306-312；Smith等人,1992,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人,1992,FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。
本发明的变体多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域在另一种多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。
例如，在一个实施例中，根据本发明的变体α-淀粉酶的催化结构域可以与另一种酶的碳水化合物结合模块(CBM)融合，从而形成杂合α-淀粉酶，其中催化核心和CBM是异源的，这意味着它们在自然界中不存在并且CBM对于催化结构域是外源的或异源的。
因此，本发明的另一实施例涉及变体催化结构域片段，其包含对应于SEQ ID NO:1的至少氨基酸氨基酸12-438、优选SEQ ID NO:1的氨基酸1-438的催化结构域，其中任选地接头和/或碳水化合物结合模块(CBM)已被异源CBM替代。
异源意味着催化核心和CBM不是天然存在于相同的多肽或酶中。
在一个实施例中，CBM包含SEQ ID NO:1的氨基酸527-626，并且氨基酸439-526包含接头区域。
在另一实施例中，异源CBM选自属于家族20、21、25、26、34、41或48的CBM。优选地，CBM是家族20CBM。
在一个特别的实施例中，CBM选自由以下组成的组：
i)SEQ ID NO:14的多肽或与SEQ ID NO:14的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的多肽；
ii)SEQ ID NO:15的多肽或与SEQ ID NO:15的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的多肽；
iii)SEQ ID NO:16的多肽或与SEQ ID NO:16的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的多肽；
iv)SEQ ID NO:17的多肽或与SEQ ID NO:17的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的多肽；
v)SEQ ID NO:18的多肽或与SEQ ID NO:18的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的多肽；以及
vi)SEQ ID NO:19的多肽或与SEQ ID NO:19的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的多肽。
本领域中熟知的是，不同的α-淀粉酶和葡糖淀粉酶之间的接头区域的长度可能不同，并且通常长度可以在约1个氨基酸至约100个氨基酸的范围内变化。因此，在一个实施例中，选择接头以在1-100个氨基酸的范围内。
在实施例中，变体与亲本酶相比在pH 4、37℃下具有增加的pH稳定性。在另一个实施例中，变体与亲本酶相比在pH 4.0、32℃下具有增加的pH稳定性。
亲本α-淀粉酶
在优选的实施例中，亲本α-淀粉酶可以是与SEQ ID NO:1的多肽具有至少60％序列同一性的多肽。
在一方面，亲本与SEQ ID NO:1的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，该亲本具有α-淀粉酶活性。在一方面，亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的多肽相差多达10个氨基酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个。在另一方面，亲本包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，亲本是含有至少催化结构域的SEQ ID NO:1的多肽的片段。
亲本α-淀粉酶可以是与SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％序列同一性的多肽。
在一方面，亲本与SEQ ID NO:1的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，该亲本具有α-淀粉酶活性。在一方面，亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的多肽相差多达10个氨基酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个。在另一方面，亲本包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，亲本是含有至少催化结构域的SEQ ID NO:2的多肽的片段。
亲本α-淀粉酶可以是与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％序列同一性的多肽。
在一方面，亲本与SEQ ID NO:1的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，该亲本具有α-淀粉酶活性。在一方面，亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:3的多肽相差多达10个氨基酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个。在另一方面，亲本包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，亲本是含有至少催化结构域的SEQ ID NO:3的多肽的片段。
亲本α-淀粉酶可以是与SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％序列同一性的多肽。
在一方面，亲本与SEQ ID NO:1的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，该亲本具有α-淀粉酶活性。在一方面，亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:4的多肽相差多达10个氨基酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个。在另一方面，亲本包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，亲本是含有至少催化结构域的SEQ ID NO:4的多肽的片段。
亲本多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域在另一种多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。例如，在一个实施例中，根据本发明的变体α-淀粉酶的催化结构域可以与另一种酶的碳水化合物结合模块(CBM)融合，从而形成杂合α-淀粉酶，其中催化核心和CBM是异源的，这意味着它们在自然界中不存在并且CBM对于催化结构域是外源的或异源的。
亲本可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在本发明的多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸与本发明的多核苷酸融合来产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列使得它们符合读框，而且融合多肽的表达处于一个或多个相同的启动子和终止子的控制之下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(Cooper等人,1993,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人,1994,Science[科学]266:776-779)。
融合多肽可进一步包含两个多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：Martin等人,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物生物技术杂志]3:568-576；Svetina等人,2000,J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人,1997,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:498-503；和Contreras等人,1991,Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人,1986,Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:982-987；Carter等人,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics[蛋白质：结构、功能以及遗传学]6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World[药物发现世界]4:35-48。
亲本可以从芽孢杆菌属的细菌中获得。出于本发明的目的，如本文中与给定来源结合使用，术语“从……获得”应当意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一方面，亲本是胞外分泌的。
在一方面，亲本是嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、或苏云金芽孢杆菌α-淀粉酶。
在一个特别的方面，亲本是地衣芽孢杆菌。
在另一方面，亲本是解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶，例如，SEQ ID NO:1的α-淀粉酶。
这些物种的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)、和美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection,Northern Regional Research Center，NRRL)。
可以使用以上探针，从其他来源(包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或从天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)直接获得的DNA样品)中鉴定亲本并获得亲本。用于从天然生境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一种微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合DNA样品来获得编码亲本的多核苷酸。一旦已经用一种或多种探针检测到编码亲本的多核苷酸，则可以通过利用对本领域的普通技术人员来说已知的技术来分离或克隆该多核苷酸(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)。
变体的制备
本发明还涉及用于获得在pH 4、32℃或37℃下具有增加的稳定性并且具有α-淀粉酶活性的变体的方法，这些方法包括：(a)在对应于SEQ ID NO:1的多肽的如下位置的一个或多个位置处向亲本α-淀粉酶(或在另一种相关的亲本α-淀粉酶中)引入改变：196、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、28、38、39、43、54、56、57、64、67、68、70、71、86、89、90、94、96、99、101、103、107、108、110、113、114、117、127、134、138、142、150、151、152、156、169、171、174、179、183、193、199、200、204、205、207、208、209、212、218、221、222、224、233、241、245、259、275、278、281、282、283、284、285、308、323、335、348、359、382、386、388、392、394、396、412、414、417、424、428、457、459、466、479、489、511、533、534、542、543、545、547、549、550、551、560、566、570、574、575、576、577、578、580、581、582、589、592、599、603、605、608、614、619或626，其中该变体具有α-淀粉酶活性；以及(b)回收该变体。
可以使用本领域已知的任何诱变程序，如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等制备变体。
定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个突变的技术。
通过涉及使用含有所需突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，该盒式诱变涉及由限制酶在包含编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将含有突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化质粒和寡核苷酸的限制酶是相同的，从而允许质粒和插入物的粘性末端彼此连接。参见例如，Scherer和Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]76:4949-4955；和Barton等人,1990,Nucleic Acids Res.[核酸研究]18:7349-4966。
还可以通过本领域中已知的方法在体内实现定点诱变。参见例如，美国专利申请公开号2004/0171154；Storici等人,2001,Nature Biotechnol.[自然生物技术]19:773-776；Kren等人,1998,Nat.Med.[自然医学]4:285-290；以及Calissano和Macino,1996,Fungal Genet.Newslett.[真菌遗传学时事通讯]43:15-16。
可以在本发明中使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的许多可商购的试剂盒。
合成基因构建需要设计的多核苷酸分子的体外合成以编码目的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，例如由Tian等人(2004,Nature[自然]432:1050-1054)所述的基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。
可以使用已知的诱变、重组和/或改组方法，随后进行相关的筛选程序做出单或多氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，该相关的筛选程序例如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625披露的那些。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人,1991,Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等人,1986,Gene[基因]46:145；Ner等人,1988,DNA 7:127)。
诱变/改组方法可以与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等人,1999,Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中各个氨基酸残基的重要性。
通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是利用合成的多核苷酸片段的过程与PCR技术组合。因此，基因的限定区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以进行易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的变体的分离的多核苷酸。
核酸构建体
本发明还涉及包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中表达。
可以按多种方式来操纵多核苷酸以提供变体的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操纵可能是理想的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
该控制序列可以是启动子，即，被宿主细胞识别以对编码本发明的变体的多核苷酸进行表达的多核苷酸。启动子含有介导变体的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变启动子、截短启动子和杂合启动子，并且可以获得自编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus,1994,Molecular Microbiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人,1988,Gene[基因]69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)以及tac启动子(DeBoer等人,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:21-25)。其他启动子描述于Gilbert等人,1980,Scientific American[科学美国人]242:74-94的“Usefulproteins from recombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”；和Sambrook等人,1989,同上。串联启动子的实例披露于WO 99/43835中。
用于在丝状真菌宿主细胞中指导本发明核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶，和里氏木霉翻译延伸因子，以及NA2-tpi启动子(来自曲霉属中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中已经用来自曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代未翻译的前导序列；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中已经用来自构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代未翻译的前导序列)；及其突变启动子、截短启动子和杂合启动子。其他启动子在美国专利号6,011,147中描述。
在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因中获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。酵母宿主细胞的其他有用的启动子由Romanos等人,1992,Yeast[酵母]8:423-488描述。
控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的3'末端。在宿主细胞中有功能的任何终止子可用于本发明中。
细菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因中获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。
丝状真菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因中获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶和里氏木霉翻译延伸因子。
酵母宿主细胞的优选终止子从以下的基因中获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。酵母宿主细胞的其他有用的终止子由Romanos等人(1992,同上)描述。
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区域，其增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定子区域的实例从以下中获得：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人,1995,Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。
控制序列也可以是前导序列，即对宿主细胞翻译很重要的mRNA的非翻译区域。该前导序列可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的5'末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。
丝状真菌宿主细胞的优选前导序列从以下的基因中获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。
酵母宿主细胞的适合的前导序列从以下的基因中获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
控制序列还可以是多腺苷酸化序列，一种可操作地连接至该多核苷酸的3’末端并且当转录时由宿主细胞识别为将多腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何多腺苷酸化序列。
丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列从以下的基因中获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
酵母宿主细胞的有用的多腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.[分子细胞生物学]15:5983-5990描述。
控制序列还可以是信号肽编码区域，该编码区域编码与变体的N-末端连接的信号肽，并且指导该变体进入细胞的分泌途径。多核苷酸的编码序列的5'-端可以固有地包含信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码该变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，编码序列的5'-端可以含有对编码序列而言是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地含有信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地替代天然信号肽编码序列，以便增强变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下的基因中获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。其他信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews[微生物评论]57:109-137描述。
丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下的基因中获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
酵母宿主细胞的有用的信号肽从以下的基因中获得：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。其他的有用的信号肽编码序列由Romanos等人(1992，同上)描述。
控制序列还可以是编码位于变体的N-末端处的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割前肽而被转化成活性变体。前肽编码序列可以从以下的基因中获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子。
在信号肽和前肽序列两者都存在的情况下，将前肽序列紧邻变体的N-末端定位并且将信号肽序列紧邻前肽序列的N-末端定位。
还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节变体的表达的调节序列。调节序列的实例是引起基因表达以响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些。原核系统中的调节序列包括lac、tac、和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子和里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该变体的多核苷酸将可操作地连接至该调节序列。
表达载体
本发明还涉及包含编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个合宜的限制位点以允许在此类位点处插入或取代编码变体的多核苷酸。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列如此位于载体中，使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。
载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。
细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性)的标记。酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于：ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)连同其等同物。优选的用于在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。优选的用于在木霉属细胞中使用的是adeA、adeB、amdS、hph和pyrG基因。
选择性标记可以是如WO 2010/039889中所述的双选择性标记系统。在一方面，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。
载体优选地含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
为了整合至宿主细胞基因组中，载体可以依赖于编码变体的多核苷酸序列或用于借助同源或非同源重组整合至基因组中的任何其他载体元件。可替代地，载体可以含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了提高在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数目的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、和800至10,000个碱基对，这些核酸与相对应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，该复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、和pAMβ1的复制起点。
用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合以及ARS4与CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人,1991,Gene[基因]98:61-67；Cullen等人,1987,Nucleic Acids Res.[核酸研究]15:9163-9175；WO00/24883)。可根据WO00/24883中披露的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。
可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞中以增加变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。
用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持，如较早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码变体的基因及其来源。
宿主细胞可以是在变体的重组产生中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽疫亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、以及浅青紫链霉菌细胞。
将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可以通过以下方式来实现：原生质体转化(参见例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.[分子与普通遗传学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829；或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques[生物技术]6:742-751)、或接合(参见例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可以通过以下方式来实现：原生质体转化(参见例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见例如，Dower等人,1988,Nucleic Acids Res.[核酸研究]16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，Gong等人,2004,Folia Microbiol.(Praha)[叶线形微生物学(布拉格)]49:399-405)、接合(参见例如，Mazodier等人,1989,J.Bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)、或转导(参见例如，Burke等人,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]98:6289-6294)。将DNA引入假单胞菌属细胞中可以通过以下方式来实现：电穿孔(参见例如，Choi等人,2006,J.Microbiol.Methods[微生物学方法杂志]64:391-397)或接合(参见例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可以通过以下方式来实现：天然感受态(natural competence)(参见例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质体转化(参见例如，Catt和Jollick,1991,Microbios[微生物学]68:189-207)、电穿孔(参见例如，Buckley等人,1999,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)、或接合(参见例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如本文所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如由Hawksworth等人在以下文献中所定义：Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi[安斯沃思和拜斯比真菌字典],第8版,1995,CAB International[国际应用生物科学中心],University Press[大学出版社],Cambridge，UK[英国剑桥])。
真菌宿主细胞可以为酵母细胞。如本文所用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类可在将来变化，出于本发明的目的，酵母应当如Biology and Activities of Yeast[酵母的生物学与活性](Skinner,Passmore和Davenport编辑，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9[应用细菌学学会专题论文集系列9],1980)中所描述的那样定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)的亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人,1995(同上)所定义的)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸来进行的，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)来进行的，而碳分解代谢可以是发酵性的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉胞菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、篮状菌属、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)、或木霉属细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、女王杜香金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳、长域毛栓菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的工艺以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序描述于以下文献中：EP 238023,Yelton等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474以及Christensen等人,1988,Bio/Technology[生物/技术]6:1419-1422。用于转化镰孢属物种的适合方法由Malardier等人,1989,Gene[基因]78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由以下文献描述的程序转化酵母：Becker和Guarente,在Abelson,J.N.和Simon,M.I.编辑,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology[酵母遗传学与分子生物学指南],Methods in Enzymology[酶学方法],第194卷,第182-187页,AcademicPress,Inc.[学术出版社有限公司],纽约；Ito等人,1983,J.Bacteriol.[细菌学杂志]153:163；以及Hinnen等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:1920。
产生方法
本发明还涉及产生变体的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该变体的条件下培养本发明的重组宿主细胞；以及任选地(b)回收该变体。
使用本领域已知的方法在适合于产生变体的营养培养基中培养重组宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许该变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养该细胞。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的适合的营养培养基中。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果变体被分泌到营养培养基中，则变体可以直接从培养基回收。如果变体没有分泌，则它可以从细胞裂解液中回收。
可以使用本领域已知的对这些变体特异的方法检测这些变体。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定变体的活性。
可以使用本领域已知的方法回收变体。例如，可以通过多种常规程序从营养培养基中回收变体，这些常规程序包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。在一方面，回收全发酵液。
可以通过本领域中已知的多种程序来纯化变体以获得基本上纯的变体，这些程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水作用色谱法、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱法)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见例如，Protein Purification[蛋白质纯化]，Janson和Ryden编辑,VCH Publishers[VCH出版社],纽约,1989)。
在可替代的方面，没有回收变体，而是将表达变体的本发明的宿主细胞用作变体的来源。
发酵液配制品或细胞组合物
本发明还涉及包含本发明的变体的发酵液配制品或细胞组合物。发酵液产物进一步包括在发酵工艺中使用的另外的成分，例如像，细胞(包括包含编码本发明的变体的基因的宿主细胞，这些宿主细胞被用于产生目的变体)、细胞碎片、生物质、发酵培养基和/或发酵产物。在一些实施例中，组合物是含有一种或多种有机酸、杀灭的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。
如本文所用，术语“发酵液”是指由细胞发酵产生的、不经历或经历最少的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物在允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞表达酶)并且将蛋白质分泌到细胞培养基中的碳限制条件下孵育生长到饱和时，产生发酵液。发酵液可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，发酵液是未分级的并且包含用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液含有用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。
在实施例中，发酵液配制品和细胞组合物包含第一有机酸组分(包含至少一种1-5个碳的有机酸和/或其盐)和第二有机酸组分(包含至少一种6个或更多个碳的有机酸和/或其盐)。在特定的实施例中，第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐、或前述两种或更多种的混合物；并且第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐、或前述两种或更多种的混合物。
在一方面，组合物含有一种或多种有机酸，并且任选地进一步含有杀灭的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀灭的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。
这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含防腐剂和/或抗微生物(例如，抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域已知的其他试剂。
细胞杀灭的全培养液或组合物可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的内容物。典型地，细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)在允许蛋白质合成的碳限制条件下孵育生长到饱和之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶和杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知的方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。
如本文所述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶性组分，例如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以去除不溶性组分以提供澄清的液体组合物。
本发明的全培养液配制品和细胞组合物可以通过WO 90/15861或WO 2010/096673中所述的方法来产生。
酶组合物
本发明还涉及包含本发明的变体的组合物。优选地，这些组合物富含这种变体。术语“富含”指示该组合物的α-淀粉酶活性已经增加，例如，以至少1.1的富集因子。
这些组合物可以包含本发明的变体作为主要酶组分，例如，单组分组合物。可替代地，这些组合物可以包含多种酶活性，如选自下组的一种或多种酶，该组由以下组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶，例如，α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
在特别的实施例中，该组合物包含本发明的变体α-淀粉酶和葡糖淀粉酶。
在另一个实施例中，该组合物包含本发明的变体α-淀粉酶和另一种α-淀粉酶。
在另一个实施例中，该组合物包含本发明的变体α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和另一种α-淀粉酶。
在实施例中，其他α-淀粉酶是真菌或细菌来源的。在优选的实施例中，其他α-淀粉酶是真菌酸性稳定的α-淀粉酶。真菌酸性稳定的α-淀粉酶是在3.0至7.0的pH范围内并且优选地在3.5至6.5的pH范围内具有活性，包括在约4.0、4.5、5.0、5.5、和6.0的pH下的活性的α-淀粉酶。
在优选的实施例中，糖化和/或发酵中存在的和/或添加的其他α-淀粉酶衍生自根毛霉属的菌株，优选菌株微小根毛霉，例如示于WO 2013/006756的SEQ ID NO:3中的菌株，例如具有黑曲霉接头和淀粉结合结构域的微小根毛霉α-淀粉酶杂合体，例如示于本文的SEQ ID NO:12中的杂合体或其变体。
在实施例中，其他α-淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:12的多肽的α-淀粉酶；
(ii)包含如下氨基酸序列的α-淀粉酶，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:12的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
在优选的实施例中，其他α-淀粉酶是示于SEQ ID NO:12中的、具有以下取代或取代的组合中的至少一个的α-淀粉酶的变体：D165M；Y141W；Y141R；K136F；K192R；P224A；P224R；S123H+Y141W；G20S+Y141W；A76G+Y141W；G128D+Y141W；G128D+D143N；P219C+Y141W；N142D+D143N；Y141W+K192R；Y141W+D143N；Y141W+N383R；Y141W+P219C+A265C；Y141W+N142D+D143N；Y141W+K192R V410A；G128D+Y141W+D143N；Y141W+D143N+P219C；Y141W+D143N+K192R；G128D+D143N+K192R；Y141W+D143N+K192R+P219C；G128D+Y141W+D143N+K192R；或G128D+Y141W+D143N+K192R+P219C(使用SEQ ID NO:12进行编号)。
在实施例中，α-淀粉酶衍生自具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉，优选披露为本文的SEQ ID NO:12，优选具有以下取代中的一个或多个：G128D、D143N，优选G128D+D143N(使用SEQ ID NO:12进行编号)。
在实施例中，糖化和/或发酵中存在的和/或添加的其他α-淀粉酶变体与本文的SEQ ID NO:12的多肽具有至少75％同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但低于100％同一性。
在实施例中，包含在组合物中的葡糖淀粉酶是真菌来源的，优选地来自曲霉属的菌株，优选黑曲霉、泡盛曲霉或米曲霉；或木霉属的菌株，优选里氏木霉；或篮状菌属的菌株，优选埃默森篮状菌；或栓菌属的菌株,优选瓣环栓菌(T.cingulata)；或密孔菌属的菌株，优选血红密孔菌；或粘褶菌属的菌株，如篱边粘褶菌或密粘褶菌；或黑层孔属(Nigrofomes)的菌株。
在实施例中，葡糖淀粉酶衍生自栓菌属，例如瓣环栓菌的菌株，例如示于本文的SEQ ID NO:7中的菌株。
在实施例中，葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:7的多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含如下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:7的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
在实施例中，葡糖淀粉酶衍生自篮状菌属，例如埃默森篮状菌的菌株，例如示于本文的SEQ ID NO:8中的菌株。
在实施例中，葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:8的多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含如下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:8的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
在实施例中，葡糖淀粉酶可以按如下量添加到糖化和/或发酵中：0.0001-20AGU/gDS，优选0.001-10AGU/g DS，尤其是在0.01-5AGU/g DS之间，例如0.1-2AGU/g DS。
包含葡糖淀粉酶的可商购的组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SANTMSUPER、SANTMEXTRA L、SPIRIZYMETMPLUS、SPIRIZYMETMFUEL、SPIRIZYMETMB4U、SPIRIZYMETMULTRA、SPIRIZYMETMEXCEL和AMGTME(来自诺维信公司(Novozymes A/S))；OPTIDEXTM300、GC480、GC417(来自杜邦公司(DuPont.))；AMIGASETM和AMIGASETMPLUS(来自帝斯曼公司(DSM))；G-ZYMETMG900、G-ZYMETM和G990 ZR(来自杜邦公司)。
除了葡糖淀粉酶之外，该组合物可以进一步包含蛋白酶。特别地是家族S53的内切蛋白酶，更特别地是衍生自大型亚灰树花菌(Meripilus giganteus)的S53蛋白酶。
在优选的实施例中，在糖化和/或发酵期间存在的和/或添加的葡糖淀粉酶与α-淀粉酶之间的比率优选地可以在500:1至1:1，例如从250:1至1:1、例如从100:1至1:1、例如从100:2至100:50、例如从100:3至100:70的范围内。
可以根据本领域中已知的方法来制备组合物，并且组合物可以处于液体或干组合物的形式。例如，组合物可以处于颗粒或微颗粒的形式。可以根据本领域中已知的方法将变体稳定化。
可以根据本领域中已知的方法来制备组合物，并且组合物可以处于液体或干组合物的形式。可以根据本领域中已知的方法将组合物稳定化。
本发明的酶组合物可以处于任何适于使用的形式，例如像除去或未除去细胞的粗发酵液、具有或不具有细胞碎片的细胞裂解液、半纯化或纯化的酶组合物、或作为酶的来源的宿主细胞。
酶组合物可以是干粉或颗粒、无粉尘的颗粒、液体、稳定化液体或稳定化受保护的酶。可以根据已建立的工艺例如通过添加稳定剂(如糖、糖醇或其他多元醇)、和/或乳酸或另一种有机酸，将液体酶组合物稳定化。
下面给出了本发明的组合物的优选的用途的实例。组合物的剂量以及使用组合物的其他条件可以基于本领域中已知的方法进行确定。
使用本发明的α-淀粉酶的方法-工业应用
本发明的变体α-淀粉酶具有允许各种工业应用的有价值的特性。特别地，这些α-淀粉酶可以用于乙醇生产以及淀粉转化工艺中。
此外，本发明的α-淀粉酶特别适用于从淀粉或全谷物中生产甜味剂/糖浆以及乙醇(参见，例如美国专利号5,231,017)，例如燃料乙醇、饮用乙醇以及工业乙醇。
在一个实施例中，本发明涉及根据本发明的α-淀粉酶在糖化工艺中，特别是同时糖化和发酵工艺中的用途。
淀粉加工
天然淀粉由室温下不溶于水的微观颗粒组成。当加热水性淀粉浆料时，颗粒膨胀并且最后破裂，将淀粉分子分散至溶液中。在高达约50℃至75℃的温度下，膨胀可以是可逆的。然而，在更高温度，开始不可逆膨胀，称为“糊化”。在此“糊化”工艺中，粘度有显著地增加。有待加工的颗粒状淀粉可以具有高度精制的淀粉质量，优选地至少90％、至少95％、至少97％或至少99.5％纯，或它可以为更粗糙的含淀粉材料，这些材料包含(例如，经碾磨的)全谷物，全谷物包括非淀粉部分，例如胚芽残余物和纤维。该原材料(如全谷物)可例如通过磨制减小粒度，以打开结构并且允许进一步加工。在干磨中，整个谷粒被碾磨并且使用。湿磨使胚芽与粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)很好分离并且时常应用于在例如糖浆的生产中使用淀粉水解物的场所。干磨和湿磨两者是本领域中熟知的淀粉加工法并且可以用于本发明的工艺中。用于减少该含淀粉材料的粒度的方法为本领域的技术人员所熟知的。
由于典型工业工艺中的固体水平为30％-40％，因此不得不稀释或“液化”淀粉以使其能够被适当加工。在当前商业实践中，这种粘度的降低主要通过酶降解来实现。
在α-淀粉酶，优选细菌α-淀粉酶和/或酸性真菌α-淀粉酶的存在下进行液化。在实施例中，在液化期间还存在植酸酶。在实施例中，在液化期间还存在降低粘度的酶例如木聚糖酶和/或β-葡聚糖酶。
在液化期间，通过α-淀粉酶将长链淀粉降解为支链以及直链的较短单元(麦芽糖糊精)。液化可以作为三步热浆料工艺进行。将浆料加热至60℃-95℃之间(例如70℃-90℃，例如77℃-86℃、80℃-85℃、83℃-85℃)并且添加α-淀粉酶以开始液化(稀释)。
在实施例中，可以将浆料在95℃-140℃(例如，105℃-125℃)之间喷射蒸煮持续约1-15分钟，例如约3-10分钟，尤其是约5分钟。然后，将浆料冷却至60℃-95℃并且添加更多的α-淀粉酶，以获得最终水解(二次液化)。在pH 4.5-6.5下，典型地在5与6之间的pH下进行喷射蒸煮工艺。可以将α-淀粉酶以单一剂量添加，例如在喷射蒸煮之前，或部分在喷射蒸煮之前给予并且部分在喷射蒸煮之后给予。
在70℃-95℃之间，例如80℃-90℃，例如约85℃，进行液化工艺持续约10分钟至5小时，典型地是1-2小时。pH在4与7之间，例如在5.5与6.2之间。为了确保在这些条件下最佳的酶稳定性，可以任选地添加钙(以提供1-60ppm游离钙离子，例如约40ppm游离钙离子)。如此处理之后，液化的淀粉将典型地具有10-16的“右旋糖当量(DE)”。
通常，液化和液化条件在本领域是熟知的。
用于在液化中使用的α-淀粉酶优选是细菌酸性稳定的α-淀粉酶。特别地，α-淀粉酶来自噬细胞菌属物种(Cytophaga sp.)、微小杆菌属物种(Exiguobacterium sp.)或芽孢杆菌属物种(例如像嗜热脂肪芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌)。
在实施例中，α-淀粉酶来自芽孢杆菌属，例如嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，例如示于WO 99/019467的SEQ ID NO:3中或本文的SEQID NO:9中的α-淀粉酶。
在实施例中，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置179至182的区域中具有两个氨基酸的双缺失，更特别是在位置I181+G182、R179+G180、G180+I181、R179+I181或G180+G182(优选I181+G182)处的双缺失，和任选地N193F取代(使用SEQ ID NO:9进行编号)。
在实施例中，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置S242处具有取代，优选S242Q取代。
在实施例中，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置E188处具有取代，优选E188P取代。
在实施例中，α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组，这些变体具有以下突变：
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；
-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-I181*+G182*+N193F+V59A Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；以及
-V59A+E129V+K177L+R179S+I181*+G182*+A184Q+E188P+T191N+N193F+V212T+S242Y+Q254S+Y268G+K279I+M284V+N293Y+T297N；(使用SEQ ID NO:9进行编号)。
在实施例中，α-淀粉酶变体与SEQ ID NO:9的多肽具有至少75％同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、但小于100％同一性。
在另一个实施例中，α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组，这些变体具有以下突变：
-N126Y F153W R178*G179*T180H E187P I203Y S362A R377Y；
-N126Y F153W R178*G179*T180H E187P I203Y Y303A S362A R377Y；以及
-N126Y F153W R178*G179*T180H I203Y S241Q；(使用SEQ ID NO:13进行编号)，并且其中该α-淀粉酶变体与SEQ ID NO:9的多肽或SEQ ID NO:13的多肽具有至少75％同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％同一性。
应理解的是，当提及嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶及其变体时，它们通常以截短的形式产生。特别地，截短可以为这样使得示于WO 99/19467的SEQ ID NO:3中或本文的SEQID NO:9中的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体在C-末端截短以优选地具有约490个氨基酸，例如482-493个氨基酸。优选地，嗜热脂肪芽孢杆菌变体α-淀粉酶优选地在SEQ IDNO:9的位置484之后，特别地在位置485之后、特别地在位置486之后、特别地在位置487之后、特别地在位置488之后、特别地在位置489之后、特别地在位置490之后、特别地在位置491之后、特别地在位置492之后，更特别地在位置493之后被截短。
可以使用本领域中熟知的条件，用产碳水化合物源的酶，特别是根据本发明的α-淀粉酶和葡糖淀粉酶进行糖化。例如，全部糖化步骤可以持续约24至约72小时。然而，通常，在30℃-65℃之间的温度(典型地约60℃)进行典型地40-90分钟的预糖化，随后在同时糖化和发酵(SSF)工艺的发酵期间进行完全糖化。典型地在20℃-75℃的范围内的温度(例如，25℃-65℃和40℃-70℃，典型地约60℃)，并且在约4与5之间的pH，一般在约pH 4.5下进行糖化。
糖化步骤和发酵步骤可以依次或同时进行。在实施例中，糖化和发酵是同时进行的(称为“SSF”)。然而，通常，在30℃至65℃、典型地约60℃的温度下进行一个预糖化步骤持续约30分钟至2小时(例如，30至90分钟)，随后在被称为同时糖化和发酵(SSF)的发酵期间进行完全糖化。pH通常在4.2-4.8之间，例如，pH 4.5。在同时糖化和发酵(SSF)工艺中，没有糖化的保持阶段，而实际上是酵母和酶一起添加。
在典型的糖化工艺中，通过添加葡糖淀粉酶以及任选的去分支酶，例如异淀粉酶(美国专利号4,335,208)或支链淀粉酶，来将液化期间产生的麦芽糖糊精转化成右旋糖。添加葡糖淀粉酶以及去分支酶之前使温度降低至60℃。糖化工艺进行24-72小时。在添加糖化酶之前，使pH降低至低于4.5，同时维持高温(高于95℃)，以便使液化α-淀粉酶失活。此工艺减少了称为“潘糖前体”的短寡糖的形成，这种短寡糖不能通过去分支酶来适当水解。正常地，约0.2％-0.5％的糖化产物是分支三糖潘糖(Glc pα1-6Glc pα1-4Glc)，它不能由支链淀粉酶降解。如果糖化期间仍然存在来自液化的活性淀粉酶(即未变性)，潘糖的量可以高至1％-2％，这是高度不希望的，因为它显著降低了糖化产率。
其他发酵产物可以在本领域的普通技术人员熟知的、适于所讨论的发酵生物体的条件和温度下发酵。
可以通过本领域熟知的方法(例如，通过蒸馏)回收发酵产物。
在特别的实施例中，本发明的工艺在将含淀粉材料转化为糖/糊精之前进一步包括以下步骤：
(x)减少该含淀粉材料的粒度；以及
(y)形成包含该含淀粉材料和水的浆料。
在实施例中，将含淀粉材料碾磨，以减少粒度。在实施例中，粒度被减少至0.05-3.0mm、优选0.1-0.5mm之间，或使得至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％的含淀粉材料适合通过一个具有0.05-3.0mm筛网、优选0.1-0.5mm筛网的筛。
水性浆料可以含有含淀粉材料的10-55wt.％干固体(DS)，优选25-45wt.％干固体(DS)，更优选30-40wt.％干固体(DS)。
常规的淀粉转化工艺(例如液化和糖化工艺)描述于例如美国专利号3,912,590、EP 252730以及EP 063909中。
在实施例中，转化工艺将淀粉降解为较低分子量的碳水化合物成分，例如糖或脂肪替代物，该工艺包括一个去分支步骤。
当将淀粉转化为糖时，淀粉被解聚。这种解聚工艺由例如预处理步骤以及两个或三个连续工艺步骤组成，即，液化工艺、糖化工艺并且取决于所需最终产物，任选的异构化工艺。
当所需最终糖产物是例如高果糖糖浆时，右旋糖糖浆可以被转化为果糖。糖化工艺之后，将pH值增加至6-8范围内的值，例如pH 7.5，并且通过离子交换去除钙。然后，使用例如固定化葡萄糖异构酶将右旋糖糖浆转化成高果糖糖浆。
发酵产物的生产
可发酵的糖(例如，糊精、单糖，特别是葡萄糖)由酶糖化产生。这些可发酵的糖可以进一步纯化和/或转化成有用的糖产物。另外，这些糖可以在微生物发酵工艺中用作发酵进料来生产最终产物，例如醇(例如，乙醇和丁醇)、有机酸(例如，丁二酸、3-HP和乳酸)、糖醇(例如，甘油)、抗坏血酸中间物(例如，葡萄糖酸盐、2-酮基-D-葡萄糖酸盐、2,5-二酮基-D-葡萄糖酸盐和2-酮基-L-古洛糖酸)、氨基酸(例如，赖氨酸)、蛋白质(例如，抗体及其片段)。
在实施例中，将液化工艺步骤期间获得的可发酵的糖用于生产醇，特别是乙醇。在乙醇生产中，通常使用SSF工艺，其中糖化酶和发酵生物体(例如，酵母)一起添加，然后在30℃-40℃的温度下进行。
发酵中所使用的生物体取决于所需最终产物。典型地，如果乙醇是所需最终产物，则将酵母用作发酵生物体。在一些优选的实施例中，产乙醇微生物是酵母，并且特别地是酵母属、例如酿酒酵母的菌株(美国专利号4,316,956)。各种酿酒酵母是可商购的并且这些包括但不限于FALI(弗莱希曼酵母公司(Fleischmann's Yeast))、SUPERSTART(奥泰公司(Alltech))、FERMIOL(帝斯曼公司食品配料部(DSM Specialties))、RED STAR(乐斯福公司(Lesaffre))以及Angel醇酵母(天使酵母公司(Angel Yeast Company)，中国)。这些方法中所使用的起始酵母的量是在适合时间内有效产生商业上有效量乙醇的量(例如，在小于72小时内从具有25％-40％之间DS的底物产生至少10％乙醇)。酵母细胞通常以约104至约1012、并且优选约107至约1010有活力的酵母计数/mL发酵液的量来供应。在将酵母添加至醪液之后，使它典型地经受发酵约24-96小时，例如，35-60小时。温度在约26℃-34℃之间，典型地约32℃，并且pH是pH 3-6，例如，约pH 4-5。
除了发酵微生物(例如，酵母)以外，发酵还可以包括营养素以及另外的酶，这些另外的酶包括植酸酶。酵母在发酵中的使用在本领域中是熟知的。
在另外的实施例中，如本领域中已知的，适当发酵微生物的使用可产生发酵最终产物，包括例如甘油、1,3-丙二醇、葡萄糖酸盐、2-酮基-D-葡萄糖酸盐、2,5-二酮基-D-葡萄糖酸盐、2-酮基-L-古洛糖酸、丁二酸、乳酸、氨基酸及其衍生物。更特别地，当乳酸是所需最终产物时，可以使用乳杆菌属物种(干酪乳杆菌(L.casei))；当甘油或1,3-丙二醇是所需最终产物时，可以使用大肠杆菌；并且当2-酮基-D-葡萄糖酸盐、2,5-二酮基-D-葡萄糖酸盐以及2-酮基-L-古洛糖酸是所需最终产物时，柠檬泛菌可以用作发酵微生物。以上列举的列表只是实例并且本领域技术人员知道可以用于获得所需最终产物的许多发酵微生物。
从含未糊化淀粉的材料生产发酵产物的工艺
本发明涉及用于在含淀粉材料没有糊化(即，没有蒸煮)的情况下从含淀粉材料生产发酵产物的工艺(通常被称为“生淀粉水解”工艺)。可在不使包括含淀粉材料和水的水性浆料液化的情况下生产发酵产物(例如乙醇)。在一个实施例中，本发明的工艺包括：在低于初始糊化温度下，优选地在本发明的α-淀粉酶和一种或多种产碳水化合物源的酶的存在下，将(例如，经碾磨的)含淀粉材料(例如，颗粒状淀粉)糖化，以产生可以通过适合的发酵生物体发酵成发酵产物的糖。在这一实施例中，所需发酵产物(例如，乙醇)是从未糊化的(即，未蒸煮的)、优选经碾磨的谷粒(例如玉米)中产生的。
相应地，在一方面，本发明涉及用于从含淀粉材料生产发酵产物的工艺，该工艺包括使用产碳水化合物源的酶和发酵生物体，在低于含淀粉材料的初始糊化温度的温度下，在本发明的α-淀粉酶的存在下，将所述含淀粉材料同时糖化和发酵。
糖化和发酵还可以是分开的。因此，在另一方面，本发明涉及生产发酵产物的工艺，这些工艺包括以下步骤：
(i)在低于初始糊化温度的温度下将含生淀粉材料糖化；以及
(ii)使用发酵生物体进行发酵；
其中使用至少一种本发明的α-淀粉酶和任选地葡糖淀粉酶进行步骤(i)。
在一个实施例中，发酵生物体、优选酿酒酵母表达本发明的α-淀粉酶和/或葡糖淀粉酶。
在一个实施例中，发酵生物体、优选酿酒酵母表达本发明的α-淀粉酶和/或另一种α-淀粉酶。
在实施例中，其他α-淀粉酶是真菌或细菌来源的。在优选的实施例中，其他α-淀粉酶是真菌酸性稳定的α-淀粉酶。真菌酸性稳定的α-淀粉酶是在3.0至7.0的pH范围内并且优选地在3.5至6.5的pH范围内具有活性，包括在约4.0、4.5、5.0、5.5、和6.0的pH下的活性的α-淀粉酶。
在优选的实施例中，由在发酵中的发酵生物体表达的其他α-淀粉酶衍生自根毛霉属的菌株，优选菌株微小根毛霉，例如示于WO 2013/006756的SEQ ID NO:3中的菌株，例如具有黑曲霉接头和淀粉结合结构域的微小根毛霉α-淀粉酶杂合体，例如示于本文的SEQ IDNO:12中的杂合体或其变体。
在实施例中，其他α-淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:12的多肽的α-淀粉酶；
(ii)包含如下氨基酸序列的α-淀粉酶，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:12的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
在优选的实施例中，其他α-淀粉酶是示于SEQ ID NO:12中的、具有以下取代或取代的组合中的至少一个的α-淀粉酶的变体：D165M；Y141W；Y141R；K136F；K192R；P224A；P224R；S123H+Y141W；G20S+Y141W；A76G+Y141W；G128D+Y141W；G128D+D143N；P219C+Y141W；N142D+D143N；Y141W+K192R；Y141W+D143N；Y141W+N383R；Y141W+P219C+A265C；Y141W+N142D+D143N；Y141W+K192R V410A；G128D+Y141W+D143N；Y141W+D143N+P219C；Y141W+D143N+K192R；G128D+D143N+K192R；Y141W+D143N+K192R+P219C；G128D+Y141W+D143N+K192R；或G128D+Y141W+D143N+K192R+P219C(使用SEQ ID NO:12进行编号)。
在实施例中，α-淀粉酶衍生自具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉，优选披露为本文的SEQ ID NO:12，优选具有以下取代中的一个或多个：G128D、D143N，优选G128D+D143N(使用SEQ ID NO:12进行编号)。
在实施例中，糖化和/或发酵中存在的和/或添加的其他α-淀粉酶变体与本文的SEQ ID NO:12的多肽具有至少75％同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但低于100％同一性。
发酵之后，可以任选地例如通过蒸馏来回收发酵产物(例如乙醇)。典型地，在发酵期间存在一种或多种淀粉酶如一种或多种葡糖淀粉酶、和/或其他产碳水化合物源的酶、和/或一种或多种α-淀粉酶。葡糖淀粉酶以及其他产碳水化合物源的酶的实例包括使生淀粉水解的葡糖淀粉酶。一种或多种α-淀粉酶的实例包括酸性α-淀粉酶，例如酸性真菌α-淀粉酶，特别是本发明的α-淀粉酶。发酵生物体的实例包括酵母例如，酿酒酵母的菌株。术语“初始糊化温度”意指淀粉的糊化发生的最低温度。通常，在水中加热的淀粉在约50℃与75℃之间开始糊化；糊化的准确温度依赖于特定的淀粉，并能够由本领域的技术人员容易地确定。因此，初始糊化温度可以根据植物物种、植物物种的特定品种、以及生长条件而变化。在本发明的上下文中，给定含淀粉材料的初始糊化温度是使用Gorinstein和Lii，1992，
Figure BDA0003789758780000851
[淀粉]44(12):461-466所描述的方法，使5％的淀粉颗粒丧失双折射的温度。在开始该工艺之前，可以制备具有含淀粉材料的10-55w/w％干固体(DS)、优选25-45w/w％干固体、更优选30-40w/w％干固体的含淀粉材料(例如颗粒状淀粉)的浆料。该浆料可以包括水和/或工艺用水，例如釜馏物(逆流)、洗涤器水、蒸发器冷凝物或馏出物、由蒸馏得到的侧流汽提器水，或来自其他发酵产物设备的工艺用水。由于本发明的工艺是在低于该初始糊化温度下进行的并且因此没有发生显著的粘度增加，所以如果希望的话，可以使用高水平的釜馏物。在实施例中，水性浆料含有约1至约70vol.％、优选15-60vol.％、尤其是约30至50vol.％的水和/或工艺用水，如釜馏物(逆流)、洗涤器水、蒸发器冷凝物或馏出物、由蒸馏得到的侧线汽提器水，或来自其他发酵产物设备的工艺用水，或其组合等。含淀粉材料可以优选地通过干磨或湿磨将粒度降低至0.05至3.0mm，优选0.1-0.5mm来制备。在经受本发明的工艺之后，含淀粉材料中至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或优选至少99％的干固体被转化成可溶性淀粉水解物。本发明这一方面中的工艺是在低于初始糊化温度的温度下进行的，意味着温度典型地在30℃-75℃之间、优选地在45℃-60℃之间的范围内。在优选的实施例中，在25℃至40℃，例如28℃至35℃，例如30℃至34℃，优选约32℃的温度下进行该工艺。在实施例中，进行该工艺以使得糖水平，例如葡萄糖水平保持在低水平，例如低于6w/w％，例如低于约3w/w％，例如低于约2w/w％，例如低于约1w/w％，例如低于约0.5w/w％，或低于0.25w/w％，例如低于约0.1w/w％。通过简单地采用调节量的酶和发酵生物体就可以实现这样的低水平的糖。本领域的技术人员可容易地确定有待使用的酶和发酵生物体的剂量/数量。还可以选择酶和发酵生物体的所采用的量以在发酵液中维持低麦芽糖浓度。例如，麦芽糖水平可保持低于约0.5w/w％，例如低于约0.2w/w％。本发明的工艺可以在约3与7之间、优选地pH 3.5至6、或更优选地pH 4至5的pH下进行。在实施例中，发酵进行6至120小时，特别是24至96小时。
从含糊化淀粉的材料生产发酵产物的工艺
在这一方面，本发明涉及用于从含淀粉材料生产发酵产物、尤其是乙醇的工艺，这些工艺包括液化步骤，以及依次或同时进行的糖化和发酵步骤。因此，本发明涉及用于从含淀粉材料生产发酵产物的工艺，这些工艺包括以下步骤：
(a)在α-淀粉酶的存在下，在高于初始糊化温度的温度下，将含淀粉材料液化；
(b)使用本发明的变体α-淀粉酶和任选地葡糖淀粉酶将步骤(a)中获得的液化的材料糖化；以及
(c)使用发酵生物体进行发酵。
在实施例中，在液化之前、期间和/或之后添加蛋白酶，例如热稳定的丝氨酸蛋白酶、酸性真菌蛋白酶或金属蛋白酶。在实施例中，金属蛋白酶衍生自嗜热子囊菌属的菌株，例如，橙色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的菌株，尤其是橙色嗜热子囊菌CGMCCNo.0670。在另一个实施例中，蛋白酶是细菌蛋白酶，特别是丝氨酸蛋白酶，例如S8蛋白酶，更特别是衍生自火球菌属(Pyrococcus)或高温球菌属(Thermococcus)的菌株的蛋白酶，更特别是衍生自披露于US 6,358,726或本文的SEQ ID NO:10中的强烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)。
在实施例中，葡糖淀粉酶衍生自曲霉属的菌株，例如黑曲霉或泡盛曲霉；篮状菌属的菌株，尤其是埃默森篮状菌；或阿太菌属(Athelia)的菌株，尤其是罗耳阿太菌(Atheliarolfsii)；栓菌属的菌株，例如瓣环栓菌；或密孔菌属的菌株，或粘褶菌属的菌株，例如篱边粘褶菌或密粘褶菌，或黑层孔属的菌株；或其混合物。糖化步骤(b)和发酵步骤(c)可以依次或同时进行。当该工艺作为依次糖化和发酵工艺进行时，支链淀粉酶和/或蛋白酶可以在糖化和/或发酵期间添加，并且当步骤(b)和(c)同时(SSF工艺)进行时，在发酵之前或期间添加。支链淀粉酶和/或蛋白酶还可以有利地在液化之前(预液化处理)(即在步骤(a)之前或期间)和/或在液化之后(液化后处理)(即在步骤(a)之后)添加。支链淀粉酶最有利地是在液化之前或期间(即在步骤(a)之前或期间)添加。发酵产物，例如尤其是乙醇，可以任选地在发酵之后，例如通过蒸馏来回收。发酵生物体优选是酵母，优选是酿酒酵母的菌株。在优选的实施例中，酵母表达本发明的变体葡糖淀粉酶。在特别的实施例中，本发明的工艺在步骤(a)之前进一步包括以下步骤：
x)优选地通过碾磨(例如，使用锤磨机)来减小含淀粉材料的粒度；
y)形成包含该含淀粉材料和水的浆料。
在实施例中，粒度小于7号筛网，例如6号筛网。7号筛网通常用于常规的现有技术工艺中。水性浆料可以含有从10-55，例如25-45以及30-40w/w％干固体(DS)的含淀粉材料。将浆料加热至高于糊化温度并且可以添加α-淀粉酶变体以开始液化(稀释)。在实施例中，可以将浆料在步骤(a)中经受α-淀粉酶之前进行喷射蒸煮以进一步使该浆料糊化。在实施例中，液化可以作为三步热浆料工艺进行。在pH 4-6、优选4.5-5.5下，将浆料加热至60℃-95℃之间、优选70℃-90℃之间、例如优选80℃-85℃之间，并且任选地连同支链淀粉酶和/或蛋白酶、优选金属蛋白酶一起添加α-淀粉酶变体以开始液化(稀释)。在实施例中，然后，可以将浆料在95℃-140℃、优选100℃-135℃、例如105℃-125℃之间的温度下喷射蒸煮约1-15分钟、优选约3-10分钟、尤其是约5分钟。将浆料冷却至60℃-95℃并且添加更多的α-淀粉酶以及任选地支链淀粉酶和/或蛋白酶、优选金属蛋白酶，以完成水解(二次液化)。通常在pH 4.5-6.5，例如约4.8，或5.0-6.2的pH，例如5.0-6.0，例如5.0-5.5，例如约5.2，例如约5.4，例如约5.6，例如约5.8下进行液化工艺。可以使用本领域熟知的条件来进行糖化步骤(b)。例如，完全糖化工艺可以持续约24至约72小时，然而，通常仅在30℃至65℃之间的温度下，典型地约60℃下进行典型地40-90分钟的预糖化，随后在同时糖化和发酵工艺(SSF工艺)的发酵期间进行完全糖化。典型地在20℃-75℃，优选40℃-70℃，典型地约60℃的温度下并且在4与5之间的pH下、一般在约pH 4.5下进行糖化。在发酵产物，尤其是乙醇的生产中最广泛使用的工艺是同时糖化和发酵(SSF)工艺，在该工艺中，没有糖化的保持阶段，这意味着发酵生物体(例如酵母)和一种或多种酶可以一起添加。可以典型地在25℃至40℃、例如28℃至36℃、例如30℃至34℃、优选约32℃的温度下进行SSF。在实施例中，发酵进行6至120小时，特别是24至96小时。
从含糊化淀粉的材料生产糖浆的工艺
在这一方面，省略发酵步骤，然而，条件通常如以上“从含糊化淀粉的材料生产发酵产物的工艺”所描述。因此，在这一方面，本发明涉及从含淀粉材料生产糖浆的工艺，该工艺包括以下步骤：
a)在α-淀粉酶的存在下，在高于初始糊化温度的温度下，将该含淀粉材料液化；以及
b)在葡糖淀粉酶和本发明的变体α-淀粉酶的存在下，将步骤a)的产物糖化。
液化期间存在的和/或添加的蛋白酶
根据本发明，在一个实施例中，热稳定的蛋白酶可以连同α-淀粉酶，例如热稳定的α-淀粉酶，以及任选的产碳水化合物源的酶，特别是热稳定的葡糖淀粉酶或热稳定的支链淀粉酶，在液化期间存在和/或添加。
蛋白酶根据其催化机制分为以下几组：丝氨酸蛋白酶(S)、半胱氨酸蛋白酶(C)、天冬氨酸蛋白酶(A)、金属蛋白酶(M)、以及未知或还未分类的蛋白酶(U)，参见Handbook ofProteolytic Enzymes[蛋白水解酶手册],A.J.Barrett,N.D.Rawlings,J.F.Woessner(编辑),Academic Press[学术出版社](1998)，特别是概述部分。
在优选的实施例中，根据本发明使用的热稳定的蛋白酶是“金属蛋白酶”，其定义为属于EC 3.4.24(金属内肽酶)的蛋白酶；优选EC 3.4.24.39(酸性金属蛋白酶)。
为了确定给定蛋白酶是否是金属蛋白酶，参照上述“Handbook of ProteolyticEnzymes[蛋白水解酶手册]”以及其中指示的原则。可以对所有类型的蛋白酶进行这样的确定，而不论其是天然存在的或野生型蛋白酶；或基因工程化的或合成的蛋白酶。
可以使用任何适合的测定来测量蛋白酶活性，其中采用一种底物，该底物包括与所讨论的蛋白酶的特异性相关的肽键。测定pH值和测定温度同样适用于所讨论的蛋白酶。测定pH值的实例是pH 6、7、8、9、10或11。测定温度的实例是30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或80℃。
蛋白酶底物的实例为酪蛋白，例如Azurine-Crosslinked Casein(天青精-交联的酪蛋白，AZCL-酪蛋白)。在下文“材料与方法”部分中描述了两种蛋白酶测定，其中所谓的“AZCL-酪蛋白测定”是优选的测定。
对于在本发明的工艺中使用的蛋白酶的来源没有限制，只要其满足下文定义的热稳定性特性。
蛋白酶可以是例如野生型蛋白酶的变体，只要该蛋白酶具有本文定义的热稳定性特性。
在实施例中，蛋白酶在85℃具有高于60％，例如高于90％、例如高于100％、例如高于110％的热稳定性，如使用Zein-BCA测定确定的。
在实施例中，蛋白酶在85℃具有在60％-120％之间，例如在70％-120％之间、例如在80％-120％之间、例如在90％-120％之间、例如在100％-120％之间、例如110％-120％的热稳定性，如使用Zein-BCA测定确定的。
在一个实施例中，热稳定的蛋白酶是如上定义的金属蛋白酶的变体。在实施例中，在本发明的工艺中使用的热稳定的蛋白酶是真菌来源的，例如真菌金属蛋白酶，例如衍生自嗜热子囊菌属的菌株，优选橙色嗜热子囊菌的菌株，尤其是橙色嗜热子囊菌CGMCCNo.0670的真菌金属蛋白酶(分类为EC 3.4.24.39)。
在优选的实施例中，热稳定的蛋白酶是披露为以下的金属蛋白酶的变体：WO2003/048353中披露的SEQ ID NO:2的成熟部分或WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1的成熟部分，该变体具有选自以下突变：
D79L+S87P+A112P+D142L；
D79L+S87P+D142L；或
A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。
在实施例中，蛋白酶变体与披露于WO 2003/048353中的SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分或WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1的成熟部分具有至少75％同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％同一性。
热稳定的蛋白酶还可以衍生自细菌，特别是丝氨酸蛋白酶、更特别是S8蛋白酶，更特别是来自火球菌属物种或高温球菌属物种的S8蛋白酶。
在实施例中，热稳定的蛋白酶衍生自细菌火球菌属的菌株，例如强烈火球菌的菌株(pfu蛋白酶)。
在实施例中，蛋白酶是如美国专利号6,358,726-B1(宝酒造公司(Takara ShuzoCompany))的SEQ ID NO:1和本文的SEQ ID NO:10所示的蛋白酶。
在另一个实施例中，热稳定的蛋白酶是披露于本文的SEQ ID NO:10中的蛋白酶或与美国专利号6,358,726-B1中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:10具有至少80％同一性，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同一性的蛋白酶。
液化中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶
在实施例中，在本发明的工艺(即，油回收工艺和发酵产物生产工艺)的液化步骤a)中，存在和/或添加葡糖淀粉酶。
在优选的实施例中，液化步骤a)中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶衍生自青霉属的菌株，尤其是披露为WO 2011/127802的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:11中的草酸青霉菌的菌株。
在实施例中，葡糖淀粉酶与示于WO 2011/127802的SEQ ID NO:2中的成熟多肽或本文的SEQ ID NO:11具有至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。
在优选的实施例中，葡糖淀粉酶是示于WO 2011/127802的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:11中的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的、具有K79V取代(使用示于SEQ ID NO:11中的成熟序列进行编号)的变体，例如WO 2013/053801中披露的变体。
在优选的实施例中，液化中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶是草酸青霉菌葡糖淀粉酶，该草酸青霉菌葡糖淀粉酶具有K79V取代并且优选地进一步具有以下取代中的一个：
-P11F+T65A+Q327F；
-P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F(使用SEQ ID NO:11进行编号)。
在实施例中，葡糖淀粉酶变体与本文的SEQ ID NO:11的多肽的成熟部分具有至少75％同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％同一性。
葡糖淀粉酶可以按从0.1-100微克EP/g，例如0.5-50微克EP/g，例如1-25微克EP/g，例如2-12微克EP/g DS的量添加。
糖化和/或发酵中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶
在本发明的工艺(即，油回收工艺和发酵产物生产工艺)的糖化和/或发酵、优选同时糖化和发酵(SSF)中，存在和/或添加葡糖淀粉酶。
在实施例中，糖化和/或发酵中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶是真菌来源的，优选地来自曲霉属的菌株，优选黑曲霉、泡盛曲霉或米曲霉；或木霉属的菌株，优选里氏木霉；或篮状菌属的菌株，优选埃默森篮状菌；或栓菌属的菌株，优选瓣环栓菌；或密孔菌属的菌株；或粘褶菌属的菌株，例如篱边粘褶菌或密粘褶菌；或黑层孔属的菌株。
在实施例中，葡糖淀粉酶衍生自栓菌属，例如瓣环栓菌的菌株，例如示于本文的SEQ ID NO:7中的菌株。
在实施例中，葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:7的多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含如下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:7的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
在实施例中，葡糖淀粉酶衍生自篮状菌属，例如埃默森篮状菌的菌株，例如示于本文的SEQ ID NO:8中的菌株。
在实施例中，葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:8的多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含如下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:8的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
在实施例中，葡糖淀粉酶可以按如下量添加到糖化和/或发酵中：0.0001-20AGU/gDS，优选0.001-10AGU/g DS，尤其是在0.01-5AGU/g DS之间，例如0.1-2AGU/g DS。
包含葡糖淀粉酶的可商购的组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SANTMSUPER、SANTMEXTRA L、SPIRIZYMETMPLUS、SPIRIZYMETMFUEL、SPIRIZYMETMB4U、SPIRIZYMETMULTRA、SPIRIZYMETMEXCEL和AMGTME(来自诺维信公司)；OPTIDEXTM300、GC480、GC417(来自杜邦公司)；AMIGASETM和AMIGASETMPLUS(来自帝斯曼公司)；G-ZYMETMG900、G-ZYMETM和G990 ZR(来自杜邦公司)。
根据本发明的优选的实施例，在糖化和/或发酵中，葡糖淀粉酶是与本发明的变体α-淀粉酶组合存在的和/或添加的。下面描述了适合的α-淀粉酶的实例。
糖化和/或发酵中存在的和/或添加的α-淀粉酶
在实施例中，在本发明的工艺的糖化和/或发酵中存在和/或添加本发明的变体α-淀粉酶。在优选的实施例中，α-淀粉酶是真菌或细菌来源的。在优选的实施例中，α-淀粉酶是本发明的真菌酸性稳定的α-淀粉酶。真菌酸性稳定的α-淀粉酶是在3.0至7.0的pH范围内并且优选地在3.5至6.5的pH范围内具有活性，包括在约4.0、4.5、5.0、5.5、和6.0的pH下的活性的α-淀粉酶。
在优选的实施例中，糖化和/或发酵中存在的和/或添加的α-淀粉酶衍生自芽孢杆菌属的菌株，优选地是地衣芽孢杆菌的菌株，例如示于本文的SEQ ID NO:1中的菌株。
在实施例中，糖化和/或发酵中存在的和/或添加的α-淀粉酶选自本发明的变体α-淀粉酶，或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的本发明的变体α-淀粉酶。
在优选的实施例中，在糖化和/或发酵期间存在的和/或添加的葡糖淀粉酶与变体α-淀粉酶之间的比率优选地可以在500:1至1:1，例如从250:1至1:1、例如从100:1至1:1、例如从100:2至100:50、例如从100:3至100:70的范围内。
发酵培养基
进行发酵的环境通常称为“发酵培养基(fermentation media或fermentationmedium)”。发酵培养基包括发酵底物，即被发酵生物体代谢的碳水化合物源。根据本发明，发酵培养基可以包含用于一种或多种发酵生物体的一种或多种营养素和生长刺激剂。营养素和生长刺激剂在发酵领域中广泛使用，并且包括氮源，如氨；尿素、维生素和矿物质或其组合。
发酵生物体
术语“发酵生物体”是指适用于发酵工艺中并且能够生产所需发酵产物的任何生物体，包括细菌和真菌生物体，尤其是酵母。尤其适合的发酵生物体能够使糖(例如葡萄糖或麦芽糖)直接或间接发酵成(即，转化成)所需发酵产物(例如乙醇)。发酵生物体的实例包括真菌生物体，例如酵母。优选的酵母包括酵母属物种的菌株，特别是酿酒酵母。
在发酵(例如SSF)期间，有活力的发酵生物体的适合的浓度在本领域是熟知的，或可以由本领域的技术人员容易地确定。在一个实施例中，将发酵生物体(例如乙醇发酵酵母(例如，酿酒酵母))添加至发酵培养基中，使得每mL的发酵培养基的有活力的发酵生物体(例如酵母)计数在105至1012，优选107至1010的范围内，尤其是约5x107个。
可商购的酵母的实例包括例如RED STARTM和ETHANOL REDTM酵母(可获得自富酶泰斯公司/乐斯福公司(Fermentisis/Lesaffre)，美国)、FALI(可获得自弗莱希曼酵母公司(Fleischmann’s Yeast)，美国)、SUPERSTART和THERMOSACCTM新鲜酵母(可获得自乙醇技术公司(Ethanol Technology)，威斯康星州，美国)、BIOFERM AFT和XR(可获得自NABC-北美生物制品公司(North American Bioproducts Corporation)，佐治亚州，美国)、GERT STRAND(可获得自格特·斯特兰德公司(Gert Strand AB)，瑞典)以及FERMIOL(可获得自帝斯曼特殊产品公司(DSM Specialties))。
含淀粉材料
根据本发明可以使用任何适合的含淀粉材料。通常基于所需发酵产物来选择起始材料。适用于本发明的工艺中的含淀粉材料的实例包括全谷物、玉米、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、木薯淀粉、高粱、稻、豌豆、豆类或甜薯或其混合物或者由其衍生的淀粉，或谷类。还涵盖糯型(waxy type)与非糯型(non-waxy type)的玉米与大麦。在优选的实施例中，用于根据本发明的乙醇生产的含淀粉材料是玉米或小麦。
发酵产物
术语“发酵产物”意指通过包括使用发酵生物体进行的发酵步骤在内的工艺生产的产物。根据本发明涵盖的发酵产物包括醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇；多元醇如甘油、山梨醇和肌醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、琥珀酸、葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)；抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；和激素。在优选的实施例中，发酵产物是乙醇，例如，燃料乙醇；饮用乙醇，即中性饮用酒精；或用于消费性醇工业(例如，啤酒和酒)、乳品工业(例如，发酵的乳制品)、皮革工业和烟草工业的工业乙醇或产物。优选的啤酒类型包含爱尔啤酒(ale)、烈性黑啤酒(stout)、波特啤酒(porter)、拉格啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、麦芽酒(maltliquor)、低麦芽啤酒(happoushu)、高醇啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒或清淡啤酒。优选地，本发明的工艺用于生产醇，例如乙醇。根据本发明获得的发酵产物(例如乙醇)可以用作典型地与汽油共混的燃料。然而，在乙醇的情况下，它还可以用作饮用乙醇。
发酵产物的回收
发酵或SSF之后，可以将发酵产物与发酵培养基分开。可以蒸馏浆料以提取所需发酵产物(例如，乙醇)。可替代地，可以通过微滤或膜过滤技术从发酵培养基中提取所需发酵产物。还可以通过汽提或本领域熟知的其他方法来回收发酵产物。
植物
本发明还涉及分离的植物，例如，转基因植物、植物部分或植物细胞，其包含本发明的多核苷酸，从而以可回收的量表达和产生变体。变体可以从植物或植物部分回收。可替代地，含有变体的植物或植物部分可以按原样用于改善食品或饲料的质量，例如，改善营养价值、可口性以及流变特性，或破坏抗营养因子，或减少淀粉的糖化中需要的α-淀粉酶的量，以及任选地将葡萄糖发酵成发酵产物，例如醇。
转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草，例如草地早熟禾(蓝草，早熟禾属)；饲用草，例如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；温带草，例如翦股颖属(Agrostis)；以及谷物，例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱和玉蜀黍(玉米)。
双子叶植物的实例是烟草、豆科植物(例如羽扇豆、马铃薯、糖甜菜、豌豆、菜豆和大豆)以及十字花科植物(十字花科)(例如花椰菜、油菜籽和紧密相关的模式生物体拟南芥)。
植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子和块茎以及包含这些部分的独立组织，例如表皮、叶肉、薄壁组织、维管组织、分生组织。特定植物细胞区室，例如叶绿体、质外体(apoplast)、线粒体、液泡、过氧化物酶体以及细胞质也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论是何种组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，例如分离以有助于本发明的利用的特定组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚、胚乳、糊粉和种皮。
同样包含于本发明范围内的是此类植物、植物部分以及植物细胞的子代。
表达变体的转基因植物或植物细胞可以根据本领域已知的方法来构建。简而言之，通过如下方法构建植物或植物细胞：将编码变体的一个或多个表达构建体结合到植物宿主基因组或叶绿体基因组中，并且使所得经修饰的植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。
表达构建体宜为包含编码变体的多核苷酸的核酸构建体，该多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当的调节序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含用于鉴定整合了此表达构建体的植物细胞的选择性标记，和将此构建体引入所讨论的植物所必需的DNA序列(后者取决于所用的引入DNA的方法)。
例如，基于希望在何时、何处、以及如何表达变体来确定对调节序列如启动子和终止子序列和任选的信号或转运序列的选择。例如，编码变体的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且可以使基因产物靶向特定组织或植物部分，如种子或叶。调节序列由例如Tague等人,1988,Plant Physiology[植物生理学]86：506描述。
对于组成型表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1、或稻肌动蛋白1启动子(Franck等人.,1980,Cell 21:285-294；Christensen等人,1992,Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]18:675-689；Zhang等人,1991,Plant Cell[植物细胞]3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是以下各项的启动子，例如来自贮藏库组织(例如种子、马铃薯块茎、和果实)(Edwards和Coruzzi,1990,Ann.Rev.Genet.[遗传学年度评论]24:275-303)、或来自代谢库组织(例如分生组织)(Ito等人,1994,Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]24:863-878)、种子特异性启动子，例如来自水稻的谷蛋白、醇溶谷蛋白、球蛋白、或白蛋白启动子(Wu等人,1998,Plant Cell Physiol.[植物与细胞生理学]39:885-889)、来自豆球蛋白B4的蚕豆启动子和来自蚕豆的未知种子蛋白基因(Conrad等人.,1998,J.Plant Physiol.[植物生理学杂志]152:708-711)、来自种子油体蛋白的启动子(Chen等人.,1998,Plant Cell Physiol.[植物与细胞生理学]39:935-941)、来自欧洲油菜的贮藏蛋白napA启动子、或本领域已知的任何其他种子特异性启动子，例如，如在WO 91/14772中所描述的。此外，启动子可以是叶特异性启动子，例如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等人.,1993,Plant Physiol.[植物生理学]102:991-1000)、小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(Mitra和Higgins,1994,Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]26:85-93)、来自水稻的aldP基因启动子(Kagaya等人,1995,Mol.Gen.Genet.[分子与普通遗传学]248:668-674)、或伤口诱导型启动子(如马铃薯pin2启动子)(Xu等人.,1993,Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]22:573-588)。同样地，该启动子可以通过例如温度、干旱或盐度变化等非生物处理来诱导，或通过外源地应用使该启动子活化的物质(例如，乙醇；雌激素；植物激素，例如乙烯、脱落酸及赤霉酸；及重金属)来诱导。
启动子增强子元件也可以用于实现变体在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是置于启动子与编码变体的多核苷酸之间的内含子。例如，Xu等人,1993,同上，披露了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。
选择性标记基因及表达构建体的任何其他部分可以选自本领域中可用的那些。
可以根据本领域中已知的常规技术将核酸构建体结合到植物基因组中，这些常规技术包括土壤杆菌介导的转化、病毒介导的转化、微注射、粒子轰击、生物射弹转化、以及电穿孔(Gasser等人，1990，Science[科学]244:1293；Potrykus，1990，Bio/Technology[生物/技术]8:535；Shimamoto等人，1989，Nature[自然]338:274)。
根癌土壤杆菌介导的基因转移是用于产生转基因双子叶植物(关于综述，请参见Hooykas和Schilperoort,1992,Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]19:15-38)并且用于转化单子叶植物的方法，尽管对于这些植物可以使用其他转化方法。一种用于产生转基因单子叶植物的方法是胚性愈伤组织或发育的胚的粒子轰击(用转化DNA包衣的微观金或钨颗粒)(Christou,1992,Plant J.[植物杂志]2:275-281；Shimamoto,1994,Curr.Opin.Biotechnol.[生物技术当前述评]5:158-162；Vasil等人,1992,Bio/Technology[生物/技术]10:667-674)。用于转化单子叶植物的替代方法是基于原生质体转化，如由Omirulleh等人,1993,Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]21:415-428所描述。另外的转化方法包括美国专利号6,395,966和7,151,204(两者都通过引用以其全文并入本文)中所描述的那些。
在转化后，根据本领域熟知的方法选出已结合了表达构建体的转化体，并使其再生成为完整植物。通常设计转化程序用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两个独立的T-DNA构建体的共转化或利用特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。
除用本发明的构建体直接转化特定植物基因型之外，还可以通过使具有构建体的植物与缺乏该构建体的第二植物杂交来产生转基因植物。例如，可以通过杂交将编码变体的构建体引入特定植物品种中，无需总是直接地转化该给定品种的植物。因此，本发明不仅涵盖了从根据本发明已经转化的细胞直接再生的植物，而且还涵盖了此类植物的子代。如本文所用，子代可以是指根据本发明制备的亲本植物的任何世代的后代。此类子代可以包括根据本发明制备的DNA构建体。杂交导致通过将起始系用供体植物系交叉授粉，将转基因引入植物系。此类步骤的非限制性实例描述于美国专利号7,151,204中。
植物可以通过回交转化工艺生成。例如，植物包括被称为回交转化的基因型、种系、近交体、或杂交体的植物。
可以使用遗传标记以协助本发明的一种或多种转基因从一个遗传背景渗入到另一个。标记协助的选择提供了相对于常规育种的优势，在于其可以用于避免由表型变异引起的错误。另外，遗传标记可以在特定杂交的个别子代中提供有关良种种质相对程度的数据。例如，当具有所希望性状并且另外具有非农艺学所希望的遗传背景的植物与良种亲本杂交时，可以使用遗传标记来选择不仅具有感兴趣的性状，还具有相对较大比例所希望种质的子代。以此方式，使一种或多种性状渗入特定遗传背景所需的世代数得以最小化。
本发明还涉及产生本发明的变体的方法，这些方法包括：(a)在有益于产生该变体的条件下培养包含编码该变体的多核苷酸的转基因植物或植物细胞；以及(b)回收该变体。
通过以下编号的实施例进一步说明本发明。
实施例1.一种亲本α-淀粉酶的α-淀粉酶变体，该α-淀粉酶变体在对应于SEQ IDNO:1的多肽的位置196、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、28、38、39、43、54、56、57、64、67、68、70、71、86、89、90、94、96、99、101、103、107、108、110、113、114、117、127、134、138、142、150、151、152、156、169、171、174、179、183、193、199、200、204、205、207、208、209、212、218、221、222、224、233、241、245、259、275、278、281、282、283、284、285、308、323、335、348、359、382、386、388、392、394、396、412、414、417、424、428、457、459、466、479、489、511、533、534、542、543、545、547、549、550、551、560、566、570、574、575、576、577、578、580、581、582、589、592、599、603、605、608、614、619或626的一个或多个位置处包含改变，其中该变体具有α-淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ IDNO:4的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性，但小于100％序列同一性。
实施例2.根据实施例1所述的α-淀粉酶变体，该α-淀粉酶变体在对应于SEQ IDNO:1的多肽的位置196、199、64、96、150、179、207、222、284和603的一个或多个位置处包含取代，其中该变体具有α-淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、或SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性，但小于100％序列同一性。
实施例3.根据实施例1所述的变体，该变体包含选自由以下组成的组的改变：E1*、T2*、A3*、N4*、K5*、S6*、N7*、K8*、V9*、V9D、V9L、T10*、T10I、A11*、S12*、S12P、S13*、V14*、V14I、K15*、N16*、N16S、N28R、N28W、R38H、R38Y、D39R、A43D、A43T、A43V、K54I、G56P、G56W、N57P、R64S、Y67T、Y67W、W68S、W68Y、Y70F、Q71E、Q71N、Q86R、K89R、D90E、A94D、E96H、E96K、G99N、K101R、I103Y、V107T、I108L、I108P、H110D、S113D、S113F、S113G、S113H、S113Q、S113W、S113Y、D114Q、A117T、N127D、Q134E、Q134L、Q134M、Q134N、Q134T、Q134W、W138Y、W142E、L150F、L150H、L150M、L150S、L150V、L150W、L150Y、G151F、G151S、G151W、G151Y、L152M、N156K、N156R、F169H、E171Q、L174I、D179G、D179S、Y183F、Y183I、D193S、D193DQ、D193DY、D193DQY、D193SQY N196W、S199G、Q200W、N204D、I205Y、N207W、T208N、T208S、S209L、F212W、L218F、L218W、S221N、A222E、A222I、A222V、R224K、N233S、H241N、S245N、H259Y、S275L、S275N、T278N、T278W、T278Y、N281Q、N281S、D282P、D283*、D283A、D283P、E284Q、E285V、T308M、T308Y、R323K、S335K、S335Q、S335R、T348K、E359Y、A382T、S386D、S388W、N392R、N392W、S394K、K396S、Q412W、A414K、K417W、K417Y、A424P、A428S、Q457L、Q457R、T459M、A466V、Q479QP、L489Q、E511D、G533H、Y534H、Q542K、V543P、A545P、I547Y、K549*、K549Y、H550*、H550Y、D551*、G560P、A566P、N570H、M574MW、M574W、Y575W、T576Y、L577Y、T578Y、P580*、E581*、N582*、K589F、F592FK、V599W、N603W、P605S、D608Y、L614W、G619W、和H626*。
实施例4.根据实施例2所述的变体，该变体包含选自由以下组成的组的改变：R64S、E96K、L150Y、L150W、L150H、L150M、L150F、D179S、N196W、S199G、N207W、A222E、A222I、A222V、E284Q、N603W、和H626*。
实施例5.根据实施例1-4中任一项所述的变体，该变体相对于亲本具有改善的特性，其中该改善的特性是与亲本α-淀粉酶、特别是披露为SEQ ID NO:1的α-淀粉酶相比在pH4.0、32℃至37℃、优选32℃下的增加的pH稳定性。
实施例6.根据实施例1-5中任一项所述的变体，该变体包含选自以下的取代或取代的组合：
A222I；
A222V；
A222E；
S199G；
N196W；
N207W；
N603W；
L150Y；
L150W；
L150H；
L150M；
L150F；
R64S：
E96K；
D179S；
E284Q；
N207W+N603W；
N196W+N207W；
N196W+N603W；
N196W+N207W+N603W；
A222I+S199G+N196W；
A222V+S199G+N196W；
A222E+S199G+N196W；
A222V+S199G+N196W+L150Y；
L150H+S199G+A222I；
L150M+S199G+A222V；
N196W+S199G+A222V+N603W；
L150F+N196W+S199G+A222I；
L150M+N196W+S199G+A222V；
L150W+S199G+A222V；
L150H+N196W+S199G+A222V；
L150W+N196W+S199G+A222I；
L150Y+S199G+A222V；
E96K+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
R64S+E96K+N196W+S199G+A222V；
其中该变体具有α-淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性，但小于100％序列同一性。
实施例7.根据实施例1-6中任一项所述的变体，该变体包含N-末端缺失，更特别地包含SEQ ID NO:1的至少氨基酸11至626、SEQ ID NO:1的至少氨基酸12至626、例如SEQ IDNO:1的至少氨基酸13至626。
实施例8.根据实施例1-7中任一项所述的变体，其中该α-淀粉酶进一步包含C-末端缺失，特别是H626*。
实施例9.根据实施例1-5中任一项所述的变体α-淀粉酶，该变体α-淀粉酶包含选自以下的改变或改变的组合：
N28W；
N196W；
S199G；
N196W+V599W；
N196W+H550Y+P605S；
N196W+A545P+T576Y；
N196W+K549Y+G560P；
I108P+Y183I+N196W+I205Y；
N196W+R323K；
N196W+D283P；
W138Y+N196W；
L150W；
N196W+N392W+K417W；
N196W+N392R+K417W；
N196W+K549*+H550*+D551*；
N196W+P580*+E581*+N582*；
N196W+F592FK；
N28W+N196W+N207W+S386D+N603W；
R38Y+N196W；
N196W+H259Y；
N196W+Q412W；
N196W+F212W；
N196W+V599W；
N196W+H550Y+P605S；
N196W+H550Y+K589F；
N196W+H550Y+D608Y；
N196W+M574W+L614W；
N196W+G533H+M574W+L614W；
N196W+V543P+N570H；
N196W+G533H+Y575W+L614W；
N196W+A545P+T576Y；
N196W+A566P+T578Y；
N196W+K549Y+G560P；
N196W+A566P+L577Y；
N196W+I547Y+G560P；
N196W+M574MW；
N196W+K549*+H550*+D551*+M574MW+P580*+E581*+N582*+F592FK；
N196W+L614W+G619W；
N28W+I108P+N196W+N207W+S386D+A466V+Q542K+N603W；
N28W+I108P+N196W+N207W+S386D+N603W；
N196W+D282P+D283*；
W138Y+N196W；
N28W+N196W+N207W+S386D+N603W；
N196W+S388W+A424P；
N196W+S388W+A424P+L489Q；
A117T+N196W+H550Y+D608Y；
N196W+Q457R+Y575W+L614W；
N196W+S199G；
N196W+A222V；
N196W+A222E；
N196W+A222I；
S199G+A222V；
S199G+A222E；
S199G+A222I；
N196W+S199G+A222I；
Q134L；
L150W+N156K+N196W+S199G+A222V；
L150Y+N156K+N196W+S199G+A222I；
L150W+N196W+S199G+A222I+A428S；
L150F+N156K+N196W+S199G+A222I；
L150Y+N156R+N196W+A222V；
L150M+N156R+N196W+S199G+A222I；
L150M+N156R+N196W+A222V；
L150Y+N156R+N196W+S199G+A222V；
L150M+N156K+N196W+S199G+A222V；
L150Y+N156R+N196W+A222I；
L150H+N156R+N196W+S199G+A222I；
L150H+N156K+N196W+A222V；
L150W+N156R+N196W+A222I；
L150F+N156R+N196W+A222I；
L150F+N156K+N196W+S199G+A222V；
L150H+N156K+N196W+S199G+A222V；
L150F+N156R+S199G+A222I；
L150M+N156K+N196W+A222V；
L150W+N156K+N196W+S199G+A222I；
N156K+N196W+S199G+A222V；
L150Y+N156R+S199G+A222I；
L150M+N156R+S199G+A222I；
L150W+N156K+S199G+A222V；
L150W+N156R+N196W+S199G+A222V；
L150Y+N156R+N196W；
N156K+N196W+A222V；
N156K+N196W+S199G；
N156R+S199G+A222V；
S113H+N196W+S199G+A222V；
Q71E+S113H+N196W+S199G+A222V；
N196W+S199G+A222V+D283A；
N196W+S199G+A222V+D283P；
W142E+D193SQY+N196W+S199G+A222V+R224K；
E96K+K101R+L150W+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V；
E96K+K101R+L150Y+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V+E284Q；
E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V+E284Q；
S113Q+Q134E+N196W+S199G+A222V；
S113D+Q134N+N196W+S199G+A222V；
S113F+N196W+S199G+A222V；
E171Q+N196W+S199G+N204D+A222V；
N196W+S199G+A222V+H241N+S245N+T278N+E284Q+E285V；
N196W+S199G+A222V+S394K+A414K+K417Y；
N196W+S199G+A222V+E359Y+S394K+K396S+A414K+K417Y；
R38H+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
R38H+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
V107T+H110D+N196W+S199G+A222V；
Q134T+L150Y+N196W+S199G+A222V；
S113F+L150W+N196W+S199G+A222V；
S113F+L150Y+N196W+S199G+A222V；
E96K+K101R+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V；
E96K+K101R+L150Y+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V；
E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V；
E96K+K101R+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V+E284Q；
E96K+K101R+L150W+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V+E284Q；
N28R+Q86R+N196W+S199G+A222V；
N28R+Q86R+K89R+N196W+S199G+A222V；
G56P+N196W+S199G+S209L+A222V；
E96K+N196W+S199G+A222V；
T10I+N196W+S199G+A222V；
D39R+N196W+S199G+A222V；
R64S+N196W+S199G+A222V；
T10I+D39R+R64S+N196W+S199G+A222V；
T10I+D39R+N196W+S199G+A222V；
D39R+E96K+N196W+S199G+A222V；
R64S+D90E+E96K+N196W+S199G+A222V；
R38H+D39R+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
R38H+R64S+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
T10I+R38H+R64S+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
T10I+R38H+R64S+D90E+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
T10I+R38H+D39R+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
R38H+D39R+R64S+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
T10I+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+N196W+S199G+A222V+E284Q；
R64S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
T10I+D39R+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D193SQY+N196W+S199G+A222V；
Q134T+N196W+S199G+A222V；
L174I+N196W+S199G+T208N+A222V；
Y183F+N196W+S199G+T208S+A222V；
N127D+N156R+N196W+S199G+A222V；
Q134T+L150W+N196W+S199G+A222V；
N57P+N196W+S199G+A222V；
N196W+S199G+Q200W+A222V；
T10I+D39R+R64S+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
T10I+D39R+R64S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
T10I+R64S+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+R64S+D90E+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
T10I+R64S+E96K+N196W+S199G+A222V；
T10I+D39R+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+R64S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
R64S+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+R64S+N196W+S199G+A222V；
S12*+S13*+V14*+K15*+N16*+I103Y+N196W+S199G+A222V+N233S+T308Y；
S12*+S13*+V14*+K15*+N16*+A43D+I103Y+N196W+S199G+A222V+N233S+T308M；
V9L+S12P+V14I+N16S+A43T+N196W+S199G+A222V；
S12*+S13*+V14*+K15*+N16*+N196W+S199G+A222V；
N28W+N196W+S199G+A222V；
N196W+S199G+A222V+N392W+K417W；
T10I+D39R+E96K+N196W+S199G+A222V；
V9D+R38H+N196W+S199G+A222V+T348K；
S113F+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V；
S113Y+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V；
S113W+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V；
S113F+N156K+N196W+S199G+A222V；
S113Y+N156K+N196W+S199G+A222V；
S113W+N156K+N196W+S199G+A222V；
W138Y+L150V+N196W+S199G+A222V；
W138Y+L150V+D179G+N196W+S199G+A222V；
W138Y+L150V+N196W+S199G+L218W+A222V；
E96K+Q134L+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
E96K+Q134L+L150Y+N156R+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
E96K+L150Y+N156R+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
R38H+E96K+G99N+K101R+Q134L+D179S+N196W+S199G+S221N+A222V；
R38H+E96K+G99N+K101R+Q134L+D179S+N196W+S199G+A222V；
R38H+E96K+G99N+K101R+Q134L+L150Y+N156R+D179S+N196W+S199G+A222V；
R38H+E96K+G99N+K101R+L150Y+N156R+D179S+N196W+S199G+A222V；
L150F+N196W+S199G+A222I；
Q134L+L150F+N156R+N196W+S199G+A222I；
Q134L+L150H+N156R+N196W+S199G+A222I；
Q134L+L150M+N156K+N196W+S199G+A222I；
Q134L+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222I+Q457L；
Q134M+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I；
Q134W+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I；
L150W+L152M+N156K+N196W+S199G+A222I；
S113F+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I；
S113Y+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I；
L150W+G151W+N156K+N196W+S199G+A222I；
L150W+G151S+N156K+N196W+S199G+A222I；
S113F+L150W+G151S+N156K+N196W+S199G+A222I；
Y67W+W68Y+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I；
A43V+L150M+G151F+N156R+N196W+S199G+A222I；
L150M+G151Y+N156R+N196W+S199G+A222I；
L150M+G151W+N156R+N196W+S199G+A222I；
L150M+G151S+N156R+N196W+S199G+A222I+Y534H；
S113F+L150M+G151S+N156R+N196W+S199G+A222I；
Q134L+L150F+N156K+N196W+S199G+A222I；
L150W+G151F+N156K+N196W+S199G+A222I；
L150W+G151Y+N156K+N196W+S199G+A222I；
Y67W+W68Y+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I；
G56W+N57P+Y67W+W68Y+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I；
K54I+Y67W+W68S+S113G+N196W+S199G+A222V+A382T；
K54I+Y67W+W68S+S113G+D114Q+L150V+N196W+S199G+A222V；
K54I+Y67W+W68S+S113G+W138Y+N196W+S199G+A222V；
K54I+Y67W+W68S+S113G+D114Q+W138Y+L150V+N196W+S199G+A222V；
Q134L+N196W+S199G+A222V；
V107T+I108L+H110D+F169H+N196W+S199G+A222V；
N196W+S199G+A222V+N392W+K417W；
V9D+R38H+N196W+S199G+A222V+T348K；
E96H+L150Y+N156R+N196W+S199G+A222V+E284Q；
Q134L+L150Y+N196W+S199G+A222V；
L150Y+N196W+S199G+A222V；
Q134L+L150Y+N196W+S199G+A222V；
L150F+N156R+N196W+S199G+A222V；
L150H+N156R+N196W+S199G+A222V；
Q134L+L150F+N156R+N196W+S199G+A222V；
Q134L+L150H+N156R+N196W+S199G+A222V；
Q134L+L150F+N156K+N196W+S199G+A222V；
Q134L+L150H+N156K+N196W+S199G+A222V；
Q134L+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V；
L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V；
Q134L+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V；
Q134W+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V；
Q134M+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V；
Q134M+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V+A466V；
L150Y+L152M+N156K+N196W+S199G+A222V；
L150S+N196W+S199G+A222V；
N196W+S199G+A222V+N281S；
Y67T+N196W+S199G+A222V；
Q71N+N196W+S199G+A222V；
Q71N+A94D+N196W+S199G+A222V；
N196W+S199G+L218F+A222V；
N196W+S199G+L218W+A222V；
N196W+S199G+A222V+T278W；
N196W+S199G+A222V+T278W+T459M；
N196W+S199G+A222V+T278Y；
N196W+S199G+A222V+S275N；
N196W+S199G+A222V+S275L；
N196W+S199G+A222V+S335Q；
N196W+S199G+A222V+S335K；
N196W+S199G+A222V+S335R；
N196W+S199G+L218W+A222V+S335K；
N196W+S199G+L218W+A222V+S335Q；
Y67W+N196W+S199G+A222V；
N196W+S199G+A222V+N281Q；
L150M+N156R+N196W+S199G+A222V；
Q134L+L150M+N156R+N196W+S199G+A222V；
Q134L+L150M+N156K+N196W+S199G+A222V；
D39R+N196W+S199G+A222V+N281Q+E284Q；
D39R+N196W+S199G+A222V+E284Q+Q479QP；
D39R+Y70F+N196W+S199G+A222V+E284Q；
N28W+D39R+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+N196W+S199G+N207W+A222V+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+D39R+N196W+S199G+N207W+A222V+E284Q；
N196W+N207W；
N196W+N207W+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+N196W+N207W+E284Q；
L150Y+N196W+S199G+A222V；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+L150Y+N196W+S199G+A222V；
E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+N207W+T208N+A222V；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V；
Q134L+L150H+N156R+N196W+S199G+A222I+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+Q134L+L150H+N156R+N196W+S199G+A222I；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+Q134L+L150H+N156R+N196W+S199G+N207W+A222I+E284Q；
E96K+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+E96K+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
R64S+E96K+N196W+S199G+N207W+A222V；
N28W+D39R+N196W+S199G+N207W+A222V+E284Q；
D39R+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+N196W+S199G+N207W+A222V+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+D39R+N196W+S199G+A222V+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+N196W+N207W+E511D；
L150Y+N196W+S199G+N207W+A222V；
E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V；
E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+N207W+T208N+A222V+E284Q；
Q134L+L150H+N156R+N196W+S199G+A222I；
N28W+E96K+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
R64S+E96K+N196W+S199G+A222V；
R64S+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+R64S+E96K+N196W+S199G+A222V；
并且其中该变体具有α-淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性，但小于100％序列同一性。
实施例10.根据实施例9所述的变体，其中该α-淀粉酶进一步包含C-末端缺失，特别是H626*。
实施例11.根据实施例1-5中任一项所述的变体α-淀粉酶，该变体α-淀粉酶包含选自以下的改变的组合：
N28W+H626*；
S199G+H626*；
N196W+V599W+H626*；
N196W+H550Y+P605S+H626*；
N196W+A545P+T576Y+H626*；
N196W+K549Y+G560P+H626*；
I108P+Y183I+N196W+I205Y+H626*；
N196W+R323K+H626*；
N196W+D283P+H626*；
W138Y+N196W+H626*；
L150W+H626*；
N196W+N392W+K417W+H626*；
N196W+N392R+K417W+H626*；
N196W+K549*+H550*+D551*+H626*；
N196W+P580*+E581*+N582*+H626*；
N196W+F592FK+H626*；
N28W+N196W+N207W+S386D+N603W+H626*；
R38Y+N196W+H626*；
N196W+H259Y+H626*；
N196W+Q412W+H626*；
N196W+F212W+H626*；
N196W+V599W+H626*；
N196W+H550Y+P605S+H626*；
N196W+H550Y+K589F+H626*；
N196W+H550Y+D608Y+H626*；
N196W+M574W+L614W+H626*；
N196W+G533H+M574W+L614W+H626*；
N196W+V543P+N570H+H626*；
N196W+G533H+Y575W+L614W+H626*；
N196W+A545P+T576Y+H626*；
N196W+A566P+T578Y+H626*；
N196W+K549Y+G560P+H626*；
N196W+A566P+L577Y+H626*；
N196W+I547Y+G560P+H626*；
N196W+M574MW+H626*；
N196W+K549*+H550*+D551*+M574MW+P580*+E581*+N582*+F592FK+H626*；
N196W+L614W+G619W+H626*；
N28W+I108P+N196W+N207W+S386D+A466V+Q542K+N603W+H626*；
N28W+I108P+N196W+N207W+S386D+N603W+H626*；
N196W+D282P+D283*+H626*；
W138Y+N196W+H626*；
N28W+N196W+N207W+S386D+N603W+H626*；
N196W+S388W+A424P+H626*；
N196W+S388W+A424P+L489Q+H626*；
A117T+N196W+H550Y+D608Y+H626*；
N196W+Q457R+Y575W+L614W+H626*；
N196W+S199G；
N196W+A222V；
N196W+A222E；
N196W+A222I；
S199G+A222V；
S199G+A222E；
S199G+A222I；
N196W+S199G+A222I；
Q134L+H626*；
L150W+N156K+N196W+S199G+A222V；
L150Y+N156K+N196W+S199G+A222I；
L150W+N196W+S199G+A222I+A428S；
L150F+N156K+N196W+S199G+A222I；
L150Y+N156R+N196W+A222V；
L150M+N156R+N196W+S199G+A222I；
L150M+N156R+N196W+A222V；
L150Y+N156R+N196W+S199G+A222V；
L150M+N156K+N196W+S199G+A222V；
L150Y+N156R+N196W+A222I；
L150H+N156R+N196W+S199G+A222I；
L150H+N156K+N196W+A222V；
L150W+N156R+N196W+A222I；
L150F+N156R+N196W+A222I；
L150F+N156K+N196W+S199G+A222V；
L150H+N156K+N196W+S199G+A222V；
L150F+N156R+S199G+A222I；
L150M+N156K+N196W+A222V；
L150W+N156K+N196W+S199G+A222I；
N156K+N196W+S199G+A222V；
L150Y+N156R+S199G+A222I；
L150M+N156R+S199G+A222I；
L150W+N156K+S199G+A222V；
L150W+N156R+N196W+S199G+A222V；
L150Y+N156R+N196W；
N156K+N196W+A222V；
N156K+N196W+S199G；
N156R+S199G+A222V；
S113H+N196W+S199G+A222V；
Q71E+S113H+N196W+S199G+A222V；
N196W+S199G+A222V+D283A；
N196W+S199G+A222V+D283P；
W142E+D193SQY+N196W+S199G+A222V+R224K；
E96K+K101R+L150W+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V；
E96K+K101R+L150Y+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V+E284Q；
E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V+E284Q；
S113Q+Q134E+N196W+S199G+A222V；
S113D+Q134N+N196W+S199G+A222V；
S113F+N196W+S199G+A222V；
E171Q+N196W+S199G+N204D+A222V；
N196W+S199G+A222V+H241N+S245N+T278N+E284Q+E285V；
N196W+S199G+A222V+S394K+A414K+K417Y；
N196W+S199G+A222V+E359Y+S394K+K396S+A414K+K417Y；
R38H+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
R38H+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
V107T+H110D+N196W+S199G+A222V；
Q134T+L150Y+N196W+S199G+A222V；
S113F+L150W+N196W+S199G+A222V；
S113F+L150Y+N196W+S199G+A222V；
E96K+K101R+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V；
E96K+K101R+L150Y+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V；
E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V；
E96K+K101R+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V+E284Q；
E96K+K101R+L150W+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V+E284Q；
N28R+Q86R+N196W+S199G+A222V；
N28R+Q86R+K89R+N196W+S199G+A222V；
G56P+N196W+S199G+S209L+A222V；
E96K+N196W+S199G+A222V；
T10I+N196W+S199G+A222V；
D39R+N196W+S199G+A222V；
R64S+N196W+S199G+A222V；
T10I+D39R+R64S+N196W+S199G+A222V；
T10I+D39R+N196W+S199G+A222V；
D39R+E96K+N196W+S199G+A222V；
R64S+D90E+E96K+N196W+S199G+A222V；
R38H+D39R+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
R38H+R64S+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
T10I+R38H+R64S+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
T10I+R38H+R64S+D90E+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
T10I+R38H+D39R+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
R38H+D39R+R64S+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
T10I+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+N196W+S199G+A222V+E284Q；
R64S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
T10I+D39R+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D193SQY+N196W+S199G+A222V；
Q134T+N196W+S199G+A222V；
L174I+N196W+S199G+T208N+A222V；
Y183F+N196W+S199G+T208S+A222V；
N127D+N156R+N196W+S199G+A222V；
Q134T+L150W+N196W+S199G+A222V；
N57P+N196W+S199G+A222V；
N196W+S199G+Q200W+A222V；
T10I+D39R+R64S+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
T10I+D39R+R64S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
T10I+R64S+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+R64S+D90E+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
T10I+R64S+E96K+N196W+S199G+A222V；
T10I+D39R+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+R64S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
R64S+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+R64S+N196W+S199G+A222V；
S12*+S13*+V14*+K15*+N16*+I103Y+N196W+S199G+A222V+N233S+T308Y；
S12*+S13*+V14*+K15*+N16*+A43D+I103Y+N196W+S199G+A222V+N233S+T308M；
V9L+S12P+V14I+N16S+A43T+N196W+S199G+A222V；
S12*+S13*+V14*+K15*+N16*+N196W+S199G+A222V；
N28W+N196W+S199G+A222V；
N196W+S199G+A222V+N392W+K417W；
T10I+D39R+E96K+N196W+S199G+A222V；
V9D+R38H+N196W+S199G+A222V+T348K；
S113F+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
S113Y+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
S113W+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
S113F+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
S113Y+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
S113W+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
W138Y+L150V+N196W+S199G+A222V+H626*；
W138Y+L150V+D179G+N196W+S199G+A222V+H626*；
W138Y+L150V+N196W+S199G+L218W+A222V+H626*；
E96K+Q134L+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q+H626*；
E96K+Q134L+L150Y+N156R+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q+H626*；
E96K+L150Y+N156R+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q+H626*；
R38H+E96K+G99N+K101R+Q134L+D179S+N196W+S199G+S221N+A222V+H626*；
R38H+E96K+G99N+K101R+Q134L+D179S+N196W+S199G+A222V+H626*；
R38H+E96K+G99N+K101R+Q134L+L150Y+N156R+D179S+N196W+S199G+A222V+H626*；
R38H+E96K+G99N+K101R+L150Y+N156R+D179S+N196W+S199G+A222V+H626*；
L150F+N196W+S199G+A222I+H626*；
Q134L+L150F+N156R+N196W+S199G+A222I+H626*；
Q134L+L150H+N156R+N196W+S199G+A222I+H626*；
Q134L+L150M+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
Q134L+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222I+Q457L+H626*；
Q134M+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
Q134W+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
L150W+L152M+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
S113F+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
S113Y+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
L150W+G151W+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
L150W+G151S+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
S113F+L150W+G151S+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
Y67W+W68Y+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
A43V+L150M+G151F+N156R+N196W+S199G+A222I；
L150M+G151Y+N156R+N196W+S199G+A222I；
L150M+G151W+N156R+N196W+S199G+A222I；
L150M+G151S+N156R+N196W+S199G+A222I+Y534H；
S113F+L150M+G151S+N156R+N196W+S199G+A222I；
Q134L+L150F+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
L150W+G151F+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
L150W+G151Y+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
Y67W+W68Y+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I；
G56W+N57P+Y67W+W68Y+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
K54I+Y67W+W68S+S113G+N196W+S199G+A222V+A382T+H626*；
K54I+Y67W+W68S+S113G+D114Q+L150V+N196W+S199G+A222V+H626*；
K54I+Y67W+W68S+S113G+W138Y+N196W+S199G+A222V+H626*；
K54I+Y67W+W68S+S113G+D114Q+W138Y+L150V+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134L+N196W+S199G+A222V+H626*；
V107T+I108L+H110D+F169H+N196W+S199G+A222V+H626*；
N196W+S199G+A222V+N392W+K417W+H626*；
V9D+R38H+N196W+S199G+A222V+T348K+H626*；
E96H+L150Y+N156R+N196W+S199G+A222V+E284Q+H626*；
Q134L+L150Y+N196W+S199G+A222V+H626*；
L150Y+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134L+L150Y+N196W+S199G+A222V+H626*；
L150F+N156R+N196W+S199G+A222V+H626*；
L150H+N156R+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134L+L150F+N156R+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134L+L150H+N156R+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134L+L150F+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134L+L150H+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134L+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134L+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134W+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134M+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134M+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V+A466V+H626*；
L150Y+L152M+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
L150S+N196W+S199G+A222V+H626*；
N196W+S199G+A222V+N281S+H626*；
Y67T+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q71N+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q71N+A94D+N196W+S199G+A222V+H626*；
N196W+S199G+L218F+A222V+H626*；
N196W+S199G+L218W+A222V+H626*；
N196W+S199G+A222V+T278W+H626*；
N196W+S199G+A222V+T278W+T459M+H626*；
N196W+S199G+A222V+T278Y+H626*；
N196W+S199G+A222V+S275N+H626*；
N196W+S199G+A222V+S275L+H626*；
N196W+S199G+A222V+S335Q+H626*；
N196W+S199G+A222V+S335K+H626*；
N196W+S199G+A222V+S335R+H626*；
N196W+S199G+L218W+A222V+S335K+H626*；
N196W+S199G+L218W+A222V+S335Q+H626*；
Y67W+N196W+S199G+A222V+H626*；
N196W+S199G+A222V+N281Q+H626*；
L150M+N156R+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134L+L150M+N156R+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134L+L150M+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
D39R+N196W+S199G+A222V+N281Q+E284Q；
D39R+N196W+S199G+A222V+E284Q+Q479QP；
D39R+Y70F+N196W+S199G+A222V+E284Q；
N28W+D39R+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+N196W+S199G+N207W+A222V+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+D39R+N196W+S199G+N207W+A222V+E284Q+H626*；
N196W+N207W；
N196W+N207W+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+N196W+N207W+E284Q；
L150Y+N196W+S199G+A222V+H626*；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+L150Y+N196W+S199G+A222V；
E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+N207W+T208N+A222V；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V；
Q134L+L150H+N156R+N196W+S199G+A222I+E284Q+H626*；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+Q134L+L150H+N156R+N196W+S199G+A222I+H626*；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+Q134L+L150H+N156R+N196W+S199G+N207W+A222I+E284Q；
E96K+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q+H626*；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+E96K+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
R64S+E96K+N196W+S199G+N207W+A222V；
N28W+D39R+N196W+S199G+N207W+A222V+E284Q；
D39R+N196W+S199G+A222V+E284Q+H626*；
D39R+N196W+S199G+N207W+A222V+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+D39R+N196W+S199G+A222V+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+N196W+N207W+E511D；
L150Y+N196W+S199G+N207W+A222V；
E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V+H626*；
E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+N207W+T208N+A222V+E284Q+H626*；
Q134L+L150H+N156R+N196W+S199G+A222I；
N28W+E96K+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
R64S+E96K+N196W+S199G+A222V+H626*；
R64S+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+R64S+E96K+N196W+S199G+A222V；
并且其中该变体具有α-淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性，但小于100％序列同一性。
实施例12.根据实施例1-8中任一项所述的变体，其中该α-淀粉酶包含选自以下的改变的组合：
S199G+H626*；
N196W+H626*
N196W+S199G+A222V+H 626*；
N196W+N207W+H626*：
L150Y+N196W+S199G+A222V
E96K+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
R64S+E96K+N196W+S199G+A222V；
并且其中该变体具有α-淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性，但小于100％序列同一性。
实施例13.根据实施例1-12中任一项所述的变体，其中在pH 4.0下的增加的pH稳定性可以确定为该变体淀粉酶在pH 4.0、32℃下孵育18-24小时后的％残余α-淀粉酶活性(％RA)。
实施例14.根据实施例1-12中任一项所述的变体，其中在pH 4.0下的增加的pH稳定性可以确定为该变体淀粉酶在pH 4.0、32℃下孵育96小时，并且以小时为单位计算酶的半衰期后的残余α-淀粉酶活性。
实施例15.根据实施例1-14中任一项所述的变体，其中与SEQ ID NO:1、2、3或4的亲本淀粉酶相比，半衰期增加了至少1.2、1.3、1.4、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0倍，例如至少8.0倍。
实施例16.根据实施例1-10中任一项所述的变体，该变体进一步包含对应于K8N的取代。
实施例17.根据前述实施例中任一项所述的变体α-淀粉酶，该变体α-淀粉酶包含至少包含在SEQ ID NO:1的氨基酸12-438中的催化结构域，其中该变体具有α-淀粉酶活性，并且其中该催化结构域与SEQ ID NO:1的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性，但小于100％序列同一性，并且其中该变体任选地具有CBM。
实施例18.根据实施例1-17中任一项所述的变体，其中接头和/或碳水化合物结合模块CBM已被异源CBM替代。
实施例19.根据实施例18所述的变体，其中该CBM包含SEQ ID NO:1的氨基酸527-626，并且氨基酸439-526包含接头区域。
实施例20.根据实施例17-19中任一项所述的变体，其中该异源CBM选自属于家族20、21、25、26、34、41或48的异源CBM。
实施例21.根据实施例20所述的变体，其中该CBM是家族20CBM。
实施例22.根据实施例18-21中任一项所述的变体，其中该CBM选自由以下组成的组：
i)SEQ ID NO:14的多肽或与SEQ ID NO:14的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的多肽；
ii)SEQ ID NO:15的多肽或与SEQ ID NO:15的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的多肽；
iii)SEQ ID NO:16的多肽或与SEQ ID NO:16的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的多肽；
iv)SEQ ID NO:17的多肽或与SEQ ID NO:17的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的多肽；
v)SEQ ID NO:18的多肽或与SEQ ID NO:18的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的多肽；以及
vi)SEQ ID NO:19的多肽或与SEQ ID NO:19的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的多肽。
实施例23.根据实施例18-22中任一项所述的变体，其中该接头在1至100个氨基酸之间。
实施例24.一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸编码根据实施例1-23中任一项所述的变体。
实施例25.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含根据实施例24所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在表达宿主中的产生的一个或多个控制序列。
实施例26.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含根据实施例24所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个异源控制序列。
实施例27.根据实施例26所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是酵母细胞，特别是酵母属，例如酿酒酵母。
实施例28.一种产生根据实施例1-23中任一项所述的变体α-淀粉酶的方法，该方法包括：在适合于表达该变体的条件下培养根据实施例26所述的重组宿主细胞；以及任选地回收该变体。
实施例29.一种组合物，该组合物包含根据实施例1-23中任一项所述的变体α-淀粉酶。
实施例30.根据实施例29所述的组合物，该组合物进一步包含至少一种葡糖淀粉酶。
实施例31.一种全培养液配制品或细胞培养组合物，该全培养液配制品或细胞培养组合物包含根据实施例1-23中任一项所述的变体α-淀粉酶。
实施例32.根据实施例29所述的组合物，该组合物进一步包含表面活性剂。
实施例33.根据实施例32所述的组合物，其中该组合物包含表面活性剂或表面活性剂系统，其中该表面活性剂可以选自非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、兼性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂、及其混合物。
实施例34.根据实施例33所述的组合物，其中该组合物包含阴离子表面活性剂，特别是直链烷基苯磺酸盐(LAS)和/或醇乙氧基硫酸盐(AEOS)。
实施例35.根据实施例33所述的组合物，其中该组合物包含非离子表面活性剂，例如醇乙氧基化物(AEO)。
实施例36.根据实施例32-35中任一项所述的组合物，其中该组合物包含一种或多种阴离子表面活性剂和/或一种或多种非离子表面活性剂。
实施例37.根据实施例32-36中任一项所述的组合物，其中该组合物包含表面活性剂中的一种或多种，特别是直链烷基苯磺酸(LAS)、月桂醇聚醚硫酸钠(SLES)和/或醇乙氧基化物(AEO)。
实施例38.根据实施例1-23中任一项所述的变体α-淀粉酶用于生产糖浆和/或发酵产物的用途。
实施例39.一种从含淀粉材料生产发酵产物的工艺，该工艺包括以下步骤：(a)在α-淀粉酶的存在下，在高于含淀粉材料的初始糊化温度下，将所述含淀粉材料液化；(b)将该液化的材料糖化；以及(c)用发酵生物体进行发酵；其中在至少一种根据实施例1-23中任一项所述的变体α-淀粉酶和任选地葡糖淀粉酶的存在下进行步骤(b)。
实施例40.根据实施例39所述的工艺，其中步骤(b)和步骤(c)同时进行。
实施例41.根据实施例39-40中任一项所述的工艺，其中将根据实施例26-27中任一项所述的宿主细胞作为该发酵生物体应用。
实施例42.根据实施例39所述的工艺，其中该宿主细胞进一步表达葡糖淀粉酶。
实施例43.根据实施例41-42中任一项所述的工艺，其中该宿主细胞进一步表达α-淀粉酶，该α-淀粉酶衍生自根毛霉属的菌株，优选微小根毛霉的菌株，例如具有来自黑曲霉葡糖淀粉酶的接头和淀粉结合结构域的微小根毛霉α-淀粉酶杂合体。
实施例44.根据实施例43所述的工艺，其中在发酵中由该宿主细胞进一步表达的α-淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含SEQ ID NO:12的多肽的α-淀粉酶；
(ii)包含如下氨基酸序列的α-淀粉酶，该氨基酸序列与SEQ ID NO:12的多肽具有至少60％，至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
实施例45.根据实施例44所述的工艺，其中该α-淀粉酶进一步包含以下取代中的一个或多个：G128D、D143N，优选G128D+D143N，使用SEQ ID NO:12进行编号。
实施例46.根据实施例39-45中任一项所述的工艺，其中该发酵生物体或宿主细胞是酵母细胞，特别是酵母属细胞，例如酿酒酵母。
实施例47.根据实施例39-46中任一项所述的工艺，其中该发酵产物是醇，例如乙醇。
实施例48.根据实施例39-47中任一项所述的工艺，其中该含淀粉材料是玉米。
实施例49.一种从含淀粉材料生产糖浆产物的工艺，该工艺包括以下步骤：(a)在α-淀粉酶的存在下，在高于含淀粉材料的初始糊化温度的温度下，将所述含淀粉材料液化；(b)在至少一种根据实施例1-23中任一项所述的变体α-淀粉酶和任选地葡糖淀粉酶的存在下，将该液化的材料糖化。
实施例50.根据实施例49所述的工艺，其中使用至少一种根据实施例1-22中任一项所述的变体α-淀粉酶和第二α-淀粉酶进行步骤a)。
实施例51.根据实施例1-23中任一项所述的变体α-淀粉酶，其中该变体是分离的。
实施例52.一种转基因植物、植物部分或植物细胞，该转基因植物、植物部分或植物细胞包含根据实施例1-23中任一项所述的变体α-淀粉酶。
通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应理解为对本发明的范围进行限制。
实例
菌株
在实例中使用的解淀粉芽孢杆菌菌株是于2011年从美国弗吉尼亚州的土壤中分离的。
酿酒酵母菌株MBG5012在美国农业研究服务专利培养物保藏中心5(NRRL)登录号NRRL Y67700下保藏，并且在WO 19/161227中描述。
材料与方法
材料：
TB-GLY培养基
MSA-SUB-FS-057
Figure BDA0003789758780001331
100mM BR缓冲液由1M BR储备液制备，其通过在100mL 1M储备液中添加50μL的2MCaCl2溶液和1000μL的10％Brij35储备溶液，并且将900mL milliQ水添加至浓度为0.1mMCaCl2和0.01％Brij35。
1M BR储备液通过将136g乙酸钠二水合物(CAS 6131-90-4)、142g磷酸氢二钠(CAS7558-79-4)和61.8g硼酸(CAS 10043-35-3)溶解在milliQ水中至1L的总体积来制备。
稀释后，根据需要通过添加HCL或NaOH将100mM BR缓冲液的pH调节至pH 4或pH 7。
测定：
pNP-G7α-淀粉酶活性测定
可以通过使用G7-pNP底物的方法确定α-淀粉酶活性。为4,6-亚乙基(G7)-对硝基苯基(G1)-α,D-麦芽庚糖苷的缩写的G7-pNP是一种可以由内切淀粉酶如α-淀粉酶切割的嵌段寡糖。切割之后，试剂盒中所包括的α-葡糖苷酶进一步消化水解底物以释放游离PNP分子，该分子具有黄颜色并且因而可通过可见分光光度法在λ＝405nm(400-420nm)处测量。含有G7-pNP底物和α-葡糖苷酶的试剂盒由罗氏公司/日立公司(目录号11876473)或西格玛奥德里奇公司(目录号MAK009)制造。
试剂：
来自这个试剂盒的G7-pNP底物含有22mM 4,6-亚乙基-G7-pNP和52.4mM HEPES(2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸)，pH 7.0。
α-葡糖苷酶试剂含有52.4mM HEPES、87mM NaCl、12.6mM MgCl2、0.075mM CaCl2、≥4kU/L的α-葡糖苷酶。
通过将1mL的α-葡糖苷酶试剂与0.2mL的G7-pNP底物混合，制成底物工作溶液。此底物工作溶液在使用之前立即制成。
稀释缓冲液：50mM MOPS，0.05％(w/v)Triton X100(聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚(C14H22O(C2H4O)n(n＝9-10)))，1mM CaCl2，pH 8.0。
程序：
将待分析的淀粉酶样品稀释于稀释缓冲液中以确保稀释样品中的pH是7。通过将20μl稀释的酶样品转移至96孔微量滴定板中并添加80μl底物工作溶液来进行测定。将溶液混合并在室温预孵育1分钟并且在OD 405nm经5分钟每20秒测量吸收。
在给定的一组条件下，时间依赖性吸收曲线的斜率(吸光度/分钟)与所讨论的α-淀粉酶的比活性(活性/mg酶)成正比。淀粉酶样品应稀释至其中斜率低于0.4吸光度单位/分钟的水平。
淀粉酶pH 4稳定性筛选测定
样品制备
表达克隆在埃德蒙德比勒公司(Edmund Bühler Gmbh)的TH 15 TiMix微板摇床中在37℃下以700RPM在2.2mL深孔板中的TB-GLY培养基中在良好表达条件下生长18小时至24小时之间。
发酵后，可以将样品离心(spun down)以减少上清液中的细胞数量。
样品孵育
来自每种变体的上清液样品，将子样品在调节为pH 4的100mM BR缓冲液中在pH 4和37℃下孵育18至24小时(下文称为应激样品)，而将等同的子样品在调节为pH 7的100mMBR缓冲液中在pH 7下在4℃或更低下储存(下文称为未应激样品)。在用安捷伦热封膜机(Agilent PlateLoc)封板机密封的96孔Nunc微孔聚丙烯板(西格玛奥德里奇公司P6866)中进行孵育。
通过将10μL的变体上清液样品混合到90μl缓冲液中稀释10倍进行孵育。
样品分析
孵育后，在测量活性前将样品预稀释20倍。使用G7-pNP试剂盒(西格玛奥德里奇公司目录号MAK009)确定淀粉酶活性。在pH 7的BR缓冲液中进行样品稀释。通过将10μL的稀释样品与40μL G7底物在380孔珀金埃尔默公司(PerkinElmer)的SpectraPlate读取器板中混合来进行进一步的稀释以达到1000倍的总测定稀释度。
给定变体的应激样品和未应激样品在同一读取器板上读取。根据G7测定方案评估酶活性。将溶液混合并在室温预孵育1分钟并且在OD 405nm经30分钟每20秒测量吸收，并且测量的最高斜率被用作酶活性的量度。将未添加酶样品的孔用作对照，并且从在同一板上所有测量的活性中减去该孔中的任何斜率。
数据评估-半衰期的确定
对于给定变体，将应激样品的酶活性除以未应激样品的酶活性来计算残余活性。据此，将酶候选物的以小时为单位的半衰期计算为以小时为单位的孵育时间的负数除以残余活性的log2。
实例1：亲本野生型解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶及其变体的克隆和表达
菌株解淀粉芽孢杆菌是于2011年从美国弗吉尼亚州的土壤中分离的。将来自该菌株的染色体DNA使用Illumina技术进行全基因组测序。通过分析糖基水解酶结构域(根据CAZY定义)，在基因组中鉴定了GH13亚家族28淀粉酶。
将线性整合载体系统用于来自解淀粉芽孢杆菌的淀粉酶的表达克隆。线性整合构建体是一种PCR融合产物，该融合产物由两个枯草芽孢杆菌同源染色体区域之间的基因与强启动子和氯霉素抗性标记融合而成。通过SOE PCR进行融合(Horton,R.M.,Hunt,H.D.,Ho,S.N.,Pullen,J.K.和Pease,L.R.(1989)Engineering hybrid genes without the useof restriction enzymes,gene splicing by overlap extension Gene[在不使用限制酶、通过重叠延伸的基因剪接的情况下工程化杂合基因]Gene[基因]77:61-68)。专利申请WO 2003/095658中也描述了SOE PCR方法。在三联启动子系统(如WO 1999/43835中所述)的控制下表达该基因，该启动子系统由包含稳定化序列的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)启动子、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)启动子和苏云金芽孢杆菌cryIIIA启动子组成。编码氯霉素乙酰基转移酶的基因被用作标记(描述于例如Diderichsen,B.；Poulsen,G.B.；Joergensen,S.T.1993,Plasmid[质粒]A useful cloning vector for Bacillussubtilis[枯草芽孢杆菌的有用的克隆载体]30:312中)。在芽孢杆菌属染色体上通过同源重组将最终的基因构建体整合到果胶裂解酶基因座中。
用包含至两个侧翼载体片段的突出端的基因特异性引物从菌株的染色体DNA扩增编码淀粉酶的基因。用克劳氏芽孢杆菌分泌信号(SEQ ID NO:6的氨基酸1-27)代替基因天然分泌信号以及用直接融合到蛋白质的C-末端的6个组氨酸的组氨酸标签来表达淀粉酶。用于表达的多核苷酸序列作为SEQ ID NO:5被包括在本文中。从菌株MB1361的基因组DNA扩增上游和下游载体片段(根据描述于专利申请WO 2003095658中的菌株PL3598)。通过SOEPCR将2个线性载体片段和基因片段组装成一个线性载体构建体。将PCR产物的等分部分转化到枯草芽孢杆菌中。在每ml补充有6μg氯霉素的LB板上选择转化体。将含有经序列证实的、整合的表达构建体的重组枯草芽孢杆菌克隆在回转式摇床上在500mL带挡板的锥形瓶中的液体培养物中培养，每个锥形瓶含有100ml基于酵母提取物的培养基。将克隆在30℃下培养4天。收获含有酶的上清液并如实例2中所述将该酶进行纯化。
实例2：从解淀粉芽孢杆菌中纯化带有His标签的淀粉酶
将上清液的pH用3M Tris调节至pH 8，静置1小时，然后使用配备有0.2μm过滤器的过滤装置(乐基因公司(Nalgene))过滤。将过滤的上清液应用到5ml HisTrapTMExcel柱(GE医疗集团生命科学部(GE Healthcare Life Sciences))上，将该柱用5个柱体积(CV)的50mM Tris/HCl pH 8预平衡。通过用8CV的50mM Tris/HCl pH 8洗涤该柱来洗脱未结合的蛋白质。用50mM HEPES pH 7-10mM咪唑洗脱淀粉酶，并通过在280nm处的吸光度监测洗脱。将洗脱的淀粉酶在HiPrepTM26/10脱盐柱(GE医疗集团生命科学部)上脱盐，将该柱用3CV的50mM HEPES pH 7-100mM NaCl预平衡。使用相同的缓冲液，以10ml/分钟的流速从该柱洗脱淀粉酶。选择相关级分，并且使用4％-12％Bis-Tris凝胶(英杰公司(Invitrogen))和2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)SDS-PAGE运行缓冲液(英杰公司)，基于色谱图和SDS-PAGE分析进行合并。将凝胶用InstantBlue(诺韦新公司(Novexin))染色，并使用miliQ水脱色。通过在280nm处的吸光度确定纯化的酶的浓度。
实例3：变体α-淀粉酶的pH稳定性的确定
如上所述使用G7-pNP试剂盒(西格玛奥德里奇公司目录号MAK009)测试根据本发明的淀粉酶变体的pH稳定性。在如所描述的使变体生长后，测试每种变体的上清液样品在pH 4下相对于亲本淀粉酶的增加的稳定性。将子样品在调节为pH 4的100mM BR缓冲液中在pH 4和37℃下孵育19.5或21小时(下文称为应激样品)，而将等同的子样品在调节为pH 7的100mM BR缓冲液中在pH 7下在4℃或更低下储存(下文称为未应激样品)。在用安捷伦热封膜机封板机密封的96孔Nunc微孔聚丙烯板(西格玛奥德里奇公司P6866)中进行孵育。
孵育后，在测量活性前将样品预稀释20至200倍。使用G7-pNP试剂盒(西格玛奥德里奇公司目录号MAK009)确定淀粉酶活性。在pH 7的BR缓冲液中进行样品稀释。进行进一步的稀释以达到100倍至1000倍的总测定稀释度。将10μL的稀释样品与40μL G7底物在380孔珀金埃尔默公司的SpectraPlate读取器板中混合。
每种变体的应激样品和未应激样品在同一读取器板上读取。根据G7测定方案评估酶活性。将溶液混合并在室温预孵育1分钟并且在OD 405nm经30分钟每20秒测量吸收，并且测量的最高斜率被用作酶活性的量度。将未添加酶样品的孔用作对照，并且从在同一板上所有测量的活性中减去该孔中的任何斜率。
稳定性测试的结果示于下表1和2中。
表1.在pH 4.0、37℃下应激19.5小时的变体的半衰期
Figure BDA0003789758780001381
表2.在pH 4.0、37℃下应激21小时的变体的半衰期
Figure BDA0003789758780001382
Figure BDA0003789758780001391
结果显示，所有测试的变体与SEQ ID NO:1的野生型亲本α-淀粉酶相比在pH 4.0下具有增加的稳定性。
实例4：在生淀粉的存在下变体α-淀粉酶的pH 4稳定性的确定
淀粉酶变体作为发酵上清液和纯化的样品进行测试。将纯化的酶样品在含有0.01％Brij的水中稀释至5μM的浓度。对于该测定，将10μl的上清液或稀释的纯化的样品与90μl 10％生玉米淀粉在pH 4的100mM BR缓冲液中混合。在两个单独的板上制备每种样品，其中通过在37℃、850rpm下孵育18小时对一个板进行应激(下文称为应激样品)，并且在室温、850rpm下孵育第二个板2分钟(下文称为未应激样品)。各自孵育后，将两个板以2000rpm离心2min，并且在-20℃下储存上清液直至分析。将解冻的上清液在pH 7的100mM BR缓冲液中稀释10倍，并且使用G7-pNP测定方案(罗氏公司/日立公司，目录号11876473)评估酶活性。简而言之，将20μl稀释的酶样品与100μl G7-pNP溶液混合，并且在室温下跟踪在405nm处的吸光度持续20min。减去空白后的初始斜率(0-2min)用作活性量度。通过将应激样品的活性除以未应激样品的活性来计算应激后的残余活性。据此，将酶候选物的以小时为单位的半衰期(T
Figure BDA0003789758780001393
)计算为以小时为单位的孵育时间除以残余活性的log2乘以-1。
由估计的半衰期(T
Figure BDA0003789758780001394
)计算改善因子(IF)，即通过将变体的估计的T
Figure BDA0003789758780001395
除以野生型酶(SEQ ID NO:1)的T
Figure BDA0003789758780001396
。
表3.在生淀粉的存在下在pH 4.0、37℃下应激18小时的变体的半衰期
Figure BDA0003789758780001392
Figure BDA0003789758780001401
结果显示，列出的变体与SEQ ID NO:1的野生型亲本α-淀粉酶相比在pH 4.0下具有增加的稳定性。
实例5：蛋白质工程化对解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:1)的影响，从而在生淀粉玉米醪发酵期间提高乙醇产量并且增加动力学
该实例描述了对SEQ ID NO:1的α-淀粉酶的评价，该α-淀粉酶含有在生淀粉玉米醪同时糖化和发酵(SSF)期间提高乙醇量和动力学的突变。特别地，在表4中列出的酶之间比较发酵期间的乙醇和动力学。
表4.使用的酶的列表
酶
Wt AA解淀粉芽孢杆菌(SEQ ID NO:1)
N196W变体AA
种子培养物：
首先使酿酒酵母菌株MBG5012的冷冻保存的培养物(在美国农业研究服务专利培养物保藏中心5(NRRL)登录号NRRL Y67700下保藏，并且在WO 19/161227(通过引用以其全文并入本文)中描述)在液体YPD培养基(酵母提取物，10g；蛋白胨，20g；右旋糖，60g；溶解在1L的蒸馏水中)中生长。培养在无菌的125-ml锥形瓶中无菌地进行，该锥形瓶装有50ml YPD培养基并接种有100μl冷冻保存的培养物。将烧瓶在振荡培养箱中在32℃下以150rpm振荡孵育16h。将YPD生长的种子培养物(40ml)在22℃下以3,500rpm离心10min，并将所得的细胞沉淀洗涤并重悬于自来水和甘油中。在同时糖化和发酵(SSF)开始时，将重悬的细胞用于接种玉米醪。
玉米醪：
在邦恩(Bunn)咖啡研磨机上使用土耳其式研磨设置研磨玉米粒。玉米粉的％干固体(DS)是84.50％。使用土耳其式研磨的玉米和自来水，制备目标为37.50％DS的浆料。用1000ppm尿素和3ppm的抗生素LACTROLTM补充玉米浆料，并且在用于SSF之前将其pH调节至4.5。最终的干固体水平确定为37.50％DS。
同时糖化和发酵(SSF)
所有发酵均在具有带钻孔的盖的12mL圆底试管中进行。将试管装有3.8-4.5g的玉米浆料，并以每克醪1千万个细胞用种子培养物进行接种。将来自瓣环栓菌的葡糖淀粉酶(本文披露为SEQ ID NO:7)以88μg酶蛋白/g干玉米固体添加至试管中。将表4中的淀粉酶以32μg酶蛋白/g干玉米固体添加至试管中。所有试管都含有相同的葡糖淀粉酶，并且将来自表4的一种淀粉酶添加至每个试管。将试管在32℃下在培养箱中孵育。每天涡旋试管两次。发酵进行72小时。
重量损失分析
记录发酵前试管的初始重量。记录发酵18、24、48和72h后试管的重量。计算发酵0h与18、24、48和72h之间的重量差异。重量差异除以g DS/试管得出g重量损失/g DS。
乙醇分析
发酵72小时后，将100μl的40％v/v H2SO4添加至每个样品试管，将样品涡旋，并且在22℃下以3,500rpm离心10min。将所得的上清液通过0.2μm注射器过滤器进行过滤。在进行HPLC分析之前和期间，将过滤的样品储存在4℃下。使用配备有保护柱(伯乐公司(Bio-Rad),Micro-Guard Cation H+柱,30x4.6mm)和分析柱(伯乐公司,Aminex HPX-87H,300x7.8mm)的HPLC(安捷伦公司(Agilent)1100/1200系列)机器，进行乙醇分析，使用5mM硫酸作为流动相，流速为0.8mL/min。将柱温保持在65℃，并使用折射率检测器在55℃下检测乙醇。
结果
表5和表6分别显示了在玉米醪发酵期间淀粉酶的CO2g重量损失动力学/gDS和乙醇滴度。结果表明，与亲本wt淀粉酶相比，当用包含N196W取代的变体α-淀粉酶进行发酵时，发酵动力学和乙醇滴度增加。动力学和乙醇滴度的差异可归因于变体淀粉酶中存在的突变。可以得出结论，变体中存在的N196W取代通过增加对生淀粉玉米浆料中存在的淀粉底物的活性而提供发酵性能的改善。
表5.在用以下进行的生淀粉发酵期间的克重量损失/g DS动力学
Figure BDA0003789758780001421
表6.在含有来自表4的淀粉酶的生淀粉浆料中发酵72h后的乙醇滴度。
Figure BDA0003789758780001422
实例6.在生淀粉的存在和不存在下变体α-淀粉酶的pH 4稳定性的确定
将纯化的淀粉酶变体在含有0.01％Brij的水中稀释至5μM的浓度。对于该测定，将10μl稀释的纯化的样品与90μl 100mM BR缓冲液(pH)或与10％生玉米淀粉在pH 4的100mMBR缓冲液中混合。在两个单独的板上制备每种样品，其中通过在32℃、850rpm下孵育96小时对一个板进行应激(下文称为应激样品)，并且在室温、850rpm下孵育第二个板2分钟(下文称为未应激样品)。各自孵育后，将两个板以2000rpm离心2min，并且在-20℃下储存上清液直至分析。将解冻的上清液在pH 7的100mM BR缓冲液中稀释10倍，并且使用G7-pNP测定方案(罗氏公司/日立公司，目录号11876473)评估酶活性。简而言之，将20μl稀释的酶样品与100μl G7-pNP溶液混合，并且在室温下跟踪在405nm处的吸光度持续20min。减去空白后的初始斜率(0-2min)用作活性量度。通过将应激样品的活性除以未应激样品的活性来计算应激后的残余活性。
表7.在生淀粉的不存在或存在下在pH 4.0、32℃下应激96小时的变体的残余活性。
Figure BDA0003789758780001431
结果显示，列出的变体与SEQ ID NO:1的野生型亲本α-淀粉酶相比在pH 4.0下具有增加的稳定性。
实例7.变体α-淀粉酶的pH 4稳定性的确定
将纯化的淀粉酶变体在含有0.01％Trition-X-100的水中稀释至5μM的浓度。对于该测定，将5μM样品稀释10倍到应激缓冲液(pH 4的222mM乙酸钠缓冲液、0.56mM CaCl2和0.01％Brij-35)或稀释缓冲液(0.01％Trition-X-100)中。将应激缓冲液中的样品在32℃(850rpm)下孵育24H(下文称为应激样品)。将与稀释缓冲液混合的其他样品储存在5℃下直至进一步分析，最多2天(下文称为未应激样品)。
各自孵育后，将样品用测定缓冲液(500mM Hepes pH 7、0.5mM CaCl2、0.01％Brij-35)稀释10-50倍，并且使用G7-pNP测定方案(罗氏公司/日立公司，目录号11876473)评估酶活性。简而言之，将20μl稀释的酶样品与100μl G7-pNP溶液混合，并且在室温下测量在405nm处的吸光度持续20min。计算初始斜率(滞后时间：2min，最大吸光度＝2)并且减去空白。这些斜率-空白用作活性量度。通过将应激样品的活性除以未应激样品的活性再乘以100来计算应激后的残余活性(RA％)。
表8.在pH 4.0、32℃下应激24小时的变体的残余活性(RA％)。
Figure BDA0003789758780001441
结果显示，列出的变体与SEQ ID NO:1的野生型亲本α-淀粉酶相比在pH 4.0下具有增加的稳定性。
实例8.变体α-淀粉酶的pH 4稳定性的确定
将纯化的淀粉酶变体在含有0.01％Trition-X-100的水中稀释至5μM的浓度。对于该测定，将5μM样品稀释10倍到应激缓冲液(pH 4的222mM乙酸钠缓冲液、0.56mM CaCl2和0.01％Brij-35)或稀释缓冲液(0.01％Trition-X-100)中。将应激缓冲液中的样品在32℃(850rpm)下孵育24小时(下文称为应激样品)。将与稀释缓冲液混合的其他样品储存在5℃下直至进一步分析(下文称为未应激样品)。
孵育后，将应激样品用测定缓冲液(500mM Hepes pH 7、0.5mM CaCl2、0.01％Brij-35)稀释10-50倍。将未应激样品稀释在10-100倍之间以获得最少四种不同的稀释度，并因此获得最少4种不同的浓度。使用G7-pNP测定方案(罗氏公司/日立公司，目录号11876473)评估所有稀释样品(应激的和未应激的)的酶活性。简而言之，将20μl稀释的酶样品与100μl G7-pNP溶液混合，并且在室温下测量在405nm处的吸光度持续20min。计算初始斜率(滞后时间：2min，最大吸光度＝1.5)。对于未应激样品，使用初始斜率作为Y并且酶浓度作为X进行非线性拟合(例如，Michaelis Menten)。基于该拟合，在应激样品中估计残余活性酶的浓度。通过将估计的残余活性酶的浓度除以酶的初始浓度(开始时)再乘以100来计算残余活性的水平(RA％)。
结果在下表9中给出。将列出的改变引入SEQ ID NO:1的亲本α-淀粉酶中，并且结果显示，列出的变体与SEQ ID NO:1的野生型亲本α-淀粉酶相比在pH 4.0下具有增加的稳定性。
表9.在pH 4.0、32℃下应激24小时的变体的残余活性(RA％)。
Figure BDA0003789758780001451
Figure BDA0003789758780001461
Figure BDA0003789758780001471
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Figure BDA0003789758780001521
Figure BDA0003789758780001531
Figure BDA0003789758780001541
Figure BDA0003789758780001551
本文描述和要求保护的本发明不限于本文披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明几个方面的说明。任何等同方面旨在处于本发明的范围之内。实际上，除了本文所示和描述的那些之外，本发明的各种修改因前述说明而对本领域的技术人员变得清楚。此类修改也旨在落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。
Figure IDA0003789758810000011
Figure IDA0003789758810000021
Figure IDA0003789758810000031
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Claims (52)

1.一种亲本α-淀粉酶的α-淀粉酶变体，该α-淀粉酶变体在对应于SEQ ID NO:1的多肽的位置196、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、28、38、39、43、54、56、57、64、67、68、70、71、86、89、90、94、96、99、101、103、107、108、110、113、114、117、127、134、138、142、150、151、152、156、169、171、174、179、183、193、199、200、204、205、207、208、209、212、218、221、222、224、233、241、245、259、275、278、281、282、283、284、285、308、323、335、348、359、382、386、388、392、394、396、412、414、417、424、428、457、459、466、479、489、511、533、534、542、543、545、547、549、550、551、560、566、570、574、575、576、577、578、580、581、582、589、592、599、603、605、608、614、619或626的一个或多个位置处包含改变，其中该变体具有α-淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性，但小于100％序列同一性。
2.根据权利要求1所述的α-淀粉酶变体，该α-淀粉酶变体在对应于SEQ ID NO:1的多肽的位置196、199、64、96、150、179、207、222、284和603的一个或多个位置处包含取代，其中该变体具有α-淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性，但小于100％序列同一性。
3.根据权利要求1所述的变体，该变体包含选自由以下组成的组的改变：E1*、T2*、A3*、N4*、K5*、S6*、N7*、K8*、V9*、V9D、V9L、T10*、T10I、A11*、S12*、S12P、S13*、V14*、V14I、K15*、N16*、N16S、N28R、N28W、R38H、R38Y、D39R、A43D、A43T、A43V、K54I、G56P、G56W、N57P、R64S、Y67T、Y67W、W68S、W68Y、Y70F、Q71E、Q71N、Q86R、K89R、D90E、A94D、E96H、E96K、G99N、K101R、I103Y、V107T、I108L、I108P、H110D、S113D、S113F、S113G、S113H、S113Q、S113W、S113Y、D114Q、A117T、N127D、Q134E、Q134L、Q134M、Q134N、Q134T、Q134W、W138Y、W142E、L150F、L150H、L150M、L150S、L150V、L150W、L150Y、G151F、G151S、G151W、G151Y、L152M、N156K、N156R、F169H、E171Q、L174I、D179G、D179S、Y183F、Y183I、D193SQY、N196W、S199G、Q200W、N204D、I205Y、N207W、T208N、T208S、S209L、F212W、L218F、L218W、S221N、A222E、A222I、A222V、R224K、N233S、H241N、S245N、H259Y、S275L、S275N、T278N、T278W、T278Y、N281Q、N281S、D282P、D283*、D283A、D283P、E284Q、E285V、T308M、T308Y、R323K、S335K、S335Q、S335R、T348K、E359Y、A382T、S386D、S388W、N392R、N392W、S394K、K396S、Q412W、A414K、K417W、K417Y、A424P、A428S、Q457L、Q457R、T459M、A466V、Q479QP、L489Q、E511D、G533H、Y534H、Q542K、V543P、A545P、I547Y、K549*、K549Y、H550*、H550Y、D551*、G560P、A566P、N570H、M574MW、M574W、Y575W、T576Y、L577Y、T578Y、P580*、E581*、N582*、K589F、F592FK、V599W、N603W、P605S、D608Y、L614W、G619W、和H626*。
4.根据权利要求2所述的变体，该变体包含选自由以下组成的组的改变：R64S、E96K、L150Y、L150W、L150H、L150M、L150F、D179S、N196W、S199G、N207W、A222E、A222I、A222V、E284Q、N603W、和H626*。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的变体，该变体相对于该亲本具有改善的特性，其中该改善的特性是与亲本α-淀粉酶、特别是披露为SEQ ID NO:1的α-淀粉酶相比，在pH 4.0、32℃至37℃、优选32℃下的增加的pH稳定性。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的变体，该变体包含选自以下的取代或取代的组合：
A222I；
A222V；
A222E；
S199G；
N196W；
N207W；
N603W；
L150Y；
L150W；
L150H；
L150M；
L150F；
R64S：
E96K；
D179S；
E284Q；
N207W+N603W；
N196W+N207W；
N196W+N603W；
N196W+N207W+N603W；
A222I+S199G+N196W；
A222V+S199G+N196W；
A222E+S199G+N196W；
A222V+S199G+N196W+L150Y；
L150H+S199G+A222I；
L150M+S199G+A222V；
N196W+S199G+A222V+N603W；
L150F+N196W+S199G+A222I；
L150M+N196W+S199G+A222V；
L150W+S199G+A222V；
L150H+N196W+S199G+A222V；
L150W+N196W+S199G+A222I；
L150Y+S199G+A222V；
E96K+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
R64S+E96K+N196W+S199G+A222V；
其中该变体具有α-淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、或SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性，但小于100％序列同一性。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的变体，该变体包含N-末端缺失，更特别地包含SEQID NO:1的至少氨基酸11至626、SEQ ID NO:1的至少氨基酸12至626、例如SEQ ID NO:1的至少氨基酸13至626。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的变体，其中该α-淀粉酶进一步包含C-末端缺失，特别是H626*。
9.根据权利要求1-5中任一项所述的变体α-淀粉酶，该变体α-淀粉酶包含选自以下的改变或改变的组合：
N28W；
N196W；
S199G；
N196W+V599W；
N196W+H550Y+P605S；
N196W+A545P+T576Y；
N196W+K549Y+G560P；
I108P+Y183I+N196W+I205Y；
N196W+R323K；
N196W+D283P；
W138Y+N196W；
L150W；
N196W+N392W+K417W；
N196W+N392R+K417W；
N196W+K549*+H550*+D551*；
N196W+P580*+E581*+N582*；
N196W+F592FK；
N28W+N196W+N207W+S386D+N603W；
R38Y+N196W；
N196W+H259Y；
N196W+Q412W；
N196W+F212W；
N196W+V599W；
N196W+H550Y+P605S；
N196W+H550Y+K589F；
N196W+H550Y+D608Y；
N196W+M574W+L614W；
N196W+G533H+M574W+L614W；
N196W+V543P+N570H；
N196W+G533H+Y575W+L614W；
N196W+A545P+T576Y；
N196W+A566P+T578Y；
N196W+K549Y+G560P；
N196W+A566P+L577Y；
N196W+I547Y+G560P；
N196W+M574MW；
N196W+K549*+H550*+D551*+M574MW+P580*+E581*+N582*+F592FK；
N196W+L614W+G619W；
N28W+I108P+N196W+N207W+S386D+A466V+Q542K+N603W；
N28W+I108P+N196W+N207W+S386D+N603W；
N196W+D282P+D283*；
W138Y+N196W；
N28W+N196W+N207W+S386D+N603W；
N196W+S388W+A424P；
N196W+S388W+A424P+L489Q；
A117T+N196W+H550Y+D608Y；
N196W+Q457R+Y575W+L614W；
N196W+S199G；
N196W+A222V；
N196W+A222E；
N196W+A222I；
S199G+A222V；
S199G+A222E；
S199G+A222I；
N196W+S199G+A222I；
Q134L；
L150W+N156K+N196W+S199G+A222V；
L150Y+N156K+N196W+S199G+A222I；
L150W+N196W+S199G+A222I+A428S；
L150F+N156K+N196W+S199G+A222I；
L150Y+N156R+N196W+A222V；
L150M+N156R+N196W+S199G+A222I；
L150M+N156R+N196W+A222V；
L150Y+N156R+N196W+S199G+A222V；
L150M+N156K+N196W+S199G+A222V；
L150Y+N156R+N196W+A222I；
L150H+N156R+N196W+S199G+A222I；
L150H+N156K+N196W+A222V；
L150W+N156R+N196W+A222I；
L150F+N156R+N196W+A222I；
L150F+N156K+N196W+S199G+A222V；
L150H+N156K+N196W+S199G+A222V；
L150F+N156R+S199G+A222I；
L150M+N156K+N196W+A222V；
L150W+N156K+N196W+S199G+A222I；
N156K+N196W+S199G+A222V；
L150Y+N156R+S199G+A222I；
L150M+N156R+S199G+A222I；
L150W+N156K+S199G+A222V；
L150W+N156R+N196W+S199G+A222V；
L150Y+N156R+N196W；
N156K+N196W+A222V；
N156K+N196W+S199G；
N156R+S199G+A222V；
S113H+N196W+S199G+A222V；
Q71E+S113H+N196W+S199G+A222V；
N196W+S199G+A222V+D283A；
N196W+S199G+A222V+D283P；
W142E+D193SQY+N196W+S199G+A222V+R224K；
E96K+K101R+L150W+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V；
E96K+K101R+L150Y+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V+E284Q；
E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V+E284Q；
S113Q+Q134E+N196W+S199G+A222V；
S113D+Q134N+N196W+S199G+A222V；
S113F+N196W+S199G+A222V；
E171Q+N196W+S199G+N204D+A222V；
N196W+S199G+A222V+H241N+S245N+T278N+E284Q+E285V；
N196W+S199G+A222V+S394K+A414K+K417Y；
N196W+S199G+A222V+E359Y+S394K+K396S+A414K+K417Y；
R38H+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
R38H+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
V107T+H110D+N196W+S199G+A222V；
Q134T+L150Y+N196W+S199G+A222V；
S113F+L150W+N196W+S199G+A222V；
S113F+L150Y+N196W+S199G+A222V；
E96K+K101R+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V；
E96K+K101R+L150Y+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V；
E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S 199G+T208N+A222V；
E96K+K101R+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V+E284Q；
E96K+K101R+L150W+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V+E284Q；
N28R+Q86R+N196W+S199G+A222V；
N28R+Q86R+K89R+N196W+S199G+A222V；
G56P+N196W+S199G+S209L+A222V；
E96K+N196W+S199G+A222V；
T10I+N196W+S199G+A222V；
D39R+N196W+S199G+A222V；
R64S+N196W+S199G+A222V；
T10I+D39R+R64S+N196W+S199G+A222V；
T10I+D39R+N196W+S199G+A222V；
D39R+E96K+N196W+S199G+A222V；
R64S+D90E+E96K+N196W+S199G+A222V；
R38H+D39R+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
R38H+R64S+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
T10I+R38H+R64S+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
T10I+R38H+R64S+D90E+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
T10I+R38H+D39R+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
R38H+D39R+R64S+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
T10I+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+N196W+S199G+A222V+E284Q；
R64S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
T10I+D39R+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D193SQY+N196W+S199G+A222V；
Q134T+N196W+S199G+A222V；
L174I+N196W+S199G+T208N+A222V；
Y183F+N196W+S199G+T208S+A222V；
N127D+N156R+N196W+S199G+A222V；
Q134T+L150W+N196W+S199G+A222V；
N57P+N196W+S199G+A222V；
N196W+S199G+Q200W+A222V；
T10I+D39R+R64S+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
T10I+D39R+R64S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
T10I+R64S+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+R64S+D90E+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
T10I+R64S+E96K+N196W+S199G+A222V；
T10I+D39R+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+R64S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
R64S+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+R64S+N196W+S199G+A222V；
S12*+S13*+V14*+K15*+N16*+I103Y+N196W+S199G+A222V+N233S+T308Y；
S12*+S13*+V14*+K15*+N16*+A43D+I103Y+N196W+S199G+A222V+N233S+T308M；
V9L+S12P+V14I+N16S+A43T+N196W+S199G+A222V；
S12*+S13*+V14*+K15*+N16*+N196W+S199G+A222V；
N28W+N196W+S199G+A222V；
N196W+S199G+A222V+N392W+K417W；
T10I+D39R+E96K+N196W+S199G+A222V；
V9D+R38H+N196W+S199G+A222V+T348K；
S113F+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V；
S113Y+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V；
S113W+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V；
S113F+N156K+N196W+S199G+A222V；
S113Y+N156K+N196W+S199G+A222V；
S113W+N156K+N196W+S199G+A222V；
W138Y+L150V+N196W+S199G+A222V；
W138Y+L150V+D179G+N196W+S199G+A222V；
W138Y+L150V+N196W+S199G+L218W+A222V；
E96K+Q134L+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
E96K+Q134L+L150Y+N156R+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
E96K+L150Y+N156R+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
R38H+E96K+G99N+K101R+Q134L+D179S+N196W+S199G+S221N+A222V；
R38H+E96K+G99N+K101R+Q134L+D179S+N196W+S199G+A222V；
R38H+E96K+G99N+K101R+Q134L+L150Y+N156R+D179S+N196W+S199G+A222V；
R38H+E96K+G99N+K101R+L150Y+N156R+D179S+N196W+S199G+A222V；
L150F+N196W+S199G+A222I；
Q134L+L150F+N156R+N196W+S199G+A222I；
Q134L+L150H+N156R+N196W+S199G+A222I；
Q134L+L150M+N156K+N196W+S199G+A222I；
Q134L+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222I+Q457L；
Q134M+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I；
Q134W+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I；
L150W+L152M+N156K+N196W+S199G+A222I；
S113F+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I；
S113Y+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I；
L150W+G151W+N156K+N196W+S199G+A222I；
L150W+G151S+N156K+N196W+S199G+A222I；
S113F+L150W+G151S+N156K+N196W+S199G+A222I；
Y67W+W68Y+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I；
A43V+L150M+G151F+N156R+N196W+S199G+A222I；
L150M+G151Y+N156R+N196W+S199G+A222I；
L150M+G151W+N156R+N196W+S199G+A222I；
L150M+G151S+N156R+N196W+S199G+A222I+Y534H；
S113F+L150M+G151S+N156R+N196W+S199G+A222I；
Q134L+L150F+N156K+N196W+S199G+A222I；
L150W+G151F+N156K+N196W+S199G+A222I；
L150W+G151Y+N156K+N196W+S199G+A222I；
Y67W+W68Y+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I；
G56W+N57P+Y67W+W68Y+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I；
K54I+Y67W+W68S+S113G+N196W+S199G+A222V+A382T；
K54I+Y67W+W68S+S113G+D114Q+L150V+N196W+S199G+A222V；
K54I+Y67W+W68S+S113G+W138Y+N196W+S199G+A222V；
K54I+Y67W+W68S+S113G+D114Q+W138Y+L150V+N196W+S199G+A222V；
Q134L+N196W+S199G+A222V；
V107T+I108L+H110D+F169H+N196W+S199G+A222V；
N196W+S199G+A222V+N392W+K417W；
V9D+R38H+N196W+S199G+A222V+T348K；
E96H+L150Y+N156R+N196W+S199G+A222V+E284Q；
Q134L+L150Y+N196W+S199G+A222V；
L150Y+N196W+S199G+A222V；
Q134L+L150Y+N196W+S199G+A222V；
L150F+N156R+N196W+S199G+A222V；
L150H+N156R+N196W+S199G+A222V；
Q134L+L150F+N156R+N196W+S199G+A222V；
Q134L+L150H+N156R+N196W+S199G+A222V；
Q134L+L150F+N156K+N196W+S199G+A222V；
Q134L+L150H+N156K+N196W+S199G+A222V；
Q134L+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V；
L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V；
Q134L+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V；
Q134W+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V；
Q134M+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V；
Q134M+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V+A466V；
L150Y+L152M+N156K+N196W+S199G+A222V；
L150S+N196W+S199G+A222V；
N196W+S199G+A222V+N281S；
Y67T+N196W+S199G+A222V；
Q71N+N196W+S199G+A222V；
Q71N+A94D+N196W+S199G+A222V；
N196W+S199G+L218F+A222V；
N196W+S199G+L218W+A222V；
N196W+S199G+A222V+T278W；
N196W+S199G+A222V+T278W+T459M；
N196W+S199G+A222V+T278Y；
N196W+S199G+A222V+S275N；
N196W+S199G+A222V+S275L；
N196W+S199G+A222V+S335Q；
N196W+S199G+A222V+S335K；
N196W+S199G+A222V+S335R；
N196W+S199G+L218W+A222V+S335K；
N196W+S199G+L218W+A222V+S335Q；
Y67W+N196W+S199G+A222V；
N196W+S199G+A222V+N281Q；
L150M+N156R+N196W+S199G+A222V；
Q134L+L150M+N156R+N196W+S199G+A222V；
Q134L+L150M+N156K+N196W+S199G+A222V；
D39R+N196W+S199G+A222V+N281Q+E284Q；
D39R+N196W+S199G+A222V+E284Q+Q479QP；
D39R+Y70F+N196W+S199G+A222V+E284Q；
N28W+D39R+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+N196W+S199G+N207W+A222V+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+D39R+N196W+S199G+N207W+A222V+E284Q；
N196W+N207W；
N196W+N207W+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+N196W+N207W+E284Q；
L150Y+N196W+S199G+A222V；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+L150Y+N196W+S199G+A222V；
E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+N207W+T208N+A222V；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V；
Q134L+L150H+N156R+N196W+S199G+A222I+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+Q134L+L150H+N156R+N196W+S199G+A222I；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+Q134L+L150H+N156R+N196W+S199G+N207W+A222I+E284Q；
E96K+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+E96K+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
R64S+E96K+N196W+S199G+N207W+A222V；
N28W+D39R+N196W+S199G+N207W+A222V+E284Q；
D39R+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+N196W+S199G+N207W+A222V+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+D39R+N196W+S199G+A222V+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+N196W+N207W+E511D；
L150Y+N196W+S199G+N207W+A222V；
E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V；
E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+N207W+T208N+A222V+E284Q；
Q134L+L150H+N156R+N196W+S199G+A222I；
N28W+E96K+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
R64S+E96K+N196W+S199G+A222V；
R64S+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+R64S+E96K+N196W+S199G+A222V；
并且其中该变体具有α-淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性，但小于100％序列同一性。
10.根据权利要求9所述的变体，其中该变体α-淀粉酶进一步包含C-末端缺失，特别是H626*。
11.根据权利要求1-5中任一项所述的变体α-淀粉酶，该变体α-淀粉酶包含选自以下的改变的组合：
N28W+H626*；
S199G+H626*；
N196W+V599W+H626*；
N196W+H550Y+P605S+H626*；
N196W+A545P+T576Y+H626*；
N196W+K549Y+G560P+H626*；
I108P+Y183I+N196W+I205Y+H626*；
N196W+R323K+H626*；
N196W+D283P+H626*；
W138Y+N196W+H626*；
L150W+H626*；
N196W+N392W+K417W+H626*；
N196W+N392R+K417W+H626*；
N196W+K549*+H550*+D551*+H626*；
N196W+P580*+E581*+N582*+H626*；
N196W+F592FK+H626*；
N28W+N196W+N207W+S386D+N603W+H626*；
R38Y+N196W+H626*；
N196W+H259Y+H626*；
N196W+Q412W+H626*；
N196W+F212W+H626*；
N196W+V599W+H626*；
N196W+H550Y+P605S+H626*；
N196W+H550Y+K589F+H626*；
N196W+H550Y+D608Y+H626*；
N196W+M574W+L614W+H626*；
N196W+G533H+M574W+L614W+H626*；
N196W+V543P+N570H+H626*；
N196W+G533H+Y575W+L614W+H626*；
N196W+A545P+T576Y+H626*；
N196W+A566P+T578Y+H626*；
N196W+K549Y+G560P+H626*；
N196W+A566P+L577Y+H626*；
N196W+I547Y+G560P+H626*；
N196W+M574MW+H626*；
N196W+K549*+H550*+D551*+M574MW+P580*+E581*+N582*+F592FK+H626*；
N196W+L614W+G619W+H626*；
N28W+I108P+N196W+N207W+S386D+A466V+Q542K+N603W+H626*；
N28W+I108P+N196W+N207W+S386D+N603W+H626*；
N196W+D282P+D283*+H626*；
W138Y+N196W+H626*；
N28W+N196W+N207W+S386D+N603W+H626*；
N196W+S388W+A424P+H626*；
N196W+S388W+A424P+L489Q+H626*；
A117T+N196W+H550Y+D608Y+H626*；
N196W+Q457R+Y575W+L614W+H626*；
N196W+S199G；
N196W+A222V；
N196W+A222E；
N196W+A222I；
S199G+A222V；
S199G+A222E；
S199G+A222I；
N196W+S199G+A222I；
Q134L+H626*；
L150W+N156K+N196W+S199G+A222V；
L150Y+N156K+N196W+S199G+A222I；
L150W+N196W+S199G+A222I+A428S；
L150F+N156K+N196W+S199G+A222I；
L150Y+N156R+N196W+A222V；
L150M+N156R+N196W+S199G+A222I；
L150M+N156R+N196W+A222V；
L150Y+N156R+N196W+S199G+A222V；
L150M+N156K+N196W+S199G+A222V；
L150Y+N156R+N196W+A222I；
L150H+N156R+N196W+S199G+A222I；
L150H+N156K+N196W+A222V；
L150W+N156R+N196W+A222I；
L150F+N156R+N196W+A222I；
L150F+N156K+N196W+S199G+A222V；
L150H+N156K+N196W+S199G+A222V；
L150F+N156R+S199G+A222I；
L150M+N156K+N196W+A222V；
L150W+N156K+N196W+S199G+A222I；
N156K+N196W+S199G+A222V；
L150Y+N156R+S199G+A222I；
L150M+N156R+S199G+A222I；
L150W+N156K+S199G+A222V；
L150W+N156R+N196W+S199G+A222V；
L150Y+N156R+N196W；
N156K+N196W+A222V；
N156K+N196W+S199G；
N156R+S199G+A222V；
S113H+N196W+S199G+A222V；
Q71E+S113H+N196W+S199G+A222V；
N196W+S199G+A222V+D283A；
N196W+S199G+A222V+D283P；
W142E+D193SQY+N196W+S199G+A222V+R224K；
E96K+K101R+L150W+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V；
E96K+K101R+L150Y+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V+E284Q；
E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V+E284Q；
S113Q+Q134E+N196W+S199G+A222V；
S113D+Q134N+N196W+S199G+A222V；
S113F+N196W+S199G+A222V；
E171Q+N196W+S199G+N204D+A222V；
N196W+S199G+A222V+H241N+S245N+T278N+E284Q+E285V；
N196W+S199G+A222V+S394K+A414K+K417Y；
N196W+S199G+A222V+E359Y+S394K+K396S+A414K+K417Y；
R38H+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
R38H+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
V107T+H110D+N196W+S199G+A222V；
Q134T+L150Y+N196W+S199G+A222V；
S113F+L150W+N196W+S199G+A222V；
S113F+L150Y+N196W+S199G+A222V；
E96K+K101R+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V；
E96K+K101R+L150Y+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V；
E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V；
E96K+K101R+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V+E284Q；
E96K+K101R+L150W+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V+E284Q；
N28R+Q86R+N196W+S199G+A222V；
N28R+Q86R+K89R+N196W+S199G+A222V；
G56P+N196W+S199G+S209L+A222V；
E96K+N196W+S199G+A222V；
T10I+N196W+S199G+A222V；
D39R+N196W+S199G+A222V；
R64S+N196W+S199G+A222V；
T10I+D39R+R64S+N196W+S199G+A222V；
T10I+D39R+N196W+S199G+A222V；
D39R+E96K+N196W+S199G+A222V；
R64S+D90E+E96K+N196W+S199G+A222V；
R38H+D39R+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
R38H+R64S+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
T10I+R38H+R64S+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
T10I+R38H+R64S+D90E+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
T10I+R38H+D39R+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
R38H+D39R+R64S+E96K+G99N+K101R+D179S+N196W+S199G+A222V；
E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
T10I+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+N196W+S199G+A222V+E284Q；
R64S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
T10I+D39R+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D193SQY+N196W+S199G+A222V；
Q134T+N196W+S199G+A222V；
L174I+N196W+S199G+T208N+A222V；
Y183F+N196W+S199G+T208S+A222V；
N127D+N156R+N196W+S199G+A222V；
Q134T+L150W+N196W+S199G+A222V；
N57P+N196W+S199G+A222V；
N196W+S199G+Q200W+A222V；
T10I+D39R+R64S+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
T10I+D39R+R64S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
T10I+R64S+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+R64S+D90E+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
T10I+R64S+E96K+N196W+S199G+A222V；
T10I+D39R+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+R64S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
R64S+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+R64S+N196W+S199G+A222V；
S12*+S13*+V14*+K15*+N16*+I103Y+N196W+S199G+A222V+N233S+T308Y；
S12*+S13*+V14*+K15*+N16*+A43D+I103Y+N196W+S199G+A222V+N233S+T308M；
V9L+S12P+V14I+N16S+A43T+N196W+S199G+A222V；
S12*+S13*+V14*+K15*+N16*+N196W+S199G+A222V；
N28W+N196W+S199G+A222V；
N196W+S199G+A222V+N392W+K417W；
T10I+D39R+E96K+N196W+S199G+A222V；
V9D+R38H+N196W+S199G+A222V+T348K；
S113F+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
S113Y+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
S113W+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
S113F+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
S113Y+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
S113W+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
W138Y+L150V+N196W+S199G+A222V+H626*；
W138Y+L150V+D179G+N196W+S199G+A222V+H626*；
W138Y+L150V+N196W+S199G+L218W+A222V+H626*；
E96K+Q134L+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q+H626*；
E96K+Q134L+L150Y+N156R+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q+H626*；
E96K+L150Y+N156R+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q+H626*；
R38H+E96K+G99N+K101R+Q134L+D179S+N196W+S199G+S221N+A222V+H626*；
R38H+E96K+G99N+K101R+Q134L+D179S+N196W+S199G+A222V+H626*；
R38H+E96K+G99N+K101R+Q134L+L150Y+N156R+D179S+N196W+S199G+A222V+H626*；
R38H+E96K+G99N+K101R+L150Y+N156R+D179S+N196W+S199G+A222V+H626*；
L150F+N196W+S199G+A222I+H626*；
Q134L+L150F+N156R+N196W+S199G+A222I+H626*；
Q134L+L150H+N156R+N196W+S199G+A222I+H626*；
Q134L+L150M+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
Q134L+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222I+Q457L+H626*；
Q134M+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
Q134W+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
L150W+L152M+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
S113F+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
S113Y+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
L150W+G151W+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
L150W+G151S+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
S113F+L150W+G151S+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
Y67W+W68Y+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
A43V+L150M+G151F+N156R+N196W+S199G+A222I；
L150M+G151Y+N156R+N196W+S199G+A222I；
L150M+G151W+N156R+N196W+S199G+A222I；
L150M+G151S+N156R+N196W+S199G+A222I+Y534H；
S113F+L150M+G151S+N156R+N196W+S199G+A222I；
Q134L+L150F+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
L150W+G151F+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
L150W+G151Y+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
Y67W+W68Y+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I；
G56W+N57P+Y67W+W68Y+L150W+N156K+N196W+S199G+A222I+H626*；
K54I+Y67W+W68S+S113G+N196W+S199G+A222V+A382T+H626*；
K54I+Y67W+W68S+S113G+D114Q+L150V+N196W+S199G+A222V+H626*；
K54I+Y67W+W68S+S113G+W138Y+N196W+S199G+A222V+H626*；
K54I+Y67W+W68S+S113G+D114Q+W138Y+L150V+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134L+N196W+S199G+A222V+H626*；
V107T+I108L+H110D+F169H+N196W+S199G+A222V+H626*；
N196W+S199G+A222V+N392W+K417W+H626*；
V9D+R38H+N196W+S199G+A222V+T348K+H626*；
E96H+L150Y+N156R+N196W+S199G+A222V+E284Q+H626*；
Q134L+L150Y+N196W+S199G+A222V+H626*；
L150Y+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134L+L150Y+N196W+S199G+A222V+H626*；
L150F+N156R+N196W+S199G+A222V+H626*；
L150H+N156R+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134L+L150F+N156R+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134L+L150H+N156R+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134L+L150F+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134L+L150H+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134L+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134L+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134W+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134M+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134M+L150Y+N156K+N196W+S199G+A222V+A466V+H626*；
L150Y+L152M+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
L150S+N196W+S199G+A222V+H626*；
N196W+S199G+A222V+N281S+H626*；
Y67T+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q71N+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q71N+A94D+N196W+S199G+A222V+H626*；
N196W+S199G+L218F+A222V+H626*；
N196W+S199G+L218W+A222V+H626*；
N196W+S199G+A222V+T278W+H626*；
N196W+S199G+A222V+T278W+T459M+H626*；
N196W+S199G+A222V+T278Y+H626*；
N196W+S199G+A222V+S275N+H626*；
N196W+S199G+A222V+S275L+H626*；
N196W+S199G+A222V+S335Q+H626*；
N196W+S199G+A222V+S335K+H626*；
N196W+S199G+A222V+S335R+H626*；
N196W+S199G+L218W+A222V+S335K+H626*；
N196W+S199G+L218W+A222V+S335Q+H626*；
Y67W+N196W+S199G+A222V+H626*；
N196W+S199G+A222V+N281Q+H626*；
L150M+N156R+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134L+L150M+N156R+N196W+S199G+A222V+H626*；
Q134L+L150M+N156K+N196W+S199G+A222V+H626*；
D39R+N196W+S199G+A222V+N281Q+E284Q；
D39R+N196W+S199G+A222V+E284Q+Q479QP；
D39R+Y70F+N196W+S199G+A222V+E284Q；
N28W+D39R+N196W+S199G+A222V+E284Q；
D39R+N196W+S199G+N207W+A222V+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+D39R+N196W+S199G+N207W+A222V+E284Q+H626*；
N196W+N207W；
N196W+N207W+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+N196W+N207W+E284Q；
L150Y+N196W+S199G+A222V+H626*；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+L150Y+N196W+S199G+A222V；
E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+N207W+T208N+A222V；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V；
Q134L+L150H+N156R+N196W+S199G+A222I+E284Q+H626*；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+Q134L+L150H+N156R+N196W+S199G+A222I+H626*；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+Q134L+L150H+N156R+N196W+S199G+N207W+A222I+E284Q；
E96K+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q+H626*；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+E96K+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
R64S+E96K+N196W+S199G+N207W+A222V；
N28W+D39R+N196W+S199G+N207W+A222V+E284Q；
D39R+N196W+S199G+A222V+E284Q+H626*；
D39R+N196W+S199G+N207W+A222V+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+D39R+N196W+S199G+A222V+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+N196W+N207W+E511D；
L150Y+N196W+S199G+N207W+A222V；
E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V+H626*；
E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+T208N+A222V+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+E96K+K101R+L150M+N156R+D179S+N196W+S199G+N207W+T208N+A222V+E284Q+H626*；
Q134L+L150H+N156R+N196W+S199G+A222I；
N28W+E96K+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
R64S+E96K+N196W+S199G+A222V+H626*；
R64S+E96K+N196W+S199G+A222V+E284Q；
E1*+T2*+A3*+N4*+K5*+S6*+N7*+K8*+R64S+E96K+N196W+S199G+A222V；
并且其中该变体具有α-淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性，但小于100％序列同一性。
12.根据权利要求1-8中任一项所述的变体，其中该α-淀粉酶包含选自以下的改变的组合：
S199G+H626*；
N196W+H626*
N196W+S199G+A222V+H 626*；
N196W+N207W+H626*：
L150Y+N196W+S199G+A222V
E96K+D179S+N196W+S199G+A222V+E284Q；
R64S+E96K+N196W+S199G+A222V；
并且其中该变体具有α-淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性，但小于100％序列同一性。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的变体，其中在pH 4.0下的增加的pH稳定性可以确定为该淀粉酶变体在pH 4.0、32℃下孵育18-24小时后的％残余α-淀粉酶活性(％RA)。
14.根据权利要求1-12中任一项所述的变体，其中在pH 4.0下的增加的pH稳定性可以确定为该变体淀粉酶在pH 4.0、32℃下孵育96小时，并且以小时为单位计算酶的半衰期后的残余α-淀粉酶活性。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的变体，其中与SEQ ID NO:1、2、3或4的亲本淀粉酶相比，半衰期增加了至少1.2、1.3、1.4、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0倍，例如至少8.0倍。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的变体，该变体进一步包含对应于K8N的取代。
17.根据前述权利要求中任一项所述的变体α-淀粉酶，该变体α-淀粉酶包含至少包含在SEQ ID NO:1的氨基酸12-438中的催化结构域，其中该变体具有α-淀粉酶活性，并且其中该催化结构域与SEQ ID NO:1的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性，但小于100％序列同一性，并且其中该变体任选地具有CBM。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的变体，其中接头和/或碳水化合物结合模块CBM已被异源CBM替代。
19.根据权利要求18所述的变体，其中该CBM包含SEQ ID NO:1的氨基酸527-626，并且氨基酸439-526包含接头区域。
20.根据权利要求17-19中任一项所述的变体，其中该异源CBM选自属于家族20、21、25、26、34、41或48的异源CBM。
21.根据权利要求20所述的变体，其中该CBM是家族20CBM。
22.根据权利要求18-21中任一项所述的变体，其中该CBM选自由以下组成的组：
i)SEQ ID NO:14的多肽或与SEQ ID NO:14的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的多肽；
ii)SEQ ID NO:15的多肽或与SEQ ID NO:15的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的多肽；
iii)SEQ ID NO:16的多肽或与SEQ ID NO:16的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的多肽；
iv)SEQ ID NO:17的多肽或与SEQ ID NO:17的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的多肽；
v)SEQ ID NO:18的多肽或与SEQ ID NO:18的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的多肽；以及
vi)SEQ ID NO:19的多肽或与SEQ ID NO:19的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的多肽。
23.根据权利要求18-22中任一项所述的变体，其中该接头在1至100个氨基酸之间。
24.一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸编码根据权利要求1-23中任一项所述的变体。
25.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含根据权利要求24所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在表达宿主中的产生的一个或多个控制序列。
26.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含根据权利要求24所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列。
27.根据权利要求26所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是酵母细胞，特别是酵母属，例如酿酒酵母。
28.一种产生根据权利要求1-23中任一项所述的变体α-淀粉酶的方法，该方法包括：
在适合于表达该变体的条件下培养根据权利要求26所述的重组宿主细胞；以及任选地回收该变体。
29.一种组合物，该组合物包含根据权利要求1-23中任一项所述的变体α-淀粉酶。
30.根据权利要求29所述的组合物，该组合物进一步包含至少一种葡糖淀粉酶。
31.一种全培养液配制品或细胞培养组合物，该全培养液配制品或细胞培养组合物包含
根据权利要求1-23中任一项所述的变体α-淀粉酶。
32.根据权利要求29所述的组合物，该组合物进一步包含表面活性剂。
33.根据权利要求32所述的组合物，其中该组合物包含表面活性剂或表面活性剂系统，其中该表面活性剂可以选自非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、兼性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂、及其混合物。
34.根据权利要求33所述的组合物，其中该组合物包含阴离子表面活性剂，特别是直链烷基苯磺酸盐(LAS)和/或醇乙氧基硫酸盐(AEOS)。
35.根据权利要求33所述的组合物，其中该组合物包含非离子表面活性剂，例如醇乙氧基化物(AEO)。
36.根据权利要求32-35中任一项所述的组合物，其中该组合物包含一种或多种阴离子表面活性剂和/或一种或多种非离子表面活性剂。
37.根据权利要求32-36中任一项所述的组合物，其中该组合物包含表面活性剂中的一种或多种，特别是直链烷基苯磺酸(LAS)、月桂醇聚醚硫酸钠(SLES)和/或醇乙氧基化物(AEO)。
38.根据权利要求1-23中任一项所述的变体α-淀粉酶用于生产糖浆和/或发酵产物的用途。
39.一种从含淀粉材料生产发酵产物的工艺，该工艺包括以下步骤：(a)在α-淀粉酶的存在下，在高于含淀粉材料的初始糊化温度下，将所述含淀粉材料液化；(b)将该液化的材料糖化；以及(c)用发酵生物体进行发酵；其中在至少一种根据权利要求1-23中任一项所述的变体α-淀粉酶和任选地葡糖淀粉酶的存在下进行步骤(b)。
40.根据权利要求39所述的工艺，其中步骤(b)和步骤(c)同时进行。
41.根据权利要求39-40中任一项所述的工艺，其中将根据权利要求26-27中任一项所述的宿主细胞作为该发酵生物体应用。
42.根据权利要求39所述的工艺，其中该宿主细胞进一步表达葡糖淀粉酶。
43.根据权利要求41-42中任一项所述的工艺，其中该宿主细胞进一步表达α-淀粉酶，该α-淀粉酶衍生自根毛霉属的菌株，优选微小根毛霉的菌株，例如具有来自黑曲霉葡糖淀粉酶的接头和淀粉结合结构域的微小根毛霉α-淀粉酶杂合体。
44.根据权利要求43所述的工艺，其中在发酵中由该宿主细胞进一步表达的α-淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含SEQ ID NO:12的多肽的α-淀粉酶；
(ii)包含如下氨基酸序列的α-淀粉酶，该氨基酸序列与SEQ ID NO:12的多肽具有至少60％，至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
45.根据权利要求44所述的工艺，其中该α-淀粉酶进一步包含以下取代中的一个或多个：G128D、D143N，优选G128D+D143N，使用SEQ ID NO:12进行编号。
46.根据权利要求39-45中任一项所述的工艺，其中该发酵生物体或宿主细胞是酵母细胞，特别是酵母属细胞，例如酿酒酵母。
47.根据权利要求39-46中任一项所述的工艺，其中该发酵产物是醇，例如乙醇。
48.根据权利要求39-47中任一项所述的工艺，其中该含淀粉材料是玉米。
49.一种从含淀粉材料生产糖浆产物的工艺，该工艺包括以下步骤：(a)在α-淀粉酶的存在下，在高于含淀粉材料的初始糊化温度的温度下，将所述含淀粉材料液化；(b)在至少一种根据权利要求1-23中任一项所述的变体α-淀粉酶和任选地葡糖淀粉酶的存在下，将该液化的材料糖化。
50.根据权利要求49所述的工艺，其中使用至少一种根据权利要求1-23中任一项所述的变体α-淀粉酶和第二α-淀粉酶进行步骤a)。
51.根据权利要求1-23中任一项所述的变体α-淀粉酶，其中该变体是分离的。
52.一种转基因植物、植物部分或植物细胞，该转基因植物、植物部分或植物细胞包含根据权利要求1-23中任一项所述的变体α-淀粉酶。
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