BR112020016677A2

BR112020016677A2 - Levedura melhorada para a produção de etanol

Info

Publication number: BR112020016677A2
Application number: BR112020016677-4A
Authority: BR
Inventors: Hamid Rismani Yazdi; Paul Victor Attfield; Philip John Livingstone Bell; Xin Li; Robert Lyle Osborne; Alan Jay House
Original assignee: Novozymes A/S; Microbiogen Pty. Ltd.
Priority date: 2018-02-15
Filing date: 2019-02-15
Publication date: 2020-12-15
Also published as: EP3752626A1; AU2019222480A8; AU2019222480A1; CA3107124A1; WO2019161227A1; MX2020008309A; CN112272707B; CN112272707A; US20210079430A1; US11473109B2

Abstract

são aqui descritas as cepas mbg5038 e mbg5012 de saccharomyces cerevisiae depositadas sob o tratado de budapeste e com os números de acesso nrrl y67549 e nrrl y67700, respectivamente, ou um derivado das cepas nrrl y67549 ou y67700 que exibem uma ou mais propriedades ou características definidoras das cepas mbg5038 ou mbg5012 de saccharomyces cerevisiae. também são descritas composições compreendendo a levedura saccharomyces e componentes de ocorrência natural e/ou não natural, bem como processos para a produção de etanol a partir de material contendo amido utilizando as cepas.

Description

“LEVEDURA MELHORADA PARA A PRODUÇÃO DE ETANOL” REFERÊNCIA A UMA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0001] Este pedido contém uma Listagem de Sequências em formato legível por computador, que é incorporada aqui por referência.

REFERÊNCIA A UM DEPÓSITO DE MATERIAL BIOLÓGICO

[0002] Este pedido contém uma referência a um depósito de material biológico, cujo é incorporado no presente documento a título de referência.

ÁREA

[0003] São aqui descritos processos, por exemplo, incluindo uma etapa de liquefação, para a produção de etanol a partir de um material contendo amido, usando leveduras para converter açúcares fermentáveis em etanol. Também são descritas cepas de levedura Saccharomyces com capacidade melhorada para fermentar açúcares em etanol, métodos para a produção de cepas de levedura Saccharomyces com capacidade melhorada para fermentar açúcares em etanol, e à utilização de cepas de levedura Saccharomyces com capacidade melhorada para fermentar açúcares em etanol na produção de etanol. Por fim, são também descritas composições que compreendem cepas de levedura Saccharomyces e componentes que ocorrem naturalmente e/ou que ocorrem não naturalmente.

ANTECEDENTES

[0004] A produção de etanol a partir de material contendo amido é bem conhecida na técnica. A produção de etanol como biocombustível se tornou uma indústria importante, tendo sido produzidos em todo o mundo em 2014 um excesso de 24 biliões de galões de etanol.

[0005] O processo comercial mais comumente utilizado na indústria, frequentemente referido como "processo convencional", inclui a liquefação de amido gelatinizado a alta temperatura (cerca de 85 °C) usando tipicamente uma alfa-amilase bacteriana, seguida de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) levadas a cabo anaerobicamente tipicamente na presença de uma glucoamilase e de levedura Saccharomyces cerevisae.

[0006] As leveduras que são usadas para produção de etanol para uso como combustível, tal como na indústria do etanol de milho, requerem várias características para assegurar produção rentável do etanol. Estas características incluem tolerância ao etanol, baixo rendimento de subprodutos, fermentação rápida e a capacidade de se limitar a quantidade de açúcares residuais permanecendo no fermento. Tais características têm um efeito pronunciado na viabilidade do processo industrial.

[0007] A levedura do gênero Saccharomyces exibe muitas das características requeridas para produção de etanol. Em particular, cepas de Saccharomyces cerevisiae são amplamente usadas para a produção de etanol na indústria de combustíveis de etanol. As cepas de Saccharomyces cerevisiae que são amplamente usadas na indústria de combustíveis de etanol podem produzir elevados rendimentos de etanol sob condições de fermentação encontradas, por exemplo, na fermentação de mosto de milho. Um exemplo de uma tal cepa é a levedura usada no produto de leveduras para etanol comercialmente disponível chamado ETHANOL RED®.

[0008] As cepas de Saccharomyces cerevisiae são utilizadas na indústria de combustíveis de etanol para fermentar açúcares tais como a glucose, frutose, sacarose e maltose, para produzir etanol através da via glicolítica. Estes açúcares são obtidos a partir de fontes tais como milho e outros grãos, suco de açúcar, melaços, suco de uva, sucos de fruta e vegetais amiláceos de raiz, e podem incluir a degradação de material celulósico em glucose.

[0009] Embora as cepas de Saccharomyces cerevisiae atualmente utilizadas na indústria de combustíveis de etanol sejam adequadas para a produção de etanol, existe uma necessidade crescente de melhorar a eficácia da produção de etanol devido ao aumento da procura de etanol como combustível, e aumento da disponibilidade de amido em novas cepas de milho.

[0010] Há, por conseguinte, necessidade de novas cepas robustas de levedura Saccharomyces capazes de melhorar a eficácia da produção de etanol na fermentação à escala industrial.

[0011] Adicionalmente, não obstante a melhoria significativa dos processos de produção de etanol durante a última década, ainda se deseja e necessita proporcionar processos de produção de etanol a partir de material contendo amido e levedura que pode ser usada em processos de etanol em escala comercial.

SUMÁRIO

[0012] São descritos aqui, inter alia, processos para produção de etanol, a partir de material contendo amido ou celulose, e levedura adequada para uso em tais processos.

[0013] Um primeiro aspecto se refere a processos de produção de etanol a partir de material contendo amido, que compreendem as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando uma alfa- amilase; ii) sacarificação usando uma glucoamilase; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é: (1) a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em

Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae com características definidoras da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae; ou (2) a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae com características definidoras da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae;

[0014] Em algumas modalidades, o derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae expressa uma glucoamilase e/ou uma alfa- amilase.

[0015] Conforme usado neste documento, os termos "propriedades" e "características definidoras" da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae e/ou cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae incluem pelo menos aumento de etanol aumentado (ou seja, rendimento de etanol) em comparação com a cepa de Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob Acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições. Outras

"propriedades" e "características definidoras" incluem, entre outras coisas, produção reduzida de acetaldeído, aumento da tolerância à temperatura e diminuição da produção de glicerol. Um organismo de fermentação aqui descrito, por exemplo, usado em um processo aqui descrito pode ter uma ou mais das "propriedades" e "características definidoras" mencionadas acima.

[0016] O organismo fermentador aqui descrito, especialmente a levedura Saccharomyces cerevisiae, com propriedades semelhantes às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae, ou com propriedades semelhantes às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 na Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae, com uma ou mais, tais como todas as seguintes propriedades e/ou características definidoras da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae;

[0017] aumento de etanol aumentado (isto é, rendimento de etanol) em comparação com a cepa de Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) sob as mesmas condições de processo;

[0018] produção reduzida de acetaldeído em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo;

[0019] aumento da tolerância à temperatura em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo;

[0020] diminuição da produção de glicerol em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo;

[0021] Um organismo fermentador descrito aqui pode ter uma ou mais, tal como todas, das "propriedades" ou "características definidoras" mencionadas acima.

[0022] De acordo com o processo de produção de etanol, a liquefação na etapa i) é levada a cabo submetendo material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial, tipicamente entre 80-90 °C, utilizando uma alfa-amilase. O pH na liquefação se encontra preferencialmente entre 4,5 e 6,0, tal como entre 4,8 e 5,8. Exemplos de alfa-amilases podem ser encontrados abaixo na seção "Alfa- Amilases Presentes e/ou Adicionadas Durante a Liquefação". Em uma modalidade, a alfa-amilase é uma alfa-amilase bacteriana termoestável. Em uma modalidade, a alfa-amilase é do gênero Bacillus, tal como uma cepa de Bacillus stearothermophilus, em particular uma variante de uma alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, tal como aquela apresentada na SEQ ID NO: 3 em WO 99/019467 ou SEQ ID NO: 1 aqui. Exemplos de variantes de alfa- amilases de Bacillus stearothermophilus adequadas podem ser encontrados abaixo na seção "Alfa-Amilases Termoestáveis", e incluem uma do seguinte grupo de variantes de alfa-amilases de Bacillus stearothermophilus com as mutações que se seguem: I181*+G182*, e opcionalmente N193F, e ainda uma das seguintes substituições ou combinações de substituições E129V+K177L+R179E;

V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+ Q254S; V59A+ Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; V59A+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; e E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando a SEQ ID NO: 1 para numeração).

[0023] Exemplos de outras alfa-amilases de Bacillus stearothermophilus adequadas com termoestabilidade aumentada em comparação com uma alfa-amilase de referência (alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus com as mutações I181*+G182*, e opcionalmente a substituição N193F, truncada no terminal C para ter 485-495 aminoácidos de comprimento, tal como cerca de 491 aminoácidos de comprimento) a pH 4,5 e 5,5, CaCl2 0,12 mM pode ser encontrado em WO 2011/082425 aqui incorporada por referência. (Ver também Exemplo 1 abaixo)

[0024] A liquefação na etapa i) pode ser levada a cabo usando uma combinação de alfa-amilase e protease. A protease pode ser uma protease com um valor de termoestabilidade de mais de 20%, determinada como Aividade Relativa a 80 °C/70 °C. Exemplos de proteases adequadas são descritos abaixo na seção "Proteases Presentes e/ou Adicionadas Durante a Liquefação".

[0025] A protease pode ser de origem fúngica, tal como de origem fúngica filamentosa. Exemplos específicos de proteases fúngicas adequadas são variantes de proteases de metaloproteases derivadas de uma cepa do gênero Thermoascus, preferencialmente de uma cepa de Thermoascus aurantiacus, especialmente da cepa Thermoascus aurantiacus CGMCC No. 0670 divulgada como a parte madura da SEQ ID NO: 2 divulgada em WO 2003/048353 ou a parte madura da SEQ ID NO: 1 em WO 2010/008841 ou SEQ ID NO: 3 aqui com uma das seguintes substituições ou combinações de substituições:

D79L+S87P+A112P+D142L; D79L+S87P+D142L; e A27K+ D79L+ Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L.

[0026] Exemplos de outras variantes de proteases adequadas podem ser encontrados em WO 2011/072191, incorporada neste documento como referência (Ver também o Exemplo 2 abaixo).

[0027] Proteases adequadas incluem também proteases bacterianas. Uma protease bacteriana adequada pode ser derivada de uma cepa de Pyrococcus, preferencialmente de uma cepa de Pyrococcus furiosus. Em uma modalidade preferida, a protease é a mostrada na SEQ ID NO: 1 em US 6,358,726 ou SEQ ID NO: 13 neste documento.

[0028] Em uma modalidade, estão presentes e/ou são adicionados 0,5-50 microgramas de protease de Pyrococcus furiosus por grama de DS, tal como 1-5 microgramas de protease de Pyrococcus furiosus por grama de DS, tal como cerca de 1,5 ou 3 microgramas de protease de Pyrococcus furiosus por grama de DS na etapa i) de liquefação.

[0029] Em uma modalidade, a alfa-amilase e/ou a protease adicionadas na etapa i) de liquefação são ainda combinadas com uma glucoamilase. Deste modo, também pode estar presente e/ou ser adicionada uma glucoamilase durante a etapa i) de liquefação. A glucoamilase pode ser termoestável. Isso significa que a glucoamilase tem uma estabilidade térmica a 85 °C, pH 5,3, de pelo menos 20%, tal como de pelo menos 30%, preferencialmente pelo menos 35%, determinada tal como descrito no Exemplo 4 (estabilidade térmica). Em uma modalidade, a glucoamilase presente e/ou adicionada na liquefação tem um pico ótimo de atividade relativa a pH 5,0 de pelo menos 90%, preferencialmente de pelo menos 95%, preferencialmente pelo menos 97%. Em uma modalidade, a glucoamilase tem uma estabilidade de pH a pH 5,0 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, determinada tal como descrito no Exemplo 4 (pH ótimo).

[0030] Uma glucoamilase adequada presente e/ou adicionada na etapa i) de liquefação pode ser derivada de uma cepa do gênero Penicillium, tal como de uma cepa de Penicillium oxalicum divulgada como SEQ ID NO: 2 no documento WO 2011/127802 ou SEQ ID NOs: 9 ou 14 aqui. Em uma modalidade, a glucoamilase é uma variante da glucoamilase de Penicillium oxalicum mostrada em SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 com uma substituição K79V (utilizando a sequência madura apresentada na SEQ ID NO: 14 para numeração), tal como uma variante divulgada em WO 2013/053801. Em uma modalidade, a glucoamilase de Penicillium oxalicum tem uma substituição K79V (usando SEQ ID NO: 14 para numeração) e adicionalmente uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: P11F + T65A + Q327F; e P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F (usando SEQ ID NO: 14 para numeração).

[0031] Exemplos de outras variantes de glucoamilases de Penicillium oxalicum adequadas podem ser encontrados em WO 2013/053801, incorporada neste documento como referência (Ver também o Exemplo 15 abaixo).

[0032] Em uma modalidade, a glucoamilase, tal como uma variante da glucoamilase de Penicillium oxalicum, utilizada na liquefação tem uma termoestabilidade determinada como Td por DSC a pH 4,0 como descrito no Exemplo 15 de pelo menos 70 °C, preferencialmente de pelo menos 75 °C, tal como de pelo menos 80 °C, tal como de pelo menos 81 °C, tal como de pelo menos 82 °C, tal como de pelo menos 83 °C, tal como de pelo menos 84 °C, tal como de pelo menos 85 °C, tal como de pelo menos 86 °C, tal como de pelo menos 87%, tal como de pelo menos 88 °C, tal como de pelo menos 89 °C, tal como de pelo menos 90 °C. Em uma modalidade, a glucoamilase, tal como uma variante da glucoamilase de Penicillium oxalicum tem uma termoestabilidade determinada como Td por DSC a pH 4,0 tal como descrito no Exemplo 15, no intervalo de 70 °C a 95 °C, tal como de 80 °C a 90 °C.

[0033] Em uma modalidade, a glucoamilase, tal como uma variante da glucoamilase de Penicillium oxalicum, utilizada na liquefação tem uma termoestabilidade determinada como Td por DSC a pH 4,8 como descrito no Exemplo 15 de pelo menos 70 °C, por exemplo, de pelo menos 75 °C, pelo menos 80 °C, pelo menos 81 °C, pelo menos 82 °C, pelo menos 83 °C, pelo menos 84 °C, pelo menos 85 °C, pelo menos 86 °C, pelo menos 87%, pelo menos 88 °C, pelo menos 89 °C, pelo menos 90 °C, ou pelo menos 91 °C. Em uma modalidade, a glucoamilase, tal como uma variante da glucoamilase de Penicillium oxalicum tem uma termoestabilidade determinada como Td por DSC a pH 4,8 tal como descrito no Exemplo 15, no intervalo de 70 °C a 95 °C, tal como de 80 °C a 90 °C.

[0034] Em uma modalidade, a glucoamilase, tal como uma variante da glucoamilase de Penicillium oxalicum, utilizada na liquefação tem uma atividade residual determinada tal como descrito no Exemplo 16, de pelo menos 100%, tal como de pelo menos 105%, pelo menos 110%, pelo menos 115%, pelo menos 120%, pelo menos 125%. Em uma modalidade, a glucoamilase, tal como uma variante da glucoamilase de Penicillium oxalicum, tem uma termoestabilidade determinada como atividade residual tal como descrito no Exemplo 16, no intervalo de 100% a 130%.

[0035] Para além disso, em uma modalidade, pode estar presente uma pululanase durante a liquefação em combinação com uma alfa-amilase, uma protease e/ou uma glucoamilase.

[0036] Em uma modalidade, pode estar presente e/ou ser adicionada uma glucoamilase na sacarificação e/ou fermentação, ou sacarificação e fermentação simultâneas. A glucoamilase pode não ser a mesma que a glucoamilase termoestável utilizada na liquefação.

[0037] Em uma modalidade, a glucoamilase expressa pelo derivado da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae, presente e/ou adicionada na sacarificação e/ou fermentação é de origem fúngica, tal como de origem fúngica filamentosa. Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada de uma cepa de Aspergillus, por exemplo, A. niger, A. awamori, ou A. oryzae; ou de uma cepa de Trichoderma, por exemplo de T. reesei; ou de uma cepa de Talaromyces, por exemplo T. emersonii; ou de uma cepa de Pycnoporus, ou de uma cepa de Gloephyllum, tal como G. serpiarium ou G. trabeum, ou de uma cepa dos Nigrofomes.

[0038] Em uma modalidade, a glucoamilase expressa pelo derivado da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae, presente e/ou adicionada na sacarificação e/ou fermentação é derivada de Talaromyces emersonii, tal como o mostrado na SEQ ID NO: 19 neste documento. Em uma outra modalidade, a glucoamilase é derivada de Gloeophyllum serpiarium, tal como aquela mostrada em SEQ ID NO: 15 neste documento. Em outra modalidade, a glucoamilase é derivada a partir de Gloeophyllum trabeum tal como aquela mostrada em SEQ ID NO: 17 neste documento.

[0039] Em uma modalidade, a glucoamilase expressa pelo derivado da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae, presente e/ou adicionada na sacarificação e/ou fermentação é uma variante da glucoamilase de Gloeophyllum trabeum divulgada em WO 2014/177546 (aqui incorporada por referência), especialmente uma variante com uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: V59A; S95P; A121P; T119W; S95P+A121P; V59A+S95P; S95P+T119W; V59A+S95P+A121P; e S95P+T119W+A121P, especialmente S95P+A121P (usando SEQ ID NO: 17 aqui para numeração).

[0040] Em uma modalidade, a glucoamilase está em combinação com uma alfa-amilase e, opcionalmente, uma protease. A alfa- amilase pode ser de origem fúngica ou bacteriana.

[0041] A alfa-amilase expressa pelo derivado da cepa MBG5038 ou MBG5012, de Saccharomyces cerevisiae, presente e/ou adicionada em combinação com uma glucoamilase pode ser derivada de uma cepa do gênero Rhizomucor, preferencialmente de uma cepa de Rhizomucor pusillus, tal como a mostrada na SEQ ID NO: 3 em WO 2013/006756, tal como um hibrido de alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com um ligante de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido, tal como o apresentado na SEQ ID NO: 16 neste documento.

[0042] Em uma modalidade, a alfa-amilase expressa pelo derivado da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae, presente e/ou adicionada é derivada de uma cepa de Rhizomucor pusillus, por exemplo, com um ligante glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (SBD), tal como o divulgado como SEQ ID NO: 16 neste documento, e pode ter uma ou mais das seguintes substituições: G128D, D143N, tal como G128D+D143N (usando SEQ ID NO: 16 para numeração).

[0043] Em uma modalidade, uma protease está presente e/ou é adicionada na sacarificação e/ou fermentação, ou SSF, que pode resultar em aumento do rendimento de etanol. Tal como descrito, por exemplo, na patente US No. 5,231,017 (aqui incorporada como referência) a protease pode, por exemplo, ser uma protease ácida fúngica. Uma protease também pode estar presente e/ou ser adicionada na sacarificação e/ou fermentação ou SSF, para melhorar o rendimento do óleo.

[0044] Em uma modalidade, uma composição de enzimas celulolíticas está presente e/ou é adicionada na sacarificação, fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). Exemplos de tais composições podem ser encontrados na seção “Composição de Enzimas

Celulolíticas presente e/ou adicionada durante a Sacarificação e/ou Fermentação” em baixo. Em uma modalidade, a enzima celulolítica está presente e/ou é adicionada conjuntamente com uma glucoamilase, tal como uma descrita em "glucoamilases Presentes E/Ou Adicionadas na Sacarificação e/ou Fermentação"-seção abaixo.

[0045] Um segundo aspecto se relaciona com processos de produção de etanol, a partir de um material contendo amido, tal como amido granular, compreendendo: (i) sacarificação de um material contendo amido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial; e (ii) fermentação usando um organismo de fermentação; em que o organismo fermentador é: (1) a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae com características definidoras da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae; ou (2) a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae com características definidoras da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae;

[0046] Em algumas modalidades, o derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae expressa uma glucoamilase e/ou uma alfa- amilase.

[0047] Em uma modalidade, é um processo de produção de etanol, a partir de um material contendo amido, tal como amido granular, compreendendo: (i) sacarificação de um material contendo amido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial; e (ii) fermentação usando um organismo de fermentação;

[0048] em que a sacarificação e/ou a fermentação é realizada na presença das seguintes enzimas: glucoamilase e alfa-amilase, e opcionalmente protease; e

[0049] em que o organismo fermentador é uma cepa de levedura Saccharomyces que fornece:

[0050] um aumento no rendimento de etanol em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de fermentação;

[0051] produção reduzida de acetaldeído em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo;

[0052] aumento da tolerância à temperatura em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red®

(depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo; e/ou

[0053] diminuição da produção de glicerol em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo;

[0054] Em uma modalidade, o organismo de fermentação é um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae com as características definidoras (por exemplo, aumento de elevado rendimento em etanol e/ou produção diminuída de glicerol da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae). Em algumas modalidades, o derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae expressa uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase.

[0055] Em uma modalidade, o organismo de fermentação é um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae com as características definidoras (por exemplo, aumento de elevado rendimento em etanol e/ou produção diminuída de glicerol da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae). Em algumas modalidades, o derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae expressa uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase.

[0056] Exemplos de enzimas adequadas usadas, especialmente glucoamilases, alfa-amilases, proteases, composições de enzimas celulolíticas etc. são descritas na seção "Enzimas e Misturas de Enzimas Usadas em um Processo de Hidrólise de Amido em Bruto" abaixo.

[0057] Um terceiro aspecto fornece (1) uma cepa de levedura Saccharomyces cerevisiae depositada sob o Tratado de Budapeste e com o número de acesso NRRL Y67549, ou um derivado da cepa NRRL Y67549 de Saccharomyces cerevisiae. Em algumas modalidades, o derivado da cepa NRRL Y67549 de Saccharomyces cerevisiae expressa uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase; ou 2) uma cepa de levedura Saccharomyces cerevisiae depositada ao abrigo do Tratado de Budapeste e com o número de acesso NRRL Y67700, ou um derivado da cepa NRRL Y67700 de Saccharomyces cerevisiae. Em algumas modalidades, o derivado da cepa NRRL Y67700 de Saccharomyces cerevisiae expressa uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase.

[0058] Um quarto aspecto fornece um método de produção de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositado sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA), compreendendo: (a) cultura de uma primeira cepa de levedura com uma segunda cepa de levedura, em que a segunda cepa de levedura é a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (ou um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae) ou a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (ou um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae), sob condições que permitem a combinação de DNA entre a primeira cepa de levedura e a segunda cepa de levedura; e (b) isolamento de cepas híbridas; e (c) repetição opcional das etapas (a) e (b) usando uma cepa híbrida isolada na etapa (b) como a primeira cepa de leveduras e/ou a segunda cepa de levedura. Em algumas modalidades, o derivado da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae expressa uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase.

[0059] Um quinto aspecto fornece um método de produção de uma cepa de Saccharomyces com as características definidoras da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA), compreendendo: (a) proporcionar: (i) uma primeira cepa de levedura; e (ii) uma segunda cepa de levedura, em que a segunda cepa de levedura é a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (ou um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae) ou a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (ou um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae); (b) cultura da primeira cepa de leveduras e da segunda cepa de leveduras sob condições que permitam a combinação do DNA entre a primeira cepa de leveduras e a segunda cepa de leveduras; (c) triagem ou seleção de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae; (d) repetição opcional das etapas (b) e (c) com a cepa triada ou selecionada da etapa (c) como primeira e/ou segunda cepa, até se obter um derivado que apresente as características definidoras da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae.

Em algumas modalidades, o derivado da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae expressa uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase.

[0060] Um sexto aspecto fornece um método de produção de um derivado recombinante da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositado sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA), compreendendo: (a) transformar a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (ou um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae) ou a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (ou um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae) com um ou mais vetores de expressão que codificam uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase; e (b) isolar a cepa transformada.

[0061] Um sétimo aspecto fornece uma cepa de Saccharomyces produzida pelo método do quarto, quinto ou sexto aspecto.

[0062] Um oitavo aspecto fornece uma cepa de Saccharomyces com as características definidoras da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou as características definidoras da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA).

[0063] Um oitavo aspecto proporciona um método para a produção de etanol, que compreende a incubação de uma cepa do primeiro,

quarto ou quinto aspecto com um substrato que compreende um açúcar fermentável sob condições que promovem a fermentação do açúcar fermentável para produzir etanol.

[0064] Um décimo aspecto proporciona a utilização de uma cepa do terceiro, sexto e sétimo aspecto na produção de etanol.

[0065] Um décimo primeiro aspecto proporciona um método de produção de grãos de destiladores, que compreende: (a) a incubação de uma cepa de Saccharomyces do terceiro, sétimo ou oitavo aspecto com um substrato que compreende açúcar fermentável sob condições que permitem a fermentação do açúcar fermentável para produzir etanol e grãos de destiladores; (b) o isolamento dos grãos de destiladores.

[0066] Um décimo segundo aspecto proporciona grãos de destiladores produzidos pelo método do décimo aspecto.

[0067] Um décimo terceiro aspecto proporciona a utilização de uma cepa do terceiro, sétimo ou oitavo aspecto na produção de grãos de destiladores.

[0068] Um décimo quarto aspecto fornece o uso de uma cepa do terceiro, sétimo ou oitavo aspecto na produção de uma cepa de Saccharomyces que exibe uma ou mais características definidoras da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA).

[0069] Um décimo quinto aspecto proporciona uma composição que compreende uma cepa de Saccharomyces do terceiro, sétimo ou oitavo aspecto.

[0070] Também são descritas composições compreendendo uma cepa de levedura Saccharomyces aqui descrita, por exemplo, cepa de MBC5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae, ou um seu derivado, e componentes de ocorrência natural e/ou não natural.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0071] A Fig. 1 mostra um rendimento melhorado de etanol a partir da fermentação da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae sob condições sem estresse, em sólidos de mistura variados (%).

[0072] A Fig. 2 mostra a produção reduzida de glicerol a partir da fermentação da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae sob condições sem estresse, em sólidos de mistura variados (%).

[0073] A Fig. 3 mostra um rendimento melhorado de etanol da fermentação da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae na presença de níveis elevados de ácido orgânico.

[0074] A Fig. 4 mostra diminuição da glucose residual da fermentação da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae na presença de níveis elevados de ácido orgânico.

[0075] A Fig. 5 mostra um rendimento melhorado de etanol a partir da fermentação da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae sob condições sem estresse, em sólidos de mistura elevados (%).

[0076] A Fig. 6 mostra diminuição da glucose residual da fermentação da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae sob condições sem estresse, em sólidos de mistura elevados (%).

[0077] A Fig. 7 mostra um rendimento melhorado de etanol da fermentação da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae na presença de níveis elevados de ácido orgânico.

[0078] A Fig. 8 mostra diminuição da glucose residual da fermentação da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae na presença de níveis elevados de ácido orgânico. Definições

[0079] Variante alélica: O termo "variante alélica" significa qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo lócus cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação e pode resultar em polimorfismo dentro de populações. As mutações genéticas podem ser silenciosas (sem mudança no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos tendo sequências de aminoácidos alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.

[0080] Domínio catalítico: O termo "domínio catalítico" significa a região de uma enzima contendo a maquinaria catalítica da enzima.

[0081] cDNA: O termo “cDNA” significa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa a partir de uma molécula de mRNA madura, processada, obtida a partir de uma célula eucariótica ou procariótica. O cDNA não tem sequências de íntrons que podem estar presentes no DNA genômico correspondente. O transcrito de RNA primário, inicial, é um precursor de mRNA que é processado através de uma série de etapas, incluindo processamento, antes de aparecer como mRNA maduro processado.

[0082] Sequência codificante: O termo "sequência codificante" significa um polinucleotídeo que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo. As fronteiras da sequência codificante são geralmente determinadas por uma grelha de leitura aberta, que começa com um códon de iniciação tal como ATG, GTG, ou TTG e termina com um códon de terminação tal como TAA, TAG ou TGA. A sequência codificante pode ser um DNA genômico, cDNA, DNA sintético ou uma sua combinação.

[0083] Sequências de controle: O termo "sequências de controle" significa sequências de ácidos nucleicos necessárias para expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser nativa (isto é, do mesmo gene) ou estranha (isto é, de um gene diferente) ao polinucleotídeo codificando o polipeptídeo ou nativa ou estranha entre si. Tais sequências de controle incluem, mas sem limitação, um líder, sequência de poliadenilação, sequência de pró-peptídeo, promotor, sequência de peptídeo-sinal e terminador da transcrição. Em um mínimo, as sequências de controle incluem um promotor, e sinais de paragem da transcricional e tradução. As sequências de controle podem ser dotadas de ligantes para a finalidade de introdução de sítios de restrição específicos, facilitando a ligação das sequências de controle com a região de codificação do polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo.

[0084] Expressão: O termo "expressão" inclui qualquer etapa envolvida na produção de um polipeptídeo, incluindo, mas sem limitação, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós-translacional e secreção.

[0085] Vetor de expressão: O termo "vetor de expressão" significa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo e está operacionalmente ligada a sequências de controle que proporcionam a sua expressão.

[0086] Fragmento: O termo "fragmento" designa um polipeptídeo que tem um ou mais (por exemplo, diversos) aminoácidos ausentes no terminal amino e/ou carboxila de um polipeptídeo ou domínio maduro; em que o fragmento tem atividade de pululanase.

[0087] Célula hospedeira: O termo “célula hospedeira” significa qualquer tipo de célula que seja suscetível a transformação, transfecção, transdução ou similar com um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção. O termo “célula hospedeira” abrange qualquer descendência de uma célula progenitora que não é idêntica à célula progenitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação.

[0088] Isolado: O termo "isolado" significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Os exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância de ocorrência não natural, (2) qualquer substância que inclui, mas sem limitação, qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que é pelo menos parcialmente removida de um ou mais ou todos os constituintes de ocorrência natural com os quais é associada em natureza; (3) qualquer substância modificada manualmente em relação a essa substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada aumentando-se a quantidade da substância em relação a outros componentes com os quais é naturalmente associada (por exemplo, produção recombinante em uma célula hospedeira; múltiplas cópias de um gene que codifica a substância; e uso de um promotor mais forte do que o promotor naturalmente associado ao gene que codifica a substância). Uma substância isolada pode estar presente em uma amostra de caldo de fermentação; por exemplo, uma célula hospedeira pode ser geneticamente modificada para expressar o polipeptídeo da invenção. O caldo de fermentação da célula hospedeira compreenderá o polipeptídeo isolado.

[0089] Polipeptídeo maduro: O termo “polipeptídeo maduro” significa um polipeptídeo em sua forma final após tradução e quaisquer modificações pós-tradução, como processamento N-terminal, truncamento C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc. É conhecido na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais polipeptídeos maduros diferentes (isto é, com um aminoácido C- terminal e/ou N-terminal diferente) expressos pelo mesmo polinucleotídeo. É também conhecido na técnica que diferentes células hospedeiras processam polipeptídeos diferentemente, e, assim, uma célula hospedeira expressando um polinucleotídeo pode produzir um polipeptídeo maduro diferente (por exemplo, tendo um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) em comparação com outra célula hospedeira expressando o mesmo polinucleotídeo.

[0090] Sequência codificante do polipeptídeo maduro: O termo "sequência codificante do polipeptídeo maduro" significa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro tendo atividade de protease.

[0091] Construto de ácido nucleico: O termo “construto de ácido nucleico” significa uma molécula de ácido nucleico, de feita simples ou dupla, que é isolada a partir de um gene ocorrendo naturalmente ou é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de uma maneira que não existiria de outro modo na natureza ou que é sintético, que compreende uma ou mais sequências de controle.

[0092] Operacionalmente ligado: O termo “operacionalmente ligado” significa uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação à sequência codificante de um polinucleotídeo tal que a sequência de controle dirija a expressão da sequência codificante.

[0093] Tal como usado neste documento, as formas singulares "um", "uma", e "o/a" incluem referência a plurais, a não ser que o contexto claramente indique o contrário. Assim, por exemplo, uma referência a "uma célula" inclui uma pluralidade de tais células. A menos que definidos de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado que comumente entendido por um cperitona técnica.

[0094] A referência a “cerca de” um valor ou parâmetro aqui inclui aspectos que são dirigidos a esse valor ou parâmetro per se. Por exemplo, a descrição se referindo a “cerca de X” inclui o aspecto “X”.

[0095] Como usada aqui, exceto onde o contexto requeira de outro modo devido à linguagem expressa ou implicação necessária, a palavra “compreendem” ou variações tais como “compreende” ou “compreendendo” é usada em um sentido inclusivo, isto é, para especificar a presença das características indicadas, mas não para excluir a presença ou a adição de características adicionais em várias modalidades.

DESCRIÇÃO DETALHADA Processos

[0096] São descritos aqui processos para a produção de etanol a partir de material contendo amido em um processo que inclui liquefação, sacarificação e fermentação. Os açúcares fermentáveis gerados durante a sacarificação são convertidos em etanol durante a fermentação por meio de leveduras.

[0097] Em um primeiro aspecto é um processo de produção de etanol a partir de material contendo amido, que compreendem as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando uma alfa- amilase; ii) sacarificação usando uma glucoamilase; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é: (1) a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em

[0098] Em algumas modalidades, o derivado da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae expressa uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase.

[0099] As etapas ii) e iii) são levadas a cabo sequencial ou simultaneamente (SSF). Em uma modalidade, as etapas ii) e iii) são realizadas simultaneamente (SSF). Fontes de Nitrogênio adicionadas Durante a Fermentação

[0100] Geralmente, os organismos fermentadores tais como leveduras, incluindo levedura Saccharomyces cerevisiae, requerem uma fonte adequada de nitrogênio para propagação e fermentação. Podem ser utilizadas muitas fontes de nitrogênio e essas fontes de nitrogênio são bem conhecidas na técnica. A fonte de nitrogênio pode ser orgânica, tal como ureia, DDG, bolo úmido ou mosto de milho, ou inorgânica, tal como amônia ou hidróxido de amônio. Em uma modalidade, a fonte de nitrogênio é ureia. Etapa i) de liquefação

[0101] De acordo com processos aqui descritos, a liquefação na etapa i) pode ser levada a cabo submetendo material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial a uma alfa-amilase e opcionalmente uma protease, e/ou uma glucoamilase. Podem também estar presentes e/ou ser adicionadas na liquefação outras enzimas tais como uma pululanase e uma fitase.

[0102] A etapa de liquefação i) pode ser levada a cabo durante 0,5-5 horas, tal como 1-3 horas, tal como tipicamente cerca de 2 horas.

[0103] O termo “temperatura de gelatinização inicial” significa a temperatura mais baixa à qual a gelatinização do material contendo amido começa. Em geral, o amido aquecido em água começa a gelatinizar entre cerca de 50 °C e 75 °C; a temperatura exata da gelatinização depende do amido específico e pode ser prontamente determinada pelo especialista. Assim, a temperatura de gelatinização inicial pode variar de acordo com a espécie de planta, com a variedade particular da espécie de planta bem como com as condições de crescimento. A temperatura de gelatinização inicial de um dado material contendo amido pode ser determinada como a temperatura à qual a birrefrigência é perdida em 5% dos grânulos de amido usando o método descrito por Gorinstein e Lii, 1992, Starch/Stärke 44 (12): 461-466.

[0104] A liquefação é tipicamente levada a cabo a uma temperatura na gama de 70-100 °C. Em uma modalidade, a temperatura na liquefação é entre 75-95 °C, tal como entre 75-90 °C, entre 80-90 °C ou entre 82-88 °C, tal como cerca de 85 °C.

[0105] Pode ser levada a cabo uma etapa de cozimento a jato antes da liquefação na etapa i). O cozimento a jato pode ser levado a cabo a uma temperatura entre 110-145 °C, 120-140 °C, 125-135 °C, ou cerca de 130 °C durante cerca de 1-15 minutos, durante cerca de 3-10 minutos, ou cerca de 5 minutos.

[0106] O pH durante a liquefação pode variar entre 4 e 7, tal como um pH de 4,5-6,5, pH 5,0-6,5, pH 5,0-6,0, pH 5,2-6,2, ou cerca de 5,2, cerca de 5,4, cerca de 5,6, ou cerca de 5,8.

[0107] Em uma modalidade, o processo compreende adicionalmente, antes da etapa i), as etapas de: a) redução do tamanho das partículas do material contendo amido, preferencialmente por moagem a seco; b) formação de uma pasta compreendendo o material contendo amido e água.

[0108] O material de partida contendo amido, tal como grãos integrais, pode ser reduzido no tamanho das partículas, por exemplo, por moagem, de modo a abrir a estrutura, para aumentar a área superficial, e permitir processamento adicional. Geralmente existem dois tipos de processos: moagem a úmido e a seco. Na moagem a seco, os grãos inteiros são moídos e usados. A moagem a úmido dá uma boa separação do gérmen e farelo (grânulos de amido e proteína). A moagem a úmido é frequentemente aplicada em localizações onde o hidrolisado de amido é usado na produção de, por exemplo, xaropes. Tanto a moagem a seco como a moagem a úmido são bem conhecidas na técnica de processamento de amido. Em uma modalidade, o material contendo amido é sujeito a moagem a seco. Em uma modalidade, o tamanho das partículas é reduzido até entre 0,05 e 3,0 mm, por exemplo, 0,1-0,5 mm, ou tal que pelo menos 30%, pelo menos 50%, pelo menos 70% ou pelo menos 90% do material contendo amido passe através de um crivo com uma grelha de 0,05 a 3,0 mm, por exemplo, grelha de 0,1-0,5 mm. Em outra modalidade, pelo menos 50%, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% do material contendo amido passa através de um crivo com grelha # 6.

[0109] A pasta semiaquosa pode conter 10-55% p/p de sólidos secos (DS), por exemplo, 25-45% p/p de sólidos secos (DS) ou 30- 40% p/p de sólidos secos (DS) de material contendo amido.

[0110] A alfa-amilase, opcionalmente uma protease, opcionalmente uma glucoamilase pode ser adicionada inicialmente à pasta aquosa para iniciar a liquefação (diluição). Em uma modalidade, somente uma porção das enzimas (por exemplo, cerca de 1/3) é adicionada à pasta semiaquosa, enquanto o resto das enzimas (por exemplo, cerca de 2/3) é adicionado durante a etapa de liquefação i).

[0111] Uma lista não exaustiva de exemplos de alfa- amilases pode ser encontrada abaixo na seção "Alfa-Amilases Presentes e/ou Adicionadas Durante a Liquefação". Em uma modalidade, a alfa-amilase é uma alfa-amilase bacteriana. As alfa-amilases bacterianas são tipicamente termoestáveis. Em uma modalidade, a alfa-amilase é do gênero Bacillus, tal como uma cepa de Bacillus stearothermophilus, em particular uma variante de uma alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, tal como aquela apresentada na SEQ ID NO: 3 em WO 99/019467 ou SEQ ID NO: 1 neste documento.

[0112] Em uma modalidade, a alfa-amilase tem uma estabilidade melhorada em comparação com uma alfa-amilase de referência (alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus com as mutações I181*+G182*, opcionalmente com uma substituição N193F, truncada para cerca de 491 aminoácidos, isto é, de 480-495 aminoácidos, (usando a SEQ ID NO: 1 do presente documento para numeração) determinada por incubação da alfa- amilase de referência e variantes a pH 4,5 e 5,5 e temperaturas de 75 °C e 85 °C com CaCl2 0,12 mM seguida da determinação da atividade residual usando o substrato EnzChek® (Kit de ensaio Ultra Amilase EnzChek®, E33651, Molecular Probes). Isto é descrito no Exemplo 1.

[0113] Exemplos de variantes de alfa-amilases de Bacillus stearothermophilus adequadas podem ser encontrados abaixo na seção "Alfa-Amilases Termoestáveis", e incluem uma do seguinte grupo de variantes de alfa-amilases de Bacillus stearothermophilus com as mutações que se seguem: I181*+G182*, e opcionalmente substituição N193F, e ainda uma das seguintes substituições ou combinações de substituições E129V+K177L+R179E; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+ Q254S; V59A+ Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; V59A+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; e E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando a SEQ ID NO: 1 para numeração).

[0114] Exemplos de outras alfa-amilases de Bacillus stearothermophilus adequadas com termoestabilidade aumentada em comparação com uma alfa-amilase de referência (alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus com as mutações I181*+G182*, e opcionalmente a substituição N193F, truncada no terminal C para ter 485-495 aminoácidos de comprimento, tal como cerca de 491 aminoácidos de comprimento) a pH 4,5 e 5,5, CaCl2 0,12 mM pode ser encontrado em WO 2011/082425 aqui incorporada por referência. (Ver também Exemplo 1 abaixo)

[0115] A liquefação na etapa i) pode ser levada a cabo usando uma combinação de alfa-amilase e protease. A protease pode ser uma protease com um valor de termoestabilidade de mais de 20%, determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C, determinada como descrito no Exemplo 2 (Atividade Relativa). Exemplos de proteases adequadas são descritos abaixo na seção "Proteases Presentes e/ou Adicionadas Durante a Liquefação".

[0116] A protease pode ser de origem fúngica, tal como de origem fúngica filamentosa. Exemplos específicos de proteases fúngicas adequadas são variantes de proteases de metaloproteases derivadas de uma cepa do gênero Thermoascus, por exemplo, de uma cepa de Thermoascus aurantiacus, tal como a cepa Thermoascus aurantiacus CGMCC No. 0670 divulgada como a parte madura da SEQ ID NO: 2 divulgada em WO 2003/048353 ou a parte madura da SEQ ID NO: 1 em WO 2010/008841 ou SEQ ID NO: 3 aqui com uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: D79L+S87P+A112P+D142L; D79L+S87P+D142L; e A27K+ D79L+ Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L.

[0117] Mais exemplos de variantes adequadas da protease de Thermoascus aurantiacus podem ser encontradas em WO 2011/072191, incorporada neste documento como referência (Ver também o Exemplo 2 abaixo).

[0118] Proteases adequadas incluem também proteases bacterianas. Uma protease bacteriana adequada pode ser derivada de uma cepa de Pyrococcus, por exemplo, de uma cepa de Pyrococcus furiosus. Em uma modalidade preferida, a protease é a mostrada na SEQ ID NO: 1 em US 6,358,726 ou SEQ ID NO: 13 neste documento.

[0119] Em uma modalidade, a alfa-amilase e/ou protease adicionadas na etapa i) de liquefação é/são ainda combinadas com uma glucoamilase. Deste modo, também pode estar presente e/ou ser adicionada uma glucoamilase durante a etapa i) de liquefação. A glucoamilase pode ser termoestável. Isto significa que a glucoamilase tem uma estabilidade térmica a 85 °C, pH 5,3, de pelo menos 20%, tal como de pelo menos 30%,

preferencialmente pelo menos 35%, determinada tal como descrito no Exemplo 4 (estabilidade térmica). Em uma modalidade, a glucoamilase presente e/ou adicionada na liquefação tem um pico ótimo de atividade relativa a pH 5,0 de pelo menos 90%, por exemplo, de pelo menos 95%, ou pelo menos 97%. Em uma modalidade, a glucoamilase tem uma estabilidade de pH a pH 5,0 de pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, ou pelo menos 90%, determinada tal como descrito no Exemplo 4 (estabilidade do pH).

[0120] Uma glucoamilase adequada presente e/ou adicionada na etapa i) de liquefação pode ser derivada de uma cepa do gênero Penicillium, especialmente uma cepa de Penicillium oxalicum divulgada como SEQ ID NO: 2 no documento WO 2011/127802 ou SEQ ID NOs: 9 ou 14 aqui. Em uma modalidade, a glucoamilase é uma variante da glucoamilase de Penicillium oxalicum mostrada em SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 com uma substituição K79V (utilizando a sequência madura apresentada na SEQ ID NO: 14 do presente documento para numeração), tal como uma variante divulgada em WO 2013/053801. Em uma modalidade, a glucoamilase de Penicillium oxalicum tem uma substituição K79V (usando SEQ ID NO: 14 para numeração) e adicionalmente uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: P11F + T65A + Q327F; e P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F (usando a SEQ ID NO: 14 para numeração).

[0121] Exemplos de outras variantes de glucoamilases de Penicillium oxalicum adequadas podem ser encontrados em WO 2013/053801, incorporada neste documento como referência (ver também os Exemplos 10-16 abaixo, tais como as variantes de glucoamilase de Penicillium oxalicum na Tabela 15).

[0122] Para além disso, de acordo com os processos aqui descritos, também pode estar presente uma pululanase durante a liquefação em combinação com uma alfa-amilase, uma protease e/ou uma glucoamilase. Sacarificação e Fermentação

[0123] Uma glucoamilase é expressa pelo derivado da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae, presente e/ou adicionada na etapa de sacarificação ii) e/ou etapa de fermentação iii) ou sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). A glucoamilase expressa pelo derivado da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae, adicionada na etapa ii) de sacarificação e/ou etapa iii) de fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) é tipicamente diferente da glucoamilase, opcionalmente adicionada na etapa i) de liquefação. Em uma modalidade, a glucoamilase é expressa e/ou é adicionada em conjunto com uma alfa-amilase fúngica. Podem ser encontrados exemplos de glucoamilases na seção “Glucoamilases Presentes e/ou Adicionadas na Sacarificação e/ou Fermentação” em baixo.

[0124] Quando se faz sacarificação e fermentação sequenciais, a etapa de sacarificação ii) pode ser levada a cabo sob condições bem conhecidas na técnica. Por exemplo, a etapa ii) de sacarificação pode durar até de cerca de 24 a cerca de 72 horas. Em uma modalidade, uma pré-sacarificação é feita. A pré-sacarificação é tipicamente feita durante 40-90 minutos a uma temperatura entre 30-65 °C, tipicamente cerca de 60 °C. A pré-sacarificação é, em uma modalidade, seguida por sacarificação durante a fermentação na sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). A sacarificação é tipicamente levada a cabo a temperaturas de 20-75 °C, preferencialmente de 40-70 °C, tipicamente em torno de 60 °C em tipicamente, a um pH entre 4 e 5, tal como cerca de pH 4,5.

[0125] O processo de sacarificação e fermentação simultâneas (“SSF”) é amplamente usado em processos de produção de produtos de fermentação à escala industrial, especialmente processos de produção de etanol. Quando se efetua a SSF, a etapa ii) de sacarificação e a etapa iii) de fermentação são levadas a cabo em simultâneo. Não existe etapa de espera para a sacarificação, significando que um organismo fermentador, tal como levedura, e enzima(s), podem ser adicionados em conjunto. No entanto está também contemplado adicionar o organismo fermentador e a(s) separadamente. A SSF é tipicamente levada a cabo a uma temperatura de 25 °C a 40 °C, tal como de 28 °C a 35 °C, tal como de 30 °C a 34 °C ou cerca de 32 °C. Em uma modalidade, a fermentação decorre durante 6 a 120 horas, em particular 24 a 96 horas. Em uma modalidade, o pH é entre 4-5.

[0126] Em uma modalidade, uma composição de enzimas celulolíticas está presente e/ou é adicionada na sacarificação, fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). Exemplos de tais composições de enzima celulolítica podem ser encontrados na seção “Composição de Enzimas Celulolíticas presente e/ou adicionada durante a Sacarificação e/ou Fermentação” em baixo. A composição da enzima celulolítica está presente e/ou é adicionada conjuntamente com uma glucoamilase, tal como uma descrita em "glucoamilases Presentes E/Ou Adicionadas na Sacarificação e/ou Fermentação"-seção abaixo. Materiais Contendo Amido

[0127] Qualquer material de partida adequado contendo amido pode ser usado com o processo aqui descrito. O material de partida é geralmente selecionado com base no produto de fermentação desejado, aqui o etanol. Exemplos de materiais de partida contendo amido incluem cereais, tubérculos ou grãos. Especificamente, o material contendo amido pode ser milho, trigo, cevada, centeio, milo, sagu, mandioca, tapioca, sorgo, aveia,

arroz, ervilhas, feijão ou batata-doce ou suas misturas. Estão também contemplados tipos cerosos e não cerosos de milho e cevada.

[0128] Em uma modalidade, o material de partida contendo amido é milho. Em uma modalidade, o material de partida contendo amido é trigo. Em uma modalidade, o material de partida contendo amido é cevada. Em uma modalidade, o material de partida contendo amido é centeio. Em uma modalidade, o material de partida contendo amido é milo. Em uma modalidade, o material de partida contendo amido é sagu. Em uma modalidade, o material de partida contendo amido é mandioca. Em uma modalidade, o material de partida contendo amido é tapioca. Em uma modalidade, o material de partida contendo amido é sorgo. Em uma modalidade, o material de partida contendo amido é arroz. Em uma modalidade, o material de partida contendo amido é ervilhas. Em uma modalidade, o material de partida contendo amido é feijões. Em uma modalidade, o material de partida contendo amido é batata-doce.

[0129] Em uma modalidade, o material de partida contendo amido é aveia. Fermentação

[0130] A fermentação é levada a cabo em um meio de fermentação. O meio de fermentação inclui o substrato da fermentação, isto é, a fonte de carboidratos que é metabolizada pelo organismo fermentador. Com os processos descritos aqui, o meio de fermentação pode compreender nutrientes e estimulante(s) do crescimento para o(s) organismo(s) fermentador(es). Nutrientes e estimulantes do crescimento são amplamente usados na técnica de fermentação e incluem fontes de nitrogênio, tais como amônia; ureia, vitaminas e minerais ou suas combinações. Organismos Fermentadores

[0131] A cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural

Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades praticamente iguais como as da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae, ou um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae, com características definidoras da cepa MBG5038, ou cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae, (depositado sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades semelhantes às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae, ou um derivado da cepa MBG5012, de Saccharomyces cerevisiae com características definidoras da cepa MBG5012, pode ser utilizado em um processo aqui descrito. Em uma modalidade, o organismo fermentador tem propriedades que são quase as mesmas da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae, pois fornece um aumento no rendimento de etanol em comparação com a cepa Ethanol Red® de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) sob as mesmas condições de processo.

[0132] Em uma modalidade, a cepa do organismo fermentador com propriedades que são aproximadamente as mesmas da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae tem pelo menos uma ou mais, tal como todas, as seguintes propriedades e características definidoras:

[0133] aumenta o rendimento de etanol em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo, por exemplo, condições como aqui descritas;

[0134] reduz a produção de acetaldeído em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo;

[0135] aumenta a tolerância à temperatura em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo; e

[0136] diminui a produção de glicerol em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo, condições como aqui descritas;

[0137] Numa modalidade, o organismo fermentador com propriedades semelhantes às da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae fornece um aumento no rendimento de etanol sobre a cepa Ethanol Red® de Saccharomyces cerevisiae (depositado sob o número de acesso V14 / 007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) de mais de 1,0%, por exemplo, mais de 2,0%, tal como mais de 2,5%, tal como cerca de 2,9% usando a mesma configuração e condições do processo, por exemplo, condições descritas aqui.

[0138] Em uma modalidade, o organismo fermentador com propriedades semelhantes às da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae, reduz a produção de acetaldeído em mais de 10%, por exemplo, mais de 20%, mais de 30%, mais de 40%, mais do que 45%, tal como entre 5-60%, tal como 30-50%, em comparação com a cepa Ethanol Red® de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso V14 / 007039 no National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo, por exemplo, condições aqui descritas.

[0139] Em uma modalidade, o organismo fermentador tendo propriedades que são quase as mesmas da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae, aumenta a tolerância à temperatura em comparação com a cepa Ethanol Red® de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) sob as mesmas condições de processo, por exemplo, condições aqui descritas.

[0140] O aumento da tolerância à temperatura é uma vantagem, pois a temperatura da fermentação pode flutuar em algum grau. Na parte inicial das plantas de fermentação, muitas vezes não aquecem ativamente a fermentação. A temperatura pode, portanto, aumentar naturalmente a partir do metabolismo da levedura. A planta pode usar permutadores de calor para controlar as temperaturas iniciais da fermentação, para que não suba muito. Durante a maior parte do ano, as plantas podem controlar facilmente a temperatura inicial e a temperatura máxima é tipicamente de 34 °C. No entanto, durante os meses de verão, a água de resfriamento usada nos permutadores de calor não é fria o suficiente para controlar as temperaturas. Portanto, em plantas que não possuem refrigeradores (isto é, um sistema de refrigeração a água), as temperaturas iniciais da fermentação podem atingir acima de 36,5 °C, o que estressa a levedura.

[0141] Em uma modalidade, o organismo fermentador com propriedades semelhantes às da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae, diminui a produção de glicerol em mais de 3%, por exemplo, mais de 4%, mais de 5%, mais de 6%, mais do que 7%, tal como entre 2-15%, tal como 5-10%, em comparação com a cepa Ethanol Red® de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso V14 / 007039 no National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo, por exemplo, condições aqui descritas.

Recuperação

[0142]Após a fermentação, por exemplo, SSF, o etanol pode ser separado do meio de fermentação. A pasta semifluida pode ser destilada para se recuperar/extrair o produto de fermentação desejado (isto é, etanol). Alternativamente, o produto de fermentação desejado (isto é, etanol) pode ser extraído a partir do meio de fermentação por técnicas de microfiltração ou filtração em membrana. O produto de fermentação (isto é, etanol) pode ser também recuperado por separação ou outro método bem conhecido na técnica. Alfa-Amilase Presente e/ou Adicionada Na Liquefação

[0143] A alfa-amilase aqui usada pode estar presente e/ou ser adicionada na liquefação, opcionalmente em conjunto com uma protease e/ou glucoamilase, e/ou opcionalmente pululanase, por exemplo, tal como divulgado em WO 2012/088303 (Novozymes) ou WO 2013/082486 (Novozymes), cujas referências estão ambas incorporadas como referência.

[0144] A alfa-amilase adicionada na etapa i) de liquefação pode ser qualquer alfa-amilase. Em uma modalidade, a alfa-amilase é uma alfa-amilase bacteriana, que pode ser estável à temperatura.

[0145] Qualquer alfa-amilase aqui descrita, incluindo qualquer alfa-amilase bacteriana, híbrida e/ou termoestável descrita abaixo, pode ser expressa pela cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae. Alfa-Amilase Bacteriana

[0146] O termo “alfa-amilase bacteriana” significa qualquer alfa-amilase bacteriana classificada sob EC 3.2.1.1. Uma alfa-amilase bacteriana usada aqui pode, por exemplo, ser derivada de uma cepa do gênero Bacillus, que é por vezes também referido como o gênero Geobacillus. Em uma modalidade, a alfa-amilase de Bacillus é derivada de uma cepa de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus ou Bacillus subtilis, mas pode ser também derivada de outras Bacillus sp.

[0147] Exemplos específicos de alfa-amilases bacterianas incluem a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus (BSG) da SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 1 neste documento, a alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (BAN) de SEQ ID NO: 5 em WO 99/19467, e a alfa-amilase de Bacillus licheniformis (BLA) de SEQ ID NO: 4 em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 21 do presente documento (todas as sequências são por este meio incorporadas a título de referência). Em uma modalidade, a alfa-amilase pode ser uma enzima tendo um grau de identidade de pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% com qualquer uma das sequências mostradas nas SEQ ID NOS: 3, 4 ou 5, respectivamente, em WO 99/19467.

[0148] Em uma modalidade, a alfa-amilase pode ser uma enzima tendo um grau de identidade de pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% com qualquer uma das sequências mostradas na SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 1 neste documento.

[0149] Em uma modalidade, a alfa-amilase é derivada de Bacillus stearothermophilus. A alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus pode ser um tipo selvagem maduro ou uma sua variante madura. As alfa- amilases maduras de Bacillus stearothermophilus podem ser naturalmente truncadas durante a produção recombinante. Por exemplo, a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus pode ser truncada no terminal C, tal que tenha de 480-495 aminoácidos em comprimento, tal como cerca de 491 aminoácidos em comprimento, por exemplo, tal que não tenha um domínio funcional de ligação ao amido (em comparação com SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467) ou SEQ ID NO: 1 aqui.

[0150] A alfa-amilase de Bacillus pode ser também uma variante e/ou híbrido. Exemplos de uma tal variante podem ser encontrados em qualquer uma das patentes WO 96/23873, WO 96/23874, WO 97/41213, WO 99/19467, WO 00/60059, e WO 02/10355 (cada uma aqui incorporada como referência). Variantes de alfa-amilase específicas são divulgadas nas Patentes U.S. Nos. 6,093,562, 6,187,576, 6,297,038 e 7,713,723 (aqui incorporadas como referência) e incluem variantes da alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus (frequentemente referida como alfa-amilase de BSG) com uma deleção de um ou dois aminoácidos nas posições R179, G180, I181 e/ou G182, preferencialmente uma dupla deleção divulgada em WO 96/23873 – consultar, por exemplo, a página 20, linhas 1-10 (aqui incorporada como referência), tal como correspondendo à deleção das posições I181 e G182 em comparação com a sequência de aminoácidos da alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus estabelecida na SEQ ID NO: 3 divulgada em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 1 neste documento ou à deleção dos aminoácidos R179 e G180 usando a SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 1 aqui para numeração (cuja referência é deste modo incorporada por referência). Em algumas modalidades, as alfa-amilases de Bacillus, tais como alfa-amilases de Bacillus stearothermophilus, têm uma dupla deleção correspondendo a uma deleção das posições 181 e 182 e compreendem adicionalmente opcionalmente uma substituição N193F (também denotada I181* + G182* + N193F) em comparação com a sequência de aminoácidos da alfa-amilase BSG de tipo selvagem indicada na SEQ ID NO: 3 divulgada em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 1 neste documento. A alfa-amilase bacteriana pode ter também uma substituição em uma posição correspondendo a S239 na alfa-amilase de Bacillus licheniformis mostrada na SEQ ID NO: 4 em WO 99/19467 ou SEQ ID NO:

21 do presente documento, ou uma variante S242 e/ou E188P da alfa- amilase de Bacillus stearothermophilus de SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 1 neste documento.

[0151] Em uma modalidade, a variante é uma variante S242A, E ou Q, por exemplo, uma variante S242Q, da alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus (usando SEQ ID NO: 1 aqui para numeração).

[0152] Em uma modalidade, a variante é uma variante da posição E188, por exemplo, uma variante E188P da alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus (usando SEQ ID NO: 1 aqui para numeração).

[0153] A alfa-amilase bacteriana pode, em uma modalidade, ser uma alfa-amilase de Bacillus truncada. Em uma modalidade, a truncagem é tal que, por exemplo, a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus mostrada na SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 1 do presente documento, tem cerca de 491 aminoácidos de comprimento, tal como de 480 a 495 aminoácidos de comprimento, ou então carece de um domínio funcional de ligação ao amido. Alfa-Amilases Híbridas Bacterianas

[0154] A alfa-amilase bacteriana pode ser também uma alfa-amilase bacteriana híbrida, por exemplo, uma alfa-amilase compreendendo 445 resíduos de aminoácidos C-terminais da alfa-amilase de Bacillus licheniformis (mostrada na SEQ ID NO: 4 de WO 99/19467) e os 37 resíduos de aminoácidos N-terminais da alfa-amilase derivada de Bacillus amyloliquefaciens (mostrada na SEQ ID NO: 5 de WO 99/19467). Em uma modalidade, este híbrido tem uma ou mais das, especialmente todas as, seguintes substituições:

[0155] G48A + T49I + G107A + H156Y + A181T + N190F + I201F + A209V + Q264S (usando a numeração de Bacillus licheniformis na SEQ ID NO: 4 de WO 99/19467) ou SEQ ID NO: 21 neste documento. Em algumas modalidades, as variantes têm uma ou mais das seguintes mutações (ou mutações correspondentes em outras alfa-amilases de Bacillus): H154Y, A181T, N190F, A209V e Q264S e/ou a deleção de dois resíduos entre as posições 176 e 179, por exemplo a deleção de E178 e G179 (usando SEQ ID NO: 5 de WO 99/19467 para numeração de posição ou SEQ ID NO: 21 neste documento).

[0156] Em uma modalidade, a alfa-amilase bacteriana é a parte madura da alfa-amilase quimérica divulgada em Richardson et al. (2002), The Journal of Biological Chemistry, Vol. 277, No 29, Edição de 19 de julho, pp. 267501-26507, referida como BD5088 ou uma sua variante. Esta alfa-amilase é a mesma que aquela mostrada na SEQ ID NO: 2 no documento WO 2007134207. A sequência da enzima madura começa após o aminoácido “Met” inicial na posição 1. Alfa-Amilase Termoestável

[0157] A alfa-amilase pode ser uma alfa-amilase termoestável, tal como uma alfa-amilase bacteriana termoestável, por exemplo, de Bacillus stearothermophilus. Em uma modalidade, a alfa- amilase usada em um processo descrito aqui tem um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 a 0,12 mM de pelo menos 10 determinado como descrito no Exemplo 1.

[0158] Em uma modalidade, a alfa-amilase termoestável tem um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 a 0,12 mM, de pelo menos 15.

[0159] Em uma modalidade, a alfa-amilase termoestável tem um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 a 0,12 mM, de pelo menos 20.

[0160] Em uma modalidade, a alfa-amilase termoestável tem um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 a 0,12 mM, de pelo menos 25.

[0161] Em uma modalidade, a alfa-amilase termoestável tem um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 a 0,12 mM, de pelo menos 30.

[0162] Em uma modalidade, a alfa-amilase termoestável tem um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 a 0,12 mM, de pelo menos 40.

[0163] Em uma modalidade, a alfa-amilase termoestável tem um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 a 0,12 mM, de pelo menos 50.

[0164] Em uma modalidade, a alfa-amilase termoestável tem um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 a 0,12 mM, de pelo menos 60.

[0165] Em uma modalidade, a alfa-amilase termoestável tem um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 a 0,12 mM, entre 10-70.

[0166] Em uma modalidade, a alfa-amilase termoestável tem um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 0,12 mM, entre 15 e 70.

[0167] Em uma modalidade, a alfa-amilase termoestável tem um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 0,12 mM, entre 20 e 70.

[0168] Em uma modalidade, a alfa-amilase termoestável tem um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 0,12 mM, entre 25 e 70.

[0169] Em uma modalidade, a alfa-amilase termoestável tem um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 0,12 mM, entre 30 e 70.

[0170] Em uma modalidade, a alfa-amilase termoestável tem um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 0,12 mM, entre 40 e 70.

[0171] Em uma modalidade, a alfa-amilase termoestável tem um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 0,12 mM, entre 50 e 70.

[0172] Em uma modalidade, a alfa-amilase termoestável tem um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 0,12 mM, entre 60 e 70.

[0173] Em uma modalidade, a alfa-amilase é uma alfa- amilase bacteriana, por exemplo, derivada do gênero Bacillus, tal como uma cepa de Bacillus stearothermophilus, por exemplo de Bacillus stearothermophilus tal como divulgada em WO 99/019467 como SEQ ID NO: 3 (SEQ ID NO: 1 do presente documento) com um ou dois aminoácidos deletados nas posições R179, G180, I181 e/ou G182, em particular com R179 e G180 deletadas, ou com I181 e G182 deletadas, com mutações na lista abaixo de mutações.

[0174] Em algumas modalidades, as alfa-amilases de Bacillus stearothermophilus têm uma dupla deleção I181 + G182, e substituição opcional N193F, compreendendo adicionalmente uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: V59A+Q89R+G112D+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+ Q254S; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+ Q254S; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+ D269E+D281N; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+I 270L; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+ H274K; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+ Y276F; V59A+E129V+R157Y+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+ Q254S; V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+ Q254S; V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+ H274K; V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+ Y276F; V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+ D281N; V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+ M284T;

V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+ G416V; V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S; V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T; A91L+M96I+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q 254S; E129V+K177L+R179E; E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F +L427M; E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T ; E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+N376* +I377*; E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S; E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T; E129V+K177L+R179E+S242Q; E129V+K177L+R179V+K220P+N224L+S242Q+Q254S; K220P+N224L+S242Q+Q254S; M284V; V59A+Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; e V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+ M284V;

[0175] Em uma modalidade, a alfa-amilase é selecionada do grupo de variantes de alfa-amilases de Bacillus stearothermophilus com dupla deleção I181*+G182*, e opcionalmente substituição N193F, e adicionalmente uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: E129V+K177L+R179E;

V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+ Q254S; V59A+Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+ M284V; e E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando SEQ ID NO: 1 aqui para numeração).

[0176] Deve ser entendido que quando se faz referência a alfa-amilases de Bacillus stearothermophilus e suas variantes elas são normalmente produzidas na forma truncada. Em particular, o truncamento pode ser tal que a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus mostrada na SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 1 neste documento, ou suas variantes, sejam truncadas no terminal C e tenham tipicamente de 480-495 aminoácidos em comprimento, tal como cerca de 491 aminoácidos em comprimento, por exemplo, tal que não tenha um domínio funcional de ligação ao amido.

[0177] Em uma modalidade, a variante de alfa-amilase pode ser uma enzima tendo um grau de identidade de pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, com a sequência mostrada na SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 1 aqui.

[0178] Em uma modalidade, a alfa-amilase bacteriana, por exemplo, alfa-amilase de Bacillus, tal como especialmente alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, ou sua variante, é doseada para a liquefação a uma concentração de 0,01-10 KNU-A/g de DS, por exemplo, entre 0,02 e 5 KNU-A/g de DS, tal como entre 0,03 e 3 KNU-A, preferencialmente 0,04 e 2 KNU-A/g de DS, tal como especialmente 0,01 e 2 KNU-A/g de DS. Em uma modalidade, a alfa-amilase bacteriana, por exemplo, alfa-amilase de Bacillus,

tal como especialmente alfa-amilases de Bacillus stearothermophilus, ou sua variante, é doseada para a liquefação a uma concentração de 0,0001-1 mg de EP (Proteína Enzimática)/g de DS, por exemplo, 0,0005-0,5 mg de EP/g de DS, tal como 0,001-0,1 mg de EP/g de DS. Protease Presente e/ou Adicionada Na Liquefação

[0179] Nos processos descritos aqui, a protease está opcionalmente presente e/ou é opcionalmente adicionada na liquefação em conjunto com alfa-amilase e uma glucoamilase e/ou pululanase opcionais.

[0180] As proteases são classificadas com base no seu mecanismo catalítico nos seguintes grupos: Serina proteases (S), Cisteína proteases (C), Proteases aspárticas (A), Metaloproteases (M) e Proteases desconhecidas ou ainda não classificadas (U), ver Handbook of Proteolytic Enzymes, A.J. Barrett, N.D. Rawlings, J.F. Woessner (eds), Academic Press (1998), em particular a parte da introdução geral.

[0181] Em uma modalidade, a protease termoestável usada de acordo com um processo descrito aqui é uma “metaloprotease” definida como uma protease pertencendo a EC 3.4.24 (metaloendopeptidases); preferencialmente EC 3.4.24.39 (metaloproteinases ácidas).

[0182] Para se determinar se uma dada protease é uma metaloprotease ou não, é feita referência ao “Handbook of Proteolytic Enzymes” acima e aos princípios indicados no mesmo. Tal determinação pode ser levada a cabo para todos os tipos de proteases, sejam proteases ocorrendo naturalmente ou de tipo selvagem; ou proteases geneticamente manipuladas ou sintéticas.

[0183] A atividade de protease pode ser medida usando qualquer ensaio adequado, no qual um substrato é empregue, que inclua ligações de peptídeos relevantes para a especificidade da protease em questão. O pH do ensaio e a temperatura do ensaio devem ser do mesmo modo adaptados para a protease em questão. Exemplos de valores de pH do ensaio são pH 6, 7, 8, 9, 10 ou 11. Exemplos de temperaturas do ensaio são 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 ou 80 °C.

[0184] Exemplos de substratos de proteases são caseína, tal como a Caseína Reticulada com Azurina (AZCL-caseína). Dois ensaios de protease são descritos em baixo na seção “Materiais & Métodos”, dos quais o assim chamado “Ensaio de AZCL-Caseína” é o ensaio preferencial.

[0185] Em uma modalidade, a protease termoestável tem pelo menos 20%, tal como pelo menos 30%, tal como pelo menos 40%, tal como pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 100% da atividade de protease da variante da Protease 196 ou das Pfu de Protease determinada pelo ensaio AZCL- caseína descrito na seção de "Materiais & Métodos".

[0186] Não existem nenhumas limitações quanto à origem da protease usada em um processo descrito aqui desde que ela cumpra com as propriedades de termoestabilidade definidas em baixo.

[0187] Em uma modalidade, a protease tem origem fúngica.

[0188] A protease pode ser uma variante, por exemplo, de uma protease de tipo selvagem desde que a protease tenha as propriedades de termoestabilidade definidas aqui. Em uma modalidade, a protease termoestável é uma variante de uma metaloprotease como definida acima. Em uma modalidade, a protease termoestável usada em um processo descrito aqui tem origem fúngica, tal como uma metaloprotease fúngica, tal como uma metaloprotease fúngica derivada de uma cepa do gênero Thermoascus, preferencialmente uma cepa de Thermoascus aurantiacus, especialmente Thermoascus aurantiacus CGMCC N.º 0670 (classificada como EC 3.4.24.39).

[0189] Em uma modalidade, a protease termoestável é uma variante da parte madura da metaloprotease mostrada na SEQ ID NO: 2 divulgada no documento WO 2003/048353 ou da parte madura de SEQ ID NO: 1 em WO 2010/008841 e mostrada como SEQ ID NO: 3 neste documento, opcionalmente com uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: S5*+D79L+S87P+A112P+D142L; D79L+S87P+A112P+T124V+D142L; S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L; N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L; T46R+D79L+S87P+T116V+D142L; D79L+P81R+S87P+A112P+D142L; A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L; D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L; D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L; D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L; D79L+S87P+A112P+D142L; D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L; S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L; D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L; A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L; D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L; D79L+S87P+A112P+D142L+T141C+M161C; S36P+D79L+S87P+A112P+D142L; A37P+D79L+S87P+A112P+D142L; S49P+D79L+S87P+A112P+D142L; S50P+D79L+S87P+A112P+D142L; D79L+S87P+D104P+A112P+D142L; D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L;

S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L; D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L; S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L; D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L; D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L; Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L; Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L; A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L; A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L; A27K+D79L+Y82F+ D104P+A112P+A126V+D142L; A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L; A27K+D79L+S87P+A112P+D142L; e D79L+S87P+D142L.

[0190] Em uma modalidade, a protease termoestável é uma variante da metaloprotease divulgada como a parte madura da SEQ ID NO: 2 divulgada em WO 2003/048353 ou a parte madura da SEQ ID NO: 1 em WO 2010/008841 ou SEQ ID NO: 3 aqui com uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: D79L+S87P+A112P+D142L; D79L+S87P+D142L; e A27K+ D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L.

[0191] Em uma modalidade, a variante de protease tem pelo menos 75% de identidade, preferencialmente, pelo menos, 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo da SEQ ID NO: 2 divulgada em WO 2003/048353 ou a parte madura da SEQ ID NO: 1 em WO 2010/008841 ou SEQ ID NO: 3 aqui.

[0192] A protease termoestável pode ser também derivada de qualquer bactéria desde que a protease tenha as propriedades de termoestabilidade.

[0193] Em uma modalidade, a protease termoestável é derivada de uma cepa da bactéria Pyrococcus, tal como de uma cepa de Pyrococcus furiosus (pfu de protease).

[0194] Em uma modalidade, a protease termoestável é uma mostrada como SEQ ID NO: 1 na patente dos EUA No. 6,358,726-B1 (Takara Shuzo Company) ou em SEQ ID NO: 13 neste documento.

[0195] Em uma modalidade, a protease termoestável é SEQ ID NO: 13 aqui ou uma protease tendo pelo menos 80% de identidade, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, de identidade com SEQ ID NO: 1 na patente dos EUA no. 6,358,726-B1 ou SEQ ID NO: 13 neste documento. A protease de Pyrococcus furiosus pode ser adquirida a partir da Takara Bio, Japão.

[0196] A protease de Pyrococcus furiosus é uma protease termoestável. Foi descoberto que o produto comercial protease de Pyrococcus furiosus (PfuS) tem uma termoestabilidade de 110% (80 °C/70 °C) e 103% (90 °C/70 °C) a pH 4,5 determinado como descrito no Exemplo

2.

[0197] Em uma modalidade, uma protease termoestável usada em um processo aqui descrito tem um valor de termoestabilidade de mais de 20%, determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C, determinada como descrito no Exemplo 2.

[0198] Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade de mais do que 30%, mais do que 40%, mais do que 50%, mais do que 60%, mais do que 70%, mais do que 80%, mais do que 90%, mais do que 100%, tal como mais do que 105%, tal como mais do que 110%, tal como mais do que 115%, tal como mais do que 120% determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C.

[0199] Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade de entre 20 e 50%, tal como entre 20 e 40%, tal como 20 e 30% determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C. Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade entre 50 e 115%, tal como entre 50 e 70%, tal como entre 50 e 60%, tal como entre 100 e 120%, tal como entre 105 e 115% determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C.

[0200] Em uma modalidade, a protease tem um valor de termoestabilidade de mais de 10%, determinada como Atividade Relativa a 85 °C/70 °C, determinada como descrito no Exemplo 2.

[0201] Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade de mais do que 10%, tal como mais do que 12%, mais do que 14%, mais do que 16%, mais do que 18%, mais do que 20%, mais do que 30%, mais do que 40%, mais do que 50%, mais do que 60%, mais do que 70%, mais do que 80%, mais do que 90%, mais do que 100%, mais do que 110% determinada como Atividade Relativa a 85 °C/70 °C.

[0202] Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade entre 10 e 50%, tal como entre 10% e 30%, tal como entre 10% e 25% determinada como Atividade Relativa a 85 °C/70 °C.

[0203] Em uma modalidade, a protease tem mais do que 20%, mais do que 30%, mais do que 40%, mais do que 50%, mais do que 60%, mais do que 70%, mais do que 80%, mais do que 90% determinada como Atividade Restante a 80 °C; e/ou a protease tem mais do que 20%,

mais do que 30%, mais do que 40%, mais do que 50%, mais do que 60%, mais do que 70%, mais do que 80%, mais do que 90% determinada como Atividade Restante a 84 °C.

[0204] A determinação da “Atividade Relativa” e “Atividade Restante” é feita conforme descrito no Exemplo 2.

[0205] Em uma modalidade, a protease pode ter uma termoestabilidade para acima de 90, tal como acima de 100 a 85 °C como determinada usando o teste de Zeína-BCA, como divulgado no Exemplo 3.

[0206] Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade acima de 60%, tal como acima de 90%, tal como acima de 100%, tal como acima de 110% a 85 °C como determinada usando o ensaio de Zeína-BCA.

[0207] Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade entre 60-120, tal como entre 70-120%, tal como entre 80- 120%, tal como entre 90-120%, tal como entre 100-120%, tal como 110- 120% a 85 °C como determinada usando o ensaio de Zeína-BCA.

[0208] Em uma modalidade, a protease termoestável tem pelo menos 20%, tal como pelo menos 30%, tal como pelo menos 40%, tal como pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 100% da atividade da variante da protease JTP196 ou Protease Pfu determinada por o ensaio de AZCL-caseína. Glucoamilase Expressa, Presente e/ou Adicionada Na Etapa i) de Liquefação

[0209] Uma glucoamilase pode estar opcionalmente expressa, presente e/ou ser adicionada na etapa i) de liquefação. Em uma modalidade, a glucoamilase é adicionada conjuntamente com a, ou separadamente da, alfa-amilase e/ou protease e/ou pululanase adicionais.

[0210] Em uma modalidade, a glucoamilase tem uma Atividade Relativa com estabilidade térmica a 85 °C de pelo menos 20%, pelo menos 30%, ou pelo menos 35%, determinada tal como descrito no Exemplo 4 (estabilidade térmica).

[0211] Em uma modalidade, a glucoamilase tem uma atividade relativa pH ótimo a pH 5,0 de pelo menos 90%, por exemplo, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou 100% determinada como descrito no Exemplo 4 (pH ótimo).

[0212] Em uma modalidade, a glucoamilase tem uma estabilidade de pH a pH 5,0 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, determinada tal como descrito no Exemplo 4 (estabilidade do pH).

[0213] Em uma modalidade, a glucoamilase, tal como uma variante da glucoamilase de Penicillium oxalicum, utilizada na liquefação tem uma termoestabilidade determinada como Td por DSC a pH 4,0 como descrito no Exemplo 15 de pelo menos 70 °C, preferencialmente de pelo menos 75 °C, tal como de pelo menos 80 °C, tal como de pelo menos 81 °C, tal como de pelo menos 82 °C, tal como de pelo menos 83 °C, tal como de pelo menos 84 °C, tal como de pelo menos 85 °C, tal como de pelo menos 86 °C, tal como de pelo menos 87%, tal como de pelo menos 88 °C, tal como de pelo menos 89 °C, tal como de pelo menos 90 °C. Em uma modalidade, a glucoamilase, tal como uma variante da glucoamilase de Penicillium oxalicum tem uma termoestabilidade determinada como Td por DSC a pH 4,0 tal como descrito no Exemplo 15, no intervalo de 70 °C a 95 °C, tal como de 80 °C a 90 °C.

[0214] Em uma modalidade, a glucoamilase, tal como uma variante da glucoamilase de Penicillium oxalicum, utilizada na liquefação tem uma termoestabilidade determinada como Td por DSC a pH 4,8 como descrito no Exemplo 15, de pelo menos 70 °C, preferencialmente de pelo menos 75 °C, tal como de pelo menos 80 °C, tal como de pelo menos 81 °C, tal como de pelo menos 82 °C, tal como de pelo menos 83 °C, tal como de pelo menos 84 °C, tal como de pelo menos 85 °C, tal como de pelo menos 86 °C, tal como de pelo menos 87%, tal como de pelo menos 88 °C, tal como de pelo menos 89 °C, tal como de pelo menos 90 °C, tal como de pelo menos 91 °C. Em uma modalidade, a glucoamilase, tal como uma variante da glucoamilase de Penicillium oxalicum tem uma termoestabilidade determinada como Td por DSC a pH 4,8 tal como descrito no Exemplo 15, no intervalo de 70 °C a 95 °C, tal como de 80 °C a 90 °C.

[0215] Em uma modalidade, a glucoamilase, tal como uma variante da glucoamilase de Penicillium oxalicum, utilizada na liquefação tem uma atividade residual determinada tal como descrito no Exemplo 16, de pelo menos 100%, tal como de pelo menos 105%, tal como de pelo menos 110%, tal como de pelo menos 115%, tal como de pelo menos 120%, tal como de pelo menos 125%. Em uma modalidade, a glucoamilase, tal como uma variante da glucoamilase de Penicillium oxalicum, tem uma termoestabilidade determinada como atividade residual tal como descrito no Exemplo 16, no intervalo de 100% a 130%.

[0216] Em uma modalidade, a glucoamilase, por exemplo, de origem fúngica tal como um fungo filamentoso, de uma cepa do gênero Penicillium, por exemplo, uma cepa de Penicillium oxalicum, em particular a glucoamilase de Penicillium oxalicum divulgada como SEQ ID NO: 2 no documento WO 2011/127802 (que é deste modo incorporada por referência) e mostrada na SEQ ID NO: 9 ou 14 neste documento.

[0217] Em uma modalidade, a glucoamilase tem pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com o polipeptídeo maduro mostrado na SEQ ID NO: 2 no documento WO 2011/127802 ou SEQ ID NOs: 9 ou 14 neste documento.

[0218] Em uma modalidade, a glucoamilase é uma variante da glucoamilase de Penicillium oxalicum divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 e mostrada na SEQ ID NO: 9 e 14 aqui, tendo uma substituição K79V (usando a sequência madura mostrada na SEQ ID NO: 14 aqui para numeração). A variante da glucoamilase K79V tem uma sensibilidade reduzida à degradação da protease relativamente à glucoamilase de origem, tal como divulgado em WO 2013/036526 (que aqui é incorporada como referência).

[0219] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada de Penicillium oxalicum.

[0220] Em uma modalidade, a glucoamilase é uma variante da glucoamilase de Penicillium oxalicum divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 e mostrada na SEQ ID NO: 9 e 14 no presente documento. Em uma modalidade, a glucoamilase de Penicillium oxalicum é aquela divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 e mostrada na SEQ ID NO: 9 e 14 do presente documento com Val (V) na posição 79 (usando a SEQ ID NO: 14 aqui para numeração).

[0221] Variantes de glucoamilase de Penicillium oxalicum contempladas são divulgadas em WO 2013/053801 que é deste modo incorporada por referência.

[0222] Em uma modalidade, estas variantes têm sensibilidade reduzida à degradação por proteases.

[0223] Em uma modalidade, estas variantes têm termoestabilidade melhorada em comparação com original.

[0224] Em uma modalidade, a glucoamilase tem uma substituição K79V (usando a SEQ ID NO: 14 neste documento para numeração), correspondendo à variante PE001 e, adicionalmente, compreende uma das seguintes alterações ou combinações de alterações.

[0225] T65A; Q327F; E501V; Y504T; Y504*; T65A + Q327F; T65A + E501V; T65A + Y504T; T65A + Y504*; Q327F + E501V; Q327F + Y504T; Q327F + Y504*; E501V + Y504T; E501V + Y504*; T65A + Q327F + E501V; T65A + Q327F + Y504T; T65A + E501V + Y504T; Q327F + E501V + Y504T; T65A + Q327F + Y504*; T65A + E501V + Y504*; Q327F + E501V + Y504*; T65A + Q327F + E501V + Y504T; T65A + Q327F + E501V + Y504*; E501V + Y504T; T65A + K161S; T65A + Q405T; T65A + Q327W; T65A + Q327F; T65A + Q327Y; P11F + T65A + Q327F; R1K + D3W + K5Q + G7V + N8S + T10K + P11S + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F; P11F + D26C + K33C + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; R1E + D3N + P4G + G6R + G7A + N8A + T10D+ P11D + T65A + Q327F; P11F + T65A + Q327W; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; T65A + Q327F + E501V + Y504T; T65A + S105P + Q327W; T65A + S105P + Q327F; T65A + Q327W + S364P; T65A + Q327F + S364P; T65A + S103N + Q327F; P2N + P4S + P11F + K34Y + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + D445N + V447S; P2N + P4S + P11F + T65A + I172V + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + N502*; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + N502T + P563S + K571E; P2N + P4S + P11F + R31S + K33V + T65A + Q327F + N564D + K571S; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + S377T; P2N + P4S + P11F + T65A + V325T+ Q327W; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + D445N + V447S + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + I172V + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + S377T + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + D26N + K34Y + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + I375A + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + K218A + K221D + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + S103N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + T10D + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + F12Y + T65A + Q327F + E501V + Y504T; K5A + P11F + T65A + Q327F + E501V

+ Y504T; P2N + P4S + T10E + E18N + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + T10E + E18N + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T + T568N; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T + K524T + G526A; P2N + P4S + P11F + K34Y + T65A + Q327F + D445N + V447S + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + R31S + K33V + T65A + Q327F + D445N + V447S + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + D26N + K34Y + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + F80* + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + K112S + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T + T516P + K524T + G526A; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + N502T + Y504*; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + S103N + Q327F + E501V + Y504T; K5A + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T + T516P + K524T + G526A; P2N + P4S + P11F + T65A + V79A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + V79G + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + V79I + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + V79L + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + V79S + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + L72V + Q327F + E501V + Y504T; S255N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + E74N + V79K + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + G220N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Y245N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q253N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + D279N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + S359N + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + D370N + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + V460S + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + V460T + P468T + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + T463N + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A +

Q327F + S465N + E501V + Y504T; e P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + T477N + E501V + Y504T.

[0226] Em uma modalidade, a variante de glucoamilase de Penicillium oxalicum tem uma substituição K79V (usando SEQ ID NO: 14 aqui para numeração), correspondendo à variante PE001, e compreende adicionalmente uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: P11F + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F; P11F + D26C + K33C + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327W + E501V +Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; e P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T.

[0227] A glucoamilase pode ser adicionada em quantidades de 0,1-100 microgramas de EP/g, tal como 0,5-50 microgramas de EP/g, tal como 1-25 microgramas de EP/g, tal como 2-12 microgramas de EP/g de DS. Pululanase Presente e/ou Adicionada Na Etapa i) de Liquefação

[0228] Opcionalmente pode estar presente e/ou ser adicionada uma pululanase durante a etapa i) de liquefação, conjuntamente com uma alfa-amilase, e/ou protease e/ou glucoamilase opcionais.

[0229] A pululanase pode estar presente e/ou ser adicionada na etapa i) de liquefação e/ou etapa ii) de sacarificação, ou sacarificação e fermentação simultâneas (SSF).

[0230] As pululanases (E.C. 3.2.1.41, pululana 6- glucanoidrolase), são enzimas desramificadoras caracterizadas pela sua capacidade de hidrolisarem as ligações alfa-1,6-glicosídicas, por exemplo, na amilopectina e pululana.

[0231] As pululanases contempladas incluem as pululanases de Bacillus amyloderamificans divulgadas na Patente dos E.U.A. 4,560,651 (deste modo incorporada por referência), a pululanase divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 01/151620 (deste modo incorporada por referência), a Bacillus deramificans divulgada como SEQ ID NO: 4 em WO 01/151620 (deste modo incorporada por referência) e a pululanase de Bacillus acidopullulyticus divulgada como SEQ ID NO: 6 em WO 01/151620 (deste modo incorporada por referência) e também descrita em FEMS Mic. Let. (1994), 115, 97-106.

[0232] Pululanases adicionais contempladas incluem as pululanases de Pyrococcus woesei, especificamente de Pyrococcus woesei DSM N.º 3773 divulgadas em WO92/02614.

[0233] Em uma modalidade, a pululanase é uma pululanase da família GH57. Em uma modalidade, a pululanase inclui um domínio X47 como divulgado em US 61/289,040 publicada como WO 2011/087836 (que aqui deste modo incorporadas por referência). Mais especificamente, a pululanase pode ser derivada de uma cepa do gênero Thermococcus, incluindo Thermococcus litoralis e Thermococcus hydrothermalis, tal como a pululanase de Thermococcus hydrothermalis apresentada na SEQ ID NO: 11 truncada no sítio X4 imediatamente após o domínio X47 (isto é, aminoácidos 1-782 nas SEQ ID NOs: 11 e 12 no presente documento). A pululanase também pode ser um híbrido das pululanases de Thermococcus litoralis e Thermococcus hydrothermalis ou uma enzima híbrida de T. hydrothermalis/T. litoralis com o sítio de truncagem X4 divulgado em US 61/289,040 publicada como WO 2011/087836 (aqui incorporada como referência) e divulgada na SEQ ID NO: 12 neste documento.

[0234] Em outra modalidade, a pululanase é uma compreendendo um domínio X46 divulgado no documento WO 2011/076123 (Novozymes).

[0235] A pululanase pode ser adicionada em uma quantidade eficaz que inclua a quantidade preferencial de cerca de 0,0001- 10 mg de proteína enzimática por grama de DS, preferencialmente 0,0001- 0,10 mg de proteína enzimática por grama de DS, mais preferencialmente 0,0001-0,010 mg de proteína enzimática por grama de DS. A atividade de pululanase pode ser determinada como NPUN. Um Ensaio para determinação de NPUN é descrito na seção ”Materiais & Métodos” em baixo.

[0236] Produtos de pululanase adequados comercialmente disponíveis incluem PROMOZYME D, PROMOZYME™ D2 (Novozymes A/S, Dinamarca), OPTIMAX L-300 (DuPont-Danisco, EUA) e AMANO 8 (Amano, Japão). Glucoamilase Expressa, Presente E/Ou Adicionada na Sacarificação e/ou Fermentação

[0237] A glucoamilase pode estar expressa, presente e/ou ser adicionada na sacarificação, fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). A glucoamilase pode ser derivada de qualquer fonte adequada, por exemplo, derivada de um microrganismo ou uma planta. As glucoamilases preferenciais têm origem fúngica ou bacteriana, selecionadas do grupo consistindo em glucoamilases de Aspergillus, em particular glucoamilases G1 ou G2 de Aspergillus niger (Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), p. 1097-1102), ou suas variantes, tais como aquelas divulgadas em WO 92/00381, WO 00/04136 e WO 01/04273 (a partir da Novozymes, Dinamarca); a glucoamilase de A. awamori divulgada em WO 84/02921, glucoamilase de Aspergillus oryzae (Agric. Biol. Chem. (1991), 55 (4), p. 941- 949) ou suas variantes ou fragmentos. Outras variantes de glucoamilases de Aspergillus incluem variantes com estabilidade térmica intensificada: G137A e G139A (Chen et al. (1996), Prot. Eng. 9, 499-505); D257E e D293E/Q (Chen et al. (1995), Prot. Eng. 8, 575-582); N182 (Chen et al. (1994), Biochem. J. 301, 275-281); ligações de dissulfeto, A246C (Fierobe et al. (1996), Biochemistry, 35, 8698-8704); e introdução de resíduos de Pro nas posições A435 e S436 (Li et al. (1997), Protein Eng. 10, 1199-1204).

[0238] Outras glucoamilases incluem glucoamilase de Athelia rolfsii (previamente denotada Corticium rolfsii) (ver patente dos EUA no. 4,727,026 e (Nagasaka et al. (1998) “Purification and properties of the raw-starch-degrading glucoamylases from Corticium rolfsii”, Appl Microbiol Biotechnol 50: 323-330), glucoamilases de Talaromyces, em particular derivadas de Talaromyces emersonii (WO 99/28448), Talaromyces leycettanus (patente dos EUA no. Re. 32,153), Talaromyces duponti, Talaromyces thermophilus (patente dos EUA no. 4,587,215). Em uma modalidade, a glucoamilase usada durante a sacarificação e/ou fermentação é a glucoamilase de Talaromyces emersonii divulgada em WO 99/28448.

[0239] Glucoamilases bacterianas contempladas incluem glucoamilases do gênero Clostridium, em particular C. thermoamylolyticum (EP 135,138) e C. thermohydrosulfuricum (WO 86/01831).

[0240] Glucoamilases fúngicas contempladas incluem Trametes cingulate (SEQ ID NO: 20), Pachykytospora papyracea; e Leucopaxillus giganteus, todas divulgadas em WO 2006/069289; ou Peniophora rufomarginata divulgada em WO2007/124285; ou uma sua mistura. São também contempladas glucoamilases híbridas. Exemplos incluem as glucoamilases híbridas divulgadas no documento WO 2005/045018. Exemplos específicos incluem a glucoamilase híbrida divulgada nas Tabelas 1 e 4 do Exemplo 1 (híbridos esses que são deste modo incorporados por referência).

[0241] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada de uma cepa do gênero Pycnoporus, em particular, uma cepa de Pycnoporus como descrita em WO 2011/066576 (SEQ ID NOs 2, 4 ou 6), incluindo glucoamilase de Pycnoporus sanguineus divulgada como SEQ ID NO: 18 do presente documento, ou de uma cepa do gênero Gloeophyllum, tal como de uma cepa de Gloeophyllum sepiarium ou Gloeophyllum trabeum, em particular de uma cepa de Gloeophyllum tal como descrita em WO 2011/068803 (SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ou 16). Em uma modalidade, a glucoamilase tem SEQ ID NO: 2 em WO 2011/068803 ou SEQ ID NO: 15 do presente documento (isto é, glucoamilase de Gloeophyllum sepiarium).

[0242] Em uma modalidade, a glucoamilase tem SEQ ID NO: 17 do presente documento (isto é, glucoamilase de Gloeophyllum trabeum divulgada como SEQ ID NO: 3 em WO2014/177546). Em uma outra modalidade, a glucoamilase é derivada de uma cepa do gênero Nigrofomes, em particular de uma cepa de Nigrofomes sp. divulgada em WO 2012/064351 (SEQ ID NO: 2) (todas as referências deste modo incorporadas por referência).

[0243] São também contempladas glucoamilases que exibem uma elevada identidade com qualquer uma das glucoamilases acima mencionadas, isto é, pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mesmo 100% de identidade com qualquer uma das partes maduras das sequências de enzimas mencionadas acima, tais como qualquer um de SEQ ID NOs: 15, 17, 18 ou 19 do presente documento, respetivamente, preferencialmente a SEQ ID NO: 15 do presente documento ou a SEQ ID NO: 17 neste documento.

[0244] As glucoamilases podem ser adicionadas à sacarificação e/ou fermentação em uma quantidade de 0,0001-20 AGU/g de DS, preferencialmente 0,001-10 AGU/g de DS, especialmente 0,01-5 AGU/g de DS, tal como 0,1-2 AGU/g de DS.

[0245] As glucoamilases podem ser adicionadas à sacarificação e/ou fermentação em uma quantidade de 1-1.000 µg de EP/g de DS, preferencialmente 10-500 µg de EP/g de DS, especialmente entre 25- 250 µg de EP/g de DS.

[0246] Em uma modalidade, a glucoamilase é adicionada como uma combinação compreendendo adicionalmente uma alfa-amilase. Em uma modalidade, a alfa-amilase é uma alfa-amilase fúngica, especialmente uma alfa-amilase fúngica ácida. A alfa-amilase é tipicamente uma atividade secundária.

[0247] Em uma modalidade, a glucoamilase é uma combinação compreendendo glucoamilase de Talaromyces emersonii divulgada em WO 99/28448 como SEQ ID NO: 34 e SEQ ID NO: 19 aqui e glucoamilase de Trametes cingulata divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 06/069289 e SEQ ID NO: 20 neste documento.

[0248] Em uma modalidade, a glucoamilase é uma combinação compreendendo glucoamilase de Talaromyces emersonii divulgada em WO 99/28448 (SEQ ID NO: 19 aqui), glucoamilase de Trametes cingulata divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 06/69289 e SEQ ID NO: 20 apresentada neste documento e uma alfa-amilase.

[0249] Em uma modalidade, a glucoamilase é uma combinação compreendendo glucoamilase de Talaromyces emersonii divulgada em WO99/28448 (SEQ ID NO: 19 aqui), glucoamilase de Trametes cingulata divulgada em WO 06/69289 (SEQ ID NO: 20 neste documento) e alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase e SBD de Aspergillus niger, divulgada como V039 na Tabela 5 em WO 2006/069290 ou SEQ ID NO: 16 neste documento.

[0250] Em uma modalidade, a glucoamilase é uma combinação compreendendo glucoamilase de Gloeophyllum sepiarium mostrada como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/068803 (SEQ ID NO: 15 neste documento) e uma alfa-amilase, em particular alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (SBD), divulgada na SEQ ID NO: 3 em WO 2013/006756, em particular com as seguintes substituições: G128D + D143N.

[0251] Em uma modalidade, a alfa-amilase pode ser derivada de uma cepa do gênero Rhizomucor, preferencialmente uma cepa de Rhizomucor pusillus, tal como aquela mostrada na SEQ ID NO: 3 em WO2013/006756, ou do gênero Meripilus, preferencialmente uma cepa de Meripilus giganteus. Em uma modalidade, a alfa-amilase é derivada a partir de uma Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase e domínio de ligação ao amido (SBD) de Aspergillus niger, divulgada como V039 na Tabela 5 em WO 2006/069290 ou SEQ ID NO: 16 neste documento.

[0252] Em uma modalidade, a alfa-amilase de Rhizomucor pusillus ou a alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (SBD) tem pelo menos uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: D165M; Y141W; Y141R; K136F; K192R; P224A; P224R; S123H+Y141W; G20S + Y141W; A76G + Y141W; G128D + Y141W; G128D + D143N; P219C + Y141W; N142D + D143N; Y141W + K192R; Y141W + D143N; Y141W + N383R; Y141W + P219C + A265C; Y141W + N142D + D143N; Y141W + K192R V410A; G128D + Y141W + D143N; Y141W + D143N + P219C; Y141W + D143N + K192R; G128D + D143N + K192R; Y141W + D143N + K192R + P219C; e G128D + Y141W + D143N + K192R; ou G128D + Y141W + D143N + K192R + P219C (usando SEQ ID NO: 3 em WO 2013/006756 para numeração ou a SEQ ID NO: 16 aqui).

[0253] Em uma modalidade, a combinação de glucoamilases compreende glucoamilase de Gloeophyllum sepiarium (por exemplo, SEQ ID NO: 2 em WO 2011/068803 ou SEQ ID NO: 15 deste documento) e alfa-amilase de Rhizomucor pusillus.

[0254] Em uma modalidade, a combinação de glucoamilases compreende glucoamilase de Gloeophyllum sepiarium mostrada como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/068803 ou SEQ ID NO: 15 aqui e Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase e domínio de ligação ao amido (SBD) de Aspergillus niger, divulgada como SEQ ID NO: 3 em WO 2013/006756 e SEQ ID NO: 16 aqui com as seguintes substituições: G128D + D143N.

[0255] Composições compreendendo glucoamilase comercialmente disponíveis incluem AMG 200L; AMG 300 L; SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L, SPIRIZYME™ PLUS, SPIRIZYME™ FUEL, SPIRIZYME™ B4U, SPIRIZYME™ ULTRA, SPIRIZYME™ EXCEL, SPIRIZYME ACHIEVE™ e AMG™ E (a partir da Novozymes A/S); OPTIDEX™ 300, GC480, GC417 (a partir da DuPont-Danisco); AMIGASE™ e AMIGASE™ PLUS (a partir da DSM); G-ZYME™ G900, G-ZYME™ e G990 ZR (a partir da DuPont-Danisco). Composições de Enzima Celulolítica presentes e/ou adicionadas durante a Sacarificação e/ou a Fermentação.

[0256] Uma composição de enzima celulolítica compreendendo uma beta-glucosidase, uma celobio-hidrolase e uma endoglucanase pode estar presente na sacarificação ou fermentação ou na sacarificação e fermentação simultâneas (SSF).

[0257] Exemplos de composições de enzima celulolítica adequadas podem ser encontrados em WO 2008/151079 e WO 2013/028928 que são incorporadas por referência.

[0258] Em modalidades preferenciais, a composição de enzimas celulolíticas é derivada a partir de uma cepa de Trichoderma, Humicola ou Chrysosporium.

[0259] Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolíticas é derivada a partir de uma cepa de Trichoderma reesei, Humicola insolens e/ou Chrysosporium lucknowense.

[0260] Em uma modalidade, a composição de enzima celulolítica compreende uma beta-glucosidase, por exemplo, uma derivada de uma cepa do gênero Aspergillus, como Aspergillus oryzae, como a divulgada em WO 2002/095014 ou a proteína de fusão tendo atividade de beta-glucosidase divulgada em WO 2008/057637, ou Aspergillus fumigatus, tal como a divulgada em WO 2005/047499, por exemplo, SEQ ID NO: 29 neste documento) ou uma variante de beta-glucosidase Aspergillus fumigatus divulgada em WO 2012/044915 (Novozymes), tal como a que apresenta as seguintes substituições: F100D, S283G, N456E, F512Y (usando a SEQ ID NO: 29 neste documento para numeração); ou uma cepa do gênero Penicillium, tal como uma cepa da Penicillium brasilianum divulgada em WO 2007/019442, ou uma cepa do gênero Trichoderma, tal como uma cepa de Trichoderma reesei.

[0261] Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolíticas compreende um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica tal como um derivado a partir do gênero Thermoascus, tal como uma cepa de Thermoascus aurantiacus, tal como aquele descrito em WO 2005/074656 como SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 30 aqui; ou um derivado do gênero Thielavia, tal como uma cepa de Thielavia terrestris, tal como aquele descrito em WO 2005/074647 como SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8; ou um derivado a partir de uma cepa de Aspergillus, tal como uma cepa de Aspergillus fumigatus, tal como aquela descrito no documento WO 2010/138754 como SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2; ou um derivado a partir de uma cepa derivada a partir de Penicillium, tal como uma cepa de Penicillium emersonii, tal como aquele divulgado em WO 2011/041397 como SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 31 neste documento.

[0262] Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolíticas compreende uma celobio-hidrolase I (CBH I), tal como uma derivada de uma cepa do gênero Aspergillus, tal como uma cepa de Aspergillus fumigatus, tal como a CBH I Cel7a divulgada na SEQ ID NO: 2 em WO 2013/028928 ou SEQ ID NO: 32 neste documento, ou uma cepa do gênero Trichoderma, tal como uma cepa de Trichoderma reesei.

[0263] Em uma modalidade, a composição de enzima celulolítica compreende uma celobio-hidrolase II (CBH II), tal como uma derivada de uma cepa do gênero Aspergillus, tal como uma cepa de Aspergillus fumigatus, tal como a divulgada como SEQ ID NO: 4 em WO 2013/028928 ou SEQ ID NO: 33 neste documento); ou uma cepa do gênero Trichoderma, tal como Trichoderma reesei, ou uma cepa do gênero Thielavia, tal como uma cepa de Thielavia terrestris, tal como celobio- hidrolase II CEL6A de Thielavia terrestris.

[0264] Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolíticas compreende um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica e uma beta-glucosidase.

[0265] Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolíticas compreende um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificante celulolítica, uma beta-glucosidase e uma CBH I.

[0266] Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolíticas compreende um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificante celulolítica, uma beta-glucosidase, uma CBH I e uma CBH II.

[0267] Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolíticas é uma composição de enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei, compreendendo adicionalmente o polipeptídeo GH61A de Thermoascus aurantiacus tendo atividade intensificadora celulolítica (SEQ ID NO: 2 em WO 2005/074656 ou SEQ ID NO: 30 aqui) e proteína de fusão de beta-glucosidase de Aspergillus oryzae (WO 2008/057637).

[0268] Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolíticas é uma composição de enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei, compreendendo adicionalmente o polipeptídeo GH61A de Thermoascus aurantiacus tendo atividade intensificadora celulolítica (SEQ ID NO: 2 em WO 2005/074656 ou SEQ ID NO: 30 aqui) e beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 2 de WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 29 no presente documento).

[0269] Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolíticas é uma composição de enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei compreendendo adicionalmente um polipeptídeo GH61A de Penicillium emersonii tendo atividade intensificadora celulolítica divulgado como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/041397 ou SEQ ID NO: 31 aqui e beta- glucosidase de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 2 de WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 29 aqui) ou uma sua variante com as seguintes substituições F100D, S283G, N456E, F512Y (usando SEQ ID NO: 29 para numeração).

[0270] Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolíticas compreende um ou mais dos seguintes componentes: (i) uma celobio-hidrolase I de Aspergillus fumigatus; (ii) uma celobio-hidrolase II de Aspergillus fumigatus; (iii) uma beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus ou sua variante; e (iv) um polipeptídeo GH61 de Penicillium sp. tendo atividade intensificadora celulolítica; ou seus homólogos.

[0271] Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolíticas é derivada a partir de Trichoderma reesei compreendendo um polipeptídeo GH61A com atividade intensificadora celulolítica derivado a partir de uma cepa de Penicillium emersonii (SEQ ID NO: 2 em WO 2011/041397 ou SEQ ID NO: 31 aqui, beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 2 em WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 29 aqui) com as seguintes substituições: F100D, S283G, N456E, F512Y) divulgada em WO 2012/044915; CBH1 Cel7A de Aspergillus fumigatus divulgada como SEQ ID NO: 6 em WO2011/057140 ou SEQ ID NO: 32 aqui e CBH II de Aspergillus fumigatus divulgada como SEQ ID NO: 18 em WO 2011/057140 ou SEQ ID NO: 33 neste documento.

[0272] Em uma modalidade, a composição de enzima celulolítica é doseada de 0,0001-3 mg de EP/g de DS, preferencialmente 0,0005-2 mg de EP/g de DS, preferencialmente 0,001-1 mg/g de DS, mais preferencialmente 0,005-0,5 mg de EP/g de DS e, ainda mais preferencialmente, 0,01-0,1 mg de EP/g de DS. Exemplos de Processos Preferenciais

[0273] Em uma modalidade, é um processo de produção de etanol a partir de material contendo amido, que compreendem as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando uma alfa- amilase derivada de Bacillus stearothermophilus (por exemplo, SEQ ID NO: 1 neste documento). ii) sacarificação usando uma glucoamilase; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é: (1) a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5038; ou (2) a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5012.

[0274] Em uma modalidade, o derivado da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae expressa uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase.

[0275] Em uma modalidade, é adicionada uma protease na sacarificação e/ou fermentação ou SSF.

[0276] Em uma modalidade, são processos de produção de etanol a partir de material contendo amido, que compreendem as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando uma alfa- amilase derivada de Bacillus stearothermophilus compreendendo uma dupla deleção nas posições I181 + G182 e, opcionalmente, uma substituição N193F; (usando a SEQ ID NO: 1 para numeração); ii) sacarificação usando uma glucoamilase, por exemplo, uma derivada de uma cepa de Gloephyllum, tal como Gloephyllum serpiarium ou Gloephyllum trabeum; iii) fermentação usando um organismo fermentador;

em que o organismo fermentador é: (1) a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou uma cepa com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5038 de Saccharomyces; ou (2) a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou uma cepa com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5012 de Saccharomyces.

[0277] Em uma modalidade, o derivado da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae expressa uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase.

[0278] Em uma modalidade, são processos de produção de etanol a partir de material contendo amido, que compreendem as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando: uma alfa-amilase derivada de Bacillus stearothermophilus (por exemplo, SEQ ID NO: 1);

uma protease com um valor de termoestabilidade de mais de 20%, determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C, preferencialmente derivada de Pyrococcus furiosus e/ou Thermoascus aurantiacus; e opcionalmente uma glucoamilase de Penicillium oxalicum; ii) sacarificação usando uma glucoamilase; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é: (1) a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou uma cepa com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5038 de Saccharomyces; ou (2) a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou uma cepa com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5012 de Saccharomyces.

[0279] Em uma modalidade, o derivado da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae expressa uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase.

[0280] Em uma modalidade, são processos de produção de etanol a partir de material contendo amido, que compreendem as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando uma alfa- amilase, preferencialmente derivada de Bacillus stearothermophilus, em particular uma compreendendo uma dupla deleção nas posições I181 + G182 e, opcionalmente, uma substituição N193F (usando a SEQ ID NO: 1 para numeração) e com um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 0,12 mM, de pelo menos 10; ii) sacarificação usando uma glucoamilase; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é: (1) a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou uma cepa com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5038 de Saccharomyces; ou (2) a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou uma cepa com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa

MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5012 de Saccharomyces.

[0281] Em uma modalidade, o derivado da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae expressa uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase.

[0282] Em uma modalidade, são processos de produção de etanol a partir de material contendo amido, que compreendem as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura entre 80-90 °C: uma alfa-amilase, preferencialmente derivada de Bacillus stearothermophilus, em particular uma tendo um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 0,12 mM, de pelo menos 10; uma protease, preferencialmente derivada de Pyrococcus furiosus e/ou Thermoascus aurantiacus, com um valor de termoestabilidade de mais de 20%, determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C; opcionalmente uma glucoamilase de Penicillium oxalicum ii) sacarificação usando uma glucoamilase; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é: (1) a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou uma cepa com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5038 de Saccharomyces; ou (2) a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou uma cepa com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5012 de Saccharomyces.

[0283] Em uma modalidade, o derivado da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae expressa uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase.

[0284] Em uma modalidade, são processos de produção de etanol a partir de material contendo amido, que compreendem as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando: uma alfa-amilase derivada de Bacillus stearothermophilus com uma deleção dupla nas posições I181 + G182, e uma substituição opcional N193F; e opcionalmente ainda uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: E129V+K177L+R179E; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+ Q254S: V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V; V59A+ E129V+ K177L+R179E+Q254S+M284V; e

E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando SEQ ID NO: 1 apresentada neste documento para numeração); ii) sacarificação usando uma glucoamilase, tal como uma de uma cepa de Gloephyllum, tal como uma cepa de Gloephyllum serpiarium; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é: (1) a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou uma cepa com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5038 de Saccharomyces; ou (2) a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou uma cepa com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5012 de Saccharomyces.

[0285] Em uma modalidade, o derivado da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae expressa uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase.

[0286] Em uma modalidade, são processos de produção de etanol a partir de material contendo amido, que compreendem as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando: uma alfa-amilase derivada de Bacillus stearothermophilus com uma deleção dupla nas posições I181 + G182, e uma substituição opcional N193F, e opcionalmente ainda uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: E129V+K177L+R179E; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+ Q254S: V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V; V59A+ E129V+ K177L+R179E+Q254S+M284V; e E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando SEQ ID NO: 1 aqui para numeração). uma protease com um valor de termoestabilidade de mais de 20%, determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C, preferencialmente derivada de Pyrococcus furiosus e/ou Thermoascus aurantiacus; e opcionalmente uma glucoamilase de Penicillium oxalicum apresentada na SEQ ID NO: 14 tendo uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: K79V; K79V+ P11F + T65A + Q327F; K79V+P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F; K79V +P11F + D26C + K33C + T65A + Q327F; K79V +P2N + P4S + P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T;

K79V +P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; e K79V +P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T (usando SEQ ID NO: 14 para numeração). ii) sacarificação usando uma glucoamilase; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é: (1) a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou uma cepa com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5038 de Saccharomyces; ou (2) a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou uma cepa com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5012 de Saccharomyces.

[0287] Em uma modalidade, o derivado da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae expressa uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase.

[0288] Em uma modalidade, são processos de produção de etanol a partir de material contendo amido, que compreendem as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura entre 80-90 °C usando: uma alfa-amilase derivada de Bacillus stearothermophilus com uma deleção dupla nas posições I181 + G182, e uma substituição opcional N193F, e opcionalmente ainda uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: E129V+K177L+R179E; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+ Q254S; V59A+Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V; e E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando SEQ ID NO: 1 deste documento para numeração), uma protease com um valor de termoestabilidade de mais de 20%, determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C, preferencialmente derivada de Pyrococcus furiosus e/ou Thermoascus aurantiacus; uma glucoamilase de Penicillium oxalicum apresentada na SEQ ID NO: 14 tendo uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: K79V; K79V+ P11F + T65A + Q327F; K79V+P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F; K79V +P11F + D26C + K33C + T65A + Q327F; K79V +P2N + P4S + P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T;

[0289] Em uma modalidade, o derivado da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae expressa uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase.

[0290] Em uma modalidade, são processos de produção de etanol a partir de material contendo amido, que compreendem as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando: uma alfa-amilase derivada de Bacillus stearothermophilus compreendendo uma deleção dupla nas posições I181 + G182, e uma substituição opcional N193F; uma protease com um valor de termoestabilidade de mais de 20%, determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C, preferencialmente derivada de Pyrococcus furiosus e/ou Thermoascus aurantiacus; e opcionalmente uma pululanase; uma glucoamilase de Penicillium oxalicum com uma substituição K79V (utilizando a SEQ ID NO: 14 para numeração); ii) sacarificação usando uma glucoamilase; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é: (1) a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou uma cepa com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5038 de Saccharomyces; ou (2) a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em

Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou uma cepa com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5012 de Saccharomyces.

[0291] Em uma modalidade, o derivado da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae expressa uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase.

[0292] Em uma modalidade, são processos de produção de etanol a partir de material contendo amido, que compreendem as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando: uma alfa-amilase, preferencialmente derivada de Bacillus stearothermophilus, com um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 0,12 mM, de pelo menos 10; entre 0,5 e 10 microgramas de protease de Pyrococcus furiosus por g de DS; ii) sacarificação usando uma glucoamilase selecionada do grupo de glucoamilases derivadas de uma cepa de Aspergillus, preferencialmente A. niger, A. awamori, ou A. oryzae; ou de uma cepa de Trichoderma, preferencialmente T. reesei; ou de uma cepa de Talaromyces, preferencialmente T. emersonii, ou de uma cepa de Pycnoporus, ou de uma cepa de Gloeophyllum, tal como G. serpiarium ou G. trabeum, ou de uma cepa de Nigrofomes; iii) fermentação usando um organismo fermentador;

em que o organismo fermentador é: (1) a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou uma cepa com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5038 de Saccharomyces; ou (2) a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou uma cepa com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5012 de Saccharomyces.

[0293] Em uma modalidade, o derivado da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae expressa uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase.

[0294] Em uma modalidade, são processos de produção de etanol a partir de material contendo amido, que compreendem as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura entre 80-90 °C usando; uma alfa-amilase, preferencialmente derivada de Bacillus stearothermophilus, com uma deleção dupla nas posições I181

+ G182 e uma substituição opcional N193F, e com T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 0,12 mM, de pelo menos 10; entre 0,5 e 10 microgramas de protease de Pyrococcus furiosus por g de DS; opcionalmente uma pululanase; uma glucoamilase de Penicillium oxalicum; ii) sacarificação usando uma glucoamilase; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é: (1) a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou uma cepa com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5038 de Saccharomyces; ou (2) a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou uma cepa com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5012 de Saccharomyces.

[0295] Em uma modalidade, o derivado da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae expressa uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase.

[0296] Em uma modalidade, são processos de produção de etanol a partir de material contendo amido, que compreendem as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura entre 80-90 °C usando; uma alfa-amilase derivada de Bacillus stearothermophilus com uma deleção dupla I181 + G182 e uma substituição opcional N193F; e opcionalmente ainda uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: E129V+K177L+R179E; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+ Q254S; V59A+Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; V59A+E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; e E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando SEQ ID NO: 1 apresentada neste documento para numeração); entre 0,5 e 10 microgramas de protease de Pyrococcus furiosus por g de DS; e opcionalmente uma pululanase; uma glucoamilase de Penicillium oxalicum apresentada na SEQ ID NO: 14 tendo uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: K79V; K79V+ P11F + T65A + Q327F; K79V+P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F;

K79V +P11F + D26C + K33C + T65A + Q327F; K79V +P2N + P4S + P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; K79V +P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; e K79V +P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T (usando SEQ ID NO: 14 para numeração). ii) sacarificação usando uma glucoamilase; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é: (1) a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou uma cepa com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5038 de Saccharomyces; ou (2) a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou uma cepa com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5012 de Saccharomyces.

[0297] Em uma modalidade, são processos de produção de etanol a partir de material contendo amido, que compreendem as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura entre 80-90 °C usando: uma alfa-amilase derivada de Bacillus stearothermophilus com uma deleção dupla I181 + G182 e uma substituição opcional N193F; e ainda uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: E129V+K177L+R179E; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+ Q254S; V59A+Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; V59A+E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; e E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando SEQ ID NO: 1 apresentada neste documento para numeração); uma protease com um valor de termoestabilidade de mais de 20%, determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C, preferencialmente derivada de Pyrococcus furiosus e/ou Thermoascus aurantiacus; opcionalmente uma pululanase; e uma glucoamilase de Penicillium oxalicum apresentada na SEQ ID NO: 14 tendo uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: K79V; K79V+ P11F + T65A + Q327F; K79V+P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F; K79V +P11F + D26C + K33C + T65A + Q327F;

K79V +P2N + P4S + P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; K79V +P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; e K79V +P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T (usando SEQ ID NO: 14 para numeração). ii) sacarificação usando uma glucoamilase selecionada do grupo de glucoamilases derivadas de uma cepa de Aspergillus; ou uma cepa de Trichoderma; uma cepa de Talaromyces, uma cepa de Pycnoporus; uma cepa de Gloeophyllum; e uma cepa de Nigrofomes; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é: (1) a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou uma cepa com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5038 de Saccharomyces; ou (2) a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou uma cepa com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5012 de Saccharomyces.

[0298] Em uma modalidade, o derivado da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae expressa uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase.

[0299] Em uma modalidade, são processos de produção de etanol a partir de material contendo amido, que compreendem as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura entre 80-90 °C e a um pH entre 5,0 e 6,5 usando: uma alfa-amilase derivada de Bacillus stearothermophilus com uma deleção dupla I181 + G182 e uma substituição opcional N193F; e opcionalmente ainda uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: E129V+K177L+R179E; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+ Q254S; V59A+Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; V59A+E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; e E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando SEQ ID NO: 1 aqui para numeração). uma protease derivada de Pyrococcus furiosus, preferencialmente a apresentada na SEQ ID NO: 13 deste documento; uma glucoamilase de Penicillium oxalicum apresentada na SEQ ID NO: 14 tendo uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: K79V; K79V+ P11F + T65A + Q327F;

K79V+P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F; K79V +P11F + D26C + K33C + T65A + Q327F; K79V +P2N + P4S + P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; K79V +P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; e K79V +P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T (usando SEQ ID NO: 14 para numeração). ii) sacarificação usando uma glucoamilase; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é: (1) a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou uma cepa com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5038 de Saccharomyces; ou (2) a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou uma cepa com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5012 de Saccharomyces.

[0300] Em uma modalidade, o derivado da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae expressa uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase.

[0301] Em uma modalidade, é um processo que compreende as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura entre 80-90 °C e a um pH entre 5,0 e 6,5 usando: uma alfa-amilase derivada de Bacillus stearothermophilus com uma deleção dupla I181 + G182 e uma substituição opcional N193F; e opcionalmente ainda uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: E129V+K177L+R179E; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+ Q254S; V59A+Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; V59A+E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; e E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando SEQ ID NO: 1 apresentada neste documento para numeração); uma protease derivada de Pyrococcus furiosus, preferencialmente a apresentada na SEQ ID NO: 13 aqui presente e/ou adicionada em uma dosagem de 1-5 microgramas de protease por grama de DS, tal como cerca de 1,5 ou 3 microgramas de protease por grama de DS; uma glucoamilase de Penicillium oxalicum apresentada na SEQ ID NO: 14 tendo uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: K79V; K79V+ P11F + T65A + Q327F;

[0302] Em uma modalidade, o derivado da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae expressa uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase.

[0303] Em uma modalidade, são processos de produção de etanol a partir de material contendo amido, que compreendem as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando uma alfa- amilase derivada de Bacillus stearothermophilus; ii) sacarificação usando uma glucoamilase; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador aumenta o rendimento de etanol em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo, por exemplo, condições como aqui descritas. Processo de Hidrólise de Amido em Bruto

[0304] Este aspecto se refere a processos melhorados de hidrólise de amido em bruto para a produção de etanol usando um organismo de fermentação e cepas de levedura adequadas para uso em processos e métodos dos mesmos.

[0305] Mais especificamente, este aspecto se relaciona com processos de produção de etanol, a partir de um material contendo amido, tal como amido granular, compreendendo: (i) sacarificação de um material contendo amido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial; e (ii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é:

(1) a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou uma cepa com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5038 de Saccharomyces; ou (2) a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou uma cepa com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5012 de Saccharomyces.

[0306] Em uma modalidade, o derivado da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae expressa uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase.

[0307] Em um aspecto, são processos de produção de etanol, a partir de um material contendo amido, tal como amido granular, compreendendo: (i) sacarificação de um material contendo amido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial; e (ii) fermentação usando um organismo fermentador; em que

[0308] a sacarificação e/ou a fermentação é realizada na presença das seguintes enzimas: glucoamilase e alfa-amilase, e opcionalmente protease; e

[0309] o organismo fermentador é uma cepa de levedura Saccharomyces que fornece uma ou mais, tal como todas, as seguintes melhorias:

[0310] um aumento do rendimento de etanol em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de fermentação (por exemplo, condições como aqui descritas);

[0311] produção de acetaldeído reduzida em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo (por exemplo, condições como aqui descritas);

[0312] tolerância à temperatura aumentada em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo (por exemplo, condições como aqui descritas);

[0313] produção de glicerol reduzida em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo (por exemplo, condições como aqui descritas).

[0314] Em uma modalidade, o organismo fermentador usado em um processo é cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositado sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural

Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA). Em uma modalidade, o organismo fermentador usado em um processo é um derivado da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae que expressa uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase.

[0315] Um processo de hidrólise de amido em bruto usando a levedura aqui descrita resulta em uma ou mais, tal como todas, as seguintes melhorias em comparação com um processo correspondente realizado sob as mesmas condições usando a cepa de Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) como organismo fermentador:

[0316] um aumento do rendimento de etanol em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de fermentação (por exemplo, condições como aqui descritas);

[0317] produção de acetaldeído reduzida em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo (por exemplo, condições como aqui descritas);

[0318] tolerância à temperatura aumentada em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement

Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo (por exemplo, condições como aqui descritas);

[0319] produção de glicerol reduzida em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo (por exemplo, condições como aqui descritas).

[0320] Exemplos de enzimas adequadas usadas, especialmente glucoamilases, alfa-amilases, proteases, composições de enzimas celulolíticas etc. são descritas na seção "Enzimas e Misturas de Enzimas Usadas em um Processo de Hidrólise de Amido em Bruto" abaixo.

[0321] Em uma modalidade, as seguintes enzimas são expressas, presentes e/ou adicionadas na sacarificação e/ou fermentação: Glucoamilase de Trametes cingulata, por exemplo, a mostrada na SEQ ID NO: 20 apresentada neste documento e uma alfa-amilase. Em uma modalidade, a alfa-amilase é uma alfa-amilase de Rhizomucor pusillus, preferencialmente a alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com um ligante e domínio de ligação ao amido (SBD), em particular a alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido mostrado na SEQ ID NO: 16 neste documento.

[0322] Em uma modalidade, as seguintes enzimas são expressas, presentes e/ou adicionadas na sacarificação e/ou fermentação: Glucoamilase de Gloeophyllum trabeum, por exemplo, a mostrada na SEQ ID NO: 17 apresentada neste documento, especialmente uma ainda tendo uma ou mais das seguintes substituições: S95P, A121P, especialmente S95P+A121P, e uma alfa-amilase. Em uma modalidade, a alfa-amilase é derivada de Rhizomucor pusillus, por exemplo alfa-amilase é derivada de Rhizomucor pusillus com um ligante e um domínio de ligação ao amido (SBD), em particular, alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (SBD) divulgado como V039 na Tabela 5 em WO 2006/069290 ou SEQ ID NO: 16 neste documento.

[0323] Em uma modalidade do processo, as seguintes enzimas são expressas, presentes e/ou adicionadas na sacarificação e/ou fermentação: Glucoamilase de Gloeophyllum trabeum, preferencialmente a mostrada na SEQ ID NO: 17 apresentada neste documento, preferencialmente uma ainda tendo uma ou mais das seguintes substituições: S95P, A121P, especialmente S95P+A121P, e uma alfa- amilase. A alfa-amilase pode ser derivada de Rhizomucor pusillus, preferencialmente a alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com um ligante e domínio de ligação ao amido (SBD), em particular a alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (SBD) mostrado na SEQ ID NO: 16 apresentada neste documento, preferencialmente uma ainda tendo uma ou mais das seguintes substituições: G128D, D143N, especialmente G128D+143N.

[0324] Em uma modalidade, as seguintes enzimas são expressas, presentes e/ou adicionadas na sacarificação e/ou fermentação: Glucoamilase de Pycnoporus sanguineus, preferencialmente a mostrada na SEQ ID NO: 18 apresentada neste documento e uma alfa-amilase. Em uma modalidade, a alfa-amilase é derivada de Rhizomucor pusillus, preferencialmente com um ligante e um domínio de ligação ao amido (SBD), por exemplo, o Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (SBD) divulgado como V039 na Tabela 5 em WO 2006/069290 ou SEQ ID NO: 16 apresentada neste documento, tal como uma ainda tendo uma ou mais das seguintes substituições: G128D, D143N (por exemplo, G128D+D143N).

[0325] Em uma modalidade, uma protease está presente e/ou é adicionada na sacarificação e/ou fermentação. Em uma modalidade preferencial, a protease é uma metaloprotease ou uma serina protease. Em uma modalidade a metaloprotease preferencialmente é derivada de uma cepa do gênero Thermoascus, tal como uma cepa de Thermoascus aurantiacus, por exemplo, Thermoascus aurantiacus CGMCC No. 0670 (por exemplo, a metaloprotease divulgada como a parte madura de SEQ ID NO: 2 divulgada em WO 2003/048353 ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 neste documento).

[0326] Em uma modalidade, uma composição de enzima celulolítica está presente e/ou é adicionada na sacarificação e/ou fermentação.

[0327] Em uma modalidade, a composição de enzima celulolítica é derivada de Trichoderma reesei, preferencialmente adicionalmente compreendendo polipeptídeo GH61A de Thermoascus aurantiacus tendo atividade intensificante celulolítica (por exemplo, SEQ ID NO: 2 em WO 2005/074656 ou SEQ ID NO: 30 apresentada neste documento) e beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (por ex., SEQ ID NO: 2 de WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 29 apresentada neste documento), ou uma composição de enzima celulolítica derivada de Trichoderma reesei, preferencialmente compreendendo ainda polipeptídeo GH61A de Penicillium emersonii, por exemplo, o divulgado como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/041397 ou SEQ ID NO: 31 apresentada neste documento, e beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus, por ex, a divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 29 apresentada neste documento, ou uma variante da mesma, tal como uma variante tendo uma, preferencialmente todas, das seguintes substituições: F100D, S283G, N456E, F512Y, CBH1de Aspergillus fumigatus, por ex., a divulgada como SEQ ID NO: 6 em WO2011/057140 e SEQ ID NO: 32 apresentada neste documento, e CBH II de Aspergillus fumigatus, por ex, a divulgada como SEQ ID NO: 18 em WO 2011/057140 e como SEQ ID NO: 33 neste documento.

[0328] Em uma modalidade, a razão de glucoamilase para alfa-amilase é entre 99:1 e 1:2, tal como entre 98:2 e 1:1, tal como entre 97:3 e 2:1, tal como entre 96:4 e 3:1, tal como 97:3, 96:4, 95:5, 94:6, 93:7, 90:10, 85:15, 83:17 ou 65:35 (mg de EP de glucoamilase:mg de EP de alfa-amilase).

[0329] Em uma modalidade, a razão de glucoamilase para alfa-amilase é entre 100:1 e 1:2, tal como entre 90:1 e 1:1, tal como entre 80:1 e 2:1, tal como entre 70:1 e 3:1, tal como 16:1 (determinado como AGU: FAU-F).

[0330] Em uma modalidade, a dose total de glucoamilase e de alfa-amilase é de 10-1,000 µg/g de DS, tal como de 50-500 µg/g de DS, tal como 75-250 µg/g de DS.

[0331] Em uma modalidade, a dose total de composição de enzimas celulolíticas adicionada é de 10-500 µg/g de DS, tal como de 20- 400 µg/g de DS, tal como 20-300 µg/g de DS.

[0332] Em uma modalidade, a dose de protease adicionada é de 1-200 µg/g de DS, tal como de 2-100 µg/g de DS, tal como 3-50 µg/g de DS.

[0333] Em uma modalidade, a etapa de sacarização (a) e a etapa de fermentação (b) são realizadas simultaneamente.

[0334] Em uma modalidade, o organismo fermentador é uma cepa não recombinante de Saccharomyces, de preferência uma cepa não recombinante de Saccharomyces cerevisiae produzida utilizando o método descrito e ao qual se refere a patente US nº. 8,257,959-BB. Enzimas e Misturas de Enzimas Usadas Em Um Processo De Hidrólise de Amido Em Bruto

[0335] Glucoamilase e uma alfa-amilase podem estar presentes e/ou adicionadas na etapa de sacarificação (i) e/ou etapa de fermentação (ii) (por exemplo, sacarificação e fermentação simultânea (SSF)). Opcionalmente, uma protease e/ou uma composição de enzima celulolítica está (estão) também presente(s) e/ou adicionada(s). Outras enzimas, tal como pululanases, pectinases e/ou trealases, também podem estar presentes e/ou adicionadas.

[0336] Uma lista não exaustiva de enzimas e combinações de enzimas adequadas e especificamente contempladas (por exemplo, misturas) é descrita abaixo.

[0337] Em uma modalidade, as seguintes enzimas estão presentes e/ou adicionadas durante a sacarificação e/ou fermentação: A glucoamilase de Trametes, de preferência, glucoamilase de Trametes cingulata mostrada na SEQ ID NO: 20 apresentada neste documento e uma alfa-amilase.

[0338] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada de Trametes cingulata, tal como aquela mostrada em SEQ ID NO: 20 apresentada neste documento, ou uma glucoamilase selecionada a partir do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 20 aqui; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, por ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 20 neste documento.

[0339] Em uma modalidade, as seguintes enzimas estão presentes e/ou adicionadas durante a sacarificação e/ou fermentação: A glucoamilase de Gloeophyllum, preferencialmente a glucoamilase Gloeophyllum trabeum, especialmente a glucoamilase de Gloeophyllum trabeum mostrada na SEQ ID NO: 17 apresentada neste documento e uma alfa-amilase.

[0340] Em uma modalidade, a glucamilase é derivada de Gloeophyllum trabeum, tal como a mostrada na SEQ ID NO: 17 apresentada neste documento, ou uma glucoamilase selecionada a partir do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 17 aqui; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, por ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 17 neste documento.

[0341] Em uma modalidade, a glucoamilase de Gloeophyllum, tal como a glucoamilase de Gloeophyllum trabeum mostrada em SEQ ID NO: 17, tem uma das seguintes substituições: V59A; S95P; A121P; T119W; S95P+A121P; V59A+S95P; S95P+T119W; V59A+S95P+A121P; ou S95P+T119W+A121P, especialmente S95P+A121P (usando a SEQ ID NO: 17 para numeração).

[0342] A alfa-amilase usada em um processo aqui descrito é tipicamente uma alfa-amilase fúngica, tal como uma alfa-amilase fúngica ácida. Em uma modalidade, a alfa-amilase é derivada de Rhizomucor, tal como uma alfa-amilase é derivada de Rhizomucor pusillus com um ligante e um domínio de ligação ao amido (SBD), por exemplo, alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (SBD) divulgado como V039 na Tabela 5 em WO 2006/069290 ou SEQ ID NO: 16 neste documento.

[0343] Em uma modalidade, a alfa-amilase é uma alfa- amilase de Rhizomucor ou a alfa-amilase Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação a amido (SBD) mostrado na SEQ ID NO: 16 apresentada neste documento, por exemplo, uma tendo pelo menos uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: D165M; Y141W; Y141R; K136F; K192R; P224A; P224R; S123H+Y141W; G20S + Y141W; A76G + Y141W; G128D + Y141W; G128D + D143N; P219C + Y141W; N142D + D143N; Y141W + K192R; Y141W + D143N; Y141W + N383R; Y141W + P219C + A265C; Y141W + N142D + D143N; Y141W + K192R V410A; G128D + Y141W + D143N; Y141W + D143N + P219C; Y141W + D143N + K192R; G128D + D143N + K192R; Y141W + D143N + K192R + P219C; G128D + Y141W + D143N + K192R; ou G128D + Y141W + D143N + K192R + P219C, especialmente G128D+D143N (usando SEQ ID NO: 16 para numeração).

[0344] Em uma modalidade, a alfa-amilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma alfa-amilase compreendendo o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 16 neste documento; (ii) uma alfa-amilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, por ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 neste documento.

[0345] Em uma modalidade, as seguintes enzimas estão presentes e/ou são adicionadas na sacarificação e/ou fermentação: a glucoamilase de Trametes cingulata mostrada na SEQ ID NO: 20 neste documento e uma alfa-amilase derivada de Rhizomucor pusillus,

preferencialmente com um ligante e um domínio de ligação ao amido (SBD), em particular, a alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (SBD) divulgado como V039 na Tabela 5 em WO 2006/069290 ou SEQ ID NO: 16 neste documento.

[0346] Em uma modalidade, as seguintes enzimas estão presentes e/ou adicionadas na sacarificação e/ou fermentação: Glucoamilase de Gloeophyllum, preferencialmente a glucoamilase de Gloeophyllum trabeum mostrada na SEQ ID NO: 17 neste documento e uma alfa-amilase derivada de Rhizomucor pusillus, preferencialmente com um ligante e um domínio de ligação ao amido (SBD), em particular, a alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (SBD) divulgado como V039 na Tabela 5 em WO 2006/069290 ou SEQ ID NO: 16 neste documento.

[0347] Em uma modalidade, as enzimas presentes e/ou adicionadas compreendem a glucoamilase de Gloeophyllum trabeum mostrada na SEQ ID NO: 17 apresentada neste documento tendo uma ou mais das seguintes substituições: S95P, A121P, especialmente S95P+A121P (usando a SEQ ID NO: 17 apresentada neste documento para numeração); e a alfa-amilase derivada de Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (SBD), preferencialmente a mostrada na SEQ ID NO: 16, apresentada neste documento, preferencialmente aquela tendo uma ou mais das seguintes substituições: G128D, D143N, especialmente G128D+D143N (usando a SEQ ID NO: 16 para numeração).

[0348] Em uma modalidade, as seguintes enzimas estão presentes e/ou adicionadas na sacarificação e/ou fermentação: A glucoamilase de Pycnoporus, em particular a glucoamilase de Pycnoporus sanguineus mostrada na SEQ ID NO: 18 e a alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com um ligante e domínio de ligação ao amido (SBD), em particular a alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (SBD) mostrado na SEQ ID NO: 16 neste documento.

[0349] Em uma modalidade, as enzimas presentes e/ou adicionadas na sacarificação e/ou fermentação compreendem uma glucoamilase de Pycnoporus, tal como a glucoamilase de Pycnoporus sanguineus mostrada na SEQ ID NO: 18 neste documento e a alfa-amilase, em particular uma alfa-amilase derivada de Rhizomucor pusillus com um ligante e de ligação ao amido (SBD), preferencialmente a alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com um ligante e domínio de ligação de glucoamilase de Aspergillus niger (SBD) mostrado na SEQ ID NO: 16 aqui, preferencialmente tendo uma ou mais das seguintes substituições: G128D, D143N, especialmente G128D+D143N.

[0350] As enzimas presentes e/ou adicionadas na sacarificação e/ou fermentação em um processo aqui descrito incluem i) glucoamilase e ii) alfa-amilase; e podem opcionalmente compreender adicionalmente iii) uma composição de enzima celulolítica e/ou iv) uma protease.

[0351] Em uma modalidade, a protease compreende uma metaloprotease preferencialmente derivada a partir de uma cepa do gênero Thermoascus, preferencialmente uma cepa de Thermoascus aurantiacus, especialmente Thermoascus aurantiacus CGMCC No. 0670, tal como a metaloprotease divulgada como a parte madura de SEQ ID NO: 2 divulgada em WO 2003/048353 ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 neste documento.

[0352] Em uma modalidade, a protease, em particular uma protease derivada de Thermoascus aurantiacus, é selecionada do grupo que consiste em:

(i) uma protease compreendendo o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 aqui; (ii) uma protease compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, por ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 neste documento.

[0353] Em uma modalidade, as enzimas presentes e/ou adicionadas na sacarificação e/ou fermentação compreendem a glucoamilase de Trametes cingulata mostrada na SEQ ID NO: 20 apresentada neste documento, e a alfa-amilase derivada de Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (SBD), tal como a mostrada na SEQ ID NO: 16 neste documento, e pode ter uma ou mais das seguintes substituições: G128D, D143N (por exemplo, G128D+D143N) e opcionalmente ainda uma composição de enzima celulolítica derivada de Trichoderma reesei, por exemplo, compreendendo ainda polipeptídeo GH61 de Thermoascus aurantiacus tendo atividade celulolítica de reforço (SEQ ID NO: 2 em WO 2005/074656 ou SEQ ID NO: 30 aqui) e beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 2 de WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 29 apresentada neste documento); ou uma composição de enzima celulolítica derivada de Trichoderma reesei, por exemplo, compreendendo ainda GH61A polipeptídeo de Penicillium emersonii, divulgado como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/041397 ou SEQ ID NO: 31 apresentada neste documento e beta- glucosidase de Aspergillus fumigatus divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 29 apresentada neste documento, ou uma variante da mesma, por exemplo, uma variante tendo uma,

preferencialmente todas, das seguintes substituições: F100D, S283G, N456E, F512Y, Cel7A CBH1 de Aspergillus fumigatus divulgada como SEQ ID NO: 6 em WO2011/057140 e SEQ ID NO: 32 aqui e CBH II de Aspergillus fumigatus divulgada como SEQ ID NO: 18 em WO 2011/057140 e como SEQ ID NO: 33 neste documento.

[0354] Em uma modalidade, as enzimas presentes e/ou adicionadas na sacarificação e/ou fermentação compreendem a glucoamilase de Gloeophyllum trabeum mostrada na SEQ ID NO: 17 aqui, preferencialmente tendo uma ou mais das seguintes substituições: S95P, A121P, especialmente S95P+A121P; e a alfa-amilase derivada de Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (SBD), preferencialmente a mostrada na SEQ ID NO: 16 aqui, preferencialmente tendo uma ou mais das seguintes substituições: G128D, D143N, especialmente G128D+D143N, e opcionalmente ainda uma composição de enzima celulolítica derivada de Trichoderma reesei, preferencialmente, compreendendo ainda polipeptídeo GH61 de Thermoascus aurantiacus tendo atividade celulolítica de reforço (SEQ ID NO: 2 em WO 2005/074656 ou SEQ ID NO: 30 aqui) e beta- glucosidase de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 2 de WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 29 apresentada neste documento); ou uma composição de enzima celulolítica derivada de Trichoderma reesei, preferencialmente, compreendendo ainda GH61A polipeptídeo de Penicillium emersonii, divulgado como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/041397 ou SEQ ID NO: 31 apresentada neste documento e beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 29 apresentada neste documento, ou uma variante da mesma, preferencialmente uma variante tendo uma, preferencialmente todas, das seguintes substituições: F100D, S283G, N456E, F512Y, Cel7A CBH1 de Aspergillus fumigatus divulgada como SEQ ID NO: 6 em WO2011/057140 e

SEQ ID NO: 32 aqui e CBH II de Aspergillus fumigatus divulgada como SEQ ID NO: 18 em WO 2011/057140 e como SEQ ID NO: 33 neste documento.

[0355] Em uma modalidade, as enzimas presentes e/ou adicionadas na sacarificação e/ou fermentação compreendem a glucoamilase de Pycnoporus sanguineus mostrada na SEQ ID NO: 18 apresentada neste documento e a alfa-amilase derivada de Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (SBD), preferencialmente a mostrada na SEQ ID NO: 16 aqui, preferencialmente tendo uma ou mais das seguintes substituições: G128D, D143N, especialmente G128D+D143N, e opcionalmente ainda uma composição de enzima celulolítica derivada de Trichoderma reesei, preferencialmente, compreendendo ainda polipeptídeo GH61 de Thermoascus aurantiacus tendo atividade celulolítica de reforço (SEQ ID NO: 2 em WO 2005/074656 ou SEQ ID NO: neste documento) e beta- glucosidase de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 2 de WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 30 apresentada neste documento); ou uma composição de enzima celulolítica derivada de Trichoderma reesei, preferencialmente, compreendendo ainda GH61A polipeptídeo de Penicillium emersonii, divulgado como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/041397 ou SEQ ID NO: 31 apresentada neste documento e beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 29 apresentada neste documento, ou uma variante da mesma, preferencialmente uma variante tendo uma, preferencialmente todas, das seguintes substituições: F100D, S283G, N456E, F512Y, Cel7A CBH I de Aspergillus fumigatus divulgada como SEQ ID NO: 6 em WO2011/057140 e SEQ ID NO: 29 aqui e CBH II de Aspergillus fumigatus divulgada como SEQ ID NO: 18 em WO 2011/057140 e como SEQ ID NO: 33 neste documento.

[0356] Em uma modalidade, uma composição de enzima celulolítica é aquela descrita abaixo na seção "Composições de Enzimas Celulolíticas".

[0357] A composição opcional de enzima celulolítica, protease ou outras enzimas, pode ser adicionada no processo aqui descrito ao mesmo tempo que a glucoamilase e a alfa-amilase. As enzimas, por exemplo, na forma de uma composição enzimática, podem ser adicionadas à sacarificação e/ou fermentação, preferencialmente sacarificação e fermentação simultâneas (isto é, processo de uma etapa). Se deve entender que as enzimas também podem ser adicionadas individualmente ou como composições/componentes enzimáticos de dois, três, quatro ou mais enzimas. Em uma modalidade, a glucoamilase e a alfa-amilase são adicionadas como uma composição de mistura e a composição opcional de enzima celulolítica e a protease opcional são adicionadas separadamente. Em outra modalidade, a glucoamilase, alfa-amilase e composição de enzima celulolítica é adicionada como uma composição enzimática e a protease opcional é adicionada separadamente. Todas as enzimas também podem, em uma modalidade, ser adicionadas como uma composição de enzima compreendendo uma glucoamilase, uma alfa-amilase, uma composição de enzima celulolítica, e/ou uma protease e, opcionalmente, outras enzimas, incluindo pululanase, tre-halase e/ou pectinase, tal como pectina liase ou poligalacturonase.

[0358] Outras enzimas também podem estar presentes. As enzimas especificamente contempladas são descritas mais abaixo. Glucoamilase

[0359] A glucoamilase usada em um processo aqui descrito pode ser de qualquer origem, tal como de origem bacteriana ou fúngica. As glucoamilases fúngicas são preferidas.

[0360] Em uma modalidade a glucoamilase pode ser uma derivada de uma cepa de Trametes, tal como uma cepa de Trametes cingulata (SEQ ID NO: 20, apresentada neste documento); ou uma cepa de Pachykytospora, tal como uma cepa de Pachykytospora papyracea; ou uma cepa de Leucopaxillus, tal como uma cepa de Leucopaxillus giganteus (todas divulgadas no documento WO 2006/069289).

[0361] Em uma modalidade, a glucoamilase, em particular derivada de uma cepa de Trametes cingulata, é selecionada a partir do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 20 aqui; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, por ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 20 neste documento.

[0362] Em uma modalidade, a glucoamilase é de uma cepa de Aspergillus, preferencialmente Aspergillus niger, Aspergillus awamori, ou Aspergillus oryzae; ou uma cepa de Trichoderma, preferencialmente Trichoderma reesei; ou uma cepa de Talaromyces, preferencialmente Talaromyces emersonii (por exemplo, SEQ ID NO: 19 neste documento).

[0363] Em uma modalidade, a glucoamilase, tal como uma derivada de uma cepa de Talaromyces emersonii, é selecionada a partir do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 19 aqui;

(ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, por ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 19 neste documento.

[0364] Em outra modalidade, a glucoamilase é derivada de uma cepa de Penicillium, tal como uma cepa de Penicillium oxalicum.

[0365] Em uma modalidade, a glucoamilase, tal como uma derivada de uma cepa de Penicillium oxalicum, é selecionada a partir do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 14 aqui; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, por ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 14 neste documento.

[0366] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada de uma cepa de Gloeophyllum, tal como uma cepa de Gloeophyllum sepiarium ou Gloeophyllum trabeum, tal como uma divulgada no documento WO 2011/068803 como qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ou

16. Em uma modalidade, a glucoamilase tem SEQ ID NO: 2 em WO 2011/068803 ou SEQ ID NO: 15 neste documento. Em outra modalidade, a glucoamilase é SEQ ID NO: 18 em WO 2011/068803) (aqui incorporado como referência).

[0367] Em uma modalidade, a glucoamilase, tal como uma derivada de uma cepa de Gloeophyllum sepiarium, é selecionada a partir do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 15 aqui; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, por ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 15 neste documento.

[0368] Em uma modalidade adicional a glucoamilase é derivada de uma cepa do gênero Pycnoporus, em particular uma cepa de Pycnoporus sanguineus, tal como uma cepa descrita no documento WO 2011/066576 (SEQ ID NOs 2, 4 ou 6). Em uma modalidade, a glucoamilase é a mostrada na SEQ ID NO: 4 em WO 2011/066576 ou SEQ ID NO: 18 neste documento.

[0369] Em uma modalidade, a glucoamilase, tal como uma derivada de uma cepa de Pycnoporus sanguineus, é selecionada a partir do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 18 aqui; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, por ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 18 neste documento.

[0370] São também contempladas glucoamilases que exibem uma elevada identidade com qualquer uma das glucoamilases acima mencionadas, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100% de identidade com qualquer uma das partes maduras das sequências de enzimas mencionadas acima.

[0371] Em uma modalidade, a glucoamilase, tal como uma derivada de uma cepa de Gloeophyllum trabeum, é selecionada a partir do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 17 aqui; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, por ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 17 neste documento.

[0372] Em uma modalidade, a glucoamilase, tal como a derivada de Gloeophyllum trabeum, mostrada na SEQ ID NO: 17 tem uma das seguintes substituições: V59A; S95P; A121P; T119W; S95P+A121P; V59A+S95P; S95P+T119W; V59A+S95P+A121P; ou S95P+T119W+A121P, especialmente S95P+A121P. Em uma modalidade preferencial, a glucoamilase de Gloeophyllum trabeum mostrada na SEQ ID NO: 18 tem uma das seguintes substituições: V59A; S95P; A121P; T119W; S95P+A121P; V59A+S95P; S95P+T119W; V59A+S95P+A121P; ou

S95P+T119W+A121P, especialmente S95P+A121P (usando a SEQ ID NO: 17 aqui para numeração). Todas as variantes de glucoamilase de Gloeophyllum trabeum, especialmente variantes na SEQ ID NO: 3, divulgada em WO 2014/177546 são aqui incorporadas como referência.

[0373] A variante de gluocoamilase pode compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, por ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 17. Alfa-Amilases

[0374] A alfa-amilase usada em um processo aqui descrito pode ser de qualquer origem, tal como de origem bacteriana ou fúngica. Em uma modalidade, a alfa-amilase é uma alfa-amilase ácida, tal como uma alfa- amilase fúngica ácida, isto é, com um pH ótimo abaixo de pH 7.

[0375] Em uma modalidade, a alfa-amilase pode ser derivada de uma cepa do gênero Rhizomucor, preferencialmente uma cepa de Rhizomucor pusillus, tal como aquela mostrada na SEQ ID NO: 3 em WO 2013/006756 (ver, por exemplo, a Tabela 1 no Exemplo 1 incorporada neste documento por referência), ou do gênero Meripilus, preferencialmente uma cepa de Meripilus giganteus.

[0376] Em uma modalidade, a alfa-amilase é derivada de Rhizomucor pusillus, tal como uma com um ligante e um domínio de ligação ao amido (SBD), preferencialmente, o ligante da glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (SBD), divulgado como V039 na Tabela 5 em WO 2006/069290 (incorporado por referência) ou SEQ ID NO: 16 neste documento.

[0377] Em uma modalidade, a alfa-amilase é derivada de Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (SBD), divulgado no documento WO 2013/006756 (incorporada neste documento por referência), ou na SEQ ID NO: 16 neste documento.

[0378] Em uma modalidade, a alfa-amilase de Rhizomucor pusillus ou a alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (SBD) tem pelo menos uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: D165M; Y141W; Y141R; K136F; K192R; P224A; P224R; S123H+Y141W; G20S + Y141W; A76G + Y141W; G128D + Y141W; G128D + D143N; P219C + Y141W; N142D + D143N; Y141W + K192R; Y141W + D143N; Y141W + N383R; Y141W + P219C + A265C; Y141W + N142D + D143N; Y141W + K192R V410A; G128D + Y141W + D143N; Y141W + D143N + P219C; Y141W + D143N + K192R; G128D + D143N + K192R; Y141W + D143N + K192R + P219C; G128D + Y141W + D143N + K192R; ou G128D + Y141W + D143N + K192R + P219C, especialmente G128D+D143N (usando SEQ ID NO: 16 aqui para numeração).

[0379] Em uma modalidade, a alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (SBD), é selecionado a partir do grupo consistindo em: (i) uma alfa-amilase compreendendo o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 16 aqui; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, por ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 neste documento.

[0380] Em uma modalidade preferencial, a alfa-amilase é uma variante da alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com uma ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (SBD), em que a variante de alfa-amilase compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60%, pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95 %, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade, mas menos de 100% para o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 neste documento.

[0381] Em uma modalidade, a variante de alfa-amilase tem uma das substituições acima mencionadas, tais como: G128D, Y141W, D143W ou K192R (usando SEQ ID NO: 16 para numeração).

[0382] Em uma modalidade, a alfa-amilase (usando SEQ ID NO: 16, apresentada neste documento para numeração) tem uma das seguintes substituições: Y141W + D143N.

[0383] Em uma modalidade, a alfa-amilase tem as seguintes substituições: G128D+Y141W+D143N.

[0384] Em uma modalidade, a alfa-amilase tem as seguintes substituições: G128D+Y141W+D143N+K192R;

[0385] Em uma modalidade, a alfa-amilase tem as seguintes substituições: G128D + D143N (usando SEQ ID NO: 16 para numeração).

[0386] Uma variante pode compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, por ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16. Protease

[0387] As enzimas presentes e/ou adicionadas à sacarificação e/ou fermentação podem opcionalmente incluir ainda uma protease. A protease pode ser de qualquer origem, tal como origem fúngica ou bacteriana.

[0388] Em uma modalidade, a protease tem origem fúngica.

[0389] Em uma modalidade, a protease compreende uma metaloprotease derivada a partir de uma cepa do gênero Thermoascus, preferencialmente uma cepa de Thermoascus aurantiacus, especialmente Thermoascus aurantiacus CGMCC No. 0670, tal como a metaloprotease divulgada como a parte madura de SEQ ID NO: 2 divulgada em WO 2003/048353 ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 neste documento.

[0390] Em uma modalidade, a protease, tal como uma derivada de uma cepa de Thermoascus aurantiacus, é selecionada a partir do grupo consistindo em: (i) uma protease compreendendo o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 neste documento; (ii) uma protease compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, por ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 neste documento.

[0391] Em uma modalidade, a protease é de origem bacteriana.

[0392] Em uma modalidade, a protease é derivada a partir de uma cepa de Pyrococcus, tal como uma cepa de Pyrococcus furiosus, tal como a protease mostrada em SEQ ID NO: 1 em US 6,358,726 ou SEQ ID NO: 5 neste documento.

[0393] Em uma modalidade, a protease, tal como uma derivada de Pyrococcus furiosus, é selecionada a partir do grupo consistindo em: (i) uma protease compreendendo o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5 aqui; (ii) uma protease compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, por ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5 neste documento. Composições de Enzimas Celulolíticas

[0394] As enzimas presentes e/ou adicionadas à sacarificação e/ou fermentação podem opcionalmente incluir ainda uma composição de enzima celulolítica. A composição de enzima celulolítica pode consistir em, ou compreender uma ou mais enzima celulolítica. A composição de enzima celulolítica pode ser de qualquer origem. Em uma modalidade, a composição de enzima celulolítica compreende enzima celulolítica de origem fúngica.

[0395] Em uma modalidade, a composição de enzima celulolítica é derivada de uma cepa de Trichoderma, tal como Trichoderma reesei; ou uma cepa de Humicola, tal como Humicola insolens; ou uma cepa de Chrysosporium, tal como Chrysosporium lucknowense; ou uma cepa de Penicillium, tal como Penicillium decumbens. Em uma modalidade, a composição de enzima celulolítica é derivada de uma cepa de Trichoderma reesei.

[0396] A composição de enzima celulolítica pode compreender uma beta-glucosidase, uma celobio-hidrolase, e uma endoglucanase.

[0397] Em uma modalidade, a composição de enzima celulolítica compreende um ou mais polipeptídeos selecionados do grupo consistindo em: beta-glucosidase (BG); celobio-hidrolase I (CBHI); celobio-hidrolase II (CBHII); ou uma mistura das mesmas.

[0398] Em uma modalidade, a composição de enzima celulótica compreende ainda um polipeptídeo GH61 tendo atividade celulolítica intensificadora. Atividade celulolítica intensificadora. é definida e determinada conforme descrito no documento WO 2011/041397 (incorporado neste documento por referência).

[0399] O termo "polipeptídeo GH61 tendo atividade celulolítica intensificadora" significa um polipeptídeo GH61 que intensifica a hidrólise de um material celulósico por enzimas tendo atividade celulolítica. Para propósitos dos processos aqui descritos, a atividade celulolítica intensificadora é determinada por medição do aumento em açúcares redutores ou pelo aumento do total de celobiose e glucose a partir da hidrólise de um material celulósico por enzima celulolítica sob as seguintes condições: 1-50 mg de proteína total/g de celulose em PCS (palha de milho pré-tratada), em que a proteína total é compreendida de proteína de enzima celulolítica a 50-99,5% p/p e proteína de um polipeptídeo GH61 a 0,5-50%

p/p tendo atividade celulolítica intensificadora durante 1-7 dias a 50 °C em comparação com uma hidrólise de controle com igual carga de proteína total sem atividade celulolítica intensificadora (1-50 mg de proteína celulolítica/g de celulose em PCS). Em um aspecto preferencial, uma mistura de CELLUCLAST™ 1.5L (Novozymes A/S, Bagsværd, Dinamarca) na presença de 2-3% de peso de proteína total de beta-glucosidase de Aspergillus oryzae (produzida de modo recombinante em Aspergillus oryzae de acordo com o documento WO 02/095014) ou 2-3% de peso de proteína total de beta- glucosidase de Aspergillus fumigatus (produzida de modo recombinante em Aspergillus oryzae conforme descrito em WO 2002/095014) de carga de proteína celulase é usada como fonte da atividade celulolítica.

[0400] A composição de enzima celulolítica compreende uma beta-glucosidase, preferencialmente uma derivada de uma cepa do gênero Aspergillus, tal como Aspergillus oryzae, tal como a divulgada em WO 2002/095014 ou a proteína de fusão tendo atividade de beta-glucosidase divulgada em WO 2008/057637 (ver SEQ ID NOs: 74 ou 76); ou Aspergillus fumigatus, tal como uma divulgada neste documento em SEQ ID NO: 2 em WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 8 apresentada neste documento; ou uma variante de beta-glicosidase de Aspergillus fumigatus divulgada em WO 2012/044915; ou uma cepa do gênero Penicillium, tal como uma cepa da Penicillium brasilianum divulgada em WO 2007/019442, ou uma cepa do gênero Trichoderma, tal como uma cepa de Trichoderma reesei. Em uma modalidade, a beta-glucosidase é a partir de uma cepa de Aspergillus, tal como uma cepa de Aspergillus fumigatus, tal como uma beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 29 apresentada neste documento), ou uma variante da mesma, cuja variante compreende uma ou mais substituições selecionadas do grupo consistindo de L89M, G91L, F100D, I140V, I186V, S283G, N456E e F512Y; como uma variante da mesma com as seguintes substituições:

F100D + S283G + N456E + F512Y; L89M + G91L + I186V + I140V; I186V + L89M + G91L + I140V + F100D + S283G + N456E + F512Y.

[0401] Em uma modalidade, a beta-glucosidase genitora possui pelo menos 60% de identidade, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 29 neste documento.

[0402] No caso de a beta-glucosidase ser uma variante de beta-glucosidase essa possui pelo menos 60% de identidade, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99% de identidade, mas menos do que 100% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 29 neste documento.

[0403] No caso da composição de enzima celulótica compreender um polipeptídeo GH61, esse pode ser um derivado do gênero Thermoascus, tal como uma cepa de Thermoascus aurantiacus, tal como o descrito em WO 2005/074656 como SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 30 aqui; ou um derivado do gênero Thielavia, tal como uma cepa de Thielavia terrestris, tal como aquele descrito em WO 2005/074647 como SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 (aqui incorporado como referência); ou um derivado a partir de uma cepa de Aspergillus, tal como uma cepa de Aspergillus fumigatus, tal como aquela descrito em WO 2010/138754 como SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 (aqui incorporado como referência); ou um derivado a partir de uma cepa de Penicillium, tal como uma cepa de Penicillium emersonii, tal como aquela divulgada em WO 2011/041397 como SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 31 neste documento.

[0404] Em uma modalidade, o polipeptídeo GH61, tal como um derivado de uma cepa de Thermoascus, é selecionado a partir do grupo consistindo em: (i) um polipeptídeo GH61 compreendendo o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 30 aqui; (ii) um polipeptídeo GH61 compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, por ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 30 neste documento.

[0405] Em uma modalidade, o polipeptídeo GH61, tal como um derivado de uma cepa de Penicillium sp., é selecionado a partir do grupo consistindo em: (i) um polipeptídeo GH61 compreendendo o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 31 aqui; (ii) um polipeptídeo GH61 compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, por ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 31 neste documento.

[0406] Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolíticas compreende uma celobio-hidrolase I (CBH I), tal como uma derivada de uma cepa do gênero Aspergillus, tal como uma cepa de Aspergillus fumigatus, tal como a CBH I Cel7a divulgada como SEQ ID NO: 6 em WO 2011/057140 ou SEQ ID NO: 32 neste documento, ou uma cepa do gênero Trichoderma, tal como uma cepa de Trichoderma reesei.

[0407] Em uma modalidade, a celobio-hidrolase I, tal como uma derivada de uma cepa de Aspergillus fumigatus, é selecionada a partir do grupo consistindo em: (i) uma celobio-hidrolase I compreendendo o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 32 aqui; (ii) uma celobio-hidrolase I compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, por ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 32 neste documento.

[0408] Em uma modalidade, a composição de enzima celulolítica, compreendida em uma composição de enzima aqui descrita, compreende uma celobio-hidrolase II (CBH II), tal como uma derivada de uma cepa do gênero Aspergillus, tal como uma cepa de Aspergillus fumigatus, tal como a divulgada na SEQ ID NO: 33 neste documento ou uma cepa do gênero Trichoderma, tal como Trichoderma reesei, ou uma cepa do gênero Thielavia, tal como uma cepa de Thielavia terrestris, tal como celobio- hidrolase II CEL6A de Thielavia terrestris.

[0409] Em uma modalidade, a celobio-hidrolase II, tal como uma derivada de uma cepa de Aspergillus fumigatus, é selecionada a partir do grupo consistindo em: (i) uma celobio-hidrolase II compreendendo o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 33 aqui; (ii) uma celobio-hidrolase II compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 33 neste documento.

[0410] Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolíticas compreende um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica e uma beta-glucosidase.

[0411] Em uma modalidade, a composição de enzima celulolítica compreende um polipeptídeo GH61 com atividade celulolítica intensificadora derivada de uma cepa de Penicillium, tal como uma cepa de Penicillium emersonii, tal como a descrita como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/041397 ou SEQ ID NO: 31 apresentada neste documento, e uma beta- glucosidase.

[0412] Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolíticas compreende um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificante celulolítica, uma beta-glucosidase e uma CBH I.

[0413] Em uma modalidade, a composição de enzima celulolítica compreende um polipeptídeo GH61 com atividade celulolítica intensificadora derivada de uma cepa de Penicillium, tal como uma cepa de Penicillium emersonii, tal como a descrita como SEQ ID NO: 2 em WO

2011/041397 ou SEQ ID NO: 31 apresentada neste documento, uma beta- glucosidase, e uma CBHII.

[0414] Em uma modalidade a composição de enzima celulótica, compreendida em uma composição de enzima aqui descrita, compreende um polipeptídeo GH61 tendo atividade celulolítica intensificadora, uma beta-glucosidase, uma CBHI e uma CBHII.

[0415] Em uma modalidade, a composição de enzima celulolítica compreende um polipeptídeo GH61 com atividade celulolítica intensificadora derivada de uma cepa de Penicillium, tal como uma cepa de Penicillium emersonii, tal como a descrita como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/041397 ou SEQ ID NO: 31 apresentada neste documento, uma beta- glucosidase, uma CBH I, e uma CBH II.

[0416] Em uma modalidade, a composição de enzima celulolítica é uma composição celulolítica de Trichoderma reesei, compreendendo adicionalmente um polipeptídeo GH61A de Thermoascus aurantiacus (SEQ ID NO: 2 em WO 2005/074656 ou SEQ ID NO: 30 aqui) e proteína de fusão de beta-glucosidase de Aspergillus oryzae (WO 2008/057637).

[0417] Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolíticas é uma composição de enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei, compreendendo adicionalmente o polipeptídeo GH61A de Thermoascus aurantiacus tendo atividade intensificadora celulolítica (SEQ ID NO: 2 em WO 2005/074656 ou SEQ ID NO: 30 aqui) e beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 2 de WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 29 no presente documento).

[0418] Em uma modalidade, a composição de enzima celulolítica é uma composição de enzima celulolítica de Trichoderma reesei, compreendendo adicionalmente um polipeptídeo GH61A de Penicillium emersonii divulgado como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/041397 ou SEQ ID

NO: 31 apresentada neste documento, e beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 29 apresentada neste documento, ou uma variante da mesma, cuja variante tem uma, preferencialmente todas, das seguintes substituições: F100D, S283G, N456E, F512Y, e opcionalmente CBHI de Aspergillus fumigatus, por ex., a divulgada como SEQ ID NO: 6 em WO2011/057140 e SEQ ID NO: 32 do presente documento, e CBH II de Aspergillus fumigatus, por ex, a divulgada como SEQ ID NO: 18 em WO 2011/057140 e como SEQ ID NO: 33 neste documento.

[0419] Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolíticas compreende um ou mais dos seguintes componentes: (i) uma celobio-hidrolase I de Aspergillus fumigatus; (ii) uma celobio-hidrolase II de Aspergillus fumigatus; (iii) uma beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus ou uma variante da mesma.

[0420] Em uma modalidade a beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 29 apresentada neste documento), compreende uma ou mais substituições selecionadas do grupo consistindo em L89M, G91L, F100D, I140V, I186V, S283G, N456E e F512Y; tal como uma variante da mesma, com uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: F100D + S283G + N456E + F512Y; L89M + G91L + I186V + I140V; e I186V + L89M + G91L + I140V + F100D + S283G + N456E + F512Y (usando SEQ ID NO: 29 para numeração).

[0421] Em uma modalidade, a composição celulolítica compreende ainda o polipeptídeo GH61 de Penicillium sp. mostrado na SEQ ID NO: 31 apresentada neste documento; ou um polipeptídeo GH61 compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, por ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 31 neste documento. Pululanase

[0422] As enzimas presentes e/ou adicionadas à sacarificação e/ou fermentação podem opcionalmente incluir ainda uma pululanase. A pululanase pode ser de qualquer origem, tal como origem fúngica ou bacteriana.

[0423] Em uma modalidade, a pululanase é derivada de uma cepa de Bacillus sp., tal como uma cepa de Bacillus deramificans. Trealase

[0424] As enzimas presentes e/ou adicionadas à sacarificação e/ou fermentação podem opcionalmente incluir ainda uma trealase.

[0425] A trealase pode ser de qualquer origem, tal como origem fúngica ou bacteriana.

[0426] Em uma modalidade, a trealase é de origem fúngica, tal como derivada de uma cepa de Trichoderma, tal como Trichoderma reesei. Pectinase

[0427] As enzimas presentes e/ou adicionadas à sacarificação e/ou fermentação podem opcionalmente incluir ainda uma pectinase, tal como uma pectina-liase (também conhecida como pectolase) e/ou uma poligalacturonase, ou uma combinação das mesmas.

[0428] A pectinase pode ser de qualquer origem, tal como origem fúngica ou bacteriana.

[0429] Em uma modalidade, a pectinase é uma pectina liase (EC 4.2.2.10).

[0430] Em uma modalidade, a pectina liase é derivada de uma cepa de Aspergillus, tal como Aspergillus niger.

[0431] Em uma modalidade, a pectinase é uma poligalacturonase (EC. 3.2.1.15). Em uma modalidade, a poligalacturonase é derivada de uma cepa de Aspergillus, tal como Aspergillus aculeatus.

[0432] Em uma modalidade, a pectinase é uma combinação de pectina liase e poligalacturonase. Em uma modalidade, a pectinase é uma combinação de pectina liase derivada de Aspergillus niger e poligalacturonase derivada de Aspergillus aculeatus. Exemplos de Enzimas (por exemplo, Mistura) Adequadas Para Uso em um Processo de Hidrólise de Amido em Bruto

[0433] Em uma modalidade, as enzimas (por exemplo, mistura) para uso em um processo aqui descrito compreendem uma glucoamilase e uma alfa-amilase, e opcionalmente uma composição de protease e/ou enzima celulolítica. Outras enzimas opcionais também podem ser usadas.

[0434] Em uma modalidade, as enzimas (por exemplo, mistura) usadas em um processo descrito neste documento compreendem ou consistem em uma glucoamilase de Trametes cingulata (por exemplo, SEQ ID NO: 20) e uma alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (SBD), por exemplo, SEQ ID NO: 16.

[0435] Em uma modalidade, as enzimas (por exemplo, mistura) usadas em um processo descrito neste documento compreendem a glucoamilase de Gloeophyllum trabeum (por exemplo, SEQ ID NO: 17 apresentada neste documento) tendo uma ou mais das seguintes substituições: S95P, A121P, preferencialmente S95P+A121P e uma alfa- amilase, preferencialmente uma alfa-amilase derivada de Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (SBD), mostrada na SEQ ID NO: 16 aqui, preferencialmente tendo uma ou mais das seguintes substituições: G128D, D143N, preferencialmente G128D+D143N.

[0436] Em uma outra modalidade, as enzimas (por exemplo, mistura) usadas em um processo descrito neste documento compreendem uma glucoamilase de Pycnoporus sanguineus mostrada em SEQ ID NO: 18 neste documento e uma alfa-amilase, preferencialmente uma derivada de Rhizomucor pusillus com um ligante e de ligação ao amido (SBD), preferencialmente Rhizomucor pusillus com um ligante e domínio de ligação de glucoamilase de Aspergillus niger (SBD), em particular uma mostrada na SEQ ID NO: 16 aqui, preferencialmente tendo uma ou mais das seguintes substituições: G128D, D143N, especialmente G128D+D143N.

[0437] Em uma modalidade, as enzimas (por exemplo, mistura) usadas em um processo descrito neste documento compreendem a glucoamilase de Gloeophyllum sepiarium mostrada em SEQ ID NO: 15 neste documento e a alfa-amilase, preferencialmente uma alfa-amilase derivada de Rhizomucor pusillus com um ligante e de ligação ao amido (SBD), preferencialmente a alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com um ligante e domínio de ligação de glucoamilase de Aspergillus niger (SBD) mostrado na SEQ ID NO: 16 aqui, preferencialmente tendo uma ou mais das seguintes substituições: G128D, D143N, preferencialmente G128D+D143N.

[0438] Em uma modalidade, as enzimas (por exemplo, mistura) usadas em um processo descrito neste documento compreendem a glucoamilase de Trametes cingulata mostrada em SEQ ID NO: 20 apresentada neste documento, e uma alfa-amilase, preferencialmente uma alfa-amilase derivada de Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (SBD), mostrada na SEQ ID NO: 16 apresentada neste documento, tendo uma ou mais das seguintes substituições: G128D, D143N, preferencialmente G128D+D143N.

[0439] Em uma modalidade, as enzimas (por exemplo, mistura) usadas em um processo descrito neste documento compreendem i) glucoamilase fúngica; ii) alfa-amilase fúngica; iii) composição de enzima celulolítica derivada de uma cepa de Trichoderma reesei, compreendendo ainda um polipeptídeo GH61, beta-glucosidase, CBH I e CBH II; iv) opcionalmente uma protease.

[0440] Em uma modalidade, as enzimas (mistura) usadas em um processo descrito neste documento compreendem i) glucoamilase de Trametes cingulata; ii) alfa-amilase de Rhizomucor pusillus, ou uma variante da mesma; iii) composição de enzima celulolítica derivada de uma cepa de Trichoderma reesei, compreendendo ainda um polipeptídeo GH61 de Penicillium emersonii, beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus com as seguintes substituições: F100D, S283G, N456E, F512Y, e opcionalmente CBH I de Aspergillus fumigatus e CBH II de Aspergillus fumigatus; iv) opcionalmente, uma protease de Thermoascus aurantiacus, ou uma variante da mesma.

[0441] Em uma modalidade, as enzimas (por exemplo, mistura) usadas em um processo descrito neste documento compreendem i) glucoamilase de Trametes cingulata;

ii) alfa-amilase de Rhizomucor pusillus, ou uma variante da mesma; iii) composição de enzima celulolítica derivada de uma cepa de Trichoderma reesei, compreendendo ainda um polipeptídeo GH61 de Penicillium emersonii, beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus com as seguintes substituições: F100D, S283G, N456E, F512Y, e opcionalmente CBH I de Aspergillus fumigatus e CBH II de Aspergillus fumigatus; iv) opcionalmente uma protease de Pyropoccus furiosus.

[0442] Em uma modalidade, as enzimas (por exemplo, mistura) usadas em um processo descrito neste documento compreendem i) glucoamilase derivada de Trametes cingulata; ii) alfa-amilase derivada de Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (SBD), ou uma variante da mesma; iii) composição de enzima celulolítica derivada de uma cepa de Trichoderma reesei. iv) opcionalmente, uma protease de Thermoascus aurantiacus, ou uma variante da mesma e/ou Pyrococcus furiosus.

[0443] Em uma modalidade, as enzimas (por exemplo, mistura) usadas em um processo descrito neste documento compreendem i) glucoamilase fúngica; ii) alfa-amilase fúngica; iii) composição de enzima celulolítica derivada de uma cepa de Trichoderma reesei, compreendendo ainda um polipeptídeo GH61, beta-glucosidase CBH I e CBH II; iv) pectinase, preferencialmente, uma pectina liase ou uma poligalacturonase, ou uma combinação das mesmas.

[0444] Em uma modalidade, a pectinase é uma combinação de pectina liase derivada de Aspergillus niger e poligalacturonase derivada de Aspergillus aculeatus.

[0445] Em uma modalidade, a pectinase é uma combinação de pectina liase e poligalacturonase. Em uma modalidade, a pectinase é uma combinação de pectina liase derivada de Aspergillus niger e poligalacturonase derivada de Aspergillus aculeatus.

[0446] Em uma modalidade, as enzimas (por exemplo, mistura) usadas em um processo descrito neste documento compreendem i) glucoamilase fúngica; ii) alfa-amilase fúngica; iii) pectinase, preferencialmente, uma pectina liase ou uma poligalacturonase, ou uma combinação das mesmas. iv) composição de enzima celulolítica derivada de uma cepa de Trichoderma reesei, compreendendo ainda um polipeptídeo GH61, beta-glucosidase CBH I e CBH II; v) protease.

[0447] Em uma modalidade, as enzimas (por exemplo, mistura) usadas em um processo descrito neste documento compreendem i) glucoamilase fúngica; ii) alfa-amilase fúngica; iii) composição de enzima celulolítica derivada de uma cepa de Trichoderma reesei, compreendendo ainda um polipeptídeo GH61, beta-glucosidase, CBH I e CBH II; iv) opcionalmente uma protease.

[0448] Em uma modalidade, as enzimas (por exemplo, mistura) usadas em um processo descrito neste documento compreendem i) glucoamilase de Trametes cingulata;

ii) alfa-amilase de Rhizomucor pusillus, ou uma variante da mesma; iii) composição de enzima celulolítica derivada de uma cepa de Trichoderma reesei, compreendendo ainda um polipeptídeo GH61 de Penicillium emersonii, beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus com as seguintes substituições: F100D, S283G, N456E, F512Y, e opcionalmente CBH I de Aspergillus fumigatus e CBH II de Aspergillus fumigatus; iv) pectina liase derivada de Aspergillus niger ou poligalacturonase derivada de Aspergillus aculeatus, ou uma combinação das mesmas; v) protease de Thermoascus aurantiacus, ou uma variante da mesma e/ou Pyrococcus furiosus.

[0449] Em uma modalidade, as enzimas (mistura) usadas em um processo descrito neste documento compreendem i) glucoamilase de Gloeophyllum trabeum mostrada na SEQ ID NO: 18 apresentada neste documento tendo uma ou mais das seguintes substituições: S95P, A121P, tal como S95P+A121P; ii) alfa-amilase derivada de Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (SBD), mostrada na SEQ ID NO: 13 apresentada neste documento, tendo as seguintes substituições: G128D+D143N; iii) composição de enzima celulolítica derivada de uma cepa de Trichoderma reesei, compreendendo ainda um polipeptídeo GH61 de Penicillium emersonii, beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus com as seguintes substituições: F100D, S283G, N456E, F512Y, e opcionalmente CBH I de Aspergillus fumigatus e CBH II de Aspergillus fumigatus;

opcionalmente iv) protease de Thermoascus aurantiacus, ou uma variante da mesma.

[0450] Em uma modalidade, as enzimas (por exemplo, mistura) usadas em um processo descrito neste documento compreendem i) glucoamilase de Pycnoporus sanguineus mostrada na SEQ ID NO: 18 aqui; ii) alfa-amilase derivada de Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (SBD), mostrada na SEQ ID NO: 16 apresentada neste documento, tendo as seguintes substituições: G128D+D143N; iii) composição de enzima celulolítica derivada de uma cepa de Trichoderma reesei, compreendendo ainda um polipeptídeo GH61 de Penicillium emersonii, beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus com as seguintes substituições: F100D, S283G, N456E, F512Y, e opcionalmente CBH I de Aspergillus fumigatus e CBH II de Aspergillus fumigatus; opcionalmente iv) protease de Thermoascus aurantiacus, ou uma variante da mesma.

[0451] Em uma modalidade, as enzimas (por exemplo, mistura) usadas em um processo descrito neste documento compreendem i) glucoamilase de Gloeophyllum sepiarium mostrada na SEQ ID NO: 15 aqui; ii) alfa-amilase derivada de Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (SBD), mostrada na SEQ ID NO: 16 apresentada neste documento, tendo as seguintes substituições: G128D+D143N; iii) composição de enzima celulolítica derivada de uma cepa de Trichoderma reesei, compreendendo ainda um polipeptídeo GH61 de Penicillium emersonii, beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus com as seguintes substituições: F100D, S283G, N456E, F512Y, e opcionalmente CBH I de Aspergillus fumigatus e CBH II de Aspergillus fumigatus; opcionalmente iv) protease de Thermoascus aurantiacus, ou uma variante da mesma.

[0452] Em uma modalidade, as enzimas (por exemplo, mistura) usadas em um processo descrito neste documento compreendem i) glucoamilase de Trametes cingulata mostrada na SEQ ID NO: 20 aqui; ii) alfa-amilase derivada de Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (SBD), mostrada na SEQ ID NO: 16 apresentada neste documento, tendo as seguintes substituições: G128D+D143N; iii) composição de enzima celulolítica derivada de uma cepa de Trichoderma reesei, compreendendo ainda um polipeptídeo GH61 de Penicillium emersonii, beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus com as seguintes substituições: F100D, S283G, N456E, F512Y, e opcionalmente CBH I de Aspergillus fumigatus e CBH II de Aspergillus fumigatus; opcionalmente iv) protease de Thermoascus aurantiacus, ou uma variante da mesma. Exemplos de Processos de Hidrólise de Amido em Bruto

[0453] Em uma modalidade, um processo de produção de etanol a partir de material contendo amido compreende: (i) sacarificação de material contendo amido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial; e (ii) fermentação usando um organismo de fermentação; em que

[0454] a sacarificação e/ou a fermentação é realizada na presença das seguintes enzimas: glucoamilase e alfa-amilase, e opcionalmente protease e/ou composição de enzimas celulolíticas; e

[0455] o organismo fermentador é uma cepa de levedura Saccharomyces, que aumenta o rendimento de etanol em comparação com o ETHANOL RED™ nas mesmas condições de fermentação.

[0456] Em uma modalidade, o processo fornece um ou mais, tal como todos, dos seguintes melhoramentos:

[0457] um aumento no rendimento de etanol comparado ao ETHANOL RED™ nas mesmas condições de fermentação (por exemplo, condições descritas aqui);

[0458] produção reduzida de acetaldeído em comparação com ETHANOL RED™ nas mesmas condições de processo (por exemplo, condições descritas aqui);

[0459] tolerância a temperatura aumentada em comparação com ETHANOL RED™ nas mesmas condições de processo (por exemplo, condições descritas aqui);

[0460] diminuição da produção de glicerol em comparação com ETHANOL RED™ nas mesmas condições de processo (por exemplo, condições descritas aqui);

[0461] Em uma modalidade, é um processo para a produção de etanol a partir de material contendo amido, compreendendo: (i) sacarificação de material contendo amido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial; e (ii) fermentação usando um organismo de fermentação; em que

[0462] a sacarificação e/ou a fermentação é realizada na presença das seguintes enzimas: glucoamilase e alfa-amilase, e opcionalmente protease e/ou composição de enzimas celulolíticas; e

[0463] o organismo fermentador é uma cepa de levedura Saccharomyces que fornece uma ou mais, tal como todas, os seguintes melhoramentos: aumenta o rendimento de etanol; reduz a produção de acetaldeído; aumento da tolerância à temperatura; e diminui a produção de glucose.

[0464] Em uma modalidade, o processo fornece um ou mais, tal como todos, dos seguintes melhoramentos:

[0465] aumenta o rendimento de etanol sobre ETHANOL RED™ (ER) em mais de 0,5%, por exemplo, mais de 1,0%, mais de 2,0%, mais de 2,5%, tal como cerca de 2,9%, tal como entre 0,5 e 5%, tal como entre 1-3%, nas mesmas condições do processo (por exemplo, condições descritas aqui);

[0466] reduz a produção de acetaldeído em mais de 10%, preferencialmente em mais de 20%, mais preferencialmente em mais de 30%, ainda mais preferencialmente em mais de 40%, especialmente em mais de 45%, tal como entre 5-60%, tal como 30-50%, comparado com ETHANOL RED™ nas mesmas condições de processo (por exemplo, condições descritas aqui);

[0467] aumenta a tolerância a temperatura em comparação com ETHANOL RED™ nas mesmas condições de processo (por exemplo, condições descritas aqui); e

[0468] diminui a produção de glicerol em mais de 3%, preferencialmente em mais de 4%, mais preferencialmente em mais de 5%, ainda mais preferencialmente em mais de 6%, especialmente em mais de 7%, tal como entre 2-15%, tal como 5-10%, comparado com ETHANOL RED™ nas mesmas condições de processo (por exemplo, condições descritas aqui).

[0469] Em uma modalidade, é um processo de produção de etanol a partir de material contendo amido compreende: (i) sacarificação de material contendo amido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial; e (ii) fermentação usando um organismo de fermentação; em que a sacarificação e/ou a fermentação é realizada na presença das seguintes enzimas: glucoamilase e alfa-amilase, e opcionalmente protease; e em que o organismo fermentador é: (1) a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae com características definidoras da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae; ou (2) a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae com características definidoras da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae;

[0470] Em uma modalidade, o derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae expressa uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase.

[0471] Em uma modalidade, o processo de produção de etanol a partir de material contendo amido compreende: (a) sacarificação de um material contendo amido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial; e (b) fermentação usando um organismo de fermentação; em que a sacarificação e/ou a fermentação são feitas na presença das seguintes enzimas: i) glucoamilase derivada de Trametes cingulata, Gloeophyllum trabeum, Gloeophyllum sepiarium, ou Pycnoporus sanguineus; ii) alfa-amilase derivada de Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (SBD), ou uma variante da mesma; iii) composição de enzima celulolítica derivada de Trichoderma reesei; iv) opcionalmente, uma protease de Thermoascus aurantiacus, ou uma variante da mesma e/ou Pyrococcus furiosus; e em que o organismo fermentador é uma cepa de levedura Saccharomyces que fornece uma ou mais, tal como todas, os seguintes melhoramentos: um aumento do rendimento de etanol em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de fermentação (por exemplo, condições como aqui descritas);

produção de acetaldeído reduzida em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo (por exemplo, condições como aqui descritas); tolerância à temperatura aumentada em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo (por exemplo, condições como aqui descritas); produção de glicerol reduzida em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo (por exemplo, condições como aqui descritas).

[0472] Em uma modalidade, o processo de produção de etanol a partir de material contendo amido compreende: (a) sacarificação de um material contendo amido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial; e (b) fermentação usando um organismo de fermentação; em que a sacarificação e/ou a fermentação são feitas na presença das seguintes enzimas: i) glucoamilase derivada de Gloeophyllum trabeum divulgada na SEQ ID NO: 17, com as seguintes substituições: S95P+A121P; ii) alfa-amilase derivada de Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (SBD), ou uma variante da mesma, mostrada na SEQ ID

NO: 16 neste documento, com as seguintes substituições: G128D+D143N; iii) composição de enzima celulolítica derivada de Trichoderma reesei; iv) opcionalmente, uma protease de Thermoascus aurantiacus, ou uma variante da mesma; e em que o organismo fermentador é uma cepa de levedura Saccharomyces que fornece um aumento no rendimento de etanol em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) sob as mesmas condições de fermentação (por exemplo, fornece aumento de rendimento de etanol em pelo menos 1,0%, pelo menos 2,0%, e pelo menos 2,5%, tal como entre 0,5-5%, por exemplo, entre 1-3% comparado a ETHANOL RED® nas condições aqui descritas).

[0473] Em uma modalidade, o processo de produção de etanol a partir de material contendo amido compreende: (a) sacarificação de um material contendo amido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial; e (b) fermentação usando um organismo de fermentação;

[0474] em que a sacarificação e/ou a fermentação são feitas na presença das seguintes enzimas: i) glucoamilase derivada de Pycnoporus sanguineus mostrada na SEQ ID NO: 18; ii) alfa-amilase derivada de Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (SBD), ou uma variante da mesma, mostrada na SEQ ID

NO: 16 neste documento, com as seguintes substituições: G128D+D143N; iii) composição de enzima celulolítica derivada de Trichoderma reesei; iv) opcionalmente, uma protease de Thermoascus aurantiacus, ou uma variante da mesma; e em que o organismo fermentador é uma cepa de levedura Saccharomyces que fornece um aumento no rendimento de etanol em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) sob as mesmas condições de fermentação (por exemplo, fornece aumento de rendimento de etanol em pelo menos 0,5%, pelo menos 1,0%, pelo menos 2,0%, pelo menos 2,5%, tal como entre 0,5-5%, por exemplo, entre 1-3% nas mesmas condições em comparação com ETHANOL RED®).

[0475] Em uma modalidade, o processo de produção de etanol a partir de material contendo amido compreende: (a) sacarificação de um material contendo amido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial; e (b) fermentação usando um organismo de fermentação; em que a sacarificação e/ou a fermentação são feitas na presença das seguintes enzimas: i) glucoamilase derivada de Gloeophyllum sepiarium mostrada na SEQ ID NO: 15; ii) alfa-amilase derivada de Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (SBD), ou uma variante da mesma, mostrada na SEQ ID

NO: 16 neste documento, com as seguintes substituições: G128D+D143N; iii) composição de enzima celulolítica derivada de Trichoderma reesei; iv) opcionalmente, uma protease de Thermoascus aurantiacus, ou uma variante da mesma; em que o organismo fermentador é uma cepa de levedura Saccharomyces que fornece um aumento no rendimento de etanol em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) sob as mesmas condições de fermentação (por exemplo, fornece aumento de rendimento de etanol em pelo menos 0,5%, pelo menos 1,0%, pelo menos 2,0%, pelo menos 2,5%, tal como entre 0,5-5%, por exemplo, entre 1-3% nas condições definidas no Exemplo 18 em comparação com ETHANOL RED®).

[0476] Em uma modalidade, o processo de produção de etanol a partir de material contendo amido compreende: (a) sacarificação de um material contendo amido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial; e (b) fermentação usando um organismo de fermentação; em que a sacarificação e/ou a fermentação são feitas na presença das seguintes enzimas: i) glucoamilase derivada de Trametes cingulata mostrada na SEQ ID NO: 20; ii) alfa-amilase derivada de Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (SBD), ou uma variante da mesma, mostrada na SEQ ID

NO: 16 neste documento, com as seguintes substituições: G128D+D143N; iii) composição de enzima celulolítica derivada de Trichoderma reesei; iv) opcionalmente, uma protease de Thermoascus aurantiacus, ou uma variante da mesma; e em que o organismo fermentador é uma cepa de levedura Saccharomyces que fornece um aumento no rendimento de etanol em comparação com ETHANOL RED™ sob as mesmas condições de fermentação (por exemplo, fornece aumento de rendimento de etanol em pelo menos 0,5%, pelo menos 1,0%, pelo menos 2,0%, pelo menos 2,5%, tal como entre 0,5-5%, por exemplo, entre 1-3% nas condições definidas no Exemplo 18 em comparação com ETHANOL RED™).

[0477] O uso da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae que expressa uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase.

[0478] O uso da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou dderivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae que expressa uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase.

[0479] A cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades praticamente iguais como as da cepa MBG5038 de Saccharomyces, ou um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces, com características definidoras da cepa MBG5038, ou cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae, (depositado sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture

Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades semelhantes às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae, ou um derivado da cepa MBG5038, de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5012, pode ser utilizado para aumentar o rendimento de etanol na fermentação.

[0480] Em uma modalidade, a mistura liquefeita a ser fermentada foi submetida a alfa-amilase e 0,5-50 microgramas de protease por grama de DS, tal como 1-5 microgramas de protease por grama de DS, tal como cerca de 1,5 ou 3 microgramas de protease por grama de DS.

[0481] A protease pode ser uma protease bacteriana. A protease pode ser derivada de uma cepa da bactéria Pyrococcus, tal como uma cepa de Pyrococcus furiosus (pfu de protease), tal como na SEQ ID NO: 13 neste documento. A protease pode ser a divulgada na SEQ ID NO: 13 aqui ou uma protease tendo pelo menos 80% de identidade, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, de identidade com SEQ ID NO: 13 neste documento.

[0482] A alfa-amilase utilizada para liquefação pode ser de origem bacteriana, tal como do gênero Bacillus, tal como uma cepa de Bacillus stearothermophilus, em particular uma variante de uma alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, tal como a mostrada na SEQ ID NO: 1 neste documento. Em uma modalidade, a variante da alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus é selecionada do grupo com as seguintes mutações: I181*+G182*, e opcionalmente substituição N193F, e ainda uma das seguintes substituições ou combinações de substituições E129V+K177L+R179E; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+ Q254S;

V59A+ Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; V59A+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; e E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando a SEQ ID NO: 1 para numeração).

[0483] Em uma modalidade, a mistura liquefeita a ser fermentada foi submetida a alfa-amilase, glucoamilase e a partir de 0,5-50 microgramas de protease por grama de DS, tal como 1-5 microgramas de protease por grama de DS, tal como cerca de 1,5 ou 3 microgramas de protease por grama de DS. A glucoamilase pode ser derivada de uma cepa do gênero Penicillium, especialmente de uma cepa de Penicillium oxalicum divulgada nas SEQ ID NOs: 9 ou 14 neste documento.

[0484] A glucoamilase pode ser uma variante da glucoamilase de Penicillium oxalicum com uma substituição K79V (utilizando a sequência madura apresentada na SEQ ID NO: 14 para numeração).

[0485] Em uma modalidade, a glucoamilase de Penicillium oxalicum tem uma substituição K79V (usando SEQ ID NO: 14 para numeração) e adicionalmente uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: P11F + T65A + Q327F; e P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F (usando SEQ ID NO: 14 para numeração). Levedura

[0486] Em uma modalidade, é uma cepa de Saccharomyces cerevisiae depositada sob o Tratado de Budapeste em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL) tendo o número de acesso do depósito NRRL Y67549 (cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae), ou um seu derivado que expressa uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase.

[0487] Em uma modalidade, é uma cepa de Saccharomyces cerevisiae depositada sob o Tratado de Budapeste em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL) tendo o número de acesso do depósito NRRL Y67700 (cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae), ou um seu derivado que expressa uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase.

[0488] A maioria do etanol mundial para combustíveis é produzida por meio de fermentação à escala industrial de açúcares à base de amido, em substratos tais como mosto de milho. Durante a fermentação à escala industrial, as leveduras enfrentam vários desafios fisiológicos incluindo concentrações variáveis de açúcares, elevadas concentrações de metabolitos de leveduras tais como etanol, glicerol, ácidos orgânicos, estresse osmótico, bem como potencial competição por parte de micróbios contaminantes tais como leveduras e bactérias selvagens. Como consequência, muitas cepas de Saccharomyces, particularmente aquelas que ocorrem naturalmente, não são apropriadas para utilização na fermentação industrial. A cepa industrial disponível comercialmente amplamente utilizada de Saccharomyces (isto é, para a fermentação à escala industrial) é a cepa de Saccharomyces cerevisiae, usada, por exemplo, no produto ETHANOL RED™. Esta cepa é apropriada para a produção industrial de etanol; porém, são necessárias cepas melhoradas de Saccharomyces cerevisiae.

[0489] Os Requerentes produziram as cepas NMI V14/004037 (Ver, WO2015/143324 e WO2015/143317), que é uma cepa de Saccharomyces cerevisiae que produz níveis mais elevados de etanol a partir do mosto de milho do que as cepas naturais de Saccharomyces cerevisiae e cepas de Saccharomyces cerevisiae usadas na indústria de combustível etanol, tal como ETHANOL RED™. Em particular, a cepa NMI V14/004037 possui um rendimento de etanol a partir da glucose que é maior do que outras cepas industriais, tal como ETHANOL RED™, durante a fermentação de mosto de milho. Isso significa que a cepa NMI V14/004037 pode produzir mais etanol por grama de glucose do que ETHANOL RED™ durante a fermentação do mosto de milho.

[0490] Os Requerentes produziram ainda a cepa número V15/004035, V15/004036 e V15/004037 (ver WO 2016/153924) que são capazes de produzir etanol a partir de glucose igual ou semelhante à cepa V14/004037 nas condições encontradas na fermentação em escala industrial, tal como aquelas encontradas durante a fermentação do mosto de milho, e que são superiores às cepas industriais de Saccharomyces cerevisiae disponíveis no mercado, usadas na indústria de etanol e às cepas de Saccharomyces cerevisiae que ocorrem naturalmente.

[0491] Os Requerentes produziram ainda a cepa número NRRL Y67549 e NRRL Y67700 como aqui descrito que demonstram propriedades melhoradas como descrito nos Exemplos.

[0492] Os requerentes produziram ainda derivados das cepas números NRRL Y67549 e NRRL Y67700, como aqui descrito, que expressam uma glucoamilase e demonstram propriedades melhoradas, como descrito nos Exemplos.

[0493] Tipicamente, o etanol produzido da fermentação de mosto de milho é produzido a partir da fermentação de açúcares que são endógenos do mosto de milho. Os açúcares que são endógenos do mosto de milho são açúcares derivados do milho, em vez de açúcares que são adicionados de uma fonte exógena.

[0494] A capacidade de produzir etanol rapidamente nas primeiras 20 horas de fermentação, o rendimento de etanol após 50 horas de fermentação e a capacidade de utilizar grande parte da glucose presente no substrato de mosto de milho dentro de 50 horas após a fermentação, são características que podem distinguir as cepas aqui descritas de cepas de ocorrência natural e cepas industriais comercialmente disponíveis de Saccharomyces cerevisiae.

[0495] Adicionalmente, a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositado sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) e cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) são capazes de crescer em meios nos quais a cisteína é a única fonte de nitrogênio. Como consequência, a capacidade das cepas MBG5038 e MBG 5012 de Saccharomyces cerevisiae de utilizar a cisteína como única fonte de nitrogênio é outra característica que distingue esta cepa de: (a) cepas contaminantes de Saccharomyces que não utilizam cisteína como única fonte de nitrogênio; e (b) outras cepas utilizadas na indústria do etanol que não possuem as capacidades de produção de etanol das cepas MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae; e/ou não utilizam cisteína como única fonte de nitrogênio.

[0496] Como resultado de sua capacidade de utilizar a cisteína como única fonte de nitrogênio, as cepas MBG5038 e MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae são prontamente diferenciadas das cepas currentes de Saccharomyces que são usadas na indústria de etanol, tal como Ethanol Red®.

[0497] A cepa também pode ser um derivado das cepas MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae. Como aqui utilizado, um "derivado" da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae é uma cepa derivada da referida cepa, tal como por meio de mutagênese, tecnologia de DNA recombinante, acoplamento, fusão celular ou citodução entre cepas de levedura. A cepa derivada da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae pode ser de descendência direta (ou seja, o produto de um acoplamento entre a cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae e outra cepa ou ela própria) ou uma descendência distante resultante de um acoplamento inicial entre a cepa MBG5038 ou MBG5012 Saccharomyces cerevisiae e outra cepa ou ela própria, seguida por um grande número de acoplamentos subsequentes.

[0498] Em uma modalidade, um derivado da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae é uma cepa híbrida produzida pela cultura de uma primeira cepa de levedura com a cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae sob condições que permitem a combinação de DNA entre a primeira cepa de levedura e a cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae.

[0499] Em uma modalidade, um derivado recombinante da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae foi preparado modificando geneticamente a cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (ou outro seu derivado) para expressar uma alfa- amilase e/ou glucoamilase aqui descrita.

[0500] Em uma modalidade é um método de produção de um derivado recombinante da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositado sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA), compreendendo:

(a) transformar a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (ou um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae) ou a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (ou um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae) com um ou mais vetores de expressão que codificam uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase; e (b) isolar a cepa transformada.

[0501] Em uma modalidade, um derivado da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae pode ser preparado por: (a) cultura de uma primeira cepa de levedura com uma segunda cepa de levedura, em que a segunda cepa de levedura é a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (ou um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae) ou a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (ou um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae), sob condições que permitem a combinação de DNA entre a primeira cepa de levedura e a segunda cepa de levedura; e (b) isolamento de cepas híbridas; e (c) repetição opcional das etapas (a) e (b) usando uma cepa híbrida isolada na etapa (b) como a primeira cepa de leveduras e/ou o derivado da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae.

[0502] Em uma modalidade, o derivado da MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae apresenta uma ou mais das características definidoras da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae. Os derivados de Saccharomyces que apresentam uma ou mais das características definidoras da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae são produzidos usando a cepa

MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae, respectivamente. A este respeito, a cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae constitui a base para a preparação de outras cepas com características definidoras da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae. Por exemplo, as cepas de Saccharomyces que apresentam uma ou mais das características definidoras da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae podem ser derivadas da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae respectivamente, usando métodos tais como o acoplamento clássico, fusão celular, ou citodução entre cepas de leveduras, mutagênese ou tecnologia de DNA recombinante.

[0503] Em uma modalidade, um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae que apresente uma ou mais das características definidoras da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae pode ser produzido por: (a) cultura de uma primeira cepa de levedura com uma segunda cepa de levedura, em que a segunda cepa de levedura é a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (ou um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae) ou a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (ou um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae), sob condições que permitem a combinação de DNA entre a primeira cepa de levedura e a segunda cepa de levedura; (b) triagem ou seleção para um derivado da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae, tal como triagem ou seleção de um derivado com produção aumentada de etanol no mosto de milho em comparação com a primeira cepa; (c) repetição opcional das etapas (a) e (b) com a cepa triada ou selecionada da etapa (c) como primeira cepa de leveduras e/ou segunda cepa de leveduras, até se obter um derivado da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae que apresente uma ou mais das características definidoras da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae.

[0504] A primeira cepa de leveduras pode ser qualquer cepa de levedura se o DNA da cepa puder ser combinado com a segunda cepa de leveduras usando métodos tal como o acoplamento clássico, fusão celular ou citodução. Tipicamente, a primeira cepa de leveduras é uma cepa de Saccharomyces. Mais tipicamente, a primeira cepa de leveduras é uma cepa de Saccharomyces cerevisiae. Saccharomyces cerevisiae é tal como definida por Kurtzman (2003) FEMS Yeast Research vol 4 pp. 233-245. A primeira cepa de leveduras pode ter propriedades desejadas que se procura combinar com as características definidoras da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae. A primeira cepa de leveduras pode ser, por exemplo, qualquer cepa de Saccharomyces cerevisiae, tal como por exemplo ETHANOL RED®. Também será apreciado que a primeira cepa de levedura pode ser a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (ou um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae) ou a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (ou um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae).

[0505] A primeira e a segunda cepas de leveduras são cultivadas em condições que permitem a combinação de DNA entre as cepas de leveduras. Tal como aqui utilizado, "combinação do DNA" entre cepas de leveduras se refere à combinação de todo ou de uma parte do genoma das cepas de leveduras. A combinação do DNA entre cepas de leveduras pode ser efetuada por meio de qualquer método adequado para a combinação do DNA de pelo menos duas células de levedura, e pode incluir, por exemplo, métodos de acoplamento que compreendem a esporulação das cepas de levedura para produzir células haploides e posterior hibridização de células haploides compatíveis; citodução; ou fusão celular tal como fusão de protoplastos.

[0506] Em uma modalidade, a cultura da primeira cepa de leveduras com a segunda levedura, sob condições que permitam a combinação do DNA entre a primeira cepa de leveduras e a segunda cepa de leveduras, compreende: (i) esporulação da primeira cepa de leveduras e da segunda cepa de leveduras; (ii) germinação e hibridização dos esporos produzidos pela primeira cepa de leveduras com os esporos produzidos pela segunda cepa de leveduras.

[0507] Em uma modalidade, o método de produção de um derivado da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae que apresenta uma ou mais das características definidoras da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae compreende: (a) proporcionar: (i) uma primeira cepa de levedura; e (ii) uma segunda cepa de levedura, em que a segunda cepa de levedura é a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (ou um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae) ou a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (ou um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae); (b) esporulação da primeira cepa de leveduras e da segunda cepa de leveduras; (c) germinação e hibridização dos esporos da primeira cepa de leveduras com os esporos germinados da segunda cepa de leveduras; (d) triagem ou seleção de um derivado da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae, tal como triagem ou seleção de um derivado com produção aumentada de etanol em

20 horas de fermentação em mosto de milho em comparação com a primeira cepa e/ou maior rendimento de etanol da glucose durante a fermentação do mosto de milho que a primeira cepa; (e) repetição opcional das etapas (b) a (d) com a cepa triada ou selecionada como primeira e/ou segunda cepa de leveduras.

[0508] Os métodos de esporulação, germinação e hibridização de cepas de leveduras, e em particular, de cepas de Saccharomyces, são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Ausubel, F. M. et al., (1997) Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, páginas 13.2.1 a 13.2.5 (John Willey & Sons Inc); Capítulo 7, "Sporulation and Hybridisation of yeast" por R.R. Fowell, em “The Yeasts” vol 1, A.H. Rose e J.S. Harrison (Eds), 1969, Academic Press.

[0509] Em uma modalidade, as cepas de leveduras podem ser cultivadas em condições que permitam a fusão celular. Os métodos para a geração de híbridos intraespecíficos ou interespecíficos usando técnicas de fusão celular são descritos, por exemplo, em Spencer et al. (1990) em, Yeast Technology, Spencer JFT e Spencer DM (Eds), Springer Verlag, Nova Iorque.

[0510] Em uma outra modalidade, as cepas de leveduras podem ser cultivadas em condições que permitam a citodução. Os métodos de citodução são descritos, por exemplo, em Inge-Vechymov et al. (1986) Genetika 22: 2625-2636; Johnston (1990) em, Yeast technology, Spencer JFT e Spencer DM (Editores), Springer Verlag, Nova Iorque.

[0511] Em uma modalidade, a triagem ou seleção de derivados da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae compreende triagem ou seleção de um derivado com produção aumentada de etanol nas primeiras 20 horas de fermentação do mosto de milho em comparação com a primeira cepa e/ou triagem ou seleção para um híbrido com maior rendimento de etanol a partir de glucose no mosto de milho em comparação com a primeira cepa

[0512] Como usado aqui, "rendimento de etanol a partir de glucose" é o rendimento de etanol que seria alcançado a partir de glucose se toda a glucose em um substrato fosse usada na fermentação. Numa modalidade, o rendimento de etanol a partir da glucose é calculado da seguinte forma: (G x 0,51) + E em que G = % peso/volume de glucose remanescente após fermentação do substrato contendo glucose; e E = % peso/volume de etanol presente após fermentação do substrato contendo glucose.

[0513] Os derivados podem ser triados ou selecionados quanto ao rendimento de etanol, triando uma ou mais das seguintes características: (a) produz uma % p/v de acetato que está na gama de uma quantidade superior à produzida pela cepa Ethanol Red® até a quantidade produzida pela cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae, nas mesmas condições em uma fermentação de mosto de milho; (b) produz uma razão de % p/v de glicerol para % p/v de acetato que está na gama inferior à razão entre % p/v de glicerol e % p/v de acetato produzido por Ethanol Red® para a razão de % p/v de glicerol a % p/v de acetato produzido por a cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae, nas mesmas condições em uma fermentação de mosto de milho; (c) produz uma razão de % p/v de etanol para % p/v de acetato que está na gama inferior à razão entre % p/v de etanol e % p/v de acetato produzido por Ethanol Red® para a razão de % p/v de etanol a % p/v de acetato produzido por a cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae, nas mesmas condições em uma fermentação de mosto de milho.

[0514] Os métodos para a determinação da quantidade de etanol, glicerol e acetato produzida por uma cepa são conhecidos na técnica. Por exemplo, os métodos de teste para a determinação da quantidade de etanol, glicerol e acetato produzidos por uma cepa durante a fermentação de mosto de milho são descritos, por exemplo, em WO 2011/035392. Uma vez conhecidas as quantidades de etanol, glicerol e acetato produzidas, as razões etanol/acetato e glicerol/acetato podem ser prontamente determinadas. Consequentemente, podem ser prontamente triadas cepas quanto aos níveis de produção de etanol, acetato e/ou glicerol utilizando métodos conhecidos.

[0515] Em uma modalidade, um derivado da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae que apresente uma ou mais das características definidoras da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae pode ser um mutante da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae. São conhecidos na técnica métodos para a produção de mutantes de levedura Saccharomyces, e especificamente mutantes de Saccharomyces cerevisiae, e são descritos, por exemplo, em Lawrence C.W. Hayashida et al., 1991, Methods In Enzymology 194: 273-281.

[0516] Em outra modalidade, um derivado da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae que apresente uma ou mais das características definidoras da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae pode ser um derivado recombinante da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae. Um derivado recombinante da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae é uma cepa produzida pela introdução na cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae de um ácido nucleico usando a tecnologia de DNA recombinante. Os métodos para a introdução de ácidos nucleicos em células de levedura Saccharomyces, e em particular de cepas de Saccharomyces, são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Ausubel, F. M. et al. (1997), Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, páginas 13.7.1 a 13.7.7, publicado por John Wiley & Sons Inc.

[0517] Também são descritos métodos para a produção de etanol usando a cepa aqui descrita. Em uma forma, a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (ou um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae) ou a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (ou um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae) é incubada com um substrato que compreende açúcares fermentáveis em condições que permitem a fermentação do açúcar. Os açúcares fermentáveis podem ser um ou mais de, galactose, maltose, frutose e sacarose. Tipicamente, o açúcar fermentável é a glucose. Enquanto que as cepas MBG5038 e MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae são adequadas para a fermentação em mosto de milho, se prevê que a cepa também possa ser adequada para outros processos de fermentação. Consequentemente, a fonte do açúcar fermentável no substrato pode ser, por exemplo, amido hidrolisado, celulose hidrolisada, melaços, suco de cana, suco de uva, suco de fruta, glucose, maltodextrinas, suco de açúcar em bruto, galactose, sacarose, ou quaisquer outras formas de açúcares fermentáveis. Em uma forma, a fonte de açúcar fermentável no substrato é amido hidrolisado. Tipicamente, o amido é obtido a partir de um substrato tal como mosto de milho. Na preparação do substrato, o grão é tipicamente moído e misturado com água e (uma) enzima(s) hidrolítica(s) sob condições que resultam na hidrólise do amido e na liberação de açúcares fermentáveis tais como glucose. Enzimas típicas para a hidrólise do amido incluem a α-

amilase, amiloglicosidase, pululanase, alfa-amilase, glucoamilase, ou misturas das mesmas. Enzimas adequadas para a hidrólise estão disponíveis, por exemplo, na Novozymes ou Genencor Inc. Em uma forma, o substrato é fornecido na forma de mosto de milho. O mosto de milho é tipicamente produzido por meio de: (a) moagem do milho para formar uma farinha; (b) mistura da farinha com água; e (c) hidrólise do amido na farinha de milho. Os métodos para a preparação do mosto de milho são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Thomas, K. C. et al., (2001) Journal of Applied Microbiology, volume 90, páginas 819-828. Os métodos para a preparação de outros substratos à base de amido incluindo o sorgo, correntes de amido e suas combinações, também são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Kwiatkowski J.R. et al. (2003) Industrial Crops and Products 23: 288-296 e Bothast R.J. e Schlicher M.A.(2005) Applied Microbial Biotechnology 67: 19-25

[0518] A fermentação é levada a cabo a uma temperatura que permite a fermentação dos açúcares fermentáveis. Tipicamente, a temperatura à qual a fermentação é levaada a cabo varia de 25-34 °C.

[0519] A fermentação resulta em um mosto alcoólico compreendendo etanol e açúcares residuais em solução, e em uma parte específica compreendendo sólidos residuais incluindo leveduras. O etanol é isolado do mosto usando métodos conhecidos na técnica tais como destilação ou filtração.

[0520] Os métodos de fermentação e destilação são conhecidos na técnica e estão descritos, por exemplo, Kwiatkowski J.R. et al. (2003) Industrial Crops and Products 23: 288-296 e Bothast R.J. e Schlicher M.A.(2005) Applied Microbial Biotechnology 67: 19-25

[0521] Também são contemplados métodos de produção de grãos de destilador. Os grãos de destiladores podem ser produzidos a partir dos sólidos residuais produzidos na fermentação, usando métodos conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos 7,572,353. Uma vez que as cepas MBG5038 e MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae reduzem o nível de açúcares residuais que restam após fermentação, os grãos de destiladores que resultam da fermentação usando a cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae têm um teor reduzido de glucose e são, por conseguinte, mais estáveis e menos propensos a carbonização, caramelização ou contaminação com micro-organismos indesejados.

[0522] Para além disso, um teor mais baixo de glicerol nos grãos de destiladores é uma vantagem do processo porque é necessário menos tempo para secar os grãos de destiladores. Adicionalmente, menos glicerol nos grãos de destiladores resulta em uma melhoria da fluidez, e resulta ainda em grãos de destiladores que possuem um teor mais elevado em nutrientes (por exemplo mais proteínas).

[0523] Um outro aspecto fornece levedura seca ou comprimida compreendendo a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (ou um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae) ou a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (ou um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae), tipicamente com as características definidoras da cepa MBG5012 ou MBG5012 Saccharomyces cerevisiae.

[0524] Um aspecto adicional fornece uma composição compreendendo a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (ou um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae) ou a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (ou um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae). A composição pode ser, por exemplo, levedura de creme, levedura comprimida, levedura úmida, levedura seca, levedura semi-seca, levedura desintegrada, levedura líquida estabilizada ou levedura congelada. Os métodos para preparar tais composições de levedura são conhecidos na técnica.

[0525] Em algumas modalidades, o derivado da cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae expressa uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase. Os derivados que expressam glucoamilase e/ou alfa-amilase foram gerados para melhorar o rendimento de etanol e para melhorar a economia do processo, reduzindo os custos das enzimas, uma vez que parte ou todas as enzimas necessárias para hidrolisar o amido serão produzidas pelo organismo de levedura.

[0526] Um aspecto da presente invenção se refere, portanto, as cepas de leveduras que compreendem um ou mais vetores de expressão que codificam uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase, em que a levedura é derivada de uma cepa genitora MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae; e em que a glucoamilase é selecionada a partir de glucoamilases obtidas de Gloeophyllum, Pynnoporous, Trametes.

[0527] Um outro aspecto da presente invenção se refere, portanto, a cepa de leveduras que compreende um ou mais vetores de expressão que codificam uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase, em que a levedura é derivada de uma cepa genitora MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae; e em que a alfa-amilase é selecionada a partir de uma alfa-amilase de Rhizomucor pusillus ou Aspergillus terreus.

[0528] Em uma modalidade, a glucoamilase é selecionada a partir de glucoamilase de Gloeophyllum trabeum, Gloeophyllum sepiarium ou Gloeophyllum abietinum.

[0529] Em uma outra modalidade a glucoamilase é selecionada do grupo que consiste em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 17; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 17.

[0530] Em uma modalidade, a glucoamilase é a glucoamilase de Gloeophyllum trabeum mostrada na SEQ ID NO: 17 tendo uma das seguintes substituições: V59A; S95P; A121P; T119W; S95P+A121P; V59A+S95P; S95P+T119W; V59A+S95P+A121P; ou S95P+T119W+A121P, especialmente S95P+A121P; e em que a glucoamilase tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 17.

[0531] Em uma modalidade particular, a glucoamilase é selecionada a partir de uma glucoamilase de Trucoetes cingulata. Mais particularmente, a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 20; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 20.

[0532] Em uma modalidade particular, a glucoamilase é selecionada a partir de uma glucoamilase de Pycnoporus sanguineus. Mais particularmente, a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo de

SEQ ID NO: 18; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 18.

[0533] Em uma outra modalidade particular, a alfa-amilase é uma alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação a amido (SBD) mostrado na SEQ ID NO: 16, preferencialmente uma tendo pelo menos uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: D165M; Y141W; Y141R; K136F; K192R; P224A; P224R; S123H+Y141W; G20S + Y141W; A76G + Y141W; G128D + Y141W; G128D + D143N; P219C + Y141W; N142D + D143N; Y141W + K192R; Y141W + D143N; Y141W + N383R; Y141W + P219C + A265C; Y141W + N142D + D143N; Y141W + K192R V410A; G128D + Y141W + D143N; Y141W + D143N + P219C; Y141W + D143N + K192R; G128D + D143N + K192R; Y141W + D143N + K192R + P219C; G128D + Y141W + D143N + K192R; ou G128D + Y141W + D143N + K192R + P219C, especialmente G128D+D143N (usando SEQ ID NO: 16 para numeração), e em que a alfa-amilase tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95 %, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 16.

[0534] Em outra modalidade, a alfa-amilase é uma alfa- amilase de Aspergillus terreus. Mais particularmente, a alfa-amilase é selecionada do grupo que consiste em: (i) uma alfa-amilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ

ID NO: 6 da WO2017/087330 (cujo conteúdo é incorporado por referência); (ii) uma alfa-amilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 6 de WO2017/087330. Composições

[0535] Este aspecto relaciona-se a uma composição de levedura Saccharomyces formulada, compreendendo uma cepa de leveduras aqui descrita e um componente que ocorre naturalmente e/ou um componente que ocorre não naturalmente.

[0536] Como mencionado acima, uma cepa de levedura Saccharomyces aqui descrita pode estar em qualquer forma viável, incluindo forma desintegrada, seca, incluindo seca ativa e instantânea, comprimida, creme (líquido), etc. Em uma modalidade, a cepa de levedura Saccharomyces cerevisiae é levedura seca, tal como levedura seca ativa ou levedura instantânea. Em uma modalidade, a cepa de levedura Saccharomyces cerevisiae é uma levedura desintegrada. Em uma modalidade, a cepa de levedura Saccharomyces cerevisiae é uma levedura comprimida. Em uma modalidade, a cepa de levedura Saccharomyces cerevisiae é uma levedura em creme.

[0537] Em uma modalidade está uma composição compreendendo uma levedura Saccharomyces descrita aqui, em particular uma cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae, e um ou mais dos componentes selecionados do grupo consistindo em: tensoativos,

emulsificantes, gomas, agentes de dilatação e antioxidantes e outros auxiliares de processamento. Tensoativo

[0538] As composições aqui descritas podem compreender uma levedura Saccharomyces aqui descrita, em particular as cepas MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae e quaisquer tensoativos adequados. Em uma modalidade, o(s) tensoativo(s) é/são (um) tensoativo(s) aniônico(s), tensoativo(s) catiônico(s) e/ou tensoativo(s) não iônico(s). Emulsionante

[0539] As composições aqui descritas podem compreender uma levedura Saccharomyces aqui descrita, em particular as cepas MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae e qualquer emulsificante adequado. Em uma modalidade, o emulsificante é um éster de ácidos graxos de sorbitana. Em uma modalidade, o emulsificante é selecionado do grupo de monoestearato de sorbitana (SMS), ésteres de ácido cítrico de monodiglicerídeos, poligliceroléster, ésteres de ácidos graxos de propilenoglicol.

[0540] Em uma modalidade, a composição compreende uma levedura Saccharomyces descrita aqui, em particular, uma cepa MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae, e Olindronal SMS, Olindronal SK ou Olindronal SPL incluindo a composição em causa na Patente Europeia No. 1,724,336 (deste modo incorporada por referência). Estes produtos estão comercialmente disponíveis a partir da Bussetti, Áustria, para leveduras secas ativas. Goma

[0541] As composições aqui descritas podem compreender uma levedura Saccharomyces aqui descrita, em particular as cepas MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae e qualquer goma adequada. Em uma modalidade, a goma é selecionada do grupo de gomas de alfarroba, guar, tragacanto, arábica, xantana e acácia, em particular para leveduras em creme, comprimidas e secas. Agentes de Dilatação

[0542] As composições aqui descritas podem compreender uma levedura Saccharomyces aqui descrita, em particular as cepas MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae e qualquer agente de dilatação adequado. Em uma modalidade, o agente de dilatação é celulose de metila ou celulose de carboximetila. Antioxidante

[0543] As composições aqui descritas podem compreender uma levedura Saccharomyces aqui descrita, em particular as cepas MBG5038 ou MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae e qualquer antioxidante adequado. Em uma modalidade, o antioxidante é hidroxianisol butilado (BHA) e/ou o hidroxitolueno butilado (BHT) ou ácido ascórbico (vitamina C), particular para leveduras secas ativas.

[0544] A invenção pode ser adicionalmente descrita nos seguintes parágrafos numerados:

[0545] Parágrafo 1. Um processo para produzir etanol a partir de material contendo amido, que compreendem as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando uma alfa- amilase; ii) sacarificação usando uma glucoamilase; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815

University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5038.

[0546] Parágrafo 2. O processo do parágrafo 1, em que o organismo fermentador tem uma ou mais, tais como todas, as seguintes propriedades e características definidoras: aumenta o rendimento de etanol em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo, por exemplo, condições do processo como aqui descritas; e/ou produção de glicerol reduzida em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo, por exemplo, condições do processo como aqui descritas.

[0547] Parágrafo 3. O processo dos parágrafos 1 ou 2, em que o organismo fermentador fornece um aumento no rendimento de etanol sobre a cepa de Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) de mais de 0,5%, por exemplo, mais de 1,0%, mais de 2,0%, mais de 2,5%, tal como cerca de 2,9%, tal como entre 0,5 e 5%, tal como entre 1- 3%, sob as mesmas condições de processo, por exemplo, condições descritas aqui.

[0548] Parágrafo 4. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-3, em que o organismo fermentador reduz a produção de acetaldeído em mais de 10%, por exemplo, mais de 20%, mais de 30%, mais de 40%, mais do que 45%, tal como 5-60%, tal como 30-50%, em comparação com a cepa Ethanol Red® de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso V14 / 007039 no National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo, por exemplo, condições de processo aqui descritas.

[0549] Parágrafo 5. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-4, em que o organismo fermentador aumenta a tolerância à temperatura em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo, por exemplo, condições de processo como aqui descritas.

[0550] Parágrafo 6. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-5, em que o organismo fermentador diminui a produção de glicerol em mais de 3%, por exemplo, mais de 4%, mais de 5%, mais de 6%, mais do que 7%, tal como 2-15%, tal como 5-10%, em comparação com a cepa Ethanol Red® de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso V14 / 007039 no National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo, por exemplo, condições de processo aqui descritas.

[0551] Parágrafo 7. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-6, em que o organismo fermentador: (a) produz um título mais elevado de etanol nas primeiras 20 horas de fermentação do que a cepa de Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália), nas mesmas condições em um mosto de milho fermentação, por exemplo, condições aqui descritas; (b) deixa menos glucose remanescente após 50 horas de fermentação do que a cepa de Saccharomyces cerevisiae

Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália), nas mesmas condições em um mosto de milho fermentação, por exemplo, condições aqui descritas; (c) tem um rendimento mais alto de etanol do que a cepa de Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) após 50 horas de fermentação sob as mesmas condições em uma fermentação de mosto de milho, por exemplo, condições aqui descritas.

[0552] Parágrafo 8. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-7, em que é adicionada uma protease na sacarificação ou fermentação ou SSF.

[0553] Parágrafo 9. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-8, que compreende ainda, antes da etapa i) de liquefação, as etapas de: x) redução do tamanho das partículas do material contendo amido, preferencialmente por moagem a seco; y) formação de uma pasta semifluida compreendendo o material contendo amido e água.

[0554] Parágrafo 10. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-9, em que pelo menos 50%, por exemplo pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% do material contendo amido passa através de uma peneira com tela de # 6.

[0555] Parágrafo 11. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-10, em que o pH na liquefação se situa entre 4-7, tal como pH 4,5-6,5, tal como pH 5,0-6,5, tal como pH 5,0-6,0, tal como pH 5,2-6,2, tal como a cerca de 5,2, tal como a cerca de 5,4, tal como a cerca de 5,6, tal como a cerca de 5,8.

[0556] Parágrafo 12. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-11, em que a temperatura na liquefação se encontra no intervalo de 70-100 °C, tal como 75-95 °C, 75-90 °C, 80-90 °C ou 82-88 °C, tal como a cerca de 85 °C.

[0557] Parágrafo 13. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-12, em que é levada a cabo uma etapa de cozimento a jato antes da liquefação na etapa i).

[0558] Parágrafo 14. O processo do parágrafo 13, em que o cozimento a jato é levado a cabo a uma temperatura de 110-145 °C, por exemplo, 120-140 °C, tal como 125-135 °C, ou cerca de 130 °C durante cerca de 1-15 minutos, por exemplo durante cerca de 3-10 minutos, ou cerca de 5 minutos.

[0559] Parágrafo 15. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-14, em que a sacarificação e a fermentação são levadas a cabo sequencial ou simultaneamente (SSF).

[0560] Parágrafo 16. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-15, em que a sacarificação é levada a cabo a uma temperatura de 20-75 °C, por exemplo de 40-70 °C, tal como a cerca de 60 °C, e a um pH entre 4 e 5.

[0561] Parágrafo 17. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-16, em que a fermentação ou a sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) é/são levada(s) a cabo a uma temperatura de 25 °C a 40 °C, tal como de 28 °C a 35 °C, tal como de 30 °C a 34 °C, ou cerca de 32 °C. Em uma modalidade, a fermentação está em curso durante 6 a 120 horas, em particular 24 a 96 horas.

[0562] Parágrafo 18. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-17, em que o produto da fermentação é recuperado após fermentação, tal como por destilação.

[0563] Parágrafo 19. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-18, em que o produto da fermentação é um álcool, preferencialmente etanol, especialmente etanol combustível, etanol potável e/ou etanol industrial.

[0564] Parágrafo 20. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-19, em que o material de partida contendo amido são grãos integrais.

[0565] Parágrafo 21. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-20, em que o material contendo amido é derivado de milho, trigo, cevada, centeio, milo, sagu, aipim, mandioca, tapioca, sorgo, aveia, arroz ou batatas.

[0566] Parágrafo 22. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-21, em que a alfa-amilase utilizada ou adicionada na etapa i) de liquefação é de origem bacteriana.

[0567] Parágrafo 23. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-22, em que a alfa-amilase é do gênero Bacillus, tal como uma cepa de Bacillus stearothermophilus, em particular uma variante de uma alfa- amilase Bacillus stearothermophilus, tal como a mostrada na SEQ ID NO: 3 em WO 99/019467 ou SEQ ID NO: 1 neste documento.

[0568] Parágrafo 24. O processo do parágrafo 23, em que a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, ou variante da mesma está truncada no terminal C, preferencialmente para ter de 485 a 495 aminoácidos de comprimento, tal como cerca de 491 aminoácidos de comprimento.

[0569] Parágrafo 25. O processo de qualquer um dos parágrafos 23 ou 24, em que a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus tem uma dupla deleção nas posições I181 + G182, e opcionalmente uma substituição N193F, ou deleção de R179 + G180 (usando a SEQ ID NO: 1 para numeração).

[0570] Parágrafo 26. O processo de qualquer um dos parágrafos 23-25, em que a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus tem uma substituição na posição S242, por exemplo uma substituição S242Q (usando a SEQ ID NO: 1 para numeração).

[0571] Parágrafo 27. O processo de qualquer um dos parágrafos 23-26, em que a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus tem uma substituição na posição E188, por exemplo uma substituição E188P (usando a SEQ ID NO: 1 para numeração).

[0572] Parágrafo 28. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-27, em que a alfa-amilase tem um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 0,2 mM) de pelo menos 10, tal como de pelo menos 15, tal como de pelo menos 20, tal como de pelo menos 25, tal como de pelo menos 30, tal como de pelo menos 40, tal como de pelo menos 50, tal como de pelo menos 60, tal como 10-70, tal como 15-70, tal como 20-70, tal como 25-70, tal como 30-70, tal como 40-70, tal como 50-70, tal como 60-70.

[0573] Parágrafo 29. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-28, em que a alfa-amilase presente e/ou adicionada na etapa i) de liquefação é selecionada do grupo de variantes da alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus com uma das seguintes substituições ou combinações de substituições, além de I181*+G182*, e opcionalmente substituição N193F: V59A+Q89R+G112D+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+D269E+D281 N; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+I270L; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+H274K; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+Y276F; V59A+E129V+R157Y+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+H274K; V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F; V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+D281N; V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T; V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+G416V; V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S; V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T; A91L+M96I+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; E129V+K177L+R179E; E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F+L427M; E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T; E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+N376*+I377*; E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S; E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T; E129V+K177L+R179E+S242Q; E129V+K177L+R179V+K220P+N224L+S242Q+Q254S; K220P+N224L+S242Q+Q254S; M284V; V59A+Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; e V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+ M284V;

[0574] Parágrafo 30. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-29, em que a alfa-amilase presente e/ou adicionada na etapa i) de liquefação é selecionada do seguinte grupo de variantes da alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus compreendendo as seguintes mutações: I181*+G182*, e opcionalmente substituição N193F, e ainda uma das seguintes substituições ou combinações de substituições E129V+K177L+R179E;

V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+ Q254S V59A+ Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; V59A+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; e E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando SEQ ID NO: 1 aqui para numeração).

[0575] Parágrafo 31. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-30, em que a glucoamilase está presente e/ou é adicionada na sacarificação e/ou fermentação.

[0576] Parágrafo 32. O processo do parágrafo 31, em que a glicomilase presente e/ou adicionada na sacarificação, fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) é de origem fúngica, preferencialmente de uma cepa de Aspergillus, preferencialmente A. niger, A. awamori, ou A. oryzae; ou de uma cepa de Trichoderma, preferencialmente Trichoderma reesei; ou de uma cepa de Talaromyces, preferencialmente Talaroomyces emersonii, ou de uma cepa de Pycnoporus, ou de uma cepa de Gloeophyllum, tal como Gloeophyllum serpiarium ou G. trabeum, ou de uma cepa de Nigrofomes.

[0577] Parágrafo 33. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-32, em que a glucoamilase é derivada de Talaromyces emersonii, tal como a mostrada na SEQ ID NO: 19 neste documento.

[0578] Parágrafo 34. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-33, em que a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 19 aqui; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, por ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 19 neste documento.

[0579] Parágrafo 35. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-34, em que a glucoamilase presente e/ou adicionada na sacarificação é derivada de Gloeophyllum serpiarium, tal como a apresentada na SEQ ID NO: 15 neste documento.

[0580] Parágrafo 36. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-35, em que a glucoamilase presente e/ou adicionada na sacarificação é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 15 aqui; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, por ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 15 neste documento.

[0581] Parágrafo 37. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-36, em que a glucoamilase presente e/ou adicionada na sacarificação é derivada de Gloeophyllum trabeum, tal como a apresentada na SEQ ID NO: 17 neste documento.

[0582] Parágrafo 38. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-37, em que a glucoamilase presente e/ou adicionada na sacarificação é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 17 aqui;

(ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, por ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 17 neste documento.

[0583] Parágrafo 39. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-38, em que a glucoamilase está presente e/ou é adicionada na sacarificação e/ou fermentação em combinação com uma alfa-amilase.

[0584] Parágrafo 40. O processo do parágrafo 39, em que a alfa-amilase está presente e/ou é adicionada na sacarificação e/ou fermentação é de origem fúngica ou bacteriana.

[0585] Parágrafo 41. O processo do parágrafo 40 ou 41, em que a alfa-amilase presente e/ou adicionada na sacarificação e/ou fermentação é derivada de uma cepa do gênero Rhizomucor, preferencialmente uma cepa de Rhizomucor pusillus, tal como a mostrada na SEQ ID NO: 3 em WO 2013/006756, tal como um hibrido de alfa-amilase de Rhizomucor pusillus tendo um ligante e um domínio de ligação ao amido, em particular, tendo um ligante e domínio de ligação ao amido de Aspergillus niger, tal como o mostrado na SEQ ID NO: 16 neste documento.

[0586] Parágrafo 42. O processo de qualquer um dos parágrafos 39-41, em que a alfa-amilase presente e/ou adicionada na sacarificação e/ou fermentação é selecionada do grupo que consiste em: (i) uma alfa-amilase compreendendo o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 16 aqui; (ii) uma alfa-amilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, por ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 neste documento.

[0587] Parágrafo 43. O processo de qualquer um dos parágrafos 39-42, em que a alfa-amilase é uma variante da alfa-amilase mostrada na SEQ ID NO: 16 tendo pelo menos uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: D165M; Y141W; Y141R; K136F; K192R; P224A; P224R; S123H + Y141W; G20S + Y141W; A76G + Y141W; G128D + Y141W; G128D + D143N; P219C + Y141W; N142D + D143N; Y141W + K192R; Y141W + D143N; Y141W + N383R; Y141W + P219C + A265C; Y141W + N142D + D143N; Y141W + K192R V410A; G128D + Y141W + D143N; Y141W + D143N + P219C; Y141W + D143N + K192R; G128D + D143N + K192R; Y141W + D143N + K192R + P219C; e G128D + Y141W + D143N + K192R; ou G128D + Y141W + D143N + K192R + P219C (usando a SEQ ID NO: 16 para numeração).

[0588] Parágrafo 44. O processo de qualquer um dos parágrafos 39-43, em que a alfa-amilase é derivada de uma cepa de Rhizomucor pusillus, preferencialmente com um ligante glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (SBD), preferencialmente a divulgada como SEQ ID NO: 16 aqui, por exemplo, tendo uma ou mais das seguintes substituições: G128D, D143N, tal como G128D+D143N (usando SEQ ID NO: 16 para numeração).

[0589] Parágrafo 45. O processo de qualquer um dos parágrafos 39-44, em que a variante da alfa-amilase tem pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, por exemplo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100% de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 16 neste documento.

[0590] Parágrafo 46. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-42, em que a etapa i) de liquefação é levada a cabo utilizando: uma alfa-amilase; uma protease com um valor de termoestabilidade de mais de 20%, determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C; e opcionalmente uma glucoamilase.

[0591] Parágrafo 47. O processo de 46, em que a protease tem um valor de termoestabilidade de mais de 25%, determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C.

[0592] Parágrafo 48. O processo dos parágrafos 46-47, em que a protease tem uma termoestabilidade de mais de 30%, por exemplo, mais de 40%, mais de 50%, mais de 60%, mais de 70%, mais de 80%, mais de 90%, mais de 100%, tal como mais de 105%, tal como mais de 110%, tal como mais de 115%, tal como mais de 120%, determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C.

[0593] Parágrafo 49. O processo de qualquer um dos parágrafos 46-48, em que a protease tem uma termoestabilidade entre 20 e 50%, tal como entre 20 e 40%, tal como 20 e 30%, determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C.

[0594] Parágrafo 50. O processo de qualquer um dos parágrafos 46-49, em que a protease tem uma termoestabilidade entre 50 e 115%, tal como entre 50 e 70%, tal como entre 50 e 60%, tal como entre 100 e 120%, tal como entre 105 e 115% determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C.

[0595] Parágrafo 51. O processo de qualquer um dos parágrafos 46-50, em que a protease tem uma termoestabilidade de mais de 10%, por exemplo mais de 12%, mais de 14%, mais de 16%, mais de 18%,

mais de 20%, mais de 30%, mais de 40%, mais de 50%, mais de 60%, mais de 70%, mais de 80%, mais de 90%, mais de 100%, mais de 110%, determinada como Atividade Relativa a 85 °C/70 °C.

[0596] Parágrafo 52. O processo de qualquer um dos parágrafos 46-51, em que a protease tem uma termoestabilidade entre 10 e 50%, tal como entre 10 e 30%, tal como 10 e 25%, determinada como Atividade Relativa a 85 °C/70 °C.

[0597] Parágrafo 53. O processo de qualquer um dos parágrafos 46-52, em que a protease tem uma termoestabilidade acima de 60%, tal como acima de 90%, tal como acima de 100%, tal como acima de 110% a 85 °C, tal como determinado usando o ensaio de Zeína-BCA.

[0598] Parágrafo 54. O processo de qualquer um dos parágrafos 46-53, em que a protease tem uma termoestabilidade entre 60- 120, tal como entre 70-120%, tal como entre 80-120%, tal como entre 90- 120%, tal como entre 100-120%, tal como 110-120% a 85 °C, tal como determinado usando o ensaio de Zeína-BCA.

[0599] Parágrafo 55. O processo de qualquer um dos parágrafos 46-54, em que a protease é de origem fúngica.

[0600] Parágrafo 56. O processo de qualquer um dos parágrafos 46-55, em que a protease é uma variante da metaloprotease derivada de uma cepa do gênero Thermoascus, preferencialmente uma cepa de Thermoascus aurantiacus, especialmente Thermoascus aurantiacus CGMCC Nº 0670.

[0601] Parágrafo 57. O processo de qualquer um dos parágrafos 46-56, em que a protease é uma variante da metaloprotease divulgada como a parte madura da SEQ ID NO: 2 divulgada em WO2003/048353 ou a parte madura da SEQ ID NO: 1 em WO2010/008841 ou SEQ ID NO: 3 aqui com uma das seguintes substituições ou combinações de substituições:

S5*+D79L+S87P+A112P+D142L; D79L+S87P+A112P+T124V+D142L; S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L; N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L; T46R+D79L+S87P+T116V+D142L; D79L+P81R+S87P+A112P+D142L; A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L; D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L; D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L; D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L; D79L+S87P+A112P+D142L; D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L; S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L; D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L; A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L; D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L; D79L+S87P+A112P+D142L+T141C+M161C; S36P+D79L+S87P+A112P+D142L; A37P+D79L+S87P+A112P+D142L; S49P+D79L+S87P+A112P+D142L; S50P+D79L+S87P+A112P+D142L; D79L+S87P+D104P+A112P+D142L; D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L; S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L; D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L; S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L; D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L; D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L; Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L;

Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L; A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L; A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L; A27K+D79L+Y82F+ D104P+A112P+A126V+D142L; A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L; A27K+D79L+S87P+A112P+D142L; e D79L+S87P+D142L.

[0602] Parágrafo 58. O processo de qualquer um dos parágrafos 46-57, em que a protease é uma variante da metaloprotease divulgada como a parte madura da SEQ ID NO: 2 divulgada em WO2003/048353 ou a parte madura da SEQ ID NO: 1 em WO 2010/008841 ou SEQ ID NO: 3 aqui com uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: D79L+S87P+A112P+D142L: D79L+S87P+D142L; e A27K+ D79L+ Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L.

[0603] Parágrafo 59. O processo de qualquer um dos parágrafos 46-58, em que a variante da protease tem pelo menos 75% de identidade, por exemplo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100% de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 divulgada em WO 2003/048353 ou a parte madura da SEQ ID NO: 1 em WO 2010/008841 ou SEQ ID NO: 3 aqui.

[0604] Parágrafo 60. O processo de qualquer um dos parágrafos 46-59, em que a variante da protease da protease de Thermoascus aurantiacus mostrada na SEQ ID NO: 3 neste documento compreende uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: D79L S87P D142L; D79L S87P A112P D142L; D79L Y82F S87P A112P D142L; S38T D79L S87P A112P A126V D142L; D79L Y82F S87P A112P A126V D142L; A27K D79L S87P A112P A126V D142L; S49P D79L S87P A112P D142L; S50P D79L S87P A112P D142L; D79L S87P D104P A112P D142L; D79L Y82F S87G A112P D142L; S70V D79L Y82F S87G Y97W A112P D142L; D79L Y82F S87G Y97W D104P A112P D142L; S70V D79L Y82F S87G A112P D142L; D79L Y82F S87G D104P A112P D142L; D79L Y82F S87G A112P A126V D142L; Y82F S87G S70V D79L D104P A112P D142L; Y82F S87G D79L D104P A112P A126V D142L; e A27K D79L Y82F S87G D104P A112P A126V D142L.

[0605] Parágrafo 61. O processo de qualquer um dos parágrafos 46-60, em que a protease é de origem bacteriana.

[0606] Parágrafo 62. O processo de qualquer um dos parágrafos 46-61, em que a protease é derivada de uma cepa de Pyrococcus, preferencialmente uma cepa de Pyrococcus furiosus.

[0607] Parágrafo 63. O processo de qualquer um dos parágrafos 46-62, em que a protease é a mostrada na SEQ ID NO: 1 de US 6,358,726, ou na SEQ ID NO: 13 neste documento.

[0608] Parágrafo 64. O processo de qualquer um dos parágrafos 46-63, em que a protease é uma que tem pelo menos 80%, por exemplo pelo menos 85%, pelo menos 90 %, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1 em US 6,358,726 ou SEQ ID NO: 13 neste documento.

[0609] Parágrafo 65. O processo de qualquer um dos parágrafos 46-64, em que estão presentes e/ou são adicionados na etapa i)

de liquefação 0,5-100 microgramas de protease de Pyrococcus furiosus por grama de DS, tal como 1-50 microgramas de protease de Pyrococcus furiosus por grama de DS, tal como 1-10 microgramas de protease de Pyrococcus furiosus por grama de DS, tal como 1,5-5 microgramas de protease de Pyrococcus furiosus por grama de DS, tal como cerca de ou mais de 1,5 microgramas de protease de Pyrococcus furiosus por grama de DS.

[0610] Parágrafo 66. O processo de qualquer um dos parágrafos 46-65, em que estão presentes e/ou são adicionados na etapa i) de liquefação 2-100 microgramas de protease de Pyrococcus furiosus por grama de DS, tal como 2,5-50 microgramas de protease de Pyrococcus furiosus por grama de DS, tal como 2,5-10 microgramas de protease de Pyrococcus furiosus por grama de DS, tal como 2,5-5 microgramas de protease de Pyrococcus furiosus por grama de DS, especialmente cerca de 3 microgramas de protease de Pyrococcus furiosus por grama de DS.

[0611] Parágrafo 67. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-66, em que a glucoamilase está presente e/ou é adicionada durante a etapa i) de liquefação.

[0612] Parágrafo 68. O processo do parágrafo 67, em que a glucoamilase presente e/ou adicionada na liquefação tem uma estabilidade térmica a 85 °C, pH 5,3 de pelo menos 20%, tal como de pelo menos 30%, ou pelo menos 35%.

[0613] Parágrafo 69. O processo do parágrafo 67 ou 68, em que a glucoamilase presente e/ou adicionada na liquefação tem uma atividade relativa a pH ótimo de 5,0 de pelo menos 90%, preferencialmente de pelo menos 95%, preferencialmente de pelo menos 97%.

[0614] Parágrafo 70. O processo de qualquer um dos parágrafos 67-68, em que a glucoamilase presente e/ou adicionada na liquefação tem uma estabilidade de pH a pH 5,0 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%.

[0615] Parágrafo 71. O processo de qualquer um dos parágrafos 67-70, em que a glucoamilase presente e/ou adicionada na etapa i) de liquefação é derivada de uma cepa do gênero Penicillium, especialmente de uma cepa de Penicillium oxalicum divulgada como SEQ ID NO: 2 no documento WO 2011/127802 ou SEQ ID NOs: 9 ou 14 neste documento.

[0616] Parágrafo 72. O processo de qualquer um dos parágrafos 67-71, em que a glucoamilase tem pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94%, e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com o polipeptídeo maduro apesentado na SEQ ID NO: 2 no documento WO 2011/127802 ou SEQ ID NOs: 9 ou 14 neste documento.

[0617] Parágrafo 73. O processo de qualquer um dos parágrafos 67-72, em que a glucoamilase é uma variante da glucoamilase de Penicillium oxalicum mostrada na SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 com uma substituição K79V (utilizando a sequência madura apresentada na SEQ ID NO: 14 do presente documento para numeração), tal como uma variante divulgada em WO 2013/053801.

[0618] Parágrafo 74. O processo de qualquer um dos parágrafos 67-73, em que a glucoamilase de Penicillium oxalicum tem uma substituição K79V (utilizando a SEQ ID NO: 14 para numeração) e adicionalmente uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: T65A; Q327F; E501V; Y504T; Y504*; T65A + Q327F; T65A + E501V; T65A + Y504T; T65A + Y504*; Q327F + E501V; Q327F

+ Y504T; Q327F + Y504*; E501V + Y504T; E501V + Y504*; T65A + Q327F + E501V; T65A + Q327F + Y504T; T65A + E501V + Y504T; Q327F + E501V + Y504T; T65A + Q327F + Y504*; T65A + E501V + Y504*; Q327F + E501V + Y504*; T65A + Q327F + E501V + Y504T; T65A + Q327F + E501V + Y504*; E501V + Y504T; T65A + K161S; T65A + Q405T; T65A + Q327W; T65A + Q327F; T65A + Q327Y; P11F + T65A + Q327F; R1K + D3W + K5Q + G7V + N8S + T10K + P11S + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F; P11F + D26C + K33C + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; R1E + D3N + P4G + G6R + G7A + N8A + T10D+ P11D + T65A + Q327F; P11F + T65A + Q327W; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; T65A + Q327F + E501V + Y504T; T65A + S105P + Q327W; T65A + S105P + Q327F; T65A + Q327W + S364P; T65A + Q327F + S364P; T65A + S103N + Q327F; P2N + P4S + P11F + K34Y + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + D445N + V447S; P2N + P4S + P11F + T65A + I172V + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + N502*; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + N502T + P563S + K571E; P2N + P4S + P11F + R31S + K33V + T65A + Q327F + N564D + K571S; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + S377T; P2N + P4S + P11F + T65A + V325T+ Q327W; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + D445N + V447S + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + I172V + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + S377T + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + D26N + K34Y + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + I375A + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + K218A + K221D + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S

+ P11F + T65A + S103N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + T10D + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + F12Y + T65A + Q327F + E501V + Y504T; K5A + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + T10E + E18N + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + T10E + E18N + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T + T568N; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T + K524T + G526A; P2N + P4S + P11F + K34Y + T65A + Q327F + D445N + V447S + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + R31S + K33V + T65A + Q327F + D445N + V447S + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + D26N + K34Y + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + F80* + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + K112S + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T + T516P + K524T + G526A; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + N502T + Y504*; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + S103N + Q327F + E501V + Y504T; K5A + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T + T516P + K524T + G526A; P2N + P4S + P11F + T65A + K79A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + K79G + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + K79I + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + K79L + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + K79S + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + L72V + Q327F + E501V + Y504T; S255N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + E74N + V79K + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + G220N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A

+ Y245N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q253N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + D279N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + S359N + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + D370N + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + V460S + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + V460T + P468T + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + T463N + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + S465N + E501V + Y504T; andP2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + T477N + E501V + Y504T.

[0619] Parágrafo 75. O processo de qualquer um dos parágrafos 67-74, em que a glucoamilase presente e/ou adicionada na liquefação é a glucoamilase de Penicillium oxalicum que tem uma substituição K79V (utilizando a SEQ ID NO: 14 aqui para numeração) e ainda uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: P11F + T65A + Q327F; e P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F (usando a SEQ ID NO: 14 aqui para numeração).

[0620] Parágrafo 76. O processo de qualquer um dos parágrafos 67-75, em que a variante da glucoamilase tem pelo menos 75% de identidade, por exemplo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100% de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 14 neste documento.

[0621] Parágrafo 77. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-76, em que adicionalmente está presente uma pululanase durante a liquefação e/ou a sacarificação.

[0622] Parágrafo 78. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-77, que compreende as etapas de:

i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando uma alfa- amilase derivada de Bacillus stearothermophilus; ii) sacarificação usando uma glucoamilase; iii) fermentação usando um organismo fermentador;

[0623] em que o organismo fermentador é a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5038.

[0624] Parágrafo 79. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-78, que compreende as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando uma alfa- amilase derivada de Bacillus stearothermophilus compreendendo uma dupla deleção nas posições I181 + G182 e, opcionalmente, uma substituição N193F; (usando a SEQ ID NO: 1 deste documento para numeração); ii) sacarificação usando uma glucoamilase derivada de uma cepa de Gloephyllum, tal como Gloephyllum serpiarium ou Gloephyllum trabeum. iii) fermentação usando um organismo fermentador;

[0625] em que o organismo fermentador é a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University

Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5038.

[0626] Parágrafo 80. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-79, que compreende as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando: uma alfa-amilase derivada de Bacillus stearothermophilus; uma protease com um valor de termoestabilidade de mais de 20%, determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C, preferencialmente derivada de Pyrococcus furiosus e/ou Thermoascus aurantiacus; e opcionalmente uma glucoamilase de Penicillium oxalicum; ii) sacarificação usando uma glucoamilase; iii) fermentação usando um organismo fermentador;

[0627] em que o organismo fermentador é a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5038.

[0628] Parágrafo 81. Um processo dos parágrafos 1-80, que compreende as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando uma alfa- amilase, preferencialmente derivada de Bacillus stearothermophilus compreendendo uma dupla deleção nas posições I181 + G182 e, opcionalmente, uma substituição N193F; (usando a SEQ ID NO: 1 para numeração) e com um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 0,12 mM, de pelo menos 10; ii) sacarificação usando uma glucoamilase; iii) fermentação usando um organismo fermentador;

[0629] em que o organismo fermentador é a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5038.

[0630] Parágrafo 82. Um processo dos parágrafos 1-81, que compreende as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura entre 80-90 °C usando: uma alfa-amilase, preferencialmente derivada de Bacillus stearothermophilus, com um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 0,12 mM, de pelo menos 10; uma protease, preferencialmente derivada de Pyrococcus furiosus e/ou Thermoascus aurantiacus, com um valor de termoestabilidade de mais de 20%, determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C; e opcionalmente uma glucoamilase de Penicillium oxalicum ii) sacarificação usando uma glucoamilase; iii) fermentação usando um organismo fermentador;

[0631] em que o organismo fermentador é a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5038.

[0632] Parágrafo 83. Um processo dos parágrafos 1-82, que compreende as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando: uma alfa-amilase derivada de Bacillus stearothermophilus com uma deleção dupla nas posições I181 + G182, e uma substituição opcional N193F; e opcionalmente ainda uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: E129V+K177L+R179E; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+ Q254S; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V; V59A+ E129V+ K177L+R179E+Q254S+M284V; e E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando SEQ ID NO: 1 apresentada neste documento para numeração); ii) sacarificação usando uma glucoamilase, tal como uma de uma cepa de Gloephyllum, tal como uma cepa de Gloephyllum serpiarium; iii) fermentação usando um organismo fermentador;

[0633] em que o organismo fermentador é a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5038.

[0634] Parágrafo 84. Um processo dos parágrafos 1-83, que compreende as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando: uma alfa-amilase derivada de Bacillus stearothermophilus com uma deleção dupla nas posições I181 + G182, e uma substituição opcional N193F, e opcionalmente ainda uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: E129V+K177L+R179E; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+ Q254S; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V; V59A+ E129V+ K177L+R179E+Q254S+M284V; e E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando SEQ ID NO: 1 apresentada neste documento para numeração); uma protease com um valor de termoestabilidade de mais de 20%, determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C, preferencialmente derivada de Pyrococcus furiosus e/ou Thermoascus aurantiacus; e opcionalmente uma glucoamilase de Penicillium oxalicum apresentada na SEQ ID NO: 14 tendo uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: K79V; K79V+ P11F + T65A + Q327F; K79V+P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F; K79V +P11F + D26C + K33C + T65A + Q327F; K79V +P2N + P4S + P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; K79V +P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; e K79V +P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T (usando SEQ ID NO: 14 para numeração). ii) sacarificação usando uma glucoamilase; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5038.

[0635] Parágrafo 85. Um processo dos parágrafos 1-84, que compreende as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura entre 80-90 °C usando: uma alfa-amilase derivada de Bacillus stearothermophilus com uma deleção dupla nas posições I181 + G182, e uma substituição opcional N193F, e opcionalmente ainda uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: E129V+K177L+R179E; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+ Q254S; V59A+Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V; e E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando SEQ ID NO: 1 deste documento para numeração), uma protease com um valor de termoestabilidade de mais de 20%, determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C, preferencialmente derivada de Pyrococcus furiosus e/ou Thermoascus aurantiacus; uma glucoamilase de Penicillium oxalicum apresentada na SEQ ID NO: 14 tendo uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: K79V; K79V+ P11F + T65A + Q327F; K79V+P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F; K79V +P11F + D26C + K33C + T65A + Q327F; K79V +P2N + P4S + P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; K79V +P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; e K79V +P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T (usando SEQ ID NO: 14 para numeração). ii) sacarificação usando uma glucoamilase; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL

Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5038.

[0636] Parágrafo 86. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-85, que compreende as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando: - uma alfa-amilase derivada de Bacillus stearothermophilus com uma deleção dupla nas posições I181 + G182, e opcionalmente uma substituição N193F; (usando a SEQ ID NO: 1 apresentada neste documento para numeração); uma protease com um valor de termoestabilidade de mais de 20%, determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C, preferencialmente derivada de Pyrococcus furiosus e/ou Thermoascus aurantiacus; uma glucoamilase de Penicillium oxalicum com uma substituição K79V (utilizando a SEQ ID NO: 14 aqui apresentada para numeração); e opcionalmente uma pululanase; ii) sacarificação usando uma glucoamilase; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5038.

[0637] Parágrafo 87. Um processo dos parágrafos 1-86, que compreende as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando: uma alfa-amilase, preferencialmente derivada de Bacillus stearothermophilus, com um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 0,12 mM, de pelo menos 10; entre 0,5 e 10 microgramas de protease de Pyrococcus furiosus por g de DS; ii) sacarificação usando uma glucoamilase selecionada do grupo de glucoamilases derivadas de uma cepa de Aspergillus, preferencialmente A. niger, A. awamori, ou A. oryzae; ou de uma cepa de Trichoderma, preferencialmente T. reesei; ou de uma cepa de Talaromyces, preferencialmente T. emersonii, ou de uma cepa de Pycnoporus, ou de uma cepa de Gloephyllum, tal como G. serpiarium ou G. trabeum, ou de uma cepa de Nigrofomes; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5038.

[0638] Parágrafo 88. Um processo dos parágrafos 1-87, que compreende as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura entre 80-90 °C usando; uma alfa-amilase, preferencialmente derivada de Bacillus stearothermophilus, com uma deleção dupla nas posições I181 + G182 e uma substituição opcional N193F, e com T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 0,12 mM, de pelo menos 10; entre 0,5 e 10 microgramas de protease de Pyrococcus furiosus por g de DS; uma glucoamilase de Penicillium oxalicum; e opcionalmente uma pululanase; ii) sacarificação usando uma glucoamilase; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5038.

[0639] Parágrafo 89. Um processo dos parágrafos 1-88, que compreende as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura entre 80-90 °C usando; uma alfa-amilase derivada de Bacillus stearothermophilus com uma deleção dupla I181 + G182 e uma substituição opcional

N193F; e opcionalmente ainda uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: E129V+K177L+R179E; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+ Q254S; V59A+Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; V59A+E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; e E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando SEQ ID NO: 1 apresentada neste documento para numeração); entre 0,5 e 10 microgramas de protease de Pyrococcus furiosus por g de DS; uma glucoamilase de Penicillium oxalicum apresentada na SEQ ID NO: 14 tendo uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: K79V; K79V+ P11F + T65A + Q327F; K79V+P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F; K79V +P11F + D26C + K33C + T65A + Q327F; K79V +P2N + P4S + P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; K79V +P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; e K79V +P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T (usando SEQ ID NO: 14 para numeração); e opcionalmente uma pululanase; ii) sacarificação usando uma glucoamilase; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL

[0640] Parágrafo 90. Um processo dos parágrafos 1-89, que compreende as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura entre 80-90 °C usando: uma alfa-amilase derivada de Bacillus stearothermophilus com uma deleção dupla I181 + G182 e uma substituição opcional N193F; e ainda uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: E129V+K177L+R179E; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+ Q254S; V59A+Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; V59A+E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; e E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando SEQ ID NO: 1 apresentada neste documento para numeração); uma protease com um valor de termoestabilidade de mais de 20%, determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C, preferencialmente derivada de Pyrococcus furiosus e/ou Thermoascus aurantiacus; uma glucoamilase de Penicillium oxalicum apresentada na SEQ ID NO: 14 tendo uma das seguintes substituições ou combinações de substituições:

K79V; K79V+ P11F + T65A + Q327F; K79V+P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F; K79V +P11F + D26C + K33C + T65A + Q327F; K79V +P2N + P4S + P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; K79V +P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; e K79V +P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T (usando SEQ ID NO: 14 para numeração); e opcionalmente uma pululanase; ii) sacarificação usando uma glucoamilase selecionada do grupo de glucoamilases derivadas de uma cepa de Aspergillus; ou de uma cepa de Trichoderma; de uma cepa de Talaromyces, uma cepa de Pycnoporus; uma cepa de Gloephyllum; e uma cepa de Nigrofomes; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5038.

[0641] Parágrafo 91. Um processo de qualquer um dos parágrafos 1-90, que compreende as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura entre 80-90 °C e a um pH entre 5,0 e 6,5 usando:

uma alfa-amilase derivada de Bacillus stearothermophilus com uma deleção dupla I181 + G182 e uma substituição opcional N193F; e opcionalmente ainda uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: E129V+K177L+R179E; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+ Q254S; V59A+Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; V59A+E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando SEQ ID NO: 1 apresentada neste documento para numeração); uma protease derivada de Pyrococcus furiosus, preferencialmente a apresentada na SEQ ID NO: 13 deste documento; uma glucoamilase de Penicillium oxalicum apresentada na SEQ ID NO: 14 tendo uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: K79V; K79V+ P11F + T65A + Q327F; ou K79V+P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F; ou K79V +P11F + D26C + K33C + T65A + Q327F; ou K79V +P2N + P4S + P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; ou K79V +P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; ou K79V +P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T (usando SEQ ID NO: 14 para numeração). ii) sacarificação usando uma glucoamilase;

iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5038.

[0642] Parágrafo 92. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-91, em que está presente uma composição de enzima celulolítica na sacarificação, fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas (SSF).

[0643] Parágrafo 93. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-92, em que o organismo fermentador tem propriedades que são aproximadamente as mesmas da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae, ou um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae com as características definidoras da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae, pois fornece uma ou mais, tal como todas, as seguintes propriedades ou características definidoras um aumento no rendimento de etanol em comparação com a cepa de Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 no National Measurement Institute, Victoria, Austrália) sob as mesmas condições de processo, por exemplo, como aqui descrito; e/ou produção de glicerol reduzida em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo, por exemplo, como aqui descritas.

[0644] Parágrafo 94. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-93, em que o organismo fermentador fornece um aumento no rendimento de etanol sobre a cepa de Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) de mais de 0,5%, por exemplo, mais de 1,0%, mais de 2,0%, mais de 2,5%, cerca de 2,9%, tal como entre 0,5 e 5%, tal como entre 1-3%, sob as mesmas condições de processo, por exemplo, condições descritas aqui.

[0645] Parágrafo 95. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-94, em que o organismo fermentador reduz a produção de acetaldeído em mais de 10%, por exemplo, mais de 20%, mais de 30%, mais de 40%, mais do que 45%, tal como 5-60%, tal como 30-50%, em comparação com a cepa Ethanol Red® de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso V14 / 007039 no National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo, por exemplo, condições aqui descritas.

[0646] Parágrafo 96. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-95, em que o organismo fermentador aumenta a tolerância à temperatura em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo, por exemplo, condições como aqui descritas.

[0647] Parágrafo 97. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-96, em que o organismo fermentador diminui a produção de glicerol em mais de 3%, por exemplo, mais de 4%, mais de 5%, mais de 6%, mais do que 7%, tal como 2-15%, tal como 5-10%, em comparação com a cepa Ethanol Red® de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso V14 / 007039 no National Measurement Institute, Victoria,

Austrália) nas mesmas condições de processo, por exemplo, condições de processo aqui descritas.

[0648] Parágrafo 98. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-97, em que o organismo fermentador é uma cepa não recombinante de Saccharomyces, por exemplo, uma cepa não recombinante de Saccharomyces cerevisiae.

[0649] Parágrafo 99. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-98, em que o organismo fermentador é capaz de utilizar cisteína como a única fonte de nitrogênio.

[0650] Parágrafo 100. Um processo para produzir etanol a partir de material contendo amido, que compreendem as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando uma alfa- amilase derivada de Bacillus stearothermophilus; ii) sacarificação usando uma glucoamilase; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador tem uma ou mais, tais como todas, as seguintes propriedades e características definidoras: aumenta o rendimento de etanol em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo, por exemplo, condições como aqui descritas; reduz a produção de acetaldeído em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo, por exemplo, condições como aqui descritas;

tolerância à temperatura aumentada em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo, por exemplo, condições como aqui descritas; produção de glicerol reduzida em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo, por exemplo, condições como aqui descritas.

[0651] Parágrafo 101. O processo do parágrafo 100, em que o organismo fermentador é uma levedura Saccharomyces cerevisiae.

[0652] Parágrafo 102. O processo dos parágrafos 100 ou 101, em que o organismo fermentador é uma levedura não recombinante de Saccharomyces cerevisiae.

[0653] Parágrafo 103. Um processo de qualquer um dos parágrafos 1-102, que compreende as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura entre 80-90 °C e a um pH entre 5,0 e 6,5 usando: uma alfa-amilase derivada de Bacillus stearothermophilus com uma deleção dupla I181 + G182 e uma substituição opcional N193F; e opcionalmente ainda uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: E129V+K177L+R179E; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+ Q254S; V59A+Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; V59A+E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V;

E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando SEQ ID NO: 1 aqui para numeração). uma protease derivada de Pyrococcus furiosus, preferencialmente a apresentada na SEQ ID NO: 13 aqui presente e/ou adicionada em uma dosagem de 1-5 microgramas de protease por grama de DS, tal como cerca de 1,5 ou 3 microgramas de protease por grama de DS; opcionalmente uma glucoamilase de Penicillium oxalicum apresentada na SEQ ID NO: 14 tendo uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: K79V; K79V+ P11F + T65A + Q327F; ou K79V+P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F; ou K79V +P11F + D26C + K33C + T65A + Q327F; ou K79V +P2N + P4S + P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; ou K79V +P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; ou K79V +P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T (usando SEQ ID NO: 14 para numeração). ii) sacarificação usando uma glucoamilase; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5038.

[0654] Parágrafo 104. O processo de qualquer um dos parágrafos 100-103, em que o organismo fermentador é a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5038.

[0655] Parágrafo 105. O processo do parágrafo 104, em que está presente ou é adicionada uma protease na sacarificação e/ou fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas (SSF).

[0656] Parágrafo 106. Uma cepa de levedura Saccharomyces depositada sob o Tratado de Budapeste e com o número de acesso NRRL Y67549, ou um derivado da cepa NRRL Y67549.

[0657] Parágrafo 107. Um método para produzir um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de Acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA), compreendendo: a. cultura de uma primeira cepa de leveduras com uma segunda cepa de leveduras, em que a segunda cepa de leveduras é a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou um seu derivado, em condições que permitem a combinação do DNA entre a primeira cepa de leveduras e a segunda cepa de leveduras; e b. isolamento de cepas híbridas; e c. repetição opcional das etapas (a) e (b) usando uma cepa híbrida isolada na etapa (b) como a primeira cepa de leveduras e/ou a segunda cepa de levedura.

[0658] Parágrafo 108. Um método para produzir um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de Acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA), que exibe as características definidoras da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae, compreendendo: (a) proporcionar: (i) uma primeira cepa de levedura; e (ii) uma segunda cepa de levedura, em que a segunda cepa de levedura é a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou um seu derivado; (b) cultivar a primeira cepa de levedura e a segunda cepa de levedura sob condições que permitem combinação de DNA entre a primeira e a segunda cepas de levedura; (c) triagem ou seleção de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae.

[0659] Parágrafo 109. O método do parágrafo 108, em que a etapa (c) compreende a triagem ou seleção de uma cepa híbrida que apresente uma ou mais das características definidoras da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae.

[0660] Parágrafo 110. O método do parágrafo 108, que compreende a etapa adicional de: (d) repetição das etapas (b) e (c) com a cepa triada ou selecionada da etapa (c) como primeira e/ou segunda cepa, até se obter um derivado que apresente as características definidoras da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae.

[0661] Parágrafo 111. O método do parágrafo 109 ou 110, em que a etapa (b) de cultura compreende: (i) esporulação da primeira cepa de leveduras e da segunda cepa de leveduras; (ii) hibridização dos esporos germinados produzidos pela primeira cepa de leveduras com os esporos germinados produzidos pela segunda cepa de leveduras.

[0662] Parágrafo 112. Uma cepa de Saccharomyces produzida pelo método de acordo com qualquer um dos parágrafos 107 a

111.

[0663] Parágrafo 113. Uma cepa de Saccharomyces com as características definidoras da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de Acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA).

[0664] Parágrafo 114. Um método para a produção de etanol, que compreende a incubação de uma cepa de qualquer um dos parágrafos 106, 112 ou 113 com um substrato que compreende um açúcar fermentável sob condições que permitam a fermentação do açúcar fermentável para produzir etanol.

[0665] Parágrafo 115. Utilização de uma cepa de qualquer um dos parágrafos 106, 112 ou 113 na produção de etanol.

[0666] Parágrafo 116. Um método de produção de grãos de destiladores, compreendendo: (a) a incubação de uma cepa de Saccharomyces de qualquer um dos parágrafos 106, 112 ou 113 com um substrato que compreende açúcar fermentável sob condições que permitem a fermentação do açúcar fermentável para produzir etanol e grãos de destiladores; (b) o isolamento dos grãos de destiladores.

[0667] Parágrafo 117. Grãos de destiladores produzidos pelo método do parágrafo 116.

[0668] Parágrafo 118. Utilização de uma cepa do parágrafo 106, 112 ou 113 na produção de grãos de destiladores.

[0669] Parágrafo 119. Utilização de uma cepa dos parágrafos 106, 112 ou 113 na produção de uma cepa de Saccharomyces com as características definidoras da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de Acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA).

[0670] Parágrafo 120. Utilização da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) na produção de uma cepa de Saccharomyces com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou que exibe uma ou mais características definidoras da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae;

[0671] Parágrafo 121. Utilização da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou uma cepa com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou de um seu derivado no processo de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-120.

[0672] Parágrafo 122. Uma composição compreendendo uma levedura Saccharomyces de qualquer um dos parágrafos 106, 112 ou 113 e um ou mais componentes que ocorrem naturalmente e/ou que ocorrem não naturalmente.

[0673] Parágrafo 123. A composição do parágrafo 122, em que os componentes são selecionados do grupo que consiste em: tensoativos, emulsionantes, gomas, agentes de dilatação, e antioxidantes.

[0674] Parágrafo 124. A composição dos parágrafos 122 ou 123, em que a levedura Saccharomyces é cepa MBG5038 de Saccharomyces (depositada sob o número de Acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA).

[0675] Parágrafo 125. A composição de qualquer um dos parágrafos 122-124, em que a levedura Saccharomyces se encontra em uma forma viável, em particular na forma seca, de creme ou comprimida.

[0676] Parágrafo 126. Um processo de produção de etanol a partir de material contendo amido, compreendendo: (a) sacarificação do material contendo amido; e (b) fermentação usando um organismo de fermentação; em que sacarificação e/ou a fermentação é realizada na presença de pelo menos uma glucoamilase e opcionalmente uma alfa- amilase. o organismo fermentador é Saccharomyces cerevisiae; e em que uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase é expressa a partir do organismo fermentador.

[0677] Parágrafo 127. O processo de acordo com o parágrafo 126, em que o material contendo amido é amido gelatinizado ou não gelatinizado.

[0678] Parágrafo 128. O processo de acordo com o parágrafo 127, em que uma etapa de liquefação precede a etapa de sacarificação e em que a etapa de liquefação é realizada na presença de pelo menos uma alfa-amilase bacteriana, como uma alfa-amilase de Bacillus sp., particularmente Bacillus stearothermophilus.

[0679] Parágrafo 129. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos 126-128, em que a Saccharomyces cerevisiae é a MBG5038 (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais de MBG5038 ou de um derivado de MBG5038 com características definidoras da cepa MBG5038.

[0680] Parágrafo 130. O processo dos parágrafos 126- 129, em que o organismo fermentador é um derivado recombinante de MBG5038 que expressa a glucoamilase.

[0681] Parágrafo 131. O processo dos parágrafos 126- 130, em que a glucocamilase é uma glucoamilase de Gloeophyllum, preferencialmente glucoamilase de Gloeophyllum trabeum, Gloeophyllum sepiarium, ou Gloeophyllum abietinum.

[0682] Parágrafo 132. O processo dos parágrafos 126- 131, em que a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 17; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 17.

[0683] Parágrafo 133. O processo do parágrafo 131 ou 132, em que a glucoamilase é a glucoamilase de Gloeophyllum trabeum mostrada na SEQ ID NO: 17 tendo uma das seguintes substituições: V59A; S95P; A121P; T119W; S95P+A121P; V59A+S95P; S95P+T119W; V59A+S95P+A121P; ou S95P+T119W+A121P, especialmente S95P+A121P.

[0684] Parágrafo 134. O processo de qualquer um dos parágrafos 126-130, em que a glucoamilase é expressa a partir do organismo de fermentação e é uma glucoamilase de Trametes, preferencialmente uma glucoamilase de Trametes cingulata.

[0685] Parágrafo 135. O processo do parágrafo 134, em que a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 20; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 20.

[0686] Parágrafo 136. O processo de qualquer um dos parágrafos 126-130, em que a glucoamilase é expressa a partir do organismo de fermentação e é uma glucoamilase de Pycnoporus, particularmente uma glucoamilase de Pycnoporus sanguineus.

[0687] Parágrafo 137. O processo do parágrafo 136, em que a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 18; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 18.

[0688] Parágrafo 138. O processo de qualquer um dos parágrafos 126-137, em que o organismo fermentador é um derivado recombinante de MBG5038 que expressa a alfa-amilase.

[0689] Parágrafo 139. O processo dos parágrafos 126- 138, em que a alfa-amilase expressa a partir do organismo fermentador e é derivada de Rhizomucor pusillus ou Aspergillus terreus.

[0690] Parágrafo 140. O processo do parágrafo 139, em que a alfa-amilase é uma alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação a amido (SBD) mostrado na SEQ ID NO: 16, preferencialmente uma tendo pelo menos uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: D165M; Y141W; Y141R; K136F; K192R; P224A; P224R; S123H+Y141W; G20S + Y141W; A76G + Y141W; G128D + Y141W; G128D + D143N; P219C + Y141W; N142D + D143N; Y141W + K192R; Y141W + D143N; Y141W + N383R; Y141W + P219C + A265C; Y141W + N142D + D143N; Y141W + K192R V410A; G128D + Y141W + D143N; Y141W + D143N + P219C; Y141W + D143N + K192R; G128D + D143N + K192R; Y141W + D143N + K192R + P219C; G128D + Y141W + D143N + K192R; ou G128D + Y141W + D143N + K192R + P219C, especialmente G128D+D143N, e em que a alfa-

amilase tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95 %, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 16.

[0691] Parágrafo 141. O processo do parágrafo 139, em que a alfa-amilase é uma alfa-amilase de Aspergillus terreus selecionada do grupo que consiste em: (i) uma alfa-amilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 6 de WO2017/087330; (ii) uma alfa-amilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 6 de WO2017/087330.

[0692] Parágrafo 142. Uma cepa de levedura Saccharomyces cerevisiae, em que a cepa é um derivado de MBG5038 compreendendo um ou mais vetores de expressão que codificam uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase.

[0693] Parágrafo 143. A cepa de levedura de acordo com o parágrafo 142, em que a glucoamilase é selecionada dentre glucoamilases obtidas de Gloeophyllum, Pynnoporous ou Trametes.

[0694] Parágrafo 144. A cepa de levedura de acordo com o parágrafo 143, em que a glucoamilase é selecionada a partir de glucoamilase de Gloeophyllum trabeum, Gloeophyllum sepiarium ou Gloeophyllum abietinum.

[0695] Parágrafo 145. A cepa de levedura do parágrafo 144, em que a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 17; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 17.

[0696] Parágrafo 146. A cepa de levedura de qualquer um dos parágrafos 143-145, em que a glucoamilase é a glucoamilase de Gloeophyllum trabeum mostrada na SEQ ID NO: 17 tendo uma das seguintes substituições: V59A; S95P; A121P; T119W; S95P+A121P; V59A+S95P; S95P+T119W; V59A+S95P+A121P; ou S95P+T119W+A121P, especialmente S95P+A121P.

[0697] Parágrafo 147. A cepa de levedura do parágrafo 143, em que a glucoamilase é uma glucoamilase de Trametes cingulata.

[0698] Parágrafo 148. A cepa de levedura do parágrafo 147, em que a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 20; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 20.

[0699] Parágrafo 149: A cepa de levedura do parágrafo 143, em que a glucoamilase é uma glucoamilase de Pycnoporus sanguineus.

[0700] Parágrafo 150. A cepa de levedura do parágrafo 149, em que a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 18; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 18.

[0701] Parágrafo 151. O vetor de expressão da cepa de levedura do parágrafo 142, na qual a alfa-amilase é selecionada a partir de uma alfa-amilase de Rhizomucor pusillus ou Aspergillus terreus.

[0702] Parágrafo 152. A cepa de levedura do parágrafo 151, em que a alfa-amilase é uma alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação a amido (SBD) mostrado na SEQ ID NO: 16, preferencialmente uma tendo pelo menos uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: D165M; Y141W; Y141R; K136F; K192R; P224A; P224R; S123H+Y141W; G20S + Y141W; A76G + Y141W; G128D + Y141W; G128D + D143N; P219C + Y141W; N142D + D143N; Y141W + K192R; Y141W + D143N; Y141W + N383R; Y141W + P219C + A265C; Y141W + N142D + D143N; Y141W + K192R V410A; G128D + Y141W + D143N; Y141W + D143N + P219C; Y141W + D143N + K192R; G128D + D143N + K192R; Y141W + D143N + K192R + P219C; G128D + Y141W + D143N + K192R; ou G128D + Y141W + D143N + K192R + P219C, especialmente G128D+D143N, e em que a alfa- amilase tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95 %, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 16.

[0703] Parágrafo 153. A cepa de levedura do parágrafo 151, em que a alfa-amilase é alfa-amilase de Aspergillus terreus selecionada do grupo que consiste em: (i) uma alfa-amilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 6 de WO2017/087330; (ii) uma alfa-amilase compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 6 de WO2017/087330.

[0704] Parágrafo 154. Um processo para produzir etanol a partir de material contendo amido, que compreendem as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando uma alfa- amilase; ii) sacarificação usando uma glucoamilase; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5012.

[0705] Parágrafo 155. O processo do parágrafo 155, em que o organismo fermentador tem uma ou mais, tais como todas, as seguintes propriedades e características definidoras: aumenta o rendimento de etanol em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo, por exemplo, condições do processo como aqui descritas; e/ou produção de glicerol reduzida em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo, por exemplo, condições do proecsso como aqui descritas.

[0706] Parágrafo 156. O processo dos parágrafos 154 ou 155, em que o organismo fermentador fornece um aumento no rendimento de etanol sobre a cepa de Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) de mais de 0,5%, por exemplo, mais de 1,0%, mais de 2,0%, mais de 2,5%, tal como cerca de 2,9%, tal como entre 0,5 e 5%, tal como entre 1-3%, sob as mesmas condições de processo, por exemplo, condições descritas aqui.

[0707] Parágrafo 157. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-156, em que o organismo fermentador reduz a produção de acetaldeído em mais de 10%, por exemplo, mais de 20%, mais de 30%, mais de 40%, mais do que 45%, tal como 5-60%, tal como 30-50%, em comparação com a cepa Ethanol Red® de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso V14 / 007039 no National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo, por exemplo, condições de processo aqui descritas.

[0708] Parágrafo 158. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-157, em que o organismo fermentador aumenta a tolerância à temperatura em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo, por exemplo, condições de processo como aqui descritas.

[0709] Parágrafo 159. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-158, em que o organismo fermentador diminui a produção de glicerol em mais de 3%, por exemplo, mais de 4%, mais de 5%, mais de 6%, mais do que 7%, tal como 2-15%, tal como 5-10%, em comparação com a cepa Ethanol Red® de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso V14 / 007039 no National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo, por exemplo, condições de processo aqui descritas.

[0710] Parágrafo 160. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-159, em que o organismo fermentador: (a) produz um título mais elevado de etanol nas primeiras 20 horas de fermentação do que a cepa de Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália), nas mesmas condições em um mosto de milho fermentação, por exemplo, condições aqui descritas; (b) deixa menos glucose remanescente após 50 horas de fermentação do que a cepa de Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália), nas mesmas condições em um mosto de milho fermentação, por exemplo, condições aqui descritas; (c) tem um rendimento mais alto de etanol do que a cepa de

Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) após 50 horas de fermentação sob as mesmas condições em uma fermentação de mosto de milho, por exemplo, condições aqui descritas.

[0711] Parágrafo 161. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-160, em que é adicionada uma protease na sacarificação ou fermentação ou SSF.

[0712] Parágrafo 162. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-161, que compreende ainda, antes da etapa i) de liquefação, as etapas de: x) redução do tamanho das partículas do material contendo amido, preferencialmente por moagem a seco; y) formação de uma pasta semifluida compreendendo o material contendo amido e água.

[0713] Parágrafo 163. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-162, em que pelo menos 50%, por exemplo pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% do material contendo amido passa através de uma peneira com tela de # 6.

[0714] Parágrafo 164. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-163, em que o pH na liquefação se situa entre 4-7, tal como pH 4,5-6,5, tal como pH 5,0-6,5, tal como pH 5,0-6,0, ta como pH 5,2-6,2, tal como a cerca de 5,2, tal como a cerca de 5,4, tal como a cerca de 5,6, tal como a cerca de 5,8.

[0715] Parágrafo 165. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-164, em que a temperatura na liquefação se encontra no intervalo de 70-100 °C, tal como 75-95 °C, 75-90 °C, 80-90 °C ou 82-88 °C, tal como a cerca de 85 °C.

[0716] Parágrafo 166. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-165, em que é levada a cabo uma etapa de cozimento a jato antes da liquefação na etapa i).

[0717] Parágrafo 167. O processo do parágrafo 166, em que o cozimento a jato é levado a cabo a uma temperatura de 110-145 °C, por exemplo, 120-140 °C, tal como 125-135 °C, ou cerca de 130 °C durante cerca de 1-15 minutos, por exemplo durante cerca de 3-10 minutos, ou cerca de 5 minutos.

[0718] Parágrafo 168. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-167, em que a sacarificação e a fermentação são levadas a cabo sequencial ou simultaneamente (SSF).

[0719] Parágrafo 169. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-168, em que a sacarificação é levada a cabo a uma temperatura de 20-75 °C, por exemplo de 40-70 °C, tal como a cerca de 60 °C, e a um pH entre 4 e 5.

[0720] Parágrafo 170. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-169, em que a fermentação ou a sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) é/são levada(s) a cabo a uma temperatura de 25 °C a 40 °C, tal como de 28 °C a 35 °C, tal como de 30 °C a 34 °C, ou cerca de 32 °C. Em uma modalidade, a fermentação está em curso durante 6 a 120 horas, em particular 24 a 96 horas.

[0721] Parágrafo 171. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-170, em que o produto da fermentação é recuperado após fermentação, tal como por destilação.

[0722] Parágrafo 172. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-171, em que o produto da fermentação é um álcool, preferencialmente etanol, especialmente etanol combustível, etanol potável e/ou etanol industrial.

[0723] Parágrafo 173. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-172, em que o material de partida contendo amido são grãos integrais.

[0724] Parágrafo 174. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-173, em que o material contendo amido é derivado de milho, trigo, cevada, centeio, milo, sagu, aipim, mandioca, tapioca, sorgo, aveia, arroz ou batatas.

[0725] Parágrafo 175. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-174, em que a alfa-amilase utilizada ou adicionada na etapa i) de liquefação é de origem bacteriana.

[0726] Parágrafo 176. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-175, em que a alfa-amilase é do gênero Bacillus, tal como uma cepa de Bacillus stearothermophilus, em particular uma variante de uma alfa-amilase Bacillus stearothermophilus, tal como a mostrada na SEQ ID NO: 3 em WO 99/019467 ou SEQ ID NO: 1 neste documento.

[0727] Parágrafo 177. O processo do parágrafo 176, em que a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, ou variante da mesma está truncada no terminal C, preferencialmente para ter de 485 a 495 aminoácidos de comprimento, tal como cerca de 491 aminoácidos de comprimento.

[0728] Parágrafo 178. O processo de qualquer um dos parágrafos 176 ou 177, em que a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus tem uma dupla deleção nas posições I181 + G182, e opcionalmente uma substituição N193F, ou deleção de R179 + G180 (usando a SEQ ID NO: 1 para numeração).

[0729] Parágrafo 179. O processo de qualquer um dos parágrafos 176-178, em que a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus tem uma substituição na posição S242, por exemplo uma substituição S242Q (usando a SEQ ID NO: 1 para numeração).

[0730] Parágrafo 180. O processo de qualquer um dos parágrafos 176-179, em que a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus tem uma substituição na posição E188, por exemplo uma substituição E188P (usando a SEQ ID NO: 1 para numeração).

[0731] Parágrafo 181. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-180, em que a alfa-amilase tem um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 0,12 mM) de pelo menos 10, tal como de pelo menos 15, tal como de peo menos 20, tal como de pelo menos 25, tal como de pelo menos 30, tal como de pelo menos 40, tal como de pelo menos 50, tal como de pelo menos 60, tal como 10-70, tal como 15-70, tal como 20-70, tal como 25-70, tal como 30-70, tal como 40-70, tal como 50-70, tal como 60-70.

[0732] Parágrafo 182. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-181, em que a alfa-amilase presente e/ou adicionada na etapa i) de liquefação é selecionada do grupo de variantes da alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus com uma das seguintes substituições ou combinações de substituições, além de I181*+G182*, e opcionalmente substituição N193F: V59A+Q89R+G112D+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S ; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+D269E +D281N; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+I270L; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+H274K; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+Y276F; V59A+E129V+R157Y+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254 S; V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254 S;

V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+H274 K; V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276 F; V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+D281 N; V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284 T; V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+G416 V; V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S; V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T; A91L+M96I+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; E129V+K177L+R179E; E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F+L427 M; E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T; E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+N376*+I377*; E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S; E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T; E129V+K177L+R179E+S242Q; E129V+K177L+R179V+K220P+N224L+S242Q+Q254S; K220P+N224L+S242Q+Q254S; M284V; V59A+Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; e V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+ M284V;

[0733] Parágrafo 183. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-182, em que a alfa-amilase presente e/ou adicionada na etapa i) de liquefação é selecionada do seguinte grupo de variantes da alfa- amilase de Bacillus stearothermophilus compreendendo as seguintes mutações: I181*+G182*, e opcionalmente substituição N193F, e ainda uma das seguintes substituições ou combinações de substituições E129V+K177L+R179E; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+ Q254S V59A+ Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; V59A+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; e E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando SEQ ID NO: 1 aqui para numeração).

[0734] Parágrafo 184. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-183, em que a glucoamilase está presente e/ou é adicionada na sacarificação e/ou fermentação.

[0735] Parágrafo 185. O processo do parágrafo 184, em que a glicomilase presente e/ou adicionada na sacarificação, fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) é de origem fúngica, preferencialmente de uma cepa de Aspergillus, preferencialmente A. niger, A. awamori, ou A. oryzae; ou de uma cepa de Trichoderma, preferencialmente Trichoderma reesei; ou de uma cepa de Talaromyces, preferencialmente Talaroomyces emersonii, ou de uma cepa de Pycnoporus, ou de uma cepa de Gloeophyllum, tal como Gloeophyllum serpiarium ou G. trabeum, ou de uma cepa de Nigrofomes.

[0736] Parágrafo 186. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-185, em que a glucoamilase é derivada de Talaromyces emersonii, tal como a mostrada na SEQ ID NO: 19 neste documento.

[0737] Parágrafo 187. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-186, em que a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 19 aqui; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, por ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 19 neste documento.

[0738] Parágrafo 188. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-187, em que a glucoamilase presente e/ou adicionada na sacarificação é derivada de Gloeophyllum serpiarium, tal como a apresentada na SEQ ID NO: 15 neste documento.

[0739] Parágrafo 189. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-188, em que a glucoamilase presente e/ou adicionada na sacarificação é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 15 aqui; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, por ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 15 neste documento.

[0740] Parágrafo 190. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-189, em que a glucoamilase presente e/ou adicionada na sacarificação é derivada de Gloeophyllum trabeum, tal como a apresentada na SEQ ID NO: 17 neste documento.

[0741] Parágrafo 191. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-190, em que a glucoamilase presente e/ou adicionada na sacarificação é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 17 aqui; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, por ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 17 neste documento.

[0742] Parágrafo 192. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-191, em que a glucoamilase está presente e/ou é adicionada na sacarificação e/ou fermentação em combinação com uma alfa-amilase.

[0743] Parágrafo 193. O processo do parágrafo 192, em que a alfa-amilase está presente e/ou é adicionada na sacarificação e/ou fermentação é de origem fúngica ou bacteriana.

[0744] Parágrafo 194. O processo do parágrafo 192 ou 193, em que a alfa-amilase presente e/ou adicionada na sacarificação e/ou fermentação é derivada de uma cepa do gênero Rhizomucor, preferencialmente uma cepa de Rhizomucor pusillus, tal como a mostrada na SEQ ID NO: 3 em WO 2013/006756, tal como um hibrido de alfa-amilase de Rhizomucor pusillus tendo um ligante e um domínio de ligação ao amido,

em particular, tendo um ligante e domínio de ligação ao amido de Aspergillus niger, tal como o mostrado na SEQ ID NO: 16 neste documento.

[0745] Parágrafo 195. O processo de qualquer um dos parágrafos 192-194, em que a alfa-amilase presente e/ou adicionada na sacarificação e/ou fermentação é selecionada do grupo que consiste em: (i) uma alfa-amilase compreendendo o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 16 aqui; (ii) uma alfa-amilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, por ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 neste documento.

[0746] Parágrafo 196. O processo de qualquer um dos parágrafos 192-195, em que a alfa-amilase é uma variante da alfa-amilase mostrada na SEQ ID NO: 16 tendo pelo menos uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: D165M; Y141W; Y141R; K136F; K192R; P224A; P224R; S123H + Y141W; G20S + Y141W; A76G + Y141W; G128D + Y141W; G128D + D143N; P219C + Y141W; N142D + D143N; Y141W + K192R; Y141W + D143N; Y141W + N383R; Y141W + P219C + A265C; Y141W + N142D + D143N; Y141W + K192R V410A; G128D + Y141W + D143N; Y141W + D143N + P219C; Y141W + D143N + K192R; G128D + D143N + K192R; Y141W + D143N + K192R + P219C; e G128D + Y141W + D143N + K192R; ou G128D + Y141W + D143N + K192R + P219C (usando a SEQ ID NO: 16 para numeração).

[0747] Parágrafo 197. O processo de qualquer um dos parágrafos 192-196, em que a alfa-amilase é derivada de uma cepa de Rhizomucor pusillus, preferencialmente com um ligante glucoamilase de

Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (SBD), preferencialmente a divulgada como SEQ ID NO: 16 aqui, por exemplo, tendo uma ou mais das seguintes substituições: G128D, D143N, tal como G128D+D143N (usando SEQ ID NO: 16 para numeração).

[0748] Parágrafo 198. O processo de qualquer um dos parágrafos 192-197, em que a variante da alfa-amilase tem pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, por exemplo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100% de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 16 neste documento.

[0749] Parágrafo 199. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-198, em que a etapa i) de liquefação é levada a cabo utilizando: uma alfa-amylase; uma protease com um valor de termoestabilidade de mais de 20%, determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C; e opcionalmente uma glucoamilase.

[0750] Parágrafo 200. O processo de 199, em que a protease tem um valor de termoestabilidade de mais de 25%, determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C.

[0751] Parágrafo 201. O processo do parágrafo 199 ou 200, em que a protease tem uma termoestabilidade de mais de 30%, por exemplo, mais de 40%, mais de 50%, mais de 60%, mais de 70%, mais de 80%, mais de 90%, mais de 100%, tal como mais de 105%, tal como mais de 110%, tal como mais de 115%, tal como mais de 120%, determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C.

[0752] Parágrafo 202. O processo de qualquer um dos parágrafos 199-201, em que a protease tem uma termoestabilidade entre 20 e 50%, tal como entre 20 e 40%, tal como 20 e 30%, determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C.

[0753] Parágrafo 203. O processo de qualquer um dos parágrafos 199-202, em que a protease tem uma termoestabilidade entre 50 e 115%, tal como entre 50 e 70%, tal como entre 50 e 60%, tal como entre 100 e 120%, tal como entre 105 e 115% determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C.

[0754] Parágrafo 204. O processo de qualquer um dos parágrafos 199-203, em que a protease tem uma termoestabilidade de mais de 10%, por exemplo mais de 12%, mais de 14%, mais de 16%, mais de 18%, mais de 20%, mais de 30%, mais de 40%, mais de 50%, mais de 60%, mais de 70%, mais de 80%, mais de 90%, mais de 100%, mais de 110%, determinada como Atividade Relativa a 85 °C/70 °C.

[0755] Parágrafo 205. O processo de qualquer um dos parágrafos 199-204, em que a protease tem uma termoestabilidade entre 10 e 50%, tal como entre 10 e 30%, tal como 10 e 25%, determinada como Atividade Relativa a 85 °C/70 °C.

[0756] Parágrafo 206. O processo de qualquer um dos parágrafos 199-205, em que a protease tem uma termoestabilidade acima de 60%, tal como acima de 90%, tal como acima de 100%, tal como acima de 110% a 85 °C, tal como determinado usando o ensaio de Zeína-BCA.

[0757] Parágrafo 207. O processo de qualquer um dos parágrafos 199-206, em quea protease tem uma termoestabilidade entre 60- 120, tal como entre 70-120%, tal como entre 80-120%, tal como entre 90- 120%, tal como entre 100-120%, tal como 110-120% a 85 °C, tal como determinado usando o ensaio de Zeína-BCA.

[0758] Parágrafo 208. O processo de qualquer um dos parágrafos 199-207, em que a protease é de origem fúngica.

[0759] Parágrafo 209. O processo de qualquer um dos parágrafos 199-208, em que a protease é uma variante da metaloprotease derivada de uma cepa do gênero Thermoascus, preferencialmente uma cepa de Thermoascus aurantiacus, especialmente Thermoascus aurantiacus CGMCC Nº 0670.

[0760] Parágrafo 210. O processo de qualquer um dos parágrafos 199-209, em que a protease é uma variante da metaloprotease divulgada como a parte madura da SEQ ID NO: 2 divulgada em WO2003/048353 ou a parte madura da SEQ ID NO: 1 em WO2010/008841 ou SEQ ID NO: 3 aqui com uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: S5*+D79L+S87P+A112P+D142L; D79L+S87P+A112P+T124V+D142L; S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L; N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L; T46R+D79L+S87P+T116V+D142L; D79L+P81R+S87P+A112P+D142L; A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L; D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L; D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L; D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L; D79L+S87P+A112P+D142L; D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L; S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L; D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L; A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L; D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L;

D79L+S87P+A112P+D142L+T141C+M161C; S36P+D79L+S87P+A112P+D142L; A37P+D79L+S87P+A112P+D142L; S49P+D79L+S87P+A112P+D142L; S50P+D79L+S87P+A112P+D142L; D79L+S87P+D104P+A112P+D142L; D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L; S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L; D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L; S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L; D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L; D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L; Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L; Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L; A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L; A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L; A27K+D79L+Y82F+ D104P+A112P+A126V+D142L; A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L; A27K+D79L+S87P+A112P+D142L; e D79L+S87P+D142L.

[0761] Parágrafo 211. O processo de qualquer um dos parágrafos 199-210, em que a protease é uma variante da metaloprotease divulgada como a parte madura da SEQ ID NO: 2 divulgada em WO2003/048353 ou a parte madura da SEQ ID NO: 1 em WO 2010/008841 ou SEQ ID NO: 3 aqui com uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: D79L+S87P+A112P+D142L: D79L+S87P+D142L; e A27K+ D79L+ Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L.

[0762] Parágrafo 212. O processo de qualquer um dos parágrafos 199-211, em que a variante da protease tem pelo menos 75% de identidade, por exemplo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100% de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 divulgada em WO 2003/048353 ou a parte madura da SEQ ID NO: 1 em WO 2010/008841 ou SEQ ID NO: 3 aqui.

[0763] Parágrafo 213. O processo de qualquer um dos parágrafos 199-212, em que a variante da protease da protease de Thermoascus aurantiacus mostrada na SEQ ID NO: 3 neste documento compreende uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: D79L S87P D142L; D79L S87P A112P D142L; D79L Y82F S87P A112P D142L; S38T D79L S87P A112P A126V D142L; D79L Y82F S87P A112P A126V D142L; A27K D79L S87P A112P A126V D142L; S49P D79L S87P A112P D142L; S50P D79L S87P A112P D142L; D79L S87P D104P A112P D142L; D79L Y82F S87G A112P D142L; S70V D79L Y82F S87G Y97W A112P D142L; D79L Y82F S87G Y97W D104P A112P D142L; S70V D79L Y82F S87G A112P D142L; D79L Y82F S87G D104P A112P D142L; D79L Y82F S87G A112P A126V D142L; Y82F S87G S70V D79L D104P A112P D142L; Y82F S87G D79L D104P A112P A126V D142L; e A27K D79L Y82F S87G D104P A112P A126V D142L.

[0764] Parágrafo 214. O processo de qualquer um dos parágrafos 199-213, em que a protease é de origem bacteriana.

[0765] Parágrafo 215. O processo de qualquer um dos parágrafos 199-214, em que a protease é derivada de uma cepa de Pyrococcus, preferencialmente uma cepa de Pyrococcus furiosus.

[0766] Parágrafo 216. O processo de qualquer um dos parágrafos 199-215, em que a protease é a mostrada na SEQ ID NO: 1 de US 6,358,726, ou na SEQ ID NO: 13 neste documento.

[0767] Parágrafo 217. O processo de qualquer um dos parágrafos 199-216, em que a protease é uma que tem pelo menos 80%, por exemplo pelo menos 85%, pelo menos 90 %, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1 em US 6,358,726 ou SEQ ID NO: 13 neste documento.

[0768] Parágrafo 218. O processo de qualquer um dos parágrafos 199-217, em que estão presentes e/ou são adicionados na etapa i) de liquefação 0,5-100 microgramas de protease de Pyrococcus furiosus por grama de DS, tal como 1-50 microgramas de protease de Pyrococcus furiosus por grama de DS, tal como 1-10 microgramas de protease de Pyrococcus furiosus por grama de DS, tal como 1,5-5 microgramas de protease de Pyrococcus furiosus por grama de DS, tal como cerca de ou mais de 1,5 microgramas de protease de Pyrococcus furiosus por grama de DS.

[0769] Parágrafo 219. O processo de qualquer um dos parágrafos 199-218, em que estão presentes e/ou são adicionados na etapa i) de liquefação 2-100 microgramas de protease de Pyrococcus furiosus por grama de DS, tal como 2,5-50 microgramas de protease de Pyrococcus furiosus por grama de DS, tal como 2,5-10 microgramas de protease de Pyrococcus furiosus por grama de DS, tal como 2,5-5 microgramas de protease de Pyrococcus furiosus por grama de DS, especialmente cerca de 3 microgramas de protease de Pyrococcus furiosus por grama de DS.

[0770] Parágrafo 220. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-219, em que a glucoamilase está presente e/ou é adicionada durante a etapa i) de liquefação.

[0771] Parágrafo 221. O processo do parágrafo 220, em que a glucoamilase presente e/ou adicionada na liquefação tem uma estabilidade térmica a 85 °C, pH 5,3 de pelo menos 20%, tal como de pelo menos 30%, ou pelo menos 35%.

[0772] Parágrafo 222. O processo do parágrafo 220 ou 221, em que a glucoamilase presente e/ou adicionada na liquefação tem uma atividade relativa a pH ótimo de 5,0 de pelo menos 90%, preferencialmente de pelo menos 95%, preferencialmente de pelo menos 97%.

[0773] Parágrafo 223. O processo de qualquer um dos parágrafos 220-222, em que a glucoamilase presente e/ou adicionada na liquefação tem uma estabilidade de pH a pH 5,0 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%.

[0774] Parágrafo 224. O processo de qualquer um dos parágrafos 220-223, em que a glucoamilase presente e/ou adicionada na etapa i) de liquefação é derivada de uma cepa do gênero Penicillium, especialmente de uma cepa de Penicillium oxalicum divulgada como SEQ ID NO: 2 no documento WO 2011/127802 ou SEQ ID NOs: 9 ou 14 neste documento.

[0775] Parágrafo 225. O processo de qualquer um dos parágrafos 220-224, em que a glucoamilase tem pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94%, e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com o polipeptídeo maduro apesentado na SEQ ID NO: 2 no documento WO 2011/127802 ou SEQ ID NOs: 9 ou 14 neste documento.

[0776] Parágrafo 226. O processo de qualquer um dos parágrafos 220-225, em que a glucoamilase é uma variante da glucoamilase de Penicillium oxalicum mostrada na SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 com uma substituição K79V (utilizando a sequência madura apresentada na SEQ ID NO: 14 do presente documento para numeração), tal como uma variante divulgada em WO 2013/053801.

[0777] Parágrafo 227. O processo de qualquer um dos parágrafos 220-226, em que a glucoamilase de Penicillium oxalicum tem uma substituição K79V (utilizando a SEQ ID NO: 14 para numeração) e adicionalmente uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: T65A; Q327F; E501V; Y504T; Y504*; T65A + Q327F; T65A + E501V; T65A + Y504T; T65A + Y504*; Q327F + E501V; Q327F + Y504T; Q327F + Y504*; E501V + Y504T; E501V + Y504*; T65A + Q327F + E501V; T65A + Q327F + Y504T; T65A + E501V + Y504T; Q327F + E501V + Y504T; T65A + Q327F + Y504*; T65A + E501V + Y504*; Q327F + E501V + Y504*; T65A + Q327F + E501V + Y504T; T65A + Q327F + E501V + Y504*; E501V + Y504T; T65A + K161S; T65A + Q405T; T65A + Q327W; T65A + Q327F; T65A + Q327Y; P11F + T65A + Q327F; R1K + D3W + K5Q + G7V + N8S + T10K + P11S + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F; P11F + D26C + K33C + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; R1E + D3N + P4G + G6R + G7A + N8A + T10D+ P11D + T65A + Q327F; P11F + T65A + Q327W; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; T65A + Q327F + E501V + Y504T; T65A + S105P +

Q327W; T65A + S105P + Q327F; T65A + Q327W + S364P; T65A + Q327F + S364P; T65A + S103N + Q327F; P2N + P4S + P11F + K34Y + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + D445N + V447S; P2N + P4S + P11F + T65A + I172V + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + N502*; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + N502T + P563S + K571E; P2N + P4S + P11F + R31S + K33V + T65A + Q327F + N564D + K571S; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + S377T; P2N + P4S + P11F + T65A + V325T+ Q327W; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + D445N + V447S + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + I172V + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + S377T + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + D26N + K34Y + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + I375A + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + K218A + K221D + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + S103N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + T10D + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + F12Y + T65A + Q327F + E501V + Y504T; K5A + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + T10E + E18N + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + T10E + E18N + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T + T568N; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T + K524T + G526A; P2N + P4S + P11F + K34Y + T65A + Q327F + D445N + V447S + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + R31S + K33V + T65A + Q327F + D445N + V447S + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + D26N + K34Y + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + F80* + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + K112S + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F

+ E501V + Y504T + T516P + K524T + G526A; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + N502T + Y504*; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + S103N + Q327F + E501V + Y504T; K5A + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T + T516P + K524T + G526A; P2N + P4S + P11F + T65A + K79A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + K79G + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + K79I + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + K79L + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + K79S + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + L72V + Q327F + E501V + Y504T; S255N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + E74N + V79K + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + G220N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Y245N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q253N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + D279N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + S359N + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + D370N + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + V460S + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + V460T + P468T + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + T463N + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + S465N + E501V + Y504T; andP2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + T477N + E501V + Y504T.

[0778] Parágrafo 228. O processo de qualquer um dos parágrafos 220-227, em que a glucoamilase presente e/ou adicionada na liquefação é a glucoamilase de Penicillium oxalicum que tem uma substituição K79V (utilizando a SEQ ID NO: 14 aqui para numeração) e ainda uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: P11F + T65A + Q327F; e P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F (usando a SEQ ID NO: 14 aqui para numeração).

[0779] Parágrafo 229. O processo de qualquer um dos parágrafos 220-228, em que a variante da glucoamilase tem pelo menos 75% de identidade, por exemplo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100% de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 14 neste documento.

[0780] Parágrafo 230. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-229, em que adicionalmente está presente uma pululanase durante a liquefação e/ou a sacarificação.

[0781] Parágrafo 231. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-230, que compreende as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando uma alfa- amilase derivada de Bacillus stearothermophilus; ii) sacarificação usando uma glucoamilase; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5012.

[0782] Parágrafo 232. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-231, que compreende as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando uma alfa- amilase derivada de Bacillus stearothermophilus compreendendo uma dupla deleção nas posições I181 + G182 e, opcionalmente, uma substituição N193F; (usando a SEQ ID NO: 1 deste documento para numeração); ii) sacarificação usando uma glucoamilase derivada de uma cepa de Gloephyllum, tal como Gloephyllum serpiarium ou Gloephyllum trabeum. iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5012.

[0783] Parágrafo 233. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-232, que compreende as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando: uma alfa-amilase derivada de Bacillus stearothermophilus; uma protease com um valor de termoestabilidade de mais de 20%, determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C, preferencialmente derivada de Pyrococcus furiosus e/ou Thermoascus aurantiacus; e opcionalmente uma glucoamilase de Penicillium oxalicum; ii) sacarificação usando uma glucoamilase; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5012.

[0784] Parágrafo 234. Um processo dos parágrafos 154- 233, que compreende as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando uma alfa- amilase, preferencialmente derivada de Bacillus stearothermophilus compreendendo uma dupla deleção nas posições I181 + G182 e, opcionalmente, uma substituição N193F; (usando a SEQ ID NO: 1 para numeração) e com um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 0,12 mM, de pelo menos 10; ii) sacarificação usando uma glucoamilase; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5012.

[0785] Parágrafo 235. Um processo dos parágrafos 154- 234, que compreende as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura entre 80-90 °C usando: uma alfa-amilase, preferencialmente derivada de Bacillus stearothermophilus, com um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 0,12 mM, de pelo menos 10; uma protease, preferencialmente derivada de Pyrococcus furiosus e/ou Thermoascus aurantiacus, com um valor de termoestabilidade de mais de 20%, determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C; e opcionalmente uma glucoamilase de Penicillium oxalicum ii) sacarificação usando uma glucoamilase; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5012.

[0786] Parágrafo 236. Um processo dos parágrafos 154- 235, que compreende as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando:

uma alfa-amilase derivada de Bacillus stearothermophilus com uma deleção dupla nas posições I181 + G182, e uma substituição opcional N193F; e opcionalmente ainda uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: E129V+K177L+R179E; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+ Q254S; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V; V59A+ E129V+ K177L+R179E+Q254S+M284V; e E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando SEQ ID NO: 1 apresentada neste documento para numeração); ii) sacarificação usando uma glucoamilase, tal como uma de uma cepa de Gloephyllum, tal como uma cepa de Gloephyllum serpiarium; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5012.

[0787] Parágrafo 237. Um processo dos parágrafos 154- 236, que compreende as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando:

uma alfa-amilase derivada de Bacillus stearothermophilus com uma deleção dupla nas posições I181 + G182, e uma substituição opcional N193F, e opcionalmente ainda uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: E129V+K177L+R179E; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+ Q254S; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V; V59A+ E129V+ K177L+R179E+Q254S+M284V; e E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando SEQ ID NO: 1 apresentada neste documento para numeração); uma protease com um valor de termoestabilidade de mais de 20%, determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C, preferencialmente derivada de Pyrococcus furiosus e/ou Thermoascus aurantiacus; e opcionalmente uma glucoamilase de Penicillium oxalicum apresentada na SEQ ID NO: 14 tendo uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: K79V; K79V+ P11F + T65A + Q327F; K79V+P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F; K79V +P11F + D26C + K33C + T65A + Q327F; K79V +P2N + P4S + P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; K79V +P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; e K79V +P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T (usando SEQ ID NO: 14 para numeração). ii) sacarificação usando uma glucoamilase;

iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5012.

[0788] Parágrafo 238. Um processo dos parágrafos 154- 237, que compreende as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura entre 80-90 °C usando: uma alfa-amilase derivada de Bacillus stearothermophilus com uma deleção dupla nas posições I181 + G182, e uma substituição opcional N193F, e opcionalmente ainda uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: E129V+K177L+R179E; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+ Q254S; V59A+Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V; e E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando SEQ ID NO: 1 deste documento para numeração), uma protease com um valor de termoestabilidade de mais de 20%, determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C, preferencialmente derivada de Pyrococcus furiosus e/ou Thermoascus aurantiacus;

uma glucoamilase de Penicillium oxalicum apresentada na SEQ ID NO: 14 tendo uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: K79V; K79V+ P11F + T65A + Q327F; K79V+P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F; K79V +P11F + D26C + K33C + T65A + Q327F; K79V +P2N + P4S + P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; K79V +P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; e K79V +P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T (usando SEQ ID NO: 14 para numeração). ii) sacarificação usando uma glucoamilase; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5012.

[0789] Parágrafo 239. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-238, que compreende as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando: - uma alfa-amilase derivada de Bacillus stearothermophilus com uma deleção dupla nas posições I181 + G182, e opcionalmente uma substituição N193F; (usando a SEQ ID NO: 1 apresentada neste documento para numeração); uma protease com um valor de termoestabilidade de mais de 20%, determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C, preferencialmente derivada de Pyrococcus furiosus e/ou Thermoascus aurantiacus; uma glucoamilase de Penicillium oxalicum com uma substituição K79V (utilizando a SEQ ID NO: 14 aqui apresentada para numeração); e opcionalmente uma pululanase; ii) sacarificação usando uma glucoamilase; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5012.

[0790] Parágrafo 240. Um processo dos parágrafos 154- 239, que compreende as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando: uma alfa-amilase, preferencialmente derivada de Bacillus stearothermophilus, com um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 0,12 mM, de pelo menos 10; entre 0,5 e 10 microgramas de protease de Pyrococcus furiosus por g de DS;

ii) sacarificação usando uma glucoamilase selecionada do grupo de glucoamilases derivadas de uma cepa de Aspergillus, preferencialmente A. niger, A. awamori, ou A. oryzae; ou de uma cepa de Trichoderma, preferencialmente T. reesei; ou de uma cepa de Talaromyces, preferencialmente T. emersonii, ou de uma cepa de Pycnoporus, ou de uma cepa de Gloephyllum, tal como G. serpiarium ou G. trabeum, ou de uma cepa de Nigrofomes; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5012.

[0791] Parágrafo 241. Um processo dos parágrafos 154- 240, que compreende as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura entre 80-90 °C usando; uma alfa-amilase, preferencialmente derivada de Bacillus stearothermophilus, com uma deleção dupla nas posições I181 + G182 e uma substituição opcional N193F, e com T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 0,12 mM, de pelo menos 10; entre 0,5 e 10 microgramas de protease de Pyrococcus furiosus por g de DS; uma glucoamilase de Penicillium oxalicum; e opcionalmente uma pululanase;

ii) sacarificação usando uma glucoamilase; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5012.

[0792] Parágrafo 242. Um processo dos parágrafos 154- 241, que compreende as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura entre 80-90 °C usando; uma alfa-amilase derivada de Bacillus stearothermophilus com uma deleção dupla I181 + G182 e uma substituição opcional N193F; e opcionalmente ainda uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: E129V+K177L+R179E; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+ Q254S; V59A+Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; V59A+E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; e E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando SEQ ID NO: 1 apresentada neste documento para numeração); entre 0,5 e 10 microgramas de protease de Pyrococcus furiosus por g de DS;

uma glucoamilase de Penicillium oxalicum apresentada na SEQ ID NO: 14 tendo uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: K79V; K79V+ P11F + T65A + Q327F; K79V+P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F; K79V +P11F + D26C + K33C + T65A + Q327F; K79V +P2N + P4S + P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; K79V +P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; e K79V +P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T (usando SEQ ID NO: 14 para numeração); e opcionalmente uma pululanase; ii) sacarificação usando uma glucoamilase; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5012.

[0793] Parágrafo 243. Um processo dos parágrafos 154- 242, que compreende as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura entre 80-90 °C usando: uma alfa-amilase derivada de Bacillus stearothermophilus com uma deleção dupla I181 + G182 e uma substituição opcional

N193F; e ainda uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: E129V+K177L+R179E; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+ Q254S; V59A+Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; V59A+E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; e E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando SEQ ID NO: 1 apresentada neste documento para numeração); uma protease com um valor de termoestabilidade de mais de 20%, determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C, preferencialmente derivada de Pyrococcus furiosus e/ou Thermoascus aurantiacus; uma glucoamilase de Penicillium oxalicum apresentada na SEQ ID NO: 14 tendo uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: K79V; K79V+ P11F + T65A + Q327F; K79V+P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F; K79V +P11F + D26C + K33C + T65A + Q327F; K79V +P2N + P4S + P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; K79V +P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; e K79V +P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T (usando SEQ ID NO: 14 para numeração); e opcionalmente uma pululanase; ii) sacarificação usando uma glucoamilase selecionada do grupo de glucoamilases derivadas de uma cepa de Aspergillus; ou de uma cepa de Trichoderma; de uma cepa de Talaromyces, uma cepa de Pycnoporus; uma cepa de Gloephyllum; e uma cepa de Nigrofomes; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5012.

[0794] Parágrafo 244. Um processo de qualquer um dos parágrafos 154-243, que compreende as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura entre 80-90 °C e a um pH entre 5,0 e 6,5 usando: uma alfa-amilase derivada de Bacillus stearothermophilus com uma deleção dupla I181 + G182 e uma substituição opcional N193F; e opcionalmente ainda uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: E129V+K177L+R179E; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+ Q254S; V59A+Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; V59A+E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando SEQ ID NO: 1 apresentada neste documento para numeração);

uma protease derivada de Pyrococcus furiosus, preferencialmente a apresentada na SEQ ID NO: 13 deste documento; uma glucoamilase de Penicillium oxalicum apresentada na SEQ ID NO: 14 tendo uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: K79V; K79V+ P11F + T65A + Q327F; ou K79V+P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F; ou K79V +P11F + D26C + K33C + T65A + Q327F; ou K79V +P2N + P4S + P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; ou K79V +P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; ou K79V +P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T (usando SEQ ID NO: 14 para numeração). ii) sacarificação usando uma glucoamilase; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5012.

[0795] Parágrafo 245. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-244, em que está presente uma composição de enzima celulolítica na sacarificação, fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas (SSF).

[0796] Parágrafo 246. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-245, em que o organismo fermentador tem propriedades que são aproximadamente as mesmas da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae, ou um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae com as características definidoras da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae, pois fornece uma ou mais, tal como todas, as seguintes propriedades ou características definidoras um aumento no rendimento de etanol em comparação com a cepa de Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 no National Measurement Institute, Victoria, Austrália) sob as mesmas condições de processo, por exemplo, como aqui descrito; e/ou produção de glicerol reduzida em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo, por exemplo, como aqui descritas.

[0797] Parágrafo 247. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-246, em que o organismo fermentador fornece um aumento no rendimento de etanol sobre a cepa de Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) de mais de 0,5%, por exemplo, mais de 1,0%, mais de 2,0%, mais de 2,5%, cerca de 2,9%, tal como entre 0,5 e 5%, tal como entre 1-3%, sob as mesmas condições de processo, por exemplo, condições descritas aqui.

[0798] Parágrafo 248. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-247, em que o organismo fermentador reduz a produção de acetaldeído em mais de 10%, por exemplo, mais de 20%, mais de 30%, mais de 40%, mais do que 45%, tal como 5-60%, tal como 30-50%, em comparação com a cepa Ethanol Red® de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso V14 / 007039 no National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo, por exemplo, condições aqui descritas.

[0799] Parágrafo 249. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-248, em que o organismo fermentador aumenta a tolerância à temperatura em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo, por exemplo, condições como aqui descritas.

[0800] Parágrafo 250. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-249, em que o organismo fermentador diminui a produção de glicerol em mais de 3%, por exemplo, mais de 4%, mais de 5%, mais de 6%, mais do que 7%, tal como 2-15%, tal como 5-10%, em comparação com a cepa Ethanol Red® de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso V14 / 007039 no National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo, por exemplo, condições de processo aqui descritas.

[0801] Parágrafo 251. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-250, em que o organismo fermentador é uma cepa não recombinante de Saccharomyces, por exemplo, uma cepa não recombinante de Saccharomyces cerevisiae.

[0802] Parágrafo 252. O processo de qualquer um dos parágrafos 154-251, em que o organismo fermentador é capaz de utilizar cisteína como a única fonte de nitrogênio.

[0803] Parágrafo 253. Um processo para produzir etanol a partir de material contendo amido, que compreendem as etapas de:

i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando uma alfa- amilase derivada de Bacillus stearothermophilus; ii) sacarificação usando uma glucoamilase; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador tem uma ou mais, tais como todas, as seguintes propriedades e características definidoras: aumenta o rendimento de etanol em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo, por exemplo, condições como aqui descritas; reduz a produção de acetaldeído em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo, por exemplo, condições como aqui descritas; tolerância à temperatura aumentada em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo, por exemplo, condições como aqui descritas; produção de glicerol reduzida em comparação com a cepa Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) nas mesmas condições de processo, por exemplo, condições como aqui descritas.

[0804] Parágrafo 254. O processo do parágrafo 253, em que o organismo fermentador é uma levedura Saccharomyces cerevisiae.

[0805] Parágrafo 255. O processo dos parágrafos 253 ou 254, em que o organismo fermentador é uma levedura não recombinante de Saccharomyces cerevisiae.

[0806] Parágrafo 256. Um processo de qualquer um dos parágrafos 154-255, que compreende as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura entre 80-90 °C e a um pH entre 5,0 e 6,5 usando: uma alfa-amilase derivada de Bacillus stearothermophilus com uma deleção dupla I181 + G182 e uma substituição opcional N193F; e opcionalmente ainda uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: E129V+K177L+R179E; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+ Q254S; V59A+Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; V59A+E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando SEQ ID NO: 1 aqui para numeração). uma protease derivada de Pyrococcus furiosus, preferencialmente a apresentada na SEQ ID NO: 13 aqui presente e/ou adicionada em uma dosagem de 1-5 microgramas de protease por grama de DS, tal como cerca de 1,5 ou 3 microgramas de protease por grama de DS; opcionalmente uma glucoamilase de Penicillium oxalicum apresentada na SEQ ID NO: 14 tendo uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: K79V; K79V+ P11F + T65A + Q327F; ou K79V+P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F; ou

K79V +P11F + D26C + K33C + T65A + Q327F; ou K79V +P2N + P4S + P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; ou K79V +P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; ou K79V +P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T (usando SEQ ID NO: 14 para numeração). ii) sacarificação usando uma glucoamilase; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5012.

[0807] Parágrafo 257. O processo de qualquer um dos parágrafos 153-256, em que o organismo fermentador é a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces com características definidoras da cepa MBG5012.

[0808] Parágrafo 258. O processo do parágrafo 257, em que está presente ou é adicionada uma protease na sacarificação e/ou fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas (SSF).

[0809] Parágrafo 259. Uma cepa de levedura Saccharomyces depositada sob o Tratado de Budapeste e com o número de acesso NRRL Y67700, ou um derivado da cepa NRRL Y67700.

[0810] Parágrafo 260. Um método para produzir um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de Acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA), compreendendo: d. cultura de uma primeira cepa de leveduras com uma segunda cepa de leveduras, em que a segunda cepa de leveduras é a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou um seu derivado, em condições que permitem a combinação do DNA entre a primeira cepa de leveduras e a segunda cepa de leveduras; e e. isolamento de cepas híbridas; e f. repetição opcional das etapas (a) e (b) usando uma cepa híbrida isolada na etapa (b) como a primeira cepa de leveduras e/ou a segunda cepa de levedura.

[0811] Parágrafo 261. Um método para produzir um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de Acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA), que exibe as características definidoras da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae, compreendendo: (d) proporcionar: (j) uma primeira cepa de levedura; e (iii) uma segunda cepa de levedura, em que a segunda cepa de levedura é a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou um seu derivado; (e) cultivar a primeira cepa de levedura e a segunda cepa de levedura sob condições que permitem combinação de DNA entre a primeira e a segunda cepas de levedura; (f) triagem ou seleção de um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae.

[0812] Parágrafo 262. O método do parágrafo 261, em que a etapa (c) compreende a triagem ou seleção de uma cepa híbrida que apresente uma ou mais das características definidoras da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae.

[0813] Parágrafo 263. O método do parágrafo 261, que compreende a etapa adicional de: (d) repetição das etapas (b) e (c) com a cepa triada ou selecionada da etapa (c) como primeira e/ou segunda cepa, até se obter um derivado que apresente as características definidoras da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae.

[0814] Parágrafo 264. O método do parágrafo 262 ou 263, em que a etapa (b) de cultura compreende: (i) esporulação da primeira cepa de leveduras e da segunda cepa de leveduras; (ii) hibridização dos esporos germinados produzidos pela primeira cepa de leveduras com os esporos germinados produzidos pela segunda cepa de leveduras.

[0815] Parágrafo 265. Uma cepa de Saccharomyces produzida pelo método de acordo com qualquer um dos parágrafos 260-264.

[0816] Parágrafo 266. Uma cepa de Saccharomyces com as características definidoras da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de Acesso NRRL Y67700 em

Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA).

[0817] Parágrafo 267. Um método para a produção de etanol, que compreende a incubação de uma cepa de qualquer um dos parágrafos 259, 265 ou 266 com um substrato que compreende um açúcar fermentável sob condições que permitam a fermentação do açúcar fermentável para produzir etanol.

[0818] Parágrafo 268. Utilização de uma cepa de qualquer um dos parágrafos 259, 265 ou 266 na produção de etanol.

[0819] Parágrafo 269. Um método de produção de grãos de destiladores, compreendendo: (c) a incubação de uma cepa de Saccharomyces de qualquer um dos parágrafos 259, 265 ou 266 com um substrato que compreende açúcar fermentável sob condições que permitem a fermentação do açúcar fermentável para produzir etanol e grãos de destiladores; (d) o isolamento dos grãos de destiladores.

[0820] Parágrafo 270. Grãos de destiladores produzidos pelo método do parágrafo 269.

[0821] Parágrafo 271. Utilização de uma cepa do parágrafo 259, 265 ou 266 na produção de grãos de destiladores.

[0822] Parágrafo 272. Utilização de uma cepa dos parágrafos 259, 265 ou 266 na produção de uma cepa de Saccharomyces com as características definidoras da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de Acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA).

[0823] Parágrafo 273. Utilização da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) na produção de uma cepa de Saccharomyces com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou que exibe uma ou mais características definidoras da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae;

[0824] Parágrafo 274. Utilização da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou uma cepa com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou de um seu derivado no processo de acordo com qualquer um dos parágrafos 154-273.

[0825] Parágrafo 275. Uma composição compreendendo uma levedura Saccharomyces de qualquer um dos parágrafos 259, 265 ou 266 e um ou mais componentes que ocorrem naturalmente e/ou que ocorrem não naturalmente.

[0826] Parágrafo 276. A composição do parágrafo 275, em que os componentes são selecionados do grupo que consiste em: tensoativos, emulsionantes, gomas, agentes de dilatação, e antioxidantes.

[0827] Parágrafo 277. A composição dos parágrafos 275 ou 276, em que a levedura Saccharomyces é cepa MBG5012 de Saccharomyces (depositada sob o número de Acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA).

[0828] Parágrafo 278. A composição de qualquer um dos parágrafos 275-277, em que a levedura Saccharomyces se encontra em uma forma viável, em particular na forma seca, de creme ou comprimida.

[0829] Parágrafo 279. Um processo de produção de etanol a partir de material contendo amido, compreendendo: (a) sacarificação do material contendo amido; e (b) fermentação usando um organismo de fermentação; em que sacarificação e/ou a fermentação é realizada na presença de pelo menos uma glucoamilase e opcionalmente uma alfa-amilase. o organismo fermentador é Saccharomyces cerevisiae; e em que uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase é expressa a partir do organismo fermentador.

[0830] Parágrafo 280. O processo de acordo com o parágrafo 279, em que o material contendo amido é amido gelatinizado ou não gelatinizado.

[0831] Parágrafo 281. O processo de acordo com o parágrafo 280, em que uma etapa de liquefação precede a etapa de sacarificação e em que a etapa de liquefação é realizada na presença de pelo menos uma alfa-amilase bacteriana, como uma alfa-amilase de Bacillus sp., particularmente Bacillus stearothermophilus.

[0832] Parágrafo 282. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos 279-281, em que a Saccharomyces cerevisiae é a MBG5012 (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais de MBG5012 ou de um derivado de MBG5012 com características definidoras da cepa MBG5012.

[0833] Parágrafo 283. O processo dos parágrafos 279- 282, em que o organismo fermentador é um derivado recombinante de MBG5012 que expressa a glucoamilase.

[0834] Parágrafo 284. O processo dos parágrafos 279- 283, em que a glucocamilase é uma glucoamilase de Gloeophyllum, preferencialmente glucoamilase de Gloeophyllum trabeum, Gloeophyllum sepiarium, ou Gloeophyllum abietinum.

[0835] Parágrafo 285. O processo dos parágrafos 279- 284, em que a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 17; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 17.

[0836] Parágrafo 286. O processo do parágrafo 284 ou 285, em que a glucoamilase é a glucoamilase de Gloeophyllum trabeum mostrada na SEQ ID NO: 17 tendo uma das seguintes substituições: V59A; S95P; A121P; T119W; S95P+A121P; V59A+S95P; S95P+T119W; V59A+S95P+A121P; ou S95P+T119W+A121P, especialmente S95P+A121P.

[0837] Parágrafo 287. O processo de qualquer um dos parágrafos 279-283, em que a glucoamilase é expressa a partir do organismo de fermentação e é uma glucoamilase de Trametes, preferencialmente uma glucoamilase de Trametes cingulata.

[0838] Parágrafo 288. O processo do parágrafo 287, em que a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em:

(i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 20; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 20.

[0839] Parágrafo 289. O processo de qualquer um dos parágrafos 279-283, em que a glucoamilase é expressa a partir do organismo de fermentação e é uma glucoamilase de Pycnoporus, particularmente uma glucoamilase de Pycnoporus sanguineus.

[0840] Parágrafo 290. O processo do parágrafo 289, em que a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 18; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 18.

[0841] Parágrafo 291. O processo de qualquer um dos parágrafos 279-290, em que o organismo fermentador é um derivado recombinante de MBG5012 que expressa a alfa-amilase.

[0842] Parágrafo 292. O processo dos parágrafos 279- 291, em que a alfa-amilase expressa a partir do organismo fermentador e é derivada de Rhizomucor pusillus ou Aspergillus terreus.

[0843] Parágrafo 293. O processo do parágrafo 292, em que a alfa-amilase é uma alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação a amido (SBD) mostrado na SEQ ID NO: 16, preferencialmente uma tendo pelo menos uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: D165M; Y141W; Y141R; K136F; K192R; P224A; P224R; S123H+Y141W; G20S + Y141W; A76G + Y141W; G128D + Y141W; G128D + D143N; P219C + Y141W; N142D + D143N; Y141W + K192R; Y141W + D143N; Y141W + N383R; Y141W + P219C + A265C; Y141W + N142D + D143N; Y141W + K192R V410A; G128D + Y141W + D143N; Y141W + D143N + P219C; Y141W + D143N + K192R; G128D + D143N + K192R; Y141W + D143N + K192R + P219C; G128D + Y141W + D143N + K192R; ou G128D + Y141W + D143N + K192R + P219C, especialmente G128D+D143N, e em que a alfa- amilase tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95 %, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 16.

[0844] Parágrafo 294. O processo do parágrafo 292, em que a alfa-amilase é uma alfa-amilase de Aspergillus terreus selecionada do grupo que consiste em: (i) uma alfa-amilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 6 de WO2017/087330; (ii) uma alfa-amilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 6 de

WO2017/087330.

[0845] Parágrafo 295. Uma cepa de levedura Saccharomyces cerevisiae, em que a cepa é um derivado de MBG5012 compreendendo um ou mais vetores de expressão que codificam uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase.

[0846] Parágrafo 296. A cepa de levedura de acordo com o parágrafo 295, em que a glucoamilase é selecionada dentre glucoamilases obtidas de Gloeophyllum, Pynnoporous ou Trametes.

[0847] Parágrafo 297. A cepa de levedura de acordo com o parágrafo 296, em que a glucoamilase é selecionada a partir de glucoamilase de Gloeophyllum trabeum, Gloeophyllum sepiarium ou Gloeophyllum abietinum.

[0848] Parágrafo 298. A cepa de levedura do parágrafo 297, em que a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 17; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 17.

[0849] Parágrafo 299. A cepa de levedura de qualquer um dos parágrafos 296-298, em que a glucoamilase é a glucoamilase de Gloeophyllum trabeum mostrada na SEQ ID NO: 17 tendo uma das seguintes substituições: V59A; S95P; A121P; T119W; S95P+A121P; V59A+S95P; S95P+T119W; V59A+S95P+A121P; ou S95P+T119W+A121P, especialmente S95P+A121P.

[0850] Parágrafo 300. A cepa de levedura do parágrafo 296, em que a glucoamilase é uma glucoamilase de Trametes cingulata.

[0851] Parágrafo 301. A cepa de levedura do parágrafo 300, em que a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 20; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 20.

[0852] Parágrafo 302. A cepa de levedura do parágrafo 296, em que a glucoamilase é uma glucoamilase de Pycnoporus sanguineus.

[0853] Parágrafo 303. A cepa de levedura do parágrafo 302, em que a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 18; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 18.

[0854] Parágrafo 304. O vetor de expressão da cepa de levedura do parágrafo 295, na qual a alfa-amilase é selecionada a partir de uma alfa-amilase de Rhizomucor pusillus ou Aspergillus terreus.

[0855] Parágrafo 305. A cepa de levedura do parágrafo 304, em que a alfa-amilase é uma alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação a amido (SBD) mostrado na SEQ ID NO: 16, preferencialmente uma tendo pelo menos uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: D165M; Y141W; Y141R; K136F; K192R; P224A; P224R; S123H+Y141W; G20S + Y141W; A76G + Y141W; G128D + Y141W; G128D + D143N; P219C + Y141W; N142D + D143N; Y141W + K192R; Y141W + D143N; Y141W + N383R; Y141W + P219C + A265C; Y141W + N142D + D143N; Y141W + K192R V410A; G128D + Y141W + D143N; Y141W + D143N + P219C; Y141W + D143N + K192R; G128D + D143N + K192R; Y141W + D143N + K192R + P219C; G128D + Y141W + D143N + K192R; ou G128D + Y141W + D143N + K192R + P219C, especialmente G128D+D143N, e em que a alfa- amilase tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95 %, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 16.

[0856] Parágrafo 306. A cepa de levedura do parágrafo 304, em que a alfa-amilase é alfa-amilase de Aspergillus terreus selecionada do grupo que consiste em: (i) uma alfa-amilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 6 de WO2017/087330; (ii) uma alfa-amilase compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 6 de WO2017/087330.

[0857] A invenção descrita e reivindicada aqui não é para estar limitada em escopo pelos aspectos específicos aqui divulgados, uma vez que estes aspectos se pretendem como ilustração de vários aspectos da invenção. Quaisquer aspectos equivalentes se destinam a estar dentro do escopo desta invenção. De fato, diversas modificações da invenção, para além das aqui mostradas e descritas, se tornarão evidentes para os peritos na técnica a partir da descrição anterior. Tais modificações se destinam também a residir dentro do escopo das reivindicações anexas. Em caso de conflito, a presente divulgação incluindo definições prevalecerá.

[0858] Diversas referências são citadas no presente documento, cujas divulgações são incorporadas a título de referência em suas totalidades. Depósito de Material Biológico

[0859] O seguinte material biológico foi depositado sob os termos do Tratado de Budapeste com a Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA, e recebeu o seguinte número de acesso: Depósito Número de Acesso Data de Depósito Saccharomyces NRRL Y-67549 1 de fevereiro de 2018 cerevisiae cepa MBG5038 Saccharomyces NRRL Y-67700 quinta-feira, 29 de novembro de 2018 cerevisiae cepa MBG5012

[0860] O seguinte material biológico foi depositado sob os termos do Tratado de Budapeste com o National Measurement Institute, Vitória, Austrália, e recebeu o seguinte número de acesso: Depósito Número de Acesso Data de Depósito Ethanol Red® V14/007039 19 de março de 2014

[0861] As cepas foram depositadas sob condições que asseguram que o acesso à cultura estará disponível durante a pendência deste pedido de patente a um determinado pelo Comissário de Patentes e Marcas Registradas como tendo direito às mesmas sob 37 C.F.R. §1.14 e 35 U.S.C. §122. O depósito representa uma cultura substancialmente pura da cepa depositada. O depósito está disponível como requerido por leis de patentes estrangeiras em países em que as contrapartidas do pedido em questão, ou sua descendência, sejam depositadas. No entanto deve ser entendido que a disponibilidade de um depósito não constitui uma licença para praticar a invenção em questão em derrogação de direitos de patente concedidos por ação governamental. Materiais & Métodos MATERIAIS:

[0862] Alfa-Amilase 369 (“AA369”): Alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus com as mutações: I181* + G182* + N193F + V59A + Q89R + E129V + K177L + R179E + Q254S + M284V truncada até 491 aminoácidos (usando SEQ ID NO: 1 apresentada neste documento para numeração);

[0863] Variante da glucoamilase de Penicillium oxalicum PE498 ("PoAMG498"): Variante de glucoamilase de Penicillium oxalicum com as seguintes mutações: K79V+ P2N+ P4S+ P11F+ T65A+ Q327F (usando a SEQ ID NO: 14 deste documento para numeração):

[0864] Protease Pfu (“PFU”): Protease derivada a partir de Pyrococcus furiosus mostrada na SEQ ID NO: 13 neste documento.

[0865] A glucoamilase SA ("GSA") compreende uma mistura compreendendo a glucoamilase de Talaromyces emersonii divulgada em WO99/28448 (SEQ ID NO: 19 aqui), glucoamilase de Trametes cingulata divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 06/69289 e SEQ ID NO: 20 do presente documento, e alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com um ligante glucoamilase de Aspergillus niger e SBD divulgado como SEQ ID NO: 16 aqui com as seguintes substituições: G128D+D143N (razão de atividade AGU:AGU:FAU(F): aprox. 30:7:1).

[0866] Levedura:

[0867] ETHANOL RED™ ("ER"): Levedura Saccharomyces cerevisiae disponível na Fermentis/Lesaffre, EUA. Métodos

[0868] Identidade: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro "identidade".

[0869] Para os propósitos aqui descritos, o grau de identidade entre duas sequências de aminoácidos, bem como o grau de identidade entre duas sequências de nucleotídeos, pode ser determinado pelo programa "align" que é um alinhamento de Needleman-Wunsch (isto é, um alinhamento global). O programa é usado para o alinhamento de polipeptídeos, bem como de sequências de nucleotídeos. A matriz de pontuação padrão BLOSUM50 é usada para alinhamentos de polipeptídeos e a matriz de identidade padrão é usada para alinhamentos de nucleotídeos. A penalidade para o primeiro resíduo de um vão é -12 para polipeptídeos e - 16 para nucleotídeos. As penalidades para resíduos adicionais de um vão são -2 para polipeptídeos e -4 para nucleotídeos.

[0870] "Align” é parte do pacote FASTA versão v20u6 (consultar W. R. Pearson e D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2.444 a 2.448 e W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA," Methods in Enzymology 183:63 a 98). Os alinhamentos de proteína de FASTA usam o algoritmo de Smith-Waterman sem limitação no tamanho de vão (consultar "Smith-Waterman algorithm", T. F. Smith e M. S. Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147:195 a 197).

Ensaios de protease Ensaio de AZCL-caseína

[0871] Uma solução de 0,2 % do substrato azul AZCL- caseína é suspensa em tampão Bórax/NaH2PO4 pH 9 enquanto se agitava. A solução é distribuída enquanto se agita a placa de microtitulação (100 microL em cada poço), 30 microL da amostra de enzima são adicionados e as placas são incubadas em um Termomisturador Eppendorf durante 30 minutos a 45 °C e 600 rpm. A amostra de enzima desnaturada (ebulição a 100 °C durante 20 min) é usada como um branco. Após incubação, a reação é parada por transferência da placa de microtitulação para gelo e a solução colorida é separada do sólido por centrifugação a 3000 rpm durante 5 minutos a 4 °C. 60 microL de sobrenadante são transferidos para uma placa de microtitulação e a absorvância a 595 nm é medida usando um Leitor de Microplacas da BioRad. Ensaio de pNA

[0872] 50 microL de amostra contendo protease são adicionados a uma placa de microtitulação e o ensaio é iniciado adicionando 100 microL de substrato pNA 1 mM (5 mg dissolvidos em 100 microL de DMSO e adicionalmente diluídos até 10 mL com tampão Bórax/NaH2PO4, pH 9,0). O aumento na OD405 à temperatura ambiente é monitorizado como uma medida da atividade de protease.

[0873] Aividade de glucoamilase (AGU) A atividade de glucoamilase pode ser medida em Unidades de Glucoamilase (AGU).

[0874] A Unidade de glucoamilase Novo (AGU) é definida como a quantidade de enzimas que hidrolisa 1 micromol de maltose por minuto sob as condições padrão 37 °C, pH 4,3, substrato: maltose 23,2 mM, tampão: acetato 0,1 M, tempo de reação de 5 minutos.

[0875] Um sistema autoanalisador pode ser usado. Mutarotase é adicionada ao reagente de glucose desidrogenase de modo que qualquer alfa-D-glucose presente se transforme em beta-D-glucose. glucose desidrogenase reage especificamente com beta-D-glucose na reação mencionada acima, formando NADH que é determinado com o uso de um fotômetro a 340 nm como uma medida da concentração de glucose original. Incubação de AMG: Substrato: maltose a 23,2 mM Tampão: acetato a 0,1 M pH: 4,30 ± 0,05 Temperatura de incubação: 37 °C ± 1 Tempo de reação: 5 minutos Gama de trabalho da enzima: 0,5-4,0 AGU/mL Reação de cor GlucDH: 430 U/l Mutarotase: 9 U/l NAD: 0,21 mM Tampão: fosfato a 0,12 M; NaCl a 0,15 M pH: 7,60 ± 0,05 Temperatura de incubação: 37 °C ± 1 Tempo de reação: 5 minutos Comprimento de onda: 340 nm

[0876] Uma pasta (EB-SM-0131.02/01) que descreve esse método analítico com mais detalhes está disponível mediante solicitação junto à Novozymes A/S, Dinamarca, cuja pastas está incluída no presente documento a título de referência. Atividade de alfa-amilase ácida (AFAU)

[0877] A atividade de alfa-amilase ácida pode ser medida em AFAU (Unidades de Alfa-amilase Fúngica Ácida), que são determinadas em relação a um padrão de enzima. 1 AFAU é definido como a quantidade de enzima que degrada 5,260 mg de matéria seca de amido por hora sob as condições padrão mencionadas em baixo.

[0878] A alfa-amilase ácida, uma endo-alfa-amilase (1,4- alfa-D-glucana-glucano-hidrolase, E.C. 3.2.1.1), hidrolisa ligações alfa-1,4- glucosídicas nas regiões internas da molécula de amido para formar dextrinas e oligossacarídeos com diferentes comprimentos de cadeia. A intensidade da cor formada com iodo é diretamente proporcional à concentração de amido. A atividade de amilase é determinada usando colorimetria reversa como uma redução na concentração de amido sob as condições analíticas especificadas.

azul/violeta t = 23 seg. descoloração Condições padrão/condições de reação: Substrato: Amido solúvel, aprox. 0,17 g/L Tampão: Citrato, aprox. 0,03 M Iodo (I2): 0,03 g/L CaCl2: 1,85 mM pH: 2,50 ± 0,05 Temperatura de incubação: 40 oC Tempo de reação: 23 segundos Comprimento de onda: 590 nm Concentração de enzima: 0,025 AFAU/mL Gama de trabalho da enzima: 0,01-0,04 AFAU/mL

[0879] Uma pasta EB-SM-0259.02/01 descrevendo este método analítico em mais detalhe está disponível mediante pedido à

Novozymes A/S, Dinamarca, pasta essa que é deste modo incluída por referência. Atividade de Alfa-amilase (KNU)

[0880] A atividade de alfa-amilase pode ser determinada usando amido de batata como substrato. Este método é baseado na desagregação de amido de batata modificado pela enzima, e a reação é seguida por mistura de amostras da solução de amido/enzima com uma solução de iodo. Inicialmente é formada uma cor enegrecida-azul, mas durante a desagregação do amido a cor azul se torna mais fraca e se torna gradualmente em um avermelhado-marrom, que é comparado com um vidro colorido padrão.

[0881] Uma Unidade de alfa-amilase Kilo Novo (KNU) é definida como a quantidade de enzima que, sob condições padrão (isto é, a 37 °C +/- 0,05; Ca2+ a 0,0003 M; e pH 5,6) dextriniza 5260 g de substância seca de amido Merck Amylum solúvel.

[0882] Uma pasta EB-SM-0009.02/01 descrevendo este método analítico em mais detalhe está disponível mediante pedido à Novozymes A/S, Dinamarca, pasta essa que é deste modo incluída por referência. Atividade de Alfa-amilase (KNU-A)

[0883] A atividade de alfa-amilase é medida em KNU(A), Quilo Unidades de Novozymes Quilo (A), em relação a um padrão de enzima de uma resistência declarada. A alfa-amilase em amostras e a α-glucosidase no estojo de reagentes hidrolisam o substrato (4,6-etilideno(G7)-p-nitrofenil(G1)-α,D-malto- heptaosídeo (etilideno-G7PNP)) em glucose e o p-nitrofenol de cor amarela.

[0884] A taxa de formação de p-nitrofenol pode ser observada por Konelab 30. Isto é uma expressão da taxa de reação e deste modo da atividade de enzima.

[0885] A enzima é uma alfa-amilase com o número de classificação de enzimas EC 3.2.1.1. Parâmetro Condições de reação Temperatura 37 C pH 7,00 (a 37 °C) Conc. de substrato Etilideno-G7PNP, R2: 1,86 mM Conc. da enzima 1,35-4,07 KNU(A)/L (conc. de padrão elevado/baixo na mistura reacional) Tempo de reação 2 min Tempo de medição cinética de 7/18 s intervalo

Comprimento de onda 405 nm Conc. de reagentes/químicos críticos α-glucosidase, R1:≥ 3,39 kU/L para a análise

[0886] Uma pasta EB-SM-5091.02-D sobre a determinação de atividade de KNU-A está disponível mediante solicitação junto à Novozymes A/S, Dinamarca, cuja pasta está incluída no presente documento a título de referência. Atividade da Alfa-amilase KNU(S)

[0887] A BS-amilase nas amostras e a enzima alfa- glicosidase no "kit" de reagentes hidrolisam o substrato (4,6-etilideno(G7)-p- nitrofenil(G1)-alfa-D-maltoheptaosídeo (etilideno-G7PNP)) em glucose e no p-nitrofenol de cor amarela.

[0888] A taxa de formação do p-nitrofenol pode ser observada por meio de Konelab 30. Trata-se de uma expressão da taxa da reação e, por conseguite, da atividade enzimática. Condições de Reação Reação: pH: 7,15 Temperatura: 37 °C Tempo de reação: 180 seg Detecção: Comprimento de onda: 405 nm Tempo de Medição: 120 seg Definição das unidades

[0889] A atividade da amilase de Bacillus stearothermophilus (BS-amilase) é medida em KNU(S), (do inglês Kilo Novo Units (sterarothermophilus) = Unidades de Quilo Novo

(sterarothermophilus)), em relação a uma enzima-padrão de uma força declarada.

[0890] Este método analítico é descrito mais em detalhe em EB-SM-0221.02 (incorporado como referência), disponível da Novozymes A/S Dinamarca mediante pedido. Determinação de FAU(F)

[0891] Unidades de Alfa-Amilase Fúngica (Fungamyl) FAU(F) são medidas em relação a um padrão enzimático de uma resistência declarada. Condições de Reação Temperatura: 37 °C pH: 7,15 Comprimento de onda: 405 nm Tempo de reação: 5 min Tempo de medição: 2 min

[0892] Uma pasta (EB-SM-0216.02) que descreve esse método padrão com mais detalhes está disponível mediante solicitação junto à Novozymes A/S, Dinamarca, cuja pasta está incluída no presente documento a título de referência. Determinação da Atividade da Pululanase (NPUN)

[0893] A atividade da endo-pululanase em NPUN é medida em relação a uma pululanase da Novozymes padrão. Uma unidade de pululanase (NPUN) é definida como a quantidade de enzima que libera 1 micromol de glucose por minuto nas condições-padrão (0,7% de pululano vermelho (Megazyme), pH 5, 40 °C, 20 minutos). A atividade é medida em NPUN/mL usando pululano vermelho.

[0894] 1 mL de amostra diluída ou padrão é incubado a 40 °C durante 2 minutos. Adiciona-se 0,5 mL de pululano vermelho a 2%, KCl 0,5 M, ácido cítrico 50 mM, pH 5 e se mistura. Os tubos são incubados a 40

°C durante 20 minutos e parados por adição de 2,5 mL de etanol a 80%. Os tubos são deixados a repousar à temperatura ambiente durante 10-60 minutos, se seguindo 10 minutos de centrifugação a 4000 rpm. A OD dos sobrenadantes é então medida a 510 nm e a atividade calculada usando uma curva-padrão.

[0895] A presente invenção é adicionalmente descrita em detalhe adicional nos seguintes exemplos que são oferecidos para ilustrarem a presente invenção, mas não se destinam de modo nenhum a limitar o escopo da invenção como reivindicada. Todas as referências citadas aqui são especificamente incorporadas por referência para tal que é descrito aqui.

EXEMPLOS Exemplo 1: Estabilidade de Variantes da Alfa-Amilase

[0896] A estabilidade de uma alfa-amilase de referência (alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus com as mutações I181*+G182*+N193F truncada para 491 aminoácidos (numeração da SEQ ID NO: 1)) e suas variantes de alfa-amilase foi determinada por incubação da alfa-amilase de referência e variantes a pH 4,5 e 5,5 e temperaturas de 75 °C e 85 °C com CaCl2 0,12 mM seguida da determinação da atividade residual usando o substrato EnzChek® (Kit de ensaio Ultra Amilase EnzChek®, E33651, Molecular Probes).

[0897] Diluiu-se amostras de enzima purificada até concentrações de trabalho de 0,5 e 1 ou 5 e 10 ppm (microgramas/mL) em tampão de diluição enzimática (acetato 10 mM, Triton X100 0,01%, CaCl2 0,12 mM, pH 5,0). Transferiu-se vinte microlitros de amostra de enzima para PCR MTP de 48 poços e se adicionou 180 microlitros de tampão de estabilidade (acetato 150 mM, MES 150 mM, Triton X100 a 0,01%, CaCl2 0,12 mM, pH 4,5 ou 5,5) a cada poço e se misturou. O ensaio foi efetuado usando duas concentrações de enzima em duplicado. Antes da incubação a 75 °C ou 85 °C, se retirou 20 microlitros e armazenou em gelo como amostras de controle. A incubação foi efetuada em uma máquina de PCR a 75 °C e 85 °C. Após incubação, as amostras foram diluídas até 15 ng/mL em tampão residual de atividade (Acetato 100 mM, Triton X100 a 0,01%, CaCl2 0,12 mM, pH 5,5) e se transferiu 25 microlitros de enzima diluída para 384-MTP negra. A atividade residual foi determinada usando o substrato EnzChek, por adição de 25 microlitros de solução de substrato (100 microgramas/mL) a cada poço. A fluorescência foi determinada a cada minuto durante 15 minutos, usando um filtro de excitação a 485-P nm e um filtro de emissão a 555 nm (o leitor de fluorescência é um Polarstar, BMG). A atividade residual foi normalizada para controlar as amostras para cada configuração.

[0898] Assumindo um decaimento logarítmico, se calculou o tempo de meia-vida (T½ (min)) usando a equação: T½ (min) = T(min)*LN(0,5)/LN(%RA/100), onde T é o tempo de incubação do ensaio em minutos, e %RA é a % de atividade residual determinada no ensaio.

[0899] Usando esta configuração no ensaio, o tempo de meia-vida foi determinado para a alfa-amilase de referência e suas variantes, tal como se mostra na Tabela 1.

[0900] Tabela 1. T½ (min) T½ (min) T½ (min) (pH 4,5, 75 (pH 4,5, 85 °C, (pH 5,5, 85 Mutações °C, 0,12 0,12 mM °C, 0,12 mM CaCl2) CaCl2) mM CaCl2) Alfa-Amilase A de Referência 21 4 111 Alfa-Amilase A de Referência 32 6 301 com a substituição V59A Alfa-Amilase A de Referência 28 5 230 com a substituição V59E Alfa-Amilase A de Referência 28 5 210 com a substituição V59I

Alfa-Amilase A de Referência 30 6 250 com a substituição V59Q Alfa-Amilase A de Referência com as substituições V59A+Q89R+ 149 22 ND G112D+E129V+K177L+R179 E+ K220P+N224L+Q254S Alfa-Amilase A de Referência com as substituições V59A+Q89R+E129V+ >180 28 ND K177L+R179E+H208Y+K220 P+ N224L+Q254S Alfa-Amilase A de Referência com as substituições V59A+Q89R+E129V+ 112 16 ND K177L+R179E+K220P+N224 L+ Q254S+D269E+D281N Alfa-Amilase A de Referência com as substituições V59A+Q89R+E129V+ 168 21 ND K177L+R179E+K220P+N224 L+ Q254S+I270L Alfa-Amilase A de Referência com as substituições >180 24 ND V59A+Q89R+E129V+

K177L+R179E+K220P+N224 L+ Q254S+H274K Alfa-Amilase A de Referência com as substituições V59A+Q89R+E129V+ 91 15 ND K177L+R179E+K220P+N224 L+ Q254S+Y276F Alfa-Amilase A de Referência com as substituições V59A+E129V+ 141 41 ND R157Y+K177L+R179E+K220 P+ N224L+S242Q+Q254S Alfa-Amilase A de Referência com as substituições V59A+E129V+ >180 62 ND K177L+R179E+H208Y+K220 P+ N224L+S242Q+Q254S Alfa-Amilase A de Referência com as substituições V59A+E129V+ K177L+R179E+K220P+N224 L+ S242Q+Q254S >180 49 >480

Alfa-Amilase A de Referência com as substituições V59A+E129V+ K177L+R179E+K220P+N224 L+ S242Q+Q254S+H274K >180 53 ND Alfa-Amilase A de Referência com as substituições V59A+E129V+ K177L+R179E+K220P+N224 L+ S242Q+Q254S+Y276F >180 57 ND Alfa-Amilase A de Referência com as substituições V59A+E129V+ K177L+R179E+K220P+N224 L+ S242Q+Q254S+D281N >180 37 ND Alfa-Amilase A de Referência com as substituições V59A+E129V+ K177L+R179E+K220P+N224 L+ S242Q+Q254S+M284T >180 51 ND Alfa-Amilase A de Referência com as substituições V59A+E129V+ K177L+R179E+K220P+N224 L+ >180 45 ND

S242Q+Q254S+G416V Alfa-Amilase A de Referência com as substituições V59A+E129V+ K177L+R179E+K220P+N224 L+ Q254S 143 21 >480 Alfa-Amilase A de Referência com as substituições V59A+E129V+ K177L+R179E+K220P+N224 L+ Q254S+M284T >180 22 ND Alfa-Amilase A de Referência com as substituições A91L+M96I+E129V+ K177L+R179E+K220P+N224 L+ S242Q+Q254S >180 38 ND Alfa-Amilase A de Referência com as substituições E129V+K177L+ R179E 57 11 402 Alfa-Amilase A de Referência com as substituições E129V+K177L+ R179E+K220P+N224L+S242 Q+ Q254S 174 44 >480

Alfa-Amilase A de Referência com as substituições E129V+K177L+ R179E+K220P+N224L+S242 Q+ Q254S+Y276F+L427M >180 49 >480 Alfa-Amilase A de Referência com as substituições E129V+K177L+ R179E+K220P+N224L+S242 Q+ Q254S+M284T >180 49 >480 Alfa-Amilase A de Referência com as substituições E129V+K177L+ R179E+K220P+N224L+S242 Q+ Q254S+N376*+I377* 177 36 >480 Alfa-Amilase A de Referência com as substituições E129V+K177L+ R179E+K220P+N224L+Q254 S 94 13 >480 Alfa-Amilase A de Referência com as substituições E129V+K177L+ R179E+K220P+N224L+Q254 S+ M284T 129 24 >480

Alfa-Amilase A de Referência com as substituições E129V+K177L+ R179E+S242Q 148 30 >480 Alfa-Amilase A de Referência com as substituições E129V+K177L+ R179V 78 9 >480 Alfa-Amilase A de Referência com as substituições E129V+K177L+ R179V+K220P+N224L+S242 Q+ Q254S 178 31 >480 Alfa-Amilase A de Referência com as substituições K220P+N224L+ S242Q+Q254S 66 17 >480 Alfa-Amilase A de Referência com as substituições K220P+N224L+ Q254S 30 6 159 Alfa-Amilase A de Referência com a substituição M284T 35 7 278 Alfa-Amilase A de Referência com as substituições M284V 59 13 ND

ND: Não determinado

[0901] Os resultados demonstram que as variantes da alfa-amilase têm uma meia-vida e uma estabilidade significativamente superiores do que a alfa-amilase de referência. Exemplo 2: Preparação de Variantes da Protease e Teste da Termoestabilidade Cepas e plasmídeos

[0902] E.coli DH12S (disponível na Gibco BRL) foi utilizada para resgate de plasmídeos de levedura. pJTP000 é um vetor de transporte de S. cerevisiae e E.coli sob o controle do promotor TPI, construído a partir de pJC039 descrito em WO 01/92502, em que o gene da protease de Thermoascus aurantiacus M35 (WO 03048353) foi inserido.

[0903] Células competentes de Saccharomyces cerevisiae YNG318: MATa Dpep4[cir+] ura3-52, leu2-D2, his 4-539 foi usado para expressão das variantes da protease. Descreve-se em J. Biol. Chem. 272 (15), págs. 9720-9727, 1997. Meios e substratos

[0904] Solução basal 10X: Base nitrogenada de levedura sem aminoácidos (DIFCO) a 66,8 g/L, succinato a 100 g/L, NaOH a 60 g/L.

[0905] SC-glucose: glucose a 20 % (isto é, uma concentração final de 2 % = 2 g/100 mL) 100 mL/L, treonina a 5 % 4 mL/L, triptofano a 1 % 10 mL/L, casaminoácidos a 20 % 25 mL/L, solução basal 10 X 100 mL/L. A solução é esterilizada usando um filtro de um tamanho de poros de 0,20 micrômetros. Submete-se ágar (2%) e H2O (aprox. 761 mL) a autoclavagem em conjunto, e a solução de SC-glucose esterilizada separadamente é adicionada à solução de ágar.

[0906] YPD: Bactopeptona a 20 g/L, extrato de levedura a 10 g/L, glucose a 20 % 100 mL/L.

[0907] YPD+Zn: YPD+ZnSO4 0,25 mM

[0908] Solução de PEG/LiAc: 50 mL de PEG4000 a 40 %, 1 mL de Acetato de Litio 5 M.

[0909] Placa de microtitulação de Zeína de 96 poços:

[0910] Cada poço contém 200 microL de zeína a 0,05-0,1 % (Sigma), ZnSO4 0,25 mM e ágar a 1 % em tampão de acetato de sódio 20 mM, pH 4,5. Manipulações de DNA

[0911] Salvo indicação em contrário, as manipulações e transformações de DNA foram realizadas usando métodos padrão de biologia molecular como descrito em Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab. Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al. (editores) "Current protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R. e Cutting, S. M. (Eitores). Transformação de leveduras

[0912] A transformação de leveduras foi levada a cabo usando o método do acetato de lítio. Mistura-se 0,5 microL de vetor (digerido por endonucleases de restrição) e1 microL de fragmentos de PCR. Adiciona- se a mistura de DNA, 100 microL de células competentes YNG318, e 10 microL de DNA transportador YEAST MAKER (Clontech) a um tubo de polipropileno de 12 mL (Falcon 2059). Adicionar 0,6 mL de solução de PEG/LiAc e misturar cuidadosamente. Incubar durante 30 minutos a 30 °C, e 200 rpm se seguindo 30 minutos a 42 °C (choque térmico). Transferir para um tubo eppendorf e centrifugar durante 5 s. Remover o sobrenadante e resolver em 3 mL de YPD. Incubar a suspensão de células durante 45 minutos a 200 rpm a 30 °C. Verter a suspensão para placas de SC-glucose e incubar a 30 °C durante 3 dias para o crescimento das colônias. O DNA total das leveduras é extraído com o "Kit" Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep (ZYMO research). Sequenciamento de DNA

[0913] A transformação em E. coli para a sequenciamento de DNA foi levada a cabo por eletroporação (BIO-RAD Gene Pulser). Preparou-se plasmídeos de DNA pelo método alcalino (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor) ou com o "Kit" Qiagen® Plasmid. Os fragmentos de DNA foram recuperados do gel de agarose pelo Kit de extração em gel da Qiagen. A PCR foi realizada usando um Dispositivo PTC-200 DNA. O Analisador Genético ABI PRISMTM 310 foi usado para a determinação de todas as sequências de DNA. Construção do vetor de expressão da protease

[0914] O gene da protease M35 de Thermoascus foi amplificado com o par de iniciadores Prot F (SEQ ID NO: 4) e Prt R (SEQ ID NO: 5). Os fragmentos resultantes da PCR foram introduzidos em S. cerevisiae YNG318 conjuntamente com o vetor pJC039 (descrito em WO 2001/92502) digerido com enzimas de restrição para remover o gene cutinase insolens Humicola.

[0915] O Plasmídeo em clones de levedura em placas com SC-glucose foi recuperado para confirmar a sequência interna e denominada pJTP001. Construção de bibliotecas de leveduras e variantes sítio-dirigidas

[0916] As bibliotecas de levedura e variantes sítio-dirigidas foram construídas pelo método SOE PCR (Processamento por Extensão de Sobreposição, ver "PCR: A practical approach", p. 207-209, Oxford University press, editores McPherson, Quirke, Taylor), se seguindo a recombinação in vivo de leveduras. Iniciadores gerais para amplificação e sequenciamento

[0917] Os iniciadores AM34 (SEQ ID NO: 6) e AM35 (SEQ ID NO: 7) foram usados para fazer fragmentos de DNA contendo quaisquer fragmentos mutados pelo método SOE em conjunto com iniciadores degenerados (AM34 + Iniciador reverso e AM35 + iniciador direto), ou simplesmente para amplificar um gene da protease (AM34 + AM35).

Sistema de reação PCR: Condições: 48,5 microL de H2O 1 94 °C 2 min 2 pérulas de puRe Taq Ready-To-Go PCR 2 94 °C 30 s (Amersham Biosciences) 3 55 °C 30 s 0,5 microL X 2 de iniciadores a 100 pmole/microL 4 72 °C 90 s 0,5 microL de DNA molde 2-4 25 ciclos 5 72 °C 10 min

[0918] Os fragmentos de DNA foram recuperados do gel de agarose pelo Kit de extração em gel da Qiagen. Os fragmentos purificados resultantes foram misturados com a digestão de vetor. A solução misturada foi introduzida em Saccharomyces cerevisiae para construir bibliotecas ou variantes sítio-dirigidas por recombinação in vivo. Ensaio de atividade relativa

[0919] Os clones de leveduras em SC-glucose foram inoculados em um poço de uma placa de microtitulação de 96 poços contendo meio YPD+Zn e cultivados a 28 °C durante 3 dias. Os sobrenadantes da cultura foram aplicados a uma placa de microtitulação com zeína de 96 poços e incubados a pelo menos 2 temperaturas (ex. 60 °C e 65 °C, 70 °C e 75 °C, 70 °C e 80oC) durante mais de 4 horas ou durante a noite. A turbidez da zeína na placa foi medida como A630 e a atividade relativa (temperaturas superior/inferior) determinada como indicador da melhoria da termoatividade. Selecionou-se os clones com atividade relativa mais elevada do que a variante de origem e se determinou a sequência. Ensaio da atividade remanescente

[0920] Os clones de leveduras em SC-glucose foram inoculados em um poço de uma placa de microtitulação de 96 poços e cultivados a 28 °C durante 3 dias. A atividade da protease foi medida a 65 °C usando azo-caseína (Megazyme) após incubação do sobrenadante da cultura em tampão de acetato de sódio 20 mM, pH 4,5, durante 10 minutos a uma determinada temperatura (80 °C ou 84 °C com 4 °C como referência) para determinar a atividade remanescente. Selecionou-se os clones com atividade remanescente mais elevada do que a variante de origem e se determinou a sequência. Ensaio de azo-caseína

[0921] Misturou-se 20 microL de amostras com 150 microL de solução de substrato (4 mL de azo-caseína a 12,5% em etanol em 96 mL de acetato de sódio 20 mM, pH 4,5, contendo triton-100 a 0,01% e ZnSO4 0,25 mM) e se incubou durante 4 horas ou mais.

[0922] Após se adicionar 20 microL/poço de solução de ácido tricloroacético (TCA) a 100 %, a placa foi centrifugada e se retirou com uma pipeta 100 microL dos sobrenadantes para medir a A440. Expressão de variantes da protease em Aspergillus oryzae

[0923] Os construtos compreendendo os genes da variante da protease foram usados para construir vetores de expressão para Aspergillus. Os vetores de expressão de Aspergillus consistem em um cassete de expressão baseado no promotor de amilase II neutra de Aspergillus niger fundido com a sequência de líder não traduzida de triose fosfato isomerase (Pna2/tpi) de Aspergillus nidulans e o terminador de amiloglicosidade (Tamg) de Aspergillus niger. Também presente no plasmídeo estava o marcador seletivo amdS de Aspergillus de Aspergillus nidulans permitindo crescimento em acetamida como única fonte de nitrogênio. Os plasmídeos de expressão para as variantes da protease foram transformados em Aspergillus como descrito em Lassen et al. (2001), Appl.

Environ. Microbiol. 67, 4701-4707. Para cada um dos construtos, 10-20 cepas foram isoladas, purificadas e cultivadas em frascos de agitação. Purificação de variantes expressas

1. Ajustar o pH da amostra de fermentação filtrada de 0,22 µm a 4,0.

2. Colocar a amostra em um banho de gelo com agitação magnética. Adicionar (NH4)2SO4 em pequenas alíquotas (correspondentes a (NH4)2SO4 aprox. 2,0-2,2 M não tendo em conta o aumento de volume quando se adiciona o composto).

3. Após a adição final de (NH4)2SO4, incubar a amostra no banho de gelo com agitação magnética suave durante 45 minutos no mínimo.

4. Centrifugação: Centrifugadora Hitachi himac CR20G de Alta Velocidade Refrigerada, equipada com uma cabeça de rotor R20A2, 5 °C, 20.000 rpm, 30 min.

5. Dissolver o precipitado formado em 200 mL de Na-acetato 50 mM pH 4,0.

6. Filtrar a amostra por sucção em vácuo usando uma membrana de 0,22 µm PES PLUS (IWAKI).

7. Remover os sais/trocar o tampão da amostra para Na- acetato 50 mM pH 4,0 usando ultrafiltração (Vivacell 250 da Vivascience equipada com uma membrana de 5 kDa MWCO PES) durante a noite em uma sala fria. Diluir a amostra retentada para 200 mL usando Na-acetato 50 mM pH 4,0. A condutividade da amostra é preferencialmente inferior a 5 mS/cm.

8. Carregar a amostra em uma coluna de permuta catiônica equilibrada Na-acetate 50 mM pH 4,0. Lavar a amostra não ligada à coluna para fora desta usando o volume correspondente a 3 colunas de tampão de ligação (Na-acetato 50 mM pH 4,0), e eluir a amostra usando um gradiente linear, tampão de eluição de 0-100% (Na-acetato 50 mM + NaCl 1 M pH 4,0) em um volume correspondente a 10 colunas.

9. As frações recolhidas são avaliadas por meio de um ensaio de endoprotease (comparar com abaixo) seguido de SDS-PAGE padrão (condições redutoras) em frações selecionadas. As frações são reunidas com base no ensaio de endoprotease e SDS-PAGE. Ensaio de endoprotease

1. Dissolve-se um comprimido de Protazyme OL/5 mL de Na-acetato 250 mM pH 5,0 por meio de agitação magnética (substrato: comprimido de endoprotease Protazyme AK da Megazyme – cat. # PRAK 11/08).

2. Com agitação, se transfere 250 microL de solução de substrato para um tubo Eppendorf de 1,5 mL.

3. Adiciona-se 25 microL de amostra a cada tubo (o branco é o tampão da amostra).

4. Os tubos são incubados em um Thermomixer com agitação (1000 rpm) a 50 °C durante 15 minutos.

5. Adiciona-se 250 microL de NaOH 1 M a cada tubo, se seguindo agitação em vórtex.

6. Centrifugação durante 3 minutos a 16.100 × G e 25 °C.

7. Transfere-se 200 microL do sobrenadante para uma MTP, e se registra a absorvância a 590 nm. Resultados

[0924] Tabela 2. Atividade relativa de variantes de proteases. A numeração da(s) substituição/substituições começa no N- terminal do peptídeo maduro nos aminoácidos 1 a 177 da SEQ ID NO: 3 Atividade relativa Variante Substituição/Substituições 65 °C/60 °C

TS nenhuma 31% JTP004 S87P 45% JTP005 A112P 43% JTP008 R2P 71% JTP009 D79K 69% JTP010 D79L 75% JTP011 D79M 73% JTP012 D79L/S87P 86% JTP013 D79L/S87P/A112P 90% JTP014 D79L/S87P/A112P 88% JTP016 A73C 52% JTP019 A126V 69% JTP021 M152R 59%

[0925] Tabela 3. Atividade relativa de variantes de proteases. A numeração da(s) substituição/substituições começa no N- terminal do peptídeo maduro nos aminoácidos 1 a 177 da SEQ ID NO: 3 Atividade relativa Substituição/Substituições 75 75 Variante 70 °C/65 e/ou deleção (S) °C/65 °C/70 °C °C °C TS nenhuma 59% 17% JTP036 D79L/S87P/D142L 73% 73% JTP040 T54R/D79L/S87P 71% JTP042 Q53K/D79L/S87P/I173V 108% JTP043 Q53R/D79L/S87P 80% JTP045 S41R/D79L/S87P 82% JTP046 D79L/S87P/Q158W 96%

JTP047 D79L/S87P/S157K 85% JTP048 D79L/S87P/D104R 88% JTP050 D79L/S87P/A112P/D142L 88% S41R/D79L/S87P/A112P/D14 102% JTP051 2L D79L/S87P/A112P/D142L/S1 111% JTP052 57K S41R/D79L/S87P/A112P/D14 113% JTP053 2L/S157K JTP054 ΔS5/D79L/S87P 92% JTP055 ΔG8/D79L/S87P 95% JTP059 C6R/D79L/S87P 92% JTP061 T46R/D79L/S87P 111% JTP063 S49R/D79L/S87P 94% JTP064 D79L/S87P/N88R 92% JTP068 D79L/S87P/T114P 99% JTP069 D79L/S87P/S115R 103% JTP071 D79L/S87P/T116V 105% JTP072 N26R/D79L/S87P 92% A27K/D79L/S87P/A112P/D14 106% JTP077 2L A27V/D79L/S87P/A112P/D14 100% JTP078 2L A27G/D79L/S87P/A112P/D14 104% JTP079 2L

[0926] Tabela 4. Atividade relativa de variantes de proteases. A numeração da(s) substituição/substituições começa no N- terminal do peptídeo maduro nos aminoácidos 1 a 177 da SEQ ID NO: 3

Atividade Atividade Variante Substituição(ções) e/ou deleção(ções) relativa remanescente 75 °C/65 °C 80 °C 84 °C JTP082 ΔS5/D79L/S87P/A112P/D142L 129% 53% JTP083 T46R/D79L/S87P/A112P/D142L 126% JTP088 Y43F/D79L/S87P/A112P/D142L 119% JTP090 D79L/S87P/A112P/T124L/D142L 141% JTP091 D79L/S87P/A112P/T124V/D142L 154% 43% JTP092 ΔS5/N26R/D79L/S87P/A112P/D142L 60% JTP095 N26R/T46R/D79L/S87P/A112P/D142L 62% JTP096 T46R/D79L/S87P/T116V/D142L 67% JTP099 D79L/P81R/S87P/A112P/D142L 80% JTP101 A27K/D79L/S87P/A112P/T124V/D142L 81% JTP116 D79L/Y82F/S87P/A112P/T124V/D142L 59% JTP117 D79L/Y82F/S87P/A112P/T124V/D142L 94% JTP127 D79L/S87P/A112P/T124V/A126V/D142L 53%

[0927] Tabela 5. Atividade relativa de variantes de proteases. A numeração da(s) substituição/substituições começa no N- terminal do peptídeo maduro nos aminoácidos 1 a 177 da SEQ ID NO: 3 Atividade relativa Variante Substituições 75oC/ 80oC/70oC 85oC/70oC 70oC JTP050 D79L S87P A112P D142L 55% 23% 9% JTP134 D79L Y82F S87P A112P D142L 40% JTP135 S38T D79L S87P A112P A126V D142L 62% JTP136 D79L Y82F S87P A112P A126V D142L 59% JTP137 A27K D79L S87P A112P A126V D142L 54% JTP140 D79L S87P N98C A112P G135C D142L 81% JTP141 D79L S87P A112P D142L T141C M161C 68% JTP143 S36P D79L S87P A112P D142L 69% JTP144 A37P D79L S87P A112P D142L 57%

JTP145 S49P D79L S87P A112P D142L 82% 59% JTP146 S50P D79L S87P A112P D142L 83% 63% JTP148 D79L S87P D104P A112P D142L 76% 64% JTP161 D79L Y82F S87G A112P D142L 30% 12% S70V D79L Y82F S87G Y97W A112P JTP180 52% D142L D79L Y82F S87G Y97W D104P A112P JTP181 45% D142L JTP187 S70V D79L Y82F S87G A112P D142L 45% JTP188 D79L Y82F S87G D104P A112P D142L 43% JTP189 D79L Y82F S87G A112P A126V D142L 46% Y82F S87G S70V D79L D104P A112P JTP193 15% D142L Y82F S87G D79L D104P A112P A126V JTP194 22% D142L A27K D79L Y82F S87G D104P A112P JTP196 18% A126V D142L

[0928] Tabela 6. Atividade relativa de variantes de proteases. A numeração da(s) substituição/substituições começa no N- terminal do peptídeo maduro nos aminoácidos 1 a 177 da SEQ ID NO: 3 Atividade relativa Variante Substituições 75oC/70oC 80oC/70oC A27K D79L Y82F S87G D104P JTP196 A112P A126V D142L 102% 55% A27K Y82F S87G D104P A112P JTP210 A126V D142L 107% 36% A27K D79L Y82F D104P A112P JTP211 A126V D142L 94% 44%

A27K Y82F D104P A112P A126V JTP213 D142L 103% 37% Exemplo 3: Perfil de temperatura de variantes selecionadas usando enzimas purificadas

[0929] Purificou-se variantes selecionadas que apresentavam boa termoestabilidade e se usou as enzimas purificadas em uma tese de zeína-BCA como descrito abaixo. A atividade remanescente da protease foi determinada a 60 °C após incubação da enzima a temperaturas elevadas tal como indicado para 60 minutos. Ensaio da Zeína-BCA:

[0930] O teste da Zeína-BCA foi efetuado para detectar a quantificação de proteínas solúveis liberadas da zeína por variantes da protease a várias temperaturas.

[0931] Protocolo: 1） Misturar 10 uL de soluções enzimáticas a 10 ug/mL e 100 uL de solução de zeína a 0,025% em uma placa de microtitulação (MTP).

2） Incubar a várias temperaturas durante 60 minutos.

3） Adicionar 10 uL de solução de ácido tricloroacético (TCA) a 100% (TCA).

4） Centrifugar a MTP a 3500 rpm durante 5 minutos.

5） Retirar 15 uL para uma nova MTP contendo 100 uL de solução de teste BCA (Pierce Cat#:23225, "Kit" de Teste de Proteínas com BCA).

6） Incubar durante 30 minutos a 60 °C.

7） Medir A562.

[0932] Os resultados são mostrados na Tabela 7. Todas as variantes testadas mostraram uma melhoria da termoestabilidade em comparação com a protease do tipo selvagem.

[0933] Tabela 7. Ensaio da Zeína-BCA WT/Variante Amostra incubada durante 60 minutos às temperaturas indicadas (°C) (µg/mL de peptídeo liberado, equivalente a Albumina do soro bovino) 60°C 70°C 75°C 80°C 85°C 90°C 95°C TS 94 103 107 93 58 38 JTP050 86 101 107 107 104 63 36 JTP077 82 94 104 105 99 56 31 JTP188 71 83 86 93 100 75 53 JTP196 87 99 103 106 117 90 38 Exemplo 4: Caracterização de glucoamilase de Penicillium oxalicum

[0934] A glucoamilase de Penicillium oxalicum é divulgada na SEQ ID NO: 9 neste documento.

[0935] Substrato. Substrato: 1% de amido solúvel (Sigma S-9765) em água desionizada

[0936] Tampão reacional: Tampão acetato 0,1 M a pH 5,3

[0937] Kit de determinação da concentração de glucose: "Kit" de teste da glucose Wako (LabAssay glucose, WAKO, Cat# 298-65701).

[0938] Condições reacionais. Misturou-se 20 microL de amido solúvel e 50 microL de tampão acetato a pH 5,3. Adicionou-se 30 microL de solução enzimática (50 microgramas de proteína enzimática/mL) para um volume final de 100 microL seguida de incubação a 37 °C durante 15 minutos.

[0939] A concentração de glucose foi determinada com "kits" Wako.

[0940] Todo o trabalho foi realizado em paralelo.

[0941] Temperatura ótima. Para avaliar a temperatura ótima da glucoamilase de Penicillium oxalicum o ensaio das "Condições reacionais" descrito acima foi efetuado a 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90 e 95 °C. Os resultados são apresentados na Tabela 8.

[0942] Tabela 8. Temperatura ótima Temperatura 20 30 40 50 60 70 80 85 90 95 (°C) Atividade 63,6 71,7 86,4 99,4 94,6 100,0 92,9 92,5 82,7 82,8 relativa (%)

[0943] A partir dos resultados, pode se verificar que a temperatura ótima para a glucoamilase de Penicillium oxalicum nas condições fornecidas se encontra entre 50 °C e 70 °C, e a glucoamilase mantém mais de 80% da atividade a 95 °C.

[0944] Estabilidade térmica. Para avaliar a estabilidade térmica da glucoamilase de Penicillium oxalicum, o teste das Condições reacionais foi modificado na pré-incubação da solução enzimática e do tampão de acetato durante 15 minutos a 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90 e 95 °C. Depois da incubação, se adicionou 20 microL de amido à solução e o teste foi realizado tal como descrito acima.

[0945] Os resultados são mostrados na Tabela 9.

[0946] Tabela 9. Estabilidade térmica Temperatura 20 30 40 50 60 70 80 85 90 95 (°C) Atividade 91,0 92,9 88,1 100,0 96,9 86,0 34,8 36,0 34,2 34,8 relativa (%)

[0947] A partir dos resultados pode se verificar que a glucoamilase de Penicillium oxalicum é estável até 70 °C após pré-incubação durante 15 minutos, mantendo mais de 80% da atividade.

[0948] pH ótimo. Para avaliar o pH ótimo da glucoamilase de Penicillium oxalicum o ensaio das Condições reacionais descrito acima foi efetuado a pH 2,0, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 e 11,0. Em vez de se usar o tampão de acetato descrito no ensaio das condições reacionais, se utilizou o seguinte tampão de Ácido succínico 100mM, HEPES, CHES, CAPSO, CaCl2 1mM, KCl 150mM, Triton X-100 a 0,01%, pH austado a 2,0, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 6,0 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 ou 11,0 com HCl ou NaOH.

[0949] Os resultados são mostrados na Tabela 10.

[0950] Tabela 10 pH ótimo pH 2,0 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 Atividade relativa 71,4 78,6 77,0 91,2 84,2 100,0 55,5 66,7 30,9 17,8 15,9 16,1 (%)

[0951] A partir dos resultados, pode se verificar que a glucoamilase de Penicillium oxalicum nas condições fornecidas tem a atividade mais elevada a pH 5,0. A glucoamilase de Penicillium oxalicum é ativa em um intervalo amplo de pH, mantendo mais de 50% de atividade de pH 2 a 7.

[0952] Estabilidade com o pH. Para avaliar a estabilidade térmica da glucoamilase de Penicillium oxalicum, se modificou o ensaio das Condições reacionais na pré-incubação da solução enzimática (50micro g/mL) durante 20 horas em tampões com pH 2,0, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 6,0 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 e 11,0 usando os tampões descritos sob pH ótimo. Após pré-incubação, se adicionou à solução 20 microL de amido solúvel para um volume final de 100 microL e o ensaio foi efetuado como descrito acima.

[0953] Os resultados são mostrados na Tabela 11.

[0954] Tabela 11 estabilidade com o pH pH 2,0 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 Atividade relativa 17,4 98,0 98,0 103,2 100,0 93,4 71,2 90,7 58,7 17,4 17,0 17,2 (%)

[0955] A partir dos resultados pode se verificar que a glucoamilase de Penicillium oxalicum é estável de pH 3 a pH 7 após pré- incubação durante 20 horas, e diminui a sua atividade a pH 8. Exemplo 5: Termoestabilidade da Protease de Pfu

[0956] a termoestabilidade da protease de Pyrococcus furiosus (Pfu S) adquirida à Takara Bio Inc, (Japão) foi testada usando os mesmos métodos que no Exemplo 2. Verificou-se que a termoestabilidade (Atividade Relativa) foi de 110% a (80 °C/70 °C) e de 103% (90 °C/70 °C) a pH 4,5. Exemplo 6: Clonagem do gene da glucoamilase da cepa de Penicillium oxalicum Preparação de cDNA da cepa de Penicillium oxalicum

[0957] O cDNA foi sintetizado seguindo as instruções da Amplificação Rápida de 3' do Sistema Terminal de cDNAA (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, EUA). Clonagem do gene da glucoamilase da cepa de Penicillium oxalicum.

[0958] O gene da gluoamilase de Penicillium oxalicum foi clonado usando o iniciador de oligonucleotídio apresentado abaixo, concebido para amplificar o gene da glucoamilase a partir da extremidade 5'.

[0959] Iniciador senso: 5’- ATGCGTCTCACTCTATTATCAGGTG-3’ (SEQ ID NO: 22)

[0960] O gene de comprimento total foi amplificado por PCR com Iniciador senso e AUAP (fornecido pela Amplificação Rápida de 3' do Sistema Terminal de cDNA End System) utilizando Taq DNA polimerase Platinum HIFI (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, EUA). A reação de amplificação foi composta por 5 µL de tampão PCR 10x, 2 µL de MgCl 2 25mM, 1 µL de dNTP 10mM, 1 µL de Iniciador senso 10uM, 1 µL de AUAP 10 uM, 2 µL da primeira cadeia de cDNA, 0,5 µL de HIFI Taq, e 37,5 µL de água desionizada. O programa dePCR foi: 94 °C, 3minutos; 10 ciclos de 94 °C durante 40s, 60 °C 40s com diminuição de 1 °C por ciclo, 68 °C durante 2 minutos; 25 ciclos de 94 °C durante 40s, 50 °C durante 40s, 68 °C durante 2 minutos; extensão final a 68 °C durante 10 minutos.

[0961] O fragmento obtido da PCR foi clonado no vetor pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, EUA) usando um Sistema de Vetores pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, EUA) para gerar o plasmídeo AMG 1. O gene da glucoamilase inserido no plasmídeo AMG 1 foi confirmado por sequenciamento. A cepa de E. coli TOP10 contendo o plasmídeo AMG 1 (designado NN059173), foi despositado na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) a 23 de novembro de 2009, e foi-lhe atribuído o número de acesso DSM 23123. Exemplo 7: Expressão da glucoamilase de Penicillium oxalicum clonada

[0962] O gene da gluoamilase de Penicillium oxalicum foi reclonado a partir do plasmídeo AMG 1 em um vetor de expressão de Aspergillus por PCR usando dois iniciadores de clonagem F e o iniciador R, apresentados abaixo, que foram desenhados com base na sequência conhecida e marcadores adicionados para clonagem direta por estratégia IN- FUSIONTM.

[0963] Iniciador F: 5’ ACACAACTGGGGATCCACCATGCGTCTCACTCTATTATC (SEQ ID NO: 23)

[0964] Iniciador R: 5’ AGATCTCGAGAAGCTTAAAACTGCCACACGTCGTTGG (SEQ ID NO: 24)

[0965] Foi efetuada uma reação PCR com o plasmídeo AMG 1 para amplificar o gene de comprimento total. A reação PCR foi composta por 40 µg do plasmídeo AMG 1 DNA, 1 µl de cada iniciador (100 µM); 12,5 µL de mistura principal Extensor Hi-Fidelity 2X (Extensor Hi-Fidelity Master Mix, ABgene, Reino Unido), e 9,5 µL de água de grau PCR. A reação de PCR foi efetuada usando uma máquina DYAD PCR (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA) programada para 2 minutos a 94 °C, seguidos de 25 ciclos de 94 °C durante 15 segundos, 50 °C durante 30 segundos, e 72 °C durante 1 minuto; e então 10 minutos a 72 °C.

[0966] Os produtos reacionais foram isolados por meio de eletroforese em gel de agarose a 1,0 % usando tampão TAE 1 x onde uma banda de produto de PCR de aproximadamente 1,9 kb foi excisada do gel e purificada usando um "Kit" de Purificação DNA e Banda de Gel GFX® PCR (GE Healthcare, Reino Unido) de acordo com as instruções do fabricante. O DNA correspondente ao gene da glucoamilase de Penicillium oxalicum foi clonado em um vetor de expressão de Aspergillus linearizado com BamHI e HindIII, usando um "Kit" de Clonagem por PCR Dry-Down IN-FUSIONTM (BD Biosciences, Palo Alto, CA, EUA) de acordo com a instrução do fabricante. A construção do vetor linearizado é tal como descrita em WO 2005/042735 A1.

[0967] Usou-se um volume de 2 µL da mistura de ligação para transformar 25 µL de céulas de E. coli Fusion Blue (incluídas no "Kit" de Clonagem por PCR Dry-Down IN-FUSIONTM). Após um choque de calor a 42 °C durante 45 seg, e resfriamento em gelo, 250 µL de meio SOC foram adicionados, e as células foram incubadas a 37 °C a 225 rpm durante 90 min antes de serem plaqueadas em placas LB ágar contendo 50 µg de ampicilina por mL, e cultivadas durante a noite a 37 °C. Colônias selecionadas foram inoculadas em 3 mL de meio LB suplementado com 50 µg de ampicilina por mL e incubadas a 37 °C a 225 rpm durante a noite. Purificou-se DNA de plasmídeo das colônias selecionadas usando o Mini JETSTAR (Genomed, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. A sequência do gene da glucoamilase de Penicillium oxalicum foi verificada por sequenciamento de Sanger antes de expressão heteróloga. Um dos plasmídeos foi selecionado para expressão adicional, e foi denominado XYZ XYZ1471-4.

[0968] Preparou-se protoplastos de Aspergillus niger MBin118 como descrito em WO 95/02043. Misturou-se cem µL de suspensão de protoplastos com 2,5 µg do plasmídeo XYZ1471-4 e se adicionou suavemente 250 microlitros de PEG 4000 a 60 % (Applichem) (polietilenoglicol, peso molecular 4.000), CaCl2 10 mM, e Tris-HCl 10 mM pH 7,5. A mistura foi incubada a 37 °C por 30 minutos e os protoplastos foram misturados com 6% de agarose com baixo ponto de fusão (Biowhittaker Molecular Applications) em placas de sacarose COVE (Cove, 1996, Biochim. Biophim. Biophys. Acta 133: 51-56) (1M) suplementadas com 10 mM de acetamida e 15 mM de CsCl e adicionados como camada superior em placas de sacarose COVE (1M) suplementadas com 10 mM de acetamida e 15 mM de CsCl para seleção de transformantes (4 mL de topagar por placa). Após incubação durante 5 dias a 37 °C os esporos de dezesseis transformantes foram apanhados e inoculados em 750 µL de meio YP contendo 2% de Maltose em placas de MT de 96 poços profundos. Após 5 dias de cultura estacionária a 30 °C, se analisou 10 µL do caldo de cultura de cada poço em gel de SDS-PAGE (Eletroforese em gel de dodecilsulfato de sódio- poliacrilamida), gel pré-fabricado Griton XT (BioRad, CA, EUA) para identificar os melhores transformantes com base na capacidade para produzir uma grande quantidade de glucoamilase. Foi identificado um transformante selecionado na placa de transformação original e se preservou como esporos em um estoque de glicerol a 20%, tendo se armazenado congelado (-80 °C).

[0969] Cultivo. O transformante selecionado foi inoculado em 100mL de meio MLC e cultivado a 30 °C durante 2 dias em frascos de agitação de 500 mL em um agitador rotativo. 3 mL do caldo de cultura foram inoculados em 100 mL de meio M410 e cultivados a 30 °C durante 3 dias. O caldo de cultura foi centrifugado e o sobrenadante foi filtrado usando filtros de membrana de 0,2 µm.

[0970] Gel de afinidade de alfa-ciclodextrina. Dez gramas de pó de Sepharose 6B ativada por Epoxi (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, R.U.) foram suspensos em e lavados com água destilada em um filtro de vidro sinterizado. O gel foi suspenso em solução de acoplamento (100 mL de alfa-ciclodextrina a 12,5 mg/mL, NaOH a 0,5 M) e incubado à temperatura ambiente durante um dia com agitação suave. O gel foi lavado com água destilada em um filtro de vidro sinterizado, suspenso em 100 mL de etanolamina a 1 M, pH 10, e incubado a 50 °C durante 4 horas para bloqueio. O gel foi depois lavado várias vezes usando Tris-HCl a 50 mM, pH 8 e NaOAc a 50 mM, pH 4,0 alternativamente. O gel foi finalmente empacotado em uma coluna de 35-40 mL usando tampão de equilíbrio (NaOAc a 50 mM, NaCl a 150 mM, pH 4,5).

[0971] Purificação de glucoamilase do caldo de cultura. Caldo de cultura da fermentação de A. niger MBin118 transportando o gene da glucoamilase foi filtrado através de um filtro PES de 0,22 µm, e aplicado a uma coluna de gel de afinidade de alfa-ciclodextrina previamente equilibrada em tampão NaOAc a 50 mM, NaCl a 150 mM, pH 4,5. O material não ligado foi lavado para forma da coluna com tampão de equilíbrio e a glucoamilase foi eluída usando o mesmo tampão contendo beta-ciclodextrina a 10 mM ao longo de 3 volumes da coluna.

[0972] A atividade de glucoamilase do eluente foi checada para se ver se a glucoamilase se tinha ligado ao gel de afinidade de alfa- ciclodextrina. A amostra de glucoamilase purificada foi depois dialisada contra NaOAc a 20 mM, pH 5,0. A pureza foi finalmente checada por SDS- PAGE, e foi somente encontrada uma banda.

[0973] Exemplo 8: Construção e expressão de uma variante sítio-dirigida de glucoamilase de Penicillium oxalicum

[0974] Foram realizadas duas reações de PCR com o plasmídeo XYZ1471-4, descrito no Exemplo 7, usando os iniciadores K79V F e K79VR apresentados abaixo, que foram concebidos para substituir a lisina K na posição 79 da sequência madura por valina (V) e os iniciadores F-NP003940 e R-NP003940 apresentados abaixo, que foram concebidos com base na sequência conhecida e marcadores adicionados para clonagem direta por estratégia IN-FUSIONTM.

[0975] Iniciador K79V F 18mer GCAGTCTTTCCAATTGAC (SEQ ID NO: 25)

[0976] Iniciador K79V R 18mer AATTGGAAAGACTGCCCG (SEQ ID NO: 26)

[0977] Iniciador F-NP003940: 5’ ACACAACTGGGGATCCACCATGCGTCTCACTCTATTATC (SEQ ID NO: 27)

[0978] Iniciador R-NP003940: 5’ AGATCTCGAGAAGCTTAAAACTGCCACACGTCGTTGG (SEQ ID NO: 28)

[0979] A PCR foi realizada usando um Dispositivo de DNA PTC-200 nas condições descritas abaixo.

Sistema de reação PCR: Condições: 48,5 microL H2O 1 94 °C 2 min 2 94 °C 30 s

2 pérolas Pérolas puRe Taq Ready- 3 55 °C 30 s To-Go PCR (Amersham Biosciences) 4 72 °C 90 s 0,5 microL X 2 Iniciadores 100 2-4 25 ciclos pmole/microL 5 72 °C 10 min (K79V F + Iniciador R-NP003940, K79V R + Iniciador F-NP003940) 0,5 microL DNA molde

[0980] Os fragmentos de DNA foram recuperados do gel de agarose pelo Estojo de extração em gel da Qiagen de acordo com a instrução do fabricante. Os dois fragmentos purificados resultantes foram clonados em um vetor de expressão de Aspergillus linearizado com BamHI e HindIII, usando um Kit de Clonagem por PCR Dry-Down IN-FUSIONTM (BD Biosciences, Palo Alto, CA, EUA) de acordo com a instrução do fabricante. A construção do vetor linearizado é tal como descrita em WO 2005/042735 A1.

[0981] A mistura de ligação foi usada para transformar células de E. coli DH5α (TOYOBO). As colônias selecionadas foram inoculadas em 3 mL de meio LB suplementado com 50 µg de ampicilina por mL e incubadas a 37 °C a 225 rpm durante a noite. DNA de plasmídeo das colônias selecionadas foi purificado usando mini estojo de plasmídeo Qiagen (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. A sequência do gene da variante sítio-dirigida da glucoamilase de Penicillium oxalicum foi verificada antes de expressão heteróloga e um dos plasmídeos foi selecionado para expressão adicional, e foi denominado pPoPE001.

[0982] Preparou-se protoplastos de Aspergillus niger MBin118 como descrito em WO 95/02043. Misturou-se cem µL de suspensão de protoplastos com 2,5 µg do plasmídeo pPoPE001 e se adicionou suavemente 250 microlitros de PEG 4000 a 60 % (Applichem) (polietilenoglicol, peso molecular 4.000), CaCl2 10 mM, e Tris-HCl 10 mM pH

7,5. A mistura foi incubada a 37 °C por 30 minutos e os protoplastos foram misturados com 1% de agarose L (Nippon Gene) em sacarose COVE (Cove, 1996, Biochim. Biophim. Biophys. Acta 133: 51-56) suplementadas com 10 mM de acetamida e 15 mM de CsCl e adicionados como camada superior em placas de sacarose COVE suplementadas com 10 mM de acetamida e 15 mM de CsCl para seleção de transformantes (4 mL de topagar por placa). Após incubação durante 5 dias a 37 °C os esporos de dezesseis transformantes foram apanhados e inoculados em 750 µL de meio YP contendo 2% de Maltose em placas de MT de 96 poços profundos. Após 5 dias de cultura estacionária a 30 °C, se analisou 10 µL do caldo de cultura de cada poço em gel de SDS-PAGE para identificar os melhores transformantes com base na capacidade para produzir uma grande quantidade da glucoamilase. Exemplo 9: Purificação da variante PE001 de Po AMG sítio-dirigida

[0983] O transformante selecionado da variante e a cepa que expressa a glucoamilase de Penicillium oxalicum do tipo selvagem descritos no Exemplo 6 foram cultivados em 100 mL de meio YP com 2% de maltose e a cultura foi filtrada através de um filtro PES de 0,22 µm, e aplicada a uma coluna de gel de afinidade de alfa-ciclodextrina previamente equilibrada em tampão NaOAc 50 mM, NaCl 150 mM, pH 4,5. Os materiais não ligados foram lavados para forma da coluna com tampão de equilíbrio e a glucoamilase foi eluída usando o mesmo tampão contendo beta- ciclodextrina 10 mM com um volume correspondente a 3 colunas.

[0984] A atividade de glucoamilase do eluente foi checada para se ver se a glucoamilase se tinha ligado ao gel de afinidade de alfa- ciclodextrina. As amostras de glucoamilase purificadas foram depois dialisadas contra NaOAc a 20 mM, pH 5,0. Exemplo 10: Caracterização da estabilidade da Protease PE001

[0985] Misturou-se 40 µL de soluções enzimáticas (1 mg/mL) em tampão de acetato de sódio 50 mM, pH 4,5, com 1/10 de volume de soluções de protease a 1mg/mL como aspergillopepsina I descrita em Biochem J. abril de 1975; 147(1):45-53, ou o produto disponível comercialmente na Sigma e aorsina descrita em Biochemical journal [0264- 6021] Ichishima yr: 2003 vol:371 edição:Pt 2 pág.:541 e se incubou a 4 ou 32 °C durante a noite. Como experimento de controle, se adicionou H2O à amostra em vez de proteases. As amostras foram carregadas em SDS- PAGE para verificar se as glucoamilases são clivadas pelas proteases.

[0986] Na SDS-PAGE, a PE001 apenas apresentou uma banda correspondente à molécula intacta, enquanto que a glucoamilase de tipo selvagem foi degradada pelas proteases e apresentou uma banda a um tamanho molecular inferior de 60 kCa.

[0987] Tabela 12. O resultado de SDS-PAGE após tratamento com protease Gucoamilase do tipo selvagem PE001 controle Protease aspergilopepsina I aorsina aspergilopepsina aorsina

I Temperatura 4 32 4 32 4 32 4 32 4 de incubação (°C) glucoamilase 100% 90% 40% 10% 100% 100% 100 100 100% intacta % % (ca. 70 kDa) glucoamilase N.D. 10% 60% 90% N.D. N.D. N.D N.D N.D. clivada (ca. 60 . . kDa)

[0988] N.D.: não detectado. Exemplo 11: Menos clivagem durante a cultura

[0989] O transformante de Aspergillus da variante e a glucoamilase de Penicillium oxalicum do tipo selvagem foram cultivados em placas de MT de 6 poços contendo meio diluído 4X YP com 2% de maltose complementado com tampão de acetato de sódio 10 mM, pH4,5, a 32 °C durante 1 semana.

[0990] Os sobrenadantes da cultura foram carregados em SDS-PAGE.

[0991] Tabela 13. O resultado de SDS-PAGE dos sobrenadantes da cultura Gucoamilase do tipo PE001 selvagem glucoamilase 90% 100% intacta (ca. 70 kDa) glucoamilase 10% N.D. clivada (ca. 60 kDa)

[0992] N.D.: não detectado.

[0993] A glucoamilase do tipo selvagem foi clivada por proteases hospedeiras durante a fermentação, enquanto que a variante deu origem apenas à molécula intacta. Exemplo 12: Atividade de glucoamilase da variante em comparação com a original

[0994] A atividade da glucoamilase medida como AGU tal como descrito acima, foi verificada para enzimas purificadas de Penicillium oxalicum do tipo selvagem e para a variante da glucoamilase.

[0995] A Unidade de Glucoamilase (AGU) foi definida como a quantidade de enzima que hidrolisa 1 micromole de maltose por minuto sob as condições padrão (37 °C, pH 4,3, substrato: maltose 100 mM, tampão: acetato 0,1 M, tempo de reação 6 minutos).

[0996] Tabela 14. Atividade específica relativa AGU/mg peso de Penicillium oxalicum 100 % Penicillium oxalicum PE001 (SEQ ID 102 % NO: 14 + substituição K79V) Exemplo 13: Purificação de variantes da glucoamilase com termoestabilidade aumentada

[0997] As variantes que apresentam um aumento da termoestabilidade podem ser construídas e expressas de forma semelhante ao procedimento descrito no Exemplo 8. Todas as variantes foram derivadas de PE001. Após expressão em meio YPM, as variantes compreendendo a substituição T65A ou Q327F foram micropurificadas como se segue:

[0998] O micélio foi removido por filtração através de um filtro de 0,22 µm. Adicionou-se 50 µL de material de coluna (alfa-ciclodextrina acoplada a meio de agarose ativado com divinilsulfona Mini-Fugas de acordo com as recomendações do fabricante) aos poços de uma placa de filtração (Whatman, Unifilter 800 µL, 25-30 µm MBPP). O material de coluna foi equilibrado com tampão de ligação (acetato de sódio 200 mM pH 4,5) por meio de duas adições de 200 µL de tampão, agitação vigorosa durante 10 minutos (Heidolph, Titramax 101, 1000 rpm) e remoção do tampão com vácuo (Whatman, UniVac 3). Posteriormente, se adicionou 400 µL de sobrenadante da cultura e 100 µL de tampão de ligação, e aplaca foi incubada durante 30 minutos com agitação vigorosa. O material não ligado foi removido com vácuo e a etapa de ligação foi repetida. Normalmente foram utilizados 4 poços por variante. Foram então efetuadas três etapas de lavagem com a adição de 200 µL de tampão de força iônica decrescente (acetato de sódio 50/10/5 mM, pH 4,5), agitação durante 15 minutos e remoção do tampão em vácuo. A eluição do AMG foi conseguida com a dupla adição de 100 µL de tampão de eluição (acetato de sódio 250 mM, alfa- ciclodextrina a 0,1%, pH 6,0), agitação durante 15 minutos e coleta do material eluído em uma placa de microtitulação com vácuo. Os eluatos reunidos foram concentrados e se mudou o tampão para acetato de sódio 50 mM pH 4,5 usando unidades de filtração centrífuga com 10 kDa de corte (Millipore Microcon Ultracel YM-10). As amostras micopurificadas foram armazenadas a -18 °C até ao teste da termoestabilidade. Exemplo 14: Análise de desenovelamento térmico de proteína (TSA, Ensaio de deslocamento térmico)

[0999] O desdobramento térmico das proteínas das variantes T65A e Q327F, foi monitorizado usando Sypro Orange (In-vitrogen, S-6650) e foi efetuado usando um instrumento de PCR em tempo real (Applied Biosystems; Step-One-Plus).

[1000] Em uma placa de 96 poços, se misturou 25 microlitros de amostra micropurificada em Acetato 50 mM pH4,5 a aprox. 100 microgramas/mL (5:1) com Sypro Orange (conc. resultante = 5X; solução estoque do fornecedor = 5000X). A placa foi selada com um selo de PCR ótico. O instrumento de PCR foi fixado a uma taxa de escaneamento de 76 °C por hora, começando a 25 °C e terminando a 96 °C.

[1001] O desdobramento térmico das proteínas da variante E501V + Y504T, foi monitorizado usando Sypro Orange (In-vitrogen, S-6650) e foi efetuado usando um instrumento de PCR em tempo real (Applied Biosystems; Step-One-Plus).

[1002] Em uma placa de 96 poços, se misturou 15 microlitros de amostra purificada em Acetato 50 mM pH4,5 a aprox. 50 microgramas/mL (1:1) com Sypro Orange (conc. resultante = 5X; solução estoque do fornecedor = 5000X) com ou sem 200 ppm de Acarbose (Sigma A8980). A placa foi selada com um selo de PCR ótico. O instrumento de PCR foi fixado a uma taxa de escaneamento de 76 graus C por hora, começando a 25 °C e terminando a 96 °C.

[1003] A fluorescência foi monitorada a cada 20 segundos usando luz azul LED embutida para excitação e um filtro ROX (610 nm, emissão).

[1004] Os valores de Tm foram calculados como o valor máximo da primeira derivada (dF/dK) (ref.: Gregory et al; J Biomol Screen 2009 14: 700.)

[1005] Tabela 15a. ----------------------------------------------------------------------- Amostra Tm (Graus Celsius) +/-0,4 PO-AMG (PE001) 80,3 Variante Q327F 82,3 Variante T65A 81,9 Tabela 15b. ----------------------------------------------------------------------- Amostra Tm (Graus Celsius) +/-0,4 Acarbose: - + PO-AMG (PE001) 79,5 86,9 Variante E501V Y504T 79,5 95,2 Exemplo 15: Análise da termoestabilidade por Calorimetria de Escaneamento Diferencial (DSC)

[1006] Construiu-se variantes sítio-específicas adicionais com substituições e /ou deleções em posições específicas basicamente como descrito no Exemplo 8 e se purificou como descrito no Exemplo 11.

[1007] A termoestabilidade das variantes derivadas do Po- AMG PE001 purificadas foi determinada a pH 4,0 ou 4,8 (Acetato de Sódio

50 mM) por Calorimetria de Escaneamento Diferencial (DSC) usando um Calorímetro de Escaneamento Diferencial Capilar VP (MicroCal Inc., Piscataway, NJ, EUA). A temperatura de desnaturação térmica, Td (°C), foi tomada como o topo do pico de desnaturação (principal pico endotérmico) em termogramas (Cp vs. T) obtidos após aquecimento das soluções de enzima em tampões selecionados (aacetato de sódio 50 mM, pH 4,0 ou 4,8) a uma taxa de aquecimento programada constante de 200 K/hr.

[1008] Soluções de amostra e de referência (aproximadamente 0,3 mL) foram carregadas para o calorímetro (referência: tampão sem enzima) das condições de armazenamento a 10 °C e termicamente pré-equilibrada por 10 minutos a 20 °C antes da varredura DSC de 20 °C a 110 °C. As temperaturas de desnaturação foram determinadas com uma precisão de cerca de +/- 1 °C.

[1009] As variantes isoladas e os dados de DSC são divulgados na Tabela 16 abaixo.

[1010] Tabela 16. nome Po- Mutações DSC Td (°C) DSC Td (°C) AMG @ pH 4,0 @ pH 4,8 PE001 (SEQ 82,1 83,4 ID NO: 14 +K79V) GA167 E501V Y504T 82,1 GA481 T65A K161S 84,1 86,0 GA487 T65A Q405T 83,2 GA490 T65A Q327W 87,3 GA491 T65A Q327F 87,7 GA492 T65A Q327Y 87,3 GA493 P11F T65A Q327F 87,8 88,5

GA497 R1K D3W K5Q G7V N8S 87,8 88,0 T10K P11S T65A Q327F GA498 P2N P4S P11F T65A Q327F 88,3 88,4 GA003 P11F D26C K33C T65A 83,3 84,0 Q327F GA009 P2N P4S P11F T65A Q327W 88,8 E501V Y504T GA002 R1E D3N P4G G6R G7A N8A 87,5 88,2 T10D P11D T65A Q327F GA005 P11F T65A Q327W 87,4 88,0 GA008 P2N P4S P11F T65A Q327F 89,4 90,2 E501V Y504T GA010 P11F T65A Q327W E501V 89,7 Y504T GA507 T65A Q327F E501V Y504T 89,3 GA513 T65A S105P Q327W 87,0 GA514 T65A S105P Q327F 87,4 GA515 T65A Q327W S364P 87,8 GA516 T65A Q327F S364P 88,0 GA517 T65A S103N Q327F 88,9 GA022 P2N P4S P11F K34Y T65A 89,7 Q327F GA023 P2N P4S P11F T65A Q327F 89,9 D445N V447S GA032 P2N P4S P11F T65A I172V 88,7 Q327F GA049 P2N P4S P11F T65A Q327F 88,4 N502*

GA055 P2N P4S P11F T65A Q327F 88,0 N502T P563S K571E GA057 P2N P4S P11F R31S K33V 89,5 T65A Q327F N564D K571S GA058 P2N P4S P11F T65A Q327F 88,6 S377T GA064 P2N P4S P11F T65A V325T 88,0 Q327W GA068 P2N P4S P11F T65A Q327F 90,2 D445N V447S E501V Y504T GA069 P2N P4S P11F T65A I172V 90,2 Q327F E501V Y504T GA073 P2N P4S P11F T65A Q327F 90,1 S377T E501V Y504T GA074 P2N P4S P11F D26N K34Y 89,1 T65A Q327F GA076 P2N P4S P11F T65A Q327F 90,2 I375A E501V Y504T GA079 P2N P4S P11F T65A K218A 90,9 K221D Q327F E501V Y504T GA085 P2N P4S P11F T65A S103N 91,3 Q327F E501V Y504T GA086 P2N P4S T10D T65A Q327F 90,4 E501V Y504T GA088 P2N P4S F12Y T65A Q327F 90,4 E501V Y504T GA097 K5A P11F T65A Q327F 90,0 E501V Y504T

GA101 P2N P4S T10E E18N T65A 89,9 Q327F E501V Y504T GA102 P2N T10E E18N T65A 89,8 Q327F E501V Y504T GA084 P2N P4S P11F T65A Q327F 90,5 E501V Y504T T568N GA108 P2N P4S P11F T65A Q327F 88,6 E501V Y504T K524T G526A GA126 P2N P4S P11F K34Y T65A 91,8 Q327F D445N V447S E501V Y504T GA129 P2N P4S P11F R31S K33V 91,7 T65A Q327F D445N V447S E501V Y504T GA087 P2N P4S P11F D26N K34Y 89,8 T65A Q327F E501V Y504T GA091 P2N P4S P11F T65A F80* 89,9 Q327F E501V Y504T GA100 P2N P4S P11F T65A K112S 89,8 Q327F E501V Y504T GA107 P2N P4S P11F T65A Q327F 90,3 E501V Y504T T516P K524T G526A GA110 P2N P4S P11F T65A Q327F 90,6 E501V N502T Y504*

Exemplo 16: Análise da termoestabilidade por meio do teste de estresse térmico e do ensaio de pNPG

[1011] Partindo de uma das variantes de substituição identificadas do Exemplo 15, identificada como GA008, se testou variantes adicionais por meio de um ensaio de estresse térmico em que o sobrenadante de culturas de crescimento foi analisado quanto à atividade da glucoamilase (AMG) após um choque térmico a 83 °C durante 5 minutos.

[1012] Após o choque térmico, se mediu a atividade residual da variante, bem como a de uma amostra não estressada. Descrição do ensaio de atividade de Po-AMG pNPG:

[1013] O ensaio da atividade da glucoamilase de Penicillium oxalicump sobre o pNPG é um ensaio do ponto final espetrométrico em que as amostras são separadas em duas e medidas sob estresse térmico e sem estresse térmico. Os dados resultantes são, por conseguinte, uma medida da atividade residual nas amostras estressadas. Crescimento:

[1014] Adicionou-se a cada poço de uma placa de microtitulação estéril (MTP) 200µL de meio de crescimento rico (FT X-14 sem Dowfax). As cepas de interesse foram inoculadas em triplicado diretamente a partir de estoques congelados nas MTP. Inoculou-se o controle em 20 poços. Os poços não inoculados com meios foram usados como os brancos do ensaio. A MTP foi colocada em uma caixa de plástico contendo tecido úmido para impedir a evaporação dos poços durante a incubação. A caixa de plástico foi colocada a 34 °C durante 4 dias. Ensaio:

[1015] Transferiu-se 50 µL de sobrenadante para 50 µL de NaAc 0,5 M pH 4,8 para se obter um pH correto na amostra.

[1016] Transferiu-se 50 µL da diluição para uma placa de PCR e se provocou um estresse térmico a 83 °C durante 5 minutos em uma máquina de PCR. A restante metade da diluição foi mantida à TA.

[1017] Transferiu-se 20 µL da amostra estressada e não estressada para uma MTP-padrão. Adicionou-se 20µL de substrato pNPG para se começar a reação. A placa foi incubada à TA durante 1 hora.

[1018] A reação foi terminada e a cor revelada por adição de 50 µL de Na2CO3 0,5 M. A cor amarela foi medida em um leitor de placas (Molecular Devices) a 405 nm. Tampões: NaAc 0,5 M pH 4,8 NaAc 0,25 M pH 4,8 Substrato, pNPG 6mM: 15mg de 4-nitrofenil D-glicopiranosídeo em 10 mL de NaAc 0,25 pH 4,8 Solução de terminação/revelação: Na2CO3 0,5 M Tratamento dos dados:

[1019] No Excel, aos dados da linha Abs405 das amostras estressadas e não estressadas foi subtraído o branco com os seus brancos respetivos. A atividade residual (% at. res. = (Absnão estressada –(Absnão estressada – Absestressada))/Absnão estressada *100%) foi calculada e representada graficamente em relação à referência, Po-amg0008.

[1020] Tabela 17. nome Po-AMG Mutações % de atividade residual GA008 P2N P4S P11F T65A 100 Q327F E501V Y504T GA085 P2N P4S P11F T65A 127 S103N Q327F E501V Y504T

GA097 K5A P11F T65A Q327F 106 E501V Y504T GA107 P2N P4S P11F T65A 109 Q327F E501V Y504T T516P K524T G526A GA130 P2N P4S P11F T65A 111 V79A Q327F E501V Y504T GA131 P2N P4S P11F T65A 112 V79G Q327F E501V Y504T GA132 P2N P4S P11F T65A 101 V79I Q327F E501V Y504T GA133 P2N P4S P11F T65A 102 V79L Q327F E501V Y504T GA134 P2N P4S P11F T65A 104 V79S Q327F E501V Y504T GA150 P2N P4S P11F T65A 101 L72V Q327F E501V Y504T GA155 S255N Q327F E501V 105 Y504T

[1021] Tabela 18. nome Po-AMG Mutações % de atividade residual GA008 P2N P4S P11F T65A 100 Q327F E501V Y504T GA179 P2N P4S P11F T65A 108 E74N V79K Q327F E501V Y504T GA180 P2N P4S P11F T65A 108 G220N Q327F E501V Y504T GA181 P2N P4S P11F T65A 102 Y245N Q327F E501V Y504T GA184 P2N P4S P11F T65A 110 Q253N Q327F E501V Y504T GA185 P2N P4S P11F T65A 108 D279N Q327F E501V Y504T GA186 P2N P4S P11F T65A 108 Q327F S359N E501V Y504T GA187 P2N P4S P11F T65A 102 Q327F D370N E501V Y504T GA192 P2N P4S P11F T65A 102 Q327F V460S E501V Y504T

GA193 P2N P4S P11F T65A 102 Q327F V460T P468T E501V Y504T GA195 P2N P4S P11F T65A 103 Q327F T463N E501V Y504T GA196 P2N P4S P11F T65A 106 Q327F S465N E501V Y504T GA198 P2N P4S P11F T65A 106 Q327F T477N E501V Y504T Exemplo 17: Teste da atividade da glucoamilase de variantes termoestáaveis

[1022] Todas as variantes acima descritas divulgadas nas tabelas 15, 16, e 17 foram verificadas quanto à atividade da glucoamilase em sobrenadantes da cultura usando o ensaio do pNPG descrito no Exemplo 16. Exemplo 18: Produção das cepas MBG5038 e MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae

[1023] As cepas MBG5038 e MBG5012 foram derivadas de programas de melhoramento e evolução que visavam melhorar o desempenho da fermentação com relação a características de importância para a produção industrial de etanol de milho. Cepas de uma população com capacidade de utilizar a cisteína como única fonte de nitrogênio e demonstrando melhor tolerância ao etanol e à temperatura foram cruzadas com cepas derivadas de uma população que combinava a utilização de xilose com baixos rendimentos de subprodutos (por exemplo, de acordo com os procedimentos de criação descritos na Patente US 8,257,959). Essas cepas foram cruzadas com cepas derivadas de Ethanol Red® e a descendência foi triada para identificar cepas com maior tolerância à temperatura combinadas com subprodutos reduzidos para maximizar o rendimento de etanol das fermentações de mosto de milho. Os haploides derivados deste programa de melhoramento foram triados quanto à sua capacidade de utilizar cisteína e utilizados para gerar MBG5038 (NRRLY67549) e MBG5038 (NRRLY67700). Exemplo 19: Fermentação da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae sob condições não-estressantes

[1024] As cepas MBG5038 e Ethanol Red® de Saccharomyces cerevisiae foram fermentadas nas seguintes condições: Mistura: Liquozime LpH Sólidos: variados pH: 5,0 Glucoamilose: Spirizyme Achieve (Novozymes A/S) Dose de glucoamilose 0,6 AGU/g DS Divisão de glucoamilose: 50/50 com o restante adicionado às 8 h Tempo de fermentação: 55 h Temp.32 °C Escala: Frasco Ankom de 50 g

[1025] Como mostrado nas Figuras 1 e 2, a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae demonstrou melhores rendimentos de etanol e níveis mais baixos de glicerol quando comparados a Ethanol Red®. Exemplo 20: Fermentação da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae sob condições estressantes

[1026] As cepas MBG5038 e Ethanol Red® de Saccharomyces cerevisiae foram fermentadas nas seguintes condições: Mistura: Avantec Amp

Sólidos 34,51% Glucoamilose: Spirizyme Excel (Novozymes A/S) Dose de glucoamilose: 0,6 AGU/g DS Tempo de fermentação: 54 h Temp.: 32 °C (7 h) → 35 °C (16 h) → 32 °C (31 h) Escala: Tubo de 5 g

[1027] Como mostrado nas Figuras 3 e 4, a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae demonstrou melhor rendimento de etanol e diminuição da glucose residual quando comparado a Ethanol Red® na presença de ácido orgânico (ácido lático/ácido acético). Exemplo 21: Fermentação da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae sob condições não-estressantes

[1028] As cepas MBG5038 e Ethanol Red® de Saccharomyces cerevisiae foram fermentadas nas seguintes condições: Mistura: Avantec Amp suplementado com maltodextrina Sólidos: 35% final (35% liquefato de sólidos + maltodextrina para atingir 38% de sólidos totais) pH: 5,0 Glucoamilose: Spirizyme Excel (Novozymes A/S) Dose de glucoamilose 0,6 AGU/g DS Divisão de glucoamilose: 50/50 com o restante adicionado às 8 h Tempo de fermentação: 54 h Temp. 32 °C Escala: Tubo de 5 g

[1029] Como mostrado nas Figuras 5 e 6, a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae demonstrou melhores rendimentos de etanol e diminuição da glucose residual quando comparados a Ethanol Red®.

Exemplo 22: Fermentação da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae sob condições estressantes

[1030] As cepas MBG5012 e Ethanol Red® de Saccharomyces cerevisiae foram fermentadas nas seguintes condições: Mistura: Avantec Amp Sólidos 34,51% pH: 5,0 Glucoamilose: Spirizyme Excel (Novozymes A/S) Dose de glucoamilose: 0,6 AGU/g DS Tempo de fermentação: 54 h Temp.: 32 °C (7 h) → 35 °C (16 h) → 32 °C (31 h) Escala: Tubo de 5 g

[1031] Como mostrado nas Figuras 7 e 8, a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae demonstrou melhor rendimento de etanol e diminuição da glucose residual quando comparado a Ethanol Red® na presença de ácido orgânico (ácido lático/ácido acético).

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para produzir etanol a partir de material contendo amido, o processo caracterizado por compreender as etapas de: i) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando uma alfa- amilase; ii) sacarificação usando uma glucoamilase; iii) fermentação usando um organismo fermentador; em que o organismo fermentador é: (1) a cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae com características definidoras da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae; ou (2) a cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae com características definidoras da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae;

2. Cepa de levedura Saccharomyces caracterizada por ser selecionada entre: cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae com características definidoras da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae; e cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são propriedades aproximadamente iguais às da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae ou de um derivado da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae com características definidoras da cepa MBG5012 de Saccharomyces cerevisiae.

3. Cepa de levedura Saccharomyces, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por a cepa ser capaz de crescer em xilose como uma única fonte de carbono.

4. Cepa de levedura Saccharomyces, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por a cepa compreender uma ou mais propriedades e características definidoras selecionadas a partir de: (a) produz um título mais elevado de etanol nas primeiras 20 horas de fermentação do que a cepa de Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso

V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália), nas mesmas condições em um mosto de milho fermentação, por exemplo, condições aqui descritas; (b) deixa menos glucose remanescente após 50 horas de fermentação do que a cepa de Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália), nas mesmas condições em um mosto de milho fermentação, por exemplo, condições aqui descritas; (c) tem um rendimento mais alto de etanol do que a cepa de Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) após 50 horas de fermentação sob as mesmas condições em uma fermentação de mosto de milho, por exemplo, condições aqui descritas.

5. Cepa de levedura Saccharomyces, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por a cepa ser capaz de fornecer um aumento no rendimento de etanol sobre a cepa de Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red® (depositada sob o número de acesso V14/007039 em National Measurement Institute, Victoria, Austrália) de mais de 1,0% sob as mesmas condições do processo.

6. Método caracterizado por ser para produzir um derivado da cepa MBG5038 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67549 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL) ou da cepa MBG5012 Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o número de acesso NRRL Y67700 em Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EUA), que apresenta as características definidoras das cepas MBG5038 ou MBG5012, respectivamente, o método compreendendo: (a) proporcionar: (i) uma primeira cepa de levedura; e (ii) uma segunda cepa de leveduras, em que a segunda cepa de leveduras é a cepa MBG5038, MBG5012 ou um derivado da cepa MBG5038, MBG5012; (b) cultivar a primeira cepa de levedura e a segunda cepa de levedura sob condições que permitem combinação de DNA entre a primeira e a segunda cepas de levedura; e (c) triagem ou seleção de um derivado da cepa.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a etapa (c) compreender a triagem ou seleção de uma cepa híbrida que apresente uma ou mais das características definidoras da cepa MBG5038 ou MBG5012.

8. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por compreender a etapa adicional de: (d) repetição das etapas (b) e (c) com a cepa triada ou selecionada da etapa (c) como primeira e/ou segunda cepa, até se obter um derivado que apresente as características definidoras da cepa MBG5038 ou MBG5012.

9. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a etapa (b) de cultura compreender: (i) esporulação da primeira cepa de leveduras e da segunda cepa de leveduras; e (ii) hibridização dos esporos germinados produzidos pela primeira cepa de leveduras com os esporos germinados produzidos pela segunda cepa de leveduras.

10. Cepa de Saccharomyces caracterizada por ser produzida pelo método, conforme definido na reivindicação 6.

11. Método para a produção de etanol caracterizado por compreender a incubação de uma cepa, conforme definida na reivindicação 2, com um substrato que compreende um açúcar fermentável sob condições que permitam a fermentação do açúcar fermentável para produzir etanol.

12. Método de produção de grãos de destiladores, caracterizado por compreender: (a) incubação de uma cepa de Saccharomyces, conforme definida na reivindicação 2, com um substrato compreendendo açúcar fermentável, sob condições que permitem a fermentação do açúcar fermentável para produzir etanol e grãos de destiladores; e (b) o isolamento dos grãos de destiladores.

13. Grãos de destiladores caracterizados por serem produzidos pelo método, conforme definido na reivindicação 12.

14. Composição caracterizada por compreender uma cepa de levedura Saccharomyces, conforme definida na reivindicação 2, e um ou mais componentes que ocorrem naturalmente e/ou que ocorrem não naturalmente, selecionados a partir de tensoativos, emulsionantes, gomas, agentes de dilatação e antioxidantes.

15. Método para produzir um derivado recombinante da levedura Saccharomyces, conforme definida na reivindicação 2, caracterizada por compreender a introdução de um ácido nucleico na levedura Saccharomyces, conforme definida na reivindicação 2, usando a tecnologia de DNA recombinante.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o ácido nucleico introduzido expressar uma glucoamilase e/ou uma alfa- amilase.

17. Cepa de levedura Saccharomyces derivada recombinante caracterizada por ser produzida pelo método, conforme definido na reivindicação 15.

18. Cepa de Saccharomyces, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada por a cepa ser capaz de crescer em xilose como uma única fonte de carbono.

19. Cepa de Saccharomyces, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada por o ácido nucleico introduzido expressar uma glucoamilase e/ou uma alfa-amilase.

20. Composição caracterizada por compreender a cepa de levedura Saccharomyces derivada recombinante, conforme definida na reivindicação 17, e um ou mais componentes selecionados a partir de tensoativos, emulsionantes, gomas, agentes de dilatação, e antioxidantes.