CN102947442B - 用于糖化纤维素材料的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含选自由纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、内切葡聚糖酶I、内切葡聚糖酶II和β-葡糖苷酶组成的组的组分的酶组合物。本发明还涉及用于降解或转化纤维素材料的方法，包括：用这种酶组合物处理纤维素材料。本发明还涉及用于产生发酵产物的方法，包括：(a)用这种酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种(几种)发酵微生物发酵所述经糖化纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从发酵回收所述发酵产物。本发明还涉及发酵纤维素材料的方法，包括：用一种或多种(几种)发酵微生物发酵纤维素材料，其中所述纤维素材料是用这种酶组合物糖化的。

Description

用于糖化纤维素材料的组合物
关于对联邦资助的研究和开发下完成的专利的权利
本发明是部分在能源部授予的合作协议DE-FC36-08GO18080下完成的范明。政府对本发明拥有一定权利
涉及序列表
本申请包含计算机可读形式的序列表，所述计算机可读形式通过提述并入本文。
涉及生物材料的保藏
本申请包含对于生物材料保藏的引用，所述保藏通过提述并入本文。
发明背景
发明领域
本发明涉及用于高温糖化纤维素材料的酶组合物及其用途。
相关领域描述
纤维素是单糖葡萄糖通过β-1,4-键连接的聚合物。许多微生物产生水解β-连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在随机位置消化纤维素聚合物，将其打开(openingit)以受到纤维二糖水解酶攻击(attack)。纤维二糖水解酶继而从纤维素聚合物的末端释放纤维二糖的分子。纤维二糖是水溶性的β-1,4-连接的葡萄糖二聚体。β-葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。
将含木素纤维素原料(lignocellulosicfeedstock)转化为乙醇具有以下优势：大量原料现成可用，避免燃烧或填埋材料的合意性和乙醇燃料的清洁性。木材、农业残余物、草本作物和城市固体废物被认为是用于乙醇生产的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。一旦将纤维素转化成葡萄糖，葡萄糖将容易地由酵母发酵成乙醇。
本领域存在对使纤维素材料高温糖化的效率增加，并为其提供合算的酶溶液的需求。
本发明提供了用于高温糖化纤维素材料的组合物及其用途。
发明概述
本发明涉及酶组合物，其包含两个或更多个(几个)选自下组的组分：
(I)多肽，其具有选自下组的纤维二糖水解酶I活性：
(A)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:2的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(B)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:4的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(C)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:6的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:5的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:5的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:5的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(D)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:8的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:7的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:7的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:7的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(E)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:158的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:157的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:157的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:157的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(F)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:160的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:159的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:159的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:159的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(G)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:162的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:161的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:161的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:161的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(H)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:164的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:163的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:163的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:163的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；和
(I)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:166的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:165的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:165的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:165的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(II)多肽，其具有选自下组的纤维二糖水解酶II活性：
(A)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:10的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:9的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:9的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:9的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(B)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:12的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:11的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:11的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:11的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(C)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:14的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:13的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:13的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:13的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(D)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:16的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:15的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:15的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:15的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(E)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:18的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:17的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:17的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:17的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(F)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:168的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:167的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:167的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:167的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(G)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:170的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:169的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:169的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:169的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；和
(H)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:172的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:171的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:171的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:171的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(III)多肽，其具有选自下组的内切葡聚糖酶I活性：
(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:20的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:19的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:19的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:19的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(IV)多肽，其具有选自下组的内切葡聚糖酶II活性：
(A)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:22的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:21的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:21的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:21的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(B)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:24的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:23的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:23的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:23的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(C)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:26的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:25的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:25的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:25的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(D)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:174的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:173的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:173的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:173的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；和
(E)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:176的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:175的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:175的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:175的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(V)多肽，其具有选自下组的β-葡糖苷酶活性：
(A)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:28的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:27的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:27的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:27的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(B)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:30的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:29的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:29的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:29的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(C)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:32的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:31的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:31的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:31的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(D)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:178的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:177的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:177的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:177的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(E)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:180的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:179的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:179的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:179的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(F)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:182的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:181的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:181的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:181的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(G)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:184的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:183的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:183的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:183的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(H)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:186的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:185的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:185的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:185的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(I)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:188的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:187的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:187的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:187的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；和
(J)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:190的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:189的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:189的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:189的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性。
本发明还涉及编码此种酶组合物的宿主细胞和产生此种酶组合物的方法。
本发明还涉及用于降解或转化纤维素材料的方法，其包括用此种酶组合物处理纤维素材料。
本发明还涉及产生发酵产物的方法，其包括：
(a)用此种酶组合物糖化纤维素材料；
(b)用一种或多种(几种)发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和
(c)从发酵回收发酵产物。
本发明还涉及发酵纤维素材料的方法，其包括：用一种或多种(几种)发酵微生物发酵纤维素材料，其中所述纤维素材料是用此种酶组合物糖化的。
附图简述
图1显示两种酶组合物与基于里氏木霉(Trichodermareesei)的组合物在50℃、55℃和65℃在经磨制、洗涤的PCS的水解中的比较。
图2显示具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌(Thermoascusaurantiacus)GH61A或土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)GH61EGH61多肽对高温酶组合物在50℃、55℃和60℃的PCS水解活性的作用。
图3显示了包含等量的具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A和土生梭孢霉GH61EGH61多肽的二元组合物在50℃、55℃和60℃在经磨制、洗涤的PCS的水解中的增强性能与单个GH61多肽的增强性能的比较。
图4显示含有不同比例的桔橙嗜热子囊菌GH61A和土生梭孢霉GH61E多肽的组合物对高温酶组合物在60℃的PCS水解活性的作用。
图5显示不同水平的具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A和土生梭孢霉GH61EGH61多肽各自，及其1∶1二元组合物对高温酶组合物在60℃的PCS水解活性的作用。
图6显示了ThermobifidafuscaGH11木聚糖酶对高温酶组合物在50-65℃水解经磨制、洗涤的PCS的作用。
图7显示了在高温酶组合物中用多种热稳定性纤维二糖水解酶I蛋白替代嗜热毛壳菌(Chaetomiumthermophilum)Cel7A纤维二糖水解酶I对在50-65℃经磨制、洗涤的PCS的水解的作用。
图8显示了基于烟曲霉(Aspergillusfumigatus)Cel7A和嗜热毛壳菌Cel7A的高温酶组合物与基于里氏木霉的纤维素酶XCL-533在50℃和60℃在经磨制、洗涤的PCS的水解中的比较。
图9显示了基于烟曲霉Cel7A的高温酶组合物的水解时间进程与基于里氏木霉的纤维素酶XCL-533在50℃和60℃的比较(2mg蛋白/g纤维素)。
图10显示了对以10%(0.35mg蛋白/g纤维素)添加于高温酶组合物(3.5mg蛋白/g纤维素)的棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)GH10木聚糖酶II，烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶，褐孢长毛盘菌(Trichophaeasaccata)GH10木聚糖酶和ThermobifidafuscaGH11木聚糖酶在50℃、55℃和60℃在经磨制、洗涤的PCS的水解中进行的衡量。
图11显示就与高温酶组合物在50℃、55℃和60℃在经磨制、洗涤的PCS的水解中的协同作用而对烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶、褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶和ThermobifidafuscaGH11木聚糖酶进行的衡量。每种木聚糖酶以不同水平(1.25%、2.5%、5%、10%和20%)添加于高温酶组合物的恒定加载量(3mg蛋白每g纤维素)。
图12显示含有烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶的改进高温酶组合物在60℃在经磨制、洗涤的PCS的水解中与基于里氏木霉的纤维素酶XCL-533在50℃的比较。
图13A和13B显示含有烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶或褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶的改进高温酶组合物(60℃)在经洗涤(A)或未经洗涤(B)的PCS的水解中与基于里氏木霉的纤维素酶XCL-533(50℃)的比较。
图14A和14B显示在60℃用来自里氏木霉和埃默森踝节菌(Talaromycesemersonii)的GH3β-木糖苷酶替代高温酶组合物(3mg蛋白每g纤维素)中的蛋白的作用。
图15显示用里氏木霉Cel7ACBHI、嗜热毛壳菌Cel7ACBHI、烟曲霉Cel7ACBHI和桔橙嗜热子囊菌Cel7ACBHI替代高温酶组合物中的CBHI组分在50-65℃在经磨制、未经洗涤的PCS的水解中的比较。
图16显示用嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)Cel6ACBHII、土生梭孢霉Cel6ACBHII、烟曲霉Cel6ACBHII和褐孢长毛盘菌Cel6ACBHII替代高温酶组合物中的CBHII组分在50-65℃在经磨制、未经洗涤的PCS的水解中的比较。
图17显示用里氏木霉Cel7BEGI和土曲霉(Aspergillusterreus)Cel7EGI替代高温酶组合物中的内切葡聚糖酶组分在50-65℃在经磨制、未经洗涤的PCS的水解中的比较。
图18显示用里氏木霉Cel5AEGII、嗜热毁丝霉Cel5AEGII和桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII替代高温酶组合物中的内切葡聚糖酶组分在50-65℃在经磨制、未经洗涤的PCS的水解中的比较。
图19显示高温酶组合物中的烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶、巴西青霉(Penicilliumbrasilianum)Cel3Aβ-葡糖苷酶和黑曲霉(Aspergillusniger)Cel3Aβ-葡糖苷酶在50-65℃使用经磨制、未经洗涤的PCS的比较。
图20显示高温酶组合物中的烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶、巴西青霉Cel3Aβ-葡糖苷酶和黑曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶在50-65℃使用经磨制、未经洗涤的PCS的比较。
图21显示用棘孢曲霉GH10xynII木聚糖酶、烟曲霉GH10xyn3、褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶、ThermobifidafuscaGH11木聚糖酶、嗜松青霉(Penicilliumpinophilum)GH10木聚糖酶和土生梭孢霉GH10E木聚糖酶替代高温酶组合物中的木聚糖酶组分在50-65℃在经磨制、未经洗涤的PCS的水解中的比较。
图22显示用桔橙嗜热子囊菌GH61A、土生梭孢霉GH61E、嗜松青霉GH61和烟曲霉GH61B多肽的纤维素酶增强活性替代高温酶组合物中的GH61组分在50-65℃在经磨制、未经洗涤的PCS的水解中的比较。
图23显示用桔橙嗜热子囊菌GH61A、土生梭孢霉GH61N和青霉属菌种(Penicilliumsp)GH61A多肽的纤维素酶增强活性替代高温酶组合物中的GH61组分在50-65℃在经磨制、未经洗涤的PCS的水解中的比较。
图24显示由烟曲霉Cel7A纤维二糖水解酶I和/或嗜热毁丝霉Cel6A纤维二糖水解酶II替代基于里氏木霉XCL-602纤维素酶在50-65℃对经磨制、未经洗涤的PCS的糖化的作用。
图25A和25B显示由含有烟曲霉Cel7A纤维二糖水解酶I和嗜热毁丝霉Cel6A纤维二糖水解酶II并另外补充5%烟曲霉GH10xyn3和/或5%土生梭孢霉GH61E的基于里氏木霉XCL-602纤维素酶组合物(3mg总蛋白每g纤维素)在50-60℃对经磨制、未经洗涤的PCS的水解。
图26显示含有不同替代水平的基于里氏木霉的XCL-592纤维素酶的基于里氏木霉的XCL-602组合物在50-60℃对经磨制、未经洗涤的PCS的水解。
图27A和27B显示用桔橙嗜热子囊菌GH61A、土生梭孢霉GH61E多肽替代基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶或基于XCL-602的酶组合物中5%的蛋白在50-65℃在经磨制、未经洗涤的PCS的水解中的比较。
图28A和28B显示由未替代的基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶和多种基于XCL-602的酶组合物(3mg蛋白每g纤维素)与基于里氏木霉的XCL-533纤维素酶(4.5mg蛋白每g纤维素)相比在50-60℃对经磨制、未经洗涤的PCS的水解。
图29显示高温酶组合物中的烟曲霉Cel7ACBHI和埃默森青霉(Penicilliumemersonii)Cel7CBHI在50-65℃在经磨制、未经洗涤的PCS的水解中的比较。
图30显示对高温酶组合物中烟曲霉Cel7ACBHI和嗜松青霉Cel7ACBHI在50-65℃在经磨制、未经洗涤的PCS的水解中进行的衡量。
图31显示对高温酶组合物中的烟曲霉Cel7ACBHI和土曲霉Cel7ACBHI在50-65℃在经磨制、未经洗涤的PCS的水解中进行的衡量。
图32显示对高温酶组合物中的烟曲霉Cel7ACBHI、费希新萨托菌(Neosartoryafischer)Cel7ACBHI和构巢曲霉(Aspergillusnidulans)Cel7ACBHI在50-60℃在经磨制、未经洗涤的PCS的水解中进行的衡量
图33显示对高温酶组合物中的烟曲霉Cel6ACBHII和FinnellianiveaCel6ACBHII在50-65℃在经磨制、未经洗涤的PCS的水解中进行的衡量。
图34显示对用烟曲霉Cel6ACBHII、埃默森青霉Cel6ACBHII和嗜松青霉Cel6ACBHII蛋白替代高温酶组合物中的CBHII组分在50-65℃在经磨制、未经洗涤的PCS的水解中进行的衡量。
图35显示对用烟曲霉Cel5AEGII、费希新萨托菌Cel5AEGII和嗜热毁丝霉Cel5AEGII蛋白替代高温酶组合物中的EG组分在50-65℃在经磨制、未经洗涤的PCS的水解中进行的衡量。
图36显示对高温酶组合物中的烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶和棘孢曲霉β-葡糖苷酶在50-65℃在经磨制、未经洗涤的PCS的水解中进行的衡量。
图37显示对高温酶组合物中的烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶、川地曲霉(Aspergilluskawashii)Cel3Aβ-葡糖苷酶、棒曲霉(Aspergillusclavatus)Cel3β-葡糖苷酶和埃默森踝节菌Cel3Aβ-葡糖苷酶在50-60℃在经磨制、未经洗涤的PCS的水解中进行的衡量。
图38显示对高温酶组合物中的烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶、草酸青霉(Penicilliumoxalicum)Cel3Aβ-葡糖苷酶(实施例77)和草酸青霉Cel3β-葡糖苷酶(实施例78)在50-65℃在经磨制、未经洗涤的PCS的水解中进行的衡量。
图39显示对高温酶组合物中的三种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽在50-65℃在经磨制、洗涤的PCS的水解中进行的衡量。
图40显示对高温酶组合物中的三种木聚糖酶在50-65℃在经磨制、未经洗涤的PCS的水解中进行的衡量。
图41显示对高温酶组合物中的三种木聚糖酶在50-65℃在经磨制、未经洗涤的PCS的水解中进行的衡量。
图42显示由未经替代的基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶和多种含有不同纤维二糖水解酶和木聚糖酶的基于XCL-602的酶组合物(3mg蛋白每g纤维素)在50-60℃对经磨制、未经洗涤的PCS的水解。
定义
纤维素分解酶或纤维素酶：术语“纤维素分解酶”或“纤维素酶”意指一种或多种(几种)水解纤维素材料的酶。此类酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶或其组合。测量纤维素分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解活性，和(2)测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如Zhang等,Outlookforcellulaseimprovement:Screeningandselectionstrategies,2006,BiotechnologyAdvances24:452-481所综述的。总纤维素分解活性通常是使用不溶性底物来测定的，所述底物包括WhatmanNo.1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、经预处理的木素纤维素等。最常见的总纤维素分解活性测定法是使用WhatmanNo.1滤纸作为底物的滤纸测定法。该测定法是由InternationalUnionofPureandAppliedChemistry(IUPAC)(Ghose,1987,Measurementofcellulaseactivities,PureAppl.Chem.59:257-68)确立的。
就本发明而言，纤维素分解酶活性通过测量在下述条件下由纤维素分解酶进行的纤维素材料水解的增加来确定：1-20mg的纤维素分解酶蛋白/g的PCS中纤维素在50℃进行3-7日，与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相比较。通常条件为：1ml反应液，经洗涤或未洗涤的PCS，5%不溶性固形物，50mM乙酸钠pH5，1mMMnSO4，50℃，72小时，通过HPX-87H柱(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)进行糖分析。
内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指内切-1,4-(1,3;1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-1,4-β-D-glucan4-glucanohydrolase)(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉(lichenin)中的1,4-β-D-糖苷键、混合的β-1,3葡聚糖例如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖中的β-1,4键和含有纤维素组分的其它植物材料的内水解(endohydrolysis)。内切葡聚糖酶活性可通过测量底物粘度的减少或由还原糖测定法(Zhang等,2006,BiotechnologyAdvances24:452-481)确定的还原端增加来确定。就本发明而言，根据Ghose,1987,PureandAppl.Chem.59:257-268的方法，在pH5，40℃，使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物来确定内切葡聚糖酶活性。
纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”意指1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(1,4-beta-D-glucancellobiohydrolase)(E.C.No.3.2.1.91)，其催化纤维素、纤维素寡糖，或任何包含β-1,4-连接的葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键的水解，从链的还原或非还原末端释放纤维二糖(Teeri,1997,Crystallinecellulosedegradation:Newinsightintothefunctionofcellobiohydrolases,TrendsinBiotechnology15:160-167；Teeri等,1998,Trichodermareeseicellobiohydrolases:whysoefficientoncrystallinecellulose?,Biochem.Soc.Trans.26:173-178)。就本发明而言，根据Lever等,1972,Anal.Biochem.47:273-279；vanTilbeurgh等,1982,FEBSLetters149:152-156；vanTilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBSLetters187:283-288和Tomme等,1988,Eur.J.Biochem.170:575-581描述的方法来测定纤维二糖水解酶活性。在本发明中，可采用Lever等的方法来评价玉米秸秆中纤维素的水解，而vanTilbeurgh等和Tomme等的方法可用于确定针对荧光二糖衍生物4-甲基伞形基-β-D-乳糖苷的纤维二糖水解酶活性。
β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucosideglucohydrolase)(E.C.No.3.2.1.21)，其催化末端非还原β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。就本发明而言，根据Venturi等,2002,Extracellularbeta-D-glucosidasefromChaetomiumthermophilumvar.coprophilum:production,purificationandsomebiochemicalproperties,J.BasicMicrobiol.42:55-66描述的基本方法确定β-葡糖苷酶活性。一个单位的β-葡糖苷酶定义为在25℃,pH4.8，在含有0.01%20的50mM柠檬酸钠中由作为底物1mM对硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷每分钟产生1.0微摩尔对硝基苯酚阴离子。
具有纤维素分解增强活性的多肽：术语“具有纤维素分解增强活性的多肽”意指GH61多肽，其具有催化具有纤维素分解活性的酶纤维素材料水解的增强的生物学活性。就本发明而言，通过测量由纤维素分解酶在下述条件下水解纤维素材料所导致的还原糖增加或纤维二糖与葡萄糖的总量增加来确定纤维素分解增强活性：1-50mg总蛋白/gPCS中纤维素，其中总蛋白包含50-99.5%w/w的纤维素分解酶，及0.5-50%w/w的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的蛋白质，在50℃历时1-7天，与用等量的总蛋白加载量而无纤维素分解增强活性(1-50mg纤维素分解蛋白/gPCS中纤维素)所进行的对照水解相比。在一个优选的方面，使用在总蛋白重量的2-3%的米曲霉β-葡糖苷酶(根据WO02/095014在米曲霉中重组产生)或者总蛋白质量的2-3%的烟曲霉β-葡糖苷酶(如WO2002/095014所述在米曲霉中重组产生)的纤维素酶蛋白加载量存在下的1.5L(NovozymesA/S,Bagsvaerd,Denmark)的混合物作为纤维素分解活性的来源。
所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过降低达到相同水解水平所需的纤维素分解酶的量而增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解，优选降低至少1.01倍，更优选至少1.05倍，更优选至少1.10倍，更优选至少1.25倍，更优选至少1.5倍，更优选至少2倍，更优选至少3倍，更优选至少4倍，更优选至少5倍，甚至更优选至少10倍，并且最优选至少20倍。
半纤维素分解酶或半纤维素酶：术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”意指一种或多种(几种)水解半纤维素材料的酶。参见，例如Shallom,D.和Shoham,Y.,Microbialhemicellulases.CurrentOpinionInMicrobiology,2003,6(3):219-228)。半纤维素酶是植物生物质降解中的关键组分。半纤维素酶的实例包括但不限于：乙酰甘露聚糖酯酶，乙酰木聚糖酯酶，阿拉伯聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，香豆酸酯酶，阿魏酸酯酶，半乳糖苷酶，葡糖醛酸糖苷酶，葡糖醛酸酯酶，甘露聚糖酶，甘露糖苷酶，木聚糖酶和木糖苷酶。这些酶的底物，半纤维素，是支链和直链糖类的异质组，所述糖类在植物细胞壁中通过氢键结合于纤维素微纤维，交联为鲁棒的(robust)网络。半纤维素亦共价地附于木质素，与纤维素一同形成高度复杂的结构。半纤维素多变的结构和组织需要多种酶的协同作用才能使其完全降解。半纤维素酶的催化模块为水解糖苷键的糖基水解酶(GH)，或糖酯酶(CE)，其水解乙酸或阿魏酸侧基的酯连接。这些催化模块，基于其一级序列的同源性，可分配至通过数字标识的GH和CE家族。一些家族，由于总体类似的折叠，可进一步归类为宗族(clan)，用字母编号(例如，GH-A)。对于这些和其他糖活性酶的最具信息性和最新的分类可从Carbohydrate-ActiveEnzymes(CAZy)数据库获得。半纤维素分解酶活性可根据Ghose和Bisaria,1987,Pure&AppI.Chem.59:1739-1752测量。
木聚糖降解活性或木聚糖分解活性：术语“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”意指水解含木聚糖材料的生物学活性。两种测定木聚糖分解活性的基础方法包括：(1)测定总木聚糖分解活性，和(2)测定单独的木聚糖分解活性(例如内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和α-葡糖醛酸酯酶(α-glucuronylesterase))。最近在木聚糖分解酶测定法的进展总结于几个公开文献中，包括Biely和Puchard,Recentprogressintheassaysofxylanolyticenzymes,2006,JournaloftheScienceofFoodandAgriculture86(11):1636-1647；Spanikova和Biely,2006,Glucuronoylesterase-NovelcarbohydrateesteraseproducedbySchizophyllumcommune,FEBSLetters580(19):4597-4601；Herrmann,Vrsanska,Jurickova,Hirsch,Biely和Kubicek,1997,Thebeta-D-xylosidaseofTrichodermareeseiisamultifunctionalbeta-D-xylanxylohydrolase,BiochemicalJournal321:375-381。
总木聚糖降解活性可通过确定从多种类型的木聚糖形成的还原糖来测量，所述木聚糖包括例如燕麦小麦(oatspelt)、山毛榉木(beechwood)和落叶松木(larchwood)木聚糖，或者可通过光度法确定从多种共价染色的木聚糖释放出的染色的木聚糖片段来测量。最常见的总木聚糖分解活性测定法基于从多聚的4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖产生还原糖，如Bailey,Biely,Poutanen,1992,Interlaboratorytestingofmethodsforassayofxylanaseactivity,JournalofBiotechnology23(3):257-270中所述。木聚糖酶活性亦可在37℃用0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物在0.01%TritonX-100和200mM磷酸钠缓冲液pH6中确定。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃，pH6，从200mM磷酸钠pH6缓冲液中作为底物的0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖每分钟产生1.0微摩尔的天青精(azurine)。
就本发明而言，木聚糖降解活性是通过测量由木聚糖降解酶在下述通常条件下造成的桦木木聚糖(SigmaChemicalCo.,Inc.,St.Louis,MO,USA)水解的增加来确定的：1ml反应液，5mg/ml底物(总固形物)，5mg木聚糖分解蛋白质/g底物，50mM乙酸钠，pH5，50℃，24小时，如Lever,1972,Anewreactionforcolorimetricdeterminationofcarbohydrates,Anal.Biochem47:273-279所述使用对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)测定法进行糖分析。
木聚糖酶：术语“木聚糖酶”意指1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(1,4-β-D-xylan-xylohydrolase)(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键的内水解。就本发明而言，木聚糖酶活性是使用0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物在37℃在0.01%TritonX-100和200mM磷酸钠缓冲液pH6中确定的。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃，pH6，从200mM磷酸钠pH6缓冲液中作为底物的0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖每分钟产生1.0微摩尔的天青精(azurine)。
β-木糖苷酶：术语“β-木糖苷酶”意指β-D木糖苷木糖水解酶(β-D-xylosidexylohydrolase)(E.C.3.2.1.37)，其催化短β(1→4)木寡糖(xylooligosaccharide)的外水解以从非还原端去除连续的D-木糖残基。就本发明而言，一个单位的β-木糖苷酶定义为在40℃，pH5在含有0.01%20的100mM柠檬酸钠中从1mM作为底物的对硝基苯基-β-D-木糖苷每分钟产生1.0μmol对硝基苯酚阴离子。
乙酰木聚糖酯酶：术语“乙酰木聚糖酯酶”意指羧基酯酶活性(EC3.1.1.72)，其催化乙酰基从聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、乙酸α-萘酯(alpha-napthylacetate)和乙酸对硝基苯酯(p-nitrophenylacetate)的水解。就本发明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用0.5mM乙酸对硝基苯酯作为底物，在含有0.01%TWEENTM20的50mM乙酸钠pH5.0中确定的。一个单位的乙酰木聚糖酯酶定义为能够在pH5,25℃每分钟释放1微摩尔对硝基苯酚阴离子(p-nitrophenolateanion)的酶量。
阿魏酸酯酶：术语“阿魏酸酯酶(feruloylesterase)”意指4-羟基-3-甲氧基肉桂酰-糖水解酶(EC3.1.1.73)，其催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基团从酯化的糖(其在“天然”底物中通常为阿拉伯糖)的水解，以产生阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸)。阿魏酸酯酶也称作阿魏酸酯酶(ferulicacidesterase)、羟基肉桂酰基酯酶、FAE-III、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-I或FAE-II。就本发明而言，阿魏酸酯酶活性是使用50mM乙酸钠pH5.0中的阿魏酸对硝基苯酯作为底物确定的。一个单位的阿魏酸酯酶等于能够在pH5，25℃每分钟释放出1μmol对硝基苯酚阴离子的酶量。
α-葡糖醛酸糖苷酶：术语“α-葡糖醛酸糖苷酶”意指α-D-葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶(alpha-D-glucosiduronateglucuronohydrolaseactivity)(EC3.2.1.139)，其催化α-D-葡糖醛酸糖苷水解为D-葡糖醛酸和醇。就本发明而言，α-葡糖醛酸糖苷酶活性是根据deVries,1998,J.Bacteriol.180:243-249确定的。一个单位的α-葡糖醛酸糖苷酶等于能够在pH5，40℃每分钟释放出1μmol葡糖醛酸或4-O-甲基葡糖醛酸的酶量。
α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶：术语“α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶”意指α-L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC3.2.1.55)，其催化对α-L-阿拉伯糖苷中的末端非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶对α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶或α-L-阿拉伯聚糖酶。就本发明而言，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性是使用总体积200μl中的每ml的100mM乙酸钠pH5中5mg的中等粘度小麦阿拉伯木聚糖(MegazymeInternationalIreland,Ltd.,Bray,Co.Wicklow)在40℃进行30分钟，接着通过HPX-87H柱层析(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)的阿拉伯糖分析来确定的。
家族3、5、6、7、10、11或61，或GH3、GH5、GH6、GH7、GH10、GH11或GH61，或Cel3、Cel5、Cel6或Cel7：术语“家族3”、“家族5”、“家族6”、“家族7”、“家族10”、“家族11”、“家族61”、“GH3”、“GH5”、“GH6”、“GH10”、“GH11”、“GH61”、“Cel3”、“Cel5”、“Cel6”或“Cel7”意指根据HenrissatB.,1991,Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309-316,及Henrissat和Bairoch,1996,Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316:695-696属于糖苷水解酶家族3、5、6、7、10、11和61的多肽。
纤维素材料：纤维素材料可以是包含纤维素的任何材料。生物质的初生细胞壁(primarycellwall)中的主要多糖是纤维素，其次最丰富的是半纤维素，而第三是果胶。次生细胞壁(secondarycellwall)在细胞停止生长后产生，其同样含有多糖并通过共价交联至半纤维素的聚合木质素而加强。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，并且因此是直链β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有系列取代基的复杂分支结构。尽管通常是多形的，存在于植物组织中的纤维素主要是平行葡聚糖链的不溶晶体基质。半纤维素通常与纤维素以及其它半纤维素以氢键相连，其帮助稳定细胞壁基质。
纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴，或树的叶、枝和木材。纤维素材料可以是，但不限于，草本材料、农业残余物、林业残余物、城市固体废物、废纸和纸浆与造纸厂残余物(参见，例如，Wiselogel等,1995,于HandbookonBioethanol(CharlesE.Wyman编),pp.105-118,Taylor&Francis,WashingtonD.C.；Wyman,1994,BioresourceTechnology50:3-16；Lynd,1990,AppliedBiochemistryandBiotechnology24/25:695-719；Mosier等,,1999,RecentProgressinBioconversionofLignocellulosics,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,T.Scheper主编,Volume65,pp.23-40,Springer-Verlag,NewYork)。在本文中应理解的是，纤维素可以是任何形式的木素纤维素，在混合基质中包含木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料。在一个优选的方面，纤维素材料是木素纤维素。
在一个方面，纤维素材料是草本材料。在另一个方面，纤维素材料是农业残余物。在另一个方面，纤维素材料是林业残余物。在另一个方面，纤维素材料是城市固体废物。在另一个方面，纤维素材料是废纸。在另一个方面，纤维素材料是纸浆和造纸厂残余物。
在另一个方面，纤维素材料是玉米秸秆。在另一个方面，纤维素材料是玉米纤维。在另一个方面，纤维素材料是玉米穗轴。在另一个方面，纤维素材料是橙皮。在另一个方面，纤维素材料是稻杆。在另一个方面，纤维素材料是麦杆。在另一个方面，纤维素材料是柳枝稷(switchgrass)。在另一个方面，纤维素材料是芒草属。在另一个方面，纤维素材料是甘蔗渣。在另一个方面，纤维素材料是软木。在另一个方面，纤维素材料是硬木。
在另一个方面，纤维素材料是微晶纤维素。在另一个方面，纤维素材料是细菌纤维素。在另一个方面，纤维素材料是藻类纤维素。在另一个方面，纤维素材料是棉线头(cottonlinter)。在另一个方面，纤维素材料是无定形的磷酸处理的纤维素。在另一个方面，纤维素材料是滤纸。
纤维素材料可以直接使用或进行预处理，使用本领域已知的常规方法，如本文所述。在一个优选的方面，纤维素材料经预处理。
预处理的玉米秸秆：术语“PCS”或“预处理的玉米秸秆”意指通过用热和稀硫酸处理的源自玉米秸秆的纤维素材料。
分离或纯化：术语“分离”或“纯化”意指从与其天然结合的至少一种成分移除的多肽或多核苷酸。举例而言，多肽可为至少1%纯，例如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，至少90%纯或至少95%纯，如通过SDS-PAGE确定，而多核苷酸可为至少1%纯，例如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，至少90%纯或至少95%纯，如通过琼脂糖电泳确定。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在的多肽，所述修饰例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。本领域中已知宿主细胞可产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽的混合物(即，具有不同的C端和/或N端氨基酸)。成熟多肽可使用SignalP程序(Nielsen等,1997,ProteinEngineering10:1-6)预测。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”在本文中定义为编码具有生物活性的成熟多肽的核苷酸序列。成熟多肽编码序列可使用SignalP程序(Nielsen等,1997,ProteinEngineering10:1-6)预测。
序列同一性：参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。
就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等,2000,TrendsGenet.16:276-277)的Needle程序，优选3.0.0版或更高版本中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来测定。使用的可选参数为缺口罚分(gappenalty)10，缺口延伸罚分(gapextensionpenalty)0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性(longestidentity)”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：
(同样的残基×100)/(比对长度-比对中缺口的总数)
就本发明而言，两个核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等,2000,见上文)的Needle程序，优选3.0.0版或更高版本中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来测定。使用的可选参数为缺口罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：
(同样的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度-比对中缺口的总数)
多肽片段：术语“片段”意指从的成熟多肽的氨基和/或羧基端缺失一个或多个(几个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有生物活性。
亚序列：术语“亚序列(subsequence)”意指从成熟多肽编码序列的5’和/或3’端缺失一个或多个(几个)核苷酸的多核苷酸；其中所述亚序列编码具有生物活性的片段。
等位变体(allelicvariant)：术语“等位变体”意指占据相同染色体基因座的基因的任何两种或两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子例如GTG和TTG开始，并且以终止密码子例如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的多核苷酸。
cDNA：术语“cDNA”意指能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤(包括剪接)加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因，或将其以本来不存在于(nototherwiseexist)自然界中的方式修饰以含有核酸的区段，或其为合成的。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。
调控序列(controlsequence)：术语“调控序列”意指包括对编码多肽的多核苷酸表达是必需的或有利的所有成分。各个调控序列对于编码所述多肽的多核苷酸可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点便于调控序列与编码多肽的多核苷酸编码区的连接。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得调控序列指导编码序列的表达。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。术语“宿主细胞”涵盖任何由于在复制过程中发生的突变而与亲本细胞不完全相同的亲本细胞后代。
发明详述
酶组合物
本发明涉及酶组合物，其包含两个或更多个(几个)选自下组的组分：
(I)多肽，其具有选自下组的纤维二糖水解酶I活性：
(A)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:2的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(B)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:4的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(C)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:6的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:5的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:5的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:5的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(D)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:8的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:7的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:7的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:7的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(E)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:158的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:157的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:157的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:157的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(F)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:160的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:159的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:159的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:159的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(G)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:162的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:161的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:161的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:161的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(H)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:164的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:163的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:163的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:163的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；和
(I)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:166的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:165的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:165的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:165的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(II)多肽，其具有选自下组的纤维二糖水解酶II活性：
(A)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:10的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:9的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:9的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:9的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(B)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:12的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:11的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:11的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:11的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(C)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:14的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:13的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:13的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:13的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(D)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:16的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:15的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:15的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:15的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(E)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:18的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:17的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:17的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:17的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(F)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:168的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:167的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:167的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:167的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(G)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:170的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:169的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:169的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:169的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；和
(H)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:172的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:171的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:171的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:171的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(III)多肽，其具有选自下组的内切葡聚糖酶I活性：
(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:20的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:19的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:19的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:19的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(IV)多肽，其具有选自下组的内切葡聚糖酶II活性：
(A)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:22的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:21的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:21的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:21的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(B)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:24的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:23的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:23的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:23的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(C)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:26的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:25的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:25的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:25的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(D)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:174的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:173的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:173的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:173的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；和
(E)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:176的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:175的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:175的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:175的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(V)多肽，其具有选自下组的β-葡糖苷酶活性：
(A)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:28的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:27的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:27的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:27的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(B)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:30的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:29的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:29的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:29的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(C)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:32的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:31的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:31的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:31的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(D)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:178的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:177的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:177的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:177的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(E)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:180的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:179的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:179的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:179的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(F)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:182的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:181的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:181的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:181的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(G)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:184的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:183的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:183的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:183的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(H)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:186的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:185的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:185的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:185的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(I)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:188的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:187的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:187的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:187的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；和
(J)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:190的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:189的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:189的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:189的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性。
在一个优选的方面，所述具有纤维二糖水解酶I活性的多肽是SEQIDNO:2的成熟多肽的嗜热毛壳菌Cel7A纤维二糖水解酶I。在另一个方面，所述嗜热毛壳菌Cel7A纤维二糖水解酶I由SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有纤维二糖水解酶I活性的多肽是SEQIDNO:4的成熟多肽的嗜热毁丝霉Cel7A纤维二糖水解酶I。在另一个方面，所述嗜热毁丝霉Cel7A纤维二糖水解酶I由SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有纤维二糖水解酶I活性的多肽是SEQIDNO:6的成熟多肽的烟曲霉Cel7A纤维二糖水解酶I。在另一个方面，所述烟曲霉Cel7A纤维二糖水解酶I由SEQIDNO:5的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有纤维二糖水解酶I活性的多肽是SEQIDNO:8的成熟多肽的桔橙嗜热子囊菌Cel7A纤维二糖水解酶I。在另一个方面，所述桔橙嗜热子囊菌Cel7A纤维二糖水解酶I由SEQIDNO:7的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有纤维二糖水解酶I活性的多肽是SEQIDNO:158成熟多肽的埃默森青霉Cel7A纤维二糖水解酶I。在另一个方面，所述埃默森青霉Cel7A纤维二糖水解酶I由SEQIDNO:157的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有纤维二糖水解酶I活性的多肽是SEQIDNO:160成熟多肽的嗜松青霉Cel7纤维二糖水解酶I。在另一个方面，所述嗜松青霉Cel7A纤维二糖水解酶I由SEQIDNO:159的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有纤维二糖水解酶I活性的多肽是SEQIDNO:162成熟多肽的土曲霉Cel7纤维二糖水解酶I。在另一个方面，所述土曲霉Cel7纤维二糖水解酶I由SEQIDNO:161的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有纤维二糖水解酶I活性的多肽是SEQIDNO:164成熟多肽的费希新萨托菌Cel7纤维二糖水解酶I。在另一个方面，所述费希新萨托菌Cel7纤维二糖水解酶I由SEQIDNO:163的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有纤维二糖水解酶I活性的多肽是SEQIDNO:166成熟多肽的构巢曲霉Cel7纤维二糖水解酶I。在另一个方面，所述构巢曲霉Cel7纤维二糖水解酶I由SEQIDNO:165的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有纤维二糖水解酶II活性的多肽是SEQIDNO:10的成熟多肽的嗜热毁丝霉Cel6A纤维二糖水解酶II。在另一个方面，所述嗜热毁丝霉Cel6A纤维二糖水解酶II由SEQIDNO:9的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有纤维二糖水解酶II活性的多肽是SEQIDNO:12的成熟多肽的嗜热毁丝霉Cel6B纤维二糖水解酶II。在另一个方面，所述嗜热毁丝霉Cel6B纤维二糖水解酶II由SEQIDNO:11的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有纤维二糖水解酶II活性的多肽是SEQIDNO:14的成熟多肽的土生梭孢霉Cel6A纤维二糖水解酶II。在另一个方面，所述土生梭孢霉Cel6A纤维二糖水解酶II由SEQIDNO:13的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有纤维二糖水解酶II活性的多肽是SEQIDNO:16的成熟多肽的褐孢长毛盘菌CBS804.70Cel6A纤维二糖水解酶II。在另一个方面，所述褐孢长毛盘菌Cel6A纤维二糖水解酶II由SEQIDNO:15的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有纤维二糖水解酶II活性的多肽是SEQIDNO:18的成熟多肽的烟曲霉Cel6A纤维二糖水解酶II。在另一个方面，所述烟曲霉Cel6A纤维二糖水解酶II由SEQIDNO:17的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有纤维二糖水解酶II活性的多肽是SEQIDNO:168的成熟多肽的FennellianiveaCel6纤维二糖水解酶II。在另一个方面，所述FennellianiveaCel6纤维二糖水解酶II由SEQIDNO:167的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有纤维二糖水解酶II活性的多肽是SEQIDNO:170的成熟多肽的埃默森青霉Cel6A纤维二糖水解酶II。在另一个方面，所述埃默森青霉Cel6A纤维二糖水解酶II由SEQIDNO:169的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有纤维二糖水解酶II活性的多肽是SEQIDNO:172的成熟多肽的嗜松青霉Cel6A纤维二糖水解酶II。在另一个方面，所述嗜松青霉Cel6A纤维二糖水解酶II由SEQIDNO:171的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有内切葡聚糖酶I活性的多肽是SEQIDNO:20的成熟多肽的土曲霉Cel7A内切葡聚糖酶I。在另一个方面，所述土曲霉Cel7A内切葡聚糖酶I由SEQIDNO:19的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有内切葡聚糖酶II活性的多肽是SEQIDNO:22的成熟多肽的里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II。在另一个方面，所述里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II由SEQIDNO:21的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有内切葡聚糖酶II活性的多肽是SEQIDNO:24的成熟多肽的嗜热毁丝霉Cel5A内切葡聚糖酶II。在另一个方面，所述嗜热毁丝霉Cel5A内切葡聚糖酶II由SEQIDNO:23的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有内切葡聚糖酶II活性的多肽是SEQIDNO:26的成熟多肽的桔橙嗜热子囊菌Cel5A内切葡聚糖酶II。在另一个方面，所述嗜桔橙嗜热子囊菌Cel5A内切葡聚糖酶II由SEQIDNO:25的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有内切葡聚糖酶II活性的多肽是SEQIDNO:174的成熟多肽的烟曲霉Cel5内切葡聚糖酶II。在另一个方面，所述烟曲霉Cel5内切葡聚糖酶II由SEQIDNO:173的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有内切葡聚糖酶II活性的多肽是SEQIDNO:176的成熟多肽的费希新萨托菌Cel5内切葡聚糖酶II。在另一个方面，所述费希新萨托菌Cel5内切葡聚糖酶II由SEQIDNO:175的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有β-葡糖苷酶活性的多肽是SEQIDNO:28的成熟多肽的烟曲霉β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述烟曲霉β-葡糖苷酶由SEQIDNO:27的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有β-葡糖苷酶活性的多肽是SEQIDNO:30的成熟多肽的巴西青霉β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述巴西青霉β-葡糖苷酶由SEQIDNO:29的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有β-葡糖苷酶活性的多肽是SEQIDNO:32的成熟多肽的黑曲霉β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述黑曲霉β-葡糖苷酶由SEQIDNO:31的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有β-葡糖苷酶活性的多肽是SEQIDNO:178的成熟多肽的棘孢曲霉Cel3β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述棘孢曲霉Cel3β-葡糖苷酶由SEQIDNO:177的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有β-葡糖苷酶活性的多肽是SEQIDNO:180的成熟多肽的川地曲霉Cel3β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述川地曲霉Cel3β-葡糖苷酶由SEQIDNO:179的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有β-葡糖苷酶活性的多肽是SEQIDNO:182的成熟多肽的棒曲霉Cel3β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述棒曲霉Cel3β-葡糖苷酶由SEQIDNO:181的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有β-葡糖苷酶活性的多肽是SEQIDNO:184的成熟多肽的土生梭孢霉NRRL8126Cel3β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述土生梭孢霉NRRL8126Cel3β-葡糖苷酶由SEQIDNO:182的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有β-葡糖苷酶活性的多肽是SEQIDNO:186的成熟多肽的草酸青霉Cel3β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述土生梭孢霉草酸青霉Cel3β-葡糖苷酶由SEQIDNO:185的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有β-葡糖苷酶活性的多肽是SEQIDNO:188的成熟多肽的草酸青霉Cel3β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述草酸青霉Cel3β-葡糖苷酶由SEQIDNO:187的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有β-葡糖苷酶活性的多肽是SEQIDNO:190的成熟多肽的埃默森踝节菌Cel3β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述埃默森踝节菌Cel3β-葡糖苷酶由SEQIDNO:189的成熟多肽编码序列编码。
在一个方面，所述酶组合物进一步包含或甚至进一步包含选自下组的具有纤维素分解增强活性的多肽：
(I)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:34的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:33的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:33的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:33的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(II)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:36的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:35的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:35的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:35的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(III)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:38的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:37的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:37的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:37的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(IV)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:40的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:39的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:39的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:39的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(V)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:42的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:41的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:41的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:41的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(VI)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:44的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:43的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:43的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:43的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(VII)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:192的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:191的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:191的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:191的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；和
(VIII)任意I、II、III、IV、V、VI和VII的组合。
在一个优选的方面，所述具有纤维素分解增强活性的多肽是SEQIDNO:34的成熟多肽的具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽。在另一个方面，所述具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽由SEQIDNO:33的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有纤维素分解增强活性的多肽是SEQIDNO:36的成熟多肽的具有纤维素分解增强活性的土生梭孢霉GH61E多肽。在另一个方面，所述具有纤维素分解增强活性的土生梭孢霉GH61E多肽由SEQIDNO:35的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有纤维素分解增强活性的多肽是SEQIDNO:38的成熟多肽的具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61B多肽。在另一个方面，所述具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61B多肽由SEQIDNO:37的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有纤维素分解增强活性的多肽是SEQIDNO:40的成熟多肽的具有纤维素分解增强活性的嗜松青霉GH61多肽。在另一个方面，所述具有纤维素分解增强活性的嗜松青霉GH61A多肽由SEQIDNO:39的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有纤维素分解增强活性的多肽是SEQIDNO:42的成熟多肽的具有纤维素分解增强活性的青霉属菌种GH61A多肽。在另一个方面，所述具有纤维素分解增强活性的青霉属菌种GH61多肽由SEQIDNO:41的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有纤维素分解增强活性的多肽是SEQIDNO:44的成熟多肽的具有纤维素分解增强活性的土生梭孢霉GH61N多肽。在另一个方面，所述具有纤维素分解增强活性的土生梭孢霉GH61N多肽由SEQIDNO:43的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有纤维素分解增强活性的多肽是SEQIDNO:192的成熟多肽的具有纤维素分解增强活性的痂状嗜热子囊菌(Thermoascuscrustaceus)GH61A多肽。在另一个方面，所述具有纤维素分解增强活性的嗜热子囊菌GH61A多肽由SEQIDNO:191的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述酶组合物进一步包含或甚至进一步包含具有木聚糖酶活性的多肽。在一个优选的方面，所述具有木聚糖酶活性的多肽是具有木聚糖酶活性的家族10多肽。在另一个方面，所述具有木聚糖酶活性的多肽是具有木聚糖酶活性的家族11多肽。
在一个更优选的方面，所述具有木聚糖酶活性的家族10多肽选自下组：
(I)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:46的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:45的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:45的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:45的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(II)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:48的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:47的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:47的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:47的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(III)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:50的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:49的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:49的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:49的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(IV)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:52的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:51的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:51的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:51的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(V)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:54的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:53的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:53的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:53的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(VI)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:194的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:193的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:193的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:193的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(VII)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:196的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:195的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:195的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:195的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；和
(VIII)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:198的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:197的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:197的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:197的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性。
在一个方面，所述具有木聚糖酶活性的家族10多肽是SEQIDNO:46的成熟多肽的棘孢曲霉GH10木聚糖酶。在另一个方面，所述棘孢曲霉GH10木聚糖酶由SEQIDNO:45的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有木聚糖酶活性的家族10多肽是SEQIDNO:48的成熟多肽的烟曲霉GH10C木聚糖酶。在另一个方面，所述烟曲霉GH10C木聚糖酶由SEQIDNO:47的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有木聚糖酶活性的家族10多肽是SEQIDNO:50的成熟多肽的褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶。在另一个方面，所述褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶由SEQIDNO:49的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有木聚糖酶活性的家族10多肽是SEQIDNO:52的成熟多肽的嗜松青霉GH10木聚糖酶。在另一个方面，所述嗜松青霉GH10木聚糖酶由SEQIDNO:51的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有木聚糖酶活性的家族10多肽是SEQIDNO:54的成熟多肽的土生梭孢霉GH10E木聚糖酶。在另一个方面，所述土生梭孢霉GH10E木聚糖酶由SEQIDNO:53的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有木聚糖酶活性的家族10多肽是SEQIDNO:194的成熟多肽的埃默森踝节菌GH10木聚糖酶。在另一个方面，所述埃默森踝节菌GH10木聚糖酶由SEQIDNO:193的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有木聚糖酶活性的家族10多肽是SEQIDNO:196的成熟多肽的青霉属菌种GH10木聚糖酶。在另一个方面，所述青霉属菌种GH10木聚糖酶由SEQIDNO:195的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有木聚糖酶活性的家族10多肽是SEQIDNO:198的成熟多肽的巨多孔菌(Meripilusgiganteus)GH10木聚糖酶。在另一个方面，所述巨多孔菌GH10木聚糖酶由SEQIDNO:197的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有木聚糖酶活性的家族11多肽选自下组：
(I)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:56的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与SEQIDNO:55的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:55的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；和
(II)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:200或SEQIDNO:305的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与SEQIDNO:199或SEQIDNO:304的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:199或SEQIDNO:304的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性。
在另一个方面，所述具有木聚糖酶活性的家族11多肽是SEQIDNO:56的成熟多肽的ThermobifidafuscaGH11木聚糖酶。在另一个方面，所述ThermobifidefuscaGH11木聚糖酶由SEQIDNO：55的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有木聚糖酶活性的家族11多肽是SEQIDNO:200或SEQIDNO:305的成熟多肽的嗜热网球菌(Dictyoglomusthermophilum)GH11木聚糖酶。在另一个方面，所述嗜热网球菌GH11木聚糖酶由SEQIDNO:199或SEQIDNO:304的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述酶组合物进一步包含或甚至进一步包含具有β-葡糖苷酶活性的多肽。在一个优选的方面，所述具有β-葡糖苷酶活性的多肽是具有β-葡糖苷酶活性的家族3多肽。
在另一个方面，所述具有β-木糖苷酶活性的家族3多肽选自下组：
(I)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:58的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与SEQIDNO:57的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:57的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(II)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:60的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与SEQIDNO:59的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:59的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(III)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:202的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与SEQIDNO:201的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:201的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
(IV)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:204的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与SEQIDNO:203的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:203的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；和
(V)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:206的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中-高严格条件下，更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与SEQIDNO:205的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:205的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%的同一性，且最优选至少97%的同一性；
在另一个方面，所述具有β-木糖苷酶活性的家族3多肽是SEQIDNO:58的成熟多肽的里氏木霉β-木糖苷酶。在另一个更优选的方面，所述里氏木霉β-木糖苷酶由SEQIDNO:57的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有β-木糖苷酶活性的家族3多肽是SEQIDNO:60的成熟多肽的埃默森踝节菌β-木糖苷酶。在另一个更优选的方面，所述埃默森踝节菌β-木糖苷酶由SEQIDNO:59的成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有β-木糖苷酶活性的家族3多肽是SEQIDNO:202的成熟多肽的棘孢曲霉Cel3β-木糖苷酶。在另一个更优选的方面，所述棘孢曲霉Cel3β-木糖苷酶由SEQIDNO:201成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有β-木糖苷酶活性的家族3多肽是SEQIDNO:204的成熟多肽的棘孢曲霉Cel3β-木糖苷酶。在另一个更优选的方面，所述棘孢曲霉Cel3β-木糖苷酶由SEQIDNO:203成熟多肽编码序列编码。
在另一个方面，所述具有β-木糖苷酶活性的家族3多肽是SEQIDNO:206的成熟多肽的烟曲霉Cel3β-木糖苷酶。在另一个更优选的方面，所述烟曲霉Cel3β-木糖苷酶由SEQIDNO:205成熟多肽编码序列编码。
酶组合物的一种或多种组分可为野生型蛋白，重组蛋白，或野生型蛋白和重组蛋白的组合。举例而言，一种或多种组分可为用作宿主细胞以重组表达酶组合物的一种或多种(几种)其他组分的细胞的天然蛋白。酶组合物的一种或多种组分可作为单组分产生，然后将其组合以形成酶组合物。所述酶组合物可为多组分和单组分蛋白制备物的组合。
本发明的酶组合物可用作另一种酶组合物的补充，其中将本发明的酶组合物简单地添加至另一种酶组合物，或作为另一种酶组合物的一部分的替代来添加。另一种酶组合物可为商业性酶组合物如纤维素分解酶制备物或木聚糖降解酶制备物。
商业性纤维素分解酶制备物的实例包括但不限于：CELLICTMCTec(NovozymesA/S)，CELLICTMCTec2(NovozymesA/S)，CELLUCLASTTM(NovozymesA/S)，NOVOZYMTM188(NovozymesA/S)，CELLUZYMETM(NovozymesA/S)，CEREFLOTM(NovozymesA/S)，ULTRAFLOTM(NovozymesA/S)，ACCELERASE(GenencorInt.)，LAMINEXTM(GenencorInt.)，SPEZYMETMCP(GenencorInt.)，ROHAMENTTM7069W(GmbH)，和LDI(DyadicInternational，Inc.)，LBR(DyadicInternational，Inc.)，以及150L(DyadicInternational，Inc.)。
商业性木聚糖降解酶制备物的实例包括但不限于SHEARZYMETM(NovozymesA/S)，CELLICTMHTec(NovozymesA/S)，CELLICTMHTec2(NovozymesA/S)，(NovozymesA/S)，(NovozymesA/S)，HC(NovozymesA/S)，Xylanase(GenencorInt.)，TX-200A(ABEnzymes)，HSP6000Xylanase(DSM)，DEPOLTM333P(BiocatalystsLimit,Wales,UK)，DEPOLTM740L.(BiocatalystsLimit,Wales,UK)，以及DEPOLTM762P(BiocatalystsLimit,Wales,UK)。
在一个方面，将本发明的酶组合物简单地添加至另一种酶组合物。将本发明的酶组合物以另一种酶组合物的优选至少1%，更优选至少5%，更优选至少10%，更优选至少25%，更优选至少50%，更优选至少75%，更优选至少100%，更优选至少150%，更优选至少200%，更优选至少250%，最优选至少300%，更优选至少400%，更优选至少500%，甚至更优选至少750%，最优选至少1000%的水平添加至另一种组合物。
在另一个方面，将本发明的酶组合物作为另一种酶组合物的一部分的替代添加。将本发明的酶组合物以另一种酶组合物的优选至少1%，更优选至少2%，更优选至少3%，更优选至少5%，更优选至少10%，更优选至少15%，更优选至少20%，更优选至少25%，更优选至少30%，更优选至少40%，最优选至少50%，更优选至少60%，更优选至少70%，甚至更优选至少80%，最优选至少90%的水平作为另一种酶组合物的替代添加。
在另一个方面，酶组合物可进一步或甚至进一步包含一种或多种(几种)其他酶活性以促进含纤维素材料的降解。优选的其他酶为半纤维素酶(例如α-D-葡糖醛酸糖苷酶，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，内切甘露聚糖酶，β-甘露糖苷酶，α-半乳糖苷酶，内切α-L-阿拉伯聚糖酶，β-半乳糖苷酶)，糖酯酶(例如乙酰木聚糖酯酶，乙酰甘露聚糖酯酶，阿魏酸酯酶，香豆酸酯酶，葡糖醛酸酯酶)，果胶酶，蛋白酶，木质素分解酶(例如过氧化氢酶，漆酶，锰过氧化物酶，木质素过氧化物酶，H2O2产生酶，氧化还原酶)，棒曲霉素，膨胀素(swollenin)或其混合物。
此类其他内切葡聚糖酶包括解纤维热酸菌(Acidothermuscellulolyticus)内切葡聚糖酶(WO91/05039；WO93/15186；美国专利5,275,944；WO96/02551；美国专利5,536,655，WO00/70031，WO05/093050)；Thermobifidafusca内切葡聚糖酶III(WO05/093050)；和Thermobifidafusca内切葡聚糖酶V(WO05/093050)；里氏木霉内切葡聚糖酶I(Penttila等,1986,Gene45:253-263；里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶I；GENBANKTM登录号M15665)；里氏木霉内切葡聚糖酶III(Okada等,1988,Appl.Environ.Microbiol.64:555-563；GENBANKTM登录号AB003694)；里氏木霉内切葡聚糖酶V(Saloheimo等,1994,MolecularMicrobiology13:219-228；GENBANKTM登录号Z33381)；棘孢曲霉内切葡聚糖酶(Ooi等,1990,NucleicAcidsResearch18:5884)；川地曲霉(Aspergilluskawachii)内切葡聚糖酶(Sakamoto等,1995,CurrentGenetics27:435-439)；胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovara)内切葡聚糖酶(Saarilahti等,1990,Gene90:9-14)；尖镰孢内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号L29381)；灰腐质霉thermoidea变种内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号AB003107)；Melanocarpusalbomyces内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号MAL515703)；粗糙脉孢菌内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号XM_324477)；特异腐质霉内切葡聚糖酶V；担子菌纲(basidiomycete)CBS495.95内切葡聚糖酶；担子菌纲CBS494.95内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL6B内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL6C内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL7C内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL7E内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL7F内切葡聚糖酶；CladorrhinumfoecundissimumATCC62373CEL7A内切葡聚糖酶；以及里氏木霉菌株VTT-D-80133内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号M15665)。
此类其他纤维二糖水解酶包括里氏木霉纤维二糖水解酶I；里氏木霉纤维二糖水解酶II；特异腐质霉纤维二糖水解酶I；以及嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶II。
此类其他木聚糖酶包括棘孢曲霉木聚糖酶(GeneSeqP:AAR63790；WO94/21785)；烟曲霉木聚糖酶(WO2006/078256)；以及土生梭孢霉NRRL8126木聚糖酶(WO2009/079210)。
此类其他β-木糖苷酶包括里氏木霉β-木糖苷酶(UniProtKB/TrEMBL登录号Q92458)和粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)(SwissProt登录号Q7SOW4)。
此类其他乙酰木聚糖酯酶包括红褐肉座菌(Hypocreajecorina)乙酰木聚糖酯酶(WO2005/001036)；粗糙脉孢菌乙酰木聚糖酯酶(UniProt登录号q7s259)；土生梭孢霉NRRL8126乙酰木聚糖酯酶(WO2009/042846)；球毛壳菌(Chaetomiumglobosum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登录号Q2GWX4)；细丽毛壳菌(Chaetomiumgracile)乙酰木聚糖酯酶(GeneSeqP登录号AAB82124)；颖枯壳针孢(Phaeosphaerianodorum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登录号Q0UHJ1)和特异腐质霉(Humicolainsolens)DSM1800乙酰木聚糖酯酶(WO2009/073709)。
此类其他阿魏酸酯酶包括特异腐质霉DSM1800阿魏酸酯酶(WO2009/076122)；粗糙脉孢菌阿魏酸酯酶(UniProt登录号Q9HGR3)和费希新萨托菌阿魏酸酯酶(UniProt登录号A1D9T4)。
此类其他阿拉伯呋喃糖苷酶包括特异腐质霉DSM1800阿拉伯呋喃糖苷酶(WO2009/073383)和黑曲霉阿拉伯呋喃糖苷酶(GeneSeqP登录号AAR94170)。
此类其他α-葡糖醛酸糖苷酶包括棒曲霉α-葡糖醛酸糖苷酶(UniProt登录号alcc12)；里氏木霉α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登录号Q99024)；埃默森踝节菌α-葡糖醛酸糖苷酶(UniProt登录号Q8X211)；黑曲霉α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登录号Q96WX9)；土曲霉α-葡糖醛酸糖苷酶(SwissProt登录号Q0CJP9)和烟曲霉α-葡糖醛酸糖苷酶(SwissProt登录号Q4WW45)。
用于本发明的酶可为任何适用于本文中所述工艺的形式，如例如去除或未去除细胞的粗发酵液，干粉或颗粒，无粉尘的颗粒，液体，稳定化液体或稳定化受保护的酶。液体酶制备物可根据确立的工艺，例如通过添加稳定剂如糖、糖醇或其他多元醇，和/或乳酸或其他有机酸来稳定化。
本发明的酶组合物特别适用于在高于50℃的温度进行纤维素材料的高温酶水解。纤维素材料例如木素纤维素的高温酶水解与在40-50℃进行的常规糖化相比，具有多种优点。所述优点包括由于在升高的温度热稳定性酶混合物改善的活性而减少的水解时间，减少的污染风险，和由于减少的粘性所致的使用更高生物质加载量的可能性，导致增加的糖和乙醇浓度。
在一个方面，在优选在约40℃至70℃的范围，更优选约50℃至65℃，甚至更优选在约55℃至约63℃的范围，且最优选在约55℃至约60℃的范围的温度，使用本发明的酶组合物。在另一个方面，在至少50℃的温度使用本发明的酶组合物。在另一个方面，在至少55℃的温度使用本发明的酶组合物。在另一个方面，在至少60℃的温度使用本发明的酶组合物。在另一个方面，在至少65℃的温度使用本发明的酶组合物。在另一个方面，在至少70℃的温度使用本发明的酶组合物。
在另一个方面，本发明的酶组合物在55℃，pH3.5至pH6.0，与基于里氏木霉的酶组合物SaMe-MF268在50℃，pH5.0相比，使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少优选至少1.1倍，更优选至少1.25倍，更优选至少1.5倍，更优选至少2倍，更优选至少2.5倍，更优选至少3倍，更优选至少4倍，更优选至少5倍，更优选至少7.5倍，并且最优选至少10倍。
在另一个方面，本发明的酶组合物在60℃，pH3.5至pH6.0，与基于里氏木霉的酶组合物SaMe-MF268在50℃，pH5.0相比，使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少优选至少1.1倍，更优选至少1.25倍，更优选至少1.5倍，更优选至少2倍，更优选至少2.5倍，更优选至少3倍，更优选至少4倍，更优选至少5倍，更优选至少7.5倍，并且最优选至少10倍。
在另一个方面，本发明的酶组合物在65℃，pH3.5至pH6.0，与基于里氏木霉的酶组合物SaMe-MF268在50℃，pH5.0相比，使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少优选至少1.1倍，更优选至少1.25倍，更优选至少1.5倍，更优选至少2倍，更优选至少2.5倍，更优选至少3倍，更优选至少4倍，更优选至少5倍，更优选至少7.5倍，并且最优选至少10倍。
在另一个方面，本发明的酶组合物在70℃，pH3.5至pH6.0，与基于里氏木霉的酶组合物SaMe-MF268在50℃，pH5.0相比，使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少优选至少1.1倍，更优选至少1.25倍，更优选至少1.5倍，更优选至少2倍，更优选至少2.5倍，更优选至少3倍，更优选至少4倍，更优选至少5倍，更优选至少7.5倍，并且最优选至少10倍。
在上述每一个方面，pH3.5至pH6.0的pH范围为pH3.5。在上述每一个方面，pH3.5至pH6.0的pH范围为pH4.0。在上述每一个方面，pH4.0至pH6.0的pH范围为pH4.5。在上述每一个方面，pH4.0至pH6.0的pH范围为pH5.0。在上述每一个方面，pH4.0至pH6.0的pH范围为pH5.5。在上述每一个方面，pH4.0至pH6.0的pH范围为pH6.0。
在上述每一个方面，作为底物的PCS可用任何其他含纤维素材料如玉米纤维、玉米穗轴、橙皮、稻秆、麦秆、柳枝稷、芒草属、甘蔗渣、软木或硬木来替换。可使用任何预处理如本文中所述的那些预处理来预处理所述其他含纤维素材料。
在另一个方面，纤维二糖水解酶I按蛋白计，构成本发明组合物的优选10%至90%，更优选20%至65%，且最优选35%至45%。在另一个方面，纤维二糖水解酶II按蛋白计，构成本发明组合物的优选5%至60%，更优选10%至40%，且最优选20%至30%。在另一个方面，内切葡聚糖酶I按蛋白计，构成本发明组合物的优选1%至30%，更优选2.5%至20%，且最优选5%至10%。在另一个方面，内切葡聚糖酶II按蛋白计，构成本发明组合物的优选1%至30%，更优选2.5%至20%，且最优选5%至10%。在另一个方面，β-葡糖苷酶按蛋白计，构成本发明组合物的优选1%至30%，更优选2.5%至20%，且最优选5%至10%。在另一个方面，GH61蛋白按蛋白计，构成本发明组合物的1%至50%，更优选10%至40%，且最优选15%至25%。在另一个方面，木聚糖酶按蛋白计，构成本发明组合物的1%至30%，更优选2.5%至20%，且最优选5%至10%。在另一个方面，β-木糖苷酶按蛋白计，构成本发明组合物的优选1%至20%，更优选1%至15%，且最优选1%至5%。
在一个方面，本发明的酶组合物包含至少两种组分。在另一个方面，本发明的酶组合物包含至少三种组分。在另一个方面，本发明的酶组合物包含至少四种组分。在另一个方面，本发明的酶组合物包含至少五种组分。在另一个方面，本发明的酶组合物包含至少六种组分。在另一个方面，本发明的酶组合物包含至少七种组分。在另一个方面，本发明的酶组合物包含至少八种组分。在另一个方面，本发明的酶组合物包含至少九种组分。在另一个方面，本发明的酶组合物包含至少十种组分。在另一个方面，本发明的酶组合物包含至少十一种组分。在另一个方面，本发明的酶组合物包含至少十二种组分。
在一个方面，酶组合物包含烟曲霉Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的青霉属菌种GH61A多肽，烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶，烟曲霉GH10C木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含烟曲霉Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的青霉属菌种GH61A多肽，棘孢曲霉GH3β-葡糖苷酶，烟曲霉GH10C木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含烟曲霉Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的青霉属菌种GH61A多肽，烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含烟曲霉Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的青霉属菌种GH61A多肽，棘孢曲霉GH3β-葡糖苷酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含埃默森青霉Cel7CBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的青霉属菌种GH61A多肽，烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶，烟曲霉GH10C木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含埃默森青霉Cel7CBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的青霉属菌种GH61A多肽，棘孢曲霉GH3β-葡糖苷酶，烟曲霉GH10C木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含埃默森青霉Cel7CBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的青霉属菌种GH61A多肽，烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含埃默森青霉Cel7CBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的青霉属菌种GH61A多肽，棘孢曲霉GH3β-葡糖苷酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含桔橙嗜热子囊菌Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的青霉属菌种GH61A多肽，烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶，烟曲霉GH10C木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含桔橙嗜热子囊菌Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的青霉属菌种GH61A多肽，棘孢曲霉GH3β-葡糖苷酶，烟曲霉GH10C木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含桔橙嗜热子囊菌Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的青霉属菌种GH61A多肽，烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含桔橙嗜热子囊菌Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的青霉属菌种GH61A多肽，棘孢曲霉GH3β-葡糖苷酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含烟曲霉Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，烟曲霉Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的青霉属菌种GH61A多肽，烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶，烟曲霉GH10C木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含烟曲霉Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，烟曲霉Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的青霉属菌种GH61A多肽，棘孢曲霉GH3β-葡糖苷酶，烟曲霉GH10C木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含烟曲霉Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，烟曲霉Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的青霉属菌种GH61A多肽，烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含烟曲霉Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，烟曲霉Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的青霉属菌种GH61A多肽，棘孢曲霉GH3β-葡糖苷酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含埃默森青霉Cel7CBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，烟曲霉Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的青霉属菌种GH61A多肽，烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶，烟曲霉GH10C木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含埃默森青霉Cel7CBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，烟曲霉Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的青霉属菌种GH61A多肽，棘孢曲霉GH3β-葡糖苷酶，烟曲霉GH10C木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含埃默森青霉Cel7CBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，烟曲霉Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的青霉属菌种GH61A多肽，烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含埃默森青霉Cel7CBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，烟曲霉Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的青霉属菌种GH61A多肽，棘孢曲霉GH3β-葡糖苷酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含桔橙嗜热子囊菌Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，烟曲霉Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的青霉属菌种GH61A多肽，烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶，烟曲霉GH10C木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含桔橙嗜热子囊菌Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，烟曲霉Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的青霉属菌种GH61A多肽，棘孢曲霉GH3β-葡糖苷酶，烟曲霉GH10C木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含桔橙嗜热子囊菌Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，烟曲霉Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的青霉属菌种GH61A多肽，烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含桔橙嗜热子囊菌Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，烟曲霉Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的青霉属菌种GH61A多肽，棘孢曲霉GH3β-葡糖苷酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含烟曲霉Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61B多肽，烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶，烟曲霉GH10C木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含烟曲霉Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61B多肽，棘孢曲霉GH3β-葡糖苷酶，烟曲霉GH10C木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含烟曲霉Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61B多肽，烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含烟曲霉Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61B多肽，棘孢曲霉GH3β-葡糖苷酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含埃默森青霉Cel7CBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61B多肽，烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶，烟曲霉GH10C木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含埃默森青霉Cel7CBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61B多肽，棘孢曲霉GH3β-葡糖苷酶，烟曲霉GH10C木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含埃默森青霉Cel7CBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61B多肽，烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含埃默森青霉Cel7CBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61B多肽，棘孢曲霉GH3β-葡糖苷酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含桔橙嗜热子囊菌Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61B多肽，烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶，烟曲霉GH10C木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含桔橙嗜热子囊菌Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61B多肽，棘孢曲霉GH3β-葡糖苷酶，烟曲霉GH10C木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含桔橙嗜热子囊菌Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61B多肽，烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含桔橙嗜热子囊菌Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61B多肽，棘孢曲霉GH3β-葡糖苷酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含酶组合物包含烟曲霉Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，烟曲霉Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61B多肽，烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶，烟曲霉GH10C木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含烟曲霉Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，烟曲霉Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61B多肽，棘孢曲霉GH3β-葡糖苷酶，烟曲霉GH10C木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含烟曲霉Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，烟曲霉Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61B多肽，烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含烟曲霉Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，烟曲霉Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61B多肽，棘孢曲霉GH3β-葡糖苷酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含埃默森青霉Cel7CBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，烟曲霉Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61B多肽，烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶，烟曲霉GH10C木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含埃默森青霉Cel7CBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，烟曲霉Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61B多肽，棘孢曲霉GH3β-葡糖苷酶，烟曲霉GH10C木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含埃默森青霉Cel7CBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，烟曲霉Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61B多肽，烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含埃默森青霉Cel7CBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，烟曲霉Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61B多肽，棘孢曲霉GH3β-葡糖苷酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含桔橙嗜热子囊菌Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，烟曲霉Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61B多肽，烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶，烟曲霉GH10C木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含桔橙嗜热子囊菌Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，烟曲霉Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61B多肽，棘孢曲霉GH3β-葡糖苷酶，烟曲霉GH10C木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含桔橙嗜热子囊菌Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，烟曲霉Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61B多肽，烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含桔橙嗜热子囊菌Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，烟曲霉Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61B多肽，棘孢曲霉GH3β-葡糖苷酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含烟曲霉Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶，烟曲霉GH10C木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含烟曲霉Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，棘孢曲霉GH3β-葡糖苷酶，烟曲霉GH10C木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含烟曲霉Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含烟曲霉Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，棘孢曲霉GH3β-葡糖苷酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含埃默森青霉Cel7CBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶，烟曲霉GH10C木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含埃默森青霉Cel7CBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，棘孢曲霉GH3β-葡糖苷酶，烟曲霉GH10C木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含埃默森青霉Cel7CBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含埃默森青霉Cel7CBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，棘孢曲霉GH3β-葡糖苷酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含桔橙嗜热子囊菌Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶，烟曲霉GH10C木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含桔橙嗜热子囊菌Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，棘孢曲霉GH3β-葡糖苷酶，烟曲霉GH10C木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含桔橙嗜热子囊菌Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含桔橙嗜热子囊菌Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，棘孢曲霉GH3β-葡糖苷酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含烟曲霉Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，烟曲霉Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶，烟曲霉GH10C木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含烟曲霉Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，烟曲霉Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，棘孢曲霉GH3β-葡糖苷酶，烟曲霉GH10C木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含烟曲霉Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，烟曲霉Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含烟曲霉Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，烟曲霉Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，棘孢曲霉GH3β-葡糖苷酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含埃默森青霉Cel7CBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，烟曲霉Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶，烟曲霉GH10C木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含埃默森青霉Cel7CBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，烟曲霉Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，棘孢曲霉GH3β-葡糖苷酶，烟曲霉GH10C木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含埃默森青霉Cel7CBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，烟曲霉Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含埃默森青霉Cel7CBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，烟曲霉Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，棘孢曲霉GH3β-葡糖苷酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含桔橙嗜热子囊菌Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，烟曲霉Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶，烟曲霉GH10C木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含桔橙嗜热子囊菌Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，烟曲霉Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，棘孢曲霉GH3β-葡糖苷酶，烟曲霉GH10C木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含桔橙嗜热子囊菌Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，烟曲霉Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含桔橙嗜热子囊菌Cel7ACBHI，烟曲霉Cel6ACBHII，烟曲霉Cel5AEGII，具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，棘孢曲霉GH3β-葡糖苷酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，以及埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。
酶组合物组分及其多核苷酸
在第一个方面，具有纤维二糖水解酶I活性的分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:2的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%的同一性程度，且具有纤维二糖水解酶I活性(在下文中称作“同源多肽”)。在一个优选的方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:2的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有纤维二糖水解酶I的多肽包含或组成为(consistof)SEQIDNO:2的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有纤维二糖水解酶I活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:2的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:2的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:2的氨基酸19至530或其等位变体，或它们具有纤维二糖水解酶I活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:2的氨基酸19至530。
在另一个第一个方面，具有纤维二糖水解酶I活性的分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:4的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%的同一性程度，且具有纤维二糖水解酶I活性(在下文中称作“同源多肽”)。在一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:4的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有纤维二糖水解酶I的多肽包含或组成为SEQIDNO:4的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有纤维二糖水解酶I活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:4的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:4的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:4的氨基酸21至450或其等位变体，或它们具有纤维二糖水解酶I活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:4的氨基酸21至450。
在另一个第一个方面，具有纤维二糖水解酶I活性的分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:6的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%的同一性程度，且具有纤维二糖水解酶I活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:6的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有纤维二糖水解酶I的多肽包含或组成为SEQIDNO:6的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有纤维二糖水解酶I活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:6的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:6的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:6的氨基酸27至532或其等位变体，或它们具有纤维二糖水解酶I活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:6的氨基酸27至532。
在另一个第一个方面，具有纤维二糖水解酶I活性的分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:8的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有纤维二糖水解酶I活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:8的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有纤维二糖水解酶I的多肽包含或组成为SEQIDNO:8的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有纤维二糖水解酶I活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:8的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:8的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:8的氨基酸18至457或其等位变体，或它们具有纤维二糖水解酶I活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:8的氨基酸18至457。
在另一个第一个方面，具有纤维二糖水解酶I活性的分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:158的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有纤维二糖水解酶I活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:158的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有纤维二糖水解酶I的多肽包含或组成为SEQIDNO:158的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有纤维二糖水解酶I活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:158的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:158的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:158的氨基酸19至455或其等位变体，或它们具有纤维二糖水解酶I活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:158的氨基酸19至455。
在另一个第一个方面，具有纤维二糖水解酶I活性的分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:160的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有纤维二糖水解酶I活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:160的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有纤维二糖水解酶I的多肽包含或组成为SEQIDNO:1的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有纤维二糖水解酶I活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:160的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:160的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:160的氨基酸26至529或其等位变体，或它们具有纤维二糖水解酶I活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:160的氨基酸26至529。
在另一个第一个方面，具有纤维二糖水解酶I活性的分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:162的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有纤维二糖水解酶I活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:162的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有纤维二糖水解酶I的多肽包含或组成为SEQIDNO:162的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有纤维二糖水解酶I活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:162的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:162的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:162的氨基酸24至541或其等位变体，或它们具有纤维二糖水解酶I活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:162的氨基酸24至541。
在另一个第一个方面，具有纤维二糖水解酶I活性的分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:164的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有纤维二糖水解酶I活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:164的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有纤维二糖水解酶I的多肽包含或组成为SEQIDNO:164的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有纤维二糖水解酶I活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:164的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:164的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:164的氨基酸27至535或其等位变体，或它们具有纤维二糖水解酶I活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:164的氨基酸27至535。
在另一个第一个方面，具有纤维二糖水解酶I活性的分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:166的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有纤维二糖水解酶I活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:166的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有纤维二糖水解酶I的多肽包含或组成为SEQIDNO:166的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有纤维二糖水解酶I活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:166的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:166的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:166的氨基酸24至526或其等位变体，或它们具有纤维二糖水解酶I活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:166的氨基酸24至526。
在另一个第一个方面，具有纤维二糖水解酶II活性的分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:10的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有纤维二糖水解酶II活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:10的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有纤维二糖水解酶II的多肽包含或组成为SEQIDNO:10的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有纤维二糖水解酶II活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:10的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:10的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:10的氨基酸18至482或其等位变体，或它们具有纤维二糖水解酶II活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:10的氨基酸18至482。
在另一个第一个方面，具有纤维二糖水解酶II活性的分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:12的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有纤维二糖水解酶II活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:12的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有纤维二糖水解酶II的多肽包含或组成为SEQIDNO:12的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有纤维二糖水解酶II活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:12的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:12的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:12的氨基酸18至482或其等位变体，或它们具有纤维二糖水解酶II活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:12的氨基酸18至482。
在另一个第一个方面，具有纤维二糖水解酶II活性的分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:14的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有纤维二糖水解酶II活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:14的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有纤维二糖水解酶II的多肽包含或组成为SEQIDNO:14的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有纤维二糖水解酶II活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:14的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:14的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:14的氨基酸18至481或其等位变体，或它们具有纤维二糖水解酶II活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:14的氨基酸18至481。
在另一个第一个方面，具有纤维二糖水解酶II活性的分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:16的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有纤维二糖水解酶II活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:16的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有纤维二糖水解酶II的多肽包含或组成为SEQIDNO:16的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有纤维二糖水解酶II活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:16的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:16的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:16的氨基酸17至447或其等位变体，或它们具有纤维二糖水解酶II活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:16的氨基酸17至447。
在另一个第一个方面，具有纤维二糖水解酶II活性的分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:18的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有纤维二糖水解酶II活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:18的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有纤维二糖水解酶II的多肽包含或组成为SEQIDNO:18的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有纤维二糖水解酶II活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:18的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:18的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:18的氨基酸20至454或其等位变体，或它们具有纤维二糖水解酶II活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:18的氨基酸20至454。
在另一个第一个方面，具有纤维二糖水解酶II活性的分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:168的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有纤维二糖水解酶II活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:168的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有纤维二糖水解酶II的多肽包含或组成为SEQIDNO:168的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有纤维二糖水解酶II活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:168的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:168的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:168的氨基酸19至469或其等位变体，或它们具有纤维二糖水解酶II活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:168的氨基酸19至469。
在另一个第一个方面，具有纤维二糖水解酶II活性的分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:170的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有纤维二糖水解酶II活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:170的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有纤维二糖水解酶II的多肽包含或组成为SEQIDNO:170的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有纤维二糖水解酶II活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:170的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:170的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:170的氨基酸20至459或其等位变体，或它们具有纤维二糖水解酶II活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:170的氨基酸20至459。
在另一个第一个方面，具有纤维二糖水解酶II活性的分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:172的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有纤维二糖水解酶II活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:172的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有纤维二糖水解酶II的多肽包含或组成为SEQIDNO:172的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有纤维二糖水解酶II活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:172的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:172的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:172的氨基酸20至457或其等位变体，或它们具有纤维二糖水解酶II活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:172的氨基酸20至457。
在另一个第一个方面，具有内切葡聚糖酶I活性的分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:20的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有内切葡聚糖酶I活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:20的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有内切葡聚糖酶I的多肽包含或组成为SEQIDNO:20的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有内切葡聚糖酶I活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:20的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:20的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:20的氨基酸22至471或其等位变体，或它们具有内切葡聚糖酶I活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:20的氨基酸22至471。
在另一个第一个方面，具有内切葡聚糖酶II活性的分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:22的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有内切葡聚糖酶II活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:22的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有内切葡聚糖酶II的多肽包含或组成为SEQIDNO:22的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有内切葡聚糖酶II活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:22的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:22的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:22的氨基酸22至418或其等位变体，或它们具有内切葡聚糖酶II活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:22的氨基酸22至418。
在另一个第一个方面，具有内切葡聚糖酶II活性的分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:24的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有内切葡聚糖酶II活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:24的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有内切葡聚糖酶II的多肽包含或组成为SEQIDNO:24的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有内切葡聚糖酶II活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:24的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:24的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:24的氨基酸17至389或其等位变体，或它们具有内切葡聚糖酶II活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:24的氨基酸17至389。
在另一个第一个方面，具有内切葡聚糖酶II活性的分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:26的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有内切葡聚糖酶I活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:26的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在另一个第一个方面，具有内切葡聚糖酶II活性的分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:174的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有内切葡聚糖酶II活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:174的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有内切葡聚糖酶II的多肽包含或组成为SEQIDNO:174的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有内切葡聚糖酶II活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:174的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:174的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:174的氨基酸19至329或其等位变体，或它们具有内切葡聚糖酶II活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:174的氨基酸19至329。
在另一个第一个方面，具有内切葡聚糖酶II活性的分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:176的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有内切葡聚糖酶II活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:176的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有内切葡聚糖酶II的多肽包含或组成为SEQIDNO:176的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有内切葡聚糖酶II活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:176的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:176的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:176的氨基酸17至412或其等位变体，或它们具有内切葡聚糖酶II活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:176的氨基酸17至412。
在一个方面，具有内切葡聚糖酶II的多肽包含或组成为SEQIDNO:26的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有内切葡聚糖酶II活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:26的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:26的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:26的氨基酸31至335或其等位变体，或它们具有内切葡聚糖酶II活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:26的氨基酸31至335。
在另一个第一个方面，具有β-葡糖苷酶活性的分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:28的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有β-葡糖苷酶活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:28的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有β-葡糖苷酶的多肽包含或组成为SEQIDNO:28的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有β-葡糖苷酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:28的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:28的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:28的氨基酸20至863或其等位变体，或它们具有β-葡糖苷酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:28的氨基酸20至863。
在另一个第一个方面，具有β-葡糖苷酶活性的分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:30的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有β-葡糖苷酶活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:30的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有β-葡糖苷酶的多肽包含或组成为SEQIDNO:30的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有β-葡糖苷酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:30的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:30的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:30的氨基酸37至878或其等位变体，或它们具有β-葡糖苷酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:30的氨基酸37至878。
在另一个第一个方面，具有β-葡糖苷酶活性的分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:32的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有β-葡糖苷酶活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:32的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有β-葡糖苷酶的多肽包含或组成为SEQIDNO:32的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有β-葡糖苷酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:32的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:32的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:32的氨基酸20至860或其等位变体，或它们具有β-葡糖苷酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:32的氨基酸20至860。
在另一个第一个方面，具有β-葡糖苷酶活性的分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:178的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有β-葡糖苷酶活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:178的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有β-葡糖苷酶的多肽包含或组成为SEQIDNO:178的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有β-葡糖苷酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:178的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:178的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:178的氨基酸20至680或其等位变体，或它们具有β-葡糖苷酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:178的氨基酸20至680。
在另一个第一个方面，具有β-葡糖苷酶活性的分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:180的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有β-葡糖苷酶活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:180的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有β-葡糖苷酶的多肽包含或组成为SEQIDNO:180的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有β-葡糖苷酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:180的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:180的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:180的氨基酸20至860或其等位变体，或它们具有β-葡糖苷酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:180的氨基酸20至860。
在另一个第一个方面，具有β-葡糖苷酶活性的分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:182的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有β-葡糖苷酶活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:182的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有β-葡糖苷酶的多肽包含或组成为SEQIDNO:182的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有β-葡糖苷酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:182的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:182的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:182的氨基酸19至860或其等位变体，或它们具有β-葡糖苷酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:182的氨基酸19至860。
在另一个第一个方面，具有β-葡糖苷酶活性的分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:184的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有β-葡糖苷酶活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:184的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有β-葡糖苷酶的多肽包含或组成为SEQIDNO:184的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有β-葡糖苷酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:184的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:184的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:184的氨基酸19至872或其等位变体，或它们具有β-葡糖苷酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:184的氨基酸19至872。
在另一个第一个方面，具有β-葡糖苷酶活性的分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:186的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有β-葡糖苷酶活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:186的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有β-葡糖苷酶的多肽包含或组成为SEQIDNO:186的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有β-葡糖苷酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:186的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:186的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:186的氨基酸22至883或其等位变体，或它们具有β-葡糖苷酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:186的氨基酸22至883。
在另一个第一个方面，具有β-葡糖苷酶活性的分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:188的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有β-葡糖苷酶活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:188的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有β-葡糖苷酶的多肽包含或组成为SEQIDNO:188的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有β-葡糖苷酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:188的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:188的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:188的氨基酸22至861或其等位变体，或它们具有β-葡糖苷酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:188的氨基酸22至861。
在另一个第一个方面，具有β-葡糖苷酶活性的分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:190的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有β-葡糖苷酶活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:190的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有β-葡糖苷酶的多肽包含或组成为SEQIDNO:190的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有β-葡糖苷酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:190的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:190的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:190的氨基酸22至861或其等位变体，或它们具有β-葡糖苷酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:190的氨基酸22至861。
在另一个第一个方面，具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:34的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有纤维素分解增强活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:34的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有纤维素分解增强活性的多肽包含或组成为SEQIDNO:34的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:34的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:34的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:34的氨基酸23至250或其等位变体，或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:34的氨基酸23至250。
在另一个第一个方面，具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:36的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有纤维素分解增强活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:36的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有纤维素分解增强活性的多肽包含或组成为SEQIDNO:36的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:36的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:36的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:36的氨基酸20至258或其等位变体，或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:36的氨基酸20至258。
在另一个第一个方面，具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:38的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有纤维素分解增强活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:38的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有纤维素分解增强活性的多肽包含或组成为SEQIDNO:38的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:38的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:38的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:38的氨基酸22至250或其等位变体，或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:38的氨基酸22至250。
在另一个第一个方面，具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:40的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有纤维素分解增强活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:40的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有纤维素分解增强活性的多肽包含或组成为SEQIDNO:40的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:40的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:40的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:40的氨基酸22至322或其等位变体，或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:40的氨基酸22至322。
在另一个第一个方面，具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:42的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有纤维素分解增强活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:42的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有纤维素分解增强活性的多肽包含或组成为SEQIDNO:42的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:42的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:42的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:42的氨基酸26至253或其等位变体，或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:42的氨基酸26至253。
在另一个第一个方面，具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:44的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有纤维素分解增强活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:44的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有纤维素分解增强活性的多肽包含或组成为SEQIDNO:44的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:44的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:44的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:44的氨基酸22至368或其等位变体，或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:44的氨基酸22至368。
在另一个第一个方面，具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:192的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有纤维素分解增强活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:192的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有纤维素分解增强活性的多肽包含或组成为SEQIDNO:192的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:192的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:192的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:186的氨基酸23至251或其等位变体，或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:186的氨基酸23至251。
在另一个第一个方面，具有木聚糖酶活性的分离的GH10多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:46的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有木聚糖酶活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:46的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有木聚糖酶活性的GH10多肽包含或组成为SEQIDNO:46的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有木聚糖酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:46的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:46的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:46的氨基酸23至406或其等位变体，或它们具有木聚糖酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:46的氨基酸23至406。
在另一个第一个方面，具有木聚糖酶活性的分离的GH10多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:48的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有木聚糖酶活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:48的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有木聚糖酶活性的GH10多肽包含或组成为SEQIDNO:48的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有木聚糖酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:48的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:48的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:48的氨基酸20至397或其等位变体，或它们具有木聚糖酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:48的氨基酸20至397。
在另一个第一个方面，具有木聚糖酶活性的分离的GH10多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:50的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有木聚糖酶活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:50的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有木聚糖酶活性的GH10多肽包含或组成为SEQIDNO:50的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有木聚糖酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:50的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:50的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:50的氨基酸20至398或其等位变体，或它们具有木聚糖酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:50的氨基酸20至398。
在另一个第一个方面，具有木聚糖酶活性的分离的GH10多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:52的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有木聚糖酶活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:52的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有木聚糖酶活性的GH10多肽包含或组成为SEQIDNO:50的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有木聚糖酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:52的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:52的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:52的氨基酸20至407或其等位变体，或它们具有木聚糖酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:52的氨基酸20至407。
在另一个第一个方面，具有木聚糖酶活性的分离的GH10多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:54的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有木聚糖酶活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:54的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有木聚糖酶活性的GH10多肽包含或组成为SEQIDNO:50的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有木聚糖酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:54的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:54的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:54的氨基酸20至395或其等位变体，或它们具有木聚糖酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:54的氨基酸20至395。
在另一个第一个方面，具有木聚糖酶活性的分离的GH10多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:194的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有木聚糖酶活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:194的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
具有木聚糖酶活性的GH10多肽包含或组成为SEQIDNO:194的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有木聚糖酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:194的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:194的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:194的氨基酸24至403或其等位变体，或它们具有木聚糖酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:194的氨基酸24至403。
在另一个第一个方面，具有木聚糖酶活性的分离的GH10多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:196的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有木聚糖酶活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:196的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有木聚糖酶活性的GH10多肽包含或组成为SEQIDNO:196的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有木聚糖酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:196的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:196的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:196的氨基酸24至403或其等位变体，或它们具有木聚糖酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:196的氨基酸24至403。
在另一个第一个方面，具有木聚糖酶活性的分离的GH10多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:198的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有木聚糖酶活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:198的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
具有木聚糖酶活性的GH10多肽包含或组成为SEQIDNO:198的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有木聚糖酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:198的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:198的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:198的氨基酸20至396或其等位变体，或它们具有木聚糖酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:198的氨基酸20至396。
在另一个第一个方面，具有木聚糖酶活性的分离的GH11多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:56的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有木聚糖酶活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:56的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有木聚糖酶活性的GH11多肽包含或组成为SEQIDNO:56的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有木聚糖酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:56的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:56的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:56的氨基酸43至338或其等位变体，或它们具有木聚糖酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:56的氨基酸43至338。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:56的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽组成为SEQIDNO:56的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有木聚糖酶活性的片段。
在另一个第一个方面，具有木聚糖酶活性的分离的GH11多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:200或SEQIDNO:305的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有木聚糖酶活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:200或SEQIDNO:305的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
具有木聚糖酶活性的GH11多肽包含或组成为SEQIDNO:200的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有木聚糖酶活性的片段，或者SEQIDNO:305的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有木聚糖酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:200或SEQIDNO:305的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:200或SEQIDNO:305的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:200的氨基酸25至360或其等位变体，或它们具有木聚糖酶活性的片段，或者SEQIDNO:305的氨基酸29至231或其具有木聚糖酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:200的氨基酸25至360或SEQIDNO:305的氨基酸29至231。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:200的氨基酸25至360或SEQIDNO:305的氨基酸29至231。
在另一个第一个方面，具有β-木糖苷酶活性的分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:58的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有β-木糖苷酶活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:58的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有β-木糖苷酶活性的多肽包含或组成为SEQIDNO:58的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有β-木糖苷酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:58的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:58的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:58的氨基酸21至797或其等位变体，或它们具有β-木糖苷酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:58的氨基酸21至797。
在另一个第一个方面，具有β-木糖苷酶活性的分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:60的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有β-木糖苷酶活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:60的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有β-木糖苷酶活性的多肽包含或组成为SEQIDNO:60的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有β-木糖苷酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:60的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:60的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:60的氨基酸22至795或其等位变体，或它们具有β-木糖苷酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:60的氨基酸22至795。
在另一个第一个方面，具有β-木糖苷酶活性的分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:202的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有β-木糖苷酶活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:202的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有β-木糖苷酶活性的多肽包含或组成为SEQIDNO:202的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有β-木糖苷酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:202的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:202的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:202的氨基酸18至803或其等位变体，或它们具有β-木糖苷酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:202的氨基酸18至803。
在一个方面，具有β-木糖苷酶活性的多肽包含或组成为SEQIDNO:204的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有β-木糖苷酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:204的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:204的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:204的氨基酸18至817或其等位变体，或它们具有β-木糖苷酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:204的氨基酸18至817。
在另一个第一个方面，具有β-木糖苷酶活性的分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:206的成熟多肽具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%的同一性程度，且具有β-木糖苷酶活性(在下文中称作“同源多肽”)。在另一个方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:206的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
在一个方面，具有β-木糖苷酶活性的多肽包含或组成为SEQIDNO:206的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有β-木糖苷酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:206的氨基酸序列。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:206的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:206的氨基酸21至792或其等位变体，或它们具有β-木糖苷酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:206的氨基酸21至792。
在第二个方面，具有纤维二糖水解酶I活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链(J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatis,1989,见上)。
在另一个第二个方面，具有纤维二糖水解酶I活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有纤维二糖水解酶I活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:5的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:5的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有纤维二糖水解酶I活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:7的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:7的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有纤维二糖水解酶I活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:157的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:157的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有纤维二糖水解酶I活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:159的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:159的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有纤维二糖水解酶I活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:161的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:161的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有纤维二糖水解酶I活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:163的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:163的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有纤维二糖水解酶I活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:165的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:165的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有纤维二糖水解酶II活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:9的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:9的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有纤维二糖水解酶II活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:11的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:11的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有纤维二糖水解酶II活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:13的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:13的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有纤维二糖水解酶II活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:15的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:15的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有纤维二糖水解酶II活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:17的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:17的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有纤维二糖水解酶II活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:167的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:167的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有纤维二糖水解酶II活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:169的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:169的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有纤维二糖水解酶II活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:171的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:171的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有内切葡聚糖酶I活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:19的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:19的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有内切葡聚糖酶II活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:21的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:21的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有内切葡聚糖酶II活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:23的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:23的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有内切葡聚糖酶II活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:25的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:25的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有内切葡聚糖酶II活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:173的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:173的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有内切葡聚糖酶II活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:175的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:175的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有β-葡糖苷酶活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:27的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:27的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有β-葡糖苷酶活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:29的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:29的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有β-葡糖苷酶活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:31的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:31的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有β-葡糖苷酶活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:177的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:177的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有β-葡糖苷酶活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:179的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:179的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有β-葡糖苷酶活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:181的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:181的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有β-葡糖苷酶活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:183的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:183的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有β-葡糖苷酶活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:185的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:185的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有β-葡糖苷酶活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:187的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:187的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有β-葡糖苷酶活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:189的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:189的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:33的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:33的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:35的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:35的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:37的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:37的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:39的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:39的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:41的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:41的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:43的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:43的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有木聚糖酶活性的分离的GH10多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中等严格条件下，更优选中-高严格条件下，甚至更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:191的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:191的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有木聚糖酶活性的分离的GH10多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:45的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:45的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有木聚糖酶活性的分离的GH10多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:47的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:47的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有木聚糖酶活性的分离的GH10多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中等严格条件下，更优选中-高严格条件下，甚至更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:49的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:49的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有木聚糖酶活性的分离的GH10多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中等严格条件下，更优选中-高严格条件下，甚至更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:51的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:51的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有木聚糖酶活性的分离的GH10多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中等严格条件下，更优选中-高严格条件下，甚至更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:53的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:53的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有木聚糖酶活性的分离的GH10多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中等严格条件下，更优选中-高严格条件下，甚至更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:193的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:193的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有木聚糖酶活性的分离的GH10多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中等严格条件下，更优选中-高严格条件下，甚至更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:195的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:195的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有木聚糖酶活性的分离的GH10多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中等严格条件下，更优选中-高严格条件下，甚至更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:197的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:197的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有木聚糖酶活性的分离的GH11多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中等严格条件下，更优选中-高严格条件下，甚至更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与SEQIDNO:55的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
在另一个第二个方面，具有木聚糖酶活性的分离的GH11多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中等严格条件下，更优选中-高严格条件下，甚至更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与SEQIDNO:199或304的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
在另一个第二个方面，具有β-木糖苷酶活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中等严格条件下，更优选中-高严格条件下，甚至更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:57的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:57的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有β-木糖苷酶活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中等严格条件下，更优选中-高严格条件下，甚至更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:59的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:59的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有β-木糖苷酶活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中等严格条件下，更优选中-高严格条件下，甚至更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:201的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:201的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有β-木糖苷酶活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中等严格条件下，更优选中-高严格条件下，甚至更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:203的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:203的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第二个方面，具有β-木糖苷酶活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选中等严格条件下，更优选中-高严格条件下，甚至更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:205的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:205的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
SEQIDNO:1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，157，159，161，163，165，167，169，171，173，175，177，179，181，183，185，187，189，191，193，195，197，199，201，203或205的核苷酸序列；或其亚序列；以及SEQIDNO:2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，158，160，162，164，166，168，170，172，174，176，178，180，182，184，186，188，190，192，194，196，198，200，202，204或206的氨基酸序列；或其片段可用于设计核酸探针，以根据本领域内公知的方法从不同属和种的菌株鉴定和克隆编码具有酶活性的多肽的DNA。具体而言，根据标准的Southern印迹方法，可将这些探针用于与感兴趣的属或种的基因组DNA或cDNA杂交，以鉴定和分离其中相应的基因。这些探针可显著地短于完整序列，但长度上应为至少14，优选至少25，更优选至少35，且最优选至少70个核苷酸。然而，优选所述核酸探针是至少100个核苷酸的长度。举例而言，所述核酸探针可为至少200个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选至少400个核苷酸，或最优选至少500个核苷酸。可使用甚至更长的探针，例如优选至少600个核苷酸，更优选至少700个核苷酸，甚至更优选至少800个核苷酸，或最优选至少900个核苷酸的长度的核酸探针。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以检测相应的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。这些探针涵盖于本发明中。
因此，可就与如上所述的探针杂交并编码具有酶或生物活性的多肽的DNA来筛选从此类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库。可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来从此类其他菌株分离基因组或其他DNA。可将来自文库的DNA或分离的DNA转移至并固定于硝酸纤维素或其他合适的载体材料上。为了鉴定与SEQIDNO:1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，157，159，161，163，165，167，169，171，173，175，177，179，181，183，185，187，189，191，193，195，197，199，201，203或205或其亚序列同源的克隆或DNA，优选将所述载体材料用于Southern印迹。
就本发明而言，杂交表明核苷酸序列与标记的核酸探针在非常低至非常高严格条件下杂交，所述核酸探针对应于SEQIDNO:1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，157，159，161，163，165，167，169，171，173，175，177，179，181，183，185，187，189，191，193，195，197，199，201，203或205的成熟多肽编码序列；SEQIDNO:1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，157，159，161，163，165，167，169，171，173，175，177，179，181，183，185，187，189，191，193，195，197，199，201，203或205的成熟多肽编码序列的cDNA序列或基因组DNA序列；它们的全长互补链；或它们的亚序列。在这些条件下与所述核酸探针杂交的分子可使用例如X射线片检测。
在一个方面，核酸探针是SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:1的核苷酸55至1590。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:2的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:1。在另一个方面，核酸探针是包含于嗜热毛壳菌CGMCC0581中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于嗜热毛壳菌CGMCC0581中的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:3的核苷酸61至1350。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:4的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:3。在另一个方面，核酸探针是包含于嗜热毁丝霉CBS117.65中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于嗜热毁丝霉CBS117.65中的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:5的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:5的核苷酸79至1596。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:6的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:5。在另一个方面，核酸探针是包含于烟曲霉NN055679中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于烟曲霉NN055679中的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:7的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:7的核苷酸52至1374。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:8的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:7。在另一个方面，核酸探针是包含于桔橙嗜热子囊菌CGMCC0583中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于桔橙嗜热子囊菌CGMCC0583中的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:157的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:157的核苷酸55至1428。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:158的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:157。在另一个方面，核酸探针是包含于埃默森青霉NN051602中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于埃默森青霉NN051602中的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:159的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:159的核苷酸76至1590。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:160的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:159。在另一个方面，核酸探针是包含于嗜松青霉NN046877中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于嗜松青霉NN046877中的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:161的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:161的核苷酸52至1374。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:162的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:161。在另一个方面，核酸探针是包含于土曲霉ATCC28865中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于土曲霉ATCC28865中的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:163的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:163的核苷酸79至1605。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:164的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:162。在另一个方面，核酸探针是包含于费希新萨托菌NRRL181中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于费希新萨托菌NRRL181中的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:165的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:165的核苷酸52至1374。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:166的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:165。在另一个方面，核酸探针是包含于构巢曲霉FGSCA4中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于构巢曲霉FGSCA4中的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:9的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:9的核苷酸52至1799。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:10的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:9。在另一个方面，核酸探针是包含于嗜热毁丝霉CBS117.65中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于嗜热毁丝霉CBS117.65中的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:11的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:11的核苷酸52至1809。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:12的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:11。在另一个方面，核酸探针是包含于大肠杆菌NRRLB-50059或包含于嗜热毁丝霉CBS202.73的质粒pSMai182中包含的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于大肠杆菌NRRLB-50059或包含于嗜热毁丝霉CBS202.73的质粒pSMai182中包含的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:13的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:13的核苷酸52至1443。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:14的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:13。在另一个方面，核酸探针是包含于大肠杆菌NRRLB-30802中的质粒pTter6A中包含的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于大肠杆菌NRRLB-30802中的质粒pTter6A中包含的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:15的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:15的核苷酸109至1401。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:16的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:15。在另一个方面，核酸探针是包含于大肠杆菌DSM23379中的质粒pMStr199中包含的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于大肠杆菌DSM23379中的质粒pMStr199中包含的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:17的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:17的核苷酸58至1700。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:18的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:17。在另一个方面，核酸探针是包含于烟曲霉NN055679中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于烟曲霉NN055679中的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:167的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:167的核苷酸55至1749。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:168的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:167。在另一个方面，核酸探针是FennellianiveaNN046949中包含的或包含于大肠杆菌DSM24143中的pGEM-T-CBHII46949-2中包含的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是FennellianiveaNN046949中包含的或包含于大肠杆菌DSM24143中的pGEM-T-CBHII46949-2中包含的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:169的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:169的核苷酸58至1744。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:170的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:169。在另一个方面，核酸探针是包含于埃默森青霉NN051602中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于埃默森青霉NN051602中的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:171的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:171的核苷酸58至1701。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:172的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:171。在另一个方面，核酸探针是包含于嗜松青霉NN046877中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于嗜松青霉NN046877中的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:19的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:19的核苷酸64至1502。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:20的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:19。在另一个方面，核酸探针是包含于土曲霉ATCC28865中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有内切葡聚糖酶I活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于土曲霉ATCC28865中的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:21的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:21的核苷酸64至1524。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:22的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:21。在另一个方面，核酸探针是包含于里氏木霉RutC30中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有内切葡聚糖酶II活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于里氏木霉RutC30中的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:23的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:23的核苷酸67至1185。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:24的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:23。在另一个方面，核酸探针是包含于大肠杆菌NRRLB-30902中的质粒pCIC161中包含的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有内切葡聚糖酶II活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于大肠杆菌NRRLB-30902中的质粒pCIC161中包含的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:25的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:25的核苷酸91至1005。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:26的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:25。在另一个方面，核酸探针是包含于桔橙嗜热子囊菌CGMCC0670中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有内切葡聚糖酶II活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于桔橙嗜热子囊菌CGMCC0670中的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:173的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:173的核苷酸55至1260。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:174的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:173。在另一个方面，核酸探针是包含于烟曲霉NN051616中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有内切葡聚糖酶II活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于烟曲霉NN051616中的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:175的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:175的核苷酸49至1378。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:176的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:175。在另一个方面，核酸探针是包含于费希新萨托菌NRRL181中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有内切葡聚糖酶II活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于费希新萨托菌NRRL181中的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:27的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:27的核苷酸58至2580。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:28的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:27。在另一个方面，核酸探针是包含于大肠杆菌NRRLB-30695中的质粒pEJG113中包含的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于大肠杆菌NRRLB-30695中的质粒pEJG113中包含的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:29的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:29的核苷酸171至2753。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:30的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:29。在另一个方面，核酸探针是包含于大肠杆菌NRRLB-30860中的质粒pKKAB中包含的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于大肠杆菌NRRLB-30860中的质粒pKKAB中包含的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:31的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:31的核苷酸58至2934。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:32的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:31。在另一个方面，核酸探针是包含于黑曲霉IBT10140中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于黑曲霉IBT10140中的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:177的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:177的核苷酸58至2937。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:178的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:177。在另一个方面，核酸探针是包含于构巢曲霉WDCM190中的多核苷酸序列，其编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于构巢曲霉WDCM190中的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:179的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:179的核苷酸58至2932。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:180的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:179。在另一个方面，核酸探针是包含于川地曲霉IFO4308中的多核苷酸序列，其编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于川地曲霉IFO4308中的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:181的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:181的核苷酸55至3059。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:182的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:181。在另一个方面，核酸探针是包含于棒曲霉NRRL1中的多核苷酸序列，其编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于棒曲霉NRRL1中的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:183的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:183的核苷酸55至3029。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:184的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:183。在另一个方面，核酸探针是包含于土生梭孢霉NRRL8126中的多核苷酸序列，其编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于土生梭孢霉NRRL8126中的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:185的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:185的核苷酸64至2790。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:186的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:185。在另一个方面，核酸探针是包含于大肠杆菌B-50395中的pUC19D55EX包含的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于大肠杆菌B-50395中的pUC19D55EX包含的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:187的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:187的核苷酸64至2790。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:188的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:187。在另一个方面，核酸探针是包含于草酸青霉IBT5387中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于草酸青霉IBT5387中的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:189的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:189的核苷酸58至2961。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:190的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:189。在另一个方面，核酸探针是包含于埃默森踝节菌CBS549.92中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于埃默森踝节菌CBS549.92中的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:33的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:33的核苷酸67至796。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:34的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:33。在另一个方面，核酸探针是包含于大肠杆菌NRRLB-30704中的质粒pDZA2-7包含的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于大肠杆菌NRRLB-30704中的质粒pDZA2-7包含的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:35的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:35的核苷酸58至900。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:36的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:35。在另一个方面，核酸探针是包含于大肠杆菌NRRLB-30814中的质粒pTter61E包含的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于大肠杆菌NRRLB-30814中的质粒pTter61E包含的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:37的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:37的核苷酸64至859。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:38的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:37。在另一个方面，核酸探针是包含于烟曲霉NN051616中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于烟曲霉NN051616中的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:39的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:39的核苷酸64至1018。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:40的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:39。在另一个方面，核酸探针是包含于嗜松青霉NN046877中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于大肠杆菌DSM22711中的质粒pGEM-T-Ppin7中包含的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:41的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:41的核苷酸76至832。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:42的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:41。在另一个方面，核酸探针是包含于大肠杆菌DSM22882中的质粒pGEM-T-GH61D23Y4中包含的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于大肠杆菌DSM22882中的质粒pGEM-T-GH61D23Y4中包含的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:43的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:43的核苷酸64至1104。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:44的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:43。在另一个方面，核酸探针是包含于大肠杆菌NRRLB-50320中的质粒pAG68中包含的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于大肠杆菌NRRLB-50320中的质粒pAG68中包含的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:191的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:191的核苷酸64至1104。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:192的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:191。在另一个方面，核酸探针是包含于大肠杆菌DSM22656中的质粒pGEM-T-GH61a51486中包含的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于大肠杆菌DSM22656中的质粒pGEM-T-GH61a51486中包含的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:45的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:45的核苷酸69至1314。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:46的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:45。在另一个方面，核酸探针是包含于棘孢曲霉CBS101.43中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有木聚糖酶活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于棘孢曲霉CBS101.43中的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:47的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:47的核苷酸107至1415。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:48的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:47。在另一个方面，核酸探针是包含于大肠杆菌NRRLB-30703中的质粒pHyGe001中包含的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有木聚糖酶活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于大肠杆菌NRRLB-30703中的质粒pHyGe001中包含的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:49的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:49的核苷酸58至1194。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:50的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:49。在另一个方面，核酸探针是包含于大肠杆菌NRRLB-50309中的质粒pTF12Xyl170中包含的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有木聚糖酶活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于大肠杆菌NRRLB-50309中的质粒pTF12Xyl170中包含的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:51的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:51的核苷酸58至1439。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:52的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:51。在另一个方面，核酸探针是包含于大肠杆菌DSM22922中的质粒pGEM-T-Ppin3中包含的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有木聚糖酶活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于大肠杆菌DSM22922中的质粒pGEM-T-Ppin3中包含的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:53的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:53的核苷酸58至1185。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:54的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:53。在另一个方面，核酸探针是包含于土生梭孢霉NRRL8126中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有木聚糖酶活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于土生梭孢霉NRRL8126中的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:193的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:193的核苷酸70至1383。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:194的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:193。在另一个方面，核酸探针是包含于埃默森踝节菌NN050022中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有木聚糖酶活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于埃默森踝节菌NN050022中的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:195的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:195的核苷酸70至1384。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:196的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:195。在另一个方面，核酸探针是包含于大肠杆菌NRRLB-50266中的pMMar26中包含的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有木聚糖酶活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于大肠杆菌NRRLB-50266中的pMMar26中包含的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:197的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:197的核苷酸58至1188。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:198的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:197。在另一个方面，核酸探针是包含于大肠杆菌DSM10361中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有木聚糖酶活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于大肠杆菌DSM10361中的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:55的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:55的核苷酸127至1014。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:56的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:55。在另一个方面，核酸探针是包含于ThermobifidafuscaDSM22883中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有木聚糖酶活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于ThermobifidafuscaDSM22883中的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:55的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:55的核苷酸85至693。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:56的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:55。在另一个方面，核酸探针是包含于嗜热网球菌ATCC35947中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有木聚糖酶活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于嗜热网球菌ATCC35947中的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:57的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:57的核苷酸61至2391。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:58的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:57。在另一个方面，核酸探针是包含于里氏木霉RutC30中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有β-木糖苷酶活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于里氏木霉RutC30中的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:59的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:59的核苷酸64至2388。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:60的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:59。在另一个方面，核酸探针是包含于埃默森踝节菌CBS393.64中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有β-木糖苷酶活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于埃默森踝节菌CBS393.64中的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:201的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:201的核苷酸52至2409。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:202的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:201。在另一个方面，核酸探针是包含于棘孢曲霉CBS172.66中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有β-木糖苷酶活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于棘孢曲霉CBS172.66中的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:203的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:203的核苷酸52至2451。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:204的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:203。在另一个方面，核酸探针是包含于棘孢曲霉CBS186.67中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有β-木糖苷酶活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于棘孢曲霉CBS186.67中的成熟多肽编码区。
在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:205的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:205的核苷酸61至2376。在另一个方面，核酸探针是编码SEQIDNO:206的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQIDNO:205。在另一个方面，核酸探针是包含于烟曲霉NN051616中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有β-木糖苷酶活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含于烟曲霉NN051616中的成熟多肽编码区。
对于长度至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严格条件定义为在42℃，在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA中，并且对于非常低和低严格性为25%的甲酰胺、对于中和中-高严格性为35%的甲酰胺、或对于高和非常高严格性为50%的甲酰胺，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交最佳12至24小时。使用2XSSC、0.2%SDS在45℃(非常低严格性)，在50℃(低严格性)，在55℃(中严格性)，在60℃(中-高严格性)，在65℃(高严格性)，在70℃(非常高严格性)将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将严格条件定义为在比根据Bolton和McCarthy计算法(1962,Natl.Acad.Sci.USA48:1390)得出的Tm低大约5℃至大约10℃，在0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6，6mMEDTA，0.5%NP-40，1×Denhardt溶液，1mM焦磷酸钠(sodiumpyrophosphate)，1mM磷酸二氢钠(sodiummonobasicphosphate)，0.1mMATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交和杂交最佳12至24小时。将所述载体材料在6×SSC加0.1%SDS中洗涤一次15分钟，并用6×SSC在比计算的Tm低5℃至10℃的温度最终洗涤两次，每次15分钟。
在一个第三个方面，具有纤维二糖水解酶I活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有纤维二糖水解酶I活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有纤维二糖水解酶I活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:5的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有纤维二糖水解酶I活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:7的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有纤维二糖水解酶I活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:157的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有纤维二糖水解酶I活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:159的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有纤维二糖水解酶I活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:161的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有纤维二糖水解酶I活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:163的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有纤维二糖水解酶I活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:165的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有纤维二糖水解酶II活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:9的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有纤维二糖水解酶II活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:11的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有纤维二糖水解酶II活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:13的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有纤维二糖水解酶II活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:15的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有纤维二糖水解酶II活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:17的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有纤维二糖水解酶II活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:167的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有纤维二糖水解酶II活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:169的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有纤维二糖水解酶II活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:171的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有内切葡聚糖酶I活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:19的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有内切葡聚糖酶I活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有内切葡聚糖酶II活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:21的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有内切葡聚糖酶II活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有内切葡聚糖酶II活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:23的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有内切葡聚糖酶II活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有内切葡聚糖酶II活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:25的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有内切葡聚糖酶II活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有内切葡聚糖酶II活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:173的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有内切葡聚糖酶II活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有内切葡聚糖酶II活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:175的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有内切葡聚糖酶II活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有β-葡聚糖酶活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:27的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有β-葡聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有β-葡聚糖酶活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:29的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有β-葡聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有β-葡聚糖酶活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:31的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有β-葡聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有β-葡聚糖酶活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:177的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有β-葡聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有β-葡聚糖酶活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:179的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有β-葡聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有β-葡聚糖酶活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:181的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有β-葡聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有β-葡聚糖酶活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:183的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有β-葡聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有β-葡聚糖酶活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:185的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有β-葡聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有β-葡聚糖酶活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:187的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有β-葡聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有β-葡聚糖酶活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:189的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有β-葡聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:33的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有纤维素分解增强活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:35的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有纤维素分解增强活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:37的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有纤维素分解增强活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:39的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有纤维素分解增强活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:41的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有纤维素分解增强活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:43的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有纤维素分解增强活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:191的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有纤维素分解增强活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有木聚糖酶活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:45的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有木聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有木聚糖酶活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:47的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有木聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有木聚糖酶活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:49的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有木聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有木聚糖酶活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:51的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有木聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有木聚糖酶活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:53的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有木聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有木聚糖酶活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:193的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有木聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有木聚糖酶活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:195的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有木聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有木聚糖酶活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:197的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有木聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有木聚糖酶活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:55的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有木聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有木聚糖酶活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:199或SEQIDNO:304的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有木聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有β-木糖苷酶活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:57的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有β-木糖苷酶活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有β-木糖苷酶活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:59的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有β-木糖苷酶活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有β-木糖苷酶活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:201的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有β-木糖苷酶活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有β-木糖苷酶活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:203的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有β-木糖苷酶活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个第三个方面，具有β-木糖苷酶活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:205的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，并编码具有β-木糖苷酶活性的多肽的核苷酸序列。
用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术在本领域中是已知的，包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特性的克隆DNA片段，从而实现从这种基因组DNA克隆多核苷酸。参见，例如，Innis等,1990,PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork。可以使用其它核酸扩增方法，如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligationactivatedtranscription；LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。可以从任何菌株克隆多核苷酸，并且因此可为例如核苷酸序列的多肽编码区的等位基因变体或种变体(speciesvariant)。
在一个第四个方面，编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:1的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于嗜热毛壳菌CGMCC0581中的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:1的核苷酸55至1590。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于嗜热毛壳菌CGMCC0581中的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:3成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:3的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于嗜热毁丝霉CBS117.65中的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:3的核苷酸61至1350。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于嗜热毁丝霉CBS117.65中的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:5的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:5的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于烟曲霉NN055679中的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:5的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:5的核苷酸79至1596。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于烟曲霉NN055679中的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:7的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:7的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于桔橙嗜热子囊菌CGMCC0583中的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:7的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:7的核苷酸52至1374。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于桔橙嗜热子囊菌CGMCC0583中的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:157的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:157的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于埃默森青霉NN051602中的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:157的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:157的核苷酸55至1428。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于埃默森青霉NN051602中的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:159的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:159的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于嗜松青霉NN046877中的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:159的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:159的核苷酸76至1590。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于嗜松青霉NN046877中的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:161的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:161的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于土曲霉ATCC28865中的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:161的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:161的核苷酸70至1675。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于土曲霉ATCC28865中的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:163的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:163的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于费希新萨托菌NRRL181中的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:163的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:163的核苷酸79至1605。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于费希新萨托菌NRRL181中的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:165的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:165的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于构巢曲霉FGSCA4中的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:165的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:165的核苷酸70至1578。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于构巢曲霉FGSCA4中的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:9的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:9的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于嗜热毁丝霉CBS117.65中的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:9的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:9的核苷酸52至1799。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于嗜热毁丝霉CBS117.65中的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:11的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:11的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌NRRLB-50059或包含于嗜热毁丝霉CBS202.73的质粒pSMai182中包含的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:11的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:11的核苷酸52至1809。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌NRRLB-50059或包含于嗜热毁丝霉CBS202.73的质粒pSMai182中包含的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:13的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:13的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌NRRLB-30802中的质粒pTter6A中包含的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:13的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:13的核苷酸52至1443。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌NRRLB-30802中的质粒pTter6A中包含的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:15的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:15的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌DSM23379中的质粒pMStr199中包含的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:15的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:15的核苷酸109至1401。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌DSM23379中的质粒pMStr199中包含的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:17的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:17的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于烟曲霉NN055679中的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:17的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:17的核苷酸58至1700。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于烟曲霉NN055679中的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:167的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:167的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌DSM24143中的pGEM-T-CBHII46949-2中包含的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:167的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:167的核苷酸55至1749。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌DSM24143中的pGEM-T-CBHII46949-2中包含的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:169的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:169的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于埃默森青霉NN051602中的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:169的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:169的核苷酸58至1744。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于埃默森青霉NN051602中的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:171的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:171的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于嗜松青霉NN046877中的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:171的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:171的核苷酸58至1701。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于嗜松青霉NN046877中的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有内切葡聚糖酶I活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:19的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有内切葡聚糖酶I活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有内切葡聚糖酶I活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:19的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于土曲霉ATCC28865中的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:19的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:19的核苷酸64至1502。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于土曲霉ATCC28865中的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有内切葡聚糖酶II活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:21的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有内切葡聚糖酶II活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有内切葡聚糖酶II活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:21的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于里氏木霉RutC30中的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:21的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:21的核苷酸64至1254。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于里氏木霉RutC30中的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有内切葡聚糖酶II活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:23的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有内切葡聚糖酶II活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有内切葡聚糖酶II活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:23的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌NRRLB-30902中的质粒pCIC161中包含的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:23的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:23的核苷酸67至1185。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌NRRLB-30902中的质粒pCIC161中包含的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有内切葡聚糖酶II活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:25的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有内切葡聚糖酶II活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有内切葡聚糖酶II活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:25的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于桔橙嗜热子囊菌CGMCC0670中的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:25的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:25的核苷酸91至1005。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于桔橙嗜热子囊菌CGMCC0670中的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有内切葡聚糖酶II活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:173的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有内切葡聚糖酶II活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有内切葡聚糖酶II活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:173的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于烟曲霉NN051616中的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:173的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:173的核苷酸55至1230。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于烟曲霉NN051616中的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有内切葡聚糖酶II活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:175的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有内切葡聚糖酶II活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有内切葡聚糖酶II活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:175的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于费希新萨托菌NRRL181中的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:175的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:175的核苷酸49至1378。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于费希新萨托菌NRRL181中的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:27的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:27的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌NRRLB-30695中的质粒pEJG113中包含的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:27的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:27的核苷酸58至2580。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌NRRLB-30695中的质粒pEJG113中包含的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:29的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:29的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌NRRLB-30860中的质粒pKKAB中包含的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:29的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:29的核苷酸171至2573。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌NRRLB-30860中的质粒pKKAB中包含的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:31的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:31的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于黑曲霉IBT10140中的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:31的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:31的核苷酸58至2934。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于黑曲霉IBT10140中的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:177的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:177的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于构巢曲霉WDCM190中的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:177的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:177的核苷酸58至2937。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于构巢曲霉WDCM190中的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:179的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:179的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于川地曲霉IFO4308中的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:179的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:179的核苷酸58至2932。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于川地曲霉IFO4308中的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:181的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:181的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于棒曲霉NRRL1中的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:181的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:181的核苷酸55至3059。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于棒曲霉NRRL1中的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:183的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:183的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于土生梭孢霉NRRL8126中的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:183的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:183的核苷酸55至3029。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于土生梭孢霉NRRL8126中的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:185的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:185的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌B-50395中的pUC19D55EX包含的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:185的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:185的核苷酸64至2790。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌B-50395中的pUC19D55EX包含的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:187的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:187的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于草酸青霉IBT5387中的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:187的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:187的核苷酸64至2790。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于草酸青霉IBT5387中的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:189的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:189的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于埃默森踝节菌CBS549.92中的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:189的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:189的核苷酸58至2961。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于埃默森踝节菌CBS549.92中的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:33的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有纤维素分解增强活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有纤维素分解增强活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:33的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌NRRLB-30704中的质粒pDZA2-7包含的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:33的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:33的核苷酸67至796。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌NRRLB-30704中的质粒pDZA2-7包含的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:35的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有纤维素分解增强活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有纤维素分解增强活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:35的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌NRRLB-30814中的质粒pTter61E包含的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:35的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:35的核苷酸58至900。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌NRRLB-30814中的质粒pTter61E包含的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:37的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有纤维素分解增强活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有纤维素分解增强活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:37的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于烟曲霉NN051616中的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:37的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:37的核苷酸64至859。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于烟曲霉NN051616中的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:39的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有纤维素分解增强活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有纤维素分解增强活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:39的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌DSM22711中的质粒pGEM-T-Ppin7中包含的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:39的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:39的核苷酸64至1018。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌DSM22711中的质粒pGEM-T-Ppin7中包含的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:41的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有纤维素分解增强活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有纤维素分解增强活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:41的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌DSM22882中的质粒pGEM-T-GH61D23Y4中包含的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:41的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:41的核苷酸76至832。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌DSM22882中的质粒pGEM-T-GH61D23Y4中包含的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:43的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有纤维素分解增强活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有纤维素分解增强活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:43的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌NRRLB-50320中的质粒pAG68中包含的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:43的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:43的核苷酸64至1104。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌NRRLB-50320中的质粒pAG68中包含的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:191的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:191的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌DSM22656中的质粒pGEM-T-GH61a51486中包含的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:191的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:191的核苷酸67至868。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌DSM22656中的质粒pGEM-T-GH61a51486中包含的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有木聚糖酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:45的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码活性多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有木聚糖酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:45的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于棘孢曲霉CBS101.43中的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:45的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:45的核苷酸69至1314。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于棘孢曲霉CBS101.43中的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有木聚糖酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:47的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码活性多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有木聚糖酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:47的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌NRRLB-30703中的质粒pHyGe009中包含的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:47的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:47的核苷酸107至1415。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌NRRLB-30703中的质粒pHyGe009中包含的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有木聚糖酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:49的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码活性多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有木聚糖酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:49的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌NRRLB-50309中的质粒pTF12Xyl170中包含的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:49的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:49的核苷酸58至1194。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌NRRLB-50309中的质粒pTF12Xyl170中包含的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有木聚糖酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:51的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码活性多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有木聚糖酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:51的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌DSM22922中的质粒pGEM-T-Ppin3中包含的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:51的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:51的核苷酸58至1439。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌DSM22922中的质粒pGEM-T-Ppin3中包含的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有木聚糖酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:53的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码活性多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有木聚糖酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:53的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于土生梭孢霉NRRL8126中的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:53的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:53的核苷酸58至1185。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于土生梭孢霉NRRL8126中的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有木聚糖酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:193的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有木聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有木聚糖酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:193的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于埃默森踝节菌NN05002中的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:193的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:193的核苷酸70至1383。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于埃默森踝节菌NN05002中的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有木聚糖酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:195的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有木聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有木聚糖酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:195的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌NRRLB-50266中的pMMar26中包含的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:195的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:195的核苷酸70至1384。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌NRRLB-50266中的pMMar26中包含的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有木聚糖酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:197的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有木聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有木聚糖酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:197的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌DSM10361中的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:197的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:197的核苷酸58至1188。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于大肠杆菌DSM10361中的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有木聚糖酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:55的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码活性多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有木聚糖酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:55的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于ThermobifidafuscaDSM22883中的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:55的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:55的核苷酸127至1014。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于ThermobifidafuscaDSM22883中的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有木聚糖酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:199或SEQIDNO:304的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有木聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有木聚糖酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:199或SEQIDNO:304的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于嗜热网球菌ATCC35947中的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:199或SEQIDNO:304的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:199的核苷酸76至1137或SEQIDNO:304的核苷酸85至693。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于嗜热网球菌ATCC35947中的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有β-木糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:57的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码活性多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有β-木糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:57的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于里氏木霉RutC30中的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:57的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:57的核苷酸61至2391。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于里氏木霉RutC30中的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有β-木糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:59的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码活性多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有β-木糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:59的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于埃默森踝节菌CBS393.64中的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:591的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:59的核苷酸64至2388。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于埃默森踝节菌CBS393.64中的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有β-木糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:201的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有β-木糖苷酶活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有β-木糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:201的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于棘孢曲霉CBS172.66中的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:201的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:201的核苷酸52至2409。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于棘孢曲霉CBS172.66中的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有β-木糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:203的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有β-木糖苷酶活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有β-木糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:203的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于棘孢曲霉CBS186.67中的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:203的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:203的核苷酸52至2541。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于棘孢曲霉CBS186.67中的成熟多肽编码序列。
在另一个第四个方面，编码具有β-木糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为与SEQIDNO:205的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度，并编码具有β-木糖苷酶活性的多肽的核苷酸序列。
在一个方面，编码具有β-木糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸包含或组成为SEQIDNO:205的核苷酸序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于烟曲霉NN051616中的序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:205的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为SEQIDNO:205的核苷酸61至2376。在另一个方面，所述核苷酸序列包含或组成为包含于烟曲霉NN051616中的成熟多肽编码序列。
在一个第五个方面，编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:5的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:5的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:7的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:7的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:157的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:157的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:159的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:159的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:161的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:161的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:163的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:163的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有纤维二糖水解酶I活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:165的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:165的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:9的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:9的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:11的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:11的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:13的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:13的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:15的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:15的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:17的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:17的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:167的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:167的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:169的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:169的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有纤维二糖水解酶II活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:171的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:171的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有内切葡聚糖酶I活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:19的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:19的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有内切葡聚糖酶II活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:21的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:21的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有内切葡聚糖酶II活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:23的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:23的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有内切葡聚糖酶II活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:25的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:25的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有内切葡聚糖酶II活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:173的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:173的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有内切葡聚糖酶II活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:175的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:175的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:27的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:27的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:29的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:29的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:31的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:31的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:177的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:177的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:179的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:179的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:181的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:181的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:183的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:183的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:185的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:185的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:187的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:187的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:189的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:189的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:33的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:33的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:35的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:35的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:37的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:37的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:39的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:39的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:41的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:41的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:43的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:43的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:191的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:191的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有木聚糖酶活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:45的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:45的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有木聚糖酶活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:47的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:47的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有木聚糖酶活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:49的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:49的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有木聚糖酶活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:51的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:51的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有木聚糖酶活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:53的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:53的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有木聚糖酶活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:193的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:193的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有木聚糖酶活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:195的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:195的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有木聚糖酶活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:197的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:197的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有木聚糖酶活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与SEQIDNO:55或其全长互补链杂交。
在另一个第五个方面，编码具有木聚糖酶活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:199或304的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:199或304的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有β-木糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:57的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:57的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有β-木糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:59的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:59的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有β-木糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:201的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:201的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有β-木糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:203的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:203的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在另一个第五个方面，编码具有β-木糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:205的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:205的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
具有纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、内切葡聚糖酶I、内切葡聚糖酶II、β-葡糖苷酶、纤维素分解增强、木聚糖酶或β-葡糖苷酶活性的多肽的来源
具有纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、内切葡聚糖酶I、内切葡聚糖酶II、β-葡糖苷酶、纤维素分解增强、木聚糖酶或β-葡糖苷酶活性的多肽可以获得自任何属的微生物。就本发明而言，用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”，意思是核苷酸序列编码的多肽由所述来源产生，或由其中插入了来自所述来源的核苷酸序列的菌株产生。在一个优选的方面，获得自给定来源的多肽是胞外分泌的。
具有纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、内切葡聚糖酶I、内切葡聚糖酶II、β-葡糖苷酶、纤维素分解增强、木聚糖酶或β-葡糖苷酶活性的多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽例如芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)多肽；或革兰氏阴性细菌多肽，如大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或脲原体属(Ureaplasma)属多肽。
在一个优选的方面，所述多肽是嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)多肽。
在另一个优选的方面，所述多肽是似马链球菌(Streptococcusequisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房链球菌(Streptococcusuberis)或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcusequisubsp.Zooepidemicus)多肽。
在另一个优选的方面，所述多肽是不产色链霉菌(Streptomycesachromogenes)、除虫链霉菌(Streptomycesavermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)多肽。
具有纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、内切葡聚糖酶I、内切葡聚糖酶II、β-葡糖苷酶、纤维素分解增强、木聚糖酶或β-葡糖苷酶活性多肽也可以是真菌多肽，并且更优选为酵母多肽如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)多肽；或更优选为丝状真菌多肽如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼伞属(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cyphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、蘑菇属(Lentinula)、Leptospaeria、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)多肽。
在一个优选的方面，所述多肽是卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、诺地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)多肽。
在另一个优选的方面，所述多肽是解纤维枝顶孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、热带金孢子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、毡金孢子菌(Chrysosporiumpannicola)、Chrysosporiumqueenslandicum、Chrysosporiumzonatum、杆孢状镰孢(Fusariumbactridioides)、禾谷镰孢(Fusariumcerealis)、库威镰孢(Fusariumcrookwellense)、大刀镰孢(Fusariumculmorum)、禾本科镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、尖镰孢(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusariumreticulatum)、粉红镰孢(Fusariumroseum)、接骨木镰孢(Fusariumsambucinum)、肤色镰孢(Fusariumsarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusariumsporotrichioides)、硫色镰孢(Fusariumsulphureum)、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢(Fusariumtrichothecioides)、镶片镰孢(Fusariumvenenatum)、灰腐质霉(Humicolagrisea)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)、白耙齿菌(Irpexlacteus)、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、绳状青霉(Penicilliumfuniculosum)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、无色梭孢壳(Thielaviaachromatica)、Thielaviaalbomyces、Thielaviaalbopilosa、澳洲梭孢壳(Thielaviaaustraleinsis)、Thielaviafimeti、小孢梭孢壳(Thielaviamicrospora)、卵孢梭孢壳(Thielaviaovispora)、Thielaviaperuviana、瘤孢梭孢壳(Thielaviaspededonium)、毛梭孢壳(Thielaviasetosa)、Thielaviasubthermophila、土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康宁木霉(Trichodermakoningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)或绿色木霉(Trichodermaviride)多肽。
在另一个方面，具有纤维二糖水解酶I活性的多肽是具有纤维二糖水解酶I活性的嗜热毛壳菌CGMCC0581Cel7A多肽，即，包含SEQIDNO:2的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有纤维二糖水解酶I活性的多肽是具有纤维二糖水解酶I活性的嗜热毁丝霉CBS117.65Cel7A多肽，即，包含SEQIDNO:4的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有纤维二糖水解酶I活性的多肽是具有纤维二糖水解酶I活性的烟曲霉NN055679Cel7A多肽，即，包含SEQIDNO:6的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有纤维二糖水解酶I活性的多肽是具有纤维二糖水解酶I活性的桔橙嗜热子囊菌CGMCC0583Cel7A多肽，即，包含SEQIDNO:8的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有纤维二糖水解酶I活性的多肽是具有纤维二糖水解酶I活性的埃默森青霉NN051602Cel7多肽，即，包含SEQIDNO:158的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有纤维二糖水解酶I活性的多肽是具有纤维二糖水解酶I活性的嗜松青霉NN046877Cel7多肽，即，包含SEQIDNO:160的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有纤维二糖水解酶I活性的多肽是具有纤维二糖水解酶I活性的土曲霉ATCC28865Cel7多肽，即，包含SEQIDNO:162的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有纤维二糖水解酶I活性的多肽是具有纤维二糖水解酶I活性的费希新萨托菌NRRL181Cel7多肽，即，包含SEQIDNO:164的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有纤维二糖水解酶I活性的多肽是具有纤维二糖水解酶I活性的构巢曲霉FGSCA4Cel7多肽，即，包含SEQIDNO:166的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有纤维二糖水解酶II的多肽是具有纤维二糖水解酶II活性的嗜热毁丝霉CBS117.65Cel6A多肽，即，包含SEQIDNO:10的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有纤维二糖水解酶II的多肽是具有纤维二糖水解酶II活性的嗜热毁丝霉CBS202.75Cel6B多肽，即，包含SEQIDNO:12的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有纤维二糖水解酶II的多肽是具有纤维二糖水解酶II活性的土生梭孢霉NRRL8126Cel6A多肽，即，包含SEQIDNO:14的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有纤维二糖水解酶II的多肽是具有纤维二糖水解酶II活性的褐孢长毛盘菌CBS804.70Cel6多肽，即，包含SEQIDNO:16的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有纤维二糖水解酶II的多肽是具有纤维二糖水解酶II活性的烟曲霉NN055679Cel6A多肽，即，包含SEQIDNO:18的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有纤维二糖水解酶II的多肽是具有纤维二糖水解酶II活性的FennelianiveaNN046949Cel6多肽，即，包含SEQIDNO:168的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有纤维二糖水解酶II的多肽是具有纤维二糖水解酶II活性的埃默森青霉NN051602Cel6A多肽，即，包含SEQIDNO:170的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有纤维二糖水解酶II的多肽是具有纤维二糖水解酶II活性的嗜松青霉NN046877Cel6A多肽，即，包含SEQIDNO:172的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有内切葡聚糖酶I活性的多肽是具有内切葡聚糖酶I活性的土曲霉ATCC28865Cel6A多肽，即，包含SEQIDNO:20的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有内切葡聚糖酶II活性的多肽是具有内切葡聚糖酶II活性的里氏木霉RutC30Cel5A多肽，即，包含SEQIDNO:22的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有内切葡聚糖酶II活性的多肽是具有内切葡聚糖酶II活性的嗜热毁丝霉CBS202.75Cel5A多肽，即，包含SEQIDNO:24的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有内切葡聚糖酶II活性的多肽是具有内切葡聚糖酶II活性的桔橙嗜热子囊菌CGMCC0670Cel5A多肽，即，包含SEQIDNO:26的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有内切葡聚糖酶II活性的多肽是具有内切葡聚糖酶II活性的烟曲霉NN051616Cel5多肽，即，包含SEQIDNO:174的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有内切葡聚糖酶II活性的多肽是具有内切葡聚糖酶II活性的费希新萨托菌NRRL181多肽，即，包含SEQIDNO:176的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有β-葡糖苷酶活性的多肽是具有β-葡糖苷酶活性的烟曲霉NN055679Cel5A多肽，即，包含SEQIDNO:28的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有β-葡糖苷酶活性的多肽是具有β-葡糖苷酶活性的巴西青霉IBT20888Cel5A多肽，即，包含SEQIDNO:30的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有β-葡糖苷酶活性的多肽是具有β-葡糖苷酶活性的黑曲霉IBT10140GH3多肽，即，包含SEQIDNO:32的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有β-葡糖苷酶活性的多肽是具有β-葡糖苷酶活性的棘孢曲霉WDCM190Cel3多肽，即，包含SEQIDNO:178的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有β-葡糖苷酶活性的多肽是具有β-葡糖苷酶活性的川地曲霉IFO4308Cel3多肽，即，包含SEQIDNO:180的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有β-葡糖苷酶活性的多肽是具有β-葡糖苷酶活性的棒曲霉NRRL1Cel3多肽，即，包含SEQIDNO:182的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有β-葡糖苷酶活性的多肽是具有β-葡糖苷酶活性的土生梭孢霉NRRL8126Cel3多肽，即，包含SEQIDNO:184的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有β-葡糖苷酶活性的多肽是具有β-葡糖苷酶活性的草酸青霉IBT5387Cel3多肽，即，包含SEQIDNO:186的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有β-葡糖苷酶活性的多肽是具有β-葡糖苷酶活性的草酸青霉IBT5387Cel3多肽，即，包含SEQIDNO:188的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有β-葡糖苷酶活性的多肽是具有β-葡糖苷酶活性的埃默森踝节菌CBS549.92Cel3多肽，即，包含SEQIDNO:190的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有纤维素分解增强活性的多肽是具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌CGMCC0583GH61A多肽，即，包含SEQIDNO:34的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有纤维素分解增强活性的多肽是具有纤维素分解增强活性的土生梭孢霉NRRL8126GH61E多肽，即，包含SEQIDNO:36的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有纤维素分解增强活性的多肽是具有纤维素分解增强活性的烟曲霉NN051616GH61B多肽，即，包含SEQIDNO:38的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有纤维素分解增强活性的多肽是具有纤维素分解增强活性的嗜松青霉NN046877GH61A多肽，即，包含SEQIDNO:40的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有纤维素分解增强活性的多肽是具有纤维素分解增强活性的Penicilliumsp.NN051602GH61A多肽，即，包含SEQIDNO:42的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有纤维素分解增强活性的多肽是具有纤维素分解增强活性的土生梭孢霉NRRL8126GH61N多肽，即，包含SEQIDNO:44的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有纤维素分解增强活性的多肽是具有纤维素分解增强活性的痂状嗜热子囊菌CBS181.67GH61A多肽，即，包含SEQIDNO:192的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有木聚糖酶的多肽是具有木聚糖酶活性的棘孢曲霉CBS101.43多肽，即，包含SEQIDNO:46的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有木聚糖酶的多肽是具有木聚糖酶活性的烟曲霉NN055679多肽，即，包含SEQIDNO:48的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有木聚糖酶活性的多肽是具有木聚糖酶活性的褐孢长毛盘菌CBS804.70多肽，即，包含SEQIDNO:50的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有木聚糖酶活性的多肽是具有木聚糖酶活性的嗜松青霉NN046877多肽，即，包含SEQIDNO:52的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有木聚糖酶活性的多肽是具有木聚糖酶活性的土生梭孢霉NRRL8126多肽，即，包含SEQIDNO:54的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有木聚糖酶活性的多肽是具有木聚糖酶活性的埃默森踝节菌NN050022多肽，即，包含SEQIDNO:194成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有木聚糖酶活性的多肽是具有木聚糖酶活性的青霉属菌种NN51602多肽，即，包含SEQIDNO:196成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有木聚糖酶活性的多肽是具有木聚糖酶活性的巨多孔菌CBS521.95多肽，即，包含SEQIDNO:198成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有木聚糖酶活性的多肽是具有木聚糖酶活性的ThermobifidafuscaDSM22883多肽，即，包含SEQIDNO:56的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有木聚糖酶活性的多肽是具有木聚糖酶活性的嗜热网球菌ATCC35947多肽，即，包含SEQIDNO:200或SEQIDNO:305的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有β-木糖苷酶活性的多肽是具有β-木糖苷酶活性的里氏木霉RutC30多肽，即，包含SEQIDNO:58的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有β-木糖苷酶活性的多肽是具有β-木糖苷酶活性的埃默森踝节菌CBS393.64多肽，即，包含SEQIDNO:60的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有β-木糖苷酶活性的家族3多肽是具有β-木糖苷酶活性的棘孢曲霉CBS172.66多肽，即，包含SEQIDNO:202的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有β-木糖苷酶活性的家族3多肽是具有β-木糖苷酶活性的棘孢曲霉CBS186.67多肽，即，包含SEQIDNO:204的成熟多肽的多肽。
在另一个方面，具有β-木糖苷酶活性的家族3多肽是具有β-木糖苷酶活性的烟曲霉NN051616多肽，即，包含SEQIDNO:206的成熟多肽的多肽。
可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfectandimperfectstates)，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而无论它们已知的种名。本领域熟练技术人员将容易地识别适合的等同物的同一性。
这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够容易地取得，所述保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)。
此外，可以使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物鉴定和获得此类多肽。用于从天然生境(habitat)分离微生物的技术是本领域内公知的。然后可通过相似地筛选此种微生物的基因组或cDNA文库来获得多核苷酸。一旦用所述探针检测到编码多肽的多核苷酸，就能够使用本领域普通技术人员熟知的技术将所述多核苷酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。
此类多肽还包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一个多肽融合于多肽或其片段的N端或C端。融合多肽是通过将编码另一个多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于核苷酸序列(或其部分)产生的。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，且包括将编码多肽的编码序列相连接从而使得其符合读框(inframe)，且融合多肽的表达置于相同的启动子和终止子调控下。
融合多肽可进一步包含两个多肽之间的切割位点。当融合多肽分泌时，该位点受切割，释放出两个多肽。切割位点的实例包括但不限于Martin等,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-576；Svetina等,2000,J.Biotechnol.76:245-251；Rasmussen-Wilson等,1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493；Ward等,1995,Biotechnology13:498-503；和Contreras等,1991,Biotechnology9:378-381；Eaton等,1986,Biochemistry25:505-512；Collins-Racie等,1995,Biotechnology13:982-987；Carter等,1989,Proteins:Structure,Function,andGenetics6:240-248；以及Stevens,2003,DrugDiscoveryWorld4:35-48中公开的位点。
核酸构建体
可构建包含编码本发明酶组合物的肽组分的分离的多核苷酸的核酸构建体，即将所述多核苷酸与一个或多个(几个)调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸的序列插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域熟知的。
调控序列可为合适的启动子序列，其是由用于表达编码多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
用于指导本发明的核酸构建体转录，特别是在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：大肠杆菌lac操纵子、天蓝链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等,1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等,1983,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA80:21-25)。另外的启动子在"Usefulproteinsfromrecombinantbacteria"于ScientificAmerican,1980,242:74-94中；和在Sambrook等,1989,见上中描述。
用于指导核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、镶片镰孢Daria(WO00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO00/56900)、曼赫根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(来自编码青霉素中中性α-淀粉酶的基因的修饰的启动子，其中其不翻译的先导序列由来自编码构巢曲霉或米曲霉中的丙糖磷酸异构酶的基因的不翻译的先导序列所替代)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1,ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos等,1992,Yeast8:423-488描述。
调控序列也可以是合适的转录终止子序列，其是由宿主细胞识别以终止转录的序列。所述终止子序列与编码所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。
对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等,1992,见上描述。
调控序列还可以是合适的前导序列，其是对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的5’-末端。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列用在本发明中。
对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。
对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与核苷酸序列的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为向转录的mRNA添加聚腺苷残基的信号。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本发明中使用。
对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。
对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,MolecularCellularBiology15:5983-5990描述。
调控序列还可为信号肽编码区，其编码与多肽的N端相连的信号肽，并且指导所述多肽进入细胞分泌途径。多核苷酸的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，该信号肽编码序列与编码所述多肽的编码序列区段一起天然地连接在翻译阅读框中。或者，编码序列5’端可含有对于所述编码序列为外源的信号肽编码序列。外源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者，外源信号肽编码序列可简单地取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，可使用指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,MicrobiologicalReviews57:109-137描述。
对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等,1992,见上描述。
调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽N端的前多肽。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转变为活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO95/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α因子的基因获得前肽编码序列。
当信号肽和前肽序列二者均出现在多肽的N端时，将前肽序列置于紧接着(nextto)多肽N端，并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的氨基末端。
同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(withheavymetal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的多核苷酸与调节序列可操作地连接。
表达载体
本文所述的多种核酸和调控序列可以结合在一起以构建重组表达载体，所述重组表达载体可以包括一个或多个(数个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码酶组合物的多肽组分的分离的多核苷酸。或者，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸构建体来表达多核苷酸序列。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的表达用调控序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(totalDNA)，或可以使用转座子(transposon)。
载体优选地含有一个或多个(数个)选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophytoauxotrophs)等。
细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。
载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。
为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的核苷酸序列，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应优选含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，优选400至10,000碱基对，并且最优选800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体可以还包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文定义为能够使质粒或载体体内复制的核苷酸序列。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1，ARS4，ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等,1991,Gene98:61-67；Cullen等,1987,NucleicAcidsResearch15:9163-9175；WO00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO00/24883中的方法完成。
可以将多于一个拷贝的多核苷酸插入宿主细胞以增加基因产物的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectableagent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，从而也含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。
用于连接上述元件以构建重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等,1989,见上)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，其包含一种或多种编码酶组合物的多肽组分的分离的多核苷酸，将所述重组宿主细胞有利地用于多肽的重组产生。将载体引入宿主细胞从而将所述载体作为染色体整合体或作为自复制的染色体外载体保持，如前文所述。术语“宿主细胞”包含亲本细胞的任何子代，其因为在复制过程中发生的突变而与该亲本细胞不同。宿主细胞的选择在很大程度上会依赖于编码多肽的基因及其来源。
宿主细胞可以是在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于，芽孢杆菌属、链球菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、乳杆菌属、乳球菌属、梭菌属、地芽孢杆菌属和海洋芽孢杆菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于，大肠杆菌、假单胞菌属、沙门氏菌属、弯曲杆菌属、螺杆菌属、黄杆菌属、梭杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属和脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞。在本发明的实施中有用的芽孢杆菌属细胞包括但不限于，嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。
在一个优选的方面，细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在一个更优选的方面，细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是克劳氏芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是地衣芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是枯草芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞。在本发明的实施中有用的链球菌属细胞包括但不限于，似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种细胞。
在一个优选的方面，细菌宿主细胞是似马链球菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是酿脓链球菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是乳房链球菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是马链球菌兽瘟亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞。在本发明的实施中有用的链霉菌属细胞包括但不限于，不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞。
在一个优选的方面，细菌宿主细胞是不产色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是除虫链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是天蓝色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是灰色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是浅青紫链霉菌细胞。
可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen,1979,MolecularGeneralGenetics168:111-115)，使用感受态细胞(参见，例如，Young和Spizizen,1961,dournalofBacteriology81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,JournalofMolecularBiology56:209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques6:742-751)或接合(参见，例如，Koehler和Thorne,1987,JournalofBacteriology169:5271-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166:557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等,1988,NucleicAcidsRes.16:6127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：例如原生质体转化和电穿孔(参见，例如，Gong等,2004,FoliaMicrobiol.(Praha)49:399-405)，接合(参见，例如，Mazodier等,1989,J.Bacteriol.171:3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke等,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：例如电穿孔(参见，例如，Choi等,2006,J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(参见，例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(naturalcompetence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.32:1295-1297)，原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick,1991,Microbios.68:189-207)，电穿孔(参见，例如，Buckley等,1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(参见，例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409-436)。然而，可使用将DNA引入宿主细胞的领域中已知的任何方法。
宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
在一个优选的方面，宿主细胞是真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于AinsworthandBisby’sDictionaryofTheFungi,第八版,1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等,1995,见上,171页中所引用)，和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporicfungi)(Hawksworth等,1995,见上)。
在一个更优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenousyeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenousyeast)和属于半知菌类(FungiImperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，将酵母定义为如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,和Davenport,R.R.编,Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9,1980)中所述。
在一个甚至更优选的方面，酵母宿主细胞是念珠菌属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属细胞。
在最优选的方面，酵母宿主细胞是卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母或卵形酵母细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是解脂西洋蓍霉(Yarrowialipolytica)细胞。
在另一个更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等,1995,见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。
在一个甚至更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。
在一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另一个最优选方面，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是黑刺烟管菌(Bjerkanderaadusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、干拟蜡菌、Ceriporiopsiscaregiea、Ceriporiopsisgilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、Ceriporiopsissubvermispora、嗜角质金孢子菌、Chrysosporiumlucknowense、热带金孢子菌、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、毡金孢子菌、Chrysosporiumqueenslandicum、Chrysosporiumzonatum、灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌、辐射射脉菌(Phlebiaradiata)、刺芹侧耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢霉、长绒毛栓菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁重建的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP238023和Yelton等,1984,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA81:1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等,1989,Gene78:147-156和WO96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M.I.编,GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volume194,182-187页,AcademicPress,Inc.,NewYork；Ito等,1983,JournalofBacteriology153:163；和Hinnen等,1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920。
产生方法
本发明还涉及产生本发明的酶组合物的方法，其包括：(a)在有助于产生酶组合物的条件下培养如本文所述的重组宿主细胞；和(b)回收所述酶组合物。
在本发明的产生方法中，使用本领域熟知的方法在适合于产生所述酶组合物的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述酶组合物的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果酶组合物的组分分泌到营养培养基中，该酶组合物能够从所述培养基中直接回收。如果酶组合物的组分不分泌到培养基中，酶组合物能够从细胞裂解物(lysate)回收。
可以使用本领域已知的对于多肽组分是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。
所得酶组合物可以使用本领域已知的方法回收。例如，酶组合物可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
本发明的酶组合物可以通过多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的多肽，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，ProteinPurification,J.-C.Janson和LarsRyden编,VCHPublishers,NewYork,1989)。
加工纤维素材料的方法
本发明还涉及用于降解或转化纤维素材料的方法，包括，用本发明的酶组合物处理纤维素材料。在一个优选的方面，所述方法进一步包括回收经降解或转化的纤维素材料。
本发明还涉及产生发酵产物的方法，包括：(a)用本发明的酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从发酵回收所述发酵产物。
本发明还涉及发酵纤维素材料的方法，包括：用一种或多种发酵微生物发酵所述纤维素材料，其中所述纤维素材料是用本发明的酶组合物糖化的。在一个优选的方面，所述纤维素材料的发酵产生发酵产物。在另一个优选的方面，所述方法进一步包括从发酵回收发酵产物。
本发明的方法可用于将纤维素材料糖化为可发酵的糖，并将可发酵的糖转化为许多有用物质，例如化学品和燃料。从纤维素材料产生所需发酵产物通常涉及预处理、酶水解(糖化)和发酵。
根据本发明纤维素材料的加工可使用本领域常规工艺达成。而且，本发明的方法可使用配置为依照本发明操作的任何常规生物质加工装置实施。
水解(糖化)和发酵，分别或同时，包括但不限于，分离的水解和发酵(SHF)、同步糖化和发酵(SSF)、同步糖化和共发酵(SSCF)、混合的水解和发酵(HHF)、分离的水解和共发酵(SHCF)、混合的水解和共发酵(HHCF)，和直接微生物转化(DMC)。SHF使用分离的处理步骤以首先将木素纤维素酶水解为可发酵糖，例如，葡萄糖，纤维二糖、纤维三糖和戊糖，然后将可发酵糖发酵成为乙醇。在SSF中，木素纤维素的酶水解和糖变为乙醇的发酵在一个步骤中组合(Philippidis,G.P.,1996,Cellulosebioconversiontechnology，于HandbookonBioethanol：ProductionandUtilization,Wyman,C.E编,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。SSCF涉及多种糖的共发酵(Sheehan,J.,和Himmel,M.,1999,Enzymes,energyandtheenvironment:AstrategicperspectiveontheU.S.DepartmentofEnergy’sresearchanddevelopmentactivitiesforbioethanol,Biotechnol.Prog.15:817-827)。HHF在同步糖化和水解步骤之外，还涉及单独水解步骤，所述步骤可以在同一个反应器中进行。HHF过程中的步骤可以在不同的温度，即，高温酶糖化，然后在发酵菌株能够耐受的较低温度进行SSF。DMC在一个或多个步骤中组合了所有三个过程(酶产生、木素纤维素水解和发酵)，其中使用相同的生物体产生用于将木素纤维素转化成可发酵糖并将可发酵糖转化成终产物的酶(Lynd,L.R.,Weimer,P.J.,vanZyl,W.H.,和Pretorius,I.S.,2002,Microbialcelluloseutilization:Fundamentalsandbiotechnology，Microbiol.Mol.Biol.Reviews66:506-577)。在本文可以理解的是，本领域中任何已知的方法，包括预处理、酶水解(糖化)、发酵，或它们的组合，可用于实施本发明的方法。
常规设备包括补料批式搅拌反应器、批式搅拌反应器、具有超滤的连续流搅拌反应器和/或连续活塞流柱式反应器(FernandadeCastilhosCorazza,FlávioFariadeMoraes,GisellaMariaZanin和IvoNeitzel,2003,Optimalcontrolinfed-batchreactorforthecellobiosehydrolysis,ActaScientiarum.Technology25:33-38；Gusakov,A.V.,和Sinitsyn,A.P.,1985,Kineticsoftheenzymatichydrolysisofcellulose:1.Amathematicalmodelforabatchreactorprocess,Enz.Microb.Technol.7:346-352)、研磨反应器(Ryu,S.K.,和Lee,J.M.,1983,Bioconversionofwastecellulosebyusinganattritionbioreactor,Biotechnol.Bioeng.25:53-65)，或者具有由电磁场引起的强烈搅拌的反应器(Gusakov,A.V.,Sinitsyn,A.P.,Davydkin,I.Y.,Davydkin,V.Y.,Protas,O.V.,1996,Enhancementofenzymaticcellulosehydrolysisusinganoveltypeofbioreactorwithintensivestirringinducedbyelectromagneticfield,Appl.Biochem.Biotechnol.56:141-153)。其它反应器类型包括：流化床、升流层、固定化和用于水解和/或发酵的挤出机型的反应器。
预处理。在本发明的方法的实施中，可以使用本领域已知的任何预处理过程破坏植物细胞壁成分(Chandra等,2007,Substratepretreatment:Thekeytoeffectiveenzymatichydrolysisoflignocellulosics?Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:67-93；Galbe和Zacchi,2007,Pretreatmentoflignocellulosicmaterialsforefficientbioethanolproduction,Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:41-65；Hendriks和Zeeman,2009,Pretreatmentstoenhancethedigestibilityoflignocellulosicbiomass,BioresourceTechnol.100:10-18；Mosier等,2005,Featuresofpromisingtechnologiesforpretreatmentoflignocellulosicbiomass,BioresourceTechnol.96:673-686；Taherzadeh和Karimi,2008,Pretreatmentoflignocellulosicwastestoimproveethanolandbiogasproduction:Areview，Int.J.ofMol.Sci.9:1621-1651；Yang和Wyman,2008,Pretreatment:thekeytounlockinglow-costcellulosicethanol,BiofuelsBioproductsandBiorefining-Biofpr.2:26-40)。
机械预处理。术语“机械预处理”指破坏和/或减少纤维素材料的植物细胞组分的粒度的各种类型的研磨或碾磨(例如，干磨、湿磨或振动球磨)。
化学预处理。在本发明的方法的实施中，可以使用本领域已知的任何化学预处理过程破坏纤维素材料的植物细胞壁成分(Chandra等,2007,见上；Galbe和Zacchi,2007,Pretreatmentoflignocellulosicmaterialsforefficientbioethanolproduction,Adv.Biochem.Engn./Biotechnol.108:41-65；Hendriks和Zeeman,2009,Pretreatmentstoenhancethedigestibilityoflignocellulosicbiomass,BioresourceTechnol.100:10-18；Mosier等,2005,Featuresofpromisingtechnologiesforpretreatmentoflignocellulosicbiomass,BioresourceTechnol.96:673-686；Taherzadeh和Karimi,2008,Pretreatmentoflignocellulosicwastestoimproveethanolandbiogasproduction:Areview，Int.J.ofMol.Sci.9:1621-1651；Yang和Wyman,2008,Pretreatment:thekeytounlockinglow-costcellulosicethanol,BiofuelsBioproductsandBiorefining-Biofpr.2:26-40)。
常规的化学预处理包括但不限于，蒸汽预处理(伴随或不伴随爆炸)、稀酸预处理、热水预处理、碱性预处理、石灰预处理、湿氧化、湿爆炸、氨纤维爆炸、有机溶剂预处理和生物预处理。其它预处理包括氨渗滤、超声、电穿孔、微波、超临界CO2、超临界H2O、臭氧和γ辐射预处理。
可以在水解和/或发酵之前化学预处理纤维素材料。预处理优选在水解前进行。或者，预处理可以与酶水解同时进行，以释放可发酵糖，如葡萄糖、纤维二糖和/或木糖。在大多数情况下，预处理步骤本身可使一些纤维素材料转化成可发酵糖(甚至在不存在酶的情况下)。
蒸汽预处理。在蒸汽预处理中，加热纤维素材料以破坏植物细胞壁成分，包括木质素、半纤维素和纤维素，使酶可以接触纤维素和其它部分，例如，半纤维素。将纤维素材料通过或穿过反应容器，其中注入蒸汽以增加温度至需要的温度和压力，并且在其中保持期望的反应时间。蒸汽预处理优选在140-230℃，更优选160-200℃，并且最优选170-190℃进行，其中最优的温度范围依赖于任何化学催化剂的加入。蒸汽预处理的停留时间优选1-15分钟，更优选3-12分钟，并且最优选4-10分钟，其中最优的停留时间依赖于温度范围和任何化学催化剂的加入。蒸汽预处理允许相对较高的固体加载量，使得纤维素材料在预处理过程中通常仅仅变得潮湿。蒸汽预处理经常与预处理后对物质的爆炸放料(explosivedischarge)组合，这称为蒸汽爆炸，即，快速闪变至大气压和物质的湍流，以通过破碎增加可接触的表面积(Duff和Murray,1996,BioresourceTechnology855:1-33；Galbe和Zacchi,2002,Appl.Microbiol.Biotechnol.59:618-628；美国专利申请No.20020164730)。在蒸汽预处理过程中，切割半纤维素乙酰基团，并且得到的酸自催化半纤维素部分水解成单糖和寡糖。去除木质素仅至有限的程度。
经常在蒸汽预处理之前加入催化剂如H2SO4或SO2(通常0.3至3%w/w)，其可减少时间，降低温度，增加回收率，并促进酶水解(Ballesteros等,2006,Appl.Biochem.Biotechnol.129-132:496-508；Varga等,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.113-116:509-523；Sassner等,2006,EnzymeMicrob.Technol.39:756-762)。
化学预处理：术语“化学处理“指能促进纤维素、半纤维素和/或木质素分离和/或释放的任何化学处理。合适的化学预处理步骤的实例包括例如稀酸预处理、石灰预处理、湿氧化、氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)、氨渗滤(APR)和有机溶剂预处理。
在稀酸预处理中，将纤维素材料与稀酸(通常是H2SO4)和水混合以形成浆料，由蒸汽加热至期望的温度，并在一段停留时间后闪变至大气压。可以用很多反应器设计进行稀酸预处理，例如，活塞流式反应器、逆流反应器或连续逆流收缩床反应器(Duff和Murray，1996,supra；Schell等,2004,BioresourceTechnol.91:179-188；Lee等,1999,Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65:93-115)。
还可以使用碱性条件下的几种预处理方法。这些碱预处理包括，但不限于，石灰预处理、湿氧化、氨渗滤(APR)和氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)。
用碳酸钙、氢氧化钠或氨，在85-150℃的低温进行石灰预处理，停留时间从1小时到几天(Wyman等,2005,BioresourceTechnol.96:1959-1966；Mosier等,2005,BioresourceTechnol.96:673-686)。WO2006/110891、WO2006/110899、WO2006/110900和WO2006/110901公开了使用氨的预处理方法。
湿法氧化是热预处理，通常在180-200℃进行5-15分钟，加入氧化剂如过氧化氢或过压氧(Schmidt和Thomsen,1998,BioresourceTechnol.64:139-151；Palonen等,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.117:1-17；Varga等,2004,Biotechnol.Bioeng.88:567-574；Martin等,2006,J.Chem.Technol.Biotechnol.81:1669-1677)。预处理以优选1-40%干物质，更优选2-30%干物质，并且最优性5-20%干物质进行，并且由于加入碱如碳酸钠，初始pH经常会增加。
湿氧化预处理方法的修改方法，称为湿爆炸(湿氧化和蒸汽爆炸的组合)，能够处理高达30%的干物质。在湿爆炸中，在预处理过程中，在一定的停留时间后引入氧化剂。然后通过闪变至大气压而结束预处理(WO2006/032282)。
氨纤维爆炸(AFEX)涉及在温和温度如90-100℃和高压如17-20bar，用液体或气体氨处理纤维素材料5-10分钟，其中干物质含量可以高达60%(Gollapalli等,2002,Appl.Biochem.Biotechnol.98:23-35；Chundawat等,2007,Biotechnol.Bioeng.96:219-231；Alizadeh等,2005,Appl.Biochem.Biotechnol.121:1133-1141；Teymouri等,2005,BioresourceTechnol.96:2014-2018)。AFEX预处理导致纤维素解聚，和半纤维素的部分水解。木质素-糖复合物得到切割。
有机溶剂预处理通过用含水乙醇(40-60%乙醇)在160-200℃提取30-60分钟而将纤维素材料去木质素化(Pan等,2005,Biotechnol.Bioeng.90:473-481；Pan等,2006,Biotechnol.Bioeng.94:851-861；Kurabi等,2005,Appl.Biochem.Biotechnol.121:219-230)。通常加入硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，去除大部分半纤维素。
合适的预处理方法的其他实例如Schell等,2003,Appl.BiochemandBiotechn.Vol.105-108:p.69-85,和Mosier等,2005,BioresourceTechnology96:673-686,和美国专利公开申请2002/0164730所述。
在一个方面，化学预处理优选作为酸处理，并且更优选作为连续稀酸和/或弱酸(mildacid)处理进行。酸通常是硫酸，但也可以使用其它酸，如乙酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氢或其混合物。弱酸处理在优选1-5，更优选1-4，并且最优选1-3的pH范围内进行。在一个方面，酸浓度在优选0.01至20wt%酸，更优选0.05至10wt%酸，甚至更优选0.1至5wt%酸，并且最优选0.2至2.0wt%酸的范围内。酸与纤维素材料接触，并在优选160-220℃，和更优选165-195℃范围内的温度保持数秒到数分钟，例如1秒-60分钟的时间。
在另一个方面，预处理作为氨纤维爆炸步骤(AFEX预处理步骤)进行。
在另一个方面，预处理发生在含水浆料中。在优选的方面，在预处理过程中纤维素材料以优选10-80wt％，更优选20-70wt%，并且最优性30-60wt％，如约50wt%的量存在。预处理的纤维素材料可以不洗涤或者使用本领域任何已知的方法洗涤，例如，用水洗涤。
生物预处理：术语“生物预处理”指可以促进纤维素、半纤维素和/或木质素从纤维素材料分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可涉及应用溶解木质素的微生物(参见，例如，Hsu,T.-A.,1996,Pretreatmentofbiomass,于HandbookonBioethanol:ProductionandUtilization,Wyman,C.E编,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212；Ghosh和Singh,1993,Physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass,Adv.Appl.Microbiol.39:295-333；McMillan,J.D.,1994,Pretreatinglignocellulosicbiomass:areview，于EnzymaticConversionofBiomassforFuelsProduction,Himmel,M.E.,Baker,J.O.和Overend,R.P.编,ACSSymposiumSeries566,AmericanChemicalSociety，Washington,DC,chapter15；Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.和Tsao,G.T.，1999,Ethanolproductionfromrenewableresources,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,T.编,Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany，65:207-241；Olsson和Hahn-Hagerdal,1996,Fermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction,Enz.Microb.Tech.18:312-331；和Vallander和Eriksson,1990,Productionofethanolfromlignocellulosicmaterials:Stateoftheart,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。
物理预处理：术语“物理预处理”指促进纤维素、半纤维素和/或木质素从纤维素材料分离和/或释放的任何处理。例如，物理预处理可涉及辐射(例如，微波辐射)、汽蒸/蒸汽爆炸、水热解(hydrothermolysis)和它们的组合。
物理预处理可以涉及高压和/或高温(蒸汽爆炸)。在一个方面，高压指优选约300至约600psi，更优选约350至约550psi，并且最优选约400至约500psi，如约450psi的压力。在另一个方面，高温指约100至300℃，优选约140至235℃的温度。在一个优选的方面，物理预处理在使用如上所定义的高温和高压的分批过程、蒸汽枪水解器系统，例如可由SundsDefibratorAB,Sweden获得的SundsHydrolyzer中进行。
纤维素材料也可以在预处理之前使用本领域中已知的方法进行预浸泡、润湿、洗涤或调理。
组合的物理和化学预处理：可以对纤维素材料进行物理和化学预处理。例如，预处理步骤可以涉及稀酸或弱酸处理和高的温度和/或压力处理。根据需要，可以顺序或同时进行物理和化学预处理。还可以包括机械预处理。
因此，在一个优选的方面，对纤维素材料进行机械、化学或物理预处理，或者它们的任何组合，以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。
糖化。在水解(也称作糖化)步骤中，将纤维素材料，例如预处理的纤维素材料水解以将纤维素和任选地也将半纤维素分解成可发酵糖，如葡萄糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶的寡糖。水解用本发明的酶组合物以酶法进行。
酶水解优选在易于由本领域技术人员确定的条件下，在合适的含水环境中进行。在一个优选的方面，水解在适于酶的活性，即对于酶最优的条件下进行。水解可以以补料分批或连续的工艺进行，其中将预处理的纤维素材料(底物)逐渐补入，例如，含酶的水解溶液中。
糖化通常在搅拌釜反应器或发酵罐中，在受控的pH、温度和混合条件下进行。合适的处理时间、温度和pH条件可以由本领域技术人员容易地确定。例如，糖化可以持续长达200小时，但是通常优选进行约12至约96小时，更优选约16至约72小时，并且最优选约24至约48小时。温度优选约25℃至约70℃，更优选约30℃至约65℃，并且最优选约40℃至约60℃，特别是约50℃。pH优选约3至约8，更优选约3.5至约7，并且最优选约4至约6，特别是约pH5。干燥固体含量优选约5至约50wt%，更优选约10至约40wt%，并且最优选约20至约30wt%。
在一个优选的方面，本发明的酶组合物的有效量是约0.5至约50mg，优选约0.5至约40mg，更优选约0.5至约30mg，更优选约0.75至约20mg，更优选约0.75至约15mg，甚至更优选约1.0至约10mg，并且最优选约2.0至约5mg每g纤维素材料中的纤维素。
发酵得自所述经水解的纤维素材料的可发酵的糖可由一种或多种(几种)能够将所述糖直接或间接发酵为所期望的发酵产物的发酵微生物进行发酵。“发酵”或“发酵工艺”指任何发酵工艺或任何包含发酵步骤的工艺。发酵工艺亦包括用于醇类消费品工业(例如，啤酒与葡萄酒)、乳制品工业(例如，发酵的乳产品)、皮革工业与烟草工业的发酵工艺。发酵条件取决于所期望的发酵产物以及发酵生物，且可由本领域技术人员容易地确定。
在所述发酵步骤中，作为预处理与酶水解步骤的结果自所述纤维素材料释放的糖由发酵生物(如酵母)发酵为产物，例如乙醇。如本文中所述，可分别或同时进行水解(糖化)与发酵。
在本发明的发酵步骤中可以使用任何合适的经水解的纤维素材料。通常根据所需发酵产品(即，要从发酵获得的物质)和使用的方法来选择底物，如本领域中所公知。
术语“发酵培养基”在本文中可理解为指加入发酵微生物之前的培养基，如，由糖化过程产生的培养基，以及同步的糖化和发酵方法(SSF)中使用的培养基。
“发酵微生物”指适用于理想的发酵方法产生发酵产物的任何微生物，包括细菌和真菌生物体。发酵生物体可以是C6和/或C5发酵生物体，或它们的组合。C6和C5发酵生物体均在本领域公知。合适的发酵微生物能将糖(如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖或寡糖)直接或间接地发酵(即，转化)成理想的发酵产品。
可产生乙醇的细菌和真菌发酵生物体的实例如Lin等,2006,Appl.Microbiol.Biotechnol.69:627-642所述。
能发酵C6糖的发酵微生物的实例包括细菌和真菌生物体，如酵母。优选的酵母包括酵母属菌种，优选酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
能发酵C5糖的发酵生物体的实例包括细菌和真菌生物体，如酵母。优选的C5发酵酵母包括毕赤酵母属(Pichia)，优选树干毕赤酵母(Pichiastipitis)的菌株，如树干毕赤酵母CBS5773；假丝酵母属，优选博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii)、芸薹假丝酵母(Candidabrassicae)、休哈塔假丝酵母(Candidasheatae)、迪丹斯假丝酵母(Candidadiddensii)、假热带假丝酵母(Candidapseudotropicalis)或产朊假丝酵母(Candidautilis)的菌株。
其它发酵生物体包括发酵单胞菌属(Zymomonas)，如运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)的菌株；汉逊酵母属(Hansenula)，如异常汉逊酵母(Hansenulaanomala)的菌株；克鲁维酵母属，如脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)的菌株；裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，如粟酒裂殖酵母(S.pombe)的菌株；大肠杆菌的菌株，特别是已经经过遗传修饰而改进乙醇产量的大肠杆菌菌株；梭菌属，如丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、热纤维梭菌(Chlostridiumthermocellum)和Chlostridiumphytofermentans的菌株；地芽孢杆菌属菌种的菌株；热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)，如解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobactersaccharolyticum)的菌株；和芽孢杆菌属，如凝结芽孢杆菌的菌株。
在一个优选的方面，酵母是酵母属菌种。在一个更优选的方面，酵母是酿酒酵母。在另一个更优选的方面，酵母是糖化酵母。在另一个更优选的方面，酵母是葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)。在另一个优选的方面，酵母是克鲁维酵母属。在另一个更优选的方面，酵母是马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)。在另一个更优选的方面，酵母是脆壁克鲁维酵母。在另一个优选的方面，酵母是假丝酵母属。在另一个更优选的方面，酵母是博伊丁假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是芸薹假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是迪丹斯假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是假热带假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是产朊假丝酵母。在另一个优选的方面，酵母是棒孢酵母属(Clavispora)。在另一个更优选的方面，酵母是葡萄牙棒孢酵母(Clavisporalusitaniae)。在另一个更优选的方面，酵母是仙人掌棒孢酵母(Clavisporaopuntiae)。在另一个优选的方面，酵母是管囊酵母属(Pachysolen)。在另一个更优选的方面，酵母是嗜鞣管囊酵母(Pachysolentannophilus)。在另一个优选的方面，酵母是毕赤酵母属。在另一个更优选的方面，酵母是树干毕赤酵母。在另一个优选的方面，酵母是酒香酵母属(Bretannomyces)。在另一个更优选的方面，酵母是克劳森酒香酵母(Bretannomycesclausenii)(Philippidis,G.P.,1996,Cellulosebioconversiontechnology，于HandbookonBioethanol:ProductionandUtilization,Wyman,C.E.编,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。
能有效地将己糖和戊糖发酵成乙醇的细菌包括，例如，运动发酵单胞菌、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、热纤维梭菌、Chlostridiumphytofermentans、地芽孢杆菌属菌种、解糖热厌氧杆菌和凝结芽孢杆菌(Philippidis,1996,见上文)。
在一个优选的方面，细菌是发酵单胞菌属。在更优选的方面，细菌是运动发酵单胞菌。在另一个优选的方面，细菌是梭菌属。在另一个更优选的方面，细菌是热纤维梭菌。
商业上可得到的适合乙醇产生的酵母包括，例如ETHANOLREDTM酵母(可从RedStar/Lesaffre,USA获得)、FALITM(可从Fleischmann’sYeast,BurnsPhilpFoodInc.,USA的部门获得)、SUPERSTARTTM和THERMOSACCTM新鲜酵母(可从EthanolTechnology，WI,USA获得)、BIOFERMTMAFT和XR(可从NABC-NorthAmericanBioproductsCorporation,GA,USA获得)、GERTSTRANDTM(可从GertStrandAB,Sweden获得)和FERMIOLTM(可从DSMSpecialties获得)。
在一个优选的方面，发酵微生物已经经过遗传修饰，提供发酵戊糖的能力，如利用木糖、利用阿拉伯糖和共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。
通过将异源基因克隆入多种发酵微生物已经构建了能将己糖和戊糖转化成乙醇(共发酵)的生物体(Chen和Ho,1993,CloningandimprovingtheexpressionofPichiastipitisxylosereductasegeneinSaccharomycescerevisiae,Appl.Biochem.Biotechnol.39-40:135-147；Ho等,1998,GeneticallyengineeredSaccharomycesyeastcapableofeffectivelycofermentingglucoseandxylose,Appl.Environ.Microbiol.64:1852-1859；Kotter和Ciriacy，1993,XylosefermentationbySaccharomycescerevisiae,Appl.Microbiol.Biotechnol.38:776-783；Walfridsson等,1995,Xylose-metabolizingSaccharomycescerevisiaestrainsoverexpressingtheTKL1andTAL1genesencodingthepentosephosphatepathwayenzymestransketolaseandtransaldolase,Appl.Environ.Microbiol.61:4184-4190；Kuyper等,2004,MinimalmetabolicengineeringofSaccharomycescerevisiaeforefficientanaerobicxylosefermentation:aproofofprinciple,FEMSYeastResearch4:655-664；Beall等,1991,ParametricstudiesofethanolproductionfromxyloseandothersugarsbyrecombinantEscherichiacoli,Biotech.Bioeng.38:296-303；Ingram等,1998,Metabolicengineeringofbacteriaforethanolproduction,Biotechnol.Bioeng.58:204-214；Zhang等,1995,MetabolicengineeringofapentosemetabolismpathwayinethanologenicZymomonasmobilis,Science267:240-243；Deanda等,1996,Developmentofanarabinose-fermentingZymomonasmobilisstrainbymetabolicpathwayengineering,Appl.Environ.Microbiol.62:4465-4470；WO2003/062430，木糖异构酶)。
在一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是酿酒酵母。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是运动发酵单胞菌。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是大肠杆菌。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是克鲁维酵母属菌种。
本领域中公知的是，上述生物体还能用于产生其它物质，如本文所述。
通常向降解的木素纤维素或水解物加入发酵微生物，并进行约8至约96小时，如约24至约60小时发酵。温度通常为约26℃至约60℃，特别是约32℃或50℃，并且在约pH3至约pH8，如约pH4-5、6或7。
在一个优选的方面，对降解的纤维素材料施用酵母和/或另一种微生物，并进行约12至约96小时，如通常为24-60小时发酵。在一个优选的方面，温度优选为约20℃至约60℃，更优选约25℃至约50℃，并且最优选约32℃至约50℃，特别是约32℃或50℃，并且pH通常为约pH3至约pH7，优选约pH4-7。然而，一些发酵生物体例如细菌，具有更高的最适发酵温度。酵母或另一种微生物优选以约105-1012，优选约107-1010，特别是约2x108活细胞计数每ml发酵液的量施用。关于使用酵母进行发酵的进一步指导可以在例如“TheAlcoholTextbook”(K.Jacques,T.P.Lyons和D.R.Kelsall编,NottinghamUniversityPress,UnitedKingdom1999)中找到，其通过提述并入本文。
对于乙醇生产，在发酵后蒸馏浆料以提取乙醇。根据本发明的方法获得的乙醇可以用作，例如燃料乙醇；饮料乙醇，即，中性饮料酒，或工业乙醇。
发酵刺激剂可以与本文所述的任何工艺组合使用，以进一步改进发酵工艺，而且特定地，改进发酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇得率。“发酵刺激剂”指用于发酵微生物(特别是酵母)生长的刺激剂。优选的用于生长的发酵刺激剂包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸(盐)、烟酸、内消旋肌醇(meso-inositol)、硫胺素、吡哆醇(pyridoxine)、对氨基苯甲酸、叶酸、核黄素和维生素A、B、C、D和E。参见，例如，Alfenore等,ImprovingethanolproductionandviabilityofSaccharomycescerevisiaebyavitaminfeedingstrategyduringfed-batchprocess,Springer-Verlag(2002)，其通过提述并入本文。矿物质的实例包括能够提供营养物的矿物质和矿物质盐，所述营养物包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。
发酵产物：发酵产物可以是源自发酵的任何物质。发酵产物可以是，不限于，醇(例如，阿拉伯醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1,3-丙二醇、山梨醇和木糖醇)；有机酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸)；和气体(例如，甲烷、氢气(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))。发酵产物还可以是作为高价值产品的蛋白质。
在一个优选的方面，发酵产物是醇。可理解的是，术语“醇”涵盖包含一个或多个羟基基团的物质。在更优选的方面，所述醇是阿拉伯醇。在另一个更优选的方面，所述醇是丁醇。在另一个更优选的方面，所述醇是乙醇。在另一个更优选的方面，所述醇是甘油。在另一个更优选的方面，所述醇是甲醇。在另一个更优选的方面，所述醇是1,3-丙二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是山梨醇。在另一个更优选的方面，所述醇是木糖醇。参见，例如，Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.,和Tsao,G.T.，1999,Ethanolproductionfromrenewableresources,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,T.编,Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany，65:207-241；Silveira,M.M.,和Jonas,R.,2002,Thebiotechnologicalproductionofsorbitol,Appl.Microbiol.Biotechnol.59:400-408；Nigam,P.,和Singh,D.,1995,Processesforfermentativeproductionofxylitol–asugarsubstitute,ProcessBiochemistry30(2):117-124；Ezeji,T.C.,Qureshi,N.和Blaschek,H.P.,2003,Productionofacetone,butanolandethanolbyClostridiumbeijerinckiiBA101andinsiturecoverybygasstripping,WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology19(6):595-603。
在另一个优选的方面，所述物质是有机酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是醋酮酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是己二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是抗坏血酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是柠檬酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是2,5-二酮-D-葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是甲酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是反丁烯二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖醛酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是戊二酸。在另一个优选的方面，所述有机酸是3-羟基丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是衣康酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乳酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是苹果酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是丙二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是草酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是琥珀酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是木糖酸。参见，例如，Chen,R.,和Lee,Y.Y.,1997,Membrane-mediatedextractivefermentationforlacticacidproductionfromcellulosicbiomass,Appl.Biochem.Biotechnol.63-65:435-448。
在另一个优选的方面，所述物质是酮。可理解的是术语“酮”包括含有一个或多个酮基的物质。在另一个更优选的方面，所述酮是丙酮。参见，例如，Qureshi和Blaschek,2003，见上文。
在另一个优选的方面，所述物质是氨基酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是天冬氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是赖氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是丝氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是苏氨酸。参见，例如，Richard,A.,和Margaritis,A.,2004,Empiricalmodelingofbatchfermentationkineticsforpoly(glutamicacid)productionandothermicrobialbiopolymers,BiotechnologyandBioengineering87(4):501-515。
在另一个优选的方面，所述物质是气体。在另一个更优选的方面，所述气体是甲烷。在另一个更优选的方面，所述气体是H2。在另一个更优选的方面，所述气体是CO2。在另一个更优选的方面，所述气体是CO。参见，例如，Kataoka,N.,A.Miya,和K.Kiriyama,1997,Studiesonhydrogenproductionbycontinuousculturesystemofhydrogen-producinganaerobicbacteria,WaterScienceandTechnology36(6-7):41-47；和GunaseelanV.N.于BiomassandBioenergy,Vol.13(1-2),pp.83-114,1997,Anaerobicdigestionofbiomassformethaneproduction:Areview。
回收可以使用本领域已知的任何方法，任选地从发酵培养基回收发酵产物，所述方法包括，但不限于，层析、电泳方法、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、蒸馏或提取。例如，通过常规蒸馏方法从发酵的纤维素材料分离并纯化醇。可以获得纯度高达约96vol%的乙醇，其能用作，例如，燃料乙醇、饮料乙醇，即，中性饮料酒，或工业乙醇。
进一步通过下述实施例描述本发明，其不应视作对本发明范围的限制。
实施例
材料
用作缓冲液和底物的化学品为至少试剂级别的商业产品。
培养基
PDA平板组成为39克的马铃薯右旋糖琼脂和去离子水加至1升。
基本培养基平板组成为6g的NaNO3，0.52g的KCl，1.52g的KH2PO4，1ml的COVE痕量金属溶液，20g的Noble琼脂，20ml的50%葡萄糖，2.5ml的MgSO4·7H2O，20ml的0.02%生物素溶液，和去离子水加至1升。
COVE痕量金属溶液组成为0.04g的Na2B4O7·10H2O，0.4g的CuSO4·5H2O，1.2g的FeSO4·7H2O，0.7g的MnSO4·H2O，0.8g的Na2MoO2·2H2O，10g的ZnSO4·7H2O，和去离子水加至1升。
MDU2BP培养基每升组成为45g的麦芽糖，1g的MgSO4·7H2O，1g的NaCl，2g的K2SO4，12g的KH2PO4，7g的酵母提取物，2g的尿素，和0.5ml的AMG痕量金属溶液；pH5.0。
AMG痕量金属溶液每升组成为14.3g的ZnSO4·7H2O，2.5g的CuSO4·5H2O，0.5g的NiCl2·6H2O，13.8g的FeSO4·7H2O，8.5g的MnSO4·7H2O，和3g的柠檬酸。
NNCYP-PCS培养基组成为5.0g的NaNO3，3.0g的NH4Cl，2.0g的MES，2.5g的柠檬酸，0.2g的CaCl22H2O，1.0g的细菌蛋白胨，5.0g的酵母提取物，0.2g的MgSO47H2O，4.0g的K2HPO4，1.0ml的COVE痕量金属溶液，2.5g的葡萄糖，25.0g的预处理的玉米秸秆(PCS)，和去离子水加至1升。
2XYT培养基每升组成为16g的胰蛋白胨，10g的酵母提取物，和5g的NaCl。
2XYT平板每升组成为16g的胰蛋白胨，10g的酵母提取物，5g的NaCl和15g的Noble琼脂。
YG琼脂平板每升组成为5.0g的酵母提取物，10.0g的葡萄糖，和20.0g的琼脂。
YEG培养基每升组成为20g的右旋糖和5g的酵母提取物。
LB培养基每升组成为10g的胰蛋白胨，5g的酵母提取物，和5g的氯化钠。
LB琼脂平板组成为10g的胰蛋白胨，5g的酵母提取物，10g的氯化钠，15g的琼脂，和1升的蒸馏水。
YP培养基每升组成为10g的酵母提取物和20g的细菌蛋白胨。
MEX-1培养基每升组成为20g的大豆粉，15g的麦麸，10g的微晶纤维素(FMC，Philadelphia，PA，USA)，5g的麦芽糊精，3g的细菌蛋白胨，0.2g的Pluronic，和1g的橄榄油。
LB氨苄青霉素培养基每升组成为10g的胰蛋白胨，5g的酵母提取物，5g的氯化钠，和50mg的氨苄青霉素(经过滤灭菌，在高压灭菌之后加入)。
LB氨苄青霉素平板组成为15g的细菌琼脂每升的LB氨苄青霉素培养基。
MY25培养基每升组成为25g的麦芽糊精，2g的MgSO4·7H2O，10g的KH2PO4，2g的柠檬酸，2g的K2SO4，2g的尿素，10g的酵母提取物，和1.5ml的AMG痕量金属溶液，调整至pH6。
YPD培养基组成为1%酵母提取物，2%蛋白胨，和经过滤灭菌的2%葡萄糖，其在高压灭菌之后加入。
YPM培养基组成为1%酵母提取物，2%蛋白胨，和经过滤灭菌的2%麦芽糊精，其在高压灭菌之后加入。
含葡萄糖或半乳糖的SC-URA培养基组成为100ml的10XBasal盐，25ml的20%不含维生素的酪蛋白氨基酸，10ml的1%色氨酸，4ml的5%苏氨酸(经过滤灭菌，在高压灭菌之后加入)，和100ml的20%葡萄糖或100ml的20%半乳糖(经过滤灭菌，在高压灭菌之后加入)，和去离子水加至1升。
10XBasal盐溶液组成为75g的酵母氮基(yeastnitrogenbase)，113g的琥珀酸，68g的NaOH，和去离子水加至1升。
SC-琼脂平板组成为20g的琼脂每升的SC-URA培养基(如所示，含葡萄糖或半乳糖)。
含半乳糖的0.1%AZCL木聚糖SC-URA琼脂平板组成为20g的琼脂每升的含半乳糖的SC-URA培养基和0.1%AZCL燕麦木聚糖(Megazyme，Wicklow，Ireland)。
含半乳糖的SC-URA培养基组成为900ml的SC-Grund琼脂(经高压灭菌)，4ml的5%苏氨酸(经过滤灭菌)，和100ml的20%半乳糖(经过滤灭菌)。
SC-Grund琼脂组成为7.5gYeastNitrogenBase(不含氨基酸)，11.3g的琥珀酸，6.8g的氢氧化钠，5.6g的酪蛋白氨基酸，0.1g的L-色氨酸，20g的琼脂，和去离子水加至1升。
COVE平板每升组成为342.3g的蔗糖，25g的Noble琼脂，20ml的COVE盐溶液，10mM乙酰胺，和15或20mMCsCl。在高压灭菌之前将溶液调整至pH7.0。
COVE2平板每升组成为30g的蔗糖，20ml的COVE盐溶液，20ml的1M乙酰胺，和25g的琼脂Noble。
COVE盐溶液每升组成为26g的KCl，26g的MgSO4·7H2O，76g的KH2PO4，和50ml的COVE微量金属。
YPG培养基每升组成为10g的酵母提取物，10g的细菌蛋白胨，和20g的葡萄糖。
M410培养基每升组成为50g的麦芽糖，50g的葡萄糖，2g的MgSO4-7H2O，2g的KH2PO4，4g的无水柠檬酸粉末，8g的酵母提取物，2g的尿素，0.5g的AMG痕量金属溶液，和0.5g的CaCl2在pH6.0。
SOC培养基组成为2%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，10mMNaCl，2.5mMKCl，10mMMgCl2，和10mMMgSO4；通过高压灭菌进行灭菌，然后添加经过滤灭菌的葡萄糖至20mM。
SY50培养基每升组成为50g的蔗糖，2g的MgSO4·7H2O，10g的KH2PO4,无水，2g的K2SO4，2g的柠檬酸，10g的酵母提取物，2g的尿素，0.5g的CaCl2·2H2O，和0.5g的200XAMG痕量金属溶液，pH6.0。
200XAMG痕量金属溶液每升组成为3g的柠檬酸，14.3g的ZnSO4·7H2O，2.5g的CuSO4·5H2O，13.8g的FeSO4·7H2O，和8.5g的MnSO4·H2O。
Cal-18培养基每升组成为40g的酵母提取物，1.3g的硫酸镁，50g的麦芽糊精，20g的NaH2PO4，和0.1g的消泡剂。
纤维素酶诱导培养基组成为20g的纤维素，10g的玉米浸渍固体(cornsteepsolids)，1.45g的(NH4)2SO4，2.08g的KH2PO4，0.28g的CaCl2，0.42g的MgSO4·7H2O，0.42ml的木霉属痕量金属溶液，和1-2滴的消泡剂。
木霉属痕量金属溶液每升组成为216g的FeCl3·6H2O，58g的ZnSO4·7H2O，27g的MnSO4·H2O，10g的CuSO4·5H2O，2.4g的H3BO3，和336g的柠檬酸。
TE组成为10mMTrispH7.4和0.1mMEDTA。
YPM培养基在去离子水中含有1%酵母提取物，2%的蛋白胨，和2%的麦芽糖。
MY50培养基组成为50g的麦芽糊精，2g的MgSO47H2O，10g的KH2PO4，2g的K2SO4，2g的柠檬酸，10g的酵母提取物，2g的尿素，0.5ml的AMG痕量金属溶液，和蒸馏水加至1升。
AMG痕量金属溶液每升组成为14.3g的ZnSO4·7H2O，2.5g的CuSO4·5H2O，0.5g的NiCl2·6H2O，13.8g的FeSO4·7H2O，8.5g的MnSO4·7H2O，3g的柠檬酸，和蒸馏水加至1升。
50XVogels培养基每升组成为150g的柠檬酸钠，250g的KH2PO4，10g的MgSO4·7H2O，10g的CaCl2·2H2O，2.5ml的生物素储液，5.0ml的AMG痕量金属溶液，和蒸馏水加至1升。
COVE琼脂选择性平板组成为218g山梨醇，20g琼脂，20mlCOVE盐溶液，10mM乙酰胺，15mMCsCl，和去离子水加至1升。在灭菌之前将溶液调整至pH7.0。
COVE盐溶液组成为26gKCl，26gMgSO4·7H2O，76gKH2PO4，50mlCOVE痕量金属溶液，和去离子水加至1升。
COVE痕量金属溶液组成为0.04gNa2B4O7·10H2O，0.4gCuSO4·5H2O，1.2gFeSO4·7H2O，0.7gMnSO4·H2O，0.8gNa2MoO2·2H2O，10gZnSO4·7H2O，和去离子水加至1升。
YP+2%葡萄糖培养基在去离子水中组成为1%酵母提取物，2%蛋白胨和2%葡萄糖。
YP+2%麦芽糊精培养基在去离子水中组成为2%蛋白胨，2%麦芽糊精，和1%酵母提取物。
DAP-2C-1培养基在去离子水中组成为3%麦芽糊精，1.1%硫酸镁，0.52%磷酸三钾，0.2%柠檬酸，0.1%磷酸二氢钾，0.1%Dowfax63N10，0.05%酵母提取物，和0.05%的痕量元素溶液(1.39%硫酸亚铁，0.845%硫酸锰，0.68%氯化锌，0.3%柠檬酸，0.25%硫酸铜，和0.013%氯化镍)。
DAP-2C-1培养基在去离子水中组成为2%葡萄糖，1.1%硫酸镁，1.0%麦芽糖，0.52%磷酸三钾，0.2%柠檬酸，0.1%磷酸二氢钾，0.1%Dowfax63N10，0.05%酵母提取物，和0.05%的痕量元素溶液(1.39%硫酸亚铁，0.845%硫酸锰，0.68%氯化锌，0.3%柠檬酸，0.25%硫酸铜，和0.013%氯化镍)。
实施例1：嗜热毛壳菌CGMCC0581Cel7A纤维二糖水解酶I的制备
嗜热毛壳菌CGMCC0581Cel7A纤维二糖水解酶I(CBHI)基因(SEQIDNO：1[DNA序列]和SEQIDNO：2[推定的氨基酸序列])根据WO2003/000941分离，并在米曲霉中表达JaL250(WO99/61651)。
将真菌菌株嗜热毛壳菌CGMCC0581在45℃生长于组成为0.5%酵母提取物，1%葡萄糖和2%琼脂的琼脂平板3日。使用完全生长的培养物接种含有组成为3%大豆粉，1.5%麦芽糖，和0.5%蛋白胨的液体培养基的摇瓶。将烧瓶在45℃振荡温育48小时。通过在4℃以8000rpm将培养液离心30分钟收获菌丝体，将其转移至干净的塑料袋，然后立即在液氮中冻结，并在分离总RNA之前储藏于-80℃。
将冻结的菌丝体用经200℃烘烤24小时而灭菌的杵和研钵研磨为非常细微的粉末。使用PlantMiniKit(QIAGENInc.，Valencia，CA，USA)根据生产商的指示分离总RNA。
使用3’RACESystemforRapidAmplificationofcDNAEnds的(InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA，USA)根据生产商的指示进行从总RNA的第一链cDNA合成。将3’RACE的第一链cDNA用作用于PCR筛选的PCR模板。
使用下述的两种寡核苷酸以供PCR筛选嗜热毛壳菌CGMCC0581的cDNA。正向引物来源于纤维二糖水解酶I基因的保守区的比对，而反向引物通过3’RACESystem提供。
正向引物：
5’-GGnACnGGnTA(t/c)TG(t/c)GA-3’(SEQIDNO:67)
反向引物：
5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’(SEQIDNO:68)
一百皮摩尔的正向引物和10皮摩尔的反向引物用于PCR反应，所述反应包含2μl的3’RACE的第一链cDNA，5μl的10XTaqDNA聚合酶缓冲液(PromegaCorporation，Madison，WI，USA)，3μl的25mMMgCl2，1μl的10mMdNTP，和2.5单位的TaqDNA聚合酶(PromegaCorporation，Madison，WI，USA)，终体积为50μl。在热循环仪中进行扩增，其程序如下：1个循环，在95℃进行3分钟；30个循环，每循环在95℃进行30秒，50℃进行30秒，和72℃进行50秒；和1个循环，在72℃进行10分钟。然后加热块进入4℃浸泡循环。
通过使用TBE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中将大约1.3kb产物条带从凝胶切出，并使用PCRPrepsDNAPurificationSystem(PromegaCorporation，Madison，WI，USA)根据生产商的指示进行纯化。使用377DNAAnalyzer(AppliedBiosystemsInc，FosterCity，CA，USA)对PCR产物进行测序。测序显示所述1.3kb片段与纤维二糖水解酶I同源。
设计了下文中所示的两种寡聚物用于通过使用5’RACESystemforRapidAmplificationofcDNAEnds(InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA，USA)进行嗜热毛壳菌CGMCC0581Cel7A纤维二糖水解酶I的5’端克隆。
引物4310AS1：
5’-AGATATCCATCTCAGAGCA-3’(SEQIDNO:69)
引物4310AS2：
5’-GTTGGCATCATTGGTCG-3’(SEQIDNO:70)
将基因特异性引物4310AS1用于根据生产商的指示使用5’RACESystem进行第一链cDNA合成。将5’RACE的第一链cDNA(5μl)用作模板进行PCR扩增，其包含5μl的10XTaqDNA聚合酶缓冲液，3μl的25mMMgCl2，1μl的10mMdNTP，1μl的10μM4310AS2引物，1μl的10μM引物AAP(AbridgedAnchorPrimer，在试剂盒中提供)，和2.5单位的TaqDNA聚合酶，其终体积为50μl。在热循环仪中进行扩增，其程序如下：1个循环，在94℃进行3分钟；30个循环，每循环在95℃进行30秒，50℃进行30秒，和72℃进行50秒；和1个循环，在72℃进行10分钟。然后加热块进入4℃浸泡循环。
通过使用TBE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，并使用PCRPrepsDNAPurificationSystem纯化。通过使用377DNAAnalyzer进行的测序将一个0.8kb的主要DNA片段确认为嗜热毛壳菌CGMCC0581Cel7A纤维二糖水解酶I基因的5’端。
下文所示的两个引物是基于来自5’和3’端克隆的序列信息进行设计的。用其进行嗜热毛壳菌CGMCC0581Cel7A纤维二糖水解酶I基因的全长克隆。
引物4310S：
5’-ATCCTCTCCTTCCAGTTTTC-3’(SEQIDNO:71)
引物4310AS：
5’-TATCCAAGTAGTCCACAACC-3’(SEQIDNO:72)
将十皮摩尔的上述两种引物用于PCR反应，其包含5μl的3’RACE的第一链cDNA，5μl的10XTaqDNA聚合酶缓冲液，3μl的25mMMgCl2，1μl的10mMdNTP，和2.5单位的TaqDNA聚合酶，其终体积为50μl。在热循环仪中进行扩增，其程序如下：1个循环，在95℃进行3分钟；30个循环，每循环在95℃进行50秒，55℃进行50秒，和72℃进行90秒；和1个循环，在72℃进行10分钟。然后加热块进入4℃浸泡循环。
通过使用TBE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中大约1.5kb产物条带从凝胶切出，并使用PCRPrepsDNAPurificationSystem纯化。然后将PCR片段使用pGEM-TVectorSystem(PromegaCorporation，Madison，WI，USA)连接于pGEM-T。通过使用377DNAAnalyzer进行的测序确认质粒DNA。将正确的克隆命名为pT43-10。
设计如下文所示的两种在其末端含有BspHI位点的合成寡核苷酸引物以PCR扩增嗜热毛壳菌CGMCC0581家族GH7A纤维二糖水解酶I基因的全长开读框。使用RapidLigationKit(RocheAppliedScience，Indianapolis，IN，USA)以将片段克隆入pAlLo2(WO2004/099228)。
PCR正向引物：
5’-TC -3’(SEQIDNO:73)
PCR反向引物：
5’-TCATGA -3’(SEQIDNO:74)
粗体字母代表编码序列。下划线序列含有与BspHI限制位点相同的序列。
将五十皮摩尔的上述每种引物用于PCR反应，其含有：50ng的含有嗜热毛壳菌CGMCC0581纤维二糖水解酶I基因的质粒pT43-10，含MgSO4的1XPwo扩增缓冲液(BoehringerMannheim，Indianapolis，IN，USA)，4μl的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP的10mM混合物，和2.5单位的PwoDNA聚合酶(BoehringerMannheim，Indianapolis，IN，USA)，其终体积为50μl。使用DNAENGINETMThermalCycler(MJResearch，Waltham，MA，USA)扩增片段，其程序如下：一个循环，在94℃进行2分钟；35个循环，每循环在94℃进行30秒，62℃进行30秒，和72℃进行1.5分钟。在35个循环之后，将反应物在72℃温育10分钟，然后在10℃冷却直至进一步处理。
在0.8%琼脂糖凝胶(CambrexBioproducts，EastRutherford，NJ，USA)上使用40mMTris碱-20mM乙酸钠-1mMEDTA二钠(TAE)缓冲液和0.1μg每ml的溴乙锭分离1.6kbPCR反应产物。以DARKREADERTMTransilluminator(ClareChemicalResearch，Dolores，CO，USA)协助显影DNA条带以避免UV诱导的突变。用可丢弃的刀刃将1.6kbDNA条带切出，并根据生产商的指示用DA旋转杯(Millipore，Billerica，MA，USA)纯化。
将纯化PCR片段使用BluntCloningKit(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)根据生产商的指示克隆入4Blunt-(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。对含有感兴趣的编码区的PCR克隆测序至至少40的PhredQ值以确保无PCR诱导的错误。所有的序列比对用Consed(UniversityofWashington)进行。确定克隆之一具有预期的序列，选择其，并将其重新命名为CtPCR。将含有嗜热毛壳菌(C.thermophilum)纤维二糖水解酶I编码区的CtPCR克隆用BspHI消化，并如上所述进行凝胶纯化。然后将该DNA片段用RapidLigationKit连接入pAlLo2的NcoI限制位点。通过限制性消化确认表达克隆，并进行测序以确认载体-插入连接是正确的。供转化的质粒DNA用Midi-PrepKit(QIAGENInc.，Valencia，CA，USA)制备。将最终克隆重新命名为pAlLo4。
根据Christensen等，1988，Bio/Technology6：1419-1422的方法制备米曲霉JaL250原生质体。使用八微克的pAlLo4(以及pAlLo2作为载体对照)转化米曲霉JaL250原生质体。将十二个转化体分离至单个PDA平板，并在34℃温育5日。用5ml的0.01%80洗涤汇合的孢子平板，并使用孢子悬液接种125ml玻璃摇瓶中的25ml的MDU2BP培养基。将转化体培养物在34℃以200rpm的恒速振荡温育。在接种之后第五日，以6000xg离心培养物，并收集其上清。将五微升的每种上清与等体积的2X上样缓冲液(10%β-巯基乙醇)混合，并上样于1.5mm8%-16%Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶，并用SIMPLYBLUETMSafeStain(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)染色。培养液的SDS-PAGE概貌显示所有十二个转化体具有大约66kDa的新蛋白条带。选择转化体编号12，并将其命名为米曲霉Jal250AlLo4。
摇瓶培养基每升包含50g的葡萄糖，2g的MgSO4·7H2O，10g的KH2PO4，2g的K2SO4，0.5g的CaCl2·2H2O，2g的柠檬酸，10g的酵母提取物，0.5g的AMG痕量金属溶液，和2g的尿素。AMG痕量金属溶液每升包含13.8g的FeSO4·7H2O，14.3g的ZnSO4·7H2O，8.5g的MnSO4·H2O，2.5g的CuSO4·5H2O，0.5g的NiCl2·6H2O和3.0g的一水合柠檬酸。
将一百ml的摇瓶培养基添加至500ml摇瓶。将摇瓶用米曲霉Jal250AlLo4的甘油孢子储液接种，并在34℃在定轨振荡器上以200rpm温育24小时。使用五十ml的摇瓶液接种发酵容器。
发酵批次培养基每升包含25g的蔗糖，2g的MgSO4·7H2O，2g的KH2PO4，3g的K2SO4，5g的(NH4)2HPO4，1g的柠檬酸，10g的酵母提取物，0.5g的AMG痕量金属溶液，和0.55g的Pluronic消泡剂。发酵补料培养基每升包含320g的麦芽糖，5g的Pluronic消泡剂，和1g的一水合柠檬酸。
将总计2升的发酵批次培养基添加至玻璃夹套发酵器。将发酵容器保持在34℃的温度，并使用10%NH4OH和10%H3PO4将pH控制在7进行180小时。将空气以1vvm的速率添加至容器，并将发酵液用以1100rpm旋转的Rushton叶轮搅拌。当通过溶解氧读数增加指示该批蔗糖耗尽时(大约18-24小时)，以4g每小时的速率起始补料。在发酵终止时，从容器收获全发酵液，并以3000xg离心以去除生物质。将上清过滤灭菌并储藏于5至10℃。
对经过滤的含有重组的嗜热毛壳菌Cel7A纤维二糖水解酶I的米曲霉Jal250AlLo4A发酵液(AOC18-7)的350ml(3.15g总蛋白)等分试样进行浓缩和脱盐，然后在20mMTris-HClpH8中的QBigBead柱(GEHealthcare，Piscataway，NJ，USA)上以0至1MNaCl的线性梯度纯化。基于SDS-PAGE汇集级分，将其浓缩并缓冲液交换至25mMTris-HCl，pH8。根据SDS-PAGE，纯化的纤维二糖水解酶I(大约总计800mg)为大约90%纯。使用MicroplateBCATMProteinAssayKit(ThermoFischerScientific，Waltham，MA，USA)确定蛋白浓度，其中使用牛血清白蛋白作为蛋白标样。
实施例2：嗜热毁丝霉CBS117.65Cel7A纤维二糖水解酶I的制备
将嗜热毁丝霉CBS117.65Cel7A纤维二糖水解酶I(CBHI)基因(SEQIDNO:3[DNA序列]和SEQIDNO:4[推定的氨基酸序列])根据WO2003/000941分离，并在米曲霉中表达JaL250。
设计了如下文所示的两种合成寡核苷酸引物以从嗜热毁丝霉CBS117.65PCR扩增编码家族Cel7A纤维二糖水解酶I的全长开读框。
PCR正向引物：
5’-ctcgcagtcgcagtcaag-3’(SEQIDNO:75)
PCR反向引物：
5’-cggtcaggtgcagttag-3’(SEQIDNO:76)
将三十皮摩尔的上述每种引物用于扩增反应，其含有50ng由根据美国专利号6,242,237制备的嗜热毁丝霉CBS117.65cDNA的汇集物组成的DNA，1XEXPANDTMPCR缓冲液(RocheDiagnostics，Mannheim，Germany)，4μl的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP的2.5mM混合物，0.75μl的EXPANDTMDNA聚合酶(RocheDiagnostics，Mannheim，Germany)，其终体积为50μl。在热循环仪中进行所述片段的扩增，其程序如下：一个循环，在94℃进行5分钟；和35个循环，每循环在94℃进行1分钟，54℃进行1分钟，和72℃进行2分钟。在30个循环之后，将反应物在72℃温育10分钟，然后在室温冷却直至进一步处理。
通过使用TBE缓冲液和0.1μg每ml的溴乙锭的1%琼脂糖凝胶电泳分离1.3kbPCR产物。将1.3kbDNA条带用可丢弃的刀刃切出，并使用JETSORBGelExtractionKit(GenomedGmbH，，Germany)根据生产商的指示纯化。
将纯化PCR片段根据生产商的指示克隆入4Blunt-对含有感兴趣的编码区的PCR克隆进行测序。选择一个具有预期序列的克隆并将其命名为pDAu27#15。
如下文所示的，设计在正向引物上含有BspHI限制位点并在反向引物上含有PacI限制位点的两种合成寡核苷酸引物以从pDAu27#15PCR扩增嗜热毁丝霉CBS117.65Cel7A纤维二糖水解酶I的全长开读框。使用RapidLigationKit将该片段克隆入pAlLo2(WO2004/099228)。
PCR正向引物：
5’-TC -3’(SEQIDNO:77)
PCR反向引物：
5’-TTAATTAA -3’(SEQIDNO:78)
粗体字母代表编码序列。下划线序列含有与BspHI和PacI限制位点同一的序列。
将五十皮摩尔的上述每种引物用于PCR反应，其含有50ng的含有嗜热毁丝霉CBS117.65纤维二糖水解酶I基因的质粒pDAu27#15，1XPfx扩增缓冲液(Invitrogen，Calsbad，CA，USA)，6μl的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP的10mM混合物，2.5单位的PfxDNAPolymerase(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，1μl的50mMMgSO4，和2.5μl的10XpCRxEnhancer溶液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，终体积为50μl。使用DNAENGINETMThermalCycler以扩增片段，其程序如下：一个循环，在98℃进行2分钟；和35个循环，每循环在94℃进行30秒，58℃进行30秒，和68℃进行1.5分钟。在35个循环之后，将反应物在68℃温育10分钟，然后在10℃冷却直至进一步处理。
使用TAE缓冲液和0.1μg每ml的溴乙锭在0.8%琼脂糖凝胶上分离1.3kbPCR反应产物。以DARKREADERTMTransilluminator协助显影DNA条带以避免UV-诱导的突变。将1.3kbDNA条带用可丢弃的刀刃切出，并用DA旋转杯根据生产商的指示纯化。
将纯化的PCR片段根据生产商的指示克隆入4Blunt-对含有感兴趣的编码区PCR克隆测序至PhredQ值为至少40以确保不存在PCR诱导的错误。所有的序列比对用Consed(UniversityofWashington)进行。选择一个显示具有预期序列的克隆，并将其重命名为MtPCR。将含有嗜热毁丝霉纤维二糖水解酶I编码区的MtPCR克隆用BspHI和BssSI双重消化，并如上所述凝胶纯化出352bp片段。MtPCR的另一个等分试样亦用BssSI和PacI双重消化，并如上所述凝胶纯化出1009bp片段。然后将这些DNA片段在使用RapidLigationKit的三路(three-way)连接中连接至之前用NcoI和PacI消化的pAlLo2。表达克隆通过限制性消化确认，并进行测序以确认载体-插入连接是正确的。用Midi-PrepKit制备供转化的质粒DNA。将最终克隆重新命名为pAlLo10。
米曲霉JaL250原生质体根据Christensen等，1988，见上文的方法制备。使用六微克的pAlLo10(以及pAlLo2作为载体对照)转化米曲霉JaL250原生质体。将八个转化体分离至单个PDA平板，并在34℃温育五日。用5ml的0.01%80洗涤汇合的孢子平板，并使用孢子悬液接种125ml玻璃摇瓶中25ml的MDU2BP培养基。以200rpm的恒速振荡在34℃温育转化体培养物。在接种后第五日，在6000xg离心培养物并收集其上清。将五微升的每种上清与等体积的2X上样缓冲液(10%β-巯基乙醇)混合，并加载于1.5mm8%-16%Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶上，并用SIMPLYBLUETMSafeStain染色。发酵液的SDS-PAGE概貌显示全部八种转化体具有大约50kDa的新蛋白条带。选择转化体编号8进行进一步研究，并命名为米曲霉JaL250AlLo10。
如上所述制备新的完全汇合的孢子平板。用5ml的0.01%80的水溶液收集孢子，并再进行两次用MDU2BP培养基的洗涤以使收集的孢子数最大化。然后将孢子悬液用于接种在两升Fernbach烧瓶中的500ml的MDU2BP培养基。然后将米曲霉JaL250AlLo10液体培养物在34℃以200rpm振荡温育。在接种后第五日，通过在具有0.45μm孔径的500毫升，75mmNylon过滤单元上过滤收集发酵液。
将培养滤过物脱盐，并根据生产商的指示使用26/10脱盐柱(GEHealthcare，Piscataway，NJ，USA)在20mMTris，150mMNaClpH8.5中缓冲液交换。使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定蛋白浓度，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例3：烟曲霉NN055679Cel7A纤维二糖水解酶I的制备
对烟曲霉部分基因组序列(TheInstituteforGenomicResearch，Rockville，MD)的tfasty检索(Pearson等，1997，Genomics46:24-36)使用来自里氏木霉的Cel7纤维二糖水解酶蛋白序列(登录号P00725)作为查询序列进行。基于与查询序列在氨基酸水平的高度类似性，将几种基因鉴定为推定的家族GH7同源物。选择与查询序列具有显著同一性的一个基因组区进行进一步研究并将对应的基因命名为cel7A。
设计如下文所示的两种合成寡核苷酸引物以从如WO2005/047499中所述制备的烟曲霉的基因组DNAPCR扩增烟曲霉NN055679cel7A纤维二糖水解酶I基因(SEQIDNO:5[DNA序列]和SEQIDNO:6[推定的氨基酸序列])。
正向引物：
5′-gggcATGCTGGCCTCCACCTTCTCC-3′(SEQIDNO:79)
Reverse引物：
5′-gggtaattaaCTACAGGCACTGAGAGTAA-3’(SEQIDNO:80)
大写字母代表编码序列。剩余序列分别在正向和反向序列中为SphI和PacI提供限制性核酸内切酶位点。使用这些引物，使用标准PCR方法扩增烟曲霉cel7A基因，并通过使用TAE缓冲液的1%琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，并对其使用GelExtractionKit(QIAGENInc.，Valencia，CA，USA)根据生产商的指示纯化。
将片段用SphI和PacI消化，并连接入亦用SphI和PacI根据标准步骤消化的表达载体pAlLo2。将连接产物根据生产商的指示转化入大肠杆菌XL10细胞(Stratagene，LaJolla，CA，USA)。通过限制性消化检测含有正确大小的质粒的大肠杆菌转化体，并使用9600(QIAGENInc.，Valencia，CA，USA)制备质粒DNA。来自该质粒的插入基因的DNA测序用Perkin-ElmerAppliedBiosystemsModel377XLAutomatedDNASequencer(Perkin-Elmer/AppliedBiosystems，Inc.，FosterCity，CA，USA)使用染料终止子化学(Giesecke等，1992，JournalofVirologyMethods38：47-60)和引物步移策略进行。就其品质审视核苷酸序列数据，并将所有的序列以PHRED/PHRAP软件(UniversityofWashington，Seattle，WA，USA)的协助互相比较。显示核苷酸序列匹配通过TIGR(SEQIDNO:5[DNA序列]和SEQIDNO:6[推定的氨基酸序列])确定的基因组序列。将所得质粒命名为pEJG93。
米曲霉JaL250原生质体根据Christensen等，1988，见上文的方法制备。使用五μg的pEJG93(以及pAlLo2作为载体对照)转化米曲霉JaL250。
用pEJG93转化米曲霉JaL250产生约100个转化体。将十个转化体分离至单个PDA平板。
将十个转化体中的五个的汇合的PDA平板用5ml的0.01%20洗涤，并分别接种入125ml玻璃摇瓶中25ml的MDU2BP培养基，并在34℃，250rpm温育。温育之后五日，使用8-16%Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)根据生产商的指示分析来自每个培养物的0.5μl上清。培养物的SDS-PAGE概貌显示转化体之一具有大约70kDa的主要条带。该转化体命名为米曲霉JaL250EJG93。
将五百ml的摇瓶培养基添加至2800ml摇瓶。摇瓶培养基包含45g的麦芽糖，2g的K2HPO4，12g的KH2PO4，1g的NaCl，1g的MgSO4·7H2O，7g的酵母提取物，2g的尿素，和0.5ml的痕量元素溶液。痕量元素溶液每升包含13.8g的FeSO4·7H2O，14.3g的ZnSO4·7H2O，8.5g的MnSO4·H2O，2.5g的CuSO4·5H2O，0.5g的NiCl2·6H2O，3g的柠檬酸，和去离子水加至1升。用含0.01%80的米曲霉JaL250EJG93的PDA平板的悬液接种两个摇瓶，并在34℃在定轨振荡器上以200rpm温育120小时。使用0.7μmWhatman玻璃过滤器GF/F(Whatman，Piscataway，NJ，USA)接着用0.22μmEXPRESSTMPlusMembrane(Millipore，Bedford，MA，USA)过滤培养液。
浓缩经过滤的培养液，并使用配置有10kDa聚醚砜膜(PALLFiltron，Northborough，MA，USA)的切线流浓缩器(PALLFiltron，Northborough，MA，USA)用20mMTris-HClpH8.5进行缓冲液交换。蛋白浓度使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例4：桔橙嗜热子囊菌CGMCC0583Cel7A纤维二糖水解酶I的制备
将桔橙嗜热子囊菌CGMCC0583Cel7A纤维二糖水解酶I(CBHI)基因(SEQIDNO:7[DNA序列]和SEQIDNO:8[推定的氨基酸序列])根据WO2003/000941分离并在米曲霉中表达JaL250。
将真菌菌株桔橙嗜热子囊菌CGMCC0583在45℃生长于包含0.5%酵母提取物，1%葡萄糖，和2%琼脂的琼脂平板3日。将完全生长的培养物用于接种含有液体培养基的摇瓶，所述培养基包含3%大豆粉，1.5%麦芽糖，和0.5%蛋白胨。将烧瓶在45℃振荡温育48小时。通过在8000rpm，4℃离心发酵液30分钟收获菌丝体，将其转移入干净的塑料袋，接着立即冻结在液氮中，并在分离总RNA之前储藏于-80℃。
将冻结的菌丝体用在200℃烘烤24小时的灭菌的杵和研钵粉碎为非常细微的粉末。使用PlantMiniKit根据生产商的指示分离总RNA。
来自总RNA的第一链cDNA合成使用3’RACESystemforRapidAmplificationofcDNAEnds根据生产商的指示进行。将3’RACE的第一链cDNA用作供PCR筛选的PCR模板。
使用如下文所示的两种寡核苷酸进行桔橙嗜热子囊菌CGMCC0583的cDNA的PCR筛选。正向引物来源于纤维二糖水解酶I基因的保守区的比对，而反向引物通过3’RACESystem提供。
正向引物：
5’-GGnACnGGnTA(t/c)TG(t/c)GA-3’(SEQIDNO:81)
Reverse引物：
5’-TCnA(a/g)CCAA(a/g)CAT(a/g)TT-3’(SEQIDNO:82)
将一百皮摩尔的上述引物用于PCR反应，其包含2μl的3’RACE的第一链cDNA，5μl的10XTaqDNA聚合酶缓冲液，3μl的25mMMgCl2，1μl的10mMdNTP，和2.5单位的TaqDNA聚合酶，其终体积为50μl。在热循环仪中进行扩增，其程序如下：1个循环，在95℃进行3分钟；30个循环，每循环在95℃进行30秒，50℃进行30秒，和72℃进行50秒；和1个循环，在72℃进行10分钟。然后加热块进入4℃浸泡循环。
通过使用TBE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中大约0.65kb产物条带从凝胶切出，并使用PCRPrepsDNAPurificationSystem根据生产商的指示纯化。将PCR产物使用377DNAAnalyzer测序。测序显示0.65kb片段与纤维二糖水解酶I同源。
设计两个寡聚物用于通过使用5’RACESystemforRapidAmplificationofcDNAEnds的桔橙嗜热子囊菌CGMCC0583Cel7A纤维二糖水解酶I的5’端克隆。
引物025AS1：
5’-GTAGAGATGCTGTTGGCT3’(SEQIDNO:83)
引物025AS1.5：
5’-TCTCAGCGCAGCAGGAACCGT-3’(SEQIDNO:84)
将基因特异性引物025AS1用于使用5’RACESystem根据生产商的指示的第一链cDNA合成。将5’RACE的第一链cDNA用作模板进行PCR扩增，其包含5μl的10XTaqDNA聚合酶缓冲液，3μl的25mMMgCl2，1μl的10mMdNTP，2μl的10μM引物025AS1.5，2μl的10μM引物AAP(AbridgedAnchor引物，在试剂盒中提供)，和2.5单位的TaqDNA聚合酶，其终体积为50μl。在热循环仪中进行扩增，其程序如下：1个循环，在94℃进行2分钟；30个循环，每循环在94℃进行40秒，55℃进行40秒，和72℃进行60秒；和1个循环，在72℃进行10分钟。然后加热块进入4℃浸泡循环。
通过使用TBE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，并使用PCRPrepsDNAPurificationSystem纯化。一个0.8kb的主要DNA片段通过使用377DNAAnalyzer进行的测序确认为桔橙嗜热子囊菌CGMCC0583Cel7A纤维二糖水解酶I基因的5’端。
基于5’端克隆的序列信息设计一个正向引物，如下文所示的1F。使用引物1F连同引物AUAP(在试剂盒中提供)作为反向引物进行桔橙嗜热子囊菌CGMCC0583Cel7A纤维二糖水解酶I基因的全长克隆。
引物1F：
5’-AGCGACAGCAATAACAAT-3’(SEQIDNO:85)
将十皮摩尔的上述2种引物用于PCR反应，其包含4μl的3’RACE的第一链cDNA，5μl的10XTaqDNA聚合酶缓冲液，3μl的25mMMgCl2，1μl的10mMdNTP，和2.5单位的TaqDNA聚合酶，其终体积为50μl。在热循环仪中进行扩增，其程序如下：1个循环，在95℃进行2分钟；30个循环，每循环在95℃进行40秒，58℃进行40秒，和72℃进行90秒；和1个循环，在72℃进行10分钟。然后加热块进入4℃浸泡循环。
通过使用TBE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中大约1.7kb产物从凝胶切出，并使用PCRPrepsDNAPurificationSystem纯化。然后将PCR片段使用pGEM-TVectorSystem连接于pGEM-T。将质粒DNA通过使用377DNAAnalyzer进行的测序确认。将正确的克隆命名为pT002-5。
设计如下文所示的在正向引物上含有BspLU11I位点和在反向引物含有PacI的两种合成寡核苷酸引物以PCR扩增桔橙嗜热子囊菌CGMCC0583Cel7A纤维二糖水解酶I基因的全长开读框。使用RapidLigationKit将该片段克隆入pAlLo2。
PCR正向引物：
5’-AC -3’(SEQIDNO:86)
PCR反向引物：
5’-TTAATTAA -3’(SEQIDNO:87)
粗体字母代表编码序列。下划线序列含有与BspLU11I和PacI限制位点同一的序列。
将五十皮摩尔的上述每种引物用于PCR反应，其含有50ng的质粒pT002-5，含MgSO4的1XPwo扩增缓冲液，4μl的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP的10mM混合物，和2.5单位的PwoDNA聚合酶，其终体积为50μl。使用DNAENGINETMThermalCycler以扩增片段，其程序如下：一个循环，在94℃进行2分钟；和25个循环，每循环在94℃进行30秒，59℃进行30秒，和72℃进行1.5分钟。在25个循环之后，将反应在72℃温育10分钟，然后在10℃冷却直至进一步处理。
使用TAE缓冲液和0.1μg每ml的溴乙锭在0.8%琼脂糖凝胶上分离1.3kbPCR反应产物。以DARKREADERTMTransilluminator协助显影DNA条带以避免UV-诱导的突变。将1.3kbDNA条带用可丢弃的刀刃切出并根据生产商的指示用DA旋转杯纯化。
将纯化的PCR片段根据生产商的指示克隆入4Blunt-对含有感兴趣的编码区的PCR克隆测序至PhredQ值为至少40以确保不存在PCR诱导的错误。所有的序列比对用Consed(UniversityofWashington)进行。选择一个显示具有预期序列的克隆，并重命名为TaPCR。将含有桔橙嗜热子囊菌纤维二糖水解酶I编码区的TaPCR克隆用限制性酶BspLU11I和PacI双重消化并如上所述进行凝胶纯化。然后使用RapidLigationKit将该DNA片段连接入之前用NcoI和PacI消化的pAlLo2。表达克隆通过限制性消化确认，并进行测序确认载体-插入连接是正确的。用Midi-PrepKit制备供转化的质粒DNA。将最终克隆重新命名为pAlLo6。
米曲霉JaL250原生质体根据Christensen等，1988，见上文的方法制备。使用十微克的pAlLo6转化米曲霉JaL250原生质体。将十二个转化体分离至单个PDA平板，并在34℃温育5日。汇合的孢子平板用5ml的0.01%80洗涤，并使用孢子悬液接种125ml玻璃摇瓶中25ml的MDU2BP培养基。将转化体培养物在34℃以200rpm恒速振荡温育。在接种后第五日，在6000xg离心培养物并收集其上清。将五微升的每种上清与等体积的2X上样缓冲液(10%β-巯基乙醇)混合，并通过使用1.5mm8％-16%Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶的SDS-PAGE分析，并用SIMPLYBLUETMSafeStain染色。发酵液的SDS-PAGE概貌显示十二个转化体中的十一个具有大约60kDa的新蛋白条带。选择转化体编号12进行进一步研究，并命名为米曲霉JaL250AlLo6。
通过添加10ml的0.1%20至培养平板以释放孢子而从米曲霉JaL250AlLo6的5日平板培养物制备孢子储备悬液。通过将100μl的孢子储备物接种至含有50ml的M410培养基pH6.0的250ml带挡板的烧瓶来起始摇瓶培养。将摇瓶在34℃以250rpm振荡生长5日。将培养物过滤通过0.2μm孔过滤装置，并回收滤过物以供蛋白纯化。
将50ml体积的滤过物使用ECONO-10-DG脱盐柱根据生产商的指示脱盐并缓冲液交换至20mM乙酸钠pH5.0。使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定蛋白浓度，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例5：嗜热毁丝霉CBS117.65Cel6A纤维二糖水解酶II的制备
根据下文中所述的步骤获得嗜热毁丝霉CBS117.65Cel6A纤维二糖水解酶II(SEQIDNO:9[DNA序列]和SEQIDNO:10[推定的氨基酸序列])。
将一百ml的摇瓶培养基添加至500ml摇瓶。摇瓶培养基每升包含15g的葡萄糖，4g的K2HPO4，1g的NaCl，0.2g的MgSO4·7H2O，2g的MES游离酸，1g的细菌蛋白胨，5g的酵母提取物，2.5g的柠檬酸，0.2g的CaCl2·2H2O，5g的NH4NO3，和1ml的痕量元素溶液。痕量元素溶液每升包含1.2g的FeSO4·7H2O，10g的ZnSO4·7H2O，0.7g的MnSO4·H2O，0.4g的CuSO4·5H2O，0.4g的Na2B4O7·10H2O，和0.8g的Na2MoO2·2H2O。将摇瓶用两个来自嗜热毁丝霉菌株CBS117.65的固体平板培养物的栓(plug)接种，并在45℃以200rpm振荡温育48小时。使用五十ml的摇瓶培养液接种2升发酵容器。
发酵批次培养基每升包含5g的酵母提取物，176g的粉末纤维素，2g的葡萄糖，1g的NaCl，1g的细菌蛋白胨，4g的K2HPO4，0.2g的CaCl2·2H2O，0.2g的MgSO4.7H2O，2.5g的柠檬酸，5g的NH4NO3，1.8ml的消泡剂，和1ml的痕量元素溶液(见上)。发酵补料培养基包含水和消泡剂。
将总共1.8升的发酵批次培养基添加至两升玻璃夹套发酵器(ApplikonBiotechnology，Schiedam，Netherlands)。将发酵补料培养基以4g/l/hr的速率剂量添加72小时的时间。将发酵容器保持在45℃的温度，并使用Applikon1030控制系统(ApplikonBiotechnology，Schiedam，Netherlands)控制pH至5.6+/-0.1的设定点。以1vvm的速率将空气添加至容器，并将培养液用以1100至1300rpm旋转的Rushton叶轮搅拌。在发酵终止时，从容器收获全部培养液，并将其在3000xg离心以去除生物质。
将如上所述获得的收获的培养液在500ml瓶中以13,000xg在4℃离心20分钟，然后使用0.22μm聚醚砜膜(Millipore，Bedford，MA，USA)灭菌过滤。将过滤的培养液浓缩，并用使用配置有10kDa聚醚砜膜的切线流浓缩器在大约20psi用20mMTris-HClpH8.5进行缓冲液交换。为了减少色素的量，将浓缩物施于60ml用20mMTris-HClpH8.5平衡的QSEPHAROSETMBigBead柱，并用含有600mMNaCl的平衡缓冲液分步洗脱。在用BlueStainReagent(Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)染色的8-16%SDS-PAGE凝胶(Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)上检查流过物和洗脱物级分。如通过对应于SDS-PAGE所得的蛋白的表观分子量(大约75kDa)的条带的存在判断，流过物级分含有嗜热毁丝霉Cel6A纤维二糖水解酶。
使用配置有10kDa聚醚砜膜的超滤装置(Millipore，Bedford，MA，USA)在40psi，4℃浓缩流过物级分，并与等体积的含有3.4M硫酸铵的20mMTris-HClpH7.5混合至1.7M硫酸铵的终浓度。在加载于用20mMTris-HClpH7.5中的1.7M硫酸铵平衡的PHENYLSUPEROSETM柱(HR16/10，GEHealthcare，Piscataway，NJ，USA)之前，过滤样品(0.2μM针式滤器，聚醚砜膜，Whatman，Maidstone，UnitedKingdom)以去除颗粒状物质。用12柱体积的在20mMTris-HClpH7.5中1.7M硫酸铵至0M硫酸铵减少的盐梯度洗脱结合蛋白。如上所述通过8-16%SDS-PAGE凝胶电泳分析级分，其揭示嗜热毁丝霉Cel6A纤维二糖水解酶在梯度最末端(大约20mM硫酸铵)洗脱。
汇集含有Cel6A纤维二糖水解酶II的级分，并在20mMTris-HClpH9.0中稀释10倍(以降低盐并增加pH)，然后施于用20mMTris-HClpH9.0平衡的1mlRESOURCETMQ柱(GEHealthcare，Piscataway，NJ，USA)。用20柱体积在20mMTris-HClpH9.0中的0mM至550mMNaCl的盐梯度洗脱结合蛋白。嗜热毁丝霉Cel6A纤维二糖水解酶II在梯度中较早作为单峰洗脱(~25mMNaCl)。如通过SDS-PAGE判断，该纤维二糖水解酶II为>90%纯。蛋白浓度使用BCAProteinAssayKit(Pierce，Rockford，IL，USA)确定，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例6：重组的嗜热毁丝霉CBS202.75Cel6A纤维二糖水解酶II的制备
将嗜热毁丝霉CBS202.75在45℃以200rpm振荡在带挡板的摇瓶中的100ml的YEG培养基中生长2日。通过使用(Calbiochem，LaJolla，CA，USA)过滤收获菌丝体，在去离子水中洗涤两次，并在液氮下冻结。用杵和研钵将冻结的菌丝体粉碎至细微粉末，并使用PlantMaxiKit(QIAGENInc.，Valencia，CA，USA)分离总DNA。
使用GENOMEWALKERTMUniversalKit(ClontechLaboratories，Inc.，MountainView，CA，USA)根据生产商的指示从嗜热毁丝霉CBS202.75分离全长家族6纤维二糖水解酶基因(Cel6A)。简言之，来自嗜热毁丝霉CBS202.75总基因组DNA分别用四种不同的限制性酶(DraI，EcoRV，PvuII，和StuI)消化，留下平端。然后将每个批次的消化的基因组DNA分别连接于GENOMEWALKERTMAdaptor(ClontechLaboratories，Inc.，MountainView，CA，USA)以构建四个文库。然后将这些文库在使用如下文所示的两个基因-特异性引物的PCR反应中用作模板，一个用于初级PCR和一个用于次级PCR。基于来自嗜热毁丝霉(WO2004/056981)的部分家族6纤维二糖水解酶基因(Cel6A)序列设计引物。
引物MtCel6A-R4：
5′-ATTGGCAGCCCGGATCTGGGACAGAGTCTG-3′(SEQIDNO:88)
引物MtCel6A-R5：
5′-CCGGTCATGCTAGGAATGGCGAGATTGTGG-3′(SEQIDNO:89)
初级扩增包含1μl(大约6ng)的每个文库作为模板，各0.4mM的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP，10pmol的Adaptor引物1(ClontechLaboratories，Inc.，MountainView，CA，USA)，10pmol的引物MtCel6A-R4，1XGC-MeltLA缓冲液(ClontechLaboratories，Inc.，MountainView，CA，USA)，和1.25单位的GCGenomicPolymeraseMix(ClontechLaboratories，Inc.，MountainView，CA，USA)，终体积为25μl。将扩增反应产物在5333(EppendorfScientific，Inc.，Westbury，NY，USA)中温育，其程序如下：在94℃进行预变性1分钟；7个循环，每循环在94℃的变性温度进行30秒；在72℃退火和延伸5分钟；和32个循环，每循环在67℃进行5分钟。
次级扩增包含1μl的每个初级PCR产物作为模板，各0.4mM的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP，10pmol的Adaptor引物2(ClontechLaboratories，Inc.，MountainView，CA，USA)，10pmol的引物MtCel6A-R5，1XGC-MeltLA缓冲液，和1.25单位的GCGenomicPolymeraseMix，终体积为25μl。将扩增物在5333中温育，其程序如下：在94℃进行预变性1分钟；5个循环，每循环在94℃的变性温度进行30秒；退火和延伸在72℃进行5分钟；和20个循环，每循环在67℃进行5分钟。
将反应产物通过使用TAE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，其中来自EcoRV文库的3.5kb产物条带从凝胶切出，使用GelExtractionKit根据生产商的指示纯化，并测序。
3.5kbPCR片段的DNA测序用Perkin-ElmerAppliedBiosystemsModel377XLAutomatedDNASequencer(Perkin-Elmer/AppliedBiosystems，Inc.，FosterCity，CA，USA)使用染料终止子化学(Giesecke等，1992，JournalofVirology方法38：47-60)和引物步移策略进行。使用下述基因特异性引物进行测序：
MtCel6A-F2：
5’-GCTGTAAACTGCGAATGGGTTCAG-3’(SEQIDNO:90)
MtCel6A-F3：
5’-GGGTCCCACATGCTGCGCCT-3’(SEQIDNO:91)
MtCel6A-R8：
5’-AAAATTCACGAGACGCCGGG-3’(SEQIDNO:92)
就其品质审视核苷酸序列数据，并将所有的序列以PHRED/PHRAP软件(UniversityofWashington，Seattle，WA，USA)协助互相比较。将3.5kb序列与来自嗜热毁丝霉(WO2004/056981)的部分家族6纤维二糖水解酶基因(Cel6A)序列比较和比对。
基于编码蛋白与来自土生梭孢霉、嗜热毛壳菌、特异腐质霉、和里氏木霉的同源的糖苷水解酶家族6蛋白的相似性，构建用于嗜热毁丝霉序列的基因模型。嗜热毁丝霉CBS202.75Cel6A纤维二糖水解酶II基因的核苷酸序列和推定的氨基酸序列分别显示于SEQIDNO:11和SEQIDNO:12。基因组片段编码482个氨基酸的多肽，由96，87，和180bp的3个内含子间隔。基因和成熟编码序列的%G+C含量分别为61.6%和64％。使用SignalP软件程序(Nielsen等，1997，蛋白Engineering10：1-6)预测了17个残基的信号肽。预测的成熟蛋白含有465个氨基酸具有49.3kDa的分子量。
设计如下文所示的两种合成寡核苷酸引物以PCR扩增来自如上所述制备的基因组DNA的嗜热毁丝霉纤维二糖水解酶基因以供米曲霉表达载体的构建。使用IN-FUSIONTMCloningKit(BDBiosciences，PaloAlto，CA，USA)以将该片段直接克隆入表达载体pAlLo2，无需进行限制性消化和连接。
MtCel6A-F4：
5’-actggatttacc-3’(SEQIDNO:93)
MtCel6A-R9：
5’-TCACCTCTAGTTAATTAA-3’(SEQIDNO:94)
粗体字母代表编码序列。剩余序列与pAlLo2的插入位点同源。
将五十皮摩尔的上述每种引物用于PCR反应，其包含100ng的嗜热毁丝霉基因组DNA，1XGC-MeltLA缓冲液，各0.4mM的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP，和1.25单位的GCGenomicPolymeraseMix，终体积为25μl。将扩增反应在5333中温育，其程序如下：1个循环，在94℃进行1分钟；和30个循环，每循环在94℃进行30秒，62℃进行30秒，和72℃进行2分钟。然后加热块进入4℃浸泡循环。
将反应产物通过使用TAE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，其中从凝胶切出1842bp产物，并使用GelExtractionKit根据生产商的指示纯化。用NcoI和PacI消化质粒pAlLo2，通过使用TAE缓冲液1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，并使用GelExtractionKit根据生产商的指示纯化。
将基因片段和消化的载体使用IN-FUSIONTMCloningKit连接在一起，得到pSMai180，其中纤维二糖水解酶基因的转录处于NA2-tpi启动子(修饰的启动子来自在黑曲霉中编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的先导序列由来自在构巢曲霉中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列替代)的调控之下。连接反应(50μl)包含1XIN-FUSIONTM缓冲液(BDBiosciences，PaloAlto，CA，USA)，1XBSA(BDBiosciences，PaloAlto，CA，USA)，1μl的IN-FUSIONTM酶(1:10稀释的)(BDBiosciences，PaloAlto，CA，USA)，100ng用NcoI和PacI消化的pAlLo2，和50ng的嗜热毁丝霉Cel6A纯化的PCR产物。将反应产物在室温温育30分钟。使用一μl的反应产物转化大肠杆菌XL10Gold细胞。通过限制性消化检测含有pSMai180的大肠杆菌转化体，并使用9600制备质粒DNA。通过DNA测序确认pSMai180中的嗜热毁丝霉Cel6A插入物。
将相同的1842bpPCR片段使用TAKit克隆入2.1-(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)以生成pSMai182。通过DNA测序确认pSMai182中的嗜热毁丝霉cel6A基因插入物。大肠杆菌pSMai182于2007年9月6日保藏在农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection，NorthernRegionalResearchCenter)，1815UniversityStreet，Peoria，Ill.，61604。
将嗜热毁丝霉家族6纤维二糖水解酶Cel6A基因表达于米曲霉JaL355。米曲霉JaL355(WO2002/40694)原生质体根据Christensen等，1988，见上文的方法制备。使用三μg的pSMai180转化米曲霉JaL355。
用pSMai180转化米曲霉JaL355产生约50个转化体。将二十个转化体分离至单个基本培养基平板。
将20个转化体的汇合的基本培养基平板用5ml的0.01%20洗涤，并分别接种入125ml玻璃摇瓶中25ml的MDU2BP培养基，并在34℃，250rpm温育。在5日温育之后，将5μl来自每个培养的上清使用8-16%SDS-PAGE凝胶和Cell(Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)，根据生产商的指示分析。将所得凝胶用BIO-SAFETMCoomassieStain(Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)染色。培养物的SDS-PAGE概貌显示大多数的转化体具有大约70kDa的主要条带。
将一个命名为转化体14的转化体的汇合的平板用10ml的0.01%20洗涤，并接种入含有500ml的MDU2BP培养基的2升Fernbach烧瓶以生成用于酶表征的培养液。在第5日收获培养物，并使用0.22μmEXPRESSTMPlusMembrane过滤。
将过滤的培养液浓缩，并使用配置有10kDa聚醚砜膜的切线流浓缩器以20mMTris-HClpH8.0缓冲液交换。将经浓缩和缓冲液交换的培养液调整至20mMTris-HClpH8.0-1.2M(NH4)2SO4并施于用20mMTris-HClpH8.0-1.2M(NH4)2SO4平衡的PhenylSUPEROSETM柱(HR16/10)。用10柱体积在20mMTris-HClpH8.0中的300至0mM(NH4)2SO4的线性梯度洗脱结合蛋白。洗脱物级分的SDS-PAGE显示在大约70kDa的主要条带。然后将这些级分浓缩，并通过使用VIVASPINTM离心浓缩器(10kDa聚醚砜膜，Sartorius，，Germany)的离心浓缩缓冲液交换入20mMTris-HClpH8.0。蛋白浓度使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例7：土生梭孢霉NRRL8126Cel6A纤维二糖水解酶II(CBHII)的制备
根据WO2006/074435使用里氏木霉作为宿主重组制备土生梭孢霉NRRL8126Cel6A纤维二糖水解酶II(SEQIDNO:13[DNA序列]和SEQIDNO:14[推定的氨基酸序列])。
使用ECONO-10-DG脱盐柱根据生产商的指示在20mMTris–150mM氯化钠pH8.5中对培养滤过物进行脱盐和缓冲液交换。蛋白浓度使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例8：褐孢长毛盘菌CBS804.70纤维二糖水解酶II(CBHII)的制备
如下所述制备褐孢长毛盘菌CBS804.70纤维二糖水解酶II(CBHII)(SEQIDNO:15[DNA序列]和SEQIDNO:16[推定的氨基酸序列])。
将褐孢长毛盘菌CBS804.70接种于PDA平板上，并在28℃温育7日。将几个菌丝体-PDA琼脂栓接种入含有100ml的MEX-1培养基的750ml摇瓶。将烧瓶在37℃以150rpm振荡温育9日。将真菌菌丝体通过藉由(Calbiochem，SanDiego，CA，USA)的过滤收获，然后冻结于液氮。然后将菌丝体通过将冻结的菌丝体与等体积的干冰一同在用液氮预冷却的咖啡磨中磨制粉碎至粉末。将粉末转移入液氮预冷的杵和研钵并用少量经烘烤的石英砂研磨至细微粉末。将粉末菌丝体材料保持于-80℃直至使用。
根据Chirgwin等，1979，Biochemistry18：5294-5299，从褐孢长毛盘菌CBS804.70的冻结的粉末菌丝体通过用硫氰酸胍提取，接着进行通过5.7MCsCl衬垫的超离心来制备。根据Aviv等，1972，Proc.Natl.cad.Sci.USA69：1408-1412，通过寡聚物(dT)-纤维素亲和层析分离多聚A富集的RNA。
根据Gubler和Hoffman，1983，Gene25：263-269；Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，和Maniantis，T.Molecularcloning：ALaboratoryManual，第2版，1989，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NewYork；和Kofod等，1994，J。Biol。Chem。269：29182-29189的一般方法，使用多聚A-NotI引物(PromegaCorp.，Madison，Wisconsin，USA)合成双链cDNA。在合成之后，cDNA用绿豆核酸酶处理，用T4DNA聚合酶平端化，并连接于50倍摩尔过量的EcoRI衔接头(InvitrogenCorp.，Carlsbad，CA，USA)。将cDNA用NotI切割，并将cDNA通过使用44mMTris碱，44mM硼酸，0.5mMEDTA(TBE)缓冲液的0.8%琼脂糖凝胶电泳大小分级。将700bp和更大的cDNA级分从凝胶切出，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit(GEHealthcareLifeSciences，Piscataway，NJ，USA)根据生产商的指示纯化。
然后将制备的cDNA通过使用RapidLigationKit(RocheDiagnosticsGmbH，Penzberg，Germany)根据生产商的指示连接入EcoRI-NotI切割的pMHas5(WO03/044049)进行定向克隆。将连接混合物使用GENE和PulseController(Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)在50μF，25mAmp，1.8kV用2mm间隙的小杯根据生产商的步骤电穿孔入大肠杆菌DH10B细胞(InvitrogenCorp.，Carlsbad，CA，USA)。
将电穿孔的细胞涂布于补充50μg每ml的卡那霉素的LB平板。从起始cDNA-pMHas5载体连接的大约总共30,000个转化体制备cDNA质粒汇集物。质粒DNA直接从菌落汇集物使用SpinMidi/MaxiprepKit(QIAGENGmbHCorporation，Hilden，Germany)制备。cDNA文库命名为SBL521-2。
从WO01/77315中描述的含有pSigA2转座子的质粒构建命名为pSigA4的含有转座子的质粒以构建pSigA2的信号捕获转座子具有减少的选择背景的改善型式。pSigA2转座子含有编码于转座子自身上的较少信号的β-内酰胺酶构建体。使用PCR使用校正读码的DNA聚合酶(QIAGENGmbHCorporation，Hilden，Germany)和下述5’磷酸化引物(TAGCopenhagen，Denmark)构建见于质粒骨架上的完整β-内酰胺酶基因的缺失：
SigA2NotU-P：
5’-TCGCGATCCGTTTTCGCATTTATCGTGAAACGCT-3’(SEQIDNO:95)
SigA2NotD-P：
5’-CCGCAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAA-3’(SEQIDNO:96)
扩增反应包含1μl的pSigA2(10ng/μl)，5μl的10XProofStartBuffer(QIAGENGmbHCorporation，Hilden，Germany)，2.5μl的dNTP混合物(20mM)，0.5μl的SigA2NotU-P(10mM)，0.5μl的SigA2NotD-P(10mM)，10μl的Q溶液(QIAGENGmbHCorporation，Hilden，Germany)，和31.25μl的去离子水。使用DNAENGINETMThermalCycler(MJResearchInc.，Waltham，MA，USA)进行扩增，其程序如下：1个循环，在95℃进行5分钟；和20个循环，每循环在94℃进行30秒，62℃进行30秒，和72℃进行4分钟。
通过使用TAE缓冲液和0.1μg每ml的溴乙锭的0.8%琼脂糖凝胶电泳分离3.9kbPCR反应产物。以EagleEyeImagingSystem(Stratagene，LaJolla，CA，USA)协助在360nm显影DNA条带。将3.9kbDNA条带从凝胶切出并通过使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。
将3.9kb片段用10单位的T4DNA连接酶(NewEngl和Biolabs，Inc.，Beverly，MA，USA)，9μl的3.9kbPCR片段，和1μl的10X连接缓冲液(NewEngl和Biolabs，Inc.，Beverly，MA，USA)在16℃自连接过夜。使连接物在65℃热失活10分钟，然后用DpnI在37℃消化2小时。温育之后，使用PCRDNA和GelBandPurificationKit纯化消化物。
然后将纯化材料根据生产商的指示转化入大肠杆菌TOP10感受态细胞(InvitrogenCorp.，Carlsbad，CA，USA)。将转化混合物铺板于补充25μg每ml的氯霉素的LB平板。从几个转化体制备质粒小量制备物，并用BglII消化。选择具有正确构造的一个质粒。该质粒命名为pSigA4。质粒pSigA4含有侧翼为BlII的转座子SigA2，其与WO01/77315中公开的转座子相同。
将质粒pSigA4DNA(0.3μg/μl)的60μl样品用BglII消化，并通过使用TAE缓冲液的0.8%琼脂糖凝胶电泳分离。将2kb的SigA2转座子DNA条带用200μl的EB缓冲液(QIAGENGmbHCorporation，Hilden，Germany)洗脱，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化，并在200μl的EB缓冲液中洗脱。SigA2用于转座子协助的信号捕获。
对转座子协助的信号捕获的完整描述可见于WO01/77315。从起始cDNA-pMHas5载体连接物的总共30,000个转化体制备cDNA质粒汇集物。使用SpinMidi/MaxiprepKit直接从由固体LB选择性培养基回收的菌落汇集物制备质粒DNA。将质粒汇集物用转座子SigA2和MuA转座酶(FinnzymesOY，Espoo，Finland)根据生产商的指示处理。
对于褐孢长毛盘菌CBS804.70cDNA文库的体外转座子标记，将4或8μl的含有SigA2转座子的大约2.6μg的DNA与含有2μg的DNA的褐孢长毛盘菌CBS804.70cDNA文库的1μl的质粒DNA汇集物，2μl的MuA转座酶(0.22μg/μl)，和5μl的5X缓冲液(FinnzymesOY，Espoo，Finland)混合，总体积为50μl，并在30℃温育3.5小时接着在75℃进行热失活10分钟。通过添加5μl的3M乙酸钠pH5和110μl的96%乙醇来沉淀DNA并在10,000xg离心30分钟。在70%乙醇中洗涤沉淀，在室温风干，并重悬于10μl的10mMTris，pH8，1mMEDTA(TE)缓冲液中。
将1.5μl体积的转座子标记的质粒汇集物根据生产商的指示使用GENE和PulseController(Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)在50uF，25mAmp，1.8kV用2mm间隙的小杯根据生产商的步骤电穿孔入20μl的大肠杆菌DH10B超感受态细胞(Gibco-BRL，GaithersburgMD，USA)。
将电穿孔细胞在SOC培养基中在28℃以250rpm振荡温育2小时，然后铺板于下述选择性培养基：补充50μg每ml的卡那霉素的LB培养基；补充50μg每ml的卡那霉素和15μg每ml的氯霉素的LB培养基；和/或补充50μg每ml的卡那霉素，15μg每ml的氯霉素，和12.5μg的氨苄青霉素每ml的LB培养基。
通过将电穿孔物稀释铺板于补充卡那霉素和氯霉素培养基的LB培养基，确定存在大约72,000个含有每电穿孔一个SigA2转座的cDNA文库质粒的菌落，并在三重选择(LB，卡那霉素，氯霉素，氨苄青霉素)下回收了69个菌落。进行进一步的电穿孔和铺板实验，直至在三重选择下回收了总共445个菌落。使用96TurboMiniprepKit(QIAGENGmbHCorporation，Hilden，Germany)对菌落进行小量制备。用如下文所示的转座子正向和反向引物(引物A和B)，根据WO2001/77315(第28页)中公开的步骤对质粒测序。
引物A：
5’-AGCGTTTGCGGCCGCGATCC-3’(SEQIDNO:97)
引物B：
5’-TTATTCGGTCGAAAAGGATCC-3’(SEQIDNO:98)
将编码纤维二糖水解酶的褐孢长毛盘菌家族GH6cDNA通过用两种如下所示的合成寡核苷酸引物PCR扩增如上所述的来自cDNA文库SBL0521的蛋白编码序列亚克隆入曲霉属表达载体pMStr57(WO2004/032648)。
引物848：
5’-ACACAACTGGGGATCCTCATCATGAAGAACTTCCTTCTGG-3’(SEQIDNO:99)
引物849：
5’-CCCTCTAGATCTCGAGTTACGTGAAGCTAGGATTAGCATT-3’(SEQIDNO:100)
扩增使用IPROOFTMHighFidelity2XMasterMix(Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)遵循生产商的指示进行。扩增反应包含SBL0521汇集DNA作为模板，各25pmol的引物848和849，和25μl的IPROOFTMHighFidelity2XMasterMix，终体积为50μl。进行扩增，即在98℃进行预变性2分钟；5个循环，每循环在98℃变性10秒，在65℃退火10秒，和在72℃延伸1分钟；和25个循环，每循环在98℃变性10秒，和在72℃进行组合的退火延伸1分钟。在72℃进行10分钟最终延伸。
使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示从剩余反应组分分离1.4kb的PCR产物。
将PCR片段使用IN-FUSIONTMDry-DownPCRCloningKit(ClontechLaboratories，Inc.，MountainView，CA，USA)克隆入BamHI和XhoI消化的pMStr57。将大约50ng的PCR产物和总体积10μl的200ng的载体添加至IN-FUSIONTMDry-Down沉淀。根据生产商的指示进行反应。对所得曲霉属表达构建体pMStr179的褐孢长毛盘菌家族GH6纤维二糖水解酶编码DNA进行测序，该序列与SEQIDNO:16的纤维二糖水解酶编码序列完全一致。
将相同的PCR片段使用ZeroBluntTOPOPCRCloningKit克隆入-BluntII-TOPO载体(Invitrogen，LifeTechnologies，Carlsbad，CA，USA)，以生成pMStr199。对pMStr199的褐孢长毛盘菌家族GH6纤维二糖水解酶编码DNA进行测序，且该序列与SEQIDNO:1的纤维二糖水解酶编码序列完全一致。将含有pMStr199的大肠杆菌菌株NN059165于2010年2月24日保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(DSM))，Braunschweig，Germany，并分配登录号DSM23379。
褐孢长毛盘菌纤维二糖水解酶cDNA的核苷酸序列和推定的氨基酸序列分别显示于SEQIDNO:1和SEQIDNO:2。编码序列，包含终止密码子，为1344bp。编码的预测的蛋白为447氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineering10：1-6)，预测了16个残基的信号肽。预测的成熟蛋白含有431个氨基酸，具有45.3kDa的预测的分子量和5.06的等电点pH。
氨基酸序列的比较配对全局比对使用如EMBOSS的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)确定，其中缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，并使用EBLOSUM62矩阵。比对显示编码具有纤维二糖水解酶活性的家族GH6多肽的褐孢长毛盘菌cDNA的推定的氨基酸序列与来自烟曲霉的纤维二糖水解酶的推定的氨基酸序列(GENESEQP:ABB80166)分享64%同一性(排除缺口)。
根据Christensen等，1988，Biotechnology6，1419-1422和WO2004/032648用pMStr179转化米曲霉菌株BECh2(WO2000/39322)。将十个转化体在30℃在750μl的DAP2C-1培养基(WO2004/032648)中培养4日，其中用2%葡萄糖替换麦芽糊精。通过使用CRITERIONTMXTPrecast12%Bis-Tris凝胶(Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)的SDS-PAGE根据生产商的指示监视样品。将来自用于SDS电泳的AmershamLowMolecularWeightCalibrationKit(GEHealthcareUKLimited，Buckinghamshire，UK)的LMW标样用作分子量标记。用INSTANTBLUETM(Expedeon蛋白Solutions，Cambridge，UK)染色凝胶。八个转化体产生55-60kDa范围的新型蛋白双联体。
这些转化体中的两个命名为米曲霉MStr335和MStr336，将其通过在含有0.01%X-100的选择性培养基(amdS)上通过分生孢子稀释划线分离两次以限制菌落大小。
来自米曲霉MStr335孢子的四个汇合的COVEN斜面的孢子用0.01%20溶液收集，并用于接种21个各含有150ml的DAP2C-1培养基(WO2004/032648)的摇瓶，其中用2%葡萄糖替代麦芽糊精。将烧瓶在30℃以200rpm恒速振荡温育3日。在收获时通过首先藉由3个玻璃微纤维过滤器的层叠(具有增加的颗粒保留大小：1.6μm，1.2μm和0.7μm)过滤发酵培养液，然后藉由0.45μm过滤器过滤来去除真菌菌丝体和孢子。使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定蛋白浓度，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例9：烟曲霉纤维二糖水解酶II的制备
根据下述步骤制备烟曲霉NN055679纤维二糖水解酶II(CBHII)(SEQIDNO:17[DNA序列]和SEQIDNO:18[推定的氨基酸序列])。
设计如下文所示的两种合成寡核苷酸引物以从基因组DNAPCR扩增烟曲霉家族6A糖基水解酶的全长开读框。使用TOPOCloning试剂盒克隆PCR产物。使用IN-FUSIONTMCloningKit将该片段克隆入pAILo2。
正向引物：
5’-ACTGGATTTACC-3’(SEQIDNO:101)
反向引物：
5’-TCACCTCTAGTTAATTA-3’(SEQIDNO:102)
粗体字母代表编码序列。剩余序列含有与pAlLo2的插入位点相比同一的序列。
将五十皮摩尔的上述每种引物用于PCR反应，其含有500ng的烟曲霉基因组DNA，1XThermoPolTaq反应缓冲液(NewEnglandBiolabs，Ipswich，MA，USA)，6μl的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP的10mM混合物，0.1单位的TaqDNA聚合酶(NewEnglandBiolabs，Ipswich，MA，USA)，其终体积为50μl。使用5333以扩增片段，其程序如下：一个循环，在98℃进行2分钟；和35个循环，每循环在96℃进行30秒，61℃进行30秒，和72℃进行2分钟。在35个循环之后，将反应物在72℃温育10分钟，然后在10℃冷却直至进一步处理。为了去除由Taq产生的A尾，将反应物在1单位的PfxDNAPolymerase(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)的存在下在68℃温育10分钟。
使用TAE缓冲液和0.1μg每ml的溴乙锭在0.8%GTG-琼脂糖凝胶(CambrexBioproducts，EastRutherford，NJ，USA)上分离1.3kbPCR反应产物。以DARKREADERTM(ClareChemicalResearch，Dolores，CO)协助显影DNA条带以避免UV-诱导的突变。将1.3kbDNA条带用可丢弃的刀刃切出并用Ultrafree-DA旋转杯(Millipore，Billerica，MA)根据生产商的指示纯化。
将纯化1.3kbPCR产物克隆入PCR4Blunt-TOPO载体(Invitrogen)。将两微升的纯化PCR产物与一微升的2M氯化钠溶液和一微升的Topo载体混合。将反应在室温温育15分钟，然后将两微升的Topo反应物用于根据生产商的指示转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。将转化反应物的各100微升的两个等分试样涂布于两个150mm2xYT-Amp平板，并在37℃温育过夜。
将八个重组菌落用于接种含有三毫升补充100μg每毫升培养基的氨苄青霉素的LB的液体培养物。使用9600由这些培养物制备质粒DNA。通过限制性消化分析克隆。用酶EcoRI根据生产商的指示(NEB，Ipswich，MA，USA)消化来自每个克隆的质粒DNA，并如上所述通过琼脂糖凝胶电泳分析。八个克隆中的六个具有来自这些的期待的限制性消化样式。选择克隆2，4，5，6，7和8测序以确认在克隆的插入中不存在突变。对其5-引物和3-引物端的序列分析表明克隆2，6和7具有正确的序列。选择这三个克隆重新克隆入pAlLo2。将每个克隆的一微升等分试样与17μl的稀释的TE(1∶10稀释)混合，并使用1μl的该混合物重新扩增烟曲霉糖基水解酶6A编码区。
将五十皮摩尔的上述每种引物用于PCR反应，其含有1μl的克隆2，6和7的稀释的混合物，1XPfx扩增缓冲液(Invitrogen，Calsbad，CA，USA)，6μl的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP的10mM混合物，2.5单位的PfxDNAPolymerase，1μl的50mMMgSO4，其终体积为50μl。使用 5333以扩增片段，其程序如下：一个循环，在98℃进行2分钟；和35个循环，每循环在94℃进行30秒，61℃进行30秒，和68℃进行1.5分钟。在35个循环之后，将反应物在68℃温育10分钟，然后在10℃冷却直至进一步处理。使用TAE缓冲液和0.1μg每ml的溴乙锭在0.8%GTG-琼脂糖凝胶上分离1.3kbPCR反应产物。以DARKREADERTMTransilluminator协助显影DNA条带以避免UV-诱导的突变。将1.0kbDNA条带用可丢弃的刀刃切出并用Ultrafree-DA旋转杯(Millipore，Billerica，MA)根据生产商的指示纯化。
将载体pAlLo2通过用NcoI和PacI(使用生产商指定的条件)消化而直链化。将片段通过如上所述的凝胶电泳和超滤纯化。将纯化的PCR片段克隆入直链化和纯化pAlLo2载体用IN-FUSIONTMCloningKit进行。反应物(20μl)含有1XIN-FUSIONTM缓冲液，1XBSA，1μl的IN-FUSIONTM酶(1:10稀释的)，100ng用NcoI和PacI消化的pAlLo2，和50ng的烟曲霉GH6A纯化的PCR产物。将反应在室温温育30分钟。使用反应物的2μl样品根据生产商的指示转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。在恢复期之后，将来自转化反应的两个100μl等分试样铺板于补充100μg每ml的氨苄青霉素的150mm2XYT平板。将平板在37℃温育过夜。从选择平板随机选择一组八个推定的重组克隆，并从每个克隆使用9600制备质粒DNA。通过PstI限制性消化分析克隆。八个克隆中的七个具有预期的限制性消化样式。然后对克隆1，2和3进行测序以确认在克隆插入中没有突变。选择克隆#2，并命名为pAlLo33。
生长烟曲霉cel6A(JaL355AlLo33Exp03191)以获得用于纯化纤维二糖水解酶II的培养液。
将七百五十ml的摇瓶培养基添加至2800ml摇瓶。摇瓶培养基每升包含45g的麦芽糖，2g的K2HPO4，12g的KH2PO4，1g的NaCl，1g的MgSO4·7H2O，7g的酵母提取物，2g的尿素，和0.5ml的痕量元素溶液。痕量元素溶液每升包含13.8g的FeSO4·7H2O，14.3g的ZnSO4·7H2O，8.5g的MnSO4·H2O，2.5g的CuSO4·5H2O，0.5g的NiCl2·6H2O，和3g的柠檬酸。通过用0.01%20悬浮烟曲霉cel6A的PDA平板来接种两个摇瓶，并在34℃在定轨振荡器上以200rpm温育120小时。
使用0.7μm玻璃过滤器GF/F(Whatman，Piscataway，NJ，USA)，然后使用0.22μmEXPRESSTMPlusMembrane(Millipore，Bedford，MA，USA)过滤培养液。
将过滤的培养液浓缩，并使用配置有10kDa聚醚砜膜(PALLFiltron，Northborough，MA，USA)的切线流浓缩器(PALLFiltron，Northborough，MA，USA)用20mMTris-HClpH8.0进行缓冲液交换。使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定蛋白浓度，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例10：土曲霉ATCC28865Cel7内切葡聚糖酶I的制备
如下所述将土曲霉ATCC28865Cel7内切葡聚糖酶I基因(SEQIDNO:19[DNA序列]和SEQIDNO:20[推定的氨基酸序列])克隆并在米曲霉中表达。
设计如下文所示的两种合成寡核苷酸引物以PCR扩增来自土曲霉ATCC28865基因组DNA的内切葡聚糖酶I基因。使用SpKitforSoil(MPBiomedicals，Solon，OH，USA)分离基因组DNA。
引物#226：
5′-TAACAATTGTCACCATGAATTCTCTTACAAAAAGCAT-3′(SEQIDNO:103)
引物#227：
5’-TATGCGGCCGCAGTCTGCATGTGTTACGCACCT-3’(SEQIDNO:104)
扩增反应包含1μl的土曲霉ATCC28865基因组DNA，12.5μl的2XREDDYMIXTMPCR缓冲液(ThermoFisherScientificInc.，Waltham，MA，USA)，1μl的引物#226(5μM)，1μl的#227(5μM)，和9.5μl的H2O。将扩增反应物在PTC-200DNAENGINETMThermalCycler(MJResearchInc.，Waltham，MA，USA)中温育，其程序如下：1个循环，在94℃进行2分钟；和35个循环，每循环在94℃进行15秒和60℃进行1.5分钟。
通过使用TAE缓冲液的1%琼脂糖凝胶电泳分离1.44kbPCR反应产物，并用SafeDNAGelStain(InvitrogenCorp.，Carlsbad，CA，USA)染色。以EAGLEImagingSystem(Stratagene，LaJolla，CA，USA)和Transilluminator协助显影DNA条带。将1.44kbDNA条带从凝胶切出，并使用PCRDNA和GelBandPuificationKit根据生产商的指示纯化。
将1.44kb片段用MfeI和NotI切割，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。
然后将切割的1.44kb片段定向克隆，即，使用T4连接酶(Promega，Madison，WI，USA)根据生产商的指示连接入EcoRI-NotI切割的pXYG1051(WO2005/080559)。将连接混合物根据生产商的指示转化入大肠杆菌TOP10F感受态细胞(InvitrogenCorp.，Carlsbad，CA，USA)。将转化混合物铺板于补充100μg每ml的氨苄青霉素的LB平板。制备来自几种转化体的质粒小量制备物，并对其测序。选择一个具有正确土曲霉GH7编码序列(SEQIDNO:13)的质粒。将该质粒命名为pXYG1051-NP003857。表达载体pXYG1051含有与pCaHj483(公开于WO98/00529的实施例4)相同的来源于黑曲霉的中性淀粉酶II(NA2)启动子，和终止子元件。此外，pXYG1051具有pUC18衍生序列以供在大肠杆菌中选择和繁殖，以及pDSY82(公开于美国专利号5,958,727的实施例4)衍生序列以供在曲霉属中选择和表达，借助于米曲霉的pyrG基因，其编码乳清苷脱羧酶，并用于弥补pyrG突变体曲霉属菌株。
将表达质粒pXYG1051-NP003857如WO98/00529中所述转化入米曲霉JaL355。在选择平板上通过单个分生孢子在将其在PDA平板上形成孢子之前，纯化转化体。转化体产生土曲霉GH7多肽从1ml96深孔静止培养的培养上清在26℃在含2%麦芽糊精的YP培养基中进行分析。通过SDS-PAGE使用4-12%Bis-TrisGel用50mM2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液(InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA，USA)通过考马斯蓝染色来验证表达。选择一个转化体进行进一步研究，并将其命名为米曲霉28.4。
对于大规模生产，将米曲霉28.4孢子涂布于PDA平板上，并在37℃温育五日。将汇合的孢子平板用5ml的0.01%20洗涤两次以使收集的孢子数最大化。然后将孢子悬液用于接种二十五个含有100ml的YPM培养基的500ml烧瓶。将培养物在30℃以85rpm的恒速振荡温育。在接种后第四日，通过藉由1.6μm，1.2μm，和0.7μm的三层玻璃纤维过滤器(Whatman，Piscataway，NJ，USA)过滤来收集培养液。来自该转化体的新鲜培养液产生大约64kDa的GH7蛋白条带。通过使用标准技术的肽测序验证该条带作为土曲霉GH7多肽的同一性。
将两升过滤的培养液浓缩至400ml并用50mMHEPESpH7.0使用具有10kDa截留值的AlphaPlusCrossflowSystem(SartoriusStedimBiotechS.A.，AubagneCedex，France)洗涤。将硫酸铵添加至1M的终浓度并溶解于超滤物。将溶液加载于Source15PhenylXK26/2050ml柱(GEHealthcare，，Denmark)上。在加载之后，将柱用150ml的1M硫酸铵洗涤并用1柱体积的50%乙醇洗脱以0%至100%梯度，接着以5柱体积的50%乙醇以10ml每分钟的流速洗脱。收集10ml的级分，并通过SDS-PAGE分析。将级分3至8汇集并用50mMHEPESpH7.0稀释至1000ml，然后加载于QFastFlowXK26/2060ml柱(GEHealthcare，，Denmark)。在加载之后，将柱用60ml的50mMHEPESpH7.0洗涤3次，并用100ml的50mMHEPESpH7.0，1MNaCl以10ml每分钟的流速洗脱。收集10ml的级分，并通过SDS-PAGE分析。将流过物和第一次洗涤物汇集并浓缩至400ml，并用50mMHEPESpH7.0使用具有10kDa截留值的AlphaplusCrossflowSystem洗涤。进一步的浓缩使用VIVASPINTM离心浓缩器根据生产商的指示进行至80ml的最终体积。通过A280/A260吸光度确定蛋白浓度。
实施例11：里氏木霉RutC30Cel5A内切葡聚糖酶II的制备
将里氏木霉RutC30Cel5A内切葡聚糖酶II基因(SEQIDNO:21[DNA序列]和SEQIDNO:22[推定的氨基酸序列])如下所述克隆并在米曲霉中表达。
设计如下文所示的两种合成寡核苷酸引物以从里氏木霉RutC30基因组DNAPCR扩增内切葡聚糖酶II基因。使用PlantMaxiKit分离基因组DNA。使用IN-FUSIONTMPCRCloningKit以将片段直接克隆入pAILo2(WO2004/099228)。
正向引物：
5’-ACTGGATTTACC-3’(SEQIDNO:105)
反向引物：
5’-TCACCTCTAGTTAATTAA-3’(SEQIDNO:106)
粗体字母代表编码序列。剩余序列含有与pAlLo2的插入位点同一的序列。
将五十皮摩尔的上述每种引物用于PCR反应，其含有200ng的里氏木霉基因组DNA，1XPfx扩增缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，6μl的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP的10mM混合物，2.5单位的PfxDNA聚合酶，和1μl的50mMMgSO4，终体积为50μl。将扩增反应在 5333中温育，其程序如下：一个循环，在98℃进行2分钟；和35个循环，每循环在94℃进行30秒，61℃进行30秒，和68℃进行1.5分钟。在35个循环之后，将反应在68℃温育10分钟，然后在10℃冷却。使用TAE缓冲液和0.1μg每ml的溴乙锭在0.8%琼脂糖凝胶上分离1.5kbPCR反应产物。以DARKREADERTMTransilluminator协助显影DNA条带。将1.5kbDNA条带用可丢弃的刀刃切出，并使用DA旋转杯根据生产商的指示纯化。
质粒pAlLo2通过用NcoI和PacI消化而直链化。将质粒片段如上所述通过凝胶电泳和超滤纯化。将纯化的PCR片段克隆入直链化和纯化的pAlLo2载体使用IN-FUSIONTMPCRCloningKit进行。反应物(20μl)含有1XIN-FUSIONTM缓冲液，1XBSA，1μl的IN-FUSIONTM酶(1:10稀释的)，100ng的用NcoI和PacI消化的pAlLo2，和100ng的里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶IIPCR产物。将反应在室温温育30分钟。使用2μl的反应样品根据生产商的指示转化大肠杆菌XL10Gold细胞。在恢复期之后，将来自转化反应的两个100μl等分试样铺板于补充100μg每ml的氨苄青霉素的150mm2XYT平板。将平板在37℃温育过夜。从选择平板回收了一组3个推定的重组克隆，质粒DNA从每一个克隆使用9600制备。克隆通过PciI/BspLU11I限制性消化分析。然后对一个具有预期的限制性消化样式的克隆进行测序以确认克隆插入中没有突变。选择克隆#3，并命名为pAlLo27。
米曲霉JaL250原生质体根据Christensen等，1988，见上文的方法制备。使用五微克的pAlLo27(以及pAlLo2作为对照)转化米曲霉JaL250原生质体。
用pAlLo27转化米曲霉JaL250产生约50个转化体。将十一个转化体分离至单个PDA平板，并在34℃温育五日。
用3ml的0.01%80洗涤汇合的孢子平板，并使用孢子悬液接种125ml玻璃摇瓶中25ml的MDU2BP培养基。转化体培养物在34℃以200rpm恒速振荡温育。在接种后第五日，在6000xg离心培养物并收集其上清。将五微升的每种上清与等体积的2X上样缓冲液(10%β-巯基乙醇)混合，加载于1.5mm8％-16%Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶上，并用SIMPLYBLUETMSafeStain(InvitrogenCorp.，Carlsbad，CA，USA)染色。发酵液的SDS-PAGE概貌显示十一个转化体中的十个产生大约45kDa的新蛋白条带。将命名为米曲霉JaL250AlLo27的转化体编号1在发酵器中培养。
将一百ml的摇瓶培养基添加至500ml摇瓶。摇瓶培养基每升包含50g的蔗糖，10g的KH2PO4，0.5g的CaCl2，2g的MgSO4·7H2O，2g的K2SO4，2g的尿素，10g的酵母提取物，2g的柠檬酸，和0.5ml的痕量金属溶液。痕量金属溶液每升包含13.8g的FeSO4·7H2O，14.3g的ZnSO4·7H2O，8.5g的MnSO4·H2O，2.5g的CuSO4·5H2O，和3g的柠檬酸。将摇瓶用来自PDA平板的米曲霉JaL250AlLo27的两个栓接种，并在34℃在定轨振荡器上以200rpm温育24小时。使用五十ml的摇瓶培养液接种3升发酵容器。
将总共1.8升的发酵批次培养基添加至三升玻璃夹套发酵器(ApplikonBiotechnology，Schiedam，Netherlands)。发酵批次培养基每升包含10g的酵母提取物，24g的蔗糖，5g的(NH4)2SO4，2g的KH2PO4，0.5g的CaCl2·2H2O，2g的MgSO4·7H2O，1g的柠檬酸，2g的K2SO4，0.5ml的消泡剂，和0.5ml的痕量金属溶液。痕量金属溶液每升包含13.8g的FeSO4·7H2O，14.3g的ZnSO4·7H2O，8.5g的MnSO4·H2O，2.5g的CuSO4·5H2O，和3g的柠檬酸。发酵补料培养基包含麦芽糖。发酵补料培养基以0至4.4g/l/hr的速率剂量添加185小时的时间。将发酵容器保持在34℃的温度，并使用Applikon1030控制系统(ApplikonBiotechnology，Schiedam，Netherlands)控制pH至6.1+/-0.1的设定点。将空气以1vvm的速率添加至容器，并通过以1100至1300rpm旋转的Rushton叶轮搅拌培养液。在发酵终止时，从容器收获全发酵液，并在3000xg离心以去除生物质。将上清灭菌过滤并储藏于5至10℃。
将上清在20mMBis-TrispH6.0中使用26/10脱盐柱根据生产商的指示进行脱盐和缓冲液交换。将缓冲液交换样品加载于用20mMBis-TrispH6.0平衡的柱(GEHealthcare，Piscataway，NJ，USA)，并用0至1000mM氯化钠的线性梯度洗脱结合蛋白。将蛋白级分汇集并缓冲液交换入1.2M(NH4)2SO4-20mMTris-HClpH8.5。将样品加载于用1.2M(NH4)2SO4-20mMTris-HClpH8.0平衡的PhenylSUPEROSETM柱(HR16/10)。结合蛋白用20柱体积在20mMTris-HClpH8.5中的1.2至0M(NH4)2SO4的线性梯度洗脱。将级分汇集，浓缩，并加载于用20mMTris-150mM氯化钠pH8.5平衡的75HR26/60柱(GEHealthcare，Piscataway，NJ，USA)上。将级分汇集和浓缩于20mMTris-150mM氯化钠pH8.5。使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定蛋白浓度，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例12：嗜热毁丝霉CBS202.75Cel5A内切葡聚糖酶II的制备
根据WO2007/109441使用米曲霉HowB104作为宿主重组制备嗜热毁丝霉CBS202.75Cel5A内切葡聚糖酶II(EGII)(SEQIDNO:23[DNA序列]和SEQIDNO:24[推定的氨基酸序列])。
将培养滤过物在20mMTrispH8.0中使用26/10脱盐柱根据生产商的指示进行脱盐和缓冲液交换。将缓冲液交换样品施于用20mMTrispH8.0平衡的柱，且结合蛋白用0至500mM氯化钠的梯度洗脱。将级分汇集并浓缩于20mMTrispH8.0。使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定蛋白浓度，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例13：桔橙嗜热子囊菌CGMCC0670Cel5A内切葡聚糖酶II的制备
根据下述步骤克隆编码Cel5A内切葡聚糖酶II的桔橙嗜热子囊菌CGMCC0670cDNA(SEQIDNO:25[DNA序列]和SEQIDNO:26[推定的氨基酸序列])。将桔橙嗜热子囊菌菌株在500mlErlenmeyer带挡板的烧瓶中的80ml的CBH1培养基(2.5%0.5%葡萄糖，0.14%(NH4)2SO4)中在45℃以165rpm振荡进行生长3日。通过在7000rpm进行离心30分钟收获菌丝体，并在用于RNA提取之前储藏于-80℃。从100mg的菌丝体使用PlantMiniKit分离RNA。
使用3’RACE系统和5’RACE系统和如下文所示的N端氨基酸的引物BG025-1，BG025-2，BG025-3，和BG025-4通过RTPCR分离桔橙嗜热子囊菌内切葡聚糖酶的cDNA。
引物BG025-1：
5’-AA(T/C)GA(A/G)TC(T/C/A/G)GG(T/C/A/G)GC(T/C/A/G)GAATT-3’(SEQIDNO:107)
引物BG025-2：
5’-AA(T/C)GA(A/G)TC(T/C/A/G)GG(T/C/A/G)GC(T/C/A/G)GAGTT-3’(SEQIDNO:108)
引物BG025-3：
5’-AA(T/C)GA(A/G)AG(T/C)GG(T/C/A/G)GC(T/C/A/G)GAATT-3’(SEQIDNO:109)
引物BG025-4：
5’-AA(T/C)GA(A/G)AG(T/C)GG(T/C/A/G)GC(T/C/A/G)GAGTT-3’(SEQIDNO:110)
将RTPCR产物使用pGEM-TVectorSystem连接入质粒pGEM-T，并转化入大肠杆菌菌株JM109。分离了单个克隆，其携带含有内切葡聚糖酶cDNA的称为pBGC1009的质粒。
设计PCR引物以从质粒pBGC1009扩增编码桔橙嗜热子囊菌内切葡聚糖酶的cDNA。并入限制性酶位点BspHI和PacI以供符合读框地克隆入米曲霉表达质粒pBM120a(WO2006/039541)。
引物996261：
5′-GATCTCATGAAGCTCGGCTCTCTCGT-3’(SEQIDNO:111)
BspHI
引物996167：
5′-TTAATTAATCAAAGATACGGAGTCAAAATAGG-3’(SEQIDNO:112)
PacI
将感兴趣的片段通过PCR使用EXPANDTMHighFidelityPCRSystem扩增。PCR扩增反应混合物含有1μl的0.09μg/μlpBGC1009，1μl的引物996261(50pmol/μl)，1μl的引物996167(50pmol/μl)，5μl的含15mMMgCl2的10XPCR缓冲液，1μl的dNTP混合物(各10mM)，37.25μl的水，和0.75μl(3.5U/μl)的DNA聚合酶混合物。使用thermocycler以扩增片段，其程序如下：1个循环，在94℃进行2分钟；10个循环，每循环在94℃进行15秒，55℃进行30秒，72℃进行1.5分钟；15个循环，每循环在94℃进行15秒，55℃进行30秒，和72℃进行1.5分钟，在每个后续循环加上5秒延伸；1个循环，在72℃进行7分钟；和4℃维持。
通过使用TAE缓冲液的1%琼脂糖凝胶电泳纯化1008bp的PCR产物，从凝胶切出，并使用GelPurificationKit(QIAGENInc.，Valencia，CA，USA)纯化。将纯化产物根据生产商的指示直接连接入2.1-将所得质粒命名为pBM124a。
用BspHI和PacI消化质粒pBM124a，通过使用TAE缓冲液的1%琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切出，并使用GelPurificationKit纯化。将质粒片段连接于载体pBM120a，用NcoI和PacI消化。将所得表达质粒命名为pBM123a。质粒pBM123a含有驱动桔橙嗜热子囊菌内切葡聚糖酶cDNA克隆的表达的二重NA2-TPI启动子，AMG终止子，和作为选择性标记的amdS。
米曲霉BECh2(WO2000/139322)原生质体根据Christensen等，1988，见上文的方法制备。使用六μg的pBM123a转化米曲霉BECh2。在COVE平板上选择初级转化体5日。在摇瓶分析之前将转化体孢子纯化两次。
将转化体的孢子接种入125ml摇瓶中25ml的MY25培养基。将培养物在34℃，200rpm在平台振荡器上温育五日。在第3和第5日，收获培养上清，并通过离心澄清和以去除菌丝体。使用无染色，10-20%梯度SDS-PAGE凝胶(Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)根据生产商的指示分析来自三个转化体的二十微升的上清。培养物的SDS-PAGE概貌显示所有的转化体具有大约32kDa的新的主要条带。选择一个转化体并命名为EXP00858。
用0.1ml的EXP00858的孢子储备接种含有100ml的SY50培养基的塑料不带挡板的500ml摇瓶，并在34℃，200rpm温育24小时以产生种子培养物。将五十ml的种子培养物接种入含有2升的培养基的2升发酵罐，所述培养基包含每升的0.5g的Pluronicacid，30g的蔗糖，2g的MgSO4·7H2O，2g的无水KH2PO4，1g的柠檬酸·，2g的(NH4)2SO4，1g的K2SO4，20g的酵母提取物，和0.5g的200XAMG痕量金属溶液，pH5.0。用麦芽糖给料对发酵进行补料。使用5NH3PO4和15%NH4OH控制pH并保持在5.0，然后增加至5.25。温度保持在34.0℃+/-1.0℃。搅拌为1000rpm。空气流为1.0vvm。
将200ml体积的不含细胞的上清用去离子水稀释至1升。将pH调整至8，并使用0.22μm聚醚砜(PES)过滤器对样品进行过滤灭菌。将经过滤灭菌的样品加载于用25mMTrispH8预平衡的250mlQSEPHAROSETMFastFlow柱(GEHealthcare，Piscataway，NJ，USA)。用在相同的缓冲液中的0至1MNaOH梯度从柱洗脱酶。汇集含有β-葡糖苷酶活性的级分(400ml)，并根据理论消光系数和样品在280nm的吸光度来计算酶浓度。
实施例14：烟曲霉NN055679Cel3Aβ-葡糖苷酶的制备
根据WO2005/047499使用里氏木霉RutC30作为宿主重组制备烟曲霉NN055679Cel3Aβ-葡糖苷酶(SEQIDNO:27[DNA序列]和SEQIDNO:28[推定的氨基酸序列])。
将过滤的培养液浓缩和并使用配置有10kDa聚醚砜膜的切线流浓缩器用20mMTris-HClpH8.5进行缓冲液交换。将样品加载于在20mMTrispH8.5中平衡的QHighPerformance柱(GEHealthcare，Piscataway，NJ，USA)，并用0-600mM氯化钠的线性梯度洗脱结合蛋白。将级分浓缩，并加载于用20mMTris-150mM氯化钠，pH8.5平衡的75HR26/60柱上。使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定蛋白浓度，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例15：巴西青霉IBT20888Cel3Aβ-葡糖苷酶的制备
根据WO2007/019442使用米曲霉作为宿主重组制备巴西青霉IBT20888Cel3Aβ-葡糖苷酶(SEQIDNO:29[DNA序列]和SEQIDNO:30[推定的氨基酸序列])。
将过滤的培养液浓缩并使用配置有10kDa聚醚砜膜的切线流浓缩器用20mMTris-HClpH8.0进行缓冲液交换。将样品加载于在20mMTrispH8.0中平衡的QHighPerformance柱(GEHealthcare，Piscataway，NJ，USA)，并用0-600mM氯化钠的线性梯度洗脱结合蛋白。将级分浓缩入2mMTrispH8.0。使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定蛋白浓度，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例16：黑曲霉IBT10140Cel3β-葡糖苷酶的制备
将黑曲霉IBT10140Cel3β-葡糖苷酶基因(SEQIDNO:31[DNA序列]和SEQIDNO:32[推定的氨基酸序列])使用如下文所示的两个克隆引物GH3-9.1f和GH3-9.1r通过PCR分离，所述引物基于公众可获得的黑曲霉Cel3序列(CAK48740.1)设计用于使用IN-FUSIONTMCloningKit的直接克隆。
引物GH3-9.1f：
acacaactggggatccaccatgaggttcacttcgatcgagg(SEQIDNO:113)
引物GH3-9.1r：
agatctcgagaagcttaGTGAACAGTAGGCAGAGACGCCCG(SEQIDNO:114)
用从黑曲霉菌株NN005810制备的基因组DNA进行PCR反应以供扩增全长基因。使用SpinKit(MPBiomedicals，SantaAna，CA，USA)分离基因组DNA。PCR反应包含1μl的基因组DNA，0.75μl的引物GH3-9.1f(10μM)，0.75μl的引物GH3-9.1r(10μM)，3μl的5XHF缓冲液(FinnzymesOy，Finland)，0.25μl的50mMMgCl2，0.3μl的10mMdNTP，0.15μl的DNA聚合酶(FinnzymesOy，Finland)，和PCR级水至多15μl。PCR反应使用PCR仪(Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)进行，其程序如下：在98℃进行2分钟，接着进行10个降落(touchdown)循环：在98℃进行15秒，70℃(-1℃/循环)进行30秒，和72℃进行2分30秒；和25个循环，每循环在98℃进行15秒，60℃进行30秒，72℃进行2分30秒；和在72℃进行5分钟。
通过使用TAE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中将大约2.6kbPCR产物从凝胶切出并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。将对应于黑曲霉Cel3β-葡糖苷酶基因的DNA使用IN-FUSIONTMDry-DownPCRCloningKit根据生产商的指示克隆入用BamHI和HindIII直链化的表达载体pDAu109(WO2005/042735)。
使用2.5μl体积的稀释的连接混合物转化大肠杆菌TOP10化学感受态细胞。在含有100μg每ml的氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择三个菌落，并在补充100μg每ml的氨苄青霉素的3ml的LB培养基中培养过夜。使用PlasmidMiniKit(OmegaBio-Tek，Inc.，Norcross，GA，USA)根据生产商的指示纯化质粒DNA。在异源表达之前，将黑曲霉Cel3β-葡糖苷酶基因序列通过Sanger测序验证。
米曲霉BECh2(WO2000/39322)的原生质体如WO95/02043中所述制备。将一百微的原生质体悬液与2.5-15μg的曲霉属表达载体混合，并添加250μl的10mMCaCl2-10mMTris-HClpH7.5-60%PEG4000(PEG4000；Applichem，Omaha，NE，USA)(聚乙二醇，分子量4,000)并轻柔混合。将混合物在37℃温育30分钟，并将原生质体涂布于COVE平板以供转化体选择。温育之后进行4-7日在37℃，挑取十六个转化体的孢子，并接种入YPM培养基。在4日在30℃的培养之后，基于其产生黑曲霉Cel3β-葡糖苷酶的能力分析培养液以供鉴定最佳的转化体。筛选是基于对应于通过SDS-PAGE确定的异源表达的蛋白的条带强度，和对4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)的酶活性，使用根据等，1979，Biotechnology和Bioengineering21：345-355的修饰的测定法：将10μl的培养液与含有10μl的0.1%的90μl的测定试剂，10μl的1M柠檬酸钠pH5，4μl的溶解于DMSO的100mMpNPG底物(SigmaAldrich)(在储液中0.4%的终体积)，和过滤水混合。将测定物在37℃温育30分钟，并在添加100μl的1M碳酸钠pH10之前和之后在405nm分析吸光度。将在405nm的最高吸光度值关联于SDS-PAGE数据以供选择最佳转化体。
将最佳转化体的孢子涂布于含有0.01%X-100的COVE平板以供分离单个菌落。涂布在含有1M蔗糖和10mM硝酸钠，补充10mM乙酰胺和15mMCsCl的COVE蔗糖培养基(Cove，1996，Biochim。Biophys。Acta133：51-56)上总共进行两次。然后在250ml摇瓶中使用含有2%麦芽糊精的YP培养基在30℃以100rpm振荡进行发酵4日。
将2升体积的培养上清(EXP02895)用0.7μm玻璃纤维过滤器过滤，然后使用0.22μmPES膜(NalgeneThermoFisherScientific，Rochester，NY，USA)灭菌过滤。将过滤上清浓缩，并使用具有10kDa截留值的错流SartoconSliceCassettes(非纤维素)(SartoriusStedimBiotechS.A.，AubagneCedex，France)透析过滤。通过缓慢添加稀10%乙酸将最终体积调整至500ml，pH调整至4.5。最终离子强度低于4MSi。
将50mlXK26柱(GEHealthcare，，Denmark)用以50mM乙酸钠pH4.5缓冲液平衡的XpresslineProA(UpFrontChromatographyA/S，Copenhagen，Denmark)填充。将过滤上清使用P500Pump(GEHealthCare，，Denmark)以每分钟45ml的流速加载于柱，并用50mM乙酸钠pH4.5缓冲液洗涤直至所有的未结合的材料洗脱。将结合蛋白用50mMTrispH8缓冲液使用System(GEHealthcare，，Denmark)洗脱。收集级分，并通过在280nm的UV吸光度监视。将洗脱蛋白汇集并通过缓慢添加0.5MTris碱调整至pH7，最终离子强度低于4MSi。
将50mlQFastFlow柱用50mMHEPESpH7缓冲液(缓冲液A)平衡。然后洗涤柱以去除未结合的材料，即用50mMHEPESpH7缓冲液洗涤直至洗涤液在280nm的UV吸光度低于0.05。将结合蛋白使用在作为缓冲液B的50mMHEPESpH7缓冲液中的0至1MNaCl线性盐梯度(10柱体积)使用System洗脱。蛋白级分的纯度通过使用4-20%Tris-GlycineGel(InvitrogenCarlsbad，CA，USA)的SDS-PAGE分析根据生产商的指示确定。使用INSTANTBLUETM(ExpedeonLtd.，Cambridgeshire，UK)根据生产商的指示进行在电泳之后的染色。汇集显示预期的蛋白条带的级分。蛋白的鉴定通过MS-Edman降解使用标准方法确定。
实施例17：具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌CGMCC0583GH61A多肽的制备
根据WO2005/074656使用米曲霉JaL250作为宿主重组制备具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌CGMCC0583GH61A多肽(SEQIDNO:33[DNA序列]和SEQIDNO:34[推定的氨基酸序列])。将重组产生的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽首先通过使用10kDa膜超滤来浓缩，缓冲液交换至20mMTris-HClpH8.0，然后使用100mlQBigBeads柱(GEHealthcare，Piscataway，NJ，USA)以在相同的缓冲液中的600ml的0-600mMNaCl线性梯度纯化。收集10ml的级分，并基于SDS-PAGE汇集。
然后将汇集级分(90ml)使用20mlMONO柱(GEHealthcare，Piscataway，NJ，USA)以在相同的缓冲液中的500ml的0-500mMNaCl线性梯度进一步纯化。收集6ml的级分，并基于SDS-PAGE汇集。将汇集级分(24ml)通过使用10kDa膜的超滤来浓缩，并使用320ml75SEC柱(GEHealthcare，Piscataway，NJ，USA)以大约1.3升的150mMNaCl-20mMTris-HClpH8.0的等度洗脱进行层析。收集20ml的级分，并基于SDS-PAGE汇集。使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定蛋白浓度，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例18：具有纤维素分解增强活性的土生梭孢霉NRRL8126GH61E多肽的制备
根据美国专利号7,361,495使用米曲霉JaL250作为宿主重组制备具有纤维素分解增强活性的土生梭孢霉NRRL8126GH61E多肽(SEQIDNO:35[DNA序列]和SEQIDNO:36[推定的氨基酸序列])。
将过滤的培养液使用26/10脱盐柱根据生产商的指示脱盐和缓冲液交换入20mM乙酸钠-150mMNaClpH5.0。使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定蛋白浓度，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例19：具有纤维素分解增强活性的烟曲霉NN051616GH61B多肽的制备
使用几种已知GH61蛋白(包括来自桔橙嗜热子囊菌的GH61A(GeneSeqP登录号AEC05922))作为查询序列进行烟曲霉部分基因组序列的tblastn检索(Altschul等，1997，NucleicAcidsRes.25：3389-3402)(TheInstituteforGenomeResearch，Rockville，MD)。基于与查询序列在氨基酸水平的高度类似性，几种基因鉴定为推定的家族GH61同源物。选择在氨基酸水平与桔橙嗜热子囊菌GH61A序列具有大于70%同一性的大约850bp的一个基因组区进行进一步研究。
如美国专利号7,244,605中所述生长和收获烟曲霉NN051616。冻结的菌丝体用杵和研钵粉碎至细微粉末，并使用PlantKit根据生产商的指示分离基因组DNA。
设计如下文所示的两种合成寡核苷酸引物以从基因组DNAPCR扩增烟曲霉家族GH61B蛋白基因。使用IN-CloningKit以将片段直接克隆入表达载体pAlLo2，无需进行限制性消化和连接。
正向引物：
5’-ACTGGATTTACC-3′(SEQIDNO:115)
反向引物：
5’-TCACCTCTAGTTAA-3’(SEQIDNO:116)
粗体字母代表编码序列。剩余序列与pAlLo2的插入位点同源。
将五十皮摩尔的上述每种引物用于PCR反应，其含有204ng的烟曲霉基因组DNA，1XPfx扩增缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，1.5μl的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP的10mM混合物，2.5单位的PfxDNAPolymerase，和1μl的50mMMgSO4，终体积为50μl。使用 5333epgradientS(EppendorfScientific，Inc.，Westbury，NY，USA)进行扩增，其程序如下：一个循环，在94℃进行3分钟；和30个循环，每循环在94℃进行30秒，56℃进行30秒，和72℃进行1分钟。然后将加热块维持在72℃进行15分钟，接着进行4℃浸泡循环。
通过使用TAE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中大约850bp产物条带从凝胶切出，并使用GelExtractionKit(QIAGENInc.，Valencia，CA，USA)根据生产商的指示纯化。
然后使用IN-CloningKit将片段克隆入pAlLo2。将载体用NcoI和PacI消化。将片段通过如上所述的凝胶电泳和GelPurificationKit纯化。将基因片段和消化的载体在反应中合并在一起，得到表达质粒pAG43，其中家族GH61B蛋白基因的转录处于NA2-tpi启动子的调控之下。重组反应物(20μl)包含1XIN-缓冲液，1XBSA，1μl的IN-F酶(1:10稀释的)，用NcoI和PacI消化的166ng的pAlLo2，和110ng的烟曲霉GH61B蛋白纯化的PCR产物。将反应在37℃温育15分钟接着在50℃进行15分钟。将反应物用40μl的10mMTris-0.1MEDTA缓冲液稀释，并使用2.5μl的稀释反应物转化大肠杆菌Gold细胞。通过限制酶消化鉴定出含有pAG43(GH61B蛋白基因)的大肠杆菌转化体，并使用9600制备质粒DNA。
862bpPCR片段的DNA测序用Perkin-ElmerAppliedBiosystemsModel377XLAutomatedDNASequencer使用染料终止子化学(Giesecke等，1992，见上文)和引物步移策略进行。使用下述载体特异性引物进行测序：
pAlLo25Seq：
5′TGTCCCTTGTCGATGCG3′(SEQIDNO:117)
pAlLo23Seq：
5′CACATGACTTGGCTTCC3′(SEQIDNO:118)
就其品质审视核苷酸序列数据，并以PHRED/PHRAP软件(UniversityofWashington，Seattle，WA，USA)的协助将所有的序列互相比较。
基于编码蛋白对桔橙嗜热子囊菌GH61A蛋白(GeneSeqP登录号AEC05922)的类似性构建用于烟曲霉序列的基因模型。核苷酸序列和推定的氨基酸序列分别显示于SEQIDNO:37和SEQIDNO:38。基因组片段编码250个氨基酸的多肽，由53和56bp的2个内含子间隔。基因和成熟编码序列的%G+C含量分别为53.9%和57％。使用SignalP软件程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineering10：1-6)，预测了21个残基的信号肽。预测的成熟蛋白含有221个氨基酸，具有23.39kDa的预测的分子量。
根据Christensen等，1988，见上文的方法制备米曲霉JaL355原生质体。使用六μg的pAG43转化米曲霉JaL355。将二十六个转化体分离至单个PDA平板。
将24个转化体的汇合的PDA平板的每个用5ml的0.01%20洗涤，并对每个收集孢子。将八μl的每个孢子储备分别添加至24孔平板中的1ml的YPG，YPM，和M410培养基，并在34℃温育。在温育3日之后，使用无染色，8-16%梯度SDS-PAGE凝胶根据生产商的指示分析来自四个转化体的7.5μl的上清。基于该凝胶，选择M410作为最佳培养基。五日温育之后，使用无染色，8-16%梯度SDS-PAGE凝胶分析来自每个M410培养的7.5μl的上清。培养物的SDS-PAGE概貌显示几个转化体具有大约25kDa的新的主要条带。
将一个转化体的汇合的平板(在PDA上生长)用5ml的0.01%20洗涤，并接种入四个含有100ml的M410培养基的500mlErlenmeyer烧瓶以生成用于酶表征的培养液。在第5日收获烧瓶(300ml)，使用0.22μmEXPRESSTMPlusMembrane过滤，并储藏于4℃。
将含有具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61B多肽的过滤的摇瓶培养液使用10kDaMWCOAmiconUltra离心浓缩器(Millipore，Bedford，MA，USA)浓缩至大约十分之一的体积。将浓缩的滤过物使用在20mM三-(羟基甲基)氨基甲烷(Sigma，St。Louis，MO，USA)，pH8.0中预平衡的BIO-P6脱盐柱(Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)进行缓冲液交换和脱盐，根据生产商的指示，但具有下述例外：加载3ml的样品，并用3ml的缓冲液洗脱。使用BCA蛋白测定法使用牛血清白蛋白作为蛋白浓度标样对浓缩、脱盐的GH61B蛋白定量。定量重复进行三次。使用8-16%梯度SDS-PAGE在200伏进行1小时确认酶纯度，并用BIO-SAFETMCoomassieStain染色。
实施例20：具有纤维素分解增强活性的嗜松青霉GH61多肽的制备
根据下文中所述的步骤制备具有纤维素分解增强活性的嗜松青霉GH61多肽SEQIDNO:39[DNA序列]和SEQIDNO:40[推定的氨基酸序列])。
堆肥样品于2000年12月12日收集自中国云南。嗜松青霉NN046877使用单孢子分离技术在45℃在PDA平板上分离。将嗜松青霉菌株NN046877接种于PDA平板上，并在37℃在黑暗中温育4日。将几个菌丝体-PDA栓接种入含有100ml的NNCYP-PCS培养基的500ml摇瓶。将烧瓶在37℃以160rpm振荡温育5日。在第4日和第5日收集菌丝体。将来自每日的菌丝体冻结于液氮并储藏于-80℃冷冻箱中直至使用。
将冻结的菌丝体转移入液氮预冷的杵和研钵并粉碎至细微粉末。通过用TRIZOLTM试剂(InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA，USA)提取从每日的粉末菌丝体制备总RNA。多聚A富集的RNA使用mTRAPTMTotalKit(ActiveMotif，Carlsbad，CA，USA)分离。
用SMARTTMcDNA文库ConstructionKit(ClontechLaboratories，Inc.，MountainView，CA，USA)合成来自每日的双链cDNA。将cDNA用SfiI切割并将cDNA通过使用TBE缓冲液的0.8%琼脂糖凝胶电泳大小分级。将500bp和更大的cDNA级分从凝胶切出，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。然后汇集等量的来自第4日和第5日的cDNA进行文库构建。
然后将汇集的cDNA通过使用T4连接酶(NewEnglandBiolabs，Inc.，Beverly，MA，USA)根据生产商的指示连接入SfiI切割的pMHas7(WO2009/037253)进行定向克隆。将连接混合物使用GENE和PulseController(Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)在25uF，25mAmp，1.8kV用1mm间隙的小杯根据生产商的步骤电穿孔入大肠杆菌ELECTROMAXTMDH10BTM细胞(InvitrogenCorp.，Carlsbad，CA，USA)。
将电穿孔细胞铺板于补充50mg每升的卡那霉素的LB平板。从起始pMHas7载体连接的总共60,000个转化体制备cDNA质粒汇集物。使用PlasmidKit(QIAGENInc.，Valencia，CA，USA)直接从菌落的汇集物制备质粒DNA。
从WO2001/77315所述的含有pSigA2转座子的质粒构建命名为pSigA4的含有转座子的质粒以供构建具有减少的选择背景的pSigA2的信号捕获转座子的改进型式。pSigA2转座子含有编码于转座子自身上的较少信号的β-内酰胺酶构建体。使用PCR使用校正读码的PfuTurbo聚合酶DNA聚合酶(QIAGENGmbHCorporation，Hilden，Germany)和下述5’磷酸化引物(TAGCopenhagen，Denmark)构建见于质粒骨架的完整β-内酰胺酶的缺失：
SigA2NotU-P：
5’-TCGCGATCCGTTTTCGCATTTATCGTGAAACGCT-3’(SEQIDNO:119)
SigA2NotD-P：
5’-CCGCAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAA-3’(SEQIDNO:120)
扩增反应包含1μl的pSigA2(10ng/μl)，5μl的10XPROOFSTARTTM缓冲液(QIAGENGmbHCorporation，Hilden，Germany)，2.5μl的dNTP混合物(20mM)，0.5μl的SigA2NotU-P(10mM)，0.5μl的SigA2NotD-P(10mM)，10μl的Q溶液(QIAGENGmbHCorporation，Hilden，Germany)，和31.25μl的去离子水。使用DNAENGINETMThermalCycler(MJResearchInc.，Waltham，MA，USA)进行扩增，其程序如下：一个循环，在95℃进行5分钟；和20个循环，每循环在94℃进行30秒，62℃进行30秒，和72℃进行4分钟。
通过使用TAE缓冲液和0.1μg每ml的溴乙锭的0.8%琼脂糖凝胶电泳分离3.9kbPCR反应产物。以EAGLEImagingSystem(Stratagene，LaJolla，CA，USA)协助在360nm显影DNA条带。将3.9kbDNA条带从凝胶切出，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。
将3.9kb片段用10单位的T4DNA连接酶(NewEnglandBiolabs，Inc.，Beverly，MA，USA)，9μl的3.9kbPCR片段，和1μl的10X连接缓冲液(NewEnglandBiolabs，Inc.，Beverly，MA，USA)在16℃自连接过夜。连接在65℃进行热失活10分钟，然后用DpnI在37℃进行消化2小时。温育之后，消化物使用PCRDNA和GelBandPurificationKit纯化。
然后将纯化的材料根据生产商的指示转化入大肠杆菌TOP10感受态细胞。将转化混合物铺板于补充25μg每ml的氯霉素的LB平板。由几个转化体制备质粒小量制备物并用BglII消化。选择具有正确构建的一个质粒。将质粒命名为pSigA4。质粒pSigA4含有与公开于WO2001/77315的相同侧翼为BglII的转座子SigA2。
将质粒pSigA4DNA(0.3μg/μl)的60μl样品用BglII消化，并通过使用TBE缓冲液的0.8%琼脂糖凝胶电泳分离。将2kb的SigA2转座子DNA条带用200μl的EB缓冲液(QIAGENGmbHCorporation，Hilden，Germany)洗脱并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化，并在200μl的EB缓冲液中洗脱。SigA2用于转座子协助的信号捕获。
转座子协助的信号捕获的完整描述描述于WO2001/77315。将质粒汇集物用转座子SigA2和HYPERMUTM转座酶(EPICENTREBiotechnologies，Madison，WI，USA)根据生产商的指示处理。
对于嗜松青霉cDNA文库的体外转座子标记，将含有大约100ng的DNA的2μl的SigA2转座子与含有1μg的DNA的嗜松青霉cDNA文库的1μl的质粒DNA汇集物，1μl的HYPERMUTM转座酶，和2μl的10X缓冲液(EPICENTREBiotechnologies，Madison，WI，USA)在20μl的总体积中混合，并在30℃温育3小时接着添加2μl的终止缓冲液(EPICENTREBiotechnologies，Madison，WI，USA)，并在75℃进行热失活10分钟。通过添加2μl的3M乙酸钠pH5和55μl的96%乙醇并在10,000xg，4℃进行30分钟离心来沉淀DNA。将沉淀在70%乙醇中洗涤，在室温风干，并重悬于10μl的去离子水。
将2μl体积的转座子标记的质粒汇集物根据生产商的指示使用GENE和PulseController在25uF，25mAmp，1.8kV用1mm间隙的小杯根据生产商的步骤电穿孔入50μl的大肠杆菌ELECTROMAXTMDH10BTM细胞(InvitrogenCorp.，Carlsbad，CA，USA)。
将电穿孔的细胞在SOC培养基中在37℃以225rpm振荡温育1小时，然后铺板于下述选择性培养基：补充50μg每ml的卡那霉素的LB培养基；补充50μg每ml和15μg每ml的氯霉素的卡那霉素的LB培养基；和补充50μg每ml的卡那霉素，15μg每ml的氯霉素，和30μg每ml的氨苄青霉素的LB培养基。
通过将电穿孔物铺板于补充卡那霉素，氯霉素和氨苄青霉素的LB培养基上，在30℃在3日之后观察到大约每50μl200个菌落。所有的菌落复制铺板(replicaplate)于如上所述的LB卡那霉素，氯霉素，和氨苄青霉素培养基。在该选择条件下回收了五百个菌落。将来自每个菌落的DNA用如下文所示的转座子正向和反向引物(引物A和B)，根据公开于WO2001/77315(第28页)的步骤进行测序。
引物A：
5’-agcgtttgcggccgcgatcc-3’(SEQIDNO:121)
引物B：
5’-ttattcggtcgaaaaggatcc-3’(SEQIDNO:122)
DNA序列获得自SinoGenoMaxCo.，Ltd(Beijing，China)。对于每个质粒的引物A和引物B序列读码进行修剪以去除载体和转座子序列。将装配的序列通过使用程序PhredPhrap(Ewing等，1998，GenomeResearch8：175-185；Ewing和Green，1998，GenomeResearch8：186-194)归类为重叠群。然后将所有的重叠群与可在标准的公开DNA和蛋白序列数据库(TrEMBL，SWALL，PDB，EnsemblPep，GeneSeqP)中获得的序列使用程序BLASTX2.0a19MP-WashU[14-Jul-1998][Buildlinux-x8618:51:4430-Jul-1998](Gish等，1993，Nat.Genet.3：266-72)相比较。家族GH10木聚糖酶候选物直接通过分析BlastX结果鉴定。
将嗜松青霉NN046877在37℃生长于PDA琼脂平板4-5日。菌丝体直接从琼脂平板收集至灭菌的研钵，并在液氮下冻结。将冻结的菌丝体用杵和研钵粉碎至细微粉末，并使用PlantMiniKit(QIAGENInc.，Valencia，CA，USA)分离基因组DNA。
基于如上所述获得的嗜松青霉GH10木聚糖酶基因信息，设计如下文所示的寡核苷酸引物以从嗜松青霉GH10NN046877的基因组DNA扩增GH61基因。使用IN-CFDry-downCloningKit以将片段直接克隆入表达载体pPFJO355，无需进行限制性消化和连接。
有义引物：
ATGACTCTAGTAAAGGCTATTCTTTTAGC-3’(SEQIDNO:123)
反义引物：
CAAACATTGGGAGTAGTATGG-3’(SEQIDNO:124)
粗体字母代表编码序列，而剩余序列与pPFJO355的插入位点同源。
表达载体pPFJO355含有米曲霉TAKA-淀粉酶启动子，黑曲霉葡糖淀粉酶终止子元件，用于在大肠杆菌中进行选择和繁殖的pUC19衍生序列，和构巢曲霉pyrG基因，其编码乳清苷脱羧酶以供选择pyrG突变体曲霉属菌株的转化体。
将二十个皮摩尔的上述每种引物用于PCR反应，其包含青霉属菌种NN051602基因组DNA，10μl的5XGC缓冲液(FinnzymesOy，Espoo，Finland)，1.5μl的DMSO，各2.5mM的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP，和0.6单位的PHUSIONTMHigh-FidelityDNAPolymerase(FinnzymesOy，Espoo，Finland)，其终体积为50μl。使用PeltierThermalCycler(MJResearchInc.，SouthSanFrancisco，CA，USA)进行扩增，其程序如下：在98℃变性1分钟；5个循环，每循环在98℃变性15秒，在56℃退火30秒，其中每循环增加1℃，和在72℃延伸75秒；和25个循环，每循环在98℃进行15秒，65℃进行30秒和72℃进行75秒；和在72℃最终延伸10分钟。然后加热块进入4℃浸泡循环。
通过使用TBE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中从凝胶切出大约1.4kb产物条带，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。
质粒pPFJO355用BamI和BglII消化，通过使用TBE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。
使用IN-CFDry-downPCRCloningKit将基因片段和消化的载体连接在一起，得到pPpin3，其中嗜松青霉GH10木聚糖酶基因的转录处于来自米曲霉α-淀粉酶的基因的启动子调控之下。简言之，将30ng的用BamI和BglII消化的pPFJO355，和60ng的嗜松青霉GH10木聚糖酶基因纯化的PCR产物添加至反应小瓶，并通过添加去离子水重悬至终体积为10μl。将反应在37℃温育15分钟，然后50℃温育15分钟。使用三μl的反应物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。通过菌落PCR检测含有pPpin3的大肠杆菌转化体，并使用QIAprepSpinMiniprepKit(QIAGENInc.，Valencia，CA，USA)制备质粒DNA。pPpin3中的嗜松青霉GH10木聚糖酶基因插入物通过使用3730XLDNAAnalyzer(AppliedBiosystemsInc，FosterCity，CA，USA)的DNA测序确认。
将相同的PCR片段使用pGEM-TVectorSystem克隆入载体pGEM-T以生成pGEM-T-Ppin3。pGEM-T-Ppin3中含有的嗜松青霉GH10木聚糖酶基因通过使用3730XLDNAAnalyzer的DNA测序确认。将含有pGEM-T-Ppin3的大肠杆菌菌株T-Ppin3于2009年9月7日保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(DSM))，D-38124Braunschweig，Germany，并分配登录号DSM22922。
编码具有木聚糖酶活性的GH10多肽的嗜松青霉基因组克隆的DNA测序用AppliedBiosystemsModel3700AutomatedDNASequencer使用版本3.1BIG-DYETM终止子化学(AppliedBiosystems，Inc.，FosterCity，CA，USA)和dGTP化学(AppliedBiosystems，Inc.，FosterCity，CA，USA)和引物步移策略进行。就其品质审视核苷酸序列数据，并以PHRED/PHRAP软件(UniversityofWashington，Seattle，WA，USA)的协助将所有的序列互相比较。
嗜松青霉gh10基因的核苷酸序列和推定的氨基酸序列分别显示于SEQIDNO:39和SEQIDNO:40。编码序列为1442bp，包括终止密码子，并由51bp(199-249)，73bp(383-455)，和94bp(570-663)的三个内含子间隔。编码的预测的蛋白为407个氨基酸。基因(包括内含子)编码序列的%G+C为47.99%G+C，而成熟多肽编码序列为49.22％。使用SignalP程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineering10：1-6)，预测了19个残基的信号肽。预测的成熟蛋白含有388个氨基酸，具有41.5kDa的预测的分子量和5.03的等电点pH。
氨基酸序列的比较配对全局比对如EMBOSS的Needle程序中执行的使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)确定，其中缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，并使用EBLOSUM62矩阵。比对显示编码具有木聚糖酶活性的GH10多肽的嗜松青霉基因推导的氨基酸序列与来自埃默森踝节菌(AAU99346)和马尔内菲青霉(Penicilliummarneffei)(B6QN64)的预测的GH10家族蛋白的推定的氨基酸序列分别分享76%和87%同一性(排除缺口)。
根据Christensen等，1988，Bio/Technology6：1419-1422的方法制备米曲霉HowB101(WO95/35385实施例1)原生质体。将三μg的pPpin3转化入米曲霉HowB101。
用pPpin3转化米曲霉HowB101产生约50个转化体。将十二个转化体分离至单个基本培养基平板。
将四个转化体分别接种入24孔板中的3ml的YPM培养基，并在30℃以150rpm振荡温育。在3日温育之后，通过SDS-PAGE使用4-12%Bis-Tris凝胶用MES缓冲液根据生产商的指示分析来自每个培养的20μl的上清。将所得凝胶用Blue(ExpedeonLtd.，BabrahamCambridge，UK)染色。培养物的SDS-PAGE概貌显示大多数的转化体具有大约55kDa的主要条带。将表达菌株命名为米曲霉EXP02765。
将命名为转化体2的一个转化体的斜面，用10ml的YPM洗涤，并接种入含有400ml的YPM培养基的2升烧瓶以生成用于酶表征的培养液。将培养在第3日收获，并使用0.45μm膜(Millipore，Bedford，MA，USA)过滤。
将重组的米曲霉菌株EXP02765的1升体积的上清用硫酸铵(80%饱和)沉淀和重新溶解于50ml的25mM乙酸钠pH4.3，然后对相同的缓冲液透析，并通过0.45μm过滤器过滤。将溶液施于在25mM乙酸钠pH4.3中平衡的40mlQSEPHAROSETMFastFlow柱。重组的GH10蛋白并不结合于柱。收集含木聚糖酶活性的级分和通过如上所述的SDS-PAGE进行衡量。汇集含有大约55kDa的条带的级分。将汇集的溶液通过超滤浓缩。
实施例21：具有纤维素分解增强活性的青霉属菌种GH61多肽的制备
根据下述步骤制备具有纤维素分解增强活性的青霉属菌种GH61多肽的SEQIDNO:41[DNA序列]和SEQIDNO:42[推定的氨基酸序列])。
堆肥样品收集自中国云南。青霉属菌种NN051602使用单孢子分离技术在45℃在PDA平板上分离。将青霉属菌种菌株接种于PDA平板上，并在45℃在黑暗中温育4日。将几个菌丝体-PDA栓接种入含有100ml的NNCYP-PCS培养基的500ml摇瓶。将烧瓶在45℃以160rpm振荡温育6日。在第4日、第5日和第6日收集菌丝体。然后合并来自每日的菌丝体并冻结于液氮，然后储藏于-80℃冷冻箱中直至使用。
将冻结的菌丝体转移入液氮预冷的杵和研钵，并粉碎至细微粉末。总RNA从粉末菌丝体通过用试剂提取来制备，并使用MiniKit根据生产商的实验方案纯化。对五十微克的总RNA如上所述进行测序。
对用mRNASeq实验方案富集了多聚A序列的总RNA使用GA2系统(Illumina，Inc.，SanDiego，CA，USA)测序。将原始的36个碱基对读码用内部开发(in-housedeveloped)的装配器进行装配。使用标准生物信息学方法就基因发现(genefinding)和功能性预测对装配序列进行分析。使用ESTscan2.0进行基因预测。使用NCBIblastall版本2.2.10和HMMER版本2.1.1基于结构同源性预测功能。直接通过分析Blast结果鉴定家族GH61候选物。
青霉属菌种NN051602在45℃生长于PDA琼脂平板3日。将菌丝体直接从琼脂平板收集入经灭菌的研钵，并在液氮下冻结。将冻结的菌丝体用杵和研钵粉碎至细微粉末，并使用PlantMiniKit(QIAGENInc.，Valencia，CA，USA)分离基因组DNA。
基于如上所述获得的青霉属菌种GH61基因的测序信息，设计如下文所示的寡核苷酸引物以扩增来自青霉属菌种NN051602的基因组DNA的GH61基因。使用IN-FCFDry-downCloningKit(ClontechLaboratories，Inc.，MountainView，CA，USA)以将片段直接克隆入表达载体pPFJO355，无需进行限制性消化和连接。
有义引物：
5’-ACACAACTGGGGATCCACCA-3’(SEQIDNO:125)
反义引物：
5’-GTCACCCTCTAGATCT-3’(SEQIDNO:126)
粗体字母代表编码序列，而剩余序列与pPFJO355的插入位点同源。
将二十皮摩尔的上述每种引物用于PCR反应，其包含青霉属菌种NN051602基因组DNA，10μl的5XGC缓冲液，1.5μl的DMSO，各2.5mM的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP，和0.6单位的PHUSIONTMHigh-FidelityDNAPolymerase(FinnzymesOy，Espoo，Finland)，终体积为50μl。使用PeltierThermalCycler进行扩增，其程序如下：在98℃变性1分钟；5个循环，每循环在98℃变性15秒，在63℃退火30秒，其中每循环增加1℃，和在72℃延伸60秒；和25个循环，每循环在98℃进行15秒和72℃进行60秒；和在72℃最终延伸5分钟。然后加热块进入4℃浸泡循环。
通过使用TBE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中从凝胶切出大约0.9kb产物条带，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。
用BamI和BglII消化质粒pPFJO355，通过使用TBE缓冲液1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。
使用IN-CFDfy-downPCRCloningKit将基因片段和消化的载体连接在一起，得到pGH61D23Y4，其中青霉属菌种GH61基因的转录处于米曲霉α-淀粉酶的基因的启动子的调控之下。简言之，将30ng的用BamI和BglII消化的pPFJO355，和60ng的青霉属菌种GH61基因纯化的PCR产物添加至反应小瓶，并通过添加去离子水重悬至终体积为10μl。将反应在37℃温育15分钟，然后50℃温育15分钟。使用三μl的反应物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。通过菌落PCR检测含有pGH61D23Y4的大肠杆菌转化体和使用QIAprepSpinMiniprepKit(QIAGENInc.，Valencia，CA，USA)制备质粒DNA。pGH61D23Y4中的青霉属菌种GH61基因插入物通过使用3730XLDNAAnalyzer的DNA测序确认。
将相同的PCR片段使用pGEM-TVectorSystem克隆入载体pGEM-T以生成pGEM-T-GH61D23Y4。pGEM-T-GH61D23Y4中的青霉属菌种GH61基因插入物通过使用3730XLDNAAnalyzer的DNA测序确认。含有pGEM-T-GH61D23Y4的大肠杆菌菌株T-51602，于2009年8月26日保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(DSM))，MascheroderWeg1B，D-38124Braunschweig，Germany，并分配登录号DSM22882。
编码具有纤维素分解增强活性的GH61A多肽的青霉属菌种基因组克隆的DNA测序用AppliedBiosystemsModel3700AutomatedDNASequencer使用版本3.1BIG-DYETM终止子化学(AppliedBiosystems，Inc.，FosterCity，CA，USA)和dGTP化学(AppliedBiosystems，Inc.，FosterCity，CA，USA)和引物步移策略进行。就其品质审视核苷酸序列数据，并以PHRED/PHRAP软件(UniversityofWashington，Seattle，WA，USA)的协助将所有的序列相互比较。
青霉属菌种gh61a基因的核苷酸序列和推定的氨基酸序列分别显示于SEQIDNO:45和SEQIDNO:46。编码序列为835bp，包括终止密码子，并由73bp(114-186)的一个内含子间隔。编码的预测的蛋白为253氨基酸。基因(包括内含子)编码序列的%G+C为63.35%G+C，而成熟多肽编码序列为64.62%。使用SignalP程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineering10：1-6)，预测了25个残基的信号肽。预测的成熟蛋白含有228个氨基酸，具有24.33kDa的预测的分子量和4.17的等电点pH。
氨基酸序列的比较配对全局比对使用如EMBOSS的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)确定，其中缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，并使用EBLOSUM62矩阵。比对显示编码具有纤维素分解增强活性的GH61A多肽的青霉属基因的推导的氨基酸序列与来自桔橙嗜热子囊菌(GENESEQP:AUM17198)的预测的GH61家族蛋白的推导的氨基酸序列分享74%同一性(排除缺口)。
根据Christensen等，1988，Bio/Technology6：1419-1422的方法制备米曲霉HowB101(WO95/35385实施例1)原生质体。使用三μg的pGH61D23Y4转化米曲霉HowB101。
用pGH61D23Y4转化米曲霉HowB101产生约50个转化体。将十二个转化体分离至单个基本培养基平板。
将六个转化体分别接种入在24孔板中3ml的YPM培养基，并在30℃，150rpm温育。在3日温育之后，在4-12%Bis-TrisGel上用MES缓冲液根据生产商的指示分析来自每个培养的20μl的上清。将所得凝胶用Blue(Expede在上Ltd.，BabrahamCambridge，UK)染色。培养物的SDS-PAGE概貌显示大多数的转化体具有大约45kDa的主要条带。将表达菌株命名为米曲霉EXP03089。
将命名为转化体1的一个转化体的斜面用10ml的YPM培养基洗涤，并接种入含有400ml的YPM培养基的2升烧瓶以生成用于酶表征的培养液。将培养在第3日收获，并使用0.45μmDURAPOREMembrane(Millipore，Bedford，MA，USA)过滤。
将重组的菌株米曲霉EXP03089的400ml体积的过滤的培养液用硫酸铵(80%饱和)沉淀，并重新溶解于20ml的25mM乙酸钠pH5.0缓冲液，然后对相同的缓冲液透析，并通过0.45μm过滤器过滤。将溶液施于在25mM乙酸钠pH5.0中平衡的30mlQFastFlow柱(GEHealthcare，Buckinghamshire，UK)。将重组的GH61蛋白用线性NaCl梯度(0-0.4M)洗脱。收集用0.1-0.2MNaCl洗脱的级分，并对相同的平衡缓冲液透析。将样品在柱(GEHealthcare，Buckinghamshire，UK)上用线性NaCl梯度(0-0.3M)进一步纯化。级分通过SDS-PAGE衡量。汇集含有大约45kDa的条带的级分。将汇集的溶液通过超滤浓缩。
实施例22：具有纤维素分解增强活性的土生梭孢霉GH61N多肽的制备
根据下述步骤制备土生梭孢霉NRRL8126(SEQIDNO:43[DNA序列]和SEQIDNO:44[推定的氨基酸序列])。
基因组序列信息通过U.S.DepartmentofEnergyJointGenomeInstitute(JGI)生成。从JGI下载基因组的初步集合，并使用Pedant-ProTMSequenceAnalysisSuite(BiomaxInformaticsAG，Matinsried，Germany)进行分析。使用通过该软件构建的基因模型作为出发点用于在基因组中检测GH61同源物。使用多个已知GH61蛋白序列作为指导手动构建更准确的基因模型。
为了生成供PCR扩增的基因组DNA，将土生梭孢霉NRRL8126在带挡板的摇瓶中在42℃和200rpm生长于50ml的补充1%葡萄糖的NNCYP培养基24小时。通过过滤收获菌丝体，在TE(10mMTris-1mMEDTA)中洗涤两次，并在液氮下冻结。将豌豆大小的冻结的菌丝体悬于0.7ml的在TE中的1%十二烷基硫酸锂，通过用等体积的0.1mm二氧化锆/二氧化硅珠(BiospecProducts，Inc.，Barlesville，OK，USA)在FastPrepFP120(ThermoSavant，Holbrook，NY，USA)中进行搅拌45秒来破坏。通过在13,000xg进行离心10分钟去除碎片，并将经清除的上清移至2.5M乙酸铵，并在冰上温育20分钟。在温育期间之后，通过添加2体积的乙醇沉淀核酸。在4℃在离心机中进行离心15分钟之后，沉淀在70%乙醇中洗涤，并风干。将DNA重悬于120μl的0.1XTE，并用1μl的不含DNase的RNaseA在37℃温育20分钟。将乙酸铵添加至2.5M，并用2体积的乙醇沉淀DNA。将沉淀在70%乙醇中洗涤，风干，并重悬于TE缓冲液。
设计如下文所示的两种合成寡核苷酸引物以从基因组DNAPCR扩增土生梭孢霉家族GH61N基因。使用IN-FUSIONTMCloningKit以将片段直接克隆入表达载体pAILo2(WO2005/074647)，而无需进行限制性消化和连接。
正向引物：
5’-ACTGGATTTACC-3′(SEQIDNO:127)
反向引物：
5’-TCACCTCTAGTTAATTAA-3’(SEQIDNO:128)
粗体字母代表编码序列。剩余序列与pAlLo2的插入位点同源。
将五十皮摩尔的上述每种引物用于PCR反应，其含有1μg的土生梭孢霉基因组DNA，1XGC-MeltLA缓冲液(BDBiosciences，PaloAlto，CA，USA)，1μl的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP的10mM混合物，1.25单位的GCGenomicLAPolymeraseMix(BDBiosciences，PaloAlto，CA，USA)，其终体积为25μl。扩增条件为一个循环，在94℃进行1分钟；和30个循环，每循环在94℃进行30秒，60.5℃进行30秒，和72℃进行1分钟。然后将将加热块在72℃维持5分钟接着进行4℃浸泡循环。
通过使用TAE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中从凝胶切出大约1.1kb产物条带，并使用GelExtractionKit(QIAGENInc.，Valencia，CA，USA)根据生产商的指示纯化。
然后将片段使用IN-FUSIONTMCloningKit克隆入pAlLo2。用NcoI和PacI消化载体。将片段通过使用TAE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切出，并使用GelExtractionKit(QIAGENInc.，Valencia，CA，USA)纯化。将基因片段和消化的载体在反应中合并在一起，得到表达质粒pAG66，其中家族GH61N基因的转录处于NA2-tpi启动子的调控之下(来自编码黑曲霉中中性α-淀粉酶的基因的修饰的启动子，其中未翻译的先导序列由来自编码构巢曲霉中丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列替代)。重组反应物(20μl)包含1XIN-FUSIONTM缓冲液(BDBiosciences，PaloAlto，CA，USA)，1XBSA(BDBiosciences，PaloAlto，CA，USA)，1μl的IN-FUSIONTM酶(1:10稀释的)(BDBiosciences，PaloAlto，CA，USA)，186ng的用NcoI和PacI消化的pAlLo2，和96.6ng的土生梭孢霉GH61N纯化的PCR产物。将反应在37℃温育15分钟接着在50℃进行15分钟。将反应物用40μl的TE缓冲液稀释，并使用2.5μl的稀释反应物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。通过限制酶消化鉴定含有pAG66(GH61N基因)的大肠杆菌转化体，并使用9600制备质粒DNA。
根据Christensen等，1988，Bio/Technology6：1419-1422的方法制备米曲霉JaL355原生质体。使用五μg的pAG43转化米曲霉JaL355。将三个转化体分离至单个PDA平板。
从三个转化体的每一个的初始转化平板取栓，并分别添加至在24孔平板中的1ml的M410培养基，并在34℃温育。五日温育之后，使用无染色，8-16%梯度SDS-PAGE，(Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)根据生产商的指示分析来自每个培养物的7.5μl的上清。培养物的SDS-PAGE概貌显示几个转化体具有大约70kDa和35kDa的新的主要条带。
用5ml的0.01%20洗涤两个转化体的汇合的PDA平板，并接种入五个含有100ml的M410培养基的500mlErlenmeyer烧瓶，并温育以生成用于酶表征的培养液。将烧瓶在第3和第5日收获，并使用0.22μmStericup吸滤器(Millipore，Bedford，MA)过滤。
实施例23：棘孢曲霉CBS101.43GH10木聚糖酶II的制备
从2X-CDN01013纯化棘孢曲霉CBS101.43GH10木聚糖酶II(SEQIDNO:45[DNA序列]和SEQIDNO:46[推定的氨基酸序列])。将样品在20mMBis-TrispH6.0中使用26/10脱盐柱根据生产商的指示进行脱盐和缓冲液交换。将缓冲液交换样品施于用20mMBis-TrispH6.0平衡的QBigBeads柱(64ml)，并用10柱体积的0至500mM氯化钠梯度洗脱结合蛋白。将级分汇集和浓缩入200mM氯化钠-20mMBis-TrispH6.0。使用MicroplateBCATMProteinAssayKit以牛血清白蛋白作为蛋白标样确定蛋白浓度。
实施例24：烟曲霉NN055679GH10木聚糖酶的制备
根据WO2006/078256使用米曲霉BECh2(WO2000/39322)作为宿主重组制备烟曲霉NN055679GH10木聚糖酶(xyn3)(SEQIDNO:47[DNA序列]和SEQIDNO:48[推定的氨基酸序列])。
使用26/10脱盐柱根据生产商的指示将过滤的培养液脱盐和缓冲液交换入20mMTris-150mMNaClpH8.5。使用MicroplateBCATMProteinAssayKit以牛血清白蛋白作为蛋白标样确定蛋白浓度。
实施例25：褐孢长毛盘菌CBS804.70GH10木聚糖酶的制备
将褐孢长毛盘菌CBS804.70接种于PDA平板上，并在28℃温育7日。将几个菌丝体-PDA琼脂栓接种入含有100ml的MEX-1培养基的750ml摇瓶。将烧瓶在37℃以150rpm搅拌9日。将真菌菌丝体通过藉由(Calbiochem，SanDiego，CA，USA)过滤收获然后冻结于液氮。然后将菌丝体通过将冻结的菌丝体与等体积的干冰在用液氮预冷却的咖啡磨中一同磨制而粉碎至粉末。将粉末转移入液氮预冷的杵和研钵并用少量烘烤的石英砂粉碎至细微粉末。将粉末菌丝体材料保持在-80℃直至使用。
根据Chirgwin等，1979，Biochemistry18：5294-5299从褐孢长毛盘菌CBS804.70冻结的粉末菌丝体通过用硫氰酸胍提取接着通过5.7MCsCl衬垫超离心制备总RNA。富集多聚A的RNA通过根据Aviv等，1972，Proc.Natl.Acad.Sci.USA69：1408-1412的寡聚物(dT)-纤维素亲和层析分离。
双链cDNA根据Gubler和Hoffman，1983，GENE25：263-269；Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，和Maniantis，T.Molecularcloning：ALaboratoryManual，第2版，1989，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHabor，NewYork；和Kofod等，1994，J.Biol.Chem.269：29182-29189的一般方法，使用多聚A-NotI引物(PromegaCorp.，Madison，Wisconsin，USA)合成。在合成之后，cDNA用绿豆核酸酶处理，用T4DNA聚合酶平端化，并连接于50倍摩尔过量的EcoRI衔接头(InvitrogenCorp.，Carlsbad，CA，USA)。用NotI切割cDNA，并将cDNA通过使用TBE缓冲液的0.8%琼脂糖凝胶电泳大小分级。将700bp和更大的cDNA级分从凝胶切出，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。
将定向的、大小分级的cDNA连接入EcoRI-NotI切割的pYES2.0(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。连接反应通过在16℃温育12小时，然后在70℃进行加热20分钟，和最终添加10μl的水至每个试管来进行。将一μl的每个连接混合物如Sambrook等，1989，见上文所述电穿孔入40μl的电感受态大肠杆菌DH10B细胞(InvitrogenCorp.，Carlsbad，CA，USA)。
在由汇集物组成的大肠杆菌中构建褐孢长毛盘菌CBS804.70文库。通过将转化的大肠杆菌在LB氨苄青霉素平板上铺板来制备每个汇集物，在37℃温育24小时之后得到15,000-30,000个菌落/平板。将二十ml的LB培养基添加至平板，并将细胞悬于其中。将细胞悬液在50ml试管中在37℃振荡1小时。
使用MidiPlasmidKit(QIAGENInc.，Valencia，CA，USA)，根据生产商的指示分离来自T.saccataCBS804.70的几个文库汇集物的质粒DNA，并储藏于-20℃。
将来自几个文库汇集物的纯化的质粒DNA的一μl等分试样通过电穿孔(Becker和Guarante，1991，MethodsEnzymol.194：182-187)转化入酿酒酵母W3124，并将转化体铺板于含有2%葡萄糖的SC-琼脂平板，并在30℃温育。总共，自每个汇集物获得含有250-400个酵母菌落的50-100个平板。在3-5日温育之后，将SC琼脂平板复制铺板于一组含半乳糖的0.1%AZCL木聚糖(燕麦)SC-URA琼脂平板。将平板在30℃温育2-4日，并将被蓝色晕圈围绕的菌落鉴定为木聚糖酶阳性菌落。将阳性克隆划线纯化，并获得作为单个菌落的菌株CBS521.95。
将木聚糖酶表达酵母菌落接种入在25ml试管中的5ml的YPD培养基。将试管在30℃振荡过夜。离心一ml的培养物以沉淀酵母细胞。
DNA根据WO94/14953分离并溶解于50μl的水。使用标准步骤(Sambrook等，1989，见上文)将DNA转化入大肠杆菌DH10B。
从大肠杆菌转化体使用标准步骤(Sambrook等，1989，见上文)分离质粒DNA。使用两种pYES引物做测序引物对质粒进行测序。发现一个命名为TF12Xyl170的1283bp的特异性质粒克隆编码家族10糖苷水解酶蛋白，并对其进一步表征。更可靠的序列通过使用如下文所示的基于起始序列设计的特异性引物进一步对片段测序来获得：
TF12Xyl170F1：
5’-TGAAATGGGATGCTACTGA-3’(SEQIDNO:129)
TF12Xyl170F2：
5’-CAACGACTACAACATCGAGG-3’(SEQIDNO:130)
TF12Xyl170R1：
5’-ATTTGCTGTCCACCAGTGAA-3’(SEQIDNO:131)
一个匹配初始cDNA序列的质粒命名为pTF12Xyl170，并将含有该克隆的大肠杆菌菌株命名为大肠杆菌pTF12Xyl170，并于2009年7月28日保藏于研究机构专利培养物保藏中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection)，北区研究中心(NorthernRegionalResearchCenter)，Peoria，IL，USA并给予登录号NRRLB-50309。
褐孢长毛盘菌gh10a基因的核苷酸序列和推定的氨基酸序列分别显示于SEQIDNO:49和SEQIDNO:50。编码序列为1197bp，包括终止密码子。编码的预测的蛋白含有398个氨基酸。该基因的编码区的%G+C为53.6％，而成熟多肽编码区的%G+C亦为53.6%。使用SignalP程序，版本3(Nielsen等，1997，ProteinEngineering10：1-6)，预测了19个残基的信号肽。预测的成熟蛋白含有379个氨基酸，具有40.4kDa的分子量。
用Interproscan程序(Zdobnov和Apweiler，2001，Bioinformatics17：847-848)分析gh10a基因的推定的氨基酸序列显示GH10A蛋白含有家族10糖苷水解酶典型的核心序列，从预测的成熟多肽的大约氨基酸残基65延伸至残基377。GH10A蛋白亦含有类型I真菌纤维素结合域(CBMI)的序列特征。称为PrositeEntryPS00562的该特征序列(Sigrist等，2002，BriefBioinform.3：265-274)存在于预测的成熟多肽的氨基酸残基8至残基35。
氨基酸序列的比较配对全局比对使用如EMBOSS的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)确定，其中缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，并使用EBLOSUM62矩阵。比对显示编码GH10A成熟多肽的褐孢长毛盘菌基因的推导的氨基酸序列与分别来自黄孢平革菌和巨多孔菌的家族10糖苷水解酶蛋白的推导的氨基酸序列(登录号UNIPROT:B7SIW2和GENESEQP:AAW23327分别)分享62.6%和62.0%同一性(排除缺口)。
将褐孢长毛盘菌CBS804.70gh10a基因使用BamHI和XhoI从pTF12xyl170切出，并使用标准方法(Sambrook等，1989，见上文)连接入亦用BamHI和XhoI消化的曲霉属表达载体pDAu109(WO2005/042735)。根据生产商的指示将连接反应物转化入大肠杆菌TOP10化学感受态细胞。将八个菌落在LB氨苄青霉素培养基中生长过夜，使用QIAprepSpinMiniprepKit(QIAGENInc.，Valencia，CA，USA)根据生产商的指示分离质粒DNA。对含有正确大小的插入物的质粒进行测序以确定插入物的完整性和取向。发现质粒pDAu81#5不含错误，并因此选择进行放大试验。
米曲霉BECH2(WO2000/39322)的原生质体如WO95/02043中所述制备。如WO00139322中所述构建米曲霉BECh2。将一百微升的原生质体悬液与在包含1.2M山梨醇，10mMTris-HCl，pH7.5，10mMCaCl2的10μl的STC(Christensen等，1988，Bio/Technology6：1419-1422)中的5-25μg的曲霉属表达载体pDAu81#5混合。将混合物置于室温25分钟。添加两百微升的60%PEG4000(BDH，Poole，England)(聚乙二醇，分子量4,000)，10mMCaCl2，和10mMTis-HClpH7.5，并轻柔地混合，并最后添加0.85ml的相同的溶液，并轻柔地混合。将混合物置于室温25分钟，以2,500xg进行离心15分钟，并将沉淀重悬于2ml的1.2M山梨醇。重复该沉积过程，并将原生质体涂布于COVE平板。在37℃温育4-7日之后，挑取孢子并涂布于含有0.01%X-100的COVE平板以供分离单个菌落。将铺板在含有1M蔗糖和10mM硝酸钠的COVE蔗糖培养基(Cove，1996，Biochim.Biophys.Acta133：51-56)上再重复两次。
将十个转化体接种于10ml的YPG培养基。在30℃，200rpm温育3-4日之后，移出上清，并通过SDS-PAGE10%Bis-Tris凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)如生产商的推荐进行分析。凝胶用考马斯蓝染色，且所有的分离物显示35至45kDa的扩散条带。进一步就木聚糖酶活性在pH6.0在含有0.01%X-100的0.2M磷酸钠pH6.0缓冲液中根据生产商的指示使用修饰的AZCL-阿拉伯木聚糖作为分离自小麦(Megazyme，Wicklow，Ireland)的底物分析这些转化体。选择产生最高水平活性的转化体以供产生木聚糖酶。
使用标准方法生长产生最高水平活性的转化体。将培养液使用Whatmann玻璃过滤器GF/D，GF/A，GF/C，GF/F(分别为2.7μm，1.6μm，1.2μm和0.7μm)(Whatman，Piscataway，NJ，USA)过滤，接着使用瓶顶0.45μm过滤器(ThermoFisherScientific，Rochester，NY，USA)过滤。
将硫酸铵添加至过滤的培养液至3M的终浓度，并在以10,000xg离心30分钟之后收集沉淀。将沉淀溶解于10mMTris/HClpH8.0并对10mMTris/HClpH8.0透析过夜。将经透析的制备物施于用10mMTris/HClpH8.0平衡的150mlQFastFlow柱，并用1050ml(7柱体积)在10mMTris/HClpH8.0中的0至1MNaCl的线性盐梯度洗脱酶。接着在280nm进行洗脱，收集级分，并使用0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖进行木聚糖酶活性测定，所述AZCL-阿拉伯木聚糖来自在含有0.01%X-100的0.2M磷酸钠缓冲液pH6.0中的小麦。汇集含有木聚糖酶活性的级分，并储藏于-20℃。
实施例26：嗜松青霉GH10木聚糖酶的制备
根据下述步骤制备嗜松青霉GH10木聚糖酶(SEQIDNO:51[DNA序列]和SEQIDNO:52[推定的氨基酸序列])。
堆肥样品于2000年12月12日收集自中国云南。嗜松青霉NN046877使用单孢子分离技术在45℃在PDA平板上分离。将嗜松青霉菌株NN046877接种于PDA平板上，并在37℃在黑暗中温育4日。将几个菌丝体-PDA栓接种入含有100ml的NNCYP-PCS培养基的500ml摇瓶。将烧瓶在37℃以160rpm振荡温育5日。在第4日和第5日收集菌丝体。将来自每日的菌丝体冻结于液氮和储藏于-80℃冷冻箱中直至使用。
将冻结的菌丝体转移入液氮预冷的杵和研钵并粉碎至细微粉末。从每日的粉末菌丝体通过用TRIZOLTM试剂提取制备总RNA。使用mTRAPTMTotalKit分离多聚A富集的RNA。
用SMARTTMcDNA文库ConstructionKit(ClontechLaboratories，Inc.，MountainView，CA，USA)合成来自每日的双链cDNA。将cDNA用SfiI切割，并将cDNA通过使用TBE缓冲液的0.8%琼脂糖凝胶电泳大小分级。将500bp和更大的cDNA级分从凝胶切出，并使用PCRDNA和GelBandPuificationKit根据生产商的指示纯化。然后汇集等量的来自第4日和第5日的cDNA用于文库构建。
然后将汇集的cDNA通过使用T4连接酶(NewEnglandBiolabs，Inc.，Beverly，MA，USA)根据生产商的指示连接入SfiI切割的pMHas7(WO2009/037253)进行定向克隆。将连接混合物使用GENE和PulseController(Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)在25uF，25mAmp，1.8kV用1mm间隙的小杯根据生产商的步骤电穿孔入大肠杆菌ELECTROMAXTMDH10BTM细胞(InvitrogenCorp.，Carlsbad，CA，USA)。
将电穿孔的细胞铺板于补充50mg每升的卡那霉素的LB平板。从起始pMHas7载体连接的60,000个总转化体制备cDNA质粒汇集物。使用PlasmidKit(QIAGENInc.，Valencia，CA，USA)直接从菌落汇集物制备质粒DNA。
从WO2001/77315所述的含有pSigA2转座子的质粒构建命名为pSigA4的含有转座子的质粒以供构建具有减少的选择背景的pSigA2的信号捕获转座子的改进型式。pSigA2转座子含有编码于转座子自身上的较少信号的β-内酰胺酶构建体。使用PCR使用校正读码的PfuTurbo聚合酶(QIAGENGmbHCorporation，Hilden，Germany)和下述5’磷酸化引物(TAGCopenhagen，Denmark)构建见于质粒骨架的完整β-内酰胺酶的缺失：
SigA2NotU-P：
5’-TCGCGATCCGTTTTCGCATTTATCGTGAAACGCT-3’(SEQIDNO:132)
SigA2NotD-P：
5’-CCGCAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAA-3’(SEQIDNO:133)
扩增反应包含1μl的pSigA2(10ng/μl)，5μl的10XPROOFSTARTTM缓冲液(QIAGENGmbHCorporation，Hilden，Germany)，2.5μl的dNTP混合物(20mM)，0.5μl的SigA2NotU-P(10mM)，0.5μl的SigA2NotD-P(10mM)，10μl的Q溶液(QIAGENGmbHCorporation，Hilden，Germany)，和31.25μl的去离子水。使用DNAENGINETMThermalCycler(MJResearchInc.，Waltham，MA，USA)进行扩增，其程序如下：一个循环，在95℃进行5分钟；和20个循环，每循环在94℃进行30秒，62℃进行30秒，和72℃进行4分钟。
通过使用TAE缓冲液和0.1μg每ml的溴乙锭的0.8%琼脂糖凝胶电泳分离3.9kbPCR反应产物。以ImagingSystem(Stratagene，LaJolla，CA，USA)协助在360nm显影DNA条带。将3.9kbDNA条带从凝胶切出，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。
将3.9kb片段用10单位的T4DNA连接酶(NewEnglandBiolabs，Inc.，Beverly，MA，USA)，9μl的3.9kbPCR片段，和1μl的10X连接缓冲液(NewEnglandBiolabs，Inc.，Beverly，MA，USA)在16℃自连接过夜。将连接物在65℃进行热失活10分钟，然后用DpnI在37℃进行消化2小时。温育之后，消化物使用PCRDNA和GelBandPurificationKit纯化。
然后将纯化材料根据生产商的指示转化入大肠杆菌TOP10感受态细胞。将转化混合物铺板于补充25μg每ml的氯霉素的LB平板。由几个转化体制备质粒小量制备物，并用BglII消化。选择具有正确构建的一个质粒。将质粒命名为pSigA4。质粒pSigA4含有与WO2001/77315中公开的相同的侧翼为BglII的转座子SigA2。
将质粒pSigA4DNA(0.3μg/μl)的60μl样品用BglII消化并通过使用TBE缓冲液的0.8%琼脂糖凝胶电泳分离。将2kb的SigA2转座子DNA条带用200μl的EB缓冲液(QIAGENGmbHCorporation，Hilden，Germany)洗脱，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化，并在200μl的EB缓冲液中洗脱。SigA2用于转座子协助的信号捕获。
转座子协助的信号捕获的完整描述描述于WO2001/77315。将质粒汇集物用转座子SigA2和HYPERMUTM转座酶(EPICENTREBiotechnologies，Madison，WI，USA)根据生产商的指示处理。
对嗜松青霉cDNA文库的体外转座子标记，将含有大约100ng的DNA的2μl的SigA2转座子与在总体积的20μl中含有1μg的DNA，1μl的HYPERMUTM转座酶，和2μl的10X缓冲液(EPICENTREBiotechnologies，Madison，WI，USA)的嗜松青霉cDNA文库的1μl的质粒DNA汇集物混合，并在30℃温育3小时，接着添加2μl的终止缓冲液(EPICENTREBiotechnologies，Madison，WI，USA)，并在75℃进行热失活10分钟。通过添加2μl的3M乙酸钠pH5和55μl的96%乙醇沉淀DNA，并在10,000xg，4℃进行离心30分钟。将沉淀在70%乙醇中洗涤，在室温风干，并重悬于10μl的去离子水。
将2μl体积的转座子标记的质粒汇集根据生产商的指示使用GENE和PulseController在25uF，25mAmp，1.8kV用1mm间隙的小杯根据生产商的步骤电穿孔入50μl的大肠杆菌ELECTROMAXTMDH10BTM细胞(InvitrogenCorp.，Carlsbad，CA，USA)。
将电穿孔的细胞在37℃以225rpm振荡在SOC培养基中温育1小时然后铺板于下述选择性培养基：补充50μg每ml的卡那霉素的LB培养基；补充50μg每ml的卡那霉素和15μg每ml的氯霉素的LB培养基；和补充50μg每ml的卡那霉素，15μg每ml的氯霉素，和30μg每ml的氨苄青霉素的LB培养基。
通过将电穿孔物铺板入补充卡那霉素，氯霉素和氨苄青霉素的LB培养基，在30℃3日之后观察到每50μl大约200个菌落。将所有的菌落复制铺板于如上所述的LB卡那霉素，氯霉素，和氨苄青霉素培养基。在该选择条件下回收了五百个菌落。对来自每个菌落的DNA用如下文所示的转座子正向和反向引物(引物A和B)，根据公开于WO2001/77315(第28页)的步骤进行测序。
引物A：
5’-agcgtttgcggccgcgatcc-3’(SEQIDNO:134)
引物B：
5’-ttattcggtcgaaaaggatcc-3’(SEQIDNO:135)
DNA序列获得自SinoGenoMaxCo.，Ltd(Beijing，China)。对于每个质粒的引物A和引物B序列读码进行修剪以去除载体和转座子序列。将装配序列通过使用程序PhredPhrap(Ewing等，1998，GenomeResearch8：175-185；Ewing和Green，1998，GenomeResearch8：186-194)归类为重叠群。然后将所有的重叠群与可从标准公开的DNA和蛋白序列数据库序列(TrEMBL，SWALL，PDB，EnsemblPep，GeneSeqP)获得的序列使用程序BLASTX2.0a19MP-WashU[14-Jul-1998][Buildlinux-x8618:51:4430-Jul-1998](Gish等，1993，Nat.Genet.3：266-72)相比较。直接通过分析BlastX结果鉴定家族GH10木聚糖酶候选物。
将嗜松青霉NN046877在PDA琼脂平板上在37℃生长4-5日。将菌丝体直接从琼脂平板收集入经灭菌的研钵，并在液氮下冻结。将冻结的菌丝体用杵和研钵粉碎至细微粉末，并使用PlantMiniKit(QIAGENInc.，Valencia，CA，USA)分离基因组DNA。
基于如上所述获得的嗜松青霉GH10木聚糖酶基因信息，设计如下文所示的寡核苷酸引物以从嗜松青霉GH10NN046877的基因组DNA扩增GH61基因。使用IN-CFDry-downCloningKit(ClontechLaboratories，Inc.，MountainView，CA，USA)以将片段直接克隆入表达载体pPFJO355，无需进行限制性消化和连接。
有义引物：
ATGACTCTAGTAAAGGCTATTCTTTTAGC-3’(SEQIDNO:136)
反义引物：
CAAACATTGGGAGTAGTATGG-3’(SEQIDNO:137)
粗体字母代表编码序列，而剩余序列与pPFJO355的插入位点同源。
将二十皮摩尔的上述每种引物用于PCR反应，其包含青霉属菌种NN051602基因组DNA，10μl的5XGC缓冲液，1.5μl的DMSO，各2.5mM的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP，和0.6单位的PHUSIONTMHigh-FidelityDNAPolymerase，其终体积为50μl。使用PeltierThermalCycler进行扩增，其程序如下：在98℃变性1分钟；5个循环，每循环在98℃变性15秒，在56℃退火30秒，其中每循环增加1℃，和在72℃延伸75秒；和25个循环，每循环在98℃进行15秒，65C进行30秒和72℃进行75秒；和在72℃最终延伸10分钟。然后加热块进入4℃浸泡循环。
通过使用TBE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中从凝胶切出大约1.4kb产物条带，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。
用BamI和BglII消化质粒pPFJO355，通过使用TBE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。
使用IN-CFDry-downPCRCloningKit将基因片段和消化的载体连接在一起，得到pPpin3，其中嗜松青霉GH10木聚糖酶基因的转录处于米曲霉α-淀粉酶的基因的启动子的调控之下。简言之，将用BamI和BglII消化的30ng的pPFJO355，和60ng的嗜松青霉GH10木聚糖酶基因纯化的PCR产物添加至反应小瓶，并通过添加去离子水重悬至终体积为10μl。将反应在37℃温育15分钟，然后50℃温育15分钟。使用三μl的反应物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。通过菌落PCR检测含有pPpin3的大肠杆菌转化体，并使用QIAprepSpinMiniprepKit(QIAGENInc.，Valencia，CA，USA)制备质粒DNA。pPpin3中的嗜松青霉GH10木聚糖酶基因插入物通过使用3730XLDNAAnalyzer的DNA测序确认。
使用pGEM-TVectorSystem将相同的PCR片段克隆入载体pGEM-T以生成pGEM-T-Ppin3。将pGEM-T-Ppin3中含有的嗜松青霉GH10木聚糖酶基因通过使用3730XLDNAAnalyzer的DNA测序确认。含有pGEM-T-Ppin3的大肠杆菌菌株T-Ppin3于2009年9月7日保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(DSM))，D-38124Braunschweig，Germany，并分配登录号DSM22922。
编码具有木聚糖酶活性的GH10多肽的嗜松青霉基因组克隆的DNA测序用AppliedBiosystemsModel3700AutomatedDNASequencer使用版本3.1BIG-DYETM终止子化学(AppliedBiosystems，Inc.，FosterCity，CA，USA)和dGTP化学(AppliedBiosystems，Inc.，FosterCity，CA，USA)和引物步移策略进行。就其品质审视核苷酸序列数据，并以PHRED/PHRAP软件(UniversityofWashington，Seattle，WA，USA)的协助将所有的序列相互比较。
嗜松青霉gh10基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列分别显示于SEQIDNO:51和SEQIDNO:52。编码序列为1442bp，包括终止密码子，并由51bp(199-249)，73bp(383-455)，和94bp(570-663)的三个内含子间隔。编码的预测的蛋白为407个氨基酸。基因(包括内含子)编码序列的%G+C为47.99%G+C，而成熟多肽编码序列为49.22％。使用SignalP程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineering10：1-6)，预测了19个残基的信号肽。预测的成熟蛋白含有388个氨基酸，具有41.5kDa的预测的分子量和5.03的等电pH。
氨基酸序列的比较配对全局比对使用如EMBOSS的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)确定，其中缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，并使用EBLOSUM62矩阵。比对显示编码具有木聚糖酶活性的GH10多肽的嗜松青霉基因的推定的氨基酸序列与来自埃默森踝节菌(AAU99346)和马尔内菲青霉(B6QN64)的预测的GH10家族蛋白的推导的氨基酸序列分别分享76%和87%同一性(排除缺口)。
根据Christensen等，1988，Bio/Technology6：1419-1422的方法制备米曲霉HowB101(WO95/35385实施例1)原生质体。将三μg的pPpin3转化入米曲霉HowB101。
用pPpin3转化米曲霉HowB101产生约50个转化体。将十二个转化体分离至单个基本培养基平板。
将四个转化体分别接种入培养基在24孔板中的3ml的YPM，并在30℃以150rpm振荡温育。在3日温育之后，通过SDS-PAGE使用4-12%Bis-TrisGel用MES缓冲液根据生产商的指示分析来自每个培养物的20μl的上清。将所得凝胶用Blue(ExpedeonLtd.，BabrahamCambridge，UK)染色。培养物的SDS-PAGE概貌显示大多数的转化体具有大约55kDa的主要条带。将表达菌株命名为米曲霉EXP02765。
将命名为转化体2的一个转化体的斜面用10ml的YPM洗涤，并接种入含有400ml的YPM培养基的2升烧瓶以生成用于酶表征的培养液。在第3日收获培养物，并使用0.45μm膜(Millipore，Bedford，MA，USA)过滤。
将重组的米曲霉菌株EXP02765的1升体积的上清用硫酸铵(80%饱和)沉淀并重新溶解于50ml的25mM乙酸钠pH4.3，然后对相同的缓冲液透析，并藉由0.45μm过滤器过滤。将溶液施于在25mM乙酸钠pH4.3中平衡的40mlQSEPHAROSETMFastFlow柱。重组的GH10蛋白并不结合于柱。收集具有木聚糖酶活性的级分并通过SDS-PAGE衡量，如上所述。汇集含有大约55kDa条带的级分。将汇集的溶液通过超滤浓缩。
实施例27：土生梭孢霉GH10E木聚糖酶的制备
根据下述步骤制备土生梭孢霉NRRL8126GH10E木聚糖酶(SEQIDNO:53[DNA序列]和SEQIDNO:54[推定的氨基酸序列])。
设计如下文所示的两种合成寡核苷酸引物以从基因组DNAPCR扩增土生梭孢霉gh10e基因。使用InFusionCloningKit(Clontech，MountainView，CA)以将片段直接克隆入表达载体pAILo2(WO2005/074647)。
正向引物：
5’-ACTGGATTTACC-3′(SEQIDNO:138)
反向引物：
5’-TCACCTCTAGTTAATTAA-3’(SEQIDNO:139)
粗体字母代表编码序列。剩余序列与pAlLo2的插入位点同源。
将五十皮摩尔的上述每种引物用于PCR反应，其含有2μg的土生梭孢霉基因组DNA，1XPfx扩增缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，2XPCRxEnhancer溶液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，1.5μl的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP的10mM混合物，2.5单位的PfxDNAPolymerase，和1μl的50mMMgSO4，终体积为50μl。扩增条件为一个循环，在94℃进行2分钟；和30个循环，每循环在94℃进行15秒，59.5℃进行30秒，和68℃进行150秒。然后将加热块在68℃维持7分钟接着进行4℃浸泡循环。
使用TAE缓冲液在1.0%琼脂糖凝胶上分离反应产物，并从凝胶切出大约1.2kb产物条带，并使用GelExtractionKit(QIAGENInc.，Valencia，CA，USA)根据生产商的指示纯化。
然后将片段使用IN-FUSIONTMCloningKit克隆入pAlLo2。将载体用NcoI和PacI消化(使用生产商指定的条件)。将片段通过如上所述的凝胶电泳和GelExtractionKit纯化。将基因片段和消化的载体在反应中合并在一起，得到表达质粒pAG29，其中gh10e基因的转录处于NA2-tpi启动子的调控之下(来自黑曲霉中性α-淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因的启动子的杂合体)。重组反应(10μl)包含1XInFusionBuffer(Clontech，MountainView，CA，USA)，1XBSA(Clontech，MountainView，CA，USA)，0.5ml的InFusion酶(1:10稀释的)(Clontech，MountainView，CA，USA)，93ng的用NcoI和PacI消化的pAlLo2，和1μl的土生梭孢霉gh10e纯化的PCR产物。将反应在37℃温育15分钟接着在50℃温育15分钟。将反应物用40ml的TE缓冲液稀释，并使用2.5μl的稀释反应物转化大肠杆菌Gold细胞。
质粒DNA使用9600制备，并进行限制性酶消化。用PstI消化推定的pAG29克隆。然后对将来自这些克隆的质粒DNA测序以鉴定不含PCR诱导的错误的克隆。测序反应物含有1.5μl的质粒DNA，4.5μl的水，和4μl的测序主混合物，所述混合物含有1μl的5X测序缓冲液(Millipore，Billerica，MA，USA)，1μl的BIGDYETM终止子(AppliedBiosystems，Inc.，FosterCity，CA，USA)，1μl的水和每反应3.2皮摩尔的下述引物之一。
pAlLo25’
5’-TGTCCCTTGTCGATGCG-3’(SEQIDNO:140)
pAlLo23’
5’-CACATGACTTGGCTTCC-3’(SEQIDNO:141)
米曲霉JaL355原生质体根据Christensen等，1988，Bio/Technology6：1419-1422的方法制备。使用五μg的pAG29转化米曲霉JaL355。将二十四个转化体分离至单个PDA平板。
将24个转化体的汇合的PDA平板用5ml的0.01%20洗涤，并收集孢子。将八μl的每个孢子储备分别添加至在24孔平板中的1ml的YPG，YPM，和M410，并在34℃温育。在三日温育之后，使用Criterion无染色，8-16%梯度SDS-PAGE，(BioRad，Hercules，CA)根据生产商的指示分析来自选择的培养物的7.5μl的上清。培养物的SDS-PAGE概貌显示几个转化体具有大约50kDa的新的主要条带，且最佳表达在M410中。在总共六日的温育之后，如上所述对所有的M410培养物取样，和使用Criterion无染色，8-16%梯度SDS-PAGE凝胶，(BioRad，Hercules，CA)分析，在此时点选择呈现最佳表达的转化体。
将最佳转化体的汇合的PDA平板用5ml的0.01%20洗涤，并接种入五个含有100ml的M410培养基的500mlErlenmeyer烧瓶以生成用于酶表征的培养液。将烧瓶在第5日收获。使用0.22μmStericup吸滤器(Millipore，Bedford，MA)过滤培养液。
实施例28：ThermobifidafuscaGH11木聚糖酶的制备
使用直链整合载体系统进行ThermobifidafuscaDSM22883GH11木聚糖酶基因(SEQIDNO：55[DNA序列]和SEQIDNO：56[推定的氨基酸序列])的表达克隆。该直链整合构建体为通过将两个枯草芽孢杆菌同源染色体区之间的每个基因与强启动子和氯霉素抗性标记融合所得的PCR融合产物。融合是通过SOEPCR(Horion等,1989,Gene77:61-68)进行的。SOEPCR方法亦描述于WO2003/095658。每个基因在三重启动子系统(如WO99/43835中所述)的调控下表达，所述系统由来自地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)，解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)的启动子，和包含稳定化序列的苏云金芽孢杆菌cryIIIA启动子组成。将编码氯霉素乙酰转移酶的基因用作标志物(Diderichsen等，1993，Plasmid30：312)。将最终基因构建体通过同源重组入果胶酸裂合酶基因座来整合入芽孢杆菌属染色体。
GH11木聚糖酶基因(SEQIDNO:55[DNA序列]和SEQIDNO:56[推定的氨基酸序列])从ThermobifidafuscaDSM22883(NN018438)使用下表中所示的引物通过聚合酶链式反应(PCR1)分离。引物基于蛋白序列UNIPROT:Q5RZ98。ThermobifidafuscaDSM22883分离自在2001年从夏威夷瓦胡岛获得的土壤样品。木聚糖酶基因作为全长基因和截短基因克隆。设计基因以含有C-末端HQHQHQH标记以方便纯化，但不使用His标记进行纯化。设计正向引物Ocs3使得基因从起始密码子(ATG)扩增，并具有24个碱基的悬突(在下表中以斜体显示)。该悬突互补于两个直链载体片段之一的部分，并在装配PCR片段和载体片段时(如下文所述)使用。设计反向引物Ocs1以扩增基因的截短型式，同时设计反向引物Ocs2以扩增全长基因。Ocs1和Ocs2两者均携带由编码HQHQHQH-标记的24bp和终止密码子组成的悬突(该悬突在下表中以斜体显示)。该悬突互补于两个直链载体片段之一的部分，并在装配PCR片段和载体片段时(如下文所述)使用。
分离了含有全长木聚糖酶基因和作为悬突包含于引物的短的24bp侧翼DNA序列的PCR片段。分离了含有截短的木聚糖酶基因和相同的短的24bp侧翼DNA序列的另一个PCR片段。
对于每个基因构建体，PCR扩增了3个片段：来自Thermobifidafusca(NN018438)的基因组DNA的基因片段，用引物260558和iMB1361Uni1扩增的上游侧翼片段，和用来自菌株iMB1361的基因组DNA的引物260559和oth432(描述于专利申请WO2003095658)扩增的下游侧翼片段。下表中列出了所有使用的引物。
基因片段使用校正读码的聚合酶PHUSIONTMDNA聚合酶根据生产商的指示并添加2%DMSO来扩增。两个侧翼DNA片段用EXPANDTMHighFidelityPCRSystem根据生产商的推荐扩增。PCR条件如下所述：一个循环，在94℃进行2分钟；10个循环，每循环在94℃进行15秒，50℃进行45秒，68℃进行4分钟；20个循环，每循环在94℃进行15秒，50℃进行45秒，和68℃进行4分钟(每循环+20秒延伸)；和一个循环，在68℃进行10分钟。对3个PCR片段通过重叠延伸(SOE)PCR反应进行后续的剪接以将三个片段装配为直链的载体构建体。这是通过将3个片段以相同的摩尔比混合进行的，并在下述条件下运行新的PCR反应：一个循环，在94℃进行2分钟；10个循环，每循环在94℃进行15秒，50℃进行45秒，和68℃进行5分钟；10个循环，每循环在94℃进行15秒，50℃进行45秒，和68℃进行8分钟；15个循环，每循环在94℃进行15秒，50℃进行45秒，和68℃进行8分钟(每循环再增加20秒)。在第一个循环之后添加两个端引物260558和260559(各20pmol)。将两μl的PCR产物转化入枯草芽孢杆菌。在补充6μg每ml的氯霉素的LB平板上选择转化体。将全长木聚糖酶编码序列通过同源重组整合入枯草芽孢杆菌宿主TH1(amy-，spo-，apr-，npr-；WO2005/038024)的基因组。将截短的木聚糖酶编码序列通过同源重组整合入枯草芽孢杆菌宿主PL2317(amy-，spo-，apr-，npr-，xyl-)的基因组。
然后就产生大量活性木聚糖酶的能力筛选转化体。筛选基于通过SDS-PAGE分析所得的对应于异源表达的蛋白的条带强度和对含有AZCL-木聚糖(MegazymeInternationalIreland，Ltd.，Wicklow，Ireland)的LB琼脂平板的酶的活性。
分离了一个转化体，枯草芽孢杆菌EXP01687，其含有在宿主菌株枯草芽孢杆菌TH1中表达的全长木聚糖酶基因。通过Sanger测序确认枯草芽孢杆菌EXP01687的全长木聚糖酶基因序列。蛋白序列与UNIPROT:Q5RZ98相差2个氨基酸。
分离了另一个转化体，枯草芽孢杆菌EXP01672，其含有在宿主菌株枯草芽孢杆菌PL2317中表达的截短的木聚糖酶基因。通过Sanger测序确认枯草芽孢杆菌EXP01672的截短的木聚糖酶基因序列编码至SEQIDNO:56的位置236的脯氨酸的分泌信号和成熟氨基酸序列。蛋白序列与UNIPROT:Q5RZ98相差2个氨基酸。
将枯草芽孢杆菌EXP01687在37℃以200rpm振荡生长于含有补充34mg每升的氯霉素的Cal-18培养基的500ml带挡板的Erlenmeyer烧瓶2日。根据下文中所述的实验方案从培养上清纯化酶。
在步骤1中，将全培养物(800ml)在17,600xg离心30分钟，然后通过SEITZ-EKS过滤器(PALLSeitzschenkFiltersystemsGmbH，BadKreuznach，Germany)过滤。将氯化钠添加至过滤样品至50mMNaCl，并将pH调整至pH7.5。将样品(750ml)施于用50mMNa2HPO4，50mMNaClpH7.5平衡的20mlNi6FastFlow柱(GEHealthcare，Piscataway，NJ，USA)，并用5柱体积的梯度将结合蛋白洗脱至100%50mMNa2HPO4，500mM咪唑pH7.5。通过SDS-PAGE分析在流出液中发现酶，揭示在流出液中存在具有正确大小的蛋白，而在洗脱液中无正确大小的蛋白。该结果通过如上所述使用AZCL-阿拉伯木聚糖(小麦)作为底物的活性测量得到确认。
在步骤2中，将硫酸铵添加至流出液(步骤1的)至1M，并将pH调整至7.5。将样品(800ml)施于用1M硫酸铵pH7.5平衡的60mlPhenyl-650M柱(TOSOHCorporation，Tokyo，Japan)。将结合蛋白用Milli-超纯水(Millipore，Billerica，MA，USA)洗脱。汇集具有A280的级分(55ml)。将汇集的级分用25mM乙酸pH4.5使用26/10脱盐柱根据生产商的指示进行脱盐和缓冲液交换。
在步骤3中，将步骤2的缓冲液交换的样品(110ml)用Milli-超纯水稀释2.5倍，并施于用25mM乙酸pH4.5平衡的10mlSPFastFlow柱(GEHealthcare，Piscataway，NJ，USA)。将结合蛋白用五柱体积在25mM乙酸pH4.5中0至500mM氯化钠的梯度洗脱。基于SDS-PAGE分析汇集A280和A260级分(10ml)。
在步骤4中，将步骤3汇集的级分用Milli-超纯水稀释25倍，并将pH调整至pH6.0，并施于用5mM琥珀酸pH6.0平衡的10mlSPFastFlow柱。将结合蛋白用十个柱体积在5mM琥珀酸pH6.0中0至500mM氯化钠的梯度洗脱。基于SDS-PAGE分析汇集A280和A260级分(12ml)。然后对汇集的级分的不同部分进行三种不同的步骤(下文中所述的步骤5(a)，5(b)，和5(c))。
在步骤5(a)中，将步骤4的6ml的汇集级分用Milli-超纯水稀释至25ml，并将pH调整至pH9.0，并施于用25mM硼酸pH9.0平衡的1mlRESOURCETMQ柱(GEHealthcare，Piscataway，NJ，USA)。将结合蛋白用十个柱体积在25mM硼酸pH9.0中的0至500mM氯化钠的梯度洗脱。基于A280和A260，蛋白存在于流出液(35ml)。该样品使用配置有5kDa截留值膜的超滤槽(Millipore，Billerica，MA，USA)浓缩。
在步骤5(b)中，将步骤4的3ml的汇集物用Milli-超纯水稀释至30ml，并将pH调整至pH9.6，并施于用12.5mM硼酸pH9.7平衡的1mlRESOURCETMQ柱。将结合蛋白用十个柱体积在12.5mM硼酸pH9.7中0至500mM的氯化钠的梯度洗脱。基于A280和A260和SDS-PAGE分析，蛋白存在于流出液(36ml)。
在步骤5(c)中，将步骤4的汇集物的四分之一用Milli-超纯水稀释，并将pH调整至pH8.0，并施于用25mM硼酸pH8.0平衡的1mlRESOURCETMQ柱。将结合蛋白用十个柱体积在25mM硼酸(盐)pH8.0中的0至500mM的氯化钠的梯度洗脱。基于A280和A260和SDS-PAGE分析，蛋白存在于流出液(25ml)。
在步骤6中，将来自步骤5(a)的样品，来自步骤5(b)的流出液，和来自步骤5(c)的流出液汇集并用25mM乙酸pH4.5稀释，并将pH调整至pH4.58。将汇集样品(100ml)施于用25mM乙酸pH4.5平衡的1mlSPFastFlow柱(GEHealthcare，Piscataway，NJ，USA)。将结合蛋白用一个柱体积在25mM乙酸pH4.5中的0至500mM的氯化钠的梯度洗脱。基于SDS-PAGE分析和A280和A260汇集了级分(3.5ml)。基于SDS-PAGE分析，纯化的木聚糖酶的MW为20-25kDa。
实施例29：里氏木霉RutC30GH3β-木糖苷酶的制备
通过使用Lambda-CMRXRLibraryConstructionKit(Stratagene，LaJolla，CA，USA)根据生产商的指示筛选从里氏木霉RutC30基因组DNA制备的Lambda-CMRXR文库来分离里氏木霉RutC30β-木糖苷酶基因(SEQIDNO:57[DNA序列]和SEQIDNO:58[推定的氨基酸序列])。使用标准方法制备里氏木霉RutC30基因组DNA。使用PCR如下文所示的引物扩增编码2300bp的里氏木霉β-木糖苷酶的DNA区段。
正向引物：
5’-gtgaataacgcagctcttctcg-3’(SEQIDNO:149)
反向引物：
5’-ccttaattaattatgcgtcaggtgt-3’(SEQIDNO:150)
设计引物994768以从在β-木糖苷酶起始位点之后的第一个碱基扩增，并将引物994769设计为具有5’端处的PacI位点。
将五十皮摩尔的上述每种引物用于PCR反应，其由50ng来自lamdazap文库的质粒DNA，1μl的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP的10mM混合物，5μl的10XPfxDNAPolymerase缓冲液，和1单位的PfxDNAPolymerase组成，其终体积为50μl。使用5333扩增DNA片段，其程序如下：一个循环，在95℃进行3分钟；和30个循环，每循环在94℃进行45秒，55℃进行60秒，和72℃进行1分30秒。在30个循环之后，将反应在72℃温育10分钟，然后冷却至4℃直至进一步加工。
通过使用TAE缓冲液的1%琼脂糖凝胶电泳，从凝胶切出，并使用GelExtractionKit纯化来纯化2.3kbPCR产物。然后将2.3kbPCR产物用PacI消化以促进插入pAlLo1(WO2004/099228)。
将pAlLo1载体用NcoI消化，然后使用T4聚合酶(Roche，Nutley，NJ，USA)根据生产商的指示补足。然后使用第二酶，PacI，消化pAlLo1的5’端，并和通过如上所述的琼脂糖凝胶电泳纯化反应物以分离6.9kb载体片段。
然后将2.3kbβ-木糖苷酶片段连接入6.9kb载体片段，并根据生产商的指示转化入大肠杆菌XL1-BlueSubcloningCompetentCell(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。使用限制性消化分析筛选转化体以供鉴定具有正确插入的那些。通过使用ABI3700(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)和染料终止子化学(Giesecke等，1992，JournalofVirologyMethods38：47-60)的测序确认了新表达载体，pSaMe04。
设计如下文所示的两种合成寡核苷酸引物以从pSaMe04PCR扩增里氏木霉β-木糖苷酶基因以构建木霉属表达载体。使用IN-FUSIONTMCloningKit以将片段直接克隆入表达载体pMJ09(WO2005/056772)，无需进行限制性消化和连接。
TrBXYL-F(ID064491)：
5’-CGGACTGCGCACC-3’(SEQIDNO:151)
TrBXYL-R(ID064492)：
5’-TCGCCACGGAGCTTA-3’(SEQIDNO:152)
粗体字母代表编码序列。剩余序列与pMJ09的插入位点同源。
将五十皮摩尔的上述每种引物用于PCR反应，其包含50ng的pSaMe04，1μl的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP的10mM混合物，5μl的10XACCUTAQTMDNA聚合酶缓冲液(Sigma-Aldrich，St。Louis，MO，USA)，和5单位的ACCUTAQTMDNA聚合酶(Sigma-Aldrich，St。Louis，MO，USA)，其终体积为50μl。使用5333扩增DNA片段，其程序如下：一个循环，在95℃进行3分钟；和30个循环，每循环在94℃进行45秒，55℃进行60秒，和72℃进行1分30秒。在30个循环之后，将反应在72℃温育10分钟，然后冷却至4℃直至进一步加工。
通过使用TAE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中1.2kb产物从凝胶切出，并使用GelExtractionKit根据生产商的指示纯化。
然后将1.2kb片段使用IN-FUSIONTMCloningKit克隆入pMJ09。将载体用NcoI和PacI消化，并通过如上所述的琼脂糖凝胶电泳纯化。将基因片段和消化的载体在反应中连接在一起，得到表达质粒pSaMe-TrBXYL，其中β-木糖苷酶基因的转录处于里氏木霉cbh1基因启动子的调控之下。连接反应物(50μl)包含1XIN-FUSIONTM缓冲液，1XBSA，1μl的IN-FUSIONTM酶(1:10稀释的)，用NcoI和PacI消化的100ng的pMJ09，和100ng的里氏木霉β-木糖苷酶纯化的PCR产物。将反应在室温温育30分钟。使用一μl的反应物转化大肠杆菌XL10Gold细胞。通过限制酶消化检测含有pSaMe-TrBXYL的大肠杆菌转化体，并使用9600制备质粒DNA。来自pSaMe-TrBXYL的里氏木霉β-木糖苷酶基因的DNA测序使用染料终止子化学(Giesecke等，1992，见上文)和引物步移策略进行。
构建质粒pSaMe-AaXYL以包含里氏木霉纤维二糖水解酶I基因启动子和终止子和棘孢曲霉GH10木聚糖酶编码序列。
棘孢曲霉木聚糖酶的克隆遵循如等，1994，Mol.Gen.Genet.243：253-260中概述的总体表达克隆实验方案。
从棘孢曲霉CBS101.43菌丝体分离RNA。通过在寡聚(dT)-纤维素上进行层析从总RNA分离多聚(A)+RNA。通过如Maniatis等(Molecularcloning：alaboratorymanual.ColdSpringHarborLaboratoryPress，1982)所述合成双链cDNA。在合成之后cDNA用绿豆核酸酶处理，用T4DNA聚合酶平端化，并连接至非回文的BstXI衔接头(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。将cDNA通过使用TAE缓冲液的1%琼脂糖凝胶电泳进行大小分级，其中将范围为600bp至4000bp的片段用于文库构建。将DNA连接入在GAL1启动子和异-1-细胞色素c终止子之间的BstXI-消化的pYES2.0，并转化入大肠杆菌MC1061细胞(Stratagene，LaJolla，CA，USA)。将文库铺板于LB平板，并在37℃温育过夜。从平板刮取菌落，并重悬于补充100μg每ml的氨苄青霉素的LB培养基。质粒DNA使用PlasmidMidiKit(QIAGENInc.，Valenicia，CA，USA)分离。汇集纯化的质粒DNA。
将纯化质粒DNA混合物转化入酿酒酵母W3124细胞(MATa；ura3-52；leu2-3，112；his3-D200；pep4-1137；prcl::HIS3；prbl:：LEU2；cir+；vandenHazel等，1992，Eur.J.Biochem.207：277-283)。培养，转化和培养基如Guthrie等，1991，Meth.Enzymol.Vol194，AcademicPress所述。将转化细胞在30℃铺板于含有2%葡萄糖的合成完全琼脂3日。在3日之后，将菌落复制铺板于含2%半乳糖的SC培养基，并在30℃温育4日。通过在pH4.5含0.1%AZCL-Birch-Xylan的1%琼脂糖覆层鉴定木聚糖酶表达菌落(，2006，FEMSMicrobiologyReviews21：29-42)。表达木聚糖酶活性的菌落被蓝色区围绕。从阳性菌落拯救的质粒DNA含有大约1.3kb的DNA插入物。分离的基因片段的测序揭示编码具有43.0kDa的理论分子量的多肽的1218bp开读框。将cDNA片段亚克隆入用BamHI和XhoI消化的曲霉属表达载体pHD464(和Heldt-Hansen，1994，Mol.Gen.Genet.243，253–260)，即用BamHI和XhoI切割该克隆，并分离1.2kbcDNA插入物(Christgau等，1996，Biochem。J。319：705-712)，以生成质粒pA2X2。
将棘孢曲霉GH10木聚糖酶编码序列使用质粒pA2x2作为模板和如下文所示的引物153505和153506使用标准方法进行PCR扩增以产生大约1.2kb片段。将1.2kb片段用BamHI和XhoI(导入PCR引物)消化，并克隆入载体pCaHj527(WO2004/099228)。将所得质粒命名为pMT2155，其中cDNA置于来自黑曲霉的中性淀粉酶II(NA2)启动子和来自黑曲霉的AMG终止子的转录调控之下。
引物153505：
5’-TCTTGGATCCACCATGGTCGGACTGCTTTCAATCACC-3’(SEQIDNO:153)
引物153506：
5’-TTAACTCGAGTCACAGACACTGCGAGTAATAGTC-3’(SEQIDNO:154)
设计如下文所示的两种合成寡核苷酸引物以从质粒pMT2155PCR扩增棘孢曲霉GH10基因，并导入侧翼区以供插入表达载体pMJ09(WO2005/056772)。粗体字母代表编码序列，而剩余序列与pMJ09的插入位点同源。
正向引物：
5’-cggactgcgcacc-3’(SEQIDNO:155)
反向引物：
5’-tcgccacggagctta-3’(SEQIDNO:156)
将五十皮摩尔的上述每种引物用于PCR反应，其由50ng的pMT2155，1μl的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP的10mM混合物，5μl的10XACCUTAQTMDNA聚合酶缓冲液，和5单位的ACCUTAQTMDNA聚合酶组成，其终体积为50μl。使用5333扩增DNA片段，其程序如下：一个循环，在95℃进行3分钟；和30个循环，每循环在94℃进行45秒，55℃进行60秒，和72℃进行1分钟30秒。在30个循环之后，将反应物在72℃温育10分钟，然后冷却至4℃直至进一步加工。
使用TAE缓冲液在1.0%琼脂糖凝胶上分离反应产物，其中从凝胶切出1.2kb产物，并使用QIAquickGelExtractionKit根据生产商的指示纯化。
然后将片段使用IN-FUSIONTMCloningKit克隆入pMJ09。将载体用NcoI和PacI消化，并通过如上所述的琼脂糖凝胶电泳纯化。将1.2kb基因片段和消化的载体在反应中连接在一起，得到表达质粒pSaMe-AaXYL，其中家族GH10基因的转录处于里氏木霉cbh1启动子的调控之下。连接反应物(50ul)包含1XIN-FUSIONTM缓冲液，1XBSA，1μl的IN-FUSIONTM酶(1:10稀释)，100ng的用NcoI和PacI消化的pAlLo2，和100ng的棘孢曲霉GH10木聚糖酶纯化的PCR产物。将反应在室温温育30分钟。使用一μl的反应物依照生产商转化大肠杆菌XL10Gold细胞。通过限制酶消化检测含有pSaMe-AaGH10的大肠杆菌转化体，并使用9600制备质粒DNA。来自pSaMe-AaXYL的棘孢曲霉GH10基因的DNA测序使用染料终止子化学(Giesecke等，1992，见上文)和引物步移策略进行。
将编码棘孢曲霉GH10内切葡聚糖酶的质粒pSaMe-AaXYL和编码里氏木霉β-木糖苷酶的pSaMe-TrBXYL通过PEG-介导的转化(Penttila等，1987，GENE61155-164)共转化入里氏木霉RutC30以生成里氏木霉菌株SaMe-BXX13。每个质粒含有构巢曲霉amdS基因以使得转化体能以乙酰胺作为唯一氮源生长。
将里氏木霉RutC30在27℃和90rpm在补充2%(w/v)葡萄糖和10mM尿苷的25ml的YP培养基中培养17小时。菌丝体通过使用VacuumDrivenDisposableFiltrationSystem(Millipore，Bedford，MA，USA)过滤收集，并用去离子水洗涤两次和用1.2M山梨醇洗涤两次。通过将洗涤的菌丝体悬于含有15mg的GLUCANEXTM(NovozymesA/S，Bagsvaerd，Denmark)每ml和0.36单位的壳聚糖酶(SigmaChemicalCo.，St。Louis，MO，USA)每ml的20ml的1.2M山梨醇中，并在34℃以90rpm轻柔振荡温育15-25分钟来生成原生质体。原生质体通过以400xg离心7分钟并用冷的1.2M山梨醇洗涤两次来收集。将原生质体使用血细胞计数器计数，并重悬于STC至1X108原生质体每ml的终浓度。将过量原生质体在-80℃储藏于Cryo1℃FreezingContaner(Nalgene，Rochester，NY，USA)中。
将大约4μg的质粒pSaMe-AaXYL和pSaMe-TRBXYL用PmeI消化，并添加至100μl的原生质体溶液，并轻柔地混合，接着用250μl的10mMCaCl2-10mMTris-HClpH7.5-60%PEG4000混合，并在室温温育30分钟。然后添加STC(3ml)，并混合，并将转化溶液使用构巢曲霉amdS选择铺板于COVE平板。将平板在28℃温育5-7日。将转化体传代培养至COVE2平板上，并在28℃生长。
将超过40个转化体传代培养至含有乙酰胺的新鲜平板上，并允许在28℃进行7日的孢子形成。
在含有25ml的纤维素酶诱导培养基的125ml带挡板的摇瓶中在pH6.0培养里氏木霉转化体，即，接种转化体孢子并在28℃和200rpm温育7日。运行里氏木霉RutC30作为对照。在第5日移出培养液样品。将一ml的每种培养液以15,700xg在微离心机中进行离心5分钟，并将上清转移至新试管。
使用Tris-HCl(5%分辨)凝胶(Bio-RadLaboratories，Inc.)用System进行SDS-PAGE。将五μl的第7日上清(见上)悬于2X浓度的LaemmliSampleBuffer(Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)，并在5%β-巯基乙醇的存在下煮沸3分钟。将上清样品加载于聚丙烯酰胺凝胶，并用1XTris/Glycine/SDS作为运行缓冲液(Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)进行电泳。将所得凝胶用BIO-SAFETMCoomassieStain染色。将基于蛋白凝胶显示棘孢曲霉GH10木聚糖酶和里氏木霉β-木糖苷酶两者的最高表达的转化体命名为里氏木霉SaMe-BXX13。
将里氏木霉SaMe-BXX13在含有用里氏木霉SaMe-BXX13的孢子接种的在pH6.0的250ml的纤维素酶诱导培养基的500ml带挡板的摇瓶中培养。摇瓶在28℃以200rpm温育五日。然后将培养液使用0.22μmEXPRESSTMPlus膜过滤。
将过滤的培养液使用配置有10kDa聚醚砜膜的切线流浓缩器浓缩并用乙酸缓冲液交换至pH4.0。将样品加载于在50mM乙酸钠pH4.0中平衡的SP柱，用0-1000mM氯化钠的梯度洗脱结合蛋白。将级分使用切线流浓缩器缓冲液交换至20mM磷酸钠pH7.0，并施于用1.5M(NH4)2SO4-20mM磷酸钠pH7.0平衡的PhenylSUPEROSETM柱(HR16/10)。结合蛋白用20柱体积在20mMTis-HClpH7.0中的1.5至0M(NH4)2SO4的线性梯度洗脱。将蛋白级分使用切线流浓缩器缓冲液交换至20mMTEAHClpH7.5。将样品施于柱，在20mMTEAHClpH7.5中平衡，用0-300mM氯化钠的梯度洗脱结合蛋白。最终蛋白级分的缓冲液为20mMTEA-100mM氯化钠pH7.5。蛋白浓度使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例30：埃默森踝节菌CBS393.64GH3β-木糖苷酶的制备
根据Rasmussen等，2006，Biotechnology和Bioengineering94：869-876使用米曲霉JaL355作为宿主(WO2003/070956)重组制备埃默森踝节菌CBS393.64(NN005049)β-木糖苷酶(SEQIDNO:59[DNA序列]和SEQIDNO:60[推定的氨基酸序列])。
将埃默森踝节菌β-木糖苷酶根据Rasmussen等，2006，见上文纯化。
实施例31：里氏木霉RutC30Cel7B内切葡聚糖酶I的制备
根据WO2005/067531使用米曲霉JaL250作为宿主重组制备里氏木霉RutC30Cel7B内切葡聚糖酶I(EGI)(SEQIDNO:61[DNA序列]和SEQIDNO:62[推定的氨基酸序列])。
将收获的培养液在500ml瓶中在4℃以13,000xg离心20分钟，然后使用0.22μm聚醚砜膜(Millipore，Bedford，MA，USA)灭菌过滤。使用配置有10kDa聚醚砜膜的切线流浓缩器将过滤的培养液浓缩并用20mMTris-HClpH8.5进行缓冲液交换。将样品加载于用20mMTis-HClpH8.5平衡的QHighPerformance柱，并用含有600mMNaCl的平衡缓冲液分步洗脱。流过物和流出液级分通过使用CRITERIONTM无染色显影系统(Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)的SGS-PAGE凝胶分析进行分析。将含有里氏木霉Cel7BEGI的流出液级分汇集，浓缩和缓冲液交换至20mMTris-HClpH8.5。蛋白浓度使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例32：里氏木霉RutC30Cel7A纤维二糖水解酶I的制备
里氏木霉RutC30Cel7A纤维二糖水解酶I(CBHI)(SEQIDNO:63[DNA序列]和SEQIDNO:64[推定的氨基酸序列])如Ding和Xu，2004，“Productivecellulaseadsorptiononcellulose”inLignocelluloseBiodegradation(Saha，B.C.编)，SymposiumSeries889，pp.154-169，AmericanChemicalSociety，Washington，DC所述制备。蛋白浓度使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例33：里氏木霉RutC30Cel6A纤维二糖水解酶II的制备
将里氏木霉RutC30Cel6A纤维二糖水解酶II基因(SEQIDNO:65[DNA序列]和SEQIDNO:66[推定的氨基酸序列])如WO2005/056772中所述从里氏木霉RutC30分离。
将里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II基因使用pEJG61作为表达载体根据描述于美国申请公开号20060156437的步骤表达于镶片镰孢。发酵如美国申请公开号20060156437中所述进行。
将过滤的培养液使用26/10脱盐柱根据生产商的指示脱盐并缓冲液交换入20mM乙酸钠-150mMNaClpH5.0。蛋白浓度使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例34：预处理的玉米秸秆水解测定法
在U.S.DepartmentofEnergyNationalRenewableEnergyLaboratory(NREL)使用1.4wt%硫酸在165℃和107psi将玉米秸秆预处理8分钟。预处理的玉米秸秆(PCS)中的不溶于水的固形物含有56.5%纤维素，4.6%半纤维素和28.4%木质素。纤维素和半纤维素通过两阶段硫酸水解接着通过使用NRELStandardAnalyticalProcedure#002的高效液相色谱分析糖来确定。在用硫酸水解纤维素和半纤维素级分之后，使用NRELStandardAnalyticalProcedure#003以重量法确定木质素。
制备未磨制的、未洗涤的PCS(全PCS浆料)，即通过充分搅拌下添加10MNaOH将PCS的pH调整至5.0，然后在120℃高压灭菌20分钟。总PCS浆料的干重量为29%。使用未洗涤或用水洗涤的PCS。通过在CosmosICMG40湿法多用途粉碎器(EssEmmCorporation，TamilNadu，India)中磨制全PCS浆料来制备磨制的、未洗涤的PCS(干重量32.35%)。以相同方式及随后反复用去离子水洗涤，并倾去上清级分来制备磨制的、洗涤的PCS(干重量32.35%)。
PCS的水解使用2.2ml深孔板(Axygen，UnionCity，CA，USA)以1.0ml的总反应体积进行。水解用50mg的PCS(在未洗涤的PCS的情况下，为不溶性固形物，在洗涤的PCS的情况下，为总固形物)每ml的含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液，和多种酶组合物的多种蛋白加载量(表示为mg蛋白每克的纤维素)进行。制备了酶组合物，然后以50μl至200μl范围的体积同时添加至所有的孔，至每反应1ml的终体积。然后使用ALPS-300TM平板热密封器(Abgene，Epsom，UnitedKingdom)密封平板，充分混合，并在特定温度温育72小时。所有报道的实验一式三份进行。
在水解之后，使用0.45μm96孔过滤平板(Millipore，Bedford，MA，USA)过滤样品，并如下所述就糖含量分析滤过物。当不立即使用时，将过滤的等分试样冻结于-20℃。稀释于0.005MH2SO4的样品的糖浓度使用4.6x250mmHPX-87H柱(Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)通过用0.05%w/w苯甲酸-0.005MH2SO4在65℃以0.6ml每分钟的流速洗脱，并通过对来自用纯糖样品校正的折射率检测( 1100HPLC，AgilentTechnologies，SantaClara，CA，USA)的葡萄糖、纤维二糖和木糖信号进行积分的定量而进行测量。所得的葡萄糖和纤维二糖当量用于对每个反应计算纤维素转换百分比。
单独测量葡萄糖、纤维二糖和木糖。就合适的稀释因子调整测量的糖浓度。在未洗涤的PCS的情况下，酶法产生的糖的净浓度通过就零时点的未洗涤的PCS中的相应的背景糖浓度调整测量的糖浓度来确定。所有HPLC数据处理使用MICROSOFTEXCELTM软件(Microsoft，Richland，WA，USA)进行。
纤维素转化为葡萄糖的程度使用下述等式计算：%转化=葡萄糖浓度/极限消化中的葡萄糖浓度。为了计算总转化，合并了葡萄糖和纤维二糖值。将纤维二糖浓度乘以1.053以换算为葡萄糖当量，并添加至葡萄糖浓度。使用下述方程计算总纤维素转化的程度：
%转化=[葡萄糖浓度+1.053x(纤维二糖浓度)]/[极限消化中的(葡萄糖浓度+1.053x(纤维二糖浓度)]。
对于纤维二糖的1.053因子考虑了纤维二糖转化为葡萄糖时的质量增加。为了计算%转化，基于纤维素酶对照(50-100mg的里氏木霉纤维素酶每克纤维素)设定100%转化点，并用该数除以所有值，然后乘以100。对三次重复的数据点进行平均，并计算标准偏差。
实施例35：在重构的基于里氏木霉的酶组合物中用几种纤维素分解蛋白替代CBHI，CBHII，和EGII组分对于在50℃，55℃，和60℃的改善的性能的衡量
以多种组合在50℃，55℃，和60℃针对重构的基于里氏木霉的酶组合物测试了几种纤维素分解蛋白，所述酶组合物包括四种主要的里氏木霉纤维素酶(45%里氏木霉Cel7ACBHI，25%里氏木霉Cel6ACBHII，5%里氏木霉Cel7BEGI，5%里氏木霉Cel5AEGII)，β-葡糖苷酶(10%烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶)，和具有纤维素分解增强活性的家族61多肽(10%桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽)。
受衡量的酶包括嗜热毛壳菌Cel7ACBHI，嗜热毁丝霉Cel7ACBHI，嗜热毁丝霉Cel6ACBHII，和嗜热毁丝霉Cel5AEGII。所有的酶组合物含有45%CBHI，25%CBHII，5%里氏木霉Cel7BEGI，5%EGII，10%烟曲霉β-葡糖苷酶，和10%具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽。所有的酶组合物，包括基于里氏木霉的组合物，以5mg蛋白每g纤维素的相同剂量施用。
测定如实施例34中所述进行。含5%磨制的、洗涤的PCS的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及在水解开始时的单次混合。
如图1中所示的结果表明对于纤维素水解最佳的酶组合物包括嗜热毛壳菌Cel7ACBHI，嗜热毁丝霉Cel6ACBHII，里氏木霉Cel7BEGI，嗜热毁丝霉Cel5AEGII，烟曲霉β-葡糖苷酶，和具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽。用嗜热毛壳菌Cel7ACBHI，嗜热毁丝霉Cel6ACBHII，和嗜热毁丝霉Cel5AEGII替代里氏木霉Cel7ACBHI，Cel6ACBHII，和Cel5AEGII显著地改善了在60℃纤维素转化为葡萄糖的程度(从50%至65%)。改善的组合物在60℃水解磨制的、洗涤的PCS(65%纤维素转化为葡萄糖)几乎与基于里氏木霉的组合物在50℃(68%)一样有效。
实施例36：就增强高温酶组合物在50℃，55℃，和60℃的PCS水解活性的能力衡量具有纤维素分解增强活性的GH61多肽
使用磨制的、洗涤的PCS就在50℃、55℃和60℃激发高温纤维素酶组合物的能力以10%总蛋白添加测试如本文中所述制备的具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽和具有纤维素分解增强活性的土生梭孢霉GH61E多肽。将由45%嗜热毛壳菌Cel7ACBHI，25%嗜热毁丝霉Cel6ACBHII，5%里氏木霉Cel7BEGI，5%嗜热毁丝霉Cel5AEGII，10%烟曲霉β-葡糖苷酶，和10%具有纤维素分解增强活性的GH61多肽组成的组合物用于以5mg蛋白每g纤维素水解磨制的、洗涤的PCS，并将结果与对于不含GH61多肽的高温酶组合物(以4.5mg蛋白每g纤维素使用)的结果相比较。
测定如实施例34中所述进行。含5%磨制的、洗涤的PCS的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及在水解开始时的单次混合。
图2中所示的结果表明桔橙嗜热子囊菌GH61A和土生梭孢霉GH61E多肽能够在50℃至60℃的所有温度显著地增强高温酶组合物的PCS-水解活性，且激发作用在较高温度更为显著。在60℃，不含GH61多肽的组合物显示48%的纤维素至葡萄糖的转化。与之相比，包括桔橙嗜热子囊菌GH61A或土生梭孢霉GH61E多肽的组合物分别显示70%和68%的纤维素至葡萄糖的转化。
实施例37：就在50℃，55℃，和60℃增强高温酶组合物的PCS-水解活性的能力衡量具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A和土生梭孢霉GH61EGH61多肽的二元组合物
将包含等量(按蛋白计)的具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A和土生梭孢霉GH61EGH61多肽二元组合物的增强性能与仅单个GH61蛋白的增强性能以相等的总蛋白加载量在50℃，55℃，和60℃进行比较。高温酶组合物包括45%嗜热毛壳菌Cel7ACBHI，25%嗜热毁丝霉Cel6ACBHII，5%里氏木霉Cel7BEGI，5%嗜热毁丝霉Cel5AEGII，10%烟曲霉β-葡糖苷酶，和10%GH61组分(单个多肽或二元组合物)。水解反应中的总蛋白加载量为5mg蛋白每g纤维素。
测定如实施例34中所述进行。含5%磨制的、洗涤的PCS的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及在水解开始时的单次混合。
图3中所示的结果表明两种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，桔橙嗜热子囊菌GH61A和土生梭孢霉GH61E的二元组合，比任何每种GH61蛋白自身提供了更大的增强。该作用在60℃尤其显著。
实施例38：就在60℃增强高温酶组合物的PCS水解活性衡量含有不同比例的具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A和土生梭孢霉GH61EGH61多肽的二元组合物
在确定具有纤维素分解增强活性的GH61多肽桔橙嗜热子囊菌GH61A和土生梭孢霉GH61E的1:1组合物在增强高温酶组合物的PCS水解活性中与任一蛋白单独的表现更佳之后，通过检查不同比例的桔橙嗜热子囊菌GH61A和土生梭孢霉GH61E多肽更加详细地分析该作用。将GH61多肽的多种二元组合物以0.5mg蛋白每g纤维素添加至高温酶组合物(4.5mg蛋白每g纤维素)，使得最终混合物由45%嗜热毛壳菌Cel7ACBHI，25%嗜热毁丝霉Cel6ACBHII，5%里氏木霉Cel7BEGI，5%嗜热毁丝霉Cel5AEGII，10%巴西青霉β-葡糖苷酶，和10%GH61组分(单个GH61多肽或二元组合物)组成。
测定法如实施例34中所述进行。含5%磨制的、洗涤的PCS的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及在水解开始时的单次混合。
结果显示于表1和图4。所有具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A和土生梭孢霉GH61EGH61多肽的二元组合物提供了与任一蛋白单独相比显著更佳的由高温酶组合物所致的PCS水解的增强。对于含有至少20%的具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A或土生梭孢霉GH61E的二元GH61组合物获得了最佳性能。
表1：在60℃将二元GH61多肽组合物(0.5mg蛋白每g纤维素)添加至高温酶组合物(4.5mg蛋白每g纤维素)
实施例39：就在60℃增强高温酶组合物的PCS水解活性能力衡量不同水平的包含具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A和土生梭孢霉GH61EGH61多肽的二元1:1组合物
通过在60℃将不同的GH61蛋白加载量(0.125，0.25，0.5，1.0，1.5mg蛋白每g纤维素)添加至恒定加载量的高温酶组合物(4.5mg每g纤维素)检查具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，具有纤维素分解增强活性的土生梭孢霉GH61E多肽，或其二元1∶1组合物(按蛋白计)激发高温酶组合物的能力。所述高温酶组合物含有45%嗜热毛壳菌Cel7ACBHI，25%嗜热毁丝霉Cel6ACBHII，5%里氏木霉Cel7BEGI，5%嗜热毁丝霉Cel5AEGII，和10%巴西青霉Cel3Aβ-葡糖苷酶。
测定如实施例34中所述进行。含5%磨制的、洗涤的PCS的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及在水解开始时的单次混合。
图5中所示的结果表明在相等蛋白加载量，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽桔橙嗜热子囊菌GH61A和土生梭孢霉GH61E的1:1组合物与任一GH61蛋白单独相比，提供了更高的PCS水解增强。该作用在相对高GH61蛋白添加尤其显著。该作用在GH61二元组合物的水平达到大约20%的总蛋白加载量时饱和。
实施例40：GH11木聚糖酶对高温酶组合物在50-65℃糖化磨制的、洗涤的PCS的作用
在50℃，55℃，60℃，和65℃检查ThermobifidafuscaGH11木聚糖酶(0.5mg蛋白每g纤维素)激发高温酶组合物(5mg蛋白每g纤维素)糖化磨制的、洗涤的PCS的能力。为了比较，在5.0，5.5，和6.0mg蛋白每g纤维素测试了不含补充的木聚糖酶的高温酶组合物。高温酶组合物包括45%嗜热毛壳菌Cel7ACBHI，25%嗜热毁丝霉Cel6ACBHII，5%里氏木霉Cel7BEGI，5%嗜热毁丝霉Cel5AEGII，10%巴西青霉Cel3Aβ-葡糖苷酶，和10%具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽。
测定如实施例34中所述进行。含5%磨制的、洗涤的PCS的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及在水解开始时的单次混合。
图6中所示的结果表明添加ThermobifidafuscaGH11木聚糖酶显著地改善高温酶组合物在50℃至65℃的所有温度的性能，在72小时的水解之后使纤维素至葡萄糖的转化增加4-7%。
实施例41：在50-65℃在高温酶组合物中用多种热稳定性CBHI蛋白替代嗜热毛壳菌Cel7A纤维二糖水解酶I
在50℃，55℃，60℃，和65℃测试了几种热稳定性CBHI蛋白在高温酶组合物(4mg总蛋白每g纤维素)中替代嗜热毛壳菌Cel7ACBHI的能力。高温酶组合物含有45%嗜热毛壳菌Cel7ACBHI，25%嗜热毁丝霉Cel6ACBHII，10%嗜热毁丝霉Cel5AEGII，5%具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，5%具有纤维素分解增强活性的土生梭孢霉GH61E多肽，和10%巴西青霉Cel3Aβ-葡糖苷酶。
将下述来自米曲霉表达宿主的重组CBHI纤维素酶作为嗜热毛壳菌Cel7ACBHI的替代进行测试：嗜热毁丝霉Cel7A，烟曲霉Cel7A，和桔橙嗜热子囊菌Cel7A。
测定法如实施例34中所述进行。含5%磨制的、洗涤的PCS的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及在水解开始时的单次混合。
如图7所示，用烟曲霉Cel7ACBHI替代嗜热毛壳菌Cel7ACBHI给出了最佳水解结果，在60℃提供了最终水解产量的几乎6%的改善。令人惊讶的是，不含CBM的天然的桔橙嗜热子囊菌Cel7ACBHI，亦在升高的温度显示了令人瞩目的良好性能。
实施例42：含有烟曲霉Cel7ACBHI或嗜热毛壳菌Cel7ACBHI的高温酶组合物与基于里氏木霉的纤维素酶SaMe-MF268(XCL-533)在50℃和60℃的比较
在四种蛋白加载量(3.5，4.0，4.5，和5.0mg蛋白每g纤维素)和两种(50℃和60℃)使用磨制的、洗涤的PCS作为底物将含有烟曲霉Cel7ACBHI或嗜热毛壳菌Cel7ACBHI的两种高温酶组合物与基于里氏木霉的纤维素酶组合物SaMe-MF268(XCL-533)相比较进行测试。高温酶组合物含有45%Cel7ACBHI，25%嗜热毁丝霉Cel6ACBHII，5%里氏木霉Cel7BEGI，5%嗜热毁丝霉Cel5AEGII，5%具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，5%具有纤维素分解增强活性的土生梭孢霉GH61E多肽，7.5%巴西青霉GH3Aβ-葡糖苷酶，和2.5%ThermobifidefuscaGH11木聚糖酶。基于里氏木霉的酶组合物SaMe-MF268(XCL-533)如WO2008/151079中所述获得。组合物包含具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，包含融合于野生型米曲霉β-葡糖苷酶的特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心多肽的β-葡糖苷酶融合蛋白，里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶I，里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II，里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶I，里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II，里氏木霉Cel45A内切葡聚糖酶V，和里氏木霉Cel12A内切葡聚糖酶III。
测定如实施例34中所述进行。含5%磨制的、洗涤的PCS的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及在水解开始时的单次混合。
基于烟曲霉Cel7ACBHI的组合物的蛋白剂量概貌在中与基于嗜热毛壳菌Cel7ACBHI的组合物和基于里氏木霉的纤维素酶组合物XCL-533的比较显示于图8。基于里氏木霉的纤维素酶组合物XCL-533在60℃显示不良性能，而两种高温酶组合物由50℃至60℃的温度增加而显著激活。含有烟曲霉Cel7ACBHI的高温酶组合物在60℃的表现与基于里氏木霉的纤维素酶组合物XCL-533在其50℃的最适温度的表现一样良好，需要大约3.5mg蛋白每g纤维素以在72小时实现80%纤维素至葡萄糖的转化。对于基于嗜热毛壳菌Cel7ACBHI的组合物，在60℃实现相同程度的纤维素转化所需的蛋白加载量为4.5mg蛋白每g纤维素。
实施例43：在50℃和60℃基于烟曲霉Cel7ACBHI的高温酶组合物与基于里氏木霉的纤维素酶组合物SaMe-MF268相比较的水解时程
在50℃和60℃使用磨制的、洗涤的PCS作为底物在较长温育时间(五日)比较基于烟曲霉Cel7ACBHI的高温酶组合物和基于里氏木霉的纤维素酶组合物SaMe-MF268(XCL-533)的水解性能。基于烟曲霉Cel7ACBHI的酶组合物含有45%烟曲霉Cel7ACBHI，25%嗜热毁丝霉Cel6ACBHII，5%里氏木霉Cel7BEGI，5%嗜热毁丝霉Cel5AEGII，5%具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，5%具有纤维素分解增强活性的土生梭孢霉GH61E多肽，7.5%巴西青霉GH3Aβ-葡糖苷酶，和2.5%ThermobifidafuscaGH11木聚糖酶。将基于烟曲霉Cel7ACBHI的酶组合物和基于里氏木霉的纤维素酶组合物XCL-533在四种不同的蛋白加载量，2.0，3.0，3.5，和4.0mg蛋白每g纤维素进行测试。
测定如实施例34中所述进行。含5%磨制的、洗涤的PCS的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及在水解开始时的单次混合。
对于四种测试的蛋白加载之一(2mg蛋白每g纤维素)的时程水解结果显示于图9。对于其他三种蛋白加载量获得了类似的趋势(数据未显示)。基于里氏木霉的纤维素酶组合物XCL-533在60℃显示显著降低的性能，而基于烟曲霉Cel7ACBHI的酶组合物由50℃至60℃的温度增加而显著激活。
基于烟曲霉Cel7ACBHI的酶组合物在60℃和基于里氏木霉的纤维素酶组合物XCL-533在50℃的比较显示高温组合物在起初三日期间与基于里氏木霉的纤维素酶组合物XCL-533相比表现更佳，并在最后两日水解期间类似于基于里氏木霉的纤维素酶组合物XCL-533。基于烟曲霉Cel7ACBHI的酶组合物和基于里氏木霉的纤维素酶组合物XCL-533在相同的50℃的温度的比较显示高温组合物与基于里氏木霉的纤维素酶组合物XCL-533相比较，具有较慢但更稳定的葡萄糖累积率，导致在50℃的长期水解(5日)高温组合物的性能较佳。
实施例44：在50℃，55℃，和60℃就与基于烟曲霉Cel7ACBHI的高温酶组合物的协同作用衡量四种木聚糖酶
在50℃，55℃，和60℃使用磨制的、洗涤的PCS作为底物就与含有来自Cel7ACBHI的烟曲霉的高温酶组合物的协同作用测定棘孢曲霉GH10木聚糖酶II，烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，和ThermobifidafuscaGH11木聚糖酶。将木聚糖酶以10%(0.35mg蛋白每g纤维素)添加至恒定加载的高温酶组合物(3.5mg蛋白每g纤维素)。高温酶组合物含有45%烟曲霉Cel7ACBHI，25%嗜热毁丝霉Cel6ACBHII，5%里氏木霉Cel7BEGI，5%嗜热毁丝霉Cel5AEGII，5%具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，5%具有纤维素分解增强活性的土生梭孢霉GH61E多肽，和10%巴西青霉Cel3Aβ-葡糖苷酶。
测定如实施例34中所述进行。含5%磨制的、洗涤的PCS的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及在水解开始时的单次混合。
图10中所示的结果表明木聚糖酶和高温酶组合物之间可观的协同效应。在相等蛋白加载量(3.85mg蛋白每g纤维素)，所有含有木聚糖酶的酶组合物与未补充木聚糖酶的高温酶组合物相比较达成显著较高程度的纤维素转化。来自烟曲霉(xyn3)和褐孢长毛盘菌的GH10木聚糖酶与棘孢曲霉GH10木聚糖酶II和ThermobifidafuscaGH11木聚糖酶相比较显示较佳的性能。将两种最佳木聚糖酶添加至高温酶组合物在72小时与未补充的酶组合物(3.85mg蛋白每g纤维素)相比较，导致纤维素至葡萄糖的转化增加11-16%。
实施例45：在60℃就与高温酶组合物的协同作用衡量烟曲霉GH10木聚糖酶xyn3，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，和ThermobifidafuscaGH11木聚糖酶
在60℃使用洗涤的、磨制的PCS作为底物通过将不同的水平的每种木聚糖酶(1.25%，2.5%，5％，10％，和20%)添加至恒定加载的高温酶组合物(3mg蛋白每g纤维素)来进一步检查烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，和ThermobifidafuscaGH11木聚糖酶与含有烟曲霉Cel7ACBHI的高温酶组合物协同的能力。高温酶组合物含有45%烟曲霉Cel7ACBHI，25%嗜热毁丝霉Cel6ACBHII，5%里氏木霉Cel7BEGI，5%嗜热毁丝霉Cel5AEGII，5%具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，5%具有纤维素分解增强活性的土生梭孢霉GH61E多肽，和10%巴西青霉Cel3Aβ-葡糖苷酶。
测定如实施例34中所述进行。含5%磨制的、洗涤的PCS的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及在水解开始时的单次混合。结果显示于图11。
烟曲霉GH10xyn3和褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶表现类似，并与ThermobifidafuscaGH11木聚糖酶相比较显示较佳的PCS水解的增强。补充来自烟曲霉或褐孢长毛盘菌的GH10木聚糖酶的高温酶组合物与基于里氏木霉的纤维素酶组合物SaMe-MF268(XCL-533)相比在与磨制的、洗涤的PCS温育72小时之后显著地表现较佳。最佳添加水平对于烟曲霉GH10xyn3和褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶为约5％，而对于ThermobifidafuscaGH11木聚糖酶为约10%。如图11中所示，在60℃以仅5%的水平添加烟曲霉GH10xyn3或褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶之一至高温组合物将纤维素至葡萄糖的转化从65%增强至83％。相同加载量的基于里氏木霉的纤维素酶组合物XCL-533(3.15mg蛋白每g纤维素)在50℃产生纤维素至葡萄糖的73%的转化。
实施例46：含有烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶的基于烟曲霉Cel7A的高温酶组合物与基于里氏木霉的纤维素酶SaMe-MF268的比较
在三种不同的蛋白加载量，2.0，3.0，和4.0mg蛋白每g纤维素测试了含有烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶的高温酶组合物和基于里氏木霉的纤维素酶组合物SaMe-MF268(XCL-533)，并将高温酶组合物在60℃的蛋白加载概貌与基于里氏木霉的纤维素酶组合物XCL-533在50℃的蛋白加载概貌相比较。高温酶组合物含有45%烟曲霉Cel7ACBHI，25%嗜热毁丝霉Cel6ACBHII，5%里氏木霉Cel7BEGI，5%嗜热毁丝霉Cel5AEGII，5%具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，5%具有纤维素分解增强活性的土生梭孢霉GH61E多肽，5%巴西青霉Cel3Aβ-葡糖苷酶，和5%烟曲霉GH10xyn3。
测定如实施例34中所述进行。含5%磨制的、洗涤的PCS的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及在水解开始时的单次混合。结果显示于图12。
实验确认了含有烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶的改善的高温酶组合物显著地超越了基于里氏木霉的纤维素酶组合物XCL-533的性能。在60℃，高温酶组合物与基于里氏木霉的纤维素酶组合物XCL-533在50℃(3.80mg蛋白每g纤维素)相比较需要显著较低的蛋白加载量(2.75mg蛋白每g纤维素)以在72小时将80%的纤维素水解至葡萄糖。
实施例47：在洗涤的和未洗涤的PCS的水解中含有烟曲霉GH10xyn3或褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶的高温酶组合物与基于里氏木霉的纤维素酶SaMe-MF268的比较
使用磨制的、洗涤的和磨制的、未洗涤的PCS将含有来自烟曲霉(xyn3)的GH10木聚糖酶或来自褐孢长毛盘菌的GH10木聚糖酶之一的改善高温酶组合物的蛋白加载概貌与基于里氏木霉的纤维素酶组合物SaMe-MF268(XCL-533)的蛋白加载概貌相比较。高温酶组合物含有45%烟曲霉Cel7ACBHI，25%嗜热毁丝霉Cel6ACBHII，5%里氏木霉Cel7BEGI，5%嗜热毁丝霉Cel5AEGII，5%具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，5%具有纤维素分解增强活性的土生梭孢霉GH61E多肽，5%巴西青霉Cel3Aβ-葡糖苷酶，和5%GH10木聚糖酶。在五个不同的蛋白加载量，2.0，3.0，4.0，5.0，和6.0mg蛋白每g纤维素测试高温酶组合物和基于里氏木霉的纤维素酶组合物XCL-533。所有用高温酶组合物的反应在60℃进行，而所有用基于里氏木霉的纤维素酶组合物XCL-533的反应在50℃进行。
测定如实施例34中所述进行。含磨制的、洗涤的或磨制的、未洗涤的PCS的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。以5%总固形物使用洗涤的PCS，而以5%不溶性固形物使用未洗涤的PCS。所有反应重复进行三次，并涉及在水解开始时的单次混合。
结果显示于表2和图13A和13B。含有烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶或褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶的高温酶组合物显示类似的性能，需要类似的蛋白加载量实现相同的水平的纤维素至葡萄糖的转化。含有烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶或褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶的改善的高温酶组合物与基于里氏木霉的纤维素酶组合物XCL-533相比较对于洗涤的(A)和未洗涤的(B)PCS两者均有较佳表现。
表2：达到洗涤的和未洗涤的PCS的80%纤维素转化所需的蛋白加载量(mg蛋白每g纤维素)。温度：60℃，对于高温酶组合物，50℃，对于XCL-533.
组合物 洗涤的PCS 未洗涤的PCS
组合物 洗涤的PCS 未洗涤的PCS
XCL-533 3.6 4.9
含烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶的高温组合物 2.6 4.2
含褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶的高温组合物 2.5 4.2
实施例48：里氏木霉GH3和埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶对于高温酶组合物在60℃糖化磨制的、未洗涤的PCS的作用
如实施例34中所述在60℃衡量两种β-木糖苷酶，里氏木霉GH3β-木糖苷酶和埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶，增强由高温酶组合物水解磨制的、未洗涤的PCS的能力。将含磨制的、未洗涤的PCS(5%不溶性固体)的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及在水解开始时的单次混合。结果显示于图14A和14B。
高温酶组合物含有45%烟曲霉Cel7ACBHI，25%嗜热毁丝霉Cel6ACBHII，5%里氏木霉Cel7BEGI，5%嗜热毁丝霉Cel5AEGII，5%具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，5%具有纤维素分解增强活性的土生梭孢霉GH61E多肽，5%烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶，和5%巴西青霉Cel3Aβ-葡糖苷酶。在1％，2％，3.5％，5％，和10%替代水平对高温酶组合物(3mg总蛋白每g纤维素)补充里氏木霉GH3β-木糖苷酶和埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶，并将水解结果与不含β-木糖苷酶的高温酶组合物(0%替代水平)的结果相比较。
如图14A中所示，在高温酶组合物中里氏木霉GH3β-木糖苷酶和埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶的纳入将酶法产生的单体木糖的水平从大约0.5g/L(0%β-木糖苷酶替代)增加至大约2g/L。最佳替代水平对于里氏木霉GH3β-木糖苷酶为3.5%且对于埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶为1-2%。如图14B中所示，葡萄糖和纤维二糖的合并产量对于含有3.5%里氏木霉GH3β-木糖苷酶的混合物进一步增加1.5％，而对于埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶的混合物进一步增加2.5%。
这些结果表明两种β-木糖苷酶均提供了虽然小但显著的益处，即增加磨制的、未洗涤的PCS的纤维素和半纤维素转化至可溶性糖(葡萄糖，纤维二糖和木糖)的程度。在60℃埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶显示与里氏木霉GH3β-木糖苷酶相比略更具活性，在高温酶组合物非常低的替代水平(1-2%)使单体木糖水平增加大约1.5g/L(图14A)并使纤维素转化进一步增加2.5%(图14B)。
实施例49：在50-65℃在磨制的、未洗涤的PCS的糖化中衡量替代高温酶组合物中的CBHI组分四种纤维二糖水解酶I
在50℃，55℃，60℃，和65℃使用磨制的、未洗涤的PCS作为底物测试四种纤维二糖水解酶I蛋白替代高温酶组合物(3mg总蛋白每g纤维素)中CBHI组分的能力。高温酶组合物含有35%CBHI，25%嗜热毁丝霉Cel6ACBHII，15%桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，15%具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，5%烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶，和5%烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶。
将下述CBHI纤维素酶在高温酶组合物中测试：里氏木霉Cel7ACBHI，嗜热毛壳菌Cel7ACBHI，烟曲霉Cel7ACBHI，和桔橙嗜热子囊菌Cel7ACBHI。
测定如实施例34中所述进行。含磨制的、未洗涤的PCS(5%不溶性固体)的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及在水解开始时的单次混合。
如图15中所示，烟曲霉Cel7A在所有50℃至65℃的温度与其他纤维二糖水解酶I相比较表现较佳。嗜热毛壳菌Cel7A在整个温度范围内也表现良好，但与烟曲霉Cel7A相比较，纤维素转化至葡萄糖的程度较低。里氏木霉Cel7A在高于55℃的温度表现并不良好。不含CBM的桔橙嗜热子囊菌Cel7A在60℃和65℃显示令人注目的良好性能，但在较低温度(50℃和55℃)水解未洗涤的PCS中的纤维素的效率较低。
实施例50：在50-65℃在糖化磨制的、未洗涤的PCS中衡量替代高温酶组合物中的CBHII组分的四种纤维二糖水解酶II
在50℃，55℃，60℃，和65℃使用磨制的、未洗涤的PCS作为底物测试几种纤维二糖水解酶II蛋白替代高温酶组合物(3mg总蛋白每g纤维素)中的CBHII组分的能力。高温酶组合物含有35%烟曲霉Cel7ACBHI，25%CBHII，15%桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，15%具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，5%烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶，和5%烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶。
将下述CBHII纤维素酶在高温酶组合物中测试：嗜热毁丝霉Cel6ACBHII，土生梭孢霉Cel6ACBHII，烟曲霉Cel6ACBHII，和褐孢长毛盘菌Cel6ACBHII。
测定如实施例34中所述进行。含磨制的、未洗涤的PCS(5%不溶性固体)的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及在水解开始时的单次混合。
如图16中所示，在所有温度来自烟曲霉的CBHII的表现与来自嗜热毁丝霉的CBHII大致相同，仅在60-65℃显示略较低的水解。土生梭孢霉Cel6ACBHII在整个温度范围具有高热稳定性，并性能良好，但与嗜热毁丝霉Cel6ACBHII相比较，纤维素转化至葡萄糖的程度较低。褐孢长毛盘菌Cel6ACBHII在50-55℃具有高活性，但在更高温度性能并不良好。
实施例51：在50-65℃在磨制的、未洗涤的PCS的糖化中衡量替代高温酶组合物中的内切葡聚糖酶组分的两种内切葡聚糖酶I
在50℃，55℃，60℃，和65℃使用磨制的、未洗涤的PCS作为底物测试两种内切葡聚糖酶I蛋白替代高温酶组合物(3mg总蛋白每g纤维素)中的内切葡聚糖酶组分的能力。高温酶组合物含有35%烟曲霉Cel7ACBHI，25%嗜热毁丝霉Cel6ACBHII，15%EG纤维素酶，15%具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，5%烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶，和5%烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶。
将下述EGI在高温酶组合物中测试：里氏木霉Cel7BEGI和土曲霉Cel7EGI。
测定如实施例34中所述进行。含磨制的、未洗涤的PCS(5%不溶性固体)的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及在水解开始时的单次混合。
如图17中所示，在该温度范围中含有土曲霉Cel7EGI的高温酶组合物的性能与含有里氏木霉Cel7BEGI的高温酶组合物相比较显著较佳。
实施例52：在50-65℃在磨制的、未洗涤的PCS的糖化中衡量替代高温酶组合物中的内切葡聚糖酶组分的三种内切葡聚糖酶II
在50℃，55℃，60℃，和65℃使用磨制的、未洗涤的PCS作为底物测试三种内切葡聚糖酶II蛋白替代高温酶组合物(3mg总蛋白每g纤维素)中的内切葡聚糖酶组分的能力。高温酶组合物含有35%烟曲霉Cel7ACBHI，25%嗜热毁丝霉Cel6ACBHII，15%EG纤维素酶，15%具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，5%烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶，和5%烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶。
将下述EGII在高温酶组合物中测试：里氏木霉Cel5AEGII，嗜热毁丝霉Cel5AEGII，和桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII。
测定如实施例34中所述进行。含磨制的、未洗涤的PCS(5%不溶性固体)的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及在水解开始时的单次混合。
如图18中所示，所有的内切葡聚糖酶II蛋白在该温度范围内性能类似，其中嗜热毁丝霉Cel5AEGII的性能略佳于里氏木霉Cel5AEGII和桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII。
实施例53：在50-65℃在磨制的、未洗涤的PCS的糖化中衡量替代高温酶组合物中的β-葡糖苷酶组分的三种β-葡糖苷酶
在第一实验中，在50℃，55℃，和60℃使用磨制的、未洗涤的PCS作为底物在高温酶组合物中衡量三种β-葡糖苷酶，包括烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶，巴西青霉Cel3Aβ-葡糖苷酶，和黑曲霉Cel3β-葡糖苷酶。高温酶组合物含有45%烟曲霉Cel7ACBHI，25%土生梭孢霉Cel6ACBHII，5%里氏木霉Cel7BEGI，5%桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，5%具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，5%具有纤维素分解增强活性的土生梭孢霉GH61E多肽，5%烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶，和5%β-葡糖苷酶。以3.0mg总蛋白每g纤维素使用高温酶组合物。
测定如实施例34中所述进行。含磨制的、未洗涤的PCS(5%不溶性固体)的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及在水解开始时的单次混合。
图19中所示的结果表明所有三种β-葡糖苷酶在50℃和55℃性能大致相同，而在60℃黑曲霉Cel3β-葡糖苷酶与其他两种β-葡糖苷酶相比较显示略较低的水解。
在第二实验中，在四个温度，50℃，55℃，60℃，和65℃，使用磨制的、未洗涤的PCS作为底物在高温酶组合物中比较烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶和巴西青霉Cel3Aβ-葡糖苷酶。高温酶组合物含有35%烟曲霉Cel7ACBHI，25%嗜热毁丝霉Cel6ACBHII，15%桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，15%具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，5%β-葡糖苷酶，和5%烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶。以3.0mg总蛋白每g纤维素使用高温酶组合物。
测定如实施例34中所述进行。含磨制的、未洗涤的PCS(5%不溶性固体)的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及在水解开始时的单次混合。
图20中所示的结果表明来自烟曲霉和巴西青霉的Cel3Aβ-葡糖苷酶在该温度范围中性能大致相同。
实施例54：在50-65℃在磨制的、未洗涤的PCS的糖化中衡量替代高温酶组合物中的木聚糖酶组分的六种木聚糖酶
在50℃，55℃，60℃，和65℃使用磨制的、未洗涤的PCS作为底物测试六种木聚糖酶替代高温酶组合物(3mg总蛋白每g纤维素)中的木聚糖酶组分的能力。高温酶组合物含有35%烟曲霉Cel7ACBHI，25%嗜热毁丝霉Cel6ACBHII，15%桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，15%具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，5%烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶，和5%木聚糖酶。
将下述木聚糖酶在高温酶组合物中测试：棘孢曲霉GH10xynII木聚糖酶，烟曲霉GH10xyn3，褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶，ThermobifidafuscaGH11木聚糖酶，嗜松青霉GH10木聚糖酶，和土生梭孢霉GH10E木聚糖酶。
测定如实施例34中所述进行。含磨制的、未洗涤的PCS(5%不溶性固体)的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及在水解开始时的单次混合。
如图21中所示，来自嗜松青霉的GH10木聚糖酶在50℃至65℃的所有温度优于来自烟曲霉和褐孢长毛盘菌的GH10木聚糖酶。棘孢曲霉GH10和土生梭孢霉GH10E木聚糖酶在50℃和55℃与烟曲霉GH10和褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶性能大致相同，但在更高温度(60℃和65℃)性能并不良好。ThermobifidafuscaGH11在60℃和65℃性能相对良好，但与其他木聚糖酶相比较总体上纤维素转化至葡萄糖的程度较低。
实施例55：在50-65℃使用磨制的、未洗涤的PCS衡量具有纤维素分解增强活性的四种GH61多肽增强高温酶组合物的PCS水解活性的能力
使用磨制的、未洗涤的PCS在50℃，55℃，60℃，和65℃衡量四种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，桔橙嗜热子囊菌GH61A，土生梭孢霉GH61E，嗜松青霉GH61，和烟曲霉GH61B，增强高温酶组合物的PCS水解活性的能力。高温酶组合物含有35%烟曲霉Cel7ACBHI，25%嗜热毁丝霉Cel6ACBHII，15%桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，15%具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，5%烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶，和5%烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶。以3mg总蛋白每g纤维素使用高温酶组合物。
测定如实施例34中所述进行。含磨制的、未洗涤的PCS(5%不溶性固体)的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及在水解开始时的单次混合。
如图22中所示，所有四种GH61多肽显示显著的纤维素酶增强活性，其中在该温度范围内桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽在四种中为最有效的增强剂。含有桔橙嗜热子囊菌GH61A和土生梭孢霉GH61E多肽的高温酶组合物与含有嗜松青霉GH61和烟曲霉GH61B多肽的高温酶组合物相比较在更高温度(60℃和65℃)性能较佳。
实施例56：在50-65℃使用磨制的、未洗涤的PCS衡量具有纤维素分解增强活性的三种GH61多肽增强高温酶组合物的PCS水解活性的能力
使用磨制的、未洗涤的PCS在50℃，55℃，60℃，和65℃衡量具有纤维素分解增强活性的三种GH61多肽，桔橙嗜热子囊菌GH61A，土生梭孢霉GH61N，和青霉属spGH61A，增强高温酶组合物的PCS水解活性的能力。将高温酶组合物含有45%烟曲霉Cel7ACBHI，25%嗜热毁丝霉Cel6ACBHII，10%嗜热毁丝霉Cel5AEGII，10%GH61多肽，5%烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶，和5%烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶。将含有GH61多肽(3mg总蛋白每g纤维素)的酶组合物的结果与其中不添加GH61多肽的类似酶组合物(2.7mg总蛋白每g纤维素)的结果进行比较。
测定如实施例34中所述进行。含磨制的、未洗涤的PCS(5%不溶性固体)的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及在水解开始时的单次混合。
如图23中所示，所有的三种GH61多肽显示显著的纤维素酶增强活性，其中桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽在55-65℃最有效率，而土生梭孢霉GH61N多肽在50℃与桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽相比较性能略佳。含有青霉属菌种GH61A多肽的高温酶组合物在所有的四个温度(50-65℃)几乎与含有桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的高温酶组合物性能一样良好。土生梭孢霉GH61N多肽在50℃和55℃性能良好，但在更高温度(60℃和65℃)显示显著的性能衰退。
实施例57：在50-60℃以不同水平替代基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶的烟曲霉Cel7A纤维二糖水解酶I，嗜热毁丝霉Cel6A纤维二糖水解酶II，或其二元组合物水解磨制的、未洗涤的PCS
在50℃，55℃，和60℃使用磨制的、未洗涤的PCS作为底物在1-ml水解反应中测试含有烟曲霉β-葡糖苷酶和桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的基于里氏木霉菌株981-08-D4的纤维素酶，命名为基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶。将基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶单独或在与烟曲霉Cel7ACBHI(总蛋白的10%，20%，30%或40%)，嗜热毁丝霉Cel6ACBHII(总蛋白的10%或20%)，或者烟曲霉Cel7ACBHI和嗜热毁丝霉Cel6ACBHII两者(总蛋白的10%/10%，10%/20%，20%/10%，20%/20%，30%/10%，30%/20%，40%/20%)的混合物中使用。将桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽在所有的里氏木霉XCL-602组合物中的水平保持恒定在总蛋白的8%。将基于里氏木霉的酶组合物SaMe-MF268(XCL-533)亦纳入该实验中。将未替代的基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶和基于里氏木霉的XCL-533纤维素酶以及多种含有烟曲霉Cel7ACBHI和/或嗜热毁丝霉Cel6ACBHII的里氏木霉XCL-602组合物以3mg总蛋白每g纤维素使用。
测定如实施例34中所述进行。含50mg每ml的不溶性PCS的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及在水解开始时的单次混合。
图24中所示的结果表明未替代的基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶在所有的三个温度与未替代的基于里氏木霉的XCL-533纤维素酶相比较性能大致相同。在50℃和55℃，用烟曲霉Cel7ACBHI替代XCL-602纤维素酶中的10%，20%，或30%蛋白或用嗜热毁丝霉Cel6ACBHII替代XCL-602纤维素酶中的10%或20%蛋白对于在72小时的水解之后纤维素转化至葡萄糖的程度不具有显著作用。用烟曲霉Cel7ACBHI替代基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶中的40%蛋白在50℃和55℃对于纤维素转化至葡萄糖的程度具有负面作用。在60℃，用烟曲霉Cel7ACBHI(总蛋白的10-40%)或嗜热毁丝霉Cel6ACBHII(总蛋白的10-20%)替代基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶中的蛋白与未替代的基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶相比较在相同的蛋白加载量(3mg蛋白每g纤维素)显著地改善水解。用烟曲霉Cel7ACBHI或嗜热毁丝霉Cel6ACBHII的更高的替代水平与未替代的XCL-602纤维素酶相比较在60℃提供了更高的增强。
对于含有烟曲霉Cel7ACBHI和嗜热毁丝霉Cel6ACBHII两者的基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶组合物，最佳替代水平在50℃和55℃为10-20%烟曲霉Cel7ACBHI/10-20%嗜热毁丝霉Cel6ACBHII，而在60℃为40%烟曲霉Cel7ACBHI/20%嗜热毁丝霉Cel6ACBHII。
实施例58：在50-60℃用含有烟曲霉Cel7A纤维二糖水解酶I和嗜热毁丝霉Cel6A纤维二糖水解酶II，和进一步补充烟曲霉GH10xyn3和/或土生梭孢霉GH61E的基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶水解磨制的、未洗涤的PCS
在50℃，55℃和60℃使用磨制的、未洗涤的PCS作为底物在1-ml水解反应中测试含有烟曲霉Cel7A纤维二糖水解酶I和嗜热毁丝霉Cel6A纤维二糖水解酶II的基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶。将基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶单独(3.0mg蛋白每g纤维素)或用由烟曲霉Cel7ACBHI和嗜热毁丝霉Cel6ACBHII组成的不同的二元组合物(总蛋白的10%/10%或40%/20%)替代至3mg蛋白每g纤维素的总蛋白加载量使用。将桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽在所有的含有烟曲霉Cel7ACBHI和嗜热毁丝霉Cel6ACBHII的基于里氏木霉XCL-602的组合物中的水平保持恒定在总蛋白的8%。将含有烟曲霉Cel7ACBHI和嗜热毁丝霉Cel6ACBHII的基于里氏木霉XCL-602的组合物(3mg蛋白每g纤维素)进一步补充5%烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶(0.15mg蛋白每g纤维素)，5%土生梭孢霉GH61E多肽(0.15mg蛋白每g纤维素)，或由5%烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶和5%土生梭孢霉GH61E多肽组成的二元组合物(0.30mg蛋白每g纤维素)。为了比较，将未替代的基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶以3.15mg蛋白每g纤维素和3.3mg蛋白每g纤维素单独使用。
测定如实施例34中所述进行。含50mg每ml的不溶性PCS的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及在水解开始时的单次混合。
在图25A和25B中所示的结果表明将5%烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶和/或5%土生梭孢霉GH61E多肽添加至含有烟曲霉Cel7ACBHI和嗜热毁丝霉Cel6ACBHII基于里氏木霉XCL-602的组合物在所有的三个温度显著地改善水解性能，其中在一同添加烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶和土生梭孢霉GH61E多肽两者时获得非常大的改善。在该实验中最佳的基于XCL-602的组合物(用烟曲霉Cel7ACBHI替代10%和用嗜热毁丝霉Cel6ACBHII替代10%，以及进一步补充5%烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶和5%土生梭孢霉GH61E多肽的XCL-602)需要3.3mg蛋白每g纤维素以在55℃在72小时的水解之后在磨制的、未洗涤的PCS中达成82%的纤维素至葡萄糖的转化。这代表与里氏木霉XCL-533(SaMe-MF268)相比较，蛋白加载量的1.5倍减少，所述里氏木霉XCL-533(SaMe-MF268)需要4.9mg蛋白每g纤维素以在50℃在72小时的水解之后在磨制的、未洗涤的PCS中达成80%纤维素至葡萄糖的转化(表2)。
实施例59：在50-60℃用含有不同的替代水平的基于里氏木霉的XCL-592纤维素酶的基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶组合物水解磨制的、未洗涤的PCS
将基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶(3.0mg蛋白每g纤维素)单独测试，或在与含有棘孢曲霉GH10木聚糖酶的基于里氏木霉RutC30的纤维素酶(命名为基于里氏木霉的XCL-592纤维素酶)的混合物中测试。将基于里氏木霉的XCL-592纤维素酶取代基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶中的5%，10%，15%，20%，或25%的蛋白至3mg蛋白每g纤维素的总蛋白加载量。在50℃，55℃和60℃使用磨制的、未洗涤的PCS作为底物在1-ml水解反应中测试未替代的基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶和基于XCL-602的酶组合物。为了比较，以4.5mg蛋白每g纤维素测试基于里氏木霉的XCL-533纤维素酶。
测定如实施例34中所述进行。含50mg每ml的不溶性PCS的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及在水解开始时的单次混合。
图26中所示的结果表明在50℃和55℃基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶用基于里氏木霉的XCL-592纤维素酶的最佳替代水平为10%至15%的总蛋白。在50℃和55℃，最佳的基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶组合物的性能在相同的蛋白加载量(3mg蛋白每g纤维素)与基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶单独相比显著地更佳，但无法达到用基于里氏木霉的XCL-533纤维素酶在4.5mg蛋白每g纤维素获得的性能水平。
实施例60：用具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A和土生梭孢霉GH61EGH61多肽替代基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶或基于XCL-602的酶组合物中5%的蛋白在50-60℃在磨制的、未洗涤的PCS的水解中的比较
在50-60℃使用磨制的、未洗涤的PCS作为底物将基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶单独测试，和用具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽或具有纤维素分解增强活性的土生梭孢霉GH61E多肽的5%替代进行测试。此外，测试含有30%烟曲霉Cel7ACBHI，20%嗜热毁丝霉Cel6ACBHI,I和5%桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶组合物与类似的含有土生梭孢霉GH61E多肽而非桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的组合物的比较。所有组合物以3mg蛋白每g纤维素测试。
测定如实施例34中所述进行。含50mg每ml的不溶性PCS的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及在水解开始时的单次混合。
如图27A中所示，用土生梭孢霉GH61E多肽替代基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶中的5%蛋白相对于用桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的等同替代未提供优势。类似地，如图27B中所示，用土生梭孢霉GH61E多肽替代基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶中的5%蛋白以及用烟曲霉Cel7ACBHI的30%替代和用嗜热毁丝霉Cel6ACBHII的20%替代，相对于用桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的等同替代未提供优势。将每个GH61多肽在六种不同的5%至20%的替代水平范围进行测试，其结论对于所有的替代水平都是一致的(数据未显示)。结果表明在这些条件下土生梭孢霉GH61E多肽与桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽并无协同作用。
实施例61：在50-60℃含有不同的替代水平的具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A或土生梭孢霉GH61EGH61多肽的基于XCL-602的酶组合物在磨制的、未洗涤的PCS的水解中的比较
在50-60℃使用磨制的、未洗涤的PCS作为底物在六个不同的替代水平(5%，7.5%，10%，12.5%，15%，和20%)在不同的基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶组合物中分别测试具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A和土生梭孢霉GH61EGH61多肽。在一种情况下，基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶组合物包含不同的替代水平的GH61多肽以及用烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶的5%替代。在另一种情况下，基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶组合物包含不同的替代水平的GH61多肽以及用烟曲霉Cel7ACBHI的30%替代，用嗜热毁丝霉Cel6ACBHII的20%替代，和用烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶的5%替代。所有的酶组合物在3mg总蛋白每g纤维素进行测试。为了比较，基于里氏木霉的XCL-533纤维素酶在4.5mg蛋白每g纤维素进行测试。
测定如实施例34中所述进行。含50mg每ml的不溶性PCS的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及在水解开始时的单次混合。
示于表3中的结果表明对于两种GH61多肽在50℃和55℃的最佳替代水平为在基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶组合物中总蛋白的10-12.5%。在60℃，对于两种GH61多肽的最佳替代水平为在基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶组合物中总蛋白的20%。在类似的基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶组合物中相等的替代水平的桔橙嗜热子囊菌GH61A和土生梭孢霉GH61E多肽在50-60℃在磨制的、未洗涤的PCS中提供了类似的纤维素水解的增强。
表3：在50-60℃含有不同的替代水平的桔橙嗜热子囊菌GH61A或土生梭孢霉GH61E多肽的基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶组合物在磨制的、未洗涤的PCS的水解中的比较
实施例62：在50-60℃用未替代的XCL-602和多种基于XCL-602的酶组合物(3mg蛋白每g纤维素)与基于里氏木霉的XCL-533纤维素酶(4.5mg蛋白每g纤维素)水解磨制的、未洗涤的PCS的比较
除了仅在单个替代水平(总蛋白的10%)测试一种GH61多肽(桔橙嗜热子囊菌GH61A)之外使用相同的基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶组合物重复了实施例61。将基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶和所有基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶组合物以3mg总蛋白每g纤维素使用。
测定如实施例34中所述进行。含50mg每ml的不溶性PCS的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及在水解开始时的单次混合。
图28A中所示的结果表明用包含5%烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶和10%桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的组合物替代基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶至3mg蛋白每g纤维素的总蛋白加载量在所有的三个温度与未替代的基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶相比较显著地改善水解产量。如图27B中所示，在进一步用30%烟曲霉Cel7ACBHI和20%嗜热毁丝霉Cel6ACBHII替代基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶时，增强甚至更加显著。图28B中所示的结果表明用30%烟曲霉Cel7ACBHI和20%嗜热毁丝霉Cel6ACBHII替代基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶在60℃在72小时的水解之后将纤维素转化至葡萄糖的程度从37%增加至48%。与用未替代的基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶获得的37%相比较，用烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶的进一步的5%替代将纤维素转化至葡萄糖的程度增加至58%，以及用桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的进一步的10%替代将纤维素转化至葡萄糖的程度增加至68％。在3mg蛋白每g纤维素，包含用烟曲霉Cel7ACBHI30%替代、用嗜热毁丝霉Cel6ACBHII20%替代、用烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶5%替代和用桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽10%替代的XCL-602纤维素酶的最佳的基于XCL-602的酶组合物，能够在55℃达成与在4.5mg蛋白每g纤维素和50℃的未替代的基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶相同的磨制的、未洗涤的PCS的纤维素转化(76%)—蛋白加载量的1.5倍减少。
实施例63：埃默森青霉菌株NN051602GH7纤维二糖水解酶I的制备
根据下文中所述的步骤获得埃默森青霉菌株NN051602Cel7纤维二糖水解酶I(SEQIDNO:157[DNA序列]和SEQIDNO:158[推定的氨基酸序列])。
将埃默森青霉在PDA琼脂平板上在45℃生长3日。将菌丝体直接从琼脂平板收集入经灭菌的研钵，并在液氮下冻结。将冻结的菌丝体用杵和研钵粉碎至细微粉末，并使用PlantMiniKit(QIAGENInc.，Valencia，CA，USA)分离基因组DNA。
设计如下文所示的寡核苷酸引物以从埃默森青霉的基因组DNA扩增GH7纤维二糖水解酶I基因。使用IN-FUSIONTMCFDry-downCloningKit(ClontechLaboratories，Inc.，MountainView，CA，USA)以将片段直接克隆入表达载体pPFJO355，无需进行限制性消化和连接。
有义引物：
5’-ACACAACTGGGGATCCACC-3’(SEQIDNO:207)
反义引物：
5’-GTCACCCTCTAGATCT-3’(SEQIDNO:208)
粗体字母代表编码序列(对于有义引物)或编码区的下游序列(对于反义引物)。剩余序列与pPFJO355的插入位点同源。
将二十皮摩尔的上述每种引物用于PCR反应，其包含埃默森青霉基因组DNA，10μl的5XGC缓冲液，1.5μl的DMSO，各2.5mM的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP，和0.6单位的PhusionTMHigh-FidelityDNAPolymerase，其终体积为50μl。使用PeltierThermalCycler进行扩增，其程序如下：变性在98℃进行1分钟；8个循环，每循环在98℃变性15秒，在65℃退火30秒，其中每循环降低1℃，和在72℃延伸80秒；和另一个23个循环，每循环在98℃进行15秒，66℃进行30秒和72℃进行75秒；最终在72℃延伸7分钟。然后加热块进入4℃浸泡循环。
通过使用90mMTris-硼酸和1mMEDTA(TBE)缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中从凝胶切出大约1.4kb产物条带，并使用 PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。
质粒pPFJO355用BamI和BglII消化，通过使用TBE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。
将基因片段和消化的载体使用IN-FUSIONTMCFDry-downPCRCloning连接在一起，得到pGH7_ZY209383，其中埃默森青霉GH7纤维二糖水解酶I基因的转录处于来自米曲霉α-淀粉酶的基因的米曲霉TAKA淀粉酶启动子的调控之下。克隆操作根据生产商的指示。简言之，将30ng用BamI和BglII消化的pPFJO355，和60ng的埃默森青霉GH7纤维二糖水解酶I基因纯化的PCR产物添加至反应小瓶，并添加去离子水将粉末重悬于终体积10ul。将反应在37℃温育15分钟，然后50℃温育15分钟。使用五μl的反应物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。通过菌落PCR检测含有pGH7_ZY209383的大肠杆菌转化体，并使用QIAprepSpinMiniprepKit(QIAGENInc.，Valencia，CA，USA)制备质粒DNA。pGH7_ZY209383中的埃默森青霉GH7纤维二糖水解酶I基因插入物通过使用3730XLDNAAnalyzer的DNA测序确认。
米曲霉HowB101(WO95/35385)原生质体根据Christensen等，1988，Bio/Technology6：1419-1422的方法制备，并用3μg的pGH7_ZY209383转化。转化产生约50转化体。将十二个转化体分离至单个基本培养基平板。
将四个转化体分别接种入在24孔板中的3ml的YPM培养基，并在30℃，150rpm温育。在3日温育之后，通过SDS-PAGE使用4-12%Bis-TrisGel用MES缓冲液根据生产商的指示分析来自每个培养的20μl的上清。将所得凝胶用Blue染色。培养物的SDS-PAGE概貌显示大多数的转化体具有大约50kDa的主要的不清晰条带(smearyband)。表达菌株命名为米曲霉EXP03477。
将米曲霉EXP03477的斜面用10ml的YPM培养基洗涤，并接种入含有400ml的YPM培养基的2升烧瓶以生成用于酶表征的培养液。将培养在第3日收获，并使用0.45μmDURAPORE膜(Millipore，Bedford，MA，USA)过滤。
将米曲霉EXP03477的1600ml体积的过滤的培养液用硫酸铵(80%饱和)沉淀，重新溶解于100ml的25mMBis-TrispH6.5缓冲液，对相同的缓冲液透析，并通过0.45μm过滤器过滤；最终体积为200ml。将溶液施于用25mMBis-TrispH6.5平衡的40mlQFastFlow柱，并将蛋白用线性NaCl梯度(0-0.4M)洗脱。收集具有针对PASC的活性的级分，并施于在含1.8M(NH4)2SO4的20mMPBSpH7缓冲液中平衡的40mlPhenylSepharoseTMHIC柱(GEHealthcare，Piscataway，NJ，USA)，并用20mMPBSpH7洗脱蛋白。将具有针对磷酸溶胀的纤维素(PASC)具有活性的来自柱的级分作为底物通过使用4-12%Bis-Tris凝胶的SDS-PAGE用MES缓冲液分析。汇集具有正确分子量的级分。然后汇集的溶液通过超滤浓缩。蛋白浓度使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例64：嗜松青霉菌株NN046877GH7纤维二糖水解酶I的制备
根据下文中所述的步骤获得嗜松青霉菌株NN046877Cel7纤维二糖水解酶II(SEQIDNO:159[DNA序列]和SEQIDNO:160[推定的氨基酸序列])。
将嗜松青霉在PDA琼脂平板上在37℃生长4-5日。将菌丝体直接从琼脂平板收集入经灭菌的研钵，并在液氮下冻结。将冻结的菌丝体用杵和研钵粉碎至细微粉末，并使用PlantMiniKit分离基因组DNA。
设计如下文所示的寡核苷酸引物以从嗜松青霉的基因组DNA扩增GH7纤维二糖水解酶I基因。使用IN-FUSIONTMCFDry-downCloningKit(ClontechLaboratories，Inc.，MountainView，CA，USA)以将片段直接克隆入表达载体pPFJO355，无需进行限制性消化和连接。
有义引物：
5’-ATGTCTGCCTTGAACTCTTTC-3’(SEQIDNO:209)
反义引物：
5’-TCACAAACATTGAGAGTAGTAAGGGTT-3’(SEQIDNO:210)
粗体字母代表编码序列，而剩余序列与pPFJO355的插入位点同源。
将二十皮摩尔的上述每种引物用于PCR反应，其包含嗜松青霉基因组DNA，10μl的5XGC缓冲液，1.5μl的DMSO，各2.5mM的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP，和0.6单位的PhusionTMHigh-FidelityDNAPolymerase，其终体积为50μl。使用PeltierThermalCycler进行扩增，其程序如下：在98℃变性1分钟；5个循环，每循环在98℃变性15秒，在56℃退火30秒，其中增加每循环升高1℃，和在72℃延伸75秒；和另一个25个循环，每循环在98℃进行15秒，65℃进行30秒和72℃进行75秒；最终在72℃延伸10分钟。然后加热块进入4℃浸泡循环。
将反应产物通过使用90mMTris-硼酸和1mMEDTA(TBE)缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，其中从凝胶切出大约1.6kb产物条带，并使用 PCRDNA和GelBandPuificationKit根据生产商的指示纯化。
质粒pPFJO355用BamI和BglII消化，通过使用TBE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。
将基因片段和消化的载体使用IN-FUSIONTMCFDry-downPCRCloning连接在一起，得到pPpin6，其中嗜松青霉GH7纤维二糖水解酶I基因的转录处于米曲霉TAKA淀粉酶启动子的调控之下。简言之，将30ng用BamI和BglII消化的pPFJO355，和100ng的嗜松青霉GH7纤维二糖水解酶I基因纯化的PCR产物添加至反应小瓶，并通过添加去离子水重悬至终体积10μl。将反应在37℃温育15分钟，然后50℃温育15分钟。使用三μl的反应物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。通过菌落PCR检测含有pPpin6的大肠杆菌转化体，并使用QIAprepSpinMiniprepKit(QIAGENInc.，Valencia，CA，USA)制备质粒DNA。pPpin6中的嗜松青霉GH7纤维二糖水解酶I基因插入物通过使用3730XLDNAAnalyzer的DNA测序确认。
米曲霉HowB101(WO95/35385)原生质体根据Christensen等，1988，Bio/Technology6：1419-1422的方法制备，并用3μg的pPpin6转化。转化产生约50个转化体。将四个转化体分离至单个基本培养基平板。
将四个转化体分别接种入在24孔板中的3ml的YPM培养基，并在30℃，150rpm温育。在3日温育之后，通过使用4-12%Bis-Tris凝胶的SDS-PAGE用MES缓冲液根据生产商的指示分析来自每个培养的20μl的上清。将所得凝胶用Blue染色。培养物的SDS-PAGE概貌显示大多数的转化体具有大约60-90kDa的主要的不清晰条带。表达菌株命名为米曲霉EXP02768。
将米曲霉EXP02768的斜面用10ml的YPM培养基洗涤，并接种入含有400ml的YPM培养基的2升烧瓶以生成用于酶表征的培养液。将培养在第3日收获，并使用0.45μmDURAPORE膜(Millipore，Bedford，MA，USA)过滤。
将米曲霉EXP02768的1600ml体积的过滤的培养液用硫酸铵(80%饱和)沉淀，重新溶解于100ml的25mMBis-TrispH6.0，对相同的缓冲液透析，并通过0.45μm过滤器过滤；最终体积为200ml。将溶液施于在25mMBis-TrispH6.0中平衡的40mlQFastFlow柱，并用线性NaCl梯度(0-0.4M)洗脱蛋白。通过使用4-12%Bis-TrisGel及MES缓冲液的SDS-PAGE分析具有针对pNP-β-D-乳糖吡喃糖苷的活性的来自柱的级分。汇集具有正确分子量的级分并通过超滤浓缩。蛋白浓度使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例65：土曲霉ATCC28865GH7纤维二糖水解酶I的制备
根据下文中所述的步骤获得土曲霉ATCC28865GH7纤维二糖水解酶I(SEQIDNO:161[DNA序列]和SEQIDNO:162[推定的氨基酸序列])。
设计如下文所示的两种合成寡核苷酸引物以从土曲霉ATCC28865基因组DNAPCR扩增纤维二糖水解酶I基因。使用FastDNASpinforSoilKit(MPBiomedicals，OH，USA)分离基因组DNA。
引物#222：
5′-TAAGAATTCACCATGCCTTCCACCTACGA-3′(SEQIDNO:211)
引物#302：
5’-TATGCGGCCGCATTCTCCTAGACACCCCGCAT-3’(SEQIDNO:212)
扩增反应包含1μl的土曲霉基因组DNA，12.5μl的2XREDDYMIXTMPCR缓冲液(ThermoFisherScientificInc.，Waltham，MA，USA)，1μl的5μM引物#222，1μl的5μM引物#302，和9.5μl的H2O。将扩增反应在PTC-200DNAENGINETMThermalCycler中温育，其程序如下：1个循环，在94℃进行2分钟；和35个循环，每循环在94℃进行15秒和60℃进行1.5分钟。
将1.7kbPCR反应产物通过使用TAE缓冲液的1%琼脂糖凝胶电泳分离，并用SYBRSafeDNA凝胶染料(InvitrogenCorp.，Carlsbad，CA，USA)染色。以EagleEyeImagingSystem和DarkReaderTransilluminator(ClareChemicalResearch，Dolores，CO，USA)协助显影DNA条带。将1.7kbDNA条带从凝胶切出，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。
将1.7kb片段用EcoRI和NotI切割，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。
然后将切割的1.7kb片段通过使用T4连接酶(Promega，Madison，WI，USA)根据生产商的指示连接入EcoRI-NotI切割的pXYG1051(WO2005/080559)进行定向克隆。将连接混合物根据生产商的指示转化入大肠杆菌TOP10F感受态细胞。将转化混合物铺板于补充100μg每ml的氨苄青霉素的LB平板。从几个转化体制备质粒小量制备物，并测序。选择一个具有正确土曲霉GH7编码序列的质粒。将质粒命名为pXYG1051-NP003568。
将表达质粒pXYG1051-NP003568如WO98/00529中所述转化入米曲霉JaL355。在选择平板上通过单个分生孢子纯化转化体，然后将其在PDA平板上进行孢子形成。从1ml96深孔静止培养的培养上清在26℃在含2%麦芽糊精的YP培养基中分析土曲霉GH7多肽通过转化体的产生。表达通过使用 4-12%Bis-TrisGel及MES缓冲液的SDS-PAGE和考马斯蓝染色验证。选择一个转化体进行进一步研究，并命名为米曲霉64.1。
对于更大规模的生产，将米曲霉64.1孢子铺板于PDA平板上，并在37℃温育五日。将汇合的孢子平板用5ml的0.01%20洗涤两次以最大化收集的孢子数。然后将孢子悬液用于接种二十五个含有100ml的YPG培养基的500ml烧瓶。将培养在30℃以120rpm恒速振荡温育。在接种后第四天，培养液通过藉由1.6μm，1.2μm，和0.7μm的三层Whatman玻璃微纤维过滤器的过滤收集。来自该转化体的新鲜培养液产生大约55kDa的GH7蛋白条带。通过肽测序验证该条带作为土曲霉GH7多肽的同一性。
将两升的过滤的培养液浓缩至400ml，并用50mMHEPESpH7.0使用具有10kDaMW-CO(SartoriusStedimBiotechS.A.，AubagneCedex，France)的Alpha超滤系统洗涤。将硫酸铵添加至1M的终浓度，并溶解于超滤过物。将溶液施于Source15PhenylXK26/2050ml柱(GEHealthcare，Denmark)。在施用之后，将柱用150ml的1M硫酸铵洗涤，并用1柱体积的50%乙醇以0%至100%梯度接着5柱体积50%乙醇以10ml/分钟的流速洗脱。收集10ml的级分，并通过SDS-PAGE分析。将级分3至8汇集并用50mMHEPESpH7.0稀释至1000ml，然后施于QFastFlow柱XK26/2060ml柱(GEHealthcare，Denmark)。在施用之后，将柱用60ml的50mMHEPESpH7.0洗涤3次，并用100ml的50mMHEPESpH7.0，1MNaCl以10ml/分钟的流速洗脱。收集10ml的级分，并通过SDS-PAGE分析。将流过物和第一洗涤物汇集，并浓缩至400ml，并用50mMHEPESpH7.0使用如上所述的超滤系统洗涤。进一步浓缩使用VIVASPINTM离心浓缩器根据生产商的指示进行，至80ml的最终体积。蛋白浓度通过A280/A260吸光度确定。蛋白浓度亦使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例66：费希新萨托菌菌株NRRL181GH7纤维二糖水解酶I的制备
根据下文中所述的步骤获得费希新萨托菌NRRL181GH7纤维二糖水解酶I(SEQIDNO:163[DNA序列]和SEQIDNO:164[推定的氨基酸序列])。
设计如下文所示的两种合成寡核苷酸引物以从费希新萨托菌基因组DNAPCR扩增纤维二糖水解酶I基因。基因组DNA使用FastDNASpinforSoilKit分离。
引物#374：
5′-TAAGAATTCACCATGCCTTCCACCTACGA-3′(SEQIDNO:213)
引物#375：
5’-TATGCGGCCGCATTCTCCTAGACACCCCGCAT-3’(SEQIDNO:214)
扩增反应包含1μl的费希新萨托菌基因组DNA，12.5μl的2XREDDYMIXTMPCR缓冲液，1μl的5μM引物#374，1μl的5μM引物#375，和9.5μl的H2O。将扩增反应在PTC-200DNAENGINETMThermalCycler中温育，其程序如下：1个循环，在94℃进行2分钟；和35个循环，每循环在94℃进行15秒和60℃进行1.5分钟。
将1.6kbPCR反应产物通过使用TAE缓冲液的1%琼脂糖凝胶电泳分离，并用SYBRSafeDNA凝胶染料染色。以EagleEyeImagingSystem和DarkReaderTransilluminator协助显影DNA条带。将1.6kbDNA条带从凝胶切出，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。
将1.6kb片段用EcoRI和NotI切割，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。
然后将切割的1.6kb片段通过使用T4连接酶根据生产商的指示连接入EcoRI-NotI切割的pXYG1051(WO2005/080559)进行定向克隆。将连接混合物根据生产商的指示转化入大肠杆菌TOP10F感受态细胞。将转化混合物铺板于补充100μg每ml的氨苄青霉素的LB平板。从几个转化体制备质粒小量制备物，并测序。选择具有正确费希新萨托菌GH7纤维二糖水解酶编码序列的质粒。将质粒命名为pXYG1051-NP003786。
将表达质粒pXYG1051-NP003786如WO98/00529中所述转化入米曲霉JaL355。将转化体在选择平板上纯化至单个分生孢子，然后将其在PDA平板上进行孢子形成。从1ml96深孔静止培养的培养上清在26℃在含2%麦芽糊精的YP培养基中分析费希新萨托菌GH7纤维二糖水解酶通过转化体的产生。表达通过使用4-12%Bis-TrisGel及MES缓冲液的SDS-PAGE和考马斯蓝染色验证。选择一个转化体进行进一步工作，并命名为米曲霉92.7。
对于更大规模的生产，将米曲霉92.7孢子铺板于PDA平板上，并在37℃温育五日。将汇合的孢子平板用5ml的0.01%20洗涤两次以最大化收集的孢子数。然后使用孢子悬液接种二十五个含有100ml的YPM培养基的500ml烧瓶。将培养物在26℃以120rpm恒速振荡温育。在接种后第五日，培养液通过藉由1.6μm，1.2μm，和0.7μm的三层Whatman玻璃微纤维过滤器的过滤收集。来自该转化体的新鲜培养液产生大约70kDa的GH7蛋白条带。通过肽测序验证该条带作为费希新萨托菌GH7纤维二糖水解酶的同一性。
将两升的过滤的培养液浓缩至400ml，并用50mMHEPESpH7.0使用具有10kDaMW-CO的Αlpha超滤系统洗涤。将硫酸铵添加至1M的终浓度，并溶解于超滤过物。将溶液施于Source15PhenylXK26/2050ml柱。在施用之后，将柱用150ml的1M硫酸铵洗涤，并用1柱体积的50%乙醇以0%至100%梯度接着用5柱体积50%乙醇以10ml/分钟的流速洗脱。收集10ml的级分，并通过SDS-PAGE分析。将级分3至8汇集并用50mMHEPESpH7.0稀释至1000ml，然后施于QFastFlowXK26/2060ml柱(GEHealthcare，Denmark)。在施用之后，将柱用60ml的50mMHEPESpH7.0洗涤3次，并用100ml的50mMHEPESpH7.0，1MNaCl以10ml/分钟的流速洗脱。收集10ml的级分，并通过SDS-PAGE分析。将流过物和第一洗涤物汇集，并浓缩至400ml，并用50mMHEPESpH7.0使用具有10kDaMW-CO的Αlpha超滤系统洗涤。进一步浓缩使用VIVASPINTM离心浓缩器根据生产商的指示进行，至80ml的最终体积。蛋白浓度通过A280/A260吸光度确定。蛋白浓度亦使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例67：构巢曲霉菌株FGSCA4GH7纤维二糖水解酶I的制备
根据下文中所述的步骤获得构巢曲霉菌株FGSCA4GH7纤维二糖水解酶I(SEQIDNO:165[DNA序列]和SEQIDNO:166[推定的氨基酸序列])。
设计如下文所示的两种合成寡核苷酸引物以从构巢曲霉基因组DNAPCR扩增纤维二糖水解酶I基因。基因组DNA使用FastDNASpinforSoilKit分离。
引物#376：
5′-TAACAATTGACCATGGCATCTTCATTCCAGTTGTA-3′(SEQIDNO:215)
引物#377：
5’-TATGCGGCCGCGTCTCCCATTTACGACCCACCA-3’(SEQIDNO:216)
扩增反应包含1μl的构巢曲霉基因组DNA，12.5μl的2XREDDYMIXTMPCR缓冲液，1μl的5μM引物#374，1μl的5μM引物#375，和9.5μl的H2O。将扩增反应在PTC-200DNAENGINETMThermalCycler中温育，其程序如下：1个循环，在94℃进行2分钟；和35个循环，每循环在94℃进行15秒和60℃进行1.5分钟。
将1.6kbPCR反应产物通过使用TAE缓冲液的1%琼脂糖凝胶电泳分离，并用SYBRSafeDNA凝胶染料染色。以EagleEyeImagingSystem和DarkReaderTransilluminator协助显影DNA条带。将1.6kbDNA条带从凝胶切出，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。
将1.6kb片段用MfeI和NotI切割，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。
然后将切割的1.6kb片段通过使用T4连接酶根据生产商的指示连接入EcoRI-NotI切割的pXYG1051(WO2005/080559)进行定向克隆。将连接混合物根据生产商的指示转化入大肠杆菌TOP10F感受态细胞。将转化混合物铺板于补充100μg每ml的氨苄青霉素的LB平板。从几个转化体制备质粒小量制备物，并测序。选择具有构巢曲霉GH7编码序列的质粒。鉴定出在PCR过程中导入的两个突变，其导致相对于公共序列Q8NK02，Leu7变为Trp，而Glu436变为Gly。将质粒命名为pXYG1051-NP003787。
将表达质粒pXYG1051-NP003787如WO98/00529中所述转化入米曲霉JaL355。将转化体在选择平板上纯化至单个分生孢子，然后将其在PDA平板上进行孢子形成。从1ml96深孔静止培养的培养上清在26℃在含2%麦芽糊精的YP培养基中分析构巢曲霉GH7纤维二糖水解酶通过转化体的产生。表达通过使用4-12%Bis-TrisGel及MES缓冲液的SDS-PAGE和考马斯蓝染色验证。选择一个转化体进行进一步工作，并命名为米曲霉70.5。
对于更大规模的生产，将米曲霉70.5孢子铺板于PDA平板上，并在37℃温育五日。将汇合的孢子平板用5ml的0.01%20洗涤两次以最大化收集的孢子数。然后使用孢子悬液接种二十五个含有100ml的YPM培养基的500ml烧瓶。将培养物在26℃以120rpm恒速振荡温育。在接种后第六日，培养液通过藉由1.6μm，1.2μm，和0.7μm的三层Whatman玻璃微纤维过滤器的过滤收集。来自该转化体的新鲜培养液产生大约54kDa的GH7蛋白条带。通过肽测序验证该条带作为构巢曲霉GH7纤维二糖水解酶的同一性。
将两升的过滤的培养液浓缩至400ml，并用50mMHEPESpH7.0使用具有10kDaMW-CO的Αlpha超滤系统洗涤。将硫酸铵添加至1M的终浓度，并溶解于超滤过物。将溶液施于Source15PhenylXK26/2050ml柱。在施用之后，将柱用150ml的1M硫酸铵洗涤，并用1柱体积的50%乙醇以0%至100%梯度接着用5柱体积50%乙醇以10ml/分钟的流速洗脱。收集10ml的级分，并通过SDS-PAGE分析。将级分3至8汇集并用50mMHEPESpH7.0稀释至1000ml，然后施于QFastFlowXK26/2060ml柱。在施用之后，将柱用60ml的50mMHEPESpH7.0洗涤3次，并用100ml的50mMHEPESpH7.0，1MNaCl以10ml/分钟的流速洗脱。收集10ml的级分，并通过SDS-PAGE分析。将流过物和第一洗涤物汇集，并浓缩至400ml，并用50mMHEPESpH7.0使用具有10kDaMW-CO的Αlpha超滤系统洗涤。进一步浓缩使用VIVASPINTM离心浓缩器根据生产商的指示进行，至80ml的最终体积。蛋白浓度通过A280/A260吸光度确定。蛋白浓度亦使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例68：Fennellianivea菌株NN046949GH6纤维二糖水解酶II的制备
根据下文中所述的步骤获得Fennellianivea菌株NN046949GH6纤维二糖水解酶II(SEQIDNO:167[DNA序列]和SEQIDNO:168[推定的氨基酸序列])。
Fennellianivea菌株NN046949通过直接将土壤样品铺板于PDA平板接着在37℃温育5日从来自中国云南的土壤分离。然后通过将菌丝体转移至YG琼脂平板上来纯化菌株。基于形态学和分子(ITS测序)表征将Fennellianivea菌株NN046949鉴定为Fennellianivea。
将Fennellianivea菌株NN046949接种于PDA平板上，并在37℃在黑暗中温育4日。将几个菌丝体-PDA栓接种入含有100ml的NNCYP-PCS培养基的500ml摇瓶。将烧瓶在37℃以160rpm振荡温育6日。在第4，5，和6日收集菌丝体，并分别冻结于液氮，并储藏于-80℃冷冻箱中直至使用。
混合冻结的F.nivea菌丝体，并转移入液氮预冷的杵和研钵，并粉碎至细微粉末。从每日的粉末菌丝体通过用试剂提取制备总RNA，并使用PlantMiniKit根据生产商的实验方案纯化。使用mTRApTMTotalKit分离多聚A富集的RNA。对八十七μg的总RNA进行如实施例3中所述的测序。
将用mRNASeq实验方案富集多聚A序列的总RNA使用GA2System(Illumina，Inc.，SanDiego，CA，USA)进行测序。装配原始的75个碱基对读码，并使用供基因发现和功能预测的标准生物信息学方法分析装配序列。简言之，使用ESTscan2.0进行基因预测。使用NCBIblastall版本2.2.10和HMMER版本2.1.1以基于结构同源性预测功能。家族GH6纤维二糖水解酶直接通过分析Blast结果鉴定。
将Fennellianivea菌株NN046949在PDA琼脂平板上在37℃生长3日。将菌丝体直接从琼脂平板收集入灭菌的研钵，并在液氮下冻结。将冻结的菌丝体用杵和研钵粉碎至细微粉末，并使用PlantMiniKit(QIAGENInc.，Valencia，CA，USA)分离基因组DNA。
基于在实施例3中获得的F.niveaGH6纤维二糖水解酶基因序列，设计如下文所示的寡核苷酸引物以从Fennellianivea的基因组DNA扩增该基因。使用IN-FUSIONTMCFDry-downPCRCloningKit以将片段直接克隆入表达载体pPFJO355，无需进行限制性消化和连接。
有义引物：
5’-acacaactggggatcCACC-3’(SEQIDNO:217)
反义引物：
5′-GTCACCCTCTAGATCT-3′(SEQIDNO:218)
粗体字母代表有义引物的编码序列或反义引物的终止密码子下游的反向互补序列。剩余序列与pPFJO355的插入位点同源。
将二十皮摩尔的上述每种引物用于PCR反应，其包含Fennellianivea基因组DNA，10μl的5XGC缓冲液，1.5μl的DMSO，2μl的各2.5mM的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP，和1单位的PhusionTMHigh-FidelityDNAPolymerase，其终体积为50μl。使用PeltierThermalCycler进行扩增，其程序如下：在98℃变性1分钟；5个循环，每循环在98℃变性15秒，在70℃退火30秒，其中每循环降低1℃，和在72℃延伸30秒；25个循环，每循环在98℃进行15秒和72℃进行90秒；和在72℃最终延伸10分钟。然后加热块进入4℃浸泡循环。
通过使用TBE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中从凝胶切出大约1.8kb产物条带，并使用ILLUSTRATMGFXTMPCRDNA和GelBandPurificationKit(GEHealthcare，Buckinghamshire，UK)根据生产商的指示纯化。
质粒pPFJO355用BamI和BglII消化，通过使用TBE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，并使用ILLUSTRATMGFXTMPCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。将基因片段和消化的载体使用IN-FUSIONTMDryDownPCRCloningKit连接在一起，得到pCBHII46949-2，其中FennellianiveaGH6纤维二糖水解酶基因的转录处于米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子的调控之下。简言之，将30ng用BamI和BglII消化的pPFJO355，和50ng的F.niveaGH6纤维二糖水解酶基因纯化的PCR产物添加至反应小瓶，并通过添加去离子水重悬至终体积为10μl。将反应在37℃温育15分钟，然后50℃温育15分钟。使用三μl的反应物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。通过菌落PCR检测含有pCBHII46949-2的大肠杆菌转化体，并使用QIAprepSpinMiniprepKit(QIAGENInc.，Valencia，CA，USA)制备质粒DNA。pCBHII46949-2中的F.niveaGH6纤维二糖水解酶基因插入物通过使用3730XLDNAAnalyzer的DNA测序确认。
然后将相同基因片段在10XTaqDNA聚合酶混合物(TIANGENBiotech(Beijing)Co。Ltd.，Beijing，China)中在72℃温育20分钟以将腺嘌呤添加至每个核苷酸链的3’端。然后将该基因片段使用pGEM-TVectorSystem连接至pGEM-T载体以生成pGEM-T-CBHII46949-2。pGEM-T-CBHII46949-2中的Fennellianivea纤维二糖水解酶基因插入物通过使用3730XLDNAAnalyzer的DNA测序确认。将含有pGEM-T-CBHII46949-2的大肠杆菌菌株T-CBHII46949-2，于2010年10月28日，保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(DSMZ))，MascheroderWeg1B，D-38124Braunschweig，Germany，并分配登录号DSM24143。
就其品质审视核苷酸序列数据，并以PHRED/PHRAP软件(UniversityofWashington，Seattle，WA，USA)的协助相互比较所有的序列。
F.nivea纤维二糖水解酶基因的核苷酸序列和推定的氨基酸序列分别显示于SEQIDNO:167和SEQIDNO:168。基因组片段编码469个氨基酸的多肽，由49bp(核苷酸77-125)，247bp(核苷酸195-241)，46bp(核苷酸570-615)，55bp(核苷酸870-924)，50bp(核苷酸1063-1112)，46bp(核苷酸1371-1416)，和49bp(核苷酸1659-1707)的7个预期的内含子间隔。全长编码序列和成熟编码序列的%G+C含量分别为57.65%和60.24%。使用SignalP软件程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineering10：1-6)，预测了18个残基的信号肽。预测的成熟蛋白含有451个氨基酸，具有48.77kDa的预测的分子量和5.17的等电点。氨基酸112至469为家族6糖基水解酶的标识。基于推定的氨基酸序列，显示该纤维二糖水解酶属于根据Coutinho和Henrissat，1999，见上文的纤维二糖水解酶家族GH6。氨基酸22至50是CBM域的标识，而氨基酸58至111是接头区的标识。
米曲霉HowB101(WO95/35385)原生质体根据Christensen等，1988，Bio/Technology6：1419-1422的方法制备，并用3μg的pCBHII46949-2转化。转化产生约50个转化体。将四个转化体分离至单个基本培养基平板。
四种转化体分别接种入3ml的YPM培养基在中24-孔板，并温育在30℃，150rpm。在3日温育之后，来自每个培养20μl的上清通过使用 4-12%Bis-TrisGel及MES缓冲液的SDS-PAGE根据生产商的指示分析。将所得凝胶染色用INSTANTBLUETM(ExpedeonLtd.，BabrahamCambridge，UK)。培养物的SDS-PAGE概貌显示大多数的转化体具有大约60kDa的条带。选择一转化体作为表达菌株，并命名为米曲霉EXP03324。
将米曲霉EXP03324的斜面用10ml的YPM培养基洗涤，并接种入4个2升烧瓶，每个含有400ml的YPM培养基，以生成用于酶表征的培养液。通过将培养物针对(CALBIOCHEM，Inc。LaJolla，CA，USA)过滤在第3日收获培养物。然后使用0.45μmDURAPORE膜(Millipore，Bedford，MA，USA)将过滤的培养液再次过滤。
将米曲霉EXP03324的1600ml体积的过滤的培养液用硫酸铵(80%饱和)沉淀，重新溶解于100ml25mMBis-TrispH6.5缓冲液，对相同的缓冲液透析，并通过0.45μm过滤器过滤；最终体积为200ml。将溶液施于在25mMBis-TrispH6.5缓冲液中平衡的40mlQFastFlow柱，并将蛋白用线性0-0.4MNaCl梯度洗脱。来自该柱的级分通过使用4-12%Bis-TrisGel及MES缓冲液的SDS-PAGE分析。汇集具有60kDa的分子量的级分。然后将汇集的溶液通过超滤浓缩，并使用磷酸溶胀的纤维素(PASC)作为底物测定纤维二糖水解酶活性。蛋白浓度使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
PASC储备浆料溶液通过用水润湿5g的(JRSPharmaGmbH&Co.，Rosenberg，Germany)水，接着添加150ml的冰冷的85%正磷酸(o-phosphoricacid)来制备。将悬液在冰浴中缓慢搅拌1小时。然后将500ml的冰冷的丙酮伴以搅拌添加。将浆料使用过滤，然后用100ml的冰冷的丙酮洗涤三次(在每次洗涤之后尽可能排干)。最后，将过滤浆料用500ml的水洗涤两次，并再次在每次洗涤之后尽可能排干。将PASC与去离子水混合至500ml的总体积至10g/升的浓度，使用ULTRA-Homogenizer(Cole-Parmer，Vern在上Hills，IL，USA)混合至均匀，并储藏于冰箱中最多一个月。
将PASC储备溶液用50mM乙酸钠pH5.0缓冲液稀释至2g/升的浓度，并用作底物。向150μl的PASC储备溶液，添加20μl的酶样品，并将反应混合物以850rpm振荡温育60分钟。在温育结束时，添加50μl的2%NaOH以停止反应。将反应混合物以1,000xg离心。通过首先将10μl的反应混合物与90μl的0.4％NaOH混合，接着与50μl在2%NaOH中的1.5%对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH，SigmaChemicalCo.，St.Loius，MO，USA)混合来测量释放的糖。将混合物在100℃煮沸5分钟，然后将100μl转移至微滴定平板使用SpectraMaxM2(MolecularDevices，Sunnyvale，CA，USA)在410nm进行吸光度读数。通过在水解步骤中省略PASC，并通过在糖测定步骤用缓冲液替代水解物来制备空白。
测定结果表明纯化的酶具有纤维二糖水解酶活性。
实施例69：埃默森青霉菌株NN051602GH6A纤维二糖水解酶II的制备
根据下文中所述的步骤获得埃默森青霉菌株NN051602GH6A纤维二糖水解酶II(SEQIDNO:169[DNA序列]和SEQIDNO:170[推定的氨基酸序列])。
将埃默森青霉在PDA琼脂平板上在45℃生长3日。将菌丝体直接从琼脂平板收集入经灭菌的研钵，并在液氮下冻结。将冻结的菌丝体用杵和研钵粉碎至细微粉末，并使用PlantMiniKit(QIAGENInc.，Valencia，CA，USA)分离基因组DNA。
设计如下文所示的寡核苷酸引物以从埃默森青霉的基因组DNA扩增GH6纤维二糖水解酶II基因。使用IN-FUSIONTMCFDry-downCloningKit以将片段直接克隆入表达载体pPFJO355，无需进行限制性消化和连接。
有义引物：
5’-ACACAACTGGGGATCCACCA-3’(SEQIDNO:219)
反义引物：
5’-GTCACCCTCTAGATCT-3’(SEQIDNO:220)
粗体字母代表编码序列。剩余序列与pPFJO355的插入位点同源。
将二十皮摩尔的上述每种引物用于PCR反应，其包含埃默森青霉基因组DNA，10μl的5XHF缓冲液，1.5μl的DMSO，各5mM的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP，和0.6单位的PhusionTMHigh-FidelityDNAPolymerase，其终体积为50μl。使用PeltierThermalCycler进行扩增，其程序如下：在98℃变性1分钟；8个循环，每循环在98℃变性15秒，在66℃退火30秒，其中每循环降低1℃，和在72℃延伸70秒；和另一个25个循环，每循环在98℃进行15秒，62℃进行30秒和72℃进行80秒；在72℃最终延伸5分钟。然后加热块进入4℃浸泡循环。
通过使用TBE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中从凝胶切出大约1.8kb产物条带，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。
质粒pPFJO355用BamI和BglII消化，通过使用TBE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。
将基因片段和消化的载体使用IN-FUSIONTMCFDry-downPCRCloning连接在一起，得到pCBHII51602，其中埃默森青霉GH6纤维二糖水解酶II基因的转录处于米曲霉TAKA淀粉酶启动子的调控之下。简言之，将30ng用BamI和BglII消化的pPFJO355，和60ng的埃默森青霉GH6纤维二糖水解酶II基因纯化的PCR产物添加至反应小瓶，并通过添加去离子水重悬至终体积为10μl。将反应在37℃温育15分钟，然后50℃温育15分钟。使用三μl的反应物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。通过菌落PCR检测含有pCBHII51602的大肠杆菌转化体，并使用QIAprepSpinMiniprepKit(QIAGENInc.，Valencia，CA，USA)制备质粒DNA。pCBHII51602中的埃默森青霉GH6纤维二糖水解酶II基因插入物通过使用3730XLDNAAnalyzer的DNA测序确认。
米曲霉HowB101(WO95/35385)原生质体根据Christensen等，1988，Bio/Technology6：1419-1422的方法制备，并用3μg的pCBHII51602转化。转化产生约50个转化体。将十二个转化体分离至单个基本培养基平板。
将六个转化体分别接种入在24-孔板中的3ml的YPM培养基，并在30℃，150rpm温育。在3日温育之后，将来自每个培养的20μl的上清通过使用 4-12%Bis-TrisGel及MES缓冲液的SDS-PAGE根据生产商的指示分析。将所得凝胶用Blue染色。培养物的SDS-PAGE概貌显示大多数的转化体具有大约62kDa的主要的不清晰条带。将表达菌株命名为米曲霉EXP03259。
将米曲霉EXP03259的斜面用10ml的YPM培养基洗涤，并接种入含有400ml的YPM培养基的2升烧瓶以生成用于酶表征的培养液。将培养在第3日收获，并使用0.45μmDURAPORE膜过滤。
将米曲霉EXP03259的1600ml体积的过滤的培养液用硫酸铵(80%饱和)沉淀，重新溶解于100ml的25mMBis-TrispH6.0，对相同的缓冲液透析，并通过0.45μm过滤器过滤；最终体积为200ml。将溶液施于用25mMBis-TrispH6.0平衡的40mlQFastFlow柱，并将蛋白用线性NaCl梯度(0-0.4M)洗脱。通过使用4-12%Bis-TrisGel及MES缓冲液的SDS-PAGE分析具有针对PASC活性的来自柱的级分。汇集具有正确分子量的级分并通过超滤浓缩。蛋白浓度使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例70：嗜松青霉菌株NN046877GH6A纤维二糖水解酶II的制备
根据下文中所述的步骤获得嗜松青霉菌株NN046877GH6A纤维二糖水解酶II(SEQIDNO:171[DNA序列]和SEQIDNO:172[推定的氨基酸序列])。
将嗜松青霉在PDA琼脂平板上在37℃生长4-5日。将菌丝体直接从琼脂平板收集入经灭菌的研钵，并在液氮下冻结。将冻结的菌丝体用杵和研钵粉碎至细微粉末，并使用PlantMiniKit(QIAGENInc.，Valencia，CA，USA)分离基因组DNA。
设计如下文所示的寡核苷酸引物以从嗜松青霉的基因组DNA扩增GH6纤维二糖水解酶II基因。使用IN-FUSIONTMCFDry-downCloningKit以将片段直接克隆入表达载体pPFJO355，无需进行限制性消化和连接。
有义引物：
5’-ATGTTGCGATATCTTTCCACC-3’(SEQIDNO:221)
反义引物：
5’-TCATCTAGACCAAAGCTGGGTTG-3’(SEQIDNO:222)
粗体字母代表编码序列，而剩余序列与pPFJO355的插入位点同源。
将二十皮摩尔的上述每种引物用于PCR反应，其包含嗜松青霉基因组DNA，10μl的5XGC缓冲液，1.5μl的DMSO，各2.5mM的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP，和0.6单位的PhusionTMHigh-FidelityDNAPolymerase，其终体积为50μl。使用PeltierThermalCycler进行扩增，其程序如下：在98℃变性1分钟；5个循环，每循环在98℃变性15秒，在56℃退火30秒，其中每循环增加1℃，和在72℃延伸75秒；和另一个25个循环，每循环在98℃进行15秒，65℃进行30秒和72℃进行75秒；在72℃最终延伸10分钟。然后加热块进入4℃浸泡循环。
通过使用TBE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中从凝胶切出大约1.7kb产物条带，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。
质粒pPFJO355用BamI和BglII消化，分离通过使用TBE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳，并纯化使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示。
将基因片段和消化的载体使用IN-FUSIONTMCFDry-downPCRCloning连接在一起，得到pPpin12，其中嗜松青霉GH6纤维二糖水解酶II基因的转录处于米曲霉TAKA淀粉酶启动子的调控之下。简言之，将30ng用BamI和BglII消化的pPFJO355，和60ng的嗜松青霉GH6纤维二糖水解酶II基因纯化的PCR产物添加至反应小瓶，并添加去离子水重悬至终体积为10ul。将反应在37℃温育15分钟，然后50℃温育15分钟。使用三μl的反应物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。通过菌落PCR检测含有pPpin12的大肠杆菌转化体，并使用QIAprepSpinMiniprepKit制备质粒DNA。pPpin12中的嗜松青霉GH6纤维二糖水解酶II基因插入物通过使用3730XLDNAAnalyzer的DNA测序确认。
米曲霉HowB101(WO9535385)原生质体根据Christensen等，1988，Bio/Technology6：1419-1422的方法制备，并用3μg的pPpin12转化。转化产生约50个转化体。将四个转化体分离至单个基本培养基平板。
将四个转化体分别接种入在24-孔板中的3ml的YPM培养基，并在30℃，150rpm温育。在3日温育之后，将来自每个培养的20μl的上清通过使用 4-12%Bis-TrisGel及MES缓冲液的SDS-PAGE根据生产商的指示分析。将所得凝胶用Blue染色。培养物的SDS-PAGE概貌显示大多数的转化体具有大约65kDa的主要条带。将表达菌株命名为米曲霉EXP02774。
将米曲霉EXP02774的斜面用10ml的YPM培养基洗涤，并接种入含有400ml的YPM培养基的2升烧瓶以生成用于酶表征的培养液。将培养在第3日收获，并使用0.45μmDURAPORE膜过滤。
将米曲霉EXP02774的1600ml体积的过滤的培养液用硫酸铵(80%饱和)沉淀，重新溶解于100ml25mMBis-TrispH6.0，对相同的缓冲液透析，并通过0.45μm过滤器过滤；最终体积为200ml。将溶液施于在25mMBis-TrispH6.0中平衡的40mlQFastFlow柱，并将蛋白用线性NaCl梯度(0-0.4M)洗脱。收集具有针对PASC活性的来自柱的级分，并施于在25mMBis-TrispH6.0中平衡的40mlSPFastFlow柱，并将蛋白用线性NaCl梯度(0–0.4M)洗脱。通过使用4-12%Bis-TrisGel及MES缓冲液的SDS-PAGE分析具有针对PASC活性的来自柱的级分。汇集具有正确分子量的级分并通过超滤浓缩。蛋白浓度使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例71：烟曲霉菌株NN051616GH5内切葡聚糖酶II的制备
根据下文中所述的步骤获得烟曲霉菌株NN051616GH5内切葡聚糖酶II(SEQIDNO:173[DNA序列]和SEQIDNO:174[推定的氨基酸序列])。
设计如下文所示的两种合成寡核苷酸引物以从基因组DNACR扩增烟曲霉家族GH5基因。使用IN-FUSIONTMCloningKit以将片段直接克隆入表达载体，pAILo2(WO2005/074647)，无需进行限制性消化和连接。
正向引物：
5’-ACTGGATTTACC-3′(SEQIDNO:223)
反向引物：
5’-TCACCTCTAGTTAATTAA-3’(SEQIDNO:224)
粗体字母代表编码序列。剩余序列与pAlLo2的插入位点同源。
将十五皮摩尔的上述每种引物用于PCR反应，其含有200ng的烟曲霉基因组DNA，1XPfx扩增缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，1mMMgSO4，1.5μl的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP的10mM混合物，2.5单位的PfxDNAPolymerase(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，其终体积为50μl。扩增条件为一个循环，在98℃进行3分钟；和30个循环，每循环在98℃进行30秒，57℃进行30秒，和72℃进行75秒。然后将加热块维持在72℃进行15分钟，接着进行4℃浸泡循环。
使用TAE缓冲液在1.0%琼脂糖凝胶上分离反应产物，并从凝胶切出2.4kb产物条带，并使用GelExtractionKit(QIAGENInc.，Valencia，CA)根据生产商的指示纯化。
然后将片段使用IN-FUSIONTMCloningKit克隆入pAlLo2。将载体用NcoI和PacI消化。将片段通过凝胶电泳和QIAquickKit(QIAGENInc.，Valencia，CA，USA)纯化。将基因片段和消化的载体在反应中合并在一起，得到表达质粒pAG10，其中烟曲霉家族GH5基因的转录处于NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶的基因的启动子的杂合体)的调控之下。重组反应(20μl)包含1XIIN-FUSIONTM缓冲液(Clontech，MountainView，CA)，1XBSA(Clontech，MountainView，CA)，1μl的IN-FUSIONTM酶(1∶10稀释的)(Clontech，MountainView，CA)，180ng的用NcoI和PacI消化的pAlLo2，和80ng的烟曲霉β-木糖苷酶纯化的PCR产物。将反应在环境温度温育30分钟。将反应物用40μl的TE缓冲液稀释，并使用2.5μl的稀释反应物转化大肠杆菌Gold细胞。通过限制酶消化鉴定含有pAG10(烟曲霉家族GH5基因)的大肠杆菌转化体，并使用QIAGENBioRobot9600制备质粒DNA。pAG10质粒构建体使用AppliedBiosystems3130xlGeneticAnalyzer(AppliedBiosystems，FosterCity，CA，USA)测序以验证序列。
米曲霉JaL355原生质体根据Christensen等，1988，Bio/Technology6：1419-1422的方法制备，并用5μg的pAG10转化。将三个转化体分离至单个PDA平板。
将从三个转化体的每个的原始转化平板取的栓分别添加至24孔板中的1ml的M410培养基，将其在34℃温育。在五日温育之后，使用无染色，8-16%梯度SDS-PAGE，(Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)根据生产商的指示分析来自每个培养的7.5μl的上清。培养物的SDS-PAGE概貌显示转化体具有大约35kDa的新的主要条带。
将最高表达转化体的汇合的PDA平板用5ml的0.01%20洗涤，并接种入三个500mlErlenmeyer烧瓶，每个含有100ml的M410培养基。将接种的烧瓶在34℃振荡温育3日。将培养液汇集，并通过0.22μmStericup吸滤器(Millipore，Bedford，MA，USA)过滤。
35ml体积的过滤的培养液使用400mlSephadexG-25柱(GEHealthcare，UnitedKingdom)根据生产商的指示缓冲液交换至50mM乙酸钠pH5.0。蛋白浓度使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例72：费希新萨托菌菌株NRRL181GH5内切葡聚糖酶II的制备
根据下文中所述的步骤获得费希新萨托菌NRRL181GH5内切葡聚糖酶II(SEQIDNO:175[DNA序列]和SEQIDNO:176[推定的氨基酸序列])。
设计如下文所示的两种合成寡核苷酸引物以从费希新萨托菌NRRL181基因组DNAPCR扩增内切葡聚糖酶基因。使用FastDNASpinforSoilKit分离基因组DNA。
引物#350：
5′-TAAGAATTCACCATGAAGGCTTCGACTATTATCTGTGCA-3′(SEQIDNO:225)
引物#358：
5’-TATGCGGCCGCACGGCAATCCAAGTCATTCAA-3’(SEQIDNO:226)
扩增反应包含1μl的费希新萨托菌基因组DNA，12.5μl的2XREDDYMIXTMPCR缓冲液，1μl的5μM引物#374，1μl的5μM引物#375，和9.5μl的H2O。将扩增反应在PTC-200DNAENGINETMThermalCycler中温育，其程序如下：1个循环，在94℃进行2分钟；和35个循环，每循环在94℃进行15秒和60℃进行1.5分钟。
通过使用TAE缓冲液的1%琼脂糖凝胶电泳分离1.4kbPCR反应产物，并用SYBRSafeDNA凝胶染料染色。以EagleEyeImagingSystem和DarkReaderTransilluminator协助显影DNA条带。将1.4kbDNA条带从凝胶切出，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。
将1.4kb片段用EcoRI和NotI切割，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。
然后将切割的1.4kb片段通过使用T4连接酶根据生产商的指示连接入EcoRI-NotI切割的pXYG1051(WO2005/080559)进行定向克隆。将连接混合物根据生产商的指示转化入大肠杆菌TOP10F感受态细胞。将转化混合物铺板于补充100μg每ml的氨苄青霉素的LB平板。从几个转化体制备质粒小量制备物，并测序。选择一个具有正确费希新萨托菌GH5编码序列的质粒。
将表达质粒pXYG1051-NP003772如WO98/00529中所述转化入米曲霉JaL355。将转化体在选择平板上纯化至单个分生孢子，然后将其在PDA平板上进行孢子形成。从1ml96深孔静止培养的培养上清在26℃在含2%麦芽糊精的YP培养基中分析费希新萨托菌GH5多肽通过转化体的产生。通过使用4-12%Bis-TrisGel及MES缓冲液的SDS-PAGE和考马斯蓝染色验证表达。选择一个转化体进行进一步研究，并命名为米曲霉83.3。
对于更大规模的生产，将米曲霉83.3孢子铺板于PDA平板上，并在37℃温育五日。将汇合的孢子平板用5ml的0.01%20洗涤两次以最大化收集的孢子数。然后使用孢子悬液接种二十五个含有100ml的YPM培养基的500ml烧瓶。将培养物在26℃以120rpm恒速振荡温育。在接种后第五日，培养液通过藉由1.6μm，1.2μm，和0.7μm的三层Whatman玻璃微纤维过滤器的过滤收集。来自该转化体的新鲜培养液产生大约46kDa的GH7蛋白条带。通过肽测序验证该条带作为费希新萨托菌GH5多肽的同一性。
将两升的过滤的培养液浓缩至400ml，并用50mMHEPESpH7.0使用具有10kDaMW-CO的Αlpha超滤系统洗涤。将硫酸铵添加至1M的终浓度，并溶解于超滤过物。将溶液施于Source15PhenylXK26/2050ml柱。在施用之后，将柱用150ml的1M硫酸铵洗涤，并用1柱体积的50%乙醇以0%至100%梯度接着用5柱体积50%乙醇以10ml/分钟的流速洗脱。收集10ml的级分，并通过SDS-PAGE分析。将级分3至8汇集并用50mMHEPESpH7.0稀释至1000ml，然后施于QFastFlow柱XK26/2060ml柱。在施用之后，将柱用60ml的50mMHEPESpH7.0洗涤3次，并用100ml的50mMHEPESpH7.0，1MNaCl以10ml/分钟的流速洗脱。收集10ml的级分，并通过SDS-PAGE分析。将流过物和第一洗涤物汇集，并浓缩至400ml，并用50mMHEPESpH7.0使用如上所述的超滤系统洗涤。进一步浓缩使用VIVASPINTM离心浓缩器根据生产商的指示进行，至80ml的最终体积。蛋白浓度通过A280/A260吸光度确定。蛋白浓度亦使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例73：棘孢曲霉菌株WDCM190GH3β-葡糖苷酶的制备
根据下文中所述的步骤获得棘孢曲霉菌株WDCM190GH3β-葡糖苷酶(SEQIDNO:177[DNA序列]和SEQIDNO:178[推定的氨基酸序列])。
为了生成基因组DNA以供PCR扩增，将棘孢曲霉WDCM190通过在26℃生长7日在PDA琼脂平板上进行繁殖。将从PDA平板收获的孢子接种入在带挡板的摇瓶中的25ml的YP+2%葡萄糖培养基，并在26℃以200rpm搅拌温育48小时。
根据修饰的SPIN实验方案(Qbiogene，Inc.，Carlsbad，CA，USA)分离基因组DNA。简言之，将SpinKitforSoil(Qbiogene，Inc.，Carlsbad，CA，USA)在24HomogenizationSystem(MPBiosciences，SantaAna，CA，USA)中使用。将两ml的真菌材料通过在14,000xg进行离心2分钟来收获。移出上清并将沉淀重悬于500μl的去离子水。将悬液转移至LysingMatixE管(Qbiogene，Inc.，Carlsbad，CA，USA)，并将790μl的磷酸钠缓冲液和来自SpinKit的100μl的MT缓冲液添加至管。然后将样品固定于Instrument(Qbiogene，Inc.，Carlsbad，CA，USA)并以5.5m/秒的速度继续处理60秒。然后将样品以14000xg进行两分钟离心，并将上清转移至干净的管。添加来自SpinKit的250μl体积的PPS试剂，然后样品通过倒置轻柔地混合。再次将样品以14000xg进行离心5分钟。将上清转移至15ml管，接着来自SpinKit的1ml的BindingMatrix悬液，然后通过倒置混合两分钟。将样品置于静止管架，并允许二氧化硅基质沉降3分钟。移出500μl体积的上清并弃去，然后将剩余样品重悬于基质。然后将样品转移至来自SpinKit的SPIN过滤管，并以14000xg进行离心1分钟。将接收管倒空，并将剩余基质悬液添加至SPIN过滤管。将样品再次离心(14000xg，1分钟)。将来自SpinKit的500μl体积的SEWS-M溶液添加至SPIN过滤管，并将样品以相同速度离心1分钟。将接收管倒空，并将SPIN过滤管重置于接收管。将单元在14000xg进行离心2分钟以“干燥”残余SEWS-M洗涤溶液的基质。将SPIN过滤管置于新鲜接收管中，并允许在室温进行风干5分钟。将基质用移液尖轻柔地重悬于100μl的DES(无DNA酶/热原的水)。将单元离心(14000xg，1分钟)以洗脱基因组DNA，接着通过再次在14000xg离心1分钟用100μl的10mMTris，0.1mMEDTA，pH8.0洗脱，并合并洗脱物。通过UV分光光度计在260nm测量从接收管收获的DNA的浓度。
使用如下文所示的两个克隆引物GH3-8f和GH3-8r通过PCR来分离棘孢曲霉Cel3β-葡糖苷酶基因，所述引物基于公众可获得的棘孢曲霉Cel3mRNA序列(GenbankD64088.1)设计以供通过IN-FUSIONTM策略直接克隆。
引物GH3-8f：
5’-acacaactggggatccaccatgaagctcagggcttgaggcgg-3’(SEQIDNO:227)
引物GH3-8r：
5’-agatctcgagaagcttattgcaccttcgggagcgccgcgtgaag-3’(SEQIDNO:228)
PCR反应用从棘孢曲霉菌株(IAM2445；WDCM190)制备的基因组DNA进行以供扩增全长基因。PCR反应包含1μl的基因组DNA，0.75μl的引物GH3-8f(10μM)，0.75μl的引物GH3-8r(10μM)，3μl的5XHF缓冲液，0.25μl的50mMMgCl2，0.3μl的10mMdNTP，0.15μl的DNA聚合酶，和PCR级水多至15μl。PCR反应使用PCR仪进行，其程序如下：在98℃进行2分钟，接着10个降落循环，每循环在98℃进行15秒，70℃(-1℃/循环)进行30秒，和72℃进行2分30秒；和25个循环，每循环在98℃进行15秒，60℃进行30秒，72℃进行2分30秒，和在72℃进行5分钟。
通过使用TAE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中从凝胶切出大约2.9kbPCR产物，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。将对应于棘孢曲霉Cel3β-葡糖苷酶基因的DNA根据生产商的指示使用IN-FUSIONTMDry-DownPCRCloningKit克隆入用BamHI和HindIII直链化的表达载体pDAu109(WO2005042735)。
使用2.5μl体积的稀释的连接混合物转化大肠杆菌TOP10化学感受态细胞。在含有100μg每ml的氨苄青霉素LB琼脂平板上选择三个菌落，并在补充100μg每ml的氨苄青霉素的3ml的LB培养基中培养过夜。使用PlasmidMiniKit根据生产商的指示纯化质粒DNA。在异源表达之前将棘孢曲霉Cel3β-葡糖苷酶基因序列通过Sanger测序验证。
编码序列为2940bp，包括终止密码子，并由73bp(核苷酸58至130)，52bp(核苷酸274至325)，57bp(核苷酸371至427)，61bp(核苷酸481至541)，64bp(核苷酸1734至1797)，和50bp(核苷酸2657至2706)的6个内含子间隔。编码的预测的蛋白为860个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineering10：1-6)，预测了19个残基的信号肽。预测的成熟蛋白含有841氨基酸。
米曲霉BECh2(WO2000/39322)的原生质体如WO95/02043中所述制备。将一百微升的原生质体悬液与2.5-15μg的曲霉属表达载体混合，并添加250μl的60%PEG4000(ApplichemInc.Omaha，NE，USA)(聚乙二醇，分子量4,000)，10mMCaCl2，和10mMTris-HClpH7.5，并轻柔地混合。将混合物在37℃温育30分钟，并将原生质体涂布于补充10mM乙酰胺和15mMCsCl的COVE蔗糖(1M)平板以供转化体选择。在37℃温育4-7日之后，将几个转化体的孢子接种于YP-2%麦芽糊精培养基上。在30℃培养4日之后分析培养液以供基于其产生大量活性棘孢曲霉Cel3β-葡糖苷酶的能力鉴定最佳转化体。如本文中实施例16中所述，筛选基于对应于通过SDS-PAGE确定的异源表达的蛋白的条带强度和对4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)的酶活性。
将指明为最佳转化体的孢子涂布于含有0.01%X-100的COVE平板以供分离单个菌落。铺板在含有1M蔗糖和10mM硝酸钠，补充10mM乙酰胺和15mMCsCl的COVE蔗糖培养基(Cove，1996，Biochim.Biophys.Acta133：51-56)上总共重复两次。然后在250ml摇瓶中使用YP-2%麦芽糊精培养基在30℃以100rpm振荡实施发酵4日。培养液使用标准方法过滤。蛋白浓度使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例74：川地曲霉菌株IFO4308GH3β-葡糖苷酶的制备
根据下文中所述的步骤获得川地曲霉菌株IFO4308GH3β-葡糖苷酶(SEQIDNO:179[DNA序列]和SEQIDNO:180[推定的氨基酸序列])。
为了生成基因组DNA进行PCR扩增，将真菌通过在26℃生长7日在PDA琼脂平板上进行繁殖。使用从PDA平板收获的孢子接种在带挡板的摇瓶中的25ml的YP+2%葡萄糖培养基，并在26℃以200rpm搅拌温育48小时。
基因组DNA根据描述于实施例73的步骤分离。
将川地曲霉β-葡糖苷酶基因通过PCR使用如下文所示的两个克隆引物GH3-33f和GH3-33r分离，所述引物基于公众可获得的川地曲霉全长序列(GenBankAB003470.1)设计以供通过IN-FUSIONTM策略直接克隆。
引物GH3-33f：
acacaactggggatccaccatgaggttcactttgattgaggcgg(SEQIDNO:229)
引物GH3-33r：
agatctcgagaagcttaGTGAACAGTAGGCAGAGACGCCCGGAGC(SEQIDNO:230)
PCR反应用从川地曲霉IFO4308制备的基因组DNA进行以供扩增全长基因。PCR反应包含1μl的基因组DNA，0.75μl的引物GH3-33f(10μM)，0.75μl的引物GH3-33r(10μM)，3μl的5XHF缓冲液，0.25μl的50mMMgCl2，0.3μl的10mMdNTP，0.15μl的DNA聚合酶，和PCR级水加至15μl。PCR反应使用PCR仪进行，其程序如下：在98℃进行2分钟，接着10个降落循环，每循环在98℃进行15秒，在70℃(-1℃/循环)进行30秒，和72℃进行2分30秒；和25个循环，每循环在98℃进行15秒，60℃进行30秒，72℃进行2分30秒，和在72℃进行5分钟。
通过使用TAE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中从凝胶切出大约2.9kbPCR产物，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。将对应于川地曲霉β-葡糖苷酶基因的DNA使用IN-FUSIONTMDry-DownPCRCloningKit根据生产商的指示克隆入用BamHI和HindIII直链化的表达载体pDAu109(WO2005042735)。
使用2.5μl体积的稀释的连接混合物转化大肠杆菌TOP10化学感受态细胞。在含有100μg每ml的氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择了三个菌落，并在补充100μg每ml的氨苄青霉素的3ml的LB培养基中培养过夜。使用PlasmidMiniKit根据生产商的指示纯化质粒DNA。在异源表达之前将川地曲霉β-葡糖苷酶基因序列通过Sanger测序验证。
编码序列为2935bp，包括终止密码子，并由92bp(核苷酸58至149)，48bp(核苷酸293至340)，54bp(核苷酸386至439)，51bp(核苷酸493至543)，57bp(核苷酸1736至1792)，和50bp(核苷酸2652至2701)的6个内含子间隔。编码的预测的蛋白为860个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineering10：1-6)，预测了19个残基的信号肽。预测的成熟蛋白含有841个氨基酸。
米曲霉BECh2(WO2000/39322)的原生质体如WO95/02043中所述制备。将一百微升的原生质体悬液与2.5-15μg的曲霉属表达载体混合，并添加250μl的60%PEG4000，10mMCaCl2，和10mMTis-HClpH7.5，并轻柔地混合。将混合物在37℃温育30分钟，并将原生质体涂布于补充10mM乙酰胺和15mMCsCl的COVE蔗糖(1M)平板以供转化体选择。在37℃温育4-7日之后将几个转化体的孢子接种于YP-2%麦芽糊精培养基上。在30℃培养4日之后分析培养液以供基于其产生大量活性川地曲霉β-葡糖苷酶的能力鉴定最佳转化体。如本文中实施例16所述，筛选基于对应于通过SDS-PAGE确定的异源表达的蛋白的条带强度，和对4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)的酶活性。
将最佳转化体的孢子涂布于含有0.01%X-100的COVE平板以供分离单个菌落。将铺板在含有1M蔗糖和10mM硝酸钠，补充10mM乙酰胺和15mMCsCl的COVE蔗糖培养基(Cove，1996，Biochim.Biophys.Acta133：51-56)上总共重复两次。然后在250ml摇瓶中使用YP-2%麦芽糊精培养基在30℃以100rpm振荡实施发酵4日。将培养液使用标准方法过滤。蛋白浓度使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例75：棒曲霉菌株NRRL1GH3β-葡糖苷酶的制备
根据下文中所述的步骤获得棒曲霉菌株NRRL1GH3β-葡糖苷酶(SEQIDNO:181[DNA序列]和SEQIDNO:182[推定的氨基酸序列])。
基因组DNA根据描述于实施例73的步骤分离。
使用如下文所示的两个克隆引物，GH3-10f和GH3-10r通过PCR分离棒曲霉β-葡糖苷酶基因，所述引物基于公众可获得的棒曲霉部分mRNA序列(XM_001269581)设计以供通过IN-FUSIONTM策略直接克隆。
引物GH3-10f：
acacaactggggatccaccATGAGGTTCAGCTGGCTTGAGGTCG(SEQIDNO:231)
引物GH3-10r：
agatctcgagaagcttaCTGTACCCGGGGCAGAGGTGCTCTC(SEQIDNO:232)
PCR反应用从棒曲霉NRRL1制备的基因组DNA进行以供扩增全长基因。PCR反应包含1μl的基因组DNA，0.75μl的引物GH3-10f(10μM)，0.75μl的引物GH3-10r(10μM)，3μl的5XHF缓冲液，0.25μl的50mMMgCl2，0.3μl的10mMdNTP，0.15μl的DNA聚合酶，和PCR级水加至15μl。使用PCR仪进行PCR反应，其程序如下：在98℃进行2分钟，接着10个降落循环，在98℃进行15秒，70℃(-1℃/循环)进行30秒，和72℃进行2分30秒；和25个循环，每循环在98℃进行15秒，60℃进行30秒，72℃进行2分30秒，和在72℃进行5分钟。
通过使用TAE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中从凝胶切出大约3.0kbPCR产物，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。将对应于棒曲霉β-葡糖苷酶基因的DNA使用IN-FUSIONTMDry-DownPCRCloningKit根据生产商的指示克隆入用BamHI和HindIII直链化的表达载体pDAu109(WO2005042735)。
使用2.5μl体积的稀释的连接混合物转化大肠杆菌TOP10化学感受态细胞。在含有100μg每ml的氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择三个菌落，并在补充100μg每ml的氨苄青霉素的3ml的LB培养基中培养过夜。使用PlasmidMiniKit根据生产商的指示纯化质粒DNA。在异源表达之前将棒曲霉β-葡糖苷酶基因序列通过Sanger测序验证。
编码序列为3062bp，包括终止密码子，并由67bp(核苷酸58至124)，61bp(核苷酸265至325)，62bp(核苷酸371至432)，65bp(核苷酸489至553)，50bp(核苷酸948至997)，53bp(核苷酸1021至1073)，61bp(核苷酸1849至1909)，和60bp(核苷酸2769至2828)的8个内含子间隔。编码的预测的蛋白为860个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineering10：1-6)，预测了18个残基的信号肽。预测的成熟蛋白含有842个氨基酸。
米曲霉BECh2(WO2000/39322)的原生质体如WO95/02043中所述制备。将一百微升的原生质体悬液与2.5-15μg的曲霉属表达载体混合，并添加250μl的60%PEG4000，10mMCaCl2，和10mMTris-HClpH7.5，并轻柔地混合。将混合物在37℃温育30分钟，并将原生质体涂布于补充10mM乙酰胺和15mMCsCl的COVE蔗糖(1M)平板以供转化体选择。在37℃温育4-7日之后，将几个转化体的孢子接种于YP-2%麦芽糊精培养基上。在30℃培养4日之后，分析培养液以供基于其产生大量活性棒曲霉β-葡糖苷酶的能力鉴定最佳转化体。如实施例16中所述，筛选基于对应于通过SDS-PAGE确定异源表达的蛋白的条带强度和对4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)的酶活性。
将最佳转化体的孢子涂布于含有0.01%X-100的COVE平板以供分离单个菌落。将铺板在含有1M蔗糖和10mM硝酸钠，补充10mM乙酰胺和15mMCsCl的COVE蔗糖培养基(Cove，1996，Biochim.Biophys.Acta133：51-56)上总共重复两次。然后在250ml摇瓶中使用YP-2%麦芽糊精培养基在30℃以100rpm振荡实施发酵4日。培养液使用标准方法过滤。蛋白浓度使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例76：土生梭孢霉NRRL8126GH3β-葡糖苷酶的制备
根据下文中所述的步骤获得土生梭孢霉GH3β-葡糖苷酶(SEQIDNO:183[DNA序列]和SEQIDNO:184[推定的氨基酸序列])。
将在PDA平板上生长的来自土生梭孢霉NRRL8126培养的三个琼脂糖栓接种入补充1.5%葡萄糖的100ml的NNCYP培养基，并在42℃和200rpm在定轨振荡器上温育25小时。使用五十ml的该培养接种补充0.4%葡萄糖和52g每升的粉末纤维素的1.8升的NNCYP培养基，并在42℃温育。视需要通过添加15%氢氧化铵或5N磷酸将pH控制在5.0。
将发酵在42℃以在25%的最少溶解氧以1.0VVM空气流和以1100rpm搅拌运行。在0小时以6.0–8.0g/小时的给料率将补料培养基递送至2升发酵容器120个小时。将汇集培养物以3000xg离心10分钟，并将上清通过具有玻璃纤维预滤器(Nalgene，RochesterNY，USA)的可丢弃的过滤单元过滤。将滤过物冷却至4℃以供储藏。
将滤过物的0.3ml等分试样用10%三氯乙酸(TCA)-80%丙酮在冰上沉淀20分钟。将悬液在13,000xg离心10分钟。移出上清，并将剩余的蛋白沉淀用冷丙酮漂洗。将蛋白沉淀溶解于30μl含50mM二硫苏糖醇(DTT)的1X十二烷基硫酸锂(LDS)SDS-PAGE上样缓冲液，并在80℃加热10分钟。通过SDS-PAGE使用7cm4-12%NuPAGEBis-TrisSDS-PAGE梯度凝胶和2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)运行缓冲液分离15μl样品。将SDS-PAGE在还原条件下根据生产商推荐的实验方案(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)运行。从盒移除凝胶，并用去离子水漂洗3次，每次至少5分钟，并用Bio-SafeCoomassieStain(Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)染色1小时接着用双蒸水脱色超过30分钟。切出在大约95kD观察到的蛋白条带，并用在50μl的100mM碳酸氢铵中的10mMDTT还原30分钟。在还原之后，将凝胶块用50μl在100mM碳酸氢铵中的55mM碘乙酰胺烷化20分钟。允许干燥的凝胶块在室温在胰蛋白酶消化溶液(50mM碳酸氢铵中6ng/μl测序级胰蛋白酶)中重新水合30分钟，然后在40℃消化8小时。每个所述的反应步骤继以用所需的溶液的多次洗涤和预洗涤。使用五十μl的乙腈在反应间使凝胶块脱水，并在步骤间将其风干。用HPLC级水中的1%甲酸/2%乙腈将肽提取两次30分钟。将肽提取溶液转移至冷却至10-15℃的96孔PCR型微滴定板。将含有回收的肽溶液的微滴定板密封以防止蒸发，并在4℃储藏直至可进行质谱分析。
对于通过串联质谱法进行的从头开始的(denovo)肽测序，使用Q-TofmicroTM，一种杂合的正交四极飞行时间质谱仪(WatersMSTechnologies，Milford，MA，USA)以供LC/MS/MS分析。将Q-TofmicroTM配置有UltimateTM毛细管和纳米流HPLC系统，其与FAMOS微型自动采样器和SwitchosII柱切换装置(LCPackings，SanFrancisco，CA，USA)偶合以供使样品浓缩和脱盐。将样品加载于配置于注入回路中的保护柱上(300μmIDX5cm，C18pepmap)，并用水中的0.1%甲酸以40μl/分钟使用SwitchosII泵洗涤2分钟。将肽在75μmIDx15cm，C18，3μm，PepMapTM(LCPackings，SanFrancisco，CA，USA)纳米流融合毛细管柱上以175nl/分钟的流速使用NAN-75校正器(Dionex，Sunnyvale，CA，USA)从175μl/分钟的分流分离。将0.1%甲酸中5%至80%乙腈的逐步洗脱梯度以45分钟间隔施加。在215nm监视柱洗脱液，并将其通过配置纳米喷雾界面的电喷雾离子源导入Q-TofmicroTM。使用MasslynxTM软件版本3.5(WatersMSTechnologies，Milford，MA，USA)以微处理器完全控制Q-TofmicroTM。以调查扫描模式，并以m/z400至1990的质量范围，及MS至MS/MS的切换标准来获得数据以包含大于10.0计数每秒的离子强度和+2、+3和+4的荷电状态。可获得具有1.9秒的扫描时间和0.1秒的扫描间时间的高至四个共洗脱物种的分析谱。通常使用65伏特的锥电压，并将碰撞能量编程为根据洗脱肽的质量和荷电状态而变动，且在10至60伏特范围内。将获得的谱以自动方式合并、平滑化并中心化，并生成了峰列表。以该峰列表使用ProteinLynxTMGlobalServer1.1软件(WatersMSTechnologies，Milford，MA)对选定的公共和私人数据库进行检索。衡量来自ProteinLynxTM的结果，并将未鉴定出的蛋白进一步通过衡量每个感兴趣的离子的MS/MS谱进行分析，并通过鉴定y和b离子系列并将质量差与合适的氨基酸匹配来确定从头开始的序列。
通过质谱法由从头开始的测序获得的肽序列是对于大约95kDa多肽凝胶条带从几种多电荷离子获得的。
一个524.76m/z序列双重荷电的胰蛋白酶消化的肽离子确定为Ser-Pro-Phe-Thr-Trp-Gly-Pro-Thr-Arg(SEQIDNO:184的氨基酸607至615)。第二个709.91部分序列的双重荷电的胰蛋白酶消化的肽离子确定为Gly-Val-Asn-Val-[Ile/Leu]-[Ile-Leu]-Gly-[Ile/Leu]-Gly-Pro(SEQIDNO:184的氨基酸148至155)。第二个745.38部分序列的双重荷电的胰蛋白酶消化的肽离子确定为Pro-Pro-His-Ala-Thr-Asp(SEQIDNO:184的氨基酸747至752)。第三个808.92m/z序列的双重荷电的胰蛋白酶消化的肽离子确定为Tyr-Glu-Ser-[Ile/Leu]-[Ile/Leu]-Ser-Asn-Tyr-Ala-Thr-Ser-Qln-[Ile/Leu]-Lys(SEQIDNO:184的氨基酸487至499)。第四个1023.96部分序列的双重荷电的胰蛋白酶消化的肽离子确定为Phe-Asn-Ser-Gly-Phe-Pro-Ser-Gly-Gln-Thr-Ala-Ala-Ala-Thr-Phe-Asp-Arg(SEQIDNO:184的氨基酸114至130)。
为了生成基因组DNA以供PCR扩增，将土生梭孢霉NRRL8126在42℃和200rpm在带挡板的摇瓶中的补充1%葡萄糖的50ml的NNCYP培养基中生长24小时。菌丝体通过过滤收获，在TE(10mMTris-1mMEDTA)中洗涤两次，并在液氮下冻结。将豌豆大小的一片冻结的菌丝体悬于在TE中的0.7ml的1%十二烷基硫酸锂，并用等体积的0.1mm二氧化锆/二氧化硅珠(BiospecProducts，Inc.，Bartlesville，OK，USA)在FastPrepFP120(ThermoSavant，Holbrook，NY，USA)中进行搅拌45秒来破坏。通过在13,000xg离心10分钟移出碎片，并将经清除的上清配至2.5M乙酸铵，并在冰上温育20分钟。在温育期之后，通过添加2体积的乙醇沉淀核酸。在4℃在离心机中离心15分钟之后，将沉淀在70%乙醇中洗涤并风干。将DNA重悬于120μl的0.1XTE，并用1μl的不含DNase的RNaseA在37℃温育20分钟。添加乙酸铵至2.5M，并用2体积的乙醇沉淀DNA。将沉淀在70%乙醇中洗涤，风干，并重悬于TE缓冲液。
土生梭孢霉NRRL8126基因组的低冗余度草稿序列(draftsequence)由JointGenomeCenter(JGI)，WalnutCreek，CA，USA根据Martinez等，2008，NatureBiotechnol.26：553-560的全基因组鸟枪法生成。将鸟枪测序读码(大约18307个)使用Phrap装配器(Ewing和Green，1998，GenomeRes.8：186-194)装配为重叠群。
装配的重叠群的tblastn检索(Altschul等，1997，NucleicAcidsRes.25：3389-3402)使用来自粗糙脉孢霉的β-葡糖苷酶蛋白序列(UniProt登录号q7rwp2)作为查询序列进行。鉴定出了与检索序列具有大于73.8%同一性的翻译的氨基酸序列。
使用blastp(Altschul等，1997，见上文)将该序列针对公共数据库进行检索，并发现其与来自Podosporaanserina的β-葡糖苷酶(UniProt登录号B2AVE8)80.1%相同。
土生梭孢霉β-葡糖苷酶基因的核苷酸序列和推定的氨基酸序列分别显示于SEQIDNO:183和SEQIDNO:184。编码序列为3032bp，包括终止密码子，并由295bp，57bp，和61bp的三个内含子间隔。编码的预测的蛋白为872个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineering10：1-6)，预测了18个残基的信号肽。预测的成熟蛋白含有854个氨基酸，具有93kDa的预测的分子量和5.57的等电点。
将土生梭孢霉NRRL8126在45℃在PDA平板上生长3日。从平板刮取菌丝体，并使用大约100mg的菌丝体(湿重)接种含有100ml的补充2%微晶纤维素的1XVogel’s培养基或MY50培养基的500ml摇瓶。将培养物在45℃以剧烈振荡生长2，3，4和5日。将菌丝体通过藉由(EMDChemicalsInc.，Gibbstown，NJ，USA)过滤来收获，并快速冻结于液氮。
为了分离总RNA，将土生梭孢霉NRRL8126的冻结的菌丝体在电咖啡磨中粉碎。将粉碎的材料与20ml的FENAZOLTM(Ambion，Inc.，Austin，TX，USA)在50ml管中1:1v/v混合。一旦将菌丝体悬浮，将其用氯仿和三次用苯酚-氯仿-异戊醇25:24:1v/v/v的混合物提取。从所得的水相，通过添加1/10体积的3M乙酸钠pH5.2和1.25体积的异丙醇来沉淀RNA。将沉淀的RNA通过在4℃以12,000xg离心30分钟回收。将最终沉淀用冷70%乙醇洗涤，风干，并重悬于500ml的经焦碳酸二乙酯处理的水(DEPC-水)。
汇集RNA样品，并用2100Bioanalyzer(AgilentTechnologies，Inc.，PaloAlto，CA，USA)评价纯化RNA的品质和数量。分离了总共630μg的RNA。
PolyA+RNA从总RNA使用AbsolutelymRNATMPurificationKit(Stratagene，LaJolla，CA，USA)根据生产商的指示分离。cDNA合成和克隆根据基于SuperScriptTMPlasmidSystemwithTechnologyforcDNASynthesisandCloning(Invitrogen，Carsbad，CA，USA)的步骤进行。使用1-2μg的polyA+RNA，逆转录酶SuperScriptII(Invitrogen，Carsbad，CA，USA)，和寡聚物dT-NotI引物5′-GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTTVN-3′(SEQIDNO:233)合成第一链cDNA。第二链合成用大肠杆菌DNA连接酶，聚合酶I，和RNaseH，接着使用T4DNA聚合酶末端修复来进行。将SalI衔接头(5′-TCGACCCACGCGTCCG-3’[SEQIDNO:234]和5′-CGGACGCGTGGG-3’[SEQIDNO:235])连接于cDNA，用NotI消化，并接着通过使用TAE缓冲液的1.1%琼脂糖凝胶电泳进行大小选择(>2kb)。将cDNA插入物定向连接入SalI和NotI消化的载体pCMVsport6(Invitrogen，Carsbad，CA，USA)。将连接物转化入ElectroMAXTMDH10BTMT1细胞(Invitrogen，Carsbad，CA，USA)。
通过随机选择24个克隆并用如下文所示的引物M13-F和M13-RPCR扩增cDNA插入物来确定无插入克隆的部分来评价文库品质。
引物M13-F：
5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’(SEQIDNO:236)
引物M13-R：
5’-AGGAAACAGCTATGACCAT-3’(SEQIDNO:237)
将来自每个文库的菌落以大约1000菌落每平板的密度铺板于LB平板。将平板在37℃生长18小时，然后挑取单个菌落，并使用每个来接种在384孔板(Nunc，Rochester，NY，USA)中含有补充100μg每ml的氨苄青霉素的LB培养基的孔。克隆在37℃生长18小时。用于测序的质粒DNA通过使用TempliphiTMKit(GEHealthcare，Piscataway，NJ，USA)的滚环扩增产生。亚克隆插入物从两端使用与如下文所示的侧翼载体序列互补的引物和终止子化学使用3730DNAAnalyzer(AppliedBiosystems，FosterCity，CA，USA)进行测序。
正向引物：
5’-ATTTAGGTGACACTATAGAA-3’(SEQIDNO:238)
反向引物：
5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’(SEQIDNO:239)
鉴定出在核苷酸水平与来自米曲霉的β-葡糖苷酶(美国申请公开号2005233423)显示67.4%同一性的克隆。
设计如下文所示的两种合成寡核苷酸引物以PCR扩增来自cDNA克隆的土生梭孢霉家族GH3Bβ-葡糖苷酶基因。使用IN-CloningKit(BDBiosciences，PaloAlto，CA，USA)以将片段直接克隆入表达载体pAlLo2(WO2005/074647)，无需进行限制性消化和连接。
正向引物：
5’-ACTGGATTTACC-3′(SEQIDNO:240)
反向引物：
5’-TCACCTCTAGTTAATTAA-3’(SEQIDNO:241)
粗体字母代表编码序列。剩余序列与pAlLo2的插入位点同源。
将五十皮摩尔的上述每种引物用于PCR反应，其含有200ng的质粒cDNA，1X2XAdvantageGC-MeltLA缓冲液(ClonetechLaboratories，Inc.，MountainView，CA，USA)，1μl的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP的10mM混合物，和1.25单位的AdvantageGCGenomicLAPolymeraseMix(ClonetechLaboratories，Inc.，MountainView，CA，USA)，终体积为50μl。使用5333epgradientS(EppendorfScientific，Inc.，Westbury，NY，USA)进行扩增，其程序如下：一个循环，在94℃进行1分钟；和30个循环，每循环在94℃进行30秒，60.5℃进行30秒，和72℃进行3分钟。然后将加热块维持在72℃进行15分钟接着进行4℃浸泡循环。
通过使用TAE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中从凝胶切出大约2.6kb产物条带，并使用GelExtractionKit(QIAGENInc.，Valencia，CA，USA)根据生产商的指示纯化。
然后将片段使用IN-CloningKit克隆入pAlLo2。将载体用NcoI和PacI消化。将片段通过如上所述的凝胶电泳和GelPurificationKit(QIAGENInc.，Valencia，CA，USA)纯化。将基因片段和消化的载体在反应中合并在一起，得到表达质粒pAG81，其中家族GH3B蛋白基因的转录处于NA2-tpi启动子(来自基因黑曲霉中性α-淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因的启动子的杂合体)的调控之下。重组反应(10μl)包含1XIN-F缓冲液(BDBiosciences，PaloAlto，CA，USA)，1XBSA(BDBiosciences，PaloAlto，CA，USA)，1μl的IN-酶(1∶10稀释的)(BDBiosciences，PaloAlto，CA，USA)，108ng用NcoI和PacI消化的pAlLo2，和94ng的土生梭孢霉GH3B蛋白纯化PCR产物。将反应在37℃温育15分钟接着在50℃温育15分钟。将反应物用40μl的10mMTris-0.1MEDTA缓冲液稀释，并使用2.5μl的稀释反应物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。含有pAG81(GH3B蛋白基因)的大肠杆菌转化体通过限制酶消化鉴定，并使用9600制备质粒DNA。质粒构建体使用AppliedBiosystems3130xlGeneticAnalyzer(AppliedBiosystems，FosterCity，CA，USA)测序以验证基因序列。
米曲霉JaL355原生质体根据Christensen等，1988，Bio/Technology6：1419-1422的方法制备，将其用5μg的pAG81转化。将二十六个转化体分离至单个PDA平板。使用来自每个转化体的小栓接种在24孔板中的1ml的M410培养基，并在34℃温育。在5日温育之后，将来自四种转化体的7.5μl的上清使用无染色，8-16%梯度SDS-PAGE凝胶(Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)根据生产商的指示进行分析。培养物的SDS-PAGE概貌显示几个转化体具有大约150kDa的新的主要条带。
将最佳转化体的汇合的PDA平板用5ml的0.01%20洗涤，并接种入各含有100ml的M410培养基的500ml烧瓶以生成用于酶表征的培养液。将烧瓶在第5日收获，使用0.22μmStericup吸滤器(Millipore，Bedford，MA，USA)过滤，并储藏于4℃。
将制备的摇瓶培养液的45ml等分试样使用具有10kDa的分子量截留值的VIVASPINTM离心浓缩器浓缩十倍，并缓冲液交换入pH5的50mM乙酸钠。然后将经缓冲液交换、浓缩的培养液的4ml等分试样用1MTris-HClpH8和水稀释至10ml体积至20mMTris-HCl的浓度，并使用2N氢氧化钠将pH调整至8的最终值。然后将所得材料使用以20mMTris-HCl缓冲液pH7.8平衡的MONOQTM5/5柱(GEHealthcare，Piscataway，NJ，USA)纯化。未结合的材料用2ml平衡缓冲液从柱洗涤，然后将柱用在平衡缓冲液中的0–500mM氯化钠的线性梯度洗脱。收集0.3ml的级分，汇集在柱加载过程中收集的未结合的材料和从柱洗涤的未结合的材料至12ml的总体积。将在280nm显示UV吸光度的五μl的级分，包括汇集的未结合的材料，使用CRITERIONSTAINFREETM8–16%Tris-HClSDS-PAGE凝胶(Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)根据生产商的指示进行分析。使用PrecisionPlusProteinTM未染色的标样(Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)作为分子量标记。从盒移除凝胶，并使用CRITERIONSTAINFREETMIMAGER(Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)显影。β-葡糖苷酶在汇集的未结合的材料中通过SDS-PAGE鉴定为在150kDa的条带。将12ml的汇集的未结合的材料如上所述浓缩至2ml的最终体积。将浓缩材料使用以含有150mM氯化钠的pH7.8的20mMTrisHCl缓冲液平衡的HILOADTM16/60SUPERDEXTM75PREPGRADE柱(GEHealthcare，Piscataway，NJ，USA)纯化，并用平衡缓冲液洗脱。收集3ml的级分。通过如上所述的SDS-PAGE分析柱级分。含有纯化β-葡糖苷酶的级分，通过SDS-PAGE鉴定为在150kDa的条带，汇集至6ml的总体积。将汇集的材料使用具有5kDa分子量截留值的VIVASPINTM离心浓缩器(GEHealthcare，Piscataway，NJ，USA)浓缩至0.4ml的最终体积。蛋白浓度使用Bio-RadProteinAssay(Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)确定。
纯化的β-葡糖苷酶的酶活性使用p-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作为底物测量。通过将对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷溶解于二甲亚砜(DMSO)以构建0.1M溶液来制备对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷储备溶液。在测定之前，将储备溶液的样品在含有0.01%20的100mM乙酸钠pH5中稀释100倍至1mM溶液。将100μl体积的1mM对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷与每个酶稀释液混合至120μl总体积，然后在40℃温育20分钟。将底物本身，酶本身和缓冲液本身作为对照运行。0.40，0.25，0.20，0.10，0.05，和0.02mM的对硝基苯酚标准溶液通过稀释于含有0.01%20的100mM乙酸钠pH5中的10mM储备溶液来制备。在20分钟，将50μl的1.0M碳酸钠缓冲液pH10添加至每个孔(包括样品、底物对照、酶对照、试剂对照和标样)，混合，并在SPECTRAMAXTM340PC读板器(MolecularDevices，Sunnyvale，CA，USA)上立即测量在405nm的吸光度。测得的活性为84单位每mg的蛋白。一单位的活性定义为能够每分钟在pH5，40℃释放1微摩尔对硝基苯酚阴离子的酶量。
亦用纤维二糖测量了纯化的β-葡糖苷酶的酶活性。纤维二糖的2mg/ml储备溶液在含有0.01%20的50mM乙酸钠pH5中制备，并将100μl与每个酶稀释物合并至150μl的总体积，并在50℃温育30分钟。将底物本身，酶本身和缓冲液本身作为对照运行。将1.0，0.50，0.25，0.125，0.063，和0.031mg/ml的葡萄糖标准溶液在含有0.01%20的50mM乙酸钠pH5中制备。在30分钟，将50μl的0.5M氢氧化钠溶液添加至每个孔(包括样品、底物对照、酶对照、试剂对照和标样)，混合，然后将20μl的混合物转移至EIA/RIA96孔板(CorningIncorporated，Corning，NY，USA)，并与200μl的GLUCOSEOXIDASEREAGENT(PointeScientific，Inc.，Canton，MI，USA)合并，并允许其在25℃静置20分钟，然后在SPECTRAMAXTM340PC读板器(MolecularDevices，Sunnyvale，CA，USA)上测量在500nm的吸光度。测得的活性为264单位每mg的蛋白。一个单位的活性定义为每分钟能够在pH5，50℃释放1微摩尔的葡萄糖的酶量。
实施例77：草酸青霉菌株IBT5387GH3β-葡糖苷酶的制备
根据下文中所述的步骤获得草酸青霉菌株IBT5387(TechnicalUniversityofDenmark；NN005786)GH3β-葡糖苷酶(SEQIDNO:185[DNA序列]和SEQIDNO:186[推定的氨基酸序列])。
将米曲霉BECh2(WO2000/39322)用作宿主细胞以供表达草酸青霉菌株IBT5387家族GH3β-葡糖苷酶基因。
根据Rose等，1998，NucleicAcidsResearch26：1628-1635所述的策略设计如下文所示的一组简并引物，以供克隆编码属于家族GH3的β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)的基因。
GH3scree.f1：
atgaccctggccgaaaaagtcaacytnacnacngg(SEQIDNO:242)
GH3scree.f2：
ggtggccggaactgggaaggcttctsnccngaycc(SEQIDNO:243)
GH3scree.f5：
gagctgggcttccagggctttgtnatgwsngaytgg(SEQIDNO:244)
GH3scree.f6：
agcgctttggccggcctcgayatgwsnatgcc(SEQIDNO:245)
GH3scree.r1：
atcccagttgctcaggtcccknckngt(SEQIDNO:246)
GH3scree.r2：
aaaggttgtgtagctcagnccrtgnccraaytc(SEQIDNO:247)
GH3scree.r3：
gtcaaagtggcggtagtcgatraanacnccytc(SEQIDNO:248)
GH3scree.r4：
ggtgggcgagttgccgacggggttgactctgccrtanar(SEQIDNO:249)
GH3scree.r5：
gccgggcagaccggcccagaggatggcngtnacrttngg(SEQIDNO:250)
GH3scree.r6：
caggacggggccaaccgagtgaatgacnacdatngtrtt(SEQIDNO:251)
使用两个连续的PCR进行草酸青霉菌株IBT5387的PCR筛选。将正向引物(GH3scree.f1，GH3scree.f2，GH3scree.f5，或GH3scree.f6)(0.33μl的10mM储备)与反向引物(GH3scree.r1，GH3scree.r2，GH3scree.r3，GH3scree.r4，GH3scree.r5，或GH3scree.r6)(0.33μl的10mM储备)在10μl混合物中合并，所述混合物含有0.33μl的草酸青霉基因组DNA和5μl的REDDYMIXTMExtensorPCRMasterMix1(ABgeneLtd.，Surrey，UnitedKingdom)。草酸青霉基因组DNA根据描述于SpinKit(Q-BIOgene，Carlsbad，CA，USA)的步骤获得。PCR反应使用ThermalCycler(Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)进行，其程序如下：一个循环，在94℃进行2分钟；9个循环，每循环在94℃进行15秒，63℃进行30秒，每循环降低1℃，和68℃进行1分45秒；24个循环，每循环在94℃进行15秒，55℃进行30秒，和68℃进行1分45秒；和在68℃延伸7分钟。
将在第一PCR中获得的PCR产物用其对应的引物重新扩增，即将0.5μl的第一PCR反应物转移至与第一PCR反应含有相同的浓度的引物，dNTP，DNA聚合酶，和缓冲液的第二20μl混合物。第二PCR使用ThermalCycler进行，其程序如下：一个循环，在94℃进行2分钟；24个循环，每循环在94℃进行15秒，58℃进行30秒，和68℃进行1分45秒；和在68℃延伸7分钟。
将在第二扩增中获得的PCR产物通过使用TAE缓冲液的1%琼脂糖凝胶电泳分析。将大小为2000至800个核苷酸范围的单个条带从凝胶切出，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。将纯化DNA样品直接以用于扩增的引物进行测序。将序列在SeqManv7.2.1(DNAstar，Madison，WI，USA)中装配为重叠群，使用所述重叠群涉及如下文所示的引物，基于GENEWALKINGSPEEDUPTMKit(Seegene，Inc.，Seoul，Korea)中所述温度和长度的推荐。
5786GH3-51TSP1f：
CACCAACACCGGCAATCTAGC(SEQIDNO:252)
5786GH3-51TSP2f：
GGTGACGAGGTTGTCCAACTGTACG(SEQIDNO:253)
5786GH3-51TSP1r：
CTTGAAGCCAAGGCGAGG(SEQIDNO:254)
5786GH3-51TSP2r：
TCCGGTATTTCCTACACATGGTCC(SEQIDNO:255)
GeneWalking基于来自GENEWALKINGSPEEDUPTMKit、具有一些次要差异的方法。仅进行了两次PCR扩增，且在两种情况下，均使用REDDYMIXTMExtensorPCRMasterMix1代替试剂盒中存在的酶混合物。GENEWALKINGPCR1以15μl的总体积进行，即将来自GENEWALKINGSPEEDUPTMKit1.2μl的引物1至4(2.5mM)与0.3μl的引物5786GH3-51TSP1f或引物5786GH3-51TSP1r(10mM)在7.5μl的REDDYMIXTMExtensorPCRMasterMix1，和0.5μl的草酸青霉基因组DNA的存在下混合。PCR使用ThermalCycler进行，其程序如下：一个循环，在94℃进行3分钟，接着在42℃进行1分钟和在68℃进行2分钟；30个循环，每循环在94℃进行30秒，58℃进行30秒，和68℃进行1分钟和40秒；和在68℃延伸7钟。将扩增反应物的0.5μl等分试样转移至含有20μl混合物的第二PCR管，所述混合物包含10μl的REDDYMIXTMExtensorPCRMasterMix1，1μl的来自试剂盒的引物5(10mM)，1μl的引物T5786GH3-51SP2f或5786GH3-51TSP2r(10mM)。扩增在ThermalCycler中进行，其程序如下：在94℃变性3分钟；35个循环，每循环在94℃进行30秒，58℃进行30秒，和68℃进行1分40秒；和在68℃延伸7分钟。
通过在TAE缓冲液中的1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。将大小为700至1200个核苷酸范围的单个条带从凝胶切出，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。将纯化的DNA样品直接以用于扩增的引物进行测序。
基于blastx分析，鉴定了基因的起始密码子和终止密码子，并设计如下文所示的引物以供使用IN-FUSIONTMDry-DownPCRCloningKit将基因克隆入表达载体pDAu109(WO2005042735)。
5786GH3-51r1：
agatctcgagaagcttaCCATGACTCCAATCGCGCGCTCAAGG(SEQIDNO:256)
5786GH3-51f1：
acacaactggggatccaccATGAGGAGCTCAACGACGGTTCTGGCC(SEQIDNO:257)
将草酸青霉β-葡糖苷酶基因使用如上所述的两个克隆引物用草酸青霉菌株IBT5387基因组DNA通过PCR进行扩增。PCR包含1μl的草酸青霉基因组DNA，0.75μl的引物5786GH3-51f1(10μM)，0.75μl的引物5786GH3-51r1(10μM)，3μl的5XHF缓冲液，0.25μl的50mMMgCl2，0.3μl的10mMdNTP，0.15μl的DNA聚合酶，和PCR级水直至15μl。扩增反应使用ThermalCycler进行，其程序如下：在98℃进行2分钟，接着10个降落循环，每循环在98℃进行15秒，70℃(-1℃/循环)进行30秒，和72℃进行2分30秒；和25个循环，每循环在98℃进行15秒，60℃进行30秒，72℃进行2分30秒，和在72℃进行5分钟。
通过使用TAE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中从凝胶切出大约2.8kbPCR产物，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。将对应于草酸青霉β-葡糖苷酶基因的DNA使用IN-FUSIONTMDry-DownPCRCloningKit根据生产商的指示克隆入用BamHI和HindIII直链化的表达载体pDAu109(WO2005042735)。
使用2.5μl体积的稀释的连接混合物转化大肠杆菌TOP10化学感受态细胞。在含有100μg每ml的氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择了三个菌落，并在补充100μg每ml的氨苄青霉素的3ml的LB培养基中培养过夜。使用PlasmidMiniKit根据生产商的指示纯化质粒DNA。在异源表达之前将草酸青霉β-葡糖苷酶基因序列通过Sanger测序验证。选择命名为pIF113#1的一个质粒以供在米曲霉宿主细胞中表达草酸青霉β-葡糖苷酶。
编码序列为2793bp，包括终止密码子及82bp(核苷酸85至116)和59bp(核苷酸346至404)的2个预测的内含子。编码的预测的蛋白为883个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineering10：1-6)，预测了21个残基的信号肽。预测的成熟蛋白含有862个氨基酸，具有94.7kDa的预测的分子量和5.04的等电点。
的米曲霉BECh2原生质体(WO2000/39322)根据WO95/002043制备。将一百μl的原生质体与2.5-15μg的曲霉属表达载体和250μl的60%PEG4000(Applichem，Darmstadt，Germany)(聚乙二醇，分子量4,000)，10mMCaCl2，和10mMTris-HClpH7.5混合，并轻柔地混合。将混合物在37℃温育30分钟，并将原生质体涂布于COVE平板以供选择。在37℃温育4-7日之后，将十六个转化体的孢子接种入在96深孔板中的补充2%麦芽糊精的0.5ml的YP培养基。在30℃培养4日之后，分析培养液以鉴定产生大量活性草酸青霉β-葡糖苷酶的最佳转化体。如实施例16中所述，分析基于SDS-PAGE和对4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)的酶活性。
将最佳转化体的孢子涂布于含有0.01%X-100的COVE平板以供分离单个菌落。将铺板在含有10mM硝酸钠的COVE平板上总共重复两次。然后将孢子接种入在250ml摇瓶中补充2%麦芽糊精的100ml的YP培养基，并在30℃以100rpm振荡温育4日。
将摇瓶培养物的合并的上清首先使用具有0.7μm孔径的玻璃微纤维过滤器过滤，然后使用配置有具有0.22μm孔径的PES(聚醚砜)的过滤单元(NalgeNuncInternational，NewYork，NYUSA)灭菌过滤。然后将灭菌过滤的上清调整至2M硫酸铵的浓度，即缓慢添加固体硫酸铵，通过轻柔的搅拌溶解，然后使用具有0.7μm孔径玻璃微纤维过滤器进行过滤。若有任何沉淀，将其弃去。
将过滤的上清施于用在水中的2M硫酸铵平衡的50mlToyopearlPhenyl-650M柱(TOSOHBioscienceGmbH，Germany)，并将未结合的材料用2M硫酸铵洗脱直至在280nm的UV吸光度低于0.05。结合蛋白用50%乙醇作为溶液B使用逐步梯度洗脱。收集十ml级分和通过在280nm的UV吸光度进行监视。将级分通过SDS-PAGE分析，并汇集含有具有预期的分子量的蛋白的级分。将汇集级分使用50mMHEPESpH7.5缓冲液透析，使得离子强度低于MSi，而pH为7.5。
将汇集蛋白施于用50mMHEPESpH7.5缓冲液平衡的50mlQFastFlow柱，并用50mMHEPES缓冲液pH7.5洗脱未结合的材料。然后将结合蛋白用在作为缓冲液B的含有1MNaCl的50mMHEPES缓冲液pH7.5中的线性20柱体积盐梯度洗脱。收集十ml级分的流出液，并将每个通过SDS-PAGE就蛋白纯度进行分析。汇集具有最高纯度的级分。通过质谱法确认β-葡糖苷酶的同一性，并通过凝胶中消化进行蛋白鉴定。蛋白浓度使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例78：草酸青霉菌株IBT5387GH3β-葡糖苷酶的制备
根据下文中所述的步骤获得草酸青霉菌株IBT5387(TechnicalUniversityofDenmark；NN005786)GH3β-葡糖苷酶(SEQIDNO:187[DNA序列]和SEQIDNO:188[推定的氨基酸序列])。
根据描述于实施例73的步骤分离基因组DNA。
根据Rose等，1998，NucleicAcidsRes.26：1628–1635所述的策略设计一组简并引物(如下文所示的)，以供靶向属于家族GH3的β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)。
GH3scree.f1atgaccctggccgaaaaagtcaacytnacnacngg(SEQIDNO:258)
GH3scree.f2ggtggccggaactgggaaggcttctsnccngaycc(SEQIDNO:259)
GH3scree.f5gagctgggcttccagggctttgtnatgwsngaytgg(SEQIDNO:260)
GH3scree.f6agcgctttggccggcctcgayatgwsnatgcc(SEQIDNO:261)
GH3scree.r1atcccagttgctcaggtcccknckngt(SEQIDNO:262)
GH3scree.r2aaaggtgtgtagctcagnccrtgnccraaytc(SEQIDNO:263)
GH3scree.r3gtcaaagtggcggtagtcgatraanacnccytc(SEQIDNO:264)
GH3scree.r4ggtgggcgagttgccgacggggttgactctgccrtanar(SEQIDNO:265)
GH3scree.r5gccgggcagaccggcccagaggatggcngtnacrttngg(SEQIDNO:266)
GH3scree.r6caggacggggccaaccgagtgaatgacnacdatngtrtt(SEQIDNO:267)
草酸青霉菌株IBT5387基因组DNA的PCR筛选用两次连续PCR进行。将每个正向引物(f1，f2，f5，和f6)(0.33μl的10mM储备)与每个反向引物(r1，r2，r3，r4，r5，和r6)(0.33μl的10mM储备)在10μl混合物中混合。所述混合物含有0.33μl基因组DNA，5μl的ReddyMixExtensorPCRMasterMix1(Cat#AB-0794/A，ABgeneUK，由ThermoFisherScientific商业化)。在PCR仪中进行热启动PCR反应：在94℃进行2分钟，接着9个循环，每循环在94℃进行15秒，63℃进行30秒，每循环降低1℃，68℃进行1分45秒，和接着24个循环，每循环在94℃进行15秒，55℃进行30秒，68℃进行1分45秒，补以在68℃延伸7分钟。将在该第一PCR过程中产生的PCR产物用其相应的引物重新扩增，即将0.5μl的第一PCR反应物转移至与第一PCR反应中含有相同浓度的引物、dNTP、聚合物和缓冲液的第二20μl混合物。第二PCR在相同的PCR块上进行：在94℃进行2分钟，接着24个循环，每循环在94℃进行15秒，58℃进行30秒，68℃进行1分45秒，最后在68℃延伸7分钟。在1%琼脂糖凝胶电泳上在TAE缓冲液中分析第二扩增过程中分析产生的PCR产物。收集大小为2000至800nts范围的单个条带，并使用PCRDNA和GelBandPuificationKit根据生产商的指示洗脱。将纯化的DNA样品以用于扩增的引物直接测序。
将序列在SeqManv7.2.1(DNAstar，Madison，WI，USA)中装配至重叠群，使用该重叠群对公众可获得的序列进行nblast检索(Altschul等，1997，NucleicAcidsRes.25：3389-3402)。检索结果表明序列GenBankEU700488.1几乎与鉴定出的重叠群相同。因此，基于来自GenBankEU700488.1的cds的序列信息设计克隆引物5786GH3-50f和5786GH3-50r以供根据生产商的指示进行IN-FUSIONTM克隆以供在表达载体pDAu109(WO2005/042735)中克隆。
5786GH3-50f1：
5’-acacaactggggatccaccATGAAGCTCGAGTGGCTGGAAGC-3’(SEQIDNO:268)
5786GH3-50r1
5’-agatctcgagaagcttaCTGCACCTTGGGCAGATCGGCTG-3’(SEQIDNO:269)
使用之前在用从菌株IBT5387(来自1992年接收的DTU)制备的基因组DNA进行的PCR反应中所述的两个克隆引物通过PCR扩增草酸青霉β-葡糖苷酶基因。PCR反应包含1μl的基因组DNA，0.75μl的引物5786GH3-51f1(10μM)；0.75μl的引物5786GH3-51r1(10μM)；3μl的5XHF缓冲液，0.25μl的50mMMgCl2，0.3μl的10mMdNTP；0.15μl的DNA聚合酶，和PCR级水加至15μl。PCR反应使用PCR仪进行，其程序如下：在98℃进行2分钟，接着10个降落循环：在98℃进行15秒，70℃(-1℃/循环)进行30秒，和72℃进行2分30秒；和25个循环，每循环在98℃进行15秒，60℃进行30秒，72℃进行2分30秒，和在72℃进行5分钟。
反应产物通过使用TAE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，其中从凝胶切出大约2.8kbPCR产物，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。将对应于草酸青霉β-葡糖苷酶基因的DNA使用IN-FUSIONTMDry-DownPCRCloningKit根据生产商的指示克隆入用BamHI和HindIII直链化的表达载体pDAu109(WO2005042735)。
使用2.5μl体积的稀释的连接混合物转化大肠杆菌TOP10化学感受态细胞。在含有100μg每ml的氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择三个菌落，并在补充100μg每ml的氨苄青霉素的3ml的LB培养基中培养过夜。使用PlasmidMiniKit根据生产商的指示纯化质粒DNA。在异源表达之前将草酸青霉β-葡糖苷酶基因序列通过Sanger测序验证。
编码序列为2964bp，包括终止密码子，并由101bp(核苷酸61至161)，64bp(核苷酸302至365)，79bp(核苷酸411至489)，63bp(核苷酸543至605)，和71bp(核苷酸2660至2730)的5个内含子间隔。编码的预测的蛋白为861个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineering10：1-6)，预测了19个残基的信号肽。预测的成熟蛋白含有842个氨基酸。
米曲霉BECh2(WO2000/39322)的原生质体如WO95/02043中所述制备。将一百微升的原生质体悬液与2.5-15μg的曲霉属表达载体混合，并添加250μl的60%PEG4000，10mMCaCl2，和10mMTris-HClpH7.5，并轻柔地混合。将混合物在37℃温育30分钟，并将原生质体涂布于补充10mM乙酰胺和15mMCsCl的COVE蔗糖(1M)平板以供转化体选择。在37℃温育4-7日之后将几个转化体的孢子接种于YP-2%麦芽糊精培养基上。在30℃培养4日之后分析培养液以供基于其产生大量活性草酸青霉β-葡糖苷酶的能力鉴定最佳转化体。如实施例16中所述，筛选基于通过SDS-PAGE确定的对应于异源表达的蛋白的条带强度和对4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)的酶活性。
将最佳转化体的孢子涂布于含有0.01%X-100的COVE平板以供分离单个菌落。将铺板在含有1M蔗糖和10mM硝酸钠，补充10mM乙酰胺和15mMCsCl的COVE蔗糖培养基(Cove，1996，Biochim.Biophys.Acta133：51-56)上总共重复两次。然后在250ml摇瓶中使用DAP-2C-1培养基在30℃以100rpm振荡实施发酵4日。
浓缩过滤的培养液，并用去离子水使用配置有具有10kDaMW-CO聚醚砜膜的Slice盒的切线流浓缩器(SartoriusStedimBiotechGmbH，Goettingen，Germany)来洗涤。将浓缩物添加至M硫酸铵，并加载于在2M硫酸铵中平衡的PhenylToyopearl(650M)柱(TosohCorporation，3-8-2Shiba，Minato-ku，Tokyo，Japan)上，并用1M硫酸铵洗脱结合蛋白。将洗脱蛋白用含氯化钠的25mMHEPESpH7.5通过用10kDa聚醚砜膜使用Vivaspin20(SartoriusStedimBiotechGmbH，Goettingen，Germany)的超滤进行缓冲液交换。蛋白浓度使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例79：埃默森踝节菌菌株CBS549.92GH3β-葡糖苷酶的制备
根据下文中所述的步骤获得埃默森踝节菌菌株CBS549.92GH3β-葡糖苷酶(SEQIDNO:189[DNA序列]和SEQIDNO:190[推定的氨基酸序列])。
根据描述于实施例73的步骤分离基因组DNA。
使用如下文所示的两个克隆引物GH3-11f和GH3-11r通过PCR分离埃默森踝节菌β-葡糖苷酶基因，所述引物基于公众可获得的埃默森踝节菌全长序列(GenbankAY072918.4)设计以供使用IN-FUSIONTM策略的直接克隆。
引物GH3-11f：
acacaactggggatccaccatgaggaacgggtgctcaaggtcg(SEQIDNO:270)
引物GH3-11r：
agatctcgagaagcttaaattccagggtatggcttaaggggc(SEQIDNO:271)
用从埃默森踝节菌菌株CBS549.92制备的基因组DNA进行PCR反应以供扩增全长基因。PCR反应包含1μl的基因组DNA，0.75μl的引物GH3-11f(10μM)；0.75μl的引物GH3-11r(10μM)；3μl的5XHF缓冲液，0.25μl的50mMMgCl2，0.3μl的10mMdNTP；0.15μl的DNA聚合酶，和PCR级水加至15μl。使用PCR仪进行PCR反应，其程序如下：在98℃进行2分钟，接着10个降落循环，在98℃进行15秒，70℃(-1℃/循环)进行30秒，和72℃进行2分30秒；和25个循环，每循环在98℃进行15秒，60℃进行30秒，72℃进行2分30秒，和在72℃进行5分钟。
通过使用TAE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中从凝胶切出大约2.9kbPCR产物，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。将对应于埃默森踝节菌β-葡糖苷酶基因的DNA使用IN-FUSIONTMDry-DownPCRCloningKit根据生产商的指示克隆入用BamHI和HindIII直链化的表达载体pDAu109(WO2005042735)。
使用2.5μl体积的稀释的连接混合物转化大肠杆菌TOP10化学感受态细胞。在含有100μg每ml的氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择三个菌落，并在补充100μg每ml的氨苄青霉素的3ml的LB培养基中培养过夜。使用PlasmidMiniKit根据生产商的指示纯化质粒DNA。在异源表达之前将埃默森踝节菌β-葡糖苷酶基因序列通过Sanger测序验证。
编码序列为2925bp，包括终止密码子，并由60bp(核苷酸61至120)，61bp(核苷酸261至321)，60bp(核苷酸367至426)，57bp(核苷酸480至536)，56bp(核苷酸1717至1772)，和54bp(核苷酸2632至2685)的6个内含子间隔。编码的预测的蛋白为858个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineering10：1-6)，预测了19个残基的信号肽。预测的成熟蛋白含有839个氨基酸。
米曲霉BECh2(WO2000/39322)的原生质体如WO95/02043中所述制备。将一百微升的原生质体悬液与2.5-15μg的曲霉属表达载体混合，并添加250μl的60%PEG4000，10mMCaCl2，和10mMTris-HClpH7.5，并轻柔地混合。将混合物在37℃温育30分钟，并将原生质体涂布于补充10mM乙酰胺和15mMCsCl的COVE蔗糖(1M)平板以供转化体选择。在37℃温育4-7日之后，将几个转化体的孢子接种于YP-2%麦芽糊精培养基上。在30℃培养4日之后分析培养液以供基于其产生大量活性埃默森踝节菌β-葡糖苷酶的能力鉴定最佳转化体。如实施例16中所述，筛选基于通过SDS-PAGE确定对应于异源表达的蛋白的条带强度和对4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)的酶活性。
将最佳转化体的孢子涂布于含有0.01%X-100的COVE平板以供分离单个菌落。将铺板在含有1M蔗糖和10mM硝酸钠，补充10mM乙酰胺和15mMCsCl的COVE蔗糖培养基(Cove，1996，Biochim.Biophys.Acta133：51-56)上总共重复两次。然后在250ml摇瓶中使用YP-2%麦芽糊精培养基在30℃以100rpm振荡实施发酵4日。将培养液使用标准方法过滤。蛋白浓度使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例80：痂状嗜热子囊菌菌株CBS181.67GH61A多肽的制备
根据下文中所述的步骤获得痂状嗜热子囊菌菌株CBS181.67GH61A多肽具有纤维素分解增强活性的(SEQIDNO:191[DNA序列]和SEQIDNO:192[推定的氨基酸序列])。
米曲霉菌株HowB101(WO95/35385)用作宿主以供重组表达具有纤维素分解增强活性的痂状嗜热子囊菌GH61多肽。
将痂状嗜热子囊菌菌株CBS181.67接种于PDA平板上，并在45℃在黑暗中温育3-4日。将几个菌丝体-PDA栓接种入含有100ml的NNCYP-PCS培养基的500ml摇瓶。将烧瓶在45℃以160rpm振荡温育6日。在第3、4、5和6日收集菌丝体。然后合并来自每日的菌丝体，并冻结于液氮，然后储藏于-80℃冷冻箱中直至使用。
使用PlantMiniKit(QIAGENInc.，Valencia，CA，USA)提取基因组DNA。通过使用PlantMiniKit分离总RNA。通过遵循3’RapidAmplificationofcDNAEndSystem(3’RACE)(InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA，USA)的指示合成cDNA。
基于已知GH61序列的保守区设计如下文所示的四种简并引物。
GH61AscF1：
5’-GCNACNGAYCTNGGNTTTG-3’(SEQIDNO:272)
GH61AscF2：
5’-GCNACNGAYCTNGGNTTCG-3’(SEQIDNO:273)
GH61AscF3：
5’-GCNACNGAYTTRGGNTTYG-3’(SEQIDNO:274)
GH61AscR1：
5’-CAYTGNGGRTARTTYTGNGC-3’(SEQIDNO:275)
PCR通过使用正向引物GH61AscF1，GH61scF2，和GH61AscF3，和反向引物GH61AscR1和作为模板的cDNA的组合进行。扩增反应包含5μl的10XPCR缓冲液(InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA，USA)，2μl的25mMMgCl2，1μl的10mMdNTP，1μl的100μM正向引物，1μl的100μM反向引物，2μl的cDNA，0.5μl的TaqDNA聚合酶HighFidelity(InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA，USA)，和37.5μl的H2O。扩增使用PeltierThermalCycler进行，其程序如下：在94℃变性2分钟；30个循环，每循环在94℃进行40秒，50℃进行40秒，和72℃进行1分钟；和在72℃最终延伸10分钟。
通过使用TBE缓冲液的1%琼脂糖凝胶电泳检测出大约500碱基对的PCR产物。将PCR片段从凝胶切出，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化，直接测序，并通过blast确认为GH61A部分基因。基于该部分序列，设计如下文所示的新引物以供使用GenomeWalkingKit(TakaraBioInc.，Otsu，Shiga，Japan)的5’和3’端克隆：
61ASPR1：
5′-TGCAAGGAGCAAGGTAGTTGA-3′(SEQIDNO:276)
61ASPR2：
5′-GAGTCCATTCCAGCTTGACGGT-3′(SEQIDNO:277)
61ASPF1：
5′-TCAGACAATCTGATAGCGGC-3’(SEQIDNO:278)
61ASPF2：
5′-ATCCCAACCACAACTGCACCT-3′(SEQIDNO:279)
对于5’端和3’端克隆，初级扩增包含作为模板的2μl的基因组DNA，各2.5mM的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP，100pmol的AP2(由GenomeWalkingKit提供)和10pmol的供5’端克隆的引物61ASPR1或100pmol的AP3(由GenomeWalkingKit提供)，和10pmol的供3’端克隆的引物61ASPF1，5μl的10XLAPCR缓冲液II(由GenomeWalkingKit提供)，和2.5单位的TakaRaLATaqDNA聚合酶(由GenomeWalkingKit提供)，终体积为50μl。扩增使用PeltierThermalCycler进行，其程序如下：预变性在94℃进行1分钟和98℃进行1分钟；五个循环，每循环在94℃的变性温度进行30秒；在60℃退火1分钟和在72℃延伸2分钟；1个循环，在94℃变性30秒；在25℃退火3分钟和在72℃延伸2分钟；2个循环的十五次重复，每循环在94℃进行30秒，62℃进行1分钟，和72℃进行2分钟；接着1个循环，在94℃进行30秒，44℃进行1分钟，和72℃进行2分钟；和在72℃最终延伸10分钟。然后加热块进入4℃浸泡循环。
次级扩增包含作为模板的2μl的20X稀释的初级PCR产物，各2.5mM的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP，100pmol的AP2和10pmol的供5’端克隆的引物61ASPR2或100pmol的AP3和10pmol的供3’端克隆的引物61ASPF2，5μl的10XLAPCR缓冲液II，和2.5单位的TakaRaLATaqDNA聚合酶，其终体积为50μl。扩增使用PeltierThermalCycler进行，其程序如下：2个循环的十五次重复，每循环94℃进行30秒；62℃进行1分钟；72℃进行2分钟；接着1个循环，在94℃进行30秒，44℃进行1分钟，和72℃进行2分钟；和在72℃最终延伸10分钟。然后加热块进入4℃浸泡循环。
将来自5’和3’端PCR的PCR产物回收并测序。其鉴定为GH61A多肽基因的5’端和3’端。然后装配含有部分基因，5’端，和3’端的三个序列以生成全长GH61A。
获得的全长基因显示序列含有871个核苷酸的编码区，含有1个内含子和终止密码子，并编码251个氨基酸，具有22个氨基酸的预测的信号肽。
基于全长痂状嗜热子囊菌GH61A基因序列，设计如下文所示的寡核苷酸引物以从痂状嗜热子囊菌CBS181.67的基因组DNA扩增GH61A基因。使用IN-CFDry-DownCloningKit(ClontechLaboratories，Inc.，MountainView，CA，USA)以将片段直接克隆入表达载体pPFJO355，无需进行限制性消化和连接。
有义引物：
5’-acacaactggggatcCACCA-3’(SEQIDNO:280)
反义引物：
5′-GTCACCCTCTAGATCT-3′(SEQIDNO:281)
粗体字母对于有义引物代表编码序列，而对于反义引物代表终止密码子的下游序列。剩余序列与pPFJO355的插入位点同源。
将二十皮摩尔的上述每种引物用于PCR反应，其包含痂状嗜热子囊菌基因组DNA，10μl的5XGC缓冲液，1.5μl的DMSO，各2μl的2.5mM的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP，和1单位的PHUSIONTMHigh-FidelityDNAPolymerase，其终体积为50μl。使用PeltierThermalCycler进行扩增，其程序如下：在98℃变性1分钟；5个循环，每循环在98℃变性15秒，在70℃退火30秒，其中每循环降低1℃，和在72℃延伸30秒；25个循环，每循环在98℃进行15秒和72℃进行90秒；和在72℃最终延伸10分钟。然后加热块进入4℃浸泡循环。
通过使用TBE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中从凝胶切出大约1.0kb产物条带，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。
质粒pPFJO355用BamHI和BglII消化，通过使用TBE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。
将基因片段和消化的载体使用IN-CFDry-DownPCRCloningKit连接在一起，得到pGH61a51486，其中痂状嗜热子囊菌GH61A基因的转录处于米曲霉TAKA-α-淀粉酶启动子的调控之下。简言之，将30ng用BamHI和BglII消化的pPFJO355和50ng的痂状嗜热子囊菌GH61A基因纯化的PCR产物添加至反应小瓶，并用去离子水重悬至终体积为10μl。将反应在37℃温育15分钟，然后50℃温育15分钟。使用三μl的反应物根据生产商的指示转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。将转化物涂布于补充100μg每ml的氨苄青霉素的LB平板，并在37℃温育1日。通过菌落PCR检测含有命名为pGH61a51486的质粒的大肠杆菌转化体，并使用QIAprepSpinMiniprepKit(QIAGENInc.，Valencia，CA，USA)制备质粒DNA。pGH61a51486中的痂状嗜热子囊菌GH61A基因插入物通过使用3730XLDNAAnalyzer的DNA测序确认。
将相同的PCR片段使用pGEM-TVectorSystem克隆入pGEM-T载体以生成pGEM-T-GH61a51486。pGEM-T-GH61a51486中的痂状嗜热子囊菌GH61A基因插入物通过使用3730XLDNAAnalyzer的DNA测序确认。含有pGEM-T-GH61a51486、命名为NN059126的大肠杆菌菌株T-51486A，于2009年6月10日保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(DSM))，MascheroderBraunschweig，Germany，并分配登录号DSM22656。
就其品质审视核苷酸序列数据，并将所有的序列以PHRED/PHRAP软件(UniversityofWashington，Seattle，WA，USA)的协助相互比较。
痂状嗜热子囊菌gh61a基因的核苷酸序列和推定的氨基酸序列分别显示于SEQIDNO:191和SEQIDNO:192。将编码序列为871bp，包括终止密码子，并由115碱基对(核苷酸105-219)的一个内含子间隔。编码的预测的蛋白为251个氨基酸。全长编码序列和成熟编码序列的%G+C含量分别为50.23%和52.55％。使用SignalP软件程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineering10：1-6)，预测了22个残基的信号肽。预测的成熟蛋白含有229个氨基酸，具有26.35kDa的预测的分子量。
米曲霉HowB101原生质体根据Christensen等，1988，Bio/Technology6：1419-1422的方法制备，并用3μg的pGH61a51486转化。转化产生约50个转化体。将十二个转化体分离至单个基本培养基平板。
将四个转化体分别接种入在24孔板中的3ml的YPM培养基，并在30℃振荡以150rpm温育。在3日温育之后，通过使用4-12%Bis-TrisGel及MES缓冲液的SDS-PAGE根据生产商的指示分析来自每个培养的20μl的上清。将所得凝胶用INSTANTBLUETM(ExpedeonLtd.，BabrahamCambridge，UK)染色。培养物的SDS-PAGE概貌显示大多数的转化体具有大约30kDa的主要条带。将表达菌株命名为米曲霉EXP03151。
将米曲霉EXP03151的斜面用10ml的YPM培养基洗涤，并接种入含有400ml的YPM培养基的2升烧瓶以生成用于酶表征的培养液。将培养在第3日收获，并使用0.45μm膜(Millipore，Bedford，MA，USA)过滤。
将过滤的培养液浓缩和使用配置有具有10kDa截取值聚醚砜膜的Slice盒(SartoriusStedimBiotechGmbH，Goettingen，Germany)的切线流浓缩器用25mMHEPES，pH7.0进行缓冲液交换。将蛋白施于在25mMHEPESpH7.0中平衡的QSepharoseTMFastFlow柱(GEHealthcare，Piscataway，NJ，USA)。在洗脱物中回收蛋白。蛋白浓度使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例81：埃默森踝节菌菌株NN05002GH10木聚糖酶的制备
根据下文中所述的步骤获得埃默森踝节菌菌株NN05002GH10木聚糖酶(SEQIDNO:193[DNA序列]和SEQIDNO:194[推定的氨基酸序列])。
将埃默森踝节菌在PDA琼脂平板上在45℃生长3日。将菌丝体直接从琼脂平板收集入经灭菌的研钵，并在液氮下冻结。将冻结的菌丝体用杵和研钵粉碎至细微粉末，并将基因组DNA使用PlantMiniKit分离。
设计如下文所示的寡核苷酸引物以从埃默森踝节菌的基因组DNA扩增GH10木聚糖酶基因。使用IN-FUSIONTMCFDry-downCloningKit以将片段直接克隆入表达载体pPFJO355，无需进行限制性消化和连接。
有义引物：
5’-ACACAACTGGGGATCCACC-3’(SEQIDNO:282)
反义引物：
5’-GTCACCCTCTAGATCT-3’(SEQIDNO:283)
粗体字母代表编码序列。剩余序列与pPFJO355的插入位点同源。
将二十皮摩尔的上述每种引物用于PCR反应，其包含埃默森踝节菌基因组DNA，10μl的5XGC缓冲液，1.5μl的DMSO，各5mM的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP，和0.6单位的PhusionTMHigh-FidelityDNAPolymerase，其终体积为50μl。扩增使用PeltierThermalCycler进行，其程序如下：在98℃变性40秒；8个循环，每循环在98℃变性15秒，在65℃退火30秒，其中每循环降低1℃，和在72℃延伸80秒；和另一个23个循环，每循环在98℃进行15秒，58℃进行30秒和72℃进行80秒；在72℃最终延伸7分钟。然后加热块进入10℃浸泡循环。
通过使用TBE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中从凝胶切出大约1.4kb产物条带，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。
质粒pPFJO355用BamI和BglII消化，通过使用TBE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。
将基因片段和消化的载体使用IN-FUSIONTMCFDry-downPCRCloning连接在一起，得到pxynTe50022，其中埃默森踝节菌GH10木聚糖酶基因的转录处于米曲霉TAKA淀粉酶启动子的调控之下。简言之，将20ng用BamI和BglII消化的pPFJO355，和60ng的埃默森踝节菌GH10木聚糖酶基因纯化的PCR产物添加至反应小瓶，并通过添加去离子水重悬至终体积为10μl。将反应温育在37℃进行15分钟，然后50℃进行15分钟。使用三μl的反应物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。通过菌落PCR检测含有pxynTe50022的大肠杆菌转化体，并使用QIAprepSpinMiniprepKit制备质粒DNA。pxynTe50022中的埃默森踝节菌GH10木聚糖酶基因插入物通过使用3730XLDNAAnalyzer的DNA测序确认。
米曲霉HowB101(WO95/35385)原生质体根据Christensen等，1988，Bio/Technology6：1419-1422的方法制备，并用3μg的pxynTe50022转化。转化产生约50个转化体。将十二个转化体分离至单个基本培养基平板。
将四个转化体分别接种入在24孔板中的3ml的YPM培养基，并在30℃，150rpm温育。在3日温育之后，通过使用4-12%Bis-TrisGel及MES缓冲液的SDS-PAGE根据生产商的指示分析来自每个培养的20μl的上清。将所得凝胶用Blue染色。培养物的SDS-PAGE概貌显示大多数的转化体具有大约55kDa的主要的不清晰条带。将表达菌株命名为米曲霉EXP03373。
将米曲霉EXP03373的斜面用10ml的YPM培养基洗涤，并接种入六个每个含有400ml的YPM培养基的2升烧瓶，以生成用于酶表征的培养液。将培养在第3日通过将培养物通过(CALBIOCHEM，Inc。LaJolla，CA，USA)过滤来收获。然后将过滤的培养液使用0.45μmDURAPORE膜再次过滤。蛋白浓度使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
将米曲霉EXP03373的1600ml体积的过滤的培养液上清用硫酸铵(80%饱和)沉淀，重新溶解于100ml的25mMBis-TrispH6.0，对相同的缓冲液透析，并通过0.45μm过滤器过滤；最终体积为200ml。将溶液施于用25mMBis-TrispH6.0平衡的40mlQFastFlow柱，并用线性NaCl梯度(0-0.4M)洗脱蛋白。通过使用4-12%Bis-TrisGel及MES缓冲液的SDS-PAGE分析具有针对AZCL-木聚糖活性的级分。汇集具有正确分子量的级分，并通过超滤浓缩。
通过如下所述的微滴定板测定就内切纤维素酶活性测试上清。将0.2%的蓝色底物AZCL-Xylan(Megazyme)的溶液在搅拌下悬于0.1M乙酸钠缓冲液(pH5.5)。将溶液在搅拌下分配至微滴定板(200μl至每个孔)。添加二十μl的酶样品，并在Thermomixer中在50℃和650rpm温育20分钟。将变性的酶样品(100℃进行煮沸20分钟)用作空白。温育之后将有色溶液通过在4℃以3000rpm进行离心5分钟从固体分离。然后将150μl的上清转移至微滴定板，并使用SpectraMaxM2在595nm测量吸光度。
实施例82：青霉属菌种菌株NN51602GH10木聚糖酶的制备
根据PCT/US10/032034获得青霉属菌种菌株NN51602GH10木聚糖酶(SEQIDNO:195[DNA序列]和SEQIDNO:196[推定的氨基酸序列])。蛋白浓度使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例83：巨多孔菌菌株CBS521.95GH10木聚糖酶的制备
巨多孔菌菌株CBS521.95GH10木聚糖酶(SEQIDNO:197[DNA序列]和SEQIDNO:198[推定的氨基酸序列])根据WO97/27290重组制备，只是将米曲霉Bech2(WO2000/39322)用作宿主并将pDAu75用作表达载体。载体pDAu75是pJal721(WO03/008575)的衍生物。质粒pDAu75与pJal721主要区别在于通过插入氨苄青霉素抗性基因大肠杆菌β-内酰胺酶破坏了大肠杆菌的选择性标记URA3，这允许在常用的LB氨苄青霉素平板上使用商业上可获得的高度感受态菌株迅速选择阳性重组大肠杆菌克隆。氨苄青霉素抗性基因是使用两个侧翼NotI位点可完全去除的，恢复了功能性选择性标记URA3。用于从pJal721制备pDAu75的技术是常用的供DNA克隆的分子生物学技术。将巨多孔菌GH10木聚糖酶基因的cDNA序列克隆入pDAu75是由如WO97/27290中所述的产生木聚糖酶的酵母菌落通过限制/连接克隆步骤进行的。
将培养液使用Whatmann玻璃过滤器GF/D，GF/A，GF/C，GF/F(分别为2.7μm，1.6μm，1.2μm和0.7μm)过滤，接着通过0.45μm过滤器过滤。
将硫酸铵添加至过滤的培养液至3M的终浓度，并在以10,000xg进行离心30分钟之后收集沉淀。将沉淀溶解于10mMTris/HClpH8.0，并对10mMTris/HClpH8.0透析过夜。将透析的制备物施于用10mMTris/HClpH8.0平衡的150mlQFastFlow柱，并将酶用1050ml(7柱体积)在10mMTris/HClpH8.0中0至1MNaCl的线性盐梯度洗脱。在洗脱之后进行A280nm检测，并收集级分，并就木聚糖酶活性使用在0.2M磷酸钠pH6.0加0.01%X100中的来自小麦的0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖(Megazyme)进行测定。汇集含有木聚糖酶活性的级分，并储藏于-20℃。蛋白浓度使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例84：嗜热网球菌菌株ATCC35947GH11木聚糖酶的制备
根据下述步骤重组制备嗜热网球菌GH11木聚糖酶(SEQIDNO:199[DNA序列]和SEQIDNO:200[推定的氨基酸序列])。
使用Anagnostopoulos和Spizizen，1961，JournalofBacteriology81：741-746所述的方法使枯草芽孢杆菌菌株成为感受态。DNA测序用ABI3700测序(AppliedBiosystems，Inc.，FosterCity，CA，USA)进行。
构建如下所述的枯草芽孢杆菌菌株SMO25以检测在枯草芽孢杆菌菌株A164Δ10(Bindel-Connelly等，2004，J.Bacteriol.186：4159–4167)中的胞内丝氨酸蛋白酶(ispA)基因。
通过重叠延伸剪接(SOE)(Horton等，1989，GENE77：61-8)构建缺失质粒，pNNB194-ispAΔ。通过PCR扩增从来源于枯草芽孢杆菌菌株164Δ5(美国专利No.5,891,701)的染色体DNA分别使用如下文所示的引物对994525/994526和994527/994528获得ispA基因的5’和3’的侧翼DNA序列。根据Pitcher等，1989，Lett.Appl.Microbiol.8：151-156的步骤获得染色体DNA。
引物994525：
5′-GGATCCATTATGTAGGGCGTAAAGC-3′(SEQIDNO:284)
引物994526：
5′-TTAGCAAGCTTAATCACTTTAATGCCCTCAG-3′(SEQIDNO:285)
引物994527：
5′-TGATTAGCTTGCTAATCCGCAGGACACTTC-3′(SEQIDNO:286)
引物994528：
5′-GGTACCAACACTGCCTCTCTCATCTC-3′(SEQIDNO:287)
PCR扩增在50μl反应中进行，所述反应包含10ng的枯草芽孢杆菌菌株164Δ5染色体DNA，0.4μM的每种引物，各200μM的dATP，dCTP，dGTP，和dTTP，含2.5mMMgCl2的1XPCR缓冲液II(AppliedBiosystems，Inc.，FosterCity，CA，USA)，和2.5单位的AmpliTaqDNA聚合酶(AppliedBiosystems，Inc.，FosterCity，CA，USA)。反应在40TemperatureCycler(Stratagene，Corp.，LaJolla，CA，USA)中进行，其程序如下：1个循环，在95℃进行10分钟；25个循环，每循环在95℃进行1分钟，50℃进行1分钟，和72℃进行1分钟；和1个循环，在72℃进行7分钟。
将PCR产物通过0.8%琼脂糖凝胶电泳使用0.5XTBE缓冲液(50mMTris碱-50mM硼酸-1mMEDTA二钠)解析。大约400bp的条带使用针对ispA基因5’侧翼DNA序列的引物对994525/994526获得，从凝胶切出，并使用GelExtractionKit(QIAGENInc.，Valencia，CA，USA)提取。大约400bp的条带使用针对ispA基因3’侧翼DNA序列的引物对994527/994528获得，从凝胶切出，并使用GelExtractionKit提取。
将最终SOE片段使用如上所述相同的步骤用400bp片段作为模板和如上所示的引物994525和994528扩增，以产生ispA缺失片段。将大约800kb的PCR产物通过使用0.5XTBE缓冲液的0.8%琼脂糖凝胶电泳解析。
将最终800kbSOE片段使用TA-CloningKit(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)克隆入2.1(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，并根据生产商的指示转化入ONETOP10ChemicallyCompetent大肠杆菌细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。在补充100μg每ml的氨苄青霉素的2XYT琼脂平板上选择转化体，并在37℃温育16小时。将克隆片段的DNA序列通过用M13正向和反向引物(Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA，USA)的DNA测序来验证。将质粒命名为2.1-ispAΔ。
将质粒pCR2.1-ispAΔ用BamHI和Asp718消化，并对其进行使用0.5XTBE缓冲液的0.8%琼脂糖凝胶电泳以分离ispA缺失片段。将对应于ispA缺失片段的800bp片段从凝胶切出，并使用GelExtractionKit提取。
将温度敏感性质粒pNNB194(pSK+/pE194；美国专利号5,958,728)用BamHI和Asp718消化，并通过使用0.5XTBE缓冲液的0.8%琼脂糖凝胶电泳解析以分离载体片段。将pNNB194的6600bp载体片段从凝胶切出，并使用GelExtractionKit提取。
将ispA缺失片段和pNNB194片段使用RapidDNALigationKit(RocheAppliedScience，Indianapolis，IN，USA)连接在一起，并将连接混合物转化入大肠杆菌细胞(StratageneCorp.，LaJolla，CA，USA)，根据生产商的指示就氨苄青霉素抗性进行选择。使用9600分离来自八个转化体的质粒DNA，用BamHI和Asp718消化，和通过如上所述琼脂糖电泳分析以鉴定携带ispAΔ片段的质粒。鉴定出了一个转化体，并命名为pNNB194-ispAΔ。
将质粒pNNB194-ispAΔ导入枯草芽孢杆菌A164Δ10(Bindel-Connelly等，2004，J.Bacteriol.186：4159–4167)，并通过在45℃在补充每ml1μg的红霉素和25μg的林可霉素的Tryptose血琼脂基(TBAB)平板上选择性生长而整合于ispA基因座。然后将整合的质粒通过在LB培养基上在34℃非选择性生长来切出。根据Pitcher等，1989，见上文的方法从几个红霉素敏感性克隆分离染色体DNA，并使用引物994525和994528使用与上述相同的方法通过PCR进行分析以确认ispA缺失的存在。一个此种克隆命名为枯草芽孢杆菌SMO25。
使用直链整合载体系统以供表达克隆不具结合域且不具信号肽的合成的嗜热网球菌家族11木聚糖酶基因。合成基因序列基于公共基因序列UNIPROT：P77853。将合成基因就在枯草芽孢杆菌中表达遵循Gustafsson等，2004，TrendsinBiotechnology22：346-353的推荐进行密码子优化。合成基因通过DNA2.0(MenloPark，CA，USA)生成，并作为克隆片段递送于其标准克隆载体(卡那霉素抗性)中。将木聚糖酶基因克隆为不具结合域、并具有来自克劳氏芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶基因(aprH，SAVINASETM，NovoNordiskA/S，Bagsvaerd，Denmark)(包含于侧翼区)的信号肽的截短的基因。该基因设计为含有C端HQHQHQHQP标记以方便纯化。设计正向引物使得从信号肽切割位点扩增基因，并具有26个碱基的悬突(在下表中显示为斜体)。该悬突与两个直链载体片段之一的一部分互补，并在装配PCR片段和载体片段时使用(如下所述)。设计反向引物以扩增基因的截短型式，并含有由编码HQHQHQHQP-标记和终止密码子的30bp组成的悬突(该悬突在下表中显示为斜体)。该悬突与两个直链载体片段之一的一部分互补，并在装配PCR片段和载体片段时使用(如下所述)。
直链整合构建体为通过将两个枯草芽孢杆菌同源染色体区之间的每个基因与强启动子和氯霉素抗性标记融合而制备的PCR融合产物。该融合物是通过通过重叠延伸剪接(SOE)(Horton等，1989，见上文)制备的。SOEPCR方法亦描述于WO2003/095658。在三重启动子系统(描述于WO99/43835)的调控之下表达每个基因，所述系统由来自地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)，解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)的启动子，和包含mRNA稳定序列的苏云金杆菌cryIIIA启动子组成。使用编码氯霉素乙酰转移酶的基因作为标志物(描述于，例如Diderichsen等，1993，Plasmid30：312)。将最终基因构建体通过同源重组入芽孢杆菌属染色体的果胶酸裂合酶基因座来进行整合。
通过PCR使用下表1中所示的引物从质粒7587扩增GH11木聚糖酶基因。质粒7587含有不含结合域且不含信号肽的合成的嗜热网球菌GH11木聚糖酶基因(对于DNA序列，SEQIDNO:304，而对于推定的氨基酸序列，SEQIDNO:305)。
PCR扩增了三个片段以制备构建体：含有截短的木聚糖酶基因的基因片段，和包含于引物中作为悬突的26bp和30bp侧翼DNA序列，上游侧翼片段(包含来自Savinase并用引物260558和iMB1361Uni2扩增的信号肽)和下游侧翼片段(用引物260559和HQHQHQHQP-f扩增)。从菌株iMB1361的基因组DNA扩增侧翼片段(描述于专利申请WO2003/095658)。所有使用的引物列于下表1。
基因片段使用校正读码的聚合酶PHUSIONTMDNA聚合酶根据生产商的指示扩增。将两个侧翼DNA片段用“ExpandHighFidelityPCRSystem”(Roche-Applied-Science)根据标准步骤(遵循生产商的推荐)扩增。PCR条件如下所述：94℃进行2分钟，接着10个循环，每循环(94℃进行15秒，50℃进行45秒，68℃进行4分钟)，接着20个循环，每循环(94℃进行15秒，50℃进行45秒，68℃进行4分钟(每循环+20秒延伸))，最后进行一个循环，在68℃进行10分钟。对3个PCR片段进行后续重叠延伸剪接(SOE)PCR反应以将3个片段装配入一个直链载体构建体。这是通过将3个片段以相同摩尔比混合来进行的，并在下述条件下运行新的PCR反应：在94℃起始2分钟，接着10个循环，每循环(94℃进行15秒，50℃进行45秒，68℃进行5分钟)，10个循环，每循环(94℃进行15秒，50℃进行45秒，68℃进行8分钟)，15个循环，每循环(94℃进行15秒，50℃进行45秒，68℃进行8分钟，每循环进一步增加20秒)。在第1次循环之后添加两个端引物260558和260559(各20pmol)。将两μl的PCR产物转化入枯草芽孢杆菌。在补充6μg每ml的氯霉素的LB平板上选择转化体。将截短的木聚糖酶构建体通过同源重组整合入枯草芽孢杆菌宿主PL4250(AprE-，NprE-，SrfC-，SpoIIAC-，AmyE-，comS+)的基因组。选择一个转化体，EXP01955，以供进一步研究。在该转化体中对木聚糖酶编码区测序。其含有一个导致HQHQHQHQP-标记变为HQHQHQHQQ-标记的突变，但未观察到其他突变。
表1：使用的引物
使用来自枯草芽孢杆菌菌株EXP01955的染色体DNA作为模板以使用下述引物将克劳氏芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶基因(aprH，SAVINASETM，NovoNordiskA/S，Bagsvaerd，Denmark)信号序列/成熟嗜热网球菌木聚糖酶基因(CBM缺失)PCR克隆入pCR2.1-TOPO，所述引物在5’端(紧接aprH核糖体结合位点上游)导入SacI位点和在3’端(紧接着翻译终止密码子之后，翻译终止子在位置691-693的Ser密码子之后导入，由此避免HQHQHQHQQ-标记的并入)导入MluI位点。染色体DNA根据Pitcher等，1989，见上文的步骤获得。
引物062405：
5’-GAGCTCTATAAAAATGAGGAGGGAACCGAATGAAGAAACC-3’(SEQIDNO:294)
引物062406：
5′-ACGCGTTTAGCTGCCCTGAGAGAAAGTG-3′(SEQIDNO:295)
PCR扩增在50μl反应中进行，所述反应包含10ng的枯草芽孢杆菌EXP01955染色体DNA，0.4μM每种引物，各200μM的dATP，dCTP，dGTP，和dTTP，含2.5mMMgCl2的1XPCR缓冲液II，和2.5单位的AmpliTaqDNAPolymerase。反应在40TemperatureCycler中进行，其程序如下：1个循环，在95℃进行10分钟；25个循环，每循环在95℃进行1分钟，50℃进行1分钟，和72℃进行1分钟；和1个循环，在72℃进行7分钟。通过使用0.5XTBE缓冲液的0.8%琼脂糖凝胶电泳解析截短的木聚糖酶基因的大约740kb的PCR产物，从凝胶切出，并使用GelExtractionKit提取。
将740kb片段使用TA-CloningKit根据生产商的指示克隆入2.1，并根据生产商的指示转化入ONETOP10ChemicallyCompetent大肠杆菌细胞。在补充100μg每ml的氨苄青霉素的2XYT琼脂平板上选择转化体，并在37℃温育16小时。将克隆片段的DNA序列用M13正向和反向引物通过DNA测序验证。将质粒命名为pCR2.1-Dtxyl。
DNA测序揭示在编码aprH信号序列的序列的位置19具有额外的G。使用AXLSite-DirectedMutagenesisKit(Strata基因Corp.，LaJolla，CA，USA)以校正质粒pCR2.1-Dtxyl的错误，即使用下述引物缺失额外的G残基：
引物062535：
5’-CCGTTGGGGAAAATTGTCGC-3′(SEQIDNO:296)
引物062536：
5’-GCGACAATTTTCCCCAACGG-3′(SEQIDNO:297)
根据生产商的指示使用试剂盒，并成功地进行改变，得到质粒pCR2.1-Dtxyl2。
质粒pCR2.1-Dtxyl2和pMDT100WO2008/140615用SacI和MluI消化。通过使用0.5XTBE缓冲液的0.8%琼脂糖凝胶电泳解析每个消化物。将大约8.0kb的来自pMDT100的载体片段和大约700bp的来自pCR2.1-Dtxyl2的木聚糖酶基因片段从凝胶切出，并使用GelExtractionKit提取。将两个纯化片段片段使用RapidDNALigationKit连接在一起。
用连接产物根据Young和Spizizen，1961，JournalofBacteriology81：823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，JournalofMolecularBiology56：209-221的方法转化枯草芽孢杆菌168Δ4的感受态细胞。枯草芽孢杆菌168Δ4来源于枯草芽孢杆菌类型菌株168(BGSC1A1，BacillusGeneticStockCenter，Columbus，OH，USA)，并在spoIIAC，aprE，nprE，和amyE基因中具有缺失。四个基因的缺失基本上如针对枯草芽孢杆菌A164Δ5(美国专利号5,891,701)所述的来进行。
在37℃在补充5μg每ml的氯霉素的TBAB平板上生长16小时之后选择枯草芽孢杆菌转化体。为了筛选通过双交换在amyE基因座的质粒整合，将枯草芽孢杆菌初级转化体补缀于补充6μg每ml的新霉素的TBAB平板上和补充5μg每ml的氯霉素的TBAB平板上。通过双交换在amyE基因座的质粒整合并不并入新霉素抗性基因，因此使得菌株对新霉素敏感。鉴定了具有氯霉素抗性，新霉素敏感性的转化体，其在amyE基因座携带嗜热网球菌木聚糖酶表达盒，并命名为具有pSMO271的枯草芽孢杆菌168。
从具有pSMO271的枯草芽孢杆菌168(Pitcher等，1989，见上文)分离基因组DNA，并将0.1μg转化入感受态枯草芽孢杆菌SMO25。在37℃在补充5μg每ml的氯霉素的TBAB平板上选择转化体。氯霉素抗性转化体进行单菌落纯化，并命名为枯草芽孢杆菌SMO47。
将命名为SMO47的枯草芽孢杆菌菌株在琼脂斜面上划线，并在37℃温育约24小时。琼脂培养基每升包含10g的大豆蛋白胨，10g的蔗糖，2g的柠檬酸三钠二水合物，4g的KH2PO4，5g的Na2HPO4，15g的细菌琼脂，0.15mg的生物素，2ml的微量金属，和去离子水加至1升。痕量金属溶液包含1.59g的ZnSO4·7H2O，0.76g的CuSO4·5H2O，7.52g的FeSO4·7H2O，1.88g的MnSO4·H2O，20g的柠檬酸，和去离子水加至1升。使用大约15ml的无菌缓冲液(7.0g的Na2HPO4，3.0g的KH2PO4，4.0g的NaCl，0.2g的MgSO4·7H2O，和去离子水加至1升)轻柔地从琼脂表面洗去部分细胞。然后使用细菌悬液接种含有100ml的生长培养基的带挡板的摇瓶，所述生长培养基包含11g的大豆粉，0.4g的Na2HPO4，5滴消泡剂，和去离子水加至100ml。将接种的摇瓶在37℃以300rpm振荡温育约20小时，之后，使用100ml(通过来自两个含有相同菌株的独立摇瓶的培养基获得)接种含900ml的培养基3升发酵器，所述培养基包含40g的水解的马铃薯蛋白，6g的K2SO4，4g的Na2HPO4，12g的K2HPO4，4g的(NH4)2SO4，0.5g的CaCO3，2g的柠檬酸；4g的MgSO4，40ml的痕量金属溶液(如上所述)，1mg的生物素(生物素作为1g每升生物素溶液添加于如上所述的缓冲液)，1.3ml的消泡剂，和去离子水加至1升。在高压灭菌之前，将培养基用磷酸调整至pH5.25。
发酵作为批次补料发酵进行，其中补料为蔗糖溶液。发酵温度维持恒定在37℃。以3升空气每分钟对罐通气，并将搅拌率维持在1,500-1,800rpm的范围。发酵时间为大约60-70小时。将pH维持在pH6.5-7.3的范围。
根据下述步骤就木聚糖酶活性测定发酵物。将培养上清在0.1M乙酸钠pH5.0中适当地稀释。使用2倍步骤稀释纯化的嗜热网球菌木聚糖酶，在样品缓冲液中起始以1.71μg/ml的浓度并终以0.03μg/ml的浓度。将总共40μl的每个包含标样的稀释物转移至96孔平底板。使用BiomekNX(BeckmanCoulter，Fullert在上CA，USA)，96孔移液工作站，将40μlAzo-Wheat阿拉伯木聚糖(MegazymeInternational，Ireland)底物溶液(1%w/v)添加至每个孔，然后在50℃温育30分钟。在完成温育之后，用200μl的乙醇(95%v/v)停止反应。然后将样品在环境温度温育5分钟接着以3,000rpm进行离心10分钟。移出一百五十微升的上清，并分配入新的96孔平底板。对于96孔板使用250读板器(MolecularDevices，SunnvaleCA，USA)获得590nm的光密度。通过从生成的标准曲线外推来确定样品浓度。
将过滤的培养液添加至2%v/vGC-850(Gulbrandsen，SC，USA)，接着在20,000xg离心20分钟。向上清再次添加2%v/vGC-850，接着以20,000xg离心20分钟。将上清使用配置有具有10kDaMW-CO聚醚砜膜的Slice盒的切线流浓缩器浓缩。将浓缩物在80℃处理30分钟，并通过1.2μm玻璃微纤维过滤器(Whatman，InternationalLtd，Maidstone，England)过滤。将pH调整至pH8.0，并加载于MEPHyperCelTM(PALLCorporation，EastHills，NYUSA)柱上。将结合蛋白用50mM乙酸pH4.5洗脱。将洗脱蛋白用活性碳1%w/v(PicatifFGV120，Pica，France)搅拌15分钟，并在0.2μmPES过滤器(NalgeNuncInternational，NewYork，NYUSA)上过滤。将pH使用3MTris调整至pH5.0。蛋白浓度使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例85：棘孢曲霉菌株CBS172.66GH3β-木糖苷酶的制备
根据下述步骤重组制备棘孢曲霉菌株CBS172.66GHβ-木糖苷酶(SEQIDNO:201[DNA序列]和SEQIDNO:202[推定的氨基酸序列])。
将棘孢曲霉CBS172.66用作具有β-木糖苷酶活性的多肽的来源。
通过U.S.DepartmentofEnergyJointGenomeInstitute(JGI)生成基因组序列信息。从JGI下载基因组的初步装配，并使用Pedant-ProTMSequenceAnalysisSuite(BiomaxInformaticsAG，Martinsried，Germany)分析。使用通过该软件构建的基因模型作为起始点在基因组中检测GH3同源物。使用多个已知GH3蛋白序列作为指导手动构建了更准确的基因模型。
为了生成基因组DNA以供PCR扩增，将棘孢曲霉CBS172.66通过在26℃生长7日在PDA琼脂平板上繁殖。使用从PDA平板收获的孢子接种在带挡板的摇瓶中的25ml的YP+2%葡萄糖培养基，并在26℃以200rpm搅拌温育48小时。基因组DNA根据修饰的SPIN实验方案(Qbiogene，Inc.，Carlsbad，CA，USA)分离。简言之，使用24HomogenizationSystem(MPBiosciences，SantaAna，CA，USA)中的SpinKitforSoil(Qbiogene，Inc.，Carlsbad，CA，USA)。将两ml的来自上述培养物的真菌材料通过以14,000xg离心2分钟来收获。移出上清，并将沉淀重悬于500μl的去离子水。将悬液转移至LysingMatixE管(Qbiogene，Inc.，Carlsbad，CA，USA)，并将790μl的磷酸钠缓冲液和来自SpinKit的100μl的MT缓冲液添加至管。然后将样品置于Instrument(Qbiogene，Inc.，Carlsbad，CA，USA)中，并在5.5m/秒的速度处理60秒。然后将样品以14,000xg进行离心两分钟，并将上清转移至干净的管。添加来自SpinKit的250μl体积的PPS试剂，然后将样品通过倒置轻柔地混合。再次将样品以14,000xg进行离心5分钟。将上清转移至15ml管，然后是来自SpinKit的1ml的BindingMatix悬液，然后通过倒置混合两分钟。将样品置于静止的管架，并允许二氧化硅基质沉降3分钟。移出500μl体积的上清并弃去，然后将剩余样品重悬于基质。然后将样品转移至来自SpinKit的SPIN过滤管，并以14,000xg离心1分钟。将接收管倒空，并将剩余基质悬液添加至SPIN过滤管。再次将样品离心(14,000xg，1分钟)。将来自SpinKit的500μl体积的SEWS-M溶液添加至SPIN过滤管，并将样品以相同速度进行离心1分钟。将接收管倒空，并将SPIN滤器重置于接收管。将单元以14,000xg离心2分钟以“干燥”剩余SEWS-M洗涤溶液的基质。将SPIN滤器置于新鲜的接收管，并允许在室温风干5分钟。将基质轻柔地用移液尖重悬于100μl的DES(不含DNA酶/热原的水)。将单元离心(14,000xg，1分钟)以洗脱基因组DNA，接着用100μl的10mMTris，0.1mMEDTA，pH8.0通过再次以14,000xg离心1分钟进行洗脱，并合并洗脱物。从接收管收获的DNA浓度通过UV分光光度计在260nm测量。
设计如下文所示的合成寡核苷酸引物以从在实施例2中制备的基因组DNAPCR扩增棘孢曲霉CBS172.66GH3基因。使用IN-FUSIONTMCloningKit(Clontech，MountainView，CA，USA)以将片段直接克隆入表达载体pDau109(WO2005/042735)。
引物GH3-114f：
5’-ACACAACTGGGGATCCACCATGGCTGTGGCGGCTCTT-3’(SEQIDNO:298)
引物GH3-114r：
5’-AGATCTCGAGAAGCTTACTACTCATCCCCCTGCAC-3’(SEQIDNO:299)
用从实施例2制备的基因组DNA进行PCR反应以供扩增在实施例1中鉴定出的基因。PCR反应包含1μl的基因组DNA，1μl的正向引物(f)(50μM)；1μl的反向引物(r)(50μM)；10μl的5XHF缓冲液，2μl的10mMdNTP；1μl的DNA聚合酶，和PCR-级水加至50μl。同时使用引物GH3-114f和GH3-114r。
PCR反应使用PCR仪进行，其程序如下：在98℃进行2分钟，接着20个降落循环，每循环在98℃进行15秒，70℃(-1℃/循环)进行30秒，和72℃进行2分30秒；和25个循环，每循环在98℃进行15秒，60℃进行30秒，72℃进行2分30秒；和在72℃进行5分钟。
通过使用40mMTris碱，20mM乙酸钠，1mMEDTA二钠(TAE)缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中从凝胶切出大约2.5至3.0kbPCR产物条带，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。将对应于棘孢曲霉GH3基因的DNA使用IN-FUSIONTMDry-DownPCRCloningKit根据生产商的指示克隆入用BamHI和HindIII直链化的表达载体pDAu109(WO2005042735)。
使用2.5μl体积的五倍稀释的连接混合物转化大肠杆菌TOP10化学感受态细胞。在含有100μg每ml的氨苄青霉素LB琼脂平板上选择了五个菌落，并在补充100μg每ml的氨苄青霉素的3ml的LB培养基中培养过夜。使用PlasmidMiniKit根据生产商的指示纯化质粒DNA。将棘孢曲霉GH3基因序列通过Sanger测序用AppliedBiosystemsModel3700AutomatedDNASequencer使用版本3.1BIG-DYETM终止子化学(AppliedBiosystems，Inc.，FosterCity，CA，USA)(AppliedBiosystems，Inc.，FosterCity，CA，USA)进行验证。就其品质审视核苷酸序列数据，并将所有序列以PHRED/PHRAP软件(UniversityofWashington，Seattle，WA，USA)的协助相互比较。
编码序列为2412bp，包括终止密码子，并不含内含子。编码的预测的蛋白为803个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，1997，见上文)，预测了17个残基的信号肽。预测的成熟蛋白含有786个氨基酸。
将最佳转化体的孢子涂布于含有0.01%X-100的COVE平板以供分离单个菌落。将铺板在含有1M蔗糖和10mM硝酸钠，补充10mM乙酰胺和15mMCsCl的COVE蔗糖培养基(Cove，1996，Biochim.Biophys.Acta133：51-56)上总共重复两次。然后在250ml摇瓶中使用DAP-2C-1培养基在30℃以100rpm振荡实施发酵4日。将培养液使用标准方法过滤。
将硫酸铵添加至过滤的培养液至2M的浓度。在使用0.2μmPES过滤器(ThermoFisherScientific，Roskilde，Denmark)过滤之后，将滤过物加载于在含2M硫酸铵的25mMHEPESpH7.0中平衡的PhenylSepharoseTM6FastFlow柱(highsub)(GEHealthcare，Piscataway，NJ，USA)，并将结合蛋白用不含硫酸铵的25mMHEPESpH7.0洗脱。将级分汇集，并施于在25mMHEPESpH7.0中平衡的SephadexTMG-25(介质)(GEHealthcare，Piscataway，NJ，USA)柱。将级分汇集，然后施于在25mMHEPESpH7.0中平衡的SOURCETM15Q(GEHealthcare，Piscataway，NJ，USA)柱，并将结合蛋白用0-1000mM氯化钠的线性梯度洗脱。蛋白浓度使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例86：棘孢曲霉菌株CBS186.67GH3β-木糖苷酶的制备
根据下述步骤重组制备棘孢曲霉菌株CBS186.67GH3β-木糖苷酶(SEQIDNO:203[DNA序列]和SEQIDNO:204[推定的氨基酸序列])。
根据描述于实施例73的步骤分离基因组DNA。
将棘孢曲霉β-木糖苷酶基因通过PCR使用如下文所示的两个克隆引物GH3-101f和GH3-101r分离，所述引物基于公众可获得的棘孢曲霉xyl2全长序列(GenBankAB462375.1)设计以供使用IN-FUSIONTM策略直接克隆。
引物GH3-101f：
5’-acacaactggggatccaccatggctgtggcggctcttgctctgctgg-3’(SEQIDNO:300)
引物GH3-101r：
5’-agatctcgagaagcttaCTCATCCCCCGCCACCCCCTGCACCTCC-3’(SEQIDNO:301)
PCR反应用从棘孢曲霉CBS186.67制备的基因组DNA进行以供扩增全长基因。PCR反应包含1μl的基因组DNA，0.75μl的引物GH3-101.1f(10μM)，0.75μl的引物GH3-101.1r(10μM)，3μl的5XHF缓冲液，0.25μl的50mMMgCl2，0.3μl的10mMdNTP，0.15μl的DNA聚合酶，和PCR级水加至15μl。将PCR反应进行使用PCR仪，其程序如下：在98℃进行2分钟，接着10个降落循环，每循环在98℃进行15秒，70℃(-1℃/循环)进行30秒，和72℃进行2分30秒；和25个循环，每循环在98℃进行15秒，60℃进行30秒，72℃进行2分30秒，和在72℃进行5分钟。
通过使用TAE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中从凝胶切出大约2.4kbPCR产物，并使用PCRDNA和GelBandPurificationKit根据生产商的指示纯化。将对应于棘孢曲霉β-木糖苷酶基因的DNA使用IN-FUSIONTMDry-DownPCRCloningKit根据生产商的指示克隆入用BamHI和HindIII直链化的表达载体pDAu109(WO2005042735)。
使用2.5μl体积的稀释的连接混合物转化大肠杆菌TOP10化学感受态细胞。在含有100μg每ml的氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择了三个菌落，并在补充100μg每ml的氨苄青霉素的3ml的LB培养基中培养过夜。使用PlasmidMiniKit根据生产商的指示纯化质粒DNA。在异源表达之前，棘孢曲霉β-木糖苷酶基因序列通过Sanger测序验证。
编码序列为2454bp，包括终止密码子。所述基因并不含有内含子。编码的预测的蛋白为817个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineering10：1-6)，预测了17个残基的信号肽。预测的成熟蛋白含有800氨基酸。
米曲霉MT3568的原生质体如WO95/02043中所述制备。米曲霉MT3568为米曲霉JaL355(WO2002/40694)破坏amdS(乙酰胺酶)基因的衍生物，其中通过用pyrG基因破坏米曲霉乙酰胺酶(amdS)基因来恢复pyrG原养型。将一百微升的原生质体悬液与2.5-15μg的曲霉属表达载体混合，并添加250μl的60%PEG4000，10mMCaCl2，和10mMTris-HClpH7.5，并轻柔地混合。将混合物在37℃温育30分钟，并将原生质体涂布于补充10mM乙酰胺和15mMCsCl的COVE蔗糖(1M)平板以供转化体选择。在37℃温育4-7日之后，将几个转化体的孢子接种于YP-2%麦芽糊精培养基上。在30℃培养4日之后分析培养液以供基于其产生大量活性棘孢曲霉β-木糖苷酶的能力鉴定最佳转化体。筛选如下所述基于通过SDS-PAGE确定的对应于异源表达的蛋白的条带强度和对4-硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷(pNPX)的酶活性。将十μl的培养液与90μl的测定试剂混合，所述试剂含有10μl的0.1%20，10μl的1M柠檬酸钠pH5，4μl溶解于DMSO的100mM的pNPX底物(SigmaAldrich)(在储备溶液中最终体积为0.4%)，和过滤的水。测定在37℃进行30分钟，并在405nm在添加100μl的1M碳酸钠pH10之前和之后确定吸光度。将在405nm的最高吸光度值关联于SDS-PAGE数据以供选择最佳转化体。
将命名为米曲霉EXP3611的最佳转化体的孢子涂布于含有0.01%X-100的COVE平板以供分离单个菌落。将铺板在含有1M蔗糖和10mM硝酸钠，补充10mM乙酰胺和15mMCsCl的COVE蔗糖培养基(Cove，1996，Biochim.Biophys.Acta133：51-56)上总共重复两次。然后在250ml摇瓶中使用DAP-4C-1培养基在30℃以100rpm振荡实施发酵4日。将培养液使用标准方法过滤。蛋白浓度使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例87：烟曲霉菌株NN051616GH3β-木糖苷酶Q0H905的制备
根据下述步骤重组制备烟曲霉菌株NN051616GH3β-木糖苷酶(SEQIDNO:205[DNA序列]和SEQIDNO:206[推定的氨基酸序列])。
设计如下文所示的两种合成寡核苷酸引物以从基因组DNAPCR扩增烟曲霉β-木糖苷酶基因。使用AInFusionCloningKit(Clontech，MountainView，CA)以将片段直接克隆入表达载体pAILo2(WO2005/074647)，无需进行限制性消化和连接。
正向引物：
5’-ACTGGATTTACC-3′(SEQIDNO:302)
反向引物：
5’-TCACCTCTAGTTAATTAA-3’(SEQIDNO:303)
粗体字母代表编码序列。剩余序列与pAlLo2的插入位点同源。
将十五皮摩尔的上述每种引物用于PCR反应，其含有250ng的烟曲霉基因组DNA，含MgCl2的1XExpandHighFidelity缓冲液(RocheAppliedScience，Indianapolis，IN)，1μl的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP的10mM混合物，0.75单位的ExpandHighFidelityEnzymeMix(RocheAppliedScience，Indianapolis，IN)，其终体积为50μl。扩增条件为一个循环，在94℃进行2分钟；10个循环，每循环在94℃进行15秒，56.5℃进行30秒，和72℃进行2分钟；和20个循环，每循环在94℃进行15秒，56.5℃进行30秒，和72℃进行2分钟，每后续循环增加5秒。然后将加热块在72℃维持7分钟，接着进行4℃浸泡循环。
使用TAE缓冲液在1.0%琼脂糖凝胶上分离反应产物，并从凝胶切出2.4kb产物条带，并使用GelExtractionKit(QIAGENInc.，Valencia，CA)根据生产商的指示纯化。
然后将片段使用InFusionCloningKit克隆入pAlLo2。将载体用NcoI和PacI(使用生产商指明的条件)消化。将片段通过凝胶电泳和QIAquick试剂盒(QIAGENInc.，Valencia，CA)凝胶纯化来纯化。将基因片段和消化的载体在反应中合并在一起，得到表达质粒pAG57，其中烟曲霉β-木糖苷酶基因的转录处于NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体)的调控之下。重组反应(20μl)包含1XInFusionBuffer(Clontech，MountainView，CA)，1XBSA(Clontech，MountainView，CA)，1μl的InFusion酶(1:10稀释)(Clontech，MountainView，CA)，182ng用NcoI和PacI消化的pAlLo2，和97.7ng的烟曲霉β-木糖苷酶纯化的PCR产物。将反应在37℃温育15分钟，接着在50℃温育15分钟。将反应用40μl的TE缓冲液稀释，并使用2.5μl的稀释反应物转化大肠杆菌Top10感受态细胞。通过限制酶消化鉴定含有pAG57(烟曲霉β-木糖苷酶基因)的大肠杆菌转化体和使用9600制备质粒DNA。pAG57质粒构建体使用AppliedBiosystems3130xlGeneticAnalyzer(AppliedBiosystems，FosterCity，CA，USA)测序以验证序列。
米曲霉JaL355原生质体根据Christensen等，1988，Bio/Technology6：1419-1422的方法制备，并用5μg的pAG57转化。将二十四个转化体分离至单个PDA平板。
将从二十四个转化体的每个的原始转化平板取的栓分别添加至在24孔板中的1ml的M410，其在34℃温育。在三日温育之后，使用Criterion无染色，8-16%梯度SDS-PAGE，(BioRad，Hercules，CA)根据生产商的指示分析来自每个培养的7.5μl的上清。培养物的SDS-PAGE概貌显示几个转化体具有大约130kDa的新的主要条带。
最高表达转化体的汇合的PDA平板用5ml的0.01%20洗涤，并接种入含有100ml的M410培养基的500mlErlenmeyer烧瓶。接种的烧瓶在34℃进行振荡3日来温育。培养液通过0.22μmStericup吸滤器(Millipore，Bedford，MA)过滤。
将过滤的培养液浓缩并使用配置有10kDa聚醚砜膜(PALLFiltron，Northborough，MA，USA)的切线流浓缩器(PALLFiltron，Northborough，MA，USA)用50mM乙酸钠pH5.0进行缓冲液交换。蛋白浓度使用MicroplateBCATMProteinAssayKit确定，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例88：在50-65℃在磨制的、未洗涤的PCS的糖化中衡量替代在高温酶组合物中CBHI组分的两种纤维二糖水解酶I
在50℃，55℃，60℃，和65℃使用磨制的、未洗涤的PCS作为底物测试两种纤维二糖水解酶I蛋白替代高温酶组合物中CBHI组分(3mg总蛋白每g纤维素)的能力。高温酶组合物含有37%CBHI，25%烟曲霉Cel6ACBHII，10%嗜热毁丝霉Cel5AEGII，15%具有纤维素分解增强活性的青霉属菌种GH61A多肽，5%烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶，5%烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶，和3%里氏木霉GH3β-木糖苷酶。
在高温酶组合物中测试下述每个CBHI：烟曲霉Cel7ACBHI和埃默森青霉Cel7ACBHI。
测定如实施例34中所述进行。含磨制的、未洗涤的PCS(5%不溶性固形物)的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及水解开始时的单次混合。
如图29中所示，埃默森青霉Cel7ACBHI的性能与烟曲霉Cel7ACBHI在50℃相同，并与烟曲霉Cel7ACBHI在55-65℃相比较性能更佳(因为埃默森青霉Cel7ACBHI的纤维素转化至葡萄糖的程度与烟曲霉Cel7ACBHI在55-65℃相比较更高)。
实施例89：在50-65℃在磨制的、未洗涤的PCS的糖化中衡量替代高温酶组合物中的CBHI组分的两种纤维二糖水解酶I
在50℃，55℃，60℃，和65℃使用磨制的、未洗涤的PCS作为底物测试两种纤维二糖水解酶I蛋白替代高温酶组合物中的CBHI组分(3mg总蛋白每g纤维素)的能力。高温酶组合物含有40%CBHI，25%烟曲霉Cel6ACBHII，10%嗜热毁丝霉Cel5AEGII，15%具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，5%烟曲霉GH10木聚糖酶，和5%烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶。
在高温酶组合物中测试了下述每个CBHI：烟曲霉Cel7ACBHI和嗜松青霉Cel7ACBHI。将含有烟曲霉Cel7ACBHI的高温组合物以3.3mg总蛋白每克纤维素而非3mg总蛋白每克纤维素加载，其中加载嗜松青霉Cel7ACBHI。
测定如实施例34中所述进行。含5%磨制的、未洗涤的PCS的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及水解开始时的单次混合。
如图30中所示，嗜松青霉Cel7ACBHI在整个温度范围性能良好。嗜松青霉Cel7ACBHI与烟曲霉Cel7ACBHI在50℃和55℃性能大约相同，但与烟曲霉Cel7ACBHI在60℃和65℃相比较性能略低。
实施例90：在50-65℃在磨制的、未洗涤的PCS的糖化中衡量替代高温酶组合物中的CBHI组分的两种纤维二糖水解酶I
在50℃，55℃，60℃，和65℃使用磨制的、未洗涤的PCS作为底物测试两种纤维二糖水解酶I蛋白替代高温酶组合物中的CBHI组分(3mg总蛋白每g纤维素)的能力。高温酶组合物含有37%CBHI，25%烟曲霉Cel6ACBHII，10%嗜热毁丝霉Cel5AEGII，15%具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，5%烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶，5%烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶，和3%里氏木霉GH3β-木糖苷酶。
在高温酶组合物中测试下述每个CBHI：烟曲霉Cel7ACBHI和土曲霉Cel7ACBHI。
测定如实施例34中所述进行。含磨制的、未洗涤的PCS的1ml反应(5%不溶性固形物)在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及水解开始时的单次混合。
如图31中所示，在55℃土曲霉Cel7ACBHI的性能与烟曲霉Cel7ACBHI的性能相同，而在60-65℃则较低；然而，在50℃，对于土曲霉Cel7ACBHI，纤维素转化至葡萄糖的程度与烟曲霉Cel7ACBHI在50℃相比高得多。
实施例91：在50-60℃在磨制的、未洗涤的PCS的糖化中衡量替代高温酶组合物中的CBHI组分的三种纤维二糖水解酶I
在50℃，55℃，和60℃使用磨制的、未洗涤的PCS作为底物测试三种纤维二糖水解酶I蛋白替代高温酶组合物中的CBHI组分(3mg总蛋白每g纤维素)的能力。高温酶组合物含有45%CBHI，25%土生梭孢霉Cel6ACBHII，5%里氏木霉Cel7BEGI，5%桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，5%具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，5%具有纤维素分解增强活性的土生梭孢霉GH61E多肽，5%烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶，和5%烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶。
在高温酶组合物中测试下述每个CBHI：烟曲霉Cel7ACBHI，费希新萨托菌Cel7ACBHI，和构巢曲霉Cel7ACBHI。
测定如实施例34中所述进行。含磨制的、未洗涤的PCS的1ml反应(5%不溶性固形物)在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及水解开始时的单次混合。
如图32中所示，费希新萨托菌Cel7ACBHI的性能与烟曲霉Cel7ACBHI的性能相比较在50℃和55℃较低，但性能在60℃相同。构巢曲霉Cel7ACBHI的性能与烟曲霉Cel7ACBHI在50℃几乎相同，在55℃和60℃显示较低的水解。
实施例92：在50-65℃在磨制的、未洗涤的PCS的糖化中衡量替代高温酶组合物中的CBHII组分的两种纤维二糖水解酶II
在50℃，55℃，60℃，和65℃使用磨制的、未洗涤的PCS作为底物测试两种纤维二糖水解酶II蛋白替代高温酶组合物中的CBHII组分(3mg总蛋白每g纤维素)的能力。高温酶组合物含有37%烟曲霉Cel7ACBHI，25%CBHII，10%嗜热毁丝霉Cel5AEGII，15%具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，5%烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶，5%烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶，和3%里氏木霉GH3β-木糖苷酶。
在高温酶组合物中测试下述每个CBHII：烟曲霉Cel6ACBHII和FinnellianiveaCel6ACBHII。
测定如实施例34中所述进行。含磨制的、未洗涤的PCS的1ml反应(5%不溶性固形物)在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及水解开始时的单次混合。
如图33中所示，FinnellianiveaCel6ACBHII在50-55℃性能良好，因为其显示类似于烟曲霉Cel6ACBHII在50-55℃的水解水平，但性能在60-65℃衰减。
实施例93：在50-65℃在磨制的、未洗涤的PCS的糖化中衡量替代高温酶组合物中的CBHII组分的三种纤维二糖水解酶II
在50℃，55℃，60℃，和65℃使用磨制的、未洗涤的PCS作为底物测试三种纤维二糖水解酶II蛋白替代高温酶组合物中的CBHII组分(3mg总蛋白每g纤维素)的能力。高温酶组合物含有37%烟曲霉Cel7ACBHI，25%CBHII，10%里氏木霉Cel5AEGII，15%具有纤维素分解增强活性的青霉属菌种GH61A多肽，5%烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶，5%烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶，和3%里氏木霉GH3β-木糖苷酶。
在高温酶组合物中测试下述每个CBHII：烟曲霉Cel6ACBHII，埃默森青霉Cel6ACBHII，和嗜松青霉Cel6ACBHII。
测定如实施例34中所述进行。含磨制的、未洗涤的PCS的1ml反应(5%不溶性固形物)在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及水解开始时的单次混合。
如图中所示34，埃默森青霉Cel6ACBHII在整个温度范围性能良好。埃默森青霉Cel6ACBHII与烟曲霉Cel6ACBHII在50℃性能几乎一样好，但与烟曲霉Cel6ACBHII相比较在55-65℃性能略较低。嗜松青霉Cel6ACBHII的性能在50℃和55℃与烟曲霉Cel6ACBHII的性能相当；然而，性能在60℃和65℃衰减。
实施例94：在50-65℃在磨制的、未洗涤的PCS的糖化中衡量替代高温酶组合物中的内切葡聚糖酶组分的三种内切葡聚糖酶II
在50℃，55℃，60℃，和65℃使用磨制的、未洗涤的PCS作为底物测试三种内切葡聚糖酶II蛋白替代高温酶组合物中的内切葡聚糖酶组分(3mg总蛋白每g纤维素)的能力。高温酶组合物含有40%烟曲霉Cel7ACBHI，25%烟曲霉Cel6ACBHII，10%EG纤维素酶，15%具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，5%烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶，和5%烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶。
在高温酶组合物中测试下述每个EGII：烟曲霉Cel5AEGII，费希新萨托菌Cel5AEGII，和嗜热毁丝霉Cel5AEGII。
测定如实施例34中所述进行。含磨制的、未洗涤的PCS的1ml反应(5%不溶性固形物)在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及水解开始时的单次混合。
如图35中所示，所有的内切葡聚糖酶II蛋白在该温度范围内性能类似，其中费希新萨托菌Cel5AEGII和嗜热毁丝霉Cel5AEGII在50℃和55℃具有类似活性，而烟曲霉Cel5AEGII在60℃和65℃与费希新萨托菌Cel5AEGII和嗜热毁丝霉Cel5AEGII具有相当的活性。
实施例95：在50-65℃在磨制的、未洗涤的PCS的糖化中衡量替代高温酶组合物中的β-葡糖苷酶组分的两种β-葡糖苷酶
在50℃，55℃，60℃，和65℃使用磨制的、未洗涤的PCS作为底物测试三种β-葡糖苷酶蛋白替代高温酶组合物中的β-葡糖苷酶组分(3mg总蛋白每g纤维素)的能力。高温酶组合物含有37%烟曲霉Cel7ACBHI，25%烟曲霉Cel6ACBHII，10%嗜热毁丝霉Cel5AEGII，15%具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，5%β-葡糖苷酶，5%烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶，和3%里氏木霉GH3β-木糖苷酶。
在高温酶组合物中测试下述每个β-葡糖苷酶：烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶和棘孢曲霉β-葡糖苷酶。
测定如实施例34中所述进行，除了葡萄糖背景之外，其中40g每升的葡萄糖包含于反应中。含磨制的、未洗涤的PCS的1ml反应(5%不溶性固形物)在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及水解开始时的单次混合。
如图36中所示，棘孢曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶与烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶相比较在所有温度具有略较高或类似的性能。
实施例96：在50-60℃在磨制的、未洗涤的PCS的糖化中衡量替代高温酶组合物中的β-葡糖苷酶组分的四种β-葡糖苷酶
在50℃，55℃，和60℃使用磨制的、未洗涤的PCS作为底物在高温酶组合物中衡量四种β-葡糖苷酶的每一个，包括烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶，川地曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶，棒曲霉Cel3β-葡糖苷酶，和埃默森踝节菌Cel3Aβ-葡糖苷酶。高温酶组合物含有45%烟曲霉Cel7ACBHI，25%土生梭孢霉Cel6ACBHII，5%里氏木霉Cel7BEGI，5%桔橙嗜热子囊菌Cel5AEGII，5%具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，5%具有纤维素分解增强活性的土生梭孢霉GH61E多肽，5%烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶，和5%β-葡糖苷酶。高温酶组合物以3.0mg总蛋白每g纤维素使用。
测定如实施例34中所述进行。含磨制的、未洗涤的PCS的1ml反应(5%不溶性固形物)在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及水解开始时的单次混合。
图37中所示的结果表明所有的β-葡糖苷酶，除了埃默森踝节菌Cel3Aβ-葡糖苷酶之外，在所有的三个温度具有类似性能。埃默森踝节菌Cel3Aβ-葡糖苷酶在50℃和55℃具有较低活性，但在60℃具有相等的活性。
实施例97：在50-65℃在磨制的、未洗涤的PCS的糖化中衡量替代高温酶组合物中的β-葡糖苷酶组分的三种β-葡糖苷酶
在50℃，55℃，60℃，和65℃使用磨制的、未洗涤的PCS作为底物在高温酶组合物中衡量三种β-葡糖苷酶的每一个，包括烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶，草酸青霉Cel3Aβ-葡糖苷酶(实施例77)，和草酸青霉Cel3Aβ-葡糖苷酶(实施例78)。高温酶组合物含有40%烟曲霉Cel7ACBHI，25%烟曲霉Cel6ACBHII，10%嗜热毁丝霉Cel5AEGII，15%具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，5%烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶，和5%β-葡糖苷酶。高温酶组合物以3.0mg总蛋白每g纤维素使用。
测定如实施例34中所述进行。含磨制的、未洗涤的PCS的1ml反应(5%不溶性固形物)在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及水解开始时的单次混合。
图38中所示的结果表明β-葡糖苷酶活性在所有温度具有类似的活性。
实施例98：在50-65℃使用磨制的、洗涤的PCS衡量三种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽增强高温酶组合物的PCS水解活性的能力
使用磨制的、洗涤的PCS在50℃，55℃，60℃，和65℃衡量三种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的每一个(桔橙嗜热子囊菌GH61A，青霉属菌种GH61A，和痂状嗜热子囊菌GH61A)的增强高温酶组合物PCS水解活性的能力。将每个GH61多肽分别以11.6%酶添加于高温酶混合物。高温酶组合物含有43.5%烟曲霉Cel7ACBHI，29%烟曲霉Cel6ACBHII，12%嗜热毁丝霉Cel5AEGII，6%烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶，6%烟曲霉GH10xyn3木聚糖酶，和4%里氏木霉GH3β-木糖苷酶。将对于含有GH61多肽(2.3725mg总蛋白每g纤维素)的酶组合物的结果与对于未添加GH61多肽的类似的酶组合物(2.125mg总蛋白每g纤维素)的结果相比较。
测定如实施例34中所述进行。含磨制的、洗涤的PCS的1ml反应(5%不溶性固形物)在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及水解开始时的单次混合。
如图39中所示，所有三种GH61多肽显示显著的纤维素酶增强活性，其中桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，青霉属菌种GH61A多肽，和痂状嗜热子囊菌GH61A多肽在50℃和55℃具有类似的增强，而桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽在60℃和65℃比青霉属菌种GH61A多肽和痂状嗜热子囊菌GH61A多肽具有更高的活性。
实施例99：在50-65℃在磨制的、未洗涤的PCS的糖化中衡量替代高温酶组合物中的木聚糖酶组分的三种木聚糖酶
在50℃，55℃，60℃，和65℃使用磨制的、未洗涤的PCS作为底物测试三种木聚糖酶替代高温酶组合物中的木聚糖酶组分(3mg总蛋白每g纤维素)的能力。高温酶组合物含有37%烟曲霉Cel7ACBHI，25%烟曲霉Cel6ACBHII，10%嗜热毁丝霉Cel5AEGII，15%具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，5%烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶，3%里氏木霉GH3β-木糖苷酶和5%木聚糖酶。
在高温酶组合物中测试下述每个木聚糖酶：烟曲霉GH10木聚糖酶3，埃默森踝节菌GH10木聚糖酶，和埃默森青霉GH10木聚糖酶。
测定如实施例34中所述进行。含磨制的、未洗涤的PCS的1ml反应(5%不溶性固形物)在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及水解开始时的单次混合。
如图40中所示，埃默森踝节菌GH10木聚糖酶和埃默森青霉GH10木聚糖酶在所有的三个温度具有与烟曲霉GH10木聚糖酶3类似的活性。
实施例100：通过向高温酶组合物添加木聚糖酶组分在50-60℃在磨制的、未洗涤的PCS的糖化中衡量三种木聚糖酶
在50℃，55℃，和60℃使用磨制的、未洗涤的PCS作为底物，作为对高温酶组合物(3.5mg总蛋白每g纤维素)的10%添加衡量三种木聚糖酶的每一个。高温酶组合物含有45%烟曲霉Cel7ACBHI，25%嗜热毁丝霉Cel6ACBHII，10%嗜热毁丝霉Cel5AEGII，5%具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，5%具有纤维素分解增强活性的土生梭孢霉GH61E多肽，和5%巴西青霉Cel3Aβ-葡糖苷酶。
在高温酶组合物中测试下述每个木聚糖酶：烟曲霉GH10木聚糖酶(xyl3)，巨多孔菌GH10木聚糖酶，和嗜热网球菌GH11木聚糖酶。
测定如实施例34中所述进行。含磨制的、未洗涤的PCS的1ml反应(5%不溶性固形物)在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及水解开始时的单次混合。
如图中所示41，所有的三种木聚糖酶增加了高温酶组合物的水解。烟曲霉GH10木聚糖酶和巨多孔菌GH10木聚糖酶在50℃和55℃具有相同的活性，但烟曲霉GH10木聚糖酶3在60℃具有比巨多孔菌GH10木聚糖酶显著更高的活性。嗜热网球菌GH11木聚糖酶在所有的三个温度具有比烟曲霉GH10木聚糖酶3更低的活性，但随着温度增加至60℃，嗜热网球菌GH11木聚糖酶具有增加的活性。
实施例101：在50-60℃在磨制的、未洗涤的PCS的水解中含有不同的纤维二糖水解酶和木聚糖酶的基于XCL-602的酶组合物的比较
在50℃，55℃，和60℃使用磨制的、未洗涤的PCS作为底物测试四种含有不同的纤维二糖水解酶和木聚糖酶基于XCL-602的酶组合物。在基于XCL-602的酶组合物中测试的纤维二糖水解酶为烟曲霉Cel7ACBHI和埃默森青霉Cel7CBHI。测试的木聚糖酶为烟曲霉GH10木聚糖酶3和褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶。基于XCL-602的酶组合物含有40%XCL-602，20%CBHI，20%烟曲霉Cel6ACBHII，12.5%青霉属菌种GH61A，5%木聚糖酶，和2.5%埃默森踝节菌GH3β-木糖苷酶。含有烟曲霉Cel7ACBHI的基于XCL-602的酶组合物以3.0，5.0，和7.0mg蛋白每g纤维素测试，而含有埃默森青霉Cel7CBHI的基于XCL-602的酶组合物以3.0mg蛋白每g纤维素测试。为了比较，基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶以3.0，5.0，和7.0mg蛋白每g纤维素测试。
测定如实施例34中所述进行。含磨制的、未洗涤的PCS的1ml反应(5%不溶性固形物)在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应重复进行三次，并涉及水解开始时的单次混合。
对于3mg蛋白每g纤维素的结果显示于图42。两种木聚糖酶，烟曲霉GH10木聚糖酶3和褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶在含烟曲霉Cel7ACBHI或埃默森青霉Cel7CBHI的基于XCL-602的酶组合物中显示类似性能。对于在含任一木聚糖酶的基于XCL-602的酶组合物中的CBHI，埃默森青霉Cel7CBHI在所有的三个温度与烟曲霉Cel7ACBHI相比较具有略较高的性能。最终，所有的用CBHI，CBHII，GH61，木聚糖酶，和β-木糖苷酶替代的基于XCL-602的酶组合物在所有的三个温度与未替代的基于里氏木霉的XCL-602纤维素酶相比较具有显著较高的水解。在80%葡萄糖转化时，含有烟曲霉Cel7ACBHI的基于XCL-602的酶组合物和任一木聚糖酶在55℃需要4.3mg蛋白每g纤维素，而XCL-602在50℃需要6.5mg蛋白每g纤维素，蛋白加载量减少1.5倍。
通过下述编号的段落描述进一步本发明：
[1]一种用于降解或转化纤维素材料的方法，包括：用本发明的酶组合物处理纤维素材料。
[2]段1的方法，其中所述纤维素材料经预处理。
[3]段1和2的方法，进一步包括回收经降解的纤维素材料。
[4]段19的方法，其中所述经降解的纤维素材料是糖。
[5]段20的方法，其中所述糖选自下组：葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖。
[6]一种用于产生发酵产物的方法，包括：(a)用本发明4的酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种(几种)发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从发酵回收发酵产物。
[7]段6的方法，其中所述纤维素材料经预处理。
[8]段6或7的方法，其中步骤(a)和(b)在同步糖化和发酵中同时进行。
[9]段6-8中任一项的方法，其中所述发酵产物是醇、有机酸、酮、氨基酸或气体。
[10]一种发酵纤维素材料的方法，包括，用一种或多种(几种)发酵微生物发酵纤维素材料，其中所述纤维素材料是用本发明的酶组合物糖化的。
[11]段10的方法，其中所述纤维素材料在糖化之前经预处理。
[12]段10或11的方法，其中所述纤维素材料的发酵产生发酵产物。
[13]段12的方法，进一步包括从发酵回收发酵产物。
[14]段12或13的方法，其中所述发酵产物是醇、有机酸、酮、氨基酸或气体。
本文中描述和要求保护的发明的范围不受本文中公开的具体方面所限，因为这些方面旨在说明本发明的几个方面。任何等同的方面旨在处于本发明的范围之内。事实上，除了本文中显示和描述的那些之外，本发明的多种修饰对于本领域技术人员根据前文描述会是显而易见的。此类修饰亦旨在落在所附权利要求的范围内。在出现冲突时，以包括定义的本公开为准。

Claims (96)

1.一种酶组合物，其包含
(I)多肽，其具有选自下组的纤维二糖水解酶I活性：
(a)多肽，其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列为SEQIDNO:158的成熟多肽；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列为SEQIDNO:157的成熟多肽编码序列；
(II)多肽，其具有选自下组的纤维二糖水解酶II活性：
(a)多肽，其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列为SEQIDNO:18的成熟多肽；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列为SEQIDNO:17的成熟多肽编码序列；
(III)多肽，其具有选自下组的内切葡聚糖酶I活性：
(a)多肽，其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列为SEQIDNO:20的成熟多肽；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列为SEQIDNO:19的成熟多肽编码序列；
(IV)多肽，其具有选自下组的内切葡聚糖酶II活性：
(a)多肽，其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列为SEQIDNO:26的成熟多肽；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列为SEQIDNO:25的成熟多肽编码序列；和
(V)多肽，其具有选自下组的β-葡糖苷酶活性：
(a)多肽，其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列为SEQIDNO:178的成熟多肽；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列为SEQIDNO:177的成熟多肽编码序列；其中所述酶组合物用于纤维素材料的糖化，该纤维素材料的糖化在40℃至70℃的范围的温度用所述酶组合物进行。
2.权利要求1的酶组合物，其中所述糖化的温度范围为50℃至65℃。
3.权利要求1的酶组合物，其中所述糖化的温度范围为55℃至63℃。
4.权利要求1的酶组合物，其中所述糖化的温度范围为55℃至60℃。
5.权利要求1的酶组合物，其中具有纤维二糖水解酶I活性的多肽为埃默森青霉(Penicilliumemersonii)Cel7纤维二糖水解酶I。
6.权利要求1的酶组合物，其中具有纤维二糖水解酶II活性多肽为烟曲霉(Aspergillusfumigatus)Cel6A纤维二糖水解酶II。
7.权利要求1的酶组合物，其中具有内切葡聚糖酶I活性的多肽为土曲霉Cel7A内切葡聚糖酶I。
8.权利要求1的酶组合物，其中具有内切葡聚糖酶II活性的多肽为桔橙嗜热子囊菌Cel5A内切葡聚糖酶II。
9.权利要求1的酶组合物，其中具有β-葡糖苷酶活性的多肽为棘孢曲霉Cel3β-葡糖苷酶。
10.权利要求1的酶组合物，进一步包含选自下组的具有纤维素分解增强活性的多肽：
(I)(a)多肽，其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列为SEQIDNO:34的成熟多肽；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列为SEQIDNO:33的成熟多肽编码序列；(II)(a)多肽，其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列为SEQIDNO:36的成熟多肽；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列为SEQIDNO:35的成熟多肽编码序列；
(III)(a)多肽，其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列为SEQIDNO:38的成熟多肽；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列为SEQIDNO:37的成熟多肽编码序列；
(IV)(a)多肽，其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列为SEQIDNO:40的成熟多肽；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列为SEQIDNO:39的成熟多肽编码序列；
(V)(a)多肽，其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列为SEQIDNO:42的成熟多肽；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列为SEQIDNO:41的成熟多肽编码序列；
(VI)(a)多肽，其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列为SEQIDNO:44的成熟多肽；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列为SEQIDNO:43的成熟多肽编码序列；
(VII)(a)多肽，其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列为SEQIDNO:192的成熟多肽；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列为SEQIDNO:191的成熟多肽编码序列；和
(VIII)任意I、II、III、IV、V、VI和VII的组合。
11.权利要求10的酶组合物，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽为桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽。
12.权利要求10的酶组合物，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽为土生梭孢霉GH61E多肽。
13.权利要求10的酶组合物，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽为烟曲霉GH61B多肽。
14.权利要求10的酶组合物，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽为嗜松青霉GH61多肽。
15.权利要求10的酶组合物，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽为青霉属菌种GH61A多肽。
16.权利要求10的酶组合物，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽为土生梭孢霉GH61N多肽。
17.权利要求10的酶组合物，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽为痂状嗜热子囊菌(Thermoascuscrustaceus)GH61A多肽。
18.权利要求1-17任一项的酶组合物，进一步包含具有木聚糖酶活性的多肽。
19.权利要求18的酶组合物，其中所述具有木聚糖酶活性的多肽是具有木聚糖酶活性的家族10多肽。
20.权利要求19的酶组合物，其中所述具有木聚糖酶活性的家族10多肽选自下组：
(I)(a)多肽，其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列为SEQIDNO:46的成熟多肽；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列为SEQIDNO:45的成熟多肽编码序列；
(II)(a)多肽，其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列为SEQIDNO:48的成熟多肽；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列为SEQIDNO:47的成熟多肽编码序列；
(III)(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列为SEQIDNO:50的成熟多肽；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列为SEQIDNO:49的成熟多肽编码序列；
(IV)(a)多肽，其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列为SEQIDNO:52的成熟多肽；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列为SEQIDNO:51的成熟多肽编码序列；
(V)(a)多肽，其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列为SEQIDNO:54的成熟多肽；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列为SEQIDNO:53的成熟多肽编码序列；
(VI)(a)多肽，其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列为SEQIDNO:194的成熟多肽；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列为SEQIDNO:193的成熟多肽编码序列；
(VII)(a)多肽，其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列为SEQIDNO:196的成熟多肽；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列为SEQIDNO:195的成熟多肽编码序列；和
(VIII)(a)多肽，其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列为SEQIDNO:198的成熟多肽；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列为SEQIDNO:197的成熟多肽编码序列。
21.权利要求20的酶组合物，其中所述具有木聚糖酶活性的家族10多肽为棘孢曲霉GH10木聚糖酶。
22.权利要求20的酶组合物，其中所述具有木聚糖酶活性的家族10多肽为烟曲霉GH10C木聚糖酶。
23.权利要求20的酶组合物，其中所述具有木聚糖酶活性的家族10多肽为褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶。
24.权利要求20的酶组合物，其中所述具有木聚糖酶活性的家族10多肽为嗜松青霉GH10木聚糖酶。
25.权利要求20的酶组合物，其中所述具有木聚糖酶活性的家族10多肽为土生梭孢霉GH10E木聚糖酶。
26.权利要求20的酶组合物，其中所述具有木聚糖酶活性的家族10多肽为埃默森踝节菌GH10木聚糖酶。
27.权利要求20的酶组合物，其中所述具有木聚糖酶活性的家族10多肽为青霉属菌种GH10木聚糖酶。
28.权利要求20的酶组合物，其中所述具有木聚糖酶活性的家族10多肽为巨多孔菌(Meripilusgiganteus)GH10木聚糖酶。
29.权利要求18的酶组合物，其中所述具有木聚糖酶活性的多肽是具有木聚糖酶活性的家族11多肽。
30.权利要求29的酶组合物，其中所述具有木聚糖酶活性的家族11多肽选自下组：
(I)(a)多肽，其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列为SEQIDNO:56的成熟多肽；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列为SEQIDNO:55的成熟多肽编码序列；和
(II)(a)多肽，其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列为SEQIDNO:200或SEQIDNO:305的成熟多肽；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列为SEQIDNO:199或SEQIDNO:304的成熟多肽编码序列。
31.权利要求30的酶组合物，其中所述具有木聚糖酶活性的家族11多肽为ThermobifidafuscaGH11木聚糖酶。
32.权利要求30的酶组合物，其中所述具有木聚糖酶活性的家族11多肽为嗜热网球菌(Dictyoglomusthermophilum)GH11木聚糖酶。
33.权利要求1-17任一项的酶组合物，进一步包含β-木糖苷酶。
34.权利要求33的酶组合物，其中所述β-木糖苷酶选自下组：
(I)(a)多肽，其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列为SEQIDNO:58的成熟多肽；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列为SEQIDNO:57的成熟多肽编码序列；
(II)(a)多肽，其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列为SEQIDNO:60的成熟多肽；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列为SEQIDNO:59的成熟多肽编码序列；
(III)(a)多肽，其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列为SEQIDNO:202的成熟多肽；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列为SEQIDNO:201的成熟多肽编码序列；
(IV)(a)多肽，其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列为SEQIDNO:204的成熟多肽；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列为SEQIDNO:203的成熟多肽编码序列；和
(V)(a)多肽，其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列为SEQIDNO:206的成熟多肽；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列为SEQIDNO:205的成熟多肽编码序列。
35.权利要求34的酶组合物，其中所述β-木糖苷酶为里氏木霉β-木糖苷酶。
36.权利要求34的酶组合物，其中所述β-木糖苷酶为埃默森踝节菌β-木糖苷酶。
37.权利要求34的酶组合物，其中所述β-木糖苷酶为棘孢曲霉Cel3β-木糖苷酶。
38.权利要求34的酶组合物，其中所述β-木糖苷酶为烟曲霉Cel3β-木糖苷酶。
39.权利要求1-17任一项的酶组合物，进一步包含一种或多种选自下组的酶：半纤维素酶，糖酯酶，果胶酶，蛋白酶，漆酶，H2O2产生酶，氧化还原酶，棒曲霉素，膨胀素，或其混合物。
40.权利要求1-17任一项的酶组合物，进一步包含过氧化氢酶。
41.权利要求1-17任一项的酶组合物，进一步包含过氧化物酶。
42.权利要求1-17任一项的酶组合物，其中所述酶组合物用于纤维素材料的糖化，该纤维素材料的糖化在50℃至65℃的范围的温度使用。
43.权利要求42的酶组合物，其中所述糖化的温度范围为55℃至63℃。
44.权利要求42的酶组合物，其中所述糖化的温度范围为55℃至60℃。
45.权利要求1-17任一项的酶组合物，其在55℃，pH3.5至pH6.0，与基于里氏木霉的酶组合物SaMe-MF268在50℃，pH5.0相比，使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少至少1.1倍；其中PCS指用热和稀硫酸处理的源自玉米秸秆的纤维素材料；其中基于里氏木霉的酶组合物SaMe-MF268包含具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，包含融合于野生型米曲霉β-葡糖苷酶的特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心多肽的β-葡糖苷酶融合蛋白，里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶I，里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II，里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶I，里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II，里氏木霉Cel45A内切葡聚糖酶V，和里氏木霉Cel12A内切葡聚糖酶III。
46.权利要求45的酶组合物，其中使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少至少1.25倍。
47.权利要求45的酶组合物，其中使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少至少1.5倍。
48.权利要求45的酶组合物，其中使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少至少2倍。
49.权利要求45的酶组合物，其中使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少至少3倍。
50.权利要求45的酶组合物，其中使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少至少4倍。
51.权利要求45的酶组合物，其中使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少至少5倍。
52.权利要求45的酶组合物，其中使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少至少7.5倍。
53.权利要求45的酶组合物，其中使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少至少10倍。
54.权利要求1-17任一项的酶组合物，其在60℃，pH3.5至pH6.0，与基于里氏木霉的酶组合物SaMe-MF268在50℃，pH5.0相比，使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少至少1.1倍；其中PCS指用热和稀硫酸处理的源自玉米秸秆的纤维素材料；其中基于里氏木霉的酶组合物SaMe-MF268包含具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，包含融合于野生型米曲霉β-葡糖苷酶的特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心多肽的β-葡糖苷酶融合蛋白，里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶I，里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II，里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶I，里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II，里氏木霉Cel45A内切葡聚糖酶V，和里氏木霉Cel12A内切葡聚糖酶III。
55.权利要求54的酶组合物，其中使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少至少1.25倍。
56.权利要求54的酶组合物，其中使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少至少1.5倍。
57.权利要求54的酶组合物，其中使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少至少2倍。
58.权利要求54的酶组合物，其中使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少至少3倍。
59.权利要求54的酶组合物，其中使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少至少4倍。
60.权利要求54的酶组合物，其中使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少至少5倍。
61.权利要求54的酶组合物，其中使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少至少7.5倍。
62.权利要求54的酶组合物，其中使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少至少10倍。
63.权利要求1-17任一项的酶组合物，其在65℃，pH3.5至pH6.0，与基于里氏木霉的酶组合物SaMe-MF268在50℃，pH5.0相比，使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少至少1.1倍；其中PCS指用热和稀硫酸处理的源自玉米秸秆的纤维素材料；其中基于里氏木霉的酶组合物SaMe-MF268包含具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，包含融合于野生型米曲霉β-葡糖苷酶的特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心多肽的β-葡糖苷酶融合蛋白，里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶I，里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II，里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶I，里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II，里氏木霉Cel45A内切葡聚糖酶V，和里氏木霉Cel12A内切葡聚糖酶III。
64.权利要求63的酶组合物，其中使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少至少1.25倍。
65.权利要求63的酶组合物，其中使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少至少1.5倍。
66.权利要求63的酶组合物，其中使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少至少2倍。
67.权利要求63的酶组合物，其中使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少至少3倍。
68.权利要求63的酶组合物，其中使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少至少4倍。
69.权利要求63的酶组合物，其中使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少至少5倍。
70.权利要求63的酶组合物，其中使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少至少7.5倍。
71.权利要求63的酶组合物，其中使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少至少10倍。
72.权利要求1-17任一项的酶组合物，其在70℃，pH3.5至pH6.0，与基于里氏木霉的酶组合物SaMe-MF268在50℃，pH5.0相比，使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少至少1.1倍；其中PCS指用热和稀硫酸处理的源自玉米秸秆的纤维素材料；其中基于里氏木霉的酶组合物SaMe-MF268包含具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，包含融合于野生型米曲霉β-葡糖苷酶的特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心多肽的β-葡糖苷酶融合蛋白，里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶I，里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II，里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶I，里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II，里氏木霉Cel45A内切葡聚糖酶V，和里氏木霉Cel12A内切葡聚糖酶III。
73.权利要求72的酶组合物，其中使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少至少1.25倍。
74.权利要求72的酶组合物，其中使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少至少1.5倍。
75.权利要求72的酶组合物，其中使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少至少2倍。
76.权利要求72的酶组合物，其中使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少至少3倍。
77.权利要求72的酶组合物，其中使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少至少4倍。
78.权利要求72的酶组合物，其中使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少至少5倍。
79.权利要求72的酶组合物，其中使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少至少7.5倍。
80.权利要求72的酶组合物，其中使达到相同程度的PCS的纤维素水解所需的蛋白的量减少至少10倍。
81.一种重组宿主细胞，其编码权利要求1-80任一项的酶组合物。
82.一种产生酶组合物的方法，包括：(a)在有助于产生所述酶组合物的条件下培养权利要求81的重组宿主细胞；和(b)回收所述酶组合物。
83.一种用于降解或转化纤维素材料的方法，包括：用权利要求1-80任一项的酶组合物处理纤维素材料。
84.权利要求83的方法，其中所述纤维素材料经预处理。
85.权利要求83或84的方法，进一步包括回收经降解的纤维素材料。
86.权利要求85的方法，其中所述经降解的纤维素材料是糖。
87.权利要求86的方法，其中所述糖选自下组：葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖。
88.一种用于产生发酵产物的方法，包括：
(a)用权利要求1-80任一项的酶组合物糖化纤维素材料；
(b)用一种或几种发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和
(c)从发酵回收发酵产物。
89.权利要求88的方法，其中所述纤维素材料经预处理。
90.权利要求88的方法，其中步骤(a)和(b)在同步糖化和发酵中同时进行。
91.权利要求88-90任一项的方法，其中所述发酵产物是醇、有机酸、酮、氨基酸或气体。
92.一种发酵纤维素材料的方法，包括：用一种或几种发酵微生物发酵纤维素材料，其中所述纤维素材料是用权利要求1-80任一项的酶组合物糖化的。
93.权利要求92的方法，其中所述纤维素材料在糖化之前经预处理。
94.权利要求92的方法，其中纤维素材料的发酵产生发酵产物。
95.权利要求93的方法，进一步包括从发酵回收发酵产物。
96.权利要求92-95任一项的方法，其中所述发酵产物是醇、有机酸、酮、氨基酸或气体。
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