CN116334111B - 一种草菇纤维二糖水解酶及其用途 - Google Patents
一种草菇纤维二糖水解酶及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116334111B CN116334111B CN202310203681.0A CN202310203681A CN116334111B CN 116334111 B CN116334111 B CN 116334111B CN 202310203681 A CN202310203681 A CN 202310203681A CN 116334111 B CN116334111 B CN 116334111B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- straw
- cellobiohydrolase
- low
- temperature
- silage
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 240000006794 Volvariella volvacea Species 0.000 title claims abstract description 38
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 claims abstract description 48
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 claims abstract description 48
- 239000004460 silage Substances 0.000 claims abstract description 40
- 239000010902 straw Substances 0.000 claims abstract description 40
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 claims abstract description 26
- 108010008885 Cellulose 1,4-beta-Cellobiosidase Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 claims abstract description 23
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 claims abstract description 23
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims abstract description 22
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims abstract description 21
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims abstract description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 241000209094 Oryza Species 0.000 claims description 19
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 claims description 12
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 22
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 abstract description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 abstract description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 12
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 11
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 8
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 7
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 7
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 5
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 5
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 4
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 4
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 4
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 description 3
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 2
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 2
- 235000004501 Volvariella volvacea Nutrition 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 2
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000452385 Trichoderma reesei RUT C-30 Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012271 agricultural production Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000009412 basement excavation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000004459 forage Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000028644 hyphal growth Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K30/00—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs
- A23K30/10—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs of green fodder
- A23K30/15—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs of green fodder using chemicals or microorganisms for ensilaging
- A23K30/18—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs of green fodder using chemicals or microorganisms for ensilaging using microorganisms or enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01091—Cellulose 1,4-beta-cellobiosidase (3.2.1.91)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P60/00—Technologies relating to agriculture, livestock or agroalimentary industries
- Y02P60/80—Food processing, e.g. use of renewable energies or variable speed drives in handling, conveying or stacking
- Y02P60/87—Re-use of by-products of food processing for fodder production
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种低温草菇纤维二糖水解酶,其基因序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了上述的草菇纤维二糖水解酶作为添加物在提高水稻秸秆低温青贮加工效率中的应用。本发明还提供了一种提高水稻秸秆低温青贮加工效率的方法,利用上述的草菇纤维二糖水解酶进行遗传转化,提取转化子的粗纤维素酶复合物,然后与植物乳杆菌混合添加到稻草秸秆进行低温青贮加工。本发明的方法解决了东北等寒冷地区低温不利于纤维素酶活力,进而影响高效生产青贮饲料的问题。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种新型草菇纤维二糖水解酶,具体来说是一种草菇纤维二糖水解酶及其用途。
背景技术
秸秆是农业生产的常见副产品。根据食物和农业组织,全球谷物秸秆年产量达到大约20亿吨(Aquino et al.,Sustainable rice straw management,2020)。其中作为中国最重要的粮食产区,仅东北地区就每年生产秸秆超过2亿吨(Fu etal.,Remote Sens,2020)。因此,全面秸秆废弃物的资源化利用是环境保护和可持续农业的重大挑战。
青贮是一种基于厌氧乳酸发酵的草料保存策略,能够有效的规避季节性带来的稻草副产品利用问题(Cai et al.,J Clean Prod,2021)。适宜的温度和充足的碳氮原料是成功生产青贮饲料的先决条件。但这种生产需要利用乳杆菌和纤维素酶的外源添加才能高效生产青贮饲料。而大部分纤维素酶的优化温度是超过25℃,因此秸秆青贮在寒冷地区的应用是一项挑战。特别是在中国东北,那里的水稻收割是在冬季(10月)进行的,这不利于正常青贮加工。筛选在低温下保持高活性纤维素酶是一种很有前途的有效青贮策略。
草菇(Volvariella volvacea)被称为“中国菇”,是一种重要的食用菌。草菇菌丝的生长和结实要求比较高的温度(28–35℃),尤其是其菌丝和子实体不耐低温,即使在常规低温4℃下,菌丝和子实体在短时间内便会软化、液化甚至腐烂,即通常所说的“低温自溶”。这种高温食用菌有一套在低温下保持高表达纤维素酶系统(Gong et al.,PostharvestBiology and Technology,2022)(Gong等人,2022)。然而,迄今为止,这组酶系统在菌丝生长或子实体期表现出非常低的表达水平,缺乏功能特征或应用的研究。这为进一步纤维素酶耐低温适应性功能验证及应用提供了大规模可供挖掘的新型的酶资源。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题,本发明提供了一种草菇纤维二糖水解酶及其用途,所述的这种草菇纤维二糖水解酶及其用途要解决现有技术中的水稻秸秆低温青贮加工效率低的技术问题。
本发明提供了一种低温草菇纤维二糖水解酶,其基因序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了上述的草菇纤维二糖水解酶作为添加物在提高水稻秸秆低温青贮加工效率中的应用。
具体的,所述的低温是指温度指小于或等于10℃。
进一步的,所述的应用,是利用草菇纤维二糖水解酶进行遗传转化提取转化子的粗纤维素酶复合物,然后与植物乳杆菌混合添加到稻草秸秆进行低温青贮加工。
本发明还提供了一种提高水稻秸秆低温青贮加工效率的方法,利用上述的草菇纤维二糖水解酶进行遗传转化,提取转化子的粗纤维素酶复合物,然后与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)混合添加到稻草秸秆进行低温青贮加工。
具体的,所述的一种提高水稻秸秆低温青贮加工效率的方法包括如下步骤:
1)采用上述的草菇纤维二糖水解酶序列,然后通过农杆菌介导的里氏木霉遗传转化获得草菇纤维二糖水解酶转化菌株;
2)提取草菇纤维二糖水解酶转化菌株的粗纤维素酶复合物;
3)将草菇纤维二糖水解酶转化菌株的粗纤维素酶复合物和植物乳杆菌混合添加到稻草,进行水稻秸秆低温青贮加工。
本发明的方法解决了东北等寒冷地区低温不利于纤维素酶活力,进而影响高效生产青贮饲料的问题。
本发明的验证利用草菇纤维二糖水解酶作为添加物提高水稻秸秆低温青贮加工效率的方法的步骤如下:
1)基于草菇基因组数据库的注释信息,获取草菇纤维二糖水解酶VvCBHI-I序列,然后通过农杆菌介导的里氏木霉(Trichoderma reesei)遗传转化获得VvCBHI-I转化菌株;
2)提取转化菌株的粗纤维素酶复合物,使用滤纸做底物,然后进行不同温度下总纤维素酶活性的测定;
3)将草菇纤维二糖水解酶VvCBHI-I进行异源蛋白表达,提取粗纤维素酶复合物,使用PRS做底物,然后进行不同温度下糖化水解能力的测定;
4)将草菇纤维二糖水解酶VvCBHI-I进行异源蛋白表达,提取粗纤维素酶复合物,和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)混合添加到稻草,然后开展稻草低温青贮实验,评价VvCBHI-I粗纤维素酶复合物作为添加物在提高水稻秸秆低温青贮加工的效率。
本发明和已有技术相比,其技术效果是积极和明显的。本发明利用草菇VvCBHI-I的低温糖化水解能力提高稻草秸秆低温青贮加工效率的方法,本发明具有以下优点:
(1)从草菇VvCBHI-I异源表达的转化菌株提取的粗纤维素酶复合物,在10-30℃保持较高的纤维素酶活性。
(2)利用草菇VvCBHI-I的低温糖化水解能力,显著提高稻草秸秆低温青贮加工效率。
(3)证实了草菇具有一个冷适应性纤维素酶的新型资源库。
附图说明
图1VvCBHII的里氏木霉(Trichoderma reesei)转化子和野生型T.reesei提取的粗纤维素酶复合物的滤纸酶活的最优温度。T1:VvCBHI-I的T.reesei转化子;Rut-C30为野生型T.reesei。
图2不同温度下野生型Rut-C30及其转化子T1提取的粗酶制剂水解PRS形成还原糖的产量。
图3加入纯化蛋白的野生型Rut-C30的粗酶制剂水解PRS形成还原糖的产量。Rut-C30:Rut-C30的粗纤维素酶复合物。0.3-vv和0.6-vv:Rut-C30粗纤维素酶复合物加上0.3或0.6mg纯化的VvCBHI-I蛋白。0.3-Tr和0.6-Tr:Rut-C30粗纤维素酶复合物加上0.3或0.6mg纯化的野生型Rut-C30内源TrCBHI蛋白。每个误差条表示三次重复的标准差。
图4转化子T1提取的粗纤维素酶复合物与植物乳杆菌混合添加对低温水稻秸秆青贮的纤维素含量的影响。CK,无菌水;L,植物乳杆菌悬液;LC,植物乳杆菌和Rut-C30粗纤维素酶复合物悬浮液;LT,植物乳杆菌与转化子T1的粗纤维素酶复合物的悬浮液。
图5转化子T1提取的粗纤维素酶复合物与植物乳杆菌混合添加对水稻秸秆低温青贮的半纤维素含量的影响。
图6转化子T1提取的粗纤维素酶复合物与植物乳杆菌混合添加对水稻秸秆低温青贮的还原糖含量的影响。
图7转化子T1提取的粗纤维素酶复合物与植物乳杆菌混合添加对水稻秸秆低温青贮的可溶性蛋白含量的影响。
图8转化子T1提取的粗纤维素酶复合物与植物乳杆菌混合添加对水稻秸秆低温青贮的乳酸含量的影响。
图9转化子T1提取的粗纤维素酶复合物与植物乳杆菌混合添加对水稻秸秆低温青贮的pH的影响。
具体实施方式
实施例1
(1)VvCBHII序列来源和里氏木霉遗传转化
基于草菇基因组数据库的注释信息(Protein ID:Volvo1|114242;https://mycocosm.jgi.doe.gov/Volvo1/Volvo1.home.html),获取了一个纤维二糖水解酶VvCBHII序列。
具体序列和注释信息如下所示:
>jgi|Volvo1|114242|cellobiohydrolase I-I
ATGTTCCCCAAGTCATCTCTTCTATTTCTTTCTTTCCTCGCCACGGCTTAC
GCCCAACAAGTTGGCACTCAAACAGCCGAGGTCCACCCGTCGCTCAACTG
GGCCAGATGTACCTCCAGCGGATGCACAAACGTCGCTGGCTCCGTCACCCT
TGACGCCAACTGGCGCTGGTTGCACACCACCTCCGGCTACACCAACTGCTA
CACCGGGAACACCTGGAATACCACATTGTGCCCAGATGGTGCCACCTGTGC
TCAGAACTGCGCCCTTGACGGTGCCAGCTACCAATCCACCTACGGAATCAC
CACCAGCGGTAACGCCCTCACCCTCAAATTCGTCACTCAGAGCGCACAGA
AGAACATCGGATCTCGCGTGTACTTGATGGCTAGCGACACTCAATATGAGAT
GTTCCAGCTCCTTAACAAGGAGTTCACCTTTGATGTCGATGTGTCCAACCT
CCCCTGCGGGTTGAACGGAGCATTGTACTTCTCCTCTATGGATGCGGATGG
CGGTATGGCCAAGTACCCGAGCAACAAGGCTGGTGCAAAATACGGCACTG
GTTACTGCGACTCTCAATGTCCACGAGACATCAAGTTCATCAATGGAGAGG
CTAACGTTGCAGGATGGGTCGGCTCTCCGAACGACACGAACGCAGGTACC
GGAAACTGGGGAGCGTGCTGCAATGAGATGGATATCTGGGAAGCCAACTC
AATCTCCGCTGCCTACACTcCCCACCCATGCACAGTTCAAGGTCTATCCCGC
TGCTCTGGTACTGCTTGCGGTACCAATGACCGCTACGGCACCGTCTGCGAT
CCCGACGGCTGCGATTTCAACTCGTACCGCATGGGCGACAAGACCTACTAC
GGCCCCGGCGGAACGGGCGTCGACACCCGCTCCAAGTTCACCGTCGTCAC
CCAATTCCTGACCAACAACAACAGCAGCTCCGGCACACTCTCCGAAATCC
GCCGTCTATACGTCCAGAACGGCCAGGTCGTGCAAAATTCCAAGGTCAACA
TCCCAGGAATGAGTGCGTACGACTCCATCACTGGTGCATTCTGTGATGCCC
AGAAGACTGCCTTTGGCGATACAAGGAGCTTCCAGAACAAGGGTGGCATG
TCGGCTATGGGTCAGGCTTTGGGTACAGGAATGGTCTTAGTCTTGTCCATTT
GGGACGACCACGCAGCCAACATGCTCTGGCTCGACAGCAACTACCCCGTC
GATGCGGACCCAAGCAAGCCTGGTATTGGTCGTGGTACCTGCCCAACCACA
TCCGGCAACCCATCTGATGTCGAGGTCTCTGCTGCCAATTCCTCGGTGACA
TTTTCCAACATCAAGTTCGGTGATATCGGTACTACATACACCGGTGGCTCAG
TCACCACCCCCGGTACTACCTCGGGCACTACGACTTCGACTGCTCCTGGTG
CCGTTCAGACCAAGTGGGGTCAATGTTGCCTTTTCTTCTCTGTCAGCGGTG
GTCAAGGCTGGTCTGGACCCACTCAATGCGAGAGTGGCTCTACATGCACTGTCGTCAACCAATGGTATAGTCAATGTATA(SEQ ID NO.1)。
采用Agrobacterium tumefaciens AGL1(Weili,Beijing,China)进行VvCBHII的T.reesei Rut-C30(ATCC 56765)的遗传转化。对所有选择的转化子进行单孢子培养分离后,采用Real-time PCR技术筛选单拷贝外源基因插入的转化株。将证实的转化株T1培养生长1周后收获,并转移到Sabouraud葡萄糖肉汤(SDB)用于种子培养。将种子培养转移到含有3%(w/v)微晶纤维素(Sangon,Shanghai,China)和2%微晶纤维素的诱导培养基(1:10,v:v)中培养7d。收获培养滤液提取粗纤维素酶配合物用于纤维素酶活性测定和重组蛋白纯化。
(2)里氏木霉转化子粗纤维素酶复合物的酶活性评价
与里氏木霉野生型Rut-C30显著变化的滤纸酶活(FPAs)相比较,在所有测试的温度下,转化子T1的波动较小。其中,与60℃的FPA活性相比,野生型Rut-C30 10℃的FPAs活性低于5%,转化子T1的FPAs仍然保留了其最高活性的一半(图1)。
为了评价VvCBHI-I对天然生物质的水解效率,采用了PRS用作糖化的底物。在10、15和25℃的糖化反应24小时后,与WT相比,来自转化子T1获得的粗纤维素酶复合物明显提升还原糖的释放(在10℃时增加332.24%,P=0.0089;15℃时增加438.04%,P=0.0004;25℃时增加172.41%,P=0.00006)(图2)。(3)VvCBHI-I重组蛋白的制备及低温糖化效率验证
10℃处理24小时,在未添加VvCBHI-I的野生型Rut-C30粗纤维素酶复合物中PRS释放的还原糖的含量极低(即小于0.7mg/mL)。因此,添加内源性纤维素酶对糖化效率的影响较小(0.3或0.6mg纯化TrCBHI-I)(图3)。相比之下,添加了VvCBHI-I处理显著提高了还原糖产量(0.3或0.6mg纯化VvCBHI-I)。加入VvCBHI-I转化子与野生型Rut-C30的还原糖产量曲线明显分叉。这些结果表明低温处理下VvCBHI-I重组蛋白增加了粗纤维素酶复合物糖化效率。
(4)VvCBHI-I转化子的粗纤维素酶添加对提升水稻秸秆低温青贮效率的验证
嗜冷性植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CGMCC 1.557购自中国微生物综合培养收集中心。切碎的稻草(500克)用:(i)50mL无菌水(CK);(ii)50mL L.plantarum(108CFU/mL);(iii)50mL L.plantarum(108CFU/mL)含50U(FPA)纤维素酶的制备野生型Rut-C30(LC);或(iv)50mL植物乳杆菌悬液(108CFU/mL)含50U(FPA)纤维素酶制备转化子T1(LT)。添加剂是喷在切碎的样品上,充分混合。处理后的秸秆挤入1-L筒仓(KORKEN密封筒,高度16.5cm和直径12厘米,瑞典宜家,安徽,中国),用密封盖扣紧后10℃保存。然后,在青贮后15、30、45和60d取样。
所述试验中使用的稻草纤维素和半纤维素含量分别占总干物质35.50%±0.90%和24.75%±0.50%(图4和5)。与此同时,可溶性蛋白质和还原糖分别为0.41%±0.01%和2.39%±0.07%(图6和7)。在15d后,纤维素和半纤维素含量的下降速度减缓,以及还原糖以及LT中的可溶性蛋白的释放速率减缓(图4-7)。而乳酸含量在不断上升(图8),对应的pH值的变化则趋于平稳(图9)。
在青贮过程15d后,与LC、CK(无菌喷水),L(植物乳杆菌喷雾悬浮液)相比,LT-喷施青贮显著提高了乳酸的含量(图8)。LT的pH值降低到<4.5,而其他处理组约为5.0或更高(图9)。青贮过程中乳杆菌产生的乳酸pKa=3.86,乳酸通常是在青贮饲料中发现的浓度最高的酸。这说明植物乳杆菌在LT处理组中生长旺盛,而不是在其它处理中。青贮15d后,LT组的pH值和乳酸含量保持稳定,该组有酸香味,其他组没有。
以上结果表明使用VvCBHI-I纤维素粗酶复合物和L.plantarum的混合添加提高了低温青贮效率。
对比例1
在所有测试的温度下,Rut-C30的滤纸酶活显著变化。在10℃的滤纸酶活活性,与60℃时的活性相比,Rut-C30的滤纸酶活低于5%(图1)。
采用了PRS作糖化的底物,评价VvCBHI-I对天然生物质的水解效率。在10、15和25℃的糖化反应24小时后,WT(Rut-C30)的还原糖的含量明显低于VvCBHI-I异源表达的转化子T1的还原糖的含量(图2)。
对比例2
10℃处理24小时,在未添加VvCBHI-I的Rut-C30粗纤维素酶复合体中PRS释放的还原糖的数量,含量极低(即小于0.7mg/mL)。因此,添加内源性纤维生物水解酶对糖化效率的影响较小(0.3或0.6mg纯化TrCBHI-I)(图3)。
对比例3
在10℃青贮15d后,LC、CK(无菌喷水),L(植物乳杆菌喷雾悬浮液)处理的乳酸含量明显低于LT-喷施的乳酸含量(图8)。CK组表现出不稳定的pH值和令人不快的气味(图8和9),表明低温青贮质量较差。
对本领域的技术人员来说,可根据以上描述的技术方案以构思,做出其它各种相应的改变以及形变,而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种草菇纤维二糖水解酶,其特征在于,其基因序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的草菇纤维二糖水解酶作为添加物在提高水稻秸秆低温青贮加工效率中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,是利用草菇纤维二糖水解酶进行遗传转化提取转化子的粗纤维素酶复合物,然后与植物乳杆菌混合添加到稻草秸秆进行低温青贮加工。
4.一种提高水稻秸秆低温青贮加工效率的方法,其特征在于包括如下步骤:
1)采用权利要求1所述的草菇纤维二糖水解酶序列,然后通过农杆菌介导的里氏木霉遗传转化获得草菇纤维二糖水解酶转化菌株;
2)提取草菇纤维二糖水解酶转化菌株的粗纤维素酶复合物;
3)将草菇纤维二糖水解酶转化菌株的粗纤维素酶复合物和植物乳杆菌混合添加到稻草,进行水稻秸秆低温青贮加工。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310203681.0A CN116334111B (zh) | 2023-03-03 | 2023-03-03 | 一种草菇纤维二糖水解酶及其用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310203681.0A CN116334111B (zh) | 2023-03-03 | 2023-03-03 | 一种草菇纤维二糖水解酶及其用途 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116334111A CN116334111A (zh) | 2023-06-27 |
CN116334111B true CN116334111B (zh) | 2024-02-09 |
Family
ID=86892216
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202310203681.0A Active CN116334111B (zh) | 2023-03-03 | 2023-03-03 | 一种草菇纤维二糖水解酶及其用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN116334111B (zh) |
Citations (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1524120A (zh) * | 2000-11-15 | 2004-08-25 | 凯敏工业公司 | 超量产酶的转基因微生物 |
WO2010096510A2 (en) * | 2009-02-17 | 2010-08-26 | Edenspace Systems Corporation | Tempering of cellulosic biomass |
CN102057041A (zh) * | 2008-06-06 | 2011-05-11 | 丹尼斯科美国公司 | 包含具有与非纤维素物质降低的亲和力的纤维素酶变体的组合物和方法 |
CN102666849A (zh) * | 2009-10-26 | 2012-09-12 | 斯泰伦博斯大学 | 真菌纤维二糖水解酶2基因在酵母中的异源表达 |
CN103081721A (zh) * | 2013-01-25 | 2013-05-08 | 上海市农业科学院 | 一种快速筛选耐低温草菇菌种的方法 |
CN103343111A (zh) * | 2013-07-05 | 2013-10-09 | 山东尤特尔生物科技有限公司 | 一种嗜热毛壳菌纤维素酶及其制备方法和应用 |
CN103958677A (zh) * | 2011-08-31 | 2014-07-30 | 埃欧金能源公司 | 新的纤维二糖水解酶 |
CN104254243A (zh) * | 2012-02-24 | 2014-12-31 | Sk化学株式会社 | 产生纤维素酶的新真菌株以及用其进行糖化的方法 |
CN105154416A (zh) * | 2015-10-21 | 2015-12-16 | 青岛蔚蓝生物集团有限公司 | 一种纤维二糖水解酶突变体及其应用 |
CN105176949A (zh) * | 2015-10-21 | 2015-12-23 | 青岛蔚蓝生物集团有限公司 | 一种纤维二糖水解酶突变体 |
CN105861338A (zh) * | 2016-05-04 | 2016-08-17 | 东南大学 | 一种高产纤维素酶里氏木霉工程菌及其制备方法与应用 |
CN106167796A (zh) * | 2009-11-06 | 2016-11-30 | 诺维信股份有限公司 | 用于糖化纤维素材料的组合物 |
CN106978360A (zh) * | 2017-04-24 | 2017-07-25 | 上海交通大学 | 一株高产纤维素酶里氏木霉重组菌株及其应用 |
CN107012102A (zh) * | 2017-01-13 | 2017-08-04 | 东南大学 | 一株在可溶性和非可溶性碳源诱导下高产纤维素酶的里氏木霉基因工程菌及构建方法和应用 |
CN113073064A (zh) * | 2021-04-15 | 2021-07-06 | 江苏省农业科学院 | 一组高效降解纤维素的菌株、青贮菌剂及其应用 |
-
2023
- 2023-03-03 CN CN202310203681.0A patent/CN116334111B/zh active Active
Patent Citations (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1524120A (zh) * | 2000-11-15 | 2004-08-25 | 凯敏工业公司 | 超量产酶的转基因微生物 |
CN102057041A (zh) * | 2008-06-06 | 2011-05-11 | 丹尼斯科美国公司 | 包含具有与非纤维素物质降低的亲和力的纤维素酶变体的组合物和方法 |
WO2010096510A2 (en) * | 2009-02-17 | 2010-08-26 | Edenspace Systems Corporation | Tempering of cellulosic biomass |
CN102666849A (zh) * | 2009-10-26 | 2012-09-12 | 斯泰伦博斯大学 | 真菌纤维二糖水解酶2基因在酵母中的异源表达 |
CN106167796A (zh) * | 2009-11-06 | 2016-11-30 | 诺维信股份有限公司 | 用于糖化纤维素材料的组合物 |
CN103958677A (zh) * | 2011-08-31 | 2014-07-30 | 埃欧金能源公司 | 新的纤维二糖水解酶 |
CN104254243A (zh) * | 2012-02-24 | 2014-12-31 | Sk化学株式会社 | 产生纤维素酶的新真菌株以及用其进行糖化的方法 |
CN103081721A (zh) * | 2013-01-25 | 2013-05-08 | 上海市农业科学院 | 一种快速筛选耐低温草菇菌种的方法 |
CN103343111A (zh) * | 2013-07-05 | 2013-10-09 | 山东尤特尔生物科技有限公司 | 一种嗜热毛壳菌纤维素酶及其制备方法和应用 |
CN105154416A (zh) * | 2015-10-21 | 2015-12-16 | 青岛蔚蓝生物集团有限公司 | 一种纤维二糖水解酶突变体及其应用 |
CN105176949A (zh) * | 2015-10-21 | 2015-12-23 | 青岛蔚蓝生物集团有限公司 | 一种纤维二糖水解酶突变体 |
CN105861338A (zh) * | 2016-05-04 | 2016-08-17 | 东南大学 | 一种高产纤维素酶里氏木霉工程菌及其制备方法与应用 |
CN107012102A (zh) * | 2017-01-13 | 2017-08-04 | 东南大学 | 一株在可溶性和非可溶性碳源诱导下高产纤维素酶的里氏木霉基因工程菌及构建方法和应用 |
CN106978360A (zh) * | 2017-04-24 | 2017-07-25 | 上海交通大学 | 一株高产纤维素酶里氏木霉重组菌株及其应用 |
CN113073064A (zh) * | 2021-04-15 | 2021-07-06 | 江苏省农业科学院 | 一组高效降解纤维素的菌株、青贮菌剂及其应用 |
Non-Patent Citations (15)
Title |
---|
Bao,D., Gong,M., Zheng,H., et al.Volvariella volvacea V23, whole genome shotgun sequencing project GenBank: AMXZ00000000.1.《GenBank》.2014,全文. * |
Ding,S., Ge,W. and Buswell,J.A.."Volvariella volvacea cellobiohydrolase I-I (cbhI-I) mRNA, complete cds GenBank: AY559102.1".《GenBank》.2006,全文. * |
Hess,J., Skrede,I., Wolfe,B.E., et al."hypothetical protein AX16_004286 [Volvariella volvacea WC 439],GenBank: KAF8652625.1".《GenBank》.2020,全文. * |
Sequencing and Comparative Analysis of the Straw Mushroom (Volvariella volvacea) Genome.;Bao, Dapeng ;Gong, Ming ;Zheng, Huajun ;Chen, Mingjie ;Zhang, Liang ;Wang, Hong ;Jiang, Jianping ;Wu, Lin ;Zhu, Yongqiang ;Zhu, Gang ;Zhou, Yan ;Li, Chuanhua ;Wang, Shengyue;PLoS ONE;第8卷(第3期);全文 * |
不同酶制剂对水稻秸秆青贮营养品质和饲喂价值的影响;寇江涛;孟佳琪;张海波;郭冬生;程钰;李乐;雷佳星;刘鑫;;草原与草坪(第02期);全文 * |
乳酸菌、纤维素酶和糖蜜对青贮稻秸秆发酵品质的影响;顾拥建;丁成龙;占今舜;沙文锋;;黑龙江畜牧兽医(第20期);全文 * |
乳酸菌和纤维素酶对早籼稻秸秆青贮饲料品质的试验;赵政;李旭;;饲料工业(第17期);全文 * |
正交试验研究不同添加剂对青贮稻草秸秆养分的影响;陈前岭;倪俊芬;欧阳佳良;戚如鑫;陈逸飞;王梦芝;;中国饲料(第12期);全文 * |
正交试验研究稻草秸秆与白菜尾菜混合青贮养分的变化;戚如鑫;欧阳佳良;陈逸飞;张振斌;吴诗樵;章世元;王梦芝;;饲料工业(第11期);全文 * |
纤维素酶在青贮饲料中的作用及其基因克隆的研究进展;胡爽;王炜;山其木格;杨红兰;包慧芳;;新疆农业科学(第02期);全文 * |
耐低温降解生物质废弃物复合菌剂的混料设计优化;罗立津;万立;陈宏;徐福乐;贾纬;聂毅磊;温翠莲;;科技导报(第08期);全文 * |
草菇纤维素酶活力测定条件确定及应用分析;周慧敏;李亚鹏;赵妍;汪虹;陈明杰;;上海农业学报(第04期);全文 * |
里氏木霉纤维素酶水解稻草的研究;顾斌涛;黄朝;黄国昌;邱小忠;吕;张婷;;安徽农业科学(第31期);全文 * |
青贮添加剂对稻草青贮品质和有氧稳定性的影响;郭海明;夏天婵;朱雯;张勇;叶均安;;草业学报(第02期);全文 * |
青贮稻秸秆对山羊生长性能和血液生化指标的影响;顾拥建;丁成龙;占今舜;沙文锋;;中国农学通报(第05期);全文 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN116334111A (zh) | 2023-06-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Li et al. | Ferulic acid esterase-producing lactic acid bacteria and cellulase pretreatments of corn stalk silage at two different temperatures: ensiling characteristics, carbohydrates composition and enzymatic saccharification | |
Panda et al. | Microbial-processing of fruit and vegetable wastes for production of vital enzymes and organic acids: Biotechnology and scopes | |
Pervez et al. | Saccharification and liquefaction of cassava starch: an alternative source for the production of bioethanol using amylolytic enzymes by double fermentation process | |
JP5663497B2 (ja) | 培養液製剤 | |
US11421212B2 (en) | Engineered yeast strains with signal sequence-modified glucoamylase polypeptides and enhanced ethanol production | |
CN106978360B (zh) | 一株高产纤维素酶里氏木霉重组菌株及其应用 | |
EA021855B1 (ru) | Штаммы talaromyces и ферментные композиции | |
CN102149819A (zh) | 具有提高的活性的β-葡糖苷酶变体及其用途 | |
CN111593036B (zh) | 以酸性蛋白酶为主的酶制剂的制备及其菌株和应用 | |
CN114686386B (zh) | 一种生产甲醇菌体蛋白联产纤维素酶的毕赤酵母及其应用 | |
CN104975039A (zh) | 一种重组质粒及其在降解纤维素原料中的应用 | |
CN106434404B (zh) | 产高活性角蛋白水解酶的菌株及其应用 | |
JP7388628B2 (ja) | セルロース分解能増強組成物及びセルロース分解能増強変異株 | |
Gong et al. | Improving cold-adaptability of mesophilic cellulase complex with a novel mushroom cellobiohydrolase for efficient low-temperature ensiling | |
Ilić et al. | Valorization of lignocellulosic wastes for extracellular enzyme production by novel Basidiomycetes: screening, hydrolysis, and bioethanol production | |
CA2780974C (en) | Mutli-cellulase enzyme compositions for hydrolysis of cellulosic biomass | |
CN116334111B (zh) | 一种草菇纤维二糖水解酶及其用途 | |
Kar et al. | Characterization of a recombinant thermostable β-glucosidase from Putranjiva roxburghii expressed in Saccharomyces cerevisiae and its use for efficient biomass conversion | |
EP4081645A1 (en) | Fermentation method and uses thereof | |
Mou et al. | Isolation of a newly Trichoderma asperellum LYS1 with abundant cellulase-hemicellulase enzyme cocktail for lignocellulosic biomass degradation | |
CN116925927A (zh) | 一种黑曲霉(Aspergillus niger)PL-L2及其应用 | |
CN111286463A (zh) | 一种产酸性蛋白酶的巴斯德毕赤酵母菌株 | |
CN114045223A (zh) | 来源于黄花梨的拟盘多毛孢属菌株p6、繁育方法和用途 | |
US20110008862A1 (en) | Complementation of the trichoderma reesei secretome limiting microbiological contaminations within the context of industrial processes | |
EP3333248A1 (en) | Fungal cells that produce decreased amounts of peptaibols |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |