CN106978360A

CN106978360A - 一株高产纤维素酶里氏木霉重组菌株及其应用

Info

Publication number: CN106978360A
Application number: CN201710270368.3A
Authority: CN
Inventors: 赵心清; 白凤武; 张飞
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2017-04-24
Filing date: 2017-04-24
Publication date: 2017-07-25
Anticipated expiration: 2037-04-24
Also published as: CN106978360B

Abstract

本发明公开了一株高产纤维素酶里氏木霉重组菌株及其应用；将生长不兼容性阻遏蛋白基因vib1_tr转化到里氏木霉Rut‑C30中，获得里氏木霉(Trichoderma reesei)Vib1 CGMCC No.13578。菌株Vib1和里氏木霉Rut‑C30相比，胞外蛋白分泌和纤维素酶生产显著提高，在纤维素和麸皮培养基中Vib1的纤维素酶活性比Rut‑C30提高了约200％，达到了3.3U/ml，外切纤维素酶、内切纤维素酶和β‑葡萄糖苷酶的酶活性都有提高。值得注意的是，Vib1菌株胞外蛋白分泌量达到Rut‑C30的2.19倍。对预处理玉米秸秆水解反应结果表明，Vib1菌株纤维素酶水解液中葡萄糖产量相对于Rut‑C30菌株提高了20％。

Description

一株高产纤维素酶里氏木霉重组菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物生物技术领域；具体涉及一株高产纤维素酶里氏木霉重组菌株及其应用。

背景技术

随着化石能源的不断消耗，发展可再生生物质能源引起国内外的普遍关注。木质纤维素类生物质资源储量丰富且可再生，是化石能源潜在的替代能源来源，利用纤维素酶和半纤维素酶可以将其水解为葡萄糖和木糖，并进一步发酵生产可再生生物能源和多种生物基化学品。然而，木质纤维素类生物质生物转化过程中，纤维素酶生产成本高是制约其产业化应用最主要的瓶颈之一。因此，提高菌株纤维素酶的生产效率，降低生产成本至关重要。

纤维素酶主要由三类酶组分，纤维素外切酶、纤维素内切酶和β-葡萄糖苷酶，这些酶通过协同作用完成对木质纤维素的降解。自然界中多种微生物可分泌多种纤维素酶对木质纤维素底物进行降解，丝状真菌里氏木霉是当前生物界中分泌纤维素酶能力最强的微生物，并且其胞外分泌的纤维素酶系较全，其诱变菌株广泛应用在工业界中。因为丝状真菌产纤维素酶是一个诱导过程，同时存在着寡糖对纤维素酶系的诱导和葡萄糖对产纤维素酶菌株的碳代谢阻遏效应，研究表明对于丝状真菌纤维素酶的生产，纤维素酶转录因子的全局调控比定向提高主要纤维素酶活性更加有效(Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology 2013，40：633-641；Mcrobiologyopen，2013，2：595-609；PLoS Genetics，2015，11：e1005509)。当前已知对纤维素酶产生具有显著影响的转录因子有正调控转录因子Xyr1、Ace2和Ace3，负调控转录因子是Cre1和Ace1。

Vib1蛋白是生长不兼容性阻遏调控因子，其缺失会导致异核体生长和孢子萌发受抑制，菌丝分隔和裂解破碎，另外在营养饥饿状态下，vib1缺失的粗糙脉胞菌菌株失去胞外蛋白分泌能力(Genetics，2002，162：89-101；Eukaryotic Cell，2006，5：2161-2173)。进一步研究表明，粗糙脉胞菌中vib1缺失可去调控碳代谢阻遏效应(PLoS Genetics，2014，10：e1004500)。但是，目前还没有利用vib1过表达提高纤维素酶生产的研究报道。里氏木霉Rut-C30也存在vib1基因的同源基因vib1_tr，JGI数据库中基因名为TrireC30-125610，但是对该基因与里氏木霉纤维素酶生产的关系目前还未见报道。

尽管国内外学者已经通过物理化学诱变方式获得多种纤维素酶高产菌株，但其遗传稳定性和背景皆不清楚；另外，尽管通过采用蛋白质工程改造的糖苷水解酶可以提高纤维素酶系比活，但提高纤维素酶生产菌胞外总蛋白分泌更有助于纤维素酶大规模经济生产。因此采用特异转录调控因子进行丝状真菌基因功能改造，进而获得遗传背景清晰、胞外蛋白和纤维素降解酶酶活提高的重组菌株，将其应用在天然生物质降解中，是提高纤维素酶生产，进而提高木质纤维素生物质生物炼制效率的有效手段。

发明内容

本发明目的是提供一株高产纤维素酶里氏木霉重组菌株及其应用；其基因组中含有本发明所用的核酸序列(SEQ ID NO.1)，其翻译产物是一种蛋白质(SEQ ID NO.2，可以行使转录调控功能来进行纤维素酶的高效诱导表达，在生物质高效降解中具有重要的应用价值。

本发明的里氏木霉重组菌株(Trichoderma reesei)Vib1，菌种保藏编号为CGMCCNo.13578，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期为2017年01月13日。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一株里氏木霉重组菌株，将生长不兼容性阻遏蛋白基因vib1_tr转化到里氏木霉菌株中，即得所述里氏木霉重组菌株。

优选的，所述里氏木霉重组菌株高产纤维素酶。

本发明还涉及一株里氏木霉重组菌株，所述里氏木霉重组菌株为里氏木霉(Trichoderma reesei)Vib1 CGMCC No.13578。

优选的，里氏木霉(Trichoderma reesei)Vib1是将里氏木霉中生长不兼容性阻遏蛋白基因vib1_tr转化到出发菌株里氏木霉Rut-C30而获得的。

本发明还涉及一种本发明的里氏木霉重组菌株的用途，所述里氏木霉重组菌株用于降解木质纤维素类生物质。

本发明还涉及一种本发明的里氏木霉重组菌株的制备方法，所述方法包括如下步骤：

S1、构建含有vib1基因片段的丝状真菌表达质粒pCZF3-Vib1，在组成型pdc启动子驱动下，使基因vib-1进行持续转录和表达；

S2、将所述表达质粒pCZF3-Vib1通过农杆菌介导转化转移至丝状真菌里氏木霉中。

8、优选的，步骤S1中，丝状真菌表达质粒pCZF3-Vib1的构建包括如下步骤：

S1.1分别扩增出pCAMBIA1301载体骨架和pCB303中潮霉素与基因表达框片段，将二者回收产物进行连接，获得pCZF2载体；分别从Rut-C30基因组内扩增出组成型pdc启动子和终止子conx4，将二者通过重叠延伸技术进行拼接，拼接产物纯化后与pCZF2载体BamH I单酶切并回收后的大片段连接，获得双元转化载体pCZF3；

S1.2通过PCR扩增从里氏木霉Rut-C30中获得vib1基因片段；用Nco I和Xba I进行双酶切，并与用Nco I和Xba I双酶切的载体pCZF3片段分别进行凝胶电泳回收后，进行连接；

S1.3将步骤S1.2的连接产物pCZF3-Vib转入到大肠杆菌Escherichia coli DH5α中。

更优选的，步骤S1中，丝状真菌表达质粒pCZF3-Vib1的构建按照如下步骤进行：

A1、pCZF3由pCAMBIA1301和pCB303内组件为载图骨架改造而来，首先分别用引物P1，P2(如SEQ ID NO.3、4)和引物P3，P4(如SEQ ID NO.5、6)扩增出pCAMBIA1301载体骨架和pCB303中潮霉素与基因表达框片段，通过In-Fusion方法将二者回收产物进行连接，鉴定成功载体命名为pCZF2；组成型pdc启动子和终止子conx4分别从Rut-C30基因组内通过引物P5、P6、P7和P8(如SEQ ID NO.7-10)扩增出，将二者通过重叠延伸技术进行拼接，拼接产物纯化后与pCZF2载体BamH I单酶切并回收后的大片段通过In-fusion方法连接；最终获得高拷贝农杆菌转化用载体pCZF3；

A2、通过PCR扩增从里氏木霉Rut-C30中获得vib1基因片段；

A3、将A2步骤中获得的PCR产物用Nco I和Xba I进行双酶切，并与用同样这两种限制性内切酶双酶切的载体pCZF3片段分别进行凝胶电泳回收后，通过In-Fusion方法在50摄氏度进行连接；

A4、将上述连接产物转入到大肠杆菌E.coli DH5α中(转化步骤参照《分子克隆实验指南》(第三版))；待培养12～16小时后，收集卡那霉素抗性平板上的转化子培养后，提取质粒进行相应酶切鉴定选取正确转化子进行后续实验。

优选的，步骤S2中，表达质粒pCZF3-Vib1转化转移至丝状真菌里氏木霉包括如下步骤：

S2.1将含有pCZF3-Vbi1质粒的大肠杆菌E.coli DH5α转化至根癌农杆菌感受态细胞AGL-1中，得到含有质粒pCZF3-Vib1的根癌农杆菌AGL-1；

S2.2活化后含有质粒pCZF3-Vib1的根癌农杆菌AGL-1菌株和同体积的里氏木霉Rut-C30孢子悬液混匀后，培养，收集分生孢子并提取其基因组，用载体pCZF3鉴定引物分析里氏木霉转化子菌株内Vib1核酸序列；

S2.3将步骤S2.2鉴定正确的转化子孢子在生孢培养基中培养5～6代后，用牙签将其分生孢子挑至含有潮霉素抗性培养皿中进行培养，最后获得生长状态良好、并具有孢子产生的转化子，保存。

更优选的，步骤S2中，表达质粒pCZF3-Vib1转化转移至丝状真菌里氏木霉按照如下步骤进行：

B1、将含有pCZF3-Vib1质粒的大肠杆菌E.coli DH5α接种于LB液体培养基中过夜培养，提取质粒，使用电击法转化至根癌农杆菌感受态细胞AGL-1中(转化操作方法参考《分子克隆实验指南》(第三版))，挑取农杆菌单克隆培养后，采用PCR方式鉴定阳性转化子，最终得到含有质粒pCZF3-Vib1的根癌农杆菌AGL-1；

B2、将含有pCZF3-Vib1的根癌农杆菌AGL-1按1％接种量接种于5毫升培养基中(100微克每毫升卡那霉素)，28摄氏度，240转每分钟暗培养48小时；5000转每分钟离心10分钟，收集农杆菌细胞，并悬浮于诱导培养基(IM)中调整OD₆₆₀约为0.2，按照相同条件培养6～12小时；

B3、将里氏木霉C30接种于PDA平板中，28摄氏度光照培养5～7天，用无菌水洗下分生孢子，调整至终浓度大约10⁷孢子每毫升；

B4、取100微升活化后含有载体pCZF3-Vib1的AGL-1菌株和同体积的里氏木霉Rut-C30孢子悬液混匀后，均匀涂布在覆盖到含有玻璃纸的共培养培养基(CM)中，25摄氏度暗培养48小时，将玻璃纸取下转移至含有潮霉素和头孢霉素的PDA培养基中(浓度均为300微克每毫升)，28摄氏度进行培养3～4天，便会有转化子菌丝产生，及时挑取菌丝转移至生孢培养基固体平板中进行培养，培养一周后收集分生孢子并提取其基因组，用载体pCZF3鉴定引物分析里氏木霉转化子菌株内Vib1核酸序列；

B5、将上述鉴定正确的转化子孢子在生孢培养基中培养5～6代后，用牙签将其分生孢子挑至含有潮霉素抗性培养皿中，待一周之后，将生长状态良好、并具有孢子产生的转化子保存至20％甘油中，-80摄氏度保存。

优选的，步骤S2中还包括在纤维素为诱导物条件下通过液体发酵实验，筛选出纤维素酶活性稳定提高的菌株的步骤。

与现有技术相比，本发明最终得到了一株含有特定功能基因(vib1基因)的里氏木霉重组菌株Vib1，并对这株菌株进行后续的各组分纤维素酶酶活测定。所获得的里氏木霉重组菌Vib1在纤维素与麸皮发酵条件下，总滤纸酶活可以比出发菌株C30提高200％，达到3.3酶活单位每毫升，其中各组分纤维素酶都具有显著提高。里氏木霉Vib1胞外总蛋白分泌量相比于出发菌株Rut-C30中提高219％。两株菌株纤维素酶对预处理玉米秸秆水解反应结果表明，Vib1菌株纤维素酶水解液中葡萄糖产量相对于Rut-C30菌株纤维素酶水解液中葡萄糖产量提高了20％。

附图说明

图1是本发明质粒pCZF3-Vib1图谱；

图2是本发明中里氏木霉菌株Vib1和Rut-C30纤维素酶活性比较；

图3是本发明中里氏木霉菌株Vib1和Rut-C30各组分纤维素酶活性对比；其中，A为pNPC酶活性对比，B为CMC酶活性对比，C为β-葡萄糖苷酶活性对比；D为胞外蛋白浓度对比；

图4是本发明中里氏木霉菌株Vib1和Rut-C30纤维素酶水解预处理玉米秸秆产糖量对比；其中，A为葡萄糖产量对比，B为木糖产量对比。

具体实施方式

实验材料和试剂

菌株：里氏木霉Trichoderma reesei Rut-C30，在美国典型菌种保藏中心(ATCC)购买，登录号为ATCC 56765。

培养基：

PDA培养基(1升)：土豆200克，加适量水水煮沸，纱布过滤；葡萄糖20克；琼脂粉20克，定容到1升；

生孢培养基(1升)：麦芽浸粉30克；琼脂粉20克；

孟德氏盐培养基(1升)：

盐溶液：(NH₄)₂SO₄ 1.4克；KH₂PO₄ 2克；Urea 0.3克；CaCl₂ 0.3克；MgSO₄7H₂O 0.3克；微量元素溶液1毫升pH 4.8；

微量元素溶液：柠檬酸5克；ZnSO₄·7H₂O 5克；Fe(NH₄)₂(SO₄)₂·6H₂O 1克；CuSO₄·5H₂O 0.25克；MnSO₄·H₂O 50毫克；H₃BO₄ 50毫克；NaMnO₄·2H₂O 50毫克；加去离子水定容到100毫升；

孢子萌发培养基(1升)：孟德氏盐溶液；蛋白胨1.0克；葡萄糖10克；

发酵培养基(1升)：孟德氏盐溶液；蛋白胨1.0克；微晶纤维素20克；麸皮20克；

农杆菌诱导培养基(1升)：K₂HPO₄ 2.05克；KH₂PO₄ 1.45克；NaCl 0.15克；MgSO₄·7H₂O 0.5克；CaCl₂·2H₂O 0.067克；FeSO₄·7H₂O 0.0025克；(NH₄)₂SO₄ 0.5克；葡萄糖2.0克；pH 5.3；

共培养培养基(1升)：农杆菌诱导培养基中葡萄糖浓度减半，即1.0克，另外添加20g琼脂粉；

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1、里氏木霉质粒pCZF3-Vib1构建

本发明涉及的vib1基因来自于里氏木霉Rut-C30，JGI数据库中基因名为TrireC30-125610，核酸序列见SEQ ID NO.1，里氏木霉vib1编码的蛋白序列具有NDT80家族DNA结合区域，蛋白序列编码见SEQ ID NO.2。双元质粒载体pCZF3除了具有潮霉素抗性表达框和根癌农杆菌转化所需的必须组件之外，还具有里氏木霉丙酮酸脱羧酶基因(pdc，pyruvate decarboxylase)启动子-构巢曲霉色氨酸合成酶基因(trpC，tryptophansynthase)终止子驱动的目的基因表达框，其通过Nco I和Xba I进行双酶切后，将目的基因核酸序列连入酶切后的大片段，由pdc启动子进行驱动转录，该载体在细菌中的抗性选择标记是卡那霉素(kanamycin)，在真菌中选择标记是潮霉素(hygromycin)。

1.pCZF3载体的获得

pCZF3由pCAMBIA1301和pCB303(Biotechnology Journal 2016，11(10)：1282-1290)内组件为载图骨架改造而来，首先分别用引物P1，P2和引物P3，P4)扩增出pCAMBIA1301载体骨架和pCB303中潮霉素与基因表达框片段，通过In-Fusion方法将二者回收产物进行连接，鉴定成功载体命名为pCZF2。组成型启动子pdc和终止子conx4分别从Rut-C30基因组内通过引物P5、P6、P7和P8扩增出，将二者通过重叠延伸技术拼接，拼接产物纯化后与pCZF2载体BamH I单酶切并回收后的大片段通过In-fusion方法连接。最终获得双元农杆菌转化载体pCZF3。pCZF3-Vib1质粒见附图1。

正向引物P1

5′-GGAGCCGATTTTGAAACCGCGTCTAGTGGACTGATGGGCTGCCTG-3′，SEQ ID NO.3

反向引物P2

5′-GCGGCGCTCGGTTTCTTCAGTGAGATCTCCTGTGGTTGGCATGCA-3′，SEQ ID NO.4

正向引物P3

5′-CTGAAGAAACCGAGCGCCGCCGTCT-3′，SEQ ID NO.5

反向引物P4

5′-CGCGGTTTCAAAATCGGCTCCGTCGA-3′，SEQ ID NO.6

正向引物P5

5′-AGTAGATGCCGACCGCGGAATAAAAAAAACGCAAACACACGATATC-3′，SEQ ID NO.7

反向引物P6

5′-TTAATTAAATCCCCCCAAACTACAGCGCCGCTG-3′，SEQ ID NO.8

正向引物P7

5′-TAGTTTGGGGGGATTTAATTAAGGACGCAGCAGTCGGACCTGCTGAGC-3′，SEQ ID NO.9

反向引物P8

5′-GTATTCTCTAGACTAGCATCATGCCATGGTTGTGCTGTAGCTGCGCTGCTTTGATCG-3′，SEQID NO.10

2.Vib1蛋白核酸序列的获得

Vib1蛋白核酸片段大小为1876bp，利用引物P9和P10通过PCR方式获得，PCR反应条件和体系见表1和表2。

正向引物P9：

5’-CGCAGCTACAGCACAACCATGACCGACCTCAGAGGAGAGCCT-3′，SEQ ID NO.11：

反向引物P10：

5′-TAACGTTAAGTGTATTCTCTAATTACCATGCCAGGAGTAGTTGT-3′，SEQ ID NO.12。

PCR反应条件如表1所示：

表1 PCR反应条件

PCR反应体系如表2所示：

表2 PCR反应体系

PCR反应体系	体积
		10xPCR缓冲液	5μL
dNTP混合物(2.5mM)	4μL
		正向引物(10μM)	2μL
反向引物(10μM)	2μL
		DNA模板	50ng
rTaq DNA聚合酶^*	0.5μL
		ddH₂O	至50μL

*该聚合酶购自宝生物大连公司。

2.构建含有质粒pCZF3-Vib1的Escherichia coli DH5α

将上述步骤中获得的PCR产物与载体pCZF3经过Nco I和Xba I双酶切后的大片段分别进行凝胶电泳回收后，通过In-Fusion方法在50摄氏度进行连接，反应使用即用型无缝克隆试剂盒(生工编号B632219-0020)，反应时间为1小时，反应体系图表3。

表3 20微升连接反应体系

将上述连接产物转入到大肠杆菌E.coli DH5α中，转化步骤参照《分子克隆实验指南》(第三版)。待培养12～16小时后，收集卡那霉素抗性平板上的转化子进行培养并提取质粒，通过Hind III单酶切和BamHI、EcoRI双酶切鉴定，获得正确连接转化子。

3.构建含有质粒pCZF3-Vib1的根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens AGL-1菌株

将含有pCZF3-Vbil质粒的E.coli DH5α接种于LB液体培养基中过夜培养，提取质粒，使用电击法转化至根癌农杆菌感受态细胞AGL-1中，转化操作方法参考《分子克隆实验指南》(第三版)。挑取农杆菌单克隆培养后，采用PCR方式鉴定阳性转化子，PCR反应条件和体系见表1和表2，引物序列采用P9和P10，最终得到含有质粒pCZF3-Vib1的根癌农杆菌AGL-1。

实施例2、将含有pCZF3-Vib1根癌农杆菌AGL-1转化至里氏未霉C30中

1.含有pCZF3-Vib1的根癌农杆菌AGL-1按1％接种量接种于5毫升培养基中(100微克每毫升卡那霉素)，28摄氏度，240转每分钟暗培养48小时；5000转每分钟离心10分钟，收集农杆菌细胞，并悬浮于诱导培养基(IM)中调整OD₆₆₀约为0.2，按照相同条件培养6～12小时。

2.将里氏木霉Rut-C30接种于PDA平板中，28摄氏度光照培养5～7天，用无菌水洗下分生孢子，调整至终浓度大约10⁷孢子每毫升。

3.取100微升活化后含有载体pCZF3-Vib1的AGL-1菌株和同体积里氏木霉Rut-C30孢子悬液混匀后，均匀涂布在覆盖到含有玻璃纸的共培养培养基(CM)中，25摄氏度暗培养48小时，将玻璃纸取下转移至含有潮霉素和头孢霉素的PDA培养基中(浓度均为300微克每毫升)，28摄氏度进行培养3～4天，便会有转化子菌丝产生，及时挑取菌丝转移至生孢培养基固体平板中进行培养，培养一周后收集分生孢子并提取其基因组，用载体pCZF3鉴定引物分析菌株内Vib1核酸序列。所用鉴定引物序列如下：

正向引物P11：

5′-GTTTGTCCGAGCTGTTGATGGTTG-3′，SEQ ID NO.13：

反向引物P12：

5′-CGACACCAACGATCTTATATCCAG-3′，SEQ ID NO.14。

PCR反应条件和体系同表1，2相同。

4.将上述鉴定正确的转化子孢子在生孢培养基中培养5～6代后，用牙签将其分生孢子挑至含有潮霉素抗性培养皿中，待一周之后，将生长状态良好、并具有孢子产生的转化子保存至20％甘油中，-80摄氏度保存。

实施例3、含有pCZF3-Vib1里氏未霉转化子分泌的纤维素酶性质测定

将随机三株通过PCR和抗性筛选鉴定得到里氏木霉Vib1转化子和出发菌株里氏木霉Rut-C30进行生孢培养，将孢子加入到50毫升萌发培养基中，终浓度为10⁶每毫升，在28摄氏度、150转每分钟培养36小时后，取5毫升菌丝体加入到45毫升纤维素发酵培养基中，相同条件培养并每隔24小时取培养液1毫升进行保存，连续取样7天。通过里氏木霉C30做对照，测定纤维素滤纸酶活活性，进行两种里氏木霉胞外纤维素酶酶活比较。

胞外纤维素酶酶活比较结果见附图2，最终确定里氏木霉Vib1纤维素酶活性显著提高，在纤维素麸皮发酵条件下，发酵第七天时里氏木霉Vib1胞外分泌纤维素酶单位体积总滤纸酶活可以比出发菌株Rut-C30提高约200％，达到3.3酶活单位每毫升，此时里氏木霉Rut-C30滤纸酶活是1.1酶活单位每毫升。同时对发酵第七天时纤维素酶系各组分酶活性进行分析，结果见附图3。其中pNPC酶酶活间接反映了外切纤维素酶纤维二糖水解酶活性，在里氏木霉Vib1中pNPC酶酶活达到了0.48酶活单位每毫升，此时里氏木霉Rut-C30中活性是0.15酶活单位每毫升；内切纤维素酶活性通过对羧甲基纤维素钠水解效率来衡量，里氏木霉Vib1中CMC酶酶活性是6.22酶活单位每毫升，野生型Rut-C30的CMC酶酶活是3.25酶活单位每毫升；里氏木霉Vib1中β-葡萄糖苷酶活性相对于里氏木霉Rut-C30中提高3.2倍，达到0.86酶活单位每毫升。值得注意的是，两类里氏木霉胞外分泌蛋白量有显著差异，在里氏木霉Vib1和Rut-C30中胞外分泌蛋白分别是3.96和1.24毫克每毫升，相差达到2.19倍。里氏木霉Vib1中胞外蛋白大量分泌可能是导致单位体积滤纸酶活提升的主要原因。

实施例4、里氏木霉Rut-C30和Vib1水解预处理后玉米秸秆比较

通过对预处理后的天然生物质降解分析可以更直观反应出里氏木霉胞外纤维素酶系酶学性质。将里氏木霉Vib1和Rut-C30胞外纤维素酶进行对2％NaOH预处理后的玉米秸秆进行水解实验，分析获得的葡萄糖和木糖收率，反应条件是10毫克胞外蛋白每克生物质，反应体系50毫升，反应条件pH 4.8醋酸-柠檬酸缓冲液，在50摄氏度和150转每分钟水浴摇床中进行。每12小时进行取样保存，直至48小时时反应停止，通过HPLC测定其反应液中葡萄糖和木糖含量。

水解结果见附图4，从附图4中可以看出，在48小时时里氏木霉Vib1纤维素酶水解预处理玉米秸秆水解液中葡萄糖产量达到30.2g/L，此时Rut-C30酶解液中葡萄糖产量是25.1g/L，Vib纤维素酶葡萄糖产量比Rut-C30纤维素酶葡萄糖产量提高了20％；在里氏木霉Vib1和Rut-C30纤维素酶酶解液中木糖产量分别是6.0g/L和5.6g/L，前者水解液中木糖含量相对于Rut-C30纤维素酶水解液中提高了约8％。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海交通大学

<120> 一株高产纤维素酶里氏木霉菌株及其应用

<130> 2017

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1887

<212> DNA

<213> Trichoderma reesei

<400> 1

atgaccgacc tcagaggaga gcctgcccac tccagtttct ggtccaccta caacggctcc 60

gcccatctag ccaacagact gggcacgacg actatggact ctggcttcca cagctcggcg 120

tcggcatccc ctctcccagg ccgcccccgt agcggccatg agcagcctta cccctatggg 180

cgttattccc aggaagactc tgtcgcgtat gatcgacacc cacagccgag cctgtccgct 240

cagcatggct actccggcct gaagagacct ttctcgcaga ctgaaccggc agcctatcag 300

gaaatcgttc aagacctgcg ggaggacggc tctcgactga cggtgaacca agatcacaag 360

cttttggctt tcagacgaac gcaagataag cacaccatcg tggatcaaca aggtcggatg 420

cagcagctgg agctctcggc ccagctccat ggcatgttct ttctttccga gatgccatcg 480

actgccagcg acggaactgc ccttcagccc gaattgacct gctaccgaag aaacctgttc 540

cagatcagcg gctctctgat taccccccgg ggacagctct ccgtggttaa cgagagcaat 600

gagacgctcc ccgtgtccag tatggaggtc gccatctccg ccatcgagtc tgtagatggc 660

aaccctgttc gtcttattgt catcccgtgg aagacccctc caccgaatgc ccccgaaatc 720

aaccagagcc cggatcagga gcctgccgcc ctccctttga tccctttcca ggacgatgga 780

tccgagcctg atggagacta cgccgtctat cccattggct ggcgtcgctt gcagttcaga 840

atcgctacag caaacaacgg tcgacgaaag gagctccagc agcactttgt gcttcacctc 900

aaggtgtttg gaaccttgtc cgacaactcc aaggttgtct tgacagaagc cacgacggct 960

cctattgtag tacggggccg cagccctcgc aacttccagg cccgtaaaga gattcccctg 1020

ctcggctcga gtgccggatc aaggggccag gctctagtag aaactggcct gggggttgtc 1080

gctggagctt tgagcgtcaa gcctcaagag ctcaagagaa gtgtggacat tcaagtaccg 1140

cgctcgagtt tcacctttag ttctcccaaa gtcccgggaa gtggacagct gagctcactg 1200

aggtccaatc aatattcggc atggagtgca agcagcagca atgcctccat cccccaggtc 1260

gcctcatctg gtacgggcag ctatcctgcg gcgacaatgg gcaccgattc ataccccaaa 1320

gtgcccatct cgggcgcgtc aaactacaca tcagaccccc aggatgtggc gctgcagtcc 1380

tcgataccac cgctgcctct ttcgatgggg gcaagtgagc aatcgtcatc ggctcgcggg 1440

cagtacacct acgtgcaaca gccagcttcg ggctcccagc tgccacctag cacgagcaca 1500

ccagcggttg gcggtcatgc agatagcgct ctgagcgttc ccagatatgt cgacaacggc 1560

cgaccaaaca agagtccacg ccagagtggc cagcaatccg tccacggcgc caattccatc 1620

agcagcagcg aatcgcccga gtaccgatac ggatcgtcta cgcaagctcc agcctcgtct 1680

agggaatact acccgccgtc acaagcatgg tctaccacga cggctgggga aactagttcg 1740

agcacagcct acgccagcac cgacgcacga ccgtacccat ttcctcatga gccgtacaag 1800

ccggggacag cagctggctc ctcagtcaag accgagtcgc gggcgccttt tgaacccatg 1860

cacaactact cctggcatgg taattaa 1887

<210> 2

<211> 628

<212> PRT

<213> Trichoderma reesei

<400> 2

Met Thr Asp Leu Arg Gly Glu Pro Ala His Ser Ser Phe Trp Ser Thr

1 5 10 15

Tyr Asn Gly Ser Ala His Leu Ala Asn Arg Leu Gly Thr Thr Thr Met

20 25 30

Asp Ser Gly Phe His Ser Ser Ala Ser Ala Ser Pro Leu Pro Gly Arg

35 40 45

Pro Arg Ser Gly His Glu Gln Pro Tyr Pro Tyr Gly Arg Tyr Ser Gln

50 55 60

Glu Asp Ser Val Ala Tyr Asp Arg His Pro Gln Pro Ser Leu Ser Ala

65 70 75 80

Gln His Gly Tyr Ser Gly Leu Lys Arg Pro Phe Ser Gln Thr Glu Pro

85 90 95

Ala Ala Tyr Gln Glu Ile Val Gln Asp Leu Arg Glu Asp Gly Ser Arg

100 105 110

Leu Thr Val Asn Gln Asp His Lys Leu Leu Ala Phe Arg Arg Thr Gln

115 120 125

Asp Lys His Thr Ile Val Asp Gln Gln Gly Arg Met Gln Gln Leu Glu

130 135 140

Leu Ser Ala Gln Leu His Gly Met Phe Phe Leu Ser Glu Met Pro Ser

145 150 155 160

Thr Ala Ser Asp Gly Thr Ala Leu Gln Pro Glu Leu Thr Cys Tyr Arg

165 170 175

Arg Asn Leu Phe Gln Ile Ser Gly Ser Leu Ile Thr Pro Arg Gly Gln

180 185 190

Leu Ser Val Val Asn Glu Ser Asn Glu Thr Leu Pro Val Ser Ser Met

195 200 205

Glu Val Ala Ile Ser Ala Ile Glu Ser Val Asp Gly Asn Pro Val Arg

210 215 220

Leu Ile Val Ile Pro Trp Lys Thr Pro Pro Pro Asn Ala Pro Glu Ile

225 230 235 240

Asn Gln Ser Pro Asp Gln Glu Pro Ala Ala Leu Pro Leu Ile Pro Phe

245 250 255

Gln Asp Asp Gly Ser Glu Pro Asp Gly Asp Tyr Ala Val Tyr Pro Ile

260 265 270

Gly Trp Arg Arg Leu Gln Phe Arg Ile Ala Thr Ala Asn Asn Gly Arg

275 280 285

Arg Lys Glu Leu Gln Gln His Phe Val Leu His Leu Lys Val Phe Gly

290 295 300

Thr Leu Ser Asp Asn Ser Lys Val Val Leu Thr Glu Ala Thr Thr Ala

305 310 315 320

Pro Ile Val Val Arg Gly Arg Ser Pro Arg Asn Phe Gln Ala Arg Lys

325 330 335

Glu Ile Pro Leu Leu Gly Ser Ser Ala Gly Ser Arg Gly Gln Ala Leu

340 345 350

Val Glu Thr Gly Leu Gly Val Val Ala Gly Ala Leu Ser Val Lys Pro

355 360 365

Gln Glu Leu Lys Arg Ser Val Asp Ile Gln Val Pro Arg Ser Ser Phe

370 375 380

Thr Phe Ser Ser Pro Lys Val Pro Gly Ser Gly Gln Leu Ser Ser Leu

385 390 395 400

Arg Ser Asn Gln Tyr Ser Ala Trp Ser Ala Ser Ser Ser Asn Ala Ser

405 410 415

Ile Pro Gln Val Ala Ser Ser Gly Thr Gly Ser Tyr Pro Ala Ala Thr

420 425 430

Met Gly Thr Asp Ser Tyr Pro Lys Val Pro Ile Ser Gly Ala Ser Asn

435 440 445

Tyr Thr Ser Asp Pro Gln Asp Val Ala Leu Gln Ser Ser Ile Pro Pro

450 455 460

Leu Pro Leu Ser Met Gly Ala Ser Glu Gln Ser Ser Ser Ala Arg Gly

465 470 475 480

Gln Tyr Thr Tyr Val Gln Gln Pro Ala Ser Gly Ser Gln Leu Pro Pro

485 490 495

Ser Thr Ser Thr Pro Ala Val Gly Gly His Ala Asp Ser Ala Leu Ser

500 505 510

Val Pro Arg Tyr Val Asp Asn Gly Arg Pro Asn Lys Ser Pro Arg Gln

515 520 525

Ser Gly Gln Gln Ser Val His Gly Ala Asn Ser Ile Ser Ser Ser Glu

530 535 540

Ser Pro Glu Tyr Arg Tyr Gly Ser Ser Thr Gln Ala Pro Ala Ser Ser

545 550 555 560

Arg Glu Tyr Tyr Pro Pro Ser Gln Ala Trp Ser Thr Thr Thr Ala Gly

565 570 575

Glu Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Ala Ser Thr Asp Ala Arg Pro Tyr

580 585 590

Pro Phe Pro His Glu Pro Tyr Lys Pro Gly Thr Ala Ala Gly Ser Ser

595 600 605

Val Lys Thr Glu Ser Arg Ala Pro Phe Glu Pro Met His Asn Tyr Ser

610 615 620

Trp His Gly Asn

625

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向引物P1

<400> 3

ggagccgatt ttgaaaccgc gtctagtgga ctgatgggct gcctg 45

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向引物P2

<400> 4

gcggcgctcg gtttcttcag tgagatctcc tgtggttggc atgca 45

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向引物P3

<400> 5

ctgaagaaac cgagcgccgc cgtct 25

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向引物P4

<400> 6

cgcggtttca aaatcggctc cgtcga 26

<210> 7

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向引物P5

<400> 7

agtagatgcc gaccgcggaa taaaaaaaac gcaaacacac gatatc 46

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向引物P6

<400> 8

ttaattaaat ccccccaaac tacagcgccg ctg 33

<210> 9

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向引物P7

<400> 9

tagtttgggg ggatttaatt aaggacgcag cagtcggacc tgctgagc 48

<210> 10

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向引物P8

<400> 10

gtattctcta gactagcatc atgccatggt tgtgctgtag ctgcgctgct ttgatcg 57

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向引物P9

<400> 11

cgcagctaca gcacaaccat gaccgacctc agaggagagc ct 42

<210> 12

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向引物P10

<400> 12

taacgttaag tgtattctct aattaccatg ccaggagtag ttgt 44

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向引物P11

<400> 13

gtttgtccga gctgttgatg gttg 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向引物P12

<400> 14

cgacaccaac gatcttatat ccag 24

Claims

1.一株里氏木霉重组菌株，其特征在于，将生长不兼容性阻遏蛋白基因vib1_tr转化到里氏木霉菌株中，即得所述里氏木霉重组菌株。

2.如权利要求1所述的里氏木霉重组菌株，其特征在于，所述里氏木霉重组菌株高产纤维素酶。

3.一株里氏木霉重组菌株，其特征在于，所述里氏木霉重组菌株为里氏木霉(Trichoderma reesei)Vib1 CGMCC No.13578。

4.如权利要求3所述的里氏木霉重组菌株，其特征在于，里氏木霉VIB1是将里氏木霉中生长不兼容性阻遏蛋白基因vib1_tr转化到出发菌株里氏木霉Rut-C30而获得的。

5.一种如权利要求1～4中任一项所述的里氏木霉重组菌株的用途，其特征在于，所述里氏木霉重组菌株用于降解木质纤维素类生物质。

6.一种如权利要求1或2所述的里氏木霉重组菌株的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、构建含有如SEQ ID NO.1所示的vib1基因片段的丝状真菌表达质粒pCZF3-Vibl，在组成型pdc启动子驱动下，使基因vib-1进行持续转录和表达；

7.如权利要求6所述的里氏木霉重组菌株的制备方法，其特征在于，步骤S1中，丝状真菌表达质粒pCZF3-Vib1的构建包括如下步骤：

S1.2通过PCR扩增从里氏木霉Rut-C30中获得vibl基因片段；用Nco I和Xba I进行双酶切，并与用Nco I和Xba I双酶切的载体pCZF3片段分别进行凝胶电泳回收后，进行连接；

8.如权利要求6所述的里氏木霉重组菌株的制备方法，其特征在于，步骤S2中，表达质粒pCZF3-Vib1转化转移至丝状真菌里氏木霉包括如下步骤：

9.如权利要求6所述的里氏木霉重组菌株的制备方法，其特征在于，步骤S2中还包括在纤维素和麸皮为诱导物条件下通过液体发酵实验，筛选出纤维素酶活性稳定提高的菌株的步骤。