CN105349441A - 高产孢子的木霉菌T23-Ovel1菌株及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高产孢子的木霉菌T23-Ovell菌株及其构建方法，其构建包括vell基因过表达框的构建和ATMT转化；利用重叠PCR在深绿木霉菌T23的vell基因编码框前融合色氨酸强启动子，在vell基因编码框后融合色氨酸终止子，获得vell基因过表达框；通过ATMT将vell基因过表达框插入深绿木霉T23基因组DNA中，获得转化子；对转化子进行验证、筛选，即可。本发明主要从分子遗传水平上通过过表达调控孢子形成的转录因子，获得高产孢子的木霉菌的改良菌株，本方法构建过表达菌株产孢子量明显高于野生株。并且该菌株经过继代培养，其高产分生孢子性状能够稳定遗传，为开发高效木霉菌生防菌剂提供优良的菌株资源。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种高产孢子的木霉菌T23-Ovel1菌株及其构建方法。
背景技术
木霉生防制剂是以木霉菌分生孢子、菌丝体或厚垣孢子等为主要成分，用于防治某些植物病原菌促进植物生长具有重要的生物防治价值的木霉菌剂。目前生产上常用的木霉菌剂多为分生孢子制剂，将木霉发酵制成的孢子制剂进行种子包衣或土壤处理，可以有效地防治苗期病害。早在1981年西欧国家已进行木霉菌制剂商品化生产，而我国江浙地区也早使用木霉菌制剂防治茉莉花白绢病。目前木霉生防制剂占全世界生防制剂市场的60％，截止2012年国内外已经登记的木霉菌制剂所用菌株主要包括棘孢木霉(T.asperellum)、深绿木霉(T.atroviride)、哈茨木霉(T.harzianum)和绿色木霉(T.viride)4个种的菌株共50多种，其中的多数木霉菌制剂用于植物土传病害的防治，如立枯丝核菌、镰刀菌、疫霉、腐霉等。其中，后期商品化程度较高的木霉菌制剂主要有美国的Topshield(T.harzianumT-22)、以色列的Trichodex(T.harzianumT39)及MakhteshimAgan公司的Trichodex木霉菌制剂等。
木霉菌能在其生长周期内三种不同的繁殖体——菌丝体、分生孢子和厚垣孢子，将木霉生防制剂按成分分为菌丝体制剂、分生孢子制剂和厚垣孢子制剂。菌丝体制剂可在土壤中迅速生长，制剂储存和活化过程不必保持无菌条件，但使用不方便，储存期短；分生孢子制剂是目前商品化程度最高的木霉制剂，主要优点是产量高、易培养，但其货架期较短；而厚垣孢子制剂，由于厚垣孢子具有耐干燥、耐低温、对土壤抑菌作用不敏感，存活期长，易加工储藏。因此木霉菌剂的孢子活性和数量一直是木霉菌剂商业化发展的瓶颈和障碍。
为了获得高产孢子的木霉菌剂，目前已有的研究多是发酵工艺的改进，从培养基成分和培养条件两方面共同提高孢子产量和活力，庄敬华等(2005)研究表明通过控制木霉菌在液体发酵中的温度和pH值，有利于产生分生孢子。而张广志等(2013年)发现：秸秆的细度对木霉产分生孢子有影响，粗基质有利木霉产孢，基质的细度在10-40目时木霉孢子产量最大；适量含水量对木霉产分生孢子有显著影响，发酵培养基含水量调整在60％-70％对木霉产分生孢子最为适宜；接种后静止培养有利于木霉产分生孢子。而培养工艺上的改进缺少普遍适应性，加大实际生产中的难度，且实验培养基取材地的差异影响试验结果的稳定性。随着木霉菌分子生物学研究的深入，尤其是发现木霉菌中存在vel1编码的Velvet蛋白，其作为转录因子显著的调控其生长和发育，影响孢子的形成，这一发现为从遗传水平上改进木霉菌发酵产生孢子的数量和活力提供了可控制的方向。并且利用改良的ATMT遗传转化技术，在木霉菌中过表达vel1基因，实现vel1基因调控的孢子的形成数量和活力明显增加。需要指出的是，基因的过表达是常规的概念，但不同的过表达构建方式不同，且基因过表达后也不一定都能高产孢子，要经过筛选和鉴定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高产孢子的木霉菌T23-Ovel1菌株及其构建方法。为了提高木霉菌在液体发酵时的产量，解决传统的培养条件和工艺的优化提高幅度小，不稳定等缺陷，本发明旨在利用分子遗传手段获得高效稳定产孢子的木霉菌株，基于木霉菌Vel1基因调控其分生孢子和厚垣孢子的形成，本发明构建深绿木霉菌T23的vel1基因过表达株，筛选鉴定获得孢子产量高且稳定遗传的高效生防木霉菌株，提高以木霉菌孢子为主要成分的木霉菌菌剂在农业中的防病效果。
本发明涉及的深绿木霉菌T23-Ovel1菌株为深绿木霉(Trichodermo.atroviride)，已经于2015年11月3日递交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO:11575。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
第一方面，本发明涉及一种高产孢子的深绿木霉菌T23-Ovel1菌株的构建方法，所述方法包括如下步骤：
S1、深绿木霉菌T23的vel1基因过表达框的构建：利用重叠PCR方法在深绿木霉菌T23的vel1基因编码框前融合色氨酸强启动子，在vel1基因编码框后融合色氨酸终止子，获得所述vel1基因过表达框；
S2、利用改良的ATMT转化获得木霉菌T23-Ovel1菌株：通过改良的农杆菌介导的遗传转化方法(ATMT)将所述vel1基因过表达框插入深绿木霉T23基因组DNA中，获得转化子；对所述vel1基因过表达转化子进行验证、筛选，获得所述深绿木霉菌T23-Ovel1菌株。
优选的，步骤S1中，先将长318bp的色氨酸强启动子与vel1基因编码框融合，片段回收后，再将融合色氨酸强启动子的片段与长252bp的色氨酸终止子融合。
优选的，步骤S1中，所述构建具体为：使用高保真酶KODneoplus，以pCAMBIA1300th质粒为模板分别扩增色氨酸强启动子和色氨酸终止子，以T23基因组DNA为模板扩增vel1基因，然后通过重叠PCR将三个扩增片段融合起来。
优选的，所述扩增色氨酸强启动子采用的引物为pro-F和pro-R，所述pro-F的序列如SEQIDNO.1所示，所述pro-R的序列如SEQIDNO.2所示。
优选的，所述扩增vel1编码基因采用的引物为ove-vel1-F和ove-vel1-R，所述ove-vel1-F的序列如SEQIDNO.3所示，所述ove-vel1-R的序列如SEQIDNO.4所示。
优选的，所述扩增色氨酸终止子采用的引物为term-F和term-R，所述term-F的序列如SEQIDNO.5所示，所述term-R的序列如SEQIDNO.6所示。
优选的，步骤S1中还包括利用高保真Taq酶克隆获得深绿木霉菌T23的vel1基因的步骤。
优选的，步骤S2中，所述通过改良的农杆菌介导的遗传转化方法将所述vel1基因过表达框插入深绿木霉T23基因组DNA中具体包括：
A1、通过酶切酶连将所述vel1基因过表达框与pCAMBIA1300th载体连接后，进行大肠杆菌转化；
A2、挑取单克隆进行大肠杆菌菌落PCR验证，筛选阳性克隆提取vel1基因过表达载体，再进行农杆菌AGL-1转化；
A3、在含40mol/LMES和200mmol/LAS的IM诱导固体培养基中放入玻璃纸，静置30min让水份吸干后，将含有vel1基因过表达载体的农杆菌的菌液与深绿木霉菌T23孢子悬浮液的等体积混合液涂布于玻璃纸上，于25℃培养箱共培养48h；
A4、待白色菌丝铺满玻璃纸表面而未产孢时，将玻璃纸转移至含300μg/mL的特美汀与200μg/mL的潮霉素的IM培养基上，25℃培养5d长出转化子；
A5、挑选可能的转化子到含300μg/mL的头孢与200μg/mL的潮霉素的CYA培养基，验证后在含头孢的CYA平板上传5代后，单孢分离再传一代后，设计引物PCR验证得到阳性的转化子；
即实现将所述Vel1基因过表达框插入深绿木霉菌T23基因组DNA中。
本发明采用上述改良的农杆菌介导的遗传转化方法成功地将所述vel1基因过表达框插入深绿木霉T23基因组DNA中，经鉴定，本发明获得的深绿木霉菌T23-Ovel1菌株产孢子量明显高于野生株。并且该菌株经过继代培养，其高产分生孢子性状能够稳定遗传，为开发高效木霉菌生防菌剂提供优良的菌株资源。
优选的，步骤A2中，所述筛选采用的培养基为含卡那霉素和利福平抗性的LB液体培养基。
采用含有特美汀和潮霉素的IM培养基(含300μg/mL的特美汀与200μg/mL的潮霉素)。300ug/ml的特美汀的添加能抑制农杆菌的生长，减少农杆菌在侵染过程中阻力，增加其侵染效率，提高转化效率及转化子的稳定性。
优选的，所述含有300μg/mL特美汀和200μg/mL潮霉素的IM培养基包括如下成分：10mMK2HPO4、10mMKH2PO4、2.5mMNaCl、2mMMgSO4、0.7mMCaCl2、9mMFeSO4·7H2O、4mM(NH4)2SO4、10mM葡萄糖、40mMpH5.3的MES、200mM甘油、1.4％(体积)琼脂、300μg/mL特美汀和200μg/mL潮霉素。
优选的，步骤A5中，所选择的筛选CYA培养基成分(每毫升)：NaNO32g、K2HPO4·3H2O1g、KCl0.5g、MgSO4·7H2O0.5g、FeSO4·7H2O0.01g、蔗糖30g、1.4g琼脂粉，300μg/mL的头孢与200μg/mL潮霉素。pH7.4。
第二方面，本发明还涉及一种深绿木霉菌T23的Vel1基因过表达载体，其组成和构建过程如下：
B1、利用高保真Taq酶克隆获得深绿木霉菌T23的vel1编码基因全长；
B2、使用高保真酶KODneoplus，以pCAMBIA1300th质粒为模板分别扩增色氨酸强启动子和色氨酸终止子；以木霉菌T23基因组DNA为模板，扩增vel1编码基因；
B3、通过重叠PCR方法，先将色氨酸强启动子的扩增片段与vel1基因的扩增片段融合，片段回收后，再将融合了色氨酸强启动子的vel1基因片段与色氨酸终止子的扩增片段融合，获得所述vel1基因过表达载体。
第三方面，本发明还涉及一种高产孢子的木霉菌T23-Ovel1菌株，包含前述的Vel1基因过表达载体；所述深绿木霉菌T23-Ovel1菌株为深绿木霉(Trichodermo.atroviride)CCTCCNO:11575。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明为了构建深绿木霉T23中vel1基因的过表达菌株，采用融合PCR技术和多克隆快速连接试剂盒，将vel1基因全长，启动子和终止子连接获得过表达框，通过ATMT遗传转化，获得多个可能的转化子，通过形态和定量检测，确定一株孢子形成明显增加的过表达株，vel1基因过表达后，产孢量明显上升，菌丝量也变多。因此，本发明主要从分子遗传水平上通过过表达调控孢子形成的转录因子，获得高产孢子的木霉菌的改良菌株，在与野生菌株相同的培养条件下，本方法构建过表达菌株产孢子量明显高于野生株。并且该菌株经过继代培养，其高产分生孢子性状能够稳定遗传，为开发高效木霉菌生防菌剂提供优良的菌株资源。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为vel1基因过表达框构建和重叠引物设计原理示意图；
图2为转化子平板表型图；
图3为可能的转化子DNA提取凝胶电泳结果示意图；
图4为过表达转化子的PCR验证结果示意图；
图5为平板生长表型图；
图6为vel1基因的表达量检测示意图。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明涉及的专用名词的术语解释如下：
木霉菌：木霉菌(Trichodermaspp.)属于真菌门(Fungi)、半知菌亚门(Deuteromycotina)、丝孢纲(Hyphomycetes)、丝孢目(Hyphomycetales)、丛梗孢科(Moniliaceae)、木霉属(Trichoderma)，是一类重要的生防真菌，在自然界分布十分广泛，是土壤微生物的重要组成组分
vel1基因：丝状真菌中VELVET蛋白是调控次级代谢和性发育的重要因子。木霉菌中含有vel1基因编码VELVET蛋白，具有调控菌丝形态，分生孢子和厚垣孢子形成，以及木霉菌素等次级代谢产物的功能，间接影响其生防功能。
ATMT技术：农杆菌介导的遗传转化技术是由Ti质粒介导的，而Ti质粒上毒性基因vir主要承担转化过程中各个组分的编码和表达。Vir区上共有6个操纵子—VirA-E,G，这6个操纵子编码的蛋白质产物参与单链T-DNA的合成、加工和转移等过程。T-DNA复合物T-DNA进入细胞核后随机插入到受体细胞基因组中，造成外源DNA插入突变。
分生孢子和厚垣孢子：木霉菌在其生长周期内，会产生三种繁殖体，为菌丝体、分生孢子与厚垣孢子。木霉菌菌剂剂开发多以孢子为主要成分的活菌制剂，分生孢子具有产量高，易萌发的特性；厚垣孢子具有抗逆性强，存活期久等特点。
实施例
本发明的工作原理在于：鉴于木霉菌中vel1基因主要调控木霉菌孢子的形成，为了提高该基因的表达量，进而提高孢子的数量和水平。其中提高基因表达量的两种方法：插入该基因的多个拷贝，或在该基因前插入强启动子，目的是启动该基因的表达强度。本发明从深绿木霉T23中克隆vel1基因全长，测序，同源比对。采用融合PCR技术构建vel1基因过表达载体，利用ATMT介导的遗传转化方法，获得诱导其孢子高效形成的菌株。
1、构建vel1基因过表达框
本实施例首先利用高保真KODneoplus酶(上海硕盟生物科技有限公司)克隆深绿木霉菌T23(上海交通大学木霉菌菌种保藏中心)中的vel1基因，利用重叠PCR在vel1基因编码框前融合色氨酸强启动子(TrpCpromoter)(以pCAMBIA1300th质粒为模板)，在编码框融合色氨酸终止子(TrpCterminator)(以pCAMBIA1300th质粒为模板)，过表达框构建和重叠PCR引物设计原理如图1所示，在A片段和B片段连接的地方有20bp左右的碱基对是互补配对的，所以在A片段上游引物和B片段下游引物的扩增当中，AB片段就被连接在一起了。在vel1基因编码框前融合色氨酸强启动子(TrpCpromoter)，在编码框融合色氨酸终止子(TrpCterminator)。
首先将启动子和vel1基因编码框连接，片段回收后，再将连接好的片段与终止子连接。过表达株的构建过程中最为关键的是在vel1基因前面融合TrpC强启动子，长318bp，和在其后面融合TrpC终止子，长252bp。首先使用高保真酶KODneoplus(上海硕盟生物科技有限公司)，以pCAMBIA1300th质粒(本实验室)为模板分别扩增了TrpCpromoter和TrpCterminator，以T23的基因组DNA为模板扩增vel1基因的开放性阅读框，然后通过over-lapping(重叠)PCR将三个片段融合起来，通过多片段一步法(快速/无缝)克隆试剂盒(HieffCloneTMMultiOneStepPcrCloningKit)(前尘生物科技有限公司)，通过在引物两端设计20bp重叠序列，一次将分段启始区delX、GUSORF和3’frame一次性与载体pC1300th载体连接后，进行大肠杆菌转化，方法如下：将大肠杆菌感受态从-80℃冰箱取出置于冰上融化，取10μL连接产物加入转化管中，轻混后冰上放置30min。42℃热激90s，迅速置于冰上冷却5min。然后在超净台内向转化管中加入800μL无抗LB液体。在37℃摇床内培养45min。然后取200μL至含卡那霉素抗性的LB平板上涂板。37℃培养箱倒置培养12～16h后，即可看到大肠杆菌菌落，挑取单克隆进行菌落PCR验证。筛选阳性克隆提取过表达载体，再进行农杆菌AGL-1(本实验室)转化，方法如下：①含有vel1过表达框的质粒载体pCAMBIA1300th的DNA(一般15μl)加到200μL冰上溶化的农杆菌AGL-1感受态细胞中，轻混，冰浴30min；②液氮中速冻2min，37℃水浴5min，再迅速冰浴5min；③加入800μLLB液体培养基，28℃轻摇4-6h；④取200μL菌液涂布于YEB或LB选择平板上(100ug/ml卡那霉素)，28℃倒置培养2天；⑤待平板上长出阳性菌落后，挑取大小合适的菌落进行菌落PCR，同时转接到液体LB中，5mlLB，加10μl的卡那霉素和利福平，28℃，180r/min摇菌36h以上，获得含过表达框的农杆菌。然后将此农杆菌于28℃摇床活化，然后取100μL转移到15mL含卡那霉素和利福平抗性的LB液体培养基中，培养30h左右。取1mL活化的农杆菌12,000rpm离心2min，弃上清，IM液体重悬，重复一次，然后测定OD600，确定浓度，稀释至一定量的IM培养基中至OD600＝0.2。28℃振荡培养5h，使OD600＝0.6～0.8。提前4天活化木霉菌至产孢，用5mLIM培养基将生长4d的木霉孢子冲洗后三层擦镜纸过滤，显微镜计数后用IM稀释至终浓度106个/mL，至于28℃摇床培养6h。在这个期间，倒IM平板，无抗性，然后贴上灭菌的玻璃纸。6h后将农杆菌与孢子等量混匀，取200μL涂IM平板，25℃培养。培养48h后，将玻璃纸揭到含有特美汀和潮霉素的IM培养基上，25℃培养。挑选可能转化子到CYA抗性平板传代并经PCR验证。
融合PCR引物设计原理如表1所示：
表1融合PCR引物设计
2、ATMT转化获得vel1基因过表达的菌株
将获得的含有vel1过表达框的农杆菌于28℃摇床活化，然后取100μL转移到15mL含卡那霉素和利福平抗性的LB液体培养基中，培养30h左右。取1mL活化的农杆菌12,000rpm离心2min，弃上清，IM液体重悬，重复一次，然后测定OD600，确定浓度，稀释至一定量的IM培养基中至OD600＝0.2。28℃振荡培养5h，使OD600＝0.6～0.8。提前4天活化深绿木霉菌T23至产孢，用5mLIM培养基将生长4d的木霉孢子冲洗后三层擦镜纸过滤，显微镜计数后用IM稀释至终浓度106个/mL，至于28℃摇床培养6h。在这个期间，倒IM平板，无抗性，然后贴上灭菌的玻璃纸。6h后将农杆菌与孢子等量混匀，取200μL涂IM平板，25℃培养。培养48h后，待白色菌丝铺满玻璃纸表面而未产孢时，将玻璃纸转移至含300μg/mL的特美汀与200μg/mL的潮霉素的IM培养基上，25℃培养5d长出转化子；挑选可能的转化子到含300μg/mL的头孢与200μg/mL的潮霉素的CYA培养基，验证后在含头孢的CYA平板上传5代后，单孢分离再传一代后，设计引物PCR验证得到阳性的转化子。
通过改良的ATMT转化技术，共得到了12个可能的转化子，分别为标记为1，2，3，4，6，7，9，10，11，14，15，17传代三次单孢分离后，提取其中10个产孢量较大的转化子的DNA先进行验证，转化子形态和DNA提取结果如图2和3所示。设计引物对转化子进行PCR鉴定，选择潮霉素编码框中间设计了产物为525bp的引物(F:ACTGGCAAACTGTGATGGACGSEQIDNO.7，R：GAGTGCTGGGGCGTCGGTTTCSEQIDNO.8)进行PCR验证，最终PCR电泳结果如图4所示，根据电泳结果得到第4号、第6号、第7号、第9号、第10号、第14号为T-DNA插入的转化子，但是不同转化子中vel1基因是否过表达，还需要通过生长表型和qRT-PCR进行验证。
3、vel1基因表达量转录水平分析
利用平板生长表型和QRT-PCR检测vel1基因是否在深绿木霉菌中实现表达量提高。结合平板生长表型(图5)，确定候选菌株(4号和7号)作为进一步通过显微镜观察计算孢子数量，QRT-PCR测定vel1基因的表达量。结果如图6、表2所示，四号转化子的vel1基因的表达量明显高于野生株，其孢子产量提高了1个数量级，vel1基因的表达量是野生的1.55倍，将其标记为T23ovel1-4，而7号的表达量并未升高(七号结果未显示)。因此，并不是所有的阳性转化子中vel1基因均过表达，通过孢子生长表型和QRT-PCR的检测证实4号菌株正是希望的过表达菌株T23。
表2vel1基因转录水平qRT-PCR分析数据测定
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (10)
1.一种高产孢子的深绿木霉菌T23-Ovel1菌株的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、深绿木霉菌T23的vel1基因过表达框的构建：利用重叠PCR方法在深绿木霉菌T23的vel1基因编码框前融合色氨酸强启动子，在vel1基因编码框后融合色氨酸终止子，获得所述vel1基因过表达框；
S2、ATMT转化获得木霉菌T23-Ovel1菌株：通过农杆菌介导的遗传转化方法将所述vel1基因过表达框插入深绿木霉T23基因组DNA中，获得vel1基因过表达转化子；对所述vel1基因过表达转化子进行验证、筛选，获得所述深绿木霉菌T23-Ovel1菌株。
2.根据权利要求1所述的高产孢子的木霉菌T23-Ovel1菌株的构建方法，其特征在于，步骤S1中，先将色氨酸强启动子与vel1基因编码框融合，片段回收后，再将融合色氨酸强启动子的片段与色氨酸终止子融合。
3.根据权利要求1或2所述的高产孢子的木霉菌T23-Ovel1菌株的构建方法，其特征在于，步骤S1中，所述构建具体为：使用高保真酶KODneoplus，以pCAMBIA1300th质粒为模板分别扩增色氨酸强启动子和色氨酸终止子，以木霉菌T23基因组DNA为模板，扩增vel1编码基因，然后通过重叠PCR将三个扩增片段融合起来。
4.根据权利要求3所述的高产孢子的木霉菌T23-Ovel1菌株的构建方法，其特征在于，所述扩增色氨酸强启动子采用的引物为pro-F和pro-R，所述pro-F的序列如SEQIDNO.1所示，所述pro-R的序列如SEQIDNO.2所示。
5.根据权利要求3所述的高产孢子的木霉菌T23-Ovel1菌株的构建方法，其特征在于，所述扩增vel1编码基因采用的引物为ove-vel1-F和ove-vel1-R，所述ove-vel1-F的序列如SEQIDNO.3所示，所述ove-vel1-R的序列如SEQIDNO.4所示。
6.根据权利要求3所述的高产孢子的木霉菌T23-Ovel1菌株的构建方法，其特征在于，所述扩增色氨酸终止子采用的引物为term-F和term-R，所述term-F的序列如SEQIDNO.5所示，所述term-R的序列如SEQIDNO.6所示。
7.根据权利要求1所述的高产孢子的木霉菌T23-Ovel1菌株的构建方法，其特征在于，步骤S2中，所述通过农杆菌介导的遗传转化方法将所述vel1基因过表达框插入深绿木霉T23基因组DNA中具体包括：
A1、通过酶切酶连将所述vel1基因过表达框与pCAMBIA1300th载体连接后，进行大肠杆菌转化；
A2、挑取单克隆进行大肠杆菌菌落PCR验证，筛选阳性克隆提取vel1基因过表达载体，再进行农杆菌AGL-1转化；
A3、在含40mol/LMES和200mmol/LAS的IM诱导固体培养基中放入玻璃纸，静置30min让水份吸干后，将含有vel1基因过表达载体的农杆菌的菌液与深绿木霉菌T23孢子悬浮液的等体积混合液涂布于玻璃纸上，于25℃培养箱共培养48h；
A4、待白色菌丝铺满玻璃纸表面而未产孢时，将玻璃纸转移至含300μg/mL的特美汀与200μg/mL的潮霉素的IM培养基上，25℃培养5d长出转化子；
A5、挑选可能的转化子到含300μg/mL的头孢与200μg/mL的潮霉素的CYA培养基，验证后在含头孢的CYA平板上传5代后，单孢分离再传一代后，设计引物PCR验证得到阳性的转化子；即实现将所述vel1基因过表达框插入深绿木霉菌T23基因组DNA中。
8.根据权利要求7所述的高产孢子的木霉菌T23-Ovel1菌株的构建方法，其特征在于，所述含有300μg/mL特美汀和200μg/mL潮霉素的IM培养基包括如下成分：10mMK2HPO4、10mMKH2PO4、2.5mMNaCl、2mMMgSO4、0.7mMCaCl2、9mMFeSO4·7H2O、4mM(NH4)2SO4、10mM葡萄糖、40mMpH5.3的MES、200mM甘油、1.4％(体积)琼脂、300μg/mL特美汀和200μg/mL潮霉素。
9.一种深绿木霉菌T23的vel1基因过表达载体，其特征在于，其组成和构建过程如下：
B1、利用高保真Taq酶克隆获得深绿木霉菌T23DNA中的vel1编码基因全长；
B2、使用高保真酶KODneoplus，以pCAMBIA1300th质粒为模板分别扩增色氨酸强启动子和色氨酸终止子；以木霉菌T23基因组DNA为模板，扩增vel1编码基因；
B3、通过重叠PCR方法，先将色氨酸强启动子的扩增片段与vel1基因的扩增片段融合，片段回收后，再将融合了色氨酸强启动子的vel1基因片段与色氨酸终止子的扩增片段融合，获得所述vel1基因过表达载体。
10.一种高产孢子的深绿木霉菌T23-Ovel1菌株，其特征在于，包含权利要求9所述的vel1基因过表达载体；所述深绿木霉菌T23-Ovel1菌株为深绿木霉(Trichodermo.atroviride)CCTCCNO:11575。
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Cited By (3)
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| PRASUN K. MUKHERJEE ET AL.: "Regulation of Morphogenesis and Biocontrol Properties in Trichoderma virens by a VELVET Protein, Vel1", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 * |
| RAZIEH KARIMI AGHCHEH ET AL.: "The VELVET A Orthologue VEL1 of Trichoderma reesei Regulates Fungal Development and Is Essential for Cellulase Gene Expression", 《PLOS ONE》 * |
| 张运峰等: "利用重组PCR技术构建适合真菌ATMT转化的GFP基因表达载体", 《安徽农业科学》 * |
| 徐军等: "一个抗真菌蛋白在绿色木霉中的分泌表达", 《生物化学与生物物理学报》 * |
| 柳燕等: "红曲菌M-CL过表达载体的构建", 《中国科技论文在线》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106978360A (zh) * | 2017-04-24 | 2017-07-25 | 上海交通大学 | 一株高产纤维素酶里氏木霉重组菌株及其应用 |
| CN106978360B (zh) * | 2017-04-24 | 2020-08-04 | 上海交通大学 | 一株高产纤维素酶里氏木霉重组菌株及其应用 |
| CN113881579A (zh) * | 2021-11-09 | 2022-01-04 | 上海交通大学 | 木霉菌长链抗菌肽合成及抑菌活性提高的方法 |
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