CN103045492B - 一种汉逊酵母表达系统及其构建方法和应用 - Google Patents
一种汉逊酵母表达系统及其构建方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种汉逊酵母表达系统及其构建方法和应用，该表达系统含有尿嘧啶缺陷型汉逊酵母菌AU-0501，保藏编号为CGMCC No.7013。本发明提供的尿嘧啶缺陷型汉逊酵母菌具有突变位点明确、回复突变率低、遗传稳定性好、生物表达量高等优势，在基因工程疫苗的研究和生产中作用重大，相对于目前采用的其他真核表达系统具有产量更高、成本低的优点。本发明还提供了应用于该汉逊酵母表达系统的表达载体及其构建方法。本发明的表达载体可以实现同时共表达两个或多个基因。两个目的基因在汉逊酵母营养缺陷型细胞中可以无干扰地高水平表达。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种汉逊酵母表达系统，进一步还涉及该汉逊酵母表达系统的构建方法及其应用。
背景技术
酵母菌作为低等的单细胞真核微生物，既具有原核生物生长快、遗传操作简单的特点，又具有真核生物的翻译后加工和修饰功能，是生产真核生物活性蛋白较为理想的表达系统。酿酒酵母作为第一个表达外源基因的真核系统，应用至今已有三十多年了，大量的蛋白都得到了成功表达。但这一表达系统在工业化生产中存在着诸多不足，如菌株不稳定、外源基因表达水平不高、产量和分泌效率低、蛋白过度糖基化等。甲醇营养型酵母（简称甲醇酵母）是最近二十年逐渐发展起来的一类表达真核生物基因的较为理想的系统。这类酵母能在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基上生长。这类酵母主要包括假丝酵母（Candida）、球拟酵母（Torulopsis）、汉逊酵母（Hanseaula）和毕赤酵母（Pichia）。汉逊酵母是这类酵母中的佼佼者，是目前国际上公认的最为理想的高效表达外源基因的真核表达系统，与其他酵母相比具有独特的优势：1）可以利用甲醇氧化酶基因（MOX）启动子和甲醛脱氢酶基因（FMD）启动子实现外源基因的高效表达；2）重组质粒多以非同源重组的方式高拷贝整合于染色体上，较易获得高拷贝高表达的重组菌株；3）表达的外源蛋白贮存在过氧化物酶体里，可使其免受菌体内的蛋白酶降解；4）外源蛋白基因遗传稳定性好，不易丢失；5）外源蛋白即可在胞内表达又可进行分泌表达；6）能在廉价的合成或半合成培养基上进行高密度发酵，易放大，生产成本低，产物易分离纯化。
汉逊酵母是一种优于大肠杆菌和其他酵母菌的外源基因表达系统，近年来已有大量难以高效表达的外源蛋白在汉逊酵母表达系统中都得已成功表达。有效的汉逊酵母表达系统包括两个元件：能够启动外源基因高效表达的载体系统和具有特殊筛选标记的宿主菌。汉逊酵母菌作为理想的外源基因表达宿主菌，需要不同种类的筛选标记，筛选标记主要包括如下两类：一类为营养缺陷型选择标记，如URA3、LEU2、HIS4等标志基因，标志基因发生缺失的宿主菌只能在完全培养基中生长，而不能在选择培养基中生长，只有带有筛选标记的重组表达载体整合到宿主菌后，才能使宿主菌在选择培养基中生长；另外一类为显性选择标记，如抗G418、抗Zeocin的基因等。目前获得的营养缺陷型酵母菌的方法大部分都是通过化学诱变、杂交或原生质体融合等的传统方法获得的相应选择标记，这些方法存在许多明显的缺点，例如大部分为单点突变，易回复突变、存在多重突变效应、突变位点不明确、遗传稳定性差、难以获得较为理想的菌株。
发明内容
本发明的目的在于提供一种汉逊酵母表达系统；本发明的另一目的在于提供该汉逊酵母表达系统的构建方法及其应用。
本发明首先提供了一株多型汉逊酵母菌（Hansenula polymorpha）AU-0501，其为尿嘧啶缺陷型汉逊酵母菌，乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因被阻断，其保藏编号为CGMCC No.7013。
本发明使用的ATCC26012尿嘧啶缺陷性宿主细胞为多型汉逊酵母AU-0501，其保藏编号为CGMCC No.7013，已于2012年12月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，简称CGMCC，邮编100101）保藏，分类命名为多型汉逊酵母（Hansenula polymorpha）。
本发明提供了多型汉逊酵母菌AU-0501在生产外源蛋白中的应 用。
本发明提供了含有多型汉逊酵母菌AU-0501的汉逊酵母表达系统。
本发明提供了一种构建尿嘧啶缺陷型汉逊酵母菌的方法，包括以下步骤：
（1）以汉逊酵母野生型宿主菌基因组DNA为模板，分别以引物P1和P2进行PCR扩增获得Ura3的5’端基因片段，以引物P5和P6进行PCR扩增获得Ura3的3’端基因片段；以Pichia pastoris表达载体pPIC9K为模板，以P3和P4为引物进行PCR扩增获得G418基因片段；所述引物P1~P6的核苷酸序列如SEQ ID NO.13~18所示；
（2）将上述三个基因片段进行纯化，以纯化好的Ura3的5’端基因片段、G418基因片段、Ura3的3’端基因片段为模板，以引物P1和P6进行PCR扩增获得U5’-G418-U3’基因片段，将纯化获得U5’-G418-U3’基因片段通过电穿孔转化到汉逊酵母野生型宿主细胞中，U5’-G418-U3’基因片段通过同源重组方式整合于汉逊酵母野生型宿主细胞中；
（3）将转化后的细胞涂YPD+G418固体培养基于37℃培养箱培养至长出菌落；挑选菌落依次转接到YNB选择性固体培养基、YNB+尿嘧啶固体培养基、YPD+G418固体培养基上置37℃培养箱培养，挑选在YNB+尿嘧啶固体培养基、YPD+G418固体培养基上均生长而在YNB选择性固体培养基上不生长的菌落即为汉逊酵母尿嘧啶缺陷型宿主细胞。
进一步地，步骤（2）中，Ura3基因的阻断通过同源重组的方式，在乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因的第396-546位处插入G418抗性基因，从而获得乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因共计150个核苷酸缺失的营养缺陷型汉逊酵母菌。
在本发明的一个实施例中，所用的汉逊酵母野生型宿主菌为汉 逊酵母ATCC26012。
本发明提供了一种应用于汉逊酵母表达系统启动外源基因表达的载体，其为PMV-05，其含有启动子MOX-P、终止子MOX-T、复制子HARS、ura3基因、ColE1复制子、Amp抗性基因。
表达载体PMV-05，通过如下方法制备获得：
（1）以汉逊酵母基因组DNA为模板，分别以引物MOXP-F、MOXP-R；MOXT-F、MOXT-R；HARS-F、HARS-R（见SEQ ID NO.8）；Ura3-F、Ura3-R进行PCR扩增，获得基因MOXP、MOXT、HARS、Ura3；上述引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3~10所示；
（2）以PBR-SK质粒为模板，以引物Amp+ColE1-F、Amp+ColE1-R进行PCR扩增，获得基因Amp+ColE1，上述引物核苷酸序列如SEQ ID NO.11~12所示；
（3）将以上5个基因片段纯化，取纯化好的MOXP、MOXT基因片段作为模板，以引物MOXP-F和MOXT-R进行PCR扩增获得MOXP+MOXT基因片段；分别取纯化好的HARS、Ura3、Amp+ColE1基因片段各1μl作为模板，以引物HARS-R和Amp+ColE1-R进行PCR扩增获得HARS+Ura3+Amp+ColE1基因片段；将基因片段MOXP+MOXT、HARS+Ura3+Amp+ColE1进行纯化，将纯化好的基因片段MOXP+MOXT、HARS+Ura3+Amp+ColE1用SacI、SalI分别进行双酶切，将酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收酶切基因片段，连接，将连接后的重组表达载体转化感受态细胞中，转化克隆筛选得到重组表达载体PMV-05。
表达载体PMV-05能够在表达外源蛋白中发挥作用。
表达载体PMV-05能够在合适的宿主细胞中成功表达HPV L1蛋白（16、18、31、33、52、58）及EV71（P1和3CD基因共表达）、乙肝(HBsAg)、戊肝（ORF2）。
本发明提供了一种汉逊酵母表达系统，包括启动外源基因表达 的载体和具有特定筛选标记的宿主细胞，所述宿主细胞为尿嘧啶缺陷型汉逊酵母菌，其乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因被阻断；所述启动外源基因表达的载体为PMV-05，其含有启动子MOX-P、终止子MOX-T、复制子HARS、ura3基因、ColE1复制子、Amp抗性基因。
进一步地，所述尿嘧啶缺陷型汉逊酵母菌为多型汉逊酵母AU-0501，其保藏编号为CGMCC No.7013。
进一步地，所述的特定筛选标记为尿嘧啶营养缺陷型和G418抗性基因2个筛选标记。
本发明提供了上述汉逊酵母表达系统在生产类病毒颗粒疫苗中的应用。
本发明提供的尿嘧啶缺陷型汉逊酵母菌AU-0501具有突变位点明确、回复突变率低、遗传稳定性好、生物表达量高等优势，在基因工程疫苗的研究和生产中作用重大，相对于目前采用的其他真核表达系统具有产量更高、成本低的优点。本发明还提供了应用于该汉逊酵母表达系统的表达载体及其构建方法。本发明的表达载体可以实现同时共表达两个或多个基因。两个目的基因在汉逊酵母营养缺陷型细胞中可以无干扰地高水平表达。
附图说明
图1为PCR扩增电泳检测结果，1、2、3、4、5分别为MOXP、MOXT、HARS、Ura3、Amp+ColE1；其中M：DL2000bp plus（北京全式金生物技术有限公司）。
图2为MOXP+MOXT基因片段PCR扩增电泳检测结果;其中M：DL2000bp plus（北京全式金生物技术有限公司）。
图3为HARS+Ura3+Amp+ColE1基因片段电泳结果;其中M：DL2000bp plus（北京全式金生物技术有限公司）。
图4为不同引物（MOXP-F/MOXP-R；Ura3-F/Ura3-R）对表达载体PMV单克隆菌落1-8号进行PCR鉴定的电泳检测结果；其中 m1-m8为引物MOXP-F/MOXP-R鉴定结果，u1-u8为引物Ura3-F/Ura3-R鉴定结果；其中M：DL2000bp plus（北京全式金生物技术有限公司）。
图5为表达载体PMV-05电泳检测结果，其中M：DL15000（宝生物工程有限公司）。
图6为表达载体PMV-05双酶切（SacI、SalI）电泳检测结果，1为重组表达载体PMV-05，2为重组表达载体PMV-05双酶切，其中M：DL15000（宝生物工程有限公司）。
图7为重组表达载体PMV-05-HPV16L1-f PCR鉴定电泳检测结果，其中M:DL2000bp plus（北京全式金生物技术有限公司）。
图81、2、3、4均为重组表达载体PMV-05-HPV16L1-f电泳检测结果，M:DL15000（宝生物工程有限公司）。
图9为重组表达载体PMV-05-HPV16L1-f双酶切（BamHI、EcoRI）电泳检测结果，其中1、3、5、7为重组表达载体对照，2、4、6、8为进行双酶切的表达载体，M：DL15000（宝生物工程有限公司）。
图101、2、3分别为Ura35’端、Ura33’端、G418PCR扩增电泳检测结果，M：DL2000bp plus（北京全式金生物技术有限公司）。
图11为U5’-G418-U3’基因片段PCR电泳检测结果，M：DL2000bp plus（北京全式金生物技术有限公司）。
图12显示汉逊酵母表达的HPV16L1菌株F（PMV-05-HPV16L1-f质粒转化菌）经小瓶甲醇诱导表达72h后的蛋白SDS-PAGE检定结果。M：为低分子量蛋白标准（北京全式金公司）；1：为原核表达阳性对照菌株；2：为不带外源基因的宿主细胞蛋白（阴性对照）；9、10、11、12、13：为菌株诱导样品。
图13显示汉逊酵母表达的HPV16L1菌株F经小瓶甲醇诱导表达72h后的蛋白质免疫印迹（Western blot）检定结果。样品顺序如 图12所示。
图14显示HPV16L1菌株发酵模式图。
图15显示经过超速离心纯化的HPV16L1蛋白的SDS-PAGE检定结果。M：为低分子量蛋白标准（北京全式金公司）；1：为不带外源基因的宿主细胞蛋白（阴性对照）；2-12：为超速离心后紫外吸收峰处分管收集蛋白样品。
图16显示HPV16L1-f蛋白的透射电镜照片。
图17显示EV71病毒样颗粒的透射电镜照片（放大倍数：97000）。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）中所述的条件进行。
实施例1表达载体PMV-05的构建
本发明的表达载体PMV-05由6部分组成：启动子（MOX-P）、终止子（MOX-T）、复制子HARS、ura3基因、ColE1复制子、Amp抗性基因。
以汉逊酵母ATCC26012基因组DNA为模板，分别以引物MOXP-F（序列见SEQ ID NO.3）、MOXP-R（见SEQ ID NO.4）；MOXT-F（见SEQ ID NO.5）、MOXT-R（见SEQ ID NO.6）；HARS-F（见SEQ ID NO.7）、HARS-R（见SEQ ID NO.8）；Ura3-F（见SEQID NO.9）、Ura3-R（见SEQ ID NO.10）进行PCR扩增，调取基因MOXP、MOXT、HARS、Ura3。以PBR-SK质粒（购自宝生物工程大连有限公司，货号：D3050）为模板，以引物Amp+ColE1-F（见 SEQ ID NO.11）、Amp+ColE1-R（见SEQ ID NO.12）进行PCR扩增，调取基因Amp+ColE1。PCR反应体系如下：PCR缓冲液10μl，dNTP10μl，引物F1μl,引物R1μl，Taq DNA polymerase1μl蒸馏水157μl总体积200μl。反应条件:95℃2min；95℃30s,55℃30s，72℃2min；反应30个循环。将PCR扩增的DNA片段以1%琼脂糖电泳进行检测，PCR产物大小分别约为MOXP:1500bp左右、MOXT:300bp左右、HARS：500bp左右、Ura3:1100bp左右、Amp+ColE1：2200bp左右，PCR电泳结果见图1。将以上5个基因片段用DNA片段纯化试剂盒进行纯化。分别取纯化好的MOXP、MOXT基因片段各1μl作为模板，以引物MOXP-F和MOXT-R进行PCR扩增获得MOXP+MOXT基因片段，反应体系及反应条件同上，PCR获得的MOXP+MOXT基因片段电泳结果如图2所示。分别取纯化好的HARS、Ura3、Amp+ColE1基因片段各1μl作为模板，以引物HARS-R和Amp+ColE1-R进行PCR扩增获得HARS+Ura3+Amp+ColE1基因片段，PCR反应体系如下：PCR缓冲液10μl，dNTP10μl，引物F1μl,引物R1μl，Taq DNA polymerase1μl蒸馏水155μl总体积200μl。反应条件:95℃2min；95℃30s,55℃30s，72℃4min；反应30个循环。PCR获得的HARS+Ura3+Amp+ColE1基因片段电泳结果如图3所示。将基因片段MOXP+MOXT、HARS+Ura3+Amp+ColE1用DNA片段纯化试剂盒进行纯化。将纯化好的基因片段MOXP+MOXT、HARS+Ura3+Amp+ColE1分别进行（SacI、SalI）双酶切，酶切反应如下：基因片段60μl，SacI、SalI各3μl，10×Basal buffer10μl，10×BSA10μl，加水至100μl，于37℃进行酶切过夜。将酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收酶切基因片段，通过SolutionI连接试剂盒（购自宝生物工程（大连）有限公司）进行连接。连接反应体系如下：HARS+Ura3+Amp+ColE1（SacI、SalI）双酶切纯化产物1μl，MOXP+MOXT（SacI、 SalI）双酶切纯化产物4μl，SolutionI5μl共计10μl反应体系，于16℃连接1小时。将连接后的重组表达载体转化到100μl大肠杆菌（DH5a）感受态细胞中，涂LB+Amp（100μg/mL）固体培养基37℃培养箱过夜培养。
转化克隆筛选：挑取LB+Amp固体培养基上的单克隆菌落做为模板，分别以引物MOXP-F、MOXP-R，Ura3-F、Ura3-R进行PCR鉴定转化克隆，PCR反应体系如下：PCR缓冲液2μl，dNTP2μl，上游引物0.1μl,下游引物0.1μl，Taq DNA polymerase0.1μl蒸馏水15.7μl总体积20μl。反应条件:95℃2min；95℃30s,55℃30s，72℃1min；反应30个循环。将PCR扩增的DNA片段以1%琼脂糖电泳进行检测，以MOXP-F、MOXP-R为引物的PCR产物大小约应为1500bp左右，以Ura3-F、Ura3-R为引物的PCR产物大小约应为1000bp左右，PCR电泳结果见图4。将PCR鉴定正确的5号转化克隆命名为：重组表达载体PMV-05，并将其接种到10mL LB+Amp液体培养基于37℃摇床200rpm过夜培养。按照质粒提取试剂盒（来源：北京全式金生物技术有限公司）说明书进行重组表达载体PMV-05的提取，将提取的重组表达载体进行1%琼脂糖电泳进行检测，检测结果见图5。将所获得的表达载体进行酶切鉴定，酶切反应体积如下：质粒5μl，SacI、SalI各1μl，10×Basal buffer2μl，10×BSA2μl，加水至20μl，于37℃进行酶切4小时，酶切结果电泳检测如图6所示。
实施例2尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母细胞的获得及稳定性分析
1、尿嘧啶缺陷型汉逊酵母细胞的获得
分别从Pichia pastoris表达载体pPIC9K（购自inritrogen公司）获得G418抗性基因序列，从Gene bank获得Hansenula Ura3基因序列。根据Ura3及G418基因序列设计引物P1、P2、P3、P4、P5、P6，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13~18所示。
以汉逊酵母野生型宿主菌ATCC26012基因组DNA为模板，分别以引物P1和P2进行PCR扩增获得Ura3的5’端基因片段，以引物P5和P6进行PCR扩增获得Ura3的3’端基因片段；以Pichia pastoris表达载体pPIC9K为模板，以P3和P4为引物进行PCR扩增获得G418基因片段。PCR反应体系如下：PCR缓冲液10μl，dNTP8μl，模板1μl，上游引物0.5μl,下游引物0.5μl，Taq DNApolymerase0.5μl蒸馏水79.5μl总体积100μl。反应条件:95℃2min；95℃30s,55℃30s，72℃2min；反应30个循环。将PCR扩增的DNA片段以1%琼脂糖电泳进行检测，检测结果如图10所示。将三个基因片段用DNA片段纯化试剂盒进行纯化。分别取纯化好的Ura3的5’端基因片段、G418基因片段、Ura3的3’端基因片段个1μl作为模板，以引物P1和P6进行PCR扩增获得U5’-G418-U3’基因片段，反应体系及反应条件同上，PCR获得的U5’-G418-U3’基因片段如图11所示。用DNA片段纯化试剂盒纯化上述PCR产物，将纯化获得U5’-G418-U3’基因片段通过电穿孔转化到汉逊酵母ATCC26012野生型宿主细胞中，U5’-G418-U3’基因片段通过同源重组方式整合于汉逊酵母ATCC26012野生型宿主细胞中。将转化后的细胞涂YPD+G418固体培养基于37℃培养箱培养至长出菌落。挑选100个菌落依次转接到YNB选择性固体培养基、YNB+尿嘧啶固体培养基、YPD+G418固体培养基上置37℃培养箱培养3天。挑选在YNB+尿嘧啶固体培养基、YPD+G418固体培养基上均生长而在YNB选择性固体培养基上不生长的菌落即为汉逊酵母ATCC26012尿嘧啶缺陷型宿主细胞，该尿嘧啶营养缺陷型宿主细胞为通过同源重组的方式将乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶（URA3）基因阻断，具体的为在乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因的第396-546位处插入G418抗性基因，从而获得乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因共计150个核苷酸缺失的尿嘧啶缺陷型汉逊酵母宿主细胞。本发明的ATCC26012尿嘧啶缺陷 性宿主细胞为多型汉逊酵母AU-0501，其保藏编号为CGMCCNo.7013，已于2012年12月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，简称CGMCC，邮编100101）保藏，分类命名为多型汉逊酵母（Hansenula polymorpha）。
2、尿嘧啶缺陷型汉逊酵母细胞遗传稳定性分析
取冻存的尿嘧啶缺陷型汉逊酵母菌种AU-0501一支，融化后接种到10mL YPD液体培养基中置37℃摇床培养200rpm培养20小时，连续转接8次（48世代以上），4000rpm离心10分钟，收集沉淀加入5mLMD培养基重悬洗涤菌体2次，再次离心，加入10mLMD培养基重悬菌体，取100ul用蒸馏水连续稀释到10-4、10-5、10-6，分别取100μl涂布在YPD+G418、MD和MD+Ura3固体培养基平板上，每个稀释度平行涂布两个平板，置37℃恒温培养箱培养3天。各个平板培养情况如下：
表1各平板菌落培养情况
该营养缺陷型汉逊酵母菌AU-0501能在YPD+G418和MD+Ura3固体培养基平板上生长，而在MD固体培养平板上不能生长，证明该菌株具有G418抗性，且是尿嘧啶缺陷型菌株，同时也证明了该宿主菌回复野生型的突变率为0，遗传稳定性好。
3、尿嘧啶缺陷型汉逊酵母细胞生物量分析
将野生型汉逊酵母ATCC26012和尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母 菌AU-0501划线接种于YPD固体培养基上培养2天，用牙签分别挑取大小一致的单菌落接种于10mLYPD液体培养基中37℃200rpm摇床振荡培养24小时，测定OD600nm进行计算，取相同菌量的野生型酵母菌和营养缺陷型酵母菌分别接种于2%的葡萄糖液体培养基和1%的甲醇液体培养基，每种培养基平行接种2瓶，于37℃200rpm摇床振荡培养24小时，培养结束后4000rpm离心10分钟，加入10mL蒸馏水洗涤1次，再次离心收集沉淀，进行称重计算生物量，野生型酵母菌和营养缺陷型酵母菌生物量如下表所示。
表2野生型酵母菌和营养缺陷型酵母菌生物量分析
由表2可见野生型汉逊酵母ATCC26012和尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌AU-0501在生物量上无明显差异，生长稳定，且尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌AU-0501能在以甲醇为唯一碳源的培养基上生长，保持了野生型酵母菌的生理生化特性。
实施例3编码人乳头瘤病毒16型L1蛋白（HPV16L1-f）的基因在尿嘧啶缺陷型汉逊酵母中的表达
1、编码HPV16L1-f蛋白的基因序列优化
根据我国流行的高致病性HPV16型毒株的L1蛋白的核苷酸序列，使用vector软件对HPV16L1基因序列按照汉逊酵母最偏爱密码子进行优化设计，以提高其在汉逊酵母细胞中的表达量。本发明提供的编码HPV16L1-f蛋白的基因其核苷酸序列为去掉酵母分泌信号肽的序列或被酵母识别的转录终止信号的序列。本发明编码 HPV16L1-f蛋白的基因的密码子使用了汉逊酵母最偏爱的密码子。汉逊酵母（Pichia angusta）密码子使用频率可参见 http://www.kazusa.or.jp/codon/。为了避免翻译出来的mRNA的GC含量过高、mRNA的二级结构影响翻译的效率，本发明对某些氨基酸使用次偏爱密码，前提是该次偏爱密码与最偏爱密码使用频率非常接近，氨基酸序列原序列不变，在某些很特殊的情况下，为了减少或增加酶切位点，某些位置的序列做适当的序列调整。由此，本发明优化设计了HPV16L1截短体基因，其序列如SEQ ID NO.1所示，优化后的HPV16L1基因序列如SEQ ID NO.1所示，该基因HPV16L1-f序列由上海捷瑞公司合成并克隆在Dev-C载体（购自上海捷瑞公司）上。HPV16L1-f蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2、重组表达载体PMV-05-HPV16L1-f的构建
将优化合成的基因HPV16L1-f克隆在Dev-C载体上，基因序列在优化设计时两端均加入了EcoRI、BamHI酶切位点以便克隆入表达载体。
将已克隆入HPV16L1-f基因的Dev-C载体与实施例1制备得到的表达载体PMV-05进行EcoRI、BamHI（均购自宝生物工程（大连）有限公司）双酶切，反应体系如下：质粒30μl，EcoRI、BamHI各3μl，10×K buffer10μl，加水至100μl，于37℃进行酶切过夜。将酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收基因片段与线性表达载体，通过SolutionI连接试剂盒（购自宝生物工程（大连）有限公司）进行连接。连接反应体系如下：载体PMV-05（EcoRI/BamHI）双酶切纯化产物1μl，HPV16L1-f基因（EcoRI/BamHI）双酶切纯化产物5μl，SolutionI6μl共计12μl反应体系，于16℃连接1小时。将连接后的重组表达载体转化到100μl大肠杆菌（DH5a）感受态细胞中，涂LB+Amp（100μg/mL）固体培养基37℃培养箱过夜培 养。
转化克隆筛选：挑取LB+Amp固体培养基上的单克隆菌落做为模板，以表达载体上的引物进行PCR鉴定转化克隆，PCR反应体系如下：PCR缓冲液2μl，dNTP2μl，引物F（AGTTTTTGCCCTACTTGATCACAG）0.1μl,引物R（ACTCGCTATTTCAGCTTTTCATCTC）0.1μl，Taq DNApolymerase0.1μl蒸馏水15.7μl总体积20μl。反应条件:95℃2min；95℃30s,55℃30s，72℃2min；反应30个循环。将PCR扩增的DNA片段以1%琼脂糖电泳进行检测，PCR产物大小约为1600bp左右，PCR电泳结果见图7。将PCR鉴定正确的转化克隆命名为：重组表达载体PMV-05-HPV16L1-f，并将其接种到10mLLB+Amp液体培养基于37℃摇床200rpm过夜培养。按照质粒提取试剂盒（来源：北京全式金生物技术有限公司）说明书进行重组表达载体PMV-05-HPV16L1-f的提取，将提取的重组表达载体进行1%琼脂糖电泳进行检测，检测结果见图8。将所获得的重组表达载体进行酶切鉴定，酶切反应体积如下：质粒5μl，EcoRI、BamHI各1μl，10×K buffer2μl，加水至20μl，于37℃进行酶切4小时，酶切结果电泳检测如图9。
3、汉逊酵母系统表达的HPV16L1菌株F的诱导表达及检测
将制得的重组表达载体PMV-05-HPV16L1-f通过电穿孔转化到汉逊酵母ATCC26012尿嘧啶缺陷型宿主细胞中。
通过选择培养基对转化菌株进行筛选。将表达载体转化菌命名为F，将菌株F接种在选择培养基MDL（0.67%酵母氮源培养基，购自SIGMA公司，规格：Y1251-KG，批号：030M1754），0.5%硫酸铵，2%葡萄糖）中，33℃摇床培养20小时，5000rpm离心6min，收集沉淀，加入诱导培养基MM（0.67%酵母氮源培养基，0.5%硫酸铵，1%甲醇）中，每天补加1%的甲醇，诱导表达3天。
SDS-PAGE凝胶电泳分析：取诱导后样品100μl离心，收集沉淀，用无菌水清洗，进行NaOH处理3min，离心弃上清，沉淀以100ulSDS Sample buffer重悬，煮沸10min，离心，上清10ul上样进行电泳，电泳完毕取下凝胶进行银染，凝胶成像系统软件扫描分析目的蛋白表达量。
SDS-PAGE检测结果显示（如图12）：重组菌株表达的F蛋白分子量在51KD左右，分子量大小与预期的目的蛋白大小一致，应用凝胶成像系统软件进行扫描分析结果表明目的蛋白的表达量占菌体总蛋白的20%，具有较高的表达量。
Western-blot检测：用抗HPV16L1抗体（abcam公司，ab69）作为一抗，使用HRP-羊抗鼠-IgG（北京博奥森公司）作为二抗，DAB显色。
Western-blot结果显示（如图13）：表达产物能与单克隆抗体特异性结合，并在52.6KD处有较为明显的反应条带，与SDS-PAGE结果一致，说明该表达产物具有良好地免疫反应性。
将重组菌株F发酵后，获得汉逊酵母细胞，并重悬于细胞裂解缓冲液中(20mmol/L NaH2PO4,2mmol/L EDTA-Na2，0.4mol/L NaCl,pH7.5)洗2次，然后以1：4（W/V）的比例悬浮于含4mmol/LPMSF，1%Tween-20，3%PEG6000的细胞裂解缓冲液中，使用高压匀浆机在压力1100bar的操作压力下破碎细胞2次，使细胞破碎率达95%以上。将破碎后的细胞液倒入离心筒中，进行8000rpm离心20min，收集上清液，以0.45um膜包进行微滤以除掉大分子物质。将澄清后的蛋白液以300KD的膜包进行超滤以除掉小分子物质。
将超滤后蛋白液，以0.5M NaOH调pH8.0，加入5M NaCl溶液，搅拌条件下滴加0.5g/mL PEG6000溶液至终浓度0.12g/mL，4℃下静置2h，4℃下12000rpm离心30min，弃上清液，用适当体积的20mmol/L PB溶解沉淀，于4℃下5000rpm再次离心30min， 收集第2次离心上清液即为粗纯蛋白液。向粗纯蛋白液中加入固体溴化钾调密度至1.28g/mL。超度离心上样顺序为：1M NaCl-EDTA-Na2150mL垫液；1.28KBr样品液600mL；1.34KBr梯度液700mL；1.40KBr梯度液240mL。8℃，25000rpm离心4h，以1.40KBr溶液做为顶液，分管收集紫外吸收峰，每管取样进行SDS-PAGE检测，检测结果如图15所示。
分子筛层析：以Sephacryl S-500HR为例，以PBS（pH7.2）进行洗脱，收集紫外吸收峰即为纯化蛋白液。
纯化蛋白浓度检测（Lowry法）：精确量取标准蛋白牛血清白蛋白溶液（100μg/mL）0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，分别置于试管中，加蒸馏水补至1mL，同时量取5倍稀释纯化蛋白液1mL于试管中，分别加5mL碱性铜液，0.5mL酚试剂，于比色杯中用650nm波长测定吸光度值。以标准蛋白的蛋白含量做为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，计算待检纯化蛋白液的浓度。检测结果如表3所示：
表3纯化蛋白浓度（Lowry法）检测结果
Lowry法检测结果获得纯化蛋白终浓度为288μg/mL。
纯化产物电镜分析：取经纯化的HPV16L1-f蛋白液10ul滴加于铜网上，避光保存5min，除净多余液体，用1%磷钨酸染色2min，通过透射电镜（TEM）对HPV16L1-f VLPs进行分析。结果表明HPV16L1-f蛋白呈现病毒样颗粒，具有天然病毒的正二十面体结构，病毒颗粒直径在50-60nm之间，颗粒完整规则（如图16所示，放大 倍数：59000）。
实施例4肠道病毒71型（Human enterovirus71）病毒样颗粒在尿嘧啶缺陷型汉逊酵母菌中的表达
在本实施例中，通过在一个表达载体（PMV-05）上克隆入EV71的P1前体蛋白基因和3CD蛋白酶基因，构建重组表达载体PMV-P1-3CD，经过转化汉逊酵母营养缺陷型宿主菌AU-0501，筛选获得P1和3CD蛋白在酵母体内共表达的菌株。
将重组菌株进行发酵培养96小时后，离心收获汉逊酵母细胞，使用高压匀浆机在破碎细胞2次，将破碎后的细胞液倒入离心筒中，离心收集上清液。将破碎后离心收集的上清液进行10倍系列梯度稀释，以原核表达的EV71-VP1纯化产物做为标准品，用EV71ELISA检测试剂盒（京天成生物技术（北京）有限公司，该试剂盒主要检测EV71-VP1蛋白）进行重组EV71病毒样颗粒表达量测定，经测定发酵细胞破碎液中EV71病毒样颗粒的表达量达到200mg/L。
取发酵样品进行蛋白质免疫印迹（Western blot）检测，用抗EV71-VP1单克隆抗体（京天成公司）作为一抗，使用HRP-羊抗鼠-IgG（北京博奥森公司）作为二抗，DAB显色。Western-blot结果显示：表达产物能与单克隆抗体特异性结合，并在33KD处有较为明显的反应条带，说明该表达产物具有良好地免疫反应性。
重组EV71病毒样颗粒的电镜分析：取经纯化的EV71VLP蛋白液10ul滴加于铜网上，避光保存5min，除净多余液体，用1%磷钨酸染色2min，通过透射电镜（TEM）对EV71VLPs进行分析。结果表明：EV71蛋白呈现病毒样颗粒，具有天然病毒的正二十面体结构，病毒颗粒直径在30-40nm之间，颗粒完整规则（如图17所示，放大倍数：97000）。
在本实施案例中，重组表达载体PMV-P1-3CD在营养缺陷型汉逊酵母中得到了共表达，成功实现了EV71的3CD蛋白酶自动切割 P1前体蛋白为vp1、vp2、vp3、vp4蛋白，并且该四种蛋白在酵母体内自动组装形成了病毒样颗粒（VLPs），发酵产物经过破碎、层析、超速离心后得到纯化颗粒性抗原。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (2)
1.一种用于共表达肠道病毒71型P1前体蛋白和3CD蛋白的汉逊酵母表达系统，其特征在于，包括启动外源基因表达的载体和具有特定筛选标记的宿主细胞，所述宿主细胞为尿嘧啶缺陷型汉逊酵母菌AU-0501，保藏编号为CGMCC No.7013，其乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因被阻断；启动外源基因表达的载体为PMV-05，其含有启动子MOX-P、终止子MOX-T、复制子HARS、ura3基因、ColE1复制子、Amp抗性基因；
所述载体PMV-05的构建方法为：
(1)以汉逊酵母基因组DNA为模板，分别以引物MOXP-F、MOXP-R；MOXT-F、MOXT-R；HARS-F、HARS-R；Ura3-F、Ura3-R进行PCR扩增，获得基因MOXP、MOXT、HARS、Ura3；上述引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3～10所示；
(2)以PBR-SK质粒为模板，以引物Amp+ColE1-F、Amp+ColE1-R进行PCR扩增，获得基因Amp+ColE1，上述引物核苷酸序列如SEQ ID NO.11～12所示；
(3)将获得的MOXP、MOXT、HARS、Ura3和Amp+ColE1基因片段纯化，取纯化好的MOXP、MOXT基因片段作为模板，以引物MOXP-F和MOXT-R进行PCR扩增获得MOXP+MOXT基因片段；分别取纯化好的HARS、Ura3、Amp+ColE1基因片段各1μl作为模板，以引物HARS-R和Amp+ColE1-R进行PCR扩增获得HARS+Ura3+Amp+ColE1基因片段；将基因片段MOXP+MOXT、HARS+Ura3+Amp+ColE1进行纯化，将纯化好的基因片段MOXP+MOXT、HARS+Ura3+Amp+ColE1用SacI、SalI分别进行双酶切，将酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收酶切基因片段，连接，将连接后的重组表达载体转化感受态细胞中，转化克隆筛选得到重组表达载体PMV-05。
2.权利要求1所述的汉逊酵母表达系统在制备肠道病毒71型病毒样颗粒疫苗中的应用。
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