CN1651570A - 一种重组多形汉逊酵母菌及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组多形汉逊酵母菌及其构建方法与应用，其目的是提供一种遗传较稳定的重组多形汉逊酵母菌及其构建方法与其在生产外源蛋白中的应用。本发明所提供的重组多形汉逊酵母菌，是乳清酸苷－5－磷酸脱羧酶基因被阻断的多形汉逊酵母菌。其构建方法包括以下步骤：1)构建乳清酸苷－5－磷酸脱羧酶基因被筛选标记基因灭活的重组载体；2)将步骤1)中的重组载体导入野生型多形汉逊酵母菌中，筛选得到乳清酸苷－5－磷酸脱羧酶基因被阻断的多形汉逊酵母菌。本发明的重组多形汉逊酵母菌将在外源蛋白的生产中发挥重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种重组多形汉逊酵母菌及其构建方法与应用，特别是涉及一种重组多形汉逊酵母菌及其构建方法与其在生产外源蛋白中的应用。
背景技术
酵母菌作为单细胞真核生物，既具有原核生物生长快，遗传操作简单的特点，又具有与高等真核生物相似的基因表达调控和翻译后修饰机制，因此是生产真核生物活性蛋白理想的表达系统。在过去20多年的时间里，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作为第一个真核基因表达系统得到了广泛的应用。但这一表达系统在应用过程中也存在诸多不足之处，如外源基因表达水平不高、表达蛋白的分泌水平低及多肽链糖基化过度、菌株不稳定等。而其他的酵母菌株，尤其是甲醇营养型酵母在外源基因的表达上则显示出更大的优势：重组菌株遗传稳定性高，外源蛋白的表达量和分泌效率比酿酒酵母高10-100倍，且没有过度糖基化的现象，因此适于大规模发酵生产目的蛋白。其中的多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)除具有上述优点外，还具有其特有的优势：(1)可利用甲醇氧化酶基因(MOX)启动子和甲醛脱氢酶基因(FMD)启动子等强启动子高效地启动外源基因的表达；(2)非同源重组的频率高，因而重组质粒可以高拷贝整合到染色体上，易获得高拷贝整合的转化子；(3)表达的外源蛋白通常贮存在过氧化物酶体内，可使其免受胞内蛋白酶的降解，并且降低了对细胞的毒害作用；(4)能用廉价的培养基进行高密度发酵，进一步提高外源基因的表达水平；(5)耐高温，最适生长温度为37℃-43℃，生长速率快，大规模发酵的培养时间短、污染率低。因此，多形汉逊酵母是目前国际上公认的最为理想的外源基因表达系统之一，适于大规模工业化生产外源蛋白。
有效的酵母表达系统包括两个主要元件：启动外源基因高效表达的载体系统和具有特定筛选标记的宿主细胞。在多形汉逊酵母表达系统中，主要利用的是带有营养缺陷筛选标记(leu、ura、trp或ade)的宿主细胞。由于多形汉逊酵母同源重组的频率较低，只有当两侧的同源序列大于1kb时才可能利用类似于酿酒酵母的基因阻断法获得基因阻断突变株，因此目前使用的营养缺陷型菌株多是通过化学诱变得到的，它们突出的缺点是遗传稳定性较低，难于获得理想的转化子，而且可能存在多重突变效应，使细胞的生理生化特性与野生型细胞存在明显差异，为大规模工业生产带来不便。因此通过现代生物学技术构建遗传稳定的、只有特定基因功能被阻断的基因表达宿主菌是多形汉逊酵母表达系统更好地应用于工业生产亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种遗传较稳定的重组多形汉逊酵母菌。
本发明所提供的重组多形汉逊酵母菌，是乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(HURA3被阻断的多形汉逊酵母菌。
所述重组多形汉逊酵母菌的代表是多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCC No.1218，已于2004年09月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.1218。其菌落呈凸起状、乳白色、有光泽、边缘整齐，细胞呈椭圆形，该菌株的最适生长温度为37℃，pH为5.5。
本发明的第二个目的是提供一种构建上述重组多形汉逊酵母菌的方法。
本发明所提供的构建上述重组多形汉逊酵母菌的方法，包括以下步骤：
1)构建乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因被筛选标记基因灭活的重组载体；
2)将步骤1)中的重组载体导入野生型多形汉逊酵母菌中，筛选得到乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(HURA3)被阻断的多形汉逊酵母菌。
其中，所述筛选标记基因可为G418抗性基因、新霉素抗性基因或铜离子抗性基因。
所述G418抗性基因可为KanMX。
所述KanMX可来源于pFA6a-KanMX。
用于构建所述乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(HURA3)被筛选标记基因灭活的重组载体的出发载体可为基因工程领域中的质粒载体、丝状噬菌体载体或酵母菌穿梭载体，优选为pUC18、pUC19、pUC118、pUC119等，尤其优选为pUC18或pUC19。
所述野生型多形汉逊酵母菌优选为多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)JCM3621。
所述乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因被筛选标记基因灭活的重组载体可为pHURK。
所述重组多形汉逊酵母菌为多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11CGMCC No.1218。
本发明的重组多形汉逊酵母菌可用于生产外源蛋白，在实际应用中，可将目的基因导入多形汉逊酵母表达载体，得到重组表达载体，将含有目的基因的重组表达载体转化多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCC No.1218，利用营养缺陷互补筛选获得重组菌，对重组菌进行诱导培养，得到外源蛋白。
所述外源蛋白为淀粉酶或植酸酶。
本发明利用小片段同源序列介导的同源整合及多形汉逊酵母细胞内高频率非同源重组的发生构建了乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(HURA3)被阻断的重组多形汉逊酵母菌。
本发明通过基因工程手段，构建了遗传稳定、尿嘧啶营养缺陷型的重组多形汉逊酵母菌(尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母基因工程宿主菌)，特别是多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCC No.1218，该菌株比目前国内外所用的营养缺陷型宿主菌遗传稳定性高，回复突变率低，便于进行遗传转化和重组菌株的筛选，并保持了野生型菌株的生理生化特性，有利于重组菌株的培养和外源蛋白的高效表达，具有较高的工业应用价值。
附图说明
图1为重组质粒p18HURA的构建示意图
图2为尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母基因工程宿主菌的构建示意图
图3为质粒pMOX-Amy的物理图谱
图4为质粒pMOXα-Amy的物理图谱
图5为质粒pMOXα-appA的物理图谱
具体实施方式
下述实施例中所有涉及含量的百分数均为质量百分数。
下述实施例中所用限制性内切酶均购自TaKaRa公司。
实施例1、多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCC No.1218的构建及其生物量和生物活性的检测
一、构建含有多形汉逊酵母菌的乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(HURA3)的重组质粒p18HURA
如图1所示，重组质粒p18HURA的构建过程如下：
1、多形汉逊酵母菌的乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(HURA3)的获得
根据已报道的多形汉逊酵母菌的HURA3的核苷酸序列设计的引物序列如下：
引物1：5′-CCA
GGATCCTCAACATTTCCCTGAATAAT-3′(序列表中的序列1)(划线部分碱基为BamHI识别位点)
引物2：5′-CGA
GAATTCTCACTAGTATTCCCGCGACT-3′(序列表中的序列2)(划线部分碱基为EcoRI识别位点)
以多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)JCM3621(ATCC34438)的总DNA为模板，在引物1和引物2的引导下进行PCR反应扩增HURA3，PCR反应体系为：模板DNA 0.6μg，引物1 0.5μmol/L，引物2 0.5μmol/L，dNTP 200μmol/L，10×PCR缓冲液5μL，pfu DNA聚合酶(Promega公司)1单位，用去离子水补至50μL，混匀后加入20μl石蜡油；用国产PCR仪TC-96AE设置PCR反应条件为：94℃5分钟，循环1次；94℃40秒，70℃1分钟，50℃1分钟，29个循环；94℃40秒，70℃15分钟，50℃1分钟，循环1次。
将PCR产物回收并纯化后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明得到了大小约0.9kb的DNA片段，与预期的大小一致，将其命名为HURA3。
2、将步骤1的PCR产物经BamHI和EcoRI酶切后，与经同样酶酶切的质粒载体pUC18(TaKaRa公司)在T4DNA连接酶作用下，16℃反应10-16小时进行连接，得到重组质粒，将其命名为p18HURA。将重组质粒p18HURA用BamHI和EcoRI限制性内切酶进行酶切鉴定，结果表明PCR扩增到的HURA3片段与GenBank中的HURA3片段具有相同的酶切图谱；采用双脱氧终止法测定插入重组质粒p18HURA的HURA3的核营酸序列，结果表明HURA3与已报道的HURA3的序列同源性为100％，说明扩增得到了多形汉逊酵母菌乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因的编码序列。
二、HURA3基因被阻断的重组质粒pHURK的构建
pHURK的构建过程如图2所示，具体步骤如下：
1、含有G418抗性基因(KanMX)的载体pFA6a-KanMX(Wach A，Brachat A，Poehlmann R，Philippsen P.(1994)New heterologous modules for classical orPCR-based gene disruptions in Saccharomyces cerevisiaea.Yeast，10：1793-1808)；
2、用限制性内切酶EcoRV和SacI双酶切实施例1的重组质粒p18HURA，用限制性内切酶SmaI和SacI双酶切步骤1的质粒载体pFA6a-KanMX，将上述酶切产物分别经低熔点琼脂糖凝胶电泳回收约3.6Kb的p18HURA线性片段和1.48Kb的G418抗性基因(KanMX)片段，并将回收的DNA片段分别溶于TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)，-20℃保存备用；
3、将步骤2的p18HURA线性片段和G418抗性基因(KanMX)片段用T4DNA连接酶连接，得到p18HURA载体中HURA3被阻断，即HURA3基因功能被阻断的重组质粒，将其命名为pHURK，连接反应体系为：3μl去离子水，1μl 10×连接缓冲液，1μl浓度为0.05pmol/μl的线性化的p18HURA，4μl浓度为0.02pmol/μl的KanMX片段和1μl T4DNA连接酶；连接条件为：22℃，温育10-16小时。再将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，用蓝白斑法筛选阳性克隆，挑取白色单菌落接种于含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中37℃培养12-24小时后，用碱裂解法提取质粒，得到重组质粒pHURK。
三、多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCC No.1218的获得
转化溶液的配制：
0.1M醋酸锂溶液(LiAc-TE)：将醋酸锂溶于TE缓冲液(pH8.0)，使其终浓度为0.1M；
40％PEG-4000醋酸锂溶液：将20克PEG4000溶于0.1M LiAc-TE中，定容至50ml；
小牛胸腺DNA：4mg小牛胸腺DNA溶于1ml TE缓冲液(pH8.0)，4℃ 12-24小时，反复抽吸混匀，置于100℃沸水中煮沸10分钟后，迅速冰浴，冷却后进行分装，-20℃保存备用。
将步骤二的质粒pHURK用酵母菌完整细胞转化法转化野生型多形汉逊酵母JCM3621，经筛选获得尿嘧啶营养缺陷型(因HURA3基因功能被阻断)菌株，具体步骤如下：
1、将野生型多形汉逊酵母JCM3621接种于YEPD斜面培养基进行活化，用接种环挑取一环菌体接种于5ml YEPD液体培养基中，37℃ 150rpm摇床振荡培养，取1.5ml处于对数生长期的菌体细胞悬液，5000rpm离心1分钟收集菌体，用0.5ml 0.1M醋酸锂溶液将收集的菌体清洗后，再将菌体细胞重悬于100μl 0.1M醋酸锂溶液中，得到菌体细胞悬液；向菌体细胞悬液中加入5-10μg质粒pHURK和10μg小牛胸腺DNA，37℃保温10分钟，再加入700μl 40％PEG-4000醋酸锂溶液，混匀，37℃保温1.5小时；转化体系中加入二甲亚砜，使其终浓度为10％(v/v)，45℃水浴热击5分钟；再加入1ml液体YEPD培养基，37℃保温30分钟，离心收集菌体细胞，将收集的菌体细胞重悬于2ml含1mg/ml G418的液体YEPD培养基中，37℃培养12小时；
2、将菌液稀释1000倍后，取200μL涂布于含0.1mg/ml G418的YEPD平板上，37℃培养3-5天，筛选转化子；
3、筛选转化子中的尿嘧啶营养缺陷型菌株，具体步骤如下：
挑取步骤2中在YEPD抗性平板上长出的单菌落于无菌水中混匀，室温静置4小时，然后分别接种于固体YNB(酵母菌生长基本培养基)培养平板、添加35μg/ml尿嘧啶(Ura)的固体YNB培养平板和固体YEPD平板上，37℃培养48小时，获得在添加35μg/ml尿嘧啶(Ura)的固体YNB培养平板和YEPD平板上能够正常生长，而在YNB培养基上不能生长的菌株，将上述菌株在YEPD平板上划线培养，每个菌株挑取50个单菌落分别置于无菌水中，室温静置4小时后，分别接种于以葡萄糖作碳源的YNB培养平板、添加35μg/ml尿嘧啶(Ura)的YNB培养平板以及以甲醇作碳源的YNB、添加35μg/ml尿嘧啶(Ura)的YNB培养平板培养平板上，37℃培养48小时，结果表明：在含尿嘧啶的YNB培养基上能够生长，而在缺乏尿嘧啶的YNB培养基上不能存活的菌株为尿嘧啶缺陷型菌株，其它表型(甲醇利用、37℃生长良好)均与野生型相同；
4、对步骤3获得的尿嘧啶营养缺陷型菌株进行鉴定：
1)用质粒YEp352(Hill JE，Meyers AM，Koerner TJ，Tzagoloff A，Yeast/E.colishuttle vectors with multiple unique restriction sites.Yeast，1993，9：163-167.)转化上述尿嘧啶缺陷型菌株，获得能够被酿酒酵母乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(ScURA3)互补的菌株，从生物学功能上证明上述尿嘧啶营养缺陷型菌株即为HURA3基因功能缺失的多形汉逊酵母菌突变株；
2)提取多形汉逊酵母野生型菌株JCM3621和步骤1)获得的尿嘧啶营养缺陷型菌株的总DNA。用限制性内切酶HindIII和PstI酶切质粒pFA6a-KanMX，回收0.7kb的G418抗性基因内部的DNA片段，以此为探针进行Southern杂交检测，结果野生型菌株和尿嘧啶营养缺陷型菌株的总DNA均未产生杂交信号，表明通过质粒pHURK引入细胞内的KanMX既没有插入到HURA3基因内部，也没有插入到染色体的其他部位；
3)以步骤2)提取的尿嘧啶营养缺陷型菌株的总DNA为模板，在步骤一的引物1和引物2的引导下，进行高保真PCR反应扩增菌株内的HURA3基因，对PCR产物用双脱氧法进行核苷酸序列测定，通过序列分析和同源性比较，表明在获得的HURA3基因功能缺失的多形汉逊酵母突变株的HURA3基因内部插入了5个碱基，造成第10个密码子之后发生移码突变，使得细胞不能产生有活性的乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶，将该HURA3基因功能缺失的尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母突变株(Hansenulapolymorpha)命名为HU-11，该菌株已于2004年09月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC №1128，即为尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母基因工程宿主菌-多形汉逊酵母菌(Hansenulapolymorpha)HU-11 CGMCC No.1218(构建过程如图2所示)。
四、检测尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCCNo.1218的生物量
将野生型多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)JCM3621和尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCC No.1218接种于YEPD斜面培养基进行活化，用接种环从斜面上挑取一环菌体接种于2ml YEPD液体培养基中，37℃振荡培养16小时；再按10％接种量转接于10ml YEPD液体培养基中，37℃摇床振荡培养16小时；离心收集菌体细胞，将细胞用无菌水洗两次，称重后，将细胞分成等量的四份，两份细胞为一组，将两组细胞分别接种于50ml YEPD液体培养基中和50ml以甲醇代替YEPD中的葡萄糖的液体培养基中，再将每组中的两份细胞分别于37℃摇床振荡培养24小时和48小时，离心收集细胞，用无菌水洗一次，再次离心后，将收集的细胞沉淀称重，计算其生物量。在以葡萄糖为碳源的培养基中，培养24小时，野生型菌株和尿嘧啶营养缺陷型菌株的生物量分别为27.2g/L和26.7g/L，培养48小时，生物量分别为37.8g/L和37.5g/L；以甲醇为碳源的培养基中，野生型菌株和尿嘧啶营养缺陷型菌株的生物量分别为23.4g/L(24小时)、31.7g/L(48小时)和22.9g/L(24小时)、31.5g/L(48小时)。因此多形汉逊酵母菌(Hansenulapolymorpha)HU-11 CGMCC No.1218和野生型多形汉逊酵母菌在生物量上无明显差异，生长较稳定。
五、尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCCNo.1218的遗传稳定性分析
将上述构建的HURA3基因功能被阻断的尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCC No.1218接种于YEPD液体培养基中传代培养30次，取200μl经稀释后细胞涂布于YEPD平板，37℃培养48小时，随机挑取100个单菌落分别置于2ml无菌水中，在室温下饥饿4-6小时；取饥饿后的菌液分别接种于以葡萄糖为碳源的YNB平板和添加35μg/ml尿嘧啶的YNB平板上以及用甲醇作碳源的YNB平板和添加35μg/ml尿嘧啶的YNB平板上，37℃培养48小时，结果表明单菌落在添加尿嘧啶的YNB基本培养基上都生长，在没有添加尿嘧啶的YNB基本培养基上则完全不能生长，且没有出现回复突变现象，证明本发明构建的多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCC No.1218是一株遗传稳定，并保持了野生型多形汉逊酵母菌生理生化特性的尿嘧啶营养缺陷型突变株。
实施例2、淀粉酶基因在多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCCNo.1218中的胞内表达
1)以载体YIp5(Struhl K，Stinchcomb DT，et al.High-frequencytransformation of yeast：Autonomous replication of hybrid DNA molecules.ProcNatl Acad Sci USA，1979，76：1035-1039)为出发载体。用限制性内切酶SalI分别酶切质粒YIp5和pHARS(Roggenkamp R，Hansen H，et al.Transformation of themethylotrophic yeast Hansenula polymorphabby autonomous replication andintegration vectors.Mol Gen Genet，1986，202：302-308)，低熔点琼脂糖凝胶电泳分别回收5.6kb的线性YIp5 DNA片段和0.5kb的多形汉逊酵母自主复制序列HARS，并将回收的DNA片段分别溶于TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)中，进行连接反应，连接反应体系为：3μl去离子水，1μl 10×连接缓冲液，1μl浓度为0.05pmol/μl的线性化的YIp5，4μl浓度为0.06pmol/μl的HARS片段和1μl T4DNA连接酶；连接条件为：16℃，温育10-16小时。再将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，通过四环素抗性失活筛选阳性克隆，挑取失去四环素抗性的单菌落接种于含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中37℃培养12-24小时后，用碱裂解法提取质粒，得到重组质粒pIHARS5。用EcoRI完全酶切质粒pIHARS5后，再用SalI进行部分酶切，低熔点琼脂糖凝胶电泳回收6.1DNA片段，溶于TE缓冲液中；用SalI和MunI酶切质粒pMPT121(Godecke S，Eckart M，et al.Identification ofsequences responsible for transcriptional regulation of the stronglyexpressed methanol oxidase-encoding gene in hansenula polymorpha，Gene，1994，139：35-42)，低熔点琼脂糖凝胶电泳回收1.8kb含甲醇氧化酶基因启动子和终止子序列及多克隆位点的DNA片段(MOXp-MOXt)，将回收的DNA片段进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞，将转化子接种于含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中37℃培养12-24小时后，用碱裂解法提取质粒，得到重组质粒pHAM1。
根据报道的扣囊复膜孢酵母α-淀粉酶基因(AMY)的核苷酸序列设计引物amy1(5′-CC
GAATTCAATATGCAAATTTCAAAAGC-3′，划线部分为EcoRI识别位点)和amy2(5′-CT
GAATTCTCATGAACAAATGTCAGAAGC-3′，划线部分为EcoRI识别位点，以扣囊复膜孢酵母(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.2.1626)染色体DNA为模板进行PCR反应扩增α-淀粉酶基因(AMY)。用EcoRI分别酶切PCR扩增的α-淀粉酶基因和质粒pHAM1，低熔点琼脂糖凝胶电泳回收1.5kb的DNA片段和7.9kb的线性载体片段，上述片段在T4DNA连接酶作用下进行连接反应，转化大肠杆菌感受态细胞，将转化子接种于含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中37℃培养12-24小时后，用碱裂解法提取质粒，获得重组载体pMOX-Amy，该质粒的物理图谱如图3所示，该质粒带有ScURA3基因作为遗传转化的筛选标记；
2)遗传转化：将重组质粒pMOX-Amy转化多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCC No.1218，在酵母菌基本培养基上，通过营养缺陷互补筛选转化子，可在以葡萄糖为碳源的YNB平板生长的菌株为转化子；
3)验证转化子：挑取多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCCNo.1218和转化子单菌落置于2ml无菌水中，在室温条件下饥饿4-6小时，取饥饿后的菌液分别接种于以葡萄糖为碳源的YNB培养平板和添加35μg/ml尿嘧啶(Ura)的YNB培养平板以及以甲醇为碳源的YNB培养平板和添加35μg/ml尿嘧啶(Ura)的YNB培养平板上，37℃培养48小时，结果表明转化子在不含尿嘧啶(Ura)的两种不同碳源的YNB培养平板均能够正常生长，从营养需求上验证了转化子。
4)多拷贝转化子筛选：将转化子接于基本培养基YNB中，连续传代培养30次，稀释后涂YEPD平板，提取单菌落总DNA，以淀粉酶基因AMY为探针进行Southern杂交检测，结果表明获得了AMY高拷贝整合的重组菌株，将其命名为HU11-AMY，将重组HU11-AMY菌接种于YEPD斜面上，37℃培养48小时，4℃保存。
5)重组菌株培养：将多形汉逊酵母重组菌株HU11-AMY活化后，用接种环挑取一环细胞接种于10毫升YNB液体培养基中，37℃摇床振荡培养14-20小时获得的菌液作为液体菌种，将液体菌种按10％的接种量接入装有100毫升以总还原糖含量为2％的甘蔗糖蜜为碳源的合成培养基(5.0g磷酸二氢钾，10g磷酸一铵，4.5g七水合硫酸镁，5.0g硫酸铵，2.3g氯化钾，0.5g氯化钠，0.75g氯化钙，0.1g硫酸铁铵，8mg五水合硫酸铜，30mg七水合硫酸锌，40mg硫酸锰，0.1g硫胺素，0.3mg生物素，适量甘蔗糖蜜，用水定容至1升)，37℃振荡培养48小时；
6)诱导培养：在上述培养物中添加甲醇至终浓度为1％，37℃摇床振荡培养48小时，期间每隔8小时按0.5％比例补加甲醇；
7)培养结束后，5000转/分钟离心5分钟收集细胞，按常规方法测定细胞内淀粉酶活性，表明在上述条件下，每升培养液的细胞湿重为80-85克，每克湿细胞的淀粉酶为28-32个酶活力单位。
实施例3、淀粉酶基因在多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCCNo.1218中的分泌表达
1)设计并合成引物amy3(5′CC
CTGCAGAATATGCAAATTTCAAAAGC-3′，划线部分为PstI识别位点)，与实施例2中的引物amy2一起，以扣囊复膜孢酵母(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CGMCC No.2.1626)染色体DNA为模板，进行PCR反应扩增α-淀粉酶基因(AMY)。
设计并合成引物αP1(5′-TAA
GAATTCAAAATGAGATTTCCTT-3′，划线部分为EcoRI识别位点)和αP2(5′CGT
CTGCAGCTCAGCTTCAGCCTCTCTT-3′，划线部分为PstI识别位点)，以质粒pMETαB(Invitrogen公司)为模板，进行PCR反应扩增约0.3kb的编码酿酒酵母α-因子信号肽的序列MFα1s。
用限制性内切酶EcoRI酶切实施例2中构建的质粒pHAM1，用限制性内切酶EcoRI和PstI酶切本实施例中PCR扩增产物AMY和MFα1s，低熔点琼脂糖凝胶电泳回收7.9kb的线性pHAM1片段、1.5kb的α-淀粉酶基因AMY和0.3kb的α-因子信号肽序列MFα1s，上述三个DNA片段在T4DNA连接酶作用下进行连接反应，转化大肠杆菌感受态细胞，将转化子接种于含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中37℃培养12-24小时后，用碱裂解法提取质粒，获得重组载体pMOXα-Amy，该质粒的物理图谱如图4所示，该重组质粒带有ScURA3基因作为遗传转化的筛选标记，而且在外源基因编码序列上游有分泌信号序列，可以进行外源蛋白的分泌表达；
步骤2)-6)与实施例2相同；
7)培养结束后，5000转/分钟离心5分钟收集细胞和上清液，按常规方法测定细胞外淀粉酶活性，表明在上述条件下，每升培养液的细胞湿重为83-87克，每升培养液总的淀粉酶为2300-2560个活力单位，其中上清液中的酶活力为总活力的91％，细胞内的淀粉酶活力仅为总活力的9％。
实施例4、植酸酶在多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCCNo.1218中的分泌表达
1)质粒YEp352(Hill JE，Meyers AM，Koerner TJ，Tzagoloff A.Yeast/E.colishuttle vectors with multiple unique restriction sites.Yeast，1993，9：163-167.)为出发载体，用EcoRI和SalI双酶切质粒YEp352，回收5.2kb线性DNA片段，按实施例2步骤1)所述方法分别回收含甲醇氧化酶基因启动子和终止子序列及多克隆位点的DNA片段(MOXp-MOXt)和多形汉逊酵母自主复制序列HARS，首先将线性YEp352与HARS进行连接反应，16℃反应8小时后，反应体系中再加入MOXp-MOXtDNA片段，16℃继续反应8小时，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，通过蓝白菌落筛选阳性克隆，将白色转化子接种于含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中37℃培养12-24小时后，用碱裂解法提取质粒，获得重组载体pYEAM1。
根据报道的大肠杆菌植酸酶基因appA核苷酸序列设计并合成引物AP1(5′-CAA
CTGCAGATGAAAGCGATCTTAATCCCAT-3′，划线部分为PstI识别位点)和AP2(5′-CCA
GAATTCATTACAAACTGCACGCCGGT-3′，划线部分为EcoRI识别位点)，以大肠杆菌(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CGMCC No.1.1420)基因组DNA为模板，进行PCR反应扩增1.3kb的植酸酶基因appA。用EcoRI酶切质粒pYEAM1，回收7.5kb线性DNA片段，用PstI和EcoRI酶切PCR产物，低熔点琼脂糖凝胶电泳回收1.3kb appA基因，上述两种DNA片段与实施例3回收的0.3kb的α-因子信号肽序列MFα1s一起进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，将转化子接种于含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中37℃培养6小时后，快速提取质粒，电泳检测，将质粒大小正确的转化子接种于含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中37℃培养16小时后，用碱裂解法提取质粒，获得重组质粒pMOXα-appA，该质粒的物理图谱如图5所示，该质粒带有ScURA3基因作为转化酵母菌的筛选标记；
步骤2)-6)与实施例2和3相同；
7)培养结束后，5000转/分钟离心5分钟收集细胞和上清液，按常规方法测定细胞内、外植酸酶活性，表明在上述条件下，每升培养液的细胞湿重为83-87克，每升培养液中的植酸酶为1700-1800个活力单位，其中92％的植酸酶分泌到培养液中。
序列表
<160>2
<210>1
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
ccaggatcct caacatttcc ctgaataat 29
<210>2
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
cgagaattct cactagtatt cccgcgact 29
Claims (10)
1、一种重组多形汉逊酵母菌，是乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因被阻断的多形汉逊酵母菌。
2、根据权利要求1所述的重组多形汉逊酵母菌，其特征在于：所述重组多形汉逊酵母菌为多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCC No.1218。
3、一种构建权利要求1所述重组多形汉逊酵母菌的方法，包括以下步骤：
1)构建乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因被筛选标记基因灭活的重组载体；
2)将步骤1)中的重组载体导入野生型多形汉逊酵母菌中，筛选得到乳清酸苷-5磷酸脱羧酶基因被阻断的多形汉逊酵母菌。
4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述筛选标记基因为G418抗性基因、新霉素抗性基因或铜离子抗性基因；所述G418抗性基因为KanMX。
5、根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：用于构建所述乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因被筛选标记基因灭活的重组载体的出发载体为质粒载体、丝状噬菌体载体或酵母菌穿梭载体；所述质粒载体为pUC18、pUC19、pUC118或pUC119。
6、根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述野生型多形汉逊酵母菌为多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)JCM3621。
7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因被筛选标记基因灭活的重组载体为pHURK。
8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述重组多形汉逊酵母菌为多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCC No.1218。
9、权利要求1或2所述重组多形汉逊酵母菌在生产外源蛋白中的应用。
10、根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述外源蛋白为淀粉酶或植酸酶。
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