CN105727280A

CN105727280A - 基于表达HBsAg的热失活全重组汉逊酵母细胞的乙肝治疗疫苗

Info

Publication number: CN105727280A
Application number: CN201610180329.XA
Authority: CN
Inventors: 汪和睦; 王昌华; 杨珺
Original assignee: 汪和睦
Current assignee: Tianjin Jianmin harmony Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2016-03-25
Filing date: 2016-03-25
Publication date: 2016-07-06
Anticipated expiration: 2036-03-25
Also published as: US10653772B2; SG11201808266QA; US20190216921A1; EP3434281A4; JP6821780B2; EP3434281A1; WO2017162091A1; EA201892179A1; JP2019509347A; CN105727280B

Abstract

基于表达HBsAg的热失活全重组汉逊酵母细胞的乙肝治疗疫苗，所述疫苗为重组汉逊酵母胞内表达的HBsAg，在10⁸细胞中含有6?10μg HBsAg为抗原；所述疫苗共含有16?21个HBsAg特异性CTL(细胞毒T淋巴细胞)表位；所述疫苗以优化的热失活全重组汉逊酵母细胞为佐剂，本发明提供的疫苗基于汉逊酵母表达系统平台，通过HBsAg特异性CTL细胞靶向感染HBV的肝细胞释放IFN?γ：第一步非肝细胞损伤地减少其90％以上HBV cccDNA分子池，第二步提高了过程中损毁受感染的肝细胞，并触发HBV免疫逆转。

Description

基于表达HBsAg的热失活全重组汉逊酵母细胞的乙肝治疗疫苗

技术领域

本发明属基因工程领域，涉及疫苗为热失活全重组汉逊酵母细胞表达HBsAg-adw2治疗乙肝疫苗。

背景技术

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是一个严重的公共卫生问题。据世界卫生组织(World Health Oganization,WHO)报道,全球60亿人口中，约20亿人曾感染过HBV，其中3.5亿人为慢性HBV感染，每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌(肝癌)。全球肝癌患者中，75％以上是由HBV所致。我国属HBV感染地方性流行区。我国卫生部于1992年将乙型肝炎疫苗纳入计划免疫管理。据2006年全国乙型肝炎血清流行病学调查表明，经过近15年的努力,我国一般人群，尤其是15岁以下儿童,乙型肝炎病毒感染率明显下降。,但由于历史原因，据推算我国现在仍有慢性HBV感染者约9300万人,其中慢性乙型肝炎患者约2000万例。每年因HBV导致的肝硬化和肝癌死亡30余万例,新发乙型肝炎病例50万-100万例。乙型肝炎仍是是我国当前和今后相当长时期内危害人民健康、阻碍社会发展、影响社会稳定的重要因素,是一个严重的公共卫生问题。据调查.我国每年因慢性乙肝(包括肝硬化、肝癌)的直接和间接医疗费用约6800亿元。如何对现有的乙肝病毒感染者及乙肝患者进行有效的治疗成为成为乙肝防治工作中需要优先解决的重大问题。

乙肝疫苗免疫预防与治疗是降低疾病负担最有效的方法。基因重组技术是现代生物技术的核心技术；也是规模化生产乙肝疫苗主要组份：病毒样颗粒乙肝病毒表面抗原(HBsAg VLP)的唯一技术。酿酒酵母是第一个表达外源基因的真核系统。但由于酿酒酵母表达系统在工业化生产中仍存在许多不足，如工程菌株的外源基因质粒游离在细胞质中，遗传不稳定；发酵密度不高，生产效率低；合成的多肽链常过度糖基化等。申请人从1995年开始从事汉逊酵母重组乙肝疫苗研发工作。1998-2002年在大连高新生物制药有限公司，主持开发的汉逊酵母重组HBsAg adw2乙肝疫苗，HBsAg VLP抗原纯品(原液)产率为40mg/升；于2002年起经国家审批上市。2003-2006年本人为北京天坛生物制品股份有限公司协议开发的重组汉逊酵母HBsAg-adr2乙型肝炎疫苗，其HBsAg VLP抗原纯品(原液)产率为85mg/升以上；已于2015年申报国家新药审评，以该疫苗为基础申请的中国专利公开号为CN104232661A。

根据现有技术查明的乙型肝炎发病机制如下：人感染HBV后,一般可分为免疫耐受期、免疫清除期和非活动或低(非)复制期。免疫耐受期的特点是HBV复制活跃,血清HBsAg和HBeAg阳性,HBV DNA滴度较高(＞10⁵拷贝/ml),血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平正常,肝组织学无明显异常。免疫清除期表现为血清HBV DNA滴度＞10⁵拷贝/ml,但一般低于免疫耐受期,天门冬氨酸氨基转移酶(AST)持续或间歇升高,肝组织学有坏死炎症等表现。非活动或低(非)复制期表现为HBeAg阴性,抗-HBe阳性,检测不到(PCR法)或低于检测下限,水平正常,肝组织学无明显炎症。但在青少年和成人期感染HBV,一般无免疫耐受期,一开始即为免疫清除期,表现为急性乙型肝炎,其中仅5％-10％发展成慢性。但其确切的发病机制仍不了解。

抗乙型肝炎病毒治疗是目前对乙肝病毒感染者及乙肝患者的主要治疗手段。目前抗乙型肝炎病毒药物主要有以干扰素类为主的免疫调节剂和针对HBV DNA多聚酶的核苷酸类似物两大类,虽有一定疗效,但尚不满意,多数患者不能被治愈。干扰素虽可使少数患者HBsAg消失或血清学转化,但费用较高,需要注射,且有一定副作用；核苷酸类似物则作用于HBV DNA聚合酶,只能抑制病毒复制,不能彻底清除HBV DNA和cccDNA,且长期应用易导致病毒耐药变异。

因此,为了彻底清除肝细胞HBV和cccDNA，亟待开发新的更有效的HBV治疗乙肝疫苗。人体肝脏为一免疫耐受器官；肝脏移植免疫排斥反应低充分表明这一点。乙型肝炎病毒(HBV)感染人的部位为肝脏；因此对HBV的免疫耐受为其主要特征。逆转HBV免疫耐受是开发慢性乙型肝炎患者(CHB)免疫治疗疫苗的立足点。HBV免疫耐受不仅体现在肝脏局部anti-HBV免疫应答不能有效清除病毒，导致持续感染；也体现在HBV持续存在，进而诱导全身性免疫系统对HBV无应答，如HBV耐受期病人对HBsAg疫苗无应答。这也是当前治疗性疫苗在CHB病人中难以成功的主要原因。肝脏诱导的免疫耐受及其逆转机制研究将为研制治疗乙肝疫苗提供了理论依据。

最近的数据表明，初始CD8+T(CTL)细胞活化在肝脏内发生，同时肝脏预先有炎症(即天然免疫活化)则存活的CTLs增多，CTLs更有效，导致肝脏免疫应答，清除感染的HBV。而在预先无炎症(即天然免疫未活化，如婴幼儿时)则CTL功能受损和CTL半寿命短，导致肝脏对HBV免疫耐受。然而，初始HBV抗原相遇免疫诱导高效激活HBV CTLs存在于肝脏外的淋巴结内，然后再进入肝脏，则也使存活的CTLs增多，CTLs更有效，也导致肝脏免疫应答，清除感染的HBV。这一关于两个部位的免疫机制为研制皮下、肌肉注射治疗乙肝疫苗，导致肝脏免疫应答、清除感染的HBV提供了理论依据。

2014年美国Thomas H.King报道：“A Whole Recombinant Yeast-BasedTherapeutic Vaccine that is comprised of heat-inactivated,whole recombinantSaccharomyces cerevisiae yeast cells expressing disease-related antigens”；为一种由热失活、全重组酿酒酵母细胞-表达与疾病相关抗原为基础的治疗性疫苗。该研究开创了以胞内重组表达蛋白为抗原，以热失活全酿酒酵母细胞为佐剂的治疗性疫苗平台。在此平台下已有编号为GS4774为乙型肝炎治疗性疫苗，其表达的HBV抗原为一种作为融合蛋白的x-s-core抗原。这一酵母载体可以提供多种抗原进入MHC I类和II类抗原提呈途径，刺激强有力的CD4+和CD8+细胞反应，并能打破免疫学小鼠模型中抗原的耐受性。该酵母载体也不容易在体内被中和，因此适合于重复用药，使之获得长期的免疫压力，理想地清除慢性细胞内感染，如HCV和HBV。

2010年Huang报道：啤酒酵母细胞壁纯化而得的β-葡聚糖颗粒(GPS)，其中具有1,3-D-glucan聚合物>85％，2％甲壳素，1％脂类和蛋白质，与其余的大部分是灰和水分。进行的体外T细胞增殖实验中，将卵清蛋白(OVA)复合至空心GPS壳内(GP-OVA)组成的疫苗，并采用游离OVA为对照抗原。GPS-OVA在从0.03到0.5μ克/毫升的浓度范围内，刺激OT-I或OT-IIT细胞增殖；相反，游离OVA未能刺激OT-I或OT-II T细胞性增殖。为了实现GP-OVA相似的刺激效应，要求游离OVA浓度提高百倍至数百倍。这些结果表明：(1)病毒样颗粒GPS是Dectin-1受体的高效激动剂；(2)病毒样颗粒GP-OVA传递的抗原与游离OVA抗原相比，能被DCs(树突细胞)更高效地处理和提呈。

2003-2005年期间美国科学家报道了：乙肝病毒感染黑猩猩系列研究结果。控制疾病的机制是肝细胞核HBV池的共价闭合环状DNA(cccDNA)。由于产生IFN-γ的HBV特异性CD8+T，即CTL细胞，大量涌入肝内，靶向感染HBV的肝细胞；对cccDNA的清除、肝细胞感染HBV逆转都与肝脏CD8+ T细胞产生的IFN-γ涌入等相关。集合这些结果表明，cccDNA的清除是一个由细胞免疫反应介导的两步的过程：第一步非细胞损伤地减少90％以上cccDNA分子池，从而消除HBV松弛的环状脱氧核糖核酸的前体。第二步提高了这个过程中损毁受感染的肝细胞，并触发免疫逆转。

2014年中国科技大学博士曾筑天报道：通过水动力法建立了HBV持续携带小鼠来模拟HBV慢性感染者的免疫耐受状态，发现IL-12预处理与IL-12同HBsAg VLP疫苗共注射的联合治疗方式，称为基于IL-12的疫苗疗法,可以有效逆转HBV系统性免疫耐受,进而导致HBV清除。发现HBV小鼠经历过基于IL-12的疫苗疗法之后,淋巴结内滤泡样辅助T细胞(Tfh)以及生发中心B细胞(GC B)都发生显著扩增,与之相对应地,脾细胞中HBsAg特异性IgG生成细胞也显著增加,大部分小鼠在治疗后期血清中出现保护性抗体anti-HBs；此外,T细胞体外对HBsAg刺激的增殖能力在IL-12联合疫苗治疗之后也得到显著恢复。这些结果充分证实HBV耐受小鼠在IL-12联合治疗过程中,对外周HBsAg疫苗的应答得以恢复,从而提示HBV诱导的系统性免疫耐受已被逆转。

中国专利文献CN102038948A报道了全重组汉逊酵母细胞表达HBsAg VLP抗原的乙肝疫苗免疫健康小鼠试验，在细胞和蛋白分子水平取得了好的结果：诱导高水平树突细胞DCs活化、成熟与增殖；诱导极高水平的抗-HBs免疫应答；诱导较高水平IFN-γ分泌，产生了明显的HBsAg特异性CTL(细胞毒T淋巴细胞)应答。为慢性乙肝治疗疫苗研发提供了很好的方向。该试验小鼠免疫大剂量：2×10⁸个重组汉逊酵细胞，表达的乙肝表面抗原2μg(约为小鼠半数有效剂量ED₅₀试验20倍)是取得好结果的关键。但用于人体注射的重组汉逊酵母细胞数量存在着安全上限(8-12×10⁸个重组汉逊酵细胞)，该文献中公开的重组汉逊酵母细胞中HBsAg VLP抗原的表达量过低，在用于人体注射时其单次注射的HBsAg剂量过低，难于发挥此种疫苗的治疗效果，且该文献全文未提及任何HBsAg特异性CTL表位和热失活工艺，因此提供一种具有高HBsAg VLP抗原表达量的重组汉逊酵母细胞并优选HBsAg特异性CTL表位和热失活工艺以提供一种基于表达HBsAg的热失活全重组汉逊酵母细胞的乙肝治疗疫苗成为现有技术中亟待解决的问题。

发明内容

为解决前述技术问题，本发明提供一种基于表达HBsAg的热失活全重组汉逊酵母细胞的乙肝治疗疫苗，其特征在于所述的乙肝治疗疫苗以所述的热失活全重组汉逊酵母细胞作为佐剂，作为抗原的HBsAg在所述重组汉逊酵母细胞内表达量为每10⁸个细胞中含有6-10μg HBsAg；所述HBsAg共含有16-21个HBsAg特异性CTL表位。

所述的乙肝治疗疫苗，其特征在于所述重组汉逊酵母表达的HBsAg共含有如下19个CTL表位：VLQAGFFLL、PFVQWFVGL、FLLTRILTI、WYWGPSLYSI、SLNFLGGSPV、FLGGSPVCL、LYSIVSPF、LYSIVSPFI、PFIPLLPIF、LLLCLIFLL、LLCLIFLLV、LLDYQGMLPV、LVLLDYQGML、VLLDYQGML、WLSLLVPFV、LLVPFVQWFV、GLSPTVWLSA、SIVSPFIPLL、LLPIFFCLWV。

所述的乙肝治疗疫苗，其特征在于重组汉逊酵母表达的HBsAg为adw亚型，所述重组汉逊酵母表达HBsAg的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。重组汉逊酵母表达的HBsAg的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

所述的乙型肝炎疫苗，其特征在于所述重组汉逊酵母表达的HBsAg为病毒样颗粒结构，由HBsAg插入汉逊酵母类脂组成，所述HBsAg的14个半胱酸中有9～12个形成二硫键，优选有11个形成二硫键。

所述的乙肝治疗疫苗，其特征是所述热失活重组汉逊酵母细胞的热失活条件为：热失活温度52℃-54℃，热失活时间1小时-3小时。

所述的乙肝治疗疫苗，其特征是所述重组汉逊酵母的宿主汉逊酵母细胞株为HU-11，保藏编号为CGMCC No.1218，所述宿主汉逊酵母的乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因被破坏的DNA序列如SEQ ID NO：3所示。

所述的乙肝治疗疫苗，其特征在于还含有HBsAg原液或铝佐剂HBsAg中的一种。

所述的乙肝治疗疫苗，其特征是所述乙肝治疗疫苗的剂型选自预充式注射液剂、注射液剂或冻干粉针剂。

本发明还提供一种重组多形汉逊酵母菌，所述重组多形汉逊酵母菌中含有SEQ IDNO:1所示核苷酸序列；优选所述重组多形汉逊酵母菌的基因组中整合有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。

所述的重组多形汉逊酵母菌，其特征是所述重组多形汉逊酵母菌的宿主汉逊酵母细胞株为HU-11(CGMCC No.1218)，所述宿主多形汉逊酵母的乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(HURA3)被破坏的DNA序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明在一种新的高HBsAg表达量的重组汉逊酵母细胞的基础上提供了基于表达HBsAg的热失活全重组汉逊酵母细胞的乙肝治疗疫苗，由于所述的重组汉逊酵母每10⁸细胞中含有6-10μg HBsAg，可以在现有的作为佐剂的全重组汉逊酵母细胞的人体注射上限范围内，最大限度提高HBsAg的注射量，提高其逆转乙肝患者免疫耐受状态的效果。热失活全重组汉逊酵母细胞为最主要专职抗原递呈的树突细胞(DC)的Dectin-1受体的高效激动剂。同时我们提供的重组汉逊酵母细胞表达的HBsAg具有19个特异性CTL表位，CTLs细胞靶向感染HBV的肝细胞释放IFN-γ：第一步非肝细胞损伤地减少其90％以上cccDNA分子池，第二步提高了过程中损毁受感染的肝细胞，并触发HBV免疫逆转。在优选的技术方案中的通过优选表达HBsAg的DNA序列(SEQ ID NO：1)，优选了21个CTL中的19个CTL表位，进一步提高了优选HBsAg的免疫原性和反应性。同时本发明技术方案中还优选了重组汉逊酵母细胞的优化热失活工艺，保证了疫苗的高效性与安全性。

附图说明

图1为质粒pMPT-HBs adw2的构建过程示意图；

图2为pMPT-HBs adw2质粒的物理图谱；

图3为筛选得到的工程菌株PCR扩增产物电泳照片；

图4为重组汉逊酵母得到的重组HBsAg的纯品(原液)的电镜照片；

图5为实施例2中重组汉逊酵母乙型肝炎疫苗的转化与筛选步骤流程图。

具体实施方式

汉逊酵母胞内质粒pMPT-02的构建，为申请人的非独占专有技术：

应用基因合成技术，将汉逊酵母MOX(甲醇氧化酶)启动子1.5kb、汉逊酵母MOX(甲醇氧化酶)终止子350bp、汉逊酵母自主复制序列HARS，1.0kb、和酿酒酵母脲嘧啶基因ScURA3 1.1kb；将以上5部分基因元件紧密相连后，再插入pBluescrip Ⅱ质粒中，构建成穿梭质粒pMPT-02。

宿主细胞采用脲嘧啶营养缺陷型URA3-宿主细胞株HU-11的开发：

利用同源序列介导的同源整合构建了乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(HURA3)被破坏的重组多形汉逊酵母菌株HU-11(CGMCC No.1218)。该菌株与目前国内外所用由诱变产生的营养缺陷型宿主菌株相比，具有遗传稳定性高，回复突变率低的特点；便于进行遗传转化和重组菌株的筛选，并保持了野生型菌株的生理生化特性，有利于重组菌株培养和外源蛋白的高效表达，具有极高的工业应用价值。汉逊酵母基因被破坏宿主菌HU11株URA3基因的DNA测序结果表明：基因被破坏结果导致第31位碱基后，插入GAACT五个碱基。GAACT五个碱基的插入产生移码突变。移码突变导致第11位后的254个氨基酸编码全部产生突变，并且其中突变产生了共15个终止码，表明URA3的结构基因已不可能再表达。GAACT五个碱基同时产生回复突变的概率极小，实验检测也证明宿主菌HU11株的回复突变率为零；这种“0”回复突变率的宿主菌对转化筛选特别有利。应用上述基因敲除技术建立的URA3^-营养缺陷型宿主细胞株HU-11(CGMCC No.1218)以于申请人已申请的发明专利CN1651570A中公开。宿主汉逊酵母菌HU-11乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(HURA3)被破坏的DNA序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明提供的重组汉逊酵母表达的乙肝表面抗原(HBsAg)的DNA序列基于HBsAgadw2亚型设计，如SEQ ID NO：1所示。所述HBsAg的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

汉逊酵母胞内型质粒pMPT-HBs adw2的构建：

按照SEQ ID NO：1所示序列的合成核苷酸序列(以下简称HBsAg adw2基因)；并构建成含HBsAg adw2基因质粒的甘油菌；测序正确后的质粒用EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ双酶切，酶切产物切胶回收701bp的目的片段DNA。

将酶切鉴定正确的质粒pMPT-02用EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ双酶切，切胶回收后所得到的载体DNA连接后得到汉逊酵母胞内型质粒pMPT-HBs adw2，将质粒pMPT-HBs adw2热转化至E.coli Competent Cell JM109(Code No.D9052)中，涂布平板过夜培养菌体。从转化平板上挑选单菌落，提取质粒DNA后用EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ双酶切，酶切结果表明均为阳性克隆。测序证明质粒pMPT-HBs adw2结果正确。

HBsAg adw2基因插入汉逊酵母表达系统胞内型质粒pMPT-02的多克隆位点:EcoRⅠ和BamH Ⅰ之间。质粒pMPT-HBs adw2全长为7665bp。质粒pMPT-HBs-adw2的构建过程示意图如图1所示。pMPT-HBs adw2质粒的物理图谱如图2所示。

重组汉逊酵母乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)adw2亚型工程菌株的构建：

为了构建重组汉逊酵母乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)adw2亚型工程菌株，应用申请人开发的细胞电穿孔技术，经RC脉冲:幅度1500V,电容22μf,时间常数3-5ms电击1次，采用pMPT-HBs adw2质粒，转化已敲除URA3-基因的HU-11株(CGMCC No.1218)的汉逊酵母细胞。在MD选择培养系平皿上挑取生长的单菌落转化子，转接MD液体培养基后连续传代培养，使adw2亚型HBsAg基因及相应调控组件多拷贝、异源整合入宿主汉逊酵母细胞染色体中。经过对一千余株转化子单菌落进行如下三步筛选：

(1)转化子单菌落大、细胞生长快的克隆株为多拷贝的机率大。

(2)应用PCR技术对比HBsAg基因和单拷贝数MOX(甲醇氧化酶)基因的电泳条带亮度，半定量地确定HBsAg基因拷贝数。

(3)检测经甲醇诱导、摇瓶培养72小时的转化子细胞破碎后释放出HBsAg的表达水平。

将PCR技术应用于转化子筛选为本申请的一项新创造；对确定外源基因HBsAg多拷贝、异源整合在汉逊酵母染色体中，而汉逊酵母染色体中MOX基因完整存在，未被破坏，都具有重要作用；它们体现了汉逊酵母表达系统独特优势。为此设计了一对引物可同时扩增汉逊酵母染色体中MOX基因(单拷贝)和异源整合HBsAg外源基因(多拷贝)。通过比较扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中条带的亮度可大致判断HBsAg基因是否为多拷贝。此方法用于工程菌HBsAg基因多拷贝菌株的初步筛选。所扩增的HBsAg片段长度为800bp，扩增的MOX片段长度为2000bp。

设计使用引物序列：primer forward：5‘-TCAAAAGCGGTATGTCCTTCCACGT-’3

primer reverse：5‘-TACTGCTGCCAGTGCACGGTG-’3

PCR产物琼脂糖凝胶电泳：工程菌HBsAg基因扩增产物大小约800bp，汉逊酵母单拷贝基因MOX基因扩增产物大小约2000bp。筛选得到的工程菌株PCR扩增产物电泳照片如图3所示，图3中1为Marker。最终筛选得到的重组汉逊酵母乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)工程菌株编号为HS604-5。

重组汉逊酵母菌发酵液胞内HBsAgVLP表达量的测定:

以天坛生物提供的adr2亚型HBsAg乙肝表面抗原冻干标准品10μg用稀释液溶解对倍稀释成1024ng/mL、512ng/mL、256ng/mL、128ng/mL、64ng/mL、32ng/mL、16ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL、0ng/mL(稀释液)共11个标准点，放免试剂盒检测HBsAg反应。

将得到的工程菌株(编号HS604-5)采用30升中试发酵(批号20150422)，发酵87小时取样10OD_600nm1mL,玻璃珠破碎细胞(细胞破碎率为65％)后，样品稀释200倍与标准品同时参与放免试剂盒反应，由γ-计数器自动完成拟合曲线得出的HBsAg抗原表达量为126.9(ng/mL)。以此计算重组汉逊酵母胞内HBsAg抗原表达量为：

126.96(ng/mL)×200÷10×5.0×10⁷×65％/mL＝7.84μg/10⁸细胞

重组汉逊酵母的重组HBsAg纯品(原液)的电镜照片如图4所示。结果显示重组HBsAg的高纯度、高浓度和病毒样颗粒(VLP)结构稳定。

优化的热失活重组汉逊酵母细胞HBsAg细胞条件的确定:

为了确定热失活重组汉逊酵母的最佳条件应满足以下要求：(1)热失活重组汉逊酵母的成活率尽可降低；使之小于5％。(2)保持完整的细胞结构；热失活重组汉逊酵母胞内抗原物质不泄漏；(3)保持重组汉逊酵母细胞内表达HBsAg病毒样颗粒(VLP)热稳定性，使其抗原性不下降。以上三点是热失活重组汉逊酵表达HBsAg生产工艺主要条件；将为制定疫苗制造及检定规程提供依据。其中热失活重组汉逊酵母细胞内HBsAg病毒样颗粒(VLP)的热稳定性成为首要解决的问题。为此设计了16组不同温度(50℃、52℃、54℃、56℃和58℃)，及不同时间(1h、2h和3h)的重组HBsAg汉逊酵母的热失活试验，并设20℃为对照组。通过检测：随着热失活温度、时间的升高，导致细胞壁外层溶解度加大，细胞破碎率增加，胞内HBsAgVLP抗原反应性在52℃、1h出现倍增的峰值。胞外HBsAg抗原反应原性在热失活试验的全部温度与时间范围内均极低，表明胞内HBsAgVLP未外泄，保持了全热失活重组汉逊酵母细胞结构。热失活细胞成活率在56℃、3h条件下已低至1/50,000。从而为优化热失活重组汉逊酵母细胞的条件提供了依据。综合各种因素考虑将热失活工艺条件最终确定为：热失活温度52℃-54℃，热失活时间1小时-3小时。

HBsAg特异性CTL细胞90％以上非细胞损伤地触发免疫逆转

乙肝病毒感染黑猩猩系列研究结果表明：HBsAg特异性CTL T细胞，靶向感染HBV的肝细胞释放IFN-γ；第一步非肝细胞损伤地减少其90％以上cccDNA分子池，第二步提高了这个过程中损毁受感染的肝细胞，并触发免疫逆转。依据CTL表位的实验综述、预测和专利发明等三篇文报道：HBV衣壳抗原(Pre-S1-Pre-S2-HBsAg)不重复CTL表位共23个。本发明的HBsAg抗原氨基酸序列中共含有以下19个CTL表位：VLQAGFFLL、PFVQWFVGL、FLLTRILTI、WYWGPSLYSI、SLNFLGGSPV、FLGGSPVCL、LYSIVSPF、LYSIVSPFI、PFIPLLPIF、LLLCLIFLL、LLCLIFLLV、LLDYQGMLPV、LVLLDYQGML、VLLDYQGML、WLSLLVPFV、LLVPFVQWFV、GLSPTVWLSA、SIVSPFIPLL、LLPIFFCLWV。

汉逊酵母重组乙肝疫苗疫苗产品优先为预充式注射液剂：

实验证明常规分装重组乙肝疫苗(酵母)预充注射液剂，37℃放置45天的热稳定性实验表明疫苗的体外相对效力(RP)均符合要求,而常规分装乙肝疫苗在相同保存条件下RP均不符合要求。预充注射器分装的重组乙肝疫苗(酵母)可在短时间内脱离冷链运输、保存和使用。

预充注射器1针1盒，使用方便、使用方法和要领易于掌握,为一次性注射器,不能重复使用。疫苗接种时不需另备注射器,可防止使用玻璃注射器消毒不彻底造成感染或传播传染病以及针头选择不当影响接种效果,避免一次性注射器被重复使用的危险。

预充注射器分装的乙肝疫苗全程接种具有良好的综合费用效益比。

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

实施例1

基于所述SEQ ID NO：1序列构建pMPT-HBsAg adw2质粒(即包含所述SEQ ID NO：1序列的表达载体)。质粒pMPT-HBs adw2的构建工作包含以下内容：

按照我们设计的SEQ ID NO：1所示DNA序列合成了HBsAg adw2基因；并构建成含HBsAg adw2基因质粒的甘油菌，将其命名为MC407B-16。

测序正确后的MC407B-16号质粒用EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ双酶切，酶切产物用TaKaRa PCRFragment Recovery Kit(Code No.D301)切胶回收701bp的目的片段DNA称为Inset DNA6。

将酶切鉴定正确的质粒pMPT-02用EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ双酶切，切胶回收后所得到的载体DNA称为Vector DNA6。

使用TaKaRa DNA Ligation Kit(Code No.D6022)中的Solution，将Inset DNA6与Vector DNA6连接后，热转化至E.coli Competent Cell JM109(Code No.D9052)中，涂布平板过夜培养菌体。从转化平板上挑选单菌落，提取质粒DNA后用EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ双酶切，酶切结果表明：MC407A+B+C+D-77～80均为阳性克隆。

将MC407A+B+C+D-77号质粒分别用引物RV-M，M13-47，MC407P1，MC407P2，MC407P3，MC407P4，MC407P5，MC407P6，MC407P7，MC407P8，MC407P9，MC407BF11，MC407BR11测序，证明质粒pMPT-HBs adw2结果正确。

实施例2

重组汉逊酵母HBsAg工程菌株(即包含所述SEQ ID NO：1所示序列的汉逊酵母宿主细胞转化筛选株)的构建。

重组汉逊酵母的转化与筛选过程如图5所示：

具体包括

1)应用细胞电穿孔法，将pMPT-HBsAg质粒，转化作为宿主细胞的URA3-营养缺陷型汉逊酵母细胞株HU-11(CGMCC No.1218)。采用选择培养基(MD液体培养基)平皿培养。在MD选择培养系平皿上挑取生长的单菌落转化子，转接MD液体培养基后连续传代培养，使adw2亚型HBsAg基因及相应调控组件多拷贝、异源整合入宿主汉逊酵母细胞染色体中。

2)菌株筛选包括以下步骤

(1)选择尿嘧啶原养型转化子单菌落

挑选菌体生长速度快的菌落，应用PCR技术检测HBsAg基因条带亮度后，挑选拷贝数多的菌落，采用选择培养基对单菌落进行摇瓶培养，连续传代培养20～400个世代；

(2)筛选多拷贝异源整合转化克隆株，

经过步骤(1)传代培养后，经甲醇诱导培养72小时后，采用/放射免疫分析(Radioimmunoassay or radioimmunoassay，RIA)测定转化子细胞破碎后释放出HBsAg的表达水平；

(3)筛选去除游离质粒的高拷贝、高表达克隆株将经过步骤(2)筛选的克隆株，采用YPD完全培养基培养48小时后，转接选择培养基平皿克隆化培养，并采用定量PCR检测HBsAg基因拷贝数，以RIA检测HBsAg表达水平。

(4)在步骤(3)的检测结果基础上，选择遗传稳定的重组汉逊酵母HBsAg工程菌的原代菌株。

实施例3 30升中试发酵

主要工艺过程和操作要点：

30升中试发酵主要工艺过程：

1)以200ml种子培养基解冻液氮贮存菌种，接种至培养基中，均分两个0.5L摇瓶，31℃培养22小时作为一级种子；

2)以1600ml种子培养基将一级种子转接入二级种子培养基中，均分6个1L摇瓶，31℃培20小时作为二级种子；

3)将12L发酵培养基调pH至5.5加入30L发酵罐中，将二级种子接入后，30-31℃经甘油、甲醇两碳源，生长、去阻遏和诱导三时相，共培养85-96小时，在停止诱导2-3小时后收获细胞。将冷冻的细胞匀浆。

操作要点：

(1)生长时相的补料操作要待溶氧有明显下降，基础培养基消耗时开始进行，并且随着基础培养基消耗量的增加逐步提高流加速度，待溶氧回升前2-3小时流加完毕。

(2)生长时相的后期要注意溶氧回升，记录溶氧最低值，溶氧回升至70-80％时开始流加，进入去阻遏时相。

(3)去阻遏时相后期，流加结束后，溶氧开始回升。溶氧回升至70-80％℅时开始流加甲醇诱导溶液，将甲醇浓度控制在3-5‰，由甲醇检测流加控制器控制流加速度。

发酵结束前2-3小时停止甲醇流加，以减少细胞收获时甲醇残留。

培养基

1.氯化钙溶液的配制

准确称量CaCl₂ 11.33g，放入洗净的三角瓶中，加适量去离子水溶解后定容至200ml。

2.微量元素溶液的配制

准确称量以下试剂：

将称量后的试剂放入洗净的三角瓶中，加适量去离子水溶解后定容至200ml。

3.维生素溶液的配制

准确称量以下试剂：

d-Biotin 6mg

Thiamin HCl 2000mg

将生物素首先溶解在10ml的50％异丙醇中，待溶解后再加入Thiamin HCl，然后加适量去离子溶解后水定容至100ml。

4.痕量元素溶液的配制

准确称量以下试剂：

将称量后的试剂放入洗净的三角瓶中，加适量去离子溶解后水定容至50ml。

以上四种溶液分别除菌过滤备用。

5.种子盐溶液的配制

准确称量以下试剂：

将称量后的试剂放入洗净的三角瓶中，加适量去离子水溶解后定容至1600ml。

6.用2000ml三角瓶称取甘油27g，混合盐溶液360mL，加去离子水定容至1800ml,等量分装于两个2000ml三角瓶中，110℃、30分钟高压蒸汽灭菌。

110℃、30分钟高压蒸汽灭菌空消500ml三角瓶2个，1000ml三角瓶6个，100ml和500ml量筒各一个。

7.一级种子培养基

在超净台中，无菌操作量取灭菌后的甘油水溶液各100ml，分别置于灭菌后的2个500ml三角瓶中，并分别加入：

将加入的溶液摇匀。

8.二级种子培养基

在超净台中以无菌操作技术取灭菌后的甘油水溶液1600ml置于灭菌后的2000ml三角瓶中，并分别加入：

9.发酵培养基

准确称量以下试剂并溶解于2000ml去离子水中。

取一个500ml小烧杯称取520g甘油，加泡敌10ml在线灭菌，然后加：

10.补料培养基

取一个1000ml三角瓶，量取87g NH₄H₂PO₄、260g甘油，加去离子水500ml，加入包裹好的补料管线，110℃、30分钟灭菌。

11.去阻遏溶液

用5000ml三角瓶，量取甘油1800g，加去离子水660ml，加入包裹好的补料管线，110℃、30分钟灭菌，冷却后无菌操作加入过滤除菌的盐溶液540ml。

12.诱导溶液

用1000ml三角瓶，量取甘油400ml，加入包裹好的补料管线，110℃、30分钟灭菌，冷却后无菌操作加入甲醇1600ml。

实施例4

纯化

将实施例3得到的发酵液经收获细胞并洗涤细胞，纯化的详细步骤可参见参考文献：李津，孔艳.重组乙型肝炎疫苗生产工艺.见李津，俞詠霆，董德祥主编：生物制药设备和分离纯化技术.第1版.北京：化学工业出版社，2003：348-349.。其中可将上述收获的细胞经过匀浆器破碎，释放出HBsAg；以0.22μm微孔滤器过滤去除细胞碎片；再以300K超微滤器超滤去除小分子杂质；以硅胶吸附处理法提取HBsAg；最后以丁基琼脂糖疏水层析方法精制纯化。

实施例5

热失活重组汉逊酵母细胞最佳条件试验

为了确定热失活重组汉逊酵母的最佳条件应满足以下要求：(1)热失活重组汉逊酵母的成活率尽可降低；使之小于5％。(2)保持完整的细胞结构；发挥多价位热失活重组汉逊酵母佐剂活性作用；(3)保持重组汉逊酵母细胞内表达HBsAg病毒样颗粒(VLP)完整，使其抗原性不下降。以上三点是热失活重组汉逊酵表达HBsAg生产工艺主要条件；将为制定疫苗制造及检定规程提供依据。其中热失活重组汉逊酵母细胞内HBsAg病毒样颗粒(VLP)的热稳定性成为首次要解决的问题。

(1)、优化条件的热失活重组汉逊酵母细胞制备。

汉逊酵母工程菌(菌株编号HS604-5)细胞培养经发酵或摇瓶诱导培养结束后。细胞用离心法在磷酸盐缓冲液(PBS)中洗涤三次，将沉淀的汉逊酵母悬浮在计算体积的PBS中。细胞使用OD_600nm计数，PBS稀释为10OD_600nm/毫升,每支试管2毫升；每试验组设破碎与不破碎2支试管；16个试验组共需制备32支细胞样品试管。

放在设定温度水浴，经设定间时热失活重组汉逊酵母。

热失活重组汉逊酵母应在加有氯霉素完全培养基琼脂皿于37℃培养3天；计数其成活率。热失活汉逊酵母储存在4摄氏度以供进一步使用。

(2)、汉逊酵母重组HBsAg(HS604-5株)细胞热失活试验组设立：

20℃室温组一支(对照)

共16个试验组。热失活后采用放免HBsAg试剂检测HBsAg抗原活性；1：100稀释和1：1000稀释，设复管。检测结果用于分析确定本项新乙肝疫苗汉逊酵母热失活的优化工艺条件。

参考文献

1、齐小秋等，全国人群乙型病毒性肝炎血清流行病学调查报告，2011年4月第1版，人民卫生出版社。

2、Bowen DG et.al,Intrahepatic immunity:a tale of two sites？Bowen DGet.al,Trends Immunol.2005,26(10):512-7.

3、Thomas H.King1,et.al,A Whole Recombinant Yeast-Based TherapeuticVaccine Elicits HBV X,S and Core Specific T Cells in Mice and Activates HumanT Cells Recognizing Epitopes Linked to Viral Clearance，2014,POLS。

4、Haibin Huang et.al,Robust Stimulation of Humoral and CellularImmune Responses following Vaccination with Antigen-Loaded β-GlucanParticles，2010，MBio.asm.org，1(3)：1-7。

5、Robert Thimme et.al,CD8+ T Cells Mediate Viral Clearance andDisease Pathogenesis during Acute Hepatitis B Virus Infection，JOURNAL OFVIROLOGY,2003,p.68–76。

6、Stefan F.Wieland et.al,Expansion and contraction of the hepatitis Bvirus transcriptional template in infected chimpanzees.Proc Natl Acad Sci U SA.2004Feb 17；101(7):2129–2134。

7、John M.Murray et.al,Dynamics of hepatitis B virus clearance inchimpanzees，2005 Dec 6；Proc Natl Acad Sci U S A.102(49):17780–17785。

8、Thimme R et.al,CD8(+)T cells mediate viral clearance and diseasepathogenesis during acute hepatitis B virus infection；J Virol.2003Jan；77(1):68-76。

9、曾筑天，肝脏诱导系统性免疫耐受及其逆转研究，中国科学技术大学博士学位论文，2014。

10、申请人：复旦大学，一种控制乙型肝炎病毒持续性感染的疫苗，2009年，申请公布号：CN102038948.A。

11、Florian K Bihl et.al,Simultaneous assessment of cytotoxic Tlymphocyte responses against multiple viral infections by combined usage ofoptimal epitope matrices,anti-CD3 mAb T-cell expansion and"RecycleSpot"；Journal of Translational Medicine 2005，3：20 1-19。

12、Yuji Sobao et.al,Identification of hepatitis B virus-specific CTLepitopes presented by HLA-A*2402,the most common HLAclass I allele in EastAsia，Journal of Hepatology，2001，34：922-929。

13、发明人吴玉章等；用于生产治疗用乙型肝炎疫苗或药物的免疫原及其制备方法和用途；公开号：CN1483736A。

SEQUENCE LISTING

<110> 汪和睦

<120> 基于表达HBsAg的热失活全重组汉逊酵母细胞的乙肝治疗疫苗

<160> 3

<210> 1

<211> 681

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggagaaca tcacttcagg gtttctagga cctctcctgg tgttgcaggc gggcttcttc 60

ctgttgaccc gaatcctcac cataccgcag agtctggata gctggtggac gtctctcaac 120

tttctcggcg gctcccctgt ctgtctcggc cagaactcgc aatcccctac ctctaaccac 180

tcgccaacct cttgtcctcc aatttgtcca ggttaccgct ggatgtgtct gaggcggttt 240

atcatttttc tcttcatctt gctcctgtgc cttatcttct tgttggtgct gcttgactat 300

cagggcatgt tgccagtctg ccctctgatc cctggatcta ctacgacttc tactggtcca 360

tgcaagacgt gcactacccc cgcccaagga aactccatgt tcccctcctg ctgttgcacg 420

aagcctaccg acggcaattg cacctgcatc ccgatcccat cgtcgtgggc attcgctaag 480

tatctgtggg agtgggccag cgtcagattc tcttggctct cccttctagt gccattcgtc 540

caatggttcg taggcctttc cccgactgtt tggctttccg ccatttggat gatgtggtat 600

tggggtccat cgctctacag cattgttagt ccctttatcc cactgctgcc cattttcttt 660

tgcctttggg tttacatcta a 681

<210> 2

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln

1 5 10 15

Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu

20 25 30

Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys

35 40 45

Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser

50 55 60

Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe

65 70 75 80

Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val

85 90 95

Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly

100 105 110

Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala

115 120 125

Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp

130 135 140

Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys

145 150 155 160

Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu

165 170 175

Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu

180 185 190

Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile

195 200 205

Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val

210 215 220

Tyr Ile

225

<210> 3

<211> 797

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgtataaat cttatggaga aagggcgaag tgaagtctca cccatctaag gtcgccagca 60

gactacttaa tttgatggaa tccaagcaaa caaacctctg cgcttctgtg gatgtgacta 120

aaactcagga attattggag cttcttgata aactgggccc ttacatctgc cttgtcaaaa 180

ctcatattga catagtagag gacttctctt atgaacacac cattttacca ttacaggact 240

tgcaaagaaa cacaacttca tgatttttga agacagaaag tttgctgata ttaggaaaca 300

cagtcaaact acagtataag ggaggaattt atcgaacatc caagtgggcc gatatcacga 360

atgcacacgg agtgactggc gcaggaattg ttgaaggtct taaacaggcc gcagaagaaa 420

gtacagatga gccacgtggg cttttgatgc ttgctgagct ctcttcaaag ggatcattag 480

ctaccggtga gtatactcaa aaaactgtgg aaatagcgaa aagcgataaa gaatttgtca 540

ttggatttat tgcacagaga gacatgggag gtcgtgagga aggctttgac tggctgatca 600

tgactccagg agttggttta gatgataaag gtgattctct gggccaacag tacagaactg 660

ttgatgaagt gatgcaaaca ggaaccgatg tcattatcgt tggaagaggt ttattcggaa 720

aaggaagaga tcctgaagtg gaagggaaga gatacagaaa tgctgggtgg gaagcttaca 780

agcggcgcat tgcttaa 797

Claims

1.基于表达HBsAg的热失活全重组汉逊酵母细胞的乙肝治疗疫苗，其特征在于所述的乙肝治疗疫苗以所述热失活全重组汉逊酵母细胞作为佐剂，作为抗原的HBsAg在所述重组汉逊酵母细胞内表达量为每10⁸细胞中含有6-10μg HBsAg；所述HBsAg共含有16-21个HBsAg特异性CTL表位。

2.如权利要求1所述的乙肝治疗疫苗，其特征在于所述重组汉逊酵母表达的HBsAg共含有如下19个CTL表位：VLQAGFFLL、PFVQWFVGL、FLLTRILTI、WYWGPSLYSI、SLNFLGGSPV、FLGGSPVCL、LYSIVSPF、LYSIVSPFI、PFIPLLPIF、LLLCLIFLL、LLCLIFLLV、LLDYQGMLPV、LVLLDYQGML、VLLDYQGML、WLSLLVPFV、LLVPFVQWFV、GLSPTVWLSA、SIVSPFIPLL、LLPIFFCLWV。

3.根据权利要求1所述的乙肝治疗疫苗，其特征在于重组汉逊酵母表达的HBsAg为adw亚型，所述重组汉逊酵母表达HBsAg的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。

4.根据权利要求2所述的乙肝治疗疫苗，其特征是重组汉逊酵母表达的HBsAg的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

5.如权利要求1所述的乙型肝炎疫苗，其特征在于所述重组汉逊酵母表达的HBsAg为病毒样颗粒结构，由HBsAg插入汉逊酵母类脂组成，所述HBsAg的14个半胱酸中有9～12个形成二硫键。

6.如权利要求1所述的乙肝治疗疫苗，其特征是所述热失活重组汉逊酵母细胞的热失活条件为：热失活温度52℃-54℃，热失活时间1小时-3小时。

7.如权利要求1所述的乙肝治疗疫苗，其特征是所述重组汉逊酵母的宿主多形汉逊酵母细胞株为HU-11，保藏编号为CGMCC No.1218，所述宿主多形汉逊酵母的乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因被破坏的DNA序列如SEQ ID NO：3所示。

8.根据权利要求1～7任一所述的乙肝治疗疫苗，其特征是所述乙肝治疗疫苗的剂型选自预充式注射液剂、注射液剂或冻干粉针剂。

9.根据权利要求1所述的乙肝治疗疫苗，其特征在于还含有HBsAg原液或铝佐剂HBsAg中的一种。

10.一种重组多形汉逊酵母菌，其特征是所述重组多形汉逊酵母菌中含有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，所述重组多形汉逊酵母菌的基因组中整合有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。