JP6821780B2 - ＨＢｓＡｇを発現する不活性化全組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞によるＢ型肝炎治療ワクチン - Google Patents

Description

本発明は遺伝子工学分野に属し、不活性化全組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞でＨＢｓＡｇ−ａｄｗ２を発現するＢ型肝炎を治療するワクチンに関する。

Ｂ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ、ＨＢＶ）感染は重大な公衆衛生上の問題である。世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｇａｎｉｚａｔｉｏｎ、ＷＨＯ）の報道によると、世界６０億人の中、約２０億人がＨＢＶに感染したことがあり、そのうち、３．５億人は慢性ＨＢＶに感染しており、ＨＢＶ感染による肝不全、肝硬変、原発性肝細胞癌（肝癌）から毎年約１００万人が死亡している。全世界の肝臓癌患者の中、７５％以上がＨＢＶにより引き起こされる。中国はＨＢＶ感染症流行地域である。１９９２年に、中国衛生部はＢ型肝炎ワクチンを計画免疫管理に組み入れた。２００６年の全国Ｂ型肝炎血清疫学調査から明らかなように、約１５年間に亘り努力を重ねた結果、中国の一般人口、特に１５歳以下の児童は、Ｂ型肝炎ウイルス感染率が著しく低下しているが、歴史的な原因から、中国では、現在、慢性ＨＢＶ感染者は約９３００万人であり、そのうち、慢性Ｂ型肝炎患者は約２０００万例であると予測されている。毎年、ＨＢＶによる肝硬変や肝癌に起因する死亡例は３０万以上であり、Ｂ型肝炎の新たな発症例は５０万−１００万ある。Ｂ型肝炎は、現在、さらに将来の長期間に、中国の人々の健康を損ない、社会の発展を妨げ、社会の安定性に悪影響を与える重要な要因となっているため、重大な公衆衛生上の問題である。調査によると、中国では、慢性Ｂ型肝炎（肝硬変や肝がんを含む）による直接または間接的な医療費は１年間あたり約６,８００億元と高い。既存のＢ型肝炎ウイルス感染者及びＢ型肝炎患者を有効に治療することは、Ｂ型肝炎の予防・治療には優先的に解決すべき重大な課題となっている。

Ｂ型肝炎ワクチンによる免疫予防および治療は疾患による負担を軽減させるための最も有効な方法である。遺伝子組換え技術は、現代のバイオテクノロジーの中核技術であり、Ｂ型肝炎ワクチンの主成分であるウイルス様粒子Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ ＶＬＰ）を量産するための唯一な技術でもある。出芽酵母は外来遺伝子を発現させる最初の真核系である。しかしながら、出芽酵母の発現系の工業的生産には、たとえば、エンジニアリング菌株の外来遺伝子プラスミドが細胞質内に遊離しており、遺伝的安定性が悪いこと、発酵密度が不十分で、生産効率が低いこと、合成したポリペプチド鎖が過度にグリコシル化されるなどの複数の欠点がある。本出願者は１９９５年からハンセヌラ・ポリモルファ組換えＢ型肝炎治療ワクチンの研究開発に取り組んできた。１９９８−２００２年に、大連高新生物製薬有限公司でリーダとして開発したハンセヌラ・ポリモルファ組換えＨＢｓＡｇ ａｄｗ２ Ｂ型肝炎治療ワクチンは、ＨＢｓＡｇ ＶＬＰ抗原純品（原液）の収率が４０ｍｇ／リットルであり、２００２年に国家の承認を受けて市販されてきた。本人は２００３−２００６年に北京天壇生物製品株式会社と契約を締結して組換えハンセヌラ・ポリモルファＨＢｓＡｇ−ａｄｒ２ Ｂ型肝炎治療ワクチンを開発した。当該Ｂ型肝炎ワクチンは、ＨＢｓＡｇ ＶＬＰ抗原純品（原液）の収率が８５ｍｇ／リットル以上に達し、２０１５年に国家新薬評価を申告しており、該ワクチンに基づいて出願した中国出願の公開番号がＣＮ１０４２３２６６１Ａである。

従来技術によれば、Ｂ型肝炎の発症メカニズムは以下のとおりである。ヒトがＨＢＶ感染した後、通常、免疫寛容期、免疫排除期及び非活動期又は低（非）増殖期に分類される。免疫寛容期では、ＨＢＶ複製が活発で、血清ＨＢｓＡｇとＨＢｅＡｇが陽性で、ＨＢＶ ＤＮＡ力価が高く（＞１０^５コピー／ｍｌ）、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルが正常であり、肝臓組織学的に顕著な異常がないことを特徴とする。免疫排除期では、血清ＨＢＶ ＤＮＡ力価が＞１０^５コピー／ｍｌであるが、一般的に免疫寛容期より低く、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）が連続的に又は断続的に上昇し、肝臓組織学的に壊死性炎症などが見られる。非活動期又は低（非）増殖期では、ＨＢｅＡｇが陰性で、抗−ＨＢｅが陽性で、（ＰＣＲ）法によりＨＢＶ ＤＮＡが検出不能であるか又は検出下限より低く、正常なレベルにあり、肝臓組織学的に顕著な炎症がない。しかしながら、青少年期や成人期にＨＢＶを感染する場合、一般的に、免疫寛容期がなく、最初から免疫排除期に入り、急性Ｂ型肝炎として発症し、そのうち、５％〜１０％だけは慢性まで発展する。その正確な発症メカニズムはまだ不明である。

現在、抗Ｂ型肝炎ウイルス治療はＢ型肝炎ウイルス感染者及びＢ型肝炎患者の主な治療手段である。従来の抗Ｂ型肝炎ウイルス薬として、主にインターフェロン類を主とする免疫調節剤とＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼに対するヌクレオチド類似体の２種類があり、一定の治療効果を果たすが、まだ満足できるものではなく、多数の患者は根治できない。インターフェロンは少数の患者のＨＢｓＡｇをなくし又はセロコンバージョンするが、コストが高く、注射する必要がある上、一定の副作用があり、それに対して、ヌクレオチド類似体は、ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼに作用するため、ウイルス複製しかを阻害できないが、ＨＢＶとｃｃｃＤＮＡを完全に排除できず、且つ長期間使用するとウイルス耐性変異を引き起こしやすい。
このため、ＨＢＶとｃｃｃＤＮＡを完全に除去するために、より効果的な新規ＨＢＶ治療用のＢ型肝炎ワクチンの開発が期待される。肝移植後の免疫拒絶反応が低い点からも明なように、ヒトの肝臓は免疫寛容器官である。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）はヒトの肝臓を感染するため、ＨＢＶに対する免疫寛容が肝臓の主な特徴である。ＨＢＶ免疫寛容逆転は慢性Ｂ型肝炎患者（ＣＨＢ）の免疫治療ワクチンを開発するための立脚点となる。ＨＢＶ免疫寛容は、肝臓の部分的なａｎｔｉ−ＨＢＶ免疫応答によりウイルスを効果的に排除できず、持続感染を引き起こすことに反映されているだけでなく、ＨＢＶの持続存在により全身免疫系がＨＢＶに対して応答しないことを誘導し、たとえば、ＨＢＶ寛容期にある患者がＨＢｓＡｇワクチンに対して応答しないことにも反映されている。これは、現在の治療性ワクチンがＣＨＢ患者に対して効かない要因でもある。肝臓により誘導された免疫寛容及びその逆転メカニズムについての研究は、Ｂ型肝炎を治療するワクチンを開発するために、理論的根拠を提供している。

最新のデータから明らかなように、初期ＣＤ８＋Ｔ（ＣＴＬ）細胞活性化が肝臓内で起こり、同時に肝臓に予め炎症があると（すなわち自然免疫活性化）、生存するＣＴＬｓが増加して、ＣＴＬｓがより効果でだり、肝臓免疫応答を引き起こして、感染ＨＢＶを排除し、予め肝臓に炎症がない場合（すなわち自然免疫未活性化、たとえば乳幼児期）、ＣＴＬ機能が破壊されてＣＴＬの半減期が短く、肝臓のＨＢＶへの免疫寛容を引き起こす。しかしながら、初期にＨＢＶ抗原と会って免疫誘導効率が高い主な活性化ＨＢＶ ＣＴＬｓが肝臓外のリンパ節内に存在し、次に肝臓に入り、それによっても、生存するＣＴＬｓを増加させ、ＣＴＬｓがより効果であり、肝臓の免疫応答も引き起こして、感染ＨＢＶを排除する。このような２つの部位についての免疫メカニズムは、皮下、筋肉内注射型の治療性Ｂ型肝炎治療用のワクチンを開発して、肝臓の免疫応答を誘導して、感染ＨＢＶを排除するために、理論的根拠を提供している。
２０１４年に、米国Ｔｈｏｍａｓ Ｈ．Ｋｉｎｇによって、「Ａ Ｗｈｏｌｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｙｅａｓｔ−Ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅ ｔｈａｔ ｉｓ ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ ｈｅａｔ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ, ｗｈｏｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｙｅａｓｔ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ− ｒｅｌａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ」が報道されており、不活性化全組換え出芽酵母細胞で疾患関連抗原を発現させることを基礎とする治療性ワクチンである。該研究は、細胞内組換え発現タンパク質を抗原とし、不活性化全出芽酵母細胞をアジュバントとする治療性ワクチンのプラットフォームを創成している。このプラットフォームでは、番号ＧＳ４７７４のＢ型肝炎治療性ワクチンがあり、それが発現するＨＢＶ抗原は融合タンパク質としてのｘ−ｓ−ｃｏｒｅ抗原である。この酵母ベクターは複数種の抗原が入るＭＨＣクラスＩとクラスＩＩ抗原提示経路を提供し、強力なＣＤ４＋とＣＤ８＋細胞反応を刺激して、且つ免疫学的マウスモデルにおける抗原寛容性を破壊できる。また、該酵母ベクターはインビボで中和されにくいため、繰り返して投与して、長期間の免疫圧力を付与し、慢性細胞内感染、たとえばＨＣＶやＨＢＶを理想的に排除することに好適である。

２０１０年に、Ｈｕａｎｇによって、ビール酵母細胞壁を精製して得たβ−グルカン粒子（ＧＰＳ）は、１,３−Ｄ−グルカン ポリマー＞８５％、キチン２％、脂質及びタンパク質１％を含む以外、残りは、大部分が灰や水分であることが報道されている。インビトロＴ細胞増殖実験では、卵白アルブミン（ＯＶＡ）を中空ＧＰＳシェル（ＧＰ−ＯＶＡ）に複合してワクチンを構成し、且つ遊離ＯＶＡを対照抗原として用いる。ＧＰＳ−ＯＶＡは、０．０３〜０．５μグラム／ミリリットルの濃度範囲では、ＯＴ−Ｉ又はＯＴ−ＩＩ Ｔ細胞の増殖を刺激するが、逆に遊離ＯＶＡは、ＯＴ−Ｉ又はＯＴ−ＩＩ Ｔ細胞増殖を刺激できなかった。ＧＰ−ＯＶＡと類似する刺激効果を実現するには、遊離ＯＶＡの濃度を百倍〜数百倍向上させる必要がある。これら結果から分かるように、（１）ウイルス様粒子ＧＰＳはＤｅｃｔｉｎ−１受容体の効率的なアゴニストであり、（２）ウイルス様粒子ＧＰ−ＯＶＡが送達する抗原は、遊離ＯＶＡ抗原に比べて、ＤＣｓ（樹状細胞）により効率的に処理されたり提示されたりすることができる。
２００３〜２００５年に、米国の科学家によって、Ｂ型肝炎ウイルスによるチンパンジー感染についての一連の研究結果が報道されている。疾患制御メカニズムは肝細胞核ＨＢＶプールの共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）である。ＩＦＮ−γを発生させるＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ、すなわちＣＴＬ細胞は大量で肝内に入り、ＨＢＶを感染した肝細胞にターゲットするため、ｃｃｃＤＮＡの排除、肝細胞感染ＨＢＶ逆転はともに肝臓ＣＤ８＋Ｔ細胞により生産するＩＦＮ−γの取り込みなどに関連する。これら結果から分かるように、ｃｃｃＤＮＡの排除は、細胞免疫反応によって媒介される二段階の過程であり、ステップ１として、細胞を損傷せずに９０％以上のｃｃｃＤＮＡ分子プールを減少させることで、ＨＢＶ弛緩環状デオキシリボ核酸の前駆体を排除する。ステップ２として、この過程において破損されて感染された肝細胞を増加させて、免疫逆転をトリガーさせる。
２０１４年に、中国科技大学の曽筑天博士によって、水動力法でＨＢＶを持続的にキャリアするマウスを構築してＨＢＶ慢性感染者の免疫寛容状態をシミュレートしたところ、ＩＬ−１２前処理及びＩＬ−１２とＨＢｓＡｇ ＶＬＰワクチンとの同時注射との併用療法を見出し、ＩＬ−１２によるワクチン療法と呼び、ＨＢＶ全身的免疫寛容を効果的に逆転して、さらにＨＢＶを排除できることが報道されている。ＨＢＶマウスにＩＬ−１２によるワクチン療法を施した後、リンパ節内の濾胞様ヘルパーＴ細胞（Ｔｆｈ）及び胚中心Ｂ細胞（ＧＣ Ｂ）はいずれも著しく増幅し、これに応じて、脾臓細胞におけるＨＢｓＡｇ特異的ＩｇＧ生成細胞も著しく増加し、大部分のマウスでは、治療後期に、血清に防御抗体ａｎｔｉ−ＨＢｓが発生し、また、Ｔ細胞のインビトロでのＨＢｓＡｇ刺激に対する増殖能力も、ＩＬ−１２とワクチンとの併用治療を受けた後に、著しく回復することが見られた。以上の結果から明らかなように、ＨＢＶ寛容マウスは、ＩＬ−１２併用治療過程において、外部からのＨＢｓＡｇワクチンに対する応答が回復され、それによりＨＢＶが誘導した全身性免疫寛容が逆転されることを提示する。

中国特許文献ＣＮ１０２０３８９４８Ａには、全組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞が発現するＨＢｓＡｇ ＶＬＰ抗原のＢ型肝炎ワクチン免疫による健康マウス試験が報道されており、細胞及びタンパク質分子のレベルでは、高レベルの樹状細胞ＤＣｓ活性化、成熟及び増殖を誘導すること、極めて高いレベルの抗−ＨＢｓ免疫応答を誘導すること、高レベルのＩＦＮ−γ分泌を誘導して、顕著なＨＢｓＡｇ特異的ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）応答を誘導することの優れた結果が得られる。慢性Ｂ型肝炎治療ワクチンの研究開発のために良好な方向を提供している。該試験免疫では、大用量である２×１０^８個の組換えハンセヌラ酵細胞で、発現するＢ型肝炎表面抗原２μｇ（マウスの５０％有効量ＥＤ_５０試験に対して約２０倍）は良好な結果が得られるキーとなる。しかしながら、ヒト注射に使用される組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞の数量に安全限界があり（８〜１２×１０^８個の組換えハンセヌラ酵細胞）、該文献に開示されている組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞にはＨＢｓＡｇ ＶＬＰ抗原の発現量が低すぎ、ヒトの注射に使用する場合の単回注射でのＨＢｓＡｇの用量が低すぎて、このワクチンの治療効果を発揮しにくく、また、該文献を通じてＨＢｓＡｇ特異的ＣＴＬエピトープおよび不活性化プロセスは記載されていないため、ＨＢｓＡｇ ＶＬＰ抗原発現量の高い組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞を提供して、さらにＨＢｓＡｇ特異的ＣＴＬエピトープおよび不活性化プロセスを最適化させてＨＢｓＡｇを発現する不活性化全組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞によるＢ型肝炎治療ワクチンを提供することは、先行技術において解決すべき課題となっている。

前述技術課題を解決するために、本発明は、ＨＢｓＡｇを発現する不活性化全組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞によるＢ型肝炎治療ワクチンであって、前記Ｂ型肝炎治療ワクチンは前記不活性化全組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞をアジュバントとし、抗原としてのＨＢｓＡｇの前記組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞内での発現量が１０^８細胞あたり６〜１０μｇのＨＢｓＡｇを含有し、前記ＨＢｓＡｇは、合計１６〜２１個のＨＢｓＡｇ特異的ＣＴＬエピトープを含有することを特徴とすＢ型肝炎治療ワクチンを提供する。
前記Ｂ型肝炎治療ワクチンにおいて、前記組換えハンセヌラ・ポリモルファが発現するＨＢｓＡｇは、
ＶＬＱＡＧＦＦＬＬ、ＰＦＶＱＷＦＶＧＬ、ＦＬＬＴＲＩＬＴＩ、ＷＹＷＧＰＳＬＹＳＩ、ＳＬＮＦＬＧＧＳＰＶ、ＦＬＧＧＳＰＶＣＬ、ＬＹＳＩＶＳＰＦ、ＬＹＳＩＶＳＰＦＩ、ＰＦＩＰＬＬＰＩＦ、ＬＬＬＣＬＩＦＬＬ、ＬＬＣＬＩＦＬＬＶ、ＬＬＤＹＱＧＭＬＰＶ、ＬＶＬＬＤＹＱＧＭＬ、ＶＬＬＤＹＱＧＭＬ、ＷＬＳＬＬＶＰＦＶ、ＬＬＶＰＦＶＱＷＦＶ、ＧＬＳＰＴＶＷＬＳＡ、ＳＩＶＳＰＦＩＰＬＬ、ＬＬＰＩＦＦＣＬＷＶの合計１９個のＣＴＬエピトープを含有することを特徴とする。
前記Ｂ型肝炎治療ワクチンにおいて、組換えハンセヌラ・ポリモルファが発現するＨＢｓＡｇはａｄｗサブタイプであり、前記組換えハンセヌラ・ポリモルファが発現するＨＢｓＡｇのＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示され、組換えハンセヌラ・ポリモルファが発現するＨＢｓＡｇのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されることを特徴とする。
前記Ｂ型肝炎治療ワクチンにおいて、前記組換えハンセヌラ・ポリモルファが発現するＨＢｓＡｇは、ウイルス様粒子構造であり、ＨＢｓＡｇをハンセヌラ・ポリモルファ脂質に挿入してなり、前記ＨＢｓＡｇの１４個のシステインのうち９〜１２個はジスルフィド結合、好ましくは、１１個はジスルフィド結合を形成することを特徴とする。
前記Ｂ型肝炎治療ワクチンにおいて、前記不活性化組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞の不活性化条件は、不活性化温度が５２℃〜５４℃であり、不活性化時間が１時間〜３時間であることを特徴とする。
前記Ｂ型肝炎治療ワクチンにおいて、前記組換えハンセヌラ・ポリモルファの宿主であるハンセヌラ・ポリモルファ細胞株はＨＵ−１１であり、保蔵番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１２１８であり、前記宿主であるハンセヌラ・ポリモルファのオロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子が破壊されたＤＮＡ配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されることを特徴とする。
前記Ｂ型肝炎治療ワクチンにおいて、ＨＢｓＡｇ原液又はアルミアジュバントＨＢｓＡｇのうちの１種をさらに含むことを特徴とする。
前記Ｂ型肝炎治療ワクチンにおいて、前記Ｂ型肝炎治療ワクチンの剤型は、プレフィルド注射液剤、注射液剤又は凍結乾燥粉末注射剤から選ばれることを特徴とする。
本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるヌクレオチド配列を含み、好ましくは、ゲノムにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるヌクレオチド配列が組み込まれている組換えハンセヌラ・ポリモルファをさらに提供する。
前記組換えハンセヌラ・ポリモルファにおいて、前記組換えハンセヌラ・ポリモルファの宿主であるハンセヌラ・ポリモルファ細胞株はＨＵ−１１（ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１２１８）であり、前記宿主ハンセヌラ・ポリモルファのオロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ＨＵＲＡ３）が破壊されたＤＮＡ配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されることを特徴とする。

本発明は、新規なＨＢｓＡｇ発現量の高い組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞に基づいてＨＢｓＡｇを発現する不活性化全組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞によるＢ型肝炎治療ワクチンを提供し、前記組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞の１０^８細胞あたりに６〜１０μｇのＨＢｓＡｇを含むため、従来のアジュバントとしての全組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞のヒトへの注射の上限範囲内で、ＨＢｓＡｇの注射量を最大限に高めて、そのＢ型肝炎患者免の疫寛容状態に対する逆転効果を向上させることができる。不活性化全組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞は、最も重要なプロフェッショナル抗原提示細胞（ＤＣ）のＤｅｃｔｉｎ−１受容体の効率的なアゴニストである。また、係る組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞が発現するＨＢｓＡｇは１９個の特異的ＣＴＬエピトープを含有し、ＣＴＬｓ細胞はＨＢＶを感染した肝細胞にターゲットしてＩＦＮ−γを放出し、具体的には、ステップ１として、肝細胞を損傷せずに９０％以上のｃｃｃＤＮＡ分子プールを減少させ、ステップ２として、この過程において破損されて感染された肝細胞を増加させ、ＨＢＶ免疫逆転をトリガーさせｒｙ。好ましい技術案において、ＨＢｓＡｇを発現するＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を最適化させ、２１個のＣＴＬのうちの１９個のＣＴＬエピトープを最適化させることによって、好ましいＨＢｓＡｇの免疫原性と反応性をさらに向上させる。また、本発明の技術案において、組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞の不活性化プロセスを最適化させることにより、ワクチンの効率性及び安全性が確保される。

プラスミドｐＭＰＴ−ＨＢｓ ａｄｗ２の構築過程の模式図である。 ｐＭＰＴ−ＨＢｓ ａｄｗ２プラスミドの物理マップである。 スクリーニングして得られたエンジニアリング菌株のＰＣＲ増幅産物の電気泳動写真である。 組換えハンセヌラ・ポリモルファから得られた組換えＨＢｓＡｇの純品（原液）の電子顕微鏡写真である。 実施例２における組換えハンセヌラ・ポリモルファＢ型肝炎ワクチンの形質転換とスクリーニング工程のフローチャートである。

ハンセヌラ・ポリモルファ細胞内プラスミドｐＭＰＴ−０２の構築は、本出願者の非独占的な独自技術である。
遺伝子合成技術を用いて、ハンセヌラ・ポリモルファＭＯＸ（メタノールオキシダーゼ）プロモーター１．５ｋｂ、ハンセヌラ・ポリモルファＭＯＸ（メタノールオキシダーゼ）ターミネーター３５０ｂｐ、ハンセヌラ・ポリモルファの自律複製配列ＨＡＲＳ １．０ｋｂ、及び出芽酵母のウリジン遺伝子ＳｃＵＲＡ３ １．１ｋｂの５つの遺伝子素子を緊密に連結した後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐIIプラスミドに挿入して、シャトルプラスミドｐＭＰＴ−０２として構築する。

ウラシル栄養要求性ＵＲＡ３−宿主細胞株ＨＵ−１１を用いた宿主細胞の開発
相同配列によって媒介される相同組み込みによってオロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ＨＵＲＡ３）が破壊された組換えハンセヌラ・ポリモルファ株ＨＵ−１１（ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１２１８）を構築する。該菌株は、中国国内及び国外で使用されている突然変異誘発により生じた従来の栄養要求性宿主菌株に比べて、遺伝的安定性が高く、復帰突然変異率が低いという特徴を有し、遺伝的形質転換及び組換え菌株のスクリーニングを容易に実施できるとともに、野生型菌株の生理学的および生化学的特徴を保持し、組換え菌株の培養や外因性タンパク質の効率的な発現に有利し、高い工業応用価値がある。ハンセヌラ・ポリモルファ遺伝子が破壊された宿主菌ＨＵ１１株のＵＲＡ３遺伝子のＤＮＡシーケンシング結果から明らかなように、遺伝子が破壊された結果、３１位の塩基後に、ＧＡＡＣＴの５個の塩基が挿入されている。ＧＡＡＣＴの５個の塩基の挿入によりフレームシフト突然変異が発生する。フレームシフト突然変異により１１位後の２５４個のアミノ酸コードはすべて突然変異し、突然変異により合計１５個の終了コードが発生し、このことから、ＵＲＡ３構造遺伝子がさらに発現できないことを示している。ＧＡＡＣＴの５個の塩基は同時に復帰突然変異を発生する確率が極めて小さく、実験によっても宿主菌ＨＵ１１株の復帰突然変異率がゼロであることを確認した。このような「０」復帰突然変異率を有する宿主菌は、形質転換やスクリーニングに特に有利である。上記遺伝子ノックアウト技術によって構築されたＵＲＡ３⁻栄養要求性宿主細胞株ＨＵ−１１（ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１２１８）については本出願者が出願した発明特許ＣＮ１６５１５７０Ａに開示された。宿主ハンセヌラ・ポリモルファ菌ＨＵ−１１のオロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ＨＵＲＡ３）が破壊されたＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：５に示される。

本発明に係る組換えハンセヌラ・ポリモルファが発現するＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）のＤＮＡ配列はＨＢｓＡｇ ａｄｗ２サブタイプに基づいて設計されるものであり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される。前記ＨＢｓＡｇのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：２である。

ハンセヌラ・ポリモルファ細胞内プラスミドｐＭＰＴ−ＨＢｓ ａｄｗ２の構築
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される配列に基づいてヌクレオチド配列（以下、略称ＨＢｓＡｇ ａｄｗ２遺伝子）を合成し、ＨＢｓＡｇ ａｄｗ２遺伝子プラスミドを含むグリセロール菌として構築し、シーケンシングして正確なプラスミドをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで二重酵素消化させ、酵素消化産物からゲル抽出して、７０１ｂｐの目的断片ＤＮＡを回収する。
酵素消化し、同定して正確なプラスミドｐＨＭＰＴ−０２をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで二重酵素消化させ、ゲル抽出して回収したベクターＤＮＡを連結して、ハンセヌラ・ポリモルファの細胞内プラスミドｐＭＰＴ−ＨＢＳ−ａｄｗ２を得て、プラスミドｐＭＰＴ−ＨＢＳ−ａｄｗ２をＥ．ｃｏｌｉ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ ＪＭ１０９（Ｃｏｄｅ Ｎｏ．Ｄ９０５２）に熱形質転換して、平板にコーティングして菌体を一晩培養する。形質転換平板から単一コロニーを選択して、プラスミドＤＮＡを抽出した後、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで二重酵素消化させ、酵素消化結果から、すべて陽性クローンであることが分かる。シーケンシングした結果、プラスミドｐＭＰＴ−ＨＢＳ−ａｄｗ２の結果は正確である。

ＨＢｓＡｇ ａｄｗ２遺伝子をハンセヌラ・ポリモルファ発現系の細胞内プラスミドｐＭＰＴ−０２のポリクローナル部位であるＥｃｏＲIとＢａｍＨIの間に挿入する。プラスミドｐＭＰＴ−ＨＢｓ ａｄｗ２は全長７６６５ｂｐである。プラスミドｐＭＰＴ−ＨＢｓ−ａｄｗ２の構築過程の模式図は図１に示される。ｐＭＰＴ−ＨＢｓ ａｄｗ２プラスミドの物理マップは図２に示される。

組換えハンセヌラ・ポリモルファＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）ａｄｗ２サブタイプエンジニアリング菌株の構築
組換えハンセヌラ・ポリモルファＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ） ａｄｗ２サブタイプエンジニアリング菌株を構築するには、出願者が開発した細胞エレクトロポレーション技術を用いて、振幅１５００Ｖ、容量２２μｆ、時間定数３−５ｍｓのＲＣパルスで１回電気穿孔し、ｐＭＰＴ−ＨＢｓ ａｄｗ２プラスミドを用いて、ＵＲＡ３−遺伝子をノックアウトしたＨＵ−１１株（ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１２１８）のハンセヌラ・ポリモルファ細胞を形質転換する。ＭＤ選択培養用平皿から成長した単一コロニー形質転換体を選択して、ＭＤ液体培地に移した後、連続継代培養し、ａｄｗ２サブタイプＨＢｓＡｇ遺伝子及び対応する調節要素をマルチコピーにして、宿主であるハンセヌラ・ポリモルファ細胞染色体に異種組み込む。千株余りの形質転換体の単一コロニーについて下記３つのステップのスクリーニングを行う。
（１）形質転換体の単一コロニーが大きく、細胞の成長速度が高いクローン株はマルチコピーの確率が高い。
（２）ＰＣＲ技術によってＨＢｓＡｇ遺伝子と単一コピー数ＭＯＸ（メタノールオキシダーゼ）遺伝子の電気泳動バンドの明るさを比較することによって、ＨＢｓＡｇ遺伝子のコピー数を半定量的に決定する。
（３）メタノールで誘導して振盪フラスコ培養を７２時間行った形質転換体の細胞が破砕した後に放出したＨＢｓＡｇの発現レベルを検出する。

ＰＣＲ技術を形質転換体スクリーニングに適用することは本願の新たな創造である。外来遺伝子ＨＢｓＡｇのマルチコピーの決定、ハンセヌラ・ポリモルファ染色体に対して異種組み込みを行っても、ハンセヌラ・ポリモルファ染色体におけるＭＯＸ遺伝子が破壊せずに完全に存在することに対して、重要な役割を果たし、ハンセヌラ・ポリモルファ発現系の特有の長所を示している。このために、ハンセヌラ・ポリモルファ染色体におけるＭＯＸ遺伝子（単一コピー）の増幅とＨＢｓＡｇ外来遺伝子（マルチコピー）の異種組み込みを同時に実施できる一対のプライマーを設計する。増幅産物のアガロースゲル電気泳動のバンドでの明るさを比較することによって、ＨＢｓＡｇ遺伝子がマルチコピーであるか否かを大体判断できる。この方法は、エンジニアリング菌のＨＢｓＡｇ遺伝子のマルチコピー菌株の予備スクリーニングに用いられる。増幅したＨＢｓＡｇ断片の長さは８００ｂｐ、増幅したＭＯＸ断片の長さは２０００ｂｐである。

使用されるプライマー配列を設計する。
ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒｗａｒｄ：５ ‘−ＴＣＡＡＡＡＧＣＧＧＴＡＴＧＴＣＣＴＴＣＣＡＣＧＴ−’３
ｐｒｉｍｅｒ ｒｅｖｅｒｓｅ：５ ‘−ＴＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＧＴＧＣＡＣＧＧＴＧ−’３

ＰＣＲ産物についてのアガロースゲル電気泳動
エンジニアリング菌のＨＢｓＡｇ遺伝子の増幅産物の大きさは約８００ｂｐ、ハンセヌラ・ポリモルファの単一コピー遺伝子のＭＯＸ遺伝子の増幅産物の大きさは約２０００ｂｐである。スクリーニングして得られたエンジニアリング菌株のＰＣＲ増幅産物の電気泳動写真は図３に示され、図３中、１はＭａｒｋｅｒである。最終スクリーニングして得られた組換えハンセヌラ・ポリモルファのＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）エンジニアリング菌株の番号はＨＳ６０４−５である。

組換えハンセヌラ・ポリモルファ菌の発酵液の細胞内ＨＢｓＡｇＶＬＰ発現量の測定
天壇生物社より提供したａｄｒ２サブタイプＨＢｓＡｇＢ型肝炎表面抗原の凍結乾燥標準品１０μｇを希釈液で溶解して、１０２４ｎｇ／ｍＬ、５１２ｎｇ／ｍＬ、２５６ｎｇ／ｍＬ、１２８ｎｇ／ｍＬ、６４ｎｇ／ｍＬ、３２ｎｇ／ｍＬ、１６ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、０ｎｇ／ｍＬ（希釈液）の合計１１個の標準点に倍数希釈して、ラジオイムノアッセイキットでＨＢｓＡｇ反応を検出する。
得られたエンジニアリング菌株（番号ＨＳ６０４−５）について３０リットルのパイロット規模発酵（ロット番号２０１５０４２２）を行い、８７時間発酵後、１０ ＯＤ_{６００ｎｍ}１ｍＬをサンプリングし、ガラスビーズで細胞（細胞破砕率６５％）を破砕した後、サンプルを２００倍希釈して、標準品とともにラジオイムノアッセイキット反応に用い、γ−カウンターで自動的に作成したフィッティング曲線から得られるＨＢｓＡｇ抗原の発現量は１２６．９（ｎｇ／ｍＬ）である。それにより組換えハンセヌラ・ポリモルファの細胞内ＨＢｓＡｇ抗原の発現量を計算する。
１２６．９６（ｎｇ／ｍＬ）×２００÷１０×５．０×１０^７×６５％／ｍＬ＝７．８４μｇ／１０^８細胞
組換えハンセヌラ・ポリモルファの組換えＨＢｓＡｇ純品（原液）の電子顕微鏡写真は図４に示される。結果から分かるように、組換えＨＢｓＡｇは、高純度、高濃度であり、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の構造が安定的である。

不活性化組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞ＨＢｓＡｇ細胞の最適化条件の決定
不活性化組換えハンセヌラ・ポリモルファの最適な条件を決定するために、下記要件を満たす必要がある。（１）不活性化組換えハンセヌラ・ポリモルファの生存率をできるだけ低下させ、５%未満にする。（２）完全な細胞構造を保持して、不活性化組換えハンセヌラ・ポリモルファの細胞内の抗原性物質が漏れないようにする。（３）抗原反応活性を低下させないように組換えハンセヌラ・ポリモルファの細胞内で発現するＨＢｓＡｇウイルス様粒子（ＶＬＰ）の熱安定性を維持する。以上の３つの点は不活性化組換えハンセヌラ・ポリモルファが発現するＨＢｓＡｇの生産プロセスの主な条件であり、ワクチンの製造及び検証規則を制定するために根拠を提供している。不活性化組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞におけるＨＢｓＡｇウイルス様粒子（ＶＬＰ）の熱安定性は最初に解決すべき問題である。このために、異なる温度（５０℃、５２℃、５４℃、５６℃及び５８℃）、及び異なる時間（１ｈ、２ｈ及び３ｈ）の組換えＨＢｓＡｇハンセヌラ・ポリモルファの不活性化試験を１６群設計して、２０℃を対照群とする。検出したところ、不活性化温度、時間の上昇に伴い、細胞壁外層の溶解度が高まり、細胞の破砕率が増大し、細胞内ＨＢｓＡｇＶＬＰ抗原反応性については５２℃、１ｈで倍増するピークが現れ、細胞外ＨＢｓＡｇ抗原反応性は、不活性化試験のすべての温度と時間の範囲で極めて低く、このことから、細胞内ＨＢｓＡｇＶＬＰが外部へ漏れず、完全不活性化組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞の構造が保持されていることが分かる。不活性化細胞の生存率は、５６℃、３ｈの条件で１／５０,０００に低下した。それにより、不活性化組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞の条件を最適化させるために根拠を提供している。各種の要因を配慮に入れて、不活性化プロセスの条件として、最終的に、不活性化温度５２℃〜５４℃、不活性化時間１時間〜３時間とする。

ＨＢｓＡｇ特異的ＣＴＬ 細胞の９０％以上の非細胞傷害的な免疫逆転のトリガー
Ｂ型肝炎ウイルスによるチンパンジーの感染についての一連の研究結果から明らかなように、ＨＢｓＡｇ特異的ＣＴＬ Ｔ細胞は、ＨＢＶを感染した肝細胞にターゲットしてＩＦＮ−γを放出し、ステップ１として、肝細胞を損傷せずに９０％以上のｃｃｃＤＮＡ分子プールを減少させ、ステップ２として、この過程において損傷されて感染された肝細胞を増加させ、免疫逆転をトリガーさせる。ＣＴＬエピトープの実験概要、予測及び特許発明などの３つの文献報道によれば、ＨＢＶカプシド抗原（Ｐｒｅ−Ｓ１−Ｐｒｅ−Ｓ２−ＨＢｓＡｇ）の重複しないＣＴＬエピトープは合計で２３個である。本発明におけるＨＢｓＡｇアミノ酸配列には、ＶＬＱＡＧＦＦＬＬ、ＰＦＶＱＷＦＶＧＬ、ＦＬＬＴＲＩＬＴＩ、ＷＹＷＧＰＳＬＹＳＩ、ＳＬＮＦＬＧＧＳＰＶ、ＦＬＧＧＳＰＶＣＬ、ＬＹＳＩＶＳＰＦ、ＬＹＳＩＶＳＰＦＩ、ＰＦＩＰＬＬＰＩＦ、ＬＬＬＣＬＩＦＬＬ、ＬＬＣＬＩＦＬＬＶ、 ＬＬＤＹＱＧＭＬＰＶ 、ＬＶＬＬＤＹＱＧＭＬ、ＶＬＬＤＹＱＧＭＬ、ＷＬＳＬＬＶＰＦＶ、ＬＬＶＰＦＶＱＷＦＶ、ＧＬＳＰＴＶＷＬＳＡ、ＳＩＶＳＰＦＩＰＬＬ、ＬＬＰＩＦＦＣＬＷＶの合計１９個のＣＴＬエピトープが含まれている。

ハンセヌラ・ポリモルファ組換えＢ型肝炎治療ワクチンワクチン製品はプレフィルド注射液剤であるが好ましい。

実験から分かるように、一般的に分注した組換えＢ型肝炎ワクチン（酵母）プレフィルド注射液剤は、３７℃で４５日間放置した後の熱安定性実験から分かるように、ワクチンのインビトロ相対効力（ＲＰ）がいずれも要求を満たし、一般的に分注したＢ型肝炎ワクチンは、同一保存条件では、ＲＰがいずれも要求を満たせない。プレフィルドシリンジに分注した組換えＢ型肝炎ワクチン（酵母）は、短時間内でコールドチェーン輸送に依存せずに、保存したり使用したりすることが可能である。

プレフィルドシリンジは、１ケースごとに１針あり、使用しやすく、使用方法やコツが容易に把握でき、使い捨て型注射器であるため、繰り返し使用が不能である。ワクチンを接種するときに、別途で注射器を準備する必要がないため、ガラス注射器を使用する場合、完全に消毒しないことによる伝染病の感染又は蔓延や不適な針先端部による接種効果への影響を避け、使い捨て型注射器の繰り返し使用のリスクを避ける。
プレフィルドシリンジに分注したＢ型肝炎治療ワクチンの完全な接種は、良好な総合的費用便益比を有する。
以下、実施例にて本発明についてさらに説明するが、下記実施例は説明するためのものであり、限定するものではなく、本発明の保護範囲は下記実施例により制限されない。

実施例１
前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１配列に基づいて、ｐＭＰＴ−ＨＢｓＡｇ ａｄｗ２プラスミド（すなわち前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１配列を含む発現ベクター）を構築した。プラスミドｐＭＰＴ−ＨＢｓ ａｄｗ２の構築プロセスは以下の工程を含む。
設計したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＤＮＡ配列に基づいて、ＨＢｓＡｇ ａｄｗ２遺伝子を合成し、ＨＢｓＡｇ ａｄｗ２遺伝子プラスミドを含むグリセロール菌を構築し、ＭＣ４０７Ｂ−１６と命名した。
シーケンシングして正確なＭＣ４０７Ｂ−１６プラスミドをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで二重酵素消化させ、酵素消化産物についてＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｃｏｄｅ Ｎｏ．Ｄ３０１）でゲル抽出して７０１ｂｐの目的断片ＤＮＡを回収し、Ｉｎｓｅｔ ＤＮＡ６とした。
酵素消化し、同定して正確なプラスミドｐＭＰＴ−０２をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで二重酵素消化させ、ゲル抽出して回収し、ベクターＤＮＡを得て、Ｖｅｃｔｏｒ ＤＮＡ６とした。

ＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｏｄｅ Ｎｏ． Ｄ６０２２）におけるＳｏｌｕｔｉｏｎを用いて、Ｉｎｓｅｔ ＤＮＡ６とＶｅｃｔｏｒ ＤＮＡ６を連結した後、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ ＪＭ１０９（Ｃｏｄｅ Ｎｏ．Ｄ９０５２）に熱形質転換し、平板にコーティングして菌体を一晩培養した。形質転換平板から単一コロニーを選択して、プラスミドＤＮＡを抽出した後、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで二重酵素消化させ、酵素消化結果から、ＭＣ４０７Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ−７７〜８０はすべて陽性クローンであることが分かった。
ＭＣ４０７Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ−７７プラスミドをそれぞれプライマーＲＶ−Ｍ、Ｍ１３−４７、ＭＣ４０７Ｐ１、ＭＣ４０７Ｐ２、ＭＣ４０７Ｐ３、ＭＣ４０７Ｐ４、ＭＣ４０７Ｐ５、ＭＣ４０７Ｐ６、ＭＣ４０７Ｐ７、ＭＣ４０７Ｐ８、ＭＣ４０７Ｐ９、ＭＣ４０７ＢＦ１１、ＭＣ４０７ＢＲ１１でシーケンシングした結果、プラスミドｐＭＰＴ−ＨＢｓ ａｄｗ２の結果は正確であることが分かった。

実施例２
組換えハンセヌラ・ポリモルファＨＢｓＡｇエンジニアリング菌株（すなわち、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ に示される配列を含むハンセヌラ・ポリモルファ宿主細胞の形質転換スクリーニング株）の構築
組換えハンセヌラ・ポリモルファの形質転換とスクリーニングの過程は図５に示される。
具体的に以下を含む。
１）細胞エレクトロポレーション法を用いて、ｐＭＰＴ−ＨＢｓＡｇプラスミドで宿主細胞であるＵＲＡ３−栄養要求性ハンセヌラ・ポリモルファ細胞株ＨＵ−１１（ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１２１８）を形質転換した。選択培地（ＭＤ液体培地）で平皿により培養した。ＭＤ選択培養用平皿から成長した単一コロニー形質転換体を選択して、ＭＤ液体培地に移した後、連続継代培養し、ａｄｗ２サブタイプＨＢｓＡｇ遺伝子及び対応する調節要素をマルチコピーにして、宿主であるハンセヌラ・ポリモルファ細胞の染色体に異種組み込んだ。
２）菌株スクリーニングは以下のステップを含む。
（１）ウラシル原栄養形質転換体の単一コロニーを選択する。
菌体の成長速度が高いコロニーを選定し、ＰＣＲ技術によってＨＢｓＡｇ遺伝子のバンドの明るさを検出した後、コピー数の多いコロニーを選択し、選択培地を用いて単一コロニーを振盪フラスコ培養し、２０〜４００世代連続継代培養した。
（２）マルチコピーの異種組み込み形質転換クローン株をスクリーニングする。
ステップ（１）で継代培養した後、メタノールで７２時間誘導培養して、ラジオイムノアッセイ（Ｒａｄｉｏ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｏｒ ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＲＩＡ）で形質転換体の細胞が破砕された後に放出するＨＢｓＡｇの発現レベルを測定した。
（３）遊離プラスミドを除去した高コピー・高発現クローン株をスクリーニングする。
ステップ（２）でスクリーニングしたクローン株を、ＹＰＤ完全培地で４８時間培養した後、選択培地平皿に移してクローン化培養を行い、定量的ＰＣＲによってＨＢｓＡｇ遺伝子のコピー数を検出し、ＲＩＡによってＨＢｓＡｇ発現レベルを検出した。
（４）ステップ（３）の検出結果に基づいて、遺伝的安定性に優れた組換えハンセヌラ・ポリモルファＨＢｓＡｇエンジニアリング菌の初代菌株を選択した。

実施例３ ３０リットルのパイロット規模発酵
主なプロセス過程及び操作ポイントは以下のとおりである。
３０リットルのパイロット規模発酵の主なプロセス
１）シード培地２００ｍｌで、液体窒素を用いて貯蔵した菌種を解凍して、培地に接種し、２つの０．５Ｌ振盪フラスコに等分して、３１℃で２２時間培養して一次シードとした。
２）シード培地１６００ｍｌを用いて一次シードを二次シード培地に移して、６個の１Ｌ振盪フラスコに等分して、３１℃で２０時間培養して二次シードとした。
３）１２Ｌ発酵培地をｐＨ５．５に調整して３０Ｌ発酵缶に投入し、二次シードを接種した後、３０〜３１℃で、グリセリン、メタノールの２種の炭素源で、成長、抑制解除及び誘導の３つの時期を経て、合計８５−９６時間培養して、誘導を停止して２〜３時間後、細胞を収穫した。凍結細胞をホモジネートした。

操作ポイント
（１）成長時期における流加操作は、溶存酸素が有意に低下して、基礎培地が消費されたときに実施し始め、且つ、基礎培地の消費量の増加に伴い徐々に流加速度を向上させ、溶存酸素が戻る前の２−３時間に流加を終了する。
（２）成長時期の後期に、溶存酸素の上昇をモニタリングして、溶存酸素の最低値を記録し、溶存酸素が７０〜８０％まで戻ったときに、流加を開始させて、抑制解除時期に入る。
（３）抑制解除時期の後期に、流加終了後、溶存酸素が戻り始める。溶存酸素が７０−８０％まで戻ったときに、メタノールを流加して溶液を誘導し、メタノール濃度を３〜５‰に制御し、メタノール検出流加コントローラで流加速度を制御する。
細胞収獲時のメタノール残留を減少させるように、発酵終了前の２〜３時間に、メタノール流加を停止する。

培地
１．塩化カルシウム溶液の調製
ＣａＣｌ_２ １１．３３ｇを正確に秤量して、洗浄した三角フラスコに投入し、適量の脱イオン水を加えて溶解した後、２００ｍｌに定容した。

２．微量元素溶液の調製
下記試薬を正確に秤量した。

秤量した試薬を洗浄した三角フラスコに投入して、適量の脱イオン水を加えて溶解した後、２００ｍｌに定容した。

３．ビタミン溶液の調製
下記試薬を正確に秤量した。

まず、ビオチンを５０％イソプロパノール１０ｍｌに溶解して、溶解後、Ｔｈｉａｍｉｎ ＨＣｌを加えて、次に適量の脱イオン水を加えて溶解した後、水で１００ｍｌに定容した。

４．痕跡元素溶液の調製
下記試薬を正確に秤量した。

秤量した試薬を洗浄した三角フラスコに投入して、適量の脱イオン水を加えて溶解した後、水で５０ｍｌに定容した。
以上の４種類の溶液をそれぞれ除菌して濾過して、使用時まで保存した。

５．シード塩溶液の調製
下記試薬を正確に秤量した。

秤量した試薬を洗浄した三角フラスコに投入して、適量の脱イオン水を加えて溶解した後、１６００ｍｌに定容した。

６．２０００ｍｌ三角フラスコにグリセリン２７ｇ、混合塩溶液３６０ｍＬを秤取して、脱イオン水を加えて１８００ｍｌに定容し、等量で２つの２０００ｍｌ三角フラスコに分注して、１１０℃で３０分間高圧蒸気滅菌を行った。
１１０℃で３０分間高圧蒸気滅菌を行うことで、５００ｍｌ三角フラスコを２個、１０００ｍｌ三角フラスコを６個、１００ｍｌと５００ｍｌのメスシリンダーをそれぞれ１つ充填前に滅菌した。

７．一次シード培地
クリーンベンチにおいて、無菌操作により滅菌したグリセリン水溶液をそれぞれ１００ｍｌ秤取して、それぞれ滅菌後の２個の５００ｍｌ三角フラスコに投入して、塩化カルシウム溶液１ｍｌ、微量元素溶液１ｍｌ、ビタミン溶液０．５ｍｌ、痕跡元素溶液０．２５ｍｌをそれぞれ加えて、加えた溶液を均一に振とうさせた。

８．二次シード培地
クリーンベンチにおいて、無菌操作技術により滅菌後のグリセリン水溶液１６００ｍｌを秤取して、滅菌後の２０００ｍｌ三角フラスコに投入して、塩化カルシウム溶液１６ｍｌ、微量元素溶液１６ｍｌ、ビタミン溶液８ｍｌ、痕跡元素溶液４ｍｌをそれぞれ加えた。

９． 発酵培地
試薬として、ＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４１７５ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ４０ｇ、ＫＣｌ ４４ｇ、ＮａＣｌ ４．４ｇを正確に秤量して、２０００ｍｌの脱イオン水に溶解した。
５００ｍｌ小ビーカーにグリセリン５２０ｇを秤量して、消泡剤１０ｍｌを加えて、オンラインで滅菌し、次に、塩化カルシウム溶液１７５ｍｌ、微量元素溶液１７５ｍｌ、ビタミン溶液８８ｍｌ、痕跡元素溶液４４ｍｌを加えた。

１０．流加培地
１０００ｍｌ三角フラスコに、ＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４８７ｇ、グリセリン２６０ｇを秤取して、脱イオン水を５００ｍｌ加え、包まれた流加管路に加えて、１１０℃で３０分間滅菌した。

１１．抑制解除溶液
５０００ｍｌ三角フラスコに、グリセリン１８００ｇを秤取して、脱イオン水６６０ｍｌを加え、包まれた流加管路に加えて、１１０℃で３０分間滅菌し、冷却後、無菌操作により濾過除菌した塩溶液５４０ｍｌを加えた。

１２．誘導溶液
１０００ｍｌ三角フラスコに、グリセリン４００ｍｌを秤取して、包まれた流加管路に加え、１１０℃で３０分間滅菌し、冷却後、無菌操作によりメタノール１６００ｍｌを加えた。

実施例４ 精製
実施例３で得られた発酵液について、細胞を収穫して細胞を洗浄し、詳細な精製ステップについては、以下の文献を参照すればよい。李津、孔艷．組換えＢ型肝炎治療ワクチンの生産プロセス。李津、兪詠霆、董徳詳編集：生物製薬装置及び分離精製技術．第１版．北京：化学工業出版社、２００３：３４８−３４９。さらに、上記収獲した細胞をホモジナイザーで破砕して、ＨＢｓＡｇを放出させ、０．２２μｍの微多孔ろ過器で濾過して、細胞破片を除去し、次に、３００Ｋの限外ろ過器で限外ろ過して小分子不純物を除去し、シリカゲル吸着処理法によりＨＢｓＡｇを抽出し、最後に、ブチルアガロース疎水性クロマトグラフィー方法で精製した。

実施例５
不活性化組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞の最適な条件試験
不活性化組換えハンセヌラ・ポリモルファの最適な条件を決定するのに、以下の要求を満たす必要がある。
（１）不活性化組換えハンセヌラ・ポリモルファの生存率をできるだけ低下させ、５％未満にする。（２）完全な細胞構造を保持し、多価の不活性化組換えハンセヌラ・ポリモルファのアジュバント活性作用を発揮させる。（３）組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞内で発現するＨＢｓＡｇウイルス様粒子（ＶＬＰ）の完全性を保持して、抗原性を低下させないようにする。以上の３つの点は不活性化組換えハンセヌラ酵にＨＢｓＡｇを発現する生産プロセスの主な条件であり、ワクチンの製造及び検証規則を制定するために根拠を提供している。不活性化組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞におけるＨＢｓＡｇウイルス様粒子（ＶＬＰ）の熱安定性は最初に解決すべき問題である。

（１）条件を最適化させた不活性化組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞の製造
ハンセヌラ・ポリモルファエンジニアリング菌（菌株番号ＨＳ６０４−５）細胞の培養は、発酵又は振盪フラスコ誘導培養を経た後、細胞を遠心法でリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）において３回洗浄して、沈殿したハンセヌラ・ポリモルファを、体積を計算したＰＢＳに懸濁させた。細胞をＯＤ_{６００ｎｍ}でカウントして、ＰＢＳで１０ ＯＤ_{６００ｎｍ}／ミリリットルに希釈し、試験管ごとに２ミリｘリットルとし、試験群ごとに、破砕試験管と非破砕試験管の２本を設置し、１６個の試験群では、合計３２本の細胞サンプル試験管を必要とした。
設定温度の水浴に入れて、所定時間にかけて組換えハンセヌラ・ポリモルファを不活性化させた。
不活性化組換えハンセヌラ・ポリモルファを、クロラムフェニコール含有完全培地を入れた寒天皿において３７℃で３日間培養し、生存率をカウントした。
不活性化ハンセヌラ・ポリモルファを４℃で貯蔵して、さらなる使用に供する。

（２）ハンセヌラ・ポリモルファ組換えＨＢｓＡｇ（ＨＳ６０４−５株）細胞の不活性化試験群の設置

合計１６個の試験群がある。不活性化後、ラジオイムノＨＢｓＡｇ ＲＩＡ試薬を用いて、ＨＢｓＡｇ抗原活性を検出した。１：１００希釈と１：１０００希釈の２本の試験管を設置した。検出結果を、本新規なＢ型肝炎治療ワクチンのハンセヌラ・ポリモルファの不活性化の最適化プロセスの条件の分析及び決定に用いた。

参照文献
１、斉小秋ら、全国人口のウイルス性Ｂ型肝炎の血清学的疫学調査の報告、２０１１年４月第１版、人民衛生出版社。
２、Ｂｏｗｅｎ ＤＧ ｅｔ．ａｌ，Ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ ｉｍｍｕｎｉｔｙ： ａ ｔａｌｅ ｏｆ ｔｗｏ ｓｉｔｅｓ？ Ｂｏｗｅｎ ＤＧ ｅｔ．ａｌ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５ ，２６（１０）：５１２−７．
３、Ｔｈｏｍａｓ Ｈ． Ｋｉｎｇ１,ｅｔ．ａｌ,Ａ Ｗｈｏｌｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｙｅａｓｔ−Ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｅｌｉｃｉｔｓ ＨＢＶ Ｘ, Ｓ ａｎｄ Ｃｏｒｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｍｉｃｅ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｅｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ Ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ Ｖｉｒａｌ Ｃｌｅａｒａｎｃｅ, ２０１４, ＰＯＬＳ。
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７、Ｊｏｈｎ Ｍ． Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ．ａｌ,Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｉｎ ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅｓ,
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８、Ｔｈｉｍｍｅ Ｒ ｅｔ．ａｌ,ＣＤ８（＋） Ｔ ｃｅｌｌｓ ｍｅｄｉａｔｅ ｖｉｒａｌ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｄｕｒｉｎｇ ａｃｕｔｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ； Ｊ Ｖｉｒｏｌ． ２００３ Ｊａｎ；７７（１）：６８−７６。
９、曽筑天、肝臓誘導全身性免疫寛容及びその逆転研究、中国科学技術大学博士論文、２０１４。
１０、出願人：復旦大学、Ｂ型肝炎ウイルスの持続感染を抑制するワクチン、２００９年、出願公布番号：ＣＮ１０２０３８９４８．Ａ。
１１、Ｆｌｏｒｉａｎ Ｋ Ｂｉｈｌ ｅｔ．ａｌ, Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｕｓａｇｅ ｏｆ ｏｐｔｉｍａｌ ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｔｒｉｃｅｓ, ａｎｔｉ− ＣＤ３ ｍＡｂ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ａｎｄ”ＲｅｃｙｃｌｅＳｐｏｔ”； Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２００５,３：２０ １−１９。
１２、Ｙｕｊｉ Ｓｏｂａｏ ｅｔ．ａｌ, Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＴＬ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｂｙ ＨＬＡ−Ａ＊２４０２, ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｃｏｍｍｏｎ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ ａｌｌｅｌｅ ｉｎ Ｅａｓｔ Ａｓｉａ, Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ,２００１,３４：９２２−９２９。
１３、発明者 呉玉章ら；治療用Ｂ型肝炎治療ワクチン又は薬品を生産するための免疫原及びその製造方法と用途；公開番号：ＣＮ１４８３７３６Ａ。

Claims (7)

1. ＨＢｓＡｇを発現する不活性化全組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞によるＢ型肝炎治療ワクチンであって、
   前記Ｂ型肝炎治療ワクチンは前記不活性化全組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞をアジュバントとし、
   前記抗原としてのＨＢｓＡｇの組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞内での発現量が１０^８細胞あたり６〜１０μｇのＨＢｓＡｇを含有し、
   前記ＨＢｓＡｇは、合計１６〜２１個のＨＢｓＡｇ特異的ＣＴＬエピトープを含有し、
   前記組換えハンセヌラ・ポリモルファが発現するＨＢｓＡｇのＤＮＡ配列はＳＥＱＩＤ ＮＯ：１に示されることを特徴とするＢ型肝炎治療ワクチン。
2. 前記組換えハンセヌラ・ポリモルファが発現するＨＢｓＡｇは、
   Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu，
   Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile，
   Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val，
   Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys Leu，
   Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu，
   Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val，
   Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu，
   Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu，
   Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val，
   Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val，
   Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val，
   Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu，
   Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Ala，
   Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile，
   Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu，
   Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro Phe，
   Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile，
   Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe，
   Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val
   の合計１９個のＣＴＬエピトープを含有することを特徴とする請求項１に記載のＢ型肝炎治療ワクチン。
3. 組換えハンセヌラ・ポリモルファが発現するＨＢｓＡｇのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されることを特徴とする請求項２に記載のＢ型肝炎治療ワクチン。
4. 前記組換えハンセヌラ・ポリモルファが発現するＨＢｓＡｇはウイルス様粒子構造であり、ＨＢｓＡｇをハンセヌラ・ポリモルファ脂質に挿入してなり、前記ＨＢｓＡｇの１４個のシステインのうち９〜１２個はジスルフィド結合を形成することを特徴とする請求項１に記載のＢ型肝炎治療ワクチン。
5. 前記組換えハンセヌラ・ポリモルファの宿主であるハンセヌラ・ポリモルファ細胞株はＨＵ−１１であり、保蔵番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１２１８であり、前記宿主であるハンセヌラ・ポリモルファのオロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子が破壊されたＤＮＡ配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されることを特徴とする請求項１に記載のＢ型肝炎治療ワクチン。
6. 剤型が、プレフィルド注射液剤、注射液剤又は凍結乾燥粉末注射剤から選ばれることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のＢ型肝炎治療ワクチン。
7. ＨＢｓＡｇ原液又はアルミアジュバントＨＢｓＡｇのうちの１種をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のＢ型肝炎治療ワクチン。

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