TWI555531B - 用以治療ｂ型肝炎病毒（ｈｂｖ）感染之組成物 - Google Patents

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Description

用以治療B型肝炎病毒(HBV)感染之組成物
本發明係關於具有B型肝炎病毒(HBV)組分之免疫原性組成物，及其可為以核酸為主或以多肽為主。該免疫原性組成物可用於刺激或提升對HBV之免疫反應，而其目的係提供對抗HBV感染或由HBV感染所引起的或相關聯的任何病況或疾病之保護效果或治療效果。本發明也係關於用於表達此等HBV組分之表達載體及其治療用途或預防用途。本發明極為特別關注於免疫治療領域，更特別係用於治療HBV感染病人，尤其慢性感染病人。
 發明背景
B型肝炎是重大公共衛生問題，全球有超過3.5億人慢性感染B型肝炎，其中20%至40%有發展成慢性肝病、肝硬化及肝細胞癌的風險。儘管目前已有有效的預防性疫苗，但B型肝炎病毒(HBV)感染仍在許多國家猖獗，甚至已開發國家亦如此，估計全球每年出現約450萬個新感染病例。WHO推薦全球實施預防接種，但全程預防性疫苗接種的覆蓋率於亞洲為25%，歐洲為75-90%。目前B型肝炎為第十大死因(每年約有1百萬個死亡病例)，而HBV相關肝癌在癌症排名中排名第5。HBV感染的地域分布不均，西方國家盛行率低於1%，東南方國家、大部分非洲及赤道南美洲的盛行率高於10%。於HBV慢性帶原者高普及地區，自感染母親至新生兒的垂直感染是最常見的傳染模式，幾乎皆導致慢性肝炎(90%病例)。藉著出生後即刻對感染的嬰兒作預防性疫苗接種，可將此種盛行率降至15%。於西方國家，感染最常見係出現於成年透過水平途徑傳染，經由體液諸如血液、精液、唾液傳染，結果導致85%病人發生急性可自行痊癒的感染，但仍然導致15%的慢性感染病例。
B型肝炎病毒(HBV)屬於肝DNA病毒科(hepadnaviridae)的成員，主要感染肝臟，在肝細胞複製。傳染性粒子乃所謂的42-45奈米「丹氏粒(Dane particle)」，丹氏粒係由含有三種不同表面蛋白質(HBs)的外部脂蛋白包膜(envelope)及內部核衣殼(nucleocapsid)(HBcAg)組成，核衣殼的主要結構蛋白質為核心蛋白(core protein)。核衣殼內部有單套HBV基因體鏈接至病毒聚合酶蛋白質(P)。除了42-45奈米病毒粒(virion)之外，HBV感染病人血液含有由HBsAg及宿主衍生之脂質所組成的20奈米球體，該球體由感染細胞釋放。此等球體數目超過病毒粒的數目達104-106倍因數。
HBV基因體為約有3,200核苷酸之鬆弛狀圓形之部分雙股DNA，該DNA係由全長的負股(negative strand)及較短的正股(positive strand)所組成。HBV基因體含有4個重疊開放讀取框(open reading frame(ORF))，亦即C、S、P、及X。CORF編碼核心蛋白(或稱作HBcAg)，此乃組成HBV核衣殼的長度183胺基酸蛋白質；及於病毒複製期間出現於病人血清的第二種蛋白質稱作為HBeAg，HBeAg含有前核N端延伸部分及部分HBcAg。核心蛋白質之C端極為鹼性，含有4個Arg豐富域，預測該Arg豐富域可結合核酸，以及含有多個磷酸化位置(核心之磷酸化位置係與衣殼粒子(capsid particle)之構象變化(conformational change)有關，說明於Yu及Sommers,1994,J. Virol. 68:2965)。S ORF編碼三種表面蛋白質，全部皆具有相同的C端，但差異在於其N端，N端存在有三個同框ATG起始密碼子(in-frame ATG start codon)將SORF劃分成三區，分別為S(226胺基酸)、pre-S2(55胺基酸)及pre-S1(108胺基酸)。大型表面抗原蛋白質(L)係於第一ATG起始密碼子之轉譯起始後製造，及包含389胺基酸殘基(preS1-preS2-S)。中型表面抗原蛋白質(M)係來自於S區及pre-S2區的轉譯始於第二起始ATG；而226胺基酸所組成的小型表面抗原蛋白質(S，也標示為HBsAg)，係來自於S區起始於第三個起始ATG密碼子的轉譯。HBV表面蛋白質為糖蛋白，碳水化合物支鏈(聚糖)藉N-糖苷鍵聯鏈接。PORF編碼病毒聚合酶；及X ORF含有稱作為X蛋白質之蛋白質，相信為轉錄活化因子。
藉由目前尚未知的受體，病毒粒進入肝細胞後，核衣殼將基因體HBV DNA轉運至細胞核，此處鬆弛狀圓形DNA轉成共價閉合圓形DNA(cccDNA)。cccDNA係作為四種病毒RNA的轉錄樣板(template)，輸出至胞質(cytoplasm)且用作為用於HBV蛋白質轉譯的mRNA。最長的(前-基因體)RNA也用作為HBV複製樣板，HBV的複製係發生於胞質的核衣殼。然後部分HBV DNA及含聚合酶的衣殼轉運回細胞核，於細胞核釋放新產生的鬆弛狀圓形DNA來形成額外cccDNA。cccDNA的半生期比肝細胞的半生期更長，cccDNA負責HBV的持續生存。其它衣殼係經由出芽進入內質網(endoplasmic reticulum)而包覆包膜，及於通過高爾基複合體(Glogi complex)後被分泌。
多項臨床前期研究及臨床研究已經強調CD4+及CD8+T細胞免疫反應對於有效抗病毒反應的重要性(Ferrari等人，1990，J Immul,145:3442；Penna等人，1996，J Clin Invest,98:1185；Penna等人，肝臟學，25:1022)。換言之，病人天然藉T助手(TH)及胞毒性T(CTL)淋巴細胞(方便於周邊血液檢測)所媒介的B型肝炎造成的多重特異性及持續反應中復原。當辨識到病毒胜肽時，胞毒性T淋巴細胞CTL具有能力透過HBV複製之非細胞致病性細胞激素媒介的抑制作用來治癒HBV感染細胞及/或透過perforin-Fas配體及TNFα-媒介的死亡路徑而殺死HBV。兩項效應物功能(effector function)係於急性B型肝炎緩解期間觀察到，此種第1型T細胞(Th1)反應於臨床復原之後仍然持續。經常重合血清丙胺酸轉胺酶(ALT；SGPT)濃度升高，及重合HBcAg特異性IgM及IgG的出現。抗HBe抗體及抗HBs抗體稍後出現，且指示有利於感染結果。HBsAg-特異性抗體經中和，媒介保護性免疫力，且於臨床復原後持續終生。但慢性HBV感染只有極為罕見地才能被免疫系統所緩解。當發生慢性HBV感染時，病毒的清除係關聯著胞毒性T淋巴細胞CTL活性增高，以及受感染的肝細胞被免疫系統摧毀，造成ALT濃度升高。但大部分慢性感染病人顯示抗原能力有限的微弱及暫時性CD4及CD8 T細胞免疫反應而無法有效清除病毒感染，但個別HBV特異性T細胞純株已經自肝臟細胞切片檢查中分離及擴增。此種慢性B型肝炎的細胞免疫反應之效應物功能改變的理由目前尚未知。但顯示有些病人於病毒載荷量(viral load)低於106國際單位/毫升(IU/mL)臨界值時，功能性T細胞反應部分恢復(Webster等人2004，J. Virol. 78:5707)。此等資料明白鼓勵及強調需要有可誘導有效T細胞反應的免疫調節策略。
理想上，慢性B型肝炎的治療首先須在肝臟遭到不可逆損傷之前，允許遏止HBV的複製，因而清除病毒，防止疾病進行至肝硬化或肝癌，且改善病人的存活率。習知慢性B型肝炎的治療包括PEG化(pegylated)干擾素-α(IFNa)及核苷/核苷酸類似物(nucleoside/nucleotide analogue(NUC))諸如拉美夫定(lamivudine)，及更為晚近的安提卡芙(entecavir)、特比夫定(telbivudine)、阿迪佛芙(adefovir)及特諾佛芙(tenofovir)(EASL臨床實務指南：慢性B型肝炎的處置，2009年)。IFNa為強力抗病毒分子，因此可抑制病毒複製，但於25-30%病人引發嚴重副作用。NUC係作為HBV聚合酶之競爭性抑制劑，針對抑制前-基因體RNA之反錄成為負DNA股，及然後轉成雙股病毒DNA。其限制新的病毒粒的形成，但對於清除隱藏在受感染的肝細胞核中之超螺旋cccDNA無效，該種超螺旋cccDNA構成新的子代病毒的來源。如此可解釋為何NUC效果為暫時，在治療停止後即刻出現病毒的回彈(rebound)，需要病人長期接受治療。此外，長期功效也受限制，原因在於出現抗藥性HBV突變株(如Leung等人，2001，肝臟學33:1527討論，拉美夫定治療一年後，出現抗藥性HBV突變株大於24%，及四年後大於66%)，但較新的NUC(安提卡芙、特比夫定及特諾佛芙)顯示抗藥性HBV突變株的發生遠較少，同時HBV DNA的遏止增加。但使用此等新穎藥物的長期治療資料有限，及此種較高功效尚未找出與HBs-血清轉化的顯著較高比率間的相關性。
除了抗病毒治療之外，目前也致力於發展針對改良宿主免疫反應，特別由胞毒性T淋巴細胞及助手T淋巴細胞所媒介的免疫反應之輔助治療。大部分現行免疫治療辦法的目光焦點皆集中在使用HBV表面蛋白、S preS1及/或preS2(Smith等人，1983，自然302:490；Lubeck等人，1989，Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:6763;Adkins等人，1998，生物藥物10:137；Loirat等人，2000，J. Immunol. 165:4748；Funuy-Ren等人，2003，J. Med. Virol. 71:376；Kasaks等人，2004，J. Gen. Virol. 85:2665；Xiangming Li等人，2005，Intern. Immunol. 17:1293；Mancini-Bourguine等人，2006，Vaccine 24:4482；Vandepapeliere等人，2007，疫苗25:8585)。至少就免疫反應刺激獲得令人振奮的結果。例如，Mancini-Bourguine等人(2006，疫苗24:4482)報告於HBV慢性感染病人使用preS2-S-編碼DNA疫苗注射來誘導及/或喚起T細胞反應，此乃此等病人體內免疫系統仍然在運作的良好指標。
HBcAg也用作為免疫原(Yi-Ping Xing等人，2005，World J. Gastro. 11:4583)及表面上載有外來抗原上突(epitope)之嵌合體HBcAg衣殼(WO92/11368；WO00/32625；Koletzki等人，1997，J.Gen.Virol.78：2049)。自免疫原性觀點，插入抗原上突最有展望的位置似乎為預測位在HBcAg表面上，位置80附近的外環位置(Argos等人，1988，EMBO J.7：819)。Schodel等人(1992，J.Virol.66：106)及Borisova等人(1993，J.Virol.67：3696)可將preS1及HBsAg抗原上突插入此區，且報告成功地使用嵌合體粒子免疫接種。
針對同時靶定多個HBV抗原之候選名單多價疫苗也曾進行研究。值得注意地，編碼存在於包膜蛋白質、核心蛋白質及聚合酶蛋白質的多重胞毒性T淋巴細胞(CTL)及助手T淋巴細胞(HTL)抗原上突之融合多肽的多抗原上突DNA疫苗，顯示於臨床前期小鼠研究模型中可提引出多重CTL及HTL反應(Depla等人，2008，J.Virol.82：435)。已經發展出數種基於編碼HBsAg、HBcAg及HBV聚合酶之DNA質體混合物的數種疫苗調配物(WO2005/056051；WO2008/020656)，及於慢性B型肝炎之基因轉殖小鼠研究模型顯示特異性抗HBV細胞反應及體液反應(Chae Young Kim等人，2008，Exp.Mol.Medicine 40：669)。南韓對HBV帶原者(carrier)使用拉美夫定的組合治療開始進行第I期臨床試驗(Yang等人，2006，基因治療學，13：1110)。
如此，仍然需要有於有需要的個體諸如HBV慢性感染病人體，以更強力更有效的方式誘生免疫反應，特別為細胞媒介免疫反應之免疫治療辦法的替代之道。此外，需要提供可以穩定持續方式表達HBV抗原之基於載體的組成 物。
欲藉實施例所解決的技術問題係定義於申請專利範圍。
本發明之其它及進一步面相、特徵及優點由後文目前本發明之較佳實施例之描述將更為彰顯。此等實施例係用於揭示目的。
發明概要
如此，於第一面相，本發明提供一種包含至少一個多肽或編碼該至少一個多肽之核酸分子之免疫原性組成物，其中該至少一個多肽係選自於由下列所組成之組群：(i)包含源自於第一HBV病毒之聚合酶蛋白質至少450胺基酸殘基的聚合酶部分；(ii)包含源自於第二HBV病毒之核心蛋白質至少100胺基酸殘基之核心部分；及(iii)源自於第三HBV病毒之HBsAg蛋白質15至100連續胺基酸殘基之一個或多個免疫原性域之env部分；或該聚合酶部分、核心部分、env部分、編碼該聚合酶部分之該核酸分子、編碼該核心部分之該核酸分子及/或編碼該env部分之該核酸分子的任一種組合。
定義
如此處於本案全文使用，除非上下文另行指示，否則「一」一詞用來表示「至少一個」、「至少第一」、「一個或多個」或「多個」所述化合物或步驟。例如「一細胞」一詞表示多個細胞包括其混合物。
「及/或」一詞用於此處包括「及」、「或」及「該術語所連結的任何元體全部或任何其它組合」之意義。
「約」或「約略」一詞用於此處表示於一給定數值或範圍之10%以內，較佳8%以內，及更佳5%以內。
如此處使用，當用來定義產物、組成物及方法時，「包含」(及包含之任何形式，諸如「包含有」)、「具有」(及具有之任何形式)、「包括」(及包括之任何形式)或「含有」(及含有之任一種形式)等詞為開放性術語且未排除額外未引述的元體或方法步驟。「主要包含」表示排除任何必要意義的其它組件或步驟。如此，主要由所引述之組件組成之組成物並未排除微量污染物及藥學上可接受之載媒劑。「由該成分所組成」表示排除多於微量元素之其它組分或步驟。例如多肽由胺基酸序列「所組成」表示該多肽除了所引述的胺基酸序列外不含任何胺基酸。多肽「主要由」胺基酸序列組成表示此種胺基酸序列之存在最終只有少數額外胺基酸殘基。多肽「包含」胺基酸序列表示胺基酸序列為多肽之最終胺基酸序列之至少一部分。此種多肽可有少數至數百額外胺基酸殘基。
「胺基酸」、「殘基」及「胺基酸殘基」等詞為同義詞及涵蓋天然胺基酸及胺基酸類似物(例如非天然、合成及改性胺基酸，包括D或L光學異構物)。
「多肽」、「胜肽」及「蛋白質」等詞於此處互換使用用來表示包含9個或更多個透過胜肽鍵而鍵結之胺基酸的胺基酸殘基聚合物。該聚合物可為線性、分支或環狀及包含天然胺基酸及/或胺基酸類似物，且可有非胺基酸所中斷。概略指示，若胺基酸聚合物為長(例如多於50胺基酸殘基)，則較佳係指多肽或蛋白質，而若其長度為50胺基酸或以下，則係指「胜肽」。
於本發明之上下文，「核酸」、「核酸分子」、「多核苷酸」及「核苷酸序列」等詞係互換使用及定義多去氧核糖核苷酸(DNA)(例如cDNA、基因體DNA、質體、載體、病毒基因體、單離DNA、探針、引子及其任一種混合物)或多核糖核苷酸(RNA)分子(例如mRNA、反訊息RNA)或混合多核糖-多去氧核糖核苷酸之任一種長度之聚合物。該術語涵蓋單股或雙股、線性或環狀、天然或合成多核苷酸。此外，多核苷酸可包含非天然核苷酸，諸如甲基化核苷酸及核苷酸類似物(參考US 5,525,711、US 4,711,955或EPA 302 175作為修改實例)且可由非核苷酸組分中斷。若存在有修改，則核苷酸之修改可於聚合前或聚合後提供。
如此處使用，「免疫原性組成物」一詞表示一種調配物包含後文說明之1、2、3、4或多個組分(例如聚合酶部分、核心部分、env部分、編碼聚合酶部分之核酸分子、編碼核心部分之核酸分子及/或編碼env部分之核酸分子)及選擇性地其它組分(例如輔劑、載劑、稀釋劑等)。本發明之免疫原性組成物典型係呈可投予宿主有機體之形式，該組成物可誘發保護性或治療性免疫反應足夠誘導或刺激抗HBV免疫力，結果導致治療效果諸如預防HBV感染，減少及/或改善因HBV感染所引起或相關聯的至少一種病況(例如減低病毒載荷量，減低或延遲肝臟病變風險，諸如肝硬化或肝癌，改善肝史等)，及/或減低血清HBeAg或HBsAg濃度或二者及/或誘生HBe血清轉化、HBs血清轉化或二者及/或提升其它抗HBV治療或預防的功效。本發明之免疫原性組成物當導入宿主有機體內時可激發免疫反應，包括但非限於抗體及/或細胞激素的製造及/或胞毒性T細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞、抗原呈現細胞、助手T細胞、樹狀細胞、NK細胞的活性，結果導致產生對至少一種HBV抗原/抗原上突之先天免疫反應及/或特異性體液免疫反應及/或特異性細胞性免疫反應。
「免疫原性域」係指可被抗體或T細胞受體結合之HBV蛋白質之結構部分。典型地，此種免疫原性域特別含有一個或多個B及/或T抗原上突。CTL或TH抗原上突或二者，且係涉及由特定抗體所辨識，或藉T細胞受體之MHC(主要組織可相容性複合體)上下文。「抗原上突」係對應於最小胜肽部分(通常為9-11個胺基酸殘基集合)其係共同形成由抗體、T細胞受體或HLA分子所辨識的部位。該等殘基可為連續(線性抗原上突)或否(隨形抗原上突其包括非彼此緊鄰的殘基)。藉T細胞辨識T細胞抗原上突一般相信係透過一種機轉，其中T細胞辨識抗原之胜肽節段，其係結合至在抗原呈現細胞表達的I類或II類MHC分子。
如此處使用，「HBV」及「B型肝炎病毒」二詞係互換 使用且係指肝DNA病毒科之任一種成員(例如參考Ganem及Schneider於肝病毒科(2001)「病毒及其複製」(2923-2969頁)，Knipe DM等人編輯，現場病毒學，第4版，費城，Lippincott Williams & Wilkin或隨後版本)。延伸種系發生分析結果導致將B型肝炎病毒歸類為8大基因型(A至H)，其顯示至少8%系列發散。各種HBV基因型顯示獨特地理分布，及可顯示異種疾病症狀及/或臨床結果。各種HBV關聯HBsAg相關的血清學而歸類為9種不同亞型(ayw1、ayw2、ayw3、ayw4、ayr、adw2、adw4、adrq+及adqr-)(參考Mamum-A1 Mahtab等人，2008，國際肝膽胰病5：457；Schaeffer，2007，世界胃腸學7：14；Norder等人，1993，J.Gen Virol.74：1341之綜論)。各基因型及血清型涵蓋不同HBV種系及單離株。單離株係對應於自特定HBV來源(例如病人樣本或其它生物HBV貯存所)單離的特定病毒，而一種系涵蓋多個單離株，就基因體序列而言彼此極為接近。
適合用於本發明之上下文之多種HBV係說明於技藝界特別於基因庫(Genbank)。A基因型HBV之實例包括但非限於單離株HB-JI444AF及種系HB-JI444A(存取號碼D00329)。B基因型HBV之實例包括但非限於純株pJDW233(存取號碼D00329)、單離株HBV/14611(存取號碼AF121243)、Hou等人於2001年識別之HBV-B1(基因庫存取號碼AF282917.1)、HBV種系Whutj-37(基因庫存取號碼AY2933309.1)其係由Zhang等人識別(2005，Arch.Virol.150,721-741)、He等人識別之中國HBV種系GDH1(基因庫存取號碼AY766463.1)，及由Jiang等人識別之HBV單離株57-1亞型adw(基因庫存取號碼AY518556.1)。C基因型HBV之實例包括但非限於單離株AH-1-ON980424(存取號碼AB113879)、種系HCC-3-TT(存取號碼AB113877)、Fang等人識別之HBV單離株SWT3.3(基因庫存取號碼EU916241.1)、Zhu等人識別之HBV單離株H85(基因庫存取號碼AY306136.1)、Tu等人識別之HBV種系C1248(基因庫存取號碼DQ975272.1)、HBV單離株CHN-H155(基因庫存取號碼DQ478901.1)其係由Wang等人識別(2007，J. Viral Hepat 14,426-434)，及Zhou等人識別之HBV單離株GZ28-1(基因庫存取號碼EF688062)。D基因型HBV之實例包括但非限於單離株KAMCHATKA27(存取號碼AB188243)、ALTAY136(存取號碼AB188245)及Y07587說明於Stoll-Becker等人(1997，J. Virol. 71:5399)及可於基因庫以存取號碼Y07587取得，以及於存取號碼AB267090描述之HBV單離株。E基因型HBV之實例包括但非限於單離株HB-JI411F及種系HB-JI411(存取號碼AP007262)。F基因型HBV之實例包括但非限於單離株HBV-BL597(存取號碼AB214516)及HBV-BL592(存取號碼AB166850)。G基因型HBV之實例包括但非限於單離株HB-J1444GF及種系HB-JI444G(存取號碼AP007264)。H基因型HBV之實例包括但非限於單離株HBV ST0404(存取號碼AB298362)及單離株HB-JI260F及種系HB-JI260(存取號碼AP007261)。但本發明並非限於此等HBV實例。確實核苷酸序列及胺基酸序列可於不同HBV單離株及基因型間改變，此種天然遺傳變化係含括於本發明之範圍及非天然修改例如於後文描述者。
如此處使用，「天然HBV蛋白質」係指天然得自HBV來源且可與人工改性或於實驗室中藉人為變更者區別之所發現、單離的、所得蛋白質、多肽或胜肽(例如聚合酶蛋白質、核心蛋白質或HBsAg等)。如此，除非另行規定，否則本術語將包括天然HBV蛋白質、多肽或胜肽。此等天然來源包括收集自已經感染HBV或曾經暴露於HBV之個體的樣本(例如血液、血漿、血清、精液、唾液、組織切片、活組織切片檢體等)、培養細胞(諸如HepG2.2.15、HuH6-C15(Sureau等人，1986，Cell 47:37；Sells等人，1987，Proc. Natl. Acad. Sci. 84(4):1005);HuH7.TA61或HuH7.TA62(Sun等人，2006，J Hepatol. 45(5):636)、組織培養及重組材料。重組材料包括但非限於HBV單離株(例如得自寄存機關)、HBV基因體、基因體RNA或cDNA存庫、含HBV基因體或其片段之質體或已知包括此等元體之任何先前技術載體。
編碼多種HBV蛋白質之核苷酸序列係出現於特化資料庫(例如前述者)及出現於參考文獻(例如參考Valenzuela等人，1980，B型肝炎病毒基因體之核苷酸序列及主病毒基因之識別(57-70頁)於「動物病毒遺傳學」編者B. Fields等人；學術出版社，紐約及Vaudin等人，1988，J. Gen. Virol. 69:1383)。天然聚合酶多肽、核心多肽及HBsAg多肽之實例分別顯示於SEQ ID NO:1-3(SEQ ID NO:1提供HBV單離株Y07587之天然聚合酶蛋白質之胺基酸序列，SEQ ID NO:2提供HBV單離株Y07587之天然核心蛋白質之胺基酸序列，及SEQ ID NO:3提供HBV單離株Y07587之天然env(HBsAg)之胺基酸序列)。編碼Y07587 HBV之天然聚合酶、核心及HBsAg之核苷酸序列供舉例說明目的顯示於SEQ ID NO:4、5及6。但如前文討論，HBV蛋白質並非限於此等序列實例，基因變化係含括於本發明之範圍。
如此處使用，「部分」一詞(例如聚合酶部分、核心部分及/或env部分)係指如本文所述，藉人工改性或於實驗室中藉人力變更後源自於天然HBV蛋白質、多肽或胜肽之蛋白質、多肽或胜肽。「改性」一詞涵蓋一個或多個核苷酸/胺基酸殘基之刪除、取代或添加、此等可能之任一種組合(例如天然核苷酸序列之簡併來減低藉本發明組成物所編碼之HBV序列間之同源性，導入適當限剪位置)及非天然排列(例如兩個或多個HBV蛋白質、多肽或胜肽或部分間之融合)。當預期若干改性時，可考慮連續殘基及/或非連續殘基。改性可藉熟諳技藝人士已知之多種方式產生，諸如位置導向突變發生(例如使用阿默山公司(Amersham)，法國Les Ullis之史卡普特(Sculptor)試管內突變發生系統)、PCR突變發生、DNA穿梭及藉化學合成技術(例如導致合成核酸分子)。本發明涵蓋之修改包括寂靜修改，其未改變所編碼之HBV多肽之胺基酸序列，以及轉譯成所編碼多肽之修改，結果導致與相對應之天然胺基酸序列比較獲得已修改之胺基酸序列。「源自」(或源自於)一詞係用來識別分子之原先來源，但並非表示限於該分子之製造方法，該分子例如可藉化學合成或藉重組手段製造。
較佳用於本發明之各個HBV部分保有與相對應之天然HBV蛋白質於全長蛋白質或其部分之高度胺基酸序列相同性。兩種多肽間之相同性百分比為由二序列所共用之相同位置數目之函數，考慮需要導入來獲得最佳排齊的間隙數目及各個間隙的長度。多個電腦程式及數學演繹法則於技藝界可用來決定胺基酸序列之相同度百分比，例如Blast程式(例如Altschul等人，1997，核酸研究25:3389；Altschul等人，2005，FEBS J. 272:5101)，該程式係得自NCBI。同等可應用於核苷酸序列。測定核苷酸序列同源性的程式也可得自特化資料庫(基因庫或威斯康辛序列分析套裝軟體)，例如BESTFIT、FASTA及GAP程式。
例如，進一步有關後文修改(例如減低酶活性等)，本發明之組成物所包含或編碼之任一種或全部HBV部分可經修改，因而表示特定基因體，如此包含與等位序列或近等位序列相對應之胺基酸序列，其典型地係於特定基因型的多種HBV多肽之序列排齊後決定。
「組合物」一詞如此處使用係指由本發明之免疫原性組成物所包含或所編碼之至少兩種組分之任一種組合物及多個組分之任一種可能的排列，但特別偏好該等組分中之二者或三者。如此涵蓋兩種或多種多肽之混合物、兩種或多種核酸分子/載體之混合物、一種或多種多肽與一種或多種核酸分子/載體之混合物、以及兩種或多種核酸分子之融合，因而提供載有兩個或多個HBV部分之單一多肽鏈(例如非自然排列)。
於較佳實施例中，本發明之免疫原性組成物包含該聚合酶部分、核心部分、env部分中之至少二者之組合，或編碼該聚合酶部分之核酸分子、編碼該核心部分之核酸分子及/或編碼env部分之核酸分子中之至少二者之組合。本發明之特佳組成物係選自於由下列所組成之組群：(i)一種組成物包含如此處定義之聚合酶部分與核心部分之組合或編碼該聚合酶部分與該核心部分之核酸分子之組合；(ii)一種組成物包含如此處定義之核心部分與env部分之組合或編碼該核心部分與該env部分之核酸分子之組合；及(iii)一種組成物包含如此處定義之聚合酶部分、核心部分與env部分之組合或編碼該聚合酶部分、該核心部分與該env部分之核酸分子之組合。
「融合」或「融合蛋白質」等詞用於此處係指於單一多肽鏈中至少二多肽(或其片段)彼此之組合。較佳多個多肽間之融合係利用遺傳手段執行，亦即經由於編碼各該多肽之核酸序列之框架內藉融合執行。「於框架內融合」一詞表示融合編碼序列之表達結果導致單一蛋白質，而各個融合多肽間並無任何轉譯終結子。融合可為直接融合(亦即其間不含任何額外胺基酸殘基)或透過鏈接基融合。鏈接基的存在可協助融合蛋白質之正確形成、摺疊及/或發揮功能。本發明並未受所採用之鏈接基序列之形式、尺寸或數目所限，於融合多肽間之接面可插入鏈接基序列之多個複本。根據本發明之適當鏈接基長3至30胺基酸且係由胺基酸殘 基諸如甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺、丙胺酸及/或脯胺酸之重複組成(例如參考Wiederrecht等人，1988，細胞54，841；Aumailly等人，1990 FEBS Lett.262,82；及Dekker等人，1993，自然362,852)，例如Ser-Gly-Ser或Gly-Ser-Gly-Ser-Gly鏈接基。
如此處使用，「異源斥水性序列」一詞係指斥水性之多肽(其含有多個斥水性胺基酸殘基諸如Val、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr及Trp殘基)。「異源性」係指對於該所選之HBV部分之來源天然HBV蛋白質、多肽或胜肽為外來序列。可為HBV病毒之外來胜肽(例如得自麻疹病毒或狂犬病病毒之胜肽)或得自HBV病毒但並非位在該病毒基因體內尋常出現的位置之胜肽。異源斥水性序列可於框架內稠合於N端、於C端或稠合於HBV部分內部，且可於多肽通訊、協助多肽製造或純化、延長半生期等方面扮演某種角色。根據本發明之適當異源斥水性序列長15至100胺基酸及含有高度斥水性域。
「載體」一詞用於此處係指表達載體及非表達載體，且包括病毒載體及非病毒載體，包括染色體外載體(例如多複本質體)及整合載體設計用來結合入宿主染色體。於本發明之內文中特別重要者為於病毒基因體傳遞核酸分子之載體(所謂之移轉載體)、用於免疫治療之載體(亦即可將核酸分子遞送至宿主有機體)及用於各種表達系統及用於宿主有機體之表達載體。
如此處使用，「病毒載體」一詞涵蓋載體DNA及由該載體DNA所產生的病毒粒子。病毒載體可為複製合格，或可為基因上不能動作因而變成複製缺陷或複製受損。「複製合格」一詞用於此處涵蓋複製選擇性及條件複製性病毒載體，該等載體經過基因改造而於特定宿主細胞(例如腫瘤細胞)可更佳地或選擇性地複製。
如此處使用，「調節序列」一詞係指允許、促成或調節核酸分子於給定的宿主細胞或有機體表達之任何序列，包括核酸分子或其衍生物之一(亦即mRNA)的增殖、複製、轉錄、剪接、轉譯、安定性及/或轉運入宿主細胞或有機體。
如此處使用，「宿主細胞」一詞須了解廣義而言並未限於任何有關組織、器官、或單離細胞的任何組織結構。此等細胞可為獨特細胞類型或不同型細胞的組群，涵蓋細菌、低等及高等真核細胞及培養細胞系、一次細胞及增生細胞。本術語包括可為或已經成為本發明之組成物、核酸分子、載體或傳染性病毒粒子之接受者的細胞及此等細胞之子代。
「宿主有機體」一詞係指脊椎動物，特別為哺乳動物種屬之成員，及尤其居家動物、農場動物、運動動物、及靈長類包括人類。較佳宿主有機體為患有HBV感染之病人。感染的HBV可來自於與用於本發明之第一、第二或第三HBV中之至少一者相同基因型或血清型。
如此處使用，「經單離」一詞係指自其天然環境移開之蛋白質、多肽、胜肽、核酸分子、宿主細胞或病毒(亦即與其天然結合的至少另一種組分分離)。
如此處使用「治療上有效量」為足夠改善通常與HBV感染或由HBV感染所引起的或關聯的任何疾病或病症相關聯之一種或多種症狀之劑量。當考慮預防性用途時，本術語表示足夠預防或延遲HBV感染之建立之劑量。「治療性」組成物係經設計及投予已經感染HBV之宿主有機體，其目的係減輕或改善由該HBV感染所引起的或關聯的至少一種疾病或病況，最終組合一種或多種如此處所述之治療模型(例如使用核苷或核苷酸類似物處理)。例如，用於誘導免疫反應之治療上有效量可為造成免疫系統活化所需之數量(例如導致抗HBV反應的出現)。「癌症」一詞涵蓋任一種癌症病況包括瀰漫性或局部性腫瘤、轉移、癌性瘜肉以及癌前病灶(例如肝硬化)。
如此處使用，「藥學上可接受之載媒劑」意圖包括任何及全部與藥物投予上可相容之任何及全部載劑、溶劑、稀釋劑、賦形劑、輔劑、分散介質、塗覆劑、抗菌劑及抗黴菌劑及吸收延遲劑等。
根據本發明，包含或藉本發明組成物編碼之該等聚合酶、核心及/或env部分分別可源自目前識別的任何HBV基因型、種系或單離株，諸如前文就「HBV」一詞所述者。進一步，聚合酶、核心及env部分各自可源自於天然相對應之HBV蛋白質或源自於改性HBV多肽(例如經修改因而表示特定基因型)。如此，本發明組成物所包含或所編碼之聚合酶、核心及env部分之來源第一、第二及第三HBV病毒分別可得自相同或相異基因型、血清型及/或單離株。例如使用源自兩個或多個不同HBV基因型之HBV部分允許保護對抗更寬廣範圍之HBV基因型。
於一個實施例中，關注於經由使用得自於本區當地之HBV基因型的至少一個HBV部分，將本發明之免疫原性組成物調整適合特定地理區。用於舉例說明目的，基因型A及C於美國最普遍，而西歐病人大部分感染基因型A及D，及地中海病人大部分感染基因型D。得自印度的有限資料指示病毒最常見基因型A及D。另一方面，基因型B及C於中國最為普及。舉例言之，目的地為歐洲國家之本發明組成物可包含源自於基因型A之聚合酶部分及源自於基因型D之核心及env部分或反之亦然。另外，聚合酶及核心部分可得自基因型A，及env部分得自基因型D。至於另一個實例，目的地用於歐洲國家及美國之本發明組成物可包含分別係源自於基因型A、C及D之聚合酶、核心及env部分。另一方面，目的地為中國之本發明組成物可包含分別源自於基因型B及/或C之聚合酶、核心及env部分。
也適合將本發明之免疫原性組成物調整適合欲治療的病人族群。例如，基因型A於美國白人及非裔美人較為常見，經過性行為感染HBV之病人無論屬於基因型B及C卻常見來自於亞裔美人、亞洲出生者以及帶有母親對嬰兒垂直傳染的HBV患者。HBV基因型也與不同的臨床結果有關(Schaeffer等人，2005，J.Viral.肝炎12：111)，基因型D及F係造成比基因型A更嚴重的疾病進程及更惡劣的預後(Sanchez-Tapias等人，2002，胃腸學123：1848)。熟諳技藝 人士之技巧範圍可根據欲治療的族群及/或地理區經由選擇適當HBV基因型、血清型、種系及/或單離株而調整本發明組成物。
根據優異實施例，第一、第二及第三HBV病毒中之至少二者及較佳為全部係得自相同HBV基因型，特別係得自基因型D。分別源自於相同單離株，特別偏好源自HBV單離株Y07587之第一、第二及第三HBV病毒，較佳，用於本發明之聚合酶部分包含與具有至少450個胺基酸殘基之SEQ ID NO：1或其部分所示胺基酸序列具有至少80%相同度，優異地至少85%相同度，較佳至少90%相同度，更佳至少95%相同度，及又更佳100%相同度之胺基酸序列。另外或此外，用於本發明之核心部分包含與具有至少100個胺基酸殘基之SEQ ID NO：2或其部分所示胺基酸序列具有至少80%相同度，優異地至少85%相同度，較佳至少90%相同度，更佳至少95%相同度，及又更佳100%相同度之胺基酸序列。另外或此外，用於本發明之env部分之一個或多個免疫原性域包含與具有至少15-100個胺基酸殘基之SEQ ID NO：3或其部分所示胺基酸序列具有至少80%相同度，優異地至少85%相同度，較佳至少90%相同度，更佳至少95%相同度，及又更佳100%相同度之胺基酸序列。
聚合酶部分
根據一個實施例，由本發明組成物所包含或編碼之聚合酶部分係比較相對應之天然HBV聚合酶經修改。適當修改為至少20胺基酸殘基截頭及至多335胺基酸殘基正常存 在於天然HBV聚合酶N端。此項修改特別係與本發明組成物相關，也包含第二多肽因而減少或刪除聚合酶部分與核心部分間之重疊部分。熟諳技藝人士之技巧範圍內可將本發明組成物於所引述的至少20胺基酸殘基及至多335胺基酸殘基之範圍內截頭。至於天然HBV聚合酶，用於本發明上下文之聚合酶部分較佳係截頭至少30胺基酸殘基至至多200胺基酸殘基，期望至少35胺基酸殘基至至多100胺基酸殘基，較佳至少40胺基酸殘基至至多60胺基酸殘基，及更佳至少45胺基酸殘基至至多50胺基酸殘基，特別偏好截頭包括於位在天然HBV聚合酶N端之起始子Met殘基後方頭47或46胺基酸殘基。較佳截頭係自SEQ ID NO：1之位置1(Met起始子)或2延伸至位置47。
較佳實施例係針對包含與自約位置48延伸至約位置832之SEQ ID NO：1所示胺基酸序列部分具有至少80%相同度、優異地至少85%相同度、較佳至少90%相同度、更佳至少95%相同度、及又更佳100%相同度之胺基酸序列之聚合酶部分；及甚至更佳係針對包含與SEQ ID NO：7所示胺基酸序列具有至少80%相同度、優異地至少85%相同度、較佳至少90%相同度、更佳至少95%相同度、及又更佳100%相同度之胺基酸序列。
另外或此外，用於本發明之聚合酶部分經修改因而比較天然HBV聚合酶具有減低的反錄酶(RTase)酶活性。較佳，該RTase活性之減低係由負責RTase酶活性之域的一個或多個突變所提供。
幾乎20年前研究HBV聚合酶之結構及功能組織(例如參考Radziwill等人，1990，J.Virol.64：613)。其為多功能蛋白質，具有三個功能域催化HBV複製之主要步驟(引發、DNA合成及RNA樣板之去除)及非必要的間隔基其係以下列順序排列：○自位置1延伸至約位置177之第一域係負責HBV端末蛋白質活性，○間隔基係位在約位置178至約位置335，○自約位置336延伸至位置679之DNA聚合酶域負責RTase活性，及○自約位置680至C端(約為位置832)之RNase H域係涉及RNase H活性。
四個殘基涉及RTase活性，形成存在於天然HBV聚合酶自約位置538至約位置541(例如相當於SEQ ID NO：1之位置538、539、540及541及SEQ ID NO：7之位置492、493、494及495)之「YMDD」部分(用於Tyr、Met、Asp及Asp殘基)；及本發明涵蓋於此部分之任何突變或RTase域它處之任何突變而該域係與RTase活性之顯著減低(亦即約減低10倍)或消除相關而同時仍然保有免疫原性。適當RTase缺陷聚合酶突變株之代表性實例係說明於參考文獻例如Radziwill等人(1990，J.Virol.64：613)、Bartenschlager等人(1990，J.Virol.64：5324)及Jeong等人(1996，Biochem Bioph Res Commun.223(2)：264)。較佳，用於本發明之聚合酶部分包含YMDD 部分(相當於SEQ ID NO：1位置540及SEQ ID NO：7位置494)之第一Asp殘基之取代，或位在相當於天然HBV聚合酶之Asp以外之任何胺基酸殘基位置的胺基酸殘基之取代，特別偏好His殘基之取代(D540H突變)。RTase活性的減少或消除可使用技藝界眾所周知之檢定分析進行(例如Radziwill等人，1990，J Virol.64：613所述內生性聚合酶檢定分析)。
另外或此外，用於本發明之聚合酶部分可經修改，因此比較天然HBV聚合酶具有減低的RNase H酶活性。較佳該RNase H活性減低係由負責RNase H酶活性之域中之一項或多項突變提供。如前文討論，涉及RNase H活性之域已經映射於HBV聚合酶之C端部分內部，更特別自位置680至C端位置832；及本發明涵蓋於此域之任何突變，該突變係與RNase H活性顯著減低(亦即至少10倍減低)或消除，及其對免疫原性無害。適當RNase H缺陷聚合酶突變株之代表例係說明於參考文獻，例如Radziwill等人(1990,J.Virol.64：613)、Bartenschlager等人(1990，J.Virol.64：6324)。較佳，用於本發明之聚合酶包含對應於SEQ ID NO：1位置718及SEQ ID NO：7位置672之Glu殘基之取代，或位在天然HBV聚合酶相當於Glu以外之任何胺基酸殘基的相當位置之胺基酸殘基之取代，特別偏好His殘基之取代(E718H突變)。RNase H活性之減低或消除可使用技藝界眾所周知之檢定分析執行(例如於試管內RNase H活性檢定分析或DNA-RNA串接分子分析，說明於Radziwill等人，1990，J Virol.64：613或Lee等人，1997，Biochem.Bioph.Res. Commun.233(2)：401)。
較佳用於本發明之聚合酶部分係經突變因而減少或消除RTase活性及RNase活性，及包含前文就此等酶功能所討論之修改，特別偏好突變D540H及E718H。
本發明之較佳實施例係針對一種聚合酶部分其包含、另外其主要組成為、或另外其組成為一種胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列或SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列具有至少80%相同度、優異地至少85%相同度、較佳至少90%相同度、更佳至少95%相同度、及又更佳100%相同度，Asp殘基於位置494取代His殘基及Glu殘基於位置672取代His殘基。
於另一且較佳實施例中，用於本發明之聚合酶部分係於框架內融合之異源斥水性序列因而改良於表達性宿主細胞表面之合成、及/或安定性、及/或呈現，及/或對宿主MHC I類及/或MHC II類抗原之呈現。適當異源性斥水序列包括允許聚合酶部分靶定於分泌路徑之序列諸如信號胜肽及/或穿膜胜肽。此等胜肽為技藝界所已知。簡言之，信號胜肽通常係存在於膜呈現或膜分泌多肽之N端，開始其進入內質網(ER)。其包含15至35個主要為斥水性胺基酸，其然後藉特定位在ER之內肽酶去除獲得成熟多肽。穿膜胜肽通常本質上為高度斥水性，用來將多肽錨定於細胞膜(例如參考Branden及Tooze，1991，蛋白質結構介紹，202-214頁，NY Garland；WO99/03885)。可用於本發明之上下文之穿膜胜肽及/或信號胜肽之選擇寬廣。其可得自任何膜定錨及/或膜 分泌多肽(例如細胞性多肽或病毒性多肽)諸如免疫球蛋白、組織胞質素原活化劑、胰島素、狂犬病、糖蛋白、HIV病毒包膜糖蛋白或麻疹病毒F蛋白質或可為合成。信號胜肽之較佳插入位置為密碼子下游N端用來引發轉譯，及穿膜胜肽之較佳插入位置為C端，例如緊接於終止密碼子上游。此外，鏈接基胜肽可用來將信號胜肽及/或穿膜胜肽連接至聚合酶部分。
其它斥水性序列可用於本發明之上下文，諸如一般存在於包膜或膜結合蛋白質包括HBsAg。本發明之上下文中特別令人感興趣者為聚合酶部分與此處所述免疫原性域(env1、env2、env3及/或env4)中之一者或多者之融合，該等域為斥水性。一個或多個斥水性域可於框架內於N端、於C端或於聚合酶部分內部融合。
較佳於本發明之上下文，用於本發明之聚合酶部分於框架內融合至狂犬病糖蛋白之信號胜肽及穿膜胜肽。如隨附之實例章節所述，狂犬病信號序列係於該聚合酶部分之N端於框架內融合，及該狂犬病穿膜序列係於聚合酶C端於框架內融合。最佳實施例係針對一種聚合酶部分其包含、另外其主要組成為、或另外其組成為一種胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列具有至少80%相同度、優異地至少85%相同度、較佳至少90%相同度、更佳至少95%相同度、及又更佳100%相同度。
核心部分
另外或與前述組成物組合，本發明也提供包含源自於 第二HBV之核心部分之組成物。如此處關聯HBV病毒所述，用於本發明之核心部分係源自於HBV，該HBV係與聚合酶部分來源的HBV病毒相同或相異。較佳核心部分及聚合酶部分皆係源自於基因型D HBV，特別偏好Y07587 HBV單離株，或另外得自中國流行的HBV基因型(例如基因型B或C)。
根據一個實施例，本發明使用之核心部分可為天然HBV核心(例如示於SEQ ID NO：2)或改性核心，該改性核心比較相對應之天然HBV核心保有至少核心蛋白質之至少100胺基酸序列，特別偏好包含120至180胺基酸殘基，期望125至148胺基酸殘基及較佳130至143胺基酸殘基(例如約140胺基酸殘基)之核心部分。
適當改性為截頭。期望地，截頭涵蓋正常存在於天然HBV核心C端或存在於C端部分內部(亦即涵蓋最末40胺基酸殘基部分)之至少10胺基酸殘基至至多40胺基酸殘基。此種改性特別有關，原因在於本發明組成物也包含聚合酶部分因而減少或刪除聚合酶部分與核心部分間之重疊部分。也關係於此核心區內部刪除NLS(核定位信號)及/或抑制與HBV聚合酶之交互作用。熟諳技藝人士之技巧範圍內可將截頭調整於本發明組成物之所引述的至少10胺基酸殘基至至多40胺基酸殘基之範圍。適當截頭包括10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40正常存在於天然HBV核心C端或其C端部分內部之連 續胺基酸殘基。至於天然HBV核心，用於本發明上下文之核心部分較佳截頭達位在天然HBV C端或C端部分內部至少20胺基酸殘基至至多40胺基酸殘基，較佳至少30胺基酸殘基至至多38胺基酸殘基，及更佳至少34胺基酸殘基至至多37胺基酸殘基；特別偏好包括天然HBV核心最末35胺基酸殘基之截頭(換言之，截頭係自核心多肽位置149延伸至C端)。
特別關注者為一種核心部分包含一胺基酸序列，其係與自位置1延伸至約位置148之SEQ ID NO：2所示胺基酸序列部分具有至少80%相同度、優異地至少85%相同度、較佳至少90%相同度、更佳至少95%相同度、及又更佳100%相同度；及又更佳一種核心部分包含一胺基酸序列，其係與SEQ ID NO：10所示胺基酸序列部分具有至少80%相同度、優異地至少85%相同度、較佳至少90%相同度、更佳至少95%相同度、及又更佳100%相同度。
另外或此外，核心部分經修改因此比較天然HBV核心，具有辨識HBV包膜蛋白質及/或與其交互作用減低。優異地，該辨識/交互作用的減低係由位在殘基80附近內部該區的一個或多個突變所提供，預測該區形成暴露於核心粒子表面上的外環圈(Argos等人，1988，EMBO J.7：819)。辨識env蛋白質或與其交互作用的減少或消除可使用技藝界眾所周知之檢定分析執行(諸如電子顯微術、細胞內核衣殼形成之分析、於HuH7暫時性轉染後分泌的病毒粒，說明於Seitz等人，2007，EMBO J.，26：416或Ponsel等人，2003， J.Virol.77(1)：416)。
較佳修改包含自約位置75至約位置85延伸的核心該區(對應於SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：10之殘基75-85)刪除一個或多個胺基酸殘基，特別偏好刪除自約位置77延伸至約位置84之核心部分之該部分(對應於SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：10之殘基77-84)。另外，較佳核心部分包含，另外其主要組成為或另外其組成為胺基酸殘基其與SEQ ID NO：11所示胺基酸序列或與缺殘基77-84之SEQ ID NO：2所示胺基酸序列具有至少80%相同度、優異地至少85%相同度、較佳至少90%相同度、更佳至少95%相同度、及又更佳100%相同度。
Env部分
另外或組合前述組成物，本發明也提供一種包含env部分之組成物。該env部分包含存在於源自於第三HBV病毒之HBs蛋白質之至少15連續胺基酸殘基之一個或多個免疫原性域。較佳該等免疫原性域各自係與存在於天然的或改性的(例如經改性因而表示特定基因型)之HBsAg中之至少20胺基酸至至多100胺基酸部分相對應。免疫原性域各自可源自相同或相異HBV病毒，比較核心部分及聚合酶部分來源的HBV蛋白質，可相同或相異。較佳，env免疫原性域各自係源自於基因型D HBV，及特別係源自於Y07587 HBV單離株或另外，源自於中國盛行的HBV基因型(例如基因型B或C)。
較佳一個或多個免疫原性域各自包含T助手(TH)細胞 及/或胞毒性T(CTL)細胞之特異性T細胞抗原上突，其可限於各種MHC I類抗原及/或II類抗原(例如A2、A24、DR、DP等)。此等抗原上突已經於技藝界描述(WO94/03764；WO94/19011；Desombere等人，2000，Clin.Exp.Immunol 122：390；Loirat等人，2000，J.Immunol.165：4748；Schirmbeck等人，2002，J.Immunol 168：6253；Depla等人，2008，J.Virol.82：432)及熟諳技藝人士之技巧範圍內可設計此處所述之適當免疫原性域落入於包括得自天然env蛋白質(例如SEQ ID NO：3)所示之B、TH及/或CTL抗原上突所引述之15至100胺基酸殘基之範圍。較佳包含於本發明組成物或藉本發明組成物所編碼之env部分不包括任何源自於preS1及preS2區之免疫原性域。
本發明涵蓋包含一個免疫原性域之env部分以及包含二、三或多個之env部分。
期望地，用於本發明之該一個或多個免疫原性域係選自於由下列所組成之組群：○自位置14-51延伸之env蛋白質(HBsAg)部分(env 1域)；○自位置165-194延伸之env蛋白質(HBsAg)部分(env 2域)；○自位置81-106延伸之env蛋白質(HBsAg)部分(env 3域)；○自位置202-226延伸之env蛋白質(HBsAg)部分(env 4域)；及 ○其任一種組合。
特別適合用於本發明之免疫原性域包含，另外其主要組成為或另外其組成為與SEQ ID NO：12-15所示胺基酸序列具有至少80%相同度、優異地至少85%相同度、較佳至少90%相同度、更佳至少95%相同度、及又更佳100%相同度之胺基酸序列。
於本發明之上下文中，免疫原性域之組合物可呈於本發明之組成物中個別免疫原性域之混合物形式或呈任一種可能的排列兩個或多個免疫原性域間之同框架融合物形式(例如env1-env2、env2-env1、env1-env3、env3-env1、env1-env4、env4-env1、env2-env3、env3-env2、env2-env4、env4-env2、env3-env4、env4-env3、env1-env2-env3、env2-env1-env3、env1-env2-env4等之融合物或混合物)。此外，組成物可包含單一複本或數個複本(例如env1-env2-env1、env1-env4,env1等)。各個免疫原性域間之融合物可直接或透過鏈接基。
本發明上下文中特別感興趣之env部分包含SEQ ID NO：12-15所示兩個或三個免疫原性域之融合物，特別偏好env1-env2融合物包含，另外其主要組成為或另外其組成為與SEQ ID NO：16所示胺基酸序列具有至少80%相同度、優異地至少85%相同度、較佳至少90%相同度、更佳至少95%相同度、及又更佳100%相同度之胺基酸序列；或env1-env2-env4融合物包含，另外其主要組成為或另外其組成為與SEQ ID NO：17所示胺基酸序列具有至少80%相同 度、優異地至少85%相同度、較佳至少90%相同度、更佳至少95%相同度、及又更佳100%相同度之胺基酸序列。
根據特定實施例，包含於本發明組成物或藉本發明組成物編碼之聚合酶、核心及/或env部分可成對或全部一起同框架融合。例如，涵蓋聚合酶部分及env部分於單一多肽鏈之融合物。另外，core部分及env部分可於單一多肽鏈中同框架融合。此處再度編碼核酸序列可直接或透過鏈接基融合。優異地，env部分係同框架融合至核心部分或聚合酶部分之C端。
核心部分與env部分之融合多肽之較佳實例係選自於由下列所組成之組群：○一種多肽包含，或另外其主要組成為或另外其組成為與SEQ ID NO：18(core*t-env1)所示胺基酸序列具有至少80%相同度、優異地至少85%相同度、較佳至少90%相同度、更佳至少95%相同度、及又更佳100%相同度之胺基酸序列；○一種多肽包含，或另外其主要組成為或另外其組成為與SEQ ID NO：19(core*t-env1-env2)所示胺基酸序列具有至少80%相同度、優異地至少85%相同度、較佳至少90%相同度、更佳至少95%相同度、及又更佳100%相同度之胺基酸序列；及○一種多肽包含，或另外其主要組成為或另外其組成為與SEQ ID NO：20(core-env1-env2-env4)所示胺基酸序列具有至少80%相同度、優異地至少85%相同度、較佳至少 90%相同度、更佳至少95%相同度、及又更佳100%相同度之胺基酸序列，或與始於殘基1及終於殘基251之SEQ ID NO：20所示胺基酸序列部分(core-env1-env2)，或與始於殘基1及終於殘基221之SEQ ID NO：20所示胺基酸序列部分(core-env1)；或其core部分缺殘基77-84之已刪除版本。
於本發明之上下文中，本發明組成物所包含或編碼的聚合酶部分、核心部分及/或env部分可進一步包含額外修改。適當修改係有利於所得多肽之合成、處理、安定性及溶解度(例如此處所示針對修改可能裂解位置、可能糖化位置及/或膜錨定)以及有利於所得組成物之免疫原性(例如摻混或融合一種或多種可提升免疫原性之化合物)。此等可提升免疫原性之化合物已經敘述於參考文獻及包括但非限於卡瑞提庫林(calreticulin)(Cheng等人，2001，J.Clin.Invest.108：669)、結核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)熱震蛋白70(HSP70)(Chen等人，2000，癌症研究60：1035)、泛素(ubiquitin)(Rodriguez等人，1997，J.Virol.71：8497)、細菌性毒素諸如綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A之轉位域(ETA(dIII))(Hung等人，2001癌症研究61：3698)以及T助手抗原上突諸如Pan-Dr胜肽(Sidney等人，1994，免疫力1：751)、pstS1 GCG抗原上突(Vordermeier等人，1992，Eur.J.Immunol.22：2631)，破傷風類毒素胜肽P2TT(Panina-Bordignon等人，1989，Eur.J.Immunol.19：2237)及P30TT(Demotz等人，1993，Eur.J.Immunol.23：425)、流行性感冒抗原上突(Lamb等人，1982，Nature 300：66)及血球凝集素抗原上突(Rothbard等人，1989，Int. Immunol. 1:479)。
核酸分子
本發明也提供經單離之核酸分子獨立或組合編碼用於本發明之聚合酶、核心及env部分以及包含此等核酸分子之組成物。
其中特別關注者為:
○　編碼如此處所述之聚合酶部分之核酸分子，特別偏好包含SEQ ID NO:7、8、9中之任一者所示胺基酸序列或SEQ ID NO:7所示胺基酸序列具有位置494以Asp殘基取代His殘基及位置672以Glu殘基取代His殘基者；
○　編碼如此處所述核心部分之核酸分子，特別偏好包含SEQ ID NO:10或11所示胺基酸序列者；
○　編碼如此處所述env部分之核酸分子，特別偏好包含SEQ ID NO:12-17中之任一者所示胺基酸序列者；及
○　編碼如此處所述已融合核心及env部分之核酸分子，特別偏好包含SEQ ID NO:18、19或20中之任一者所示胺基酸序列，或SEQ ID NO:20所示始於殘基1而終於殘基251之胺基酸序列部分(core-env1-env2)，或SEQ ID NO:20所示始於殘基1而終於殘基221之胺基酸序列部分(core-env1)者；或缺SEQ ID NO:20核心殘基77-84之其已刪除部分。
較佳，本發明之核酸分子可經最佳化用來於特殊宿主細胞或有機體例如哺乳動物、酵母(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、龐貝酵母(Saccharomyces pombe)或巴斯多比奇酵母(Pichia pastoris))或細菌(例如大腸桿菌(E. coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)或李斯特氏菌(Listeria))提供高度表達。確實觀察到當多於一個密碼子可供用來編碼給定胺基酸時，有機體之密碼子使用樣式為高度非隨機(例如參考Wada等人，1992，核酸研究20:2111)，及密碼子之利用於不同宿主間可有顯著差異(例如參考Nakamura等人，1996，核酸研究24:214)。因本發明使用之核苷酸序列大部分為病毒性來源(HBV)，其具有不適合於宿主細胞諸如細菌細胞、低等或高等真核細胞有效表達的密碼子使用樣式。典型地，藉編碼較常用的相同胺基酸之一個或多個密碼子置換於關注的宿主細胞內部不常用的密碼子相對應之一個或多個「天然」(例如HBV)密碼子來執行密碼子的最佳化。由於即使使用部分置換也可達成表達的增高，故無需置換與不常用的密碼子相對應的全部天然密碼子。此外，嚴格遵照最佳化密碼子使用之某些偏差可配合將限剪位置導入所得核酸分子。
除了密碼子的使用最佳化之外，於宿主細胞或有機體之表達可透過核苷酸序列之額外修改而進一步改良。例如，本發明之核酸分子可經修改因而避免罕見的非最佳的密碼子簇集而存在於集中區域及/或遏止或修改至少部分負面序列元體，該等元體預期對表達程度造成負面影響。此等負面序列元體包括但非限於具有極高(大於80%)或極低(小於30%)GC含量之各區；AT-豐富或GC-豐富序列延伸部；不安定之直接或顛倒重複序列；RNA二次結構；及/或內部加密調節元體諸如內部TATA-框、π-位置、核糖體進入位置、及/或剪接施體/受體位置。本發明之另一個實施例係有關本發明之核酸分子片段，例如限剪核酸內切酶及PCR產生之片段。此等片段可用作為編碼第一多肽及/或第二多肽之免疫原性部分之探針、引子或片段。
根據本發明之較佳核酸分子係選自於由下列所組成之組群：
○　一種核酸分子包含與SEQ ID NO:21所示核苷酸序列具有至少80%相同度之核苷酸序列(編碼SEQ ID NO:7之截頭Pol)；
○　一種核酸分子包含與SEQ ID NO:22所示核苷酸序列具有至少80%相同度之核苷酸序列(編碼SEQ ID NO:8之突變Pol)；
○　一種核酸分子包含與SEQ ID NO:21所示核苷酸序列具有至少80%相同度之核苷酸序列，具有位置1480之G取代成C，位置2014之G核苷酸取代成C及位置2016之A核苷酸取代成T(編碼SEQ ID NO:7之截頭Pol具有D540H及E718H突變之取代)；
○　一種核酸分子包含與SEQ ID NO:23所示核苷酸序列具有至少80%相同度之核苷酸序列(編碼SEQ ID NO:9之截頭及突變Pol-TMR)；
○　一種核酸分子包含與SEQ ID NO:24所示核苷酸序列具有至少80%相同度之核苷酸序列(編碼SEQ ID NO:18之core*t-env1)；
○　一種核酸分子包含與SEQ ID NO:25所示核苷酸序列具有至少80%相同度之核苷酸序列(編碼SEQ ID NO:19之core*t-env1-env2)；及
○　一種核酸分子包含與SEQ ID NO:26所示核苷酸序列(編碼SEQ ID NO:20之core-env1-env2-env4)，或與SEQ ID NO:26所示始於核苷酸1而終於核苷酸753之核苷酸序列部分(編碼core-env1-env2)，或與SEQ ID NO:26所示始於核苷酸1而終於核苷酸663之核苷酸序列部分(編碼core-env1)具有至少80%相同度之核苷酸序列；或缺乏SEQ ID NO:26自位置229之G延伸至位置252之A該部分之已刪除版本(對應於核心部分殘基77-84之刪除)。
本發明之核酸分子可使用技藝界可取得之序列資料及此處提供之序列資訊生成。編碼各個HBV多肽之DNA序列可藉習知分子生物學或PCR技術而直接單離自含HBV細胞、cDNA及基因體存庫、病毒基因體或任何已知包括該等DNA序列之先前技術載體；及該編碼DNA序列可經修改(例如如此處所述)。另外，本發明之核酸分子也可於自動化程序藉化學合成生成(例如自重疊寡核苷酸組裝，例如說明於Edge，1981，自然292，756；Nambair等人，1984，科學223:1299；Jay等人，1984，J. Biol. Chem. 259:6311)。
本發明也提供包含一個或多個本發明之核酸分子之載體及包含此等載體之組成物。
多種宿主-載體系統可用於本發明之上下文包括適用於原核宿主有機體諸如細菌(例如大腸桿菌、枯草桿菌或李斯特氏菌)表達之噬菌體、質體或黏端質體載體；適用於酵母(例如釀酒酵母、龐貝酵母、巴斯多比奇酵母)表達的載體；適用於昆蟲細胞系(例如Sf9細胞)表達之病毒表達載體(例如桿病毒)；適用於植物細胞系表達之病毒或質體表達載體(例如Ti質體、花椰菜嵌紋病毒CaMV；菸草嵌紋病毒TMV)；以及適用於高等真核細胞或有機體表達之質體及病毒載體。此等載體大量敘述於參考文獻且為市面上可購得(例如史翠吉(Stratagene)、阿默山生科(Amersham Biosciences)，波米加(Promega)等)。適當質體載體之代表例包括但非限於pREP4、pCEP4(英維仇貞(Invitrogene))、pCI(波米加)、pCDM8(Seed,1987，自然329，940)及pMT2PC(Kaufman等人，1987，EMBO J. 6:187)、pVAX及pgWiz(基因治療系統公司(Gene Therapy System Inc)；Himoudi等人，2002，J. Virol. 76:12735)。大量病毒載體也可用於本發明上下文之多種病毒載體可衍生自多種不同病毒(例如反錄病毒、腺病毒、AAV、痘病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、泡沫病毒、α病毒、水泡性口炎病毒等)。
特別關注有多項經文獻明確記載用於基因移轉或重組株製造之優點的腺病毒載體(有關其綜論請參考「基因治療之腺病毒載體」，2002年，編輯D. Curiel及J. Douglas，學術出版社)。根據本發明使用之腺病毒載體可衍生自多個人類來源或動物來源(例如犬、羊、猴腺病毒等)。任一種血清型可用來特別偏好用於人腺病毒及特別偏好用於亞屬C諸如Ad2(Ad2)、5(Ad5)、6(Ad6)、亞屬B諸如11(Ad11)、34(Ad34)及35(Ad35)及亞屬D諸如19(Ad19)、24(Ad24)、48(Ad48)及49(Ad49)。也可優異地使用動物Ad特別偏好用於chimp Ad，諸如chimp Ad3(Peruzzi等人，2009，疫苗27:1293)及chimp Ad63(Dudareva等人，2009，疫苗27:3501)。所引述之腺病毒可得自美國種型培養收集會(American Type Culture Collection)(ATCC，馬里蘭州洛克維)或屬於多個公開文獻之主題，描述其序列、組織及製法，允許技藝界人士應用該等腺病毒(例如參考US 6,133,028；US 6,110,735；WO 02/40665；WO00/50573；EP 1016711；Vogels等人，2003，J. Virol. 77:8263；WO00/70071；WO02/40665；WO2004/001032；WO2004/083418；WO2004/097016；WO2005/010149)。
一個實施例中，本發明之腺病毒載體為複製缺陷。較佳複製缺陷性腺病毒載體為E1-缺陷型(例如參考US 6,136,594及US 6,013,638)，具有自約位置459至3328或自約位置459至3510延伸之E1刪除(參考揭示於基因存庫存取號碼M73260及Chroboczek等人，1992，Virol. 186:280)之人腺病毒5型序列)。選殖能力可進一步藉刪除腺病毒基因體之額外部分改良(非必需E3區或其它必需E2、E4區之全部或部分，敘述於WO94/28152；Lusky等人，1998，J. Virol 72:2022)。
本發明之核酸分子可插入腺病毒基因體之任何位置，特別偏好插入置換E1區。相對於關注區之自然轉錄方向，本發明之核酸分子可位在訊息方向或反訊息方向。
本發明之上下文中之其它適當病毒載體係衍生自痘病毒(例如參考Cox等人，「人類基因治療之病毒」編輯J. M. Hos，Carolina學術出版社)。於本發明之上下文中，痘病毒載體可得自痘病毒科之任何成員，特別為金絲雀痘病毒、禽痘病毒及牛痘病毒，以後者為佳。適當牛痘病毒包括但非限於哥本哈根(Copenhagen)種系(Goebel等人，1990，Virol.179:247及517；Johnson等人，1993，Virol. 196:381)、惠氏(Wyeth)種系及改性安卡拉(Ankara)(MVA)種系(Antoine等人，1998，Virol. 244:365)。組構重組痘病毒之一般條件為技藝界眾所周知(例如參考EP 206 920；Mayr等人，1975，感染3:6；Sutter及Moss，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10847；US 6,440,422)。本發明之核酸分子較佳係插入於痘病毒基因體的非必需位置。胸苷激酶基因特別適合插入哥本哈根牛痘載體(Hruby等人，1983，Proc. Natl. Acad. Sci USA 80:3411；Weir等人，1983，J. Virol. 46:530)及刪除II或III適合插入MVA載體(Meyer等人，1991，J. Gen. Virol. 72:1031；Sutter等人，1994，疫苗12:1032)。
本發明也涵蓋複合至脂質或聚合物之載體(例如質體DNA)而形成粒狀結構諸如微脂粒、脂肪複體(lipoplexes)或奈米粒子。此等技術為技藝界可得(例如參考Arangoa等人，2003，基因治療，10:5；Eliaz等人，2002，基因治療9:1230及Betageri等人，1993，「微脂粒藥物遞送系統」，Technomic出版公司)。
根據較佳實施例，本發明之載體包含呈適合於宿主細胞或有機體表達之本發明之核酸分子，表示該核酸分子係在適合該載體及/或宿主細胞之一種或多種調節序列的控制之下。熟諳技藝人士了解調節序列之選擇可取決於宿主細胞、期望表達程度等因素。
啟動子特別重要，可用於本發明上下文之適當啟動子包括指導核酸分子於多種類型宿主細胞表達之組成性啟動子，及指導核酸分子只有於某些宿主細胞(例如肝特異性調節序列)或回應於特定事件或外生因素(例如溫度、營養物添加、激素或其它配體)而表達之組成性啟動子。
適合用於哺乳動物細胞內組成性表達之啟動子包括但非限於細胞巨病毒(CMV)緊接早期啟動子(Boshart等人，1985，細胞41:521)、RSV啟動子、腺病毒主要晚期啟動子、磷酸甘油激酶(PGK)啟動子(Adra等人，1987，基因60:65)，及疱疹病毒(HSV)-1之胸苷激酶(TK)啟動子。牛痘病毒啟動子特別適合於痘病毒載體表達。代表性實例包括但非限於牛痘7.5K、H5R、11K7.5(Erbs等人，2008，癌症基因研究15:18)、TK、p28、p11及K1L啟動子，以及合成啟動子諸如敘述於Chakrabarti等人(1997，生物技術23:1094，關聯pSE/L啟動子)、Hammond等人(1997，病毒學方法期刊66:135)及Kumar及Boyle(1990，病毒學179:151)以及早期/晚期嵌合體啟動子。肝特異性啟動子包括但非限於下列之啟動子：HMG-CoA還原酶(Luskey,1987,Mol. Cell. Biol. 7:1881)；固醇調節元體1(SRE-1；Smith等人，1990，J. Biol. Chem. 265:2306)；白蛋白(Pinkert等人，1987，基因Dev. 1:268)；磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶(PEPCK)(Bisenberger等人，1992，Mol. Cell Biol. 12:1396)；人類C反應性蛋白(CRP)(Li等人，1990，J. Biol. Chem. 265:4136)；人類糖激酶(Tanizawa等人，1992，分子內分泌學6:1070)；膽固醇7-α水解酶(CYP-7)(Lee等人，1994，J. Biol. Chem. 269:14681)；α-1抗胰蛋白酶(Ciliberto等人，1985，細胞41:531)；仿胰島素生長因子結合蛋白(IGFBP-1)(Babajko等人，1993，Biochem Biophys. Res. Comm. 196:480)；人類轉鐵蛋白(Mendelzon等人，1990，核酸研究18:5717)；膠原蛋白I型(Houglum等人，1994，J. Clin. Invest. 94:808)及FIX(US 5,814,716)基因。
熟諳技藝人士了解控制本發明之核酸分子表達的調節元體可進一步包含用於轉錄之適當起始、調節及/或終結(例如polyA轉錄終結序列)、mRNA轉運(例如核定位信號序列)、處理(例如剪接信號)、及安定性(例如內含子及非編碼5’及3’序列)、轉譯(例如起始子Met、三聯先導子序列、核糖體結合位置、善恩-達佳莫(Shine-Dalgamo)序列等)至宿主細胞及有機體及純化步驟(例如標籤)之額外元體。
根據本發明，編碼該聚合酶部分、該核心部分及/或該env部分之本發明之核酸分子可藉相同載體或至少二載體(例如二或三個獨立載體)所攜載。如此本發明涵蓋一載體其載有編碼該聚合酶部分、該核心部分及該env部分之核酸分子以及獨立載體，各自攜載編碼該聚合酶部分、該核心部分及該env部分之核酸分子中之只有一者或二者。此等載體也係由本發明以及包含此等載體之組成物提供。當使用不同載體時，載體可得自不同來源或相同來源。例如，涵蓋得自缺陷痘病毒(例如MVA)之一個HBV部分之表達及得自另一種痘病毒載體(例如哥本哈根載體)之另二部分之表達。舉例言之，可涵蓋一種組成物包含編碼聚合酶部分之腺病毒載體及編碼核心及env部分之腺病毒載體。另外，自不同病毒載體之表達(例如自腺病毒載體之聚合酶部分之表達及自MVA之核心及/或env部分之表達，或反之亦然)也適合用於本發明之上下文，以及自質體及病毒載體之HBV部分之表達。
較佳本發明之實施例係針對選自於由下列所組成之組群中之載體：
(i)　一種MVA載體包含位在牛痘啟動子諸如7.5K啟動子控制下之核酸分子，及編碼包含如SEQ ID NO:7、8或9所示或SEQ ID NO:7具有位置494之Asp殘基取代成His殘基及位置672之Glu殘基取代成His殘基所示之胺基酸部分之聚合酶部分。較佳該核酸分子係插入MVA基因體刪除III。
(ii)　一種MVA載體包含位在牛痘啟動子諸如pH5r啟動子控制下之核酸分子，及編碼包含如SEQ ID NO:18或19所示胺基酸序列之核心部分及env部分。較佳該核酸分子係插入MVA基因體之刪除III。
(iii)　一種E1-缺陷Ad載體包含在CMV啟動子控制之下在E1區插入核酸分子，及編碼包含如SEQ ID NO:7、8或9所示，或SEQ ID NO:7所示但有位置494之Asp殘基取代成His殘基及位置672之Glu殘基取代成His殘基之胺基酸序列之聚合酶部分。
(iv)　一種E1-缺陷Ad載體包含在CMV啟動子控制下插入核酸分子替代E1區，及編碼包含SEQ ID NO:18、19或20所示或SEQ ID NO:20始於殘基1而終於殘基251之部分(core-env1-env2)或SEQ ID NO:20始於殘基1而終於殘基221之部分(core-env1)所示胺基酸部分之核心部分及env部分。
以及一種包含載體(i)及(ii)或(iii)及(iv)之組成物。
若有所需，本發明之載體或組成物可進一步包含一種或多種轉移基因，例如欲連同本發明之核酸分子於宿主細胞或有機體內表達的關注基因。期望地，轉移基因之表達對HBV感染或由HBV感染所引發的或關聯的任何疾病或病況具有治療活性或預防活性，或可提升本發明組成物之免疫原性。適當轉移基因包括但非限於一種或多種額外HBV多肽/胜肽或編碼核酸分子諸如X蛋白或其片段、免疫調節因子諸如細胞激素(例如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IFNg)、細胞激素之融合物(諸如WO2005/14642所述者)或其編碼核酸分子以及特別可用於治療肝癌之自殺基因產物或編碼核酸分子(諸如胞嘧啶去胺酶(CDase)、尿嘧啶磷酸核糖基轉移酶(UPRTase)、FCU-1基因產物(敘述於WO 99/54481)及欲用於前藥5-氟胞嘧啶(5-FC)之其衍生物(敘述於WO2006/048768))。若使用轉移基因，則可以與本發明之核酸分子中之任一者融合形式表達或在適當調節元體控制之下獨立表達。又可插入本發明載體之任何位置或插入獨立載體其可組合本發明載體或本發明組成物使用。
於另一面相，本發明提供包含本發明之核酸分子或載體之傳染性病毒粒子及包含此等傳染性病毒粒子之組成物。
典型地，此等病毒粒子係藉一種方法製備，該方法包含下列步驟：
(a)　將本發明之病毒載體導入適當細胞系，
(b)　於適當條件下培養該細胞系因而允許該傳染性病毒粒子之製造，
(c)　自該細胞系之培養回收所製造的傳染性病毒粒子，及
(d)　選擇性地純化該已回收之傳染性病毒粒子。
當病毒載體為有缺陷時，傳染性粒子通常係用在互補細胞系，或透過助手病毒的使用，其係與無功能病毒基因呈反式供應。例如，用於補償E1-刪除之腺病毒載體之適當細胞系包括293細胞(Graham等人，1997，J. Gen. Virol. 36,59-72)及HER-96及PER-C6細胞(例如Fallaux等人，1998，人類基因治療學9，1909-1917；WO97/00326)。適合繁殖痘病毒載體之細胞為禽類細胞，及最佳為自受孕雞蛋所得雞胚製備的一次雞胚纖維母細胞(CEF)。
傳染性病毒粒子可自培養上清液或溶解後的細胞回收。其可根據標準技術進一步純化(層析術、於氯化銫梯度超離心，例如敘述於WO96/27677、WO98/00524、WO98/22588、WO98/26048、WO00/40702、E1016700及WO00/50573)。
本發明也涵蓋已經修改來允許優先靶定於特定標靶細胞之載體或病毒粒子(例如參考Wickam等人，1997，J.Virol.71,8221-8229；Arnberg等人，1997，Virol.227,239-244；Michael等人，1995基因治療2，660-668；WO94/10323；WO02/96939及EP 1 146 125)。本發明之已靶定的載體及病毒粒子之特性特徵為其表面存在有可辨識及結合至細胞及表面暴露的組分諸如細胞特異性標記(HBV感染細胞)、組織特異性標記(例如肝特異性標記)、及病毒(例如HBV)抗原之配體。適當配體之實例包括針對HBV抗原域之抗體或其片段。細胞靶定可藉以基因方式將配體插入存在於病毒表面上之多肽(例如腺病毒纖維、潘騰(penton)、pIX或牛痘p14基因產物)進行。
本發明也係關於宿主細胞，其包含本發明之核酸分子載體或傳染性病毒粒子以及包含此等宿主細胞之組成物。於本發明之上下文中，宿主細胞包括原核細胞、低等真核細胞諸如酵母、及其它真核細胞諸如昆蟲細胞、植物及哺乳動物(例如人類或非人)細胞以及可互補本發明之複製缺陷載體(例如腺病毒載體)的至少一項缺陷功能之互補細胞，諸如293及PERC.6細胞。
根據本發明之特定實施例，宿主細胞可進一步經包封。細胞包封技術先前曾經說明(Tresco等人，1992，ASAIO J歐38，17-23；Aebischer等人，1996，人類基因治療7，851-860)。
本發明之又另一面相為一種採用本發明之載體、傳染性病毒粒子及/或宿主細胞製造重組聚合酶、核心及/或env部分之方法。本發明方法包含(a)將本發明載體或傳染性病毒粒子導入適當宿主細胞來製造已轉移感染或感染的宿主細胞，(b)於適合宿主細胞生長之條件下，於試管內培養該已轉移感染或已感染的宿主細胞，(c)自該細胞培養回收該聚合酶、核心及/或env部分，及(d)選擇性地，純化已回收之多肽。
預期熟諳技藝人士了解可供於適當宿主細胞製造HBV部分之多個表達系統及將載體或傳染性病毒粒子導入宿主細胞之方法。此等方法包括但非限於顯微注射(Capechi等人，1980，細胞22：479)、CaPO4媒介之轉移感染(Chen及Okayama，1987，分子細胞生物學7：2745)、DEAE-葡聚糖媒介之轉移感染、電穿孔(Chu等人，1987，核酸研究15：1311)、脂質體轉染(lipofection)/微脂粒融合物(Felgner等人，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：74113)、粒子撞擊(Yang等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：9568)、基因槍、轉導、病毒感染以及透過多個手段直接投予宿主有機體。
本發明載體可結合轉移感染試劑使用俾便協助載體導入宿主細胞，諸如多陽離子性聚合物(例如甲殼聚糖、聚甲基丙烯酸酯、PEI等)及陽離子性脂質(諸如DC-Chol/DOPE、今日得自波米加之轉移感染脂質體(transfectam lipofectin))。此外，如前文討論，重組DNA技術可用於改良於宿主細胞或有機體之核酸分子表達，例如經由使用高複本數目載體，取代或修改一個或多個轉錄調節序列(例如啟動子、增強子等)，最佳化核酸分子密碼子對宿主細胞的利用率，及遏止可能使得轉錄本不穩定化之負面序列。
本發明之宿主細胞可於習知發酵生物反應器、燒瓶及培養皿培養。培養可於適合給定宿主細胞之溫度、pH及氧含量進行。未曾試圖詳細說明已知可用於原核細胞及真核細胞製造蛋白質之多種方法之細節。
HBV部分可藉眾所周知之純化方法純化，包括硫酸銨沈澱、酸萃取、凝膠電泳；過濾及層析方法(例如反相、尺寸排除、離子交換、親和力、磷酸纖維素、斥水性-交互作用、羥磷灰石、或高效能液相層析術。)使用之條件及技術取決於多項因素諸如淨電荷、分子量、斥水性、親水性且為熟諳技藝人士顯然易知。此外，純化度將取決於期望用途。
於另一面相，本發明提供一種組成物包含本發明之聚合酶、核心及/或env部分、編碼核酸分子、載體、傳染性病毒粒子、或宿主細胞中之至少一者(此處也稱作「活性劑」)或其任一種組合(例如編碼此處所述多種HBV多肽之多肽或載體/病毒粒子之組合物或不同基因型之組合物)。較佳該組成物為藥學組成物，其除了治療上有效量之活性劑之外也包含藥學上可接受之載媒劑。
本發明之組成物適合包含適合人類或動物使用之稀釋劑。稀釋劑較佳為等張性、低張性或微弱高張性及具有相對低的離子強度。代表性實例包括無菌水、生理食鹽水(例如氯化鈉)、林格氏溶液、葡萄糖、海藻糖或蔗糖溶液、漢克氏溶液、及其它水性生理平衡鹽溶液(例如參考雷明頓：製藥科學及實務，A. Gennaro，Lippincott，Williams ＆ Wilkins之最新版本)。本發明組成物適合經緩衝俾適合以生理pH或微鹼性pH(例如自約pH 7至約pH 9)用於人體。適當緩衝劑包括但非限於磷酸鹽緩衝劑(例如PBS)、碳酸氫鹽緩衝劑及/或Tris緩衝劑。
組成物也含有其它用以提供適當藥學或藥效學性質之藥學上可接受之賦形劑，包括例如修改或維持pH、滲透度、黏度、澄清度、色彩、無菌度、安定性、調配物之溶解速率、修改或維持釋放或吸收入人體或動物體、促進跨血液障壁的轉運或滲透入特定器官(例如肝臟)。適當賦形劑包括胺基酸。
含括於本發明組成物之藥學上可接受之載媒劑必須也允許於製造條件下及長期儲存(亦即至少1個月)於冷凍(例如-70℃、-20℃)、冷藏(例如4℃)或周圍溫度保有其安定性。就此方面而言，特別適用於本發明組成物之調配物包括：
○　1 M蔗糖，150 mM NaCl，1 mM MgCl2，54 mg/l吐溫(Tween) 80，10 mM Tris pH 8.5(特別活性劑為腺病毒載體時)，及
○　10毫克/毫升甘露糖醇，1毫克/毫升HSA，20 mM Tris，pH 7.2，及150 mM NaCl
○　生理食鹽水
此外，本發明組成物可包含適合於人體供系統性或黏膜應用之輔劑。較佳，輔劑可刺激對本發明組成物之免疫力，特別為例如透過類鐸受體(toll-like receptors)(TLR)諸如TLR-7、TLR-8及TLR-9媒介之T細胞媒介的免疫力。有用的輔劑之代表性實例包括但非限於礬土、礦油乳液諸如芙蘭茲(Freunds)完全及不完全(IFA)、脂多醣或其衍生物(Ribi等人，1986，細菌性內毒素之免疫原性及免疫藥理學，Plenum Publ.Corp.,NY,p407-419)、皂素類諸如QS21(Sumino等人，1998，J.Virol.72：4931；WO 98/56415)、咪唑-喹啉化合物諸如咪喹莫特(Imiquimod)(Suader,2000,J.Am Acad Dermatol.43：S6)、S-27609(Smorlesi,2005，基因治療12：1324)及相關化合物諸如WO2007/147529所述者、胞嘧啶磷酸鳥苷寡去氧核苷酸類諸如CpG(Chu等人，1997，J.Exp.Med.186：1623；Tritel等人，2003，J.Immunol.171：2358)及陽離子性胜肽諸如IC-31(Kritsch等人，2005，J.Chromatogr Anal.Technol Biomed生命科學822：263)。
本發明組成物適合用於多項投藥模式包括系統性、局部及侷限性投藥。注射可藉任一種手段進行例如皮下、皮內、肌肉、靜脈、腹內、腫瘤內、血管內、動脈內注射，或直接注射入動脈(例如藉肝動脈輸注)或靜脈進給肝臟(例如注射肝門靜脈)。注射可使用習知針筒及針頭或或技藝界可得之任何其它適當裝置進行。另外，本發明之組成物可透過黏膜途徑諸如口服/營養、鼻內、氣管內、肺內、陰道內或直腸內途徑投予。呼吸道投藥可透過小滴之霧化或噴 霧、噴霧劑或使用加壓容器之乾粉組成物(例如使用適當推進劑諸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮氣等)或於非加壓配送器進行。局部投藥也可使用經皮裝置(例如貼片等)進行。於本發明之上下文中，較佳組成物係調配供肌肉及皮下途徑投予。
本發明組成物可呈多種形式，例如固體、液體或冷凍。固體(例如乾粉或凍乾)組成物可藉一種涉及真空乾燥及凍乾之方法獲得。用於黏膜投藥，組成物調配成耐胃酸膠囊劑及顆粒劑用於口服投予，栓劑用於直腸或陰道投予，最終組合可用來增加黏膜孔隙大小之吸收促進劑。此等吸收促進劑典型為具有結構類似於黏膜之磷脂域，諸如去氧膽酸鈉、糖膽酸鈉、二甲基-β-環糊精、月桂基-1-溶磷脂膽鹼。
適當劑量可依各項參數之函數變化，特別投藥模式；採用之組成；宿主有基體之年齡、健康狀況、及重量；症狀之本質及程度；伴隨處理之類別；處理頻率；及/或預防或治療需要。測定適當治療劑量所需計算之進一步微調例行性可由執行業務人士鑑於相關狀況決定。至於一般原則，包含病毒組成物之適當劑量依據所使用之載體及定量技術而定，自約105變化至約1013vp(病毒粒子)、iu(感染單位)或pfu(溶菌斑形成單位)。可用於評估存在於樣本之vp、iu及pfu之數量技術為技藝界所習知。例如，腺病毒粒子數目(vp)通常係經由測量A260吸光比決定，iu力價係藉測量定量DBP免疫螢光測定，及pfu係經由於許可細胞感染後經由計數溶菌斑數目決定。較佳根據FDA指導原則vp/iu比係低於100。對以MVA為主之組成物以自約5x105至約109 pfu之劑量為佳，特佳為約107、約5x107、約108或約5x108 pfu之劑量。有關以Ad為主之組成物，較佳劑量含有自約106至約1012 vp，特佳劑量為約109，約5x109、約1010、約5x1010 vp或約1011 vp。基於載體質體之組成物可以10微克至20毫克，較佳100微克至2毫克之劑量投予。蛋白質組成物可以10微克至20毫克間之一劑或多劑投予，特佳為自約0.1微克至約2毫克治療性蛋白質/千克體重。投予可以單劑進行或於某個時間間隔後重複投予一次或數次。
本發明組成物可用於治療多種疾病及病理狀況，特別為由HBV感染所引起的或相關的疾病及病況。如此處使用「處理」或「治療」等詞涵蓋預防及/或治療。特別可用於治療HBV感染病人之HBV慢性感染及/或肝病灶，包括肝硬化及肝癌。較佳當根據此處所述模型導入宿主有機體時，本發明組成物對所治療的宿主比較治療前提供療效。療效可藉多種方式證實，例如於感染個體之血液、血漿、血清或肝臟檢測得HBV病毒負載量減少，及/或藉檢測抗HBV免疫反應(例如抗HBV抗體的製造及/或T細胞媒介之免疫力)或藉與HBV感染相關症狀之延遲(例如肝硬化或肝癌發展延遲)，或藉典型與HBV感染相關聯之肝發炎/脂肪變性/纖維化病況的減少，或藉個體對習知療法之反應改善。
如此，本發明也涵蓋根據此處所述模型，本發明之HBV部分、核酸分子、載體、傳染性病毒粒子、宿主細胞或組成物中之至少一者用於製備意圖用於治療或預防HBV感染、HBV相關疾病及病理狀況之藥物之用途。
本發明也提供一種用於HBV感染特別為慢性HBV感染、HBV相關聯疾病及病理狀況之治療或預防之方法，包含對有需要之人類或動物有機體投予治療上有效量之本發明之HBV部分、核酸分子、載體、傳染性病毒粒子、宿主細胞或組成物中之至少一者。
本發明之方法及用途包含一劑或多劑投予(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)治療上有效量之活性成分，投予彼此分開適當時間，係藉相同投藥途徑或藉不同投藥途徑(例如肌肉途徑及皮下途徑)，於相同位置或於不同位置進行。彼此分隔3日至10日之三劑投藥(例如3劑每週投藥)特別適合用於以MVA為主之組成物及載體。第一系列投藥接著為使用相同活性劑之一劑或多劑隨後投予，可進行一個月或數月，因而喚起藉3劑連續投予所打底的抗HBV免疫反應。至於以Ad為主之組成物及載體，較佳方法或用途包括投予一劑，最終接著於一個月及六個月後投予追加一劑或二劑。
若有所需，本發明之方法及用途可組合一種或多種習知治療模型(放射線治療、化學治療及/或手術)。使用多種治療辦法對病人提供更寬廣的介入。一個實施例中，本發明方法之前或之後可接著手術介入。於另一個實施例中，其前方或後方可藉著輻射治療(例如γ輻射)。熟諳技藝人士容易調配有用之適當輻射治療方案及參數(例如參考Perez及Brady等人，1992，輻射腫瘤學之原理及實務，第2版，JB Lippincott Co；使用如熟諳技藝人士顯然易知之適當調整及修改)。
又另一實施例中，本發明之方法及用途係關聯使用習知用於治療或預防HBV感染、HBV相關疾病及病理狀況之一種或多種HBV藥物之化學治療。其投藥可在用於本發明之活性劑投予之前、同時或之後進行。HBV藥物之代表例包括但非限於聚合酶抑制劑、RNase H抑制劑、核苷類似物、核苷酸類似物、TLR促效劑、N-糖化抑制劑、siRNA、反訊息寡核苷酸、抗HBV抗體、免疫調節因子、治療性疫苗及通常用於HBV相關肝癌治療之抗腫瘤劑(例如阿利亞黴素(adriamycin)、帶有里匹歐朵(lipiodol)之阿利亞麥辛(adriamicin)或索拉喜尼(sorasenib))。適當治療性疫苗之實例包括但非限於重組抗原、VLP、特別適合用於觸發抗HBV體液反應之基於或編碼HBV蛋白質之載體或合成胜肽(Core、preS1、preS2、S及/或聚合酶)。此等HBV藥物可以單劑提供，或另外根據標準方案、劑量及計畫經歷數小時、數日及/或數週時間以多劑提供。根據本發明之特別適合之方法及用途係組合標準照護，其可於本發明之方法或用途之前、同時或之後進行。雖然此等照護標準係因病人而異，但通常包含使用細胞激素(例如IFNa、PEG化IFNa2)及/或使用核苷酸類似物或核苷類似物諸如拉美夫定、安提卡芙、特比夫定、阿迪佛芙、底匹佛席(dipivoxil)或特諾佛芙治療。
於另一個實施例中，本發明之方法或用途可根據打底追加治療模型進行，包含循序投予一種或多種打底組成物 及一種或多種追加組成物。典型地，打底組成物及追加組成物係使用不同載媒劑，其包含或編碼至少一種共通的抗原性域。此外，打底組成物及追加組成物可藉相同投予途徑或藉不同投予途徑於相同位置或不同位置投予。舉例言之，以多肽為主之組成物可藉黏膜途徑投予，而以載體為主之組成物較佳係藉注射投予，例如MVA載體藉皮下注射，DNA質體藉肌肉注射及腺病毒載體藉皮下注射或肌肉注射。
本發明也提供一種於宿主有機體誘導或刺激抗HBV免疫反應之方法，包含對該有機體投予本發明之HBV部分、核酸分子、載體、傳染性病毒粒子、宿主細胞或組成物中之至少一者，因而誘導或刺激該免疫反應。免疫反應可為特異性及/或非特異性，體液性及/或細胞性，於本上下文中，可為CD4+媒介或CD8+媒介或二者，免疫反應較佳為針對HBV抗原之T細胞反應。
當投予動物或人類有機體時誘導或刺激抗HBV免疫反應之本發明方法之能力可使用多種技藝界標準檢定分析於試管試驗或活體試驗評估。有關評估免疫反應起點及活化之技術之一般敘述例如參考Coligan等人(1992及1994，免疫學之現行方案；編者約翰威利父子公司，美國國家衛生院)。細胞性免疫力之測量可藉下述方式進行：藉測量由已活化之效應物細胞所分泌之細胞激素側寫資料，包括衍生自CD4+ T細胞及CD8+ T細胞者(例如藉ELIspot定量IL-10或IFNg-製造性細胞)；藉測定免疫效應物細胞之活化狀況(例如藉傳統[3H]胸腺嘧啶之吸收進行T細胞增殖檢定分析)；藉檢定分析敏化個體之抗原特異性T淋巴細胞(例如於胞毒性檢定分析中之胜肽特異性溶解)。刺激體液反應之能力可藉抗體結合及/或競爭而測定(例如參考Harlow，1989，抗體，冷泉港出版社)。本發明方法也可進一步於使用適當傳染劑或腫瘤誘導劑(例如牛痘病毒或表達HBV基因產物之李斯特氏菌單胞基因細菌)挑戰而於動物研究模型中進一步證實來測定傳染劑或腫瘤誘導劑之中和，及最終對相關聯症狀之部分抗性，反應抗HBV免疫反應之誘導或增強。本發明組成物之測試及驗證也於隨附之實例章節舉例說明。
於另一面相，本發明提供一種用於根據此處所述模型治療或預防HBV感染包括慢性HBV感染、HBV相關疾病及病理狀況特別係用於感染HBV個體誘導或產生免疫反應之套件組，其中該套件組包含選自於由此處所述HBV部分、核酸分子、載體、傳染性病毒粒子、宿主細胞及組成物所組成之組群之多種活性劑。期望多種活性劑係以分開多肽或分開載體形式提供，及各種活性劑之投予可藉相同或不同投藥途徑及於相同位置(或緊密附近)或不同位置及使用相同劑量或不同劑量同時(相同時間)或分開(於某個時間間隔後循序)進行。
本發明特別關注一種套件組包含第一載體其包含編碼如此處定義之聚合酶部分之核酸分子及第二載體其包含如此處定義之編碼核心部分及/或env部分之核酸分子。
根據較佳實施例，該第一載體為一種MVA載體其包含在牛痘啟動子諸如7.5K啟動子控制下之核酸分子，及編碼包含如SEQ ID NO:7、8或9所示胺基酸序列或SEQ ID NO:7帶有位置494之Asp殘基取代成His殘基及位置672之Glu殘基取代成His殘基之胺基酸序列之聚合酶部分；及該第二載體為一種MVA載體其包含位在牛痘啟動子諸如pH5r啟動子控制之下之核酸分子及編碼包含如SEQ ID NO:18或19所示之核心部分及env部分。
根據另一較佳實施例，該第一載體為腺病毒載體其包含位在適當啟動子諸如CMV啟動子控制下之核酸分子及編碼聚合酶部分其包含如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:7帶有位置494之Asp殘基取代成His殘基及位置672之Glu殘基取代成His殘基所示胺基酸序列；及該第二載體為一種腺病毒載體包含位在適當啟動子諸如CMV啟動子控制之下之核酸分子，及編碼SEQ ID NO:18、19或20或SEQ ID NO:20始於殘基1及終於殘基251部分(core-env1-env2)或SEQ ID NO:20始於殘基1而終於殘基221部分(core-env1)所示胺基酸序列。
本發明之套件組進一步包含表達如前文定義之免疫調節因子之第三載體。用於舉例說明目的，包含於套件組之各種活性成分之較佳劑量係與前文就本發明組成物所述約略相等，特佳對痘病毒載體或MVA載體為5x105至109 pfu及對各種腺病毒載體自約106至約1012 vp。
本發明也提供用於本發明選擇性結合至HBV部分之抗體或其胜肽片段。如此處使用，抗體當結合至標靶胜肽時選擇性結合標靶胜肽而未顯著結合至不相關蛋白質。某些情況下，須了解結合至胜肽之抗體儘管可能有某種程度之交叉反應性但仍然具有選擇性。雖言如此，較佳本發明抗體並未以高度親和力或高度選擇性結合至HBV天然蛋白質。
如此處使用，抗體係與技藝界認知者符合一致定義。本發明抗體包括多株抗體及單株抗體，及此等抗體片段，包括但非限於Fab或F(ab’).sub.2及Fv片段。本發明抗體可使用技藝界習知技術製造，例如對動物體投予有效量之此處所述HBV部分中之任一者及/或其胜肽片段製造。抗體較佳係製自包含獨特序列之HBV部分之各區或分開片段，諸如針對導入天然HBV蛋白質之如此處所述改性序列。
本發明抗體具有落入於本發明範圍內之多項可能用途。例如，此等抗體可使用(a)於檢定分析用作為檢測本發明之第一或第二多肽之試劑，(b)於檢定分析用作為檢測生物樣本中HBV病毒之存在之試劑，及/或(c)用作為自蛋白質與其它污染物之混合物回收重組製造之HBV部分之工具(例如允許藉親和層析術或自培養的宿主細胞進行免疫沈澱而純化)。
本發明亦係關於使用本發明之HBV部分、核酸分子、載體、傳染性病毒粒子、宿主細胞或組成物中之至少一者，於取自於對由該HBV病毒所感染個體之生物樣本(例如血漿、血清、組織)中檢測及/或定量HBV病毒或抗HBV抗體之方法。
一個實施例中，該方法特別適合用於檢測及/或定量生物樣本之HBV病毒，及包含下述步驟，於允許病毒與抗體間之複體形成的條件下，將該生物樣本與本發明抗體中之至少一者接觸，及藉適當手段檢測及/或定量該複體的形成。
於另一個實施例中，該方法特別適合用於檢測及/或定量生物樣本中之抗HBV抗體，及包含於允許該抗HBV抗體與本發明之HBV部分、核酸分子、載體、傳染性病毒粒子、宿主細胞或組成物間之複體形成之條件下，將該生物樣本接觸本發明之HBV部分、核酸分子、載體、傳染性病毒粒子、宿主細胞或組成物中之至少一者，及藉任一種適當手段檢測及/或定量複體的形成。
熟諳技藝人士容易測定欲用於本發明方法之抗體、HBV部分、核酸分子、載體、傳染性病毒粒子、宿主細胞、組成物之數量。檢測及/或定量病毒之手段為例行性且為熟諳技藝人士眾所周知。舉例言之，值得一提者為墨點法、ELISA、所謂之三明治技術、競爭技術、及PCR技術，特別所謂之「即時」技術。本發明之抗體、HBV部分、核酸分子、載體、傳染性病毒粒子、宿主細胞、或組成物用作為試劑可藉偶合(亦即物理性鏈接)可檢測物質協助。可檢測物質之實例包括多種酶(例如辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶)、假體群(例如鏈絲菌抗生物素/生物素、或抗生物素/生物素)、螢光物質(例如繖形硐、螢光素、或螢光素衍生物)、發光物質、生物發光物質(例如蟲螢光素酶、蟲螢光素或水產螢光素(aequorin))，及放射性物質(例如125I、131I、35S、或3H)。
最後，本發明係關於本發明之HBV部分、核酸分子、載體、傳染性病毒粒子、宿主細胞或組成物中之至少一者用於試管內診斷生物樣本之HBV感染。
已經以舉例說明方式描述本發明，但須了解所使用之術語意圖用作為字面描述性質而非限制性。顯然，鑑於前文教示本發明之多項修改及變化為可能。因此須了解於隨附之申請專利範圍內，本發明可以此處特別說明者不同之方式實施。
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圖式簡單說明
第1A-B圖顯示自腺病毒及MVA感染細胞之HBV多肽表達。A549細胞或雞胚纖維母細胞以MOI 10或50感染腺病毒或MOI 0.2或1感染MVA及感染後48小時細胞溶解。然後使用得自感染各種Ad(第1A圖)及MVA(第1B圖)組構體之細胞所得細胞溶解產物來檢測特異性HBV蛋白質。使用抗核心抗體(C1-5或13A9，稀釋度1/200)及帶有抗Pol抗體之含聚合酶多肽(8D5，稀釋度1/200)作為一次抗體檢測含核心多肽，及二次抗體係偶合至HRP。藉Ad TG17909及Ad TG17910表達之蛋白質之期望大小分別為31.6kDa及88.5kDa。藉MVA TG17971、MVA TG17972、MVA TG17993及MVA TG17994表達之蛋白質之期望大小分別為20.2kDa、15.8kDa、20kDa、及23.5kDa。藉MVA TG17842及MVA TG17843表達之蛋白質之期望大小分別為88.5kDa及98.2kDa。
第2A-C圖顯示於Elispots IFNγ檢定分析中藉腺病毒編碼之HBV多肽之免疫原性。五頭小鼠(HLA-A2轉殖基因小鼠)使用Ad TG17909單獨(黑柱)、Ad TG17910單獨(白柱)或組合(Ad TG17909+Ad TG17910)(灰柱)免疫接種一次。第2A圖顯示使用HLA-A2限剪胜肽SLY(SEQ ID NO：55)或不相關者(圖中未顯示)靶定於聚合酶蛋白質之特異性T細胞反應。第2B圖顯示使用HLA-A2限剪胜肽FLP(SEQ ID NO：56)或ILC(SEQ ID NO：57)靶定於核心蛋白質之特異性T細胞反應。第2C圖顯示使用HLA-A2限剪胜肽VLQ(SEQ ID NO：58)、FLG(SEQ ID NO：59)或GLS(SEQ ID NO：60)靶定於Env域之特異性T細胞反應。各柱表示個別免疫接種小鼠，陰影柱表示各組之中值。結果顯示為得自三個重複孔對106脾細胞觀察得之點數平均值。若點數高於50點/106細胞，則反應視為陽性(此節點以粗黑線表示)。
第3A-C圖顯示於胞內細胞激素染色檢定分析中藉腺病毒載體所編碼之HBV多肽之免疫原性。五頭個別小鼠(HLA-A2轉殖基因小鼠)以AdTG17909(第3B圖)、AdTG17910(第3A圖)或AdTG17909與AdTG17910之組合物 (第3C圖)免疫接種一次。脾細胞與高爾基塞(Golgi-Plug)及於各種HLA-A2限剪胜肽(SLY用於Pol、FLP、ILC用於Core，VLQ、FLG及GLS用於Env)或不相關者存在下培養5小時。各種HLA-A2限剪抗原上突之特異性CD8+細胞製造細胞激素(IFNg及/或TNFa)之百分比係藉ICS檢定分析評估。各柱表示個別免疫接種小鼠，IFNg製造性細胞以黑柱表示，TNFa製造性細胞以白柱表示及IFNg+TNFa製造性細胞以影線柱表示，及對各頭小鼠堆積全部此等細胞族群。
第4A-C圖顯示藉腺病毒載體編碼之HBV多肽誘導CD8及CD4 T細胞反應之能力，係藉胞內細胞激素染色檢定分析檢測。五頭個別小鼠(HLA-A2轉殖基因小鼠)使用AdTG17909與AdTG17910之混合物免疫接種一次。脾細胞與高爾基塞及於各種HLA-A2限剪胜肽(SLY用於Pol、FLP、ILC用於Core，VLQ、FLG及GLS用於Env)或涵蓋整個抗原性域之重疊胜肽匯集物(11個胺基酸重疊15aa，Core有2胜肽匯集物及Env有2胜肽匯集物)或不相關胜肽存在下培養5小時。感應的CD8 T細胞製造IFNγ及/或TNFα(第4A圖)及感應的特異性CD4 T細胞製造IFNγ及/或TNFα(第4B圖)或製造IFNγ及/或IL2(第4C圖)係藉ICS檢定分析監視。各柱表示個別免疫接種小鼠，IFNg製造性細胞以灰柱表示，TNFa或IL2製造性細胞以白柱表示及IFNg+TNFa或IFNg+IL2製造性細胞以影線柱表示，各頭小鼠之全部此等細胞族群堆積。也顯示各組之中值。
第5A-B圖顯示編碼HBV多肽之腺病毒載體誘導抗載荷 有HBV HLA-A2限剪抗原上突之標靶細胞的活體內功能性細胞溶解。三頭小鼠(HLA-A2轉殖基因小鼠)各自以AdTG17909與AdTG17910之組合物免疫接種一次(M1至M3)及一頭小鼠以空白腺病毒載體免疫接種一次作為陰性對照(M0)。得自同型基因小鼠載荷HBV HLA-A2抗原上突或否(陰性對照)之經CFSE染色之脾細胞靜脈注射免疫接種小鼠。染色細胞之活體內溶解係於流量細胞計量術後24小時對各頭小鼠評估，及如材料及方法章節之指示計算。對3頭以AdHBV免疫接種之小鼠對各胜肽觀察得之特異性溶解平均值經求出及顯示(平均M1-M3)。
第6A-B圖顯示藉Elispots IFNγ檢定分析測定之由MVA載體所編碼之HBV多肽之免疫原性。以1週間隔使用MVATG17842或MVATG17843(第6A圖)或MVATG17971(第6B圖)或MVATG17972或陰性對照MVA TGN33.1(資料未顯示)免疫接種個別小鼠(HLA-A2轉殖基因小鼠)三次。第6A圖顯示使用HLA-A2限剪胜肽SLY(SEQ ID NO：55)、涵蓋聚合酶蛋白質C端部分之胜肽匯集物8(重疊11胺基酸/匯集物之15胺基酸之25胜肽)、不相關胜肽或介質(陰性對照)，以MVA TG17842(深灰柱)或MVATG17843(淺灰柱)免疫接種後靶定聚合酶蛋白質之特異性T細胞反應。第6B圖顯示使用HLA-A2限剪胜肽FLP(SEQ ID NO：56)、ILC(SEQ ID NO：57)、胜肽匯集物「核心1及核心2」(21至22個15胺基酸胜肽重疊11胺基酸/匯集物)、不相關胜肽或介質(陰性對照)，以MVA TG17971免疫接種後靶定於核心蛋白質之特異 性T細胞反應。各柱表示個別免疫接種小鼠及影線柱表示各組之平均。結果顯示為得自重複三個孔對106脾細胞觀察得之點數平均值。若點數高於50點/106細胞則反應視為陽性(此截線以虛黑線表示)。
第7A-C圖顯示於小鼠共同注射由MVA載體所編碼之HBV多肽之免疫原性，藉Elispots IFNγ檢定分析測定。個別小鼠(HLA-A2轉殖基因小鼠)使用MVATG17843與MVATG17972(第7A圖)或MVATG17993(第7B圖)或MVATG17994(第7C圖)之混合物或單獨使用MVA TG N33.1作為陰性對照(資料未顯示)以一週間隔免疫接種三次。靶定於聚合酶蛋白質之特異性T細胞反應係使用HLA-A2限剪胜肽SLY(SEQ ID NO：55)測定；及靶定於Env域之特異性T細胞反應係使用HLA-A2限剪胜肽GLS(SEQ ID NO：60)或涵蓋Env2域之胜肽匯集物(長15胺基酸之胜肽重疊11胺基酸之匯集物)測定。不相關胜肽及介質用作為陰性對照。各柱表示個別免疫接種小鼠及影線柱表示各組之平均。結果顯示為自重複三孔對106脾細胞所得點數之平均值。若點數係高於92點/106細胞則反應視為陽性(此截線以虛黑線表示)。
實例 1. 材料及方法
後文描述之組構係根據詳細說明於Maniatis等人(1989年，實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社，紐約州冷泉港)之一般經基因工程改造及分子選殖技術進行，或當使用商業 套件組時根據製造商之推薦進行。PCR擴增技術為熟諳技藝人士已知(例如參考PCR方案-方法及應用指南，1990年，Innis、Gelfand、Sninsky及White公告，學術出版社)。載有安比西林(ampicillin)抗藥性基因之重組質體係於補充100微克/毫升抗生素之瓊脂或液體培養基上，於大腸桿菌C600(史翠吉)複製。重組牛痘病毒之組構係根據前文引述之參考文獻及Mackett等人(1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79，7415-7419)及Mackett等人(1984，J.Virol.49，857-864)該技術領域之習知技術進行。大腸桿菌(Falkner及Moss，1988，J.Virol.62，1849-1854)之選擇基因gpt(黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶)用來協助重組牛痘病毒的選擇。
1.1. 載體之組構及製造 1.1.1. 所選擇之抗原及HBV序列種系
後文舉例說明之載體經過基因改造來表達包膜蛋白質之聚合酶多肽、核心多肽及免疫原性域。全部係源自於HBV種系Y07587，該序列係說明於國際資料庫(基因庫Y07587)及不同公開文獻。此乃血清型ayw之基因型D病毒。
核心多肽為野生型(aa 1-183)或刪除胺基酸77至84之核心多肽(亦即含有標示為核心*之胺基酸1至76及85至183之核心)或C端截頭多肽(1-148)或進一步刪除胺基酸77至84之C端截頭核心(1-148)(亦即含有標示為核心*t之胺基酸1至76及85至148之核心)。
聚合酶多肽為野生型或缺頭47胺基酸(48-832)或N截頭 聚合酶(48-832)之N端截頭多肽，其進一步於位置540(D於H)及718(E於H)突變(位置450及718分別係就野生型聚合酶給定)或截頭(48-832)及突變聚合酶(D540H及E718H)，其係融合至狂犬病病毒糖蛋白(Pol*TMR)之胜肽信號及穿膜域。
所選Env域為：S蛋白質之胺基酸14至51之域(Env 1)，及HBs蛋白質之胺基酸165至194之域(Env 2)，及HBs蛋白質之胺基酸202至226之域(Env 4)。
1.1.2. 表達截頭及突變HBV聚合酶(Pol*)之MVATG17842之組構及製造
編碼已改性的HBV聚合酶多肽之核苷酸序列係由吉納(Geneart)公司使用合成寡核苷酸及PCR產物合成。已改性的HBV聚合酶係與於位置540(D於H)及位置718(E於H)突變之HBV Y07587(SEQ ID NO：1)之聚合酶蛋白質相對應，俾便消除由天然HBV聚合酶所具有之Rnase H及RTase活性(導致SEQ ID NO：8所示胺基酸序列及SEQ ID NO：22所示核苷酸序列)。然後重新組裝之Pol序列於質體載體選殖，獲得PGA15-pol(SEQ ID NO：27)。存在於天然HBV聚合酶N端之頭47胺基酸刪除之截頭版本使用下列引子OTG19037(GAGCGATATCCACCATGAATGTTAGTATTCC-TTGGAC)(SEQ ID NO：28)及OTG19038(GATCGCTAGC-TCACGGTGGTCTCCATGCGAC)(SEQ ID NO：29)自pGA15-Pol質體藉PCR擴增。所得片段插入p7.5K啟動子下 游MVA轉移質體之NheI及EcoRV限剪位置(Cochran等人，1985，J.Virol.54：30)，結果獲得pTG17842。已突變且已截頭的聚合酶於後文標示為pol*。
設計MVA轉移質體來允許將核苷酸序列插入於藉同源組合刪除MVA基因體之III而轉移。MVA轉移質體係源自於質體pTG1E(描述於Braun等人，2000，基因治療學7：1447)，其中選殖環繞MVA刪除III(Sutter及Moss，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10847)之旁出序列(BRG3及BRD3)。轉移質體也含在早期晚期牛痘病毒合成啟動子p11K7.5(由洛桑大學，R.Wittek盛情提供)控制下，維多利亞水母(Aequorea victoria)加強的綠螢光蛋白質(eGFP基因，單離自pEGP-C1，克隆泰(Clontech))及大腸桿菌黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(gpt基因)間之融合。黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶之合成允許GPT+重組MVA於含有黴酚酸、黃嘌呤及次黃嘌呤之選擇性培養基內形成溶菌斑(Falkner等人，1988，J.Virol.62，1849-54)；及eGFP允許重組MVA溶菌斑變成可見。選擇標記eGFP-GPT係置於同向的二同源序列間。當達成選殖純株選擇時，選擇標記容易藉未經選擇之數代若干繼代培養去除，允許eGFP-GPT重組MVA之生長。
MVATG17842病毒之生成係經由於感染MVA且以pTG17842轉感染(根據標準磷酸鈣DNA沉澱)之一次雞胚纖維母細胞(CEF)進行同源重組而生成。病毒之選擇係藉於含黴酚酸、黃嘌呤及次黃嘌呤之選擇性培養基存在下，藉三 回合溶菌斑純化執行。如前文說明，然後選擇標記經由於非選擇性培養基繼代培養消除。藉PCR證實不存在有親代MVA的污染。
HBV聚合酶之表達分析係藉西方墨點法進行。A549細胞(ATCC CCL-185)於有或無蛋白體抑制劑MG-132(10μM)添加至生長培養基存在下，於MOI=1以MVATG17842(Pol*)感染。經24小時後收穫細胞。西方墨點分析係使用市售單株抗Pol抗體Hep B Pol(8D5，聖塔克魯茲，# sc-81591)進行。
1.1.3. 表達已截頭且已突變HBV聚合酶之MVATG17843融合至狂犬病包膜糖蛋白之膜錨定域之組構及製造
然後HBV Pol*序列之N端融合至胜肽信號(SS)，及C端融合至衍生自狂犬病病毒糖蛋白(ERA單離株；描述於基因庫號碼M38452)之膜錨定序列(TMR)。SS序列及TMR序列係分別使用引子對OTG19045(SEQ ID NO：30)(GAGT GATATC CACCATGGTTCCTCAGGCTCTCCTG)/OTG19047(SEQ ID NO：31)(GTCCAAGGAATACTAACA-TTAATAGGGAATTTCCCAAAACACAATG)及OTG19049(SEQ ID NO：32)(GTCGCATGGAGACCACCGTATGTATT-ACTGAGTGCAGGG/OTG19050(SEQ ID NO：33)(GAGT GCTAGC TCACAGTCTGGTCTCACCC)藉PCR自質體pTG8042(說明於WO99/03885)擴增。Pol*序列係使用引子對OTG19046(SEQ ID NO：34)(GTTTTGGGAAATTCCCT-ATTAATGTTAGTATTCCTTGGACTA)/OTG19048(SEQ ID NO：35)(CTGCACTCAGTAATACATACGGTGGTCTCCAT- GCGACGTGC)藉PCR自質體pGA15-Pol擴增。然後SS-Pol*-TMR序列係使用下列引子OTG19045(SEQ ID NO：30)及OTG19050(SEQ ID NO：33)藉三重PCR重新組裝。所得片段插入p7.5K啟動子下游之牛痘轉移質體的NheI及EcoRV限剪位置(Cochran等人，1985，J.Virol.54：30)，結果獲得pTG17843。
MVATG17843病毒之生成係經由前文說明之同源重組於CEF進行。
Pol*-TMR表達之分析係藉西方墨點法進行。於有或無蛋白體抑制劑MG-132(10μM)添加至生長培養基存在下，A549細胞使用MVATG17843於MOI 1感染。24小時後收穫細胞。西方墨點分析係使用市售單株抗Pol抗體Hep B Pol(8D5，聖塔克魯茲，# sc-81591)進行。
1.1.4. 表達已刪除核心多肽(Core*)之MVATG17971之組構及製造
Core*係與已刪除胺基酸77至84之HBV Y07587(SEQ ID NO：2)之Core序列相對應。
Core*編碼序列係藉雙重PCR自pGA4-Core質體重新組成。此種質體係由吉納公司製造。該質體含有已改性的HBV Core基因之全長編碼序列，該序列係自合成寡核苷酸及/或PCR產物組裝。編碼序列之末二密碼子CAA TGT係於CAG TGC改性來防止與Pol(SEQ ID NO：36)之序列同源。
自位置1至76之Core序列係使用下列引子OTG19290(SEQ ID NO：37)(GACTGTTAACCACCATGG- ACATTGATCCTTATAAAGAATTTG)及OTG19292(SEQ ID NO：38)(GTTGACATAACTGACTACCAAATTACCACCCA-CCCAGGTAG)藉PCR擴增。自位置85至183之Core序列係使用下列引子OTG19291(SEQ ID NO：39)(GTGGGTGGTAAT-TTGGTAGTCAGTTATGTCAACACTAATATG)及OTG19080(SEQ ID NO：61)(GACTCTCGAGTTAGCACTGAGATTCC-CGAGATTG)藉PCR擴增。雙重PCR係使用OTG19290(SEQ ID NO：37)及OTG19080(SEQ ID NO：61)進行，二者後來產生擴增子。所得片段插入pH5R啟動子下游牛痘轉移質體之XhoI及HpaI限剪位置(Rosel等人，1986，J Virol.60：436)，獲得pTG17971。
MVATG17971病毒之生成係如前文說明藉同源重組於CEE進行。
Core*表達之分析係藉西方墨點法進行。雞胚纖維母細胞於MOI 0.2感染MVATG17971。24小時後，收穫細胞。西方墨點分析係使用市售單株抗核心抗體Hep B cAg(13A9)(聖塔克魯茲，# sc-23946)。
1.1.5. 表達已刪除且已截頭Core多肽(Core*t)之MVATG17972之組構及製造
Core*t係與胺基酸148之後截頭及胺基酸77至84刪除之HBV Y07587(SEQ ID NO：2)之Core序列相對應。
Core*t編碼序列係藉雙重PCR自pGA4-Core質體重新組成，該序列含有編碼全長HBV Core基因之編碼序列，該基因係自合成寡核苷酸及PCR產物組裝，但於CAG TGC之 編碼序列的末二密碼子CAA TGT經修改來避免與Pol(SEQ ID NO：36)序列同源。
自位置至76之Core序列係使用下列引子OTG19290(SEQ ID NO：37)(GACTGTTAACCACCATGGA-CATTGATCCTTATAAAGAATTTG)及OTG19292(SEQ ID NO：38)(GTTGACATAACTGACTACCAAATTACCACCCA-CCCAGGTAG)藉PCR擴增。自位置85至148之Core序列係使用下列引子OTG19291(SEQ ID NO：39)(GTGGGTGGTAAT-TTGGTAGTCAGTTATGTCAACACTAATATG)及OTG19299(SEQ ID NO：40)(GACTCTCGAGTTAAACAGTAGTCTCC-GGAAGTG)自pGA4核心藉PCR擴增。雙重PCR係使用OTG19290(SEQ ID NO：37)及OTG19299(SEQ ID NO：40)進行。所得片段插入pH5R啟動子下游之牛痘轉移質體的XhoI及HpaI限剪位置(Rosel等人，1986，J Virol.60：436)，獲得pTG17972。
MVATG17972病毒之生成係如前文說明藉同源重組於CEF進行。
Core*t表達之分析係藉西方墨點進行。雞胚纖維母細胞於MOI 0.2感染MVATG17972。24小時後，收穫細胞。使用市售單株抗核心抗體Hep B cAg(13A9)(聖塔克魯茲，# sc-23946)進行西方墨點分析。
1.1.6. 表達已刪除且已截頭Core多肽融合至Env1免疫原性域(Core*t-env1)之MVATG17993之組構及製造
Core-t*部分融合至Env1域自HBs蛋白質之胺基酸14延 伸至51。
Core*t-Env1序列係藉雙重PCR重新組構。Core*t序列係使用下列引子OTG19317(SEQ ID NO：41)(GACG GGATCC ACCATGGACATTGATCCTTATAAAGAA-TTTGG)及OTG19319(SEQ ID NO：42)(GCCTGCTTGC-AGGACAACAGTAGTCTCCGGAAGTGTTG)藉PCR自pTG17972擴增。Env1序列係使用下列引子OTG19318(SEQ ID NO：44)(CCGGAGACTACTGTTGTCCTGCAAGCAGGC-TTCTTC)及OTG19320(SEQ ID NO：45)(GAGTCATTCTCGA-CTT- GCGGCCGC TTACTGACCCAGGCAAACCGTGG)藉PCR自質體pMK-C/E(SEQ ID NO：43)擴增。使用OTG19317(SEQ ID NO：41)及OTG19320(SEQ ID NO：45)進行雙重PCR。所得片段插入pH5R啟動子下游之牛痘轉移質體之BamHI及NotI限剪位置(Rosel等人，1986，J Virol.60：436)，獲得pTG17993。
用於舉例說明目的，藉吉納製造質體pMK-C/E，含有由三個HBV env域序列插入核心序列所組成之嵌合體序列(SEQ ID NO：43)。天然核心及env核苷酸序列經簡併來避免與HBV Pol序列之序列同源性，也避免因polyT或polyGC拉伸之序列不安定。此外，核心序列係刪除胺基酸77至84及於aa148截頭。所選的Env域為：自S蛋白質胺基酸14至51之域(Env 1)，及自S蛋白質胺基酸165至194之域(Env 2)，及S蛋白質胺基酸202至226之域(Env 4)。三個域分別插入核心序列之位置nt 127、nt 222及nt 416。此種序列插入MVA載 體，結果導致表達細胞之細胞毒性，強調env-core融合設計並非直捷。
MVATG17993病毒之生成係如前文說明藉同源重組於CEF進行。
Core*t-env1表達之分析係藉西方墨點進行。雞胚纖維母細胞於MOI 0.2感染MVATG17993。24小時後，收穫細胞。使用市售單株抗核心抗體Hep B cAg(13A9)(聖塔克魯茲，# sc-23946)進行西方墨點分析。
1.1.7. 表達已刪除且已截頭Core多肽融合至Env1及Env2免疫原性域(Core*t-env1-env2)之MVATG17994之組構及製造
1.1.5說明之Core*t多肽然後融合至自HBs蛋白質之胺基酸14延伸至51(Env1)及自胺基酸165延伸至194(Env2)之兩個免疫原性域。
編碼Core*t-Env1-Env2之核苷酸序列藉三重PCR重新組裝。Core*t序列使用下列引子OTG19317(SEQ ID NO：41)及OTG19319(SEQ ID NO：42)藉PCR自pTG17972擴增。Env1使用下列引子OTG19318(SEQ ID NO：44)及OTG19322(SEQ ID NO：46)(GCGTGCGCTTGCCCACTGACCCAGG-CAAACCGTGG)自pMK-C/E質體擴增。Env2使用下列引子OTG19321(SEQ ID NO：47)(CGGTTTGCCTGGGTCAGTG-GGCAAGCGCACGCTTTAGC)及OTG19323(SEQ ID NO：48)(GAGTCATTCTCGACTT GCGGCCGC TTACACGCTCAGC-CACACGGTTGG)自pMK-C/E質體擴增。三重PCR係使用OTG19317(SEQ ID NO：41)及OTG19323(SEQ ID NO：48)進行。所得片段插入pH5R啟動子下游之牛痘轉移質體之BamHI及NotI限剪位置(Rosel等人，1986，J Virol. 60：436)，獲得pTG17994。
MVATG17994病毒之生成係如前文說明藉同源重組於CEF進行。
Core*t-env1-env2表達之分析係藉西方墨點進行。雞胚纖維母細胞於MOI 0.2感染MVATG17994。24小時後，收穫細胞。使用市售單株抗核心抗體Hep B cAg(13A9，聖塔克魯茲，# sc-23946)進行西方墨點分析。
1.1.8.　表達CORE-Env1-Env2-Env4之腺病毒載體AdTG17909之組成及製造
編碼CORE-Env1-Env2-Env4融合之合成基因(831核苷酸)係藉雙重PCR重新組成。CORE係使用下列引子OTG19152(SEQ ID NO：49)(GGGGGGCTAGCAAGCTTCC-ACCATGGACATTGATCCTTATAAAGAATTTG)及OTG19154(SEQ ID NO：50)(GAAAGAATCCAGCTTGCAGGACGCAC-TGAGATTCCCGAGATTGAG)藉PCR自pGA4-Core(描述於1.1.4.)擴增。Env1-Env2-Env4係使用下列引子OTG19153(SEQ ID NO：51)(CTCAATCTCGGGAATCTCAGTGCGTC-CTGCAAGCTGGATTCTTTC)及OTG19159(SEQ ID NO：52)(GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCTTAGATATAAACCC-ACAAGC)藉PCR自pGA4-Env擴增。雙重PCR係使用OTG19152(SEQ ID NO：49)及OTG19159(SEQ ID NO：52)進行。所得片段插入含有由腺病毒序列(分別為腺病毒核苷酸1-454及核苷酸3513-5781)環繞的CMV驅動表達卡匣之腺病毒穿梭質體的NheI及NotI限剪位置來允許藉同源重組產生載體基因體(Chartier等人，1996，J. Virol. 70：4805)。所得腺病毒載體pTG17909為E3(核苷酸28593-30464)及E1(核苷酸455-3512)經刪除，E1區係由表達卡匣置換，自5’至3’，該表達卡匣含有CMV緊接早期增強子/啟動子、嵌合體人類β-球蛋白/IgG插入序列(出現於得自波米加及pCI載體)、編碼CORE-Env1-Env2-Env4之序列及SV40晚期聚腺苷化信號。重組腺病毒係經由PacI線性化病毒基因體轉染至E1互補細胞系而生成。病毒繁殖、純化及滴定係如前文說明進行(Erbs等人，2000，癌症Res. 60：3813)。
融合蛋白質之表達係藉西方墨點法評估。106 A549細胞(ATCC CLL-185)於MOI=10或50以AdTG17909感染48小時，或具有空白腺病毒作為陰性對照。細胞丸粒經收集及使用抗CORE小鼠單株抗體(C1-5，sc-23945，聖塔克魯茲)探測。
1.1.9.　表達Pol*之腺病毒載體AdTG17910之組構及製造：
編碼Pol*之基因乃截頭前47胺基酸之聚合酶蛋白質，但Met起始子(48至832)除外及於位置540(D於H)及718(E於H)突變(相對於野生型聚合酶)，此種基因插入腺病毒載體。Pol基因(2364核苷酸)係使用引子OT19155(SEQ ID NO：53)(GGGGGGCTAGCAAGCTTCCACCATGAATGTTAGTATTCCTTGGACTCATAAG)及OTG19156(SEQ ID NO：54)(GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCTCACGGTGGTCTC-CATGCGACGTGC)藉PCR自pGA15-Pol(說明於1.1.2)擴增。所得片段插入含有由腺病毒序列(腺病毒核苷酸1-454及核苷酸3513-5781分別)環繞的CMV驅動表達卡匣之腺病毒穿梭質體的NheI及NotI限剪位置來允許藉同源重組產生載體基因體(Chartier等人，1996，J.Virol.70：4805)。所得腺病毒載體pTG17910為E3(核苷酸28593-30464)及E1(核苷酸455-3512)經刪除，E1區係由表達卡匣置換，該表達卡匣自5’至3’，含有CMV緊接早期增強子/啟動子、嵌合體人類β-球蛋白/IgG插入序列(出現於得自波米加及pCI載體)、編碼已截頭且已突變Pol之序列及V40晚期聚腺苷化信號。重組腺病毒係經由PacI線性化病毒基因體轉染至E1互補細胞系而生成。病毒繁殖、純化及滴定係如前文說明進行(Erbs等人，2000，癌症Res.60：3813)。
融合蛋白質之表達係藉西方墨點法於腺病毒感染細胞評估。A549細胞(106細胞)(ATCC CLL-185)於MOI=10或50以AdTG17910感染48小時，及具有空白腺病毒作為陰性對照。細胞丸粒經收集及使用抗Pol小鼠單株抗體(8D5，sc-81591，聖塔克魯茲)探測。
1.2. 抗原免疫原性之評估
抗原之免疫原性係於HLA轉移基因小鼠免疫接種後藉Elispot IFNγ及胞內細胞激素染色(ICS)檢定分析於活體內評估。
1.2.1. 小鼠模型
用於研究的HLA-A2.1轉移基因小鼠係如Pascolo等人(1997，J.Exp.Med.185：2043)說明。此等小鼠具有H-2Db及小鼠β2-微球蛋白基因已經被剔除且表達轉移基因單鏈組織相容性I類分子(HHD分子)，其中人β2m之C端係共價鏈結至嵌合體重鏈之N端(HLA-A*0201 α1-α2、H-2Db、α3穿膜及胞質內域)。7週齡至10週齡小鼠(雄及雌)經免疫接種。小鼠平均體重約為25克至30克。
1.2.2. 免疫接種方案
小鼠分成4組：第1組藉AdTG17909(編碼HBV Core融合至env1、env2及env4免疫原性域)、第2組免疫接種AdTG17910(編碼已截頭且已突變之Pol*)、第3組免疫接種兩種載體，及第4組免疫接種空白腺病毒(AdTG15149)作為陰性對照。全部動物皆係於尾巴基部藉皮下注射免疫接種，第1組及第2組動物接受一針皮下注射108IU個別腺病毒(TG17909或TG17910)，第3組接受一次皮下注射含108IU各種腺病毒之混合物(總計2.108IU：108IU AdTG17909+108IU AdTG17910)；及陰性對照組接受一次皮下注射2.108IU AdTG15149。細胞免疫反應係於免疫接種後2週藉IFNg Elispot及胞內細胞激素染色(ICS)檢定分析評估。
1.2.3. 胜肽
於試管內用於細胞刺激之胜肽為描述為或預測為HLA-A2限剪抗原上突之9至10胺基酸等短胜肽；或包括於涵蓋全部關注抗原之胜肽存庫的15胺基酸長胜肽。
所述或所預測聚合酶蛋白質、核心蛋白質或Env域之 HLA-A2限剪抗原上突之短胜肽係藉優洛吉尼(Eurogentec)(比利時)合成，及10mM濃度溶解於100% DMSO(西格瑪(Sigma)，D2650)。
涵蓋全體聚合酶、核心及包膜蛋白質的胜肽存庫係藉普洛艾沐(ProImmune)(英國牛津)合成。Pol、Core及Env存庫係由重疊11胺基酸之15元體胜肽所組成。各粗產物胜肽係以50毫克/毫升濃度溶解於100% DMSO(西格瑪，D2650)。對各存庫，胜肽係匯集至2毫克/毫升/胜肽濃度：HBV Pol蛋白質係由得自Pol存庫之8個24至25胜肽匯集物所涵蓋(匯集物1：24胜肽涵蓋殘基45至151；匯集物2：24胜肽涵蓋殘基140至251；匯集物3：24胜肽涵蓋殘基241至347；匯集物4：24胜肽涵蓋殘基337至447；匯集物5：24胜肽涵蓋殘基437至543；匯集物6：24胜肽涵蓋殘基533至639；匯集物7：24胜肽涵蓋殘基629至735；匯集物8：25胜肽涵蓋殘基725至832)；HBV Core蛋白質係由得自Core存庫之2個21-22胜肽匯集物所涵蓋(匯集物1：22胜肽涵蓋殘基1至100；匯集物2：21胜肽涵蓋殘基89至183)；HBV Env蛋白質係由得自Env存庫之3個6至10胜肽匯集物所涵蓋(匯集物1：10胜肽涵蓋HBs殘基9至59；匯集物2：9胜肽涵蓋HBs殘基157至194；匯集物4：6胜肽涵蓋HBs殘基193至226)。
1.2.4. IFNg Elispot檢定分析
得自免疫接種小鼠之脾細胞經收集，紅血球經溶解(西 格瑪，R7757)。2.105細胞/孔於被覆以抗小鼠IFNγ單株抗體(BD生科公司(BD Biosciences)；10微克/毫升，551216)之多重篩檢(Multiscreen)孔板(密利波公司(Millipore)，MSHA S4510)，於MEM培養基(吉伯克(Gibco)，22571)重複三次培養40小時，該培養基補充以10% FCS(西格瑪，F7524或JRH，12003-100M)，80單位/毫升青黴素(penicillin)/80微克/毫升鏈黴素(streptomycin)(PAN，P06-07-100)，2mM L-麩胺(吉伯克，25030)，1X非必需胺基酸(吉伯克，11140)，10mM Hepes(吉伯克，15630)，1mM丙酮酸鈉(吉伯克，31350)及50μM β-巰乙醇(吉伯克，31350)及於10單位/毫升重組鼠IL2(佩普洛泰(Peprotech)，212-12)存在下單獨用作為陰性對照進行，或具有：- 10μM一種HAL-A2限剪胜肽存在於由Ad載體所編碼之HBV抗原(SLY於Pol、FLP、ILC用於Core；VLQ、FLG及GLS用於Env)或不相干者；- 胜肽匯集物，終濃度5微克/毫升胜肽- 5微克/毫升刀豆球蛋白A(西格瑪，C5275)用於陽性對照。
如前文說明(Himoudi等人，2002，J.Virol.76：12735)，IFNg生產性T細胞係藉Elispot(細胞激素特異性酶聯結免疫墨點法)檢定分析定量。陰性對照孔之點數(與IFNg生產性T細胞相對應)係自含HBV胜肽之實驗孔中檢測得的點數扣除。結果顯示為對三次重複孔所得平均值。對觀察得之反應(或截取值)之實驗陽性臨界值，其經計算係與單獨使用培養基所得點數平均值+2標準差相對應，報告為106細胞。聯結CTL Elispot讀取器之技術截取值也定義為50點/106細胞(其為高於該數值時讀取器之CV為系統性小於20%)。技術截取值與對實驗計算得之實驗臨界值間之最高值取用來考慮界定各實驗之截取值。使用Mann-Whitney測試進行Elispot反應之統計分析。等於或劣於0.05之P值被視為顯著。
1.2.5.　胞內細胞激素染色(ICS)檢定分析
對得自各組各頭動物的脾細胞進行ICS。使用溶解緩衝液(西格瑪，R7757)於紅血球溶解後，平底96孔孔板內每孔2x106細胞於完全α MEM培養基(吉伯克BRL，22571)於10單位/毫升鼠重組IL-2(佩普洛泰，212-12)培養，該培養基可單獨用作為陰性對照，或含有10μM特異性HBV胜肽或含有終濃度5微克/毫升/胜肽之胜肽匯集物，或含有10μM不相關胜肽。高爾基塞(BD生科公司，555029)以1微升/毫升終濃度即刻添加經歷5小時。然後細胞收穫於V字形底96孔孔板，及以1% FCS-PBS洗滌。於室溫使用抗CD3(倉鼠MAb anti-CD3e-PE，稀釋度1/200)、CD8(大鼠MAb anti-CD8a-APC，稀釋度1/600)及CD4(大鼠MAb anti-CD4-PerCP，稀釋度1/600)之單株抗體(全部皆係得自BD生科公司，分別為553063，553035及553052)於50微升1% FCS-PBS進行染色15分鐘。洗滌後，細胞經固定及使用賽托菲(Cytofix)/賽托潘(Cytoperm)滲透，及使用潘/瓦汐(Perm/Wash)溶液(BD生科公司，554714)洗滌。然後，抗小鼠IFNg-PE抗體(BD生科公司，554412557724)及及抗小鼠TNFa-Alexa488抗體(BD生科公司，557719)或抗小鼠IFNg-PE抗體(BD生科公司，554412557724)及抗小鼠IL2-Alexa488抗體(BD生科公司，557719)於室溫添加歷時15分鐘，使用潘/瓦汐洗滌後，細胞再懸浮於1% FCS-PBS，及使用費克凱利伯(FacsCalibur)(貝克敦狄金森公司(Becton Dickinson))藉細胞流量計分析。CE3e+、CD8a+細胞或CD3e+、CD4+細胞經閘控來測定IFNg+CD8+或IFNg+CD4+T或TNFa+CD8+或TNFa+CD4+T或IL2+CD8或IL2CD4+T或IFNg+TNFa+CD8+或IFNg+TNFa+CD4或IFNg+IL2+CD8+或IFNg+IL2+CD4+T細胞族群之百分比。只有培養基所得百分比視為背景值。
1.2.6.　活體內CTL檢定分析
活體內CTL檢定分析係如所述進行(Fournillier等人，2007)。脾細胞懸浮液係得自同基因型小鼠脾臟，於紅血球溶解後調整至20x106細胞/毫升。三分之一細胞係與HBV特異性胜肽中之一者共同培養，三分之二細胞係與另一種HBV胜肽共同培養，全部皆係於37℃於10μM終濃度培養1小時，而最末選分保持未加脈衝。5(6)-羧螢光素二乙酸丁二醯亞胺酯(CFSE)(分子探針(Molecular probes)，C1157)係以16μM(CFSE-高)添加至未加脈衝之細胞，於4μM(CFSE-中)添加至ILC或VLQ胜肽脈衝化細胞，及以1μM(CFSE-低)添加至SLY或FLP胜肽脈衝化細胞歷時10分鐘。使用PBS洗滌後，混合三個族群(未加脈衝、ILC及SLY胜肽脈衝化細胞；或未加脈衝、FPL及ILC胜肽脈衝化細胞)經混合，30.106總細胞透過框後靜脈注射而麻醉小鼠(使用K他命(ketamine)-西拉金(xylazin)-PBS混合液(K他命(Ktamine)維巴克(Virbac)，仙查維(Centravet)KET204，終濃度25毫克/毫升；西拉金鹽酸鹽隆龐(Rompum)拜耳(Bayer)，仙查維，終濃度5毫克/毫升))。如此，CFSE-低及中族群表示提示為可藉胞毒性T細胞溶解之特定標靶，CFSE-高族群為內部參考，允許檢定分析標準化。得自接受之小鼠脾細胞於24小時後藉細胞流量計分析來檢測CFSE標記的細胞。於淋巴細胞(SSC-FSC)閘控後，基於事件/CFSE螢光(FL1)數目進行第二閘控，顯示3峰，第一峰對應於CFSE-低細胞，第二峰對應於CFSE-中細胞，及第三峰對應於CFSE-高細胞。各頭動物計算CFSE+胜肽脈衝化標靶與CFSE+未加脈衝化標靶間之比(R=CFSE-低細胞數目/CFSE-高細胞數目)。二頭本地小鼠用來測定R參考。各頭動物之特異性溶解百分比係藉下式測定：%溶解=(1-R小鼠/R參考) x 100。若特異性溶解百分比高於10%(截取值)則該反應被視為陽性。
2.　結果 2.1.　藉病毒載體之抗原表達 2.1.1.　自腺病毒組成體AdTG17909及AdTG17910之抗原表達
Core-env1-env2-env4融合蛋白質之表達係藉西方墨點法評估。A549細胞(106細胞)係以MOI=10或50使用AdTG17909感染48小時，或使用空白腺病毒作為陰性對照。細胞丸粒經收集且使用抗核心小鼠單株抗體(C1-5，sc-23945，聖塔克魯茲)探測。如第1A圖所示，具有預期分子量(31.6 kDa)之主帶顯示於自感染AdTG17909之細胞所收集的樣本。
Pol*多肽之表達係於AdTG17910感染A549之細胞後藉西方墨點法評估。然後收集細胞丸粒及使用抗Pol小鼠單株抗體(8D5，sc-81591，聖塔克魯茲)探測。如第1A圖所示，具有期望分子量(88.5 kDa)之帶顯示於自感染AdTG17910連同若干次級產物(部分聚合酶蛋白質)之細胞收集得之樣本。
2.1.2.　自MVA組成體之抗原表達
Pol*、Pol*TMR、Core*t、Core*tEnv1、Core*t-Env1-Env2之表達係藉西方墨點法進行。A549細胞或CEF係以MOI=1或0.2分別使用MVATG17842、MVATG17843、MVATG17971、MVATG17972、MVATG17993及MVATG17994於有或無蛋白體抑制劑MG-132(10μM)添加至MVATG17842及MVATG17843之生長培養基存在下感染。24小時後，收穫細胞。
對MVATG17842，西方墨點分析係使用市售單株Pol抗體Hep B Pol(8D5，聖塔克魯茲，# sc-81591)進行。如第1B圖所示，具有88.5 kDa表觀分子量之蛋白質表達只於MG-132存在下檢測。此帶具有Pol*蛋白質之期望分子量。
對MVATG17843，西方墨點分析係使用市售抗Pol抗體Hep B Pol(8D5，聖塔克魯茲，# sc-81591)進行。如第1B圖所示，於有或無MG-132存在下檢測具有98.2 kDa表觀分子量之蛋白質表達。此帶具有Pol*-TMR蛋白質之期望分子量。須注意於MG132存在下，檢測得更多產物及超過200Kda之高分子量額外產物。
對MVATG17971，使用市售單株抗核心抗體Hep B cAg(13A9)(聖塔克魯茲，# sc-23946)進行西方墨點分析。如第1B圖所示，檢測得Core*之表達具有21kDd表觀分子量其係與期望分子量相對應。
對MVATG17972，使用市售單株抗核心抗體Hep B cAg(13A9)(聖塔克魯茲，# sc-23946)進行西方墨點分析。如第1B圖所示，檢測得Core*t之表達具有15.8kDd表觀分子量其係與期望分子量相對應。
對MVATG17993及MVATG17994，使用市售單株抗核心抗體Hep B cAg(13A9)(聖塔克魯茲，# sc-23946)進行西方墨點分析。如第1B圖所示，檢測得蛋白質表達分別具有19.9kDd及23.4kDd之表觀分子量。此帶具有Core*t-Env1蛋白質及Core*t-Env1-Env2之期望分子量。
2.2. 自腺病毒載體AdTG17909及AdTG17910表達之抗原之免疫原性
藉腺病毒載體表達之HBV多肽之免疫原性係於單獨使用AdTG17909或AdTG17910或使用兩種腺病毒混合物免疫接種至HLA-A2轉移基因小鼠評估。一次皮下注射後誘導的特異性T細胞反應係藉Elispot IFNg、ICS及活體內細胞溶解檢定分析，使用存在於聚合酶、核心或包膜域之已知之(描述為病人體內特異性T細胞反應之標靶)HLA-A2抗原上突或/及覆蓋所關注的HBV抗原之重疊胜肽匯集物進行評估。
2.2.1. 藉Elispot檢定分析評估HBV特異性IFNγ生產性細胞
Elispot IFNg檢定分析顯示AdTG17910可誘導HLA-A2限剪抗原上突(SLYADSPSV)(SEQ ID NO：55位在HBV聚合酶內部位置816-824)(第2A圖)之特異性IFNg製造性細胞。使用AdTG17909免疫接種也導致對兩種核心HLA-A2限剪抗原上突(FLPSDFFPSV於位置18-27(SEQ ID NO：56)及ILCWGELMTL於位置99-108(SEQ ID NO：57)及對3種包膜HLA-A2限剪抗原上突(VLQAGFFLL(SEQ ID NO：58)於位置14-22及FLGGTTVCL(SEQ ID NO：59)於位置41-49二者皆存在於Env1，及GLSPTVWLSV(SEQ ID NO：60)於位置185-194存在於Env2之特異性IFNg生產性細胞的高頻率誘導(第2B及第2C圖)。以AdTG17909及AdTG17910之混合物免疫接種也誘導將相同抗原上突靶定於3種抗原之特異性IFNg生成性細胞可相媲美的含量，亦即SLY抗原上突存在於Pol，FLP及ILC抗原上突存在於核心蛋白質，及包膜域之3個抗原上突(VLQ、FLG及GLS)(第2A、B及C圖)。於使用單一Ad或兩種Ad之混合物免疫接種後檢測得之T細胞反應頻率可相媲美，顯示自所述載體表達的3種抗原間並無重大免疫顯性。
2.2.2. 藉胞內染色檢定分析評估HBV特異性IFNg/TNFa生產性細胞
可單獨製造IFNg或製造IFNg+TNFa靶定存在於聚合酶域(SLY)、核心域(FLP及ILC)及包膜域(VLQ、FLG及GLS)之HLA-A2限剪抗原上突之CD8 T細胞數目係藉ICS檢定分 析評估。全部此等抗原上突皆為雙重分泌細胞及簡單分泌細胞的標靶。結果顯示於第3圖。以單獨AdTG17909或組合AdTG17910免疫接種動物獲得粗略相等的Core-及Env-特異性CD8 T細胞反應(於使用FLP、ILC、VLQ、FLG及GLS胜肽再度刺激後製造IFNg或IFNg+TNFa之特異性CD8 T細胞之百分比相等，如第3B圖及3C圖所示)。另一方面，有關聚合酶特異性CD8 T細胞反應(SLY抗原上突)，於使用AdTG17910表達Pol*處理之小鼠(第3A圖)以及使用AdTG17909及AdTG17909之混合物但於較低濃度免疫接種之小鼠(第3C圖)檢測得製造IFNg或IFNg+TNFa之CD8+細胞極高百分比。
2.2.3. 於使用腺病毒載體混合物免疫接種後藉胞內染色檢定分析評估可製造HBV特異性IFNg/TNFa之CD8及CD4 T細胞
可單獨製造IFNg或IFNg+TNFa或IFNg+IL2靶定存在於聚合酶域(SLY)、核心域(FLP及ILC)及包膜域(VLQ、FLG及GLS)之HLA-A2限剪抗原上突或覆蓋Core蛋白質及Env域之重疊胜肽匯集物之CD8及CD4 T細胞百分比係藉ICS檢定分析評估。全部接受試驗之HLA-A2限剪抗原上突皆為單一及雙重分泌細胞之標靶(IFNg及IFNg+TNFa)，某些重疊胜肽匯集物也是單一及雙重生產性細胞的標靶(IFNg及IFNg+TNF及IFNg+IL2)。結果顯示於第4圖。五頭HLA-A2轉移基因小鼠使用AdTG17909及AdTG17910之混合物免疫接種；3頭HLA-A2轉移基因小鼠使用AdTG15149免疫接種 (陰性對照)。以AdTG15149接種之動物並未顯示HBV特異性T細胞反應(資料未顯示)。以AdTG17909組合AdTG17910免疫接種之動物顯示HBV靶定抗原之強力特異性CD8 T細胞反應(第4A圖)，HLA-A2抗原上突之特異性單一(IFNg)及雙重(IFNg+TNFa)生產性細胞之高百分比存在於聚合酶、核心及Env域，且具有胜肽之「核心1」匯集物及涵蓋Env1及Env2域之胜肽匯集物特異性。如第4B及4C圖所示，此等免疫接種小鼠也顯示HBV抗原之特異性CD4 T細胞反應，特別為胜肽之「核心2」匯集物及胜肽之Env2涵蓋匯集物之特異性單一(IFNg)及雙重(IFNg+TNFa及IFNg+IL2)生產性細胞。
2.2.4. 藉活體內CTL檢定分析測量活體內細胞分解之誘導
腺病毒載體AdTG17910及AdTG17910對表達HBV HLA-A2抗原上突細胞誘導活體內細胞分解能力係藉活體內CTL檢定分析評估。測試四種HLA-A2抗原上突，分別為SLY(Pol)、FLP及ILC(Core)及VLQ(Env1域)。六頭動物使用AdTG17909+AdTG17910之混合物免疫接種及2頭動物使用AdTG15149免疫接種(陰性對照)。各組有半數(三頭以AdTG17909+AdTG17910免疫接種小鼠及一頭以AdTG15149免疫接種小鼠)測試其於活體內分解以SLY胜肽脈衝化細胞及以ILC胜肽脈衝化細胞。另外半數係測試免疫接種動物於活體內分解以FLP胜肽脈衝化細胞及以VLQ胜肽脈衝化細胞之能力。結果顯示於第5圖。如所預期，使用AdTG15149免疫接種小鼠無法檢測得HBV特異性活體內細 胞分解(資料未顯示)。於AdTG17909+AdTG17910免疫接種小鼠對2種核心抗原上突FLP及ILC之活體內細胞分解微弱。相反地，使用AdTG17909及AdTG17910之混合物免疫接種之動物顯示對聚合酶抗原上突SLY(第5A圖)及Env1抗原上突VLQ(第5B圖)之強力活體內細胞分解，於兩種情況下達到高於50%特異性分解。
令人關注地，表達pol、core及env部分之Ad載體組合物允許共同注射時，誘導靶定3種HBV抗原之特異性T細胞反應。所誘導的T細胞也可製造一種或兩種細胞激素，及於活體內分解載荷有部分HBV胜肽之細胞。全部此等資料證實所述組成物之免疫原性活性及當藉Ad載體化時其誘導CD8及CD4 T細胞反應之能力。
2.3. 自MVA載體MVATG17842、MVATG17843、NVATG17971、MVATG17972、MVATG17993及MVATG17994表達的抗原之免疫原性
以MVA為主之組成物之免疫原性活性係於實例1.1.2至1.1.7所述MVA載體中之一者(MVATG17842、MVATG17843、MVATG17971或MVATG17972單獨)或以2種MVA之混合物(MVATG17843+MVATG17972、MVATG17843+MVATG17993或MVATG17843+MVATG17994)免疫接種至HLA-A2轉移基因小鼠評估。小鼠係以一週間隔皮下注射3劑免疫接種，使用前述存在於聚合酶、核心或包膜域之HLA-A2抗原上突或/及涵蓋感興趣之HBV抗原之重疊胜肽匯集物，藉Elispot IFNg及ICS評估特 異性T細胞反應。
2.3.1. 於以聚合酶表達性MVA免疫接種後藉Elispot檢定分析評估HBV特異性IFNγ生產性細胞。
三頭小鼠以表達經截頭且經突變之聚合酶抗原之MVATG17842或表達相同已截頭且已突變之聚合酶之膜靶定版本之MVATG17843或MVA N33.1(陰性對照)免疫接種。使用SLY HLA-A2限剪抗原上突及涵蓋聚合酶之胜肽匯集物藉IFNg Elispot檢定分析評估聚合酶特異性T細胞反應。未以MVA N33.1及MVATG17842(資料未顯示)免疫接種之小鼠未檢測得HBV特異性T細胞反應。但於第6A圖所示，使用MVATG17843免疫接種後誘導IFNg生產性細胞，其為HLA-A2限剪抗原上突SLY特異性及涵蓋聚合酶C端部分之胜肽匯集物8特異性(於測試之實驗條件下並未檢測得對抗其它胜肽匯集物1-7之特異性反應)。此等資料強調至少於以MVA為主之組成物中，表達聚合酶作為膜錨定抗原的效果。
2.3.2. 於使用核心表達MVA免疫接種後藉Elispot檢定分析評估HBV特異性IFNγ生產性細胞。
八頭小鼠以表達核心部分但刪除殘基77-84之MVATG17971或表達其截頭版本之MVATG17972(自殘基149 C端截頭)或MVA N33.1(陰性對照)免疫接種。使用HLA-A2限剪抗原上突(FLP及ILC胜肽)及前述胜肽之核心1及核心2匯集物，藉IFNg Elispot檢定分析測定核心特異性T 細胞反應。如第6B圖所示，以MVA TG17971免疫接種可誘導對HLA-A2限剪FLP及ILC胜肽及涵蓋核心抗原之兩個胜肽匯集物(第6B圖)之特異性偶發型T細胞反應。於使用測試之胜肽且於測試之實驗條件(資料未顯示)以MVATG17972免疫接種小鼠未檢測得核心特異性T細胞反應。
2.3.3. 於使用MVA載體組成物免疫接種後藉Elispot檢定分析評估HBV特異性IFNγ生產性細胞。
以MVA TG17843及MVA TG17972、MVA TG17993及MVA TG17994之混合物免疫接種三頭小鼠，使用前述胜肽藉Elispot IFNg檢定分析評估HBV特異性T細胞反應。
-於大部分以組成物MVATG17843+MVATG17972免疫接種之動物檢測得聚合酶特異性T細胞反應(如第7A圖所示2/3動物為陽性反應)、MVATG17843+MVATG17993(如第7B圖所示3/3動物為陽性反應)及MVATG17843+MVATG17994(如第7C圖所示2/3動物為陽性反應)。IFNg生產性細胞頻率似乎與單獨注射MVATG17843時觀察得之頻率(第6A圖)可相媲美，驗證載體組合對誘導免疫反應無害。
-於使用HLA-A2或胜肽匯集物(資料未顯示)於任何免疫接種動物體，於測試的實驗條件下皆未檢測得核心特異性反應。
- 任何以包含MVATG17993之組成物免疫接種之動物體，於測試的實驗條件下，使用Env1 HLA-A2或胜肽匯集物(資料未顯示)皆未檢測得env特異性反應。
- 如第7C圖所示，以包含MVATG17994之組合物免疫接 種之3頭動物中有2頭檢測得env 2特異性T細胞反應，其係針對HLA-A2限剪GLS抗原上突及Env2-涵蓋胜肽匯集物(此等實驗條件下並未觀察得對Env1域之T細胞反應；資料未顯示)。
於相同條件下進行ICS檢定分析證實於Elispot檢定分析觀察得之結果(資料未顯示)。
令人關注地，表達pol、core及env部分之MVA載體組合物當共同注射時允許誘導靶定pol及env2抗原之特異性T細胞反應。
總而言之，此等資料證實所述組成物之免疫原活性及其誘導對主要HBV抗原之T細胞反應之能力。
<110> 傳斯堅公司(TRANSGENE S.A.)
<120> 用以治療B型肝炎病毒(HBV)感染之組成物
<130> TG200
<160> 61
<170> PatentIn版本3.3
<210> 1
<211> 832
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 1
<210>　2
<211>　183
<212>　PRT
<213>　B型肝炎病毒
<400>　2
<210>　3
<211>　226
<212>　PRT
<213>　B型肝炎病毒
<400>　3
<210>　4
<211>　2499
<212>　DNA
<213>　B型肝炎病毒
<400>　4
<210>　5
<211>　552
<212>　DNA
<213>　B型肝炎病毒
<400>　5
<210>　6
<211>　681
<212>　DNA
<213>　B型肝炎病毒
<400>　6
<210>　7
<211>　786
<212>　PRT
<213>　人造序列
<220>
<223>　N端截頭HBV聚合酶(48-832)
<400>　7
<210>　8
<211>　832
<212>　PRT
<213>　人造序列
<220>
<223>　帶有RTase及RNase H活性缺陷之突變聚合酶
<400>　8
<210> 9
<211> 874
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 截頭及突變HBV聚合酶融合至狂犬病糖蛋白之穿膜域(TMR)
<400> 9
<210> 10
<211> 148
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 截頭核心(1-148)
<400> 10
<210> 11
<211> 140
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 截頭及已刪除之HBV核心(1-76及85-148)
<400> 11
<210> 12
<211> 39
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> HBV免疫原性域Env1(14-51)
<400> 12
<210> 13
<211> 30
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> HBV免疫原性域Env2(165-194)
<400> 13
<210> 14
<211> 26
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> HBV免疫原性域Env3(81-106)
<400> 14
<210> 15
<211> 25
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> HBV免疫原性域Env4(202-226)
<400> 15
<210> 16
<211> 69
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> HBV免疫原性域Env1-Env2之融合
<400> 16
<210> 17
<211> 94
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> HBV免疫原性域Env1-Env2-Env4之融合
<400> 17
<210> 18
<211> 179
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 截頭及已刪除之HBV核心(1-76及85-148)與HBV免疫原性域Env1 之融合
<400> 18
<210> 19
<211> 208
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 截頭及已刪除之HBV核心(1-76及85-148)與HBV免疫原性域Env1及Env2之融合
<400> 19
<210> 20
<211> 276
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 核心與HBV免疫原性域Env1、Env2及Env4之融合
<400> 20
<210>　21
<211>　2361
<212>　DNA
<213>　人造序列
<220>
<223>　編碼HBV截頭聚合酶(48-832)之核苷酸序列
<400>　21
<210>　22
<211>　2499
<212>　DNA
<213>　人造序列
<220>
<223>　編碼帶有RTase及RNase活性缺陷之突變HBV聚合酶之核苷酸序列
<400>　22
<210> 23
<211> 2628
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 編碼截頭及突變HBV聚合酶融合至狂犬病糖蛋白之穿膜域(TMR)之核苷酸序列
<400> 23
<210> 24
<211> 537
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 編碼HBV截頭及已刪除之核心(1-76及85-148)融合至HBV免疫原性域Env1之核苷酸序列
<400> 24
<210> 25
<211> 627
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 編碼HBV截頭及已刪除之核心(1-76及85-148)融合至HBV免疫原性域Env1及Env2之核苷酸序列
<400> 25
<210> 26
<211> 828
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 編碼HBV核心(1-183)融合至HBV免疫原性域Env1-Env2及Env4之核苷酸序列
<400> 26
<210> 27
<211> 2499
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 存在於質體pGA-15pol之核苷酸序列
<400>　27
<210>　28
<211>　37
<212>　DNA
<213>　人造序列
<220>
<223>　引子
<400>　28
<210>　29
<211>　31
<212>　DNA
<213>　人造序列
<220>
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第1A-B圖顯示自腺病毒及MVA感染細胞之HBV多肽表達。
第2A-C圖顯示於Elispots IFNγ檢定分析中藉腺病毒編碼之HBV多肽之免疫原性。
第3A-C圖顯示於胞內細胞激素染色檢定分析中藉腺病毒載體所編碼之HBV多肽之免疫原性。
第4A-C圖顯示藉腺病毒載體編碼之HBV多肽誘導CD8及CD4 T細胞反應之能力，係藉胞內細胞激素染色檢定分析檢測。
第5A-B圖顯示編碼HBV多肽之腺病毒載體誘導抗載荷有HBV HLA-A2限剪抗原上突之標靶細胞的活體內功能性細胞溶解。
第6A-B圖顯示藉Elispots IFNγ檢定分析測定之由MVA載體所編碼之HBV多肽之免疫原性。
第7A-C圖顯示於小鼠共同注射由MVA載體所編碼之HBV多肽之免疫原性，藉Elispots IFNγ檢定分析測定。

Claims (36)

  1. 一種免疫原性組成物，其包含三個多肽或編碼該三個多肽之核酸分子之組合，其中該等多肽係選自於由下列所組成之組群：(i)一具有源自於第一HBV病毒之聚合酶蛋白質至少450個胺基酸殘基的聚合酶部分，其中該聚合酶部分與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示胺基酸序列具有至少95%相同度，且該聚合酶部分係突變於對應SEQ ID NO：1位置538-541之YMDD部分，以使得其相較於天然HBV聚合酶展現減低之反錄酶(RTase)酶催化活性，以及該聚合酶部分係突變於對應SEQ ID NO：1中該HBV聚合酶之位置680-832，以使得其相較於天然HBV聚合酶展現減低之RNase H酶催化活性；(ii)一源自於第二HBV病毒之核心部分，其係如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：10所示；及(iii)一具有源自於第三HBV病毒之HBsAg蛋白質20至100連續胺基酸殘基之一或多個免疫原性域之env部分，該一或多個免疫原性域選自於下列所構成之組群：a)自位置14-51延伸之env蛋白質(HBsAg)部分(env 1域)，其係如SEQ ID NO：12所示；b)自位置165-194延伸之env蛋白質(HBsAg)部分(env 2域)，其係如SEQ ID NO：13所示；及c)該等env蛋白質部分之任一種組合。
  2. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組成物，其中該第一、第二及第三HBV病毒係得自相同基因型。
  3. 如申請專利範圍第2項之免疫原性組成物，其中該第一、第二及第三HBV病毒係得自基因型D。
  4. 如申請專利範圍第3項之免疫原性組成物，其中該第一、第二及第三HBV病毒係得自HBV單離株Y07587。
  5. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組成物，其中該聚合酶部分包含將對應於SEQ ID NO：1的位置540及SEQ ID NO：7的位置494之Asp殘基取代成His殘基。
  6. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組成物，其中該聚合酶部分包含將對應於SEQ ID NO：1的位置718及SEQ ID NO：7的位置672之Glu殘基取代成His殘基。
  7. 如申請專利範圍第1或6項之免疫原性組成物，其中該聚合酶部分包含SEQ ID NO：8所示胺基酸序列或SEQ ID NO：7所示胺基酸序列，其具有於位置494之Asp殘基取代成His殘基及於位置672之Glu殘基取代成His殘基。
  8. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組成物，其中該聚合酶部分係同框架融合至狂犬病糖蛋白之信號胜肽及穿膜胜肽，及其中該狂犬病信號序列係同框架融合於該聚合酶部分之N端，以及該狂犬病穿膜序列係同框架融合於該聚合酶部分之C端。
  9. 如申請專利範圍第8項之免疫原性組成物，其中該聚合酶部分包含SEQ ID NO：9所示胺基酸序列。
  10. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組成物，其中該免疫 原性組成物進一步包含選自於由下列所組成之組群的免疫原性域：a)自位置81-106延伸之env蛋白質(HBsAg)部分(env 3域)；b)自位置202-226延伸之env蛋白質(HBsAg)部分(env 4域)；及c)該等env蛋白質部分之任一種組合。
  11. 如申請專利範圍第10項之免疫原性組成物，其中該免疫原性域包含SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15所示胺基酸序列。
  12. 如申請專利範圍第11項之免疫原性組成物，其中該env部分包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17所示胺基酸序列。
  13. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組成物，其中該聚合酶、核心及/或env部分係成對或全部共同於同框架融合於單一多肽鏈。
  14. 如申請專利範圍第13項之免疫原性組成物，其中該env部分係同框架融合於該核心部分之C端，該融合多肽包含SEQ ID NO：20所示胺基酸序列，或SEQ ID NO：20所示胺基酸序列始於殘基1而終於殘基251之部分，或者SEQ ID NO：20所示胺基酸序列始於殘基1而終於殘基221之部分。
  15. 一種核酸分子，其編碼下列組合：如申請專利範圍第1及5至9項中任一項所定義之聚合酶部分、如申請專利範 圍第1項所定義之核心部分，及如申請專利範圍第10至12項中任一項所定義之env部分。
  16. 如申請專利範圍第15項之核酸分子，其中該核酸分子含有選自於由下列所組成之組群的核酸分子：a)一核酸分子，其包含SEQ ID NO：22所示核苷酸序列；b)一核酸分子，其包含SEQ ID NO：21所示核苷酸序列帶有位置1480之G核苷酸取代成C，位置2014之G核苷酸取代成C及位置2016之A核苷酸取代成T；c)一核酸分子，其包含SEQ ID NO：23所示核苷酸序列；及d)一核酸分子，其包含SEQ ID NO：26所示核苷酸序列、或SEQ ID NO：26所示核苷酸序列始於核苷酸1而終於核苷酸753之部分、或SEQ ID NO：26所示核苷酸序列始於核苷酸1而終於核苷酸663之部分、或缺乏SEQ ID NO：26自位置229之G延伸至位置252之A部分之刪除版本。
  17. 一種質體或病毒載體，其包含一或多個如申請專利範圍第15或16項定義之核酸分子。
  18. 如申請專利範圍第17項之載體，其中該病毒載體為複製缺陷腺病毒載體，其包含該核酸分子插入而置換E1區。
  19. 如申請專利範圍第17項之載體，其中該病毒載體係得自金絲雀痘病毒、禽痘病毒或牛痘病毒之痘病毒載體。
  20. 如申請專利範圍第19項之載體，其中該牛痘病毒係來自 經修飾的安卡拉牛痘病毒株(MVA)。
  21. 如申請專利範圍第17至20項中任一項之載體，其中該載體攜載編碼該聚合酶部分、該核心部分及該env部分之核酸分子。
  22. 如申請專利範圍第17至20項中任一項之載體，其中該載體只攜載編碼該聚合酶部分、該核心部分及該env部分之核酸分子中之一者或二者。
  23. 如申請專利範圍第22項之載體，其中該載體係選自於由下列所組成之組群：(i)一MVA載體，其包含位在牛痘啟動子諸如7.5K啟動子控制下且編碼聚合酶部分之核酸分子，該聚合酶部分包含SEQ ID NO：8或9所示胺基酸序列或SEQ ID NO：7所示胺基酸序列帶有位置494之Asp殘基取代成His殘基及位置672之Glu殘基取代成His殘基；(ii)E1-缺陷Ad載體，其包含經插入置換E1區位在CMV啟動子控制下且編碼聚合酶部分之核酸分子，該聚合酶部分包含SEQ ID NO：8或9所示胺基酸序列或SEQ ID NO：7所示胺基酸序列帶有位置494之Asp殘基取代成His殘基及位置672之Glu殘基取代成His殘基；及(iii)E1-缺陷Ad載體，其包含於經插入置換E1區位在CMV啟動子控制下且編碼核心部分及env部分之核酸分子，該核心部分及env部分包含如SEQ ID NO：20所示胺基酸序列或SEQ ID NO：20始於殘基1而終於殘基251之該部分或SEQ ID NO：20始於殘基1而終於殘基221之 該部分。
  24. 一種傳染性病毒粒子，包含如申請專利範圍第15或16項之核酸分子或如申請專利範圍第17至23項中任一項之載體。
  25. 如申請專利範圍第24項之傳染性病毒粒子，其中該傳染性病毒粒子係經由一種方法製造，該方法包含下列步驟：(a)將本發明之病毒載體導入適當細胞系，(b)於適當條件下培養該細胞系因而允許該傳染性病毒粒子之製造，(c)自該細胞系之培養回收所製造的傳染性病毒粒子，及(d)選擇性地純化該已回收之傳染性病毒粒子。
  26. 一種宿主細胞，包含如申請專利範圍第15或16項之核酸分子、如申請專利範圍第17至23項中任一項之載體或如申請專利範圍第24或25項之傳染性病毒粒子。
  27. 一種組成物，包含如申請專利範圍第15或16項之核酸分子、如申請專利範圍第17至23項中任一項之載體或如申請專利範圍第24或25項之傳染性病毒粒子或如申請專利範圍第26項之宿主細胞及藥學上可接受之載媒劑。
  28. 如申請專利範圍第27項之組成物，其進一步包含一或多種適合用於人類之系統性或黏膜施用之輔劑。
  29. 如申請專利範圍第27或28項之組成物，其係調配供肌肉或皮下投予。
  30. 一種如申請專利範圍第1至14項中任一項之免疫原性組成物、如申請專利範圍第15或16項之核酸分子、如申請專利範圍第17至23項中任一項之載體、如申請專利範圍第24或25項之傳染性病毒粒子、如申請專利範圍第26項之宿主細胞或如申請專利範圍第27至29項中任一項之組成物的用途，係供用於製備一用來治療或預防HBV感染或HBV相關疾病或病理狀況之醫藥品。
  31. 一種如申請專利範圍第1至14項中任一項之免疫原性組成物、如申請專利範圍第15或16項之核酸分子、如申請專利範圍第17至23項中任一項之載體、如申請專利範圍第24或25項之傳染性病毒粒子、如申請專利範圍第26項之宿主細胞或如申請專利範圍第27至29項中任一項之組成物的用途，係用於製備一用以治療患有慢性B型肝炎病毒感染之病人的醫藥品。
  32. 如申請專利範圍第30或31項之用途，其中該醫藥品係組合照護標準使用，該照護標準包含細胞激素及/或選自於由拉美夫定(lamivudine)、安提卡芙(entecavir)、特比夫定(telbivudine)、阿迪佛芙(adefovir)、底匹佛席(dipivoxil)及特諾佛芙(tenofovir)所組成之組群中之核苷酸或核苷類似物。
  33. 一種如申請專利範圍第1至14項中任一項之免疫原性組成物、如申請專利範圍第15或16項之核酸分子、如申請專利範圍第17至23項中任一項之載體、如申請專利範圍第24或25項之傳染性病毒粒子、如申請專利範圍第26項 之宿主細胞或如申請專利範圍第27至29項中任一項之組成物之用途，係供用於製備一用以誘導或刺激CD4+及/或CD8+媒介之細胞反應，以對抗宿主生物中之HBV的醫藥品。
  34. 一種用於HBV感染之治療之部件套件組，其中該套件組包含多種選自於由以下組成之組群之活性劑：如申請專利範圍第1至14項中任一項之免疫原性組成物、如申請專利範圍第15或16項之核酸分子、如申請專利範圍第17至23項中任一項之載體、如申請專利範圍第24或25項之傳染性病毒粒子、如申請專利範圍第26項之宿主細胞或如申請專利範圍第27至29項中任一項之組成物。
  35. 如申請專利範圍第34項之部件套件組，其包含一第一載體，該第一載體包含編碼如申請專利範圍第1及5至9項中任一項定義之聚合酶部分之核酸分子；及一第二載體，該第二載體包含編碼如申請專利範圍第1項之核心部分與如申請專利範圍第1及10至12項中任一項定義之env部分之核酸分子。
  36. 一種免疫原性組成物，其包含至少兩個獨立的載體之組合，該等載體編碼如申請專利範圍第1及5至12項中所定義之聚合酶部分、核心部分及env部分。
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