KR102658198B1 - 안정한 바이러스 함유 조성물 - Google Patents

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아흐마드 샤켑 세디크
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마르티누스 안네 호베 카펠레
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얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이.
버베리안 노딕 에이/에스
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Abstract

본 발명은 폭스바이러스, 특히 백시니아 바이러스, 예를 들어, 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스, 약 5 mM 내지 300 mM 농도의 설페이트 염, 및 완충제 를 포함하는 조성물 및 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 약 6.0 내지 8.5의 pH를 갖는다. 본 발명은 또한 상기 바이러스 제형을 제조하는 것을 포함하는 폭스바이러스 조성물을 안정화시키기 위한 방법을 개시한다.

Description

안정한 바이러스 함유 조성물
정부 지원의 진술
본 발명은 미국 보건복지부; 미국 질병 예방 대응 본부; 미국 생체의학 상급 연구개발 당국에 의해 수여되는 계약 HHSO100201500008C 하에 미국 정부의 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.
발명의 분야
본 발명은 저장에 적합한 폭스바이러스 함유 조성물 및 관련 약학 제품의 분야에 관한 것이다. 본원에 개시된 바와 같은 바람직한 조성물은 장기간 저장에 사용하기 위한 폭스바이러스, 예를 들어, 백시니아 바이러스 또는 변형된 백시니아 앙카라(vaccinia Ankara; MVA) 바이러스, 설페이트 염 및 완충제, 예를 들어, 포스페이트 또는 트리스-완충제를 포함하는 조성물이다. 조성물은 특히 다양한 병원체 또는 질병에 대한 백신 또는 치료제로 사용될 수 있다.
백시니아 바이러스 및 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스와 같은 폭스바이러스는 천연두에 대한 예방 백신으로 사용된다. 또한, 재조합 백시니아 바이러스 및 MVA는 현재 많은 병원체 또는 암을 포함하는 표적에 대한 예방적 또는 치료적 예방접종을 위한 많은 임상 연구에서 사용된다. 다른 생 또는 비활성화된 바이러스 백신과 마찬가지로, 예방적 또는 치료적 폭스바이러스 의약은 수용자 또는 환자에게 적용되기 전에 저장될 필요가 있고, 이에 따라 이들의 효능을 상실하지 않으면서 며칠, 몇 주 또는 몇 개월, 최대 몇 년에 걸쳐 저장될 필요가 있다. 폭스바이러스의 외피는 세포 진입에 관여하고, 대상체에서 원하는 면역 반응을 자극하기 위한 재조합 항원의 복제 또는 발현에 대한 필요 조건이므로, 바이러스 역가의 감소는 감염성 및 이에 따른 생성물의 효과의 변화와 서로 밀접히 연관된다.
일반적으로 외피 보유 바이러스는 외피가 결여된 것보다 저장 동안 더 큰 불안정성을 나타내며, 이는 지질 이중층이 바이러스 불안정성의 주요 요인임을 암시한다. 백시니아 바이러스는 특별히 큰 크기(약 200 내지 300 nm)를 가질 뿐만 아니라, 이들의 외피는 다른 바이러스의 외피보다 훨씬 더 복잡하다. 세포내의 둘러싸인 막에 더하여, 폭스바이러스는 이들이 표면으로부터 분리되는 경우에 추가 막을 획득한다. 따라서, 백시니아 바이러스를 안정화시키는 것은 다른 외피 보유 바이러스보다 훨씬 더 난제이다. 예를 들어, WO 2016/087457호에는 MVA의 안정성에 부정적인 영향을 미치는 다양한 첨가물을 갖는 여러 시험된 액체 제형이 개시되어 있다. 따라서, 광범위한 조건에 걸친 안정성을 보장하는 폭스바이러스에 대한 확실한 제형을 찾기 위한 맞춤화된 접근법이 필요하다.
WO 03/053463호 및 WO 2014/053571호에는 MVA를 포함하는 동결-건조된 제형이 개시되어 있다. 그러나, 동결-건조 공정은 보다 시간-소모적이고, 활성의 손실을 피하기 위해 건조 공정 동안 바이러스의 생물학적 활성을 보존시키기 위한 첨가물을 필요로 한다. 또한, 투여 전에 재구성 단계가 필요하며, 이는 투여 절차를 복잡하게 한다.
따라서, 당 분야에서는 생성물의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않으면서 연장된 기간에 걸친 저장 및 산업적 적용을 가능하게 하는 약학적 적용을 위한 안정한 폭스바이러스 백신 제형을 개발할 필요가 남아 있다. 더욱 특히, 잠재적으로 증가된 독성 또는 변경된 면역원성을 갖는 부산물의 형성 및/또는 바이러스 역가 손실은 최소로 제한되어야 한다. 백신은 또한 적용 및 임상적 사용 동안 전단력에 대해 보호되어야 하며, 특히 운송시 다양한 기후 상황에 따라 상승된 온도에 대해 보호되어야 하고, 부적절한 관찰 또는 콜드 체인(cold chain) 중단으로 인한 효능의 손실을 피해야 한다. 또한, 생성물의 제조, 저장 및 운송 동안 1회 이상의 동결 및 해동 주기 후에 활성을 유지할 필요가 있다. 바이러스 인코딩된 막 단백질을 함유하는 세포외 소포가 재조합 폭스바이러스 생성의 부산물이므로, 폭스바이러스(예를 들어, 백시니아 바이러스 또는 MVA)의 제형은 더욱 더 복잡하며, 바이러스 감염성에 영향을 미치는 많은 변수를 고려한 맞춤화된 접근법을 필요로 한다. 본 발명의 이들 및 다른 목적은 본 발명의 상세한 설명과 함께 추가로 상세히 기재될 것이다.
이들 및 다른 요구를 충족시키기 위해, 이전에 개시된 제형과 비교하여 개선된 열 안정성 및 진탕 스트레스에 대한 개선된 안정성을 갖는 폭스바이러스를 포함하는 조성물이 본원에 기재된다. 상기 조성물에 함유된 폭스바이러스는 이들의 효능 및 감염성을 유지한다. 이는 약 6.0 내지 8.5 범위의 pH를 갖는 완충제 중의 폭스바이러스에 약 5 mM 내지 300 mM 농도의 설페이트 염, 바람직하게는 소듐 설페이트를 첨가하여 달성되었다. 이들 조성물은, 예를 들어, 실온, -20℃ 저장 온도에서 저장하는 경우 또는 가속화된 스트레스 후에 바이러스의 응집 및 입체형태적 변화가 적고/적거나, 저장시 pH 변화가 적고/적거나, 혼탁도의 변화가 적은 것을 나타냄으로써 당 분야에 공지된 통상적인 조성물에 비해 개선된다. 구체적으로, 본 발명은 몇 주 또는 몇 개월 동안 25℃ 또는 더 긴 기간 동안 2℃ 내지 8℃ 및 동결 조건 외에서의 저장 수명의 표적 생성물 프로파일 특징을 달성할 것으로 예상된다. 본 발명은 또한 0℃ 미만, 특히 -20℃에서 몇 주 또는 몇 개월 또는 그 보다 더 긴 기간 동안의 저장 수명을 제공한다.
따라서, 본 발명은 a) 폭스바이러스; b) 완충제; 및 c) 약 5 mM 내지 300 mM 농도의 설페이트 염을 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 약 6.0 내지 8.5의 pH를 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 a) 폭스바이러스; b) 완충제; 및 c) 약 5 mM 내지 300 mM 농도의 설페이트 염을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 제형은 약 6.0 내지 8.5의 pH를 갖는다.
일부 구현예에서, 조성물 또는 약학적 조성물은 주사, 예를 들어, 근내, 피하, 정맥내 또는 비내 적용에 의한 투여에 적합하다. 예를 들어, 약학적 조성물은 병원체 또는 암에 대한 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 a) 폭스바이러스; b) 완충제; 및 c) 약 5 mM 내지 300 mM 농도의 설페이트 염을 포함하는 조성물을 제조하는 것을 포함하는 폭스바이러스 조성물을 안정화시키는 방법에 관한 것으로, 상기 조성물은 약 6.0 내지 8.5의 pH를 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 a) 폭스바이러스; b) 완충제; 및 c) 약 5 mM 내지 300 mM 농도의 설페이트 염을 포함하는 조성물을 제조하는 단계(여기서, 상기 조성물은 약 6.0 내지 8.5의 pH를 가짐) 및 2 섭씨 온도 내지 8 섭씨 온도 범위의 온도에서 상기 조성물을 저장하는 단계를 포함하는 폭스바이러스 조성물을 안정화시키는 방법에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 약 5 mM 내지 300 mM 농도의 설페이트 염을 폭스바이러스 조성물에 첨가하는 단계를 포함하는 폭스바이러스 조성물을 안정화시키는 방법에 관한 것이다.
본 명세서에 포함되고, 본 명세서의 일부를 구성하는 첨부 도면은 본 발명의 여러 구현예를 예시하며, 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명하는 역할을 한다. 본 발명은 도면에 제시된 정확한 구현예로 제한되지 않음이 이해되어야 한다.
도 1: Na2SO4가 없는 상이한 제형(A1-A4, 10 mM 트리스 pH 7.5, 8.0, 8.5 및 9.0) 및 100 mM Na2SO4를 갖는 상이한 제형(B1-B4, 10 mM 트리스 pH 7.5, 8.0, 8.5 및 9.0, 100 mM Na2SO4)에 대한 플루오로맥스 4(Fluoromax 4)를 이용하여 획득된 비등방성 결과. 흑색 선(*로 표시됨)은 가속화된 스트레스(1주 25℃) 전에 획득된 스캔을 제시하며, 회색 선은 스트레스 후를 제시한다.
도 2: 위에서 아래로: 적용된 가속화 스트레스(1주 25℃) 후의 pH 변화, 방출 피크 이동, 방출 강도의 변화, Z-평균 직경의 변화 및 다분산 지수(PDI)의 변화가 Na2SO4가 없는 상이한 제형(A1-A4; 10 mM 트리스 pH 7.5, 8.0, 8.5 및 9.0) 및 100 mM Na2SO4를 갖는 상이한 제형(B1-B4; 10 mM 트리스 pH 7.5, 8.0, 8.5 및 9.0, 100 mM Na2SO4)에 대해 제시된다.
도 3: 좌측에서 우측으로, 그래프의 각각의 열은 적용된 가속화된 스트레스(1일 37℃) 후의 혼탁도, Z-평균 직경 및 다분산 지수(PDI)의 변화를 제시한다. 제형의 상이한 그룹은 수직면, 즉, 위에서 아래로 배열된다: 염을 함유하지 않는 제형(제형 A1-A4), 100 mM Na2SO4를 함유하는 제형(제형 B1-B4), 100 mM CaCl2를 함유하는 제형(제형 C1-C4), 100 mM MgSO4를 함유하는 제형(제형 D1-D4), 100 mM MgCl2를 함유하는 제형(제형 E1-E4) 및 140 mM NaCl을 함유하는 제형(제형 F1-F4). 제형은 실시예 3에 충분히 기재되어 있다.
도 4: 좌측에서 우측으로, 그래프의 각각의 열은 적용된 가속화된 스트레스(1일 37℃) 후의 혼탁도, Z-평균 직경 및 다분산 지수(PDI)의 변화를 제시한다. 제형의 상이한 그룹은 수직면, 즉, 위에서 아래로 배열된다: 염을 함유하지 않는 제형(제형 A1-A4), 100 mM Na2SO4를 함유하는 제형(제형 B1-B4), 100 mM MgCl2를 함유하는 제형(제형 C1-C4), 및 100 mM NaCl을 함유하는 제형(제형 D1-D4). 제형은 실시예 4에 충분히 기재되어 있다.
도 5: 4개의 상이한 제형(대조군 A, 1, 대조군 B 및 3)에 대한 플루오로맥스 4를 이용하여 획득된 비등방성, 형광 방출 및 90도 광 산란 결과. *로 표시된 흑색 선은 T0에서의 스캔을 나타내는 반면, *가 없는 선은 5℃에서 3개월 저장 형태로 스트레스를 적용한 후의 스캔을 나타낸다. 제형은 실시예 6에 충분히 기재되어 있다.
도 6: 4개의 상이한 제형(대조군 A, 1, 대조군 B 및 3)에 대한 플루오로맥스 4를 이용하여 획득된 비등방성, 형광 방출 및 90도 광 산란 결과. *로 표시된 흑색 선은 T0에서의 스캔을 나타내는 반면, *가 없는 선은 -20℃에서 3개월 저장 형태로 스트레스를 적용한 후의 스캔을 나타낸다. 제형은 실시예 6에 충분히 기재되어 있다.
도 7: 4개의 상이한 제형(대조군 A, 1, 대조군 B 및 3)에 대한 플루오로맥스 4를 이용하여 획득된 비등방성, 형광 방출 및 90도 광 산란 결과. *로 표시된 흑색 선은 T0에서의 스캔을 나타내는 반면, *가 없는 선은 20회의 동결-해동 주기 형태로 가속화된 스트레스를 적용한 후의 스캔을 나타낸다. 제형은 실시예 6에 충분히 기재되어 있다.
도 8: 5개의 상이한 제형(대조군 A, 1, 대조군 B, 3 및 7)에 대한 플루오로맥스 4를 이용하여 획득된 비등방성, 형광 방출 및 90도 광 산란 결과. *로 표시된 흑색 선은 T0에서의 스캔을 나타내는 반면, *가 없는 선은 200 rpm에서 1일(24시간) 동안의 진탕 형태로 가속화된 스트레스를 적용한 후의 스캔을 나타낸다. 제형은 실시예 6에 충분히 기재되어 있다.
도 9: 좌측에서 우측으로, 그래프의 각각의 열은 혼탁도, Z-평균 직경 및 다분산 지수(PDI)를 제시한다. 위에서 아래로, 그래프는 제조 후(T0), 5℃에서 3개월 후(3M5C), -20℃에서 3개월 후(3M-20℃), 20회의 동결-해동 주기 후(20FT) 및 1일 진탕 후(AG)의 값을 제시한다. 이들 그래프의 x-축 상에 제형이 배열된다(대조군 A, 1, 대조군 B, 3 및 7). 제형은 실시예 6에 충분히 기재되어 있다.
본 명세서는 본 발명의 특징을 포함하는 하나 이상의 구현예를 개시한다. 개시된 구현예는 단지 본 발명을 예시한다. 본 발명의 범위는 개시된 구현예로 제한되지 않는다.
다양한 간행물, 논문, 특허 출원 및 특허가 배경 및 명세서 전체에 걸쳐 인용되거나 기재되며; 이들 참고문헌 각각은 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다. 참조로서 포함된 자료가 본 명세서와 모순되거나 일치하지 않는 경우, 본 명세서는 임의의 상기 자료를 대신할 것이다. 본 명세서에 포함된 문서, 행위, 물질, 장치, 물품 등의 논의는 본 발명에 상황을 제공하기 위한 것이다. 상기 논의는 이들 주제 중 임의의 주제 또는 모든 주제가 개시되거나 청구된 임의의 발명과 관련하여 선행 기술의 일부를 형성한다고 인정하는 것이 아니다.
본원에 기재된 특정 방법, 프로토콜 및 시약은 다양할 수 있으므로 본 발명은 본원에 기재된 특정 방법, 프로토콜 및 시약으로 제한되지 않음이 이해되어야 한다. 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 기재하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아님이 또한 이해되어야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 그렇지 않은 경우, 본원에서 사용된 특정 용어는 명세서에서 설정된 바와 같은 의미를 갖는다.
본원 및 첨부된 청구항에서 사용되는 바와 같은 단수 형태는 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함하는 것이 인지되어야 한다. 따라서, 예를 들어, "핵산"에 대한 언급은 하나 이상의 핵산 서열을 포함하고, "방법"에 대한 언급은 본원에 기재된 방법에 대해 변형되거나 치환될 수 있는 당업자에게 공지된 동등한 단계 및 방법에 대한 언급을 포함한다.
달리 지시되지 않는 한, 일련의 요소에 선행하는 용어 "적어도"는 그 일련 내의 모든 요소를 나타내는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 달리 언급되지 않는 한, 임의의 수치 값, 예를 들어, 본원에 기재된 농도 또는 농도 범위는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 변형되는 것으로 이해되어야 하는 것이 인지되어야 한다. 본 명세서 전체에 걸쳐, 임의의 양 또는 농도와 관련하여 용어 "약"은 그 양을 포함하는 것으로 고려된다. 예를 들어, "약 5 mM"은 5 mM뿐만 아니라 기재된 실체와 관련하여 대략 5 mM인 것으로 이해되는 값을 포함하는 것으로 본원에서 고려된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 수치 범위의 사용은 문맥이 명백히 달리 나타내지 않는 한 모든 가능한 하위범위, 상기 범위 내의 정수 및 값의 분수를 포함하는 상기 범위 내의 모든 개별적 수치 값을 명백히 포함한다. 마찬가지로, 본 발명의 맥락에서 본원에서 사용되는 임의의 수치 값 또는 범위에 선행하는 용어 "약"은 삭제될 수 있고, 덜 바람직하긴 하지만 용어 "약"이 없는 수치 값 또는 범위로 대체될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 다수의 언급된 요소 사이의 결합 용어 "약/또는"은 개별 및 조합 옵션 모두를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 2개의 요소가 "및/또는"으로 결합되는 경우, 첫 번째 옵션은 두 번째 요소가 없는 첫 번째 요소의 적용 가능성을 나타낸다. 두 번째 옵션은 첫 번째 요소가 없는 두 번째 요소의 적용 가능성을 나타낸다. 세 번째 옵션은 첫 번째 및 두 번째 요소 동시의 적용 가능성을 나타낸다. 이들 옵션 중 어느 하나는 상기 의미에 속하는 것으로 이해되므로, 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "및/또는"의 요건을 만족시킨다. 하나 초과의 옵션의 동시 적용 가능성이 또한 상기 의미에 속하는 것으로 이해되므로, 용어 "및/또는"의 요건을 만족시킨다.
본 명세서 및 후속되는 청구항 전체에 걸쳐, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 용어 "-들을 포함하다", 및 이의 변형, 예를 들어, "-을 포함하다" 및 "포함하는"은 언급된 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 그룹의 포함을 의미하나, 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹의 배제를 의미하지 않음이 이해될 것이다. 본원에서 사용되는 경우, 용어 "포함하는"은 용어 "함유하는" 또는 "포함하는"으로 대체될 수 있거나, 본원에서 사용되는 경우 용어 "갖는"으로 대체될 수 있다. 상기 언급된 용어(포함하는, 함유하는, 포함하는, 갖는) 중 임의의 용어는 본 발명의 양태 또는 구현예의 맥락에서 본원에서 사용될 때마다 덜 바람직하긴 하지만 용어 "구성되는" 또는 "본질적으로 포함하는"으로 대체될 수 있다.
본원에서 사용되는 경우, "구성되는"은 청구항 요소에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 본원에서 사용되는 경우, "본질적으로 포함하는"은 청구항의 기본 및 신규한 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계를 배제하지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "응집"은 2개 이상의 단백질 또는 바이러스가 축적되고/되거나 함께 응집되는 과정을 나타낸다. 응집은 온전한 천연 단백질뿐만 아니라 분해된 단백질에 대해서도 발생할 수 있다. 종종, 단백질 응집은 단백질의 소수성 기의 노출에 의해 야기되며, 이는 이후에 축적된다. 바이러스 응집은 바이러스 외피에서 발현된 단백질의 변형으로 인해 발생할 수 있다.
용어 "핵산", "뉴클레오티드 서열", "핵산 서열" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 선형 또는 분지형, 단일 또는 이중 가닥, 또는 이들의 하이브리드인 RNA 또는 DNA를 나타낸다. 상기 용어는 또한 RNA/DNA 하이브리드를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 화학적 합성에 의해 획득되거나 미생물로부터 유래될 수 있다. 재조합 바이러스와 관련하여 사용되는 경우 용어 "외인성" 핵산 서열은 외래 핵산 서열, 재조합 바이러스를 생성시키기 위해 사용되거나 재조합 바이러스를 생성시키는 동안 바이러스 유전체에 삽입되는 비-재조합 바이러스에 함유되지 않는 핵산 서열을 의미한다.
용어 "의약", "약학적 조성물" 및 "약제"는 질병의 예방 또는 치료에 사용되는 물질 및/또는 물질의 조합을 지칭하여 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
"약학적으로 허용되는"은 사용되는 투여량 및 농도의 담체, 첨가제, 항생제, 보존제, 애쥬번트, 희석제, 안정화제 또는 부형제가 이들이 투여되는 대상체(들)에서 임의의 원치 않거나 유해한 효과(들)을 야기시키지 않음을 의미한다.
용어 "대상체" 및 "환자"는 상호교환적으로 사용된다. 본원에서 사용되는 대상체는 전형적으로 포유동물, 예를 들어, 비-영장류(예를 들어, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트 등) 또는 영장류(예를 들어, 원숭이 및 인간) 및, 일부 바람직한 구현예에서, 인간이다.
본 발명에 따르면, "바이러스"는 바이러스, 바이러스 입자, 바이러스 벡터 및 바이러스 백신을 의미한다. 상기 용어는 모두 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 용어는 야생형 바이러스, 재조합 및 비-재조합 바이러스, 생 바이러스 및 생-약독화 바이러스를 포함한다.
본 발명의 실시는 달리 지시하지 않는 한 당 분야의 기술 범위 내에 있는 분석학, 면역학, 분자생물학, 미생물학, 세포생물학 및 재조합 DNA의 통상적인 기술을 이용할 것이다. 예를 들어, 문헌[Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel FM, et al., eds, 1987; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR2: A Practical Approach, MacPherson MJ, Hams BD, Taylor GR, eds, 1995; Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds, 1988]을 참조한다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 달리 언급되는 경우를 제외하고는, pH와 같은 물리적 파라미터의 값은 25℃에서 측정된 것이다.
본 발명은 약 6.0 내지 8.5 범위의 pH를 갖는, 약 5 mM 내지 300 mM 농도의 설페이트 염 및 완충제를 포함하는 폭스바이러스의 조성물에 관한 것이다.
용어 "조성물"은 하나 이상의 추가 성분과 함께 활성 약학적 또는 생물학적 성분, 예를 들어, 재조합 MVA를 함유하는 제형을 나타낸다. 용어 "조성물" 및 "제형"은 본원에서 용어 "약학적 조성물", "백신 조성물", "백신" 및 "백신 제형"과 상호교환적으로 사용된다.
특정 구현예에서, 제형, 조성물, 약학적 조성물, 백신 조성물, 백신 또는 백신 제형은 안정한 또는 안정화된 조성물이다.
모두 상호교환적으로 사용될 수 있는 "안정한", "안정화된", "안정성" 또는 "안정화되는"에 의해, 본 발명의 조성물에 함유되는 폭스바이러스는 본질적으로 약학적 조성물의 저장 수명에 필요한 저장시 이의 물리적 안정성, 동일성, 온전성, 및/또는 화학적 안정성, 동일성, 온전성, 입자 형태 및/또는 생물학적 활성 또는 효능을 보유하는 것으로 이해된다.
안정성을 측정하기 위한 다양한 분석 기술은 당업자에게 공지되어 있으며, 안정성을 결정하는 상기 특징은 실시예에서 더욱 상세히 기재되는 바와 같은 고유 형광, 비등방성, 동적 광 산란, pH 측정, 350 nm에서의 혼탁도 측정 및 90도 광 산란으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법 중 적어도 하나에 의해 결정될 수 있다. 안정성은 선택된 기간 동안 선택된 온도 및 다른 저장 조건에서 측정될 수 있다.
입자 형태를 결정하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 입자 형태는, 예를 들어, 문헌[Schweneker et al., Recombinant modified vaccinia virus Ankara generating Ebola virus-like particles. J. of Virology 22 March 2017]에 기재된 바와 같이 투과 전자 현미경 및 면역전자 현미경(면역-EM)을 이용하여 결정될 수 있다. 입자 형태를 결정하는 대안적 방법은, 예를 들어, 문헌[Vasco et al. (2010), Critical Evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the Measurement of Nanoparticles and Protein Aggregates. Pharmaceutical Research. 27: 796-810]에 기재된 나노입자 추적 분석(NTA)이다. 나노입자 추적 분석(NTA)은 액체에서 입자 크기 분포 및 응집의 직접 및 실시간 시각화 및 분석을 위한 방법이다. 레이저 조명 현미경 기술을 기초로 하여, 나노입자의 브라운 운동은 전하 결합 소자(CCD) 카메라에 의해 실시간으로 분석되며, 각각의 입자는 전용 입자 추적 이미지-분석 프로그램에 의해 동시에 그러나 개별적으로 시각화되고 추적된다. 입자 크기 및 입자 산란 강도를 동시에 측정하는 NTA의 능력은 이종성 입자 혼합물이 분석되고, 입자 농도가 직접 추정되는 것을 가능하게 한다.
본원에서 사용되는 용어 "효능" 또는 "감염성"은 InfU/mL로 일반적으로 제공되는 감염 담위(InfU) 또는 TCID50/mL으로 제공되는 조직 배양 감염 용량 50(TCID50)으로 표현되는 폭스바이러스(예를 들어, 백시니아 바이러스 또는 MVA)의 활성을 나타낸다. 용어 "효능" 및 "감염성" 둘 모두는 본 발명에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. MVA와 같은 폭스바이러스의 효능은, 예를 들어, 형광 활성화 세포 분류기(FACS) 검정 또는 조직 배양 감염 용량 50(TCID50) 검정에 의해 당업자에게 공지된 다양한 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 예시적 FACS 검정 및 TCID50 검정은 실시예에 기재된다.
본원에서 사용되는 용어 "저장 수명"은 생성물이 인간 약물로서 사용하기 위해 특정 저장 조건(예를 들어, 2℃ 내지 8℃에서의 저장) 하에서 생성물 특징에 따라 활성이고/이거나 안정된 채로 남아 있는 시간을 의미한다. 저장 수명은 제공된 명세의 하한 또는 상한을 초과하는 시점에 해당한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 임의의 구현예의 조성물은 4℃에서 6개월 동안 저장시 시작 감염성(0일)의 적어도 50%, 60%, 79%, 80% 또는 90%의 감염성을 갖는 것으로 추가로 정의된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 임의의 구현예의 조성물은 25℃에서 3개월 동안 저장시 시작 감염성(0일)의 적어도 50%, 60%, 79%, 80% 또는 90%의 감염성을 갖는 것으로 추가로 정의된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 임의의 구현예의 조성물은 -20℃에서 3개월, 바람직하게는 6개월 동안 저장시 시작 감염성(0일)의 적어도 50%, 60%, 79%, 80% 또는 90%의 감염성을 갖는 것으로 추가로 정의된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 임의의 구현예의 조성물은 4℃에서 6개월 동안 저장시 시작 감염성(0일)의 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 이하의 감염성의 감소를 갖는다.
특정 구현예에서, 본 발명의 임의의 구현예의 조성물은 25℃에서 3개월 동안 저장시 시작 감염성(0일)의 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 이하의 감염성의 감소를 갖는다.
특정 구현예에서, 본 발명의 임의의 구현예의 조성물은 -20℃에서 3개월, 바람직하게는 6개월 동안 저장시 시작 감염성(0일)의 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 이하의 감염성의 감소를 갖는다.
특정 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 3주(바람직하게는, 3개월, 6개월 또는 적어도 1년) 동안 25℃(+/- 5℃)에서 바이러스 역가의 전체 손실이 0.5 log10 InfU/mL 또는 TCID50/mL 미만, 바람직하게는 0.4 log10 InfU/mL 또는 TCID50/mL 미만, 더욱 바람직하게는 0.3 log10 InfU/mL 또는 TCID50/mL 미만인 경우에 안정적이다.
본 발명에 따른 "바이러스 역가의 전체 손실"은 log10 TCID50/mL로 제공되는 지정된 온도 n(예를 들어, 37℃) 및 시간 t(예를 들어, 1주)에서 조성물의 저장 동안 측정된 바이러스 역가에서의 누적 손실로 정의된다. 대안적으로, 이는 log10 InfU/mL로 제공될 수 있다. 바이러스 역가의 전체 손실은 xlog10(예를 들어, 1주 동안 37℃에서 0.5 log10)으로 제공된다.
다양한 구현예에서, 가속화된 스트레스는 조성물의 안정성 평가를 단축시키기 위해 상승된 온도, 예를 들어, 1주 동안 37℃에서 수행되는 가속화된 안정성 연구를 이용하여 측정될 수 있다. 상기 가속화된 안정성 연구는 실제 데이터를 기다릴 필요 없이 보다 높은 온도에서 안정성을 예측하는 것을 가능하게 한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 저장 동안의 바이러스 역가의 손실은 적어도 3개월 동안 5℃ +/- 3℃에서 0.4 log10 InfU/mL 또는 TCID50/mL 미만, 바람직하게는 적어도 3개월 동안 5℃ +/- 3℃에서 0.3 log10 InfU/mL 또는 TCID50/mL 미만, 더욱 바람직하게는 적어도 3개월 동안 5℃ +/- 3℃에서 0.2 log10 InfU/mL 또는 TCID50/mL 미만이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 저장 동안의 바이러스 역가의 손실은 적어도 3개월 동안 -20℃ +/- 3℃에서 0.4 log10 InfU/mL 또는 TCID50/mL 미만, 바람직하게는 적어도 3개월 동안 -20℃ +/- 3℃에서 0.3 log10 InfU/mL 또는 TCID50/mL 미만, 더욱 바람직하게는 적어도 3개월 동안 -20℃ +/- 3℃에서 0.2 log10 InfU/mL 또는 TCID50/mL 미만이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 저장 동안의 바이러스 역가의 손실은 적어도 3개월 동안 -50℃ +/- 3℃에서 0.4 log10 InfU/mL 또는 TCID50/mL 미만, 바람직하게는 적어도 3개월 동안 -50℃ +/- 3℃에서 0.3 log10 InfU/mL 또는 TCID50/mL 미만, 더욱 바람직하게는 적어도 3개월 동안 -50℃ +/- 3℃에서 0.2 log10 InfU/mL 또는 TCID50/mL 미만이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 저장 동안의 바이러스 역가의 손실은 적어도 3개월 동안 -80℃ +/- 3℃에서 0.4 log10 InfU/mL 또는 TCID50/mL 미만, 바람직하게는 적어도 3개월 동안 -80℃ +/- 3℃에서 0.3 log10 InfU/mL 또는 TCID50/mL 미만, 더욱 바람직하게는 적어도 3개월 동안 -80℃ +/- 3℃에서 0.2 log10 InfU/mL 또는 TCID50/mL 미만이다.
폭스바이러스 역가를 결정하는 검정은, 예를 들어, 문헌[Kaufmann and Kabelitz (2002), Methods in Microbiology Volume 32: Immunology of Infection, Academic Press, ISBN 0125215320]에 기재되어 있다. 검정으로부터의 역가는 밀리리터 당 플라크 형성 단위(PFU/mL)로 보고된다. 본 발명에 사용된 바와 같은 FACS 검정 및 TCID50 검정은 실시예에 기재되어 있으며, 대안적으로 임의의 다른 적합한 방법에 추가로 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 수성 조성물이다. 특정 구현예에서, 조성물은 실온(예를 들어, 주위 온도), 약 -20℃ 내지 25℃, 약 -20℃ 내지 4℃, 약 2℃ 내지 25℃, 또는 약 2℃ 내지 8℃에서의 저장에 적합하다. 임의의 구현예의 조성물은 액체 또는 동결된 액체일 수 있다. 본 발명의 조성물은 3개월, 6개월, 9개월, 12개월, 24개월 초과 동안 약 -20℃ 내지 25℃, 약 -20℃ 내지 4℃, 약 2℃ 내지 25℃, 또는 약 2℃ 내지 8℃ 또는 각각의 특정된 온도 범위에서 연장된 저장이 가능하다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 폭스바이러스를 포함하는 조성물은 6개월, 9개월, 12개월, 24개월 초과 동안 2℃ 내지 8℃에서 연장된 저장이 가능하다. 본원에서 사용되는 "실온" 또는 주위 "온도"는 25℃ +/-3℃의 온도이다.
본 발명의 폭스바이러스
본 발명에 따른 폭스바이러스는 인간을 감염시킬 수 있는 폭스바이러스의 임의의 속(예를 들어, 오르토폭스바이러스, 아비폭스바이러스, 파라폭스바이러스, 야타폭스바이러스, 및 몰루시폭스바이러스)을 나타낸다.
다양한 구현예에서, 폭스바이러스는 오르토폭스바이러스 및 아비폭스바이러스의 군으로부터 선택된다.
본 발명의 개시의 다양한 구현예에서, 폭스바이러스는 바람직하게는 아비폭스바이러스이다. 아비폭스바이러스는 카나리폭스 바이러스(CNPV) 및 조류폭스 바이러스(FWPV)를 포함한다.
본 발명의 개시의 다양한 구현예에서, 폭스바이러스는 바람직하게는 오르토폭스바이러스(OPV)이다. 본 발명에 따른 오르토폭스바이러스는 천연두 바이러스(바리올라 바이러스로도 공지됨), 백시니아 바이러스, 우두 바이러스, 및 원숭이폭스 바이러스를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 다양한 구현예에서, 폭스바이러스는 백시니아 바이러스 또는 FWPV이다.
다수의 FWPV 균주가 본 발명에 적합하다. 이들은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, WO 2016/034678호에서 FPV로 기재되어 있다. 적합한 FWPV는 FP1, FP5, FP9, FPV M, FPV S, ATCC® VR-229, ATCC® VR-250, USDA 균주 및 POXVAC-TC를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 폭스바이러스는 백시니아 바이러스(VACV)이다. 적합한 VACV는, 예를 들어, 앙카라(Ankara), VACV 웨스턴 리저브(VACV Western Reserve; WR), VACV 코펜하겐(VACV Copenhagen; VACV-COP), 템플 오브 헤븐(Temple of Heaven), 파리(Paris), 부다페스트(Budapest), 다롄(Dairen), 괌(Gam), MRIVP, 퍼(Per), 타쉬켄트(Tashkent), TBK, 천단(Tian Tan), 톰(Tom), 베른(Bern), 파트와단가(Patwadangar), BIEM, B-15, EM-63, IHD-J, IHD-W, 이케다(Ikeda), DryVax(예를 들어, 미국 특허 7,410,644호에 기재된 바와 같은 VACV Wyeth 또는 뉴욕시 보건 정신 위생국(New York City Board of Health) [NYCBH] 균주로도 공지됨), NYVAC, ACAM1000, ACAM2000, 백시니아 리스터(Vaccinia Lister)(엘스트리(Elstree)로도 공지됨), LC16mO, LC16m8, 변형된 백시니아 앙카라(MVA), 국제 특허 출원 PCT/EP01/02703호(WO 01/68820호)에서 특성규명된 바와 같은 MVA-Vero, ACAM3000 MVA, 및 변형된 백시니아 바이러스 앙카라-바바리안 노르딕(Bavarian Nordic)(MVA-BN)을 포함한다.
일부 구현예에서, VACV는 DryVax, ACAM1000, ACAM2000, 리스터(Lister), EM-63, VACV-COP, WR, NYCBH, NYVAC 및 MVA의 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일부 구현예에서, 폭스바이러스는 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스이다.
변형된 백시니아 바이러스 앙카라( MVA )
다양한 구현예에서, 본 발명에 적합한 재조합체를 생성시키는 데 사용되는 MVA 또는 MVA는 MVA-572, MVA-575, MVA-I721, ATCC® VR-1508™으로 기탁된 MVA, ATCC® VR-1566™으로 기탁된 MVA, ACAM3000 MVA, MVA-BN 또는 임의의 유사하게 약독화된 MVA 균주이다. 바람직한 구현예에서, 재조합체를 생성시키는 데 사용되는 MVA는 MVA-575, ATCC® VR-1508™으로 기탁된 MVA, ATCC® VR-1566™으로 기탁된 MVA, ACAM3000 MVA 및 MVA-BN이다. 더욱 바람직하게는, 재조합체를 생성시키는 데 사용되는 MVA는 MVA-BN이다.
MVA-572는 1994년 1월 27일에 기탁 번호 ECACC V94012707로 유럽 동물 세포 배양물 컬렉션(European Collection of Animal Cell Cultures)(ECACC, Vaccine Research and Production Laboratory, Public Health Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, United Kingdom)에 기탁되었다. MVA-575는 2000년 12월 7일에 ECACC V00120707로 기탁되었다. Acam3000 MVA는 2003년 3월 27일에 등록 번호 PTA-5095로 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)(American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA)에 기탁되었다. MVA-I721은 국립 미생물 배양물 컬렉션, 파스퇴르 연구소(Collection Nationale de Cultures de Microorganisms, Institute Pasteur)에 CNCM I721로 기탁되었다. MVA-BN은 2000년 8월 30일에 번호 V00083008로 ECACC에 기탁되었다. MVA-BN은 국제 PCT 공개 WO 02/042480호(예를 들어, 또한 미국 특허 번호 6,761,893호 및 6,913,752호 참조)에 기재되었다.
본원에 기재된 임의의 MVA 바이러스 또는 MVA-BN의 유도체 또는 변형이 또한 본 발명에 포함된다. MVA 또는 MVA-BN의 "유도체" 또는 "변형"은 언급되는 MVA 또는 MVA-BN와 동일한 복제 특징을 본질적으로 나타내지만, 이들의 유전체 중 하나 이상의 부분에서 차이를 나타내는 MVA 또는 MVA-BN 바이러스를 나타낸다. 기탁된 바이러스와 동일한 "복제 특징"을 갖는 바이러스는 CEF 세포 및 세포주 HaCat(Boukamp et al. [1988], J Cell Biol 106: 761-771), 인간 뼈 골육종 세포주 143B(ECACC No. 91112502), 인간 배아 신장 세포주 293(ECACC No. 85120602), 및 인간 자궁경부 샘암종 세포주 HeLa(ATCC No. CCL-2)에서 기탁된 균주와 유사한 증폭 비율로 복제하는 바이러스이다. MVA, 이의 유도체 및 변형의 이들 특성을 결정하기 위한 시험 및 검정은 WO 02/42480호에 기재된 바와 같은 세포주 허용성(permissivity) 검정과 같이 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예시적 세포주 허용성 검정에서, 포유동물 세포주는 낮은 세포 당 감염 다중도, 즉, 세포 당 0.05 감염 단위(5 x 104 TCID50)에서 비경구 및 유도체 또는 변형 MVA 바이러스로 감염된다. 1시간의 흡수 후, 바이러스 접종물을 제거하고, 세포를 3회 세척하여 임의의 남아 있는 흡수되지 않은 바이러스를 제거하였다. 3% FCS가 보충된 신선한 배지가 첨가되고, 바이러스 추출물이 제조될 수 있는 전체 4일 동안(37℃, 5% CO2) 감염이 유지된다. 감염은 -80℃에서 플레이트를 3회 동결시켜 중지된다. 바이러스 증식 및 세포병변 효과(CPE)는 이후 문헌[Carroll and Moss [1997], Virology 238, 198-211]에 기재된 것과 같이 당업자에게 널리 공지된 방법을 이용하여 CEF 세포에 대해 결정된다.
보다 구체적으로, MVA-BN 또는 MVA-BN의 유도체 또는 변형은 바람직하게는 닭 배아 섬유모세포(CEF)에서 생식 복제 능력을 갖지만, 인간 각질세포 세포주 HaCat(Boukamp et al (1988), J. Cell Biol. 106:761-771), 인간 뼈 골육종 세포주 143B(ECACC 기탁 번호 91112502), 인간 배아 신장 세포주 293(ECACC 기탁 번호 85120602), 및 인간 자궁경부 샘암종 세포주 HeLa(ATCC 기탁 번호 CCL-2)에서는 생식 복제 능력을 갖지 않는다. 또한, MVA-BN의 유도체 또는 변형은 Hela 세포 및 HaCaT 세포주에서 MVA-575보다 적어도 2배, 더욱 바람직하게는 3배 더 적은 바이러스 증폭 비율을 갖는다. MVA 변형의 이들 특성에 대한 시험 및 검정은 WO 02/42480호 또는 상기 기재된 바와 같은 예시적 세포주 허용성 검정에 기재된다.
용어 "생식 복제할 수 없음" 또는 "생식 복제 능력 없음"은, 예를 들어, 상기 언급된 바와 같은 원하는 특성을 갖는 MVA를 획득하는 방법을 또한 교시하는 WO 02/42480호에 기재되어 있다. 상기 용어는 WO 02/42480호 또는 미국 특허 번호 6,761,893호에 기재된 검정을 이용하여 감염 4일 후에 1 미만의 바이러스 증폭 비율을 갖는 바이러스에 적용된다.
용어 "생식 복제 실패"는 감염 4일 후에 1 미만의 바이러스 증폭 비율을 갖는 바이러스를 나타낸다. WO 02/42480호 또는 미국 특허 번호 6,761,893호에 기재된 검정은 바이러스 증폭 비율의 결정에 적용될 수 있다.
바이러스의 증폭 또는 복제는 일반적으로 "증폭 비율"로 언급되는 처음에 세포를 감염시키는 데 본래 사용된 양(투입량)에 대한 감염된 세포로부터 생성된 바이러스(산출량)의 비로 표현된다. "1"의 증폭 비율은 감염된 세포로부터 생성된 바이러스의 양이 세포를 감염시키는 데 초기에 사용된 양과 동일한 증폭 상태를 정의하며, 이는 감염된 세포가 바이러스 감염 및 생식에 허용된다는 것을 의미한다. 대조적으로, 1 미만의 증폭 비율, 즉, 투입량 수준에 비한 산출량에서의 감소는 생식 복제의 부족 및 이에 따라 바이러스의 약화를 나타낸다.
특정 구현예에서, 임의의 조성물에 포함되는 MVA는 바람직하게는 등록 번호 V00083008로 유럽 동물 세포 배양물 컬렉션(ECACC)에 기탁된 MVA-BN 또는 이의 유도체이다.
일부 구현예에서, 임의의 조성물에 포함된 MVA는 닭 배아 섬유모세포(CEF) 세포에서 시험관 내에서 생식 복제 능력을 갖지만, 인간 각질세포 세포주 HaCat, 인간 뼈 골육종 세포주 143B, 인간 배아 신장 세포주 293, 및 인간 자궁경부 샘암종 세포주 HeLa에서 생식 복제 능력을 갖지 않는 MVA-BN 바이러스 또는 이의 유도체이다.
일부 구현예에서, 임의의 조성물에 포함된 MVA는 바람직하게는 닭 배아 섬유모세포(CEF) 세포에서 시험관 내에서 생식 복제 능력을 갖지만, 인간 각질세포 세포주 HaCat, 인간 뼈 골육종 세포주 143B, 인간 배아 신장 세포주 293, 및 인간 자궁경부 샘암종 세포주 HeLa에서 생식 복제 능력을 갖지 않는 등록 번호 V00083008로 유럽 동물 세포 배양물 컬렉션(ECACC)에 기탁된 MVA-BN 바이러스 또는 이의 유도체이다.
바람직한 구현예에서, 폭스바이러스 또는 본원에 개시된 임의의 바람직한 바이러스는 정제되거나 부분적으로 정제된 바이러스이다. 폭스바이러스, 예를 들어, VACV 또는 MVA의 생성 및 정제 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 하기에 추가로 기재된다.
임의의 구현예의 폭스바이러스 바이러스는 재조합 또는 비-재조합 폭스바이러스, 바람직하게는 재조합 백시니아 바이러스, 더욱 바람직하게는 재조합 MVA일 수 있다. 용어 "재조합"은 모 바이러스에 자연적으로 존재하지 않는 이의 유전체에 삽입된 외인성 핵산 서열을 포함하는 바이러스, 더욱 특히 폭스바이러스를 나타낸다. 재조합 바이러스(예를 들어, 폭스바이러스, 비제한적인 예로, MVA)는 따라서 자연에서 발생하지 않거나, 자연에서 발견되지 않는 배열로 또 다른 핵산에 연결된 합성 또는 반합성 기원의 핵산 서열의 2개 이상의 세그먼트의 인공 조합에 의해 제조된 핵산 또는 바이러스를 나타낸다. 인공 조합은 널리 확립된 유전 공학 기술을 이용하여 핵산의 분리된 세그먼트의 인공 조작에 의해 가장 일반적으로 달성된다. 일반적으로, 본원에 기재된 바와 같은 "재조합" 폭스바이러스는 표준 유전 공학 방법에 의해 생성되는 폭스바이러스를 나타내며, 예를 들어, 본 발명의 MVA는 이에 따라 유전 조작 또는 유전 변형 MVA이다. 따라서, 용어 "재조합 MVA"는 바람직하게는 이의 유전체에 전사 단위의 형태로 안정적으로 통합된 재조합 핵산을 갖는 MVA(예를 들어, MVA-BN)를 포함한다. 전사 단위는 프로모터, 인핸서, 종결자 및/또는 사일런서를 포함할 수 있다. 본 발명의 재조합 MVA는 조절 요소의 유도시 이종성 항원 결정기, 폴리펩티드 또는 단백질(항원)을 발현할 수 있다.
용어 "항원 결정기"는 숙주의 면역계를 자극하여 세포 반응이거나 체액성 항체 반응이건 간에 항원-특이적 면역 반응을 발생시키는 임의의 분자를 나타낸다. 항원 결정기는 숙주에서 면역 반응을 유도하고 항원의 일부를 형성하는 단백질, 폴리펩티드, 항원성 단백질 단편, 항원, 및 에피토프, 예를 들어, 당화 단백질, 폴리펩티드, 항원성 단백질 단편, 항원 및 에피토프를 포함하는 단백질, 폴리펩티드 및 항원성 단백질 단편, 및 에피토프의 동족체 또는 변형, 및 상기 분자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 유전자를 포함할 수 있다. 따라서, 단백질, 폴리펩티드, 항원성 단백질 단편 및 에피토프는 특정 천연 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열로 제한되지 않고, 천연 서열과 동일한 서열뿐만 아니라 결실, 첨가, 삽입 및 치환과 같은 천연 서열에 대한 변형을 포함한다.
항원 결정기의 상황에서 사용되는 경우 용어 "유도체" 및 "변형"은 바람직하게는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 수준에서 특정 단백질, 폴리펩티드, 항원성 단백질 단편, 항원 및 에피토프에서 언급된 항원 결정기와 적어도 약 50%, 적어도 약 60% 또는 65%, 적어도 약 70% 또는 75%, 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% 또는 89%, 더욱 전형적으로 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93% 또는 94%, 더욱 더 전형적으로 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 가장 전형적으로 적어도 약 99%의 동일성을 갖는다. 핵산과 아미노산 사이의 서열 동일성을 결정하기 위한 기술은 당 분야에 공지되어 있다. 2개 이상의 서열은 이의 "동일성 백분율"을 결정함으로써 비교될 수 있다. 핵산이거나 아미노산 서열이건 간에 2개의 서열의 동일성 백분율은 2개의 정렬된 서열 사이의 정확한 일치의 수를 더 짧은 서열의 길이로 나누고, 100을 곱한 것이다.
용어 "에피토프"는 단독이거나, 예를 들어, 주요 조직적합성 복합체("MHC") 단백질 또는 T-세포 수용체와 같은 또 다른 단백질과 협력하는, B-세포 및/또는 T-세포가 반응하는 항원 상의 부위를 나타낸다. 에피토프는 단백질의 이차 및/또는 삼차 폴딩에 의해 병렬된 연속 아미노산 또는 비연속 아미노산 둘 모두로부터 형성될 수 있다. 연속 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 노출시 유지되는 반면, 삼차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 변성 용매로 처리시 전형적으로 손실된다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간적 입체형태로 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 아미노산(그러나, 일반적으로 20개 미만의 아미노산)을 포함한다. 에피토프의 공간적 입체형태를 결정하는 방법은, 예를 들어, x-선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명을 포함한다. 예를 들어, 문헌["Epitope Mapping Protocols" in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed (1996)]을 참조한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 재조합 바이러스는 이의 유전체에 삽입된 외인성 핵산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스이다.
본원에서 사용되는 용어 "외인성"은 언급된 분자가 바이러스 유전체로 도입되는 것을 의미한다. 분자는, 예를 들어, 바이러스 유전체로의 인코딩 핵산의 도입에 의해 도입될 수 있다. 따라서, 외인성 핵산의 발현과 관련하여 사용되는 상기 용어는 바이러스로의 발현 가능한 형태의 인코딩 핵산의 도입을 나타낸다. 대조적으로, 용어 "내인성"은 숙주에 존재하는 언급된 분자를 나타낸다.
특정 구현예에서, 본 발명의 재조합 바이러스는 이의 유전체에 삽입된 외인성 핵산 서열을 발현하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스이다.
상호교환적으로 사용될 수 있는 본원에서 사용되는 용어 "발현된", "발현하다", "발현하는", "발현" 등은 관심 서열의 전사 단독뿐만 아니라 전사 및 번역 둘 모두를 나타낸다. 따라서, DNA 형태로 존재하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 언급함에 있어서, 상기 발현으로부터 생성된 생성물은 RNA(발현되는 서열의 전사 단독으로부터 발생함) 또는 폴리펩티드 서열(발현되는 서열의 전사 및 번역 둘 모두로부터 발생함)일 수 있다. 따라서, 용어 "발현"은 또한 RNA 및 폴리펩티드 생성물 둘 모두가 상기 발현으로부터 발생하고, 동일한 공유된 환경에서 함께 유지될 가능성을 포함한다. 예를 들어, mRNA가 폴리펩티드 생성물로의 번역 후에 존속하는 것이 이러한 경우이다.
다른 구현예에 따르면, 임의의 구현예의 외인성 핵산 서열은 항원을 인코딩할 수 있으며, 바람직하게는 항원은 바이러스 항원 또는 종양 관련 항원(TAA)이다.
바람직하게는, 바이러스 항원은 바이러스, 예를 들어, 필로바이러스(바람직하게는, 예를 들어, WO 2016/034678호에 기재된 바와 같은 마르부르크 바이러스(MARV) 및/또는 에볼라 바이러스(EBOV)), 인간 면역결핍 바이러스 타입 I(HIV-1; 예를 들어, gp 120 또는 gp 160), 구제역(FMD) 바이러스(WO 2016/202828호 참조), 인간 또는 동물 헤르페스 바이러스, 바람직하게는 HSV1 또는 HSV2, 사이토메갈로바이러스(CMV), 대상포진 바이러스(VZV), 또는 간염 바이러스, 예를 들어, B형 간염 바이러스(HBV), 예를 들어, B형 간염 표면 항원 또는 이의 유도체(WO 2011/015656호 및 WO 2013/007772호 참조), A형 간염 바이러스(HAV), C형 간염 바이러스(HCV; WO 04/111082호 참조; 우선적으로, 유전형 1 b 균주로부터의 비-구조적 HCV 단백질), E형 간염 바이러스(HEV), 인간 유두종 바이러스(HPV; WO 90/10459호, WO 95/09241호, WO 98/04705호, WO 99/03885호, 및 WO 07/121894호 참조; HPV16 및 HPV18 균주로부터의 E6 및 E7 단백질이 바람직함), 호흡기 세포융합 바이러스(RSV; WO 2014/019718호 참조), 또는 인플루엔자 바이러스(WO 2012/048817호)로부터 유래된다.
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 항원은 바람직하게는 HCV, HBV, HIV-1, HPV, RSV, EBOV 및/또는 MARV, 바람직하게는 EBOV 및 MARV로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 재조합 MVA 및 외인성 핵산 서열은 WO 2016/034678호에 기재된 바와 같은 재조합 MVA 및 필로바이러스의 항원성 단백질 또는 항원 결정기를 인코딩하는 핵산 중 임의의 것일 수 있으며, 이에 따라 상기 출원은 본원에 참조로서 완전히 포함된다. 참조로서 포함되는 자료가 본 명세서와 모순되거나 불일치하는 경우, 본 발명의 명세서는 상기 이미 언급된 상기 임의의 자료를 대체할 것이다. WO 2016/034678호의 서열 목록이 또한 참조로서 포함된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 재조합 바이러스(바람직하게는, MVA)는 하나 이상의 필로바이러스 단백질(바람직하게는, 하나 이상의 필로바이러스 당단백질), 바람직하게는 3개의 필로바이러스 당단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스이다.
추가의 특정 구현예에서, 필로바이러스 당단백질은 에볼라 바이러스 수단(SEBOV), 에볼라 바이러스 자이레(ZEBOV), 및 마르부르크 바이러스(MARV)로부터 선택된다.
추가의 특정 구현예에서, 필로바이러스 당단백질은 에볼라 바이러스 수단(SEBOV), 에볼라 바이러스 자이레-마잉가(ZEBOV-Mayinga), 및 마르부르크 바이러스 무소케(MARV-Musoke)로부터 선택된다. 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 재조합 바이러스(바람직하게는, MVA)는 SEBOV, ZEBOV-Mayinga 및 MARV-Musoke의 필로바이러스 당단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 재조합 바이러스(바람직하게는 MVA)는 필로바이러스 핵단백질, 바람직하게는 에볼라 바이러스의 필로바이러스 핵단백질, 더욱 바람직하게는 에볼라 바이러스 아이보리 코스트(NP-EBOV-CdI)의 핵단백질을 추가로 인코딩하는 핵산을 포함한다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물에서 사용되는 재조합 바이러스는 WO 2016/034678호에 기재된 바와 같은 MVA-mBN226, MVA-mB255, MVA-mBN254로 지정된 재조합 MVA이다.
특정 구현예에서, 종양 관련 항원은 암배아항원(CEA), 뮤신-1 (MUC-1), 전립선 산 포스파타제(PAP), B7-1(CD80으로도 공지됨), 세포내 부착 분자-1(ICAM-1, CD54로도 공지됨), 림프구 기능-관련 항원-3(LFA-3, CD58로도 공지됨), 전립선 특이적 항원(PSA), HER-2, 및 brachyury 또는 이들의 임의의 조합물로부터 선택된다. 바람직하게는, TAA는 CEA, MUC-1, B7-1, ICAM-1, LFA-3, HER-2 및 brachyury로부터 선택된다. 상기 재조합체의 추가 세부사항은, 예를 들어, WO 2015/175340호 및 WO 2008/045346호에 기재되어 있다.
비-재조합 및 재조합 폭스바이러스의 생성을 위한 방법
재조합 폭스바이러스(예를 들어, VACV 또는 MVA)를 획득하거나, 폭스바이러스(예를 들어, VACV 또는 MVA) 유전체로 외인성 코딩 서열을 삽입하기 위한 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, DNA의 클로닝, DNA 및 RNA 분리, 웨스턴 블롯 분석, RT-PCR 및 PCR 증폭 기술과 같은 표준 분자생물학 기술을 위한 방법은 문헌[Molecular Cloning, A laboratory Manual 2nd Ed. (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))]에 기재되어 있고, 바이러스의 취급 및 조작을 위한 기술은 문헌[Virology Methods Manual (B.W.J. Mahy et al. (eds.), Academic Press (1996))]에 기재되어 있다. 유사하게, 폭스바이러스의 취급, 조작 및 유전 공학을 위한 기술 및 노하우는 문헌[Molecular Virology: A Practical Approach (A.J. Davison & R.M. Elliott (Eds.), The Practical Approach Series, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, UK (1993), 예를 들어, Chapter 9: Expression of genes by Vaccinia virus vectors 참조); Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Son, Inc. (1998), 예를 들어, Chapter 16, Section IV: Expression of proteins in mammalian cells using vaccinia viral vector 참조); 및 Genetic Engineering, Recent Developments in Applications, Apple Academic Press (2011), Dana M. Santos, 예를 들어, Chapter 3: Recombinant-mediated Genetic Engineering of a Bacterial Artificial Chromosome Clone of Modified Vaccinia Virus Ankara (MVA) 참조)]에 기재되어 있다. 재조합 MVA의 작제 및 분리는 또한 문헌[Methods and Protocols, Vaccinia Virus and Poxvirology, ISBN 978-1-58829-229-2 (Staib et al.), Humana Press (2004), 예를 들어, Chapter 7 참조]에 기재되어 있다.
본 발명에 따라 사용되는 바이러스 벡터와 같은 바이러스-기반 물질 및/또는 바이러스의 생성 및 정제를 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 이용 가능한 방법은 CEF 세포 또는 세포주, 특히 DF-1(US 5,879,924호), EBx 닭 세포주(WO 2005/007840호), EB66 오리 세포(WO 08/129058호), 또는 카이리나 모스카타(Cairina moschata) 무한증식화 조류 세포(WO 2007/077256호 또는 WO 2009/004016호)에서의 바이러스의 복제를 포함한다. 이들은 당업자에게 널리 공지된 조건하에서 배양될 수 있다. CEF 세포에서의 바이러스 배양 및 바이러스 증폭을 위한 혈청 비함유 방법은, 예를 들어, WO 2004/022729호에 기재되어 있다. 바이러스의 생성을 위한 상류 및 하류 공정은 WO 2012/010280호 또는 2016/087457호에서 획득될 수 있다. 본 출원의 바이러스를 정제하는데 유용한 방법은 WO 03/054175호, WO 07/147528호, WO 2008/138533호, WO 2009/100521호 및 WO 2010/130753호에 상세히 개시되어 있다. 오리 배아-유래 세포에서의 재조합 폭스바이러스의 증식 및 정제를 위한 예시적 방법은 문헌[Leon et al. [2016], The EB66 cell line as a valuable cell substrate for MVA-based vaccines production, Vaccine 34:5878-5885]에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 약 1x106 InfU/mL 내지 약 2x109 InfU/mL, 바람직하게는 약 1x107 InfU/mL 내지 약 2x109 InfU/mL, 더욱 바람직하게는 약 1x107 InfU/mL 내지 약 4x108 InfU/mL 범위 내의 바이러스 역가를 포함한다. 특정한 다른 구현예에서, 역가는 약 0.1x108 InfU/mL 내지 약 4x108 InfU/mL의 범위 내이다.
설페이트 염
특정 구현예에서, 설페이트 염은 1가 양이온 염이다. 본 발명에 따른 1가 양이온은, 예를 들어, 소듐 양이온, 포타슘 양이온, 마그네슘 양이온 또는 암모늄 양이온이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 설페이트 염은 소듐 설페이트, 포타슘 설페이트, 마그네슘 설페이트 및/또는 암모늄 설페이트로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서, 설페이트 염은 소듐 설페이트, 마그네슘 설페이트 및/또는 암모늄 설페이트, 바람직하게는 소듐 설페이트이다. 특정 구현예에서, 소듐 설페이트 염은 일염기성 및/또는 이염기성 설페이트 염이다. 바람직하게는, 설페이트 염은 디소듐 설페이트(Na2SO4) 및/또는 소듐 하이드로겐 설페이트(NaHSO4) 염이고, 바람직하게는 설페이트 염은 디소듐 설페이트(Na2SO4) 염이다.
특정 구현예에서, 설페이트 염(예를 들어, 소듐 설페이트, 포타슘 설페이트, 마그네슘 설페이트 및/또는 암모늄 설페이트) 농도는 약 5 mM 내지 300 mM, 약 5 mM 내지 250 mM, 약 5 mM 내지 220 mM, 약 5 mM 내지 200 mM, 약 5 mM 내지 180 mM, 약 5 mM 내지 150 mM, 약 5 mM 내지 120 mM, 약 10 mM 내지 300 mM, 약 20 mM 내지 300 mM, 약 30 mM 내지 300mM, 약 40 mM 내지 300 mM, 약 50 mM 내지 300 mM, 약 70 mM 내지 300 mM, 약 80 mM 내지 300 mM, 약 80 mM 내지 150 mM, 약 90 mM 내지 150 mM, 약 90 mM 내지 120 mM, 약 90 mM 내지 110 mM, 약 48 mM 내지 110 mM 또는 약 10 mM 내지 110 mM이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약 100 mM 농도의 설페이트 염, 바람직하게는 소듐 설페이트(특히, Na2SO4 및/또는 NaHSO4), 포타슘 설페이트, 마그네슘 설페이트 및/또는 암모늄 설페이트, 더욱 바람직하게는 소듐 설페이트 및/또는 암모늄 설페이트, 가장 바람직하게는 소듐 설페이트를 포함한다.
특정 구현예에서, 소듐 설페이트(특히, Na2SO4 및/또는 NaHSO4)의 농도는 다른 설페이트 염에 대해 상기 기재된 바와 같은 농도 범위 중 하나이고, 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같은 조성물 중 Na2SO4 및/또는 NaHSO4 염은 약 50 내지 150 mM의 농도, 바람직하게는 약 100 mM의 농도로 존재한다.
본 발명의 특정 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 설페이트 염 및 임의의 바람직한 설페이트 염은 무기 염이며, 바람직하게는 무기 염은 탄소 원자를 함유하지 않는다.
본 발명의 특정 구현예에서, 설페이트 염은 약학적으로 허용되는 설페이트 염이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 소듐 도데실 설페이트를 비함유하거나, 본질적으로 비함유한다. 용어 "소듐 도데실 설페이트를 본질적으로 비함유하는"은 소듐 도데실 설페이트가 존재하더라도 당업자가 이의 존재를 안정화 관점에서 유리한 것으로 판단할 정도로 제형 내의 바이러스의 안정화에 기여하지 않음을 의미하는 것으로 의도된다.
pH 및 완충제
본 발명에 따른 조성물은 약 6.0 내지 8.5, 바람직하게는 약 6.5 내지 8.5의 pH를 갖는다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 약 6.5 내지 8.5, 약 6.6 내지 8.0, 약 6.8 내지 7.5, 약 6.8 내지 7.2, 약 6.8 내지 8.2, 약 6.9 내지 8.2, 약 7.0 내지 8.5, 약 7.2 내지 8.2, 약 7.4 내지 8.2, 약 7.6 내지 8.2, 또는 약 7.5 내지 8.5의 pH를 갖는다.
이러한 pH를 유지시키기 위해, 본 발명에 따른 조성물은 조성물의 pH에서 완충 용량을 갖는 완충제를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "완충제" 또는 "완충 용액"은 약한 산 및 이의 컨쥬게이트 염기, 또는 그 반대의 혼합물로 구성되는 수용액을 나타낸다. 소량 또는 중간 정도의 양의 강산 또는 염기가 첨가하는 경우 pH가 거의 변하지 않으므로, 이는 용액의 pH 변화를 방지하는 데 사용된다. 완충 용액은 매우 다양한 적용 분야에서 거의 일정한 값으로 pH를 유지시키는 수단으로 사용된다. 산 영역의 완충제의 경우, 완충제에 염산과 같은 강산을 첨가함으로써 pH는 원하는 값으로 조정될 수 있다. 알칼리성 완충제의 경우, 소듐 하이드록시드와 같은 강염기가 첨가될 수 있다. 대안적으로, 완충제 혼합물은 산 및 이의 컨쥬게이트 염기의 혼합물로부터 제조될 수 있다. 예를 들어, 아세테이트 완충제는 아세트산 및 소듐 아세테이트의 혼합물로부터 제조될 수 있다. 유사하게, 알칼리성 완충제는 염기 및 이의 컨쥬게이트 산의 혼합물로부터 제조될 수 있다. 바람직하게는, 완충제는 약학적으로 허용되는 완충제이다.
완충제의 예는 포스페이트 완충 염수(예를 들어, PBS), 포스페이트 완충제, 시트레이트 완충제(예를 들어, SSC), 시트레이트/포스페이트 완충제, TES, DIPSO, TEA, EPPS, 바이신(Bicine), 트리스(트리스(하이드록시메틸)아미노메탄), 트리스-HCl(트리스(하이드록시메틸)아미노메탄-HCl), 트리신(Tricine)(N-[트리스(하이드록시메틸)메틸)-메틸]-글리신), TAPSO, HEPES, TES, MOPS, PIPES, POPSO, MES, 숙신산 완충제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 포스페이트 완충 염수(약어 PBS)는 소듐 포스페이트, 소듐 클로라이드 및, 일부 조성물에서, 포타슘 클로라이드 및 포타슘 포스페이트를 함유하는 물-기반 염 용액이다. 바람직하게는, 완충제는 트리스, 트리스-HCL, 트리신, 시트레이트 완충제, 시트레이트/포스페이트 및 포스페이트 완충제의 군으로부터 선택된다. 추가의 바람직한 구현예에서, 완충제는 트리스 완충제, 시트레이트 완충제, 시트레이트/포스페이트 또는 포스페이트 완충제이다. 포스페이트 완충제는 바람직하게는 Na2HPO4와 KH2PO4의 혼합물 또는 Na2HPO4와 NaH2PO4의 혼합물을 포함한다. 시트레이트/포스페이트 완충제는 바람직하게는 Na2HPO4 및 소듐 시트레이트를 포함한다. 특정 구현예에서, 완충제는 트리스 완충제 또는 포스페이트 완충제를 포함한다.
상기 완충제는 바람직하게는 약 5 mM 내지 40 mM의 농도로 존재한다. 특정 구현예에서, 상기 완충제는 약 5 mM 내지 25 mM, 약 8 mM 내지 22 mM, 약 8 mM 내지 15 mM, 또는 약 5 mM 내지 15 mM의 농도로 존재한다. 특정 구현예에서, 상기 완충제는 약 10 mM의 농도로 존재한다.
추가의 바람직한 구현예에서, 상기 완충제는 약 6.5 내지 8.5, 바람직하게는 약 7.5 내지 8.5 범위의 pH, 가장 바람직하게는 약 8.0의 pH의 트리스 완충제이다.
추가의 바람직한 구현예에서, 상기 완충제는 약 6.5 내지 8.5 범위의 pH, 약 6.5 내지 7.5 범위의 pH, 약 7.0 내지 8.5 범위의 pH, 약 6.9 내지 7.6 범위의 pH, 약 7.3 내지 7.6 범위의 pH, 약 6.9 내지 7.2 범위의 pH, 더욱 바람직하게는 약 7.0의 pH, 더욱 바람직하게는 약 7.5의 pH의 포스페이트 완충제이다.
추가의 바람직한 구현예에서, 상기 완충제는 약 6.0 내지 8.0 범위의 pH, 바람직하게는 약 6.5 내지 7.5 범위의 pH의 시트레이트 완충제 또는 시트레이트/포스페이트 완충제이다.
기타 성분
본 발명의 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용되고/되거나 승인된 담체, 첨가제, 항생제, 보존제, 애쥬번트, 항산화제, 희석제 및/또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조 물질은 하나 이상의 당, 당 알콜, 폴리올, 세제, 하나 이상의 아미노산, 점도 향상제, 하나 이상의 추가 염, 항산화제, 에탄올, EDTA 등일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 당, 당 알콜 및/또는 폴리올을 추가로 포함한다.
특정한 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 수크로스, 락토스, 만노스 및 트레할로스의 군으로부터 선택되는 당을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 소르비톨, 글리세롤 또는 만니톨, 바람직하게는 글리세롤 및/또는 소르비톨로부터 선택되는 폴리올을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 소르비톨을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 글리세롤을 포함한다.
특정 구현예에서, 임의의 조성물 내의 상기 당 또는 당 알콜의 농도는 약 1% (w/w) 내지 10% (w/w) 범위이다. 바람직한 구현예에서, 상기 조성물 내의 당 또는 당 알콜의 상기 농도는 약 2% (w/w) 내지 10% (w/w), 3% (w/w) 내지 10% (w/w), 4% (w/w) 내지 10% (w/w), 1% (w/w) 내지 9% (w/w), 1% (w/w) 내지 8% (w/w), 1% (w/w) 내지 7% (w/w), 1% (w/w) 내지 6% (w/w), 2% (w/w) 내지 6% (w/w), 2.5% (w/w) 내지 6% (w/w), 4% (w/w) 내지 6% (w/w), 5% (w/w) 내지 7% (w/w) 범위이거나, 약 6% (w/w)이다. 특정 구현예에서, 상기 조성물 내의 수크로스의 농도는 약 6% (w/w)이다.
특정 구현예에서, 상기 조성물 내의 폴리올의 농도는 약 1% (w/w) 내지 6% (w/w) 범위이다. 바람직한 구현예에서, 상기 조성물 내의 폴리올의 상기 농도는 약 2% (w/w) 내지 6% (w/w), 3% (w/w) 내지 6% (w/w), 4% (w/w) 내지 6% (w/w), 1% (w/w) 내지 4% (w/w), 1% (w/w) 내지 3% (w/w), 1% (w/w) 내지 2.5% (w/w) 범위이거나, 약 5% (w/w)이다. 특정 구현예에서, 상기 조성물 내의 글리세롤의 농도는 약 1% (w/w) 내지 6% (w/w) 범위이다. 바람직한 구현예에서, 상기 조성물 내의 폴리올의 상기 농도는 약 2% (w/w) 내지 6% (w/w), 3% (w/w) 내지 6% (w/w), 4% (w/w) 내지 6% (w/w), 1% (w/w) 내지 4% (w/w), 1% (w/w) 내지 3% (w/w), 1% (w/w) 내지 2.5% (w/w) 범위이거나, 약 5% (w/w)이다. 특정 구현예에서, 상기 조성물 내의 글리세롤의 농도는 대략 약 1% (w/w) 내지 6% (w/w) 범위, 바람직하게는 5% (w/w)이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 세제, 바람직하게는 비-이온성 세제를 추가로 포함한다. 비-이온성 계면활성제는, 예를 들어, 응집을 감소시킴으로써 액체 상태에서 다양한 바이러스의 안정화를 유도하는 것으로 나타났거나(Evans et al. [2004], J. Pharm Sci. 93:2458-75, US 7,456,009호, US 2007/0161085호), 용기 표면에 대한 흡수를 감소시키기 위해 첨가된다.
특정 구현예에서, 세제는 폴리소르베이트, 소듐 라우릴설페이트 및 폴록사머의 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 폴리소르베이트는 폴리소르베이트-20, 폴리소르베이트-40, 폴리소르베이트-60 및 폴리소르베이트-80의 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 폴리소르베이트(특히, 폴리소르베이트-20, 폴리소르베이트-40, 폴리소르베이트-60 및 폴리소르베이트-80)는 약 0.001% (w/w) 내지 약 1% (w/w), 바람직하게는 약 0.001% (w/w) 내지 약 0.5% (w/w)의 농도 범위를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 폴리소르베이트는 약 0.001% (w/w) 내지 약 0.1% (w/w), 약 0.001% (w/w) 내지 약 0.008% (w/w), 약 0.001% (w/w) 내지 약 0.005% (w/w)의 농도 범위를 갖는다. 폴리소르베이트 농도는 바람직하게는 0.001% (w/w) 초과이나, 바람직하게는 0.005% (w/w) 미만이다.
특정 구현예에서, 상기 폴록사머는 폴록사머 182, 폴록사머 188, 폴록사머 121, 폴록사머 331, 폴록사머 338 및/또는 폴록사머 407의 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 폴록사머 농도(특히, 폴록사머 182, 폴록사머 188, 폴록사머 121, 폴록사머 331, 폴록사머 338 및/또는 폴록사머 407)는 약 0.001% (w/w) 내지 1% (w/w), 바람직하게는 약 0.005% (w/w) 내지 0.5% (w/w), 약 0.01% (w/w) 내지 0.1% (w/w), 약 0.01% (w/w) 내지 0.05% (w/w), 약 0.015% (w/w) 내지 0.03% (w/w) 범위이거나, 약 0.025% (w/w)이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 아미노산을 추가로 포함하고, 바람직하게는 상기 아미노산은 아르기닌, 글리신, 알라닌, 리신, 프롤린, 히스티딘, 글루타메이트, 글루탐산 및 아스파르트산 또는 이들의 임의의 조합물의 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 아미노산은 글루탐산, 아르기닌 또는 글리신으로부터 선택된다. 아미노산은 바람직하게는 L-이성질체, 바람직하게는 L-아르기닌, L-글리신 및/또는 L-히스티딘이다. 상기 아미노산(들)은 본 발명의 재조합 또는 비-재조합 바이러스에 의해 인코딩되는 아미노산이 아니다. 따라서, 아미노산은 바이러스(예를 들어, VACV 또는 MVA)의 정제 공정을 통해 조성물에 함유되지 않고, 백신 제조용 조성물의 생성 동안 첨가된다.
아미노산은 바람직하게는 약 0.1% (w/w) 내지 약 10% (w/w), 바람직하게는 약 0.1% (w/w) 내지 약 5% (w/w)의 농도로 조성물에 존재한다. 추가 구현예에서, 아미노산은 바람직하게는 약 0.1% (w/w) 내지 약 2.5% (w/w), 바람직하게는 약 2.0% (w/w) 내지 약 5% (w/w)의 농도로 조성물에 존재한다.
아미노산, 특히 히스티딘, 아르기닌 또는 메티오닌은 액체 상태에서 다양한 바이러스의 안정화를 유도하는 것으로 밝혀졌다(문헌[EVANS et al. J Pharm Sci. 2004 Oct, 93(10):2458-75], US 7,456,009호, US 2007/0161085호, US 7,914,979호, WO 2014/029702호, WO 2014/053571호 참조). 안정성을 개선시키기 위해 히스티딘이 액체 조성물에 존재하는 경우, 히스티딘은 일반적으로 적어도 5 mM, 바람직하게는 적어도 10 mM의 농도로 존재한다(문헌[EVANS et al. J Pharm Sci. 2004 Oct, 93(10):2458-75], US 7,456,009호, WO 2014/029702호 참조). 안정성을 개선시키기 위해 아르기닌이 액체 조성물에 존재하는 경우, 아르기닌은 일반적으로 적어도 50 mM(US 2007/0161085호 참조, 적어도 1% (w/v)의 아르기닌은 적어도 약 57.4 mM에 해당함), 및 때때로 바람직하게는 적어도 150 mM, 특히 약 300 mM(WO 2014/029702호 참조)의 농도로 존재한다. 안정성을 개선시키기 위해 메티오닌이 액체 조성물에 존재하는 경우, 메티오닌은 일반적으로 적어도 25 mM, 바람직하게는 약 67 mM(WO 2014/029702호 참조)의 농도로 존재한다.
특정 구현예에서, 아미노산(바람직하게는, 아르기닌, 더욱 바람직하게는 L-아르기닌)은 300 mM 미만, 바람직하게는 150 mM 미만, 100 mM 미만, 75 mM 미만, 또는 심지어 50 mM 미만의 농도로 존재한다. 또한, 메티오닌이 본 발명에 따른 액체 조성물에 존재하는 경우, 이는 바람직하게는 60 mM 미만, 바람직하게는 50 mM 미만, 40 mM 미만, 30 mM 미만, 또는 심지어 25 mM 미만의 농도로 존재한다. 더욱 일반적으로, 하나 이상의 아미노산이 본 발명에 따른 조성물에 존재하는 경우, 아미노산 또는 아미노산들은 바람직하게는 300 mM 미만, 바람직하게는 150 mM 미만, 100 mM 미만, 75 mM 미만, 50 mM 미만, 40 mM 미만, 30 mM 미만, 25 mM 미만, 20 mM 미만, 10 mM 미만, 9 mM 미만, 8 mM 미만, 7.5 mM 미만, 7 mM 미만, 6 mM 미만, 또는 심지어 5 mM 미만의 농도로 존재한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 히스티딘, 아르기닌 및/또는 글루탐산을 비함유한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 점도 향상제와 같은 하나 이상의 추가 약학적 첨가물을 추가로 포함한다. 본 발명에 따른 점도 향상제는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 셀룰로스, 예를 들어, 메틸셀룰로스(MC) 또는 카르복시메틸셀룰로스(CMC), 젤라틴, 아가, 및/또는 아가로스 및 이의 유도체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 점도 향상제의 농도는 본 발명의 조성물의 약 0.1% (w/w) 내지 10% (w/w), 바람직하게는 약 1% (w/w) 내지 5% (w/w) 범위일 수 있다.
또한, 점도 향상제는 용액의 점도를 증가시킬 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, 조성물은 애쥬번트를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용되는 염을 추가로 포함한다. 특정한 바람직한 구현예에서, 염은 소듐 클로라이드(NaCl)이다. 소듐 클로라이드는 바람직하게는 약 10 mM 내지 100 mM, 바람직하게는 약 20 mM 내지 100 mM, 약 40 mM 내지 100 mM, 또는 약 50 mM 내지 100 mM의 농도로 본 발명의 조성물에 존재한다. 바람직한 구현예에서, 소듐 클로라이드는 약 70 mM의 농도로 존재한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 항산화제를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 항산화제는 메티오닌, 아스코르브산, 알파 토코페롤, 아스코르브산, 아스코르빌 팔미테이트, 아스코르빌 스테아레이트, 아녹소머(anoxomer); 부틸화된 하이드록시아니솔, 부틸화된 하이드록시톨루엔, 시트르산, 시트레이트, 및 3차 부틸 하이드로퀴논의 군으로부터 선택된다. 항산화제 부형제는 폭스바이러스 조성물의 0.01% (w/w), 0.05% (w/w), 0.1% (w/w), 0.5% (w/w), 1% (w/w), 2% (w/w), 3% (w/w), 4% (w/w), 5% (w/w), 6% (w/w), 7% (w/w), 8% (w/w), 9% (w/w), 10% (w/w), 예를 들어, 그 사이 내의 모든 값 및 범위의 농도로 존재할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 킬레이트제, 바람직하게는 약학적으로 허용되는 킬레이트제를 추가로 포함한다. 킬레이트제는 특히 액체 상태에서 조성물의 안정성을 추가로 개선시킬 수 있다.
특정 구현예에서, 킬레이트제는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 1,2-비스(o-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산(BAPTA), 에틸렌 글리콜 테트라아세트산(EGTA), 디머캅토숙신산(DMSA), 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산(DTPA), 및 2,3-디머캅토-1-프로판설폰산(DMPS)으로부터 선택되고, 바람직하게는 상기 킬레이트제는 EDTA이다.
특정 구현예에서, 킬레이트제는 적어도 50 μM의 농도, 바람직하게는 50 μM 내지 1 mM, 50 μM 내지 750 μM, 50 μM 내지 500 μM, 50 μM 내지 250 μM, 50 μM 내지 150 μM, 50 μM 내지 100 μM, 50 μM 내지 75 μM, 100 μM 내지 300 μM, 100 μM 내지 250 μM, 100 μM 내지 200 μM, 100 μM 내지 150 μM, 150 μM 내지 1 mM, 150 μM 내지 750 μM, 150 μM 내지 500 μM 또는 150 μM 내지 250 μM 범위의 농도로 존재하고, 바람직하게는 상기 킬레이트제는 50 μM 내지 150 μM 범위의 농도로 존재할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 에탄올을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 0.05% (v/v) 내지 5% (v/v) 범위의 농도, 바람직하게는 0.01% (v/v) 내지 5% (v/v), 0.01% (v/v) 내지 2,5% (v/v), 0.01% (v/v) 내지 1,5% (v/v), 0.1% (v/v) 내지 5% (v/v), 0.1% (v/v) 내지 2,5% (v/v), 0.1% (v/v) 내지 1,5% (v/v), 또는 0.25% (v/v) 내지 0.75% (v/v) 범위의 농도의 에탄올을 추가로 포함한다.
오스몰농도
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 숙주에 대해 생리학적으로 허용되는 이온 강도를 갖는다. 조성물 내의 염의 포함의 목적은 조성물을 안정화시킬 뿐만 아니라 백신으로서의 조성물의 주사 부위에서의 부작용 또는 국소 반응을 감소시키기 위해 원하는 이온 강도 또는 오스몰농도를 달성하는 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약 200 mOsm/L 내지 약 1000 mOsm/L 범위, 약 200 mOsm/L 내지 약 900 mOsm/L, 약 200 mOsm/L 내지 약 800 mOsm/L, 약 200 mOsm/L 내지 약 700 mOsm/L, 약 200 mOsm/L 내지 약 600 mOsm/L, 또는 약 200 mOsm/L 내지 약 500 mOsm/L 범위의 전체 오스몰농도(용액 내의 전체 분자수)를 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약 250 mOsm/L 내지 약 450 mOsm/L의 범위, 바람직하게는 약 300 mOsm/L의 전체 오스몰농도를 갖는다. 기재된 바와 같은 오스몰농도는 모두 조성물을 또한 비경구, 특히 근내 또는 피하 주사에 적합하게 만들면서 2℃ 내지 8℃ 또는 그 초과의 온도에서의 장기간 저장을 촉진한다. 이온 강도에 대한 기여는 완충 화합물에 의해 생성된 이온뿐만 아니라 비-완충 염의 이온으로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 용액의 오스몰농도 및 이온 농도는 인체의 것과 일치한다(등장성).
추가의 바람직한 조성물
일 구현예에서, 본 발명은 a) 폭스바이러스; b) 완충제; 및 c) 약 5 mM 내지 약 300 mM 농도의 설페이트 염을 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 약 6.0 내지 약 8.5의 pH를 갖고, 바람직하게는 폭스바이러스는 MVA이고, 더욱 바람직하게는 폭스바이러스는 필로바이러스 항원을 발현하는 MVA이다.
본 발명에 따른 또 다른 구현예에서, 조성물은 약 5 mM 내지 25 mM 농도의 트리스 완충제 또는 포스페이트 완충제, 약 5 내지 150 mM 농도의 소듐 설페이트를 포함하며, 상기 조성물은 약 7.0 내지 8.5 범위의 pH를 갖는다.
본 발명에 따른 또 다른 구현예에서, 조성물은 약 5 mM 내지 25 mM 농도의 트리스 완충제, 약 5 내지 150 mM 농도의 소듐 설페이트를 포함하며, 상기 조성물은 약 7.5 내지 8.5 범위의 pH를 갖는다.
본 발명에 따른 또 다른 구현예에서, 조성물은 약 8 mM 내지 12 mM 농도의 트리스 완충제, 및 80 mM 내지 100 mM 농도의 소듐 설페이트를 포함하며, 상기 조성물은 약 7.7 내지 8.2 범위의 pH를 갖는다.
본 발명에 따른 또 다른 구현예에서, 조성물은 4% (w/w) 내지 6% (w/w)의 수크로스 또는 글리세롤과 함께 또는 이들 없이 약 8 mM 내지 12 mM 농도의 트리스 완충제, 90 mM 내지 110 mM 범위의 농도의 소듐 설페이트를 포함하며, 상기 조성물은 약 7.6 내지 8.2 범위의 pH를 갖는다.
본 발명에 따른 또 다른 구현예에서, 조성물은 약 8 mM 내지 12 mM 농도의 트리스 완충제, 약 45 mM 내지 55 mM 농도의 소듐 설페이트 및 약 60 mM 내지 80 mM 농도의 소듐 클로라이드를 포함하며, 상기 조성물은 약 7.6 내지 8.0 범위의 pH를 갖는다.
본 발명에 따른 또 다른 구현예에서, 조성물은 약 10 mM 농도의 트리스 완충제, 약 100 mM 농도의 소듐 설페이트를 포함하며, 상기 조성물은 약 8의 pH를 갖는다.
본 발명에 따른 또 다른 구현예에서, 조성물은 4% (w/w) 내지 6% (w/w)의 수크로스 또는 글리세롤과 함께 약 10 mM 농도의 트리스 완충제, 약 100 mM 농도의 소듐 설페이트를 포함하며, 상기 조성물은 약 8의 pH를 갖는다.
본 발명에 따른 또 다른 구현예에서, 조성물은 약 10 mM 농도의 트리스 완충제, 약 100 mM 농도의 소듐 설페이트, 및 약 6% (w/w) 농도의 수크로스를 포함하며, 상기 조성물은 약 8의 pH를 갖는다.
본 발명에 따른 또 다른 구현예에서, 조성물은 약 10 mM 농도의 트리스 완충제, 약 100 mM 농도의 소듐 설페이트, 및 약 5% (w/w) 농도의 글리세롤을 포함하며, 상기 조성물은 약 8의 pH를 갖는다.
본 발명에 따른 또 다른 구현예에서, 조성물은 약 10 mM 농도의 트리스 완충제, 약 50 mM 농도의 소듐 설페이트, 및 약 70 mM 소듐 클로라이드를 포함하며, 상기 조성물은 약 7.7의 pH를 갖는다.
본 발명에 따른 또 다른 구현예에서, 조성물은 약 5 mM 내지 25 mM 농도의 포스페이트 완충제, 약 5 내지 150 mM 농도의 소듐 설페이트를 포함하며, 상기 조성물은 약 6.8 내지 7.5 범위의 pH를 갖는다.
본 발명에 따른 또 다른 구현예에서, 조성물은 약 7.5 mM 내지 12 mM 농도의 포스페이트 완충제, 약 90 mM 내지 110 mM 농도의 소듐 설페이트를 포함하며, 상기 조성물은 약 6.8 내지 7.2 범위의 pH를 갖는다.
본 발명에 따른 또 다른 구현예에서, 조성물은 약 10 mM 농도의 포스페이트 완충제, 약 100 mM 농도의 소듐 설페이트를 포함하며, 상기 조성물은 약 6.8 내지 7.8 범위의 pH를 갖는다.
본 발명에 따른 또 다른 구현예에서, 조성물은 약 10 mM 농도의 포스페이트 완충제, 약 100 mM 농도의 소듐 설페이트를 포함하며, 상기 조성물은 약 7의 pH를 갖는다.
본 발명에 따른 또 다른 구현예에서, 조성물은 약 10 mM 농도의 포스페이트 완충제, 약 100 mM 농도의 소듐 설페이트를 포함하며, 상기 조성물은 약 7.5의 pH를 갖는다.
본 발명에 따른 또 다른 구현예에서, 조성물은 4% (w/w) 내지 6% (w/w)의 수크로스 또는 글리세롤과 함께 또는 이들 없이 약 7.5 mM 내지 12 mM 농도의 포스페이트 완충제, 약 90 mM 내지 110 mM 농도의 소듐 설페이트를 포함하며, 상기 조성물은 약 6.8 내지 7.2 범위의 pH를 갖는다.
본 발명에 따른 또 다른 구현예에서, 조성물은 4% (w/w) 내지 6% (w/w)의 수크로스 또는 글리세롤과 함께 또는 이들 없이 약 10 mM 농도의 포스페이트 완충제, 약 100 mM 농도의 소듐 설페이트를 포함하며, 상기 조성물은 약 7의 pH를 갖는다.
본 발명에 따른 또 다른 구현예에서, 조성물은 약 10 mM 농도의 포스페이트 완충제, 약 100 mM 농도의 소듐 설페이트, 및 약 6% (w/w) 농도의 수크로스를 포함하며, 상기 조성물은 약 7의 pH를 갖는다.
본 발명에 따른 또 다른 구현예에서, 조성물은 약 10 mM 농도의 포스페이트 완충제, 약 100 mM 농도의 소듐 설페이트, 및 약 5% (w/w) 농도의 글리세롤을 포함하며, 상기 조성물은 약 7의 pH를 갖는다.
본 발명에 따른 또 다른 구현예에서, 조성물은 4% (w/w) 내지 6% (w/w)의 수크로스 또는 글리세롤과 함께 또는 이들 없이 약 10 mM 농도의 포스페이트 완충제, 약 100 mM 농도의 소듐 설페이트를 포함하며, 상기 조성물은 약 7.5의 pH를 갖는다.
본 발명에 따른 또 다른 구현예에서, 조성물은 약 10 mM 농도의 포스페이트 완충제, 약 100 mM 농도의 소듐 설페이트, 및 약 5% (w/w) 농도의 글리세롤을 포함하며, 상기 조성물은 약 7.5의 pH를 갖는다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 임의의 구현예의 조성물을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 임의의 구현예의 조성물을 포함하는 약학적 조성물은 비경구 투여에 적합한 약학적 조성물이다.
본 발명의 특정 구현예에서, 임의의 구현예의 조성물을 포함하는 약학적 조성물은 근내, 피하, 정맥내 또는 비내 적용에 적합한 약학적 조성물이다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 바이알에 함유된다. 용어 "바이알"은 본원에 개시된 바와 같은 바이러스와 같은 활성 약학적 성분을 저장할 수 있는 임의의 컨테이너, 용기, 카트리지, 장치, 유리 앰풀 또는 주사기를 나타낸다. 따라서, 용어 바이알, 컨테이너, 용기, 카트리지, 장치, 유리 앰풀 또는 주사기는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 바이알은 일반적으로 비활성 물질, 특히 유리(예를 들어, DIN 2R 타입 I 보로실리케이트 유리 바이러스) 또는 중합체 물질로 제조된다. 바람직한 구현예에서, 조성물은 주사기에 함유된다.
본 발명의 조성물은 당 분야에 공지된 임의의 수단에 의해 대상체, 바람직하게는 인간에게 투여될 수 있다. 투여 경로는 근내 주사, 피하 주사, 피내 주사, 정맥내 적용, 비내 투여, 경피 투여, 피부통과 투여 또는 피부경유 투여를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 투여 방식, 투여 용량 및 횟수는 공지된 방식으로 당업자에 의해 최적화될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 출원의 조성물은 104 내지 109 TCID50/mL, 105 내지 5 x 108 TCID50/mL, 106 내지 108 TCID50/mL, 또는 107 내지 108 TCID50/mL의 용량 범위로 바이러스를 포함한다. 대상체(바람직하게는, 인간)에 대한 바람직한 용량은 106 TCID50, 107 TCID50 또는 108 TCID50의 용량을 포함하여 106 내지 109 TCID50을 포함한다. 바람직하게는, 인간에 대한 용량은 바람직하게는 0.1 mL 내지 0.5 mL의 부피로 적어도 2 x 107 TCID50, 적어도 3 x 107 TCID50, 적어도 5 x 107 TCID50, 적어도 1 x 108 TCID50, 적어도 2 x 108 TCID50을 포함한다.
본 발명은 또한 질병 또는 병원체를 치료하고/하거나 예방하기 위한 본 발명의 임의의 구현예의 조성물 또는 약학적 조성물에 관한 것으로, 바람직하게는 질병은 암 또는 감염성 질병으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 질병 또는 병원체를 치료하고/하거나 예방하기 위한 약제의 제조를 위한 본 발명의 임의의 구현예의 조성물 또는 약학적 조성물의 용도에 관한 것으로, 바람직하게는 질병은 암 또는 감염성 질병으로부터 선택된다.
또 다른 구현예는 본 발명의 임의의 구현예의 조성물 또는 약학적 조성물로 예방접종을 필요로 하는 대상체(바람직하게는, 인간)의 예방접종을 위한 방법에 관한 것이다.
또 다른 구현예는 본원에 기재된 바와 같은 조성물 또는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체(바람직하게는, 인간)에 투여하는 것을 포함하는 질병 또는 병원체, 바람직하게는 암 또는 감염성 질병으로부터 선택되는 질병을 치료하고/하거나 예방하기 위한 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 임의의 구현예의 조성물을 제조하는 것을 포함하는 폭스바이러스 조성물을 안정화시키는 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 임의의 구현예의 조성물을 제조하는 단계 및 2 섭씨 온도 내지 8 섭씨 온도 범위의 온도에서 상기 조성물을 저장하는 단계를 포함하는 폭스바이러스 조성물을 안정화시키는 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 약 5 mM 내지 300 mM 농도의 설페이트 염을 폭스바이러스 조성물에 첨가하고, 바람직하게는 약 10 mM 내지 140 mM 농도의 설페이트 염을 첨가하는 단계를 포함하는 폭스바이러스 조성물을 안정화시키는 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 임의의 구현예의 폭스바이러스 조성물을 안정화시키는 방법에 관한 것으로, 상기 폭스바이러스 조성물은 완충제를 포함하고, 상기 조성물은 약 6.5 내지 8.5의 pH를 갖는다.
후속되는 상세한 실시예는 본 발명의 더 나은 이해에 기여하도록 의도된다. 그러나, 본 발명은 실시예에 의해 제한되지 않는다. 본 발명의 다른 구현예는 본원에 개시된 본 발명의 명세서 및 실시를 고려하여 당업자에게 명백할 것이다.
실시예
실시예 1:
액체 폭스바이러스 함유 약물 물질의 제조
하기 실시예에서 사용되는 바와 같은 MVA-BN-FILO(MVA-mBN266)는 WO 2016/034678호에 상세히 기재되어 있다. MVA는 에볼라 바이러스 수단(GP-SEBOV), 에볼라 바이러스 자이레-마잉가(GP-ZEBOV-Mayinga), 및 마르부르크 바이러스 무소케(GP-MARV-Musoke)의 당단백질의 3개의 필로바이러스 당단백질, 및 에볼라 바이러스 아이보리 코스트(NP-EBOV-CdI)의 핵단백질을 인코딩한다. GP-ZEBOV-Mayinga 및 GP-MARV-Musoke에 대한 발현 카세트를 유전자간 영역 IGR 148/149에 삽입하였다. GP-SEBOV 및 NP-EBOV-CdI에 대한 발현 카세트를 WO 2016/034678호에 기재된 바와 같이 폭스바이러스 프로모터 하에 유전자간 영역 IGR 88/89에 삽입하였다. 재조합체 바이러스를 당업자에게 공지된 표준 방법을 이용하여 정제하였다. 5x108 InfU/mL의 바이러스 농도를 갖는 MVA-BN-FILO 벌크 약물 물질(BDS)을 pH 7.7의 140 mM NaCl을 갖는 10 mM 트리스에 저장하였다. 2℃ 내지 8℃에서 생성물의 안정성을 개선시키기 위해, 다양한 염, 당 첨가제, 아미노산 및 완충제를 사용하여 200개 초과의 상이한 제형을 분석하였다. 소듐 설페이트(Na2SO4)로 최상의 결과를 획득하였다.
실시예 2:
pH, 완충제 및 설페이트의 효과
MVA-BN-FILO BDS를 초여과/정용여과를 이용하여 MilliQ 등급의 물로 완충액 교환하였다. 이후, 특정 부피의 농축된 트리스 완충제(상이한 pH) 및 소듐 설페이트(Na2SO4) 용액을 스파이킹하여 최종 제형을 획득하였다. 이러한 제형, 제형 B는 10 mM 트리스 완충제 및 100 mM Na2SO4로 구성되었으며, 각각 pH 7.5, 8, 8.5 및 9를 갖는 제형 B1, B2, B3 및 B4로 나누었다.
100 mM Na2SO4가 없는 동일한 조성물(제형 A1, A2, A3 및 A4)을 비교측정기로 취하였다. 표 1은 제조된 제형의 개관을 제공한다. 모든 제형은 3.75x108 InfU/mL의 MVA 바이러스 효능 역가를 가졌다.
표 1: 본 연구에서 제조된 제형의 조성.
각각의 제형을 25℃에서 1주 동안 가속화된 스트레스 조건에 적용시켰으며, 상기 조건은 MVA의 분해를 발생시키는 것으로 공지되었다. 샘플을 가속화된 스트레스 적용 전 및 후에 측정하였다. 비등방성(도 1) 및 고유 형광(방출 피크 이동 및 방출 강도 변화로서 도 2에 표시됨)의 측정을 플루오로맥스 4 분광형광계(Jobin Yvon Horiba, UK)에서 수행하였다. 동적 광 산란 측정(Z-평균 직경 변화 및 다분산 지수(PDI) 변화로서 도 2에 표시됨)을 제타사이저(Zetasizer)에서 수행하였다. 또한, 가속화된 스트레스 적용 전 및 후에 pH를 또한 측정하였다.
결과 및 결론
비등방성 측정의 결과는 도 1에 제시된다. 가속화된 스트레스 적용 후 모든 비등방성 스캔이 변화한 것으로 나타났다. 모든 제형에 대해, 비등방성 스캔은 스트레스 후에 감소하였으며, 이는 MVA의 단백질의 여기된 기가 더욱 유연해진 것을 나타낸다. 이러한 유연성의 증가는 단백질의 특정 기의 언폴딩 및/또는 단백질 구조물의 해리로 지정될 수 있다. 그러나, 이러한 변화의 정도는 용액에 설페이트가 존재한 경우에 덜 현저하였다. 또한, 설페이트 함유 제형에서 상이한 pH에서 변화는 유사하였고, 이는 설페이트의 강력한 안정화 효과를 나타낸다. 비등방성이 단백질 농도 및 광 산란과 독립적이라는 사실을 감안하는 경우, 이는 상기 방법으로 획득된 결과가 매우 신뢰할 수 있음을 나타낸다.
도 2는 제형 A1-A4 (Na2SO4가 없음) 및 B1-B4(Na2SO4를 가짐)의 가속화된 스트레스 후의 pH 변화, 방출 피크 이동, 방출 강도 변화, Z-평균 직경 및 다분산 지수(PDI)의 변화의 결과를 제시한다. 설페이트의 존재는 콜로이드 안정성에 현저한 영향을 미치며, 이는 설페이트 함유 제형에서 더 낮은 Z-평균 직경 및 PDI의 변화로부터 관찰될 수 있다. 개선된 콜로이드 안정성은 미립자 혼합물이 용이하게 응집되거나 해리되지 않음을 나타낸다. MVA-BN-FILO에 대한 콜로이드 불안정성과 바이러스의 감소된 효능 사이의 상관관계로 인해, 개선된 콜로이드 안정성은 바이러스의 활성에 긍정적인 영향을 미친다. pH 및 방출 강도에서의 관찰된 변화는 Na2SO4를 함유하는 제형에 대해 특히 pH 7.5 및 8.0에서 제한되었다. 방출 강도는 샘플의 산란 특성에 의해 영향을 받을 수 있으므로, 샘플의 산란 특성이 증가했다는 사실로 인해 방출 강도가 감소할 수 있다. 방출 강도와 대조적으로, 피크 이동은 광 산란에 의존하지 않으며, 결과는 피크 이동이 모든 설페이트 제형에 대해 낮음을 제시한다. 이는 단백질 구조의 입체형태 변화가 이들 제형에서 제한되고, 설페이트가 강력한 안정화 효과를 갖는 것을 나타낸다.
실시예 3
실험 설계 및 방법론
MVA 바이러스의 안정성에 대한 설페이트의 효과를 추가로 조사하기 위해, 본 발명자는 상이한 염을 갖는 몇 가지 추가 제형을 시험하였다. 이들 추가 제형의 개관은 표 2에 제시된다.
표 2: 시험된 제형의 조성
각각의 제형을 MVA의 분해를 발생시키는 것으로 공지된 가속화된 스트레스 조건(37℃에서 1일)에 적용시켰다. 샘플을 각각의 제형으로부터 채취하고, 가속화된 스트레스 적용 전 및 후에 측정하였다. 혼탁도의 측정을 BioTek Neo 플레이트 판독기에서 수행하였다. 동적 광 산란(DLS)(Z-평균 직경 변화 및 PDI 변화로 표시됨) 측정을 제타사이저에서 수행하였다.
결과 및 결론
본 실험에서 획득된 모든 결과의 개관이 도 3에 제시된다. 각각의 그래프는 상이한 pH에서 제형 당 획득된 결과를 나타낸다. 그래프의 각각의 열은 별도의 검정으로 획득된 측정을 제시한다.
MgCl2 함유 제형(제형 E1-4)이 가속화된 스트레스 후에 최소의 변화를 나타내고, 이어서 Na2SO4 제형(제형 B1-4) 및 MgSO4 제형(제형 D1-4)이 후속되고, 혼탁도에서 제한된 변화를 겪는 것으로 보이는 것이 혼탁도 결과로부터 관찰된다. 혼탁도는 용액 중의 입자의 존재로 인한 광의 전체 산란의 결과인 것이 인지되어야 한다. 이러한 산란 또는 혼탁도의 정도는 많은 요인, 무엇보다도 입자 크기, 입자 농도 및 입자 형태에 좌우된다. 콜로이드에 대한 추가 정보는 DLS 결과(Z-평균 직경 및 PDI)에 의해 제공된다.
가속화된 스트레스 후의 Z-평균 직경의 변화는 CaCl2 함유 제형(제형 C1-4)에 대해 가장 낮았다. 그러나, 이들 제형에서 초기 Z-평균 직경은 900 nm를 초과하였다. 이는 MVA 제형(약 200 nm의 크기를 갖는 MVA)에 대해 비교적 높으며, 이는 가속화된 스트레스 전에 초기 응집의 존재가 적용된 것을 나타낸다. CaCl2 함유 제형의 결과를 무시하고, NaCl 함유 제형(제형 F1-4)은 스트레스 후 Z-평균 직경에서 최소의 변화를 나타내었다. 흥미롭게도, Na2SO4 제형(제형 B1-4) 뿐만 아니라 NaCl 함유 제형에 이어서 MgSO4 제형(제형 D1-4)이 수행되는 것으로 보인다. 이러한 관찰은 제형 내의 설페이트의 존재가 콜로이드 안정성을 개선시키는 것을 제시한다. MgSO4와 대조적으로, MgCl2(E1-4)의 존재는 시험된 pH와 독립적으로 Z-평균 직경에 부정적인 영향을 미치는 것으로 보인다. PDI의 변화를 살펴보면, Na2SO4 제형(제형 B1-4)이 최소의 변화를 나타내었으며, 이어서 MgSO4 제형(제형 D1-4) 및 NaCl 함유 제형(제형 F1-4)이 후속되었다. Z-평균 직경의 변화에 대해 상기 제공된 것과 동일한 설명이 또한 PDI 결과에 적용될 수 있으며, 이는 설페이트의 존재가 중요하고, Na2SO4가 제시된 데이터를 기초로 하여 가장 바람직한 것을 나타낸다.
실시예 4
실험 설계 및 방법론
본 연구에서, 실시예 3에서와 동일한 염의 효과를 상이한 pH의 포스페이트 완충제에서 시험하였다. 이들 추가 제형의 개관은 표 3에 제시된다.
각각의 제형을 가속화된 스트레스 조건(37℃에서 1일)에 적용시켰다. 샘플을 가속화된 스트레스 적용 전 및 후에 측정하였다. 혼탁도의 측정을 BioTek Neo 플레이트 판독기에서 수행하였다. 동적 광 산란(DLS)(Z-평균 직경 변화 및 PDI 변화로 표시됨) 측정을 제타사이저에서 수행하였다.
표 3: 시험된 제형의 조성
결과 및 결론
본 실시예에서 획득된 모든 결과의 개관이 도 4에 제시된다. 각각의 그래프는 상이한 pH에서 제형 당 획득된 결과를 나타낸다. 그래프의 각각의 열은 별도의 검정으로 획득된 측정을 제시한다.
전반적으로, Na2SO4 함유 제형이 4개 모두의 제형(B1-4)에서 최소의 변화를 겪은 것으로 보이는 것이 혼탁도 결과로부터 결론내려질 수 있다. MgCl2 제형(C1-4)은 혼탁도와 관련하여 Na2SO4 제형보다 덜 수행되고, 이어서 NaCl 함유 제형(D1-4)이 후속된다. 콜로이드 특성에 대한 추가 정보를 제공하는 DLS에 의해 획득된 결과는 MVA-BN-FILO의 안정성에 대한 Na2SO4의 우세한 이로운 효과를 다시 나타내었으며, 이는 모든 시험된 pH 값에 대해 관찰되었다. 스트레스 후의 Z-평균 직경의 특히 크고 바람직하지 않은 증가가 MgCl2 제형(C1-4)에 대해 관찰되었으며, 이는 MVA-BN-FILO의 콜로이드 안정성에 대한 클로라이드 함유 염 제형에서 Mg2 + 이온의 부정적인 효과를 나타낸다. 그러므로, Na2SO4 함유 제형의 안정화 효과는 다른 시험된 제형보다 더 강력한 것으로 결론내려질 수 있다.
실시예 5
실험 설계 및 방법론
본 실험에서, 이전 연구로부터의 유망한 제형뿐만 아니라 신규한 제형 및 설페이트를 함유하지 않는 대조군 제형을 제조하였다. 이들 제형의 개관은 표 4에 제시된다.
각각의 제형을 가속화된 스트레스 조건(즉, 25℃에서 2주; 2W25C)에 적용시켰다. 제형 5, 6 및 8을 또 다른 가속화된 스트레스 조건, 즉, 37℃에서 1일(1D37C)에 추가로 노출시켰다. 샘플을 가속화된 스트레스 적용 전 및 후에 효능에 대해 측정하였다. 효능 측정을 하기 기재되는 바와 같이 형광 활성화 세포 분류기(FACS) 검정에 의해 수행하였고, 상대 효능 차이로서 표현하였다(표 5 참조).
표 4: 시험된 제형의 조성
결과 및 결론
가속화된 스트레스 조건의 결과로서의 효능 손실의 개관은 표 5에서 각각의 시험된 제형에 대해 제시된다.
표 5: 효능 분석 결과의 개관
전반적으로, 결과는 시험된 조성물에서의 설페이트의 존재가 가속화된 스트레스 후에 효능 손실에 대한 긍정적인 효과를 갖는 것을 나타낸다. 또한, 설페이트와 비교적 높은 pH(7.5 초과)의 조합은 안정성을 추가로 개선시킨다(제형 1, 2, 3, 4 및 7 참조). 또한, 제형에서의 글리세롤의 존재는 또한 효능의 손실을 감소시키는 것으로 보였다. 이는 제형 3 및 8(특히, 제형 8에 대해 1D37C 후)에 대해 관찰된 효능 손실에 의해 입증된다.
실시예 6
실험 설계 및 방법론
본 실험에서, 이전 연구로부터의 유망한 설페이트 함유 제형(실시예 5, 표 5: 제형 1, 3 및 7) 뿐만 아니라 설페이트가 없는 대조군 제형을 제조하였다. MVA-BN-FILO 약물 물질을 초여과/정용여과를 사용하여 완충액 교환하였다. 원하는 약물 생성물 농도 주위의 제형을 유리 바이알에 충전시키고, 마개를 하고 막았다. 제형의 개관은 표 6에 제시된다. 각각의 제형을 다음 스트레스 조건에 적용시켰다: i) 5℃에서 3개월, ii) -20℃에서 3개월, iii) 20회의 동결-해동 주기, iv) 200 rpm에서 1일 동안 진탕. 다양한 분광 방법(예를 들어, 비등방성, 고유 형광, 90도 광 산란, 인광, 동적 광 산란 및 혼탁도)에 의해 표시된 스트레스 조건 중 하나 전 및 후에 샘플을 측정하였다. 또한, 샘플을 효능에 대해 측정하였다.
혼탁도의 측정을 BioTek Neo 플레이트 판독기에서 수행하였다. 동적 광 산란(DLS)(Z-평균 직경 변화 및 PDI 변화로 표시됨) 측정을 제타사이저에서 수행하였다. 비등방성, 고유 형광, 90도 광 산란 및 인광의 측정을 플루오로맥스 4 분광형광계(Jobin Yvon Horiba, UK) 상의 석영 큐벳에서 수행하였다. 효능 측정을 형광 활성화 세포 분류기(FACS) 검정에 의해 수행하였고, mL 당 감염 단위(표 7)뿐만 아니라 상대 효능 차이(표 8)로 표현하였다.
표 6: 시험된 제형의 조성
결과 및 결론
스트레스 조건 적용 전 및 후의 제형의 효능이 표 7 및 8에 제시된다. 도 5, 6, 7 및 8은 제조 후 및 5℃에서 3개월, -20℃에서 3개월, 20회의 동결-해동 주기 및 200 rpm에서 1일 진탕 각각의 적용된 스트레스 조건 후의 MVA 제형에 대한 비등방성, 형광 방출 및 90도 광 산란 스펙트럼을 함유한다. 도 9는 시험된 샘플의 혼탁도, Z-평균 직경 및 PDI를 함유한다. 제형 3은 -20℃에서 3개월 후, 20회의 동결-해동 주기 후 및 1일 진탕 후의 효능 손실이 없음을 나타내었다(표 7 및 8). 측정된 변동은 검정 변동 내에 있었다. 제형 7은 1일 진탕 후에 효능 손실이 없음을 나타낸 반면, -20℃에서 3개월 또는 20회의 동결-해동 주기 후에 강한 감소가 있었다(표 7 및 8).
MVA 제형은 감염성 MVA 입자(활성 물질)뿐만 아니라 다양한 숙주 세포 단백질 및 다른 공정 유래 불순물의 고유한 조합이며; 모두 함께 평균 직경 및 PDI로 측정되는 크기를 갖는 작고 큰 입자를 함유하는 약간 흰 현탁액을 형성한다. 혼탁도 및 90도 광 산란은 이들 현탁액의 미립자 특성에 대한 추가 통찰력을 제공한다. 일반적으로, 제형 내의 설페이트는 혼탁도의 감소를 발생시켰으며, 이는 제형 1에 대해 가장 현저하다고 결론내려질 수 있다(도 9). 본 실시예에서, 표시된 스트레스 조건에서, 혼탁도, 광 산란, Z-평균 및 PDI의 훨씬 더 낮은 값에 의해 측정되는 바와 같이, 제형 1에서 더 큰 입자를 감소시키는 데 대한 설페이트의 파괴 효과는 대조군 A에 비해 추가로 증가되었다(도 5-9).
소듐 설페이트 및 글리세롤을 갖는 트리스 중 MVA인 제형 3은 i) -20℃에서 3개월, ii) 20회의 동결-해동 주기 및 iii) 200 rpm에서 1일 동안의 진탕의 스트레스 조건 후에 비등방성 스펙트럼, 형광 방출 스펙트럼, 90도 광 산란, 혼탁도, Z-평균 직경 및 PDI에서 변화가 없거나 최소의 변화를 나타내었다(도 6-9). 이는 효능 손실의 변화가 없는 것을 관찰한 것과 일치한다(검정 변동 내). 트리스 및 글리세롤과 조합된 설페이트는 MVA 제형에 긍정적으로 영향을 미쳤으며, 현탁액의 미립자 특성 및 콜로이드 특성과 관련하여 적절한 평형이 확립되었고; 예를 들어, 제형은 T0과 비교하는 경우 이의 혼탁도뿐만 아니라 약 0.3의 PDI에 의해 제시된 바와 같은 일부 비균질성을 유지하였다(도 9).
소듐 설페이트를 갖는 포스페이트 완충제 중 MVA인 제형 7은 높은 PdI 및 높은 Z-평균 값을 가졌으며(도 9), 이는 많은 작고 큰 입자의 존재를 나타낸다. 제형 7은 제형 3과 유사한 방식으로 진탕 유도 스트레스에 대해 MVA를 안정화시켰다. 진탕은 비등방성 값에서의 작은 하락이 측정되었음에도 불구하고, 제형 7의 형광 방출, 90도 광 산란 또는 혼탁도에서 변화를 유도하지 않았다. 이는 평균적으로 Trp 환경이 MVA 콜로이드 현탁액의 전체 미립자 특성에 영향을 미치지 않으면서 덜 강성이 된 것(예를 들어, 해리 또는 언폴딩)을 나타낸다. 진탕은 제형 7의 효능의 변화를 유도하지 않았으며; 관찰된 변화는 비-MVA 관련 단백질의 해리 또는 분해에 의해 야기되었을 수 있다. 또한, 1일 동안 진탕 후 제형 7의 PdI 및 Z-평균 값은 5℃에서 3개월 또는 -20℃에서 3개월 후의 값과 비교하여 더 낮았으며, 이는 입자 및 이의 크기 분포가 큰 정도의 응집 또는 클러스터 없이 정제된 MVA 입자로부터 예상되는 것과 더 일치한 것을 나타낸다. 제형 1에 비한 제형 7은 설페이트와 조합된 포스페이트의 존재가 설페이트를 갖는 트리스보다 진탕 유도 스트레스에 대해 더 보호적임을 나타낸다(표 7 및 8).
본 실시예에서, 대조군 제형 B(트리스, 글리세롤 및 NaCl)는 대조군 제형 A(트리스 및 NaCl)에 비해 유사하거나 더 악화된 효능 손실을 가졌으며, 이는 글리세롤의 존재가 설페이트를 함유하지 않는 대조군 제형의 물리적 및 생물학적 특성을 개선시키지 않은 것을 나타낸다. 그러나, 대조군 제형 B의 소듐 클로라이드를 소듐 설페이트로 대체한 경우(제형 3), MVA 제형의 안정화는 효능에 있어서 최소의 변화 내지 변화 없음을 발생시켰으며; -20℃, 20 x 동결-해동 및 진탕 조건에 대한 표 7 및 8에 제시된 값은 검정 변동 내였다.
결론적으로, MVA의 효능 및 물리적 안정성은 제형으로의 설페이트 염의 첨가에 의해 안정화되었다. 설페이트와 글리세롤의 조합은 동결된 상태 및 동결-해동시 모두 MVA 입자를 안정화시켰다. 개선된 MVA 안정성은 장기 저장, 비축 및 현장에서의 사용을 포함하는 공급망에 유리할 수 있다.
표 7: T0 및 스트레스 조건 후의 제형의 효능
표 8: T0에서의 효능(=100%)에 비한 시험된 제형의 스트레스 후의 효능의 상대적 손실( % )
안정성을 결정하기 위해 이용된 방법
고유 형광 검정
MVA 단백질은 여기 후 빛을 재방출하는 방향족 아미노산(형광단), 특히 트립토판 및 보다 덜한 정도로 티로신 및 페닐알라닌을 함유한다. 트립토판의 방출 최대치 및 양자 수율은 이의 환경의 극성에 크게 의존한다. 극성의 수성 환경(예를 들어, 구형 단백질의 표면, 또는 해리된 자유 상태)에서, 양자 수율은 비교적 낮은 반면, 극성 환경(예를 들어, 응집물 내부, 또는 친지질성 바이러스 외피 내)에서, 양자 수율은 증가한다. 이러한 특징은 트립토판 형광을 단백질 입체형태 변화, 응집, 분해, 해리 및 분자 상호작용을 연구하기 위한 유용한 도구로 만든다.
형광 강도는 단백질 안정성의 민감한 척도인 것으로 당 분야에 공지되어 있다. 샘플에서 발생하는 변화의 특성에 따라 스트레스에 대한 증가 또는 감소가 관찰될 수 있다. 단백질 언폴딩 및 캡시드 해리는 고유 형광에서 감소를 초래할 것으로 예상되며, 응집은 증가를 초래할 것으로 예상된다. 방출 최대치의 위치에서의 변화는 형광단의 환경에 대한 추가 정보를 제공한다. 일반적으로, 보다 수성 환경에 대해 형광단이 노출되는 경우 적색 이동(더 긴 파장을 향한 최대 강도 이동)이 발생한다. 형광단이 물로부터 더 보호되는 경우, 청색 이동(최대 강도에서 더 낮은 파장으로의 이동)이 전형적으로 발생한다.
스트레스 샘플에 대해 획득된 형광은 항상 대조군 샘플과 비교되어야 한다. t=0 샘플에 비한 변화(더 높거나 더 낮음)는 덜 안정한 제형을 나타낸다. t=0 샘플 값에 근접한 채로 남아 있는 스트레스 샘플이 더 안정적이다.
큐벳 기반 분광형광계 및 마이크로플레이트 기반 플레이트 판독기의 2개의 상이한 형광 기술이 적용되었다. 둘 모두의 기술의 정밀도는 사용된 범위에서 5%(CV%) 미만이다.
큐벳 기반 항정-상태 형광 측정을 플루오로맥스-4 분광형광계(Jobin Yvon Horiba, UK)로 수행하였다. 온도조절식 큐벳 홀더를 이용하여 25℃에서 측정을 수행하였다. 헬마(Hellma) 석영 큐벳을 사용하였다. 샘플을 290 nm에서 여기시키고, 항정-상태 방출 측정을 위해 2 nm(여기) 및 4 nm(방출)의 대역통과 및 0.1의 적분 시간을 이용하여 300 nm 내지 450 nm에서 방출을 모니터링하였다.
마이크로플레이트 기반 고유 형광 검정을 Biotek Neo 2 플레이트 판독기로 측정하였다. 샘플을 UV-투명, 편평-바닥 마이크로플레이트에 삼중으로 옮겼다. 트립토판 형광은 280 nm에서의 여기 및 10 nm의 대역폭, 및 310 nm 내지 450 nm의 방출 후에 측정된다.
비등방성
항정-상태 형광 비등방성은 편광으로 전환하는 형광의 능력을 측정한다. 여기 파장은 한 방향으로 편광되고, 이후 형광단에 의해 방출되는 경우에 전환된다. 여기 파장과 동일 평면에서 방출 파장을 측정하는 데 필터가 사용되며, 이는 여기 파장과 동일한 평면의 빛만 검출될 것임을 의미한다. 더 많은 편광이 전환될수록, 검출기 상의 신호는 낮아진다. 광을 전환시키는 능력은 개별적 형광단의 평균 유연성의 의존하며; 형광단이 더 유연할수록, 더 많은 빛이 전환될 것이고, 검출기 상의 신호가 낮아질 것이다. 이는 비등방성을 단백질 입체형태 변화, 응집, 분해, 해리 및 분자 상호작용을 연구하는 데 유용한 도구로 만든다.
비등방성은 단백질 안정성의 민감한 척도인 것으로 당 분야에 공지되어 있다. 샘플에서 발생하는 변화의 특성에 따라 스트레스에 대한 증가 또는 감소가 관찰될 수 있다. 단백질 언폴딩 및 캡시드 해리는 비등방성에서 감소를 초래할 것으로 예상되며, 응집은 증가를 초래할 것으로 예상된다. 스트레스 샘플에 대해 획득된 비등방성은 항상 대조군 샘플과 비교되어야 한다. 적용된 스트레스 후의 증가 또는 감소는 분해 경로에 의존적이고, 각각의 활성 약학적 성분(API)에 특이적이므로, 이는 예측될 수 없다. t=0 샘플에 비한 변화(더 높거나 더 낮음)는 덜 안정한 제형을 나타낸다. t=0 샘플 값에 근접한 채로 남아 있는 스트레스 샘플이 더 안정적이다.
항정-상태 형광 비등방성 측정을 플루오로맥스-4-분광형광계(Jobin Yvon Horiba, UK)로 수행하였다. 온도조절식 큐벳 홀더를 이용하여 25℃에서 측정을 수행하였다. 헬마 석영 큐벳을 사용하였다. 항정-상태 비등방성 측정을 Glan-Thompson 프리즘 편광기로 T-포맷 구성을 이용하여 수행하였다. 비등방성을 290 nm에서의 여기로부터 발생하는 방출 피크 범위(333 - 375 nm)에서 측정하였다. 형광 비등방성 A를 하기 식으로부터 계산하였다:
상기 식에서, G는 보정 계수이고, G는 I 90,0 /I 90,90 이다. Im,n은 제공된 파장에서의 형광 강도이고, 아래첨자는 수직 축에 비한 여기(m) 및 방출(n) 빔에서의 편광기의 위치를 나타낸다. 스펙트럼은 1 nm 스펙트럼 단계 당 1.0초 적분 시간으로 기록하였다.
90도 광 산란
큐벳 기반 90도 광 산란 측정을 플루오로맥스-4 분광형광계(Jobin Yvon Horiba, UK)로 수행하였다. 온도조절식 큐벳 홀더를 이용하여 25℃에서 측정을 수행하였다. 헬마 석영 큐벳을 사용하였다. 90도 각도에서의 광 산란을 최적화된 대역통과 조합 및 0.01초의 적분 시간을 이용하여 여기 파장에서의 방출을 모니터링함으로써 500 내지 750 nm의 파장에서 측정하였다. 광 산란 스펙트럼은 용액 내 입자의 농도, 굴절률 및 크기에 대한 정보를 제공한다. 이러한 기술은 생물학적 제형의 응집 상태의 작은 변화에 민감한 것으로 나타났다. 예를 들어, 광 산란의 감소는 입자 농도의 감소 또는 동일한 수의 입자의 크기의 감소, 또는 이들의 조합에 의해 설명될 수 있다. 광 산란의 증가는 종종 입자 수의 증가 또는 동일한 수의 입자의 크기 증가, 또는 이들의 조합으로 인한 응집과 관련된다.
동적 광 산란
동적 광 산란(DLS)은 현탁액 또는 용액에서 입자의 크기 분포를 측정하는 데 사용되는 기술이다. 평광된 레이저 광은 샘플에 진입하고, 샘플에 존재하는 입자에 의해 산란된다. 산란 광은 이후 광전자증배기에 의해 수집된다. 본원에서, 시간 경과에 따른 강도의 변동이 분석된다. 더 작은 입자는 더 큰 입자보다 용액을 통해 더 신속히 이동하므로, 이들의 더 높은 브라운 운동으로 인해, 더 작은 입자의 강도의 변동이 더 높다. MVA는 입자이고, 편광된 레이저 광을 산란시키므로, DLS는 MVA 입자 크기의 증가(예를 들어, 응집) 및/또는 감소(예를 들어, 해리)를 결정하는 데 사용될 수 있으며, 이는 DLS를 응집 또는 해리 검출을 위한 유용한 기술로 만든다.
DLS에서, 샘플을 UV-투명, 편평-바닥 마이크로플레이트에 삼중으로 옮겼다. 입자 크기 및 분포를 10mV He-Ne 레이저(830 nm)가 장비되고, 90°의 각도로 작동되는 DLS 장비 제타사이저 APS(Malvern, UK)를 이용하여 측정하였다.
스트레스 샘플에 대해 획득된 크기 분포를 대조군 샘플과 비교하였다. t=0 샘플에 비한 변화(더 높거나 더 낮음)는 덜 안정한 제형을 나타낸다. t=0 샘플 값에 근접한 채로 남아 있는 스트레스 샘플이 더 안정적이다.
350 nm에서의 혼탁도 측정
혼탁도측정은 샘플 내의 분자가 빛을 흡수하지 않는 파장(예를 들어, 단백질이 주요 발색단인 샘플에 대해 350 nm)에서 검출된 샘플 내의 입자의 산란(겉보기 흡광도)으로 인한 투과광의 강도 손실을 측정한다. 분자가 응집하거나 초분자 복합체를 형성하는 경우, 개별 입자로부터 나오는 경우 무작위인 광 산란은 이제 응집성(coherent)이 되어 측정되는 강도가 증가한다. 이는 광 산란 및 혼탁도측정을 응집 및 복합체 형성 또는 해리를 검출하는 데 유용한 기술로 만든다.
혼탁도 검정에서, 샘플을 UV-투명, 편평-바닥 마이크로플레이트에 삼중으로 옮겼다. 흡광도 스펙트럼은 230 내지 500 nm의 마이크로플레이트 판독기에 의해 기록되고, 975 nm에서의 흡광도는 광 경로 길이의 차이를 결정하고, 가능하게는 이를 교정하기 위해 측정된다. MVA가 없는 제형으로 구성되는 대조군 샘플은 필요한 경우 매트릭스 성분의 산란 또는 흡수를 교정하기 위해 검정에 포함되었다. 350 nm에서의 겉보기 흡광도를 혼탁도에 대한 정량적 척도로 사용하였다.
혼탁도 검정은 MVA 샘플에 대한 안정성을 나타낸다. MVA 응집은 혼탁도를 증가시키고, 캡시드 해리를 감소시킨다. 검정 정밀도는 1 NTU 초과의 혼탁도 값에서 5%(CV%) 미만이다.
스트레스 샘플에 대해 획득된 혼탁도는 항상 대조군 샘플과 비교되어야 한다. t=0 샘플에 비한 변화(더 높거나 더 낮음)는 덜 안정한 제형을 나타낸다. t=0 샘플과 동등한 스트레스 샘플이 더 안정적일 것으로 예상된다.
인광
인광은 여기된 삼중항 상태로부터의 방출을 나타내는 반면, 형광은 여기된 단일항 상태로부터의 방출을 나타낸다. 인광은 기본적으로 형광(ns 스케일)과 유사한 방식이나 더 긴 타임스케일(ms에서 ms)로 방사선을 방출하므로, 여기가 중된 후에 방출이 계속된다. 자블론스키 도표(Jablonski diagram)에 따르면, 형광단은 빛을 흡수하여 그라운드 상태로부터 단일항 상태로 진행한 후, 삼중항 상태로의 시스템간 교차가 후속된다. 삼중항 상태로부터의 방출(인광)은 형광에 비해 더 낮은 에너지이고, 따라서 더 높은 파장이다. 인광 신호는 활성 약학 성분(API)의 특정 특성일 수 있으며, 감소의 경우 입체형태적 변화, 분해 또는 해리의 지표를 제공한다. 예를 들어, 단백질 응집의 경우 더 크고 강성의 구조가 형성되는 경우에 인광 방출의 증가가 발생할 수 있다.
인광 측정을 플루오로맥스-4 분광형광계(Jobin Yvon Horiba, UK)로 수행하였다. 온도조절식 큐벳 홀더를 이용하여 25℃에서 측정을 수행하였다. 헬마 석영 큐벳을 사용하였다. 샘플을 343 nm에서 여기시키고, 2 nm(여기) 및 4 nm(방출)의 대역통과 및 0.5초의 적분 시간을 이용하여 360 nm 내지 550 nm에서 인광을 모니터링하였다.
감염성(효능)을 결정하는 방법
형광 활성화 세포 분류기( FACS ) 검정
재조합 또는 비-재조합 MVA의 역가(InfU/mL)를 형광 활성화 세포 분류기(FACS) 검정에 의해 결정하였다. MVA 감염된 새끼 햄스터 신장 세포 21(BHK-21) 세포를 백시니아 바이러스(VACV)에 특이적인 플루오로크롬-컨쥬게이션된 항체로 면역 염색하였으며, 이는 이후 정량적 세포 계수를 위한 BD Flow Sensor가 장비된 FACSVerse™(BD Bioscience) 기기를 이용하여 획득되고 정량되었다.
보다 상세하게는, 2.5x105 BHK 21 세포(소스 ATCC)를 12웰 플레이트에 GMEM/9% FBS/1.8% Ala-Gln에 시딩하였다. 세포를 다음날 관심 MVA 바이러스 스톡의 연속 희석액으로 감염시켰다. 37도에서 1시간 인큐베이션 후, 리팜핀(Rifampin)(GMEM/9% FBS/ 1.8% Ala-Gln 중 100 μg/mL)을 첨가하였다. 세포를 감염 19 ± 2시간 후에 수확하고, 항체 염색 전에 BD Perm/Wash™ 키트로 고정시키고, 투과화시켰다. 고정된 세포를 60-90분 동안 항-백시니아 FITC(Fitzgerald Industries International, Cat#60-v68)와 함께 인큐베이션하였다. 이후, 바이러스-양성 세포의 백분율을 BD FACSVerse™ 세포측정기를 이용한 흐름세포측정법에 의해 결정하였다. 병렬로 고정된 염색되지 않은 세포에서 BD FACSVerse™ Flow Sensor를 사용하여 전체 세포수를 결정하였다. 검정의 InfU/mL의 계산은 바이러스-양성 세포의 백분율, 감염 동안 사용된 바이러스 희석액, 감염 부피 및 웰 당 평균 세포수를 기초로 하였다. 세포수의 영향을 웰마다의 변동성으로 제한하기 위해, 다수의 웰의 세포수를 평균화함으로써 세포수를 확립하였다. 바이러스 샘플의 InfU/mL의 계산을 위해, 2 내지 35% VACV-양성 세포를 함유하는 희석액만 포함시켰다. 샘플 희석액 당 InfU/mL의 계산을 하기 식에 따라 수행하였다:
조직 배양 감염 용량 50( TCID 50 ) MVA 감염성 검정
TCID50은 WO 03/053463호의 실시예 2에 기재된 96-웰 포맷의 10배 희석액을 사용하여 MVA의 감염성을 적정하기 위한 방법이다. MVA의 적정을 96-웰 포맷의 10배 희석액을 사용하여 TCID50-기반 검정에서 수행하였다. 검정의 종점에서, 감염된 세포를 항-백시니아 바이러스 항체 및 적절한 염색 용액을 사용하여 시각화시켰다. 2-3일령 일차 CEF(닭 배아 섬유모세포) 세포를 7% RPMI에서 1x105 세포/mL로 희석시켰다. 희석 당 8회 반복으로 10배 희석을 수행하였다. 희석 후, 96-웰 플레이트의 웰 당 100 μL를 시딩하였다. 이후, 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다.
바이러스 함유 용액의 희석은 송아지 태아 혈청이 없는 RPMI를 사용하여 10배 단계로 이루어졌다. 이후, 100 μL의 모든 바이러스 샘플을 세포 함유 웰에 첨가하였다. 96-웰 플레이트를 감염 및 바이러스 복제를 가능하게 하기 위해 5일 동안 5% CO2와 함께 37 섭씨 온도에서 인큐베이션하였다. 세포를 백시니아 바이러스 특이적 항체로 감염 5일 후에 염색하였다. 특이적 항체의 검출을 위해, 호스라디쉬 퍼옥시다제(HRP) 결합된 이차 항체를 사용하였다. MVA 특이적 항체는 항-백시니아 바이러스 항체, 토끼 폴리클로날, IgG 분획(Quartett, Berlin, Germany #9503-2057)이었다. 이차 항체는 항-토끼 IgG 항체, HRP 결합된 염소 폴리클로날(Promega, Mannheim, Germany, # W4011)이었다. 색 반응을 공지된 기술에 따라 수행하였다. 색 반응에서 양성인 세포를 갖는 모든 웰을 TCID50의 계산에 대해 양성으로 표시하였다. 역가를 스피어만-카에버(Spearman-Kaerber) 계산 방법을 이용하여 계산하였다. 데이터는 또한 T=0 시점으로부터 임의의 제공된 시점에 대한 상대적 차이인 바이러스 역가의 로그로 표현될 수 있다.
상기 기재된 바와 같은 실시예는 단지 예시적인 것으로 간주되며, 본 발명의 진정한 범위 및 사상은 하기 청구범위에 의해 지시된다.

Claims (30)

  1. a) 폭스바이러스; b) 완충제; 및 c) 5 mM 내지 300 mM 농도의 소듐 설페이트를 포함하는 조성물로서,
    상기 폭스바이러스는 변형된 백시니아 앙카라(vaccinia Ankara; MVA) 바이러스이고,
    상기 완충제는 트리스 완충제, 포스페이트 완충제, 시트레이트 완충제 또는 시트레이트/포스페이트 완충제이고, 5 내지 40 mM의 농도로 존재하고,
    상기 조성물은 6.0 내지 8.5의 pH를 갖는, 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 폭스바이러스가 재조합 폭스바이러스인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, MVA가 필로바이러스 단백질, 또는 1개, 2개 또는 3개의 필로바이러스 당단백질을 발현하는 재조합 MVA인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 바이러스 역가가 1x107 InfU/mL 내지 2x109 InfU/mL, 1x107 InfU/mL 내지 4x108 InfU/mL, 또는 0.1x108 InfU/mL 내지 4x108 InfU/mL의 범위인 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 조성물이 액체 조성물 또는 동결된 액체 조성물인 조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 완충제가 5 내지 25 mM의 농도로 존재하는 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 완충제가 6.5 내지 8.5의 pH의 트리스 완충제인 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 완충제가 7.5 내지 8.5의 pH의 트리스 완충제인 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 완충제가 6.5 내지 8.5의 pH의 포스페이트 완충제인 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 완충제가 6.8 내지 7.8의 pH의 포스페이트 완충제인 조성물.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 제1항에 있어서, 염 농도가 5 mM 내지 150 mM인 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 10 mM 농도의 트리스 완충제, 100 mM 농도의 소듐 설페이트를 포함하고, 8의 pH를 갖는 조성물.
  18. 제1항에 있어서, 10 mM 농도의 포스페이트 완충제, 100 mM 농도의 소듐 설페이트를 포함하고, 7.5의 pH를 갖는 조성물.
  19. 제1항에 있어서, 소듐 클로라이드를 추가로 포함하는 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 10 mM 내지 100 mM 농도의 소듐 클로라이드를 포함하는 조성물.
  21. 제1항에 있어서, 당, 당 알콜 및/또는 폴리올을 추가로 포함하는 조성물.
  22. 제1항에 있어서, 폴리올이 글리세롤인 조성물.
  23. 제1항에 있어서, 글리세롤 농도가 1% (w/w) 내지 6% (w/w) 범위인 조성물.
  24. 제1항에 있어서, 글리세롤 농도가 5% (w/w) 범위인 조성물.
  25. 제21항에 있어서, 당이 수크로스인 조성물.
  26. 제21항에 있어서, 당 농도가 1% (w/w) 내지 10% (w/w) 범위인 조성물.
  27. 제1항, 제3항 내지 제6항, 제9항 내지 제13항, 및 제16항 내지 제26항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 암 또는 감염성 질병을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물.
  28. a) 폭스바이러스; b) 완충제; 및 c) 5 mM 내지 300 mM 농도의 소듐 설페이트를 조성물에서 조합하는 단계를 포함하는 제1항, 제3항 내지 제6항, 제9항 내지 제13항, 및 제16항 내지 제26항 중 어느 한 항의 조성물을 제조하는 방법으로서,
    상기 폭스바이러스는 변형된 백시니아 앙카라(vaccinia Ankara; MVA) 바이러스이고,
    상기 완충제는 트리스 완충제, 포스페이트 완충제, 시트레이트 완충제 또는 시트레이트/포스페이트 완충제이고, 5 내지 40 mM의 농도로 존재하고,
    상기 조성물이 6.0 내지 8.5의 pH를 갖는, 방법.
  29. 제1항, 제3항 내지 제6항, 제9항 내지 제13항, 및 제16항 내지 제26항 중 어느 한 항의 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 폭스바이러스 조성물을 안정화시키는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 2 섭씨 온도 내지 8 섭씨 온도의 온도에서 조성물을 저장하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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