KR102435054B1 - 재조합 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(ankara) (mva) 호흡기 신시티알 바이러스(rsv) 백신 - Google Patents

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Abstract

호흡기 신시티알 바이러스(RSV 바이러스)의 감염에 대한 개선된 백신으로서 재조합 개질된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA) 균주 및 관련 생성물, 방법 및 용도가 본원에 제공된다. 구체적으로, RSV 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열 및 RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전학적으로 조작된 재조합 MVA 벡터가 본원에 제공된다. 또한, 대상체가 재발성 RSV 감염의 위험에 처해있는지의 여부를 측정하는 것 뿐만 아니라, 예를 들어, 대상체에서 면역 반응에 영향을 주는데 적합하거나 RSV 감염을 진단하기 위해 적합한 생성물, 방법 및 그의 용도가 본원에 제공된다.

Description

재조합 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(ANKARA) (MVA) 호흡기 신시티알 바이러스(RSV) 백신{RECOMBINANT MODIFIED VACCINIA VIRUS ANKARA (MVA) RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS (RSV) VACCINE}
본 발명은 호흡기 신시티알 바이러스(RSV 바이러스)의 감염에 대한 개선된 백신으로서 재조합 개질된 백시니아 바이러스 앙카라(Ankara) (MVA 바이러스), 및 관련된 생성물, 방법 및 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 RSV 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열 및 RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전학적으로 조작된 재조합 MVA 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 예를들어, 대상체에서 면역 반응에 영향을 주는데 적합하거나 RSV 감염을 진단하기 위해 적합하고, 대상체가 재발성 RSV 감염 위험에 처해 있는지 여부를 측정하기 위해 적합한 생성물, 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
RSV는 상당한 호흡기 병원체이다. 급성의 하부 기도관 (LRT) 감염은 전세계적으로 5세 미만의 유아 및 어린이에서 상당한 이환율 및 사망율을 유발한다 [A.M. Aliyu et al. (2010), Bayero J. Pure Appl . Sci . 3(1):147-155]. 호흡기 신시티알 바이러스(RSV)는 LRT 감염의 가장 임상적으로 중요한 원인이고; RSV에 의한 1차감염은 일반적으로 2세까지 발병한다 W.P. Glezen (1987), Ped . Virol . 2:1-4; Y. Murata (2009), Clin . Lab. Med . 29(4):725-739]. 1차 RSV 감염은 RSV에 대한 완전한 면역력을 유도하지 않기 때문에 인생 전반에 걸쳐 재감염이 빈번하게 발생하고 가장 중증의 감염은 매우 어릴 때, 매우 늙었을 때 및 임의의 연령의 면역 손상된 환자에서 발생한다 [Y. Murata (2009)].
RSV로 감염된 자들의 40%의 많은 감염자들은 궁극적으로 입원이 요구될정도로 심각한 LRT 질환을 발병하고 질환의 중증도 및 강도는 감염 및 숙주 반응의 정도 및 강도에 의존한다 [Aliyu et al. (2010)]. RSV는 또한 손상된 면역계, 호흡계 또는 심장계를 갖는 임의의 연령의 환자들에서 심각한 LRT 질환을 유발할 수 있고 또한 어린이들에게 이후에 천식이 발병될 수 있게 할수 있다. RSV는 미국에서만 매년 126,000명으로 추정되는 병원 입원 및 300명의 유아들의 사망 원인이 된다 [Y. Murata (2009)]. 더욱이, RSV는 노인 환자들 중 및 저하된 심폐 또는 면역억제 병태를 갖는 자들 중에서 각겨울마다 80,000 초과의 병원입원 및 13,000 초과의 사망을 유발한다 [Y. Murata (2009)]. 호흡기 병원체로서 RSV의 중요성에도 불구하고, 시장에는 현재 안전하고 효과적인 RSV 백신이 없다.
RSV는 파라믹소비리대(Paramyxoviridae) 패밀리의 뉴모비리내(Pneumovirinae) 서브패밀리의 외피 RNA 바이러스이다 [Aliyu et al. (2010)]. 각각의 RSV 비리온은 8개의 구조 단백질 (G, F, SH, M1, N, P, M2.1, 및 L) 및 3개의 비-구조 단백질(NS1, NS2, 및 M2.2)를 포함하는 11개의 별도의 단백질을 인코딩하는 10개의 유전자들을 함유하는 대략 15,191개의 뉴클레오티드의 비-절편화된 네가티브-센스 단일 가닥 RNA를 함유한다(M2는 2개의 개방 판독 프레임을 함유한다) [Y. Murata (2009)]. 상기 게놈은 하기의 순서로 NS1로부터 L까지 순차적으로 전사된다: 3'-NS1-NS2-N-P-M1-SH-G-F-M2.1-M2.2-L-5'
상기 바이러스 외피는 매트릭스(M1) 단백질 뿐만 아니라 3개의 막관통 당단백질(접착 당단백질(G), 융합 당단백질(F) 및 소형 소수성 단백질(SH))을 함유한다 [Y. Murata (2009)]. RSV 복제 동안에, 상기 바이러스는 먼저 과중하게 당화된 G 단백질에 의해 매개된 과정에서 표적 세포에 부착한다. 이후, 상기 바이러스는 F 단백질에 의해 매개되는 과정에서 숙주 세포와 융합하며, 이로써 세포막을 침투하고 숙주 세포에 진입하며; 상기 F 단백질은 또한 RSV-감염된 세포의 융합세포 특성의 형성을 위해 요구된다. 상기 부착 및 융합 과정은 SH 단백질에 의해 증강된다. 상기 M1 단백질은 외피 단백질 F 및 G와 상호작용하고 뉴클레오캡시드 단백질 N, P 및 M2.1과 상호작용함으로써 성숙한 RSV의 어셈블리(assembly)를 조절한다 (하기 참조). 외피 내에서, 바이러스 RNA는 뉴클레오캡시드 단백질 (N), 인단백질 (P), 전사 연장 인자 (M2.1) 및 RNA 폴리머라제 (L) 단백질로 이루어진 전사 효소 복합체에 의해 캡시드화된다 [Y. Murata (2009)]. N은 게놈 RNA와 연합하고, 반면 P는 L, 바이러스 RNA 폴리머라제에 대한 보조인자이다. M2.1은 바이러스 전사에 필요한 연장 인자이고, M2.2는 바이러스 게놈의 전사를 조절한다. 최종적으로, NS1 및 NS2는 I형 인터페론 활성을 억제한다.
임상 RSV 분리물은 항원 그룹 (A 또는 B)에 따라 분류되고 추가로 각각의 항원성 그룹의 바이러스 게놈내 유전학적 가변성을 기준으로 다수의 게놈형(예를 들어, A그룹에 대해 A2 또는 ALong; 및 B 그룹에 대해 B1, CH-18537, 또는 8/60)으로 세분된다 [Y. Murata (2009)]. 분류는 바이러스와, 부착 당단백질(G 단백질)에 대해 지시된 모노클로날 항체의 반응성 및 다양한 유전학적 분석을 기초로 한다. [M. Sato et al., J. Clin . Microbiol. 43(1):36-40 (2005)]. 바이러스 분리물 중에, 일부 RSV-인코딩된 단백질은 아미노산 서열 수준에서 높은 수준으로 보존되어 있고 (예를 들어, F), 반면 다른 것들은 2개의 주요 항원 그룹간에 및 그룹내에서 광범위하게 변한다 (예를 들어, G) [Y. Murata (2009)]. A 및 B 항원성 그룹 기원의 F 단백질들은 상당한 상동성을 공유한다. 대조적으로, G 단백질은 2개의 항원성 그룹들 사이에서 상당히 상이하다.
상기 G 단백질은 가장 가변적인 RSV 단백질이고, 이의 초가변 C-말단 영역은 균주-특이적 에피토프의 대부분을 차지한다. 상기 G 단백질의 분자 역학 및 진화적 패턴은 RSV의 임상적 및 역학적 특징에 대해 중요한 정보를 제공했다. 전형적으로 다수의 상이한 게놈형이 동시에 순환하고 매년 집단에서 우세한 하나는 변화할 수 있다. 그러나, RSV의 임상적 및 역학적 특징의 균주 다양성의 중요성은 아직 잘 이해되지 않고 있다. 따라서 재조합 RSV 단백질들은 이로부터 유전자 또는 단백질이 클로닝되는 원래의 RSV 균주를 지시하는 균주 지정을 수반한다. 예를 들어, RSV 균주 ALong 기원의 클로닝된 G 단백질은 G(ALong), RSV ALong G, 또는 RSV RSV ALong G 단백질로 지정된다.
RSV는 감염된 숙주에서 케모카인 및 시토카인의 분비, 체액성 및 점막성 항체들의 중화 생성 및 CD4+ (예를 들어, TH1 및 TH2) 및 CD8+ (예를 들어, CTL) T-세포의 생성을 포함하는 다양한 면역 반응들을 자극한다. 그러한 숙주 면역 반응들은 대부분 상기 바이러스가 체내 제한된 세포 세포병리학을 유발하기 때문에 RSV 감염의 임상적 현상에 있어서 큰 원인이 있다 [Y. Murata (2009)]. RSV-유도된 질환의 표현형 현상 및 중증도는 명백하게 RSV 감염에 의해 자극된 면역 반응의 범위 중에서 균형 및 상호작용에 의해 매개된다 [Y. Murata (2009)].
많은 이전의 연구들은 세포성 및 체액성 면역 반응이 질환 진행에서 뿐만 아니라 RSV에 대한 면역성의 유도 및 RSV 감염의 해결에서 상이한 역할을 수행함을 시사한다 [Y. Murata (2009) 및 그 안의 참조들]. 예를 들어, 인간화된 항-F 항체를 사용한 연구는 항-RSV 항체가 감염을 예방하거나 이의 중증도를 제한하기에 충분한 반면 이들이 바이러스 감염을 제거하는데 있어서 요구되지는 않음을 보여주었다 [Y. Murata (2009); A.F.G. Antonis et al. (2007), Vaccine 25:4818-4827]. 대조적으로, T-세포 반응은 확정된 RSV 감염을 제거하기 위해 필요하다 [Y. Murata (2009)]. 상기 RSV-유도된 T-세포 반응은 또한 감염 동안에 폐 병리학에서 주요 역할을 수행한다. 예를 들어, 인터페론 -γ (IFNγ)-분비 TH1 세포는 - 연합된 CD8+ CTL 반응의 존재 또는 부재하에 - 최소 폐 병리학과 함께 RSV를 제거하고, 반면 인터페론 4 (IL-4)-분비 TH2 세포는 또한 RSV를 제거하지만, 흔히 상당한 폐 변화를 수반하고, 이는 이전의 백신 시도들 동안에 관찰된 증진된 질환의 특징인 호산성 침윤을 포함한다 (하기 참조).
그러나, RSV 감염의 면역학, 바이러스학 및 생리학에 관해 가용한 정보의 풍부함에도 불구하고 하기의 섹션에서 보다 상세하게 논의된 바와 같이 또한 RSV에 대한 후-백신접종 노출에서 증진된 질환을 생성시키지 않으면서, 정확하게 어떠한 종류의 면역 반응이 지속적인 면역성을 유도하는데 가장 효과적일지는 결코 명백하지 않다.
선행 백신 개발
백신은 전형적으로 표적 감염성 제제 또는 병원체 (예를 들어, 바이러스, 박테리아, 또는 기생충)에 대한 보호 면역성을 유도하기 위한 다양한 전략중 하나를 사용하고, 이는 (1) 불활성화된 병원체 제제; (2) 유전학적으로 약독화된 병원체 균주를 포함하는 생 약독화된 병원체 제제; (3) 정제된 단백질 서브유닛 백신 제제; (4) 병원체 항원 및/또는 보조제를 인코딩하는 바이러스 벡터계 백신; 및 (5) 병원체 항원을 인코딩하는 DNA계 백신을 포함한다.
초기 RSV 백신 개발 노력은 포르말린-불활성화된 RSV(FI-RSV) 백신의 임상 시험 효능이 처참한 결과와 함께 1960년대 동안에 미국에서 수행될때까지 불활성화된 바이러스 제제 상에 집중되어 있었다 [M.R. Olson & S.M. Varga (2007), J. Immunol. 179:5415-5424]. 상당수의 백신 접종된 환자들은 RSV와 후속적인 천연 감염 후 호산구 및 호중구 침윤 및 실질적인 염증 반응을 특징으로 하는 증진된 폐 질환을 발병했다 [Olson & Varga (2007), [Blanco JC et al. (2010) Hum Vaccin. 6:482-92]. 많은 상기 환자들은 병원 입원을 필요했고 소수의 임상적으로 병든 환자들은 사망했다. 결국, 조사자들은 보다 안전한 RSV 백신을 개발하기 위한 노력에서 후속적 시도 후 증진된 질환의 발병을 야기하는 바이러스 및/또는 숙주 인자를 찾기 시작했다. 상기 조사는 RSV 생물학 및 이것이 유도할 수 있는 광범위한 면역 반응에 대한 많은 새로운 정보를 밝혔지만 안전하고 효과적인 RSV 백신은 찾기힘든 채로 남아있다.
후-FI-RSV 백신 개발 노력은 대부분 G, F, 및 보다 드문 정도로는 N 또는 M2를 사용하는 단일 항원 백신에 대해 집중했고 상기 바이러스 항원은 바이러스 유전자를 발현하는 플라스미드 DNA 벡터들에 의하여, 아니면 정제된 단백질들로서 전달된다. [예를 들어, W. Olszewska et al. (2004), Vaccine 23:215-221; G. Taylor et al. (1997), J. Gen. Virol. 78:3195-3206; 및 L.S. Wyatt et al. (2000), Vaccine 18:392-397 참고]. F+G의 조합으로의 백신 접종은 또한 가지각색의 결과와 함께 소, 코튼 래트 및 BALB/c 마우스에서 시험되었다 [Antonis et al. (2007) (소(calves)); B. Moss, 미국 특허 출원 번호 06/849,299 ('the '299 application', 1986년 4월 8일 제출됨 (코튼 래트(cotton rats)); 및 L.S. Wyatt et al. (2000) (BALB/c 마우스)]. F 및 G 둘다는 소, 마우스, 코튼 래트, 사람에서 그리고 적어도 일부의 정도로 유아 마카크(macaque)에서 면역원성이다 [A.F.G. Antonis et al. (2007) (소(calves)); B. Moss, 'the '299 application' (코튼 래트(cotton rats)); L. de Waal et al. (2004), Vaccine 22:923-926 (유아 마카크); L.S. Wyatt et al. (2000) (BALB/c 마우스); Y. Murata (2009) (인간)].
그러나, 유의적으로, RSV 백신 후보물에 의해 유도된 면역 반응의 본질 및 유형은 흔히 매우 상당하게 사용된 백신의 유형, 선택된 항원, 투여 경로 및 심지어 사용된 모델 유기체에 따라 달라진다. 예를 들어, 생 RSV 또는 RSV F 단백질을 인코딩하는 복제 벡터로의 면역화는 둘 다 후-백신접종 바이러스 시도 상에서 미세 폐 병리학과 연관된 항-F 항체 및 CD8+ CTL의 중화 생성을 수반하는 우위 TH1 반응을 유도하였다 [Y. Murata (2009) 및 그 안에 인용된 참조들]. 대조적으로, FI-불활성화된 RSV 제제로의 면역화는 폐에서 증가된 병리학적 변화를 생성시키는 CD8+ CTL 반응이 완전히 없는 우위 TH2 반응을 유도한다 [Y. Murata (2009) 및 그 안에 인용된 참조들]. 흥미롭게도, 정제된 서브유닛 백신으로서 또는 복제 벡터에서 RSV G 단백질의 투여는 궁극적으로 후-백신접종 바이러스 시도 후, FI-RSV와 함께 관찰된 증진된 질환과 매우 유사한 반응인 호산성 폐 침윤 및 기도 과-반응을 생성시키는 우위 TH2 반응을 유도한다 [Y. Murata (2009) 및 그 안에 인용된 참조들]. 추가로, RSV F 단백질을 인코딩하는 개질된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA)는 소에서 항-F 항체 및 F-특이적 CD8+ T-세포를 유도하였고, MVA-F+MVA-G로의 백신 접종은 항-F 및 항-G 항체를 유도하였지만 F- 또는 G-특이적 CD8+ T-세포를 유도하지 못하였다 [A.F.G. Antonis et al. (2007)].
F 단백질을 발현하는 백시니아 바이러스(VV) (VV-F)를 사용한 마우스의 백신 접종은 FI-RSV로 면역화된 마우스와 유사하거나 보다 큰 체중 손실을 수반하는 폐로부터의 RSV 복제의 제거를 야기하는 강한 CD8+ T-세포 반응을 유도하였다 [W. Olszewska et al. (2004)]. 그러나, 이것은 IL-4 및 IL-5와 같은 TH2 시토카인의 증진된 분비로부터 초래된 FI-RSV, 또는 G 단백질을 발현하는 VV (VV-G)에 의해 유도된 증진된 질환 (조합된 TH2 반응 폐 호산구 및 체중 손실)과 관련이 없었다. 상기 분야에서 일부는 세포성 및 체액성 성분 둘다를 포함하는 상대적으로 균형된 면역 반응을 유도할 수 있는 RSV 백신이 후-백신접종 시도 상에서 증진된 면역병리를 나타내지 않을 것임을 시사했다 [W. Olszewska et al. (2004)].
그러나, F, G 또는 F+G를 인코딩하는 개질된 백시니아 바이러스 앙카라 (MVA)로의 BALB/c 마우스의 백신 접종이 체액성 반응 (즉, 균형된 IgG1 및 IgG2a 반응) 및 TH1 반응 (즉, 증가된 수준의 IFNγ/인터류킨-12 (IL-12) 및 감소된 수준의 인터류킨-4 (IL-4)/인터류킨-5 (IL-5)) 둘다를 포함하는 그러한 균형된 면역 반응을 유도하였던 반면, 그럼에도 불구하고 백신 접종된 동물은 여전히 일부 체중 손실을 나타냈다 [W. Olszewska et al. (2004)].
몇몇의 상이한 모델 시스템들에서 다양한 백신 후보물에 의해 유도된 면역 반응의 본질 및 정도를 특성화하기 위한 상당한 노력을 확대함에도 불구하고, 정확하게 어떠한 종류의 면역 반응이 백신 수용자에게 증진된 질환에 이르게 하지 않으면서 지속적이고 완전한 면역성을 전달하도록 요구되는지는 불명확한 상태로 남아있다. RSV의 임상적 부담 및 가용한 치료학적 및 예방학적 선택들 사이의 현저한 불균형 때문에 RSV 백신의 개발은 충족되지 않은 의학적 필요성으로 남아있다.
RSV-F 또는 RSV-G 막 당단백질 또는 이들 둘다로의 백신 접종 상에 주로 집중된 RSV 백신을 개발하기 위한 이전의 성공적이지 못한 노력들과는 다르게, 본 발명자는 RSV 막 당단백질의 적어도 하나의 항원성 결정인자 및 RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 적어도 하나의 결정인자를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스 앙카라(MVA)로의 백신 접종이 보다 양호한 보호를 유도함을 발견하였다. 추가로, 그러한 작제물들은 피하 적용과 비교하거나 심지어 하기 문헌의 Wyatt 및 동료들에 의해 사용된 근육내 투여 경로와 비교하여 비강내 경로에 의해 적용되는 경우 거의 완전한 무균(sterile) 면역성을 유도한다 [L.S. Wyatt et al. (2000)]. 증진된 보호는 근육내 투여와 비교하여 후보 RSV 백신의 비강내 투여에 의하여 수득될 수 있다.
RSV F 아니면 RSV G 막 당단백질 (또는 둘다)을 발현하는 재조합 MVA로 (예를들어, MVA-mBN199B), 또는 RSV 막 당단백질의 적어도 하나의 항원성 결정인자 및 RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 적어도 하나의 항원성 결정 인자를 발현하는 재조합 MVA로 (예를 들어, MVA-mBN201B), 본 발명자의 시도-후 4일 폐에서 RSV 게놈이 여전히 RT-qPCR에 의해 탐지됨에도 RSV 복제는 관찰되지 않았다. RSV 막 당단백질의 적어도 하나의 항원성 결정인자 및 RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 적어도 하나의 항원성 결정 인자를 발현하는 재조합 MVA들(예를 들어, MVA-mBN201B)은 보다 우수한 보호 및 RT-qPCR에 의해 탐지될 수 있는 RSV 바이러스 부하량에서 큰 감소를 유도하였는데 이는 그들이 RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자에 대해 보다 강한 CD8+ T 세포 반응을 유도하였기 때문이다. 비강내 경로에 의한 그러한 재조합 바이러스들의 투여는 더욱이 거의 완전히 무균 면역성 (RT-qPCR에 의해 탐지될 수 있는 RSV 바이러스 부하량이 거의 없음)을 유도하였는데 이는 그들이 그러한 작제물이 피하 투여되는 경우에는 나타나지 않았던 반응인 점막성 면역 반응 및 IgA 항체 분비를 유도하였기 때문이다.
FI-RSV와는 대조적으로, 그러한 작제물들은 RSV 항원에 대한 강한 특이적 세포성 면역 반응 뿐만 아니라 우수한 항체 반응을 생성시키는 균형된 Th1-면역 반응을 유도한다. 우수한 IgA 항체 반응의 유도 뿐만 아니라 통상의 피하내 투여로부터 초래된 것들 보다 더욱 높은 IgG 항체 수준을 생성시키는 백신의 비강내 투여로 보호는 개선되고 체중 손실은 감소된다. 그러나, 세포성 면역 반응의 규모는 투여 경로에 독립적이었다. 흥미롭게도, 본 발명자는 RSV 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 적어도 하나의 이종성 뉴클레오티드 서열, 및 훨씬 높음에도 불구하고 RSV 투여에 의해 유도된 T-세포 반응과 유사하였던 RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 적어도 하나의 이종성 뉴클레오티드 서열을 발현하는 재조합 MVA (예를 들어, RSV F, G, N, 및 M2 단백질을 발현하는 MVA-mBN201B)에 의해 유도된 T-세포 반응의 패턴을 관찰하였다.
따라서, 제1 측면에서, 본 발명은 호흡기 신시티알 바이러스(RSV) 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열 및 RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 개질된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA)를 제공한다.
개질된 백시니아 바이러스 앙카라 (MVA)
MVA는 많은 해동안 터키 앙카라에 소재하는 백신 접종 연구소에서 유지되고 사람의 백신 접종을 위한 기본으로서 사용된 표피 백시니아 균주 앙카라 [Chorioallantois vaccinia virus Ankara virus, CVA; for review see Mayr et al. (1975), Infection 3, 6-14]의 닭 배아 섬유아세포상에서 570회 초과의 연속 계대에 의해 생성되어 왔다. 그러나, 백시니아 바이러스와 관련된 빈번한 중증의 후-백신접종 합병증으로 인해 보다 약독화되고 안전한 천연두 백신을 생성하기 위한 여러 시도가 있었다.
1960년에서 1974년의 기간 동안, 안톤 마이르(Anton Mayr) 교수는 CEF 세포에서 570회 초과의 연속 계대에 의해 CVA를 약독화시키는데 성공하였다 [Mayr et al. (1975)]. 다양한 동물 모델에서 수득한 MVA가 비독성인 것으로 나타났다 [Mayr, A. & Danner, K. (1978), Dev. Biol. Stand. 41: 225-234]. 사전 천연두 백신으로서 MVA의 조기 개발의 일부로서, 백시니아로부터의 부작용 위험에 처한 대상체에서 리스터 엘스트리(Lister Elstree) [Stickl (1974), Prev. Med. 3: 97-101; Stickl and Hochstein-Mintzel (1971), Munich Med. Wochenschr. 113: 1149-1153]와 조합하여 MVA-517를 사용하는 임상 시도들이 있었다. 1976년에, MVA-571 씨드 스톡(seed stock) (571번째 계대에 상응하는)으로부터 유래된 MVA는 2단계 비경구 천연두 백신 접종 프로그램에서 주요 백신으로서 독일에 등록되었다. 이후, 많은 대상체들이 백시니아와 연관된 고위험의 합병증을 갖는 집단 중에 있었음에도 불구하고MVA-572는 대략 120,000명의 코카시안(Caucasian) 개체들, 보고된 중증의 부작용이 없는 1 내지 3세 사이의 대다수 어린이에 사용되었다 (Mayr et al. (1978), Zentralbl . Bacteriol. (B) 167:375-390). MVA-572는 ECACC V94012707로서 유럽 동물 세포 배양 수집 기관(European Collection of Animal Cell Cultures)에 기탁되었다.
MVA를 약독화시키기 위해 사용된 계대의 결과로서, CEF 세포에서 계대수에 따라 다수의 상이한 균주들 또는 분리물들이 있다. 예를 들어, MVA-572는 천연두 박멸 프로그램 동안에 독일에서 사용되었고 MVA-575는 가축 백신으로서 광범위하게 사용되었다. MVA-575는 2000년 12월 7일자로 기탁번호 V00120707로 유럽 동물 세포 배양 수집 기관(European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC))에 기탁되었다. 상기 약독화된 CVA-바이러스 MVA (개질된 백시니아 바이러스 앙카라)는 1차 닭 배아 섬유아세포상에서 CVA의 연속 증식(570회 초과의 계대들)에 의해 수득되었다.
1970년대 동안에 마이르(Mayr) 등은 MVA가 사람 및 포유동물에서 고도로 약독화되어 있고 비독성임을 입증하였지만 특정 조사자들은 MVA가 포유동물 및 사람 세포주에서 잔여 복제가 이들 세포들에서 발생할 수 있기 때문에 완전히 약독화되지 않음을 보고하였다 [Blanchard et al. (1998), J Gen Virol 79:1159-1167; Carroll & Moss (1997), Virology 238:198-211; 미국 특허 번호 5,185,146; Ambrosini et al. (1999), J Neurosci Res 55: 569]. 이들 공보들에 보고된 결과들은 MVA의 다양한 알려진 균주와 함께 수득된 것으로 추정되는데, 이는 사용된 바이러스들이 그들의 특성들에 있어서 본질적으로 상이하고, 특히 다양한 세포 주에서 그들의 성장 행동이 상이하기 때문이다. 그러한 잔여 복제는 사람에서의 사용과 연계된 안전성 문제를 포함하는 다양한 이유 때문에 바람직하지 않다.
백신 또는 약제와 같은 보다 안전한 생성물의 개발을 위한 증진된 안전성 프로파일을 갖는 MVA의 균주들은 바바리언 노르딕(Bavarian Nordic)에 의해 개발되었고: MVA는 바바리언 노르딕에 의해 추가로 계대되었고 이는 MVA-BN로 명명된다. MVA-BN 뿐만 아니라 MVA는 선조 CVA 바이러스와 비교하여 게놈의 대략 15%(6개 영역으로부터 31kb)이 없다. 상기 결실은 A형 봉입체에 대한 유전자 뿐만 아니라 다수의 독성 및 숙주 범위 유전자들에 영향을 준다. 계대 583회에 상응하는 MVA-BN의 샘플은 2000년 8월 30일자로 기탁번호 V00083008로서 유럽 동물 세포 배양 수집 기관(European Collection of Cell Cultures (ECACC))에 기탁되었다.
MVA-BN은 바이러스-인코딩된 유전자들이 매우 효율적으로 발현되는 사람 세포들에 부착 및 진입할 수 있다. 그러나, 자손 바이러스의 어셈블리 및 방출은 발생하지 않는다. MVA-BN은 1차 닭 배아 섬유아세포(CEF) 세포들에 강하게 적응성이고 사람 세포들에서 복제하지 않는다. 인간 세포들에서, 바이러스 유전자들은 발현되고 감염성 바이러스는 생성되지 않는다. MVA-BN은 미국에서 질환 통제 및 예방을 위한 센터에 따른 생물안전 수준 1 유기체로서 분류된다. MVA-BN 및 유도체들의 제제들은 많은 유형의 동물들, 및 면역 결핍 개체들를 포함하는 2000명 이상의 인간 대상체들에 투여되었다. 모든 백신 접종은 일반적으로 안전하고 높은 관용성인 것으로 입증되었다. 이의 높은 약독화 및 감소된 독성에도 불구하고, 임상전 연구에서 MVA-BN은 백시니아 및 MVA 게놈으로 클로닝된 유전자들에 의해 인코딩된 이종성 유전자 생성물에 대해 체액성 및 세포성 면역 반응 둘다를 유발하는 것으로 나타났다 [E. Harrer et al. (2005), Antivir . Ther. 10(2):285-300; A. Cosma et al. (2003), Vaccine 22(1):21-9; M. Di Nicola et al. (2003), Hum. Gene Ther. 14(14):1347-1360; M. Di Nicola et al. (2004), Clin . Cancer Res., 10(16):5381-5390].
MVA의 "유도체" 또는 "변이체"는 여기에 기재된 MVA와 동일한 복제 특성을 필수적으로 나타내지만 그들에 게놈들의 하나 이상의 부분들에서 차이를 나타내는 바이러스를 나타낸다. MVA-BN의 유도체 또는 변이체 뿐만 아니라 MVA-BN도 사람 및 마우스에서, 심지어 심하게 면역 억제된 마우스에서 생식적으로 체내 복제하는데 실패한다. 보다 구체적으로, MVA-BN, 또는 MVA-BN의 유도체 또는 변이체는 또한 바람직하게 닭 배아 섬유아세포 (CEF)에서 생식 복제 능력을 갖지만, 사람 각질세포 세포주 HaCat [Boukamp et al (1988), J Cell Biol 106: 761-771], 인간 골 골육종 세포주 143B (ECACC 번호 91112502), 인간 배아 신장 세포주 293 (ECACC 번호 85120602), 및 인간 자궁경관 선암종 세포주 HeLa (ATCC 번호 CCL-2) 에서는 생식 복제 능력이 없다. 추가로, MVA-BN의 유도체 또는 변이체는 Hela 세포 및 HaCaT 세포주에서 MVA-575 보다 적어도2배 적은, 보다 바람직하게는 3배 적은 바이러스 증폭 비율을 갖는다. MVA 변이체의 이들 특성에 대한 시험 및 검정은 둘다 본원에 참조로서 인용되는 WO 02/42480 (US 2003/0206926) 및 WO 03/048184 (US 2006/0159699)에 기재되어 있다.
바이러스의 증폭 또는 복제는 보통 “증폭 비율”로서 언급되는, 우선 본래 세포를 감염시키는데 사용되는 양(입력량)에 대한 감염된 세포로부터 생성된 바이러스(산출량)의 비율로서 나타난다. “1”의 증폭 비율은 상기 감염된 세포로부터 생성된 바이러스의 양이 상기 세포를 감염시키기 위해 초기에 사용되는 양과 동일한 경우의 증폭 상태를 정의하고, 이는 상기 감염된 세포가 바이러스 감염 및 생식을 위해 허용성임을 의미한다. 대조적으로, 1 미만의 증폭 비율, 즉, 입력량 수준과 비교하여 산출량의 감소는 생식 복제가 없고 바이러스가 약독화되었음을 지시한다.
MVA계 백신의 이점은 대규모 백신 생산을 위한 유용성 뿐만 아니라 이들의 안전성 프로파일을 포함한다. 임상전 시험은 MVA-BN이 다른 MVA 균주와 비교하여 보다 우수한 약독화 및 효능을 나타냄을 밝혔다 (WO02/42480). MVA-BN 균주의 추가의 성질은 DNA-프라임/백시니아 바이러스 부스트 치료 계획과 비교할 때, 백시니아 바이러스 프라임/백시니아 바이러스 부스트 치료 계획에서 실질적으로 동일한 수준의 면역력을 유도하는 능력이다.
본원에서 가장 바람직한 구현예인 상기 재조합 MVA-BN 바이러스는 포유동물에서 이들의 명백한 복제 결핍 및 이들의 잘-확정된 비독성 때문에 안전한 것으로 고려된다. 추가로, 이의 효능뿐만 아니라, 산업적 규모 제조의 실행가능성이 이로울 수 있다. 또한, MVA계 백신은 다중 이종성 항원을 전달할 수 있고 체액성 및 세포성 면역력의 동시 유도를 가능하게 한다.
또 다른 측면에서, 재조합 바이러스를 생성시키기 위해 적합한 MVA 바이러스 균주는 균주 MVA-572, MVA-575 또는 임의의 유사하게 약독화된 MVA 균주일 수 있다. 또한, 적합한 것은 결실된 코리오알란토이스 백시니아바이러스 앙카라 (dCVA)와 같은 돌연변이 MVA일 수 있다. dCVA는 MVA 게놈의 del I, del Ⅱ, del Ⅲ, del IV, del V, 및 del VI 결실 부위를 포함한다. 상기 부위들은 다중 이종성 서열의 삽입을 위해 특히 유용하다. 상기 dCVA는 사람 세포주(예를 들어, 사람 293, 143B, 및 MRC-5 세포주)에서 10초과의 증폭 비율로 생식적으로 복제할 수 있고, 이들은 이후 바이러스계 백신접종 전략을 위해 유용한 추가의 돌연변이에 의해 최적화될 수 있다 (WO 2011/092029 참조).
정의
용어 "항원성 결정인자"는 세포성 반응이든 및/또는 체액성 항체 반응이든 숙주의 면역계를 자극하여 항원-특이적 면역 반응을 생성시키는 임의의 분자를 나타낸다. 항원성 결정인자들은 단백질들, 폴리펩티드들, 항원성 단백질 단편들, 항원들, 및 숙주에서 여전히 면역 반응을 유발하고 항원의 일부를 형성하는 에피토프들, 단백질의 상동체 또는 변이체, 폴리펩티드들, 및 예를 들면 당화된 단백질들, 폴리펩티드들, 항원성 단백질 단편들, 항원들 및 에피토프들을 포함하는 항원성 단백질 단편들, 항원들 및 에피토프들, 및 그러한 분자들을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열들을 포함할 수 있다. 따라서, 단백질, 폴리펩티드, 항원성 단백질 단편, 항원 및 에피토프는 특정 본래의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열로 제한되지 않지만 결실, 첨가, 삽입 및 치환과 같은 본래의 서열에 대한 개질체 뿐만 아니라 본래의 서열과 동일한 서열을 포괄한다.
바람직하게, 상기 상동체 또는 변이체는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 수준에서 단백질, 폴리펩티드, 항원성 단백질 단편, 항원 및 에피토프와 적어도 약 50%, 적어도 약 60% 또는 65%, 적어도 약 70% 또는 75%, 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89%, 보다 전형적으로, 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94% 및 보다 더 전형적으로 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 가장 전형적으로, 적어도 약 99%의 상동성을 갖는다. 상기 용어 상동체 또는 변이체는 또한 예를 들어, (1) 전체-길이RSV-F 또는 RSV-G 단백질의 막관통 및/또는 세포질 도메인 뿐만 아니라 신호 펩티드가 없는 상응하는 RSV-F 또는 RSV-G 단백질의 가용성 형태를 인코딩하는 RSV-F 또는 RSV-G 뉴클레오티드 서열, (2) 전체-길이 전장 RSV-M2 또는 RSV-N 단백질의 결실되거나, 절단되거나 달리 돌연변이된 형태들을 인코딩하는 RSV-M2 또는 RSV-N 뉴클레오티드 서열, (3) 전체-길이 RSV-F 또는 RSV-G 단백질의 막관통 및/또는 세포질 도메인 뿐만 아니라 신호 펩티드가 없는 RSV-F 또는 RSV-G 단백질의 가용성 형태들, 또는 (4) 전체-길이 RSV-M2 또는 RSV-N 단백질의 결실되거나, 절단되거나 달리 돌연변이된 형태들과 같은 절단되거나, 결실되거나 달리 돌연변이된 뉴클레오티드 또는 단백질 서열들을 포함한다.
핵산과 아미노산과의 서열 상동성을 측정하기 위한 기술은 당업계에 알려져 있다. 2개 또는 그 이상의 서열은 이들의 "% 상동성"을 측정함으로써 비교될 수 있다. 핵산 서열이든 또는 아미노산 서열이든 2개 서열의 % 상동성은 2개의 정렬된 서열간의 정확한 매치(match) 수를 보다 짧은 서열의 길이로 나누고 100을 곱한 것이다.
본원에 기재된 단백질, 폴리펩티드, 항원성 단백질 단편, 항원 및 에피토프와 관련된 “퍼센트(%) 아미노산 서열 상동성”은 상기 서열을 정렬하고 필요하다면 갭(gap)을 도입하여 퍼센트 서열 상동성에 도달한 후, 레퍼런스 서열 (즉, 단백질, 폴리펩티드, 항원성 단백질 단편, 항원 또는 이로부터 유래된 에피토프) 에서 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열에서 아미노산 잔기들의 퍼센트로서 정의되고, 서열 상동성의 일부로서 임의의 보존성 치환들은 고려하지 않는다. 퍼센트 아미노산 서열 상동성을 측정하기 위한 정렬은 예를 들어, BLAST, ALIGN, 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 대중적으로 가용한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여, 당업계 기술에 속하는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 전체 길이의 서열 상에 최대 정렬을 달성하기 위해 요구되는 임의의 알고리즘을 포함하는 정렬을 측정하기 위해 적당한 파라미터를 결정할 수 있다.
상기 동일한 사항은 "퍼센트(%) 뉴클레오티드 서열 상동성", 무타티스 (mutatis) 무탄디스(mutandis)에 적용된다.
예를 들어, 핵산 서열에 대한 적당한 정렬은 스미스 및 워터맨(Smith and Waterman)의 국소 상동성 알고리즘에 의해 제공된다[Smith and Waterman, (1981), Advances in Applied Mathematics 2:482-489]. 상기 알고리즘은 데이호프(Dayhoff)에 의하여 개발되고 그리브스코브(Gribskov) [Gribskov (1986), Nucl . Acids Res. 14(6):6745-6763]에 의하여 정상화된 스코어링 매트릭스(scoring matrix) [Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA]를 사용함으로써 아미노산 서열에 적용될 수 있다. 서열의 퍼센트 상동성을 측정하기 위한 상기 알고리즘의 예시적 수행은 "BestFit" 유틸리티 적용에서 유전학 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group (Madison, Wis.))에 의해 제공된다. 상기 방법에 대한 디폴트 파라미터는 위스콘신 서열 분석 패키지 프로그램 매뉴얼(Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, Version 8 (1995)) (Genetics Computer Group, Madison, Wis.에서 구입 가능)에 기재되어 있다. 본 발명의 문맥에서 % 상동성을 확립하는 바람직한 방법은 에딘버그 대학(University of Edinburgh)에 저작권이 있고 John F. Collins and Shane S. Sturrok에 의하여 개발되었으며, 그리고 IntelliGenetics, Inc (Mountain View, Calif)에 의하여 배포된 프로그램의 MPSRCH 팩키지를 사용하는 것이다. 상기 팩키지 세트(suite)로부터, 상기 스미스-워터맨 알고리즘은 디폴트 계수들이 스코어링 표 (예를 들어, 갭 개방 패널티 12, 갭 연장 페널티 1 및 갭 6)에 있어 사용되는 경우 채용될 수 있다. 상기 생성된 데이터로부터, 상기 "일치(match)" 값은 "서열 상동성"을 반영한다. 서열간의 퍼센트 상동성 또는 유사성을 계산하기 위한 다른 적합한 프로그램은 일반적으로 당업계에 알려져 있고, 예를 들어, 또 다른 정렬 프로그램은 디폴트 계수와 함께 사용되는 BLAST이다. 예를 들어, BLASTN 및 BLASTP는 하기의 디폴트 계수를 사용하여 사용될 수 있다: 유전자 코드=표준; 필터=없음; 스트랜드(strand) =둘다; 컷오프=60; 예상=10; 매트릭스=BLOSUM62; 기재=50개 서열들; 근거한 분류=높은 스코어; 데이타베이스=비-중복, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+ GenBank CDS 번역 + 스위스 단백질+Spupdate+PIR. 이들 프로그램의 세부 사항은 하기의 인터넷 주소에서 발견될 수 있다: http:// http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/.
본원에 사용된 바와 같은 “이종성” 유전자, 핵산, 항원, 또는 단백질은 야생형 폭스바이러스(poxviral) 게놈 (예를 들어, MVA)에 존재하지 않는 핵산 또는 아미노산 서열인 것으로 이해된다. 당업자는 MVA와 같은 폭스바이러스에 존재할 때 “이종성 유전자”가 재조합 폭스바이러스의 숙주 세포로의 투여 후 이것이 상응하는 이종성 유전자 생성물, 즉, “이종성 항원” 및＼또는 “이종성 단백질”로서 발현되는 방식으로 폭스바이러스 게놈으로 포함되는 것으로 이해한다. 발현은 보통 상기 이종성 유전자를, 폭스바이러스 감염된 세포에서 발현을 허용하는 조절 요소에 작동적으로 연결시킴에 의해 달성된다. 바람직하게, 상기 조절 요소는 천연 또는 합성 폭스바이러스 프로모터를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 “무균성 면역력”은 민감한 탐지 방법들, 예컨대 RT-qPCR가 적용될 때 탐지가능한 RSV 게놈의 부재하에서의 보호성 면역력을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 단수 형태 “a”, “an”, 및 “the”는 명백하게 달리 언급되지 않는 경우 복수에 대한 언급을 포함하는 것으로 주지되어야 한다. 따라서, 예를 들어, “에피토프”에 대한 언급은 하나 이상의 에피토프를 포함하고, “상기 방법”에 대한 언급은 균등한 단계들 및 본원에 기재된 방법으로 변형 또는 대체될 수 있는 당업계에 숙련가들에게 알려진 방법들에 대한 언급을 포함한다.
달리 지적되지 않는다면, 일련의 요소 앞에 있는 용어 “적어도”는 일련의 모든 요소를 언급하는 것으로 이해되어야만 한다. 당업계의 숙련가들은 단지 통상의 실험, 본원에 기재된 발명의 특이적 구현예들에 대한 많은 균등물만을 사용하여 인지하거나 또는 확인 가능할 것이다. 상기 균등물은 본 발명에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.
본 명세서 및 첨부된 청구항 전반에 걸쳐, 달리 요구되지 않는 경우, 용어 “포함하다(comprise)”, 및 변이체들, 예를 들어, “포함한다(comprises)” 및 “포함하는(comprising)”은 진술된 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 그룹의 포함을 의미하나 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 배제하지 않는 것으로 이해된다. 본원에 사용될 때, 용어 “포함하는(comprising)”은 용어 “함유하는(containing)” 또는 “함유하는(including)”으로 대체될 수 있거나 때로는 본원에 사용될 때 용어 “갖는(having)”으로 대체될 수 있다. 상기 언급된 용어(포함하는, 함유하는(containing), 함유하는 (including), 갖는(having)) 중 임의의 용어는 덜 바람직하더라도 본 발명의 측면 또는 구현예의 문맥에서 본원에 사용되는 경우마다 용어 “로 이루어진”으로 대체될 수 있다.
본원에 사용될 때,“로 이루어진”은 청구된 요소에서 특정되지 않는 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 본원에 사용된 경우, "로 필수적으로 이루어진"은 청구항의 기본 및 신규 특성에 실질적으로 영향을 주지 않는 물질 또는 단계를 배제하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은, 다중 인용된 요소들 사이에 결합 용어 “및/또는”은 개별 및 조합된 선택사항들 둘다를 포괄하는 것으로서 이해된다. 예를 들어, 2개의 요소들이 “및/또는”에 의해 연결되는 경우, 제1 선택 사항은 제2 요소 없이 제1 요소의 적용가능성을 언급한다. 제2 선택사항은 제1 요소 없이 제2 요소의 적용가능성을 언급한다. 제3 선택사항은 제1 및 제2 요소들의 적용가능성을 언급한다. 이들 선택사항 중 임의의 것은 상기 의미에 속하고 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 용어 “및/또는”의 요건을 충족하는 것으로 이해된다. 상기 선택 사항들의 하나 초과의 동시 적용가능성은 또한 상기 의미에 속하고 따라서 용어 “및/또는”의 요건을 충족하는 것으로 이해된다.
RSV 뉴클레오티드 서열 및 단백질
본원에 언급된 바와 같은 RSV 유전자는 임의의 RSV 균주 또는 분리물에서 상응하는 단백질을 인코딩하는 유전자 또는 상기 유전자의 상동체 또는 변이체를 나타내지만, 상기 유전자의 정확한 서열 및/또는 게놈 위치는 균주들 또는 분리물들간에 달라질 수 있다.
유사하게, 본원에 언급된 RSV 단백질은 상기 정의된 바와 같은 상응하는 단백질 유전자에 의해 인코딩되고 발현되는 단백질들, 또는 상기 단백질들의 상동체 또는 변이체를 나타낸다.
예를 들어, 본원에 상호교환적으로 사용된 바와 같은 용어 “F 단백질 유전자”, “F 당단백질 유전자”, “RSV F 단백질 유전자”, “RSV F 당단백질 유전자” 또는 “F 유전자”는 임의의 RSV 균주 또는 분리물에서 막관통 융합 당단백질을 인코딩하는 유전자 또는 상기 유전자의 상동체 또는 변이체를 나타내지만, F 단백질 유전자의 정확한 서열 및/또는 게놈 위치는 균주 또는 분리물간에 달라질 수 있다. 예를 들어, RSV의 A2 균주에서, 상기 F(A2) 단백질 유전자는 GenBank 승인 번호 M11486에서 넘버링된 바와 같은 뉴클레오티드 5601번 내지 7499번 (종점이 포함됨)을 포함한다. 상기 F(A2) 단백질 유전자는 GenBank 승인번호 M11486에서 넘버링된바와 같은 단백질 코딩 개방 판독 프레임(ORF) 스패닝 뉴클레오티드 5614번 내지 7338번 (종점이 포함됨)을 추가로 포함한다. RSV A2 기원의 상기 F 단백질 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열 식별번호 28에 제시되어 있다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 “F 단백질”, “F 당단백질”, “RSV F 단백질”, “RSV F 당단백질”, 또는 “F”는 상기 정의된 바와 같은 RSV F 단백질 유전자에 의해 인코딩되고 발현되는 과중하게 당화된 막관통 융합 당단백질 또는 상기 단백질의 상동체 또는 변이체를 나타낸다. RSV A2로부터의 F 단백질의 아미노산 서열은 서열식별 번호 29에 제시되어 있다. 상기 RSV(A2) F 단백질은 신호 펩티드, 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 도메인(예를 들어, UniProtKB/Swiss-Prot 승인번호 P03420 참조)을 포함한다. RSV A2 F 단백질의 신호 펩티드는 서열식별 번호 29의 아미노산 1번 내지 21번으로 이루어지고; RSV A2 F 단백질의 세포외 도메인은 서열식별 번호 29의 아미노산 1번 내지 529번 또는 서열식별 번호 29의 아미노산 22번 내지 529번으로 이루어지고; RSV A2 F 단백질의 막관통 도메인은 서열식별 번호 29의 아미노산 530번 내지 550번으로 이루어지고; RSV A2 F 단백질의 세포질 도메인은 서열식별 번호 29의 아미노산 551번 내지 574번으로 이루어진다.
유사하게, 용어 “G 단백질 유전자”, “G 당단백질 유전자”, “RSV G 단백질 유전자”, “RSV G 당단백질유전자” 또는 “G 유전자”는 본원에 상호교환적으로 사용된다. 예를 들어, RSV의 A2 균주에서, 상기 G(A2) 단백질 유전자는 GenBank 승인번호 M11486에서 넘버링된 바와 같은 뉴클레오티드 4626번 내지 5543번(종점이 포함됨)을 포함한다. 상기 G(A2) 단백질 유전자는 GenBank 승인번호 M11486에서 넘버링된 바와 같은 단백질 코딩 개방 판독 프레임(ORF) 스패닝 뉴클레오티드 4641번 내지 5537번(종점이 포함됨)을 추가로 포함한다. RSV A2 로부터의 G 단백질 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열식별 번호 30에 제시된다.
상기 용어 “G 단백질”, “G 당단백질”, “RSV G 단백질”, “RSV G 당단백질”, 또는 “G”는 과중하게 당화된 막관통 부착 당단백질 또는 상기 단백질의 상동체 또는 변이체를 나타낸다. RSV A2 기원의 G 단백질의 아미노산 서열은 서열식별 번호 31에 제시되어 있다. RSV A2 G 단백질은 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 도메인 (예를 들어, UniProtKB/Swiss-Prot 승인번호 P03423 참조)을 포함한다. RSV A2 G 단백질의 세포외 도메인은 서열식별 번호 31의 아미노산 67번 내지 298번으로 이루어지고; RSV A2 G 단백질의 막관통 도메인은 서열식별 번호 31의 아미노산 38번 내지 66번으로 이루어지고; RSV A2 G 단백질의 세포질 도메인은 서열식별 번호 31의 아미노산 1번 내지 37번으로 이루어진다.
또한, 상기 용어 “M2 단백질 유전자”, “M2 뉴클레오캡시드 단백질 유전자”, “RSV M2 단백질 유전자”, “RSV M2 매트릭스 단백질 유전자”, “RSV M2 뉴클레오캡시드 단백질 유전자” 또는 “M2 유전자”는 상호교환적으로 본원에 사용된다. 예를 들어, RSV의 A2 균주에서, 상기 M2(A2) 단백질 유전자는 GenBank 승인번호 M11486에서 넘버링된 바와 같은 뉴클레오티드 7550번 내지 8506번(종점이 포함됨)을 포함한다. 상기 M2(A2) 단백질 유전자는 GenBank 승인번호 M11486에 넘버링된 바와 같은 단백질 코딩 개방 판독 프레임(ORF) 스패닝 뉴클레오티드 7559번 내지 8143번(종점이 포함됨)을 추가로 포함한다. RSV A2 기원의 M2 단백질 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열식별 번호 32에 제시되어 있다.
상기 용어 “M2 단백질”, “M2 뉴클레오캡시드 단백질”, “RSV M2 단백질”, “RSV M2 뉴클레오캡시드 단백질”, “RSV M2 매트릭스 단백질”, 또는 “M2”는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. RSV A2 기원의 M2 단백질의 아미노산 서열은 서열식별 번호 33에 제시되어 있다(예를 들어, UniProtKB/Swiss-Prot 승인번호 P04545 참조).
또한, 상기 용어 “N 단백질 유전자”, “N 뉴클레오캡시드 단백질 유전자”, “RSV N 단백질 유전자”, “RSV N 뉴클레오캡시드 단백질 유전자” 또는 “N 유전자”는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, RSV의 A2 균주에서, 상기 N(A2) 단백질 유전자는 GenBank 승인번호 M11486에서 넘버링된 바와 같은 뉴클레오티드 1081번 내지 2277번(종점이 포함됨)을 포함한다. 상기 N(A2) 단백질 유전자는 GenBank 승인번호 M11486에 넘버링된 바와 같은 단백질 코딩 개방 판독 프레임(ORF) 스패닝 뉴클레오티드 1096번 내지 2271번(종점이 포함됨)을 추가로 포함한다. RSV A2 기원의 N 단백질 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열식별 번호 34에 제시되어 있다.
RSV A2로부터의 본원에 상호교환적으로 사용되는 용어 “N 단백질”, “N 뉴클레오캡시드 단백질”, “RSV N 단백질”, “RSV N 뉴클레오캡시드 단백질”, 또는 “N”의 아미노산 서열은 서열식별 번호 35에 제시되어 있다(예를 들어, UniProtKB/Swiss-Prot 승인번호 P03418 참조).
본 발명의 특정 구현예들
특정 구현예에서, 상기 재조합 MVA는 RSV 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 적어도 하나의 이종성 뉴클레오티드 서열을 발현한다. 특정 구현예에서, RSV 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 적어도 하나의 이종성 뉴클레오티드 서열은 RSV F 항원성 결정인자를 인코딩한다. 특정 구현예에서, RSV 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 적어도 하나의 이종성 뉴클레오티드 서열은 RSV G 항원성 결정인자를 인코딩한다. 특정 구현예에서, 상기 RSV F 항원성 결정인자는 RSV 균주 A2로부터 유래한다. 특정 구현예에서, 상기 RSV G 항원성 결정인자는 RSV 균주 A2로부터 유래한다.
특정 구현예에서, 상기 재조합 MVA는 2개의 이종성 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 이들 각각은 RSV 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩한다. 특정 구현예에서, RSV 막 당단백질의 제1 항원성 결정인자는 RSV F 항원성 결정인자이고 RSV 막 당단백질의 제2 항원성 결정인자는 RSV G 항원성 결정인자이다. 특정 구현예에서, 상기 RSV F 항원성 결정인자는 RSV 균주 A2로부터 유래한다. 특정 구현예에서, 상기 RSV G 항원성 결정인자는 RSV 균주 A2로부터 유래한다. 특정 구현예에서, RSV F 항원성 결정인자 및 RSV G 항원성 결정인자 둘다는 RSV 균주 A2로부터 유래할 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 재조합 MVA는 RSV 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 적어도 하나의 이종성 뉴클레오티드 서열 및 RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 적어도 하나의 이종성 뉴클레오티드 서열을 발현한다. 특정 구현예에서, RSV 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 적어도 하나의 이종성 뉴클레오티드 서열은 RSV F 항원성 결정인자를 인코딩하고, RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 적어도 하나의 이종성 뉴클레오티드 서열은 RSV M2 항원성 결정인자를 인코딩한다. 특정 구현예에서, RSV 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 적어도 하나의 이종성 뉴클레오티드 서열은 RSV F 항원성 결정인자를 인코딩하고 RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 적어도 하나의 이종성 뉴클레오티드 서열은 RSV N 항원성 결정인자를 인코딩한다. 특정 구현예에서, RSV 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 적어도 하나의 이종성 뉴클레오티드 서열은 RSV G 항원성 결정인자를 인코딩하고 RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 적어도 하나의 이종성 뉴클레오티드 서열은 RSV M2 항원성 결정인자를 인코딩한다. 특정 구현예에서, RSV 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 적어도 하나의 이종성 뉴클레오티드 서열은 RSV G 항원성 결정인자를 인코딩하고 RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열은 RSV N 항원성 결정인자를 인코딩한다.
특정 구현예에서, 상기 재조합 MVA는 2개의 이종성 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 이들 각각은 RSV 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩한다. 특정 구현예에서, RSV 막 당단백질의 제1 항원성 결정인자는 RSV F 항원성 결정인자이고 RSV 막 당단백질의 제2 항원성 결정인자는 RSV G 항원성 결정인자이다. 특정 구현예에서, 상기 재조합 MVA는 2개의 이종성 뉴클레오티드 서열들을 포함하고, 이들은 각각 RSV 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하며, 그리고 적어도 하나의 이종성 뉴클레오티드 서열은 RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자를 인코딩한다. 특정 구현예에서, RSV 막 당단백질의 제1 항원성 결정인자는 RSV F 항원성 결정인자이고 RSV 막 당단백질의 제2 항원성 결정인자는 RSV G 항원성 결정인자이며, 그리고 RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정 인자는 RSV M2 항원성 결정인자이다. 특정 구현예에서, RSV 막 당단백질의 제1 항원성 결정인자는 RSV F 항원성 결정인자이고, RSV 막 당단백질의 제2 항원성 결정인자는 RSV G 항원성 결정인자이고, 그리고 RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자는 RSV N 항원성 결정인자이다. 특정 구현예에서, RSV F 항원성 결정인자 및 RSV G 항원성 결정인자 둘다는 RSV 균주 A2로부터 유래한다.
특정 구현예에서, 상기 재조합 MVA는 2개의 이종성 뉴클레오티드 서열들을 포함하고, 이들 각각은 RSV 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하며, 그리고 2개의 이종성 뉴클레오티드 서열들은 각각 RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자를 인코딩한다. 특정 구현예에서, RSV 막 당단백질의 제1 항원성 결정인자는 RSV F 항원성 결정인자이고, RSV 막 당단백질의 제2 항원성 결정인자는 RSV G 항원성 결정인자이고, RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 제1 항원성 결정인자는 RSV M2 항원성 결정인자이고, RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 제2 항원성 결정인자는 RSV N 항원성 결정인자이다. 특정 구현예에서, RSV F 항원성 결정인자 및 RSV G 항원성 결정인자 둘다는 RSV 균주 A2로부터 유래한다.
특정 구현예에서, 상기 재조합 MVA는 3개의 이종성 뉴클레오티드 서열을 포함하고 이들 각각은 RSV 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하고, 2개의 이종성 뉴클레오티드 서열은 각각 RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자를 인코딩한다. 특정 구현예에서, RSV 막 당단백질의 제1 항원성 결정인자는 RSV F 항원성 결정인자이고, RSV 막 당단백질의 제2 항원성 결정인자는 RSV G 항원성 결정인자이고, RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 제1 항원성 결정인자는 RSV M2 항원성 결정인자이며, 그리고 RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 제2 항원성 결정인자는 RSV N 항원성 결정인자이다. 특정 구현예에서, RSV 막 당단백질의 제1 항원성 결정인자 및 RSV 막 당단백질의 제2 항원성 결정인자 둘 다는 RSV 균주 A2로부터 유래한다. 특정 구현예에서, RSV 막 당단백질의 제3 항원성 결정인자는 RSV F 항원성 결정인자이다.
특정 구현예에서, 상기 재조합 MVA는 4개의 이종성 뉴클레오티드 서열을 포함하고 이들 각각은 RSV 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하며, 그리고 2개의 이종성 뉴클레오티드 서열은 각각 RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자를 인코딩한다. 특정 구현예에서, RSV 막 당단백질의 제1 항원성 결정인자는 RSV F 항원성 결정인자이고, RSV 막 당단백질의 제2 항원성 결정인자는 RSV G 항원성 결정인자이고, RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 제1 항원성 결정인자는 RSV M2 항원성 결정인자이며, 그리고 RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 제2 항원성 결정인자는 RSV N 항원성 결정인자이다. 특정 구현예에서, RSV 막 당단백질의 제1 항원성 결정인자 및 RSV 막 당단백질의 제2 항원성 결정인자 둘 다는 RSV 균주 A2로부터 유래한다. 특정 구현예에서, RSV 막 당단백질의 제3 항원성 결정인자는 RSV F 항원성 결정인자이다. 특정 구현예에서, RSV 막 당단백질의 제4 항원성 결정인자는 RSV G 항원성 결정인자이다.
특정 구현예에서, RSV 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 적어도 하나의 이종성 뉴클레오티드는 RSV F 항원성 결정인자를 인코딩한다. 특정 구현예에서, 상기 RSV F 항원성 결정인자는 전체 길이이다. 특정 구현예에서, 상기 RSV F 항원성 결정인자는 절단된다. 특정 구현예에서, 상기 RSV F 항원성 결정인자는 변이체 RSV F 항원성 결정인자이다. 특정 구현예에서, 전체 길이, 절단된, 또는 변이체 RSV F 항원성 결정인자는 RSV 균주 A2로부터 유래한다. 특정 구현예에서, 전체 길이 RSV(A2) F 항원성 결정인자는 서열식별 번호 29의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열식별 번호 28의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 변이체 RSV(A2) F 항원성 결정인자는 서열식별 번호 4의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열식별 번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 절단된 RSV(A2) F 항원성 결정인자는 전체 길이 RSV(A2) F 항원성 결정인자의 세포질 및 막관통 도메인이 없다. 특정 구현예에서, 상기 절단된 RSV(A2) F 항원성 결정인자는 서열식별 번호 16의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열식별 번호 15의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 전체 길이, 절단된, 또는 변이체 RSV F 항원성 결정인자는 RSV 균주 ALong으로부터 유래한다. 특정 구현예에서, 상기 개질된 RSV(ALong) F 항원성 결정인자는 서열식별 번호 6의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열식별 번호 5의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 절단된 RSV(ALong) F 항원성 결정인자는 전체 길이의 RSV (ALong) F 항원성 결정인자의 세포질 및 막관통 도메인이 없다.
특정 구현예에서, RSV 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 적어도 하나의 이종성 뉴클레오티드 서열은 RSV G 항원성 결정인자를 인코딩한다. 특정 구현예에서, 상기 RSV G 항원성 결정인자는 전체 길이이다. 특정 구현예에서, 상기 RSV G 항원성 결정인자는 절단된다. 특정 구현예에서, 상기 RSV G 항원성 결정인자는 변이체 RSV G 항원성 결정인자이다. 특정 구현예에서, 전체 길이, 절단된, 또는 변이체 RSV G 항원성 결정인자는 RSV 균주 A2로부터 유래한다. 특정 구현예에서, 전체 길이 RSV(A2) G 항원성 결정인자는 서열식별 번호 2의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열식별 번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 절단된 RSV(A2) G 항원성 결정인자는 전체 길이 RSV(A2) G 항원성 결정인자의 세포질 및 막관통 도메인이 없다. 특정 구현예에서, 전체 길이, 절단된, 또는 변이체 RSV G 항원성 결정인자는 RSV 균주 B로부터 유래한다. 특정 구현예에서, 상기 절단된 RSV(B) G 항원성 결정인자는 전체 길이 RSV(B) G 항원성 결정인자의 세포질 및 막관통 도메인이 없다. 특정 구현예에서, 상기 절단된 RSV(B) G 항원성 결정인자는 서열식별 번호 8의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열식별 번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 적어도 하나의 이종성 뉴클레오티드 서열은 RSV M2 항원성 결정인자를 인코딩한다. 특정 구현예에서, 상기 RSV M2 항원성 결정인자는 전체 길이이다. 특정 구현예에서, 상기 RSV M2 항원성 결정인자는 절단된다. 특정 구현예에서, 상기 RSV M2 항원성 결정인자는 변이체 RSV M2 항원성 결정인자이다. 특정 구현예에서, 상기 전체 길이, 절단된, 또는 변이체 RSV M2 항원성 결정인자는 RSV 균주 A2로부터 유래한다. 특정 구현예에서, 상기 RSV(A2) M2 항원성 결정인자는 서열식별 번호 33의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열식별 번호 32의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 적어도 하나의 이종성 뉴클레오티드 서열은 RSV N 항원성 결정인자를 인코딩한다. 특정 구현예에서, 상기 RSV N 항원성 결정인자는 전체 길이이다. 특정 구현예에서, 상기 RSV N 항원성 결정인자는 절단된다. 특정 구현예에서, 상기 RSV N 항원성 결정인자는 변이체 RSV N 항원성 결정인자이다. 특정 구현예에서, 상기 전체 길이, 절단된, 또는 변이체 RSV N 항원성 결정인자는 RSV 균주 A2로부터 유래한다. 특정 구현예에서, 상기 RSV(A2) N 항원성 결정인자는 서열식별 번호 35의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열식별 번호 34의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, RSV N 항원성 결정인자 및 RSV M2 항원성 결정인자 둘다는 단일 개방 판독 프레임에 의해 인코딩되고 자가-절단 프로테아제 도메인에 의해 분리된다. 특정 구현예에서, 상기 RSV M2 항원성 결정인자는 전체 길이이다. 특정 구현예에서, 상기 RSV M2 항원성 결정인자는 절단된다. 특정 구현예에서, 상기 RSV M2 항원성 결정인자는 변이체 RSV M2 항원성 결정인자이다. 특정 구현예에서, 상기 전체 길이, 절단된, 또는 변이체 RSV M2 항원성 결정인자는 RSV 균주 A2로부터 유래한다. 특정 구현예에서, 상기 RSV N 항원성 결정인자는 전체 길이이다. 특정 구현예에서, 상기 RSV N 항원성 결정인자는 절단된다. 특정 구현예에서, 상기 RSV N 항원성 결정인자는 변이체 RSV N 항원성 결정인자이다. 특정 구현예에서, 상기 전체 길이, 절단된, 또는 변이체 RSV N 항원성 결정인자는 RSV 균주 A2로부터 유래한다. 특정 구현예에서, 자가 절단 프로테아제 도메인은 구제역 바이러스로부터 유래한다. 특정 구현예에서, 상기 자가 절단 프로테아제 도메인은 서열식별 번호 12의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열식별 번호 11의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 구제역 바이러스로부터의 프로테아제 2A 단편이다. 특정 구현예에서, RSV N 항원성 결정인자 및 RSV M2 항원성 결정인자를 인코딩하는 적어도 하나의 이종성 뉴클레오티드 서열은 서열식별 번호 18의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열식별 번호 17의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
MVA로의 통합 부위
특정 구현예에서, RSV 막 당단백질의 하나 이상의 항원성 결정인자 및 RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 하나 이상의 항원성 결정인자를 인코딩하는 이종성 뉴클레오티드 서열은 MVA 게놈 또는 MVA-BN 게놈에서 다양한 삽입 부위들에 포함된다. 하나 이상의 항원성 결정인자 RSV 단백질을 인코딩하는 이종성 뉴클레오티드 서열은 도 1에 도시된 바와 같이 별도의 전사 단위체로서 또는 융합 단백질로서 재조합 MVA에 삽입될 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 이종성 RSV 뉴클레오티드 서열은 MVA의 하나 이상의 유전자간 영역(IGR)에 삽입된다. 상기 IGR은 IGR07/08, IGR 44/45, IGR 64/65, IGR 88/89, IGR 136/137, 및 IGR 148/149, 바람직하게는 IGR64/65, IGR88/89, 및/또는 IGR 148/149으로부터 선택될 수 있다. 상기 이종성 RSV 뉴클레오티드 서열은 추가로 또는 대안적으로, MVA의 천연 발생 결실 부위 I, II, II, IV, V, 또는 VI의 하나 이상에 삽입될 수 있다. 특정 구현예에서, 5, 4, 3, 또는 2개 미만의 통합 부위는 이종성 RSV 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
이종성 RSV 뉴클레오티드 서열을 포함하는 MVA의 삽입 부위의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 그 이상일 수 있다. 상기 재조합 MVA는 4, 3, 2, 또는 그보다 적은 삽입 부위에 삽입된 이종성 RSV 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으며, 그러나 바람직하게는 2개의 삽입 부위가 사용된다. 특정 구현예에서, 3개의 삽입 부위가 사용된다. 바람직하게, 상기 재조합 MVA는 2 또는 3개의 삽입 부위에 삽입된 적어도 4, 5, 6, 또는 7개의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원에 제공된 재조합 MVA 바이러스는 당업계에 알려진 통상의 방법에 의해 생성될 수 있다. 재조합 폭스바이러스를 수득하거나 이종성 뉴클레오티드 서열을 폭스바이러스 게놈으로 삽입하는 방법은 당업자에게 널리 알려져 있다. 예를 들어, DNA의 클로닝, DNA 및 RNA 분리, 웨스턴 블랏(Western blot) 검정, RT-PCR 및 PCR 증폭 기술과 같은 표준 분자 생물학 기술을 위한 방법은 분자 클로닝, 실험실 매뉴얼(Molecular Cloning, A laboratory Manual (2nd Ed.))에 기술되어 있으며 [J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)], 바이러스의 취급 및 조작을 위한 기술들은 바이러스학 방법들 매뉴얼(Virology Methods Manual)에 기술되어 있다 [B.W.J. Mahy et al. (eds.), Academic Press (1996)]. 유사하게, MVA의 취급, 조작 및 유전자 조작을 위한 기술 및 노하우는 분자 바이러스학: 실용적 접근(Molecular Virology: A Practical Approach [A.J. Davison & R.M. Elliott (Eds.), The Practical Approach Series, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, UK (1993)(예를 들어 Chapter 9: Expression of genes by Vaccinia virus vectors 참고)], 및 분자 생물학의 현재 프로토콜들(Current Protocols in Molecular Biology)에 기술되어 있다 [John Wiley & Son, Inc. (1998)(예를 들어, Chapter 16, Section IV: Expression of proteins in mammalian cells using vaccinia viral vector 참고)].
본원에 기재된 다양한 재조합 MVA의 생성을 위해 상이한 방법이 적용될 수 있다. 바이러스로 삽입될 뉴클레오티드 서열은 MVA의 DNA 섹션에 상동성인 DNA가 삽입되는 이. 콜리 (E. coli ) 플라스미드 작제물에 위치할 수 있다. 별도로, 삽입될 DNA 서열은 프로모터에 결찰될 수 있다. 상기 프로모터-유전자 연결체는 프로모터-유전자 연결체가 비-필수 유전자좌를 함유하는 MVA DNA의 영역을 플랭킹(flanking)하는 DNA 서열에 상동성인 DNA에 의해 양 말단상에 플랭킹되도록 플라스미드 작제물에 위치할 수 있다. 상기 수득한 플라스미드 작제물은 이. 콜라이 박테리아 내 증식에 의해 증폭되고 단리될 수 있다. 삽입될 DNA 유전자 서열을 함유하는 분리된 플라스미드는 배양물이 MVA로 감염되는 동시에 예를 들어 닭 배아 섬유아세포(CEF)의 세포 배양물에 형질감염될 수 있다. 플라스미드 및 바이러스 게놈 각각에서 상동성 MVA DNA간의 재조합은 외래 DNA 서열의 존재에 의해 개질된 MVA를 생성시킬 수 있다.
바람직한 구현예에 따라, 예를 들어, CEF 세포로서 적합한 세포 배양물의 세포는 폭스바이러스에 감염될 수 있다. 상기 감염된 세포는 이후 바람직하게 폭스바이러스 발현 조절 요소의 전사 조절하에 외래 유전자 또는 유전자들을 포함하는 제1 플라스미드 벡터로 형질감염될 수 있다. 상기 설명된 바와 같이, 상기 플라스미드 벡터는 또한 폭스바이러스 게놈의 선택된 부분으로 외인성 서열의 삽입을 지시할 수 있는 서열들을 포함한다. 임의로, 상기 플라스미드 벡터는 또한 폭스바이러스 프로모터에 작동적으로 연결된 마커 및/또는 선별 유전자를 포함하는 카세트(cassette)를 함유한다. 적합한 마커 또는 선별 유전자는 예를 들어, 녹색 형광 단백질, β-갈락토시다제, 네오마이신-포스포리보실트랜스퍼라제 또는 다른 마커를 인코딩하는 유전자이다. 선별 또는 마커 카세트의 사용은 생성된 재조합 폭스바이러스의 식별 및 분리를 단순화시킨다. 그러나, 재조합 폭스바이러스는 또한 PCR 기술에 의해 식별될 수 있다. 이후, 추가의 세포는 상기된 바와 같이 수득된 재조합 폭스바이러스로 감염되고 제2 외래 유전자 또는 유전자들을 포함하는 제2 벡터로 형질감염될 수 있다. 이 경우에, 상기 유전자는 폭스바이러스 게놈의 상이한 삽입 부위에 도입될 수 있고, 상기 제2 벡터는 또한 제2 외래 유전자 또는 유전자들의 폭스바이러스의 게놈으로의 통합을 지시하는 폭스바이러스-상동성 서열들에서 상이하다. 상동성 재조합이 발생한 후, 2개 이상의 외래 유전자들을 포함하는 재조합 바이러스가 단리될 수 있다. 재조합 바이러스로 추가의 외래 유전자를 도입하기 위해, 감염 및 형질감염의 단계는 감염을 위해 이전의 단계에서 분리된 재조합 바이러스를 사용하고 형질감염을 위해 추가의 외래 유전자 또는 유전자들을 포함하는 추가의 벡터를 사용함에 의해 반복될 수 있다.
대안적으로, 상기된 바와 같이 감염 및 형질감염의 단계는 상호교환될 수 있고, 즉, 적합한 세포는 먼저 외래 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터에 의해 형질감염된 이후 폭스바이러스로 감염될 수 있다. 추가의 대안으로서, 각각의 외래 유전자를 상이한 바이러스로 도입하고, 모든 수득된 재조합 바이러스로 세포를 동시 감염하고, 모든 외래 유전자들을 포함하는 재조합체를 스크리닝하는 것 또한 가능하다. 제3 대안은 시험관내 DNA 게놈 및 외래 서열의 결찰 및 헬퍼 바이러스를 사용하여 재조합된 백시니아 바이러스 DNA 게놈의 재구성이다. 제4 대안은 세균 인공 염색체(BAC)로서의 백시니아 바이러스 게놈 및 백시니아 바이러스 게놈에서의 원하는 결합 부위를 플랭킹하는 서열들과 상동성을 갖는 DNA 서열들로 플랭킹된 선형 외래 서열 사이의 이.콜라이 또는 다른 박테리아 종들에서의 상동성 재조합이다.
RSV 유전자의 발현
일 구현예에서, 이종성 RSV 뉴클레오티드 서열의 하나, 그이상 또는 모두의 발현은 하나 이상의 폭스바이러스 프로모터의 조절하에 있다. 특정 구현예에서, 상기 폭스바이러스 프로모터는 Pr7.5 프로모터, 하이브리드 얼리/레이트(early/late) 프로모터, PrS 프로모터, 합성 또는 천연 얼리 또는 레이트 프로모터 또는 카우폭스(cowpox) 바이러스 ATI 프로모터이다. 특정 구현예에서, 상기 폭스바이러스 프로모터는 PrS 프로모터 (서열식별 번호 39), Pr7.5 프로모터 (서열식별 번호 40), PrSynIIm 프로모터 (서열식별 번호 41), PrLE1 프로모터 (서열식별 번호 42), 및 PrH5m 프로모터 (서열식별 번호 43) [L.S. Wyatt et al. (1996), Vaccine 14(15):1451-1458])으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 상기 폭스바이러스 프로모터는 PrS 프로모터 (서열식별 번호 39)이다. 특정 구현예에서, 상기 폭스바이러스 프로모터는 Pr7.5 프로모터 (서열식별 번호 40)이다. 특정 구현예에서, 상기 폭스바이러스 프로모터는 PrSynIIm 프로모터 (서열식별 번호 41)이다. 특정 구현예에서, 상기 폭스바이러스 프로모터는 PrLE1 프로모터(서열식별 번호 42)이다. 특정 구현예에서, 상기 폭스바이러스 프로모터는 PrH5m 프로모터(서열식별 번호 43)이다.
이종성 RSV 뉴클레오티드 서열 또는 서열들은 단일 전사 단위로서 발현될 수 있다. 예를 들어, 이종성 RSV 뉴클레오티드 서열은 백시니아 바이러스 프로모터로 작동적으로 연결되고/되거나 백시니아 바이러스 전사 터미네이터에 연결될 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 이종성 RSV 뉴클레오티드 서열은 융합 단백질로서 발현된다. 상기 융합 단백질은 펩티다제 또는 이종성 자가-절단 펩티드 서열에 대한 인지 부위를 추가로 포함할 수 있다. 상기 이종성 자가 절단 펩티드 서열은 구제역 바이러스로부터의 2A 펩티다제일 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 “전사 단위”는 그 자체가 MVA 게놈내 삽입 부위로 삽입되지만 또한 다른 전사 단위(들)과 함께 MVA 게놈내 삽입 부위로 삽입될 수 있다. 상기 “전사 단위”는 MVA 게놈내에 천연적으로 발생하지 않고(즉, 이것은 이종성, 외인성 또는 외래이다) 감염된 세포에서 전사가 가능하다.
바람직하게, 상기 재조합 MVA는 상기 MVA 게놈내로 삽입된 1, 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상의 전사 단위를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 재조합 MVA는 1, 2, 3, 4 또는 5, 또는 그 이상의 전사 단위에 의해 인코딩된 RSV 단백질을 안정하게 발현한다. 특정 구현예에서, 상기 재조합 MVA는 상기 MVA 게놈내 1, 2, 3, 또는 그 이상의 삽입 부위에서 MVA 게놈내로 삽입되는 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상의 전사 단위를 포함한다.
RSV 백신 및 약제학적 조성물
본원에 기재된 MVA-BN을 포함하는 재조합 MVA 바이러스들은 높은 수준으로 복제 제한적이며, 그러므로 높은 수준으로 약독화되어있으며, 그들은 인간 및 심지어 면역 손상된 인간을 포함하는 광범위한 포유동물의 치료를 위한 이상적인 후보물이다. 따라서, 약제학적 조성물 및 백신 뿐만 아니라 활성 약제학적 물질로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 재조합 MVA가 본원에 제공되고, 이 모두는 인간을 포함하는 살아있는 동물체에서 면역 반응을 유도하기 위해 의도된다.
이를 위해, 상기 재조합 MVA, 백신 또는 약제학적 조성물은 용액 중에서 104 내지 109 TCID50/ml, 105 내지 5 × 108 TCID50/ml, 106 내지 108 TCID50/ml, 또는 107 내지 108 TCID50/ml의 농도 범위로 제형화할 수 있다. 인간을 위한 바람직한 용량은 106 내지 109 TCID50를 포함하고, 106 TCID50, 107 TCID50, 108 TCID50 또는 5 x 108 TCID50의 용량을 포함한다.
본원에 제공된 상기 약제학적 조성물은 일반적으로 적어도 하나의 약제학적으로 허용되고/되거나 승인된 담체, 첨가제, 항생제, 방부제, 보조제, 희석제 및/또는 안정화제를 포함할 수 있다. 그러한 보조 물질은 물, 식염수, 글리세롤, 에탄올, 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충 물질 등일 수 있다. 적합한 담체는 전형적으로 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합성 아미노산, 아미노산 공중합체, 지질 응집체 등과 같은 전형적으로 크고 서서히 대사되는 분자이다.
백신의 제조를 위해, 본원에 제공된 상기 재조합 MVA 바이러스는 생리학적으로 허용되는 형태로 전환될 수 있다. 이는 [H. Stickl et al., Dtsch . med . Wschr . 99:2386-2392 (1974)]에 기재된 바와 같은 천연두에 대한 백신 접종을 위해 사용되는 폭스바이러스 백신의 제조에서의 경험을 토대로 수행될 수 있다.
예를 들어, 정제된 바이러스는 약 10 mM Tris, 140 mM NaCl pH 7.7에 제형화된 5x108 TCID50/ml의 역가로 -80℃에서 보관될 수 있다. 백신 주사(shot)의 제조를 위해, 예를 들어, 바이러스의 102-108 또는 102-109 입자들은 앰플, 바람직하게 유리 앰플에서 2% 펩톤 및 1% 인간 알부민의 존재하에 100ml의 포스페이트 완충 식염수(PBS) 중에 동결건조될 수 있다. 대안적으로, 상기 백신 주사는 제형 중에 바이러스의 단계적 동결 건조에 의해 제조될 수 있다. 상기 제형은 추가적인 첨가제, 예를 들어, 만니톨, 덱스트란, 당, 글라이신, 락토스 또는 폴리비닐피롤리돈 또는 생체내 투여용으로 적합한 항산화제 또는 불활성 가스, 안정화제 또는 재조합 단백질(예를 들어, 인간 혈청 알부민)과 같은 다른 보조제를 함유할 수 있다. 이후 상기 유리 앰플은 밀봉되어 수개월 동안 4℃ 내지 실온에서 보관될 수 있다. 그러나, 어떠한 필요성이 존재하지 않는 한, 상기 앰플은 바람직하게 -20℃ 미만의 온도에서 보관된다.
백신 접종 또는 치료를 위해, 상기 동결건조물은 수용액, 바람직하게는 생리학적 식염수 또는 Tris 완충액에서 용해될 수 있고 전신 또는 국소적으로, 즉, 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 비강내 또는 당업자에게 알려진 임의의 다른 투여 경로로 투여될 수 있다. 상기 투여 방식, 투여 용량 및 횟수는 알려진 방식으로 당업자에 의해 최적화될 수 있다. 그러나, 가장 통상적으로 환자는 제1 백신접종주사 후 약 1개월 내지 6주에 제2 주사로 백신접종을 하게 된다.
재조합 MVA 바이러스를 포함하는 키트
본원에 기재된 재조합 MVA 중 임의이 하나 이상을 포함하는 키트가 또한 본원에 제공된다. 상기 키트는 RSV 감염의 위험에 처한 대상체에게 재조합 MVA를 투여하기 위한 지침과 함께 재조합 MVA의 하나 또는 다수의 컨테이너 또는 바이알을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 대상체는 인간이다. 상기 지침은 재조합 MVA가 단일 용량 또는 다중(즉, 2, 3, 4, 등) 용량으로 대상체에게 투여되는 것을 지시할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 지침은 재조합 MVA 바이러스가 순수(
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) 또는 비-순수 대상체에게 제1 (프라이밍) 및 제2 (부스팅) 투여로 투여된다는 것을 지시한다.
제1 투여(프라이밍)용 제1 바이러스 또는 컨테이너 및 제2 투여(부스팅)용 제2 바이알 또는 컨테이너에서 재조합 MVA 바이러스를 포함하는 키트가 추가로 제공된다. 상기 키트는 또한 제3, 제4 또는 추가의 투여(부스팅)를 위한 제3, 제4 또는 추가의 바이알 또는 컨테이너 내에 재조합 MVA를 포함할 수 있다.
재조합 MVA 바이러스의 방법 및 용도
또한, 대상체 동물을 면역화시키는 방법, 또한 대상체 동물을 면역화시키는 방법에 사용하기 위한 재조합 MVA 및 대상체 동물을 면역화시키기 위한 약물 또는 백신의 제조에서 본원에 제공된 재조합 MVA의 용도가 본원에 제공된다. 특정 구현예에서, 상기 동물은 포유동물이다. 특정 구현예에서, 상기 포유동물은 래트, 토끼, 돼지, 마우스, 또는 인간이고, 상기 방법은 본원에 제공된 재조합 MVA의 임의의 하나 이상의 용량을 대상체에 투여함을 포함한다.
상기 대상체는 바람직하게 인간이고 성인일 수 있고, 여기서, 상기 성인은 면역 손상일 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 성인은 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 또는 85세 초과이다. 다른 구현예에서, 상기 대상체의 연령은 5세 미만, 3세 미만, 2세 미만, 15개월 미만, 12개월 미만, 9개월 미만, 6개월 미만 또는 3개월 미만이다. 상기 대상체의 연령은 또한 0 내지 3개월, 3 내지 6개월, 6 내지 9개월, 9 내지 12개월, 1 내지 2년 또는 2 내지 5년 범위일 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 재조합 MVA는 대상체에 106 내지 109 TCID50의 용량, 106 내지 5×108 TCID50의 용량, 또는 107 내지 108 TCID50의 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 본원에 제공된 상기 재조합 MVA는 또한 106, 107 TCID50, 108, 또는 5×108 TCID50의 용량으로 상기 대상체에 투여될 수 있다. 본원에 제공된 상기 재조합 MVA의 임의의 것은 또한 107 TCID50, 108, 또는 5×108 TCID50의 용량으로 상기 대상체에 투여된다.
본원에 제공된 재조합 MVA는 단일 용량 또는 다중(즉, 2, 3, 4, 등) 용량으로 대상체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 상기 재조합 MVA 바이러스는 제1 (프라이밍) 및 제2 (부스팅) 투여로 투여된다. 특정 구현예에서, 제1 용량은 재조합 MVA 바이러스의 107 내지 108 TCID50를 포함하고 제2 용량은 재조합 MVA 바이러스의 107 내지 108 TCID50를 포함한다.
상기 재조합 MVA는 전신 또는 국소적으로, 비경구로, 피하내, 정맥내, 근육내 또는 비강내, 바람직하게 피하내 또는 비강내로 투여될 수 있다. 상기 재조합 MVA는 또한 당업자에게 알려진 임의의 다른 투여 경로에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 측면에서, 특히, RSV 감염을 진단하는 방법 및 대상체가 신생아, 1세 내지 6세의 어린이 및/또는 성인에 대해 중증의 위협일 수 있는, 재발성 RSV 감염의 위험에 처해있는지의 여부를 측정하는 방법이 본원에 제공된다.
본 발명자는 RSV 감염을 진단하는 현재 방법이 부정확한 결과를 제공할 수 있음을 발견하였다. 예를 들어, RSV에 대한 항체 또는 바이러스 플라크를 탐지하는 면역검정은 재발성 감염의 위험에 있는 개체를 필연적으로 정확하게 식별하지 않을 수 있다. 실제로, 본 발명자는 개체로부터 채취한 샘플이 바이러스 플라크 검정 [예를들어, W. Olszewska et al., 2004. 참고]에서 음성 결과로 복귀할 수 있다고 하더라도, 그러한 결과는 때로는 가짜(false) 음성일 수 있으며, 이는 보다 민감한 방법이 때로는 감염성 RSV 입자가 여전히 존재하고 있다는 것을 입증하기 때문이라는 것을 관찰하였다. 사실, 정량적 실시간-폴리머라제 연쇄 반응(qRT-PCR)과 같은 방법은 대상체가 RSV로 실제로 감염될 수 있거나 재발성 감염의 위험에 처해있는지 또는 실제로 백신 접종된 대상체가 RSV에 대해 무균성 면역력을 획득했는지의 여부를 확인하기 위해 요구된다. 상기 측정은, 백신 접종 후 재감염이 때로는 사망을 초래하는 증진된 질환을 야기하기 때문에 중요할 수 있다.
따라서, 특정 구현예에서, 대상체로부터 수득된 샘플이 RSV 게놈을 함유하는지의 여부를 정량적으로 측정함을 포함하고, 여기서 RSV 게놈의 존재는 대상체가 RSV로의 재발성 감염을 지시하는, 대상체가 재발성 RSV 감염 위험에 처해있는지의 여부를 측정하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 구현예에서, 대상체로부터 수득된 샘플이 RSV 게놈을 함유하는지 여부의 정량적 측정은 qRT-PCR에 의해 수행된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 “샘플”은 개체, 세포주, 조직, 배양물 또는 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 또는 그의 일부를 함유하는 다른 공급원으로부터 수득된 임의의 생물학적 샘플을 나타낸다. 생물학적 샘플은 체액(예를 들어, 혈액, 혈청, 혈장, 뇨, 활액, 척수액, 폐포기관지 세척액(BAL)과 같은) 및 예를 들어, 임상 시험 또는 다른 실험 연구에 참여한 대상체로부터 수득된 임상 샘플을 포함하는, RSV를 함유하는 것으로 밝혀지고/지거나 의심되는 체조직을 포함한다. 포유동물로부터 조직 생검 및 체액을 수득하기 위한 방법은 당업계에 널리 알려져 있다. 특정 구현예에서, 상기 생물학적 샘플은 RSV 핵산을 포함한다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 “RT-qPCR” 또는 “qRT-PCR”은 “정량적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응”으로 알려진 방법을 나타낸다. 일부 경우에, 상기 방법은 또한 역학적 폴리머라제 연쇄 반응(KPCR)로서 언급될 수 있다.
특정 구현예에서, 대상체로부터 수득된 샘플이 RSV 게놈을 함유하는지를 정량적으로 측정함을 포함하고, 여기서 RSV 게놈의 존재는 대상체가 RSV에 대해 순수한 면역력을 획득하지 못하였음을 지시하는, 대상체가 RSV에 대한 무균성 면역력을 획득하였는지를 측정하는 방법이 본원에 제공된다. 또한, 본원에 기재된 재조합 MVA 중 임의의 것을 대상체에 비강내로 투여함을 포함하는, RSV에 대해 무균성 면역력을 획득하지 못한 대상체를 면역화시키는 방법이 제공된다. 추가로 또는 대안적으로, 본원에 기재된 재조합 MVA의 임의의 것은 RSV에 대해 무균성 면역력을 획득하지 못한 대상체를 면역화시키는 방법에 사용하기 위해 제공되고, 상기 방법은 본원에 기재된 재조합 MVA 중 임의의 것을 대상체에 비강내 투여함을 포함한다. 또한, RSV에 대해 무균성 면역력을 획득하지 못한 대상체를 면역화시키기 위한 약물 및/또는 백신의 제조에서 본원에 기재된 재조합 MVA의 임의의 용도가 제공되고, 여기서 상기 약물 또는 백신은 비강내 투여된다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 MVA 중 임의의 것을 대상체에 비강내 투여함을 포함하는, RSV에 대해 무균성 면역력을 획득하지 못한 대상체에서 RSV에 대해 무균성 면역력을 유도하는 방법이 제공된다. 또한, RSV에 대해 무균성 면역력을 획득하지 못한 대상체에서 RSV에 대해 무균성 면역력을 유도하는 방법에 사용하기 위한 본원에 기재된 재조합 MVA의 임의의 것이 제공되고, 상기 방법은 본원에 기재된 재조합 MVA 중 임의의 것을 대상체에 비강내 투여함을 포함한다. 추가로 또는 대안적으로, RSV에 대해 무균성 면역력을 획득하지 못한 대상체에서 RSV에 대해 무균성 면역력을 유도하기 위한 약물 및/또는 백신의 제조에서 본원에 기재된 재조합 MVA 중 임의의 것의 용도가 제공되고, 상기 약물 또는 백신은 비강내 투여된다.
본 발명의 특정 구현예는 또한 하기의 항목을 포함한다:
1. 적어도 하나의 호흡기 신시티알 바이러스(RSV) 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 비강내 투여함에 의해 RSV 감염을 치료하거나 예방하기 위한 재조합 개질된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA)로서, 근육내 투여가 배제된다.
2. 약제학적 조성물 및/또는 백신의 제조를 위한 적어도 하나의 호흡기 신시티알 바이러스(RSV) 막당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 개질된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA)의 용도로서, 여기서 상기 약제학적 조성물 및/또는 백신이 비강내 투여되고 근육내 투여가 배제된다.
3. 호흡기 신시티알 바이러스(RSV) 막 당단백질의 적어도 하나의 항원성 결정인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 개질된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA)를, 인간을 포함하는 대상체에 비강내 투여함을 포함하는, RSV 감염에 대해, 인간을 포함하는 대상체를 면역화시키는 방법으로서, 여기서 근육내 투여는 배제된다.
4. 유일하게 비강내 투여를 포함하는 항목 1의 재조합 MVA, 항목 2의 용도 및/또는 항목 3의 방법.
5. 피하 투여를 포함하는 항목 1의 재조합 MVA, 항목 2의 용도 및/또는 항목 3의 방법.
6. 상기 재조합 MVA가 RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 항목 1 또는 4 내지 5 중 임의의 항목의 재조합 MVA, 항목 2, 4 또는 5 중 임의의 항목의 용도 및/또는 항목 3 내지 5 중 임의의 것의 방법.
7. 호흡기 신시티알 바이러스(RSV) 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열 및 RSV 뉴클레오캡시드 항원성 결정인자를 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 개질된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA).
8. RSV 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열이 RSV F 항원성 결정인자를 인코딩하는, 항목 1 내지 7 중 임의의 것의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
9. RSV F 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 항목 1 내지 8 중 임의의 항목의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
10. RSV 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열이 전체 길이 RSV F 막 당단백질을 인코딩하는, 항목 1 내지 9 중 임의의 항목의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
11. RSV F 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 RSV 균주 A, 바람직하게는 A2 및/또는 Along으로부터 유래하는, 청구항 8 내지 10 중 임의의 항목의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
12. RSV F 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 서열식별 번호 4의 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 항목 8 내지 11 중 임의의 항목의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
13. RSV F 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 서열식별 번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 항목 8 내지 12 중 임의의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
14. RSV 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 절단된 RSV F 막 당단백질을 인코딩하는, 항목 1 내지 13 중 임의의 항목의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
15. 절단된 RSV F 막 당단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 RSV 균주 A, 바람직하게는 Along으로부터 유래하는, 항목 14의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
16. 절단된 RSV F 막 당단백질이 막관통 도메인이 없는, 항목 14 또는 15의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
17. 절단된 RSV F 막 당단백질이 세포질 도메인이 없는, 항목 14 내지 16 중 어느 한 항목의 재조합MVA, 용도 및/또는 방법.
18. RSV F 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 서열식별 번호 6의 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 항목 8 내지 17 중 어느 한 항목의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
19. RSV F 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 서열식별 번호 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 항목 8 내지 18 중 어느 한 항목의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
20. RSV 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 RSV G 막 당단백질의항원성 결정인자를 인코딩하는, 이전의 항목 중 어느 한 항목의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
21. RSV G 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 항목 1 내지 20 중 어느 한 항목의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
22. RSV 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 전체 길이의 RSV G 막 당단백질을 인코딩하는, 항목 1 내지 21 중 어느 한 항목의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
23. RSV G 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 RSV 균주 A, 바람직하게는 균주 A2 및/또는 B로부터 유래하는, 항목 20 내지 22 중 어느 한 항목의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
24. RSV G 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 서열식별 번호 2의 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 항목 20 내지 23 중 어느 한 항목의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
25. RSV G 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 서열식별 번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 항목 20 내지 24 중 어느 한 항목의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
26. RSV 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 절단된 RSV G 막 당단백질을 인코딩하는, 항목 1 내지 25 중 어느 한 항목의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
27. 절단된 RSV G 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 RSV 균주 B로부터 유래하는, 항목 26의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
28. 절단된 RSV G 막 당단백질이 막관통 도메인이 없는, 항목 26 또는 27의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
29. 절단된 RSV G 막 당단백질이 세포질 도메인이 없는, 항목 26 내지 28 중 어느 한 항목의 재조합MVA, 용도 및/또는 방법.
30. RSV G 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 서열식별 번호 8의 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 항목 20 내지 29 중 어느 한 항목의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
31. RSV G 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 서열식별 번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 항목 20 내지 30 중 어느 한 항목의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
32. RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 RSV N 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는, 항목 6 내지 31 중 어느 한 항목의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
33. RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 RSV M2 매트릭스 단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는, 항목 6 내지 32 중 어느 한 항목의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
34. RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 전체 길이의 단백질을 인코딩하는, 항목 6 내지 33 중 어느 한 항목의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
35. RSV N 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 RSV 균주A, 바람직하게 균주 A2로부터 유래하는, 항목 32 내지 34 중 어느 한 항목의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
36. RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 RSV N 뉴클레오캡시드 및 RSV M2 매트릭스 단백질 둘다의 항원성 결정인자를 인코딩하는, 항목 32 내지 35 중 어느 한 항목의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
37. RSV N 뉴클레오캡시드 및 RSV M2 매트릭스 단백질의 항원성 결정인자 둘다가 단일 개방 판독 프레임에 의해 인코딩된, 항목 36의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
38. RSV N 뉴클레오캡시드 및 RSV M2 매트릭스 단백질의 항원성 결정인자가 자가 절단 프로테아제도메인에 의해 분리된, 항목 36 또는 37의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
39. 자가 절단 프로테아제 도메인 서열이 구제역 바이러스로부터 유래하는, 항목 38의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
40. 자가 절단 프로테아제 도메인 서열이 프로테아제 2A 단편 서열인, 항목 38 또는 39의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
41. 자가 절단 프로테아제 도메인 서열이 서열식별 번호 12의 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드서열을 포함하는, 항목 38 내지 40 중 어느 한 항목의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
42. 자가 절단 프로테아제 도메인 서열이 서열식별 번호 11의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 항목 38 내지 41 중 어느 한 항목의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
43. 단일 개방 판독 프레임이 서열식별 번호 18의 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 항목 37 내지 42 중 어느 한 항목의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
44. 단일 개방 판독 프레임이 서열식별 번호 17의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 항목 37 내지 43 중 어느 한 항목의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
45. RSV 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 하나의 뉴클레오티드 서열 및 RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이전의 항목 중 어느 한 항목의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
46. RSV F 막 당단백질 및 RSV N 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자를 포함하는 항목 45의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
47. RSV F 막 당단백질 및 RSV M2 매트릭스 단백질의 항원성 결정인자를 포함하는 항목 45의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
48. RSV G 막 당단백질 및 RSV N 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자를 포함하는 항목 45의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
49. RSV G 막 당단백질 및 RSV M2 매트릭스 단백질의 항원성 결정인자를 포함하는 항목 45의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
50. RSV 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 2개의 뉴클레오티드 서열 및 RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 1개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 항목 1 내지 44 중 어느 한 항목의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
51. RSV F 및/또는 G 막 당단백질 및 RSV N 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자를 포함하는 항목 50의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
52. RSV F 및/또는 G 막 당단백질 및 RSV M2 매트릭스 단백질의 항원성 결정인자를 포함하는 항목 50의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
53. RSV 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 2개의 뉴클레오티드 서열 및 RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 2개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 항목 1 내지 44 중 어느 한 항목의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
54. RSV F 및/또는 G 막 당단백질의 항원성 결정인자 및 RSV N 뉴클레오캡시드 및/또는 M2 매트릭스 단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 항목 53의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
55. RSV 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 3개의 뉴클레오티드 서열 및 RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 2개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 항목 1 내지 44 중 어느 한 항목의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
56. 2개의 RSV F 막 당단백질 및/또는 1개의 RSV G 막 당단백질의 항원성 결정인자 및 RSV N 뉴클레오캡시드 단백질 및/또는 RSV M2 매트릭스 단백질의 항원성 결정인자를 포함하는 항목 55의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
57. 2개의 RSV G 막 당단백질 및/또는 1개의 RSV F 막 당단백질의 항원성 결정인자 및 RSV N 뉴클레오캡시드 단백질 및/또는 RSV M2 매트릭스 단백질의 항원성 결정인자를 포함하는 항목 55의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
58. RSV 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 4개의 뉴클레오티드 서열 및 RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 1개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 항목 1 내지 44 중 어느 한 항목의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
59. 2개의 RSV F 막 당단백질 및/또는 2개의 RSV G 막 당단백질의 항원성 결정인자 및 RSV N 뉴클레오캡시드 단백질 또는 RSV M2 매트릭스 단백질의 항원성 결정인자를 포함하는 항목 58의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
60. RSV 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 4개의 뉴클레오티드 서열 및 RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 2개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 항목 1 내지 44 중 어느 한 항목의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
61. 2개의 RSV F 막 당단백질 및/또는 2개의 RSV G 막 당단백질의 항원성 결정인자 및 RSV N 뉴클레오캡시드 단백질 및/또는 RSV M2 매트릭스 단백질의 항원성 결정인자를 포함하는 항목 60의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
62. 재조합 MVA를 생성시키기 위해 사용되는 MVA가 MVA-BN 또는 이의 유도체인 항목 1 내지 61의 재조합 MVA, 용도 및/또는 방법.
63. 활성 약제학적 물질로서 사용하기 위한 항목 1 또는 항목 4 내지 62 중 어느 한 항목의 재조합MVA.
64. 항목 1 또는 항목 4 내지 63 중 어느 한 항목의 재조합 MVA 및 임의로 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물 및/또는 백신.
65. 약제학적 조성물 및/또는 백신의 제조를 위한 항목 1 또는 항목 4 내지 63 중 어느 한 항목의 재조합 MVA의 용도.
66. RSV 감염을 치료하거나 예방하기 위한 항목 6 내지 63 중 어느 한 항목의 재조합 MVA, 항목 64의 약제학적 조성물 및/또는 백신 및/또는 항목 2, 4 내지 6, 8 내지 62 또는 65 중 어느 한 항목의 용도.
67. 항목 1, 4 내지 63 또는 66 중 어느 한 항목의 재조합 MVA 및/또는 항목 64 또는 66에 따른 약제학적 조성물 및/또는 백신을 인간을 포함하는 대상체에게 투여함을 포함하는, RSV 감염에 대한, 인간을 포함하는 대상체를 면역화시키는 방법.
68. 재조합 MVA가 107-109 TCID50의 용량으로 투여되거나 투여되어야만 하는, 항목 1, 4 내지 63 또는 66 중 어느 한 항목의 재조합 MVA, 항목 64 또는 66의 약제학적 조성물 및/또는 백신, 항목 2, 4 내지 6, 8 내지 62, 65 또는 66 중 어느 한 항목의 용도 및/또는 항목 3 내지 6, 8 내지 62 또는 67 중 어느 한 항목의 방법.
69. 재조합 MVA가 비강내 및/또는 피하로 투여되거나 투여되어야만 하는, 항목 5 내지 68 중 어느 한 항목의 재조합 MVA, 약제학적 조성물 및/또는 백신, 용도 및/또는 방법.
70. 재조합 MVA가 단일 또는 다중 용량으로, 인간을 포함하는 면역학적으로 순수하거나 면역학적으로 경험한 대상체에테 투여되거나 투여되어야만 하는 항목 1 내지 69 중 어느 한 항목의 재조합 MVA, 약제학적 조성물 및/또는 백신, 용도 및/또는 방법.
71. 2세 초과인 인간을 포함하는 대상체에게 투여하기 위한, 항목 1 내지 70 중 어느 한 항목의 재조합 MVA, 약제학적 조성물 및/또는 백신, 용도 및/또는 방법.
72. 2세 미만인 인간을 포함하는 대상체에게 투여하기 위한, 항목 1 내지 70 중 어느 한 항목의 재조합 MVA, 약제학적 조성물 및/또는 백신, 용도 및/또는 방법.
73. 항목 1, 4 내지 63, 66 또는 68 내지 72 중 어느 한 항목의 재조합 MVA의 1개 또는 다중 바이알 및 RSV 감염의 위험에 처한 대상체에게 바이러스를 투여하기 위한 지침를 포함하는 키트.
74. 제1 투여(프라이밍)를 위한 제1 바이알 또는 컨테이너 및 제2 투여(부스팅)를 위한 제2 바이알 또는 컨테이너 중에 재조합 MVA를 포함하는, 항목 1, 4 내지 63, 66 또는 68 내지 72 중 어느 한 항목에 따른 재조합 MVA를 포함하는 키트 및/또는 항목 73에 따른 키트.
75. 제3, 제4 또는 추가의 투여(부스팅)를 위한 제3, 제4 또는 추가의 바이알 또는 컨테이너 중에 재조합 MVA를 포함하는 항목 73 또는 74에 따른 키트.
76. 항목 1, 4 내지 63 또는 66 중 어느 한 항목에 따른 재조합 MVA를 포함하는 세포.
77. 항목 1, 4 내지 63, 66 또는 68 내지 72 중 어느 한 항목에 따른 재조합 MVA를 생성시키는 방법으로서:
(a) 숙주 세포를 MVA 바이러스로 감염시키는 단계,
(b) RSV 항원성 결정인자를 인코딩하고 뉴클레오티드 서열의 MVA 바이러스 게놈으로의 통합을 지시할 수 있는 게놈 MVA 바이러스 서열을 추가로 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 감염된 세포를 형질감염시키는 단계,
(c) 상기 생성된 재조합 MVA 바이러스를 식별하고, 분리하고 임의로 정제하는 단계를 포함하는, 방법.
78. 항목 77의 방법에 따라 생성된 재조합 MVA.
79. 항목 1, 4 내지 63, 66 또는 68 내지 72 중 어느 한 항목에 따른 재조합 MVA를 생성시키고/생성시키거나 상기 재조합 MVA의 게놈으로부터 발현되는 항원성 결정인자를 생성시키기 위한 방법으로서:
(a) 숙주 세포를 항목 1, 4 내지 63, 66 또는 68 내지 72 중 어느 한 항목의 재조합 MVA로 감염시키거나 상기 세포를 재조합 MVA의 재조합 DNA로 형질감염시키는 단계,
(b) 상기 감염되거나 형질감염된 세포를 배양하는 단계,
(c) 상기 세포로부터 MVA 및/또는 항원성 결정인자를 분리하는 단계를 포함하는 방법.
80. 항목 79의 방법에 의해 수득될 수 있는 재조합 MVA 및/또는 항원 결정인자.
81. RT-qPCR을 수단으로 대상체로부터 수득된 샘플에서 RSV가 존재하는지를 측정하여 RSV의 존재가재발 RSV 감염의 존재를 지적하는 것임을 포함하는, 대상체가 재발 RSV 감염의 위험에 처해있는지를 측정하기 위한 방법.
82. RT-qPCR을 수단으로 대상체로부터 수득된 샘플에서 RSV가 존재하는지를 측정하여 RSV의 존재가상기 대상체가 RSV에 대한 무균성 면역력을 획득하지 못하였음을 지적하는 것임을 포함하는, 대상체가 RSV에 대한 무균성 면역력을 획득하였는지의 여부를 측정하기 위한 방법.
83. 항목 1, 4 내지 63, 66, 68 내지 72, 78 또는 80 중 어느 한 항목의 재조합 MVA 및/또는 항목 64, 66 또는 68 내지 72 중 어느 한 항목의 약제학적 조성물 및/또는 백신을 대상체에게 비강내로 투여함을 포함하는, 항목 82의 방법에 의해 RSV에 대한 무균성 면역력을 획득하지 못한 것으로 진단된 대상체를 면역화시키는 방법.
84. 항목 82의 방법에 의해 RSV에 대해 무균성 면역력을 획득하지 못한 것으로 진단된 대상체를 면역화시키는 방법에서 사용하기 위한, 항목 1, 4 내지 63, 66, 68 내지 72, 78 또는 80 중 어느 한 항목의 재조합 MVA 및/또는 항목 64, 66 또는 68 내지 72 중 어느 한 항목의 약제학적 조성물 및/또는 백신으로서, 여기서 상기 방법은 상기 재조합 MVA를 대상체에게 비강내 투여함을 포함한다.
85. 항목 82의 방법에 의해 진단된 대상체가 RSV에 대해 무균성 면역력을 획득하지 못한 것으로 진단된 대상체를 면역화시키기 위한 약제학적 조성물 및/또는 백신의 제조하기 위한 항목 1, 4 내지 63, 66, 68 내지 72, 78 또는 80 중 어느 한 항목의 재조합 MVA의 용도로서, 상기 약제학적 조성물 및/또는 백신이 비강내 투여용인, 용도.
86. 항목 1, 4 내지 63, 66, 68 내지 72, 78 또는 80 중 어느 한 항목의 재조합 MVA 및/또는 항목 64, 66 또는 68 내지 72 중 어느 한 항목의 약제학적 조성물 및/또는 백신을 대상체에게 비강내로 투여함을 포함하는, 항목 82의 방법에 의해 RSV에 대해 무균성 면역력을 획득하지 못한 것으로 진단된 대상체에서 무균성 면역력을 유도하는 방법.
87. 항목 82의 방법에 의해 RSV에 대한 무균성 면역력을 획득하지 못한 것으로 진단된 대상체에서 무균성 면역력을 유도하는 방법(상기 방법은 상기 재조합 MVA를 대상체에게 비강내 투여함을 포함한다)에 사용하기 위한 항목 1, 4 내지 63, 66, 68 내지 72, 78 또는 80 중 어느 한 항목의 재조합 MVA 및/또는 항목 64, 66 또는 68 내지 72 중 어느 한 항목의 약제학적 조성물 및/또는 백신.
88. 항목 82의 방법에 의해 RSV에 대한 무균성 면역력을 획득하지 못한 것으로 진단된 대상체에서 무균성 면역력을 유도하기 위한 약제학적 조성물 및/또는 백신의 제조를 위한 항목 1, 4 내지 63, 66, 68 내지 72, 78 또는 80 중 어느 한 항목의 재조합 MVA의 용도로서, 상기 약제학적 조성물 또는 백신이 비강내 투여를 위한 것인, 용도.
일반 기재 및 상세한 설명 둘다는 단지 예시적인 것이고 청구된 바와 같이 본 발명을 제한하는 것이 아닌 것으로 이해되어야만 한다. 본 명세서에 인용되고 일부를 구성하는 첨부된 도면은 본 발명의 다양한 구현예를 설명하고 상기 기재와 함께 본 발명의 원리를 설명하는 작용을 한다.
도 1은 상기 시험된 재조합 MVA-작제물, MVA-mBN199B, MVA-mBN201B, MVA-mBN201BΔM2, MVA-mBN294B, MVA-mBN295B 및 MVA-mBN330B에 사용되는 이종성 RSV 유전자를 보여준다.
도 2는 IBL 햄버그-계(Hamburg-based) ELISA 에 의해 측정된 혈청 RSV-특이적 IgG 반응을 보여준다. 마우스는 TBS 또는 MVA-mBN199B, MVA-mBN201B 또는 MVA-mBN201BΔM2의 1×108 TCID50로 2회 또는 3회 면역화시켰다(s.c. 또는 i.n.). 대조군 마우스는 106 pfu RSV로 2회 i.n.으로 면역화시켰다. 혈청은 1/100으로 희석시키고 RSV F 및 G 단백질로 피복된 플레이트를 사용한 IBL 햄버그 키트를 기초로 RSV-특이적 IgG ELISA를 사용하여 검정했다.
도 3은 연속 희석 후 IBL 햄버그계 ELISA에 의해 측정된 혈청 RSV-특이적 IgG 반응을 보여준다. 마우스는 TBS, 또는 MVA-mBN199B, MVA-mBN201B 또는 MVA-mBN201BΔM2의 1×108 TCID50로 2회 또는 3회 (s.c. 또는 i.n.) 면역화시켰다. 대조군 마우스는 106 pfu RSV로 2회 i.n.으로 면역화시켰다. 혈청은 희석 (1/100, 1/200 및 1/400)하고 RSV F 및 G 단백질로 피복된 플레이트를 사용하는 IBL 햄버그 키트를 기초로 RSV-특이적 IgG ELISA를 사용하여 검정하였다.
도 4는 단지 F 단백질로 피복된 플레이트를 사용하여 IBL 햄버그-계 ELISA에 의해 측정된 혈청 RSV-특이적 IgG 반응을 보여준다. 마우스는 TBS 또는 MVA-mBN199B, MVA-mBN201B 또는 MVA-mBN201BΔM2의 1×108 TCID50를 사용하여 s.c.로 2회 또는 3회 면역화시켰다. 대조군 마우스는 106 pfu RSV로 2회 i.n.으로 면역화시켰다. 혈청은 1/100으로 희석시키고, 단지 RSV F 단백질로 피복된 플레이트를 사용하는 IBL 햄버그 키트를 기초로 RSV-특이적 IgG ELISA를 사용하여 검정하였다.
도 5는 세리온(Serion)-계 ELISA에 의해 측정된 혈청 RSV-특이적 IgG 반응을 보여준다. 마우스는 TBS 또는 MVA-mBN199B, MVA-mBN201B 또는 MVA-mBN201BΔM2의 1×108 TCID50로 2회 또는 3회 (s.c. 또는 i.n.) 면역화시켰다. 대조군 마우스는 106 pfu RSV로 2회 i.n.으로 면역화시켰다. 혈청은 (1/100)으로 희석시키고 RSV 용해물로 피복된 플레이트를 사용하는 세리온 키트를 기초로 RSV-특이적 IgG ELISA를 사용하여 검정하였다.
도 6은 기관지폐포 세척액(BAL) 유체 및 혈청에서 IBL 햄버그-계 ELISA에 의해 측정된 RSV-특이적 IgA 대 IgG 반응을 보여준다. 마우스는 TBS 또는 MVA-mBN199B, MVA-mBN201B 또는 MVA-mBN201BΔM2의 1×108 TCID50로 2회 또는 3회 (s.c. 또는 i.n.) 면역화시켰다. 대조군 마우스는 106 pfu RSV로 2회 i.n.으로 면역화시켰다. 혈청 및 BAL 유체는 (1/100)으로 희석시켰고 RSV F 및 G 단백질로 피복된 플레이트를 사용하는 IBL 햄버그 키트를 기초로 RSV-특이적 IgG 또는 IgA ELISA를 사용하여 분석하였다.
도 7은 ELISPOT에 의해 측정된 RSV F-, RSV G- 및 RSV M2-특이적 T-세포 반응을 보여준다. 마우스는 TBS 또는 MVA-mBN199B, MVA-mBN201B 또는 MVA-mBN201BΔM2의 1×108 TCID50으로 2회 또는 3회 (s.c. 또는 i.n.) 면역화시켰다. 대조군 마우스는 106 pfu RSV로 2회 i.n.으로 면역화시켰다. 비장은 48일째에 단리하였고 비장 세포는 3개의 상이한 RSV F-특이적 펩티드 (RSV-1 (서열식별 번호 19), RSV-2 (서열식별 번호 20) 및 RSV-3 (서열식별 번호 21), 즉, 하나의 RSV G-특이적 펩티드 (RSV-4 (서열식별 번호 22)), 하나의 RSV M2-특이적 펩티드(RSV-9 (서열식별 번호 27)) 또는 MVA-BN으로 재자극시켰다. IFNγ-분비 세포는 ELISPOT로 탐지하였다. 상기 자극 지수는 실시예에 설명된 바와 같이 계산하였다.
도 8은 RSV(A2)로 시도 한 후 상대적 체중 손실을 보여준다. 마우스는 TBS, 또는 MVA-mBN199B, MVA-mBN201B 또는 MVA-mBN201BΔM2의 TBS or 1×108 TCID50로 2회 또는 3회 (s.c. 또는 i.n.) 면역화시켰다. 대조군 마우스는 106 pfu RSV로 비강내(i.n.) 면역화시켰다. 이어서 마우스는 49일째에 106 pfu RSV(A2)로 시험감염하였다. 체중은 시도하는 날로부터 매일 측정하였다. 시험하는 날에 체중은 상대적 체중 변화의 %를 계산하기 위해 기준선으로서 사용하였다.
도 9는 플라크 검정에 의해 측정된 폐에서의 RSV 부하량을 보여준다. 마우스는 TBS 또는 MVA-mBN199B, MVA-mBN201B 또는 MVA-mBN201BΔM2의 TBS or 1×108 TCID50로 2회 또는 3회 (s.c. 또는 i.n.) 면역화시켰다. 대조군 마우스는 106 pfu RSV로 2회 i.n.으로 면역화시켰다. 이후 마우스는 49일째에 106 pfu RSV(A2)로 시도하였다. 폐는 4일 후 단리하였고 RSV 부하량(폐 당 pfu)은 플라크 검정에 의해 측정하였다.
도 10은 RT-qPCR에 의해 측정된 폐에서 RSV 부하량을 보여준다. 마우스는 TBS 또는 MVA-mBN199B, MVA-mBN201B 또는 MVA-mBN201BΔM2의 1×108 TCID50로 2회 또는 3회 (s.c. 또는 i.n.) 면역화시켰다. 대조군 마우스는 106 pfu RSV로 2회 i.n.으로 면역화시켰다. 이어서 마우스는 49일째에 106 pfu RSV A2로 시도하였다. 폐는 4일 후 단리하였고 RSV 부하량(관찰된 L 유전자 카피수를 기초로하여 추정됨)은 RT-qPCR로 측정하였다.
도 11은 ELISA에 의해 측정된 RSV(A2) 시도 후 4일째에 기관지폐포 세척액(BAL)에서 IL4 수준을 보여준다. 마우스는 TBS 또는 MVA-mBN199B 또는 MVA-mBN201B의 1×108 TCID50로 2회 (s.c. 또는 i.n.)으로 면역화시켰다. 대조군 마우스는 106 pfu RSV로 2회 i.n.으로 면역화시켰다. 이어서 마우스는 106 pfu RSV A2로 시험감염하였다. 폐는 4일 후 1ml의 PBS로 세척하고 BAL에서 상기 IL4 수준은 ELISA로 측정하였다. (n.d. = 탐지될 수 없음)
도 12는 ELISA에 의해 측정된 RSV(A2) 시도후 4일째에 기관지폐포 세척액(BAL)에서 IL5 수준을 보여준다. 마우스는 TBS 또는 MVA-mBN199B 또는 MVA-mBN201B의 1×108 TCID50로 2회 (s.c. 또는 i.n.) 면역화시켰다. 대조군 마우스는 106 pfu RSV로 2회 i.n.으로 면역화시켰다. 이어서 마우스는 106 pfu RSV A2로 시도하였다. 폐는 4일 후 1ml의 PBS로 세척하고 BAL에서 IL5 수준은 ELISA로 측정하였다. (n.d. = 탐지될 수 없음)
도 13은 세리온-계 ELISA로 측정된 혈청 RSV-특이적 IgG 반응을 보여준다. 마우스는 TBS 또는 MVA-mBN199B, MVA-mBN201B 또는 MVA-mBN294A의 1×108 TCID50로 3주 후 2회 s.c.로 면역화시켰다. 대조군 마우스는 106 pfu RSV로 2회 i.n.으로 면역화시켰다. 마지막 면역화한지 2주 후 수득된 그룹당 5마리 마우스의 혈청을 희석하고 RSV 용해물로 피복된 플레이트를 사용하는 세리온 키트를 기초로 RSV-특이적 IgG ELISA를 사용하여 분석하였다.
도 14는 PRNT에 의해 측정된 혈청 RSV-특이적 중화 항체 반응을 보여준다. 마우스는 TBS 또는 MVA-mBN199B, MVA-mBN201B 또는 MVA-mBN294A의 1×108 TCID50로 3주 후 2회 s.c.로 면역화시켰다. 대조군 마우스는 106 pfu RSV로 2회 i.n.으로 면역화시켰다. 그룹당 5마리의 마우스의 혈청은 PRNT에 의해 분석된 마지막 면역화 후 2주째에 수득하였다.
도 15는 ELISPOT에 의해 측정된 RSV F- 및 RSV M2-특이적 T-세포 반응을 보여준다. 마우스는 TBS, 또는 MVA-mBN199B, MVA-mBN201B 또는 MVA-mBN294A의 1×108 TCID50로 3주 간격으로 2회 s.c.로 면역화시켰다. 대조군 마우스는 106 pfu RSV로 2회 i.n.으로 면역화시켰다. 비장은 34일째에 분리하고 비장세포는 하나의 RSV F-특이적 펩티드 (RSV-2 (서열식별 번호 20), 하나의 RSV M2-특이적 펩티드 (RSV-9 (서열식별 번호 27)) 또는 MVA-BN으로 재자극하였다. IFNγ-분비 세포는 ELISPOT으로 탐지하였다. 상기 자극 지수는 실시예에 설명된 바와 같이 산출하였다.
도 16은 플라크 검정에 의해 측정된 폐에서 RSV 부하량을 보여준다. 마우스는 TBS 또는 MVA-mBN199B, MVA-mBN201B 또는 MVA-mBN294A의 1×108 TCID50로 3주 간격으로 2회 s.c.로 면역화시켰다. 대조군 마우스는 106 pfu RSV로 2회 i.n. 또는 50μl FI-RSV로 2회 i.m.으로 면역화시켰다. 이어서 마우스에는 49일째에 106 pfu RSV(A2)로 시도하였다. 폐는 4일 후 분리하고 RSV 부하량(폐당 pfu)은 플라크 검정으로 측정하였다.
도 17은 RT-qPCR에 의해 측정된 폐에서 RSV 부하량을 보여준다. 마우스는 TBS 또는 MVA-mBN199B, MVA-mBN201B 또는 MVA-mBN294A의 1×108 TCID50로 3주 간격으로 2회 s.c.로 면역화시켰다. 대조군 마우스는 106 pfu RSV로 2회 i.n. 또는 50μl FI-RSV로 2회 i.m으로 면역화시켰다. 이어서, 마우스에는 49일째에 106 pfu RSV A2로 시도하였다. 폐는 4일 후 분리하고 RSV 부하량(관찰된 L 유전자 카피수를 기준으로 추정됨)은 RT-qPCR에 의해 측정하였다.
도 18은 RSV(A2) 시험감염 4일 후 기관지폐포 세척액(BAL) 유체에서 호산구 및 호중구 침윤를 보여준다. 마우스는 TBS, 또는 MVA-mBN199B, MVA-mBN201B 또는 MVA-mBN294A의 1×108 TCID50로 3주 간격으로 2회 s.c.로 면역화시켰다. 대조군 마우스는 106 pfu RSV로 2회 i.n. 또는 50μl FI-RSV로 2회 i.m으로 면역화시켰다. 이어서, 마우스에는 106 pfu RSV A2로 시도하였다. 폐는 4일 후 1ml의 PBS로 세척하고 BAL 유체에서 호산구 및 호중구의 %를 측정하였다.
서열의 간단한 설명
서열식별 번호 1은 인간 RSV (hRSV) 균주 A2 (GenBank 승인번호 M11486) 기원의 전체 길이 G 단백질을 인코딩하는 DNA 서열이다.
서열식별 번호 2는 hRSV 균주 A2 (GenBank 승인번호 M11486) 기원의 전체 길이 G 단백질의 아미노산 서열이다.
서열식별 번호 3은 hRSV 균주 A2 기원의 전체 길이의 F 단백질(BN 변이체)를 인코딩하는 DNA 서열이다.
서열식별 번호 4는 hRSV 균주 A2 기원의 전체 길이의 F 단백질(BN 변이체)의 아미노산 서열이다.
서열식별 번호 5는 hRSV 균주 ALong 기원의 전체 길이의 F 단백질(BN 변이체)를 인코딩하는 DNA 서열이다.
서열식별 번호 6은 hRSV 균주 ALong 기원의 전체 길이의 F 단백질(BN 변이체)를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열식별 번호 7은 hRSV 균주 B (GenBank 승인번호 P20896) 기원의 막관통 및 세포질 도메인이 없는 절단된 G 단백질을 인코딩하는 DNA 서열이다.
서열식별 번호 8은 hRSV 균주 B (GenBank 승인번호 P20896) 기원의 막관통 및 세포질 도메인이 없는 절단된 G 단백질의 아미노산 서열이다.
서열식별 번호 9는 hRSV 균주 A2 (Genbank 승인번호 M11486) 기원의 종료 코돈이 없는 N 단백질을 인코딩하는 DNA 서열이다.
서열식별 번호 10은 hRSV 균주 A2 (Genbank 승인번호 M11486) 기원의 종료 코돈이 없는 N 단백질의 아미노산 서열이다.
서열식별 번호 11은 개시 및 종료 코돈 둘다가 없는 구제역 바이러스 기원의 프로테아제 2A의 단편을 인코딩하는 DNA 서열이다.
서열식별 번호 12는 개시 및 종료 코돈이 없는 구제역 바이러스 기원의 프로테아제 2A의 단편의 아미노산 서열이다.
서열식별 번호 13은 hRSV 균주 A2 (GenBank 승인번호 M11486) 기원의 개시 코돈이 없는 전체 길이의 M2 단백질을 인코딩하는 DNA 서열이다.
서열식별 번호 14는 hRSV 균주 A2 (GenBank 승인번호 M11486) 기원의 개시 코돈이 없는 전체 길이의 M2 단백질을 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열식별 번호 15는 hRSV 균주 A2 (GenBank 승인번호 M11486) 기원의 막관통 및 세포질 도메인이 없는 절단된 F 단백질(BN 변이체)을 인코딩하는 DNA 서열이다.
서열식별 번호 16은 hRSV 균주 A2 (GenBank 승인번호 M11486) 기원의 막관통 및 세포질 도메인이 없는 절단된 F 단백질(BN 변이체)의 아미노산 서열이다.
서열식별 번호 17은 hRSV 균주 A2 (Genbank 승인번호 M11486)의 종료 코돈이 없는 N 단백질을 인코딩하는 DNA 서열 + 개시 코돈 및 종료 코돈 둘다가 없는 구제역 바이러스 기원의 프로테아제 2A 단편을 인코딩하는 DNA 서열 + hRSV 균주 A2 (GenBank 승인번호 M11486) 기원의 개시 코돈이 없는 전체 길이의 M2 단백질을 인코딩하는 DNA 서열이다.
서열식별 번호 18은 hRSV 균주 A2 (Genbank 승인번호 M11486) 기원의 N 단백질의 아미노산 서열 + 개시 코돈이 없는 구제역 바이러스 기원의 프로테아제 2A 단편의 아미노산 서열 + hRSV 균주 A2 (GenBank 승인번호 M11486) 기원의 개시 코돈이 없는 전체 길이의 M2 단백질의 아미노산 서열이다.
서열식별 번호 19는 RSV F 단백질로부터 유래된 RSV-1 펩티드의 아미노산 서열이다.
서열식별 번호 20은 RSV F 단백질로부터 유래된 RSV-2 펩티드의 아미노산 서열이다.
서열식별 번호 21은 RSV F 단백질로부터 유래된 RSV-3 펩티드의 아미노산 서열이다.
서열식별 번호 22는 RSV G 단백질로부터 유래된 RSV-4 펩티드의 아미노산 서열이다.
서열식별 번호 23은 RSV G 단백질로부터 유래된 RSV-5 펩티드의 아미노산 서열이다.
서열식별 번호 24는 RSV G 단백질로부터 유래된 RSV-6 펩티드의 아미노산 서열이다.
서열식별 번호 25는 RSV G 단백질로부터 유래된 RSV-7 펩티드의 아미노산 서열이다.
서열식별 번호 26은 RSV G 단백질로부터 유래된 RSV-8 펩티드의 아미노산 서열이다.
서열식별 번호 27은 RSV M2 단백질로부터 유래된 RSV-9 펩티드의 아미노산 서열이다.
서열식별 번호 28은 hRSV 균주 A2 기원의 전체 길이 F 단백질을 인코딩하는 DNA 서열이다.
서열식별 번호 29는 hRSV 균주 A2 기원의 전체 길이의 F 단백질의 아미노산 서열이다.
서열식별 번호 30은 hRSV 균주 A2 기원의 전체 길이의 G 단백질을 인코딩하는 DNA 서열이다.
서열식별 번호 31은 hRSV 균주 A2 기원의 전체 길이의 G 단백질의 아미노산 서열이다.
서열식별 번호 32는 hRSV 균주 A2 기원의 전체 길이의 M2 단백질을 인코딩하는 DNA 서열이다.
서열식별 번호 33은 hRSV 균주 A2 기원의 전체 길이의 M2 단백질의 아미노산 서열이다.
서열식별 번호 34는 hRSV 균주 A2 기원의 전체 길이의 N 단백질을 인코딩하는 DNA 서열이다.
서열식별 번호 35는 hRSV 균주 A2 기원의 전체 길이의 N 단백질의 아미노산 서열이다.
서열식별 번호 36은 RT-qPCR에 사용된 프라이머 1이다.
서열식별 번호 37은 RT-qPCR에 사용된 프라이머 2이다.
서열식별 번호 38은 RT-qPCR에 사용된 프로브 6이다.
서열식별 번호 39는 PrS 프로모터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별 번호 40은 Pr7.5 프로모터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별 번호 41은 PrSynIIm 프로모터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별 번호 42는 PrLE1 프로모터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별 번호 43은 PrH5m 프로모터의 뉴클레오티드 서열이다.
실시예
실시예 1: 재조합 MVA의 작제 .
재조합 MVA의 생성은 재조합 MVA를 선별하기 위한 선별 마커를 사용하여 CEF 세포에서 상동성 재조합을 통해 RSV 코딩 서열을 지정된 프로모터(도 1)와 함께 MVA 게놈으로 삽입함에 의해 수행하였다. 삽입 부위로서 유전자간 영역(IGR)의 사용은 WO 03/097845에 기재되어 있다. 선별 마커를 제거하기 위해, 상동성 재조합의 제2 단계를 사용하였다.
MVA-BN® 바이러스는 IGR88/89에서 RSV-A2-G 및 RSV-F-A2_BN에 대한 유전자를 함유하는 재조합 MVA-mBN199B의 생성을 위한 출발 물질로서 사용하였다. MVA-mBN199의 프리마스터 물질은 하기된 바와 같은 MVA-mBN201B의 생성을 위한 출발 물질로서 사용하였다.
IGR88 /89 ( MVA - mBN199B ) 로의 삽입:
RSV-A2-G에 대한 코딩 서열은 RSV-A2-균주 당단백질 G의 천연 서열을 기초로 한다. 융합 단백질 RSV-F-A2 BN의 코딩 서열은 또한 RSV-A2 균주를 기초로 하지만 바바리안 노르딕(Bavarian Nordic)에 의해 개질시켰다. 삽입된 유전자 둘다는 인간 적응된 코돈 용법과 함께 게너트(Geneart)에 의해 합성하고 재조합 플라스미드의 클로닝을 위해 사용하였다. RSV-A2-G의 단백질 서열은 GenBank 서열 P03423.1과 100% 상동성을 나타낸다. RSV-F-A2 BN의 단백질 서열은 위치 103번에서 1개의 단일 아미노산 교환(P에서 A로)으로 인해 GenBank 서열 P03420.1과 단지 99% 상동성을 나타낸다.
IGR148 /149 ( MVA - mBN201B ) 으로의 삽입:
RSV-N-A2 및 RSV-M2-A2에 대한 코딩 서열은 각각의 RSV-A2-균주 당단백질의 천연 서열을 기초로 한다. 유전자 둘다는 단일 프로모터의 조절하에 2개의 별도의 본래의 단백질의 발현을 허용하는 2A 자가 절단 펩티드 서열 [M.D. Ryan et al. (1991), J. Gen. Virol . 72(Pt 11):2727-2732]로 연결한다. RSV-G(B) 및 RSV-F A 롱(long) BN에 대한 코딩 서열은 발현된 단백질이 분비될 수 있도록 하는 막관통 도메인을 제거하기 위해 절단하였다. 모든 삽입된 유전자들은 최적화된 코돈 용법과 함께 게너트에 의해 합성하고 재조합 플라스미드의 클로닝을 위해 사용하였다. RSV-N-A2 및 RSV-M2-A2의 단백질 서열은 각각 GenBank 서열 P03418.1 및 P04545.1에 대해 100% 상동성을 나타낸다. 절단된 RSV-G(B)의 단백질 서열은 GenBank 서열 P20896.1과 100% 상동성을 나타낸다. 절단된 RSV-F A 롱(long) BN의 코딩 서열은 [R.P. Du et al. (1994) Biotechnology (N Y) 12(8):813-818]에 기재된 바와 같이 RSV-F 단백질의 처음 526개 아미노산을 함유하도록 디자인하였다.
MVA - mBN210BΔM2의 M2(A2)에서 결실 돌연변이체:
MVA-mBN210BΔM2는 M2(A2) 유전자의 12번째 코돈에서 결실 돌연변이를 포함하고 이는 기능성 M2가 발현되지 못하도록 한다. 상기 결실은 M2(A2)의 처음 11개 아미노산으로 2개의 아미노산 트레오닌 및 알라닌의 부가에 이어서 전사 종료(UGA 종료 코돈)를 야기한다.
실시예 2: RSV F 단백질, RSV G 단백질, RSV N 단백질 및 RSV M2 단백질을 발현하는 재조합 MVA 백신의 면역원성 및 효능.
백신 후보 MVA-mBN199B는 RSV의 당단백질(G) 및 융합(F) 단백질을 인코딩하고, MVA-MVA-mBN201BΔM2 및 MVA-mBN201B는 전체 길이의 F 및 G 단백질 뿐만 아니라 절단된 버전의 F 및 G, 뉴클레오캡시드 단백질(N), 및 MVA-mBN201B의 경우에 또한 RSV의 매트릭스 단백질(M2)을 발현한다 (도 1 참조). 이들 실험의 목적은 피하 (s.c.) 또는 비강내 (i.n.) 투여 경로를 통한 2회 또는 3회 면역화 후 MVA-mBN199B와 대비되는 MVA-mBN201BΔM2 및 MVA-mBN201B의 면역원성 및 보호 효능을 분석하는 것이다.
이들 작제물의 효능은 BALB/c 마우스에서 RSV(A2) 시도 모델을 사용하여 시험하였다. MVA-mBN199B 또는 MVA-mBN201B를 사용한 2회 면역화는 피하 적용되는 경우 실시간 정량적 폴리머라제 연쇄 반응(RT-qPCR)에 의해 판단되는 바와 같이 부분적 보호를 제공했고 비강내 투여에 의해 적용되는 경우 거의 완전한 보호를 제공했다. MVA-mBN201B에 의해 제공되는 보호는 MVA-mBN199B에 의해 제공되는 것보다 우수하였다. 2개의 작제물에 의해 유도되는 체액성 면역 반응에는 차이가 없었지만 주요 차이는 T-세포 반응에서 관찰되었다. MVA-mBN199B는 우수한 RSV F-특이적 세포 반응을 유도하는 반면 MVA-mBN201B에서는 MVA-mBN199B과 비교하여 보다 현저한 G-특이적 반응 뿐만 아니라 강한 M2-특이적 T-세포 반응이 관찰되었다. 피하 및 비강내 면역화 후 유도된 IgG 및 T-세포 반응은 유사하므로, 비강내 면역화에 의해 수득된 거의 완전한 무균성 면역력은 점막 감염 부위에서 RSV-특이적 IgA의 유도 및 분비와 상호 관련성이 있을 가능성이 있다. MVA-mBN201BΔM2에 대해, M2-특이적 T-세포 반응의 부재는 MVA-mBN201B와 비교하여 감소된 보호와 상호관련되고 MVA-mBN199B과 유사한 보호를 유도했다.
연구 설계
마우스는 1×108 TCID50 MVA-mBN199B (그룹 3, 4 및 5), 1×108 TCID50 MVA-mBN201B (그룹 6, 7 및 8), 또는 1×108 TCID50 MVA-mBN201BΔM2 (그룹 9)로 피하내(s.c.) 또는 비강내(i.n.) 처리하였다. 마우스는 표 1에 따라 2회 (그룹 3, 4, 6, 7 및 9) 또는 3회 (그룹 5 및 8) 처리하였다. 상기 2개의 대조군 그룹은 표 7에 따라 TBS(그룹 1)으로 2회 (s.c.) 또는 RSV (그룹 2)으로 i.n. 처리하였다. 희생(sacrifice)의 날 뿐만 아니라 면역화 또는 시도 하루 전날에도 혈액을 수거하였다. RSV-특이적 IgG 역가는 효소-연결된 면역흡착 검정(ELISA)으로 측정하였다. 48일째에, 마우스의 절반이 희생되었다. 이들의 비장을 제거하고 효소-연결된 면역흡착 스팟(ELISPOT)에 의한 RSV-특이적 T-세포 반응의 분석을 위해 제조하였다. 49일째에, 잔여 마우스에 106 pfu RSV A2를 시도(i.n.) 하였다. 외관 및 체중은 시도하는 날에 시작하여 매일 모니터링하였다. 시도 후 4일째에, 마우스는 상승된 용량의 케타민-크실라진을 주사하여 희생시키고 채혈-종료하였다. 폐 세척 후, 상기 폐를 제거하고 RSV 부하량은 플라크 검정 및 RT-qPCR에 의해 검정하였다.
표 1: 실험 설계
Figure 112021066173718-pat00002
제1 면역화에 상대적인 %.
# 마우스에 비강내 경로로 106 pfu의 RSV A2를 시도하였다. 시도 후 4일째에, 마우스에서 채혈하고 마취하에 희생시켰다. BAL 유체 및 폐에서 샘플 채취하였다.
& 48일째에, 이들 마우스를 희생시키고 비장은 ELISPOT으로 검정하였다.
연구 스케줄. 인-라이프(in-life) 단계의 스케줄은 표 2에 요약한다.
표 2: 인- 라이프 (in-life) 단계의 스케줄
Figure 112021066173718-pat00003
** 1번째 면역화 날에 상대적인.
재료 및 방법
실험 동물 . 7주령에서 85마리 암컷 BALB/cJ Rj (H-2d) 마우스는 젠비어(Janvier) (Route des Chenes Secs, F-53940 Le Genest-Saint-Isle, France)]으로부터 수득하였다. 모든 마우스는 특이적 병원체가 없었다.
하우징 . 상기 연구는 연구소(Bavarian Nordic-Martinsreid)에서 동물 설비 117호실에서 수행하였다. 상기 유닛에 20-24℃의 온도 및 40% 내지 70%의 상대 습도에서 여과된 공기를 제공하였다. 상기 방에는 14시간의 광 사이클 및 10시간의 암 사이클로 인공적으로 조명하였다. 상기 연구 적응 기간은 15일이었다. . 상기 동물들은 바닥 면적이 530 cm²인 투명한 SealSafe™-케이지 (H Temp [polysulfon] 케이지 유형 II L - Euro 표준)에 하우징시켰다. 상기 케이지는 H-Temp SealSafe™ 뚜껑으로 덮었다. 상기 케이지는 모든 단일 케이지에 별도로 HEPA-여과된 공기를 제공하는 SLIMLine™ 순환 유닛을 갖는 TECNIPLAST-IVC SealSafe™시스템에 위치시켰다. 동물 잠자리는 1주 1회 변화시켰다.
식이 및 물. 마우스는 조사된 유지 식이 (SSNIFF R/M-H, 조사된, V1534-727) 및 물 (20분동안 121°C에서 오토클레이빙)에 자유롭게 접근하도록 하였다.
전처리 과정: 동물의 식별 각각의 케이지내 동물을 개별적으로 표시하기 위해, 귀 펀칭은 표준 과정에 따라 수행하였다.
내포/배제 조사. 내포/배제 조사는 표준 과정에 따라 수행하였다.
사전 채혈을 위한 혈액 샘플 채취. 대략 150 μl의 혈액 샘플은 표준 과정에 따라 안면 정맥 천공에 의해 수득하였다. 혈액 샘플은 표준 과정에 따른 추가의 프로세싱을 위해 연구소로 보냈다.
처리 과정: 시험 항목 1 내지 3 및 레퍼런스 항목의 제조 및 투여. 시험 및 레퍼런스 항목의 제조 및 투여는 표준 과정에 따라 클래스 II 미생물학적 안전성 캐비넷 (HERAsafe®/클래스 II형 H, Kendro)에서 수행하였다. 간략하게, s.c. 투여를 위해, 재조합 MVA는 TBS 중에서 희석하여 2×108 TCID50/ml의 농도를 갖는 사용액(working solution)을 수득하였다. 500μl 중의 1×108 TCID50는 표준 과정에 따라 s.c.로 주사하였다. i.n. 투여를 위해, 재조합 MVA는 TBS 중에서 희석하여 2×109 TCID50/ml의 농도를 갖는 사용액을 수득하였다. 50 μl의 희석된 바이러스는 표준 과정에 따라 마취된 (크실라진/케타민) 마우스의 하나의 콧구멍에 투여하였다. 500μl의 TBS는 표준 과정에 따라 s.c.로 투여하였다.
시험 항목 4 / 시도 바이러스의 제조 및 투여. RSV 스톡 바이알은 해동시키고 바이러스가 불안정(빙상에서 최대 15분)하므로 가능한한 빨리사용하였다. 바이러스는 계속 빙상에 유지시키고 표준 과정에 따른 비강내 경로에 의해 100 μl의 순수 바이러스 용액으로 마취된(크실라진/케타민) 마우스를 시도하기 위해 즉시 사용하였다.
후처리 과정들:
체중. 체중은 표준 과정에 따른 희생때까지 시도하는 날로부터 매일 모니터링하였다.
혈액 샘플링. 혈액 샘플 (대략 150 μl)은 표준 과정에 따라 안구 뒤쪽 또는 안면 정맥 천공(상세하게는 표 1 및 표 2를 참조한다)에 의해 수득하였다. 혈액 샘플은 표준 과정에 따른 추가의 프로세싱을 위해 연구소로 보냈다.
안락사. 마우스 절반의 안락사는 경부 이탈에 의해 48일째에 수행하였다. 53일째에, 남아있는 마우스에 2배 용량의 케타민-크실라진을 복강내 주사하여 투여하고 안락사는 복강내 대동맥 절단에 의해 수행하였다.
비장 제거. 비장은 무균적으로 제거하였다. 이들은 표준 과정에 따라 배지로 채워진 튜브에 위치시켰다. 이들 튜브는 동물 설비로 도입하고 이어서 표준 과정에 따라 배출시켰다.
폐 세척 및 폐 제거. 기관지폐포 세척 (BAL) 유체는 폐를 1ml의 PBS로 4회 세정하여 수거하였다. 이어서 폐를 제거하고 후속적 플라크 검정 및 RNA 추출을 위해 액체 질소에서 2등분으로 순간 동결시켰다.
분석: 혈액 샘플 프로세싱 및 혈청의 보관. 연구소로 보낸 후, 혈액 샘플은 표준 과정에 따라 혈청으로 프로세싱하였다. 제조 후, 상기 혈청은 분석을 위해 요구될 때까지 -20℃ (± 5℃)에서 보관하였다.
혈청 샘플로부터의 RSV -특이적 항체 역가의 검정. 상기 총 RSV-특이적 IgG ELISA 역가는 개질된 ELISA 키트 (Serion ELISA classic, 카탈로그 번호 ESR113G)를 사용하여 모든 혈청 샘플로부터 측정하였다: 키트와 함께 제공된 알칼리 포스파타제-접합된 항-인간 IgG 항체 대신에, 알칼리 포스파타제 접합된 염소 항-마우스 IgG (Serotec cat: 103004)를 2차 항체로서 사용하였다.
상기 RSV-F/G-특이적 IgG ELISA 역가는 개질된 ELISA 키트 (IBL-햄버그 참조번호 RE56881)를 사용하여 모든 혈청 샘플 및 BAL 유체로부터 측정하였다. 키트와 함께 공급되는 POD-접합된 항-인간 IgG 항체 대신, HRP-접합된 양 항-마우스 IgG (참조번호 BN-687-95/96, Serotec cat: AAC10P)를 2차 항체로서 사용하였다.
그룹 4 및 7을 제외하고는, RSV-F-특이적 IgG ELISA 역가는 개질된 ELISA 키트 (IBL-햄버그 참조번호. RE56692)를 사용하여 48일째에 혈청 샘플로부터 측정하였다. 키트내에 제공된 POD-접합된 항-인간 IgG 항체 대신, HRP-접합된 양 항-마우스 IgG(참조번호: BN-687-95/96 Serotec cat: AAC10P)를 2차 항체로서 사용하였다.
혈청 및 BAL 유체내 RSV-특이적 IgA ELISA 역가는 각각 48일 및 53일째 샘플로부터 개질된 ELISA 키트 (IBL-햄버그 참조번호. RE56881)를 사용하여 측정하였다: 키트내에 공급되는 POD-접합된 항-인간 IgG 항체 대신, HRP-접합된 양 항-마우스 IgA (참조번호. BN-687-95/96 Serotec cat: STAR137P)를 2차 항체로서 사용하였다.
비장세포 기원의 RSV -특이적 세포 면역 반응의 검정. 상기 RSV F-, RSV G- 및 RSV M2-특이적 세포 반응은 그 밖에 기재된 바 (예를 들면 S.M. Varga et al. (2000); S. Johnstone et al. (2004); S. Jiang et al., (2002); 및 A.B. Kulkarni et al., J. Virol. 67(7):4086-4092 (1993) 참고)와 같은 특이적 펩티드로 비장세포의 재자극에 의한 마지막 투여 후 2주째에 및 ELISPOT 검정에 의한 비장 세포로부터 IFNγ 방출의 탐지 후 측정하였다.
ELISPOT 검정 방법. 상기 마우스 IFN-감마-키트 (BD Biosciences, 카탈로그 번호 551083)는 ELISPOT 검정을 위해 사용하였다. 상기 검정은 제조업자의 지침에 따라 수행하였다. 간략하게, 비장세포 단리 전날, 플레이트(plate)를 포획 항체로 피복하였다. 단리 후, 세포는 ELISPOT 플레이트로 전달하고 37℃에서 20시간 동안 상이한 펩티드(표 3 참조)로 자극하였다. IFNγ 생성은 탐지 항체를 사용하여 탐지하였다. 플레이트는 제조업자의 지침에 따라 BD™ ELISPOT AEC Substrate Set (BD Biosciences, 카탈로그 번호 551951)를 사용하여 현상하였다.
ELISPOT 자극 계획. 모든 조건은 중복 시험하였다. RSV-1, RSV-2, RSV-3, RSV-4, 및 RSV-5 펩티드 (표 3 참조)는 웰당 5×105 및 2.5×105의 비장세포를 자극하기 위해 5 μg/ml (1 μg/웰)의 최종 농도로 사용하였다. MVA (면역화 대조군)은 웰 당 5×105 및 2.5×105의 비장세포를 자극하기 위해 10의 감염 다중도(MOI)에서 사용하였고, 콘카나발린 A (ConA [양성 대조군])는 2.5×105의 비장세포를 자극하기 위해 0.5 μg/ml의 최종 농도에서 사용하였다. 음성 대조군으로서, 5×105의 비장세포는 단지 배지(글루타맥스, 페니실린, 스트렙토마이신, 10% 태아 소 혈청 및 105 M의 ß-마컵토에탄올(mercaptoethanol)이 보충된 RPMI-1640)에서 배양하였다.
표 3: RSV -특이적 자극
Figure 112021066173718-pat00004
BAL 유체 및 폐의 분석. BAL의 세포성 특성화는 염색 문제 때문에 가능하지 않았다. 폐 샘플 중의 RSV 부하량은 RSV 플라크 검정 및 RT-qPCR에 의해 측정하였다.
RSV 플라크 검정. 순간-동결된 폐 각각의 1/2은 프렌치 프레스를 사용하여 1ml의 냉 배지(7% 태아 소 혈청이 보충된 듈베코 개질된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium))에서 균질화하였다. 간략한 원심분리 후, 각각의 상청액의 2개의 튜브는 2배 연속 희석으로 48-웰 편평-바닥의 플레이트에서 성장한 베로(Vero) 세포 단층상에 적정하였다. 6일 후, 상기 단층을 세척하였고 1% 포름알데하이드로 고정시켰다. 24시간 후, 상기 단층을 0.04% 중성 레드로 염색하고 플라크를 계수하였다.
RSV RT- qPCR . 100 μl의 파쇄된 폐 조직을 즉시 제거하고 RNA를 제조원(Qiagen (카탈로그 번호 74104))으로부터의 RNeasy® 미니 키트를 사용하여 분리하였다. 상기 역전사 반응은 Applied Biosystems (카탈로그 번호 4387406))으로부터의 고성능 RNA 대 cDNA 키트를 사용하여 수행하였다. RSV L 유전자에 특이적인 PCR은 열 순환기에서 하기의 파라미터로 수행하였다: (1) 2분동안 50°C; (2) 10분동안 95°C; (3) 제조원(Applied Biosystems (카탈로그 번호 4352042))으로부터의 범용 PCR 마스터 믹스 및 3개의 프라이머 혼합물을 사용한 45 사이클 (95°C에서 15초, 60℃에서 1분): (1) 프라이머 1 (5'-GAA CTC AGT GTA GGT AGA ATG TTT GCA-3' 서열식별 번호 36); (2) 프라이머 2 (5'-TTC AGC TAT CAT TTT CTC TGC CAA T-3' 서열식별 번호 37); 및 (3) 프로브 6 (5'-TTT GAA CCT GTC TGA ACA TTC CCG GTT-3' (서열식별 번호 38). 카피수는 RSV L 유전자의 단편을 함유하는 pMISC202 플라스미드 벡터의 표준 곡선으로부터 측정하였다. 쥐 베타 액틴에 대한 유사 반응은 제조원(Applied Biosystems (카탈로그 번호 4351315))으로부터의 VIC/MGB 표지된 프로브를 사용하여 입력 cDNA에 대한 내부 대조군으로서 사용하였다.
연구 기록. 인-라이프 흐름 챠트는 생전 단계의 개별 단계 동안에 모든 정보를 수집하기 위해 작성하였다. 추가로, 마우스- 또는 케이지-특이적 정보는 상응하는 케이지 카드상에 기록하였다. 케이지 카드는 연구 미가공 데이터로서 고려되지 않지만 Upper Bavaria 정부로부터의 요구 사항이다.
검정 단계 흐름 챠트는 검정 단계의 개별 단계 동안에 모든 정보를 수집하기 위해 작성하였다. 검정은 검정-특이적 시험 기록 또는 연구 노트북에 기록하고 상호 참조문헌은 검정 단계 흐름 차트에 기록하였다. 미가공 데이터를 포함하는 모든 검정 기록은 표준 과정에 따라 검토하였다. 추가로, 혈청 샘플에 대한 샘플 추적 시트는 표준 과정에 따라 작성하였다.
데이터 프로세싱. 상기 미가공 데이터는 표준 과정에 따라 추가의 검정을 위해 상응하는 엑셀 파일로 전환시켰다.
ELISA. OD의 평균값 및 평균 표준 오차는 엑셀을 사용하여 산출하였다.
ELISPOT . ELISPOT 플레이트는 제조업자의 지침에 따라 CTL 판독기로 판독하였다. 스팟 형성 세포(SFC)의 수는 각각의 웰에 대해서 측정하고 추가의 평가를 위해 엑셀 파일로 전환하였다. 웰당 5×105 및 2.5×105로의 배양으로부터, 1×106 비장세포 당 스팟의 수는 각각의 웰에 대해 산출하였다. 음성 대조군에 대한 평균을 산출하고 마우스 당 평균값의 산출 전에 각각의 개별 값으로부터 공제하여 마우스 당 자극 지수(SI) 값(IFN-γ 방출 비장세포의 펩티드 특이적 빈도)을 수득하였다.
펩티드 자극을 위해, SI는 스팟이 너무 많아 RSV 면역화된 동물을 계수하지 못하는 경우를 제외하고는 5×105 및 2.5×105 세포를 갖는 웰로부터 수득하였다. 상기 경우에, 2.5×105 농도만을 사용하였다. MVA-BN 자극을 위해, SI는 스팟이 너무 많아 계수하지 못하는 경우를 제외하고는 5×105을 갖는 웰로부터 수득하였다. 상기 경우에, 2.5×105 농도를 사용하였다. 개별 동물에 대한 SI의 측정 후, SI (1×106 비장세포 당 SFC)의 평균 및 평균 표준 오차(SEM)은 그룹 당 산출하였다.
체중 변화. RSV 시도 전 개별 체중 값(그램으로)은 기준 값으로 취하였다. 이들 기준 값과 함께, 그룹의 평균 체중 변화 뿐만 아니라 개별 동물 체중 변화(%로)를 마이크로소프트 엑셀을 사용하여 시도 후 각각 모니터링된 시점에 대해 산출하였다.
RSV 플라크 검정. 바이러스의 3개의 최고 계수가능한 희석과 함께 플라크의 수를 웰에서 계수하였다. 이후 희석 인자에 의해 조정된 플라크의 평균수에 10을 곱하여 pfu/ml로 용액의 역가를 수득하고 최종적으로 2를 곱하여 폐 당 역가를 수득하였다.
RSV RT- qPCR. PCR 증폭은 제조원(Applied Biosystems (카탈로그 번호 4351107))으로부터의 ABI 7500을 사용하여 실시간으로 측정하고 제조원(Applied Biosystems)에 의해 공급된 시스템 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 모든 값은 L 유전자 표준과 비교하고 각각의 샘플에 대한 쥣과 베타-액틴 측정으로 정상화시켰다.
결과
체액성 면역 반응의 분석: 혈청 샘플로부터 RSV 특이적 IgG 항체 반응의 분석. 혈청은 먼저 재조합 RSV F 및 G 단백질만으로 피복된 플레이트를 사용하는 IBL-햄버그 키트를 기초로 하는 ELISA를 사용하여 검정하였다 (도 2 및 도 3). 도 2에 나타낸 바와 같이, 유사한 RSV-특이적 IgG 반응 (0.870 내지 1.347 범위의 OD)은 단일 면역화 후 및 면역화를 위해 사용된 경로(s.c. 또는 i.n.)와는 독립적으로 3개 모두의 작제물 (MVA-mBN199B, MVA-mBN201BΔM2 및 MVA-mBN201B)과 함께 관찰하였다. 제2 면역화는 항체 반응에서 2.0 내지 거의 3.5배 증가를 초래하였고(2.627 내지 3.407 범위의 OD), 제3 s.c. 주사는 B 세포 반응에 대해 최소의 효과만을 가져 제2 면역화 후 OD와 비교하여 대략적으로 0.500 OD 유닛의 증가를 생성시켰다. 유사한 결과는 재조합 RSV F 단백질로만 피복된 플레이트를 사용하는 IBL 햄버그 키트를 기초로하는 ELISA를 사용하여 수득하였다 (도 4).
혈청의 연속 희석 (1/100, 1/200 및 1/400) 후, RSV F- 및 RSV G-특이적 ELISA 결과는 MVA-mBN201BΔM2 및 MVA-mBN201B에 의한 절단된 RSV F 단백질 및 절단된 RSF G 단백질의 추가의 발현에도 불구하고 MVA-mBN199B, MVA-mBN201BΔM2 및 MVA-mBN201B가 유사한 RSF 및 RSV G 특이적 IgG 반응을 유도하였음을 보여주었다(도 3). 상기 작제물로 2회 s.c. 면역화 후, 상기 B-세포 반응은 단독의 RSV (양성 대조군)로의 면역화와 비교하여 여전히 낮았다. RSV의 2회 i.n. 적용에 의해 유도된 항체 반응의 수준에 도달하기 위해서는 MVA-mBN 작제물을 사용한 제3 s.c. 면역화가 요구되었다. 대조적으로, MVA-mBN199B 및 MVA-mBN201B를 사용한 2회 i.n. 면역화는 IBL 햄버그 키트를 기초로 하는 ELISA를 사용하여 분석되는 경우 단독의 RSV로 두 면역화 또는 MVA-mBN199B, MVA-mBN201BΔM2 및 MVA-mBN201B를 사용한 3회 s.c. 면역화와 유사한 B 세포 반응을 유도하였다 (도 3).
혈청을 RSV 용해물로 피복된 플레이트를 사용하는 세리온 키트를 기초로 하는 ELISA에 의해 다시 분석하는 경우, MVA-mBN199B, MVA-mBN201BΔM2 및 MVA-mBN201B간에는 차이가 발견되지 않았다. 2회 및 3회 면역화, 또는 s.c. 및 i.n. 투여 경로간에도 또한 차이가 관찰되지 않았다. 추가로, 상기 반응은 모두 RSV의 2회 i.n. 적용에 의해 유도된 항체 반응 보다 낮았다 (도 5).
RSV -특이적 IgA 항체 반응의 검정. RSV F- 및 RSV G-특이적 IgA (IBL 햄버그 키트를 기초로 하는)는 시도 4일 후 (53일째) BAL 유체에서 측정하였다. 추가로, 또한 RSV F- 및 RSV G-특이적 IgG에 대한 BAL 및 혈청을 ELISA에 의해 검정하였다. 결과는 시도 바로 전(48일째)에 혈청에서 수득된 결과와 비교하고 도 6에 나타낸다.
예상된 바와 같이, IgA 반응은 RSV, MVA-mBN199B 및 MVA-mBN201B를 사용한 i.n. 적용 후에만 탐지되었다. IgG가 또한 BAL에서 탐지될 수 있었지만, IgA는 i.n. 적용 후 보다 높은 수준으로 탐지되었다. IgA의 혈청 수준은 적용 경로와는 무관하게 IgG 수준 보다 훨씬 낮았다.
RSV -특이적 세포 면역 반응의 검정. T-세포 반응은 마지막 투여 후 2주째에 ELISPOT에 의해 비장에서 검정하였다 (도 7). i.n. 또는 s.c. 경로에 의해 투여된 MVA-mBN199B는 강한 RSV-F 특이적 T-세포 반응을 유도하였다. 상기 면역 반응은 주로 RSV-M2의 부재하에 면역우성인 RSV-F-특이적 펩티드 RSV-2에 대해 지시된다. 상기 반응은 2번째 s.c. 면역화 후 106 비장세포 당 약 2000 스팟이고, 3번째 s.c. 주사 또는 2번째 비강내 적용 후에는 약 4000이었다. RSV 비강내 적용에 대한 반응과 유사하게, 펩티드 RSV-4에 대한 낮은 G-특이적 반응은 MVA-mBN199B로 면역화 후 탐지하였고(106의 비장세포 당 대략적으로 500 스팟), 예상된 바와 같이, MVA-mBN199B는 M2-특이적 T-세포를 유도하지 않았다. 상기 M2 펩티드는 마우스에서 RSV의 면역-우성 펩티드이다. 결과적으로, RSV 비강내 면역화는 106 비장세포 당 1000 스팟 이상의 우수한 M2-특이적 T-세포 반응을 유도하였고 F-특이적 T-세포 반응에 대해서는 거의 유도하지 않았다.
MVA-mBN199B 처럼, MVA-mBN201B는 강한 T-세포 반응을 유도하였지만 이것은 M2에 의해 지배되었다(투여되는 용량 또는 투여 경로와 독립적으로 106 비장세포 당 4000 스팟 초과). 심지어 MVA-mBN201B에 의해 유도된 G-특이적 반응은 MVA-mBN199B 또는 RSV에 의해 유도된 G-특이적 반응 보다 적어도 3배 높다. MVA-mBN199B와는 대조적으로, MVA-mBN201B에 의해 유도된 F-특이적 반응은 RSV-2 펩티드에 대한 106 비장세포 당 600 스팟 미만으로 훨씬 낮았다.
RSV A2 균주로 RSV 시도. 마우스에는 마지막 면역화 후 2주째에 106 pfu의 RSV(A2)로 비강내 시도 하였다. 체중은 매일 모니터링하였다. 시도 후 4일째에 마우스를 희생시켰다. 1ml의 PBS로 폐 세척 후, 폐를 제거하고 폐내 RSV 부하량은 상기된 바와 같이 수행되는 플라크 검정 및 RT-qPCR에 의해 측정하였다.
체중 변화. 모든 마우스는 시도-후 1일째에, 가장 가능하게는 마취 및 i.n. 시도 자체로 인해 체중이 감량되었다 (도 8). TBS-처리된 마우스는 RSV 시도-후 4일째에 체중이 상당한 수준으로 감량하기 시작했다. 대조적으로, 3번째 RSV를 비강내 투여받은 마우스는 체중 감량을 나타내지 않았다. MVA-mBN199B, MVA-mBN201B 또는 MVA-mBN201BΔM2로 s.c.로 면역화된 모든 마우스는 시도 후 4일째에 약 20%의 체중이 감량되었다. 상기 체중 감량은 Olszewska et al. (Vaccine 23:215 (2004))에 의하여 앞서 기술되었다. 그러나, 본 발명의 RT-qPCR 결과 (도 10)는 이것이 1차 RSV 감염의 정상적인 제거와 비교하여 백신-프라이밍된 CTL 반응을 통한 우수한 보호 및 폐로부터의 조기 제거와 상호관련됨을 보여준다. i.n.으로 적용되는 경우, MVA-mBN201B 면역화된 마우스는 시도 2일 후 s.c. 면역화된 마우스와유사한 체중 감량을 가졌지만 s.c. 경로와 비교하여 폐내 낮은 RSV 부하량으로 인해 시도 4일 후 회복하였다 (도 10). RSV-면역화된 그룹 처럼, MVA-mBN199B으로 i.n. 면역화된 마우스는 어떠한 체중 감량을 나타내지 않았다.
플라크 검정에 의해 측정된 RSV 부하량. 시도 후 4일째에, 비-면역화된 마우스에 대한 폐당 57671 pfu의 평균이 탐지되었다 (도 9). RSV-면역화된 대조군에서와 같이, RSV A2 플라크는 2회 s.c. 또는 i.n. 적용 후 MVA-mBN199B, MVA-mBN201B 또는 MVA-mBN201BΔM2로 면역화된 동물의 폐에서 탐지되지 않았다.
정량적 실시간 PCR에 의해 측정된 RSV 부하량. 폐내 RSV 부하량은 또한 RT-qPCR로 검정하였다 (도 10). RSV는 백신접종된 마우스의 임의의 것에서 플라크 검정에 의해 탐지되지 않았지만 RSV 게놈은 MVA-mBN199B로 3회 면역화된 마우스에서 여전히 탐지가능하였다. MVA-mBN199B로 3회 면역화한 후, 상기 RSV 부하량은 TBS 대조군 그룹과 비교하여 38배 낮았다. RSV 게놈은 또한 MVA-mBN201B로 3회 면역화한 후 탐지하였지만 상기 부하량은 TBS 대조군 그룹과 비교하여 158배 낮았다. 2회 또는 3회 면역화된 마우스간에는 주요한 차이가 없었다. 흥미롭게도, MVA-mBN201B로 관찰된 RSV 부하량의 감소는 MVA-mBN199B와 동등한 M2가 부재인 MVA-mBN201BΔM2로 백신 접종 후에는 관찰되지 않았다.
RSV로 처리된 그룹에서 수득된 것과 상응하는 거의 완전한 보호는 MVA-mBN201B로 i.n. 면역화 후 관찰되었지만 여러 카피의 L 유전자는 5마리 중 1마리의 마우스에서 여전히 탐지가능하였다. MVA-mBN199B로의 비강내 면역화는 또한 RSV 부하량에서 강한 감소를 유도하였지만, 상기 L 유전자는 4마리 중 3마리의 마우스에서 낮은 수준으로 여전히 탐지되었다.
토론 및 결론
MVA-mBN201B는 MVA-mBN199B 작제물에 또한 포함된 전체 길이의 RSV F 및 G 단백질 뿐만 아니라 절단된 버전의 RSV F 및 G 단백질을 발현하였지만, MVA-mBN201B는 유사한 정도의 체액성 면역 반응을 유도하였다. 작제물 둘다는 RSV F 및 G ELISA와 비교하여 RSV F 단독의 ELISA에서 측정된 유사하게 우수한 반응에 의해 판단되는 바와 같은 RSV F 단백질에 대해 대부분 지시된 항체 반응을 유도하였다. 2회 i.n. 적용 후 항체 수준은 2회 s.c. 적용 후 보다 높았다. 3번째 s.c. 적용은 2회 i.n. 적용에 의해 유도되는 항체 반응 수준에 도달하기 위해 요구되었다. 대조적으로, i.n. 경로에 비해 s.c.를 사용하거나 3회 s.c. 적용에 비해 2회 적용을 사용하여 유도된T-세포 반응에서 주요한 차이가 관찰되지 않았다. 그러나, MVA-mBN199B는 우수한 RSV F 특이적 세포성 반응을 유도하는 반면, MVA-mBN201B에 의한 강한 M2-특이적 T-세포 반응이 관찰되었다. MVA-mBN201B에 의해 유도된 상기 RSV G-특이적 반응은 또한 MVA-mBN199B에 비해 보다 현저하였다. MVA-mBN201B에 의해 유도된 T 세포 반응의 패턴은 많이 높다하더라도 RSV 면역화에 의해 유도된 T 세포 반응과 유사하였다.
적용 경로 또는 횟수와 독립적으로, 작제물 둘다는 RSV(A2)를 사용한 시도으로부터 마우스를 보호하였고, 어떠한 복제 바이러스도 폐로부터 회수될 수 없었다. 그러나, 이전에 관찰된 바와 같이, MVA-mBN199B 또는 MVA-mBN201B로의 s.c. 면역화는 무균성 면역력(즉, 표적화된 감염성 제제가 몸체로부터 제거된 후에도 지속되는 면역력)을 유도하지 못하였다. MVA-mBN199B 또는 MVA-mBN201B 의 s.c. 적용에 의해 면역화된 마우스의 폐에서 게놈성 RSV 부하량(바이러스 RNA 폴리머라제 (L) 유전자의 수준에 의해 측정된)은 상당히 감소하였지만 정량적 RT-PCR에 의해 여전히 탐지될 수 있었고 제3 s.c. 면역화는 RSV-특이적 IgG 수준에서의 이의 증가에도 불구하고, 바이러스 부하량에 대해서는 이로운 영향을 주지않았다. RSV L 단백질 발현에서의 감소는 MVA-mBN199B와 비교하여 MVA-mBN201B로의 백신 접종후 보다 더 현저하였지만 이는 증가된 M2-특이적 CD8+ T-세포 반응으로 인한 것일 수 있는데, 이는 RSV 게놈 부하량이 MVA-mBN199B 처럼 MVA-mBN201B로 백신 접종된 동물에 대해서보다 MVA-mBN201B
Figure 112021066173718-pat00005
M2로 백신 접종된 동물에서 보다 높았기 때문이다.
무균성 면역력은 MVA-mBN199B 또는 MVA-mBN201B의 2회 i.n. 적용후 거의 수득되었다. 상기 관찰은 점막 감염 부위에서 RSV-특이적 IgA의 유도 및 분비와 서로 관련된다.
실시예 3: FI - RSV와 비교하여 RSV F 단백질, RSV G 단백질, RSV N 단백질, 및 RSV M2 단백질을 발현하는 재조합 MVA 백신의 안전성.
백신 후보물 MVA-mBN199B는 RSV의 당단백질(G) 및 융합(F) 단백질을 인코딩하지만 MVA-mBN201B은 RSV의 전체 길이의 단백질 뿐만 아니라 절단된 버전의 F 및 G, 뉴클레오캡시드 단백질(N) 및 매트릭스 단백질(M2)를 발현한다(도 1 참조). 이들 실험의 목적은 피하 투여(s.c.) 또는 비강내(i.n.) 투여 경로를 통한 2회 면역화 후 FI-RSV와비교하여 MVA-mBN199B 및 MVA-mBN201B의 안전성을 검정하는 것이었다.
이들 작제물의 안전성은 BALB/c 마우스에서 RSV(A2) 시도 모델을 사용하여 시험하였다. MVA-mBN199B 또는 MVA-mBN201B를 사용한 2회 면역화는 FI-RSV와 비교하여 RSV(A2) 시도 후 BAL에서 증가된 IL4 및 IL5 분비를 유도하지 못했다.
연구 설계
마우스는 표 x에 따라 1×108 TCID50 MVA-mBN199B (그룹 3 및 4), 1×108 TCID50 MVA-mBN201B (그룹 5 및 6)으로 3주 간격으로 피하(s.c.) 또는 비강내(i.n.)로 2회 처리하였다. 3개의 대조군 그룹은 표 x에 따라 TBS (그룹 1)으로 2회 (s.c.) 처리하거나 RSV (그룹 2)로 2회 i.n.으로 처리하거나 30μg FI-RSV(그룹 7) 로 2회 i.m.으로 처리하였다. 35일째에, 마우스에는 (i.n.)으로 106 pfu RSV A2를 시도하였다. 시도 후 4일째에, 마우스는 상승된 용량의 케타민-크실라진을 주사하여 희생시키고 채혈-종료하였다. 폐 세척 후, IL4 및 IL5 수준은 ELISA에 의해 BAL에서 분석하였다.
표 4: 실험 설계
Figure 112021066173718-pat00006
제1 면역화에 상대적인 %.
# 마우스에는 비강내 경로로 106 pfu의 RSV A2를 시도하였다. 시도 후 4일째에, 마우스에서 채혈하고 마취하여 희생시켰다. BAL 유체를 샘플 채취하였다.
연구 스케줄. 인-라이프 단계의 스케줄은 표 y에 요약한다.
표 5: 인- 라이프 단계의 연구 스케줄
Figure 112021066173718-pat00007
** 1번째 면역화의 날에 상대적인.
재료 및 방법
실험 동물 . 7주령의 암컷 BALB/cJ Rj (H-2d) 마우스는 젠비어(Janvier) (Route des Chenes Secs, F-53940 Le Genest-Saint-Isle, France)로부터 수득하였다. 모든 마우스는 특이적 병원체가 없다.
하우징 . 상기 연구는 Bavarian Nordic-Martinsreid의 동물 설비의 117호실에서 수행하였다. 상기 유닛에 20-24℃의 온도 및 40% 내지 70%의 상대 습도에서 여과된 공기를 제공하였다. 상기 방에는 14시간의 광 및 10시간의 암 사이클로 인공적으로 조명하였다. 상기 연구 순응 기간은 15일이었다. . 상기 동물은 바닥 면적이 530 cm²인 투명한 SealSafe™케이지 (H Temp [polysulfon] cage Type II L - Euro standard)에 하우징시켰다. 상기 케이지는 H-Temp SealSafe™뚜껑으로 덮었다. 상기 케이지는 HEPA-여과된 공기를 별도로 모든 단일 케이지에 제공하는 SLIMLine™ 순환 유닛이 장착된 TECNIPLAST-IVC SealSafe™시스템에 위치시켰다. 동물 잠자리는 1주에 1회 변화시켰다.
식이 및 물. 마우스는 조사된 유지 식이 (SSNIFF R/M-H, irradiated, V1534-727) 및 물 (20분동안 121 °C에서 오토클레이빙함)에 자유롭게 접근가능하게 한다.
전처리 과정: 동물의 식별. 각각의 케이지내 동물을 개별적으로 표시하기 위해, 귀 펀칭은 표준 과정에 따라 수행하였다.
내포/배제 조사. 내포/배제 조사는 표준 과정에 따라 수행하였다.
사전 채혈을 위한 혈액 샘플링. 대략 150 μl의 혈액 샘플은 표준 과정에 따라 안면 정맥 천공에 의해 수득하였다. 혈액 샘플은 표준 과정에 따른 추가의 프로세싱을 위해 연구소로 보냈다.
처리 과정: 시험 항목 및 레퍼런스 항목의 제조 및 투여. 시험 및 표준 항목의 제조 및 투여는 표준 과정에 따라 클래스 II 미생물학적 안전성 캐비넷 II (HERAsafe®/분류 II 유형 H, Kendro)에서 수행하였다. 간략하게, s.c. 투여를 위해, 재조합 MVA는 TBS 중에 희석시켜 2×108 TCID50/ml의 농도를 갖는 작용액을 수득하였다. 500μl 중의 1×108 TCID50은 표준 과정에 따라 s.c.로 주사하였다. i.n. 투여를 위해, 재조합 MVA는 TBS 중에 희석시켜 2×109 TCID50/ml의 농도를 갖는 작용액을 수득하였다. 50 μl의 희석된 바이러스는 표준 과정에 따라 마취된 (크실라진/케타민) 마우스의 하나의 콧구멍에 투여하였다. 500μl TBS는 표준 과정에 따라 s.c.로 투여하였다.
RSV (A2) 바이러스의 제조 및 투여. 상기 RSV 스톡 바이알을 해동시키고 바이러스 불안전성(빙상에서 최대 15분)때문에 가능한한 빨리 사용하였다. 바이러스를 계속 빙상에 유지시키고 표준 과정에 따른 비강내 경로에 의해 100 μl의 순수 바이러스 용액으로 마취된(크실라진/케타민) 마우스를 시도하기 위해 즉시 사용하였다.
FI - RSV의 제조 및 투여. 40μl 중 30μg FI-RSV를 근육내 주사하였다.
안락사. 35일째에 남아있는 마우스에 2배 용량의 케타민-크실라진을 복강내 주사하여 투여하고 안락사는 복강내 대동맥을 절단하여 수행하였다.
폐 세척. 기관지폐포 세척 (BAL) 유체는 1ml의 PBS로 4회 폐를 세정함에 의해 수거하였다.
분석
IL-4 및 IL-5 수준은 시판되는 ELISA 키트(제조원(eBIOSCIENCE Cat N° BMS613)으로 부터의 mIL4 PLATINUM ELISA 및 제조원(eBIOSCIENC Cat N° 88-7054-22)으로부터 READY-SET-GO MIL-5 ELISA)을 사용하여 기관지폐포 세척(BAL) 상등액에서 측정하였다.
연구 기록. 인-라이프 유동 챠트는 생전 단계의 개별 단계들 동안에 모든 정보를 수집하기 위해 작성하였다. 추가로, 마우스 - 또는 케이지-특이적 정보는 상응하는 케이지 카드상에 기록하였다. 케이지 카드는 연구 미가공 데이터로서 고려되지 않았지만 Upper Bavaria의 정부로부터의 요구사항이다.
분석 단계 흐름 챠트는 합성 단계의 개별 단계 동안에 모든 정보를 수집하기 위해 작성하였다. 검정은 검정-특이적 시험 기록 또는 연구 노트북에 기록하고; 상호 참조문헌은 분석 단계 흐름차트에 기록하였다. 미가공 데이터를 포함하는 검정 기록은 표준 과정에 따라 검토하였다. 추가로, 혈청 샘플에 대한 샘플 추적 쉬트는 표준 과정에 따라 작성하였다.
데이터 프로세싱. 상기 미가공 데이터는 표준 과정에 따라 추가의 검정을 위해 상응하는 엑셀 파일로 전환하였다.
ELISA. 시토카인 농도는 반복되는 ELISA 키트의 표준 곡선으로부터 측정하였다.
결과
FI-RSV와 함께 관찰된 것과 같이 IL-4 (도 11) 및 IL-5(도 12)의 증가는 MVA-mBN199B 또는 MVA-mBN201B에 대해서는 관찰되지 않았다. 시토카인 둘다는 마우스가 MVA-mBN199B 또는 MVA-mBN201B로 i.n.으로 면역화되는 경우 탐지 수준 미만이었다.
토론 및 결론
MVA-mBN199B 및 MVA-mBN201B 둘다는 TH2 반응에 의한 평가시 FI-RSV와 비교하여 증진된 질환을 유도하지 않았다.
실시예 4: RSV F 단백질, RSV G 단백질, RSV N 단백질, 및 RSV M2 단백질을 발현하는 상이한 재조합 MVA 백신의 면역원성 효능 및 안전성의 비교.
백신 후보 MVA-mBN199B는 RSV의 당단백질 (G) 및 융합 (F) 단백질을 인코딩하고, MVA-mBN201B는 RSV의 전체 길이 단백질 뿐만 아니라 절단된 버전의 F 및 G, 뉴클레오캡시드 단백질(N) 및 매트릭스 단백질(M2)을 발현하고, MVA-mBN294B는 RSV의 하나의 F 및 2개의 G 전체 길이 단백질, 뉴클레오캡시드 단백질(N) 및 매트릭스 단백질(M2)을 발현한다 (도 1 참조). MVA-mBN294A은 여전히 하나의 클로닝 카세트를 갖는 클로닝 MVA-mBN294B내 중간체 생성물에 있다. 상기 클로닝 카세트는 전이유전자 발현 또는 전이성 단백질의 면역원성 성질을 영향을 주지않는다. 상기 실험의 목적은 피하 (s.c.) 경로 투여를 통한 2회 면역화 후 MVA-mBN199B 및 MVA-mBN201B와 비교하여 MVA-mBN294A의 면역원성, 효능 및 안전성을 검정하는 것이다.
이들 작제물의 면역원성 효능 및 안전성은 BALB/c 마우스에서 RSV(A2) 시도 모델을 사용하여 시험하였다. 본 발명자는 MVA-mBN201B과 비교하여 MVA-mBN294A(MVA-mBN294B에 상응함)에서의 변화에도 불구하고 이것이 유사한 B- 및 T-세포 반응을 유도하고 유사한 보호를 제공했음을 확인했다. 상기 실험은 RSV 막 당단백질(F 또는 G)의 적어도 하나의 항원성 결정인자 및 RSV 뉴클레오캡시드 단백질(N 또는 M2)의 적어도 하나의 항원성 결정인자를 발현하는 작제물 (MVA-mBN201B 또는 MVA-mBN294A)은 RSV 막 당단백질 (MVA-mBN199B)의 유일한 항원성 결정인자를 발현하는 작제물 보다 우수한 보호를 유도함을 보여주었다.
연구 설계
마우스에는 표 6에 따른 프라임-부스트 스케줄(0 및 21일째)에서 1x108 TCID50 MVA-mBN294A, MVA-mBN199B 또는 MVA-mBN201B로 백신접종(s.c.) 하였다. 상기 대조군 그룹은 표 6에 따라 TBS 또는 RSV-A2로 2회 피하내 처리하였다. 포르말린 불활성화된 (FI)-RSV는 표 6에 따라 1회 또는 2회 근육내(i.m) 주사하였다.
혈액은 희생하는 날 뿐만 아니라 각각 면역화 및 시도 하루 전날에 수거하였다. 34일째에 그룹 1 내지 5의 5마리 동물에 대해, RSV-특이적 IgG 역가 및 RSV-특이적 중화 항체 역가는 각각 ELISA 및 PRNT에 의해 측정하였다.
34일째에, 일부 마우스(표 6)는 치사량의 케타민-크실라진을 주사하여 희생시키고 최종 채혈하였다. 비장은 제거하고 ELISPOT에 의한 RSV 특이적 T 세포 반응의 검정을 위해 준비하였다.
35일째에, 남아있는 마우스 (표 6)에는 106 pfu RSV-A2로 시도하였다. 시도 후 4일째에, 마우스는 치사량의 케타민-크실라진을 주사하여 희생시키고 최종 채혈하였다. 폐 세척 후, 상기 폐를 제거하고 RSV 부하량은 플라크 검정 및 RT-qPCR에 의해 분석하였다. 세포성 침윤, 및 기관지폐포 세척(BAL) 유체에서 시토카인 수준을 분석하였다.
표 6: 실험 설계
Figure 112021066173718-pat00008
1:면역화에 상대적인 %
2:마우스에는 비강내 경로로 106 pfu의 RSV-A2를 시도한다. 시도 후 4일째에, 마우스에서 채혈하고 마취하에 희생시키고 BAL 및 폐를 샘플링할 것이다
&: 34일째, 이들 마우스를 희생시키고 비장은 ELISPOT으로 검정한다
연구 스케줄. 인-라이프 단계의 스케줄은 표 7에 요약한다.
표 7: 인- 라이프 단계의 파트 1의 연구 스케줄
Figure 112021066173718-pat00009
1: 첫번째 면역화의 날에 상대적인
재료 및 방법
실험 동물 . 7주령에 암컷 BALB/cJ Rj (H-2d) 마우스는 기관(Janvier (Route des Chenes Secs, F-53940 Le Genest-Saint-Isle, France))으로부터 수득하였다. 모든 마우스는 특이적 병원체가 없다.
하우징 . 상기 연구는 Bavarian Nordic-Martinsreid의 동물 설비의 117호실에서 수행하였다. 상기 유닛에 20-24℃의 온도 및 40% 내지 70%의 상대 습도에서 여과된 공기를 제공하였다. 상기 방에는 14시간의 광 및 10시간의 암 사이클로 인공적으로 조명하였다. 상기 연구 순응 기간은 15일이었다. . 상기 동물은 바닥 면적이 530 cm²인 투명한 SealSafe™케이지 (H Temp [polysulfon] cage Type II L - Euro standard)에 하우징시켰다. 상기 케이지는 H-Temp SealSafe™ 뚜껑으로 덮었다. 상기 케이지는 HEPA-여과된 공기를 별도로 모든 단일 케이지에 제공하는 SLIMLine™ 순환 유닛이 장착된 TECNIPLAST-IVC SealSafe™ 시스템에 위치시켰다. 동물 잠자리는 1주에 1회 변화시켰다.
식이 및 물. 마우스는 조사된 유지 식이 (SSNIFF R/M-H, 조사된(irradiated), V1534-727) 및 물 (20분동안 121℃에서 오토클레이빙함)에 자유롭게 접근가능하게 한다.
전처리 과정:
동물의 식별. 각각의 케이지내 동물을 개별적으로 표시하기 위해, 귀 펀칭은 표준 과정에 따라 수행하였다.
내포/배제 조사. 내포/배제 조사는 표준 과정에 따라 수행하였다.
사전 채혈을 위한 혈액 샘플링. 대략 150 μl의 혈액 샘플은 표준 과정에 따라 안면 정맥 천공에 의해 수득하였다. 혈액 샘플은 표준 과정에 따른 추가의 프로세싱을 위해 연구소로 보냈다.
처리 과정: 시험 항목 및 레퍼런스 항목의 제조 및 투여. 시험 및 표준 항목의 제조 및 투여는 표준 과정에 따라 클래스 II 미생물학적 안전성 캐비넷 II (HERAsafe®/분류 II 유형 H, Kendro)에서 수행하였다. 간략하게, s.c. 투여를 위해, 재조합 MVA는 TBS 중에 희석시켜 2×108 TCID50/ml의 농도를 갖는 작용액을 수득하였다. 500μl 중의 1×108 TCID50은 표준 과정에 따라 s.c.로 주사하였다. 500μl TBS는 표준 과정에 따라 s.c.로 투여하였다.
RSV (A2) 바이러스의 제조 및 투여. 상기 RSV 스톡 바이알을 해동시키고 바이러스 불안전성(빙상에서 최대 15분)때문에 가능한한 빨리 사용하였다. 바이러스를 계속 빙상에 유지시키고 표준 과정에 따른 비강내 경로에 의해 100 μl의 순수 바이러스 용액으로 마취된(크실라진/케타민) 마우스를 시도하기 위해 즉시 사용하였다.
FI - RSV의 제조 및 투여: 50μl의 FI-RSV를 i.m.으로 적용하였다.
후처리 과정들:
혈액 샘플링. 혈액 샘플 (대략 150 μl)은 표준 과정에 따라 안구 뒤쪽 또는 안면 정맥 천공(상세하게는 표 7을 참조한다)에 의해 수득하였다. 혈액 샘플은 표준 과정에 따른 추가의 프로세싱을 위해 연구소로 보냈다.
안락사. 마우스에 2배 용량의 케타민-크실라진을 복강내 주사하여 투여하고 안락사는 복강내 대동맥 절단에 의해 수행하였다.
비장 제거. 비장은 무균적으로 제거하였다. 이들은 표준 과정에 따라 배지로 채워진 튜브에 위치시켰다. 이들 튜브는 동물 설비로 도입하고 이어서 표준 과정에 따라 배출시켰다.
폐 세척 및 폐 제거. 기관지폐포 세척 (BAL) 유체는 폐를 1ml의 PBS로 4회 세정하여 수거하였다. 이어서 폐를 제거하고 후속적 플라크 검정 및 RNA 추출을 위해 액체 질소에서 2등분으로 순간 동결시켰다.
분석:
혈액 샘플 프로세싱 및 혈청의 보관. 연구소로 보낸 후, 혈액 샘플은 표준 과정에 따라 혈청으로 프로세싱하였다. 제조 후, 상기 혈청은 분석을 위해 요구될 때까지 -20℃ (± 5℃)에서 보관하였다.
혈청 샘플로부터의 RSV -특이적 항체 역가의 검정. 상기 총 RSV-특이적 IgG ELISA 역가는 개질된 ELISA 키트 (Serion ELISA classic, 카탈로그 번호 ESR113G)를 사용하여 모든 혈청 샘플로부터 측정하였다: 키트와 함께 제공된 알칼린 포스파타제-접합된 항-인간 IgG 항체 대신에, 알칼리 포스파타제 접합된 염소 항-마우스 IgG (Serotec cat: 103004)를 2차 항체로서 사용하였다.
혈청 샘플로부터의 RSV -특이적 중화 항체 역가의 검정. 간략하게, 시험 혈청의 2배 연속 희석물을 제조하고, 한정된 수의 RSV 플라크 형성 유닛(pfu)를 상기 희석물에 첨가하였다. 36℃ (±2℃) 및 5% CO2 (±1%)에서 185분 인큐베이팅 후 베로(Vero) 세포를 함유하는 사전-시딩된 플레이트에 첨가하였다. 2일 후 플레이트를 고정시키고 RSV-특이적 항체 플라크의 혼합물로 면역 염색하고 플라크를 계수하였다.
비장세포로부터의 RSV -특이적 세포 면역 반응의 검정. 상기 RSV F-, 및 RSV M2-특이적 세포 반응은 그 밖에 기재된 바와 같은 특이적 펩티드로 비장세포의 재자극에 의한 마지막 투여 후 2주째에 및 ELISPOT 검정에 의한 비장 세포로부터 IFNγ 방출의 탐지 후 측정하였다.
ELISPOT 검정 방법. 상기 마우스 IFN-감마-키트 (BD Biosciences, 카탈로스 번호 551083)는 ELISPOT 검정을 위해 사용하였다. 상기 검정은 제조업자의 지침에 따라 수행하였다. 간략하게, 플레이트들은 비장세포 단리 전날 포획 항체로 피복하였다. 단리 후, 세포는 ELISPOT 플레이트로 전달하고 37℃에서 20시간 동안 상이한 펩티드(표 3 참조)로 자극하였다. IFNγ 생성은 탐지 항체를 사용하여 탐지하였다. 플레이트는 제조업자의 지침에 따라 BD™ ELISPOT AEC 기질 세트(Substrate Set) (BD Biosciences, 카탈로그 번호 551951)를 사용하여 현상하였다.
ELISPOT 자극 계획. 모든 조건은 중복 시험하였다. RSV-2 및 RSV-5 펩티드 (표 8 참조)는 웰당 5×105 및 2.5×105의 비장세포를 자극하기 위해 5 μg/ml (1 μg/웰)의 최종 농도로 사용하였다. MVA (면역화 대조군)은 웰 당 5×105 및 2.5×105의 비장세포를 자극하기 위해 10의 감염 다중도(Multiplicity)에서 사용하였고, 콘카나발린 A (ConA [양성 대조군])는 2.5×105의 비장세포를 자극하기 위해 0.5 μg/ml의 최종 농도에서 사용하였다. 음성 대조군으로서, 5×105의 비장세포는 단지 배지(글루타맥스, 페니실린, 스트렙토마이신, 10% 태아 소 혈청 및 105 M의 ß-마컵토에탄올(mercaptoethanol)이 보충된 RPMI-1640)에서 배양하였다.
표 8: RSV -특이적 자극
Figure 112021066173718-pat00010
BAL 유체의 분석:
2개의 슬라이드는 100 μl의 BAL 유체의 사이토스핀 원심분리(800rpm. 5분)에 의해 제조하였다. 슬라이드는 밤새 건조시키고 이어서 염색시켰다. 슬라이드는 현미경으로 검정하여 호산구 및 호중구의 %를 측정하였다. 이후, BAL의 나머지는 원심분리하였다 (12,000 rpm 5 분). 제조 후, BAL 상청액은 검정때까지 -20℃ (± 5℃)에서 보관하였다. IL-4 및 IL-5 수준은 시판되는 ELISA 키트 (제조원(eBIOSCIENCE Cat N° BMS613) 기원의 mIL4 PLATINUM ELISA 및 제조원(eBIOSCIENCE Cat N° 88-7054-22) 기원의 READY-SET-GO MIL-5 ELISA)를 사용하여 기관지폐포 세척(BAL) 상등액 중에서 측정하였다.
폐내 RSV 부하량의 분석
폐 샘플 중의 RSV 부하량은 RSV 플라크 검정 및 RT-qPCR에 의해 측정하였다.
RSV 플라크 검정. 순간-동결된 폐 각각의 절반은 프렌치 프레스를 사용하여 1ml의 냉 배지(7% 태아 소 혈청이 보충된 듈베코 개질된 이글 배지)에서 파쇄시켰다. 간략한 원심분리 후, 각각의 상등액의 2개의 튜브는 2배 연속 희석으로 48웰 평저 플레이트에서 성장한 베로(Vero) 세포 단층상에 적정하였다. 6일 후, 상기 단층을 세척하였고 1% 포름알데하이드로 고정시켰다. 24시간 후, 상기 단층을 0.04% 중성 레드로 염색하고 플라크를 계수하였다.
RSV RT- qPCR . 100 μl의 파쇄된 폐 조직을 즉시 제거하고 RNA를 제조원(Qiagen (카탈로그 번호 74104))으로부터의 RNeasy® 소형 키트를 사용하여 분리하였다. 상기 역전사 반응은 제조원(Applied Biosystems (카탈로그 번호 4387406))으로부터의 고성능 RNA 대 cDNA 키트를 사용하여 수행하였다. RSV L 유전자에 특이적인 PCR은 열 순환기에서 하기의 파라미터로 수행하였다: (1) 2분동안 50℃; (2) 10분동안 95℃; (3) Applied Biosystems (카탈로그 번호 4352042)으로부터의 범용 PCR 마스터 믹스 및 3개의 프라이머 혼합물을 사용한 45 사이클 (95℃에서 15초, 60℃에서 1분): (1) 프라이머 1 (5'-GAA CTC AGT GTA GGT AGA ATG TTT GCA-3' 서열식별 번호 36); (2) 프라이머 2 (5'-TTC AGC TAT CAT TTT CTC TGC CAA T-3' 서열식별 번호 37); 및 (3) 프로브 6 (5'-TTT GAA CCT GTC TGA ACA TTC CCG GTT-3' (서열식별 번호 38). 카피수는 RSV L 유전자의 단편을 함유하는 pMISC202 플라스미드 벡터의 표준 곡선으로부터 측정하였다. 쥐 베타 액틴에 대한 유사 반응은 제조원(Applied Biosystems (카탈로그 번호 4351315))으로부터의 VIC/MGB 표지된 프로브를 사용하여 입력 cDNA에 대한 내부 대조군으로서 사용하였다.
연구 기록.
인-라이프 유동 챠트는 생전 단계의 개별 단계들 동안에 모든 정보를 수집하기 위해 작성하였다. 추가로, 마우스 - 또는 케이지-특이적 정보는 상응하는 케이지 카드상에 기록하였다. 케이지 카드는 연구 미가공 데이터로서 고려되지 않았지만 Upper Bavaria의 정부로부터의 요구사항이다.
분석 단계 흐름 차트는 합성 단계의 개별 단계 동안에 모든 정보를 수집하기 위해 작성하였다. 검정은 검정-특이적 시험 기록 또는 연구 노트북에 기록하고; 상호 참조문헌은 분석 단계 흐름차트에 기록하였다. 미가공 데이터를 포함하는 검정 기록은 표준 과정에 따라 검토하였다. 추가로, 혈청 샘플에 대한 샘플 추적 시트는 표준 과정에 따라 작성하였다.
데이터 프로세싱. 상기 미가공 데이터는 표준 과정에 따라 추가의 분석을 위해 상응하는 엑셀 파일로 전환하였다.
ELISA. OD의 평균값 및 평균 표준 오차는 엑셀을 사용하여 산출하였다.
PRNT. 플라크는 현미경에 전달하여 표준 과정에 따른 PRNT 역가를 산출하였다.
ELISPOT. ELISPOT 플레이트는 제조업자의 지침에 따라 CTL 판독기로 판독하였다. 스팟 형성 세포(SFC)의 수는 각각의 웰에 대해서 측정하고 추가의 평가를 위해 엑셀 파일로 전환하였다. 웰당 5×105 및 2.5×105 세포로의 인큐베이팅으로부터, 1×106 비장세포 당 스팟의 수는 각각의 웰에 대해 산출하였다. 음성 대조군에 대한 평균을 산출하고 마우스 당 평균값의 산출 전에 각각의 개별 값으로부터 공제하여 마우스 당 자극 지수(SI) 값(IFN-γ 방출 비장세포의 펩티드 특이적 빈도)을 수득하였다.
펩티드 자극을 위해, SI는 스팟이 너무 많아 RSV 면역화된 동물을 계수하지 못하는 경우를 제외하고는 5×105 및 2.5×105 세포를 갖는 웰로부터 수득하였다. 상기 경우에, 2.5×105 농도만을 사용하였다. MVA-BN 자극을 위해, SI는 스팟이 너무 많아 계수하지 못하는 경우를 제외하고는 5×105을 갖는 웰로부터 수득하였다. 상기 경우에, 2.5×105 농도를 사용하였다. 개별 동물에 대한 SI의 측정 후, SI (1×106 비장세포 당 SFC)의 평균 및 평균 표준 오차(SEM)은 그룹 당 산출하였다.
RSV 플라크 검정. 바이러스의 3개의 최고 계수가능한 희석과 함께 플라크의 수를 웰에서 계수하였다. 이어서 희석 인자에 의해 조정된 플라크의 평균수에 10을 곱하여 pfu/ml로 용액의 역가를 수득하고 최종적으로 2를 곱하여 폐당 역가를 수득하였다.
RSV RT- qPCR . PCR 증폭은 Applied Biosystems (카탈로그 번호 4351107))으로부터의 ABI 7500을 사용하여 실시간으로 측정하고 제조원(Applied Biosystems)에 의해 공급된 시스템 소프트웨어를 사용하여 검정하였다. 모든 값은 L 유전자 표준과 비교하고 각각의 샘플에 대한 쥐 베타 액틴 측정으로 정상화시켰다.
시토카인 ELISA. 시토카인 농도는 각각의 ELISA 키트의 표준 곡선으로부터 측정하였다.
결과
체액성 면역 반응의 분석:
RSV -특이적 IgG (ELISA, 도 13) 및 RSV -특이적 중화 항체 반응 ( PRNT , 도 14) 둘다에 대해, 본원 발명자는 3개의 작제물 ( MVA - mBN199B , MVA - mBN201B 및 MVA -mBN294A)간에 어떠한 차이를 관찰하지 못했다
세포성 면역 반응의 분석:
예상된 바와 같이, MVA - mBN294A는 M2 T-세포 반응에 의해 지배되는 F 및 M2 특이적 반응 둘다를 유도하는 MVA - mBN201B (도 15)와 유사한 T-세포 반응 패턴을 가졌다. 대조적으로, MVA - mBN199B는 단지 F-특이적 반응을 유도하였지만 MVA -mBN201B 및 MVA - mBN294A 보다는 높은 수준으로 유도하였다.
폐에서 RSV 부하량의 분석:
RSV A2 균주를 사용한 RSV 시도. 마우스에는 마지막 면역화 후 2주째에 106 pfu의 RSV(A2)를 비강내로 시도하였다. 시도-후 4일째에 마우스를 희생시켰다. 1ml의 PBS로 폐 세척 후, 폐를 제거하고 폐에서 RSV 부하량은 상기된 바와 같이 수행된 플라크 검정 및 RT-qPCR로 측정하였다.
플라크 검정에 의해 측정된 RSV 부하량. 시도 후 4일째에 비면역화된 마우스에 대한 폐 당 평균 29842 pfu를 탐지하였다 (도 16). RSV-면역화된 대조군 그룹에서와 같이, 어떠한 RSV A2 플라크도 2회 s.c. 적용 후 MVA-mBN199B, MVA-mBN201B 또는 MVA-mBN294A로 면역화된 동물의 폐에서 탐지되지 않았다.
정량적 실시간에 의해 측정된 RSV 부하량. 폐에서 상기 RSV 부하량은 또한 RT-qPCR로 검정하였다(도 17). RSV는 백신접종된 어떠한 마우스에서도 플라크 검정에 의해 탐지되지 않았고, RSV 게놈은 MVA-mBN199B, MVA-mBN201B 또는 MVA-mBN294A로 2회 s.c.로 면역화된 마우스에서 여전히 탐지가능하였다. MVA-mBN199B에 대해, 상기 RSV 부하량은 TBS 대조군 그룹에 비해 45배 낮았다. RSV 게놈은 또한 MVA-mBN201B 및 MVA-mBN294A에 대해서 탐지가능하였지만 상기 부하량은 MVA-mBN199B에 비해 매우 감소하였고, TBS 대조군 그룹에 비해 각각 416배 및 281배 낮았다.
증진된 질환 징후의 분석
실시예 3에 기재된 실험에 사용된 FI-RSV의 배치와는 대조적으로, 본 연구에 사용된 새로운 배치는 임의의 IL-4 또는 IL-5 생산 증가를 나타내지 않았다. 그러나, 본 발명자는 상기 배치와 함께 FI-RSV에 대한 증진된 질환의 주요 특징인 BAL 유체에서 호산구 및 호중구 침윤를 탐지할 수 있었다. 증진된 질환의 어떠한 징후도 MVA-mBN199B, MVA-mBN201B, 및 MVA-mBN294A에 대해서 탐지가능하지 않았다.
토론 및 결론
MVA-mBN294A (MVA-mBN294B와 동등한)와 MVA-mBN201B간의 차이에도 불구하고, 이 둘 다는 증진된 질환을 유도하는 것 없이 유사한 B- 및 T-세포 반응을 유도하였고 유사한 보호를 제공한다. 작제물 둘 다는 막 당단백질의 유일한 항원성 결정인자(F 및 G)를 발현하는 MVA-mBN199B 보다 우수한 보호를 유도하였다.
발명의 또 다른 구현예는 본원에 기재된 명세서 및 발명의 관행을 고려하여 당업자에게 자명할 것이다. 명세서 및 실시예는 단지 예시적인 것으로 고려되어야 하고 진정한 본 발명의 범위 및 취지는 하기의 특허청구범위에 의해 지정된다.
SEQUENCE LISTING <110> Bavarian Nordic A/S <120> RECOMBINANT MODIFIED VACCINIA VIRUS ANKARA (MVA) RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS (RSV) VACCINE <130> BNI14747PCT <140> Not yet assigned <141> 2013-03-15 <150> US 61/678,367 <151> 2012-08-01 <150> EP 12005594.2 <151> 2012-08-01 <160> 43 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 897 <212> DNA <213> Human Respiratory Syncytial Virus (hRSV), strain A2 <400> 1 atgagcaaga acaaggacca gcggaccgcc aagaccctgg aacggacctg ggacaccctg 60 aaccatctgc tgttcatcag tagctgcctg tacaagctga acctgaagtc cgtggcccag 120 atcaccctga gcatcctggc catgatcatc agcaccagcc tgatcattgc cgccatcatc 180 tttatcgcca gcgccaacca caaagtgacc cccaccacag ccatcatcca ggacgccacc 240 tcccagatca agaacaccac ccccacctac ctgacccaga accctcagct gggcatcagc 300 cccagcaacc ccagcgagat caccagccag atcacaacca tcctggcctc caccacccct 360 ggcgtgaagt ccaccctgca gagcaccacc gtgaaaacca agaataccac caccacacag 420 acccagccca gcaagcccac caccaagcag agacagaaca agcccccctc caagcccaac 480 aacgacttcc acttcgaggt gttcaacttc gtgccctgca gcatctgcag caacaacccc 540 acctgttggg ccatctgcaa gcggatcccc aacaagaagc ccggcaagaa aaccacaacc 600 aagcctacca agaagcctac cctgaaaacc accaagaagg accccaagcc ccagaccacc 660 aagagcaaag aggtgccaac caccaagccc accgaggaac ccaccatcaa caccaccaag 720 accaacatca tcaccaccct gctgacctcc aacaccaccg gcaaccccga gctgacaagc 780 cagatggaaa ccttccacag caccagcagc gagggcaacc ctagccctag ccaggtgtcc 840 accacctccg agtaccccag ccagcctagc agccccccca acacccccag acagtga 897 <210> 2 <211> 298 <212> PRT <213> hRSV strain A2 <400> 2 Met Ser Lys Asn Lys Asp Gln Arg Thr Ala Lys Thr Leu Glu Arg Thr 1 5 10 15 Trp Asp Thr Leu Asn His Leu Leu Phe Ile Ser Ser Cys Leu Tyr Lys 20 25 30 Leu Asn Leu Lys Ser Val Ala Gln Ile Thr Leu Ser Ile Leu Ala Met 35 40 45 Ile Ile Ser Thr Ser Leu Ile Ile Ala Ala Ile Ile Phe Ile Ala Ser 50 55 60 Ala Asn His Lys Val Thr Pro Thr Thr Ala Ile Ile Gln Asp Ala Thr 65 70 75 80 Ser Gln Ile Lys Asn Thr Thr Pro Thr Tyr Leu Thr Gln Asn Pro Gln 85 90 95 Leu Gly Ile Ser Pro Ser Asn Pro Ser Glu Ile Thr 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Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr 115 120 125 Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val 130 135 140 Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160 Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val 180 185 190 Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn 195 200 205 Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln 210 215 220 Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn 225 230 235 240 Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu 245 250 255 Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys 260 265 270 Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile 275 280 285 Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro 290 295 300 Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 305 310 315 320 Leu Cys 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Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val 530 535 540 Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser 545 550 555 560 Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn 565 570 <210> 30 <211> 897 <212> DNA <213> hRSV strain A2 <400> 30 atgagcaaga acaaggacca gcggaccgcc aagaccctgg aacggacctg ggacaccctg 60 aaccatctgc tgttcatcag tagctgcctg tacaagctga acctgaagtc cgtggcccag 120 atcaccctga gcatcctggc catgatcatc agcaccagcc tgatcattgc cgccatcatc 180 tttatcgcca gcgccaacca caaagtgacc cccaccacag ccatcatcca ggacgccacc 240 tcccagatca agaacaccac ccccacctac ctgacccaga accctcagct gggcatcagc 300 cccagcaacc ccagcgagat caccagccag atcacaacca tcctggcctc caccacccct 360 ggcgtgaagt ccaccctgca gagcaccacc gtgaaaacca agaataccac caccacacag 420 acccagccca gcaagcccac caccaagcag agacagaaca agcccccctc caagcccaac 480 aacgacttcc acttcgaggt gttcaacttc gtgccctgca gcatctgcag caacaacccc 540 acctgttggg ccatctgcaa gcggatcccc aacaagaagc ccggcaagaa aaccacaacc 600 aagcctacca agaagcctac cctgaaaacc accaagaagg accccaagcc ccagaccacc 660 aagagcaaag aggtgccaac caccaagccc accgaggaac ccaccatcaa caccaccaag 720 accaacatca tcaccaccct gctgacctcc aacaccaccg gcaaccccga gctgacaagc 780 cagatggaaa ccttccacag caccagcagc gagggcaacc ctagccctag ccaggtgtcc 840 accacctccg agtaccccag ccagcctagc agccccccca acacccccag acagtga 897 <210> 31 <211> 298 <212> PRT <213> hRSV strain A2 <400> 31 Met Ser Lys Asn Lys Asp Gln Arg Thr Ala Lys Thr Leu Glu Arg Thr 1 5 10 15 Trp Asp Thr Leu Asn His Leu Leu Phe Ile Ser Ser Cys Leu Tyr Lys 20 25 30 Leu Asn Leu Lys Ser Val Ala Gln Ile Thr Leu Ser Ile Leu Ala Met 35 40 45 Ile Ile Ser Thr Ser Leu Ile Ile Ala Ala Ile Ile Phe Ile Ala Ser 50 55 60 Ala Asn His Lys Val Thr Pro Thr Thr Ala Ile Ile Gln Asp Ala Thr 65 70 75 80 Ser Gln Ile Lys Asn Thr Thr Pro Thr Tyr Leu Thr Gln Asn Pro Gln 85 90 95 Leu Gly Ile Ser Pro Ser Asn Pro Ser Glu Ile Thr Ser Gln Ile Thr 100 105 110 Thr Ile Leu Ala Ser Thr Thr Pro Gly Val Lys Ser Thr Leu Gln Ser 115 120 125 Thr Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln Pro Ser 130 135 140 Lys Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Ser Lys Pro Asn 145 150 155 160 Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys 165 170 175 Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys 180 185 190 Lys Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Leu 195 200 205 Lys Thr Thr Lys Lys Asp Pro Lys Pro Gln Thr Thr Lys Ser Lys Glu 210 215 220 Val Pro Thr Thr Lys Pro Thr Glu Glu Pro Thr Ile Asn Thr Thr Lys 225 230 235 240 Thr Asn Ile Ile Thr Thr Leu Leu Thr Ser Asn Thr Thr Gly Asn Pro 245 250 255 Glu Leu Thr Ser Gln Met Glu Thr Phe His Ser Thr Ser Ser Glu Gly 260 265 270 Asn Pro Ser Pro Ser Gln Val Ser Thr Thr Ser Glu Tyr Pro Ser Gln 275 280 285 Pro Ser Ser Pro Pro Asn Thr Pro Arg Gln 290 295 <210> 32 <211> 585 <212> DNA <213> hRSV strain A2 <400> 32 atgtcacgaa ggaatccttg caaatttgaa attcgaggtc attgcttaaa tggtaagagg 60 tgtcatttta gtcataatta ttttgaatgg ccaccccatg cactgcttgt aagacaaaac 120 tttatgttaa acagaatact taagtctatg gataaaagta tagatacctt atcagaaata 180 agtggagctg cagagttgga cagaacagaa gagtatgctc ttggtgtagt tggagtgcta 240 gagagttata taggatcaat aaacaatata actaaacaat cagcatgtgt tgccatgagc 300 aaactcctca ctgaactcaa tagtgatgat atcaaaaagc tgagggacaa tgaagagcta 360 aattcaccca agataagagt gtacaatact gtcatatcat atattgaaag caacaggaaa 420 aacaataaac aaactatcca tctgttaaaa agattgccag cagacgtatt gaagaaaacc 480 atcaaaaaca cattggatat ccataagagc ataaccatca acaacccaaa agaatcaact 540 gttagtgata caaatgacca tgccaaaaat aatgatacta cctga 585 <210> 33 <211> 194 <212> PRT <213> hRSV strain A2 <400> 33 Met Ser Arg Arg Asn Pro Cys Lys Phe Glu Ile Arg Gly His Cys Leu 1 5 10 15 Asn Gly Lys Arg Cys His Phe Ser His Asn Tyr Phe Glu Trp Pro Pro 20 25 30 His Ala Leu Leu Val Arg Gln Asn Phe Met Leu Asn Arg Ile Leu Lys 35 40 45 Ser Met Asp Lys Ser Ile Asp Thr Leu Ser Glu Ile Ser Gly Ala Ala 50 55 60 Glu Leu Asp Arg Thr Glu Glu Tyr Ala Leu Gly Val Val Gly Val Leu 65 70 75 80 Glu Ser Tyr Ile Gly Ser Ile Asn Asn Ile Thr Lys Gln Ser Ala Cys 85 90 95 Val Ala Met Ser Lys Leu Leu Thr Glu Leu Asn Ser Asp Asp Ile Lys 100 105 110 Lys Leu Arg Asp Asn Glu Glu Leu Asn Ser Pro Lys Ile Arg Val Tyr 115 120 125 Asn Thr Val Ile Ser Tyr Ile Glu Ser Asn Arg Lys Asn Asn Lys Gln 130 135 140 Thr Ile His Leu Leu Lys Arg Leu Pro Ala Asp Val Leu Lys Lys Thr 145 150 155 160 Ile Lys Asn Thr Leu Asp Ile His Lys Ser Ile Thr Ile Asn Asn Pro 165 170 175 Lys Glu Ser Thr Val Ser Asp Thr Asn Asp His Ala Lys Asn Asn Asp 180 185 190 Thr Thr <210> 34 <211> 1176 <212> DNA <213> hRSV strain A2 <400> 34 atggctctta gcaaagtcaa gttgaatgat acactcaaca aagatcaact tctgtcatcc 60 agcaaataca ccatccaacg gagcacagga gatagtattg atactcctaa ttatgatgtg 120 cagaaacaca tcaataagtt atgtggcatg ttattaatca cagaagatgc taatcataaa 180 ttcactgggt taataggtat gttatatgcg atgtctaggt taggaagaga agacaccata 240 aaaatactca gagatgcggg atatcatgta aaagcaaatg gagtagatgt aacaacacat 300 cgtcaagaca ttaatggaaa agaaatgaaa tttgaagtgt taacattggc aagcttaaca 360 actgaaattc aaatcaacat tgagatagaa tctagaaaat cctacaaaaa aatgctaaaa 420 gaaatgggag aggtagctcc agaatacagg catgactctc ctgattgtgg gatgataata 480 ttatgtatag cagcattagt aataactaaa ttagcagcag gggacagatc tggtcttaca 540 gccgtgatta ggagagctaa taatgtccta aaaaatgaaa tgaaacgtta caaaggctta 600 ctacccaagg acatagccaa cagcttctat gaagtgtttg aaaaacatcc ccactttata 660 gatgtttttg ttcattttgg tatagcacaa tcttctacca gaggtggcag tagagttgaa 720 gggatttttg caggattgtt tatgaatgcc tatggtgcag ggcaagtgat gttacggtgg 780 ggagtcttag caaaatcagt taaaaatatt atgttaggac atgctagtgt gcaagcagaa 840 atggaacaag ttgttgaggt ttatgaatat gcccaaaaat tgggtggtga agcaggattc 900 taccatatat tgaacaaccc aaaagcatca ttattatctt tgactcaatt tcctcacttc 960 tccagtgtag tattaggcaa tgctgctggc ctaggcataa tgggagagta cagaggtaca 1020 ccgaggaatc aagatctata tgatgcagca aaggcatatg ctgaacaact caaagaaaat 1080 ggtgtgatta actacagtgt actagacttg acagcagaag aactagaggc tatcaaacat 1140 cagcttaatc caaaagataa tgatgtagag ctttga 1176 <210> 35 <211> 391 <212> PRT <213> hRSV strain A2 <400> 35 Met Ala Leu Ser Lys Val Lys Leu Asn Asp Thr Leu Asn Lys Asp Gln 1 5 10 15 Leu Leu Ser Ser Ser Lys Tyr Thr Ile Gln Arg Ser Thr Gly Asp Ser 20 25 30 Ile Asp Thr Pro Asn Tyr Asp Val Gln Lys His Ile Asn Lys Leu Cys 35 40 45 Gly Met Leu Leu Ile Thr Glu Asp Ala Asn His Lys Phe Thr Gly Leu 50 55 60 Ile Gly Met Leu Tyr Ala Met Ser Arg Leu Gly Arg Glu Asp Thr Ile 65 70 75 80 Lys Ile Leu Arg Asp Ala Gly Tyr His Val Lys Ala Asn Gly Val Asp 85 90 95 Val Thr Thr His Arg Gln Asp Ile Asn Gly Lys Glu Met Lys Phe Glu 100 105 110 Val Leu Thr Leu Ala Ser Leu Thr Thr Glu Ile Gln Ile Asn Ile Glu 115 120 125 Ile Glu Ser Arg Lys Ser Tyr Lys Lys Met Leu Lys Glu Met Gly Glu 130 135 140 Val Ala Pro Glu Tyr Arg His Asp Ser Pro Asp Cys Gly Met Ile Ile 145 150 155 160 Leu Cys Ile Ala Ala Leu Val Ile Thr Lys Leu Ala Ala Gly Asp Arg 165 170 175 Ser Gly Leu Thr Ala Val Ile Arg Arg Ala Asn Asn Val Leu Lys Asn 180 185 190 Glu Met Lys Arg Tyr Lys Gly Leu Leu Pro Lys Asp Ile Ala Asn Ser 195 200 205 Phe Tyr Glu Val Phe Glu Lys His Pro His Phe Ile Asp Val Phe Val 210 215 220 His Phe Gly Ile Ala Gln Ser Ser Thr Arg Gly Gly Ser Arg Val Glu 225 230 235 240 Gly Ile Phe Ala Gly Leu Phe Met Asn Ala Tyr Gly Ala Gly Gln Val 245 250 255 Met Leu Arg Trp Gly Val Leu Ala Lys Ser Val Lys Asn Ile Met Leu 260 265 270 Gly His Ala Ser Val Gln Ala Glu Met Glu Gln Val Val Glu Val Tyr 275 280 285 Glu Tyr Ala Gln Lys Leu Gly Gly Glu Ala Gly Phe Tyr His Ile Leu 290 295 300 Asn Asn Pro Lys Ala Ser Leu Leu Ser Leu Thr Gln Phe Pro His Phe 305 310 315 320 Ser Ser Val Val Leu Gly Asn Ala Ala Gly Leu Gly Ile Met Gly Glu 325 330 335 Tyr Arg Gly Thr Pro Arg Asn Gln Asp Leu Tyr Asp Ala Ala Lys Ala 340 345 350 Tyr Ala Glu Gln Leu Lys Glu Asn Gly Val Ile Asn Tyr Ser Val Leu 355 360 365 Asp Leu Thr Ala Glu Glu Leu Glu Ala Ile Lys His Gln Leu Asn Pro 370 375 380 Lys Asp Asn Asp Val Glu Leu 385 390 <210> 36 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RT-PCR primer. <400> 36 gaactcagtg taggtagaat gtttgca 27 <210> 37 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RT-PCR primer. <400> 37 ttcagctatc attttctctg ccaat 25 <210> 38 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RT-PCR probe. <400> 38 tttgaacctg tctgaacatt cccggtt 27 <210> 39 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic promoter. <400> 39 aaaaattgaa attttatttt ttttttttgg aatataaata 40 <210> 40 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic promoter. <400> 40 tccaaaccca cccgcttttt atagtaagtt tttcacccat aaataataaa tacaataatt 60 aatttctcgt aaaagtagaa aatatattct aatttattgc acgg 104 <210> 41 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic promoter. <400> 41 taaaaattga aaaaatattc taatttatag gacggttttg attttctttt tttctattct 60 ataaataata aat 73 <210> 42 <211> 227 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic promoter. <400> 42 gttttgaaaa tttttttata ataaatatcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat 60 tgcacggtcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat tgcacggtcc ggtaaaaatt 120 gaaaaactat tctaatttat tgcacggtcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat 180 tgcacggtcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat tgcacgg 227 <210> 43 <211> 112 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic promoter. <400> 43 tacttaaaaa ttgaaaataa atacaaaggt tcttgagggt tgtgttaaat tgaaagcgag 60 aaataatcat aaataatttc attatcgcga tatccgttaa gtttgtatcg ta 112

Claims (21)

  1. (a) 서열 식별번호 4 또는 서열 식별번호 6의 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 호흡기 신시티알 바이러스(RSV) F 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열;
    (b) 서열 식별번호 9 또는 서열 식별번호 34의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RSV N 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열;
    (c) 서열 식별번호 13 또는 서열 식별번호 32의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RSV M2 매트릭스 단백질의 RSV 뉴클레오캡시드 항원성 결정인자를 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열; 및
    (d) 서열 식별번호 1 또는 서열 식별번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RSV G 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 개질된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA).
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 호흡기 신시티알 바이러스(RSV) F 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 상기 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열은 서열 식별번호 3 또는 서열 식별번호 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 개질된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA).
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, RSV N 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자와 RSV M2 매트릭스 단백질의 항원성 결정인자는 RSV 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 하나의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되며, 둘다 단일 개방 판독 프레임에 의해 인코딩되는, 재조합 MVA.
  7. 제6항에 있어서, 단일 개방 판독 프레임은 자가-절단 프로테아제 도메인에 의하여 분리되는, 재조합 MVA.
  8. 제7항에 있어서, 상기 자가-절단 프로테아제 도메인은 구제역 바이러스에서 유래된 프로테아제 2A 단편 서열인, 재조합 MVA.
  9. 제1항에 있어서, 상기 RSV G 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열은 RSV 균주 A 또는 B로부터 유래하는, 재조합 MVA.
  10. 제1항에 있어서, 제2 RSV G 막 당단백질의 항원성 결정인자를 추가로 포함하는, 재조합 MVA.
  11. 제1항, 제4항 및 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항의 재조합 MVA 및, 임의로, 약제학적으로 수용가능한 담체 및/또는 희석제를 포함하는, RSV 감염을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물.
  12. 제1항, 제4항 및 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, RSV 감염을 치료하거나 또는 예방하기 위하여 사용되는, 재조합 MVA.
  13. 호흡기 신시티알 바이러스(RSV) 감염을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 재조합 개질된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA)로서,
    (a) RSV F 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열,
    (b) RSV N 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열,
    (c) RSV M2 매트릭스 단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열, 및
    (d) RSV G 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
    상기 RSV F 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 식별번호 4 또는 서열 식별번호 6의 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
    상기 RSV N 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 식별번호 9 또는 서열 식별번호 34의 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
    상기 RSV M2 매트릭스 단백질의 RSV 뉴클레오캡시드 항원성 결정인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 식별번호 13 또는 서열 식별번호 32의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 및
    상기 RSV G 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 식별번호 1 또는 서열 식별번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 재조합 MVA.
  14. 제13항에 있어서, 상기 재조합 MVA는 단일 또는 다중 용량으로 면역학적으로 순수(
    Figure 112021067104858-pat00029
    )하거나 또는 면역학적으로 경험이 있는 인간 대상체에게 투여되거나 또는 투여 예정인, 재조합 MVA.
  15. 제13항에 있어서, 상기 재조합 MVA는 비강내만으로 투여되는, 재조합 MVA.
  16. 제13항에 있어서, 상기 RSV F 막 당단백질의 항원성 결정인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 식별번호 3 또는 서열 식별번호 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 MVA.
  17. 제1항, 제4항 및 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 2세 초과의 연령의 인간 대상체에 투여하기 위한 재조합 MVA.
  18. 제1항, 제4항 및 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 2세 미만의 연령의 인간 대상체에 투여하기 위한 재조합 MVA.
  19. 제11항에 있어서, 상기 재조합 MVA는 단일 또는 다중 용량으로 면역학적으로 순수(
    Figure 112021067104858-pat00030
    )하거나 또는 면역학적으로 경험이 있는 인간 대상체에게 투여되거나 또는 투여 예정인, 약제학적 조성물.
  20. 제11항에 있어서, 2세 초과의 연령의 인간 대상체에 투여하기 위한 약제학적 조성물.
  21. 제11항에 있어서, 2세 미만의 연령의 인간 대상체에 투여하기 위한 약제학적 조성물.

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