ES2918381T3

ES2918381T3 - Composiciones de proteína F de VRS y métodos para producir las mismas

Info

Publication number: ES2918381T3
Application number: ES16190004T
Authority: ES
Inventors: Kurt Swanson; Philip Dormitzer
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2009-07-15
Filing date: 2010-07-15
Publication date: 2022-07-15
Anticipated expiration: 2030-07-15
Also published as: CA2768186A1; US20110305727A1; EP2453918B1; US20230348574A1; US11261239B2; TW201116294A; US11655284B2; US20120164176A1; US20220213177A1; EP4183412A1; US20220372115A1; BR112012001666A2; US20230348575A1; HRP20220756T1; EP4218800A1; CO6491045A2; PL3178490T3; US20220340645A1; SI3178490T1; EP3988115A2

Abstract

La presente invención se relaciona con las composiciones inmunogénicas que comprenden proteína RSV F, métodos para preparar composiciones que contienen polipéptidos de dominio ecto-dominio de RSV F y con ciertas proteínas RSV F diseñadas y ácidos nucleicos que codifican las proteínas RSV F diseñadas. Las composiciones preparadas utilizando los métodos pueden contener polipéptidos de dominio ecto de proteína RSV F en una forma y conformación predominante o deseada única. La invención también se relaciona con los métodos para inducir una respuesta inmune al RSV F. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones de proteína F de VRS y métodos para producir las mismas

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El virus respiratorio sincitial (VRS) es un virus de ARN de cadena negativa no segmentado con envoltura de la familia Paramyxoviridae, género Pneumovirus. Es la causa más común de bronquiolitis y neumonía entre los niños en su primer año de vida. El VRS también provoca infecciones repetidas incluyendo enfermedad grave de las vías respiratorias inferiores, lo que puede producirse a cualquier edad, especialmente entre los ancianos o aquellos con sistemas cardíaco, pulmonar o inmunitario comprometidos.

Para infectar una célula huésped, los paramixovirus tales como VRS, como otros virus con envoltura tales como virus influenza y VIH, requieren la fusión de la membrana viral con la membrana de una célula huésped. Para VRS, la proteína de fusión conservada (F de VRS) fusiona las membranas viral y celular acoplando el replegamiento irreversible de las proteínas con la yuxtaposición de las membranas. En modelos actuales basados en estudios con paramixovirus, la proteína F de VRS se pliega inicialmente en una conformación de “prefusión” metaestable. Durante la entrada en la célula, la conformación de prefusión experimenta replegamiento y cambios conformacionales a su conformación de “posfusión” estable.

La proteína F de VRS se traduce a partir de ARNm a una proteína de aproximadamente 574 aminoácidos designada Fo. El procesamiento postraduccional de Fo incluye la eliminación de un péptido señal N-terminal por una peptidasa señal en el retículo endoplasmático. Fo también se escinde en dos sitios (aproximadamente 109/110 y aproximadamente 136/137) por proteasas celulares (en particular furina) en el trans-Golgi. Esta escisión da como resultado la eliminación de una secuencia intermedia corta y genera dos subunidades designadas Fi (—50 kDa; C-terminal; aproximadamente los residuos 137-574) y F2 (~20 kDa; N-terminal; aproximadamente los residuos 1-109) que permanecen asociadas entre sí. F1 contiene un péptido de fusión hidrófobo en su extremo N-terminal y también dos regiones de repetición de héptada antipática (HRA y HRB). HRA está cerca del péptido de fusión y HRB está cerca del dominio transmembrana. Se ensamblan tres heterodímeros F1-F2 como homotrímeros de F1-F2 en el virión.

Actualmente, no está disponible una vacuna contra la infección por VRS, pero se desea. Un posible enfoque para producir una vacuna es una vacuna de subunidades basada en proteína F de VRS purificada. En el documento W02009/079796A se da a conocer un antígeno F de VRS recombinante que comprende un ectodominio fusionado a un dominio de multimerización de proteína GCN4. Sin embargo, para este enfoque, es deseable que la proteína F de VRS purificada esté en una sola forma y conformación que sea estable a lo largo del tiempo, constante entre los lotes de vacunas, y convenientemente purificada.

La proteína F de VRS puede truncarse, por ejemplo por deleción del dominio transmembrana y la cola citoplasmática, para permitir su expresión como ectodominio, que puede ser soluble. Además, aunque la proteína F de VRS se traduce inicialmente como un monómero, los monómeros se escinden y se ensamblan en trímeros. Cuando la proteína F de VRS está en forma de trímeros escindidos, se expone el péptido de fusión hidrófobo. Los péptidos de fusión hidrófobos expuestos en diferentes trímeros, por ejemplo, trímeros de ectodominios solubles, pueden asociarse entre sí, dando como resultado la formación de rosetas. Los péptidos de fusión hidrófobos pueden asociarse también con lípidos y lipoproteínas, por ejemplo a partir de células que se usan para expresar proteína F de VRS soluble recombinante. Debido a la complejidad del procesamiento, la estructura y el replegamiento de la proteína F de VRS, es difícil obtener preparaciones inmunogénicas purificadas y homogéneas.

Por tanto, existe la necesidad de composiciones de proteína F de VRS mejoradas y métodos para preparar composiciones de proteína F de VRS.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto.

Se dan a conocer composiciones inmunogénicas que contienen uno o más polipéptidos F de VRS, y ciertas proteínas F de VRS modificadas por ingeniería genética y ácidos nucleicos que codifican las proteínas F de VRS modificadas por ingeniería genética.

Según la invención, la proteína F de VRS es soluble. La proteína F de VRS tiene la región transmembrana y la cola citoplasmática delecionadas. La proteína F de VRS es un trímero. El trímero puede estar monodisperso o en forma de una roseta. En otros aspectos adicionales o alternativos, la proteína F de VRS puede estar en una conformación de prefusión, una conformación intermedia o una conformación de posfusión.

En otro aspecto, la composición inmunogénica contiene un polipéptido F de VRS en el que F de VRS contiene los aminoácidos 23-99 y 151-524 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 y es soluble (por ejemplo, un ectodominio).

En un aspecto, la composición inmunogénica contiene un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 54. En algunas realizaciones, el péptldo señal y/o la etiqueta HIS se omiten. El polipéptido F de VRS es soluble (por ejemplo, un ectodominio).

En realizaciones preferidas, la composición Inmunogénica Incluirá un adyuvante. El adyuvante es preferiblemente una sal de aluminio, una emulsión de escualeno en agua (tal como MF59), un compuesto de benzonaftlrldlna, un compuesto de fosfolípldo (tal como E6020), un ¡nmunopotenclador de molécula pequeña o una combinación de dos cualesquiera o más de cualquiera de los anteriores.

Aún otro aspecto de la invención incluye polipéptidos F de VRS recombinantes. El F de VRS puede estar en forma de un trímero o roseta de trímeros. El polipéptido recomblnante puede Incluir un péptldo señal.

En un aspecto, el polipéptido recomblnante se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 54, y cualquier combinación de los mismos. Opclonalmente, el péptldo señal y/o la etiqueta HIS se omiten.

Todavía otro aspecto Incluye ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los polipéptidos anteriores. El ácido nucleico puede ser una molécula de ARN autorrepllcante.

Otro aspecto de la Invención es una composición Inmunogénica que comprende un ARN autorrepllcante que codifica un polipéptido F de VRS de la Invención. La composición Inmunogénica puede Incluir un sistema de administración.

Otro aspecto de la Invención Incluye métodos de Inducción de una respuesta ¡nmunltarla a F de VRS mediante la administración de cualquiera de las composiciones ¡nmunogénlcas.

La divulgación proporciona también métodos para preparar composiciones y composiciones que contienen proteína F de VRS, tal como polipéptidos de ectodominio de F de VRS solubles, incluyendo composiciones ¡nmunogénlcas. Los polipéptidos de ectodominio de F de VRS pueden estar en una sola forma, tal como trímeros no escindidos, trímeros escindidos o rosetas de trímeros escindidos. La Invención proporciona varias ventajas. Por ejemplo, la presencia de una sola forma deseada de F de VRS en una composición Inmunogénica proporciona una respuesta ¡nmunltarla más predecible cuando se administra la composición a un sujeto, y una estabilidad más constante y otras características físicas y químicas cuando se formula en una vacuna.

En un aspecto, se da a conocer un método para producir una composición que comprende polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS escindidos. El método Incluye a) proporcionar polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos que contienen uno o más sitios de escisión de proteasa que, cuando se escinden, producen los fragmentos Fi y F2, y b) escindir los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos con una proteasa o proteasas que reconocen el sitio o sitios de escisión de proteasa. En general, la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos contiene sitios de escisión de furlna alterados, y los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS se secretan de una célula huésped que los produce sin escindir en una posición del aminoácido 101 al aminoácido 161 (por ejemplo, no está escindido en los sitios de escisión de furlna en las posiciones 106-109 y 131-136). En algunas realizaciones, los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos proporcionados en a) se purifican.

Los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos tal como se dan a conocer en el presente documento en a) pueden comprender un péptldo de fusión Intacto o un péptldo de fusión alterado (por ejemplo, un péptldo de fusión deleclonado o péptldo de fusión mutado). Cuando los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos proporcionados en a) contienen un péptldo de fusión Intacto, la escisión en la etapa b) da como resultado la formación de rosetas de trímeros. Cuando los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos proporcionados en a) comprenden un péptldo de fusión alterado, la escisión en la etapa b) da como resultado la formación de trímeros.

El método puede comprender además la etapa opcional de purificar las rosetas o trímeros producidos escindiendo los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos. En realizaciones preferidas de la divulgación, los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS escindidos producidos según el método están sustanclalmente libres de lípldos y lipoproteínas.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un método para producir una composición que comprende trímeros de polipéptido de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos. El método Incluye a) proporcionar un material biológico que contiene polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos; y b) purificar los trímeros de polipéptido de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos del material biológico. En general, la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos contiene sitios de escisión de furlna alterados, y los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS se secretan de una célula huésped que los produce sin escindir en una posición del aminoácido 101 al aminoácido 161 (por ejemplo, no está escindido en los sitios de escisión de furlna en las posiciones 106-109 y 131 -136). En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos contiene además sitios de escisión de tripsina alterados, y los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no se escinden por tripsina en un sitio entre el aminoácido 101 y el aminoácido 161. En otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos contiene además un péptido de fusión alterado.

En algunas realizaciones, los trímeros de polipéptido de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos se purifican. En realizaciones preferidas, los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS escindidos producidos según el método están sustancialmente libres de lípidos y lipoproteínas.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un método para producir una composición que comprende trímeros de polipéptido de ectodominio de proteína F de VRS escindidos. El método incluye a) proporcionar un material biológico que contiene polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS escindidos que contienen un péptido de fusión alterado; y b) purificar los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS escindidos del material biológico.

En algunas realizaciones, los trímeros de polipéptido de ectodominio de proteína F de VRS escindidos se purifican. En realizaciones preferidas, los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS escindidos producidos según el método están de manera preferible sustancialmente libres de lípidos y lipoproteínas. En todavía otra realización, se purifica un trímero de ectodominio de proteína F de VRS escindido que contiene un péptido de fusión alterado.

En otros aspectos, la Invención proporciona composiciones, Incluyendo composiciones inmunogénlcas, producidas usando los métodos dados a conocer. Cualquier referencia a un método de tratamiento puesto en práctica sobre el cuerpo humano o animal ha de interpretarse como los polipéptidos de la Invención y las composiciones que comprenden los mismos para su uso en tales métodos de tratamiento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 muestra el esquema de la F de VRS de tipo natural (figura 1 A) y de un constructo de ectodominio en el que el dominio transmembrana y la cola citoplasmática se han eliminado y se ha añadido una etiqueta HIS6 opcional al extremo C-terminal (figura 1B). Por claridad, la numeración residuos se refiere a la F de VRS de la cepa A2 de tipo natural que comienza en el péptido señal N-termlnal y no está alterada en constructos que contienen deleciones de aminoácidos. En los esquemas está marcada la secuencia señal o péptido señal (sp). La figura 1A es un esquema de la proteína F de VRS que muestra la secuencia señal o péptido señal (SP), la región llgadora p27, el péptido de fusión (FP), el dominio HRA (HRA), el dominio HRB (HRB), la región transmembrana (TM) y la cola citoplasmática (CT). Los límites C-termlnales del ectodominio pueden variar. La figura 1B es un esquema general del constructo de ectodominio de F de VRS que representa las características compartidas con los esquemas de la figura 1A y que incluye una etiqueta HIS6 opcional (ETIQUETA HIS). Están presentes sitios de escisión de furina en las posiciones de aminoácido 109/110 y 136/137. La figura 1C también muestra la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 100 - 150 de F de VRS (tipo natural) (SEQ ID NO: 108) y varias proteínas (Furmt-SEQ ID NO: 3; Furdel-SEQ ID NO: 4; Furx-SEQ ID NO: 6; Furx R113Q, K123N, K124N-SEQ ID NO: 5; Furx R113Q, K123Q, K124Q-SEQ ID NO: 92; Delp21 furx-SEQ ID NO: 7; Delp23 furx-SEQ ID NO: 8; Delp23 furdel-SEQ ID NO: 9; Furina N-term-SEQ ID NO: 10; Furina C-term-SEQ ID NO: 11; Deleción de péptido de fusión 1-SEQ ID NO: 12; y Factor Xa-SEQ ID NO: 13) en las que uno o ambos sitios de escisión de furina y/o región de péptido de fusión están mutados o delecionados. En la figura 1C, el símbolo indica que el aminoácido en esa posición está delecionado.

La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos del extremo carboxllo terminal desde la posición de aminoácido 488 hasta el inicio de la región TM de F de VRS (tipo natural) (SEQ ID NO: 94) y varias proteínas (SEQ ID NOS: 95-100) que contienen sitios de escisión de proteasa añadidos. En la figura 2, el símbolo indica que no hay aminoácido en esa posición.

La figura 3 es un cromatograma y una imagen de un gel de electroforesisque muestra la purificación de monómeros de F de VRS F (3) usando cromatografía de exclusión molecular.

Las figuras 4A-4F muestran la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 101) del plásmldo que codifica la molécula de ARN autorreplicante pT7-TC83R-FL.RSVF (A317) que codifica la glucoproteína F del virus respiratorio sincitial (F de VRS). La secuencia de nucleótidos que codifica F de VRS está subrayada.

La figura 5 es una alineación de las secuencias de aminoácidos de proteínas F de varias cepas de VRS. La alineación se preparó usando el algoritmo dado a conocer por Corpet, Nucleic Acids Research, 1998, 16(22):10881 -10890, usando parámetros por defecto (tabla de comparación de símbolos Blossum 62, penalización por apertura de hueco: 12, penalización por extensión de hueco: A2, proteína F de la cepa A2 (número de registro AF035006) (SEQ ID NO: 102); CP52, proteína F de la cepa CP52 (número de registro AF013255) (SEQ ID NO: 103); B, proteína F de la cepa B (número de registro AF013254) (SEQ ID NO: 104); Long, proteína F de la cepa Long (número de registro AY911262) (SEQ ID NO: 105) y cepa 18537, proteína F de la cepa 18537 (número de registro Swiss Prot P13843) (SEQ ID NO: 106). También se muestra un consenso de secuencias de proteína F (SEQ ID NO: 107).

La figura 6 muestra regiones relevantes de cromatogramas de exclusión molecular (SEC) de purificaciones de antígenos F de VRS seleccionados. El pico principal que contiene el antígeno indicado se indica mediante un asterisco con el tiempo de retención de la columna Superdex P200 16/60 (GE Healthcare) indicado en mililitros. En una columna calibrada, los tiempos de retención aproximados de 47 mi, 65 mi y 77 mi corresponden al volumen vacío de la columna, la retención del trímero de F de VRS y la retención del monómero de F de VRS, respectivamente. En la figura 6A, el constructo Delp23 Furdel (Ap23 Furdel) no escindido se purifica del pico de monómero a aproximadamente 77 mi. Cuando el antígeno F de VRS Delp23 Furdel no escindido se trata con tripsina, la proteína puede formar rosetas, que migran ahora sobre la SEC en el volumen vacío a aproximadamente 47 mi (figura 6B). La especie de trímero escindido de la deleción de péptido de fusión de F de VRS se purifica del pico de trímero a un tiempo de retención de aproximadamente 65 mi (figura 6C) mientras que el constructo Delp21 Furx (Ap21 Furx) no escindido se purifica del pico de monómero a aproximadamente 77 mi (figura 6D).

La figura 7 muestra imágenes de EM representativas de antígenos F de VRS seleccionados. La figura 7A muestra una imagen de EM de F de VRS Ap23 (Delp23) antes del tratamiento con tripsina. Las formas de muleta de la figura 7A, consecuentes con una conformación de trímero de posfusión, no siempre se observan en el constructo Ap23 (Delp23) Furdel no escindido. Cuando el constructo Ap23 (Delp23) Furdel se trata con tripsina y se purifica del volumen vacío de una columna de SEC y se observa mediante EM, se encuentra que las proteínas han adoptado conformaciones de roseta (figura 7B). Cuando el constructo de deleción de péptido de fusión de F de VRS se purifica del pico de trímero sobre una columna de SEC, se observa una forma de muleta monodispersa, consecuente con un trímero de posfusión (figura 7C). En la figura 7D se muestran tres preparaciones de cualquiera de F de VRS Ap21 (Delp21) furx (marcado como monómero), F de VRS de deleción de péptido de fusión (carriles marcados como trímero) y rosetas de F de VRS purificadas (marcadas como rosetas). El gel contiene varios carriles de GE Full Range Standard (los pesos moleculares convencionales están marcados a la izquierda del gel) mientras que los tiempos de retención aproximados de los fragmentos de F de VRS están indicados a la derecha del gel.

Las figuras 8A-8C son gráficos que muestran que los monómeros (Ap21 (Delp21) furx no escindido), las rosetas de trímeros (Ap23 (Delp23) Furdel escindido) y los trímeros (deleción de péptido de fusión) de polipéptidos de ectodominio de F de VRS son inmunogénicos en ratas algodoneras. Se midieron los títulos en suero de IgG anti-F de VRS y anticuerpos neutralizantes anti-VRS 2 semanas después de la 1a vacunación (2wp1), 3 semanas después de la 1a vacunación (3wp1) y/o 2 semanas después de la 2a vacunación (2wp2).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a polipéptidos y/o proteínas F de virus respiratorio sincitial (F de VRS), a composiciones inmunogénicas que comprenden polipéptidos y/o proteínas F de VRS, a métodos para producir polipéptidos y/o proteínas F de VRS y a composiciones que comprenden polipéptidos y/o proteínas F de VRS, y a ácidos nucleicos que codifican polipéptidos y/o proteínas F de VRS.

En general, las composiciones inmunogénicas comprenden polipéptidos y/o proteínas F de VRS que contienen mutaciones (por ejemplo, reemplazos, deleciones o adiciones de aminoácidos) que proporcionan características beneficiosas, tales como una o más de 1) conformación de prefusión o intermedia (no de posfusión) estabilizada, 2) exposición reducida o eliminada del péptido de fusión, 3) estabilidad mejorada (por ejemplo, agregación y/o degradación reducida y 4) semejanza más estrecha a la proteína viral F1/F2 activa. Estas características proporcionan ventajas para las composiciones inmunogénicas y para la fabricación de las composiciones inmunogénicas. Por ejemplo, tal como se describe en el presente documento, las conformaciones que no son de posfusión de la proteína F de VRS (es decir, conformación de prefusión, conformaciones intermedias) pueden ser mejores inmunógenos y provocar una mejor respuesta de anticuerpos neutralizantes. La reducción o eliminación de la exposición del péptido de fusión, por ejemplo, introduciendo mutaciones o deleciones en los sitios de escisión de furina, reducirá la hidrofobicidad del polipéptido y facilitará las purificaciones, y también reducirá o eliminará la asociación de la proteína F de VRS con las membranas celulares en un sujeto al que se administra la proteína. La estabilidad mejorada de la proteína facilita la producción de composiciones inmunogénicas en las que la proteína tiene una tendencia disminuida a agregarse o degradarse, lo que proporciona una respuesta inmunitaria más predecible cuando se administra la composición a un sujeto. Finalmente, polipéptidos o proteínas F de VRS mutantes que se asemejan a la proteína viral F1/F2, por ejemplo mediante la deleción de la totalidad o parte de la región ligadora p27, pueden provocar una mejor respuesta de anticuerpos neutralizantes. Otras ventajas de la invención se describen en el presente documento.

La divulgación también proporciona métodos para preparar composiciones que contienen proteína F de VRS, en particular polipéptidos de ectodominio de F de VRS, y composiciones incluyendo composiciones inmunogénicas que comprenden proteína F de VRS. Preferiblemente, los polipéptidos de ectodominio de F de VRS están en una sola forma o en un equilibrio dinámico entre formas conocidas.

Definiciones

Tal como se usa en el presente documento, “población” se refiere a más de un polipéptido o proteína F de VRS que está presente en una composición. La población puede ser sustanclalmente homogénea, en la que sustanclalmente todos los pollpéptldos o proteínas F de VRS son sustanclalmente ¡guales (por ejemplo, misma secuencia de aminoácidos, misma conformación), heterogénea o tener un grado deseado de homogeneidad (por ejemplo, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 99 % de los pollpéptldos o proteínas F de VRS están en la conformación de prefusión, están en la conformación de posfusión, son monómeros, son trímeros).

La “conformación de posfusión” de la proteína F de VRS es un trímero caracterizado por la presencia de un haz de seis hélices que comprende 3 reglones HRB y 3 HRA.

La “conformación de prefusión” de la proteína F de VRS es una conformación caracterizada por un trímero que contiene una triple hélice que comprende 3 regiones HRB.

Tal como se usa en el presente documento, “polipéptido de ectodomlnlo de F de VRS” se refiere a un polipéptido de proteína F de VRS que contiene sustancialmente la porción extracelular de la proteína F de VRS madura, con o sin el péptldo señal (por ejemplo, de aproximadamente el aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 524, o de aproximadamente el aminoácido 22 a aproximadamente el aminoácido 524) pero carece del dominio transmembrana y la cola cltoplasmátlca de la proteína F de VRS que se produce de manera natural.

Tal como se usa en el presente documento, “polipéptido de ectodominio de F de VRS escindido” se refiere a un polipéptido de ectodomlnlo de F de VRS que se ha escindido en una o más posiciones de aproximadamente 101 /102 a aproximadamente 160/161 para producir dos subunldades, en el que una de las subunldades comprende Fi y la otra subunidad comprende F2.

Tal como se usa en el presente documento, “polipéptido de ectodominio de F de VRS no escindido C-terminal” se refiere a un polipéptido de ectodomlnlo de F de VRS que se escinde en una o más posiciones de aproximadamente 101/102 a aproximadamente 131/132, y no se escinde en una o más posiciones de aproximadamente 132/133 a aproximadamente 160/161, para producir dos subunldades, en el que una de las subunldades comprende F1 y la otra subunidad comprende F2.

Tal como se usa en el presente documento, “polipéptido de ectodominio de F de VRS no escindido” se refiere a un polipéptido de ectodomlnlo de F de VRS que no se escinde en una o más posiciones de aproximadamente 101/102 a aproximadamente 160/161.

Tal como se usa en el presente documento, “péptido de fusión” se refiere a los aminoácidos 137-154 de la proteína F de VRS.

Tal como se usa en el presente documento, “péptldo de fusión alterado” se refiere a un péptldo de fusión en el que uno o más aminoácidos se reemplazan o delecionan Independientemente, Incluyendo el reemplazo o la deleclón de todos los aminoácidos de las posiciones 137-154. Preferiblemente, los pollpéptldos de ectodomlnlo de F de VRS escindidos que contienen un “péptido de fusión alterado” no forman rosetas.

Tal como se usa en el presente documento, una proteína o polipéptido “purificado” es una proteína o polipéptido que se produce de manera recomblnante o sintética, o se produce por su huésped natural, y se ha aislado de otros componentes del sistema de producción recomblnante o sintético o huésped natural de manera que la cantidad de la proteína en relación con otros componentes macromoleculares presentes en una composición es sustanclalmente mayor que la presente en una preparación en bruto. En general, una proteína purificada será al menos aproximadamente el 50 % homogénea y más preferiblemente al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 % o sustanclalmente homogénea.

Tal como se usa en el presente documento, “sustanclalmente libre de lípldos y llpoproteínas” se refiere a composiciones, proteínas y pollpéptldos que están al menos aproximadamente el 95 % libres de lípldos y llpoproteínas en una base en masa cuando se observa la pureza de la proteína y/o polipéptido (por ejemplo, polipéptido F de VRS) en un gel de SDS PAGE y se mide el contenido de proteína total usando o bien absorción de UV280 o bien análisis de BCA, y se determina el contenido de lípldos y llpoproteínas usando el ensayo de fosfolipasa C (Wako, n.e de código 433-36201).

Tal como se usa en el presente documento, “sitio de escisión de furlna alterado” se refiere a la secuencia de aminoácidos en aproximadamente las posiciones 106-109 y en aproximadamente las posiciones 133-136 en la proteína F de VRS que se produce de manera natural que se reconocen y se escinden por furlna o proteasas similares a la furina, pero en un polipéptido de ectodominio de proteína F de VRS no escindido contiene uno o más reemplazos de aminoácidos, una o más deleciones de aminoácidos, o una combinación de uno o más reemplazos de aminoácidos y una o más deleciones de aminoácidos, de modo que se secreta un polipéptido de ectodominio de F de VRS que contiene un sitio de escisión de furina alterado de una célula que lo produce sin escindir en el sitio de escisión de furina alterado.

Las características de los ectodominios de proteína F de VRS adecuados para su uso en esta invención se describen en el presente documento con referencia a aminoácidos particulares que se identifican por la posición del aminoácido en la secuencia de proteína F de VRS de la cepa A2 (SEQ ID NO: 1). Los ectodominios de proteína F de VRS pueden tener la secuencia de aminoácidos de la proteína F de la cepa A2 o cualquier otra cepa deseada. Cuando se usa el ectodominio de proteína F de una cepa distinta de la cepa A2, los aminoácidos de la proteína F han de numerarse con referencia a la numeración de la proteína F de la cepa A2, con la inserción de huecos según sea necesario. Esto puede lograrse alineando la secuencia de cualquier proteína F de VRS deseada con la proteína F de la cepa A2, tal como se muestra en el presente documento para proteínas F de la cepa A2, cepa CP52, cepa B, cepa Long y la cepa 18537. Véase la figura 5. Las alineaciones de secuencias se producen preferiblemente usando el algoritmo dado a conocer por Corpet, Nucleid Acids Research, 1998, 16(22): 10881-10890, usando parámetros por defecto (tabla de comparación de símbolos Blossum 62, penalización por apertura de hueco: 12, penalización por extensión de hueco: 2).

La invención proporciona polipéptidos y proteínas F de VRS solubles, y composiciones inmunogénicas que comprenden los polipéptidos y proteínas F de VRS solubles, así como composiciones que comprenden ácidos nucleicos (por ejemplo, moléculas de ARN autorreplicante) que codifican los polipéptidos y proteínas F de VRS solubles.

Los polipéptidos F de VRS (por ejemplo, polipéptidos de ectodominio) pueden estar en cualquier forma deseada, tal como en una sola forma, tal como trímeros no escindidos, trímeros escindidos o rosetas de trímeros escindidos. La divulgación proporciona varias ventajas. Por ejemplo, la presencia de una sola forma deseada de VRS, o un equilibrio dinámico entre formas conocidas, en una composición inmunogénica, proporciona una formulación, solubilidad y estabilidad más predecibles, y una respuesta inmunitaria más predecible cuando se administra la composición a un sujeto.

Preferiblemente, los polipéptidos de ectodominio de F de VRS están en una sola forma, tal como trímeros no escindidos, trímeros escindidos, rosetas de trímeros escindidos.

En un aspecto de la invención, los polipéptidos y proteínas F de VRS están en conformación de prefusión. Los epítopos de la conformación de prefusión pueden ser capaces de generar mejor anticuerpos que pueden reconocer y neutralizar viriones naturales.

En una realización de la invención, una composición inmunogénica comprende una población de glucoproteínas F de virus respiratorio sincitial en conformación de prefusión. En otro aspecto de la invención, una composición inmunogénica comprende una población de glucoproteínas F de virus respiratorio sincitial que desfavorecen la conformación de posfusión en comparación con una población de glucoproteínas F de VRS aisladas.

La invención también proporciona una composición inmunogénica que comprende un polipéptido que muestra un epítopo presente en una conformación de prefusión o de fusión intermedia de la glucoproteína F de virus respiratorio sincitial pero ausente en la conformación de posfusión de la glucoproteína.

La glucoproteína F

La glucoproteína F de VRS dirige la penetración viral por la fusión entre la envoltura del virión y la membrana plasmática de la célula huésped. Es una proteína integral de la membrana de un solo paso de tipo I que tiene cuatro dominios generales: secuencia señal (SS) de translocación al ER N-terminal, ectodominio (ED), dominio transmembrana (TM) y una cola citoplasmática (CT). La CT contiene un solo residuo de cisterna palmitoilada. La secuencia de la proteína F está altamente conservada entre los aislados de VRS, pero está en constante evolución (7). A diferencia de la mayoría de los paramixovirus, la proteína F en VRS puede mediar en la entrada y la formación de sincitios independientemente de las otras proteínas virales (habitualmente, es necesaria la HN además de F en otros paramixovirus).

El ARNm de F de VRSh se traduce en una proteína precursora de 574 aminoácidos designada Fo, que contiene una secuencia de péptido señal en el extremo N-terminal que se elimina por una peptidasa señal en el retículo endoplasmático. Fo se escinde en dos sitios (a.a. 109/110 y 136/137) por proteasas celulares (en particular furina) en el trans-Golgi, eliminando una secuencia intermedia glucosilada corta y generando dos subunidades designadas Fi (~50 kDa; extremo C-terminal; residuos 137-574) y F2 (~20 kDa; extremo N-terminal; residuos 1-109) (véase, por ejemplo, la figura 1). F1 contiene un péptido de fusión hidrófobo en su extremo N-terminal y también dos regiones de repetición de héptada hidrófobas (HRA y HRB). HRA está cerca del péptido de fusión y HRB está cerca el dominio transmembrana (véase, por ejemplo, la figura 1). Los heterodímeros F1-F2 se ensamblan como homotrímeros en el virión.

VRS existe como un solo serotipo pero tiene dos subgrupos antigénicos: A y B. Las glucoproteínas F de los dos grupos son aproximadamente el 90 % idénticas. En la invención puede usarse el subgrupo A, el subgrupo B o una combinación o híbrido de ambos. Una secuencia de ejemplo para el subgrupo A es SEQ ID NO: 1 (cepa A2; GenBank Gl: 138251; Swiss Prot P03420), y para el subgrupo B es SEQ ID NO: 2 (cepa 18537; Gl: 138250; Swiss Prot P13843). SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 son ambas secuencias de 574 aminoácidos. El péptido señal en la cepa A2 son los a.a. 1-21, pero en la cepa 18537 son 1-22. En ambas secuencias, el dominio TM son aproximadamente los a.a. 530-550, pero se ha notificado alternativamente como 525-548.

SEQ ID NO: 1

1 MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIE 60

61 LSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPPTNNRARRELPRFMNYTLN 120

121 NAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWS 180

181 LSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVN 240

241 AGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYV 300

301 VQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKV 360

361 QSNRVFCDTMNSLTLPSEINLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKT 420

421 KCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGMDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDP 480

481 LVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLS 540

541 LIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN 574

SEQ ID NO: 2

1 MELLIHRSSAIFLTLAVNALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIE 60

61 LSNIKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTIN 120

121 TTKNLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWS 180

181 LSNGVSVLTSKVLDLKNYINNRLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQMNSRLLEITREFSVN 240

241 AGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYV 300

301 VQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKV 360

361 QSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKT 420

421 KCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDP 480

481 LVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLHNVNTGKSTTNIMITTIIIVIIWLLS 540

541 LIAIGLLLYCKAKNTPVTLSKDQLSGINNIAFSK 574

La invención puede usar cualquier secuencia de aminoácidos de F de VRS deseada, tal como la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o 2, o una secuencia que tiene identidad con SEQ ID NO: 1 o 2. Normalmente, tendrá al menos el 80 % de identidad con SEQ ID NO: 1 o 2, por ejemplo, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % de identidad con SEQ ID NO: 1 o 2. La secuencia puede encontrarse de manera natural en VRS.

Cuando la invención usa un ectodominio de proteína F, en su totalidad o en parte, puede comprender:

(i) un polipéptido que comprende aproximadamente los aminoácidos 22-525 de SEQ ID NO: 1.

(ii) un polipéptido que comprende aproximadamente los aminoácidos 23-525 de SEQ ID NO: 2.

(iii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80 % de identidad (por ejemplo, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % de identidad) con (i) o (ii).

También se dan a conocer (iv) un polipéptido que comprende un fragmento de (i), (ii) o (iii), en el que el fragmento comprende al menos un epítopo de proteína F. El fragmento tendrá habitualmente al menos aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, por ejemplo, al menos aproximadamente 150, al menos aproximadamente 200, al menos aproximadamente 250, al menos aproximadamente 300, al menos aproximadamente 350, al menos aproximadamente 400, al menos aproximadamente 450 aminoácidos de longitud.

El ectodominio de la invención puede ser una forma Fo con o sin el péptido señal, o puede comprender dos cadenas peptídicas separadas (por ejemplo, una subunidad Fi y una subunidad F2) que están asociadas entre sí, por ejemplo, las subunldades pueden estar unidas por un puente disulfuro. Por consiguiente, la totalidad o una porción de aproximadamente el aminoácido 101 a aproximadamente 161, tal como los aminoácidos 110-136, pueden estar ausentes del ectodomlnlo. Por tanto, el ectodomlnlo, en su totalidad o en parte, puede comprender: (v) una primera cadena peptídlca y una segunda cadena peptídlca que está asociada con la primera cadena pollpeptídlca, donde la primera cadena peptídlca comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80 % de Identidad (por ejemplo, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o Incluso el 100 % de Identidad) con de aproximadamente el aminoácido 22 a aproximadamente el aminoácido 101 de SEQ ID NO: 1 o con de aproximadamente el aminoácido 23 a aproximadamente el aminoácido 101 de SEQ ID NO: 2, y la segunda cadena peptídlca comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80 % de identidad (por ejemplo, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o Incluso el 100 % de Identidad) con de aproximadamente el aminoácido 162 a aproximadamente 525 de SEQ ID NO: 1 o con de aproximadamente el aminoácido 162 a 525 de SEQ ID NO: 2.

También se dan a conocer (vi) una primera cadena peptídlca y una segunda cadena peptídlca que está asociada con la primera cadena pollpeptídlca, donde la primera cadena peptídlca comprende una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento de aproximadamente el aminoácido 22 a aproximadamente el aminoácido 101 de SEQ ID NO: 1 o de aproximadamente el aminoácido 23 a aproximadamente el aminoácido 109 de SEQ ID NO: 2, y la segunda cadena peptídlca comprende un fragmento de aproximadamente el aminoácido 162 a aproximadamente el aminoácido 525 de SEQ ID NO: 1 o de aproximadamente el aminoácido 161 a aproximadamente el aminoácido 525 de SEQ ID NO: 2. Uno o ambos de los fragmentos comprenderá al menos un epítopo de proteína F. El fragmento en la primera cadena peptídlca tendrá habltualmente al menos 20 aminoácidos de longitud, por ejemplo, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80 aminoácidos de longitud. El fragmento en la segunda cadena peptídlca tendrá habltualmente al menos 100 aminoácidos de longitud, por ejemplo, al menos 150, al menos 200, al menos 250, al menos 300, al menos 350, al menos 400, al menos 450 aminoácidos de longitud.

(vil) Una molécula obtenible por digestión con furlna de (I), (¡I), (iii) o (¡v).

Por tanto, una secuencia de aminoácidos usada con la Invención puede encontrarse de manera natural dentro de la proteína F de VRS (por ejemplo, una proteína F de VRS soluble que carece de TM y CT, aproximadamente los aminoácidos 522-574 de SEQ ID NOS: 1 o 2), y/o puede tener una o más (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11,12 ,13,14,15,16,17,18,19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30) mutaciones de aminoácidos individuales (Inserciones, deleclones o sustituciones) en relación con una secuencia de VRS natural. Por ejemplo, se sabe cómo mutar proteínas F para eliminar sus secuencias de escisión de furlna, Impidiendo de ese modo el procesamiento intracelular. En determinadas realizaciones, la proteína F de VRS carece de TM y CT (aproximadamente los aminoácidos 522-574 de SEQ ID NOS: 1 o 2) y contiene una o más (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30) mutaciones de aminoácidos Individuales (Inserciones, deleclones o sustituciones) en relación con una secuencia de VRS natural.

Mutaciones de escisión de furina, de escisión de tripsina y de péptido de fusión

Los pollpéptldos o proteínas F de VRS pueden contener una o más mutaciones que Impiden la escisión en uno o ambos de los sitios de escisión de furlna (es decir, aminoácidos 109 y 136 de SEQ ID NOS: 1 y 2). Estas mutaciones pueden Impedir la agregación de los pollpéptldos o proteínas solubles y, de ese modo, facilitar las purificaciones, pueden Impedir la fusión célula-célula si la proteína F de VRS se expresa en la superficie de una célula, tal como por expresión de un replicón viral (por ejemplo, partículas de replicón de alfavlrus), o si la proteína F de VRS es un componente de una partícula similar a un virus. Estas mutaciones, solas o en combinación con otras mutaciones descritas en el presente documento, pueden estabilizar también la proteína en la conformación de prefusión.

Los ejemplos de mutaciones de escisión de furlna adecuadas Incluyen el reemplazo de los residuos de aminoácido 106 - 109 de SEQ ID NO: 1 o 2 con RARK (SEQ ID NO: 77), RARO (SEQ ID NO: 78), QAQN (SEQ ID NO: 79) o IEGR (SEQ ID NO: 80). Alternativamente, o además, los residuos de aminoácido 133 - 136 de SEQ ID NO: 1 o 2 pueden reemplazarse con RKKK (SEQ ID NO: 81), AAAR, QNQN (SEQ ID NO: 82), QQQR (SEQ ID NO: 83) o IEGR (SEQ ID NO: 80). (A Indica que el residuo de aminoácido se ha deleclonado). Estas mutaciones pueden combinarse, si se desea, con otras mutaciones descritas en el presente documento, tales como mutaciones en la región p27 (aminoácidos 110-136 de SEQ ID NOS: 1 o 2), incluyendo la deleción de la región p27 en su totalidad o en parte.

Estas mutaciones de escisión de furlna pueden combinarse, si se desea, con otras mutaciones descritas en el presente documento, tales como mutaciones de escisión de tripsina y mutaciones de péptido de fusión. Los ejemplos de mutaciones de escisión de tripsina adecuadas Incluyen la deleción de cualquier residuo de Usina o arglnlna entre aproximadamente la posición 101 y la posición 161 de SEQ ID NO: 1 o 2, o el reemplazo de cualquiera de tales residuos de Usina o arglnlna con un aminoácido distinto de Usina o arglnlna. Por ejemplo, los residuos de Usina y/o arglnlna en la reglón p27 (aproximadamente los aminoácidos 110-136 de SEQ ID NOS: 1 o 2) pueden sustituirse o deleclonarse, Incluyendo la deleción de la reglón p27 en su totalidad o en parte.

Alternativamente o además de las mutaciones de escisión de furina, los polipéptidos o proteínas F de VRS pueden contener una o más mutaciones en la región de péptido de fusión (aminoácidos 137 y 153 de SEQ ID NOS: 1 o 2). Por ejemplo, esta región puede delecionarse en su totalidad o en parte.

En realizaciones particulares, la secuencia de residuo de aminoácido 100 - 150 del polipéptido o proteína F de VRS, tal como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, o los ectodominios solubles del mismo, es

(Furmt) TPATNNRARKELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKKKFLGFLLGVGSAIAS (SEQ ID NO: 3) (Furdel)TPATNNRARQELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKK—RFLGFLLGVGSAIAS (SEQ ID NO: 4)

(Furx) TPATNNQAQNELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSQNQNQNFLGFLLGVGSAIAS (SEQ ID NO: 6)

(Furx R113Q, K123N, K124N) TPATNNQAQNELPQFMNYTLNNANNTNVTLSQNQNQNFLGFLLGVGSAIAS (SEQ ID NO: 5)

(Furx R113Q, K123Q, K124Q)) TPATNNQAQNELPQFMNYTLNNAQQTNVTLSQNQNQNFLGFLLGVGSAIAS (SEQ ID NO: 92)

(Delp21Furx) TPATNNQAQN..........................QNQNQNFLGFLLGVGSAIAS (SEQ ID NO: 7)

(Delp23Furx) TPATNNQAQN.............................QNQNFLGFLLGVGSAIAS (SEQ ID NO: 8)

(Delp21 furdel)TPATNNRARQ.......................... QNQQQRFLGFLLGVGSAIAS (SEQ ID NO: 109) (Delp23furdel)TPATNNRARQ.............................QQQRFLGFLLGVGSAIAS (SEQ ID NO: 9)

(Furina Nterm) TPATNNRARRELPQFMNYTLNNAQQTNVTLSQNQNQNFLGFLLGVGSAIAS (SEQ ID NO: 10) (Furina Cterm)TPATNNQAQNELPQFMNYTLNNAQQTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIAS (SEQ ID NO: 11) (Delecion de péptido de fusión 1) TPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRR......SAIAS (SEQ ID NO: 12^),

(Delecion de péptido de fusión 2) TPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRR-GVGSAIAS (SEQ ID NO: 91), o

(Factor Xa) TPATNNIEGRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKIEGRFLGFLLGVGSAIAS (SEQ ID NO: 13); en las que el símbolo indica que el aminoácido en esa posición está delecionado.

Además de las mutaciones de escisión de furina y de péptido de fusión, los polipéptidos o proteínas F de VRS solubles, tales como aquellos que carecen de la región transmembrana y la cola citoplasmática, contienen una o más secuencias de oligomerización que es una secuencia de trimerización. En la técnica se conocen bien secuencias de oligomerización adecuadas e incluyen, por ejemplo, la superhélice de la proteína de cremallera de leucina GCN4 de levadura, la secuencia de trimerización de fibritina del bacteriófago T4 (“foldon”) y el dominio de trímero de HA de influenza. Estas y otras secuencias de oligomerización adecuadas se describen en mayor detalle en el presente documento.

En realizaciones particulares, la secuencia del extremo carboxilo terminal del polipéptido o proteína F de VRS, comenzando desde la posición 480, es

(foldon corto) PLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 17); o

(foldon largo)

PLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNNKNDDKGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLS

TFL (SEQIDNO:18)

Además de cualquier combinación de mutaciones de escisión de furina, mutaciones de péptido de fusión y secuencias de oligomerización añadidas, los polipéptidos o proteínas F de VRS que contienen una región transmembrana pueden contener una secuencia de aminoácidos añadida que proporciona un sitio de escisión de proteasa. Este tipo de polipéptido o proteína F de VRS puede producirse mediante expresión en la superficie de una célula, y recuperarse en forma soluble tras la escisión de la superficie celular usando una proteasa apropiada. Generalmente, la secuencia de aminoácidos que proporciona un sitio de escisión de proteasa estará ubicada dentro de aproximadamente 60 aminoácidos, aproximadamente 50 aminoácidos, aproximadamente 40 aminoácidos, aproximadamente 30 aminoácidos, aproximadamente 20 aminoácidos, aproximadamente 10 aminoácidos, o sustancialmente adyacente al extremo amino terminal del dominio transmembrana (aminoácido 525 de SEQ ID NO: 1 o 2). En la técnica se conocen bien muchas secuencias de aminoácidos adecuadas que se escinden por proteasas comercialmente disponibles. Por ejemplo, la trombina escinde la secuencia LVPR (SEQ ID NO: 75), el factor Xa escinde la secuencia IEGR y la enterocinasa escinde la secuencia DDDDK (SEQ ID NO: 76). Estas secuencias de aminoácidos pueden Introducirse en un polipéptido F de VRS.

Los polipéptidos inmunogénicos usados según la Invención estarán habitualmente aislados o purificados. Por tanto, no estarán asociados con moléculas con las que normalmente, si es aplicable, se encuentran en la naturaleza. Por ejemplo, una proteína F usada con la invención no estará en forma de un virión de VRS (aunque puede estar en forma de un virión artificial, tal como un vlrosoma o VLP).

Los polipéptidos se prepararán habitualmente mediante expresión en un sistema huésped recombinante. Generalmente, se producen (por ejemplo, ectodominios de VRS) mediante expresión de constructos recombinantes que codifican los ectodominios en células huésped recombinantes adecuadas, aunque puede usarse cualquier método adecuado. Las células huésped recombinantes adecuadas incluyen, por ejemplo, células de insecto (por ejemplo, Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx morí, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda y Trichoplusia ni), células de mamífero (por ejemplo, ser humano, primate no humano, caballo, vaca, oveja, perro, gato y roedor (por ejemplo, hámster), células de ave (por ejemplo, pollo, pato y gansos), bacterias (por ejemplo, E. cotí, Bacillus subtilis y Streptococcus spp.), células de levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenual polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe y Yarrowia lipolitica), células de Tetrahymena (por ejemplo, Tetrahymena thermophila) o combinaciones de las mismas. En la técnica se conocen bien muchas células de insecto y células de mamífero adecuadas. Las células de insecto adecuadas incluyen, por ejemplo, células Sf9, células Sf21, células Tn5, células Schnelder S2 y células High Five (un aislado clonal derivado de la línea celular original de Trichoplusia ni BTI-TN-5B1-4 (Invitrogen)). Las células de mamífero adecuadas Incluyen, por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñón embrionario humano (células HEK293, normalmente transformadas por ADN de adenovirus de tipo 5 fragmentado), células NIH-3T3, células 293-T, células Vero, células HeLa, células PERC.6 (número de depósito de ECACC 96022940), células Hep G2, MRC-5 (ATCC CCL-171), WI-38 (ATCC CCL-75), células de pulmón de rhesus fetal (ATCC CL-160), células de riñón bovino Madln-Darby (“MDBK”), células de riñón canino Madln-Darby (“MDCK”) (por ejemplo, MDCK (NBL2), ATCC CCL34; o MDCK 33016, DSM ACC 2219), células de riñón de cría de hámster (BHK), tales como BHK21-F, células HKCC, y similares. Las células de ave adecuadas Incluyen, por ejemplo, células madre embrionarias de pollo (por ejemplo, células EBx®), fibroblastos embrionarios de pollo, células germinales embrionarias de pollo, células de pato (por ejemplo, líneas celulares AGE1.CR y AGE1.CR.plX (ProBioGen) que se describen, por ejemplo, en Vaccine 27:4975-4982 (2009) y el documento W02005/042728), células EB66, y similares.

Los expertos en la técnica conocen sistemas de expresión de células de Insecto adecuados, tales como sistemas de baculovirus, y se describen en, por ejemplo, Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987). Los materiales y métodos para sistemas de expresión de baculovirus/células de Insecto están comercialmente disponibles en forma de kit de, entre otros, Invitrogen, San Diego CA. Los expertos en la técnica también conocen sistemas de expresión de células de ave y se describen en, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 5.340.740; 5.656.479; 5.830.510; 6.114.168; y 6.500.668; la patente europea n.e EP 0787180B; la solicitud de patente europea n.e EP03291813.8; los documentos WO 03/043415; y WO 03/076601. De manera similar, en la técnica también se conocen sistemas de expresión de células bacterianas y de mamífero y se describen en, por ejemplo, Yeast Genetic Engineering (Barr et al., eds., 1989) Butterworths, Londres.

Pueden prepararse constructos recombinantes que codifican ectodominios de proteína F de VRS en vectores adecuados usando métodos convencionales. Se conocen bien varios vectores adecuados para la expresión de proteínas recombinantes en células de insecto o mamífero y son convencionales en la técnica. Los vectores adecuados pueden contener varios componentes, Incluyendo, pero sin limitarse a, uno o más de los siguientes: un origen de repllcaclón; un gen marcador seleccionare; uno o más elementos de control de la expresión, tales como un elemento de control de la transcripción (por ejemplo, un promotor, un potenciador, un terminador) y/o una o más señales de traducción; y una secuencia señal o secuencia líder para dirigirse a la ruta secretora en una célula huésped seleccionada (por ejemplo, de origen de mamífero o de una especie de mamífero o distinta de mamífero heteróloga). Por ejemplo, para la expresión en células de Insecto, se usa un vector de expresión de baculovirus adecuado, tal como pFastBac (Invitrogen), para producir partículas de baculovirus recomblnantes. Las partículas de baculovirus se amplifican y se usan para Infectar células de Insecto para que expresen una proteína recomblnante. Para la expresión en células de mamífero, se usa un vector que dirigirá la expresión del constructo en la célula huésped de mamífero deseada (por ejemplo, células de ovario de hámster chino).

Los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS pueden purificarse usando cualquier método adecuado. Por ejemplo, en la técnica se conocen métodos para purificar polipéptidos de ectodominio de F de VRS mediante cromatografía de inmunoafinidad. Ruiz-Arguello et al., J. Gen. Viral., 85:3677-3687 (2004). En la técnica se conocen bien métodos adecuados para purificar proteínas deseados incluyendo precipitación y diversos tipos de cromatografía, tal como de Interacción hidrófoba, Intercambio Iónico, afinidad, quelaclón y exclusión molecular. Pueden crearse esquemas de purificación adecuados usando dos o más de estos u otros métodos adecuados. SI se desea, los pollpéptldos de ectodomlnlo de proteína F de VRS pueden Incluir una “etiqueta” que facilita la purificación, tal como una etiqueta de epítopo o una etiqueta HIS. Tales pollpéptldos etiquetados pueden purificarse convenientemente, por ejemplo, a partir de medios acondicionados, mediante cromatografía de quelaclón o cromatografía de afinidad.

Los pollpéptldos F de VRS también pueden producirse in situ mediante expresión de ácidos nucleicos que los codifican en las células de un sujeto. Por ejemplo, mediante expresión de un ARN autorrepllcante descrito en el presente documento.

Los pollpéptldos pueden Incluir secuencias adicionales además de las secuencias de VRS. Por ejemplo, un pollpéptldo puede Incluir una secuencia para facilitar la purificación (por ejemplo, una secuencia de poll-HIs). De manera similar, para fines de expresión, el péptldo líder natural de proteína F puede sustituirse por uno diferente. Por ejemplo, la referencia 6 usó un péptldo líder de melltlna de abeja en lugar del natural.

Forma y conformación de polipéptidos

La Invención Incluye composiciones ¡nmunogénlcas que Incluyen cualquiera de las formas y conformaciones de pollpéptldos y proteínas F de VRS como en las reivindicaciones adjuntas Incluyendo cualquier combinación deseada de las formas y conformaciones de pollpéptldos y proteínas F de VRS dadas a conocer en el presente documento. El polipéptido F de VRS puede ser un trímero que comprende tres polipéptidos monoméricos. Los trímeros pueden estar monodlspersos o pueden estar en forma de una roseta, por ejemplo, debido a Interacciones entre los péptldos de fusión de trímeros Individuales. Las composiciones ¡nmunogénlcas pueden comprender pollpéptldos que son trímeros, rosetas de trímeros, y cualquier combinación de los anteriores. Además, tal como se describe adicionalmente en el presente documento, la proteína F de VRS puede estar en una conformación de posfusión, una conformación de prefusión o conformación Intermedia.

La proteína F de VRS puede estar en una conformación de prefusión, una conformación de posfusión o una conformación intermedia. Se cree que la “conformación de posfusión” de la proteína F de VRS es la conformación de baja energía de F de VRS nativa, y es un trímero caracterizado por la presencia de un haz de seis hélices que comprende 3 regiones HRB y 3 HRA. La conformación de posfusión tiene una forma de “muleta” o “soporte de golf” característica mediante microscopía electrónica. La “conformación de prefusión” de la proteína F de VRS es una conformación caracterizada por un trímero que contiene una superhélice que comprende 3 regiones HRB. El péptldo de fusión no está expuesto en la conformación de prefusión y, por tanto, las conformaciones de prefusión generalmente no forman rosetas, y tienen una forma de “piruleta” o “bola y tallo” mediante microscopía electrónica.

En algunos aspectos, la proteína F de VRS está en la conformación de posfusión. Por ejemplo, la proteína F de VRS puede estar en forma de un trímero monodisperso en la conformación de posfusión, o en forma de una roseta compuesta por trímeros de posfusión.

El polipéptido F de VRS es un trímero.

En otros aspectos, la proteína F de VRS está en la conformación de prefusión. Sin querer restringirse a ninguna teoría particular, se cree que la conformación de prefusión o formas Intermedias de la proteína F de VRS pueden contener epítopos que son los mismos que los de la proteína F de VRS expresada en vlrlones de VRS naturales, y por tanto proporcionan ventajas para generar anticuerpos neutralizantes.

Algunos aspectos de la Invención usan un pollpéptldo que desfavorece la conformación de posfusión de la proteína F. Preferiblemente, los pollpéptldos (en su totalidad o en parte) mostrarán un epítopo de la proteína F de prefusión o un epítopo de una conformación Intermedia en la conversión desde la conformación de prefusión hasta la conformación de posfusión. Estos pollpéptldos pueden ser proteínas F nativas o mutadas en un estado de prefusión, pueden ser proteínas F nativas o mutadas en una conformación Intermedia o pueden ser una población de proteínas nativas o mutadas donde la conformación de posfusión se ha desfavorecido o excluido preferentemente. En ciertos casos, la proteína nativa o mutada puede combinarse con una o más moléculas adicionales que ayudan a mantener los pollpéptldos en uno de los estados anteriores tales como un anticuerpo monoclonal que se une preferentemente a la conformación de prefusión o una conformación Intermedia. Además, los pollpéptldos pueden ser derivados de proteínas F nativas. Tales derivados Incluyen pollpéptldos que comprenden uno o más fragmentos de una proteína F nativa, pollpéptldos de fusión que comprenden una proteína F nativa (o fragmento de la misma) y una secuencia heteróloga, y pollpéptldos que comprenden una secuencia de proteína F nativa que tiene una o más mutaciones. Estas (u otras) modificaciones pueden desfavorecer la conformación de posfusión. Los enfoques a modo de ejemplo para desfavorecer la conformación de posfusión Incluyen estabilizar la conformación de prefusión, estabilizar una conformación Intermedia, desestablllzar la conformación de posfusión o aumentar la barrera de activación de una o más etapas que conducen a la conformación de posfusión.

En otra realización, la invención es un polipéptido que muestra al menos un epítopo que es específico para la proteína F en conformación de prefusión o una proteína F en conformación intermedia. Un epítopo que es específico para la proteína F en conformación de prefusión o una proteína F en conformación intermedia es un epítopo que no se presenta en la conformación de posfusión. Se prefiere que el al menos un epítopo se presente de manera estable, por ejemplo, el epítopo se presenta de manera estable en disolución durante al menos doce horas, al menos un día, al menos dos días, al menos cuatro días, al menos seis días, al menos una semana, al menos dos semanas, al menos cuatro semanas o al menos seis semanas.

Tales polipéptidos pueden ser proteínas F nativas o mutadas en el estado de prefusión, un estado intermedio o una población de estados donde el estado de posfusión está subrepresentado o en un porcentaje menor que para proteínas F nativas aisladas, o puede ser un derivado de una proteína F nativa. Tales derivados incluyen polipéptidos que comprenden uno o más fragmentos de una proteína F nativa, polipéptidos de fusión que comprenden una proteína F nativa (o fragmento de la misma) y una secuencia heteróloga, y polipéptidos que comprenden una secuencia de proteína F nativa que tiene una o más mutaciones. Estas (u otras) modificaciones pueden estabilizar una secuencia de aminoácidos de proteína F en su conformación de prefusión, estabilizar una secuencia de aminoácidos de proteína F en una conformación intermedia, desestabilizar la conformación de posfusión de una secuencia de aminoácidos de proteína F, aumentar la barrera de energía en una transición que conduce a la conformación de posfusión de una secuencia de aminoácidos de proteína F, o una combinación de dos o más de los anteriores.

Los dominios TM y/o CT de las proteínas F son importantes para la estabilidad de la conformación de prefusión (8). Sin embargo, ya que puede ser deseable no incluir dominios transmembranas en inmunógenos solubles, el efecto funcional de TM puede lograrse por otros medios. Por ejemplo, el comportamiento de pre- y posfusión de la proteína F del virus parainfluenza 5 se ha estudiado en algún detalle (6), y los autores estabilizaron la estructura de prefusión de ED fusionando un dominio de trimerización heterólogo al extremo C-terminal del ED.

Dominio de oligomerización

La composición puede comprender un polipéptido F de virus respiratorio sincitial (F de VRS) recombinante soluble en forma de un trímero que comprende un primer dominio y un segundo dominio, en el que (i) el primer dominio comprende el ectodominio de proteína F de VRS en su totalidad o en parte, y (ii) el segundo dominio comprende un dominio de oligomerización heterólogo que es la secuencia de trimerización de fibritina de bacteriófago T4 (“foldon”),

en el que el ectodominio de F de VRS en su totalidad o en parte comprende:

a) los aminoácidos 22-525 de SEQ ID NO: 1;

b) los aminoácidos 23-525 de SEQ ID NO: 2; o

c) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad con (a) o (b).

El segundo dominio permite la oligomerización del polipéptido, facilitando de ese modo que el primer dominio adopte un estado de prefusión o un estado intermedio. El polipéptido estará presente como un trímero.

Están disponibles diversos dominios de oligomerización para el experto en la técnica y se dan a conocer en el presente documento. Estos son secuencias de aminoácidos que pueden formar una estructura que puede interaccionar con los dominios de oligomerización (ya sean iguales o diferentes) en otros polipéptidos (ya sean iguales o diferentes) de manera que los múltiples polipéptidos puedan asociarse (habitualmente de manera no covalente) para formar oligómeros, por ejemplo, trímeros. Por ejemplo, la trimerización de la proteína F de VIH (es decir, gp160) se ha logrado fusionándola con la subunidad catalítica de la aspartato transcarbamoilasa (ATCasa) de E. coli, que es de manera natural un trímero estable (9). De manera similar, la trimerización de las proteínas F de VIH (10) y PIV5 (6) se ha logrado fusionando sus ectodominios con GCNt. Por tanto, la divulgación incluye la superhélice de la proteína de cremallera de leucina GCN4 de levadura (11). La trimerización del ectodominio de la proteína HA del virus influenza A se ha logrado usando una secuencia de trimerización (‘foldon’) de fibritina de bacteriófago T4 (GSGYIPEAPRDGQ AYVRKDGEWVLLSTFL - SEQ ID NO: 19) (12). Por tanto, el dominio de oligomerización usado con la presente invención comprende un foldon de este tipo.

Los oligómeros proteicos que se producen de manera natural (tanto heterooligómeros como homooligómeros) se asocian en una variedad de modos diferentes, por ejemplo, mediante asociación de láminas 6 en diferentes monómeros, mediante asociación de hélices a en diferentes monómeros, mediante asociación de parches superficiales hidrófobos, etc. Un motivo estructural común implicado en la oligomerización de proteínas es el dominio de superhélice. El motivo estructural de superhélice a puede formar por sí misma espirales, y dos, tres, cuatro o cinco hélices a pueden envolverse unas alrededor de otras para formar una hélice superenrollada levógira conocida como “superhélice”, aunque se han diseñado hélices superenrolladas dextrógiras artificiales (13-19). La simplicidad del dominio de superhélice lo ha convertido en una elección popular para diseñar proteínas quiméricas con estados de oligomerización definidos (16).

En una estructura de superhélice, las hélices a interaccionan a través de residuos hidrófobos que forman una franja apolar a lo largo de un lado de cada hélice, y puede haber también interacciones electrostáticas estabilizantes entre cadenas laterales en cualquier lado de esta franja. Dentro de la repetición de héptada abcdefg de una hélice a, la franja apolar está definida por cadenas laterales hidrófobas en los residuos a y d, siendo principalmente cualquier interacción electrostática en los residuos e y g. La posición a es lo más frecuentemente Leu, lie o Ala y la posición d es habitualmente Leu o Ala. Los residuos e y g son a menudo Glu o Gln, con Arg y Lys también prominentes en la posición g. Son comunes residuos cargados en las posiciones b, c y f ya que estos residuos están en contacto con el disolvente. Sin embargo, hay excepciones a este patrón de héptada general, y algunas veces se encuentran residuos de Pro dentro de la héptada. Tales excepciones tienen habitualmente significación funcional incluyendo, a modo de ejemplo, desestabilización del dominio de oligomerización para permitir el replegamiento y reordenamiento tal como se produce en la proteína F.

En la técnica se conocen cientos de secuencias de dominio de superhélice. Como alternativa a usar un dominio de superhélice natural, pueden usarse dominios de superhélice artificiales (21, 22). Debido a la estructura sumamente repetitiva de un dominio de superhélice, el dominio es particularmente propenso a modelado informático ya que las porciones de estructura principal de cada residuo de aminoácido pueden parametrizarse en lugar de tratar cada porción de estructura principal de un residuo como una unidad única con sus propias variables.

El dominio de superhélice dado a conocer es preferiblemente uno que forma un trímero, de manera que el polipéptido también puede ensamblarse en un trímero. Los dominios de superhélice dados a conocer son aquellos tomados de proteínas transmembrana bacterianas. Un subconjunto dado a conocer de proteínas transmembrana son las adhesinas (es decir, proteínas de superficie celular que median en la adhesión a otras células o a superficies), y particularmente adhesinas no fimbriales (por ejemplo, en la familia de adhesinas de superhélice de oligomerización, u ‘Oca’). Las secuencias específicas incluyen las dadas a conocer en la referencia 24 de adhesina de Yersinia enterocolitica YadA, adhesina de Neisseria meningitidis NadA, proteína de superficie de Moraxella catarrhalis UspA2, y otras adhesinas, tales como la adhesina HadA de Haemophilus influenzae biogrupo aegyptius, etc. (SEQ ID NO 28-31 y 42-58 de la referencia 24). Además, el factor de transcripción de choque térmico eucariota tiene un dominio de trimerización de superhélice que puede expresarse por separado.

Dentro de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que tiene una región de superhélice, la naturaleza de repetición de héptada de las hélices a significa que el límite del dominio de superhélice puede determinarse con cierta precisión, pero el residuo preciso donde puede decirse que termina una disposición de superhélice puede no conocerse con precisión absoluta. Sin embargo, esta falta de precisión absoluta no es un problema para la práctica de la invención, ya que las pruebas de rutina pueden revelar si la superhélice requiere algún residuo de aminoácido particular del que podría haber dudas. Incluso así, no es un requisito que los límites se conozcan con precisión absoluta, ya que el único requisito básico es que el dominio de superhélice funcione de un modo que permita que el polipéptido se oligomerice con otros dominios de superhélice sin destruir la función de los otros dominios dentro del polipéptido.

Otra clase de dominio de oligomerización se encuentra en la triple hélice levógira conocida como hélice de colágeno (25). Estas secuencias que forman triple hélice implican una secuencia de repetición de tripéptido básica de 1Gly-2Xaa-3Xaa, donde 2Xaa es a menudo Pro y 3Xaa es a menudo 4-hidroxiprolina. Aunque este motivo se conoce como hélice de “colágeno”, se encuentra en muchas proteínas más allá del colágeno. Por tanto, el dominio de oligomerización puede ser una secuencia que comprende múltiples repeticiones del motivo de secuencia 1Gly-2Xaa-3Xaa, motivo que se pliega para formar una estructura helicoidal que puede oligomerizarse con estructuras helicoidales correspondientes en otras cadenas polipeptídicas.

El colágeno también proporciona otra clase de dominio de oligomerización. La referencia 26 describe un motivo que se encuentra en el dominio 1 no colagenoso (NC1) del colágeno tipo X, y este motivo puede usarse para la formación de trímeros y multímeros de orden superior sin una triple hélice. Esta asociación trimérica es altamente termoestable sin enlaces disulfuro intermoleculares. El dominio de oligomerización puede comprender por tanto una secuencia de NC1.

Otros dominios de oligomerización pueden derivarse de los dominios transmembrana de proteínas TM oligoméricas. Ya que estas son habitualmente lipófilas, los residuos hidrófobos situados en el exterior de sus regiones TM pueden sustituirse por residuos cargados para proporcionar un dominio soluble. Tales métodos de solubilización de dominios transmembrana mediante ingeniería de proteínas se conocen en la técnica, por ejemplo, de la referencia 27. Este método también se ha usado para GCN4, donde las posiciones de repetición de héptada “a” y “d” se reemplazaron por isoleucina (11): KQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEA (SEQ ID NO: 20).

Los dominios de oligomerización usados con la invención generalmente pueden mantener una estructura oligomérica sin la necesidad de la formación de puentes disulfuro entre monómeros, pero los oligómeros que contienen monómeros unidos por disulfuro no se excluyen de la invención.

Además de usar un dominio de oligomerización para estabilizar una proteína F en su conformación de prefusión, puede usarse mutación. Por ejemplo, la referencia 28 notifica que la mutación en una región conservada de la subunldad F2 de las proteínas F en el virus de simio 5 o el virus Hendra puede Influir en la estabilidad de la conformación de prefusión.

En algunas circunstancias, también puede usarse un pH bajo para favorecer la conformación de prefusión.

Estabilización del trímero de dominio HRB

En otro aspecto preferido de la presente divulgación, la conformación de posfusión de la proteína F puede verse desfavorecida por la estabilización del trímero de dominio HRB. El dominio HRB forma una superhélice tricatenaria en las formas de prefusión y probablemente la intermedia. Tal como se comentó en la sección anterior, debido a su simplicidad, las superhélices se han estudiado extensamente como sistemas modelo para interacciones ¡ntermoleculares entre proteínas y como sistemas modelo para interacciones intramoleculares de mayor alcance (es decir, Interacciones de plegamlento terciarlo). Estos estudios son útiles en la enseñanza de métodos que puedan usarse para estabilizar el dominio HRB en la forma de superhélice trlmérlca. A modo de ejemplo, uno o más residuos en las posiciones a y/o d de la repetición de héptada pueden reemplazarse por residuos que favorecen la formación de superhélices trlmérlcas estables tales como residuos de lie. Además, aunque menos preferido, pueden eliminarse interacciones iónicas desfavorables en las posiciones e y g o pueden añadirse interacciones iónicas favorables en las posiciones e y g.

La región preferida del dominio HRB para la manipulación es la repetición de héptada entre P484-N517. Ejemplos preferidos de residuos a y afpara seleccionarlos como diana para las mutaciones son F488, 1492, V495, 1499, S502, 1506, S509, L512 y V516. Los residuos de serlna se prefieren especialmente ya que el reemplazo de los residuos hidrófilos por residuos hidrófobos estabilizaría el núcleo hidrófobo de la superhélice. Otra diana preferida sería la fenllalanlna con un residuo hidrófobo más pequeño que se empaquetaría mejor en el núcleo tal como una isoleucina.

Desestabilización del trímero de dominio HRA

En otro aspecto preferido de la presente divulgación, la conformación de posfusión de la proteína F puede verse desfavorecida por la desestabilización del trímero de dominio HRA. El dominio HRA forma una superhélice tricatenaria en las formas de posfusión y posiblemente una o más formas intermedias. A modo de ejemplo, uno o más residuos en las posiciones a y/o d de la repetición de héptada pueden reemplazarse por residuos que desfavorecen la formación de superhélices trlmérlcas estables. Además, aunque menos preferido, pueden eliminarse interacciones iónicas favorables en las posiciones e y g o pueden añadirse interacciones iónicas desfavorables en las posiciones e y g. Preferiblemente, tales mutaciones se seleccionarán para que tengan un impacto mínimo sobre la estabilidad del dominio HRA en la conformación de prefusión ya que pueden modelarse basándose en las estructuras cristalinas disponibles de la proteína PIV5 F en las formas de prefusión y posfusión.

Otras modificaciones

Además de las modificaciones anteriores, pueden diseñarse además modificaciones basándose en el modelado molecular de las proteínas F de VRSh basándose en las estructuras cristalinas disponibles de la proteína F de PIV5 en las formas de prefusión y posfusión. Pueden hacerse mutaciones que desestabilizan la conformación de posfusión tales como el pliegue 6HB de los dominios HRA y HRB o que estabilizan la conformación de prefusión tales como el pliegue de HRA en la conformación de prefusión. Además, la barrera de energía de las transiciones que conducen a la conformación de posfusión pueden aumentarse. Aunque un experto en la técnica apreciará que la estabilización de la conformación Inicial o la desestabilización de la conformación final puede tener el efecto de aumentar la barrera de energía, pueden Introducirse otras modificaciones que afectan al propio estado de transición.

Como ejemplo adicional, los aminoácidos N-terminales con respecto al dominio HRB (aproximadamente a.a. 449 482, preferiblemente V459-F483) actúan como “anclaje” que permite que el dominio HRB se desplace desde un lado del trímero de proteína F hasta el otro lado de modo que el dominio HRB pueda participar en el 6HB de la conformación de posfusión. La deleción de uno o más de estos aminoácidos afectará a o impedirá completamente la participación del dominio HRB en el pliegue 6HB de la conformación de posfusión de la proteína F (véase la figura 3). Además, la interacción entre el anclaje y la proteína F en la conformación de prefusión puede estabilizarse para impedir que el anclaje se aleje para permitir que el dominio HRB participe en el pliegue 6HB. Ejemplos de mutaciones estabilizantes que podrían hacerse son puentes de cisteína entre el anclaje y la porción de la proteína F con la que entra en contacto el anclaje en la conformación de prefusión.

Aún otro ejemplo es la estabilización del HRA en la conformación de prefusión (residuos T50-Y306). De nuevo, basándose en las estructuras cristalinas de proteínas F homólogas, el núcleo hidrófobo puede estabilizarse reemplazando residuos iónicos o hidrófilos enterrados por residuos hidrófobos de tamaño similar. Además, pueden introducirse puentes de cisteína en la superficie o dentro del núcleo. Además, tal como se demostró con un extenso análisis de la estructura cristalina de mutantes de lisozima, las proteínas o núcleos hidrófobos son relativamente rígidos y, por tanto, la Introducción de agujeros desestablllzó de manera predecible los mutantes de lisozima. De manera similar, el reempaquetamlento del núcleo de la proteína F en la conformación de prefusión para eliminar cualquier agujero natural puede estabilizar la proteína F en las formas de prefusión o Intermedia, desfavoreciendo por tanto la conformación de posfusión.

Métodos para preparar composiciones

Se dan a conocer métodos para preparar composiciones y composiciones que contienen proteína F de VRS, en particular pollpéptldos de ectodomlnlo de F de VRS solubles, Incluyendo composiciones ¡nmunogénlcas. Preferiblemente, los polipéptidos de ectodominio de F de VRS están en una sola forma, trímeros no escindidos, trímeros escindidos, rosetas de trímeros escindidos. Estos tipos de composiciones pueden usarse para una variedad de fines, tales como en la producción de composiciones ¡nmunogénlcas que pueden usarse para producir vacunas. La presencia de una sola forma deseada de F de VRS, o un equilibrio dinámico entre formas conocidas, en una composición ¡nmunogénlca, proporciona una formulación, solubilidad y estabilidad más predecibles, y una respuesta ¡nmunltarla más predecible cuando se administra la composición a un sujeto.

Cuando se producen pollpéptldos de ectodomlnlo de proteína F de VRS mediante expresión recomblnante convencional en células huésped, los pollpéptldos se escinden en los sitios de escisión de furlna en aproximadamente la posición 109/110 y en aproximadamente la posición 136/137 durante la producción en la célula huésped antes de que se secreten a los medios de cultivo. La escisión de los pollpéptldos por las células huésped es permisiva para el replegamlento del pollpéptldo de ectodomlnlo de proteína F de VRS, lo que da como resultado la exposición del péptldo de fusión hidrófobo. Por consiguiente, los pollpéptldos de ectodomlnlo de proteína F de VRS escindidos, debido a la presencia de un péptldo de fusión expuesto, forman rosetas y se asocian con lípldos y lipoproteínas que se derivan de las células huésped y los medios de cultivo. De hecho, la microscopía electrónica del ectodomlnlo de F de VRS escindido que se produce en células de Insecto y se purifica en virtud de una etiqueta HIS6 mostró que los pollpéptldos tenían una forma de muleta consecuente con una forma de posfusión y estaban unidos a lo que parecían restos celulares residuales. Por consiguiente, no pueden obtenerse fácilmente preparaciones de alta pureza de rosetas y otras formas y conformaciones de pollpéptldos de ectodomlnlo de proteína F de VRS mediante expresión recombinante convencional en células huésped.

Métodos para producir polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS escindidos

En un aspecto, la divulgación proporciona un método para preparar una composición que contiene pollpéptldos de ectodomlnlo de proteína F de VRS escindidos. En general, el método Implica proporcionar pollpéptldos de ectodomlnlo de proteína F de VRS no escindidos y luego escindirlos para producir una subunldad Fi y una subunldad F2. Tal como se describe en el presente documento, los pollpéptldos de ectodomlnlo de proteína F de VRS no escindidos pueden purificarse y separarse fácilmente de lípldos y lipoproteínas contaminantes usando métodos adecuados, tales como cromatografía de exclusión molecular. Sin querer restringirse a ninguna teoría particular, se cree que el péptldo de fusión hidrófobo no se expone en los pollpéptldos de ectodomlnlo de proteína F de VRS no escindidos y, por tanto, los pollpéptldos no escindidos no se asocian con contaminantes lipidíeos y lipoproteicos. Tal como se describe además en el presente documento, los ectodominios de proteína F de VRS no escindidos pueden escindirse para producir las subunidades F1 y F2, que pueden purificarse como trímeros, rosetas de trímeros o una mezcla de trímeros y rosetas de trímeros.

Pueden producirse pollpéptldos de ectodomlnlo de proteína F de VRS no escindidos usando cualquier método adecuado. Por ejemplo, mediante producción recomblnante en células huésped que no contienen furlna activa o proteasas similares a furlna en el momento en que están produciéndose los pollpéptldos de ectodomlnlo de proteína F de VRS. Puede usarse una variedad de métodos para lograr este método de producción, tales como, producción en células huésped recomblnantes que están mutadas para Impedir la expresión de furlna o proteasa similar a furlna (“desactivación” condicional o completa), y diversos métodos que reducen o Impiden la expresión de furlna o proteasas similares a furlna en las células huésped, por ejemplo, usando Interferencia de ARN u otros métodos similares, o Inhibiendo la actividad de furlna o proteasa similar a furlna en células huésped usando Inhibidores de las proteasas.

Se producen preferiblemente pollpéptldos de ectodomlnlo de proteína F de VRS no escindidos mediante expresión recomblnante de constructos que codifican un ectodomlnlo de proteína F de VRS en el que la secuencia de aminoácidos de los sitios de escisión de furlna están alterados, de modo que los pollpéptldos de ectodomlnlo de proteína F de VRS se secretan por una célula huésped que produce los pollpéptldos sin escindir. Los pollpéptldos de ectodomlnlo de proteína F de VRS no escindidos pueden producirse usando cualquier célula huésped adecuada, tal como células de insecto (por ejemplo, Aedes aegypti, Autographa califomica, Bombyx morí, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperday Trichoplusia ni), células de mamífero (por ejemplo, ser humano, primate no humano, caballo, vaca, oveja, perro, gato y roedor (por ejemplo, hámster), células de ave (por ejemplo, pollo, pato y gansos), bacterias (por ejemplo, E. cotí, Bacillus subtilis y Streptococcus spp.), células de levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe y Yarrowia ¡¡política), células de Tetrahymena (por ejemplo, Tetrahymena thermophila) o combinaciones de las mismas. En la técnica se conocen bien muchas células de Insecto y células de mamífero adecuadas. Las células de Insecto adecuadas Incluyen, por ejemplo, células Sf9, células Sf21, células Tn5, células Schnelder S2 y células High Five (un aislado clonal derivado de la línea celular original de Trichoplusia ni BTI-TN-5B1 -4 (Invitrogen)). Las células de mamífero adecuadas Incluyen, por ejemplo, células de ovarlo de hámster chino (CHO), células de riñón embrionario humano (células HEK293, normalmente transformadas por ADN de adenovirus de tipo 5 fragmentado), células NIH-3T3, células 293-T, células Vero, células HeLa, células PERC.6 (número de depósito de ECACC 96022940), células Hep G2, MRC-5 (ATCC CCL-171), WI-38 (ATCC CCL-75), células de pulmón de rhesus fetal (ATCC CL-160), células de riñón bovino Madin-Darby (“MDBK”), células de riñón canino Madin-Darby (“MDCK”) (por ejemplo, MDCK (NBL2), ATCC CCL34; o MDCK 33016, DSM ACC 2219), células de riñón de cría de hámster (BHK), tales como BHK21-F, células HKCC, y similares. Las células de ave adecuadas incluyen, por ejemplo, células madre embrionarias de pollo (por ejemplo, células EBx®), fibroblastos embrionarios de pollo, células germinales embrionarias de pollo, células de pato (por ejemplo, líneas celulares AGE1.CR y AGE1.CR.plX (ProBioGen) que se describen, por ejemplo, en Vaccine 27:4975-4982 (2009) y el documento W02005/042728), células EB66, y similares.

Los expertos en la técnica conocen sistemas de expresión de células de Insectos adecuados, tales como sistemas de baculovirus, y se describen en, por ejemplo, Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987). Los materiales y métodos para sistemas de expresión de baculovlrus/células de Insecto están comercialmente disponibles en forma de kit de, entre otros, Invitrogen, San Diego CA. Los expertos en la técnica también conocen sistemas de expresión de células de ave y se describen en, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 5.340.740; 5.656.479; 5.830.510; 6.114.168; y 6.500.668; la patente europea n.e EP 0787180B; la solicitud de patente europea n.e EP03291813.8; los documentos WO 03/043415; y WO 03/076601. De manera similar, en la técnica también se conocen sistemas de expresión de células bacterianas y de mamífero y se describen en, por ejemplo, Yeast Genetic Engineering (Barr et al., eds., 1989) Butterworths, Londres.

Generalmente, la secuencia de aminoácidos de un ectodomlnlo de proteína F de VRS no escindido se altera para Impedir la escisión en los sitios de escisión de furlna en aproximadamente la posición 109/110 y aproximadamente la posición 136/137, pero contiene un sitio de escisión de proteasa que se produce de manera natural o Introducido, que cuando se escinde produce una subunldad Fi y una subunldad F2. Por ejemplo, el pollpéptldo de ectodomlnlo de proteína F de VRS no escindido puede tener una secuencia de aminoácidos que se altera para Impedir la escisión en los sitios de escisión de furlna en aproximadamente la posición 109/110 y aproximadamente la posición 136/137, pero contiene uno o más sitios de escisión de proteasa que se producen de manera natural o escindidos desde aproximadamente la posición 101 hasta aproximadamente la posición 161.

Un experto habitual en la técnica puede diseñar y prever fácilmente una variedad de secuencias de aminoácidos particulares que permitirán la producción y expresión de pollpéptldos de ectodomlnlo de proteína F de VRS no escindidos por células huésped, Incluyendo secuencias de aminoácidos que no se escinden en los sitios de escisión de furina en aproximadamente la posición 109/110 y aproximadamente la posición 136/137. En general, uno o más aminoácidos que son parte de, o están ubicados cerca de, los sitios de escisión de furlna en aproximadamente la posición 109/110 y aproximadamente la posición 136/137 se reemplazan o delecionan Independientemente. Se conocen algunas sustituciones y deleciones de aminoácidos que son adecuadas para Impedir la escisión de pollpéptldos de ectodomlnlo de proteína F de VRS. Por ejemplo, se han descrito las sustituciones R108N, R109N, R108N/R109N, que Inhiben la escisión en 109/110, y la sustitución K131Q o la deleción de los aminoácidos en las posiciones 131-134, que inhiben la escisión en 136/137. Gonzalez-Reyes et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 98:9859-9864 (2001). Se ha descrito un polipéptido de ectodominio de F de VRS no escindido que contiene las sustituciones de aminoácidos R108N/R109N/ K131Q/R133Q/R135Q/R136Q. Ruiz-Arguello et al., J. Gen. Viral. 85:3677687 (2004). Tal como se describe en detalle en el presente documento, secuencias de aminoácidos de proteína F de VRS adicionales que dan como resultado la secreción del pollpéptldo de ectodomlnlo de F de VRS de una célula huésped sin escindir contienen sitios de escisión de furlna alterados, por ejemplo, secuencias de aminoácidos alteradas en aproximadamente las posiciones 106-109 y en aproximadamente las posiciones 133-136. Los sitios de escisión de furlna alterados contienen al menos una sustitución o deleción de aminoácido en aproximadamente las posiciones 106-109, y al menos una sustitución o deleción de aminoácido en aproximadamente las posiciones 133-136.

De manera similar, son posibles una variedad de secuencias de aminoácidos particulares de pollpéptldos de ectodomlnlo de proteína F de VRS no escindidos que contienen un sitio de escisión de proteasa (por ejemplo, que se produce de manera natural o Introducido) que cuando se escinden producen una primera subunldad que comprende una F1 y una segunda subunidad que comprende F2, y pueden diseñarse y preverse fácilmente. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de proteína F de VRS desde aproximadamente la posición 101 hasta aproximadamente la posición 161 contiene sitios de escisión de tripsina, y uno o más de los sitios de escisión de tripsina pueden escindirse mediante tripsina para generar las subunldades F1 y F2. Si se desea, pueden Introducirse uno o más sitios de reconocimiento de proteasa adecuados en el pollpéptldo de ectodomlnlo de proteína F de VRS no escindido, por ejemplo, entre aproximadamente las posiciones 101 y aproximadamente la posición 161. Los sitios de reconocimiento de proteasa Introducidos pueden escindirse usando la proteasa apropiada para generar las subunldades F1 y F2. Cuando se Introduce un sitio de reconocimiento de proteasa en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de ectodominio de proteína F de VRS no escindido, se prefiere que el sitio se reconozca por una proteasa que no escinde el ectodominio de proteína F de VRS que se produce de manera natural.

El método dado a conocer Incluye: a) proporcionar polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos que contienen un sitio de escisión de proteasa que, cuando se escinde, produce las subunldades Fi y F2, y b) escindir los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos con una proteasa que reconoce el sitio de escisión de proteasa. En general, la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos contiene sitios de escisión de furina alterados, y los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS se secretan de una célula huésped que los produce sin escindir en los sitios de escisión de furina en aproximadamente las posiciones 106-109 y aproximadamente las posiciones 131-136.

Los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos proporcionados pueden purificarse hasta el grado deseado. Por ejemplo, los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos proporcionados pueden proporcionarse como un Usado celular, homogeneizado celular o medio acondicionado de cultivo celular que está sustancialmente sin procesar (por ejemplo, sin procesar o solo clarificado), o en forma parcial o sustancialmente purificada. En ejemplos particulares, los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos proporcionados se proporcionan en medios acondicionados de cultivo celular seleccionados del grupo que consiste en medios acondicionados de células de insecto, medios acondicionados de células de mamífero, medios acondicionados de células de ave, medios acondicionados de células de levadura, medios acondicionados de células de Tetrahymena, y combinaciones de los mismos.

Se prefiere generalmente que los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos proporcionados se purifiquen, por ejemplo, se purifiquen para que sean al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 % o sustancialmente homogéneos. Tal como se describe en el presente documento, los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos pueden purificarse fácilmente de lípidos y lipoproteínas, mientras que las formas escindidas producidas convencionalmente de proteína F de VRS se purifican conjuntamente con contaminantes lipídicos y lipoproteicos. Por consiguiente, cuando se proporcionan polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos purificados, el método puede usarse para producir fácilmente una composición que contiene ectodomlnlos de proteína F de VRS escindidos que están sustancialmente libres de lípidos o lipoproteínas.

Se conocen bien métodos adecuados para escindir polipéptidos usando una proteasa y son convencionales en la técnica. Generalmente, los polipéptidos que van a escindirse se combinan con una cantidad suficiente de proteasa en condiciones (por ejemplo, pH, concentración de polipéptido y proteasa, temperatura) adecuadas para la escisión del polipéptido. Muchas proteasas adecuadas están comercialmente disponibles, y se conocen bien condiciones adecuadas para realizar la escisión de polipéptidos para muchas proteasas. Si se desea, los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS escindidos pueden purificarse tras la escisión con proteasa.

En un ejemplo del método dado a conocer, se proporcionan polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos que contienen un péptido de fusión Intacto, tal como un polipéptido de ectodominio de proteína F de VRS no escindido en el que ninguno de los aminoácidos de las posiciones 137-154 están sustituidos o delecionados. En algunas realizaciones, los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos proporcionados se purifican. Los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos proporcionados que contienen un péptido de fusión Intacto se escinden, y la escisión da como resultado la formación de rosetas de trímeros de polipéptido de ectodominio de proteína F de VRS escindidos. Si se desea, las rosetas pueden purificarse además usando cualquier método adecuado, tal como cromatografía de exclusión molecular.

En otro ejemplo del método, se proporcionan polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos que contienen un péptido de fusión alterado, tal como un polipéptido de ectodominio de proteína F de VRS no escindido en el que aproximadamente los aminoácidos 137-152, aproximadamente los aminoácidos 137-153, aproximadamente los aminoácidos 137-145 o aproximadamente los aminoácidos 137-142 se delecionan. También se han descrito otras deleciones de péptidos de fusión adecuadas, tales como la deleción de los aminoácidos en las posiciones 137-146. Ruiz-Arguello etal., J. Gen. Viral., 85:3677-3687 (2004).

En algunas realizaciones, los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos proporcionados se purifican. Los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos proporcionados se escinden, y la escisión da como resultado la formación de trímeros de polipéptido de ectodominio de proteína F de VRS escindidos. Si se desea, los trímeros pueden purificarse usando cualquier método adecuado, tal como cromatografía de exclusión molecular.

Los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos dados a conocer se escinden, por ejemplo, con tripsina, y la escisión da como resultado la formación de trímeros escindidos, rosetas de trímeros escindidos o una combinación de trímeros escindidos y rosetas de trímeros escindidos de polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS. Si se desea, los trímeros escindidos y/o rosetas de trímeros escindidos pueden purificarse además usando cualquier método adecuado, tal como cromatografía de exclusión molecular.

Métodos para producir polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos

En otro aspecto, la divulgación proporciona un método para preparar una composición que contiene polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos. En general, el método implica proporcionar un material biológico que contiene polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos, tal como un Usado celular, homogenelzado celular o medio acondicionado de cultivo celular, y luego purificar los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos. Tal como se describe en el presente documento, se ha descubierto que los monómeros de pollpéptldo de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos purificados pueden autoasoclarse para formar trímeros no escindidos.

El método de este aspecto de la divulgación Incluye: a) proporcionar un material biológico que contiene polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos, tal como un Usado celular, homogenelzado celular o medio acondicionado de cultivo celular; y b) purificar trímeros de pollpéptldo de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos del material biológico.

En general, la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos contiene sitios de escisión de furlna alterados, y los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS se secretan de una célula huésped que los produce sin escindir entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161 (Incluyendo en los sitios de escisión de furlna en las posiciones 106-109 y 131-136).

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del pollpéptldo de ectodominio de proteína F de VRS contiene sitios de escisión de furlna alterados, y otros sitios de escisión de proteasa (por ejemplo, sitios de escisión de tripsina) entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161 se alteran o se deleclonan para Impedir la escisión por proteasa (por ejemplo, tripsina). Por ejemplo, se sabe bien que la tripsina escinde después de residuos de Usina y arglnlna. En determinadas realizaciones preferidas, la secuencia de aminoácidos del pollpéptldo de ectodominio de proteína F de VRS no escindido contiene sitios de escisión de furlna alterados, uno o más residuos de Usina y/o arglnlna (por ejemplo, todos los residuos de Usina y arglnlna) presentes entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161 se deleclonan o se reemplazan por un aminoácido que no es Usina ni arglnlna, los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS se secretan de una célula huésped que los produce sin escindir entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161, y los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no se escinden por la tripsina entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161. Preferiblemente, los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no se escinden por la tripsina cuando se trata una disolución de 1 mg/ml de pollpéptldo de ectodominio de proteína F de VRS (diluido en Tris 25 mM pH 7,5, NaCI 300 mM) con una milésima del volumen de la disolución de tripsina (tripsina de plasma bovino diluida hasta una concentración de 1 mg/ml en Tris 25 mM pH 7,5, NaCI 300 mM; la razón en masa final en la reacción de digestión es tripsina: ectodominio de F de VRS 0,001:1; tripsina usada a 10-15 unidades BAEE por mg de proteína) durante 1 hora a 37 °C.

SI se desea, los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos (por ejemplo, los polipéptidos que contienen sitios de escisión de furlna alterados, y polipéptidos que contienen sitios de escisión de furlna alterados y sitios de escisión de tripsina alterados) pueden contener además un péptldo de fusión alterado, tal como un pollpéptldo de ectodominio de proteína F de VRS no escindido en el que, por ejemplo, se deleclonan aproximadamente los aminoácidos 137-152, se delecionan aproximadamente los aminoácidos 137-154, se delecionan aproximadamente los aminoácidos 137-145 o se delecionan aproximadamente los aminoácidos 137 142. También se han descrito otras deleclones de péptldos de fusión adecuadas, tales como la deleclón de los aminoácidos en las posiciones 137-146. Ruiz-Arguello etal., J. Gen. Viral., 85:3677-3687 (2004).

En realizaciones particulares, el método Incluye: a) proporcionar un material biológico que contiene polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos, tal como un Usado celular, homogenelzado celular o medio acondicionado de cultivo celular, en el que la secuencia de aminoácidos del pollpéptldo de ectodominio de proteína F de VRS no escindido contiene sitios de escisión de furlna alterados, los residuos de Usina y arglnlna presentes entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161 se deleclonan o se reemplazan por un aminoácido que no es Usina ni arglnlna, los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS se secretan de una célula huésped que los produce sin escindir entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161, y los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no se escinden por la tripsina entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161; y b) purificar trímeros de pollpéptldo de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos del material biológico.

El método dado a conocer Incluye: a) proporcionar un material biológico que contiene polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos en los que el péptldo de fusión está mutado (por ejemplo, al menos una porción del péptldo de fusión se deleciona), tal como un Usado celular, homogenelzado celular o medio acondicionado de cultivo celular; y b) purificar polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos del material biológico. El pollpéptldo de ectodominio de proteína F de VRS no escindido puede contener sitios de escisión de furlna alterados, y los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS se secretan de una célula huésped que los produce sin escindir entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161 (incluyendo en los sitios de escisión de furina en las posiciones 106-109 y 131-136). Si se desea, el polipéptido de ectodominio de proteína F de VRS no escindido con sitios de escisión de furina alterados contiene además sitios alterados o delecionados para otras proteasas (por ejemplo, sitios de escisión de tripsina) entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161 para impedir la escisión por proteasa (por ejemplo, tripsina). Por ejemplo, uno o más residuos de lisina y/o arginina (por ejemplo, todos los residuos de lisina y arginina) presentes entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161 se delecionan o se reemplazan por un aminoácido que no es lisina ni arginina, y los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no se escinden por la tripsina entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161.

Los monómeros, trímeros y combinaciones de monómeros y trímeros de polipéptido de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos pueden purificarse hasta el grado deseado. Generalmente, se prefiere que los monómeros o trímeros de polipéptido de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos se purifiquen, por ejemplo, para que sean al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 % o sustancialmente homogéneos. Tal como se describe en el presente documento, los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos pueden purificarse fácilmente de lípidos y lipoproteínas, por ejemplo, mediante cromatografía de exclusión molecular. Por consiguiente, el método puede usarse para producir fácilmente una composición que contiene trímeros de polipéptido de ectodominio de proteína F de VRS escindidos que están sustancialmente libres de lípidos y lipoproteínas.

En un ejemplo, el método incluye proporcionar medio acondicionado de cultivo de células de insecto, medio acondicionado de cultivo de células de mamífero, medio acondicionado de células de ave, medio acondicionado de células de levadura, medio acondicionado de células de Tetrahymena, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, los trímeros de polipéptido de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos se purifican.

Métodos para producir polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS escindidos con péptidos de fusión alterados

Se da a conocer un método para preparar una composición que contiene polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS escindidos que contienen un péptido de fusión alterado. Cuando se expresan polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS que no contienen sitios de escisión de furina en células huésped, las células huésped procesan los polipéptidos, en parte escindiendo el polipéptido en los sitios de furina en aproximadamente las posiciones 109/110 y aproximadamente las posiciones 136/137 para producir las subunidades Fi y F2. Los polipéptidos procesados se secretan en el cultivo y pueden recuperarse como subunidades F1-F2 asociadas (por ejemplo, subunidades F1 y F2 con enlaces disulfuro), que pueden formar rosetas de trímeros a través de agregación de péptidos de fusión expuestos. Los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS que contienen péptidos de fusión alterados pueden producirse en y secretarse de las células huésped como subunidades F1-F2 asociadas, y preferiblemente no se agregan en rosetas ni con contaminantes lipídicos o lipoproteicos. Sin querer restringirse a ninguna teoría particular, se cree que los polipéptidos no forman rosetas ni se asocian con contaminantes lipídicos y lipoproteicos porque el péptido de fusión alterado no media en la agregación.

El método incluye: a) proporcionar un material biológico que contiene polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS escindidos que contienen un péptido de fusión alterado (por ejemplo, al menos una porción del péptido de fusión se deleciona), tal como un lisado celular, homogeneizado celular o medio acondicionado de cultivo celular; y b) purificar polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS escindidos del material biológico. Los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS escindidos purificados pueden purificarse como trímeros escindidos, rosetas de trímeros escindidos o una mezcla de trímeros escindidos y rosetas de trímeros escindidos. Los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS adecuados que contienen péptidos de fusión alterados contienen sitios de escisión de furina escindibles en aproximadamente 109/110 y aproximadamente 136/137 y contienen además un péptido de fusión alterado tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo, puede usarse en el método un polipéptido de ectodominio de proteína F de VRS en el que se delecionan aproximadamente los aminoácidos 137-152, se delecionan aproximadamente los aminoácidos 137-153, se delecionan aproximadamente los aminoácidos 137-145, se delecionan aproximadamente los aminoácidos 137-146 o se delecionan aproximadamente los aminoácidos 137-142. En ejemplos particulares, el material biológico que contiene polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos incluye al menos la deleción de péptido de fusión 1.

Los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS escindidos (por ejemplo, trímeros escindidos o una mezcla de trímeros escindidos y rosetas de trímeros escindidos) pueden purificarse hasta el grado deseado. Se prefiere generalmente que los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS escindidos se purifiquen, por ejemplo, para que sean al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 % o sustancialmente homogéneos. Tal como se describe en el presente documento, los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS escindidos que contienen un péptido de fusión alterado pueden purificarse fácilmente de lípidos y lipoproteínas, por ejemplo, mediante cromatografía de exclusión molecular. Por consiguiente, el método puede usarse para producir fácilmente una composición que contiene trímeros de polipéptido de ectodominio de proteína F de VRS escindidos, rosetas de trímeros escindidos o una combinación de trímeros escindidos y rosetas de trímeros escindidos que están sustancialmente libres de lípidos y lipoproteínas.

Métodos para producir polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS con mutaciones de furina C-terminales

Se da a conocer un método para preparar una composición que contiene polipéptidos de ectodominio de VRS no escindidos C-terminales y un método para preparar polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS escindidos. Sin querer restringirse a ninguna teoría particular, se cree que los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales se escinden por las células que producen las proteínas en el sitio de escisión de furina en aproximadamente la posición 109/110, pero no en el sitio de escisión de furina en aproximadamente la posición 136/137, y se secretan al medio como una subunidad Fi que está asociada con una subunidad F2. Se cree además que el péptido de fusión hidrófobo no se expone en los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales y, por tanto, los polipéptidos no escindidos C-terminales no se asocian con contaminantes lipidíeos y lipoproteicos. Tal como se describe además en el presente documento, los ectodominios de proteína F de VRS no escindidos C-terminales pueden escindirse además para producir una subunidad F1 , en la que el extremo amino terminal es de desde la posición 110 hasta aproximadamente la posición 161, que está asociada con una subunidad F2. Tales subunidades F1 y F2, que pueden purificarse como trímeros, rosetas de trímeros o una mezcla de trímeros y rosetas de trímeros.

Generalmente, la secuencia de aminoácidos de un ectodominio de proteína F de VRS no escindido C-terminal se altera para impedir la escisión en el sitio de escisión de furina en aproximadamente la posición 136/137, pero contiene un sitio de escisión de proteasa que se produce de manera natural o introducido, que cuando se escinde produce una subunidad F1 , en la que el extremo amino terminal es de desde la posición 110 hasta aproximadamente la posición 161, y una subunidad F2. Por ejemplo, el polipéptido de ectodominio de proteína F de VRS no escindido C-terminal puede tener una secuencia de aminoácidos que se altera para impedir la escisión en los sitios de escisión de furina en aproximadamente la posición 136/137, pero contiene uno o más sitios de escisión de proteasa que se producen de manera natural o introducidos desde aproximadamente la posición 101 hasta aproximadamente la posición 161. En un ejemplo particular, la secuencia de aminoácidos de un ectodominio de proteína F de VRS no escindido C-terminal se altera para impedir la escisión en el sitio de escisión de furina en aproximadamente la posición 136/137, pero contiene un sitio de escisión de furina que se produce de manera natural en aproximadamente la posición 109/110.

Un experto habitual en la técnica puede diseñar y prever fácilmente una variedad de secuencias de aminoácidos particulares que permitirán la producción y expresión de polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales por células huésped, incluyendo secuencias de aminoácidos que no se escinden en los sitios de escisión de furina en aproximadamente la posición 136/137. En general, uno o más aminoácidos que son parte de, o están ubicados cerca de, los sitios de escisión de furina en aproximadamente la posición 136/137 se reemplazan o delecionan independientemente. En el presente documento se describen sustituciones y deleciones de aminoácidos adecuadas que impiden la escisión en aproximadamente la posición 136/137. Por ejemplo, pueden usarse la sustitución K131Q, la deleción de los aminoácidos en las posiciones 131-134 o las sustituciones K131Q/R133Q/R135Q/R136Q, cada una de las cuales inhibe la escisión en 136/137. En determinadas realizaciones, los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales comprenden al menos una sustitución o deleción de aminoácido en aproximadamente las posiciones 133-136.

De manera similar, son posibles una variedad de secuencias de aminoácidos particulares de polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales que contienen un sitio de escisión de proteasa (por ejemplo, que se produce de manera natural o introducido) que cuando se escinden producen una primera subunidad que comprende una F1 y una segunda subunidad que comprende F2, y pueden diseñarse y preverse fácilmente. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de proteína F de VRS desde aproximadamente la posición 101 hasta aproximadamente la posición 161 contiene sitios de escisión de tripsina, y uno o más de los sitios de escisión de tripsina pueden escindirse para generar las subunidades F1 y F2. Si se desea, pueden introducirse uno o más sitios de reconocimiento de proteasa adecuados en el polipéptido de ectodominio de proteína F de VRS no escindido C-terminal, por ejemplo, entre aproximadamente las posiciones 101 y aproximadamente la posición 161. Los sitios de reconocimiento de proteasa introducidos pueden escindirse usando la proteasa apropiada para generar las subunidades F1 y F2. Cuando se introduce un sitio de reconocimiento de proteasa en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de ectodominio de proteína F de VRS no escindido C-terminal, se prefiere que el sitio se reconozca por una proteasa que no escinde el ectodominio de una proteína F de VRS que se produce de manera natural.

Pueden producirse polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales usando cualquier método adecuado. Un método preferido es mediante expresión recombinante de constructos que codifican un ectodominio de proteína F de VRS en el que esa secuencia de aminoácidos del sitio de escisión de furina en aproximadamente las posiciones 136/137 se altera, de modo que los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales se secretan por una célula huésped que produce los polipéptidos sin escindir en el sitio de escisión de furina en aproximadamente la posición 136/137. Preferiblemente, el polipéptido de ectodominio de proteína F de VRS no escindido C-terminal se secreta por una célula huésped que lo produce como una subunidad Fi que está asociada con una subunidad F2, en el que el extremo amino terminal de la subunidad F1 es de desde la posición 132 hasta aproximadamente la posición 161, pero no la posición 137. Los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales pueden producirse usando cualquier célula huésped adecuada, tal como se describe en el presente documento.

Un método incluye: a) proporcionar polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales que comprenden un sitio de escisión de furina alterado en la posición 136/137, y dichos polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales se secretan de una célula que los produce en forma de un fragmento F2 que está asociado con una subunidad que comprende F1 pero no está escindida en la posición 136/137, y b) escindir los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales proporcionados con una proteasa que escinde el ectodominio de proteína F de VRS en un sitio entre las posiciones 101 y 161, produciendo de ese modo dicha composición. En realizaciones particulares, la etapa b) comprende escindir los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales proporcionados con una proteasa que escinde el ectodominio de proteína F de VRS en un sitio entre aproximadamente las posiciones 101 y 132, o aproximadamente las posiciones 132 y 161, o aproximadamente las posiciones 110 y 132. Alternativamente o además, en algunas realizaciones, los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales comprenden un sitio de escisión de furina alterado en la posición 136/137, con la condición de que el sitio de escisión de furina alterado no sea la deleción de los aminoácidos 131-134. En ejemplos particulares, el material biológico que contiene polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales; incluye al menos el polipéptido de furina N-terminal.

Los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales proporcionados pueden purificarse hasta el grado deseado. Por ejemplo, los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales proporcionados pueden proporcionarse en un lisado celular, homogeneizado celular o medios acondicionados de cultivo celular que están sustancialmente sin procesar (por ejemplo, sin procesar, o clarificados solo), o en forma parcial o sustancialmente purificada. En ejemplos particulares, los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales proporcionados se proporcionan en medios acondicionados cultivo celular seleccionados del grupo que consiste en medios acondicionados de células de insecto, medios acondicionados de células de mamífero, medios acondicionados de células de ave, medios acondicionados de células de levadura, medios acondicionados de células de Tetrahymena, y combinaciones de los mismos.

Se prefiere generalmente que los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales proporcionados se purifiquen, por ejemplo, se purifiquen para que sean al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 % o sustancialmente homogéneos. Tal como se describe en el presente documento, los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales pueden purificarse fácilmente de lípidos y lipoproteínas, mientras que las formas escindidas producidas convencionalmente de proteína F de VRS se purifican conjuntamente con contaminantes lipídicos y lipoproteicos. Por consiguiente, cuando se proporcionan polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales purificados, el método puede usarse para producir fácilmente una composición que contiene ectodominios de proteína F de VRS escindidos que están sustancialmente libres de lípidos o fosfolípidos.

Se conocen bien métodos adecuados para escindir polipéptidos usando una proteasa y son convencionales en la técnica. Generalmente, los polipéptidos que van a escindirse se combinan con una cantidad suficiente de proteasa en condiciones (por ejemplo, pH, concentración de polipéptido y proteasa, temperatura) adecuadas para la escisión del polipéptido. Muchas proteasas adecuadas están comercialmente disponibles, y se conocen bien condiciones adecuadas para realizar la escisión de polipéptidos para muchas proteasas. Si se desea, los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS pueden purificarse tras la escisión con proteasa.

En un ejemplo del método dado a conocer, se proporcionan polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales que contienen un péptido de fusión intacto, tal como un polipéptido de ectodominio de proteína F de VRS no escindido C-terminal en el que ninguno de los aminoácidos de las posiciones 137-154 se sustituyen o se delecionan. En otro ejemplo del método, se proporcionan polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales que contienen un péptido de fusión alterado, tal como un polipéptido de ectodominio de proteína F de VRS no escindido C-terminal en el que aproximadamente los aminoácidos 137-152, aproximadamente los aminoácidos 137-153, aproximadamente los aminoácidos 137-145 o aproximadamente los aminoácidos 137-142 se delecionan. También se han descrito otras deleciones de péptidos de fusión adecuadas, tales como la deleción de los aminoácidos en las posiciones 137-146. Ruiz-Arguello etal., J. Gen. Viral., 85:3677-3687 (2004).

En algunas realizaciones, los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales proporcionados se purifican. Los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos proporcionados se escinden, y la escisión da como resultado la formación de trímeros de polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS escindidos. Si se desea, los trímeros pueden purificarse usando además cualquier método adecuado, tal como cromatografía de exclusión molecular.

En ejemplos particulares del método dado a conocer, los polipéptidos de ectodomlnlo de proteína F de VRS no escindidos C-termlnales proporcionados contienen al menos el polipéptido de furina N-terminal (figura 1). Los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales proporcionados se escinden, por ejemplo con tripsina, y la escisión da como resultado la formación de trímeros escindidos, rosetas de trímeros escindidos o una combinación de trímeros escindidos y rosetas de trímeros escindidos de polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS. Si se desea, los trímeros escindidos y/o rosetas de trímeros escindidos pueden purificarse además usando cualquier método adecuado, tal como cromatografía de exclusión molecular.

Otro método de este aspecto de la divulgación incluye: a) proporcionar un material biológico, tal como un lisado celular, homogeneizado celular o medio acondicionado de cultivo celular, que contiene polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales que comprenden un sitio de escisión de furina alterado en la posición 136/137, y dichos polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS solubles se secretan de una célula que los produce en forma de un fragmento F2 que está asociado con una subunidad que comprende F1 pero no está escindido en la posición 136/137, con la condición de que el sitio de escisión de furina alterado no sea la deleción de aminoácidos 131-134; y b) purificar los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales del material biológico, produciendo de ese modo la composición. Preferiblemente, el extremo amino terminal de la subunidad F1 es de desde aproximadamente la posición 110 hasta aproximadamente la posición 132. Más preferiblemente, el extremo amino terminal de la subunidad F1 es aproximadamente la posición 110. Se prefiere particularmente que el extremo amino terminal de la subunidad F1 no sea la posición 137. En ejemplos particulares, el material biológico que contiene polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales incluye al menos el polipéptido de furina N-terminal.

Si se desea, el polipéptido de ectodominio de proteína F de VRS no escindido C-terminal contiene además sitios alterados o delecionados para otras proteasas (por ejemplo, sitios de escisión de tripsina) entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161 para impedir la escisión por proteasa (por ejemplo, tripsina). Por ejemplo, uno o más residuos de Usina y/o arginina (por ejemplo, todos los residuos de Usina y arginina) presentes entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161 se delecionan o se reemplazan por un aminoácido que no es Usina ni arginina, y los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales no se escinden por la tripsina entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161. Los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales pueden contener un péptido de fusión intacto o un péptido de fusión alterado, tal como se describe en el presente documento.

Los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales, por ejemplo, monómeros, trímeros y combinaciones de monómeros y trímeros, pueden purificarse hasta el grado deseado. Se prefiere generalmente que los monómeros o trímeros de polipéptido de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales se purifiquen, por ejemplo, para que sean al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 % o sustancialmente homogéneos. Tal como se describe en el presente documento, los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales pueden purificarse fácilmente de lípidos y lipoproteínas, por ejemplo, mediante cromatografía de exclusión molecular. Por consiguiente, el método dado a conocer puede usarse para producir fácilmente una composición que contiene polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales, por ejemplo, trímeros, que están sustancialmente libres de lípidos y lipoproteínas. En ejemplos particulares del método, los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales contienen al menos el polipéptido de furina N-terminal (figura 1).

En un ejemplo, el método incluye proporcionar medio acondicionado de cultivo de células de insecto, medio acondicionado de cultivo de células de mamífero, medios acondicionados de células de ave, medios acondicionados de células de levadura, medios acondicionados de células de Tetrahymena o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, se purifican trímeros de polipéptido de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales. En otras realizaciones, se purifican monómeros de polipéptido de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales.

ARN autorreplicante

Los polipéptidos de F de VRS descritos en el presente documento pueden producirse mediante expresión de ácidos nucleicos recombinantes que codifican los polipéptidos en las células de un sujeto. Ácidos nucleicos preferidos que pueden administrarse a un sujeto para provocar la producción de polipéptidos F de VRS son moléculas de ÁRN autorreplicante. Las moléculas de ARN autorreplicante de la invención se basan en el ARN genómico de virus de ARN, pero carecen de los genes que codifican una o más proteínas estructurales. Las moléculas de ARN autorreplicante son capaces de traducirse para producir proteínas no estructurales de los virus de ARN y proteínas heterólogas codificadas por el ARN autorreplicante.

El ARN autorreplicante contiene generalmente al menos uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en repllcasa viral, proteasas virales, hellcasas virales y otras proteínas virales no estructurales, y también comprende secuencias de repllcaclón activas en cls en los extremos 5’ y 3’, y si se desea, secuencias heterólogas que codifican secuencias de aminoácidos deseadas (por ejemplo, una proteína, un antígeno). En el ARN autorreplicante puede Incluirse un promotor subgenómlco que dirige la expresión de la secuencia heteróloga. SI se desea, la secuencia heteróloga puede fusionarse en marco con otras reglones codificantes en el ARN autorreplicante y/o puede estar bajo el control de un sitio Interno de entrada al rlbosoma (IRES).

Pueden diseñarse moléculas de ARN autorreplicante de la Invención de modo que la molécula de ARN autorreplicante no pueda Inducir la producción de partículas virales Infecciosas. Esto puede lograrse, por ejemplo, omitiendo uno o más genes virales que codifican proteínas estructurales que son necesarias para la producción de partículas virales en el ARN autorreplicante. Por ejemplo, cuando la molécula de ARN autorreplicante se basa en un virus, tal como el virus Slnebls (SIN), virus del bosque de Semllkl y virus de la encefalitis equina venezolana (VEE), pueden omitirse uno o más genes que codifican proteínas estructurales virales, tales como glucoproteínas de la cápside y/o la envoltura. SI se desea, pueden diseñarse moléculas de ARN autorreplicante de la Invención para Inducir la producción de partículas virales Infecciosas que están atenuadas o son virulentas, o para producir partículas virales que son capaces de una sola ronda de Infección posterior.

Una molécula de ARN autorreplicante, cuando se administra a una célula de vertebrado Incluso sin ninguna proteína, puede conducir a la producción de múltiples ARN hijos mediante transcripción de sí misma (o de una copla antlsentldo de sí misma). El ARN autorreplicante puede traducirse directamente después de la administración a una célula, y esta traducción proporciona una ARN pollmerasa dependiente de ARN que luego produce transcritos a partir del ARN administrado. Por tanto, el ARN administrado conduce a la producción de múltiples ARN hijos. Estos transcritos son antlsentldo en relación con el ARN administrado y pueden traducirse por sí mismos para proporcionar expresión in situ de un producto génlco, o pueden transcribirse para proporcionar trascritos adicionales con el mismo sentido que el ARN administrado que se traducen para proporcionar expresión in situ del pollpéptldo F de VRS codificado.

Un sistema adecuado para lograr la autorrepllcaclón es usar un replicón de ARN basado en alfavlrus. Estos replicones de cadena se traducen después de su administración a una célula para dar una repllcasa (o replicasatranscrlptasa). La repllcasa se traduce como una pollproteína que se autoesclnde para proporcionar un complejo de repllcaclón que crea coplas de cadena genómlcas del ARN administrado de cadena . Estos transcritos de cadena pueden transcribirse por sí mismos para dar coplas adicionales del ARN original de cadena y también para dar un transcrito subgenómlco que codifica el pollpéptldo F de VRS. La traducción del transcrito subgenómlco conduce, por tanto, a la expresión /ns/fudelpolipéptido Fde VRS por la célula Infectada. Los replicones de alfavlrus adecuados pueden usar una repllcasa de un virus Slndbls, un virus del bosque de Semllkl, un virus de la encefaclllts equina oriental, un virus de la encefalitis equina venezolana, etc.

Una molécula de ARN autorreplicante preferida codifica, por tanto, (I) una ARN pollmerasa dependiente de ARN que puede transcribir ARN a partir de la molécula de ARN autorreplicante y (¡I) un pollpéptldo F de VRS. La pollmerasa puede ser una repllcasa de alfavlrus que comprende, por ejemplo, proteína nsP4 de alfavlrus.

Mientras que los genomas de alfavlrus naturales codifican proteínas estructurales del vlrlón además de la pollproteína repllcasa no estructural, se prefiere que una molécula de ARN autorreplicante basada en alfavlrus de la Invención no codifique proteínas estructurales de alfavlrus. Por tanto, el ARN autorreplicante puede conducir a la producción de coplas de ARN genómlco de sí mismo en una célula, pero no a la producción de vlrlones de alfavlrus que contienen ARN. La Incapacidad de producir estos vlrlones significa que, a diferencia de un alfavlrus de tipo natural, la molécula de ARN autorreplicante no puede perpetuarse a sí misma en forma Infecciosa. Las proteínas estructurales de alfavlrus que son necesarias para la perpetuación en virus de tipo natural están ausentes de los ARN autorrepllcantes de la Invención y su lugar lo ocupa(n) gen(es) que codlflca(n) el producto génlco deseado, de manera que el transcrito subgenómlco codifica el producto génlco deseado en vez de las proteínas estructurales del vlrlón de alfavlrus.

Por tanto una molécula de ARN autorreplicante útil con la Invención puede tener dos marcos de lectura abiertos. El primer marco de lectura abierto (5’) codifica una repllcasa; el segundo marco de lectura abierto (3’) codifica un pollpéptldo F de VRS. En algunas realizaciones, el ARN puede tener marcos de lectura abiertos adicionales (en el sentido de 3’), por ejemplo, que codifican productos génlcos deseados adicionales. Una molécula de ARN autorreplicante puede tener una secuencia 5’ que es compatible con la repllcasa codificada.

En un aspecto, la molécula de ARN autorreplicante se deriva de o se basa en un alfavlrus. En otros aspectos, la molécula de ARN autorreplicante se deriva de o se basa en un virus distinto de un alfavlrus, preferiblemente, virus de ARN de cadena positiva, y más preferiblemente un plcornavlrus, flavlvlrus, rublvlrus, pestlvlrus, hepaclvlrus, calicivirus o coronavirus. Se conocen bien secuencias de alfavlrus de tipo natural adecuadas y están disponibles de depósitos de secuencias, tales como la Colección americana de cultivos tipo, Rockvllle, Md. Los ejemplos representativos de alfavirus adecuados incluyen Aura (ATCC VR-368), virus Bebaru (ATCC VR-600, ATCC VR-1240), Cabassou (ATCC VR-922), virus Chikungunya (ATCC VR-64, ATCC VR-1241), virus de la encefalomlelltls equina oriental (ATCC VR-65, ATCC VR-1242), Fort Morgan (ATCC VR-924), virus Getah (ATCC VR-369, ATCC VR-1243), Kyzilagach (ATCC VR-927), Mayara (ATCC VR-66), virus Mayara (ATCC VR-1277), Middleburg (ATCC VR-370), virus Mucambo (ATCC VR-580, ATCC VR-1244), Ndumu (ATCC VR-371), virus Pixuna (ATCC VR-372, ATCC VR-1245), virus del río Ross (ATCC VR-373, ATCC VR-1246), bosque de Semliki (ATCC VR-67, ATCC VR-1247), virus Sindbis (ATCC VR-68, ATCC VR-1248), Tonate (ATCC VR-925), Triniti (ATCC VR-469), Una (ATCC VR-374), encefalomielitis equina venezolana (ATCC VR-69, ATCC VR-923, ATCC VR-1250 ATCC VR-1249, ATCC VR-532), encefalomielitis equina occidental (ATCC VR-70, ATCC VR-1251, ATCC VR-622, ATCC VR-1252), Whataroa (ATCC VR-926) e Y-62-33 (ATCC VR-375).

El ARN autorreplicante puede estar asociado con un sistema de administración. El ARN autorreplicante puede administrarse con o sin un adyuvante.

SISTEMAS DE ADMINISTRACIÓN DE ARN

El ARN autorreplicante es adecuado para su administración en una variedad de modalidades, tales como administración de ARN desnudo o en combinación con lípidos, polímeros u otros compuestos que facilitan la entrada en las células. Pueden introducirse moléculas de ARN autorreplicante en células o sujetos diana usando cualquier técnica adecuada, por ejemplo, mediante inyección directa, microinyección, electroporación, lipofección, biolística, y similares. La molécula de ARN autorreplicante puede introducirse también en células por medio de endocitosis mediada por receptor. Véanse, por ejemplo, la patente estadounidense n.- 6.090.619; Wu y Wu, J. Biol. Chem., 263:14621 (1988); y Curiel et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88:8850 (1991). Por ejemplo, la patente estadounidense n.- 6.083.741 da a conocer la introducción de un ácido nucleico exógeno en células de mamífero asociando el ácido nucleico a un resto de policatión (por ejemplo, poli-L-lisina que tiene 3-100 residuos de Usina), que está acoplado por sí mismo a un resto de unión a receptor de integrina (por ejemplo, un péptido cíclico que tiene la secuencia Arg-Gly-Asp).

La molécula de ARN autorreplicante puede administrarse a las células por medio de anfífilos. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.- 6.071.890. Normalmente, una molécula de ácido nucleico puede formar un complejo con el anfífilo catiónico. Las células de mamífero en contacto con el complejo pueden captarlo fácilmente.

El ARN autorreplicante puede administrarse como ARN desnudo (por ejemplo, meramente como una disolución acuosa de ARN) pero, para potenciar la entrada en células y también efectos intercelulares posteriores, el ARN autorreplicante se administra preferiblemente en combinación con un sistema de administración, tal como un sistema de administración particulado o en emulsión. Los expertos en la técnica conocen un gran número de sistemas de administración. Tales sistemas de administración incluyen, por ejemplo administración basada en liposomas (Debs y Zhu (1993) documento WO 93/24640; Mannino y Gould-Fogerite (1988) BioTechniques 6(7): 682-691; Rose, patente estadounidense n.e 5.279.833; Brigham (1991) documento WO 91/06309; y Felgner etal. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84: 7413-7414), así como el uso de vectores virales (por ejemplo, adenovirales (véanse, por ejemplo, Berns etal. (1995) Ann. NY Acad. Sci. 772: 95-104; Ali etal. (1994) Gene Ther. 1: 367-384; y Haddada etal. (1995) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 199 (Pt 3): 297-306 para una revisión), de papilomavirus, retrovirales (véanse, por ejemplo, Buchscher et al. (1992) J. Viral. 66(5) 2731-2739; Johann et al. (1992) J. Viral.

66 (5): 1635-1640 (1992); Sommerfelt etal., (1990) Viral. 176:58-59; Wilson etal. (1989) J. Viral. 63:2374-2378; Miller etal., J. Viral. 65:2220-2224 (1991); Wong-Staal etal., documento PCT/US94/05700, y Rosenburg y Fauci (1993) en Fundamental Immunology, tercera edición Paul (ed) Raven Press, Ltd., Nueva York y las referencias en el mismo, y Yu etal., Gene Therapy (1994) citado anteriormente), y vectores virales adenoasociados (véase, West etal. (1987) Virology 160:38-47; Cárter ef a!. (1989) patente estadounidense n.24.797.368; Cárter etal. documento WO 93/24641 (1993); Kotin (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Muzyczka (1994) J. Clin. Invst. 94:1351 y Samulski (supra) para una visión general de vectores de VAA; véanse también, Lebkowski, patente estadounidense n.25.173.414; Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5(11):3251-3260; Tratschin, et al. (1984) Mol. Cell. Biol., 4:2072-2081; Hermonat y Muzyczka (1984) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81:6466-6470; McLaughlin etal. (1988) y Samulski etal. (1989) J. Viral., 63:03822-3828), y similares.

Tres sistemas de administración particularmente útiles son (i) liposomas (ii) micropartículas de polímero no tóxicas y biodegradables (iii) emulsiones de aceite en agua submicrométricas catiónicas.

Liposomas

Diversos lípidos anfifílicos pueden formar bicapas en un entorno acuoso para encapsular un núcleo acuoso que contiene ARN como un liposoma. Estos lípidos pueden tener un grupo de cabeza hidrófilo aniónico, catiónico o zwitteriónico. La formación de liposomas a partir de fosfolípidos aniónicos se remonta a la década de 1960, y se han estudiado lípidos que forman liposomas catiónicos desde la década de 1990. Algunos fosfolípidos son aniónicos mientras que otros son zwitteriónicos. Las clases adecuadas de fosfolípidos incluyen, pero no se limitan a, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilcolinas, fosfatidilserinas y fosfatidilgliceroles, y algunos fosfolípidos útiles se enumeran en la tabla 20. Los lípidos catiónicos útiles incluyen, pero no se limitan a, dioleoil trimetilamonio propano (DOTAP), 1,2-diesteariloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DSDMA), 1,2-dioleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DODMA), 1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DLinDMA), 1,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DLenDMA). Los lípidos zwitteriónicos incluyen, pero no se limitan a, lípidos zwitteriónicos de acilo y lípidos zwitteriónicos de éter. Ejemplos de lípidos zwitteriónicos útiles son DPPC, DOPC y dodecilfosfocolina. Los lípidos pueden ser saturados o insaturados.

Pueden formarse liposomas a partir de un solo lípido o de una mezcla de lípidos. Una mezcla puede comprender (i) una mezcla de lípidos aniónicos (ii) una mezcla de lípidos catiónicos (iii) una mezcla de lípidos zwitteriónicos (iv) una mezcla de lípidos aniónicos y lípidos catiónicos (v) una mezcla de lípidos aniónicos y lípidos zwitteriónicos (vi) una mezcla de lípidos zwitteriónicos y lípidos catiónicos o (vil) una mezcla de lípidos aniónicos, lípidos catiónicos y lípidos zwitteriónicos. De manera similar, una mezcla puede comprender tanto lípidos saturados como insaturados. Por ejemplo, una mezcla puede comprender DSPC (zwitteriónico, saturado), DlinDMA (catiónico, insaturado) y/o DMPG (aniónico, saturado). Cuando se usa una mezcla de lípidos, no es necesario que todos los lípidos componentes de la mezcla sean anfífilos, por ejemplo, uno o más lípidos anfífilos pueden mezclarse con colesterol.

La porción hidrófila de un lípido puede PEGilarse (es decir, modificarse por unión covalente de un polietilengllcol). Esta modificación puede aumentar la estabilidad e impedir la adsorción no específica de los liposomas. Por ejemplo, pueden conjugarse lípidos con PEG usando técnicas tales como las descritas en Heyes et al. (2005) J Controlled Release 107: 276-287.

En los ejemplos se usa una mezcla de DSPC, DlinDMA, PEG-DMPG y colesterol. Un aspecto separado de la invención es un liposoma que comprende DSPC, DlinDMA, PEG-DMG y colesterol. Este liposoma encapsula preferiblemente ARN, tal como un ARN autorreplicante que codifica, por ejemplo, un inmunógeno.

Los liposomas se dividen habitualmente en tres grupos: vesículas multilaminares (MLV); vesículas unilaminares pequeñas (SUV); y vesículas unilaminares grandes (LUV). Las MLV tienen múltiples bicapas en cada vesícula, formando varios compartimentos acuosos separados. Las SUV y LUV tienen una sola bicapa que encapsula un núcleo acuoso; las SUV tienen normalmente un diámetro ¿50 nm y las LUV tienen un diámetro >50 nm. Idealmente, los liposomas útiles de la invención son LUV con un diámetro en el intervalo de 50-220 nm. Para una composición que comprende una población de LUV con diferentes diámetros: (i) al menos el 80 % en número debe tener diámetros en el intervalo de 20-220 nm, (ii) el diámetro promedio (Zav, por intensidad) de la población está idealmente en el intervalo de 40-200 nm, y/o (iii) los diámetros deben tener un índice de polidispersidad <0,2.

En la técnica se conocen bien técnicas para preparar liposomas solubles, por ejemplo, véase Liposomes: Methods and Protocols, volumen 1: Pharmaceutical Nanocarriers: Methods and Protocols. (ed. Weissig). Humana Press, 2009. ISBN 160327359X; Liposome Technology, volúmenes I, II y III. (ed. Gregoriadis). Informa Healthcare, 2006; y Functional Polymer Colloids and Micropartlcles volumen 4 (Microspheres, microcapsules & liposomes). (eds. Arshady & Guyot). Citus Books, 2002. Un método útil Implica mezclar (i) una disolución etanóllca de los lípidos (¡I) una disolución acuosa del ácido nucleico y (¡II) tampón, seguido por mezclado, equilibrado, dilución y purificación (Heyes etal. (2005) J Controlled Release 107:276-87.).

El ARN se encapsula preferiblemente dentro de los liposomas, y así el liposoma forma una capa exterior alrededor de un núcleo acuoso que contiene ARN. Se ha descubierto que esta encapsulaclón protege al ARN de la digestión por ARNasa. Los liposomas pueden incluir algo de ARN externo (por ejemplo, en la superficie de los liposomas), pero al menos la mitad del ARN (e Idealmente todo) se encapsula.

Micropartículas poliméricas

Diversos polímeros pueden formar micropartículas para encapsular o adsorber ARN. El uso de un polímero sustanclalmente no tóxico significa que un receptor puede recibir las partículas de manera segura, y el uso de un polímero blodegradable significa que las partículas pueden metabollzarse después de la administración para evitar la persistencia a largo plazo. Los polímeros útiles también son esterilizables, para ayudar en la preparación de formulaciones de calidad farmacéutica.

Los polímeros no tóxicos y blodegradables adecuados Incluyen, pero no se limitan a, poll(a-hidroxiácldos), poli(ácidos hidroxibutíricos), polllactonas (Incluyendo pollcaprolactonas), polldloxanonas, pollvalerolactona, pollortoésteres, pollanhídridos, pollclanoacrilatos, policarbonatos derivados de tlroslna, polivinil-pirrolidinonas o polléster-amidas, y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, las micropartículas se forman a partir de poll(a-hidroxiácldos), tales como poll(lactldas) (“PLA”), copolímeros de lactida y glicolida tales como poli(D,L-lactida-co-glicolida) (“PLG”), y copolímeros de D,L-lactlda y caprolactona. Los polímeros de PLG útiles incluyen aquellos que tienen una razón molar de lactida/glicolida que oscila, por ejemplo, entre 20:80 y 80:20, por ejemplo, 25:75, 40:60,45:55, 55:45, 60:40, 75:25. Los polímeros de PLG útiles incluyen aquellos que tienen un peso molecular de entre, por ejemplo, 5.000 200.000 Da, por ejemplo, entre 10.000-100.000, 20.000-70.000, 40.000-50.000 Da.

Las micropartículas tienen idealmente un diámetro en el Intervalo de 0,02 nm a 8 nm. Para una composición que comprenda una población de mlcropartículas con diferentes diámetros, al menos el 80% en número debe tener diámetros en el intervalo de 0,03-7 nm.

En la técnica se conocen bien técnicas para preparar mlcropartículas adecuadas, por ejemplo, véase Functlonal Polymer Colloids and Mlcropartlcles volumen 4 (Mlcrospheres, microcapsules & liposomes). (eds. Arshady & Guyot). Citus Books, 2002; Polymers in Drug Delivery. (eds. Uchegbu & Schatzlein). CRC Press, 2006. (En particular el capítulo 7) y Microparticulate Systems for the Delivery of Proteins and Vaccines. (eds. Cohén & Bernstein). CRC Press, 1996. Para facilitar la adsorción de ARN, una micropartícula puede incluir un lípido y/o tensioactivo catiónico, por ejemplo, tal como se da a conocer en O’Hagan etal. (2001) J Virology 75:9037-9043; y Singh et al. (2003) Pharmaceutical Research 20: 247-251. Un modo alternativo de fabricar mlcropartículas pollmérlcas es mediante moldeo y curado, por ejemplo, tal como se da a conocer en el documento W02009/132206.

Las mlcropartículas pueden tener un potencial zeta de entre 40-100 mV.

El ARN puede adsorberse a las mlcropartículas y la adsorción se facilita Incluyendo materiales catlónlcos (por ejemplo, lípldos catlónlcos) en la micropartícula.

Emulsiones catiónicas de aceite en agua

Se conocen emulsiones de aceite en agua como adyuvantes para vacunas contra la gripe, por ejemplo, el adyuvante MF59™ en el producto FLUAD™, y el adyuvante AS03 en el producto PREPANDRIX™. La administración de ARN según la presente Invención puede utilizar una emulsión de aceite en agua, siempre que la emulsión Incluya una o más moléculas catiónicas. Por ejemplo, puede Incluir un lípido catiónico en la emulsión para proporcionar una superficie de gotlta positiva a la que puede unirse ARN cargado negativamente.

La emulsión comprende uno o más aceites. El(los) aceite(s) adecuado(s) incluye(n) los de, por ejemplo, una fuente animal (tal como pescado) o vegetal. El aceite es Idealmente blodegradable (metabollzable) y biocompatible. Las fuentes de aceites vegetales Incluyen frutos secos, semillas y granos. El aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite de coco y aceite de oliva, los más comúnmente disponibles, ejemplifican los aceites de frutos secos. Puede usarse aceite de jojoba obtenido, por ejemplo, de la semilla de jojoba. Los aceites de semillas Incluyen aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de semilla de girasol, aceite de semilla de sésamo y similares. En el grupo de cereales, el aceite de maíz es el más fácilmente disponible, pero también puede usarse el aceite de otros cereales tales como trigo, avena, centeno, arroz, teff, triticale y similares. Pueden prepararse ésteres de ácidos grasos de 6-10 carbonos de gllcerol y 1,2-propanodlol, aunque no se producen de manera natural en los aceites de semillas, por hidrólisis, separación y esterificación de los materiales apropiados partiendo de los aceites de frutos secos y semillas. Las grasas y aceites de la leche de mamíferos son metabollzables y, por tanto, pueden usarse. Los procedimientos de separación, purificación, saponificación y otros medios necesarios para obtener aceites puros de fuentes animales se conocen bien en la técnica.

La mayoría de los peces contienen aceites metabollzables que pueden recuperarse fácilmente. Por ejemplo, el aceite de hígado de bacalao, aceites de hígado de tiburón y aceite de ballena tal como esperma de ballena ejemplifican varios de los aceites de pescado que pueden usarse en el presente documento. Varios aceites de cadena ramificada se sintetizan bioquímicamente en unidades de ¡sopreno de 5 carbonos y generalmente se denominan terpenoldes. También puede usarse escualano, el análogo saturado del escualeno. Los aceites de pescado, Incluyendo escualeno y escualano, están fácilmente disponibles en fuentes comerciales o pueden obtenerse mediante métodos conocidos en la técnica.

Otros aceites útiles son los tocoferoles, particularmente en combinación con escualeno. Cuando la fase oleosa de una emulsión Incluye un tocoferol, puede usarse cualquiera de los a, (3, y, 8, s o C tocoferoles, pero se prefieren atocoferoles. Pueden usarse tanto D-a-tocoferol como DL-a-tocoferol. Un a-tocoferol preferido es DL-a-tocoferol. Puede usarse una combinación de aceites que comprende escualeno y un tocoferol (por ejemplo, DL-a-tocoferol).

Las emulsiones preferidas comprenden escualeno, un aceite de hígado de tiburón que es un terpenolde ramificado e insaturado (C30H50; [(CH3)2C[=CHCH2CH2C(CH3)]2=CHCH2-]2; 2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno; CAS RN 7683-64-9).

El aceite en la emulsión puede comprender una combinación de aceites, por ejemplo, escualeno y al menos un aceite adicional.

El componente acuoso de la emulsión puede ser agua corriente (por ejemplo, agua para Inyección) o puede Incluir componentes adicionales, por ejemplo, solutos. Por ejemplo, puede Incluir sales para formar un tampón, por ejemplo, sales de cltrato o fosfato, tales como sales de sodio. Los tampones típicos Incluyen: un tampón fosfato; un tampón Tris; un tampón borato; un tampón succinato; un tampón histidina; o un tampón citrato. Se prefiere una fase acuosa tamponada y los tampones se Incluirán normalmente en el Intervalo de 5-20 mM.

La emulsión también Incluye un lípldo catiónico. Preferiblemente, este lípldo es un tensloactlvo para que pueda facilitar la formación y estabilización de la emulsión. Los lípldos catiónicos útiles generalmente contienen un átomo de nitrógeno que está cargado positivamente en condiciones fisiológicas, por ejemplo, como una amina terciarla o cuaternaria. Este nitrógeno puede estar en el grupo de cabeza hidrófilo de un tensloactlvo anfífllo. Los lípldos catiónicos útiles incluyen, pero no se limitan a: 1,2-dioleoiloxi-3-(trimetilamonio)propano (DOTAP), 3’-[N-(N’,N’-dimetilaminoetano)-carbamoil]colesterol (DC colesterol), dimetildioctadecil-amonio (DDA, por ejemplo, el bromuro), 1,2-dimiristoil-3-trimetil-amoniopropano (DMTAP), dipalmitoil(C16:0)trimetilamonio-propano (DPTAP), diestearoiltrimetilamonio-propano (DSTAP). Otros lípidos catiónicos útiles son: cloruro de benzalconio (BAK), cloruro de bencetonlo, cetramida (que contiene bromuro de tetradeclltrlmetllamonlo y posiblemente pequeñas cantidades de bromuro de dedeclltrlmetllamonlo y bromuro de hexadeclltrlmetllamonlo), cloruro de cetllplrldlnlo (CPC), cloruro de cetiltrimetilamonio (CTAC), N,N’,N’-polioxietileno (10)-N-sebo-1,3-diaminopropano, bromuro de dodeclltrlmetllamonlo, bromuro de hexadeclltrlmetll-amonlo, bromuro mixto de alqull-trlmetllamonlo, cloruro de benclldlmetlldodecllamonlo, cloruro de benclldlmetllhexadecll-amonlo, metóxldo de benclltrlmetllamonlo, bromuro de cetlldlmetlletllamonlo, bromuro de dlmetlldloctadecllamonlo (DDAB), cloruro de metllbencetonlo, cloruro de decametonlo, cloruro mixto de metlltrlalqullamonlo, cloruro de metlltrloctllamonlo), cloruro de N,N-dimetil-N-[2(2-metll-4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenoxi]-etoxi)etil]-bencenometanaminio (DEBDA), sales de dlalqulldlmetllamonlo, cloruro de [1-(2,3-dioleiloxi)-propil]-N,N,N-trimetilamonio, 1,2-diacil-3-(trimetilamonio)propano (grupo acilo = dimiristoílo, dipalmitoílo, dlestearoílo, dloleoílo), 1,2-diacil-3(dimetilamonio)propano (grupo acllo = dimiristoílo, dipalmitoílo, diestearoílo, dioleoílo), 1,2-dioleoil-3-(4’-trimetilamonio)butanoil-sn-glicerol, áster de colina de 1,2-dloleoll-3-succlnll-sn-gllcerol, (4’-trimetilamonio)butanoato de colesterllo, sales de N-alquNplrldlnlo (por ejemplo, bromuro de cetllplrldlnlo y cloruro de cetllplrldlnlo), sales de N-alquNplperldlnlo, electrolitos bolaformes dicatiónicos (C12Me6; C12BU6), dialquilglicetilfosforilcolina, lisolecitina, L-a-dioleoilfosfatidiletanolamina, éster de colina de hemlsucclnato de colesterol, llpopollamlnas, Incluyendo, pero sin limitarse a, dioctadecilamidoglicilespermina (DOGS), dipalmitoilfosfatidiletanolamina-amidoespermina (DPPES), lipopoli-L (o D)-lisina (LPLL, LPDL), poli(L(o D)-lisina conjugada con N-glutarlIfosfatldlIetanolamlna, éster de glutamato de didodecilo con grupo amlno colgante (CAGluPhCnN), éster de glutamato de ditetradecilo con grupo amino colgante (CI4GluCnN+), derivados catiónicos de colesterol, Incluyendo, pero sin limitarse a, sal de colesteril-33-oxisuccinamidoetilentrimetilamonio, colesteril-33-oxlsucclnamldoetllendlmetllamlna, sal de colesteril-33-carboxiamidoetilentrimetilamonio y colesteril-33-carboxiamidoetilendimetilamina. Otros lípldos catiónicos útiles se describen en los documentos US 2008/0085870 y US 2008/0057080.

El lípldo catiónico es preferiblemente blodegradable (metabolizable) y biocompatible.

Además del aceite y el lípldo catiónico, una emulsión puede Incluir un tensloactlvo no Iónico y/o un tensloactlvo zwltterlónlco. Tales tensloactlvos Incluyen, pero no se limitan a: los tensloactlvos de ásteres de polloxletllensorbltán (comúnmente denominados Tweens), especialmente pollsorbato 20 y pollsorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO) y/u óxido de butileno (BO), comercializados con el nombre comercial DOW FAX™, tales como copolímeros de bloque de EO/PO lineales; octoxlnoles, que pueden variar en el número de grupos etoxi (oxi-1,2-etanodiilo) de repetición, siendo de particular interés octoxinol-9 (Tritón X-100, o toctilfenoxipolietoxietanol); (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolípidos tales como fosfatldllcollna (lecltlna); éteres grasos de polloxletlleno derivados de alcoholes lauríneo, cetíllco, estearílico y oleílico (conocidos como tensloactlvos Brlj), tales como monolaurll éter de trletllengllcol (Brij 30); polioxietilen-9-laurll éter; y ásteres de sorbltán (comúnmente conocidos como Spans), tales como trloleato de sorbltán (Span 85) y monolaurato de sorbltán. Los tensloactlvos preferidos para su Inclusión en la emulsión son pollsorbato 80 (Tween 80; monooleato de polloxletllensorbltán), Span 85 (trloleato de sorbltán), lecltlna y Tritón X-100.

Pueden Incluirse mezclas de estos tensloactlvos en la emulsión, por ejemplo, mezclas de Tween 80/Span 85 o mezclas de Tween 80/Triton-X100. También es adecuada una combinación de un éster de polioxietilensorbitán tal como monooleato de polloxletllensorbltán (Tween 80) y un octoxlnol tal como t-octllfenoxl-polletoxletanol (Tritón X-100). Otra combinación útil comprende laurll éter 9 más un éster de polloxletllensorbltán y/o un octoxlnol. Las mezclas útiles pueden comprender un tensioactivo con un valor de HLB en el intervalo de 10-20 (por ejemplo, pollsorbato 80, con un HLB de 15,0) y un tensioactivo con un valor de HLB en el intervalo de 1-10 (por ejemplo, trioleato de sorbitán, con un HLB de 1,8).

Las cantidades preferidas de aceite (% en volumen) en la emulsión final están entre el 2-20%, por ejemplo, el 5-15%, el 6-14%, el 7-13%, el 8-12%. Un contenido de escualeno de aproximadamente el 4-6% o aproximadamente el 9-11% es particularmente útil.

Las cantidades preferidas de tensioactivos (% en peso) en la emulsión final están entre el 0,001% y el 8%. Por ejemplo: ásteres de polloxletllensorbltán (tales como pollsorbato 80) del 0,2 al 4%, en particular entre el 0,4-0,6%, entre el 0,45-0,55%, aproximadamente el 0,5% o entre el 1,5-2%, entre el 1,8-2,2%, entre el 1,9-2,1%, aproximadamente el 2% o el 0,85-0,95% o aproximadamente el 1%; ásteres de sorbitán (tales como trioleato de sorbltán) del 0,02 al 2%, en particular aproximadamente el 0,5% o aproximadamente el 1%; octil- o nonilfenoxipolioxietanoles (tales como Tritón X-100) del 0,001 al 0,1%, en particular del 0,005 al 0,02%; éteres de polloxletlleno (tales como laurll éter 9) del 0,1 al 8%, preferiblemente del 0,1 al 10% y en particular del 0,1 al 1% o aproximadamente el 0,5%.

Las cantidades absolutas de aceite y tensioactivo, y su razón, pueden variarse dentro de amplios límites al tiempo que todavía se forma una emulsión. Un experto en la técnica puede variar fácilmente las proporciones relativas de los componentes para obtener una emulsión deseada, pero es típica una razón en peso de entre 4:1 y 5:1 para el aceite y el tensioactivo (exceso de aceite).

Un parámetro importante para garantizar la actividad inmunoestimuladora de una emulsión, particularmente en animales grandes, es el tamaño de las gotitas de aceite (diámetro). Las emulsiones más eficaces tienen un tamaño de gotita en el intervalo submicrométrico. Adecuadamente, los tamaños de gotita estarán en el intervalo de 50 750 nm. De la manera más útil, el tamaño de gotita promedio es menor de 250 nm, por ejemplo menor de 200 nm, menor de 150 nm. El tamaño de gotita promedio está útilmente en el intervalo de 80-180 nm. Idealmente, al menos el 80 % (en número) de las gotitas de aceite de la emulsión tienen menos de 250 nm de diámetro, y preferiblemente al menos el 90 %. Están disponibles comercialmente aparatos para determinar el tamaño de gotita promedio en una emulsión y la distribución de tamaño. Estos usan normalmente las técnicas de dispersión dinámica de la luz y/o detección óptica de partículas individuales, por ejemplo, las series Accusizer™ y Nicomp™ de instrumentos disponibles de Particle Sizing Systems (Santa Bárbara, EE. UU.), o los instrumentos Zetasizer™ de Malvem Instruments (Reino Unido) o los instrumentos analizadores de la distribución de tamaño de partícula de Horiba (Kyoto, Japón).

Idealmente, la distribución de tamaños de gotita (en número) tiene solo un máximo, es decir, hay una sola población de gotitas distribuidas alrededor de un promedio (moda), en lugar de tener dos máximos. Las emulsiones preferidas tienen una polidispersidad de <0,4, por ejemplo, 0,3, 0,2, o menos.

Pueden obtenerse emulsiones adecuadas con gotitas submicrométricas y una distribución de tamaño estrecha mediante el uso de microfluidización. Esta técnica reduce el tamaño de gotitas de aceite promedio al impulsar corrientes de componentes de entrada a través de canales geométricamente fijos a alta presión y alta velocidad. Estas corrientes entran en contacto con las paredes del canal, las paredes de la cámara y entre sí. Las fuerzas resultantes de cizallamiento, impacto y cavitación provocan una reducción en el tamaño de las gotitas. Pueden realizarse etapas repetidas de microfluidización hasta que se consiga una emulsión con una distribución y promedio de tamaño de gotita deseados.

Como alternativa a la microfluidización, pueden usarse métodos térmicos para provocar la inversión de fases. Estos métodos también pueden proporcionar una emulsión submicrométríca con una distribución de tamaño de partícula estrecha.

Las emulsiones preferidas pueden esterilizarse por filtración, es decir, sus gotitas pueden hacerse pasar a través de un filtro de 220 nm. Además de proporcionar una esterilización, este procedimiento también elimina cualquier gotita grande de la emulsión.

En determinadas realizaciones, el lípido catiónico en la emulsión es DOTAP. La emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender desde aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 25 mg/ml de DOTAP. Por ejemplo, la emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender DOTAP a desde aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 25 mg/ml, desde aproximadamente 0,6 mg/ml hasta aproximadamente 25 mg/ml, desde aproximadamente 0,7 mg/ml hasta aproximadamente 25 mg/ml, desde aproximadamente 0,8 mg/ml hasta aproximadamente 25 mg/ml, desde aproximadamente 0,9 mg/ml hasta aproximadamente 25 mg/ml, desde aproximadamente 1,0 mg/ml hasta aproximadamente 25 mg/ml, desde aproximadamente 1,1 mg/ml hasta aproximadamente 25 mg/ml, desde aproximadamente 1,2 mg/ml hasta aproximadamente 25 mg/ml, desde aproximadamente 1,3 mg/ml desde aproximadamente 25 mg/ml, desde aproximadamente 1,4 mg/ml hasta aproximadamente 25 mg/ml, desde aproximadamente 1,5 mg/ml hasta aproximadamente 25 mg/ml, desde aproximadamente 1,6 mg/ml hasta aproximadamente 25 mg/ml, desde aproximadamente 1,7 mg/ml hasta aproximadamente 25 mg/ml, desde aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 24 mg/ml, desde aproximadamente 0,5 mg/ml

hasta aproximadamente 22 mg/ml, desde aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 20 mg/ml,

desde aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 18 mg/ml, desde aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 15 mg/ml, desde aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 12 mg/ml, desde aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 10 mg/ml, desde aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 2 mg/ml, desde aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 1,9 mg/ml, desde aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 1,8 mg/ml, desde aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 1,7 mg/ml, desde aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 1,6 mg/ml, desde aproximadamente 0,6 mg/ml hasta aproximadamente 1,6 mg/ml, desde aproximadamente 0,7 mg/ml hasta aproximadamente 1,6 mg/ml, desde aproximadamente 0,8 mg/ml hasta aproximadamente 1,6 mg/ml, aproximadamente 0,5 mg/ml, aproximadamente 0,6 mg/ml, aproximadamente 0,7 mg/ml, aproximadamente 0,8 mg/ml, aproximadamente 0,9 mg/ml, aproximadamente 1,0 mg/ml, aproximadamente 1,1 mg/ml, aproximadamente 1,2 mg/ml, aproximadamente 1,3 mg/ml, aproximadamente 1,4 mg/ml, aproximadamente 1,5 mg/ml, aproximadamente 1,6 mg/ml, aproximadamente 12 mg/ml, aproximadamente 18 mg/ml, aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 21,8 mg/ml, aproximadamente 24 mg/ml, etc. En una realización a modo de ejemplo, la emulsión catiónica de aceite en agua comprende desde aproximadamente 0,8 mg/ml hasta aproximadamente 1,6 mg/ml de DOTAP, tal como 0,8 mg/ml, 1,2 mg/ml, 1,4 mg/ml o 1,6 mg/ml.

En determinadas realizaciones, el lípido catiónico es DC colesterol. La emulsión catiónlca de aceite en agua puede comprender DC colesterol a desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml de DC colesterol. Por ejemplo, la emulsión catlónica de aceite en agua puede comprender DC colesterol desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 0,2 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 0,3 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 0,4 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 0,62 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 1 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 1,5 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 2 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 2,46 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 3 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 3,5 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 4 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 4,5 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 4,92 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 4,5 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 4 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 3,5 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 3 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 2,46 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 2 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 1,5 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 1 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 0,62 mg/ml, aproximadamente 0,15 mg/ml, aproximadamente 0,3 mg/ml, aproximadamente 0,6 mg/ml, aproximadamente 0,62 mg/ml, aproximadamente 0,9 mg/ml, aproximadamente 1,2 mg/ml, aproximadamente 2,46 mg/ml, aproximadamente 4,92 mg/ml, etc. En una realización a modo de ejemplo, la emulsión catlónica de aceite en agua comprende desde aproximadamente 0,62 mg/ml hasta aproximadamente 4,92 mg/ml de DC colesterol, tal como 2,46 mg/ml.

En determinadas realizaciones, el lípido catiónico es DDA. La emulsión catlónica de aceite en agua puede comprender desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml DDA. Por ejemplo, la emulsión catlónica de aceite en agua puede comprender DDA a desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 4,5 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 4 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 3,5 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 3 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 2,5 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 2 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 1,5 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 1,45 mg/ml, desde aproximadamente 0,2 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 0,3 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 0,4 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 0,6 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 0,73 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 0,8 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 0,9 mg/ml desde aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 1,0 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 1,2 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 1,45 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 2 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 2,5 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 3 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 3,5 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 4 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 4,5 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, aproximadamente 1,2 mg/ml, aproximadamente 1.45 mg/ml, etc. Alternativamente, la emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender DDA a aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 21 mg/ml, aproximadamente 21,5 mg/ml, aproximadamente 21,6 mg/ml, aproximadamente 25 mg/ml. En una realización a modo de ejemplo, la emulsión catlónica de aceite en agua comprende desde aproximadamente 0,73 mg/ml hasta aproximadamente 1,45 mg/ml de DDA, tal como 1.45 mg/ml.

Pueden usarse catéteres o dispositivos similares para administrar las moléculas de ARN autorrepllcante de la invención, como ARN desnudo o en combinación con un sistema de administración, a un tejido u órgano diana. Se dan a conocer catéteres adecuados en, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 4.186.745; 5.397.307; 5.547.472; 5.674.192; y 6.129.705

La presente divulgación incluye el uso de sistemas de administración adecuados, tales como llposomas, micropartículas poliméricas o micropartículas en emulsión submicrométricas con ARN autorrepllcante encapsulado o adsorbido, para administrar una molécula de ARN autorrepllcante que codifica un pollpéptldo F de VRS, por ejemplo, para provocar una respuesta inmunitaria sola, o en combinación con otra macromolécula. La divulgación Incluye llposomas, micropartículas y emulsiones submicrométricas con moléculas de ARN autorrepllcante adsorbidas y/o encapsuladas, y combinaciones de los mismos.

Tal como se demuestra además en los ejemplos, las moléculas de ARN autorrepllcante asociadas con liposomas y micropartículas en emulsión submicrométricas pueden administrarse eficazmente a la célula huésped, y pueden inducir una respuesta inmunitaria a la proteína codificada por el ARN autorreplicante.

La composición inmunogénica

La divulgación proporciona composiciones inmunogénicas. Las composiciones inmunogénicas pueden incluir un solo agente inmunogénico activo, o varios agentes inmunogénicos. Por ejemplo, la composición inmunogénica puede comprender polipéptidos F de VRS que están en una sola forma (por ejemplo, trímero). La composición inmunogénica puede comprender un ARN autorreplicante que codifica un polipéptido F de VRS, y preferiblemente también comprende un sistema de administración adecuado, tal como liposomas, micropartículas poliméricas, una emulsión de aceite en agua y combinaciones de los mismos.

Las composiciones inmunogénicas pueden comprender también uno o más agentes inmunorreguladores. Preferiblemente, uno o más de los agentes inmunorreguladores incluyen uno o más adyuvantes, por ejemplo dos, tres, cuatro o más adyuvantes. Los adyuvantes pueden incluir un adyuvante TH1 y/o un adyuvante TH2, comentados adicionalmente a continuación.

En otra realización, una composición inmunogénica comprende un polipéptido que muestra un epítopo presente en una conformación de prefusión o intermedia de la glucoproteína VRS-F, pero no presenta la conformación de posfusión de la glucoproteína.

Se da a conocer una composición inmunogénica que comprende un primer polipéptido y un segundo polipéptido, en la que el primer polipéptido comprende una proteína F de VRS, en su totalidad o en parte, y el segundo polipéptido comprende un dominio de oligomerización heterólogo. El primer polipéptido puede comprender un ectodominio de proteína F de VRS. El segundo polipéptido puede ser un dominio de trimerización.

En un aspecto, se da a conocer una composición que comprende polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS escindidos producidos proporcionando polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos, o polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales, y escindiéndolos para producir subunidades Fi y F2, tal como se describe en el presente documento.

En otro aspecto, se da a conocer una composición que comprende trímeros de polipéptido de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos producidos proporcionando un material biológico que contiene polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos, y purificando los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos, trímeros no escindidos del material biológico, tal como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el polipéptido de ectodominio de proteína F de VRS contiene sitios de escisión de furina alterados en aproximadamente las posiciones 106-109 y en aproximadamente las posiciones 133-136, y si se desea puede contener además un péptido de fusión alterado. En otras realizaciones, el ectodominio de proteína F de VRS contiene sitios de escisión de furina alterados en aproximadamente las posiciones 106-109 y en aproximadamente las posiciones 133-136, y sitios de escisión de tripsina alterados entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161, y si se desea puede contener además un péptido de fusión alterado.

En otro aspecto, la divulgación proporciona una composición que comprende trímeros de polipéptido de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales producidos proporcionando un material biológico que contiene polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos C-terminales, y purificando polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS no escindidos, trímeros no escindidos del material biológico, tal como se describe en el presente documento.

En otro aspecto, la divulgación proporciona una composición que comprende polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS escindidos producidos proporcionando un material biológico que contiene polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS escindidos que contienen un péptido de fusión alterado (por ejemplo, al menos una porción del péptido de fusión se deleciona) y purificando trímeros de polipéptido de ectodominio de proteína F de VRS escindidos del material biológico, tal como se describe en el presente documento.

Las composiciones son preferiblemente adecuadas para su administración a un sujeto mamífero, tal como un ser humano, e incluyen uno o más portadores y/o excipientes farmacéuticamente aceptables, incluyendo adyuvantes. En la referencia 29 está disponible una discusión detallada de tales componentes. Las composiciones estarán generalmente en forma acuosa. Cuando la composición es una composición inmunogénica, provocará una respuesta inmunitaria cuando se administra aun mamífero, tal como un ser humano. La composición inmunogénica puede usarse para preparar una formulación de vacuna para inmunizar a un mamífero.

Las composiciones inmunogénicas pueden incluir un solo agente inmunogénico activo, o varios agentes inmunogénicos. Por ejemplo, el polipéptido de ectodominio de proteína F de VRS puede estar en una sola forma (por ejemplo, trímero no escindido, trímero escindido o rosetas de trímeros escindidos) o en dos o más formas. Además, las composiciones pueden contener un polipéptido de ectodominio de proteína F de VRS y una o más de otras proteínas de VRS (por ejemplo, una proteína G y/o una proteína M) y/o puede combinarse con inmunógenos de otros patógenos.

La composición puede incluir conservantes tales como tiomersal o 2-fenoxietanol. Sin embargo, se prefiere que la vacuna esté sustancialmente libre de (es decir, menos de 5 ng/ml) material de mercurio, por ejemplo, libre de tiomersal. Se prefieren más composiciones inmunogénicas que no contienen mercurio. Se prefieren particularmente composiciones inmunogénicas libres de conservantes.

Para controlar la tonicidad, se prefiere incluir una sal fisiológica, tal como una sal de sodio. Se prefiere cloruro de sodio (NaCI), que puede estar presente a entre 1 y 20 mg/ml. Otras sales que pueden estar presentes incluyen cloruro de potasio, dihidrogenofosfato de potasio, fosfato de disodio deshidratado, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, y similares.

Las composiciones tendrán generalmente una osmolalidad de entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, preferiblemente entre 240-360 mOsm/kg, y se encontrarán más preferiblemente dentro del intervalo de 290 310 mOsm/kg.

Las composiciones pueden incluir uno o más tampones. Los tampones típicos incluyen: un tampón fosfato; un tampón Tris; un tampón borato; un tampón succinato; un tampón histidina (particularmente con un adyuvante de hidróxido de aluminio); o un tampón citrato. Los tampones se incluirán normalmente en el intervalo de 5-20 mM. El pH de una composición estará generalmente 5,0 y 8,1, y más normalmente entre 6,0 y 8,0, por ejemplo, entre 6,5 y 7,5, o entre 7,0 y 7,8. Por tanto, un procedimiento de la invención puede incluir una etapa de ajuste del pH de la vacuna a granel antes de su envasado.

La composición es preferiblemente estéril. La composición es preferiblemente no pirógena conteniendo, por ejemplo, <1 UE (unidad de endotoxina, una medida estándar) por dosis, y preferiblemente <0,1 UE por dosis. La composición está preferiblemente libre de gluten. Las vacunas humanas se administran normalmente en un volumen de dosificación de aproximadamente 0,5 mi, aunque puede administrarse la mitad de la dosis (es decir, aproximadamente 0,25 mi) a los niños.

Adyuvantes

Las composiciones de la invención, que contienen polipéptidos VRS-F, o ácidos nucleicos que codifican polipéptidos VRS-F, también pueden incluir uno o más adyuvantes, por ejemplo, dos, tres, cuatro o más adyuvantes, que pueden funcionar potenciando las respuestas inmunitarias (humoral y/o celular) provocadas en un paciente que recibe la composición. Los adyuvantes pueden incluir un adyuvante TH1 y/o un adyuvante TH2. Los adyuvantes que pueden usarse en las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a:

• Composiciones que contienen minerales. Las composiciones que contienen minerales adecuadas para su uso como adyuvantes en la invención incluyen sales minerales, tales como sales de calcio y sales de aluminio (o mezclas de las mismas). La invención incluye sales minerales tales como hidróxidos (por ejemplo, oxihidróxidos), fosfatos (por ejemplo, hidroxifosfatos, ortofosfatos), sulfatos, etc., o mezclas de diferentes compuestos minerales, adoptando los compuestos cualquier forma adecuada (por ejemplo, gel, cristalina, amorfa, etc.), y prefiriéndose la adsorción. Las sales de calcio incluyen fosfato de calcio (por ejemplo, las partículas “CAP” dadas a conocer en la referencia 38). Las sales de aluminio incluyen hidróxidos, fosfatos, sulfatos y similares. Las composiciones que contienen minerales también pueden formularse como una partícula de sal de metal (39). Se describen adyuvantes de sal de aluminio con más detalle a continuación.

• Composiciones de emulsión de aceite (véase con más detalle a continuación). Las composiciones de emulsión de aceite adecuadas para su uso como adyuvantes en la invención incluyen emulsiones de escualeno-agua, tales como MF59 (el 5% de escualeno, el 0,5% de Tween 80 y el 0,5% de Span, formulados en partículas submicrométricas usando un microfluidizador).

• Agentes inductores de citocinas (véase con más detalle a continuación). Los agentes inductores de citocinas adecuados para su uso en la invención incluyen agonistas del receptor 7 de tipo Toll (TLR7) (por ejemplo, compuestos de benzonaftiridina dados a conocer en el documento WO 2009/111337).

Saponinas (capítulo 22 de la referencia 74), que son un grupo heterólogo de glucósidos de esteral y glucósidos triterpenoides que se encuentran en la corteza, las hojas, los tallos, las raíces e incluso las flores de una amplia gama de especies de plantas. Se ha estudiado ampliamente la saponina de la corteza del árbol Quillaia saponaria Molina como coadyuvante. La saponina también puede obtenerse comercialmente de Smilax omata (zarzaparrilla), Gypsophilla paniculata (velo de novia) y Saponaria officinalis (jabonera). Las formulaciones de adyuvantes de saponina incluyen formulaciones purificadas, tales como QS21, así como formulaciones de lípidos, tales como ISCOM. QS21 se comercializa como STIMULON (TM). Las composiciones de saponina se han purificado usando HPLC y RP-HPLC. Se han identificado fracciones purificadas específicas usando estas técnicas, incluyendo QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B y QH-C. Preferiblemente, la saponina es QS21. En la referencia 40 se describe un método de producción de QS21. Las formulaciones de saponina también pueden comprender un esteral, tal como colesterol (41). Pueden usarse combinaciones de saponinas y colesteroles para formar partículas únicas denominadas complejos inmunoestimulantes (ISCOM) (capítulo 23 de la referencia 74). Los ISCOM normalmente también incluyen un fosfolípido tal como fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina. Cualquier saponina conocida puede usarse en ISCOM. Preferiblemente, el ISCOM incluye uno o más de QuilA, QHA y QHC. Los ISCOM se describen adicionalmente en las referencias 41-43. Opcionalmente, los ISCOM puede estar desprovisto de detergente adicional (44). En las referencias 45 y 46 puede encontrarse una revisión del desarrollo de adyuvantes a base de saponina.

Adyuvantes grasos (véase con más detalle a continuación), incluyendo emulsiones de aceite en agua, lípidos A naturales modificados derivados de lipopolisacáridos enterobacterianos, compuestos de fosfolípidos (tales como el dímero de fosfolípido sintético, E6020) y similares.

Toxinas bacterianas ADP-ribosilantes (por ejemplo, la enterotoxina termolábil de E. coli “LT”, toxina del cólera “CT” o toxina de la tosferina “PT”) y derivados detoxificados de las mismas, tales como las toxinas mutantes conocidas como LT-K63 y LT-R72 (47). En la referencia 48 se describe el uso de toxinas ADP-ribosilantes detoxificadas como adyuvantes mucosos y como adyuvantes parenterales en la referencia 49.

Bioadhesivos y mucoadhesivos, tales como microesferas de ácido hialurónico esterificado (50) o quitosano y sus derivados (51).

Micropartículas (es decir, una partícula de -100 nm a -150 nm de diámetro, más preferiblemente de -200 nm a -30 nm de diámetro o de -500 nm a -10 nm de diámetro) formadas a partir de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo, un poli(a-hidroxiácido), un poli(ácido hidroxibutírico), un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, y similares), prefiriéndose la poli(lactida-co-glicolida), opcionalmente tratadas para tener una superficie cargada negativamente (por ejemplo, con SDS) o una superficie cargada positivamente (por ejemplo, con un detergente catiónico, tal como CTAB).

Liposomas (capítulos 13 y 14 de la referencia 74). En las referencias 52-54 se describen ejemplos de formulaciones de liposomas adecuadas para su uso como adyuvantes.

Éteres de polioxietileno y ásteres de polioxietileno (55). Tales formulaciones incluyen además tensioactivos de áster de polioxietilensorbitán en combinación con un octoxinol (56) así como tensioactivos de ásteres o éteres de polioxietilenalquilo en combinación con al menos un tensioactivo no iónico adicional tal como un octoxinol (57). Los éteres de polioxietileno preferidos se seleccionan del siguiente grupo: lauril éter de polioxietilen-9 (lauril éter 9), esteoril éter de polioxietilen-9, esteoril éter de polioxietilen-8, lauril éter de polioxietilen-4, lauril éter de polioxietilen-35 y lauril éter de polioxietilen-23.

Péptidos de muramilo, tales como N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (“thr-MDP”), N-acetilnormuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilglucosaminil-N-acetilmuramil-L-AI-D-isoglu-L-Aladipalmitoxipropilamida (“DTP-DPP” o Theramide™), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1’-2’dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (“MTP-PE”).

Una preparación de proteasoma de proteína de la membrana externa preparada a partir de una primera bacteria Gram-negativa en combinación con una preparación de liposacárido derivada de una segunda bacteria Gram-negativa, en donde las preparaciones de proteosoma de proteína de la membrana externa y de liposacárido forman un complejo adyuvante no covalente estable. Tales complejos incluyen “IVX-908”, un complejo compuesto por lipopolisacáridos y membrana externa de Neisseria meningitidis.

Un polímero de polioxidonio (58, 59) u otro derivado de polietilen-piperazina N-oxidada.

5’-Monofosfato de metilinosina (“MIMP”) (60).

• Un compuesto de pirrolizidina polihidroxada (61), como el que tiene la fórmula:

donde R se selecciona del grupo que comprende hidrógeno, grupos acilo, alquilo (por ejemplo, cicloalquilo), alquenilo, alquinilo y arilo lineales o ramificados, sustituidos o no sustituidos, saturados o insaturados, o una de sal o derivado farmacéuticamente aceptable del mismo. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a: casuarina, casuarina-6-a-D-glucopiranosa, 3-ep/-casuarina, 7-ep/-casuarina, 3,7-diep/-casuarina y similares.

• Un ligando de CDId, tal como una a-glicosilceramida (62-69) (por ejemplo, a-galactosilceramida), aglicosilceramidas que contienen fitoesfingosina, OCH, KRN7000 [(2S,3S,4R)-1-0-(a-D-galactopiranosil)-2-(N-hexacosanoilamino)-1,3,4-octadecanotriol], CRONY-101,3”-0-sulfo-galactosilceramida, etc.

• Una inulina gamma (70) o un derivado de la misma, tal como algamulina.

• Virosomas y partículas similares a virus (VLP). Estas estructuras contienen generalmente una o más proteínas de un virus combinadas o formuladas opcionalmente con un fosfolípido. Generalmente no son patógenas, no se replican y generalmente no contienen nada del genoma viral nativo. Las proteínas virales pueden producirse o aislarse de manera recombinante a partir de virus completos. Estas proteínas virales adecuadas para su uso en virosomas o VLP incluyen proteínas derivadas del virus influenza (tales como HA o NA), virus de la hepatitis B (tales como proteínas del núcleo o de la cápside), virus de la hepatitis E, virus del sarampión, virus Sindbis, rotavirus, virus de la fiebre aftosa, retrovirus, virus Norwalk, virus del papiloma humano, VIH, fagos de ARN, fago Qp (tal como proteínas de la cubierta), fago GA, fago fr, fago AP205 y Ty (tal como la proteína p1 de retrotransposón Ty).

Estas y otras sustancias activas adyuvantes se comentan en más detalle en las referencias 74 y 75.

Las composiciones pueden incluir dos, tres, cuatro o más adyuvantes. Por ejemplo, las composiciones de la invención pueden incluir ventajosamente tanto una emulsión de aceite en agua como un agente inductor de citocinas, o tanto una composición que contiene minerales como un agente inductor de citocinas, o dos adyuvantes de emulsión de aceite en agua, o dos compuestos de benzonaftiridinas, etc.

Los antígenos y adyuvantes en una composición estarán normalmente en mezcla.

Adyuvantes de emulsión de aceite

Las composiciones de emulsión de aceite adecuadas para su uso como adyuvantes en la invención incluyen emulsiones de escualeno-agua, tales como MF59 (el 5 % de escualeno, el 0,5 % de Tween 80 y el 0,5 % de Span 85, formulados en partículas submicrométricas utilizando un microfluidizador). También pueden usarse adyuvante completo de Freund (CFA) y adyuvante incompleto de Freund (IFA).

Se conocen diversas emulsiones de aceite en agua, y normalmente incluyen al menos un aceite y al menos un tensioactivo, siendo el(los) aceite(s) y el(los) tensioactivo(s) biodegradable(s) (metabolizable(s)) y biocompatible(s). Las gotitas de aceite en la emulsión generalmente tienen menos de 5 pm de diámetro, y pueden incluso tener un diámetro submicrométrico, lográndose estos pequeños tamaños con un microfluidizador para proporcionar emulsiones estables. Se prefieren gotitas con un tamaño menor de 220 nm, ya que pueden someterse a esterilización por filtración.

La invención puede usarse con aceites como los una fuente animal (tal como pescado) o vegetal. Las fuentes de aceites vegetales incluyen frutos secos, semillas y cereales. El aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite de coco y aceite de oliva, el más comúnmente disponible, ejemplifican los aceites de frutos secos. Puede usarse aceite de jojoba, por ejemplo, obtenido de la semilla de jojoba. Los aceites de semillas incluyen aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de semilla de girasol, aceite de semilla de sésamo y similares. En el grupo de cereales, el aceite de maíz es el más fácilmente disponible, pero también puede usarse el aceite de otros cereales tales como trigo, avena, centeno, arroz, teff, triticale y similares. Pueden prepararse ésteres de ácidos grasos de 6-10 carbonos de glicerol y 1,2-propanodiol, aunque no se producen de manera natural en los aceites de semillas, por hidrólisis, separación y esterificación de los materiales apropiados partiendo de los aceites de frutos secos y semillas. Las grasas y los aceites de la leche de mamíferos son metabolizables y, por tanto, pueden usarse en la práctica de esta invención. Los procedimientos de separación, purificación, saponificación y otros medios necesarios para obtener aceites puros de fuentes animales se conocen bien en la técnica. La mayoría de los peces contienen aceites metabolizables que pueden recuperarse fácilmente. Por ejemplo, el aceite de hígado de bacalao, aceites de hígado de tiburón y aceite de ballena tal como esperma de ballena ejemplifican varios de los aceites de pescado que pueden usarse en el presente documento. Varios aceites de cadena ramificada se sintetizan bioquímicamente en unidades de isopreno de 5 carbonos y generalmente se denominan terpenoides. El aceite de hígado de tiburón contiene un terpenoide insaturado y ramificado conocido como escualeno, 2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno, que se prefiere particularmente en el presente documento. El escualano, el análogo saturado del escualeno, también es un aceite preferido. Los aceites de pescado, Incluyendo escualeno y escualano, están fácilmente disponibles de fuentes comerciales o pueden obtenerse mediante métodos conocidos en la técnica. Otros aceites preferidos son los tocoferoles (véase a continuación). Pueden usarse mezclas de aceites.

Los tensioactivos pueden clasificarse por su ‘HLB’ (equilibrio hldrófilo/lipófilo). Los tensioactivos preferidos de la Invención tienen un HLB de al menos 10, preferiblemente al menos 15 y más preferiblemente al menos 16. La invención puede usarse con tensioactivos que incluyen, pero no se limitan a: los tensioactivos de ésteres de polioxietilensorbitán (comúnmente denominados Tweens), especialmente polisorbato 20 y polisorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO) y/u óxido de butileno (BO), comercializados con el nombre comercial DOWFAX (TM), tales como copolímeros de bloque de EO/PO lineales; octoxinoles, que pueden variar en el número de grupos etoxi (oxi-1,2-etanodiilo) de repetición, siendo de particular interés octoxinol-9 (Tritón X-100, o t-octilfenoxipolietoxietanol); (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolípidos tales como fosfatidilcolina (lecitina); etoxilatos de nonilfenol, tales como la serie TERGITOL (TM) NP; éteres grasos de polioxietileno derivados de alcoholes laurílico, cetílico, estearílico y oleílico (conocidos como tensioactivos Brlj), tales como monolauril éter de trietilenglicol (Brij 30); y ésteres de sorbitán (comúnmente conocidos como SPAN), tales como trloleato de sorbitán (Span 85) y monolaurato de sorbitán. Se prefieren tensioactivos no Iónicos. Tensioactivos preferidos para su Inclusión en la emulsión son TWEEN 80 (TM) (monooleato de polioxietilensorbitán), Span 85 (trioleato de sorbitán), lecitina y Tritón X-100.

Pueden usarse mezclas de tensioactivos, por ejemplo, mezclas de TWEEN 80 (TM)/Span 85. También es adecuada una combinación de un éster de polioxietilensorbitán tal como monooleato de polioxietilensorbitán (TWEEN 80 (TM)) y un octoxlnol tal como t-octilfenox¡polietox¡etanol (Tritón X-100). Otra combinación útil comprende laurll éter 9 más un éster de polioxietilensorbitán y/o un octoxlnol.

Las cantidades preferidas de tensioactivos (% en peso) son: ésteres de polioxietilensorbitán (tales como TWEEN 80 (TM)) del 0,01 al 1%, en particular aproximadamente el 0,1%; octil- o nonilfenoxipolioxietanoles (tales como Tritón X-100, u otros detergentes de la serie Tritón) del 0,001 al 0,1 %, en particular del 0,005 al 0,02 %; éteres de polioxietileno (tales como laurll éter 9) del 0,1 al 20 %, preferiblemente del 0,1 al 10 % y en particular del 0,1 al 1 % o aproximadamente el 0,5 %.

Los adyuvantes de emulsión de aceite en agua específicos útiles con la invención incluyen, pero no se limitan a:

• Una emulsión submicrométrica de escualeno, TWEEN 80 (TM) y Span 85. La composición de la emulsión en volumen puede ser aproximadamente el 5 % de escualeno, aproximadamente el 0,5 % de polisorbato 80 y aproximadamente el 0,5 % de Span 85. En términos de peso, estas razones se convierten en el 4,3 % de escualeno, el 0,5% de polisorbato 80 y el 0,48% de Span 85. Este adyuvante se conoce como ‘MF59’ (71-73), como se describe con más detalle en el capítulo 10 de la referencia 74 y el capítulo 12 de la referencia 75. La emulsión de MF59 incluye ventajosamente iones de citrato, por ejemplo, tampón citrato de sodio 10 mM.

• Una emulsión de escualeno, un tocoferol y TWEEN 80 (TM). La emulsión puede incluir solución salina tamponada con fosfato. También puede incluir Span 85 (por ejemplo, al 1%) y/o lecitina. Estas emulsiones pueden tener de desde el 2 hasta el 10 % de escualeno, desde el 2 hasta el 10 % de tocoferol y desde el 0,3 hasta el 3 % de TWEEN 80 (TM), y la razón en peso de escualeno: tocoferol es preferiblemente <1 ya que proporciona una emulsión más estable. Pueden estar presentes escualeno y TWEEN 80 (TM) en una razón en volumen de aproximadamente 5:2. Puede prepararse una emulsión de este tipo disolviendo TWEEN 80 (TM) en PBS para dar una disolución al 2 %, luego mezclando 90 mi de esta disolución con una mezcla de (5 g de DL-a-tocoferol y 5 mi de escualeno) y luego microfluidizando la mezcla. La emulsión resultante puede tener gotltas de aceite submicrométricas, por ejemplo, con un diámetro promedio de entre 100 y 250 nm, preferiblemente 180 nm aproximadamente.

Una emulsión de escualeno, un tocoferol y un detergente Tritón (por ejemplo, Tritón X-100). La emulsión también puede incluir un 3d-MPL (véase a continuación). La emulsión puede contener un tampón fosfato.

Una emulsión que comprende un polisorbato (por ejemplo, polisorbato 80), un detergente Tritón (por ejemplo, Tritón X-100) y un tocoferol (por ejemplo, un succinato de a-tocoferol). La emulsión puede incluir estos tres componentes en una razón en masa de aproximadamente 75:11:10 (por ejemplo, polisorbato 80 750 ng/ml, Tritón X-100 110 ng/ml y succinato de a-tocoferol 100 ng/ml), y estas concentraciones deben incluir cualquier contribución de estos componentes procedente de antígenos. La emulsión también puede incluir escualeno. La emulsión también puede incluir un 3d-MPL (véase a continuación). La fase acuosa puede contener un tampón fosfato.

Una emulsión de escualano, polisorbato 80 y poloxámero 401 (“PLURONIC (TM) L121”). La emulsión puede formularse en solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4. Esta emulsión es un vehículo de administración útil para dipéptidos de muramilo y se ha usado con treonil-MDP en el adyuvante “SAF-1” (76) (el 0,05-1 % de Thr-MDP, el 5 % de escualano, el 2,5 % de Pluronic L121 y el 0,2 % de polisorbato 80). También puede usarse sin el Thr-MDP, como en el adyuvante “AF” (77) (el 5% de escualano, el 1,25% de Pluronic L121 y el 0,2% de polisorbato 80). Se prefiere la microfluidización.

Una emulsión que comprende escualeno, un disolvente acuoso, un tensioactivo no iónico hidrófilo de alquil éter de polioxietileno (por ejemplo, cetoestearil éter de polioxietileno (12)) y un tensioactivo no iónico hidrófobo (por ejemplo, un éster de sorbitán o éster de manida, tal como monoleato de sorbitán o ‘Span 80’). La emulsión es preferiblemente termorreversible y/o tiene al menos el 90% de las gotitas de aceite (en volumen) con un tamaño menor de 200 nm. La emulsión también puede incluir uno o más de: alditol; un agente crioprotector (por ejemplo, un azúcar, tal como dodecilmaltósido y/o sacarosa); y/o un alquilpoliglucósido. Tales emulsiones pueden liofilizarse.

Una emulsión que tiene desde el 0,5 hasta el 50 % de un aceite, el 0,1-10 % de un fosfolípido y el 0,05-5 % de un tensioactivo no iónico. Tal como se describe en la referencia 78, componentes de fosfolípidos preferidos son fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, esfingomielina y cardiolipina. Son ventajosos tamaños de gotita submicrométricos.

Una emulsión de aceite en agua submicrométrica de un aceite no metabolizable (tal como un aceite mineral ligero) y al menos un tensioactivo (tal como lecitina, TWEEN 80 (TM) o Span 80). Pueden incluirse aditivos, tales como saponina QuilA, colesterol, un conjugado de saponina-lipófilo (tal como GPI-0100, descrito en la referencia 79, producido mediante la adición de una amina alifática a desacilsaponina por medio del grupo carboxilo del ácido glucurónico), bromuro de dimetilidioctadecilamonio y/o N,N-dioctadecil-N,N-bis(2-hidroxietil)propanodiamina.

Una emulsión que comprende un aceite mineral, un alcohol graso etoxilado lipófilo no iónico y un tensioactivo hidrófilo no iónico (por ejemplo, un alcohol graso etoxilado y/o un copolímero de bloque de polioxietileno-polioxipropileno).

Una emulsión que comprende un aceite mineral, un alcohol graso etoxilado hidrófilo no iónico y un tensioactivo lipófilo no iónico (por ejemplo, un alcohol graso etoxilado y/o un copolímero de bloque de polioxietileno-polioxipropileno).

• Una emulsión en la que una saponina (por ejemplo, QuilA o QS21) y un esteral (por ejemplo, un colesterol) se asocian como micelas helicoidales (80).

Las emulsiones pueden mezclarse con el antígeno de manera extemporánea, en el momento de la administración. Por tanto, el adyuvante y el antígeno pueden mantenerse por separado en una vacuna envasada o distribuida, lista para la formulación final en el momento de su uso. El antígeno estará generalmente en forma acuosa, de manera que finalmente la vacuna se prepara mezclando dos líquidos. La razón en volumen de los dos líquidos para mezclar puede variar (por ejemplo, entre 5:1 y 1:5), pero generalmente es de 1:1 aproximadamente.

Agentes inductores de citocinas

Los agentes inductores de citocinas para su inclusión en las composiciones de la invención son capaces de, cuando se administran a un paciente, provocar que el sistema inmunitario libere citocinas, incluyendo ¡nterferones e interleucinas. Los agentes preferidos pueden provocar la liberación de uno o más de: ¡nterferón-y; ¡nterleucina-1; interleucina-2; interleucina-12; TNF-a; TNF-(3; y GM-CSF. Los agentes preferidos provocan la liberación de citocinas asociadas con una respuesta inmunitaria de tipo Th1, por ejemplo, interferón-y, TNF-a, interleucina-2. Se prefiere la estimulación tanto de interferón-y como de interleucina-2.

Como resultado de recibir una composición de la invención, por tanto, un paciente tendrá células T que, cuando se estimulan con una proteína F de VRS, liberarán la(s) citocina(s) deseada(s) de una manera específica de antígeno. Por ejemplo, las células T purificadas de su sangre liberarán interferón y cuando se exponen in vitro a la proteína F. En la técnica se conocen métodos para medir tales respuestas en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) e incluyen ELISA, ELISPOT, citometría de flujo y PCR en tiempo real. Por ejemplo, la referencia 81 notifica un estudio en el que se monitorizaron las respuestas inmunitarias mediadas por células T específicas de antígeno contra el toxoide tetánico, específicamente respuestas de interferón y, y se encontró que ELISPOT era el método más sensible para discriminar las respuestas inducidas porTT específicas de antígeno de las respuestas espontáneas, pero que la detección de citocinas intracitoplasmáticas por citometría de flujo era el método más eficiente para detectar efectos reestimulantes.

Los agentes inductores de citocinas adecuados incluyen, pero no se limitan a:

• Un oligonucleótido inmunoestimulador, tal como uno que contiene un motivo CpG (una secuencia de dinucleótido que contiene una citosina no metilada unida mediante un enlace fosfato a una guanosina), o un ARN bicatenario, o un oligonucleótido que contiene una secuencia palindrómica, o un oligonucleótido que contiene una secuencia de poli(dG).

• monofosforil lípido A 3-O-desacilado (‘3dMPL’, también conocido como ‘MPL (TM)’) (82-85).

• Un compuesto de imidazoquinolina, tal como IMIQUIMOD (TM) (“R-837”) (86,87), RESIQUIMOD (TM) (“R-848”) (88), y sus análogos; y sales del mismo (por ejemplo, las sales de clorhidrato). Pueden encontrarse detalles adicionales sobre imidazoquinolinas inmunoestimuladoras en las referencias 89 a 93.

• Un compuesto de benzonaftiridina, tal como: (a) un compuesto que tiene la fórmula:

en la que:

R4 se selecciona de H, halógeno, -C(0)OR7, -C(0)R7, -C(0)N(R11R12), -N(R11R12), -N(R9)2, -NHN(R9)2, -SR7, -(CH2)nOR7, -(CH2)nR7, -LR8, -LR10, -OLR8, -OLR10, alquilo Ci-Ce, heteroalquilo Ci-Ce, haloalquilo Ci-C6, alqueno C2-Cs, alquino C2-¿8, alcoxilo C1-C6, haloalcoxilo C1-C6, arilo, heteroarilo, cicloalquilo C3-C8 y heterocicloalquilo C3-C8, en el que los grupos alquilo C1-C6, heteroalquilo C1-C6, haloalquilo C1-C6, alqueno C2-Cs, alquino C2-Cs, alcoxilo C1-C6, haloalcoxilo C1-C6, arilo, heteroarilo, cicloalquilo C3-C8 y heterocicloalquilo C3-C8 de R4 están cada uno opcionalmente sustituidos con de 1 a 3 sustituyentes independientemente seleccionados de halógeno, -CN, - N02, -R7, -OR8, -C(0)R8, -OC(0)R8, -C(Ó)OR8, -N(R9)2, -P (0 )(0R8)2j -OP(0)(ORs)2, -P(O)(OR10)2j -OP(O)(OR10)2j -C(0)N(R9)2j -S(0)2R8, -S(0)R8, -S(0)2N(R9)2 y -NR9S(0)2R8;

cada L se selecciona independientemente de un enlace, -(0(CH2)m)t-, alquilo C1-C6, alquenileno C2-C6 y alquinileno C2-C6, en el que el alquilo C1-C6, alquenileno C2-C6 y alquinileno C2-C6 de L están cada uno opcionalmente sustituidos con de 1 a 4 sustituyentes independientemente seleccionados de halógeno, -R8, -OR8, -N(R9)2, -P (0 )(0R8)2j -OP(0)(ORs)2, -P(O)(OR10)2 y -OP(O)(OR10)2;

R7 se selecciona de H, alquilo C1-C6, arilo, heteroarilo, cicloalquilo C3-C8, heteroalquilo C1-C6, haloalquilo C1-C6, alqueno C2-Cs, alquino C2-Cs, alcoxilo C1-C6, haloalcoxilo C1-C6 y heterocicloalquilo C3-C8, en el que los grupos alquilo C1-C6, arilo, heteroarilo, cicloalquilo C3-C8, heteroalquilo C1-C6, haloalquilo C1-C6, alqueno C2-Cs, alquino C2-Cs, alcoxilo C1-C6, haloalcoxilo C1-C6 y heterocicloalquilo C3-C8 de R7 están cada uno opcionalmente sustituidos con de 1 a 3 grupos R13;

cada R8 se selecciona independientemente de H, -CH(R10)2, alquilo Ci-Cs, alqueno C2-Cs, alquino C2-Cs, haloalquilo C1-C6, alcoxilo C1-C6, heteroalquilo C1-C6, cicloalquilo C3-C8, heterocicloalquilo C2-Cs, hidroxialquilo C1-C6 y haloalcoxilo C1-C6, en el que los grupos alquilo Ci-Cs, alqueno C2-Cs, alquino C2-C8, heteroalquilo C1-C6, haloalquilo C1-C6, alcoxilo C1-C6, cicloalquilo C3-C8, heterocicloalquilo C2-Cs, hidroxialquilo C1-C6 y haloalcoxilo C1-C6 de R8 están cada uno opcionalmente sustituidos con de 1 a 3 sustituyentes independientemente seleccionados de -CN, R11, -OR11, -SR11, -C(0)R11, -OC(0)R11, -C(0)N(R9)2, -C(0)OR11, -NR9C(0)R11, -NR9R10, -NR11R12, -N(R9)2j -OR9, -OR10, -C(0)NR11R12, -C(0)NR11OH, -S(0)2R11, -S(0)R11, -S(0)2NR11R12, -NR11S(0)2R11, -P(0)(OR11)2 y -OP(0)(OR11)2; cada R9 se selecciona independientemente de H, -C(0)R8, -C (0)0R8, -C(0)R10, -C (0)0R 1°, -S(0)2R1°, -alquil Ci-C6, heteroalquilo C1-C6 y cicloalquilo C3-C6, o cada R9 es independientemente un alquilo C1-C6 que junto con el N al que están unidos forman un heterocicloalquilo C3-C8, en el que el anillo de heterocicloalquilo C3-C8 contiene opcionalmente un heteroátomo adicional seleccionado de N, O y S, y en el que los grupos alquilo C1-C6, heteroalquilo C1-C6, cicloalquilo C3-C6 o heterocicloalquilo C3-C8 de R9 están cada uno opcionalmente sustituidos con de 1 a 3 sustituyentes independientemente seleccionados de -CN, R11, -OR11, -SR11, -C(0)R11, -OC(0)R11, -C(0)OR11, -NR11R12, -C(0)NR11R12, -C(0)NR11OH, -S(0)2R11, -S(0)R11, -S(0)2NR11R12, -NR11S(0)2R11, -P(0)(OR11)2 y -OP(0)(OR11)2;

cada R10 se selecciona independientemente de arilo, cicloalquilo C3-C8, heterocicloalquilo C3-C8 y heteroarilo, en el que los grupos arilo, cicloalquilo C3-C8, heterocicloalquilo C3-C8 y heteroarilo están opcionalmente sustituidos con de 1 a 3 sustituyentes seleccionados de halógeno, -R 8, -OR8, -LR9, -LO R9, -N(R9)2, -NR9C(O)R8, -NR9C 02R8, -C 02R8, -C(0 )R8 y -C(0 )N(R9)2;

R11 y R12 se seleccionan independientemente de H, alquilo C1-C6, heteroalquilo C1-C6, haloalquilo C1-C6, arilo, heteroarilo, cicloalquilo C3-C8 y heterocicloalquilo C3-C8, en los que los grupos alquilo C1-C6, heteroalquilo C1-C6, haloalquilo C1-C6, arilo, heteroarilo, cicloalquilo C3-C8 y heterocicloalquilo C3-C8 de R11 y R12 están cada uno opcionalmente sustituidos con de 1 a 3 sustituyentes independientemente seleccionados de halógeno, -CN, R8, -OR8, -C(0)R8, OC(0)R8, -C(0)OR8, -N(R9)2, -NR8C(0)R8, -NR8C (0)0R8, -C(0)N(R9)2, heterocicloalquilo Cs-Cs, -S(0)2R8, -S(0)2N(R9)2, -NR9S(0)2R8, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxilo C1-C6;

o R11 y R12 son cada uno independientemente alquilo C1-C6 y tomados junto con el átomo de N al que están unidos forman un anillo de heterocicloalquilo C3-C8 opcionalmente sustituido que contiene opcionalmente un heteroátomo adicional seleccionado de N, O y S;

cada R13 se selecciona independientemente de halógeno, -CN, -LR9, -LOR9, -OLR9, -LR10, -LOR10, -OLR10, -LR8, -LOR8, -OLR8, -LSR8, -LSR10, -LC(0)R8, -OLC(0)R8, -LC(0)OR8, -LC(0)R10, -LOC(0)OR8, -LC(0)NR9R11, -LC(0)NR9R8, -LN(R9)2, -LNR9R8, -LNR9R10, -LC(0)N(R9)2, -LS(0)2R8, -LS(0)R8, -LC(0)NR8OH, -LNR9C(0)R8, -LNR9C (0)0R 8, -LS(0)2N(R9)2,-0LS(0)2N(R9)2, -LNR9S(0)2R8, -LC(0)NR9LN(R9)2, -LP(0)(0R8)2j -L0P(0)(0R 8)2j -LP(O)(OR10)2 y -OLP(O)(OR10)2;

cada RA se selecciona independientemente de -R8, -R7, -OR7, -OR8, -R10, -OR10, -SR8, -N02, -CN, -N(R9)2, -NR9C(0)R8, -NR9C(S)R8, -NR9C(0)N(R9)2, -NR9C(S)N(R9)2, -NR9C 02R8, -NR9NR9C(0)R8, -NR9NR9C(0)N(R9)2, -NR9NR9C 02R8, -C(0)C(0)R8, -C(0)CH2C(0)R8, -C02R8, -(CH2)nC 02R8, -C(0)R8, -C(S)R8, -C(0)N(R9)2, -C(S)N(R9)2^j-0C(0)N(R9)2^j-OC(0)R8, -C(0)N(0R8)R8, -C(NOR8)R8, -S(0)2R8, -S(0)3R8, -S02N(R9)2j -S(0)R8, -NR9S 02N(R9)2j -NR9S02R8, -P(0)(0R8)2,-0P(0)(0R 8)2j -P(O)(OR10)2j -OP(O)(OR10)2^j-N(OR8)R8, -CH=CHC02R8, -C(=NH)-N(R9)2 y -(CH2)nNHC(0)R8; o dos sustituyentes RA adyacentes en el anillo A forman un anillo de 5-6 miembros que contiene hasta dos heteroátomos como miembros de anillo;

n es, independientemente en cada caso, 0 ,1,2 , 3, 4, 5, 6, 7 u 8;

cada m se selecciona independientemente de 1,2, 3, 4, 5 y 6, y

t es 1,2, 3, 4, 5,6, 7 o 8; (b) a compuesto que tiene la fórmula:

en la que:

R4 se selecciona de H, halógeno, -C(0)OR7, -C(0)R7, -C(0)N(R11R12), -N(R11R12), -N(R9)2, -NHN(R9)2, -SR7, -(CH2)nOR7, -(CH2)nR7, -LR8, -LR10, -OLR8, -OLR10, alquilo Ci-C6, heteroalquilo Ci-C6, haloalquilo C1-C6, alqueno C2-Cs, alquino C2-Cs, alcoxilo C1-C6, haloalcoxilo C1-C6, arilo, heteroarilo, cicloalquilo Cs-Cs y heterocicloalquilo C3-CS, en el que los grupos alquilo C1-C6, heteroalquilo C1-C6, haloalquilo C1-C6, alqueno C2-Cs, alquino C2-Cs, alcoxilo C1-C6, haloalcoxilo C1-C6, arilo, heteroarilo, cicloalquilo C3-C8 y heterocicloalquilo C3-C8 de R4 están cada uno opcionalmente sustituidos con de 1 a 3 sustituyentes independientemente seleccionados de halógeno, -CN, -N02, -R7, -OR8, -C(0)R8, -OC(0)R8, -C(Ó)OR8, -N(R9)2, -P (0)(0R8)2j -0P (0)(0R 8)2j -P(O)(OR10)2j -OP(O)(OR10)2j -C(0)N(R9)2j -S(0)2R8, -S(0)R8, -S(0)2N(R9)2 y -NR9S(0)2R8;

cada L se selecciona independientemente de un enlace, -(0(CH2)m)t-, alquilo C1-C6, alquenileno C2-C6 y alquinileno C2-C6, en el que el alquilo C1-C6, alquenileno C2-C6 y alquinileno C2-C6 de L están cada uno opclonalmente sustituidos con de 1 a 4 sustituyentes Independientemente seleccionados de halógeno, -R8, -OR8, -N(R9)2, -P(0)(0R8)2, -0P (0)(0R s)2, -P(O)(OR10)2 y -OP(O)(OR10)2;

R7 se selecciona de H, alquilo C1-C6, arllo, heteroarllo, cicloalquilo C3-C8, heteroalqullo C1-C6, haloalqullo C1-C6, alqueno C2-C8, alquino C2-C8, alcoxilo C1-C6, haloalcoxilo C1-C6 y heterocicloalquilo C3-C8, en el que los grupos alquilo C1-C6, arllo, heteroarllo, cicloalquilo C3-C8, heteroalqullo C1-C6, haloalqullo C1-C6, alqueno C2-C8, alquino C2-C8, alcoxilo C1-C6, haloalcoxilo C1-C6 y heterocicloalquilo C3-C8 de R7 están cada uno opclonalmente sustituidos con de 1 a 3 grupos R13;

cada R8 se selecciona independientemente de H, -CH(R10)2, alquilo Ci-Cs, alqueno C2-C8, alquino C2-C8, haloalqullo C1-C6, alcoxilo C1-C6, heteroalqullo C1-C6, cicloalquilo C3-C8, heterocicloalquilo C2-Cs, hldroxlalqullo C1-C6 y haloalcoxilo C1-C6, en el que los grupos alquilo Ci-Cs, alqueno C 2-Cs, alquino C2-C8, heteroalqullo C1-C6, haloalqullo C1-C6, alcoxilo C1-C6, cicloalquilo C3-C8, heterocicloalquilo C2-Cs, hldroxlalqullo C1-C6 y haloalcoxilo C1-C6 de R8 están cada uno opclonalmente sustituidos con de 1 a 3 sustituyentes independientemente seleccionados de -CN, R11, -OR11, -SR 11, -C(0 )R11, -OC(0 )R11, -C(0 )N(R9)2, -C(0 )OR11, -NR9C(0 )R11, -NR9R10, -NR11R12, -N(R9)2, -OR9, -OR10, -C(0 )NR11R12, -C(0 )NR11OH, -S(0 )2R11, -S(0 )R11, -S(0 )2NR11R12, -NR11S(0 )2R11, -P(0 )(OR11)2 y -O P(0 )(OR11)2;

cada R9 se selecciona independientemente de H, -C(0 )R8, -C(0 )OR8, -C(O)R10,-C(O)OR10, -S(0 )2R10, -alquil C1-C6, heteroalqullo C1-C6 y cicloalquilo C3-C6, o cada R9 es Independientemente un alquilo C1-C6 que junto con el N al que están unidos forman un heterocicloalquilo C3-C8, en el que el anillo de heterocicloalquilo C3-C8 contiene opclonalmente un heteroátomo adicional seleccionado de N, O y S, y en el que los grupos alquilo C1-C6, heteroalqullo C1-C6, cicloalquilo C3-C6 o heterocicloalquilo C3-C8 de R9 están cada uno opclonalmente sustituidos con de 1 a 3 sustituyentes Independientemente seleccionados de -CN, R11, -OR11, -SR 11, -C(0 )R11, -OC(0 )R11, -C(0 )OR11, -NR11R12, -C(0 )NR11R12, -C(0 )NR11OH, -S(0 )2R11, -S(0 )R11, -S(0 )2NR11R12, -NR11S(0 )2R11, -P(0 )(OR11)2 y -OP(0 )(OR11)2;

cada R10 se selecciona Independientemente de arllo, cicloalquilo C3-C8, heterocicloalquilo C3-C8 y heteroarllo, en el que los grupos arllo, cicloalquilo C3-C8, heterocicloalquilo C3-C8 y heteroarllo están opcionalmente sustituidos con de 1 a 3 sustituyentes seleccionados de halógeno, -R8, -OR8, -LR9, -LOR9, -N(R9)2, -NR9C(0 )R8, -NR9C 02R8, -C 02R8, -C(0 )R8 y -C(0 )N(R9)2;

R11 y R12 se seleccionan independientemente de H, alquilo C1-C6, heteroalqullo C1-C6, haloalqullo C1-C6, arllo, heteroarllo, cicloalquilo C3-C8 y heterocicloalquilo C3-C8, en los que los grupos alquilo C1-C6, heteroalqullo C1-C6, haloalqullo C1-C6, arllo, heteroarllo, cicloalquilo C3-C8 y heterocicloalquilo C3-C8 de R11 y R12 están cada uno opcionalmente sustituidos con de 1 a 3 sustituyentes independientemente seleccionados de halógeno, -CN, R8, -OR8, -C(0 )R8, -OC(0 )R8, -C(0 )OR8, -N(R9)2, -NR8C(0 )R8, -NR8C(0 )0 R8, -C(0 )N(R9)2, heterocicloalquilo C3-C8, -S(0 )2R8, -S(0 )2N(R9)2, -NR9S(0 )2R8, haloalqullo C1-C6 y haloalcoxilo C1-C6;

o R11 y R12 son cada uno independientemente alquilo C1-C6 y tomados junto con el átomo de N al que están unidos forman un anillo de heterocicloalquilo C3-C8 opclonalmente sustituido que contiene opclonalmente un heteroátomo adicional seleccionado de N, O y S;

cada R13 se selecciona independientemente de halógeno, -CN, -LR9, -LOR9, -OLR9, -LR10, -LOR10, -OLR10, -LR8, -LOR8, -OLR8, -LSR8, -LSR10, -LC(0)R8, -OLC(0)R8, -LC(0)OR8, -LC(0)R10, -LOC(0)OR8, -LC(0)NR9R11, -LC(0)NR9R8, -LN(R9)2, -LNR9R8, -LNR9R10, -LC(0)N(R9)2, -LS(0)2R8, -LS(0)R8, -LC(0)NR8OH, -LNR9C(0)R8, -LNR9C(O)0R8, -LS(0)2N(R9)2, -0LS(0)2N(R9)2, -LNR9S(0)2R8, -LC(0)NR9LN(R9)2, -LP(0)(0R8)2, -L0P(0)(0R 8)2, -LP(O)(OR10)2 y -OLP(O)(OR10)2;

cada RA se selecciona independientemente de -R8, -R7, -OR7, -OR8, -R10, -OR10, -SR8, -N02, -CN, -N(R9)2, -NR9C(0)R8, -NR9C(S)R8, -NR9C(0)N(R9)2, -NR9C(S)N(R9)2, -NR9C 02R8, -NR9NR9C(0)R8, -NR9NR9C(0)N(R9)2, -NR9NR9C 02R8, -C(0)C(0)R8, -C(0)CH2C(0)R8, -C02R8, -(CH2)nC 02R8, -C(0)R8, -C(S)R8, -C(0)N(R9)2, -C(S)N(R9)2, -0C(0)N(R9)2, -OC(0)R8, -C(0)N(0R8)R8, -C(NOR8)R8, -S(0)2R8, -S(0)3R8, -S02N(R9)2, -S(0)R8, -NR9S 02N(R9)2, -NR9S 02R8, -P(0)(0R8)2,-0P(0)(0R 8)2, -P(O)(OR10)2, -OP(O)(OR10)2, -N(OR8)R8, -CH=CHC02R8, -C(=NH)-N(R9)2 y -(CH2)nNHC(0)R8;

n es, independientemente en cada caso, 0 ,1,2 , 3, 4, 5, 6, 7 u 8;

cada m se selecciona independientemente de 1, 2, 3 ,4, 5 y 6, y

t es 1,2, 3 ,4 ,5 ,6 ,7 u 8; o (c) una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de (a) o (b). Se describen otros compuestos de benzonaftlrldlna, y métodos de preparación de compuestos de benzonaftiridina, en el documento WO 2009/111337. Un compuesto de benzonaftiridina, o una sal del mismo, puede usarse por sí mismo, o en combinación con uno o más compuestos adicionales. Por ejemplo, puede usarse un compuesto de benzonaftiridina en combinación con una emulsión de aceite en agua o una composición que contiene minerales. En una realización particular, se usa un compuesto de benzonaftiridina en combinación con una emulsión de aceite en agua (por ejemplo una emulsión de escualeno-agua, tal como MF59) o una composición que contiene minerales (por ejemplo, una sal mineral tal como una sal de aluminio o una sal de calcio).

Un compuesto de tiosemicarbazona, tal como los dados a conocer en la referencia 94. También se describen métodos de formulación, fabricación y cribado para compuestos activos en la referencia 94. Las tiosemicarbazonas son particularmente eficaces en la estimulación de células mononucleares de sangre periférica humanas para la producción de citocinas, tales como TNF-a.

Un compuesto de triptantrina, tal como los dados a conocer en la referencia 95. También se describen métodos de formulación, fabricación y cribado en la referencia 95. Las tiosemicarbazonas son particularmente eficaces en la estimulación de células mononucleares de sangre periférica humanas para la producción de citocinas, tales como TNF-a.

Un análogo de nucleósido, tal como: (a) Isatorabina (ANA-245; 7-tia-8-oxoguanosina):

y profármacos de la misma; (b) ANA975; (c) ANA-025-1; (d) ANA380; (e) los compuestos dados a conocer en las referencias 96 a 98; (f) un compuesto que tiene la fórmula:

en la que:

Ri y R2 son cada uno independientemente H, halo, -NRaRb, -OH, alcoxilo C1-6, alcoxilo C1-6 sustituido, heterociclilo, heterociclilo sustituido, arilo C6-10, arilo C6-10 sustituido, alquilo C1-6 o alquilo C1-6 sustituido;

R3 está ausente, H, alquilo C1-6, alquilo C1-6 sustituido, arilo C6-10, arilo C6-10 sustituido, heterociclilo o heterociclilo sustituido;

R4 y Rs son cada uno independientemente H, halo, heterociclilo, heterociclilo sustituido, -C(0 )-Rd, alquilo C1-6, alquilo C1-6 sustituido, o se unen entre sí para formar un anillo de 5 miembros como en R4-5:

lográndose la unión en los enlaces indicados por un ,~w , X1 y X2 son cada uno independientemente N, C, O S;

Rs es H, halo, -OH, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, -OH, -NRaRb,-(CH2)n-0 -Rc, -0-(alquilo C1-6), -S(0 )pRe o -C(0 )-Rd;

Rg es H, alquilo C1-6, alquilo C1-6 sustituido, heterociclilo, heterociclilo sustituido o Rga, en el que Rga es:

lográndose la unión en el enlace indicado por un , Río y Rn son cada uno independientemente H, halo, alcoxilo C1-6, alcoxilo C1-6 sustituido, -NRaRb u -OH;

cada Ra y Rb es independientemente H, alquilo C1-6, alquilo C1-6 sustituido, -C(0)Rd, arilo C6-10; cada Rc es independientemente H, fosfato, difosfato, trifosfato, alquilo C1-6 o alquilo C1-6 sustituido; cada Rd es independientemente H, halo, alquilo C1-6, alquilo C1-6 sustituido, alcoxilo C1-6, alcoxilo C1-6 sustituido, -NH2, -NH(alquilo C1-6), -NH(alquilo C1-6 sustituido), -N(alquilo Ci-6)2, -N(alquilo C1-6 sustituido)2, arilo C6-10 o heterociclilo;

cada Re es independientemente H, alquilo C1-6, alquilo C1-6 sustituido, arilo C6-10, arilo C6-10 sustituido, heterociclilo o heterociclilo sustituido;

cada Rf es independientemente H, alquilo C1-6, alquilo C1-6 sustituido, -C(0)Rd, fosfato, difosfato o trifosfato;

cada n es independientemente 0 ,1,2 o 3;

cada p es independientemente 0,1 o 2; o

o (g) una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de (a) a (f), un tautómero de cualquiera de (a) a (f) o una sal farmacéuticamente aceptable del tautómero.

Loxoribina (7-alil-8-oxoguanosina) (99).

Compuestos dados a conocer en la referencia 100, incluyendo: compuestos de acilpiperazina, compuestos de indolediona, compuestos de tetrahidraisoquinolina (THIQ), compuestos de benzociclodiona, compuestos de aminoazavinilo, compuestos de aminobencimidazolquinolinona (ABIQ) (101, 102), compuestos de hidraftalamida, compuestos de benzofenona, compuestos de isoxazol, compuestos de esteral, compuestos de quinazilinona, compuestos de pirrol (103), compuestos de antraquinona, compuestos de quinoxalina, compuestos de triazina, compuestos de pirazalopirimidina y compuestos de benzazol (104).

Compuestos dados a conocer en la referencia 105.

Un derivado fosfato de aminoalquilglucosaminida, tal como RC-529 (106,107).

Un fosfaceno, tal como poli[di(carbox¡latofenox¡)fosfaceno] (“PCPP”) tal como se describe, por ejemplo, en las referencias 108 y 109.

Inmunopotenciadores de molécula pequeña (SMIP) tales como:

N2-met¡l-1-(2-met¡lprop¡l)-1H-im¡dazo[4,5-c]qu¡nol¡n-2,4-d¡am¡na

N2,N2-d¡met¡l-1-(2-met¡lpropil)-1H-¡m¡dazo[4,5-c]qu¡nol¡n-2,4-d¡am¡na

N2-et¡l-N2-met¡l-1-(2-met¡lprop¡l)-1H-im¡dazo[4,5-c]qu¡nol¡n-2,4-d¡am¡na

N2-met¡l-1-(2-met¡lprop¡l)-N2-prop¡l-1H-¡midazo[4,5-c]qu¡nol¡n-2,4-d¡am¡na

1-(2-met¡lprop¡l)-N2-prop¡l-1H-¡midazo[4,5-c]qu¡nol¡n-2,4-d¡am¡na

N2-but¡l-1-(2-met¡lprop¡l)-1H-im¡dazo[4,5-c]qu¡nol¡n-2,4-d¡am¡na

N2-but¡l-N2-met¡l-1-(2-met¡lpropil)-1H-¡m¡dazo[4,5-c]qu¡nol¡n-2,4-d¡am¡na

N2-met¡l-1-(2-metilprop¡l)-N2-pent¡l-1 H-im¡dazo[4,5-c]qu¡nolin-2,4-d¡am¡na

N2-met¡l-1-(2-met¡lprop¡l)-N2-prop-2-en¡l-1H-¡midazo[4,5-c]qu¡nol¡n-2,4-d¡am¡na

1-(2-metilpropil)-2-[(fenilmetil)tio]-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina

1- (2-metilpropil)-2-(propiltio)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina

2- [[4-amino-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-2-il](metil)amino]etanol

acetato de 2-[[4-amino-1 -(2-metilpropil)-1 H-imidazo[4,5-c]quinolin-2-il](metil)amino]etilo

4-amino-1-(2-metilpropil)-1,3-dihidro-2H-imidazo[4,5-c]quinolin-2-ona

N2-butil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-2,4-diamina

N2-butil-N2-metil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-1 H-imidazo[4,5-c]quinolin-2,4-diamina

N2-metil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-1 H-imidazo[4,5-c]quinolin-2,4-diamina

N2,N2-dimetil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-2,4-diamina

1-[4-amino-2-[metil(propil)amino]-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]-2-metilpropan-2-ol

1 -[4-amino-2-(propilamino)-1 H-imidazo[4,5-c]quinolin-1 -il]-2-metilpropan-2-ol

N4,N4-dibencil-1-(2-metoxi-2-metilpropil)-N2-propil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-2,4-diamina.

Los agentes inductores de citocinas para su uso en la presente invención pueden ser moduladores y/o agonistas de receptores de tipo Toll (TLR). Por ejemplo, pueden ser agonistas de una o más de las proteínas TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 y/o TLR9 humanas. Agentes preferidos son agonistas de TLR4 (por ejemplo, lípidos A naturales modificados derivados de lipopolisacárldos enterobacterlanos, compuestos de fosfolípidos, tales como el dímero de fosfolípido sintético, E6020), TLR7 (por ejemplo, benzonaftiridinas, imidazoquinolinas) y/o TLR9 (por ejemplo, oligonucleótidos CpG). Estos agentes son útiles para activar rutas de Inmunidad innata.

El agente inductor de citocinas puede añadirse a la composición en diversas fases durante su producción. Por ejemplo, puede estar dentro de una composición de antígeno, y esta mezcla puede añadirse entonces a una emulsión de aceite en agua. Como alternativa, puede estar dentro de una emulsión de aceite en agua, en cuyo caso el agente puede añadirse a los componentes de la emulsión antes de la emulsificación o puede añadirse a la emulsión después de la emulsificación. De manera similar, el agente puede coacervarse dentro de las gotitas de la emulsión. La ubicación y distribución del agente inductor de citocinas dentro de la composición final dependerá de sus propiedades hidrófilas/lipófilas, por ejemplo, el agente puede estar ubicado en la fase acuosa, en la fase oleosa y/o en la interfase aceite-agua.

El agente inductor de citocinas puede conjugarse con un agente separado, tal como un antígeno (por ejemplo, CRM197). En la referencia 110 se proporciona una revisión general de técnicas de conjugación para moléculas pequeñas. Como alternativa, los adyuvantes pueden asociarse de manera no covalente con agentes adicionales, por ejemplo por medio de interacciones hidrófobas o iónicas.

Agentes inductores de citocinas preferidos son (a) compuestos de benzonatridina; (b) oligonucleótidos inmunoestimuladores y (c) 3dMPL.

Los oligonucleótidos inmunoestimuladores pueden incluir modificaciones/análogos de nucleótidos tales como modificaciones de fosforotioato y pueden ser bicatenarios o (excepto para el ARN) monocatenarios. Las referencias 111,112 y 113 dan a conocer posibles sustituciones de análogos, por ejemplo, el reemplazo de guanosina por 2’-desoxi-7-desazaguanosina. El efecto adyuvante de los oligonucleótidos CpG se comenta adicionalmente en las referencias 114 a 119. Una secuencia CpG puede estar dirigida a TLR9, tal como el motivo GTCGTT o TTCGTT (120). La secuencia CpG puede ser específica para inducir una respuesta inmunitaria Th1, tal como un ODN CpG-A (oligodesoxinucleótido), o puede ser más específica para inducir una respuesta de células B, tal como un ODN CpG-B. Los ODN CpG-Ay CpG-B se comentan en las referencias 121-123. Preferiblemente, el CpG es un ODN CpG-A. Preferiblemente, el oligonucleótido CpG se construye de modo que el extremo 5’ sea accesible para el reconocimiento del receptor. Opcionalmente, pueden unirse dos secuencias de oligonucleótidos CpG en sus extremos 3’ para formar “inmunómeros”. Véanse, por ejemplo, las referencias 120 y 124-126. Un adyuvante de CpG útil es CpG7909, también conocido como PROMUNE (TM) (Coley Pharmaceutical Group, Inc.).

Como alternativa, o además, al uso de secuencias CpG, pueden usarse secuencias TpG (127). Estos oligonucleótidos pueden estar libres de motivos CpG no metilados.

El oligonucleótido inmunoestimulador puede ser rico en pirimidina. Por ejemplo, puede comprender más de un nucleótido de timidina consecutivo (por ejemplo, TTTT, tal como se da a conocer en la referencia 127), y/o puede tener una composición de nucleótidos con >25 % de timidina (por ejemplo, >35 %, >40 %, >50 %, >60 %, >80 %, etc.)- Por ejemplo, puede comprender más de un nucleótido de citosina consecutivo (por ejemplo, CCCC, tal como se da a conocer en la referencia 127), y/o puede tener una composición de nucleótidos con >25 % de citosina (por ejemplo, >35 %, >40 %, >50 %, >60 %, >80 %, etc.). Estos oligonucleótidos pueden estar libres de motivos CpG no metilados.

Los oligonucleótidos inmunoestimuladores comprenderán normalmente al menos 20 nucleótidos. Pueden comprender menos de 100 nucleótidos.

3dMPL (también conocido como monofosforil lípido A 3 des-O-acilado o 3-0-desacil-4’-monofosforil lípido A) es un adyuvante en el que se ha desacilado la posición 3 del extremo reductor de la glucosamina en el monofosforil lípido A. Se ha preparado 3dMPL a partir de un mutante sin heptosa de Salmonete minnesota, y es químicamente similar al lípido A pero carece de un grupo fosforilo lábil a ácido y un grupo acilo lábil a base. Activa células del linaje de monocitos/macrófagos y estimula la liberación de varias citocinas, incluyendo IL-1, IL-12, TNF-a y GM-CSF (véase también la referencia 128). La preparación de 3dMPL se describió originalmente en la referencia 129.

3dMPL puede adoptar la forma de una mezcla de moléculas relacionadas, que varían en su acilación (por ejemplo, que tienen 3, 4, 5 o 6 cadenas de acilo, que pueden tener diferentes longitudes). Los dos monosacáridos de glucosamina (también conocida como 2-desoxi-2-amino-glucosa) están N-acilados en sus carbonos de posición 2 (es decir, en las posiciones 2 y 2’), y también hay O-acilación en la posición 3’. El grupo unido al carbono 2 tiene la fórmula -NH-CO-CH2-CR1R1’. El grupo unido al carbono 2’ tiene la fórmula -NH-CO-CH-2-CR2R2’. El grupo unido al carbono 3’ tiene la fórmula -0-C0-CH2-CR3R3’. Una estructura representativa es:

Los grupos R1, R2 y R3 son cada uno independientemente -(CH2)n-CH3. El valor de n es preferiblemente de entre 8 y 16, más preferiblemente entre 9 y 12, y es lo más preferiblemente 10.

Los grupos R1’, R2’ y R3’ pueden ser cada uno independientemente: (a) -H; (b) -OH; o (c) - O-CO-R4, donde R4 es o bien -H o bien -(CH2)m-CH3, en el que el valor de m es preferiblemente de entre 8 y 16, y es más preferiblemente 10,12 o 14. En la posición 2, m es preferiblemente 14. En la posición 2’, m es preferiblemente 10. En la posición 3’, m es preferiblemente 12. Los grupos R1’, R2’ y R3’ son por tanto preferiblemente grupos -O-acilo de ácido dodecanoico, ácido tetradecanoico o ácido hexadecanoico.

Cuando todos de R1’, R2’ y R3’ son -H, entonces el 3dMPL tiene solo 3 cadenas de acilo (una en cada una de las posiciones 2 ,2 ’ y 3’). Cuando solo dos de R1’, R2’ y R3’ son -H, entonces el 3dMPL puede tener 4 cadenas de acilo. Cuando solo uno de R1’, R2’ y R3’ es -H, entonces el 3dMPL puede tener 5 cadenas de acilo. Cuando ninguno de R1’, R2’ y R3’ es -H, entonces el 3dMPL puede tener 6 cadenas de acilo. El adyuvante 3dMPL usado según la invención puede ser una mezcla de estas formas, con desde 3 hasta 6 cadenas de acilo, pero se prefiere que incluya 3dMPL con 6 cadenas de acilo en la mezcla, y en particular para garantizar que la forma de cadena de hexaacilo constituya al menos el 10 % en peso del 3dMPL total, por ejemplo, >20 %, >30 %, >40 %, >50 % o más. Se ha encontrado que 3dMPL con 6 cadenas de acilo es la forma más activa como adyuvante.

Por tanto, la forma más preferida de 3dMPL para su inclusión en composiciones de la invención tiene la fórmula (IV), mostrada a continuación.

Cuando se usa 3dMPL en forma de una mezcla, entonces las referencias a cantidades o concentraciones de 3dMPL en las composiciones de la invención se refieren a las especies de 3dMPL combinadas en la mezcla .

En condiciones acuosas, 3dMPL puede formar agregados micelares o partículas con diferentes tamaños, por ejemplo, con un diámetro <150 nm o >500 nm. Cualquiera o ambos de estos pueden usarse con la invención, y pueden seleccionarse las mejores partículas mediante un ensayo de rutina. Se prefieren partículas más pequeñas (por ejemplo, lo suficientemente pequeñas como para dar una suspensión acuosa transparente de 3dMPL) para su uso según la invención debido a su actividad superior (130). Las partículas preferidas tienen un diámetro medio menor de 220 nm, más preferiblemente menor de 200 nm o menor de 150 nm o menor de 120 nm, y pueden tener incluso un diámetro medio menor de 100 nm. Sin embargo, en la mayoría de los casos, el diámetro medio no será inferior a 50 nm. Estas partículas son lo suficientemente pequeñas como para ser adecuadas para la esterilización por filtración. El diámetro de partícula puede evaluarse mediante la técnica de rutina de dispersión dinámica de la luz, que revela un diámetro de partícula medio. Cuando se dice que una partícula tiene un diámetro de x nm, habrá generalmente una distribución de partículas alrededor de esta media, pero al menos el 50 % en número (por ejemplo, >60 %, >70 %, >80 %, >90 %, o más) de las partículas tendrán un diámetro dentro del intervalo x+25 %.

3dMPL puede usarse ventajosamente en combinación con una emulsión de aceite en agua. Sustancialmente la totalidad del 3dMPL puede estar ubicado en la fase acuosa de la emulsión.

El 3dMPL puede usarse por sí mismo, o en combinación con uno o más compuestos adicionales. Por ejemplo, se conoce el uso de 3dMPL en combinación con la saponina QS21 (131) (incluyendo en una emulsión de aceite en agua (132)), con un oligonucleótido inmunoestimulador, con tanto QS21 como un oligonucleótido inmunoestimulador, con fosfato de aluminio (133), con hidróxido de aluminio (134) o con tanto fosfato de aluminio como hidróxido de aluminio.

Adyuvantes grasos

Los adyuvantes grasos que pueden usarse con la invención incluyen las emulsiones de aceite en agua descritas anteriormente, y también incluyen, por ejemplo:

• Un compuesto de fosfolípido de fórmula I, II o III, o una sal del mismo:

tal como se define en la referencia 135, tal como ‘ER 803058’, ‘ER 803732’, ‘ER 804053’, ER 804058’, ‘ER 804059’, ‘ER 804442’, ‘ER 804680’, ‘ER 804764’, ER 803022 o ‘ER 804057’, por ejemplo:

ER804057 también se denomina E6020. Un compuesto de fosfolípido de fórmula I, II o III, o una sal del mismo, puede usarse por sí mismo, o en combinación con uno o más compuestos adicionales. Por ejemplo, un compuesto de fórmula I, II o III, puede usarse en combinación con una emulsión de aceite en agua o una composición que contiene minerales. En una realización particular, se usa E6020 en combinación con una emulsión de aceite en agua (por ejemplo, una emulsión de escualeno-agua, tal como MF59) o una composición que contiene minerales (por ejemplo, una sal mineral tal como una sal de aluminio o una sal de calcio).

Derivados de lípido A de Escherichia coli tales como OM-174 (descrito en las referencias 136 y 137).

Una formulación de un lípido catiónico y un colípido (habitualmente neutro), tal como bromuro de aminopropil-dimetil-miristoleiloxi-propanaminio-difitanoilfosfatidil-etanolamina (“VAXFECTIN (TM)”) o bromuro de aminopropil-dimetil-bis-dodeciloxi-propanaminio-dioleoilfosfatidil-etanolamina (“GAP-DLRIE:DOPE”). Se prefieren formulaciones que contienen (+)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(syn-9-tetradeceneiloxi)-1-propanaminio (138).

Monofosforil lípido A 3-O-desacilado (véase anteriormente).

Compuestos que contienen lípidos unidos a una estructura principal acíclica que contiene fosfato, tal como el antagonista de TLR4 E5564 (139,140):

Lipopéptidos (es decir, compuestos que comprenden uno o más residuos de ácido graso y dos o más residuos de aminoácido), tales como lipopéptidos basados en glicerilcisteína. Los ejemplos específicos de tales péptidos incluyen compuestos de la siguiente fórmula

en la que cada uno de R1 y R2 representa un radical hidrocarburo saturado o insaturado, alifático o alifáticocicloalifático mixto que tiene desde 8 hasta 30, preferiblemente de 11 a 21, átomos de carbono que está también opcionalmente sustituido con funciones oxígeno, R3 representa hidrógeno o el radical Ri-CO-0-CH2- en el que R1 tiene el mismo significado que anteriormente, y X representa un aminoácido unido mediante una unión peptídica y que tiene un grupo carboxilo libre, esterificado o amidado, o una secuencia de aminoácidos de desde 2 hasta 10 aminoácidos de los cuales el grupo carboxilo terminal está en forma libre, esterificada o amidada. En determinadas realizaciones, la secuencia de aminoácidos comprende un D-aminoácido, por ejemplo, ácido D-glutámico (D-Glu) o ácido D-gamma-carboxi-glutámico (D-Gla).

Los lipopéptidos bacterianos reconocen generalmente TLR2, sin requerir la participación de TLR6. (Los TLR funcionan cooperativamente proporcionando reconocimiento específico de diversos desencadenantes, y TLR2 más TLR6 reconocen juntos peptidoglucanos, mientras que TLR2 reconoce lipopéptidos sin TLR6). Estos se clasifican algunas veces como lipopéptidos naturales y lipopéptidos sintéticos. Los lipopéptidos sintéticos tienden a comportarse de manera similar, y se reconocen principalmente por TLR2.

Los lipopéptidos adecuados para su uso como adyuvantes incluyen compuestos que tienen la fórmula:

el centro quiral marcado ** está o bien en la configuración R o bien en la S;

cada R1a y R1b es independientemente un grupo hidrocarburo alifático o cicloalifático-alifático que tiene 7-21 átomos de carbono, opcionalmente sustituido con funciones oxígeno, o uno de R1a y R1b, pero no ambos, es H;

R2 es un grupo hidrocarburo alifático o cicloalifático que tiene 1-21 átomos de carbono y opcionalmente sustituido con funciones oxígeno;

n es 0 o 1;

As representa o bien -O-Kw-CO- o bien -NH-Kw-CO-, donde Kw es un grupo hidrocarburo alifático que tiene 1-12 átomos de carbono;

As1 es un D- o L-alfa-aminoácido;

Z1 y Z2 representan cada uno independientemente -OH o el radical N-terminal de un D- o L-alfa-aminoácido de un ácido amino-(alcano inferior)-sulfónico o de un péptido que tiene hasta 6 aminoácidos seleccionados de los ácidos D- y L-alfa-aminocarboxílicos y ácidos amino-alquilo inferior-sulfónicos; y

Z3 es H o -CO-Z4, donde Z4 es -OH o el radical N-terminal de un D- o L-alfa-aminoácido de un ácido amino-(alcano inferior)-sulfónico o de un péptido que tiene hasta 6 aminoácidos seleccionados de los ácidos D y L-alfaaminocarboxílicos y ácidos amino-alquilo inferior-sulfónicos; o un áster o una amida formado a partir del ácido carboxílico de tales compuestos. Las amidas adecuadas incluyen -NH2 y NH(alquilo inferior), y los ásteres adecuados incluyen ásteres alquílicos C1-C4. (Alquilo inferior o alcano inferior, tal como se usa en el presente documento, se refiere a alquilos ramificados o de cadena lineal C1-C6).

Tales compuestos se describen en más detalle en el documento US 4.666.886. En una realización particular, el lipopéptido tiene la fórmula:

Otro ejemplo de una especie de lipopéptido se denomina LP40, y es un agonista de TLR2. Akdis, et al., Eur. J. Immunology, 33: 2717-26 (2003).

Estos están relacionados con una clase conocida de lipopéptidos de E. coli, denominados lipoproteínas de mureína. Ciertos productos de degradación parcial de esas proteínas denominadas lipopéptidos de mureína se describen en Hantke, etal., Eur. J. Biochem., 34: 284-296 (1973). Estos comprenden un péptido unido a ácido N-acetilmurámico y, por tanto, están relacionados con los péptidos de muramilo, que se describen en Baschang, et al., Tetrahedron, 45(20): 6331-6360 (1989).

Adyuvantes de sales de aluminio

Pueden usarse los adyuvantes conocidos como “hidróxido de aluminio” y “fosfato de aluminio”. Estos nombres son convencionales, pero se usan por conveniencia solo, ya que ninguno es una descripción precisa del compuesto químico real que está presente (por ejemplo, véase el capítulo 9 de la referencia 74). La invención puede usar cualquiera de los adyuvantes de “hidróxido” o “fosfato” que se usan en general como adyuvantes.

Los adyuvantes conocidos como “hidróxido de aluminio” son normalmente sales de oxihidróxido de aluminio, que habitualmente son al menos parcialmente cristalinas. El oxihidróxido de aluminio, que puede representarse mediante la fórmula AIO(OH), puede distinguirse de otros compuestos de aluminio, tales como hidróxido de aluminio AI(OH)3, por espectroscopia infrarroja (IR), en particular por la presencia de una banda de adsorción a 1070 cnr1 y un hombro fuerte a 3090-3100 cnr1 (capítulo 9 de la referencia 74). El grado de cristalinidad de un adyuvante de hidróxido de aluminio se refleja por la anchura de la banda de difracción a la mitad de la altura (WHH), mostrando partículas poco cristalinas un mayor ensanchamiento de la línea debido a los tamaños de unidades cristalinas más pequeños. El área de superficie aumenta a medida que aumenta la WHH, y se ha observado que los adyuvantes con valores de WHH más altos tienen una mayor capacidad de adsorción de antígenos. Una morfología fibrosa (por ejemplo, tal como se observa en micrografías electrónicas de transmisión) es típica de los adyuvantes de hidróxido de aluminio. El pl de los adyuvantes de hidróxido de aluminio es normalmente de aproximadamente 11, es decir, el propio adyuvante tiene una carga de superficie positiva a pH fisiológico. Se han notificado capacidades de adsorción de entre 1,8-2,6 mg de proteína por mg de Al+++ a pH 7,4 para adyuvantes de hidróxido de aluminio.

Los adyuvantes conocidos como “fosfato de aluminio” son normalmente hidroxifosfatos de aluminio, que a menudo también contienen una pequeña cantidad de sulfato (es decir, sulfato de hidroxifosfato de aluminio). Pueden obtenerse por precipitación, y las condiciones de reacción y las concentraciones durante la precipitación influyen en el grado de sustitución del hidroxilo por fosfato en la sal. Los hidroxifosfatos tienen generalmente una razón molar de PO4/AI de entre 0,3 y 1,2. Los hidroxifosfatos pueden distinguirse del AIPÜ4 estricto por la presencia de grupos hidroxilo. Por ejemplo, una banda de espectro IR a 3164 cnr1 (por ejemplo, cuando se calienta hasta 200 °C) indica la presencia de hidroxilos estructurales (capítulo 9 de la referencia 74)

La razón molar de P04/AI3+ de un adyuvante de fosfato de aluminio estará generalmente entre 0,3 y 1,2, preferiblemente entre 0,8 y 1,2, y más preferiblemente 0,95+0,1. El fosfato de aluminio generalmente será amorfo, particularmente para sales de hidroxifosfato. Un adyuvante típico es el hidroxifosfato de aluminio amorfo con una razón molar de PCVAI de entre 0,84 y 0,92, incluida a 0,6 mg de Al3+/ml. El fosfato de aluminio generalmente estará particulado (por ejemplo, morfología de placa tal como se observa en mlcrografías electrónicas de transmisión). Los diámetros típicos de las partículas están en el intervalo de 0,5-20 nm (por ejemplo, aproximadamente 5-10 nm) después de cualquier adsorción de antígeno. Se han notificado capacidades de adsorción de entre 0,7-1,5 mg de proteína por mg de Al+++ a pH 7,4 para adyuvantes de fosfato de aluminio.

El punto de carga cero (PZC) del fosfato de aluminio está Inversamente relacionado con el grado de sustitución del hldroxllo por fosfato, y este grado de sustitución puede variar dependiendo de las condiciones de reacción y la concentración de los reactivos usados para preparar la sal mediante precipitación. El PZC también se altera al cambiar la concentración de iones de fosfato libres en la disolución (más fosfato = PZC más ácido) o al añadir un tampón, tal como un tampón histidina (hace que el PZC sea más básico). Los fosfatos de aluminio usados según la invención tendrán generalmente un PZC de entre 4,0 y 7,0, más preferiblemente entre 5,0 y 6,5, por ejemplo, aproximadamente 5,7.

Las suspensiones de sales de aluminio usadas para preparar las composiciones de la Invención pueden contener un tampón (por ejemplo, un tampón fosfato o histidina o Tris), pero esto no siempre es necesario. Las suspensiones son preferiblemente estériles y libres de pirógenos. Una suspensión puede Incluir Iones de fosfato acuosos libres, por ejemplo, presentes a una concentración de entre 1,0 y 20 mM, preferiblemente entre 5 y 15 mM, y más preferiblemente 10 mM aproximadamente. Las suspensiones también pueden comprender cloruro de sodio.

La Invención puede usar una mezcla de tanto un hldróxldo de aluminio como un fosfato de aluminio. En este caso, puede haber más fosfato de aluminio que hldróxldo, por ejemplo, una razón en peso de al menos 2:1, por ejemplo, >5:1, >6:1, >7:1, >8:1, >9:1, etc.

La concentración de Al+++ en una composición para su administración a un paciente es preferiblemente menor de 10 mg/ml, por ejemplo, <5 mg/ml, <4 mg/ml, <3 mg/ml, <2 mg/ml, <1 mg/ml, etc. Un intervalo preferido está entre 0,3 y 1 mg/ml. Se prefiere un máximo de 0,85 mg/dosis.

Además de Incluir uno o más adyuvantes de sal de aluminio, el componente adyuvante puede Incluir uno o más agentes ¡nmunoestimulantes o adyuvantes adicionales. Tales componentes adicionales incluyen, pero no se limitan a: un compuesto de benzonaftiridina, un adyuvante de monofosforil lípido A 3-O-desacilado (‘3d-MPL’); y/o una emulsión de aceite en agua. 3d-MPL también se denomina monofosforil lípido A 3 des-O-acilado o 3-0-desacil-4’-monofosforil lípido A. El nombre indica que la posición 3 del extremo reductor de la glucosamlna en monofosforil lípido A está desacilada. Se ha preparado a partir de un mutante sin heptosa de S. minnesota, y es químicamente similar al lípido A pero carece de un grupo fosforllo lábil a ácido y un grupo acilo lábil a base. Activar células del linaje de monocitos/macrófagos y estimula la liberación de varias citocinas, incluyendo IL-1, IL-12, TNF-a y GM-CSF. La preparación de 3d-MPL se describió originalmente en la referencia 129, y el producto lo ha fabricado y comercializado Corixa Corporation con el nombre MPL (TM). Pueden encontrarse detalles adicionales en las referencias 82 a 85.

El uso de un adyuvante de hldróxldo de aluminio y/o fosfato de aluminio es útil, particularmente en niños, y generalmente se adsorben antígenos a estas sales. También se prefieren emulsiones de escualeno en agua, particularmente en los ancianos. Las combinaciones de adyuvantes útiles Incluyen combinaciones de adyuvantes Th1 y Th2 tales como CpG y alumbre, o resiquimod y alumbre. Puede usarse una combinación de fosfato de aluminio y 3dMPL. Otras combinaciones que pueden usarse Incluyen: alumbre y un compuesto de benzonaftiridina o SMIP, una emulsión de escualeno en agua (tal como MF59) y un compuesto de benzonaftiridina o SMIP, y E6020 y una emulsión de escualeno en agua, tal como MF59) o alumbre.

Las composiciones de la Invención pueden generar tanto una respuesta ¡nmunltarla mediada por células como una respuesta ¡nmunltarla humoral.

Generalmente, se cree que dos tipos de células T, células CD4 y CD8, son necesarias para iniciar y/o potenciar la inmunidad mediada por células y la Inmunidad humoral. Las células T CD8 pueden expresar un correceptor CD8 y se denominan comúnmente linfocitos T citotóxicos (CTL). Las células T CD8 son capaces de reconocer o interaccionar con antígenos presentados en las moléculas del MHC de clase I.

Las células T CD4 pueden expresar un correceptor CD4 y se denominan comúnmente células T auxiliares. Las células T CD4 son capaces de reconocer péptidos antigénicos unidos a moléculas del MHC de clase II. Tras la interacción con una molécula del MHC de clase II, las células CD4 pueden secretar factores tales como citocinas. Estas citocinas secretadas pueden activar células B, células T citotóxicas, macrófagos y otras células que participan en una respuesta ¡nmunltarla. Las células T auxiliares o las células CD4+ pueden dividir además en dos subconjuntos funcionalmente distintos: fenotipo TH1 y fenotipos TH2 que difieren en su función efectora y de citocinas.

Las células TH1 activadas potencian la Inmunidad celular (Incluyendo un aumento en la producción de CTL específicos de antígeno) y, por tanto, son de particular valor para responder a Infecciones ¡ntracelulares. Las células TH1 activadas pueden secretar uno o más de IL-2, IFN-y y TNF-p. Una respuesta inmunitaria TH1 puede dar como resultado reacciones Inflamatorias locales mediante la activación de macrófagos, células NK (citolíticas naturales) y células T citotóxicas (CTL) CD8. Una respuesta inmunitaria TH1 también puede actuar expandiendo la respuesta Inmunitaria al estimular el crecimiento de células B y T con IL-12. Las células B estimuladas por TH1 pueden secretar lgG2a.

Las células TH2 activadas potencian la producción de anticuerpos y, por tanto, son valiosas para responder a infecciones extracelulares. Las células TH2 activadas pueden secretar uno o más de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10. Una respuesta inmunitaria TH2 puede dar como resultado la producción de lgG1, IgE, IgA y células B de memoria para una protección futura.

Una respuesta Inmunitaria potenciada puede Incluir una o más de una respuesta Inmunitaria TH1 y una respuesta inmunitaria TH2 potenciadas.

Una respuesta inmunitaria TH1 puede incluir uno o más de un aumento en CTL, un aumento en una o más de las citocinas asociadas con una respuesta inmunitaria TH1 (tales como IL-2, IFN-y y TNF-P), un aumento en macrófagos activados, un aumento en la actividad NK o un aumento en la producción de lgG2a. Preferiblemente, la respuesta Inmunitaria TH1 potenciada Incluirá un aumento en la producción de lgG2a.

Puede generarse una respuesta inmunitaria TH1 usando un adyuvante TH1. Un adyuvante TH1 generará en general niveles aumentados de producción de lgG2a en relación con la Inmunización del antígeno sin adyuvante. Los adyuvantes TH1 adecuados para su uso en la Invención pueden Incluir, por ejemplo, formulaciones de saponlna, virosomas y partículas similares a virus, derivados no tóxicos de llpopollsacárldo (LPS) enterobacterlano, ollgonucleótldos inmunoestimuladores. Los ollgonucleótldos ¡nmunoestlmuladores, tales como ollgonucleótldos que contienen un motivo CpG, son adyuvantes TH1 preferidos para su uso en la invención.

Una respuesta Inmunitaria TH2 puede Incluir uno o más de un aumento en una o más de las citocinas asociadas con una respuesta inmunitaria TH2 (tales como IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10), o un aumento en la producción de lgG1, IgE, IgA y células B de memoria. Preferiblemente, la respuesta inmunitaria TH2 potenciada incluirá un aumento en la producción de lgG1.

Puede generarse una respuesta inmunitaria TH2 usando un adyuvante TH2. Un adyuvante TH2 generará en general niveles aumentados de producción de lgG1 en relación con la Inmunización del antígeno sin adyuvante. Los adyuvantes TH2 adecuados para su uso en la Invención Incluyen, por ejemplo, composiciones que contienen minerales, emulsiones oleosas y toxinas ADP-rlbosllantes y derivados destoxicados de las mismas. Las composiciones que contienen minerales, tales como sales de aluminio, son adyuvantes TH2 preferidos para su uso en la Invención.

Una composición puede incluir una combinación de un adyuvante TH1 y un adyuvante TH2. Preferiblemente, una composición de este tipo genera una respuesta TH1 potenciada y una TH2 potenciada, es decir, un aumento en la producción tanto de lgG1 como de lgG2a en relación con la Inmunización sin adyuvante. Todavía más preferiblemente, la composición que comprende una combinación de un adyuvante TH1 y uno TH2 genera una respuesta inmunitaria TH1 aumentada y/o TH2 aumentada en relación con la inmunización con un solo adyuvante (es decir, en relación con la Inmunización con un adyuvante TH1 solo o la Inmunización con un adyuvante TH2 solo).

La respuesta Inmunitaria puede ser una o ambas de una respuesta Inmunitaria TH1 y una respuesta TH2. Preferiblemente, la respuesta Inmunitaria proporciona una o ambas de una respuesta TH1 potenciada y una respuesta TH2 potenciada.

La respuesta Inmunitaria potenciada puede ser una o ambas de una respuesta Inmunitaria slstémlca y una mucosa. Preferiblemente, la respuesta Inmunitaria proporciona una o ambas de una respuesta Inmunitaria slstémlca potenciada y una respuesta Inmunitaria mucosa potenciada. Preferiblemente, la respuesta Inmunitaria mucosa es una respuesta inmunitaria TH2. Preferiblemente, la respuesta inmunitaria mucosa incluye un aumento en la producción de IgA.

Métodos de tratamiento y administración

Las composiciones de la Invención son adecuadas para su administración a mamíferos, y la Invención proporciona un método de Inducción de una respuesta Inmunitaria en un mamífero, que comprende la etapa de administrar una composición (por ejemplo, una composición ¡nmunogénlca) de la Invención al mamífero. Las composiciones (por ejemplo, una composición ¡nmunogénlca) puede usarse para producir una formulación de vacuna para Inmunizar a un mamífero. El mamífero es normalmente un ser humano, y el ectodomlnlo de proteína F de VRS es un ectodominio de proteína F de VRS humano. Sin embargo, el mamífero puede ser cualquier otro mamífero que sea susceptible a la infección con VRS, tal como una vaca que puede infectarse con VRS bovino. Por ejemplo, la respuesta Inmunitaria puede generarse tras la administración de una proteína F de VRS purificada, una partícula de alfavlrus o ARN autorrepllcante.

La invención también proporciona una composición de la invención para su uso como medicamento, por ejemplo, para su uso en la Inmunización de un paciente contra la Infección con VRS.

La Invención también proporciona el uso de un polipéptido tal como se describió anteriormente en la fabricación de un medicamento para generar una respuesta ¡nmunltarla en un paciente.

La respuesta ¡nmunltarla generada mediante estos métodos y usos incluirá generalmente una respuesta de anticuerpos, preferiblemente una respuesta de anticuerpos protectora. En la técnica se conocen ben métodos para evaluar respuestas de anticuerpos tras la vacunación contra VRS.

Pueden administrarse composiciones de la invención de varios modos adecuados, tales como inyección intramuscular (por ejemplo, en el brazo o la pierna), inyección subcutánea, administración ¡ntranasal, administración oral, administración ¡ntradérmica, administración transcutánea, administración transdérmica, y similares. La vía de administración apropiada dependerá de la edad, la salud y otras características del mamífero. Un médico será capaz de determinar una vía de administración apropiada basándose en estos y otros factores.

Pueden usarse composiciones ¡nmunogénicas y formulaciones de vacuna para tratar tanto a niños como a adultos, incluyendo mujeres embarazadas. Por tanto, un sujeto puede tener menos de 1 año de edad, 1-5 años de edad, 5-15 años de edad, 15-55 años de edad o al menos 55 años de edad. Sujetos preferidos para recibir las vacunas son los ancianos (por ejemplo, >50 años de edad, >60 años de edad y preferiblemente >65 años), los jóvenes (por ejemplo, <6 años de edad, tal como 4 - 6 años de edad, <5 años de edad) y las mujeres embarazadas. Las vacunas no son adecuadas únicamente para estos grupos, sin embargo, y pueden usarse más generalmente en una población.

El tratamiento puede ser mediante un programa de una sola dosis o un programa de múltiples dosis. Pueden usarse múltiples dosis en un programa de inmunización primaria y/o en un programa de inmunización de refuerzo. En un programa de múltiples dosis, las diversas dosis pueden administrarse por la misma vía o vías diferentes, por ejemplo, una sensibilización parenteral y un refuerzo mucoso, una sensibilización mucosa y un refuerzo parenteral, etc. La administración de más de una dosis (normalmente dos dosis) es particularmente útil en pacientes ¡nmunológicamente no expuestos previamente. Normalmente, se administran múltiples dosis con al menos 1 semana de separación (por ejemplo, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, y similares).

Las formulaciones de vacuna producidas usando una composición de la invención pueden administrarse a los pacientes a sustancialmente el mismo tiempo que (por ejemplo, durante la misma consulta o visita médica a un profesional sanitario o centro de vacunación) otras vacunas.

Aspectos adicionales de la invención

La invención también proporciona un polipéptido F de virus respiratorio sincitial (F de VRS) recombinante soluble en forma de un trímero que comprende un primer dominio y un segundo dominio, en el que (i) el primer dominio comprende el ectodominio de proteína F de VRS en su totalidad o en parte, y (ii) el segundo dominio comprende un dominio de oligomerización heterólogo que es la secuencia de trimerización de fibritina de bacteriófago T4 (“foldon”),

en el que el ectodominio de F de VRS en su totalidad o en parte comprende:

a) los aminoácidos 22-525 de SEQ ID NO: 1;

b) los aminoácidos 23-525 de SEQ ID NO: 2; o

c) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad con (a) o (b)

La invención también proporciona ácido nucleico (por ejemplo, ADN) que codifica este polipéptido. También proporciona vectores que incluyen tales ácidos nucleicos, y células huésped que incluyen tales vectores. Los vectores pueden usarse para, por ejemplo, fines de expresión recombinante, inmunización con ácido nucleico, etc.

La invención también proporciona una composición que comprende ectodominios de glucoproteína F de VRS de la invención, en la que los ectodominios de al menos el 50 % (por ejemplo, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 % o el 100 %) de las moléculas están presentes en una conformación de prefusión.

Polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS

Se usan polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS particulares o se incluyen en algunas realizaciones de la invención. Algunos de los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS particulares contienen secuencias de aminoácidos alteradas desde aproximadamente la posición 100 hasta aproximadamente la posición 161. Las secuencias de aminoácidos desde la posición 100 hasta la posición 150 para varios polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS particulares se muestran en la figura 1C. Las secuencias de aminoácidos de varios polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS particulares se presentan en el presente documento, por ejemplo, en el ejemplo 1.

General

El término “que comprende” abarca “que incluye” así como “que consiste” y “que consiste esencialmente en”, por ejemplo, una composición “que comprende” X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X Y.

La palabra “sustancialmente” no excluye “completamente”, por ejemplo, una composición que está “sustancialmente libre” de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra “sustancialmente” puede omitirse de la definición de la invención.

El término “aproximadamente” en relación con un valor numérico x significa, por ejemplo, x±10%.

A menos que se establezca específicamente, un procedimiento que comprende una etapa de mezclar dos o más componentes no requiere ningún orden específico de mezclado. Por tanto, los componentes pueden mezclarse en cualquier orden. Cuando hay tres componentes, entonces dos componentes pueden combinarse entre sí, y luego la combinación puede combinarse con el tercer componente, etc.

Cuando se usan materiales animales (y en particular bovinos) en el cultivo de células, deben obtenerse de fuentes que estén libres de encefalopatías espongiformes transmisibles (TSE) y, en particular, libres de encefalopatía espongiforme bovina (BSE). Globalmente, se prefiere cultivar células en ausencia total de materiales derivados de animales.

Cuando se administra un compuesto al cuerpo como parte de una composición, entonces ese compuesto puede reemplazarse alternativamente por un profármaco adecuado.

Cuando se usa un sustrato celular para procedimientos de reordenamiento o de genética inversa, es preferible uno que se haya aprobado para su uso en la producción de vacunas humanas, por ejemplo, como en la farmacopea europea, capítulo general 5.2.3.

La identidad entre secuencias de polipéptido se determina preferiblemente mediante el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman tal como se implementa en el programa MPSRCH (Oxford Molecular), usando una búsqueda de huecos afines con los parámetros penalización por apertura de hueco=12 y penalización por extensión de hueco=1.

Tabla 1. Fosfolípidos

DDPC 1.2- Didecanoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina

DEPA 1.2- Dierucoil-sn-glicero-3-fosfato

DEPC 1.2- Erucoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina

DEPE 1.2- Dierucoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina

DEPG 1.2- Dierucoil-sn-glicero-3[fosfatidil-rac-(1 -glicerol...) DLOPC 1.2- Linoleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina

DLPA 1.2- Dilauroil-sn-glicero-3-fosfato

DLPC 1.2- Dilauroil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina

DLPE 1.2- Dilauroil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina

DLPG 1.2- Dilauroil-sn-glicero-3[fosfatidil-rac-(1-glicerol...) DLPS 1.2- Dilauroil-sn-glicero-3-fosfatidilserina

DMG 1.2- Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina

DMPA 1.2- Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfato

DMPC 1.2- Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina

DMPE 1.2- Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina

DMPG 1.2- Miristoil-sn-glicero-3[fosfatidil-rac-(1 -glicerol...)

DMPS 1.2- Estoil-sn-glicero-3-fosfatidilserina

DOPA 1.2- Dioleoil-sn-glicero-3-fosfato

DOPC 1.2- Dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina

DOPE 1.2- Dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina

DOPG 1.2- Dioleoil-sn-glicero-3[fosfatidil-rac-(1 -glicerol...) DOPS 1.2- Dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilserina

DPPA 1.2- Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfato

DPPC 1.2- Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina

DPPE 1.2- Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina

DPPG 1.2- Dipalmitoil-sn-glicero-3[fosfatidil-rac-(1-glicerol...) DPPS 1.2- Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilserina

DPyPE 1.2- Difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina

DSPA 1.2- Diestearoil-sn-glicero-3-fosfato

DSPC 1.2- Diestearoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina

DSPE 1.2- Diestearoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina

DSPG 1.2- Diestearoil-sn-glicero-3[fosfatidil-rac-(1 -glicerol...) DSPS 1.2- Diestearoil-sn-glicero-3-fosfatidilserina

EPC PC de huevo

HEPC PC de huevo hidrogenada

HSPC PC de soja hidrogenada de alta pureza

HSPC PC de soja hidrogenada

LYSOPC MIRÍSTICA l-Mlrlstoll-sn-gllcero-3-fosfatldllcollna

LYSOPC PALMÍTICA 1-Palmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina

LYSOPC ESTEÁRICA 1-Estearoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina

MPPC de esflngomlellna de leche 1-Miristoil,2-palmitoil-sn-glicero 3-fosfatidilcolina

MSPC 1-Miristoil,2-estearoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina

PMPC 1-Palmitoil,2-miristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina

POPC 1-Palmitoil,2-oleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina

POPE 1-Palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina

POPG 1.2- Dioleoil-sn-glicero-3[fosfatidil-rac-(1 -glicerol)...] PSPC 1-Palmitoil,2-estearoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina

SMPC 1-Estearoil,2-miristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina

SOPC 1-Estearoil,2-oleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina

SPPC 1-Estearoil,2-palmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina

EJEMPLIFICACIÓN

Ejemplo 1 - Polipéptidos F de VRS

Este ejemplo proporciona secuencias de varios ejemplos de polipéptidos (por ejemplo, que contienen secuencias señal) y secuencias de ácido nucleico que pueden usarse para expresar polipéptidos F de VRS de la presente Invención. Las secuencias de aminoácidos presentadas Incluyen el péptldo señal y contienen un llgador C-termlnal y una etiqueta His opcionales (GGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO: 90)). Cuando se producen estos polipéptidos en células huésped, la célula procesará habltualmente el pollpéptldo para eliminar el péptldo señal y, tal como se describe en el presente documento, algunos de los polipéptidos se escindirán, por ejemplo en sitios de escisión de furlna no modificados. La Invención Incluye composiciones que contienen todas las formas de los polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS particulares dados a conocer en el presente documento, incluyendo formas maduras, que carecen del péptldo señal, formas que pueden escindirse en subunldades que comprenden Fi y F2, y formas que carecen de la etiqueta HIs C-termlnal opcional. Los siguientes ejemplos son meramente Ilustrativos del alcance de la presente Invención y por tanto no pretenden limitar el alcance de ningún modo.

Un ejemplo de escisión con furina de tipo natural es F de VRS de tipo natural truncado HIS (SEQ ID NO: 84).

Los ejemplos de polipéptidos que pueden producirse como monómeros incluyen: F de VRS Furx (SEQ ID NO: 45); F de VRS antiguo furx truncado HIS (SEQ ID NO: 88); F de VRS Furx R113Q K123N K124N truncado HIS (SEQ ID NO: 89); F de VRS delp21 furx truncado HIS (SEQ ID NO: 47); y F de VRS F delP23 furx truncado HIS (SEQ ID NO: 48).

Los ejemplos de polipéptidos que pueden producirse como trímeros incluyen: F de VRS furina N-term truncado HIS (SEQ ID NO: 85); F de VRS deleción de fusión truncado HIS (SEQ ID NO: 67); y F de VRS deleción de fusión 2 truncado HIS (SEQ ID NO: 68).

Los ejemplos de polipéptidos que pueden producirse como monómeros o rosetas de trímeros incluyen: F de VRS furmt truncado HIS (SEQ ID NO: 50); F de VRS furdel truncado HIS (SEQ ID NO: 51); F de VRS delP21 furdel truncado HIS (SEQ ID NO: 86); y F de VRS delP23 furdel truncado HIS (SEQ ID NO: 49), y F de VRS factor Xa truncado HIS (SEQ ID NO: 52).

Un ejemplo de una escisión de tipo natural que produce probablemente una formación de roseta es F de VRS furina C-term truncado HIS (SEQ ID NO: 87).

Completo

El siguiente polipéptido es un polipéptido F de VRS de longitud completa.

1 MELLILKANA ITTILTAVTF CFASGQNITE EFYQSTCSAV SKGYLSALRT GWYTSVITIE

61 LSNIKENKCN GTDAKVKLIK QELDKYKNAV TELQLLMQST PATNNRARRE LPRFMNYTLN

121 NAKKTNVTLS KKRKRRFLGF LLGVGSAIAS GVAVSKVLHL EGEVNKIKSA LLSTNKAWS

181 LSNGVSVLTS KVLDLKNYID KQLLPIVNKQ SCSISNIETV IEFQQKNNRL LEITREFSVN

241 AGVTTPVSTY MLTNSELLSL INDMPITNDQ KKLMSNNVQI VRQQSYSIMS IIKEEVLAYV

301 VQLPLYGVID TPCWKLHTSP LCTTNTKEGS NICLTRTDRG WYCDNAGSVS FFPQAETCKV

361 QSNRVFCDTM NSLTLPSEVN LCNVDIFNPK YDCKIMTSKT DVSSSVITSL GAIVSCYGKT

421 KCTASNKNRG IIKTFSNGCD YVSNKGVDTV SVGNTLYYVN KQEGKSLYVK GEPIINFYDP

481 LVFPSDEFDA SISQVNEKIN QSLAFIRKSD ELLHNVNAGK STTNIMITTI IIVIIVILLS

541 LIAVGLLLYC KARSTPVTLS KDQLSGINNI AFSN (SEQ :ID NO: 21)

La siguiente secuencia de ácido nucleico es la secuencia codificante optimizada para la secuencia de polipéptido anterior.

1 ATGGAACTGC TGATCCTGAA GGCCAACGCC ATCACCACCA TCCTGACCGC CGTGACCTTC

61 TGCTTCGCCA GCGGCCAGAA CATCACCGAG GAATTCTACC AGAGCACCTG CAGCGCCGTG

121 AGCAAGGGCT ACCTGAGCGC CCTGCGGACC GGCTGGTACA CCAGCGTGAT CACCATCGAG

181 CTGTCCAACA TCAAAGAAAA CAAGTGCAAC GGCACCGACG CCAAGGTGAA ACTGATCAAG

241 CAGGAACTGG ACAAGTACAA GAACGCCGTG ACCGAGCTGC AGCTGCTGAT GCAGAGCACC

301 CCCGCCACCA ACAACCGGGC CAGAAGAGAG CTGCCCCGGT TCATGAACTA CACCCTGAAC

361 AACGCCAAGA AAACCAACGT GACCCTGAGC AAGAAGCGGA AGCGGCGGTT CCTGGGCTTC

421 CTGCTGGGCG TGGGCAGCGC CATCGCCAGC GGGGTGGCCG TGTCCAAGGT GCTGCACCTG

481 GAAGGCGAGG TGAACAAGAT CAAGTCCGCC CTGCTGTCCA CCAACAAGGC CGTGGTGTCC

541 CTGAGCAACG GCGTGAGCGT GCTGACCAGC AAGGTGCTGG ATCTGAAGAA CTACATCGAC

601 AAGCAGCTGC TGCCCATCGT GAACAAGCAG AGCTGCAGCA TCAGCAACAT CGAGACCGTG

661 ATCGAGTTCC AGCAGAAGAA CAACCGGCTG CTGGAAATCA CCCGGGAGTT CAGCGTGAAC

721 GCCGGCGTGA CCACCCCCGT GAGCACCTAC ATGCTGACCA ACAGCGAGCT GCTGTCCCTG

781 ATCAATGACA TGCCCATCAC CAACGACCAG AAAAAGCTGA TGAGCAACAA CGTGCAGATC

841 GTGCGGCAGC AGAGCTACTC CATCATGAGC ATCATCAAAG AAGAGGTGCT GGCCTACGTG

901 GTGCAGCTGC CCCTGTACGG CGTGATCGAC ACCCCCTGCT GGAAGCTGCA CACCAGCCCC

961 CTGTGCACCA CCAACACCAA AGAGGGCAGC AACATCTGCC TGACCCGGAC CGACCGGGGC

1021 TGGTACTGCG ACAACGCCGG CAGCGTGAGC TTCTTCCCCC AAGCCGAGAC CTGCAAGGTG

1081 CAGAGCAACC GGGTGTTCTG CGACACCATG AACAGCCTGA CCCTGCCCTC CGAGGTGAAC

1141 CTGTGCAACG TGGACATCTT CAACCCCAAG TACGACTGCA AGATCATGAC CTCCAAGACC

1201 GACGTGAGCA GCTCCGTGAT CACCTCCCTG GGCGCCATCG TGAGCTGCTA CGGCAAGACC

1261 AAGTGCACCG CCAGCAACAA GAACCGGGGC ATCATCAAGA CCTTCAGCAA CGGCTGCGAC

1321 TACGTGAGCA ACAAGGGCGT GGACACCGTG AGCGTGGGCA ACACACTGTA CTACGTGAAT

1381 AAGCAGGAAG GCAAGAGCCT GTACGTGAAG GGCGAGCCCA TCATCAACTT CTACGACCCC

1441 CTGGTGTTCC CCAGCGACGA GTTCGACGCC AGCATCAGCC AGGTCAACGA GAAGATCAAC

1501 CAGAGCCTGG CCTTCATCCG GAAGAGCGAC GAGCTGCTGC ACAATGTGAA TGCCGGCAAG

1561 AGCACCACCA ATATCATGAT CACCACAATC ATCATCGTGA TCATTGTGAT CCTGCTGTCT

1621 CTGATTGCCG TGGGCCTGCT GCTGTACTGC AAGGCCCGCA GCACCCCTGT GACCCTGTCC

1681 AAGGACCAGC TGTCCGGCAT CAACAATATC GCCTTCTCCA ACTGAAG (SEQ ID NO: 22

HIS completo

El siguiente polipéptido incluye el polipéptido F de VRS de longitud completa seguido por una etiqueta de hexahistidina.

1 MELLILKANA ITTILTAVTFCFASGQNITE EFYQSTCSAV SKGYLSALRT GWYTSVITIE

61 LSNIKENKCN GTDAKVKLIKQELDKYKNAV TELQLLMQST PATNNRARRE LPRFMNYTLN

121 NAKKTNVTLS KKRKRRFLGFLLGVGSAIAS GVAVSKVLHL EGEVNKIKSA LLSTNKAWS

181 LSNGVSVLTS KVLDLKNYIDKQLLPIVNKQ SCSISNIETV IEFQQKNNRL LEITREFSVN

241 AGVTTPVSTY MLTNSELLSLINDMPITNDQ KKLMSNNVQI VRQQSYSIMS IIKEEVLAYV

301 VQLPLYGVID TPCWKLHTSPLCTTNTKEGS NICLTRTDRG WYCDNAGSVS FFPQAETCKV

361 QSNRVFCDTM NSLTLPSEVNLCNVDIFNPK YDCKIMTSKT DVSSSVITSL GAIVSCYGKT

421 KCTASNKNRG IIKTFSNGCDYVSNKGVDTV SVGNTLYYVN KQEGKSLYVK GEPIINFYDP

481 LVFPSDEFDA SISQVNEKINQSLAFIRKSD ELLHNVNAGK STTNIMITTI IIVIIVILLS

541 LIAVGLLLYC KARSTPVTLS KDQLSGINNI AFSNSGGSAG SGHHHHHH (SEQ ID NO: 23)

1 ATGGAACTGC TGATCCTGAA GGCCAACGCC ATCACCACCA TCCTGACCGC CGTGACCTTC

61 TGCTTCGCCA GCGGCCAGAA CATCACCGAG GAATTCTACC AGAGCACCTG CAGCGCCGTG

121 AGCAAGGGCT ACCTGAGCGC CCTGCGGACC GGCTGGTACA CCAGCGTGAT CACCATCGAG

181 CTGTCCAACA TCAAAGAAAA CAAGTGCAAC GGCACCGACG CCAAGGTGAA ACTGATCAAG

241 CAGGAACTGG ACAAGTACAA GAACGCCGTG ACCGAGCTGC AGCTGCTGAT GCAGAGCACC

301 CCCGCCACCA ACAACCGGGC CAGAAGAGAG CTGCCCCGGT TCATGAACTA CACCCTGAAC

361 AACGCCAAGA AAACCAACGT GACCCTGAGC AAGAAGCGGA AGCGGCGGTT CCTGGGCTTC

421 CTGCTGGGCG TGGGCAGCGC CATCGCCAGC GGGGTGGCCG TGTCCAAGGT GCTGCACCTG

481 GAAGGCGAGG TGAACAAGAT CAAGTCCGCC CTGCTGTCCA CCAACAAGGC CGTGGTGTCC

541 CTGAGCAACG GCGTGAGCGT GCTGACCAGC AAGGTGCTGG ATCTGAAGAA CTACATCGAC

601 AAGCAGCTGC TGCCCATCGT GAACAAGCAG AGCTGCAGCA TCAGCAACAT CGAGACCGTG

661 ATCGAGTTCC AGCAGAAGAA CAACCGGCTG CTGGAAATCA CCCGGGAGTT CAGCGTGAAC

721 GCCGGCGTGA CCACCCCCGT GAGCACCTAC ATGCTGACCA ACAGCGAGCT GCTGTCCCTG

781 ATCAATGACA TGCCCATCAC CAACGACCAG AAAAAGCTGA TGAGCAACAA CGTGCAGATC

841 GTGCGGCAGC AGAGCTACTC CATCATGAGC ATCATCAAAG AAGAGGTGCT GGCCTACGTG

901 GTGCAGCTGC CCCTGTACGG CGTGATCGAC ACCCCCTGCT GGAAGCTGCA CACCAGCCCC

961 CTGTGCACCA CCAACACCAA AGAGGGCAGC AACATCTGCC TGACCCGGAC CGACCGGGGC

1021 TGGTACTGCG ACAACGCCGG CAGCGTGAGC TTCTTCCCCC AAGCCGAGAC CTGCAAGGTG

1081 CAGAGCAACC GGGTGTTCTG CGACACCATG AACAGCCTGA CCCTGCCCTC CGAGGTGAAC

1141 CTGTGCAACG TGGACATCTT CAACCCCAAG TACGACTGCA AGATCATGAC CTCCAAGACC

1201 GACGTGAGCA GCTCCGTGAT CACCTCCCTG GGCGCCATCG TGAGCTGCTA CGGCAAGACC

1261 AAGTGCACCG CCAGCAACAA GAACCGGGGC ATCATCAAGA CCTTCAGCAA CGGCTGCGAC

1721 TArRTf.Af.rA ArAAnr,r.rr.T r.r.ArArrr.Tr; AnrnTnnnrA AfArArTr.TA TTArr.TnAAT

1381 AAGCAGGAAG GCAAGAGCCT GTACGTGAAG GGCGAGCCCA TCATCAACTT CTACGACCCC

1441 CTGGTGTTCC CCAGCGACGA GTTCGACGCC AGCATCAGCC AGGTCAACGA GAAGATCAAC

1501 CAGAGCCTGG CCTTCATCCG GAAGAGCGAC GAGCTGCTGC ACAATGTGAA TGCCGGCAAG

1561 AGCACCACCA ATATCATGAT CACCACAATC ATCATCGTGA TCATTGTGAT CCTGCTGTCT

1621 CTGATTGCCG TGGGCCTGCT GCTGTACTGC AAGGCCCGCA GCACCCCTGT GACCCTGTCC

1681 AAGGACCAGC TGTCCGGCAT CAACAATATC GCCTTCTCCA ACAGCGGCGG CAGCGCCGGC

1741 TCTGGCCACC ACCACCATCA CCACTGAAG (SEQ ID NO: 24)

pre HIS completo

El siguiente polipéptido incluye el polipéptido F de VRS de longitud completa con el dominio de trimerización de GCN4 (subrayado) unido al extremo C-terminal del polipéptido F de VRS seguido por una etiqueta de hexahistidina.

1 MELLILKANA ITTILTAVTF CFASGQNITE EFYQSTCSAV SKGYLSALRT GWYTSVITIE

61 LSNIKENKCN GTDAKVKLIK QELDKYKNAV TELQLLMQST PATNNRARRE LPRFMNYTLN

121 NAKKTNVTLS KKRKRRFLGF LLGVGSAIAS GVAVSKVLHL EGEVNKIKSA LLSTNKAWS

181 LSNGVSVLTS KVLDLKNYID KQLLPIVNKQ SCSISNIETV IEFQQKNNRL LEITREFSVN

241 AGVTTPVSTY MLTNSELLSL INDMPITNDQ KKLMSNNVQI VRQQSYSIMS IIKEEVLAYV

301 VQLPLYGVID TPCWKLHTSP LCTTNTKEGS NICLTRTDRG WYCDNAGSVS FFPQAETCKV

361 QSNRVFCDTM NSLTLPSEVN LCNVDIFNPK YDCKIMTSKT DVSSSVITSL GAIVSCYGKT

421 KCTASNKNRG IIKTFSNGCD YVSNKGVDTV SVGNTLYYVN KQEGKSLYVK GEPIINFYDP

481 LVFPSDEFDA SISQVNEKIN QSLAFIRKSD ELLHNVNAGK STTNIMITTI IIVIIVILLS

541 LIAVGLLLYC KARSTPVTLS KDQLSGINNI AFSNGSSGRM KQIEDKIEEI LSKIYHIENE

601 IARIKKLIGE SGGSAGSGHH HHHH (SEQ :ID NO: 25)

1 ATGGAACTGC TGATCCTGAA GGCCAACGCC ATCACCACCA TCCTGACCGC CGTGACCTTC

61 TGCTTCGCCA GCGGCCAGAA CATCACCGAG GAATTCTACC AGAGCACCTG CAGCGCCGTG

121 AGCAAGGGCT ACCTGAGCGC CCTGCGGACC GGCTGGTACA CCAGCGTGAT CACCATCGAG

181 CTGTCCAACA TCAAAGAAAA CAAGTGCAAC GGCACCGACG CCAAGGTGAA ACTGATCAAG

241 CAGGAACTGG ACAAGTACAA GAACGCCGTG ACCGAGCTGC AGCTGCTGAT GCAGAGCACC

301 CCCGCCACCA ACAACCGGGC CAGAAGAGAG CTGCCCCGGT TCATGAACTA CACCCTGAAC

361 AACGCCAAGA AAACCAACGT GACCCTGAGC AAGAAGCGGA AGCGGCGGTT CCTGGGCTTC

421 CTGCTGGGCG TGGGCAGCGC CATCGCCAGC GGGGTGGCCG TGTCCAAGGT GCTGCACCTG

481 GAAGGCGAGG TGAACAAGAT CAAGTCCGCC CTGCTGTCCA CCAACAAGGC CGTGGTGTCC

541 CTGAGCAACG GCGTGAGCGT GCTGACCAGC AAGGTGCTGG ATCTGAAGAA CTACATCGAC

601 AAGCAGCTGC TGCCCATCGT GAACAAGCAG AGCTGCAGCA TCAGCAACAT CGAGACCGTG

661 ATCGAGTTCC AGCAGAAGAA CAACCGGCTG CTGGAAATCA CCCGGGAGTT CAGCGTGAAC

721 GCCGGCGTGA CCACCCCCGT GAGCACCTAC ATGCTGACCA ACAGCGAGCT GCTGTCCCTG

781 ATCAATGACA TGCCCATCAC CAACGACCAG AAAAAGCTGA TGAGCAACAA CGTGCAGATC

841 GTGCGGCAGC AGAGCTACTC CATCATGAGC ATCATCAAAG AAGAGGTGCT GGCCTACGTG

901 GTGCAGCTGC CCCTGTACGG CGTGATCGAC ACCCCCTGCT GGAAGCTGCA CACCAGCCCC

961 CTGTGCACCA CCAACACCAA AGAGGGCAGC AACATCTGCC TGACCCGGAC CGACCGGGGC

1021 TGGTACTGCG ACAACGCCGG CAGCGTGAGC TTCTTCCCCC AAGCCGAGAC CTGCAAGGTG

1081 CAGAGCAACC GGGTGTTCTG CGACACCATG AACAGCCTGA CCCTGCCCTC CGAGGTGAAC

1141 CTGTGCAACG TGGACATCTT CAACCCCAAG TACGACTGCA AGATCATGAC CTCCAAGACC

1201 GACGTGAGCA GCTCCGTGAT CACCTCCCTG GGCGCCATCG TGAGCTGCTA CGGCAAGACC

1261 AAGTGCACCG CCAGCAACAA GAACCGGGGC ATCATCAAGA CCTTCAGCAA CGGCTGCGAC

1321 TACGTGAGCA ACAAGGGCGT GGACACCGTG AGCGTGGGCA ACACACTGTA CTACGTGAAT

1381 AAGCAGGAAG GCAAGAGCCT GTACGTGAAG GGCGAGCCCA TCATCAACTT CTACGACCCC

1441 CTGGTGTTCC CCAGCGACGA GTTCGACGCC AGCATCAGCC AGGTCAACGA GAAGATCAAC

1501 CAGAGCCTGG CCTTCATCCG GAAGAGCGAC GAGCTGCTGC ACAATGTGAA TGCCGGCAAG

1561 AGCACCACCA ATATCATGAT CACCACAATC ATCATCGTGA TCATTGTGAT CCTGCTGTCT

1621 CTGATTGCCG TGGGCCTGCT GCTGTACTGC AAGGCCCGCA GCACCCCTGT GACCCTGTCC

1681 AAGGACCAGC TGTCCGGCAT CAACAATATC GCCTTCTCCA ACGGCAGCAG CGGCCGGATG

1741 AAGCAGATCG AGGACAAGAT CGAGGAAATC CTGAGCAAGA TCTACCACAT CGAGAACGAG

1801 ATCGCCCGGA TCAAGAAGCT GATCGGCGAA AGCGGCGGCT CTGCCGGAAG CGGCCACCAC

1861 CACCATCACC ACTGAAG (SEQ ID NO: 26)

pre HIS completo 2

1 MELLILKANA ITTILTAVTF CFASGQNITE EFYQSTCSAV SKGYLSALRT GWYTSVITIE

61 LSNIKENKCN GTDAKVKLIK QELDKYKNAV TELQLLMQST PATNNRARRE LPRFMNYTLN

121 NAKKTNVTLS KKRKRRFLGF LLGVGSAIAS GVAVSKVLHL EGEVNKIKSA LLSTNKAWS

181 LSNGVSVLTS KVLDLKNYID KQLLPIVNKQ SCSISNIETV IEFQQKNNRL LEITREFSVN

241 AGVTTPVSTY MLTNSELLSL INDMPITNDQ KKLMSNNVQI VRQQSYSIMS IIKEEVLAYV

301 VQLPLYGVID TPCWKLHTSP LCTTNTKEGS NICLTRTDRG WYCDNAGSVS FFPQAETCKV

361 QSNRVFCDTM NSLTLPSEVN LCNVDIFNPK YDCKIMTSKT DVSSSVITSL GAIVSCYGKT

421 KCTASNKNRG IIKTFSNGCD YVSNKGVDTV SVGNTLYYVN KQEGKSLYVK GEPIINFYDP

481 LVFPSDEFDA SISQVNEKIN QSLAFIRKSD ELLHNVNAGK STTNIMITTI IIVIIVILLS

541 LIAVGLLLYC KARSTPVTLS KDQLSGINNI AFSNGSSGSG RMKQIEDKIE EILSKIYHIE

601 NEIARIKKLI GESGGSAGSG HHHHHH (SEQ ID NO: 27)

1 ATGGAACTGC TGATCCTGAA GGCCAACGCC ATCACCACCA TCCTGACCGC CGTGACCTTC

61 TGCTTCGCCA GCGGCCAGAA CATCACCGAG GAATTCTACC AGAGCACCTG CAGCGCCGTG

121 AGCAAGGGCT ACCTGAGCGC CCTGCGGACC GGCTGGTACA CCAGCGTGAT CACCATCGAG

181 CTGTCCAACA TCAAAGAAAA CAAGTGCAAC GGCACCGACG CCAAGGTGAA ACTGATCAAG

241 CAGGAACTGG ACAAGTACAA GAACGCCGTG ACCGAGCTGC AGCTGCTGAT GCAGAGCACC

301 CCCGCCACCA ACAACCGGGC CAGAAGAGAG CTGCCCCGGT TCATGAACTA CACCCTGAAC

361 AACGCCAAGA AAACCAACGT GACCCTGAGC AAGAAGCGGA AGCGGCGGTT CCTGGGCTTC

421 CTGCTGGGCG TGGGCAGCGC CATCGCCAGC GGGGTGGCCG TGTCCAAGGT GCTGCACCTG

481 GAAGGCGAGG TGAACAAGAT CAAGTCCGCC CTGCTGTCCA CCAACAAGGC CGTGGTGTCC

541 CTGAGCAACG GCGTGAGCGT GCTGACCAGC AAGGTGCTGG ATCTGAAGAA CTACATCGAC

601 AAGCAGCTGC TGCCCATCGT GAACAAGCAG AGCTGCAGCA TCAGCAACAT CGAGACCGTG

661 ATCGAGTTCC AGCAGAAGAA CAACCGGCTG CTGGAAATCA CCCGGGAGTT CAGCGTGAAC

721 GCCGGCGTGA CCACCCCCGT GAGCACCTAC ATGCTGACCA ACAGCGAGCT GCTGTCCCTG

781 ATCAATGACA TGCCCATCAC CAACGACCAG AAAAAGCTGA TGAGCAACAA CGTGCAGATC

841 GTGCGGCAGC AGAGCTACTC CATCATGAGC ATCATCAAAG AAGAGGTGCT GGCCTACGTG

901 GTGCAGCTGC CCCTGTACGG CGTGATCGAC ACCCCCTGCT GGAAGCTGCA CACCAGCCCC

961 CTGTGCACCA CCAACACCAA AGAGGGCAGC AACATCTGCC TGACCCGGAC CGACCGGGGC

1021 TGGTACTGCG ACAACGCCGG CAGCGTGAGC TTCTTCCCCC AAGCCGAGAC CTGCAAGGTG

1081 CAGAGCAACC GGGTGTTCTG CGACACCATG AACAGCCTGA CCCTGCCCTC CGAGGTGAAC

1141 CTGTGCAACG TGGACATCTT CAACCCCAAG TACGACTGCA AGATCATGAC CTCCAAGACC

1201 GACGTGAGCA GCTCCGTGAT CACCTCCCTG GGCGCCATCG TGAGCTGCTA CGGCAAGACC

1261 AAGTGCACCG CCAGCAACAA GAACCGGGGC ATCATCAAGA CCTTCAGCAA CGGCTGCGAC

1321 TACGTGAGCA ACAAGGGCGT GGACACCGTG AGCGTGGGCA ACACACTGTA CTACGTGAAT

1381 AAGCAGGAAG GCAAGAGCCT GTACGTGAAG GGCGAGCCCA TCATCAACTT CTACGACCCC

1441 CTGGTGTTCC CCAGCGACGA GTTCGACGCC AGCATCAGCC AGGTCAACGA GAAGATCAAC

1501 CAGAGCCTGG CCTTCATCCG GAAGAGCGAC GAGCTGCTGC ACAATGTGAA TGCCGGCAAG

1561 AGCACCACCA ATATCATGAT CACCACAATC ATCATCGTGA TCATTGTGAT CCTGCTGTCT

1621 CTGATTGCCG TGGGCCTGCT GCTGTACTGC AAGGCCCGCA GCACCCCTGT GACCCTGTCC

1681 AAGGACCAGC TGTCCGGCAT CAACAATATC GCCTTCTCCA ACGGCAGCAG CGGCAGCGGC

1741 CGGATGAAGC AGATCGAGGA CAAGATCGAG GAAATCCTGA GCAAGATCTA CCACATCGAG

1801 AACGAGATCG CCCGGATCAA GAAGCTGATC GGCGAAAGCG GCGGCTCTGC CGGAAGCGGC

1861 CACCACCACC ATCACCACTG AAG (SEQ ID NO: 28)

ecto HIS

El siguiente polipéptido incluye el ectodominio del polipéptido F de VRS seguido por una etiqueta de hexa-histidina.

1 MELLILKANA ITTILTAVTF CFASGQNITE EFYQSTCSAV SKGYLSALRT GWYTSVITIE

61 LSNIKENKCN GTDAKVKLIK QELDKYKNAV TELQLLMQST PATNNRARRE LPRFMNYTLN

121 NAKKTNVTLS KKRKRRFLGF LLGVGSAIAS GVAVSKVLHL EGEVNKIKSA LLSTNKAWS

181 LSNGVSVLTS KVLDLKNYID KQLLPIVNKQ SCSISNIETV IEFQQKNNRL LEITREFSVN

241 AGVTTPVSTY MLTNSELLSL INDMPITNDQ KKLMSNNVQI VRQQSYSIMS IIKEEVLAYV

301 VQLPLYGVID TPCWKLHTSP LCTTNTKEGS NICLTRTDRG WYCDNAGSVS FFPQAETCKV

361 QSNRVFCDTM NSLTLPSEVN LCNVDIFNPK YDCKIMTSKT DVSSSVITSL GAIVSCYGKT

421 KCTASNKNRG IIKTFSNGCD YVSNKGVDTV SVGNTLYYVN KQEGKSLYVK GEPIINFYDP

481 LVFPSDEFDA SISQVNEKIN QSLAFIRKSD ELLHNVNSGG SAGSGHHHHH H

SEQ ID NO: 29)

La siguiente secuencia d e ácido nucleico es la secuencia codificante optim izada para la secuencia de polipéptido anterior.

1 ATGGAACTGC TGATCCTGAA GGCCAACGCC ATCAOCACOA TCCTGACCGC CGTGACCTTC

61 TGCTTCGCCA GCGGCCAGAA CATCACCGAG GAATTCTACC AGAGCACCTG CAGCGCCGTG

121 AGCAAGGGCT ACCTGAGCGC CCTGCGGACC GGCTGGTACA CCAGCGTGAT CACCATCGAG

181 CTGTCCAACA TCAAAGAAAA CAAGTGCAAC GGCACCGACG CCAAGGTGAA ACTGATCAAG

241 CAGGAACTGG ACAAGTACAA GAACGCCGTG ACCGAGCTGC AGCTGCTGAT GCAGAGCACC

301 CCCGCCACCA ACAACCGGGC CAGAAGAGAG CTGCCCCGGT TCATGAACTA CACCCTGAAC

361 AACGCCAAGA AAACCAACGT GACCCTGAGC AAGAAGCGGA AGCGGCGGTT CCTGGGCTTC

421 CTGCTGGGCG TGGGCAGCGC CATCGCCAGC GGGGTGGCCG TGTCCAAGGT GCTGCACCTG

481 GAAGGCGAGG TGAACAAGAT CAAGTCCGCC CTGCTGTCCA CCAACAAGGC CGTGGTGTCC

541 CTGAGCAACG GCGTGAGCGT GCTGACCAGC AAGGTGCTGG ATCTGAAGAA CTACATCGAC

601 AAGCAGCTGC TGCCCATCGT GAACAAGCAG AGCTGCAGCA TCAGCAACAT CGAGACCGTG

661 ATCGAGTTCC AGCAGAAGAA CAACCGGCTG CTGGAAATCA CCCGGGAGTT CAGCGTGAAC

721 GCCGGCGTGA CCACCCCCGT GAGCACCTAC ATGCTGACCA ACAGCGAGCT GCTGTCCCTG

781 ATCAATGACA TGCCCATCAC CAACGACCAG AAAAAGCTGA TGAGCAACAA CGTGCAGATC

841 GTGCGGCAGC AGAGCTACTC CATCATGAGC ATCATCAAAG AAGAGGTGCT GGCCTACGTG

901 GTGCAGCTGC CCCTGTACGG CGTGATCGAC ACCCCCTGCT GGAAGCTGCA CACCAGCCCC

961 CTGTGCACCA CCAACACCAA AGAGGGCAGC AACATCTGCC TGACCCGGAC CGACCGGGGC

1021 TGGTACTGCG ACAACGCCGG CAGCGTGAGC TTCTTCCCCC AAGCCGAGAC CTGCAAGGTG

1081 CAGAGCAACC GGGTGTTCTG CGACACCATG AACAGCCTGA CCCTGCCCTC CGAGGTGAAC

1141 CTGTGCAACG TGGACATCTT CAACCCCAAG TACGACTGCA AGATCATGAC CTCCAAGACC

1201 GACGTGAGCA GCTCCGTGAT CACCTCCCTG GGCGCCATCG TGAGCTGCTA CGGCAAGACC

1261 AAGTGCACCG CCAGCAACAA GAACCGGGGC ATCATCAAGA CCTTCAGCAA CGGCTGCGAC

1321 TACGTGAGCA ACAAGGGCGT GGACACCGTG AGCGTGGGCA ACACACTGTA CTACGTGAAT

1381 AAGCAGGAAG GCAAGAGCCT GTACGTGAAG GGCGAGCCCA TCATCAACTT CTACGACCCC

1441 CTGGTGTTCC CCAGCGACGA GTTCGACGCC AGCATCAGCC AGGTCAACGA GAAGATCAAC

1501 CAGAGCCTGG CCTTCATCCG GAAGAGCGAC GAGCTGCTGC ACAATGTGAA TAGCGGCGGC

1561 AGCGCCGGCT CTGGCCACCA CCACCATCAC CACTGAAG (SEQ ID NO: 30)

ecto pre HIS

El siguiente polipéptido incluye el ectodominio del polipéptido F de VRS con el dominio de trimerización de GCN4 (subrayado) insertado en el polipéptido F de VRS en el sentido de 5’ de donde habría estado el dominio TM de la proteína de VRS (que comienza en el a. a. 517) seguido por una etiqueta de hexa-histidina.

1 MELLILKANAITTILTAVTF CFASGQNITE EFYQSTCSAV SKGYLSALRT GWYTSVITIE

61 LSNIKENKCNGTDAKVKLIK QELDKYKNAV TELQLLMQST PATNNRARRE LPRFMNYTLN

121 NAKKTNVTLSKKRKRRFLGF LLGVGSAIAS GVAVSKVLHL EGEVNKIKSALLSTNKAWS

181 LSNGVSVLTSKVLDLKNYID KQLLPIVNKQ SCSISNIETV IEFQQKNNRL LEITREFSVN

241 AGVTTPVSTYMLTNSELLSL INDMPITNDQ KKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYV

301 VQLPLYGVIDTPCWKLHTSP LCTTNTKEGS NICLTRTDRG WYCDNAGSVSFFPQAETCKV

361 QSNRVFCDTMNSLTLPSEVN LCNVDIFNPK YDCKIMTSKT DVSSSVITSL GAIVSCYGKT

421 KCTASNKNRGIIKTFSNGCD YVSNKGVDTV SVGNTLYYVN KQEGKSLYVKGEPIINFYDP

481 LVFPSDEFDASISQVNEKIN QSLAFIRKSD ELLHNVNDKIEEILSKIYHI ENEIARIKKL

541 IGESGGSAGS GHHHHHH (SEQ ID NO: 31)

1 ATGGAACTGC TGATCCTGAA GGCCAACGCC ATCACCACCA TCCTGACCGC CGTGACCTTC

61 TGCTTCGCCA GCGGCCAGAA CATCACCGAG GAATTCTACC AGAGCACCTG CAGCGCCGTG

121 AGCAAGGGCT ACCTGAGCGC CCTGCGGACC GGCTGGTACA CCAGCGTGAT CACCATCGAG

181 CTGTCCAACA TCAAAGAAAA CAAGTGCAAC GGCACCGACG CCAAGGTGAA ACTGATCAAG

241 CAGGAACTGG ACAAGTACAA GAACGCCGTG ACCGAGCTGC AGCTGCTGAT GCAGAGCACC

301 CCCGCCACCA ACAACCGGGC CAGAAGAGAG CTGCCCCGGT TCATGAACTA CACCCTGAAC

361 AACGCCAAGA AAACCAACGT GACCCTGAGC AAGAAGCGGA AGCGGCGGTT CCTGGGCTTC

421 CTGCTGGGCG TGGGCAGCGC CATCGCCAGC GGGGTGGCCG TGTCCAAGGT GCTGCACCTG

481 GAAGGCGAGG TGAACAAGAT CAAGTCCGCC CTGCTGTCCA CCAACAAGGC CGTGGTGTCC

541 CTGAGCAACG GCGTGAGCGT GCTGACCAGC AAGGTGCTGG ATCTGAAGAA CTACATCGAC

601 AAGCAGCTGC TGCCCATCGT GAACAAGCAG AGCTGCAGCA TCAGCAACAT CGAGACCGTG

661 ATCGAGTTCC AGCAGAAGAA CAACCGGCTG CTGGAAATCA CCCGGGAGTT CAGCGTGAAC

721 GCCGGCGTGA CCACCCCCGT GAGCACCTAC ATGCTGACCA ACAGCGAGCT GCTGTCCCTG

781 ATCAATGACA TGCCCATCAC CAACGACCAG AAAAAGCTGA TGAGCAACAA CGTGCAGATC

841 ⁿ ^{G3 T Jr. n U G r 'n n ra n r}AGAGCTACTC CATCATGAGC ATCATCAAAG AAGAGGTGCT GGCCTACGTG

901 GTGCAGCTGC CCCTGTACGG CGTGATCGAC ACCCCCTGCT GGAAGCTGCA CACCAGCCCC

961 CTGTGCACCA CCAACACCAA AGAGGGCAGC AACATCTGCC TGACCCGGAC CGACCGGGGC

1021 TGGTACTGCG ACAACGCCGG CAGCGTGAGC TTCTTCCCCC AAGCCGAGAC CTGCAAGGTG

1081 CAGAGCAACC GGGTGTTCTG CGACACCATG AACAGCCTGA CCCTGCCCTC CGAGGTGAAC

1141 CTGTGCAACG TGGACATCTT CAACCCCAAG TACGACTGCA AGATCATGAC CTCCAAGACC

1201 GACGTGAGCA GCTCCGTGAT CACCTCCCTG GGCGCCATCG TGAGCTGCTA CGGCAAGACC

1261 AAGTGCACCG CCAGCAACAA GAACCGGGGC ATCATCAAGA CCTTCAGCAA CGGCTGCGAC

1321 TACGTGAGCA ACAAGGGCGT GGACACCGTG AGCGTGGGCA ACACACTGTA CTACGTGAAT

1381 AAGCAGGAAG GCAAGAGCCT GTACGTGAAG GGCGAGCCCA TCATCAACTT CTACGACCCC

1441 CTGGTGTTCC CCAGCGACGA GTTCGACGCC AGCATCAGCC AGGTCAACGA GAAGATCAAC

1501 CAGAGCCTGG CCTTCATCCG GAAGAGCGAC GAGCTGCTGC ACAATGTGAA TGACAAGATC

1561 GAGGAAATCC TGAGCAAGAT CTACCACATC GAGAACGAGA TCGCCCGGAT CAAGAAGCTG

1621 ATCGGCGAAA GCGGCGGCTC TGCCGGAAGC GGCCACCACC ACCATCACCA CTGAAG

(SEQ ID NO: 32)

pre HA HIS completo

El siguiente polipéptido incluye el polipéptido F de VRS de longitud completa con el dominio de trimerización de posfusión del polipéptido de hemaglutinina de influenza (subrayado) unido al extremo C-terminal del polipéptido F de VRS seguido por una etiqueta de hexa-histidina.

1 MELLILKANA ITTILTAVTF CFASGQNITE EFYQSTCSAV SKGYLSALRT GWYTSVITIE

61 LSNIKENKCN GTDAKVKLIK QELDKYKNAV TELQLLMQST PATNNRARRE LPRFMNYTLN

121 NAKKTNVTLS KKRKRRFLGF LLGVGSAIAS GVAVSKVLHL EGEVNKIKSA LLSTNKAWS

181 LSNGVSVLTS KVLDLKNYID KQLLPIVNKQ SCSISNIETV IEFQQKNNRL LEITREFSVN

241 AGVTTPVSTY MLTNSELLSL INDMPITNDQ KKLMSNNVQI VRQQSYSIMS IIKEEVLAYV

301 VQLPLYGVID TPCWKLHTSP LCTTNTKEGS NICLTRTDRG WYCDNAGSVS FFPQAETCKV

361 QSNRVFCDTM NSLTLPSEVN LCNVDIFNPK YDCKIMTSKT DVSSSVITSL GAIVSCYGKT

421 KCTASNKNRG IIKTFSNGCD YVSNKGVDTV SVGNTLYYVN KQEGKSLYVK GEPIINFYDP

481 LVFPSDEFDA SISQVNEKIN QSLAFIRKSD ELLHNVNAGK STTNIMITTI IIVIIVILLS

541 LIAVGLLLYC KARSTPVTLS KDQLSGINNI AFSNGSSGNE KFHQIEKEFS EVEGRIQDLE

601 KSGGSAGSGH HHHHH (SEQ ID NO: 33)

La siguiente secuencia d e ácido nucleico es la secuencia codificante optim izada para la secuencia d e polipéptido anterior.

1 ATGGAACTGC TGATCCTGAA GGCCAACGCC ATCACCACCA TCCTGACCGC CGTGACCTTC

61 TGCTTCGCCA GCGGCCAGAA CATCACCGAG GAATTCTACC AGAGCACCTG CAGCGCCGTG

121 AGCAAGGGCT ACCTGAGCGC CCTGCGGACC GGCTGGTACA CCAGCGTGAT CACCATCGAG

181 CTGTCCAACA TCAAAGAAAA CAAGTGCAAC GGCACCGACG CCAAGGTGAA ACTGATCAAG

241 CAGGAACTGG ACAAGTACAA GAACGCCGTG ACCGAGCTGC AGCTGCTGAT GCAGAGCACC

301 CCCGCCACCA ACAACCGGGC CAGAAGAGAG CTGCCCCGGT TCATGAACTA CACCCTGAAC

361 AACGCCAAGA AAACCAACGT GACCCTGAGC AAGAAGCGGA AGCGGCGGTT CCTGGGCTTC

421 CTGCTGGGCG TGGGCAGCGC CATCGCCAGC GGGGTGGCCG TGTCCAAGGT GCTGCACCTG

481 GAAGGCGAGG TGAACAAGAT CAAGTCCGCC CTGCTGTCCA CCAACAAGGC CGTGGTGTCC

541 CTGAGCAACG GCGTGAGCGT GCTGACCAGC AAGGTGCTGG ATCTGAAGAA CTACATCGAC

601 AAGCAGCTGC TGCCCATCGT GAACAAGCAG AGCTGCAGCA TCAGCAACAT CGAGACCGTG

661 ATCGAGTTCC AGCAGAAGAA CAACCGGCTG CTGGAAATCA CCCGGGAGTT CAGCGTGAAC

721 GCCGGCGTGA CCACCCCCGT GAGCACCTAC ATGCTGACCA ACAGCGAGCT GCTGTCCCTG

781 ATCAATGACA TGCCCATCAC CAACGACCAG AAAAAGCTGA TGAGCAACAA CGTGCAGATC

841 GTGCGGCAGC AGAGCTACTC CATCATGAGC ATCATCAAAG AAGAGGTGCT GGCCTACGTG

901 GTGCAGCTGC CCCTGTACGG CGTGATCGAC ACCCCCTGCT GGAAGCTGCA CACCAGCCCC

961 CTGTGCACCA CCAACACCAA AGAGGGCAGC AACATCTGCC TGACCCGGAC CGACCGGGGC

1021 TGGTACTGCG ACAACGCCGG CAGCGTGAGC TTCTTCCCCC AAGCCGAGAC CTGCAAGGTG

1081 CAGAGCAACC GGGTGTTCTG CGACACCATG AACAGCCTGA CCCTGCCCTC CGAGGTGAAC

1141 CTGTGCAACG TGGACATCTT CAACCCCAAG TACGACTGCA AGATCATGAC CTCCAAGACC

1201 GACGTGAGCA GCTCCGTGAT CACCTCCCTG GGCGCCATCG TGAGCTGCTA CGGCAAGACC

1261 AAGTGCACCG CCAGCAACAA GAACCGGGGC ATCATCAAGA CCTTCAGCAA CGGCTGCGAC

1321 TACGTGAGCA ACAAGGGCGT GGACACCGTG AGCGTGGGCA ACACACTGTA CTACGTGAAT

1381 AAGCAGGAAG GCAAGAGCCT GTACGTGAAG GGCGAGCCCA TCATCAACTT CTACGACCCC

1441 CTGGTGTTCC CCAGCGACGA GTTCGACGCC AGCATCAGCC AGGTCAACGA GAAGATCAAC

1501 CAGAGCCTGG CCTTCATCCG GAAGAGCGAC GAGCTGCTGC ACAATGTGAA TGCCGGCAAG

1561 AGCACCACCA ATATCATGAT CACCACAATC ATCATCGTGA TCATTGTGAT CCTGCTGTCT

1621 CTGATTGCCG TGGGCCTGCT GCTGTACTGC AAGGCCCGCA GCACCCCTGT GACCCTGTCC

1681 AAGGACCAGC TGTCCGGCAT CAACAATATC GCCTTCTCCA ACGGCAGCAG CGGCAATGAG

1741 AAGTTCCACC AGATCGAGAA AGAATTCAGC GAGGTGGAGG GCCGGATCCA GGACCTGGAA

1801 AAGAGCGGCG GCTCTGCCGG AAGCGGCCAC CACCACCATC ACCACTGAAG

(SEQ ID NO: 34)

ecto pre HA HIS

El siguiente polipéptido incluye el ectodominio del polipéptido F de VRS con el dominio de trimerización de posfusión del polipéptido de hemaglutinina de influenza (subrayado) insertado en el polipéptido F de VRS en el sentido de 5’ de donde habría estado del dominio TM de la proteína de VRS (que comienza en el a.a.517) seguido por una etiqueta de hexa-histidina.

1 MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITE EFYQSTCSAV SKGYLSALRTGWYTSVITIE

61 LSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAV TELQLLMQST PATNNRARRELPRFMNYTLN

121 NAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIAS GVAVSKVLHL EGEVNKIKSALLSTNKAWS

181 LSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQ SCSISNIETV IEFQQKNNRLLEITREFSVN

241 AGVTTPVSTYMLTNSELLSL INDMPITNDQ KKLMSNNVQI VRQQSYSIMSIIKEEVLAYV

301 VQLPLYGVIDTPCWKLHTSP LCTTNTKEGS NICLTRTDRG WYCDNAGSVSFFPQAETCKV

361 QSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPK YDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKT

421 KCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTV SVGNTLYYVN KQEGKSLYVKGEPIINFYDP

481 LVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSD ELLHNVNEKF HQIEKEFSEVEGRIQDLEKS

541 GGSAGSGHHH HHH (SEQ ID NO: 35)

1 ATGGAACTGC TGATCCTGAA GGCCAACGCC ATCACCACCA TCCTGACCGC CGTGACCTTC

61 TGCTTCGCCA GCGGCCAGAA CATCACCGAG GAATTCTACC AGAGCACCTG CAGCGCCGTG

121 AGCAAGGGCT ACCTGAGCGC CCTGCGGACC GGCTGGTACA CCAGCGTGAT CACCATCGAG

181 CTGTCCAACA TCAAAGAAAA CAAGTGCAAC GGCACCGACG CCAAGGTGAA ACTGATCAAG

241 CAGGAACTGG ACAAGTACAA GAACGCCGTG ACCGAGCTGC AGCTGCTGAT GCAGAGCACC

301 CCCGCCACCA ACAACCGGGC CAGAAGAGAG CTGCCCCGGT TCATGAACTA CACCCTGAAC

361 AACGCCAAGA AAACCAACGT GACCCTGAGC AAGAAGCGGA AGCGGCGGTT CCTGGGCTTC

421 CTGCTGGGCG TGGGCAGCGC CATCGCCAGC GGGGTGGCCG TGTCCAAGGT GCTGCACCTG

481 GAAGGCGAGG TGAACAAGAT CAAGTCCGCC CTGCTGTCCA CCAACAAGGC CGTGGTGTCC

541 CTGAGCAACG GCGTGAGCGT GCTGACCAGC AAGGTGCTGG ATCTGAAGAA CTACATCGAC

601 AAGCAGCTGC TGCCCATCGT GAACAAGCAG AGCTGCAGCA TCAGCAACAT CGAGACCGTG

661 ATCGAGTTCC AGCAGAAGAA CAACCGGCTG CTGGAAATCA CCCGGGAGTT CAGCGTGAAC

721 GCCGGCGTGA CCACCCCCGT GAGCACCTAC ATGCTGACCA ACAGCGAGCT GCTGTCCCTG

781 ATCAATGACA TGCCCATCAC CAACGACCAG AAAAAGCTGA TGAGCAACAA CGTGCAGATC

841 GTGCGGCAGC AGAGCTACTC CATCATGAGC ATCATCAAAG AAGAGGTGCT GGCCTACGTG

901 GTGCAGCTGC CCCTGTACGG CGTGATCGAC ACCCCCTGCT GGAAGCTGCA CACCAGCCCC

961 CTGTGCACCA CCAACACCAA AGAGGGCAGC AACATCTGCC TGACCCGGAC CGACCGGGGC

1021 TGGTACTGCG ACAACGCCGG CAGCGTGAGC TTCTTCCCCC AAGCCGAGAC CTGCAAGGTG

1081 CAGAGCAACC GGGTGTTCTG CGACACCATG AACAGCCTGA CCCTGCCCTC CGAGGTGAAC

1141 CTGTGCAACG TGGACATCTT CAACCCCAAG TACGACTGCA AGATCATGAC CTCCAAGACC

1201 GACGTGAGCA GCTCCGTGAT CACCTCCCTG GGCGCCATCG TGAGCTGCTA CGGCAAGACC

1261 AAGTGCACCG CCAGCAACAA GAACCGGGGC ATCATCAAGA CCTTCAGCAA CGGCTGCGAC

1321 TACGTGAGCA ACAAGGGCGT GGACACCGTG AGCGTGGGCA ACACACTGTA CTACGTGAAT

1381 AAGCAGGAAG GCAAGAGCCT GTACGTGAAG GGCGAGCCCA TCATCAACTT CTACGACCCC

1441 CTGGTGTTCC CCAGCGACGA GTTCGACGCC AGCATCAGCC AGGTCAACGA GAAGATCAAC

1501 CAGAGCCTGG CCTTCATCCG GAAGAGCGAC GAGCTGCTGC ACAATGTGAA TGAGAAGTTC

1561 CACCAGATCG AGAAAGAATT CAGCGAGGTG GAGGGCCGGA TCCAGGACCT GGAAAAGAGC

1621 GGCGGCTCTG CCGGAAGCGG CCACCACCAC CATCACCACT GAAG (SEQ ID NO: 36)

AHRB HIS completo

El siguiente polipéptido incluye el polipéptido F de VRS de longitud completa con el dominio HRB delecionado seguido por una etiqueta de hexa-histidina.

1 MELLILKANA ITTILTAVTF CFASGQNITE EFYQSTCSAV SKGYLSALRT GWYTSVITIE

61 LSNIKENKCN GTDAKVKLIK QELDKYKNAV TELQLLMQST PATNNRARRE LPRFMNYTLN

121 NAKKTNVTLS KKRKRRFLGF LLGVGSAIAS GVAVSKVLHL EGEVNKIKSA LLSTNKAWS

181 LSNGVSVLTS KVLDLKNYID KQLLPIVNKQ SCSISNIETV IEFQQKNNRL LEITREFSVN

241 AGVTTPVSTY MLTNSELLSL INDMPITNDQ KKLMSNNVQI VRQQSYSIMS IIKEEVLAYV

301 VQLPLYGVID TPCWKLHTSP LCTTNTKEGS NICLTRTDRG WYCDNAGSVS FFPQAETCKV

361 QSNRVFCDTM NSLTLPSEVN LCNVDIFNPK YDCKIMTSKT DVSSSVITSL GAIVSCYGKT

421 KCTASNKNRG IIKTFSNGCD YVSNKGVDTV SVGNTLYYVN KQEGKSLYVK GEPNIMITTI

481 IIVIIVILLS LIAVGLLLYC KARSTPVTLS KDQLSGINNI AFSNMGGSHH HHHH

SEQ ID NO: 37)

1 ATGGAACTGC TGATCCTGAA GGCCAACGCC ATCACCACCA TCCTGACCGC CGTGACCTTC

61 TGCTTCGCCA GCGGCCAGAA CATCACCGAG GAATTCTACC AGAGCACCTG CAGCGCCGTG

121 AGCAAGGGCT ACCTGAGCGC CCTGCGGACC GGCTGGTACA CCAGCGTGAT CACCATCGAG

181 CTGTCCAACA TCAAAGAAAA CAAGTGCAAC GGCACCGACG CCAAGGTGAA ACTGATCAAG

241 CAGGAACTGG ACAAGTACAA GAACGCCGTG ACCGAGCTGC AGCTGCTGAT GCAGAGCACC

301 CCCGCCACCA ACAACCGGGC CAGAAGAGAG CTGCCCCGGT TCATGAACTA CACCCTGAAC

361 AACGCCAAGA AAACCAACGT GACCCTGAGC AAGAAGCGGA AGCGGCGGTT CCTGGGCTTC

421 CTGCTGGGCG TGGGCAGCGC CATCGCCAGC GGGGTGGCCG TGTCCAAGGT GCTGCACCTG

481 GAAGGCGAGG TGAACAAGAT CAAGTCCGCC CTGCTGTCCA CCAACAAGGC CGTGGTGTCC

541 CTGAGCAACG GCGTGAGCGT GCTGACCAGC AAGGTGCTGG ATCTGAAGAA CTACATCGAC

601 AAGCAGCTGC TGCCCATCGT GAACAAGCAG AGCTGCAGCA TCAGCAACAT CGAGACCGTG

661 ATCGAGTTCC AGCAGAAGAA CAACCGGCTG CTGGAAATCA CCCGGGAGTT CAGCGTGAAC

721 GCCGGCGTGA CCACCCCCGT GAGCACCTAC ATGCTGACCA ACAGCGAGCT GCTGTCCCTG

781 ATCAATGACA TGCCCATCAC CAACGACCAG AAAAAGCTGA TGAGCAACAA CGTGCAGATC

841 GTGCGGCAGC AGAGCTACTC CATCATGAGC ATCATCAAAG AAGAGGTGCT GGCCTACGTG

901 GTGCAGCTGC CCCTGTACGG CGTGATCGAC ACCCCCTGCT GGAAGCTGCA CACCAGCCCC

961 CTGTGCACCA CCAACACCAA AGAGGGCAGC AACATCTGCC TGACCCGGAC CGACCGGGGC

1021 TGGTACTGCG ACAACGCCGG CAGCGTGAGC TTCTTCCCCC AAGCCGAGAC CTGCAAGGTG

1081 CAGAGCAACC GGGTGTTCTG CGACACCATG AACAGCCTGA CCCTGCCCTC CGAGGTGAAC

^{1 1 A 1} CTGTGCAACG TGGACATCTT CAACCCCAAG TACGACTGCA AGATCATGAC

1201 GACGTGAGCA GCTCCGTGAT CACCTCCCTG GGCGCCATCG TGAGCTGCTA CGGCAAGACC

1261 AAGTGCACCG CCAGCAACAA GAACCGGGGC ATCATCAAGA CCTTCAGCAA CGGCTGCGAC

1321 TACGTGAGCA ACAAGGGCGT GGACACCGTG AGCGTGGGCA ACACACTGTA CTACGTGAAT

1381 AAGCAGGAAG GCAAGAGCCT GTACGTGAAG GGCGAGCCCA ATATCATGAT CACCACAATC

1441 ATCATCGTGA TCATTGTGAT CCTGCTGTCT CTGATTGCCG TGGGCCTGCT GCTGTACTGC

1501 AAGGCCCGCA GCACCCCTGT GACCCTGTCC AAGGACCAGC TGTCCGGCAT CAACAATATC

1561 GCCTTCTCCA ACATGGGGGG TTCTCATCAT CATCATCATC ATTGAAG

(SEQ ID NO: 38)

ecto

El siguiente polipéptido incluye tan solo el ectodominio del polipéptido F de VRS.

1 MELLILKANA ITTILTAVTF CFASGQNITE EFYQSTCSAV SKGYLSALRT GWYTSVITIE

61 LSNIKENKCN GTDAKVKLIK QELDKYKNAV TELQLLMQST PATNNRARRE LPRFMNYTLN

121 NAKKTNVTLS KKRKRRFLGF LLGVGSAIAS GVAVSKVLHL EGEVNKIKSA LLSTNKAWS

181 LSNGVSVLTS KVLDLKNYID KQLLPIVNKQ SCSISNIETV IEFQQKNNRL LEITREFSVN

241 AGVTTPVSTY MLTNSELLSL INDMPITNDQ KKLMSNNVQI VRQQSYSIMS IIKEEVLAYV

301 VQLPLYGVID TPCWKLHTSP LCTTNTKEGS NICLTRTDRG WYCDNAGSVS FFPQAETCKV

361 QSNRVFCDTM NSLTLPSEVN LCNVDIFNPK YDCKIMTSKT DVSSSVITSL GAIVSCYGKT

421 KCTASNKNRG IIKTFSNGCD YVSNKGVDTV SVGNTLYYVN KQEGKSLYVK GEPIINFYDP

481 LVFPSDEFDA SISQVNEKIN QSLAFIRKSD ELLHNVNAGK STTN (SEQ :ID NO: 39)

1 ATGGAACTGC TGATCCTGAA GGCCAACGCC ATCACCACCA TCCTGACCGC CGTGACCTTC

61 TGCTTCGCCA GCGGCCAGAA CATCACCGAG GAATTCTACC AGAGCACCTG CAGCGCCGTG

121 AGCAAGGGCT ACCTGAGCGC CCTGCGGACC GGCTGGTACA CCAGCGTGAT CACCATCGAG

181 CTGTCCAACA TCAAAGAAAA CAAGTGCAAC GGCACCGACG CCAAGGTGAA ACTGATCAAG

241 CAGGAACTGG ACAAGTACAA GAACGCCGTG ACCGAGCTGC AGCTGCTGAT GCAGAGCACC

301 CCCGCCACCA ACAACCGGGC CAGAAGAGAG CTGCCCCGGT TCATGAACTA CACCCTGAAC

361 AACGCCAAGA AAACCAACGT GACCCTGAGC AAGAAGCGGA AGCGGCGGTT CCTGGGCTTC

421 CTGCTGGGCG TGGGCAGCGC CATCGCCAGC GGGGTGGCCG TGTCCAAGGT GCTGCACCTG

481 GAAGGCGAGG TGAACAAGAT CAAGTCCGCC CTGCTGTCCA CCAACAAGGC CGTGGTGTCC

541 CTGAGCAACG GCGTGAGCGT GCTGACCAGC AAGGTGCTGG ATCTGAAGAA CTACATCGAC

601 AAGCAGCTGC TGCCCATCGT GAACAAGCAG AGCTGCAGCA TCAGCAACAT CGAGACCGTG

661 ATCGAGTTCC AGCAGAAGAA CAACCGGCTG CTGGAAATCA CCCGGGAGTT CAGCGTGAAC

721 GCCGGCGTGA CCACCCCCGT GAGCACCTAC ATGCTGACCA ACAGCGAGCT GCTGTCCCTG

781 ATCAATGACA TGCCCATCAC CAACGACCAG AAAAAGCTGA TGAGCAACAA CGTGCAGATC

841 GTGCGGCAGC AGAGCTACTC CATCATGAGC ATCATCAAAG AAGAGGTGCT GGCCTACGTG

901 GTGCAGCTGC CCCTGTACGG CGTGATCGAC ACCCCCTGCT GGAAGCTGCA CACCAGCCCC

961 CTGTGCACCA CCAACACCAA AGAGGGCAGC AACATCTGCC TGACCCGGAC CGACCGGGGC

1021 TGGTACTGCG ACAACGCCGG CAGCGTGAGC TTCTTCCCCC AAGCCGAGAC CTGCAAGGTG

1081 CAGAGCAACC GGGTGTTCTG CGACACCATG AACAGCCTGA CCCTGCCCTC CGAGGTGAAC

1141 CTGTGCAACG TGGACATCTT CAACCCCAAG TACGACTGCA AGATCATGAC CTCCAAGACC

1201 GACGTGAGCA GCTCCGTGAT CACCTCCCTG GGCGCCATCG TGAGCTGCTA CGGCAAGACC

1261 AAGTGCACCG CCAGCAACAA GAACCGGGGC ATCATCAAGA CCTTCAGCAA CGGCTGCGAC

1321 TACGTGAGCA ACAAGGGCGT GGACACCGTG AGCGTGGGCA ACACACTGTA CTACGTGAAT

1381 AAGCAGGAAG GCAAGAGCCT GTACGTGAAG GGCGAGCCCA TCATCAACTT CTACGACCCC

1441 CTGGTGTTCC CCAGCGACGA GTTCGACGCC AGCATCAGCC AGGTCAACGA GAAGATCAAC

1501 CAGAGCCTGG CCTTCATCCG GAAGAGCGAC GAGCTGCTGC ACAATGTGAA TGCCGGCAAG

1561 AGCACCACCA ATTGAAG (SEQ ID NO: 40)

F de VRS de longitud completa

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN

GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGF

LLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQ

SCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQI

VRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVS

FFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKT

KCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINEYDPLVEPSDEEDA

SISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLS

KDQLSGINNIAFSN (SEQ ID NO:41)

Enterocinasa de escisión de F de VRS idealizada

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN

GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGF

LLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQ

SCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQI

VRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVS

FFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKT

KCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDA

SISQINEKINQILAFIRKIDELLHNINAGKSTTNGSGSGDDDDDKGSGSGIMITTIIIVIIVILLSLIAV

GLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN (SEQ ID NO:42)

Trombina de escisión de F de VRS idealizada

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN

GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGF

LLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQ

SCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQI

VRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVS

FFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKT

KCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINEYDPLVEPSDEEDA

SISQINEKINQILAFIRKIDELLHNINAGKSTTNGSGSGLVPRGSGSGIMITTIIIVIIVILLSLIAVGL

LLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN (SEQ ID NO:43)

Factor Xa de escisión de F de VRS idealizado

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN

GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGF

LLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQ

SCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQI

VRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVS

FFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKT

KCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDA

SISQINEKINQILAFIRKIDELLHNINAGKSTTNGSGSGIEGRGSGSGIMITTIIIVIIVILLSLIAVGL

LLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN (SEQ ID NO:44)

F de VRS furx truncado HIS

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN

GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQAQNELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSQNQNQNFLGF

LLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQ

SCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQI

VRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVS

FFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKT

KCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDA

SISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO:45)

F de VRS furx R113Q, K123N, K124N truncado HIS

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN

GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQAQNELPQFMNYTLNNANNTNVTLSQNQNQNFLGF

LLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQ

SCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQI

VRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVS

FFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKT

KCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDA

SISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO:46)

F de VRS furx R113Q, K123Q, K124Q truncado HIS

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN

GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQAQNELPQFMNYTLNNAQQTNVTLSQNQNQNFLGF

LLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQ

SCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQI

VRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVS

FFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKT

KCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDA

SISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO:93) F de VRS delP21 furx truncado HIS

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGILSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQAQN-QNQNQNFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYID KQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQ KKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRG WYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSL GAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDP LVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO: 47) (el símbolo indica que el aminoácido en esta posición está delecionado)

F de VRS delP23 furx truncado HIS

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGILSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQAQN-QNQNFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQ LLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKK LMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGA IVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLV FPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO: 48) (el símbolo indica que el aminoácido en esta posición está delecionado)

F de VRS delP23 furdel truncado HIS

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGILSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARQ-QQQRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQ LLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKK LMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGA IVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLV FPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO: 49) (el símbolo ” indica que el aminoácido en esta posición está delecionado)

F de VRS furmt truncado HIS

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN

GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARKELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKKKFLGF

LLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQ

SCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQI

VRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVS

FFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKT

KCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDA

SISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQIDNO:50)

F de VRS furdel truncado HIS

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGILSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARQELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKK-RFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLP IVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMS NNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDN AGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVS CYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPS DEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO: 51) (el símbolo indica que el aminoácido en esta posición está delecionado)

F de V R S factor X a truncado H IS

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN

GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNIEGRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKIEGRFLGF

LLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQ

SCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQI

VRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVS

FFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKT

KCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDA

SISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO:52)

F de VRS ligador corto foldon HIS

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN

GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGF

LLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQ

SCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQI

VRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVS

FFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKT

KCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDA

SISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGSAGSG

HHHHHH (SEQ ID NO:53)

F de VRS ligador largo foldon HIS

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN

GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGF

LLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQ

SCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQI

VRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVS

FFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKT

KCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDA

SISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNNKNDDKGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLG

GSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO:54)

F_VRS_ecto_pre_his

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN

GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGF

LLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQ

SCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQI

VRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVS

FFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKT

KCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDA

SISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGESGGSAGSGHHHHHH

(SEQ ID NO:55)

ECTO PRE HA HIS

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN

GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGF

LLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQ

SCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQI

VRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVS

FFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKT

KCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDA

SISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKSGGSAGSGHHHHHH (SEQ

ID NO:56)

F de VRS ECTO Furx GCN HIS

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN

GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQAQNELPQFMNYTLNNANNTNVTLSQNQNQNFLGF

LLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQ

SCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQI

VRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVS

FFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKT

KCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDA

SISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGESGGSAGSGHHHHHH

(SEQIDNO:57)

F de VRS ECTO delp21 GCN HIS

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGILSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQAQN-QNQNQNFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYID KQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQ KKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRG WYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSL GAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDP LVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVN DKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGESGGSAGSGHHHHHH

(SEQ ID NO: 58) (el símbolo indica que el aminoácido en esta posición está delecionado)

F de VRS ECTO delp23 Furx GCN HIS

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGILSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQAQN-QNQNFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQ LLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKK LMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGA IVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLV FPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVN DKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGESGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO: 59) (el símbolo indica que el aminoácido en esta posición está delecionado)

F de VRS ECTO delp23 Furdel GCN HIS

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGILSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARQ-QQQRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQ LLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKK LMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGA IVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLV FPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVN DKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGESGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO: 60) (el símbolo indica que el aminoácido en esta posición está delecionado)

F de V R S longitud com pleta Furx

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGILSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQAQNELPQFMNYTLNNANNTNVTLSQNQNQNFLGF LLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQ SCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQI VRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVS FFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKT KCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDA SISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVN AGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN (SEQ ID NO: 61)

F de VRS longitud completa delp21

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGILSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQAQN-QNQNQNFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYID KQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQ KKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRG WYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSL GAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDP LVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVN AGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN (SEQ ID NO: 62) (el símbolo indica que el aminoácido en esta posición está delecionado)

F de VRS longitud completa p23 Furx GCN HIS

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGILSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQAQN-QNQNFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQ LLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKK LMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGA IVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLV FPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVN AGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN (SEQ ID NO: 63) (el símbolo indica que el aminoácido en esta posición está delecionado)

F de VRS longitud completa p23 Furdel GCN HIS

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGILSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARQ-QQQRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQ LLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKK LMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGA IVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLV FPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVN AGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN (SEQ ID NO: 64) (el símbolo indica que el aminoácido en esta posición está delecionado)

F de VRS furina N-term Furx truncado HIS

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN

GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQAQNELPQFMNYTLNNAQQTNVTLSKKRKRRFLGF

LLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQ

SCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQI

VRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVS

FFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKT

KCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDA

SISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQIDNO:65)

F de V R S furina C -term Furx truncado H IS

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN

GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPQFMNYTLNNAQQTNVTLSQNQNQNFLGF

LLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQ

SCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQI

VRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVS

FFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKT

KCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDA

SISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO:66)

F de VRS deleción de fusión 1 truncado HIS

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN

GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRSAIA

SGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIET

VIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIM

SIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCK

VQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNR

GIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKI

NQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO:67)

F de VRS deleción de fusión 2 truncado HIS

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN

GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRGVGS

AIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISN

IETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSY

SIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAE

TCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASN

KNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVN

EKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO:68)

F de VRS Furx truncado HIS

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN

GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQAQNELPQFMNYTLNNAQQTNVTLSQNQNQNFLGF

LLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQ

SCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQI

VRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVS

FFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKT

KCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDA

SISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO:69)

F de VRS Furx truncado

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN

GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQAQNELPQFMNYTLNNAQQTNVTLSQNQNQNFLGF

LLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQ

SCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQI

VRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVS

FFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKT

KCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDA

SISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTN (SEQ ID NO:70)

F de V R S d e lP 23 furdel truncado sin H IS (para células C H O )

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGILSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARQ-QQQRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQ LLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKK LMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGA IVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLV FPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTN (SEQ ID NO: 71) (el símbolo indica que el aminoácido en esta posición está delecionado)

F de VRS (Tn) truncado HIS

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN

GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGF

LLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQ

SCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQI

VRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVS

FFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKT

KCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDA

SISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO: 84)

F de VRS antiguo furx truncado HIS

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN

GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQAQNELQRFMNYTLNNANNTNVTLSQNQNQNFLGF

LLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQ

SCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQI

VRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVS

FFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKT

KCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDA

SISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO:88)

F de VRS Furx R113Q K123N K124N truncado HIS

MELLILKANAITTILTAVTFCEASGQNITEEEYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN

GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQAQNELPQFMNYTLNNAQQTNVTLSQNQNQNFLGF

LLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQ

SCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQI

VRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVS

FFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKT

KCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDA

SISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO:89)

F de VRS furina N-term truncado HIS

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN

GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPQFMNYTLNNAQQTNVTLSQNQNQNFLGF

LLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQ

SCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQI

VRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVS

FFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKT

KCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDA

SISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO:85)

F de V R S delP21 furdel truncado H IS

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN

GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARQ---------------------

QNQQQRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYID

KQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQ

KKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRG

WYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSL

GAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDP

LVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQID

NO:86)

F de VRS furina C-term truncado HIS

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCN

GTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQAQNELPQFMNYTLNNAQQTNVTLSKKRKRRFLGF

LLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQ

SCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQI

VRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVS

FFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKT

KCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDA

SISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQIDNO:87)

Ejemplo 2 - Expresión v purificación de constructos de F de VRS

Los constructos truncados y ECTO de F de VRS, que carecen del dominio transmembrana y la región de cola citoplasmática o bien con sitios de escisión de furina de tipo natural o bien que albergan mutaciones de desactivación en los sitios de escisión de furina y con o sin mutaciones de estabilización de prefusión, se clonaron en un vector de expresión de baculovirus pFastBac (Invitrogen). Varios de estos constructos contienen un ligador flexible C-terminal seguido por una secuencia de etiqueta His6 usada para la purificación por quelación. La producción de reservas de baculovirus de alto título se hizo pasar en células de insecto Sf9. Se expresaron proteínas infectando células o bien Sf9, Tn5 o bien High Five con el baculovirus requerido y recogiendo el sobrenadante del medio dos o tres días tras la infección, se monitorizaron mediante inmunotransferencia de tipo Western usando un anticuerpo anti-VRS F o anti-6HIS.

El medio de expresión a gran escala se concentró/purificó mediante una de dos estrategias generales para eliminar el efecto perjudicial de la ferritina presente en el medio de células de insecto que corrompe la resina quelante. El primer enfoque fue concentrar los aproximadamente 10-20 litros de medio de expresión de insectos hasta aproximadamente 300 mi usando una columna de concentración de fibra GE Healthcare Hollotube. Se añadió sulfato de cobre a esta mezcla concentrada hasta una concentración final de 500 pM y se cargó la disolución resultante sobre columnas quelantes HiTrap de 5 mi. Entonces se eluyó la proteína etiquetada con HIS unida de la columna con Tris 25 mM pH 7,5, NaCI 300 mM y un gradiente de imidazol.

En la segunda estrategia de purificación, se añadió CuCb al sobrenadante del medio hasta una concentración final de 500 pM. A cada 1 litro de medio, se añadieron cuatro mililitros de resina de quelación (Chelating Resin, BioRad) y se agitó la suspensión durante al menos treinta minutos a 4 grados centígrados y se separaron la resina y el medio mediante una columna de gravedad. Se lavó la resina con diez veces el volumen de la columna de tampón de equilibrado (Tris 25 mM pH 7,5, NaCI 300 mM) y se eluyó la proteína F con diez veces el volumen de la columna de tampón de elución (tampón de equilibrado con imidazol 250 mM). Se dializó la elución frente a tampón Tris 25 mM pH 7,5, y se cargó la disolución resultante sobre una columna de quelación Hitrap de 5 mi cargada con N¡S04 y se eluyó con Tris 25 mM pH 7,5, NaCI 300 mM y un gradiente de imidazol.

Se evaluaron las eluciones del gradiente de imidazol en cualquier caso usando geles de tipo Western anti-6HIS y coomassie. Se recogieron las fracciones que contenían constructos puros, se dializaron frente a diferentes tampones/soluciones salinas y se concentraron para su análisis posterior usando concentradores Millipore Centriprep y/o unidades de concentración Vivaspin. También se desarrolló un protocolo de purificación por exclusión molecular capaz de purificar adicionalmente trímeros de VRS monodispersos a partir de rosetas (a continuación).

Análisis de SEC de proteínas F de VRS:

Una característica documentada de otras proteínas de fusión de paramixovirus estabilizadas en su conformación de prefusión es que, incluso cuando se escinden de modo que el péptido de fusión queda expuesto, no forman rosetas tal como se observa para la conformación de posfusión. Un simple análisis de cromatografía de exclusión molecular permite la identificación de una proteína y la determinación de si una proteína está formando rosetas. Se desarrollaron dos métodos, HPLC-SEC y FPLC-SEC, que también sirven como etapa de purificación eficiente.

Se realizó HPLC-SEC usando una columna de SEC de Biorad (18 mm) con una fase móvil de Tris 25 mM pH 7,5, NaCI 300 mM. Usando patrones de HPLC-SEC de Biorad para calibrar el sistema, se encontró que las rosetas de VRS (que representan conformaciones de posfusión escindidas) eluyen en el volumen vacío de la columna del análisis, mientras que los trímeros monodispersos de VRS (presuntos trímeros del análisis de EM posterior) eluyen con un peso molecular aparente de aproximadamente 100 kDa.

Se realizó FPLC-SEC sobre una FPLC de GE Healtcare usando una columna 16/60 Superdex 200 con una fase móvil de Tris 25 mM pH7,5, NaCI 300 mM. Usando patrones de alto peso molecular de GE Healthcare para calibrar el sistema, se encontró que las rosetas de VRS eluyen en el volumen vacío de la columna del análisis, mientras que los trímeros monodispersos de VRS eluyen con un peso molecular aparente de aproximadamente 100 kDa.

Microscopía electrónica (EM) de proteínas F de VRS.

Se absorbieron disoluciones de proteína de aproximadamente 50 microgramos por mi de constructos de F de VRS sobre rejillas recubiertas con carbono sometidas a descarga luminiscente y se tiñeron negativamente con fosfotungstato de sodio al 2 % (pH 7,0) o formiato de uranilo al 0,75 % (pH bajo no cuantificado). Se observaron las rejillas en un microscopio electrónico de transmisión Technai Spirit o JOEL 1230 que funcionaba a entre 80 120 kV con unos aumentos de entre 20.000 y 150.000 dependiendo de la resolución requerida.

Tabla 2

Ejemplo 3 - Detección de F de VRS de prefusión v posfusión

Están disponibles varios métodos para determinar la conformación de la proteína F de VRS para someter a ensayo si una modificación en el polipéptido F de VRS o una molécula añadida desfavorece la conformación de posfusión. Los ejemplos incluyen asociación de liposomas, anticuerpos monoclonales específicos de conformación (incluyendo tal como se usan en FACS, ELISA, etc.), microscopía electrónica, sensibilidad a proteasas diferencial entre las conformaciones, cromatografía de filtración en gel, ultracentrifugación analítica, dispersión dinámica de la luz, experimentos de RMN de intercambio de deuterio, espectrometría de masas, espectroscopia de dicroísmo circular, calorimetría de titulación isotérmica, espectroscopia de triptófano y cristalografía de rayos X.

Asociación de liposomas

Puede usarse la asociación de liposomas para someter a ensayo la conformación de la proteína F de VRS. Las formas solubles de la proteína F de VRS en la conformación de prefusión no se asociarán con los liposomas, mientras que la conformación de posfusión se asociará con los liposomas.

Pueden prepararse liposomas tal como sigue: se mezclan 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina, 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina y colesterol en cloroformo (disponibles de Avanti Polar Lipids) a una razón molar de 8:2:5. El cloroformo se evapora bajo argón. Se formará una película lipídica que se seca al vacío durante la noche y se resuspende en PBS a 40 mM de lípidos totales. Después de cinco ciclos de congelacióndescongelación, los lípidos se agitan con vórtex y extruyen 21 veces a través de dos filtros de 100 nm usando una miniextrusora (disponible de Avanti Polar Lipids).

Una vez que se han preparado los liposomas, puede realizarse el ensayo de asociación de liposomas. Para cada muestra que va a someterse a prueba, se escinden 2 ng del polipéptido F de VRS que va a someterse a prueba con 25 miliunidades de tripsina (disponible de Worthington Biochemical) en tampón fosfato 100 mM (pH 7,1) durante 30 min a 25 °C. Después de la escisión, se añaden 40 ng de inhibidor de tripsina de soja (disponible de Worthington Biochemical) a cada muestra para finalizar la reacción. Las muestras se pretratan a 60 °C durante 30 min, lo que induciría un cambio conformacional desde las formas de prefusión a las de posfusión en la proteína F de VRS nativa aislada. Se añaden liposomas (40 ni por muestra) y PBS (80 ni de volumen final), y se incuban las muestras a 60 °C durante 30 min. Se añade sacarosa hasta una concentración final del 50% (500 ni de volumen final). Las muestras se recubren con 500 ni cada una de sacarosa al 40%, sacarosa al 25% y PBS y se centrifugan en un rotor TLS55 a 49.000 rpm durante 3 h a 25 °C. Se recogen fracciones (500 ni) de la parte superior de los gradientes. Las proteínas se solubilizan en Tritón X-100 al 0,5 % y se precipitan usando ácido tricloroacético al 12,5 % vol/vol. Los polipéptidos se separan mediante SDS/PAGE y se transfieren a membranas de PVDF. Las inmunotransferencias se someten a prueba con anticuerpos monoclonales anti-F de VRS.

Microscopía electrónica

Se usó microscopía electrónica para someter a ensayo la distribución conformacional de los polipéptidos F de VRS. Los polipéptidos F de VRS en la forma de prefusión tienen una forma de “bola y tallo” con una longitud de ~12 nm. En cambio, los polipéptidos R de VRS en la forma de posfusión tienen una forma de “soporte de go lf con una longitud de ~16 nm. Además, los péptidos de fusión en el extremo estrecho de los “soportes de g o lf se agregan formando estructuras en forma de roseta. Por tanto, puede usarse microscopía electrónica para someter a ensayo la distribución de conformaciones en una muestra de polipéptidos R de VRS debido a las formas fácilmente distinguibles.

Ejemplo 4 Trímeros v rosetas de ectodominio de F de VRS

Los constructos de ectodominio de proteína F de VRS, que codifican polipéptidos que carecen del dominio transmembrana y la región de cola citoplasmática o bien con sitios de escisión de furina de tipo natural o bien que albergan mutaciones de desactivación en los sitios de escisión de furina y/o mutaciones de péptido de fusión, se clonaron en un vector de expresión de baculovirus pFastBac (Invitrogen). Varios de estos constructos contienen un ligador flexible C-terminal seguido por una secuencia de etiqueta HIS6 usada para la purificación por quelación. La producción de reservas de baculovirus de alto título se obtuvo mediante pase en células de insecto Sf9. Se expresaron proteínas infectando células o bien Sf9, Tn5 o bien High Five con el baculovirus requerido y recogiendo el sobrenadante de medio acondicionado dos o tres días tras la infección. Se monitorizó la producción de proteínas mediante inmunotransferencia de tipo Western usando un anticuerpo anti-F de VRS o anti-HIS6.

El medio de expresión a gran escala se concentró/purificó usando una de dos estrategias generales para eliminar el efecto perjudicial de la ferritina presente en el medio de células de insecto, que puede corromper la resina quelante. El primer enfoque fue concentrar los aproximadamente 10-20 litros de medio de expresión de insectos hasta aproximadamente 300 mi usando una columna de concentración de fibras Hollotube de GE Healthcare. Se añadió sulfato de cobre a esta mezcla concentrada hasta una concentración final de 500 nM, y se cargó la disolución resultante sobre columnas quelantes HiTrap de 5 mi. Entonces se eluyó la proteína etiquetada con HIS unida de la columna con Tris 25 mM pH 7,5, NaCI 300 mM y un gradiente de imidazol.

En la segunda estrategia de purificación, se añadió CuCl2 al sobrenadante del medio hasta una concentración final de 500 nM. A cada 1 litro de medio, se añadieron de aproximadamente cuatro a diez mililitros de resina quelante (Chelating Resin, BioRad), y se agitó la suspensión durante al menos treinta minutos a 4 grados centígrados, y se separaron la resina y el medio usando una columna de gravedad. Se lavó la resina con aproximadamente diez veces el volumen de la columna de tampón de equilibrado (Tris 25 mM pH 7,5, NaCI 300 mM), y se eluyó el ectodominio de proteína F con aproximadamente diez veces el volumen de la columna de tampón de elución (tampón de equilibrado con imidazol 250 mM). Se dializó la elución frente a tampón Tris 25 mM pH 7,5, y se cargó la disolución resultante sobre una columna de quelación Hitrap de 5 mi cargada con NÍSO4. Se eluyó la proteína unida con Tris 25 mM pH 7,5, NaCI 300 mM y un gradiente de imidazol.

Se evaluaron las eluciones del gradiente de imidazol en cualquier caso usando inmunotransferencias de tipo Western anti-HIS6 y/o geles de SDS-PAGE teñidos con Coomassie. Se recogieron las fracciones que contenían constructos puros, se dializaron frente a diferentes tampones/soluciones salinas y se concentraron para su análisis posterior usando concentradores Millipore Centriprep y/o unidades de concentración Vivaspin. En algunos casos, se purificaron adicionalmente monómeros, trímeros o rosetas usando cromatografía de exclusión molecular.

Análisis de SEC y purificación de ectodominios de F de VRS

Se usó cromatografía de exclusión molecular para purificar y analizar monómeros, trímeros y rosetas de ectodominio de proteína F de VRS. Este método también permitió que se purificaran ectodominios de proteína F de VRS no escindidos de contaminantes lipídicos y lipoproteicos derivados de la célula huésped o el medio. Se desarrollaron dos métodos, HPLC-SEC y FPLC-SEC, que también sirven como etapa de purificación eficiente.

Se realizó HPLC-SEC usando una columna de SEC de Biorad (18 mm) con una fase móvil de Tris 25 mM pH 7,5, NaCI 300 mM. Usando patrones de HPLC-SEC de Biorad para calibrar el sistema, se encontró que las rosetas de VRS (que representan conformaciones de posfusión, escindidas) eluyen en el volumen vacío de la columna del análisis, mientras que los monómeros de F de VRS eluyen con un peso molecular aparente de aproximadamente 75-85 kDa.

Se realizó FPLC-SEC sobre una FPLC de GE Healthcare usando una columna 16/60 Superdex 200 con Tris 25 mM pH 7,5, NaCI 300 mM como fase móvil. Usando patrones de al peso molecular de GE Healthcare para calibrar el sistema, se encontró que las rosetas de VRS eluyen en el volumen vacío de la columna del análisis, mientras que los trímeros monodispersos de VRS eluyen con un peso molecular aparente de aproximadamente 140-160 kDa y los monómeros de F de VRS eluyen con un peso molecular aparente de aproximadamente 75-85 kDa.

Para la purificación, se usó el método de FPLC-SEC y se recogieron fracciones de 1 mi.

Escisión con tripsina de los constructos Furdel o Delp23 Furdel para formar rosetas de posfusión

En general, la digestión con tripsina de los monómeros Delp23 Furdel se realiza con tripsina:F de VRS 1:1000 en peso, o10-15 unidades BAEE de tripsina por 1 mg de antígeno F de VRS. En una reacción típica, se diluyó tripsina de plasma bovino (Sigma Aldrich, T8802:10.000-15.000 unidades BAEE/mg de tripsina) hasta una concentración de 1 mg/ml en Tris 25 mM pH 7,5, NaCI 300 mM. Una disolución de 1 mg/ml de pollpéptldo de ectodomlnlo de proteína F de VRS (diluido en Tris 25 mM pH 7,5, NaCI 300 mM) se trató con un mlcrolltro de disolución de tripsina (razón en masa final de tripsina:F de VRS 0,001:1 o aproximadamente 10-15 unidades BAEE de tripsina con respecto a cada miligramo de F de VRS) durante 1 hora a 37 °C. Normalmente, se monitorizó el progreso de la reacción de escisión mediante gel de SDS-PAGE. Se detuvo la reacción de escisión usando un Inhibidor de tripsina. La proteína F de VRS escindida se purificó adlclonalmente mediante cromatografía de exclusión molecular.

En ocasiones, se añadió un volumen 1:100 de Inhibidor de tripsina Inmovilizado (Sigma) o 1 mlcrolltro de Inhibidor de tripsina de soja 1 mM a la disolución de escisión y se Incubó la mezcla a temperatura ambiente durante aproximadamente 15-30 minutos con agitación suave para detener la reacción de la tripsina. Se separó la resina de Inhibidor de la disolución de proteína usando columnas de mlcrocentrífuga. Se purificó la disolución resultante mediante purificación por SEC.

Microscopía electrónica (EM) de proteínas F de VRS.

Se absorbieron polipéptidos de ectodominio de proteína F de VRS (aproximadamente 50 microgramos por mi), sobre rejillas recubiertas con carbono sometidas a descarga luminiscente y se tiñeron negativamente con fosfotungstato de sodio al 2 % (pH 7,0) o formiato de uranilo al 0,75 % (pH bajo no cuantificado). Se observaron las rejillas en un microscopio electrónico de transmisión Technal Spirit o JOEL 1230 que funcionaba a entre 80 120 kV con unos aumentos de entre 20.000 y 150.000 dependiendo de la resolución requerida.

Ensayo de fosfolípidos

Este ensayo se basa en el ensayo de fosfolípidos C colina oxidasa - método DAOS de Wako Puré Chemical Industries, Ltd. (n.e de cat.433-36201). El protocolo del ensayo se modifica solo para reducir la cantidad de material usado en el ensayo, y para disminuir la dilución de las muestras en la reacción en relación con el protocolo general del proveedor. Para determinar el contenido de lípidos de la muestra de F de VRS, se genera el reactivo de color disolviendo una botella de reactivo de color con una botella tampón (el reactivo de color es estable durante 1 semana a 4 °C). Se diluye el patrón de fosfolípidos de 300 mg/dl (3 mg/ml) hasta 1,5, 1,0, 0,75, 0,5 y 0,25 mg/ml con agua destilada. Para cada patrón, un blanco de agua y una reacción de muestra se añaden a un tubo de mlcrocentrífuga 10 ni de reactivo de color y 2 ni de o bien patrón, agua destilada (patrón de 0 mg/ml) o bien muestra. Se centrifugan las reacciones brevemente para garantizar un mezclado apropiado y se Incuban los tubos durante 15 mln a 37 °C. Se registra la absorbancla a 595 nm para cada punto de patrón y se genera una curva patrón. Se registra la absorbancla a 595 nm para cada muestra y se calcula la concentración de fosfolípidos a partir de la curva de calibración preparada.

Inmunogenicidad en tatas algodoneras

La Inmunogenicidad de polipéptidos de ectodomlnlo de proteína F de VRS en las formas de monómeros (delp21 furx no escldldo), rosetas de trímeros (delp23 furdel escindido) y trímeros (deleclón de péptldo de fusión) se determinó en ratas algodoneras (Sigmodon hispidus) en dos estudios. En el estudio 1 (figuras 8A y 8B), 10 ratas algodoneras por grupo se vacunaron por vía Intramuscular con 10 ng de monómeros o rosetas (cada uno adsorbido a hidróxido de aluminio) los días 0 y 21. Se midieron los títulos en suero de IgG anti-proteína F de VRS y de anticuerpos neutralizantes de VRS 2 semanas después de la 1a vacunación (2wp1) y 2 semanas después de la 2a vacunaclón (2wp2), o 3 semanas después de la 1a vacunación (3wp1) y 2 semanas después de la 2a vacunación (2wp2). Se determinó IgG anti-proteína F de VRS (figura 8A) mediante ELISA usando placas recubiertas con proteína F de VRS y anticuerpos de detección de pollo antl-lgG de rata algodonera conjugado con peroxldasa del rábano. Los datos se presentan como logio de títulos medios geométricos (GMT) desviaciones estándar de ratas algodoneras Individuales. Se midieron los títulos de neutralización de VRS (figura 8B) mediante la prueba de neutralización de reducción de placas (PRNT). En resumen, se prelncubaron diluciones de suero ¡nactlvado por calor con VRS Long, y luego se Inocularon sobre células HEp-2 en placas de 12 pocilios. Después de una Infección de 2 horas, se retiró el ¡nóculo y se recubrieron las células con agarosa. Se enumeraron las placas 5 días después mediante tinción con rojo neutro. El título de neutralización se define como el Inverso de la dilución de suero que produce una reducción de al menos el 60 % en el número de placas por pocilio, en relación con los controles (sin suero). Los datos se presentan como logio de GMT error estándar de 2 conjuntos de 5 ratas algodoneras por grupo.

En el estudio 2 (figura 8C), se Inmunizaron 9 ratas algodoneras por grupo por vía Intramuscular con las dosis Indicadas de monómeros, trímeros o rosetas (cada uno adsorbido a hldróxldo de aluminio). Se midieron los títulos de IgG anti-proteína F de VRS en suero 2wp1 como anteriormente.

Resultados

Se expresó el ectodomlnlo de F de VRS soluble (con sitios de escisión de furlna no mutados), pero no pudo purificarse de las Impurezas de lípldos y lipoproteínas derivadas de las células huésped o los medios de cultivo usando cromatografía de exclusión molecular. Estos pollpéptldos de ectodomlnlo de F de VRS eluyen en el volumen vacío de la columna de SEC junto con los contaminantes lipidíeos y lipoproteicos.

Se prepararon varios constructos para fabricar pollpéptldos de ectodomlnlo F de VRS que contienen mutaciones en los sitios de escisión de furlna, Incluyendo los constructos Furdel. Véase la figura 1. Los pollpéptldos producidos por la expresión de los constructos Furdel se secretaron de las células como una especie no escindida de ~65 kDa. La mutación de Furdel también Impide la exposición del péptldo de fusión, lo que a su vez Impide la formación de rosetas. Como resultado, F de VRS Furdel soluble migró en el volumen Incluido de una columna preparatoria Superdex 200, dando como resultado la separación tanto de los restos de lípldos, que eluyeron en el volumen vacío, como de la Impureza de proteína de Insecto. Estos resultados muestran que los pollpéptldos de ectodomlnlo de F de VRS en los que se han mutado los sitios de escisión de furlna se producen como pollpéptldo no escindido que puede purificarse mediante SEC. Además, el análisis del tiempo de retención de F de VRS no escindido fue consecuente con que los pollpéptldos fueran monómeros en lugar de trímeros.

Se evaluó adlclonalmente si los pollpéptldos de F de VRS furdel eran monómeros, trímeros o una mezcla de monómeros y trímeros usando ultracentrlfugaclón analítica. Se realizaron estudios de ultracentrlfugaclón analítica usando proteína purificada del pico de monómero de la purificación por SEC. Los datos de velocidad de sedimentación de F de VRS no escindido mostraron un patrón escalonado, lo que sugiere dos especies en disolución. El análisis del experimento de velocidad de sedimentación mostró que el ectodomlnlo de F de VRS no escindido tenía una alta población de monómero y una población menor de trímero aparente en la disolución. Se recogieron datos de ejecución en equilibrio y se realizaron Intentos de ajustar los datos a un modelo de monómero Ideal o un modelo de equilibrio de monómero-trímero. Sin embargo, los residuales de los ajustes son escasos, particularmente hacia el fondo de la célula donde la concentración de proteína es mayor. Estas observaciones sugirieron que los pollpéptldos de ectodomlnlo de F de VRS no escindidos son predominantemente un monómero con una población más pequeña que se autoasocla (potencialmente como trímeros) o se agrega a concentraciones superiores.

Se realizó un análisis adicional de pollpéptldos de ectodomlnlo de proteína F de VRS seleccionados usando cromatografía de exclusión molecular (SEC). Figuras 6A-6D. Los picos principales que contienen monómeros, trímeros o rosetas de trímeros se indican mediante un asterisco en las figuras 6A-6D, con el tiempo de retención de la columna Superdex P20016/60 (GE Healthcare) Indicado en mililitros. En una columna calibrada, los tiempos de retención aproximados de 47 mi, 65 mi y 77 mi corresponden al volumen vacío de la columna, la retención de trímeros de F y la retención de monómeros, respectivamente. En la figura 6A, el constructo Delp23 Furdel (Ap23 Furdel) no escindido se purificó del pico de monómero. Cuando el antígeno F de VRS Delp23 Furdel no escindido se trató con tripsina, la proteína formó rosetas, que migraron en SEC en el volumen vacío (figura 6B). La especie de trímero escindido de la deleclón del péptldo de fusión de F de VRS se purificó del pico de trímero con un tiempo de retención de aproximadamente 65 mi (figura 6C), mientras que el constructo Delp21 Furx no escindido (Ap21 Furx) se purificó del pico de monómero a aproximadamente 77 mi (figura 6D).

Varios pollpéptldos de ectodomlnlo de proteína F de VRS en forma no escindida o después de la escisión con tripsina se evaluaron mediante EM. Los constructos F de VRS Furdel y delp23 Furdel tienen residuos de arginina que quedan en el sitio de escisión de furlna. Estas arglnlnas son susceptibles a la escisión con tripsina. Tras la escisión, la especie Fo no escindida se convirtió en las especies F1/F2, en las que se expone el péptldo de fusión. El análisis de EM confirmó que, después de la escisión con tripsina, los ectodomlnlos de VRS no escindidos formaron rosetas de trímeros en virtud de sus péptldos de fusión, como se ha observado para proteínas de fusión relacionadas. Los resultados se presentan en la tabla 3 y muestran que los pollpéptldos de ectodomlnlo de proteína F de VRS no escindidos pueden escindirse formando rosetas de trímeros. El constructo deleclonado de péptldo de fusión, que se escinde mediante furlna, formó trímeros monodlspersos. Véanse, también, las figuras 7A-7D. Ventajosamente, la producción de rosetas de trímeros de esta manera da como resultado rosetas de trímeros que están sustancialmente libres de restos de lípidos y lipoproteínas.

Los resultados de los estudios de ¡nmunogenlcidad mostraron que los polipéptidos de ectodomlnlo de proteína F de VRS en forma de monómeros (delp21 furx no escindido), rosetas de trímeros (delp23 furdel escindido) y trímeros (deleción de péptido de fusión) eran inmunogénicos en ratas algodoneras (Sigmodon hispidus), e indujeron anticuerpos neutralizantes. Figuras 8A-8C.

Tabla 3

Ejemplo 5 - Métodos para producir antígenos de subunidad F de VRS en células de insecto o CHO

Purificación de antígeno F de VRS de células de insecto:

Se expresaron subunidades de ectodominio de F de VRS, incluyendo los constructos Delp21 Furx, Delp23 Furdel y deleción de péptido de fusión, en células de insecto HiFive (Invitrogen) usando el sistema de baculovirus pFAST Bac. La subunidad de F de VRS se purificó de las expresiones a gran escala, 10-25 litros, por medio de un método de quelación de dos etapas que redujo el efecto perjudicial del contaminante de ferritina en los medios de células de insecto, que puede corromper la resina quelante. Se añadió CuS04 al sobrenadante del medio hasta una concentración final de 500 nM. Se añadieron de aproximadamente diez a veinte mililitros de resina quelante (Chelating Resin, BioRad) a cada 1 litro de medio, se agitó la suspensión durante al menos treinta minutos a 4 °C, y se separaron la resina y el medio usando una columna de gravedad. Se lavó la resina con aproximadamente dos veces el volumen de resina de tampón de equilibrado (Tris 25 mM pH 7,5, NaCI 300 mM), y se eluyó el ectodominio de proteína F con aproximadamente dos veces el volumen de la columna de tampón de elución (tampón de equilibrado con imidazol 250 mM). Se dializó la elución frente a tampón Tris 25 mM pH 7,5, NaCI 300 mM y se cargó la disolución resultante sobre una columna de quelación Hitrap de 5 mi cargada con NiS04 (GE Healthcare). Se eluyó la proteína unida con Tris 25 mM pH 7,5, NaCI 300 mM y un gradiente de imidazol.

Se evaluaron las eluciones del gradiente de imidazol en ambos casos usando inmunotransferencias de tipo Western anti-HIS6 y/o geles de SDS-PAGE teñidos con Coomassie. Se recogieron las fracciones que contenían constructos puros y se concentraron hasta aproximadamente 1 mg/ml usando concentradores Millipore Centriprep y/o unidades de concentración Vivaspin para el posterior análisis/purificación mediante cromatografía de exclusión molecular.

Análisis de SEC y purificación de ectodominios de F de VRS

Se usó cromatografía de exclusión molecular (SEC) para purificar y analizar monómeros no escindidos y trímeros escindidos de ectodominio de proteína F de VRS. Este método también permitió que se purificaran ectodominios de proteína F de VRS no escindidos de contaminantes lipidíeos y lipoproteicos derivados de la célula huésped o el medio. En el caso de la generación de rosetas limpias, el constructo Delp23 Furdel no escindido se purificó inicialmente como un monómero y posteriormente se trató con proteasa y volvió a purificarse usando SEC para purificar rosetas homogéneas (véase a continuación). Se desarrollaron dos métodos para el análisis de la oligomerización de F de VRS, HPLC-SEC y FPLC-SEC, que también pueden servir como etapa de purificación eficiente.

Se realizó HPLC-SEC usando una columna de SEC de Biorad (18 mm) con una fase móvil de Tris 25 mM pH 7,5, NaCI 300 mM. Usando patrones de HPLC-SEC de Biorad para calibrar el sistema, se encontró que las rosetas de VRS (que representan conformaciones de posfusión, no escindidas) eluyen en el volumen vacío de la columna del mientras que los monómeros de F de VRS eluyen con un peso molecular aparente de aproximadamente 75 85 kDa.

Se realizó FPLC-SEC sobre una FPLC de GE Healthcare usando una columna 16/60 Superdex 200 con Tris 25 mM pH 7,5, NaCI 300 mM como fase móvil. Usando patrones de al peso molecular GE Healthcare para calibrar el sistema, se encontró que las rosetas de VRS eluyen en el volumen vacío de la columna del análisis, mientras que los trímeros monodispersos de VRS eluyen con un peso molecular aparente de aproximadamente 140-160 kDa y los monómeros de F de VRS eluyen con un peso molecular aparente de aproximadamente 75-85 kDa. Para la purificación de Delp21 Furx o Delp23 Furdel no escindidos de VRS (monómeros) o deleción de péptido de fusión (trímero), se cargaron 0,5-2 mi de material purificado por quelación de aproximadamente 1 mg/ml sobre una columna Superdex P200 16/60 equilibrada con una velocidad de flujo de entre 0,5-2 ml/min y se recogieron fracciones relevantes.

Escisión con tripsina de constructos Delp23 Furdel para formar rosetas de posfusión

Se diluyó tripsina de plasma bovino (Sigma Aldrich, T8802:10.000-15.000 unidades BAEE/mg de tripsina) hasta una concentración de 1 mg/ml en Tris 25 mM pH 7,5, NaCI 300 mM. Una disolución de 1 mg/ml de polipéptido de ectodomlnlo de proteína F de VRS (diluido en Tris 25 mM pH 7,5, NaCI 300 mM) se trató con un mlcrolitro de disolución de tripsina (razón en masa final de tripsina:F de VRS 0,001:1 o aproximadamente 10-15 unidades BAEE de tripsina con respecto a cada miligramo de F de VRS) durante 1 hora a 37 °C. Se monitorizó el progreso de la reacción de escisión mediante gel de SDS-PAGE. Se detuvo la reacción de escisión usando un Inhibidor de tripsina (Inhibidor de tripsina de soja de Gibco usando una masa igual de Inhibidor con respecto a tripsina). Se encontró que se requería un periodo de incubación entre la etapa de escisión y la purificación de rosetas posterior para permitir una mayor eficiencia de la conversión de monómeros en rosetas. Se facilitó un periodo de incubación de una a 6 horas a 37 °C para proporcionar una mayor eficiencia de formación de rosetas. La proteína F de VRS escindida se purificó adicionalmente de especies de monómero sin convertir usando cromatografía de exclusión molecular (tal como se describió anteriormente) donde pueden recogerse rosetas homogéneas en las fracciones de volumen vacío de la columna.

Purificación de antígeno F de VRS a partir de células CHO:

Se purificaron constructos de deleción de péptido de fusión de F de VRS, que no contienen una etiqueta HIS, mediante purificación catiónica. El material de CHO que contiene antígeno de trímero de F de VRS expresado se concentró hasta aproximadamente una décima parte del volumen original en un sistema de concentración de cartucho de fibras huecas de GE Healthcare (MWCO 10.000 kDa). Entonces se intercambió el tampón de la disolución concentrada cuatro veces con un volumen equivalente de acetato de sodio 25 mM pH 6,0, NaCI 25 mM. La disolución resultante, que contenía trímero de F de VRS concentrado en el tampón acetato/solución salina, se cargó sobre una columna GE Healthcare HiTrap CM precargada que se había equilibrado con tampón acetato/solución salina. Se eluyó la proteína de la columna usando un gradiente escalonado de tampón acetato 25 mM que contenía NaCI o bien 25,150, 250, 500 o bien 1000 mM (conteniendo las fracciones de NaCI 250 mM y 500 mM la mayor parte del material eluido). Este material podía purificarse adicionalmente usando una purificación por SEC similar al protocolo anterior.

Ejemplo 6 - Inmunoaenicidad de subunidades de F de VRS en ratas algodoneras

La inmunogenicidad y capacidad protectora de las subunidades de trímero (F de VRS-deleción de péptido de fusión-trun) y roseta (F de VRS-delp23-furdel-trunc, escindido) de F de VRS, cada una formulada con alumbre o MF59, se evaluó en el modelo de rata algodonera. El antígeno usado para el ELISA en este estudio fue F de VRS-deleción de péptido de fusión-trunc (tabla 4). La neutralización fue contra la cepa de VRS infecciosa, Long (tabla 5). Todas las combinaciones fueron inmunogénicas, provocando respuestas de anticuerpos neutralizantes de VRS e IgG específica de F de VRS de alto título que se reforzaron con una segunda vacunación, y proporcionaron protección frente a la exposición nasal a VRS.

Métodos

Vacunación v exposición de ratas algodoneras

Se obtuvieron ratas algodoneras (Sigmodon hispidis) hembra de Harían Laboratories. Se inmunizaron grupos de animales por vía intramuscular (i.m., 100 ni) con las vacunas indicadas los días 0 y 21. Se recogieron muestras de suero 3 semanas después de la primera inmunización (3wp1) y 2 semanas después de la segunda inmunización (2wp2). Se expuso a los animales inmunizados o de control sin vacunar por vía intranasal (i.n.) con 1 x105 ufp de VRS Long 4 semanas después de la inmunización final. Se realizaron la recogida de sangre y la exposición a VRS bajo anestesia con isoflurano al 3 % usando un vaporizador de precisión.

ELISA específico de F de VRS

Se sometieron a ensayo muestras de suero individuales para determinar la presencia de IgG específica de F de VRS mediante ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA). Se recubrieron placas de ELISA (MaxiSorp de 96 pocilios, Nunc) durante la noche a 4 °C con F de VRS purificado 1 ng/ml (deleción de péptido de fusión-truno) en PBS. Después del lavado (PBS con Tween-20 al 0,1 %), se bloquearon las placas con tampón de bloqueo Superblock en PBS (Thermo Scientific) durante al menos 1,5 horas a 37 °C. Entonces, se lavaron las placas, se añadieron diluciones en serie de suero en diluyente de ensayo (PBS con Tween-20 al 0,1 % y suero de cabra al 5 %) de ratas algodoneras experimentales o de control, y se incubaron las placas durante 2 horas a 37 °C. Después del lavado, se incubaron las placas con IgG de pollo anti-rata algoconera conjugada con peroxldasa del rábano (HRP) (Immunology Consultants Laboratory, Inc, diluida 1:5.000 en diluyente de ensayo) durante 1 hora a 37 °C. Finalmente, se lavaron las placas y se añadieron a cada pocilio 100 ul de disolución de sustrato de peroxldasa TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc). Las reacciones se detuvieron mediante la adición de 100 ni de H3PO4 1 M, y se leyó la absorbancia a 450 nm usando un lector de placas. Para cada muestra de suero, se generó un gráfico de la densidad óptica (DO) frente al logaritmo de la dilución de suero inversa mediante regresión no lineal (GraphPad Prism). Los títulos se definieron como la dilución de suero inversa a una DO de aproximadamente 0,5 (normalizada a un patrón, sueros agrupados de ratas algodoneras infectadas con VRS con un título definido de 1:2500, que se incluyó en cada placa).

Ensayo de microneutralización

Se sometieron a prueba muestras de suero para detectar la presencia de anticuerpos neutralizantes mediante un ensayo de microneutralización. Se añadieron diluciones en serle de dos veces de suero inactivado por calor (Hl) (en PBS con el 5% de suero bovino fetal (FBS) Hl) a un volumen Igual de la cepa de VRS Long, titulada previamente para dar aproximadamente 115 UFP/25 ni. Se incubaron mezclas de suero/virus durante 2 horas a 37 °C y el 5 % de C02 para permitir que se produjera la neutralización del virus, y luego se inocularon 25 ni de esta mezcla (que contenía aproximadamente 115 UFP) en pocilios duplicados de células HEp-2 en placas de 96 pocilios. Después de 2 horas a 37 °C y el 5 % de C02, se recubrieron las células con metilcelulosa al 0,75 %/EMEM el 5% de Hl-FBS y se incubaron durante 42 horas. Se determinó el número de partículas de virus infecciosas mediante la detección de la formación de sincitios mediante ¡nmunotinción seguido por recuento automático. El título de neutralización se define como el Inverso de la dilución de suero que produce una reducción de al menos el 60 % en el número de sincitios por pocilio, en relación con los controles (sin suero).

Carga viral

Se determinó la carga viral en el pulmón mediante ensayo de placas. Específicamente, se recogieron los pulmones 5 días después de la Infección con VRS y se colocó un lóbulo derecho en 2,5 mi de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Invitrogen) con sacarosa al 25% y se rompió con un homogeneizador de tejidos. Los sobrenadantes libres de células de estas muestras se almacenaron a -80 °C. Para el ensayo de virus infeccioso, se inocularon diluciones de homogeneizado de pulmón clarificado (en PBS con el 5% de HI-FBS) sobre monocapas de células HEp-2 confluentes en un volumen de 200 ul/pocillo de una placa de 12 pocilios. Después de 2 horas con agitación suave periódica (37 °C, el 5% de CO2), se retiró el inóculo y se recubrieron las células con 1,5 mi de agarosa SeaPlaque al 1,25 % (Lonza) en medio esencial mínimo de Eagle (EMEM, Lonza) suplementado con el 5 % de HI-FBS, glutamina y antibióticos. Después de 3-4 días de incubación, se recubrieron las células de nuevo con 1 mi de agarosa al 1,25 % en EMEM (Sigma) que contenía rojo neutro al 0,1 % (Sigma). Las placas se contaron un día después con la ayuda de una caja de luz.

Un método alternativo para determinar la carga viral es la PCR cuantitativa en tiempo real (gRT-PCR). La carga viral puede determinarse mediante qRT-PCR usando cebadores oligonucleotídicos específicos para el gen de F de VRS tal como se describe (I. Borg etal., Eur Respir J 2003; 21:944-51)con algunas modificaciones. En resumen, se aísla ARN a partir de 140 ul de homogeneizado de pulmón clarificado, o de un número conocido de unidades formadoras de placa (UFP) de VRS (determinado por ensayo de placas y diluido en homogeneizado de pulmón de animales no infectados), usando el kit RNeasy (Qiagen) con un volumen de elución final de 100 ul de H2O. La síntesis de ADNc y la PCR se realizan en un solo tubo usando el kit de RT-PCR cuantitativa SuperScript III Platinum One-Step (Invitrogen) con 5 ni de ARN eluido, 10 nM de cada cebador y 50 nM de la sonda (cebadores y sondas de Integrated DNA Technologies). Cebador directo: TTGGATCTGCAATCGCCA (SEQ ID NO: 72). Cebador inverso: CTTTTGATCTTGTTCACTTCTCCCTTCT (SEQ ID NO: 73). Sonda: 5’-carboxifluoresceína (FAM)-TGGCACTGCTGTATCTAAGGTCCTGCACT-tetrametilcarboxirrodamina (TAMRA)-3’ (SEQ ID NO: 74). La amplificación y la detección se realizan con un Instrumento ABI Prism 7900HT o 7500 (Applied Blosystems). Se define un valor de ciclo umbral (Ct) para cada muestra como el número de ciclo en el que la señal fluorescente se vuelve detectable por primera vez por encima de un umbral establecido. Entonces, se determinan los equivalentes de UFP para cada muestra basándose en una curva patrón de Ct frente al logaritmo del número de copias definido de ARN viral.

Resultados

La rata algodonera como modelo se ha usado ampliamente en el estudio de la patogenia e Inmunidad de VRS debido a las muchas similitudes entre la enfermedad Inducida por VRS en ratas algodoneras y seres humanos. Dos paralelismos Importantes son la eficacia de los anticuerpos neutralizantes y la hlstopatología pulmonar potenciada asociada con la vacunación con VRS ¡nactlvado con formallna. Las ratas algodoneras también son más susceptibles a la Infección con VRS que otros animales pequeños tales como los ratones.

Para evaluar la ¡nmunogenlcldad de las vacunas de subunldades de F de VRS, se vacunaron grupos de ratas algodoneras hembra por vía intramuscular con diversas dosis de trímeros (F de VRS-deleción de péptido de fusióntruno) o rosetas (F de VRS-delp23-furdel-trunc, escindido), cada uno formulado con alumbre o MF59. En todos los casos, una sola Inmunización fue suficiente para Inducir anticuerpos tanto neutralizantes como específicos de F en el suero cuando se midió tres semanas después de la primera vacunación (3wp1). A todas las ratas algodoneras se les administró una Inmunización de refuerzo homóloga tres semanas después de la primera, y esto dio como resultado un aumento significativo de IgG específica de F y anticuerpo neutralizante cuando se midieron dos semanas más tarde (2wp2). En general, la ¡nmunogenlcldad de las rosetas fue Igual o mayor que la de los trímeros, la formulación de MF59 mejoró los títulos más que la formulación de alumbre y dosis más altas de proteína produjeron títulos más altos, aunque hubo algunas excepciones.

Para determinar la capacidad protectora de las vacunas de subunldades, todas las ratas algodoneras se Infectaron cuatro semanas después de la segunda vacunación con VRS por vía nasal y se midió la carga viral en el pulmón cinco días después mediante un ensayo de placas. En todos los casos, la vacunación de subunldades confirió protección frente a la exposición, ya que las cargas virales pulmonares en ratas algodoneras vacunadas fueron más de tres órdenes de magnitud Inferiores a las de los animales de control no Inmunizados, pero expuestos.

Tabla 4: Títulos de IgG en suero específica de F

Título de IgG en suero específica de Fa alumbre MF59 Suero recogido Dosis de proteína (ug) ^{trímero roseta trímero roseta}3wp1 10 20276 36841 10251 22415

1 18341 20802 3712 28610 0,1 2698 6896 1065 8293 2wp2 10 103670 97174 130016 156144

1 142331 102405 177441 299501 0,1 11581 34354 50238 111099 a título medio geométrico para ratas algodoneras Individuales (7-8 por grupo)

El ¡nmunógeno de trímero fue F de VRS-deleción de péptido de fusión-truno

El inmunógeno de roseta fue F de VRS-delp23-furdel-trun, escindido.______

Tabla 4A: Título de virus en pulmón 5 días después de la exposición a VRSa

vacunación Dosis de proteína (ug) Título de virusb ninguna - 822760 trímero/alumbre 10 546

1 636

0,1 903 roseta/alumbre 10 305

1 341

0,1 548 trímero/MF59 10 360

1 301

0,1 456 roseta/MF59 10 244

1 257

0,1 716 aExposición intranasal con 1 x105 unidades formadoras de placa (ufp) de VRS Long

b ufp/gramo de pulmón 5 días después de la exposición

Títulos medios geométricos de 7-8 ratas algodoneras ¡ndlviduales/grupo.

Si un animal individual tenía un título de <203 (límite de detección), se le asignó un título de 100

Tabla 5: Título de neutralización en suero de VRS

Título de neutralización en suero de VRSa alumbre MF59 Suero recogido Dosis de proteína (ng) ^{trímero roseta trímero roseta}3wp1 10 628 1050 578 229

1 208 633 165 205 0,1 57 200 51 65 2wp2 10 3669 4015 3983 3436

1 3369 2844 5728 3940 0J. 744 1902 2414 2093 a Títulos de neutralización de reducción de slncltlos del 60 %

Título medio geométrico para dos conjuntos de 3-4 ratas algodoneras por grupo

Ejemplo 7 - Vacuna de ARN de VRS

Síntesis de ARN

El ADN de plásmido que codifica el replicón de alfavirus (figura 4, SEQ ID NO: 77) sirvió como molde para la síntesis de ARN in vitro. Para estos experimentos, se usó la glucoproteína de fusión de superficie de longitud completa de VRS (F de VRS) (figura 4). Tras la administración de los replicones a células eucariotas, se tradujo el ARN de cadena positiva para producir cuatro proteínas no estructurales, que juntas replicaron el ARN genómico y transcribieron abundantes ARNm subgenómicos que codifican el producto génico heterólogo. Debido a la falta de expresión de las proteínas estructurales del alfavirus, los replicones son incapaces de inducir la generación de partículas Infecciosas. Un promotor de bacteriófago (T7 o SP6) en el sentido de 5’ del ADNc de alfavirus facilita la síntesis del ARN de replicón in vitro y la ribozima del virus de la hepatitis delta (VHD) inmediatamente en el sentido de 3’ de la cola de poll(A) genera el extremo 3’ correcto a través de su actividad de autoesclslón.

Después de la lineallzaclón del ADN del plásmido en el sentido de 5’ de la ribozima del VHD con una endonucleasa de restricción adecuada, se sintetizaron transcritos colaterales in vitro usando ARN pollmerasa dependiente de ADN derivada del bacteriófago T7 o SP6. Las transcripciones se realizaron durante 2 horas a 37 °C en presencia de 7,5 mM (ARN polimerasa de T7) o 5 mM (ARN polimerasa de SP6) de cada uno de los nucleósidos trifosfato (ATP, CTP, GTP y UTP) siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante (Ambion, Austin, TX). Después de la transcripción, se digirió el molde de ADN con ADNasa TURBO (Ambion, Austin, TX). El ARN de replicón se precipitó con LiCI y se reconstituyó en agua libre de nucleasas. Al ARN sin caperuza se le añadió la caperuza postranscripclonalmente con enzima de adición de caperuza de vacclnia (VCE) usando el sistema de adición de caperuza ScriptCap m7G (Epicentre Biotechnologles, Madlson, Wl) tal como se explica resumidamente en el manual de usuario. El ARN con caperuza añadida postranscripclonalmente se precipitó con LiCI y se reconstituyó en agua libre de nucleasas. La concentración de las muestras de ARN se determinó midiendo la densidad óptica a 260 nm. La Integridad de los transcritos in vitro se confirmó mediante electroforesls en gel de agarosa desnaturalizante.

Formulación de nanopartículas lipídicas (liposomas) RV01(01)

Se sintetizó 1,2-dlllnole¡loxi-N,N-d¡met¡l-3-aminopropano (DlinDMA) usando un procedimiento publicado previamente [Heyes, J., Palmer, L., Bremner, K., MacLachlan, I. Cationic lipid saturatlon influences ¡ntracellular delivery of encapsulated nucleic acids. Journal of Controlled Release, 107: 276-287 (2005)]. Se adquirió 1,2-diaestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC) de Genzyme. Se obtuvo colesterol de Sigma-Aldrich (St. Lois, MO). Se obtuvieron 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (sal de amonio) (PEG DMG 2000), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (sal de amonio) de Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL).

Se prepararon disoluciones madre de lípldos recientes en etanol. Se pesaron 37 mg de DlinDMA, 11,8 mg de DSPC, 27,8 mg de colesterol y 8,07 mg de PEG DMG 2000 y se disolvieron en 7,55 mi de etanol. La disolución madre de lípldos recién preparada se agitó suavemente a 37 °C durante aproximadamente 15 minutos para formar una mezcla homogénea. Entonces, se añadieron 755 ni de la disolución madre a 1,245 mi de etanol para producir una disolución madre de lípldos de trabajo de 2 mi. Esta cantidad de lípldo se usó para formar LNP con 250 ng de ARN a una razón de N:P (nitrógeno con respecto a fosfato) de 8:1. El nitrógeno protonable en DlinDMA (el lípido catiónlco) y los fosfatos en el ARN se usan para este cálculo. Se supuso que cada ng de molécula de ARN autorrepllcante contenía 3 nmoles de fosfato aniónico, se supuso que cada ng de DlinDMA contenía 1,6 nmoles de nitrógeno catlónico. También se preparó una disolución de trabajo de 2 mi de ARN a partir de una disolución madre de ~ 1 ng/nl en tampón citrato 100 mM (pH 6) (Teknova, Hollister, CA)). Se enjuagaron tres viales de vidrio de 20 mi (con barras de agitación) con disolución RNase Away (Molecular BioProducts, San Diego, CA) y se lavaron con abundante agua MilliQ antes de su uso para descontaminar los viales de ARNasa. Uno de los viales se usó para la disolución de trabajo de ARN y los otros para recoger las mezclas de lípldos y ARN (tal como se describe a continuación). Las disoluciones de ARN y lípldos de trabajo se calentaron a 37 °C durante 10 minutos antes de cargarlas en jeringas con conexión de Luer de 3 cm3 (BD Medical, Franklin Lakes, NJ). Se cargaron 2 mi de tampón citrato (pH 6) en otra jeringa de 3 cm3. Las jeringas que contenían el ARN y los lípidos se conectaron a una mezcladora en T (PEEK™, unión de DI de 500 nm, Idex Health Science, Oak Harbor, WA) usando tubos de FEP ([etileno-propileno fluorado] de 2 mm de DI x 3 mm de, Idex Health Science, Oak Harbor, WA). La salida de la mezcladora en T también eran tubos de FEP (2 mm de DI x 3 mm). La tercera jeringa que contenía el tampón citrato se conectó a un trozo separado de tubo (2 mm de DI x 3 mm de DE). Entonces, todas las jeringas se accionaron a una velocidad de flujo de 7 ml/min usando una bomba de jeringa (kdScientific, modelo n.e KDS-220, Holllston, MA). Las salidas de los tubos se situaron para recoger las mezclas en un vial de vidrio de 20 mi (mientras se agitaba). Se sacó la barra de agitación y se permitió que la disolución de etanol/acuosa se equilibrara a temperatura ambiente durante 1 hora. Se cargaron 4 mi de la mezcla en una jeringa de 5 cm3 (BD Medical), que estaba conectada a un trozo de tubo de FEP (2 mm de DI x 3 mm de DE, Idex Health Science, Oak Harbor, WA) y en otra jeringa de 5 cm3 conectada a una longitud Igual de tubo de FEP, se cargó una cantidad Igual de tampón citrato 100 mM (pH 6). Las dos jeringas se accionaron a una velocidad de flujo de 7 ml/min usando la bomba de jeringa y se recogió la mezcla final en un vial de vidrio de 20 mi (mientras se agitaba). A continuación, la mezcla recogida de la segunda etapa de mezclado (llposomas) se hizo pasar a través de una membrana Mustang Q (un soporte de Intercambio aniónico que se une a y elimina moléculas aniónicas, obtenido de Pall Corporation, AnnArbor, MI, EE. UU.). Antes de hacer pasar los llposomas, se hicieron pasar sucesivamente a través de la membrana Mustang 4 mi de NaOH 1 M, 4 mi de NaC11 M y 10 mi de tampón citrato 100 mM (pH 6). Los llposomas se calentaron durante 10 minutos a 37 °C antes del paso a través del filtro Mustang. A continuación, los llposomas se concentraron hasta 2 mi y se dializaron frente a 10-15 volúmenes de IX PBS (de Teknova) usando el sistema de filtración de flujo tangencial (TFF) antes de recuperar el producto final. El sistema de TFF y las membranas de filtración de fibras huecas se adquirieron de Spectrum Labs (Rancho Dominguez, CA) y se usaron según las directrices del fabricante. Se usaron membranas de filtración de fibras huecas de pollsulfona (número de pieza P/N: XIAB-100-20P) con un corte de tamaño poro de 100 kD y 8 cm2 de área de superficie. Para experimentos in vitro e in vivo, las formulaciones se diluyeron hasta la concentración de ARN requerida con IX PBS (de Teknova).

Método de preparación de la emulsión catiónica 17 (CNE17)

Se obtuvieron escualeno, trioleato de sorbltán (Span 85) y monooleato de polloxietllensorbltán (Tween 80) de Sigma (St. Louis, MO, EE. UU.). Se adquirió 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP) de Lipoid (Ludwigshafen, Alemania). Se prepararon nanoemulslones catlónicas (CNE) de manera similar al MF59 cargado tal como se describió anteriormente con modificaciones menores, Ott, etal. Journal of Controlled Release, 79 (1 3): 1-5 (2002)). En resumen, los componentes solubles en aceite (es decir, escualeno, Span 85, lípldos catlónicos, tensioactivos lipidíeos) se combinaron en un vaso de precipitados, los componentes lipidíeos se disolvieron en cloroformo (CHCI3) o diclorometano (DCM). La disolución de lípldos resultante se añadió directamente al aceite más Span 85. Se permitió que el disolvente se evaporara a temperatura ambiente durante 2 horas en una campana extractora antes de combinar la fase acuosa y homogenelzar la muestra usando un homogenelzador IKA T25 a 24K RPM con el fin de proporcionar una materia prima homogénea. Las emulsiones primarias se hicieron pasar de tres a cinco veces a través de un homogenelzador Microfluldezer M110S o M110PS con un serpentín de enfriamiento de baño de hielo a una presión de homogenelzaclón de aproximadamente 15 k - 20 k PSI (Microfluidics, Newton, MA). Las muestras de lote de 20 mi se retiraron de la unidad y se almacenaron a 4 °C. La tabla a continuación describe la composición de CNE17.

Tabla 6: Composición de CNE17

Complejación de ARN

Se calculó el número de nitrógenos en disolución a partir de la concentración de lípldos catlónicos, DOTAP, por ejemplo, tiene 1 nitrógeno que puede protonarse por molécula. La concentración de ARN se usó para calcular la cantidad de fosfato en disolución usando una estimación de 3 nmoles de fosfato por microgramo de ARN. Variando la cantidad de ARN:lípido, puede modificarse la razón de N/P. El ARN se complejó con CNE17 a una razón de nitrógeno/fosfato (N/P) de 10:1. Usando estos valores, el ARN se diluyó hasta la concentración adecuada en agua libre de ARNasa y se añadió directamente a un volumen Igual de emulsión mientras se agitaba con vórtex ligeramente. Se permitió que la disolución reposara a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 horas. Una vez complejada, la disolución resultante se diluyó hasta la concentración requerida antes de su administración.

Electroporación

La electroporación fue un método muy eficaz para la administración de vacunas de ADNp y se usó esta técnica para administrar ARN autorrepllcante. Los ratones se anestesiaron con ¡sofluorano, se afeitaron al ras ambas patas traseras para exponer el área de la extremidad que Iba a tratarse. Se Inyectó una dosis de 30 ul de vacuna en el músculo de la pantorrilla de la extremidad posterior usando una jeringa de Insulina de 1/2 cm3. El músculo se sometió a electroporación usando el sistema de administración de ADN Elgen® (Inovio, San Diego). Los parámetros del Instrumento son los siguientes: 60 V, 2 pulsos de 60 ms cada uno. Se administró otra dosis de manera similar a la segunda extremidad, seguido por electroporación.

Partículas de replicón viral (VRP)

Para comparar las vacunas de ARN con los enfoques tradicionales de vectores de ARN para lograr la expresión in vivo de antígenos o genes indicadores, se utilizaron partículas de replicón viral (viral replicón particles, VRP) producidas en células BHK mediante los métodos descritos por Perrl et al. En este sistema, los replicones de antígeno (o gen Indicador) consistían en replicones quiméricos de alfavlrus (VCR) derivados del genoma del virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV) modificados por Ingeniería genética para que contuvieran las secuencias terminales 3’ (UTR 3’) del virus Sindbis y una señal de empaquetamiento (PS) del virus Sindbis (véase la figura 2 de Perri et al.). Estos replicones se empaquetaron en VRP sometiéndolos a electroporación conjunta en células de riñón de cría de hámster (BHK) junto con ARN auxiliares defectuosos que codifican los genes de la cápside y glucoproteína del virus Sindbis (véase la figura 2 de Perri et al.). Entonces, los VRP se recogieron y se titularon mediante métodos convencionales y se Inocularon en animales en fluido de cultivo u otros tampones ¡sotónicos. Perri S, Greer CE, Thudium K, Doe B, Legg H, Liu H, Romero RE, Tang Z, Bin Q, Dubensky TW, Jr. et al. (2003) An alphavlrus replicón partlcle chlmera derived from venezuelan equine encephalltls and sindbis vlruses ¡s a potent gene-based vaccine delivery vector. J Viral 77:10394-10403.

Vacuna de subunidades de trímero de F de VRS

El trímero de F de VRS es una proteína recombinante que comprende el ectodomlnlo de F de VRS con una deleclón de la reglón del péptldo de fusión que Impide la asociación con otros trímeros. El constructo resultante forma un trímero homogéneo, tal como se observa mediante cromatografía de exclusión molecular, y tiene un fenotipo esperado consecuente con una conformación de F de posfusión, tal como se observa mediante microscopía electrónica. La proteína se expresó en células de Insecto y se purificó en virtud de la etiqueta HIS en fusión con el extremo C terminal del constructo seguido por cromatografía de exclusión molecular usando técnicas convencionales. La muestra de proteína resultante presenta una pureza superior al 95%. Para la evaluación in vivo de la vacuna de subunldades de F, se adsorbieron 100 ng/ml de proteína de trímero en 2 mg/ml de alumbre usando tampón histidina 10 mM, pH 6,3 y se ajustó la ¡sotonlcldad con cloruro de sodio hasta 150 mM. La proteína de subunldades de F se adsorbió sobre alumbre durante la noche con agitación suave a 2-8 °C. El pH y la osmolalldad de la vacuna final se fijaron como objetivo a 6,5-7,5 y 240-360 mOsm/kg. La vacuna se caracterizó por la adsorción de proteínas mediante SDS-PAGE (Invitrogen Corporation, EE. UU.) y por el contenido de endotoxinas mediante el ensayo LAL (Charles River Laboratories, EE. UU.). La vacuna se mezcló por inversión suave antes de la Inmunización.

Estudios de inmunogenicidad murinos

Se Inmunizaron grupos de 10 ratones BALB/c hembra de 8-10 semanas de edad y que pesaban aproximadamente 20 gramos el día 0 y el día 21 con tomas de sangre los días 14, 35 y 49. Todos los animales recibieron Inyecciones en el cuádrlceps de las dos patas traseras obteniendo cada una un volumen equivalente (50 ni por sitio) para un total de 100 ni de vacuna para administrar una dosis de antígeno de 10 ng. Cuando se requirió la medición de las respuestas de células T, se recogieron los bazos el día 35 o 49.

Vacunación y exposición de ratas algodoneras

Se obtuvieron ratas algodoneras hembra (Sigmodon hispidis) de Harían Laboratories. Todos los experimentos fueron aprobados y se realizaron según el Comité de Uso y Cuidado de Animales de Novartls. Se Inmunizaron grupos de animales por vía Intramuscular (I.m., 100 n¡) con las vacunas Indicadas los días 0 y 21. Se recogieron muestras de suero 2 semanas después de cada Inmunización. Se expuso a los animales Inmunizados o de control sin vacunar por vía ¡ntranasal (i.n.) con 1x105 UFP de VRS 4 semanas después de la Inmunización final. La recogida de sangre y la exposición a VRS se realizaron bajo anestesia con ¡soflurano al 3 % usando un vaporizador de precisión.

Ensayos de función de células T de ratón

Ensayo de inmunofluorescencia de citocinas intracelulares

Se agruparon de dos a cinco bazos de ratones BALB/c vacunados de manera idéntica y se prepararon suspensiones de células individuales para cultivo. Se establecieron dos cultivos estimulados con antígeno y dos cultivos no estimulados para cada conjunto de esplenocitos. Los cultivos estimulados con antígeno contenían 1 x 106 esplenocitos, péptido F de VRS 85-93 (1 x10'6 M), péptido F de VRS 249-258 (1 x10'6 M), péptido F de VRS 51 66 (1 x 10'6 M), AcM anti-CD28 (1 mcg/ml) y brefeldina A (1:1000). Los cultivos no estimulados no contenían péptidos F de VRS y, por lo demás, eran idénticos a los cultivos estimulados. Después de cultivar durante 6 horas a 37 °C, se procesaron los cultivos para inmunofluorescencia. Se lavaron las células y luego se tiñeron con anticuerpos monoclonales (AcM) anti-CD4 y anti-CD8 marcados con fluorescencia. Se lavaron las células de nuevo y luego se fijaron con Cytofix/cytoperm durante 20 minutos. Entonces, las células fijadas se lavaron con tampón de lavado Perm y luego se tiñeron con AcM marcados con fluorescencia específicos para IFN-g, TNF-a, IL-2 e IL-5. Las células teñidas se lavaron y luego se analizaron en un citómetro de flujo LSR II. Se usó el software FlowJo para analizar los datos adquiridos. Los subconjuntos de células T CD4+8- y CD8+4- se analizaron por separado. Para cada subconjunto en una muestra dada, se determinó el % de células positivas para citocinas. Se calculó el % de células T específicas de antígeno F de VRS como la diferencia entre el % de células positivas para citocinas en los cultivos estimulados con antígeno y el % de células positivas para citocinas en los cultivos no estimulados. Se determinaron los límites de confianza del 95 % para el % de células específicas de antígeno utilizando métodos convencionales (Statistical Methods, 7- edición, G.W. Snedecory W. G. Cochran).

Ensayo de citocinas secretadas

Los cultivos para el ensayo de citocinas secretadas fueron similares a los del ensayo de Inmunofluorescencia de citocinas intracelulares excepto porque se omitió la brefeldina A. Se recogieron los sobrenadantes de cultivo después de un cultivo durante la noche a 37 °C y se analizaron para detectar múltiples citocinas utilizando kits de citocinas Th1/Th2 de ratón de Meso Scale Discovery. Se determinó la cantidad de cada citocina por cultivo a partir de curvas patrón producidas usando citocinas recombinantes purificadas suministradas por el fabricante.

ELISA específico de F de VRS

Se sometieron a ensayo muestras de suero Individuales para detectar la presencia de IgG específica de F de VRS mediante ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA). Se recubrieron placas de ELISA (MaxiSorp de 96 pocilios, Nunc) durante la noche a 4 °C con F de VRS purificado 1 ug/ml (delp23-furdel-trunc no escindido) en PBS. Después del lavado (PBS con Tween-20 al 0,1 %), se bloquearon las placas con tampón de bloqueo Superblock en PBS (Thermo Scientific) durante al menos 1,5 horas a 37 °C. Entonces, se lavaron las placas, se añadieron diluciones en serie de suero en diluyente de ensayo (PBS con Tween-20 al 0,1 % y suero de cabra al 5 %) de ratas algodoneras experimentales o de control, y se incubaron las placas durante 2 horas a 37 °C. Después del lavado, se incubaron las placas con IgG de pollo anti-rata algodonera conjugada con peroxldasa del rábano (HRP) (Immunology Consultants Laboratory, Inc, diluida 1:5.000 en diluyente de ensayo) durante 1 hora a 37 °C. Finalmente, se lavaron las placas y se añadieron a cada pocilio 100 ul de disolución de sustrato de peroxldasa TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc). Las reacciones se detuvieron mediante la adición de 100 ni de H3PO4 1 M, y se leyó la absorbancia a 450 nm usando un lector de placas. Para cada muestra de suero, se generó un gráfico de densidad óptica (DO) frente al logaritmo de la dilución de suero inversa mediante regresión no lineal (GraphPad Prism). Los títulos se definieron como la dilución de suero inversa a una DO de aproximadamente 0,5 (normalizada a un patrón, sueros agrupados de ratas algodoneras infectadas con VRS con un título definido de 1:2500, que se incluyó en cada placa).

Ensayo de microneutralización

Se sometieron a prueba muestras de suero para detectar la presencia de anticuerpos neutralizantes mediante una prueba de neutralización de reducción de placas (PRNT). Se añadieron diluciones en serle de dos veces de suero Hl (en PBS con el 5 % de HI-FBS) a un volumen Igual de VRS Long titulado previamente para dar aproximadamente 115 UFP/25 ni. Se incubaron mezclas de suero/virus durante 2 horas a 37 °C y el 5 % de C02 para permitir que se produjera la neutralización del virus y luego se inocularon 25 ni de esta mezcla (que contenía aproximadamente 115 UFP) en pocilios duplicados de células HEp-2 en placas de 96 pocilios. Después de 2 horas a 37 °C y el 5 % de C02, se recubrieron las células con metilcelulosa al 0,75 %/EMEM el 5% de HI-FBS y se incubaron durante 42 horas. Se determinó el número de partículas de virus infecciosas mediante la detección de la formación de sincitios mediante ¡nmunotinción seguido por recuento automático. El título de neutralización se define como el Inverso de la dilución de suero que produce una reducción de al menos el 60 % en el número de sincitios por pocilio, en relación con los controles (sin suero).

Carga viral

Se determinó la carga viral en el pulmón mediante ensayo de placas. Específicamente, se recogieron los pulmones 5 días después de la infección con VRS y se colocó un lóbulo derecho en 2,5 mi de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Invitrogen) con sacarosa al 25% y se rompió con un homogeneizador de tejidos. Los sobrenadantes libres de células de estas muestras se almacenaron a -80 °C. Para el ensayo de virus Infeccioso, se Inocularon diluciones de homogenelzado de pulmón clarificado (en PBS con el 5 % de suero bovino fetal inactivado con calor, HI-FBS) en monocapas de células HEp-2 confluentes en un volumen de 200 nl/pocillo de una placa de 12 pocilios. Después de 2 horas con agitación suave periódica (37 °C, el 5 % CO2), se retiró el ¡nóculo y se recubrieron las células con 1,5 mi de agarosa SeaPlaque al 1,25 % (Lonza) en medio esencial mínimo de Eagle (EMEM, Lonza) suplementado con el 5 % de HI-FBS, glutamina y antibióticos. Después de 3-4 días de incubación, se recubrieron las células de nuevo con 1 mi de agarosa al 1,25 % en EMEM (Slgma) que contenía rojo neutro al 0,1 % (Slgma). Las placas se contaron un día después con la ayuda de una caja de luz.

Patología pulmonar de ratas algodoneras

Cinco días después de la exposición a VRS, se recogieron los pulmones y se recogieron 4 lóbulos de cada animal y se fijaron con formallna tamponada neutra (NBF) al 10 % mediante Instilación intratraqueal suave seguido por fijación por inmersión. Los tejidos se procesaron de manera rutinaria para preparar secciones teñidas con hematoxilina y eosina para el examen microscópico. Los hallazgos se evaluaron usando una modificación de los criterios publicados previamente [Prince GA, et al., 2001] para los siguientes parámetros: peribronqulolltls, alveolltls, bronquitis, Infiltrados celulares perivasculares y neumonitis intersticial. Las lesiones se clasificaron en una escala semicuantltatlva de 4 puntos. El cambio mínimo (+) contenía uno o unos pocos focos pequeños; el cambio leve (++) estaba compuesto por focos de tamaño pequeño a medio; el cambio moderado (+++) contenía focos frecuentes y/o de tamaño moderado; y el cambio marcado (++++) mostró focos extensos a confluentes que afectaban a la mayoría/todo el tejido.

Ejemplo 7

A - Estudio de exposición a VRS de ratas algodoneras (CRIS14)

El replicón A317, que expresa la glucoproteína de fusión de superficie de VRS (F de VRS), se usó para este experimento. A ratas algodoneras (Sigmodon hispidus), 8 animales por grupo, se les administraron vacunaciones Intramusculares bilaterales (50 ni por pata) los días 0 y 21 con ARN autorrepllcante desnudo (A317,1 n9 o 10 ng), ARN autorreplicante formulado en LNP [RV01(01), A317, 0,1 ng o 1 n9), VRP (5x106 Ul) que expresan F de VRS, subunidad de trímero de F/alumbre (10 ng) o vacuna de VRS inactivado con formalina (5200 ufp de Fl). Se recogió suero para el análisis de anticuerpos los días 14 (2wp1) y 35 (2wp2). Se expuso a todos los animales con 1x105 ufp de VRS por vía ¡ntranasal el día 49 y se recogieron los pulmones el día 54 (5dpc) para determinación de la carga viral y la patología pulmonar.

Resultados

Tabla 7: Títulos de IgG en suero específica de F el día 14 y 35

Tabla 7. Títulos de IgG en suero específica de F de ratas algodoneras (Sigmodon hispidus), 8 animales por grupo, después de vacunaciones Intramusculares los días 0 y 21. Se recogió suero para el análisis de anticuerpos los días 14 (2wp1) y 35 (2wp2), se expuso a todos los animales con 1x105 ufp de VRS por vía ¡ntranasal el día 49. Se recogieron los pulmones el día 54 (5dpc) para la determinación de la carga viral y la patología pulmonar. Los datos se representan como títulos medios geométricos de 8 ratas algodoneras individuales por grupo. SI un animal RV0

RV0

VRP

Trím

FI-V

ning

Tabla 10. Alveolitis pulmonar 5 días tras la exposición a VRS de ratas algodoneras (Sigmodon hispidus), 8 animales por grupo, después de vacunaciones Intramusculares los días 0 y 21. Se expuso a todos los animales con 1 x105 ufp de VRS por vía ¡ntranasal el día 49. Se recogieron los pulmones el día 54 (5dpc) para la determinación de la carga viral y la patología pulmonar. Se clasificaron las lesiones en una escala semlcuantltatlva de 4 puntos. El cambio mínimo (1) contenía uno o unos pocos focos pequeños; el cambio leve (2) estaba compuesto por focos de tamaño pequeño a medio; el cambio moderado (3) contenía focos frecuentes y/o de tamaño moderado; y el cambio marcado (4) mostró focos extensos a confluentes que afectaban a la mayoría/todo el tejido.

Conclusiones

Uno objetivo de este estudio fue determinar la ¡nmunogenlcldad y la capacidad protectora del ARN de replicón en el modelo de VRS de rata algodonera. Otro objetivo fue evaluar el efecto de las formulaciones de llposomas y CNE17 sobre la ¡nmunogenlcldad y eficacia de la vacuna. El ARN de replicón no formulado Indujo anticuerpos neutralizantes de VRS e IgG específica de F en suero después de una vacunación, y esta respuesta se reforzó mediante una segunda vacunación. Las formulaciones de llposomas y CNE17 fueron Igualmente eficaces en este modelo, reforzando los títulos de IgG específica de F a 1 ng de ARN de replicón aproximadamente 8 veces y los títulos de neutralización en 4-10 veces (CNE17 y llposomas, respectivamente) después de la segunda vacunación. Todas las vacunas de ARN de replicón proporcionaron protección frente a una exposición nasal a VRS, reduciendo la carga viral pulmonar en más de 3 órdenes de magnitud cuando se midió 5 días más tarde. La magnitud y la capacidad protectora de la respuesta ¡nmunltarla generada por 1 ug de ARN de replicón formulado con llposomas estuvo dentro de dos veces la respuesta provocada por 5x106 VRP. La subunidad de trímero con adyuvante de alumbre provocó los títulos de ELISA de IgG antl-F totales más altos, provocó los títulos de neutralización más altos y provocó el grado más alto de protección frente a los títulos de VRS en el pulmón con la exposición de cualquiera de las preparaciones de vacuna sometidas a prueba en este estudio.

Ejemplo 7B - Estudio de inmunogenicidad de F de VRS (10-1001)

El replicón A317, que expresa la glucoproteína de fusión de superficie de VRS (F de VRS), se usó para este experimento. A ratones BALB/c, 10 animales por grupo, se les administraron vacunaciones Intramusculares bilaterales (50 n¡ por pata) los días 0 y 21 con VRP que expresan F de VRS (1x106 Ul), ARN autorreplicante desnudo (A317, 1 ng), ARN autorreplicante administrado usando electroporación (A317, 10 ng), ARN autorreplicante formulado en liposomas [RV01(01), A317, 0,1 ng o 1 ng) y ARN autorreplicante formulado con CNE17 (A317, 0,1 ng o 1 ng). Se recogió suero para el análisis de anticuerpos los días 14 (2wp1), 35 (2wp2) y 49 (4wp2). Se recogieron los bazos de 5 ratones por grupo el día 49 (4wp2) para el análisis de células T.

Resultados

Tabla 11: Títulos de IgG en suero específica de F el día 14

GMT

1980

13731

15903

2398

3590

1180

6685

Tabla 11. (10-1001) Títulos de IgG en suero específica de F de ratones, 10 animales por grupo, 14 días después de la vacunación Intramuscular. Los datos se representan como títulos para ratones Individuales y los títulos medios geométricos de 10 ratones Individuales por grupo. SI un animal Individual tenía un título de <25 (límite de detección), se le asignó un título de 5.

Tabla 12: Títulos de IgG en suero específica de F el día 35

Tabla 12. (10-1001) Títulos de IgG en suero específica de F de ratones, 10 animales por grupo, después de vacunaciones Intramusculares los días 0 y 21. Se recogió suero para el análisis de anticuerpos el día 35 (2wp2). Los datos se representan como títulos para ratones Individuales y los títulos medios geométricos de 10 ratones Individuales por grupo. SI un animal Individual tenía un título de <25 (límite de detección), se le asignó un título de 5.

Tabla 13: Títulos de IgG en suero específica de F el día 49

Tabla 13. (10-1001) Títulos de IgG en suero específica de F de ratones, 10 animales por grupo, después de vacunaciones Intramusculares los días 0 y 21. Se recogió suero para el análisis de anticuerpos los días 49 (4wp2). Los datos se representan como títulos para ratones Individuales y los títulos medios geométricos de 10 ratones Individuales por grupo. SI un animal Individual tenía un título de <25 (límite de detección), se le asignó un título de 5.

Tabla 14: Títulos de neutralización en suero de VRS el día 35

A317, 1 ng RV01(01) 0,1 ng RV01(01) 1 ng CNE170,1 ng CNE171 ng VRP 1E6UI

2wp2 2wp2 2wp2 2wp2 2wp2 2wp2

Tabla 14: (10-1001) Títulos de neutralización en suero de VRS de ratones, 10 animales por grupo, después de vacunaciones Intramusculares los días 0 y 21. Se recogió suero para el análisis el día 35 (2wp2). Los datos se representan como títulos de neutralización de reducción de placas del 60 % de ratones Individuales y el título medio geométrico de 10 ratones Individuales por grupo. SI un animal Individual tenía un título de <40 (límite de detección), se le asignó un título de 20. NA = no sometido a ensayo.

Tabla 15: Títulos de neutralización en suero de VRS el día 49

Tabla 15: (10-1001) Títulos de neutralización en suero de VRS de ratones, 10 animales por grupo, después de vacunaciones Intramusculares los días 0 y 21. Se recogió suero para el análisis el día 49 (4wp2). Los datos se representan como títulos de neutralización de reducción de placas del 60 % de ratones Individuales y el título medio geométrico de 10 ratones Individuales por grupo. SI un animal Individual tenía un título de <40 (límite de detección), se le asignó un título de 20. NA = no sometido a ensayo.

Table 16: T respuestas celulares el día 49

ninguna

0,04 ± 0,06

0,00 ±0,05

0,00 ± 0,02

0,00 ± 0,01

Tabla 16. (10-1001) Frecuencias de células T esplénicas CD4+ específicas de F de VRS el día 49 (4wp2). Se muestra la frecuencia neta positiva para atocinas (específicas de antígeno) (%) ± semi-intervalo de confianza del 95 %. Las frecuencias netas mostradas en negrita Indican respuestas estimuladas que eran de manera estadísticamente significativa > 0.

Tabla 17: Respuestas de células T el día 49

Tabla 17. (10-1001) Frecuencias de células T esplénicas CD8+ específicas de F de VRS el día 49 (4wp2). Se muestra la frecuencia neta positiva para atocinas (específicas de antígeno) (%) ± semi-intervalo de confianza del 95 %. Las frecuencias netas mostradas en negrita Indican respuestas estimuladas que eran de manera estadísticamente significativa > 0.

Conclusiones

La formulación de llposomas mejoró significativamente la ¡nmunogenlcldad, tal como se determinó por el aumento de los títulos de IgG específica de F (aumento de 8-30 veces), los títulos de neutralización y las respuestas de células T CD4 y CD8, en relación con el control de ARN desnudo. Sorprendentemente, los títulos de IgG específica de F y los títulos de neutralización para RV01(01) a ambas dosis de 0,1 y 1,0 ng fueron equivalentes a la VRP (1x106 Ul). Las respuestas de células T para la formulación de LNP fueron equivalentes a la dosis más alta de VRP (1 x 106 Ul). La formulación del ARN autorrepllcante con CNE17 mejoró significativamente la ¡nmunogenlcldad, tal como se determinó por el aumento de los títulos de IgG específica de F (aumento de 2-5 veces), los títulos de neutralización y las respuestas de células T CD4 y CD8, en relación con el control de ARN desnudo. La electroporaclón del ARN mejoró la ¡nmunogenlcldad en relación con el control de ARN desnudo, pero fue significativamente menor que la administración de llposomas.

Ejemplo 7C - Estudio de inmunogenicidad de F de VRS (10-1018)

El replicón A317, que expresa la glucoproteína de fusión de superficie de VRS (F de VRS), se usó para este experimento. A ratones BALB/c, 8 animales por grupo, se les administraron vacunaciones Intramusculares bilaterales (50 n¡ por pata) los días 0 y 21 con VRP que expresan F de VRS (1x106 Ul), ARN autorreplicante desnudo (A306, 1, 0,1, 0,01 nfl) y ARN autorreplicante formulado en liposomas (RV01(01) usando el método 1 (A317, 10,0, 1,0, 0,1,0,01 ng). Se recogió suero para el análisis de anticuerpos los días 14 (2wp1) y (2wp2). Se recogieron los bazos 5 ratones por grupo el día 49 (4wp2) para el análisis de células T.

Resultados

La formulación de liposomas RV01(01) tenía un diámetro de partícula promedio Z de 158 nm con un índice de polldlspersldad de 0,14, la eficiencia de encapsulaclón era del 96 %. En las tablas 18 y 19 se muestran los títulos de IgG en suero específica de F el día 14 y 35 y en las tablas 20 y 21 se muestran las respuestas de células T el día 49.

Tabla 18: Títulos de IgG en suero específica de F el día 14 y 35

Tabla 18: (10-1018) Títulos de IgG en suero específica de F de ratones, 8 animales por grupo, después de vacunaciones Intramusculares los días 0 y 21. Se recogió suero para el análisis de anticuerpos los días 14 (2wp1) y 35 (2wp2). Los datos se representan como ratones Individuales y los títulos medio geométricos de 8 ratas algodoneras Individuales por grupo. SI un animal Individual tenía un título de <25 (límite de detección) se le asignó un título de 5.

Tabla 19: Títulos de IgG en suero específica de F el día 14 y 35

Tabla 19: Continuación de 23A. (10-1018) Títulos de IgG en suero específica de F de ratones, 8 animales por grupo, después de vacunaciones Intramusculares los días 0 y 21. Se recogió suero para el análisis de anticuerpos los días 14 (2wp1) y 35 (2wp2). Los datos se representan como animales Individuales y los títulos medios geométricos (GMT) de 8 ratas algodoneras Individuales por grupo. SI un animal Individual tenía un título de <25 (límite de detección) se le asignó un título de 5.

Tabla 20: Respuestas de células T el día 49

Tabla 20. Frecuencias de células T esplénicas CD4+ específicas de F de VRS el día 49 (Expt. 10-1018,4wp2). Se muestra la frecuencia neta positiva para atocinas (específicas de antígeno) (%) ± semi-intervalo de confianza del 95 %. Las frecuencias netas mostradas en negrita Indican respuestas estimuladas que eran de manera estadísticamente significativa > 0.

Tabla 21: Respuestas de células T el día 49

Tabla 21. Frecuencias de células T CD8+ esplénicas específicas de F el día 49 (Expt. 10-1018,4wp2). Se muestra la frecuencia neta positiva para atocinas (específicas de antígeno) (%) ± semi-intervalo de confianza del 95 %. Las frecuencias netas mostradas en negrita Indican respuestas estimuladas que eran de manera estadísticamente significativa > 0.

Conclusiones

La formulación de llposomas mejoró significativamente la ¡nmunogenlcldad, tal como se determinó por el aumento de los títulos de IgG específica de F y las frecuencias de células T, en relación con los controles de ARN desnudo. Los títulos de IgG específica de F y las frecuencias de células T CD8 para RV01(01) a la dosis de 10 ng de ARN mejoraron en relación con el grupo de VRP (1x106 Ul).

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Polipéptido F de virus respiratorio sincitial (F de VRS) recombinante soluble en forma de un trímero que comprende un primer dominio y un segundo dominio, en el que (i) el primer dominio comprende el ectodominio de proteína F de VRS en su totalidad o en parte, y (ii) el segundo dominio comprende un dominio de oligomerlzación heterólogo que es la secuencia de trlmerlzación de fibrltina de bacteriófago T4 (“foldon”),

en el que el ectodominio de F de VRS en su totalidad o en parte comprende:

a) los aminoácidos 22-525 de SEQ ID NO: 1;

b) los aminoácidos 23-525 de SEQ ID NO: 2; o

2. F de VRS recombinante soluble según la reivindicación 1, en el que los aminoácidos 110-136 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 están ausentes del ectodominio de F de VRS.

3. F de VRS recombinante soluble según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el dominio de oligomerización heterólogo es la secuencia de trimerización de fibritina de bacteriófago T4 (“foldon”) representada por SEQ ID NO: 19.

4. F de VRS recombinante soluble de las reivindicaciones 1-3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:

17; o la secuencia de SEQ ID NO: 18.

5. F de VRS recombinante soluble de cualquier reivindicación anterior seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 y cualquiera de las secuencias anteriores en las que el péptido señal y/o la etiqueta HIS se omiten.

6. Ácido nucleico aislado que codifica el F de VRS recombinante soluble según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -5.

7. Composición ¡nmunogénlca que comprende el F de VRS recombinante soluble según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -5.

8. Composición ¡nmunogénlca según la reivindicación 7, que comprende además un adyuvante.

9. Composición ¡nmunogénica según la reivindicación 8, en la que el adyuvante se selecciona del grupo que consiste en: una sal de aluminio, una emulsión de escualeno en agua, un compuesto de benzonaftiridina, un compuesto de fosfolípido, un ¡nmunopotenciador de molécula pequeña y combinaciones de cualquiera de los anteriores.

10. Composición ¡nmunogénica según una cualquiera de las reivindicaciones 7-9 para su uso en la inmunización de un paciente contra la infección con VRS.