DE102013004595A1 - RSV-Impfstoffe - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich, unter anderem, auf Respiratorisches-Synzytial-Virus(RSV)-Proteine, modifizierte RSV-Proteine und Nukleinsäuren und Vektoren, die eines oder mehrere davon kodieren. Die Erfindung stellt auch Zusammensetzungen, einschließlich immunogene Zusammensetzungen, pharmazeutische Zusammensetzungen und Impfstoffe bereit. Die Zusammensetzungen, Nukleinsäuren, Vektoren, und Polypeptide der Erfindung können verwendet werden, eine Immunantwort auf RSV oder ein RSV Protein(e) auszulösen und/oder eine RSV-Infektion in einem Tier zu behandeln oder zu inhibieren.

Description

• Gebiet der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung bezieht sich, unter anderem, auf modifizierte RSV-Polypeptide, Nukleinsäuren und Vektoren, die sie kodieren, verwandte immunogene Zusammensetzungen und RSV-Impfstoffe.
• Dazugehöriges Sequenzprotokoll
• Der Inhalt der Textdatei (Name: „Sequence_Listing.txt", Größe: 50.000 Byte; Erstellungsdatum: 15. März, 2013), die hiermit elektronisch eingereicht wird, ist hiermit in seiner Gesamtheit Bestandteil der Anmeldung.
• Hintergrund der Erfindung
• Krankheit, die durch Respiratorisches-Synzytial-Virus(RSV)-Infektion ausgelöst wird, ist nicht nur für Kleinkinder sondern auch für Kinder bis zum Alter von 5 und für ältere Menschen eine ernstzunehmende Angelegenheit. Die wissenschaftliche Gemeinde hat während der letzten fünfzig Jahre versucht, einen sicheren wirksamen RSV-Impfstoff zu entwickeln, jedoch gibt es immer noch keinen RSV-Impfstoff, welcher zugelassen worden ist. Tatsächlich prädisponierte ein RSV-Impfstoff Kinder zu einer verstärkten RSV-Krankheit nach einer späteren Infektion mit RSV.
• RSV umfasst ein F-Protein an der Oberfläche des viralen Partikels, welches die Fusion der viralen Membran und der zellulären Membran vermittelt. Expression des F-Proteins durch RSV-infizierte Zellen führt dazu dass das F-Protein an der Oberfläche der infizierten Zelle exprimiert wird, wo es die Fusion zwischen den zellulären Membranen angrenzender Zellen induziert, was Synzytien zur Folge hat.
• Das RSV-Fusions(F)-Protein wird zunächst als inaktiver Vorläufer (F0) synthetisiert, welcher vor dem Transport durch den Sekretionsweg Oligomerisierung durchlauft. F0 wird durch proteolytische Spaltung in die disulfidverbundenen F1- und F2-Untereinheiten prozessiert, wodurch die reife und aktive Form des Fusionsproteins (F2s-sF1) produziert wird. Die vorhandenen Anhaltspunkte lassen darauf schließen, dass diese Spaltung während des Transports in dem Trans-Golgi durch eine Wirtszellprotease geschieht. Eine mehrbasische Aminosäuresequenz (Lys-Lys-Arg-Lys-Arg-Arg) ist zwischen diesen Sequenzen in F0 angeordnet, die schließlich die F1- und F2-Domänen im reifen Protein bilden. Diese Sequenz bildet eine Furinschnittstelle. Die Proteaseschnittstelle ist direkt proximal eines Abschnittes von hydrophoben Resten angeordnet, welche die N-terminalen 26 Aminosäurereste der F1-Domäne bilden. Die proteolytische Spaltung von F0 erzeugt daher den hydrophoben N-Terminus der F1-Untereinheit, welcher vermutlich durch Virus-vermittelte Fusion in die Zielmembran inseriert wird. Die proteolytische Aktivierung des F-Proteins ist ein wesentliches Merkmal dieses Prozesses.
• Ein humanisierter Antikörper gegen RSV F-Protein wird zur Prophylaxe gegen RSV-Infektion oder zum Reduzieren ernsthafter Krankheit bei Kleinkindern verabreicht, allerdings sind die Kosten monatlicher Verabreichung relativ hoch. Daher gibt es ein starkes Bedürfnis nach einem wirksamen RSV-Impfstoff.
• Zitierung und Diskussion einer Referenz hierin soll nicht als ein Zugeständnis ausgelegt werden, dass diese Stand der Technik für die vorliegende Erfindung ist.
• Zusammenfassung der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf, unter anderem, Proteine des Respiratorisches-Synzytial-Virus (RSV), modifizierte RSV-Proteine und Nukleinsäuren und Vektoren, die eine oder mehrere davon kodieren. Die Erfindung stellt auch Zusammensetzungen, einschließlich immunogener Zusammensetzungen, pharmazeutischer Zusammensetzungen und Impfstoffe, dar. Die Zusammensetzungen, Nukleinsäuren, Vektoren und Polypeptide der Erfindung können genutzt werden, um eine Immunantwort gegen RSV oder ein RSV Protein(e) zu induzieren und/oder eine RSV-Infektion in einem Tier zu behandeln oder zu inhibieren.
• Einige Ausführungsformen der Erfindung schließen ein modifiziertes F-Protein des Respiratorisches-Synzytial-Virus (RSV) ein, wobei das F-Protein modifiziert ist, um Fusionsaktivität zu reduzieren. Einige Ausführungsformen der Erfindung schließen ein modifiziertes RSV-Anheftungs-G-Protein ein, z. B. ein Fragment davon.
• In einigen Ausführungsformen ist das RSV-F-Protein modifiziert worden, um die Fusionsaktivität verglichen mit einem nativen RSV-F-Protein zu reduzieren. Ein modifiziertes RSV-F-Protein kann eine Deletion mindestens eines Teils der Fusionspeptid-Domäne umfassen. In einigen Ausführungsformen umfasst eine Deletion der Fusionspeptid-Domäne eine Deletion, die den Aminosäuren 137–145, 137–146 oder 137–155 von SEQ ID NO: 11 entspricht. In einigen Ausführungsformen umfasst ein modifiziertes RSV-F-Protein eine Deletion mindestens eines Teils der zytoplasmatischen Domäne, Transmembran-Domäne, Fusionsprotein oder beiden, die mit oder ohne eine Deletion mindestens eines Teils des Fusionsproteins sein können. In einigen Ausführungsformen kann eine Deletion der zytoplasmatischen Domäne oder Transmembran-Domäne eine Deletion umfassen, die den Aminosäuren 525–573 von SEQ ID NO: 11 entspricht.
• Einige Ausführungsformen der Erfindung stellen Nukleinsäuren und Vektoren bereit, die eine kodierenden Region für ein modifiziertes RSV-F-Protein umfassen. In einigen Ausführungsformen ist die kodierende Region für das modifizierte RSV-F-Protein operativ mit einem Vaccinia-H5-Promotor oder einem Vaccinia-p7.5-Promotor verbunden.
• Die Erfindung schließt auch Nukleinsäuren und Vektoren ein, die eine kodierende Region für mindestens einen Teil des RSV-Anheftungs-G-Proteins umfassen, und in einigen Ausführungsformen umfasst diese Nukleinsäure oder dieser Vektor weiter eine kodierende Region für ein modifiziertes RSV-F-Protein. Einige Ausführungsformen der Erfindung verwenden mindestens einen Teil eines RSV-Anheftungs-G-Proteins, welches eine Sequenz umfasst, die den Aminosäuren 2–101, 10–77 oder 45–58 von SEQ ID NO: 6 entspricht.
• Die Erfindung schließt auch immunogene Zusammensetzungen und pharmazeutische Zusammensetzungen, zum Beispiel, umfassend eine Nukleinsäure, einen Vektor, ein Protein (z. B. ein modifiziertes RSV-Protein) und/oder eine Zusammensetzung der Erfindung ein.
• Zusätzlich schließt die Erfindung Verfahren zum Induzieren einer Immunantwort zu einem RSV-Protein oder viraler RSV-Partikel und Verfahren zum Inhibieren von RSV-Krankheit in einem Tier ein, die die Verabreichung einer Nukleinsäure, eines Vektors, eines Proteins und/oder einer Zusammensetzung der Erfindung umfasst. In einigen Ausführungsformen wird die Verabreichung auf einem Weg ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus intravenösem, subkutanem, intradermalem, intramuskulärem oder intranasalem Weg. In einigen Ausführungsformen findet die Verabreichung an eine Maus, einen Primat, oder einen Mensch statt.
• Die Erfindung schließt auch Zellen ein, die eine Nukleinsäure oder einen Vektor, wie einen viralen Vektor, umfassen.
• Diese Zusammenfassung der Erfindung beschreibt nicht notwendigerweise alle Merkmale oder notwendigen Merkmale der Erfindung. Die Erfindung kann sich auch in einer Unterkombination der beschriebenen Merkmale befinden.
• Kurze Beschreibung der Zeichnungen
• Zum Zweck der bildlichen Darstellung der Erfindung sind in den Zeichnungen bestimmte Ausführungsformen der Erfindung dargestellt. Allerdings ist die Erfindung nicht auf die präzisen Anordnungen und Instrumentalisierungen der Ausführungsformen, die in den Zeichnungen dargestellt werden, beschränkt.
• 1A und 1B stellen verschiedene kodierende Regionen dar, welche zum Exprimieren von RSV-Proteinen konstruiert wurden. H5 ist ein relativ starker Promotor und p7.5 ist ein relativ schwacher Promotor, beide aus Vaccinia-Virus. TM ist die Transmembran-Domäne eines RSV-F-Proteins. CT ist der zytoplasmatische Schwanz/Domäne eines RSV-F-Proteins. FP ist ein RSV-F-Protein-Fusionspeptid. G2NA ist eine konservierte Domäne des RSV-A-G-Proteins (z. B. Aminosäuren 130–230). F1 und F2 sind ihre entsprechenden Domänen in einem RSV-F-Protein.
• 2A, 2B und 2C sind schematische Darstellungen der Vektoren vEM132, vEM134 beziehungsweise vEM138. Flank1/2 Del3 = 3'- und 5'-flankierende Sequenzen der modifizierten Vaccinia-Virus-Ankara(MVA)-Deletion-III-Insertionsstelle; Azami-Green (MBL International, Massachusetts) ist eine kodierende Region des grün-fluoreszierenden Proteins, welches in der Detektion rekombinanter MVA verwendet wird; BsdR ist ein Blasticidinresistenzgen, um rekombinante MVA zu selektieren; F-Protein ist ein F-Protein kodierendes Gen, Fla...at ist eine Wiederholung des 3'-Endes von Flank 1 zur Deletion der Selektion und Reporterkassette nach Isolierung der rekombinanten MVA.
• 3A und 3B zeigen Expressionsanalyse durch ELISA für die mEM60–67 basierten viralen MVA-Vektoren von den Zelllysaten beziehungsweise dem Überstand.
• Kurze Beschreibung der Sequenzen
• SEQ ID NO: 1 mEM85 und mEM87 Δ137–145 Fusionspeptid mit TM-CT
• SEQ ID NO: 2 mEM85 & mEM87 Δ137–145 Fusionspeptid mit TM-CT
• SEQ ID NO: 3 mEM86 und mEM88 Δ137–145 Fusionspeptid kein TM-CT
• SEQ ID NO: 4 mEM86 und mEM88 Δ137–145 Fusionspeptid kein TM-CT
• SEQ ID NO: 5 mEM64, mEM66, mEM87 und mEM88 DNA-Sequenz konserviert RAGP w/N-Met
• SEQ ID NO: 6 mEM64, mEM66, mEM87 und mEM88 konserviert RAGP w/N-Met
• SEQ ID NO: 7 ein p7.5-Promotor
• SEQ ID NO: 8 ein H5-Promotor
• SEQ ID NO: 9 Fwd-Primer
• SEQ ID NO: 10 Rev-Primer
• SEQ ID NO: 11 RSV-F-Protein
• SEQ ID NO: 12 mEM60 DNA-Sequenz F-Protein
• SEQ ID NO: 13 mEM60 Aminosäuresequenz F-Protein
• SEQ ID NO: 14 mEM61 DNA-Sequenz F-Protein
• SEQ ID NO: 15 mEM61 Aminosäuresequenz F-Protein
• SEQ ID NO: 16 mEM62, mEM65 & mEM66 DNA-Sequenz F-Protein
• SEQ ID NO: 17 mEM62, mEM65 & mEM66 Aminosäuresequenz F-Protein
• SEQ ID NO: 18 mEM63, mEM64 & mEM67 DNA-Sequenz F-Protein
• SEQ ID NO: 19 mEM63, mEM64 & mEM67 Aminosäuresequenz F-Protein
• Detaillierte Beschreibung
• Wie hierin verwendet ist der Übergangsbegriff „umfassend” offen. Ein Anspruch, der diesen Begriff verwendet, kann Elemente zusätzlich zu denen, die in einem solchen Anspruch aufgezählt werden, beinhalten. Deshalb können zum Beispiel die Ansprüche auf Verfahren gelesen werden, welche auch andere Schritte einschließen, die nicht spezifisch darin aufgezählt werden, solange die aufgezählten Elemente oder deren Äquivalente präsent sind.
• Eine Liste von Elementen die durch „und/oder” verbunden sind bedeutet, dass jedes jener Elemente eingeschlossen sein kann, alle dieser Elemente eingeschlossen sein können oder irgendeine Untermenge der Elemente eingeschlossen sein kann. Zum Beispiel würde eine Liste von 3 Elementen, die durch und/oder verbunden sind, 1, 3 oder irgendeine der Kombinationen von zwei Elementen einschließen.
• Es wird erwogen, dass irgendein hierin beschriebenes Verfahren oder Zusammensetzung in Bezug auf irgendein hierin beschriebenes anderes Verfahren oder Zusammensetzung implementiert werden kann. Die Verwendung des Wortes „ein” oder „eine” kann „eins” bedeutet, wenn es in Verbindung mit dem Begriff „umfassend” in den Ansprüchen und/oder der Beschreibung verwendet wird, aber es ist auch konsistent mit der Bedeutung von „ein oder mehr”, „mindestens ein”, und „ein oder mehr als ein”. Die Verwendung des Begriffs/Ausdrucks „und/oder” bedeutet, wenn er mit einer Liste verwendet wird, dass einer oder mehrere der angeführten Gegenstände verwendet werden können, z. B. ist er nicht auf einen oder alle der Gegenstände beschränkt.
• Der Begriff „entspricht” oder „entsprechend” bezieht sich, wenn sich auf eine Aminosäure(n) oder -sequenz in einem bestimmten Protein bezogen wird, auf die bestimmte(n) Aminosäure(n) in diesem bestimmten Protein und auch auf eine Aminosäure(n) in einem verwandten oder ähnlichen Protein, welches eine ähnliche Funktion wie das bestimmte Protein bereitstellt und/oder in einer ähnlichen Position lokalisiert ist. Zum Beispiel kann festgestellt werden, dass eine Aminosäure(n) in einem RSV-F-Protein von einem RSV-A-Typ-Virus einer Aminosäure(n) in einem RSV-F-Protein von einem RSV-B-Typ-Virus entspricht, was zum Beispiel durch Alignieren der Aminosäuresequenzen festgestellt wird. Zum Beispiel kann ein Fachmann zwei oder mehrere miteinander verwandte Sequenzen alignieren, um entsprechende Aminosäuren zu bestimmen, z. B. durch Verwenden eines BLAST-Programms. Außerdem können entsprechende Aminosäuren bestimmt werden, z. B. durch Alignieren von Motiven (z. B. ein Fusionspeptid-Motiv, eine Transmembran-Domäne oder eine zytoplasmatische Domäne) innerhalb verwandter oder nichtverwandter Proteine. Solch ein Alignment kann auch verwendet werden, eine Konsensus-Sequenz(en) oder bestimmte Domänen/Region abzuleiten. Ein Beispiel von Alignments, welche entsprechende Regionen und Aminosäuresequenzen in ähnlichen Proteinen zeigen wird in Figur S1 von Swanson et al. (PNAS (2011) 108(23): 9619–24) gezeigt.
• Ein „modifiziertes Protein” oder „modifiziertes RSV-Protein” ist eines, welches normalerweise in der Natur nicht vorgefunden wird oder von der Wildtyp-Version des Proteins verschieden ist. Zum Beispiel könnte ein modifiziertes Protein verglichen mit dem natürlichen oder Wildtyp-Protein eine carboxyterminale (C-terminale) Trunkierung, eine aminoterminale (N-terminale) Trunkierung, eine interne Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren, Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren, Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren, oder irgendeine Kombination davon, haben. Modifizierte Proteine schließen jene mit Deletionen von Teilen oder gesamten Domänen/Regionen, wie Transmembran-, zytoplasmatische oder Fusionspeptid-Domänen/Regionen ein.
• Einige Ausführungsformen der Erfindung beziehen sich im Allgemeinen auf modifizierte RSV-Polypeptide einschließlich Nukleinsäuren und Vektoren, die ein modifiziertes RSV-Polypeptid(e) kodieren. Die modifizierten RSV-Proteine können zum Beispiel genutzt werden, eine Immunantwort auf RSV-virale Partikel und/oder auf RSV-Proteine auszulösen. Modifizierte RSV-Proteinkandidaten können außerdem genutzt werden, die Funktion, Besonderheiten, Struktur, Interaktionen, usw., des nativen Proteins zu untersuchen. In einigen Ausführungsformen kann die Immunantwort B-Zell-vermittelt, T-Zell-vermittelt, oder eine Kombination davon sein. In einigen Ausführungsformen können die modifizierten RSV-Proteine und/oder Vektoren, die sie exprimieren, z. B. in einem Impfstoff genutzt werden, um eine schützende Immunantwort auszulösen, welche die RSV-Krankheit abschwächt oder die Krankheit vollständig verhindert. Nukleinsäuren, Vektoren, Proteine, Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung können in einigen Ausführungsformen verwendet werden, um die RSV-Krankheit zu inhibieren.
• Es wird davon ausgegangen, dass, wenn die Verwendung von einem Protein hierin diskutiert wird, in einigen Fällen dieselbe oder ähnliche Verwendung mit einer Nukleinsäure oder einem Vektor, welche(r) das Protein kodiert, durchgeführt werden kann. Zum Beispiel, wo ein Protein an ein Tier verabreicht wird um eine Immunantwort zu induzieren, kann eine Nukleinsäure oder Vektor, welche(r) das Protein kodiert, verabreicht werden, sodass, wenn das Protein in vivo exprimiert wird, eine Immunantwort induziert wird.
• Ein oder mehrere modifizierte RSV-Polypeptide oder Vektoren, die die Polypeptide kodieren, können in Kombination verwendet werden, eine Immunantwort auszulösen, zum Beispiel gleichzeitig, innerhalb von 24 Stunden voneinander oder zu verschiedenen Zeiten verabreicht werden, sodass eines zuerst und das gleiche modifizierte Protein oder ein anderes modifiziertes Protein zu einem späteren Zeitpunkt gegeben wird, z. B. als ein Booster. Verschiedene modifizierte Proteine können von vollständig unterschiedlichen RSV-Proteinen abgeleitet sein, wie RSV-F- und -G-Protein, oder von modifizierten RSV-Proteinen, die von demselben RSV-Protein abgeleitet sind, wie zwei unterschiedlich modifizierte RSV-F-Proteine. In einigen Ausführungsformen kann ein modifiziertes RSV-Polypeptid(e) direkt an ein Tier verabreicht werden, eine Nukleinsäure oder Vektor, der ein modifiziertes RSV-Polypeptid(e) kodiert, kann verabreicht werden, oder beide.
• In einigen Ausführungsformen kodiert eine Nukleinsäure für mehr als ein RSV-Protein. In einigen Ausführungsformen ist mindestens eines der RSV-Proteine modifiziert.
• Ein modifiziertes RSV-Protein kann irgendein Protein sein, welches von einem RSV-viralem Genom, welches modifiziert worden ist, kodiert wird. In einigen Ausführungsformen ist das modifizierte RSV-Protein ein modifiziertes RSV-F-Protein oder ein modifiziertes RSV-Anheftungs-G-Protein. In einigen Ausführungsformen kann ein modifiziertes RSV-F-Protein oder ein modifiziertes RSV-Anheftungs-G-Protein durch eine carboxyterminale (C-terminale) Trunkierung, eine aminoterminale (N-terminale) Trunkierung, eine interne Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren, Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren, Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren, oder irgendeine Kombination davon, modifiziert sein. Dies schließt jene mit Deletionen von gesamten Domänen/Regionen, wie Transmembran-, zytoplasmatischen und/oder Fusionspeptid-Domänen/Regionen, oder Teilen davon ein.
• In einigen Ausführungsformen umfasst ein modifiziertes RSV-Protein mindestens eine, zwei, drei oder mehrere Modifikationen, die aus der Gruppe bestehend aus Deletion von mindestens einem Teils des Fusionspeptids, der Transmembran-Domäne, und/oder der zytoplasmatischen Domäne (auch bekannt als zytoplasmatischer Schwanz) ausgewählt sind. In einigen Ausführungsformen wird eine Deletion des gesamten Fusionspeptids, der Transmembran-Domäne und/oder der zytoplasmatischen Domäne verwendet.
• Ein Beispiel eines RSV-F-Proteins wird in SEQ ID NO: 11 gezeigt. Die Erfindung ist nicht auf das RSV-F-Protein von SEQ ID NO: 11 oder Modifikationen davon beschränkt. RSV-F-Proteine von anderen Stämmen von RSV und modifizierte Proteine davon können in Übereinstimmung mit der Erfindung verwendet werden. Während bestimmte beispielhafte Sequenzen hierin beschrieben werden, schließt die Erfindung entsprechende, in ähnlichen Sequenzen gemachte Modifikationen, ein, zum Beispiel im selben RSV-Protein eines anderen Stammes, Isolates oder ein synthetisches Analog.
• In einigen Ausführungsformen ist ein F-Protein modifiziert um die Fusionsaktivität zu reduzieren. Die Fusionsaktivität kann reduziert werden durch Deletion mindestens eines Teils des Fusionspeptids, Substituieren einer oder mehrerer Aminosäuren innerhalb des Fusionspeptids, Inserieren einer oder mehrerer Aminosäuren in die Fusionspeptid-Domäne, und durch Screening einer Bibliothek von RSV-F-Proteinen, z. B. eine mutagenisierte Bibliothek, für solche mit reduzierter oder eliminierter Fusionsaktivität, von denen einige Modifikationen nicht innerhalb der Fusionspeptid-Domäne haben können, aber die immer noch Fusionsaktivität reduzieren, verglichen mit dem nicht-modifizierten/nicht-mutierten RSV-F-Protein.
• In einigen Ausführungsformen der Erfindung umfasst ein RSV-F-Protein eine Deletion mindestens eines Teils der Peptidfusions-Domäne des RS-F-Proteins. Die RSV-F-Protein-Fusions-Domäne ist aus dem Stand der Technik bekannt, z. B. siehe Swanson et al. (PNAS (2011) 108(23): 9619–24) und Martin et al. (J General Virology (2006) 87: 1649–1658). Die Fusionspeptid-Domäne des RSV-F-Proteins entspricht Aminosäuren 137–155 von SEQ ID NO: 11. Fusionspeptide von anderen RSV-F-Proteinen, z. B. von anderen Stämmen oder Isolaten, werden im Stand der Technik beschrieben und/oder können bestimmt werden, z. B. durch Alignieren ihrer Aminosäuresequenz mit SEQ ID NO: 11 (z. B. durch Verwenden von BLAST) und Identifizieren der Aminosäuren die Aminosäuren 137–155 von SEQ ID NO: 11 entsprechen.
• In einigen Ausführungsformen umfasst oder besteht ein modifiziertes RSV-F-Protein aus einer Deletion von Aminosäuren 137–155, 137–154, 137–153, 137–152, 137–151, 137–150, 137–149, 137–148, 137–147, 137–146, 137–145, 137–144, 137–143, 137–142, 137–141, 137–140, 140–145, 140–146, 140–150, 140–155 oder 145–155 von SEQ ID NO: 11. In einigen Ausführungsformen besteht ein modifiziertes RSV-F-Protein nicht aus oder schließt nicht mindestens eine der Aminosäuresequenzen von Aminosäuren 137–145, 137–146 oder 137–155 von SEQ ID NO: 11 ein. In einigen Ausführungsformen umfasst oder besteht ein modifiziertes RSV-F-Protein aus einer Deletion von 5–10, 5–15, 5–20, 10–15, 10–20, 15–20 benachbarter oder nicht-benachbarter Aminosäuren des Fusionspeptids, z. B. Aminosäuren die Aminosäuren 137–155 von SEQ ID NO: 11 entsprechen. In einigen Ausführungsformen umfasst oder besteht eine Deletion aus Aminosäureresten 137–145 oder 137–146. Einige Ausführungsformen der Erfindung schließen eine Modifikation eines RSV-F-Proteins ein, welche detektierbare Fusionsaktivität vermindert oder eliminiert, z. B. wie unter einem Mikroskop oder durch Durchflusszytometrie mit Zellen gesehen, welche das modifizierte RSV-F-Protein exprimieren, verglichen mit demselben Typ von Zellen, die ähnliche Mengen des unmodifizierten RSV-F-Proteins exprimieren.
• In einigen Ausführungsformen umfasst ein RSV-F-Protein eine Deletion mindestens eines Teils einer Transmembran-Domäne und/oder zytoplasmatischen Domäne. Dies kann mit oder ohne eine Deletion in der Peptidfusions-Domäne sein. Die Transmembran- und zytoplasmatische Domäne des RSV-F-Proteins entspricht Aminosäuren 525–573 von SEQ ID NO: 11. Transmembran- und zytoplasmatische Domäne anderer RSV-F-Proteine, z. B. von anderen Stämmen oder Isolaten, sind im Stand der Technik beschrieben und/oder können bestimmt werden durch Alignieren ihrer Aminosäuresequenz mit SEQ ID NO: 11 (z. B. durch Verwenden von BLAST) und Identifizieren der Aminosäuren, die Aminosäuren 525–573 von SEQ ID NO: 11 entsprechen. In einigen Ausführungsformen der Erfindung umfasst ein RSV-F-Protein nicht Aminosäuren, die 525–573, 525–565, 525–555, 525–545, 525–545 oder 525–555 von SEQ ID NO: 11 oder nicht mehr als 5, 10, 15, 20, 25 oder 30 benachbarten Aminosäuren von Aminosäuren 525–573 von SEQ ID NO: 11 entsprechen.
• In einigen Ausführungsformen umfasst oder besteht ein modifiziertes RSV-Protein der Erfindung aus einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuren 23–564 von SEQ ID NO: 2; 23–515 von SEQ ID NO:4; 23–573 von SEQ ID NO: 13; 23–524 von SEQ ID NO: 15; 23–554 von SEQ ID NO: 17; und 23–505 von SEQ ID NO: 19. In einigen Ausführungsformen umfasst oder besteht ein modifiziertes RSV-Protein der Erfindung aus einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 2, 4, 13, 15, 17 und 19. Die ersten 23 Aminosäuren von SEQ ID NOs: 2, 4, 13, 15, 17 und 19 sind eine Signalsequenz. Im Wesentlichen kann jede Signalsequenz verwendet werden, die funktionell in der bestimmten Zelle ist. In einigen Ausführungsformen umfassen Nukleinsäuren der Erfindung SEQ ID NOs: 1, 3, 12, 14, 16 und/oder 18. In einigen Ausführungsformen umfassen Nukleinsäuren der Erfindung SEQ ID NOs: 1, 3, 12, 14, 16 und/oder 18, aber ohne die ersten 69 Nukleotide, welche die Signalsequenz kodieren.
• Einige Ausführungsformen der Erfindung nutzen ein RSV-Anheftungs-G-Protein (RAGP) oder eine modifizierte Form davon. In einigen Ausführungsformen umfasst oder besteht ein RAGP aus Aminosäuren 2–101 von SEQ ID NO: 6, manchmal auch als RAGP-konservierte Domäne bezeichnet, z. B. siehe Nguyen et al. (PLoS One (2012) 7(3): e34331. In einigen Ausführungsformen umfasst oder besteht ein RAGP aus den Aminosäuren 56–70 von SEQ ID NO: 6. In einigen Ausführungsformen umfasst oder besteht ein RAGP aus einer Aminosäuresequenz, die Aminosäuren 2–101, 10–101, 20–101, 30–101, 40–101, 50–101, 60–101, 70–101, 10–90, 10–80, 10–70, 10–60, 10–50, 10–40, 10–77, 45–58, 40–60, 40–65, 40–70, 40–58, 35–58, 30–58, 50–75 oder 35–65 von SEQ ID NO: 6 entsprechen. In einigen Ausführungsformen umfasst oder besteht ein modifiziertes RAGP aus mindestens einem Teil des RSV-Anheftungs-G-Proteins, z. B. entsprechend Aminosäuren 2–101, 10–77 oder 45–58 von SEQ ID NO: 6. In einigen Ausführungsformen ist das RAGP ein RSV-Anheftungs-G-Protein von einem RSV-A oder RSV-B-Typ-Virus.
• In einigen Ausführungsformen ist die kodierende Region für RAGP oder Teil von einem RAGP operativ mit einem Vaccinia-H5-Promotor oder einem Vaccinia-p7.5-Promotor verbunden. In einigen Ausführungsformen sind eine kodierende Region für ein modifiziertes RSV-F-Protein und eine kodierende Region für ein RAGP, oder Teil davon, beide mit einem H5-Promotor oder einem Vaccinia-p7.5-Promoter verbunden.
• Die Erfindung schließt auch Proteine mit Aminosäuresequenzen ein, die mindestens ungefähr 80%, mindestens ungefähr 83%, mindestens ungefähr 85%, mindestens ungefähr 88%, mindestens ungefähr 90%, mindestens ungefähr 93%, mindestens ungefähr 94%, mindestens ungefähr 95%, mindestens ungefähr 96%, mindestens ungefähr 97%, mindestens ungefähr 98% oder mindestens ungefähr 99% Identität oder Homologie mit jenen aufweisen, die hierin dargelegt sind, zum Beispiel 23–564 von SEQ ID NO: 2, 23–515 von SEQ ID NO: 4, 23–573 von SEQ ID NO: 13; 23–524 von SEQ ID NO: 15; 23–554 von SEQ ID NO: 17, 23–505 von SEQ ID NO: 19 und Aminosäuren 2–101, 10–77 oder 45–58 von SEQ ID NO: 6. Die Erfindung schließt auch Nukleinsäuren mit Nukleotidsequenzen ein, die mindestens ungefähr 70%, mindestens ungefähr 75%, mindestens ungefähr 80%, mindestens ungefähr 83%, mindestens ungefähr 85%, mindestens ungefähr 88%, mindestens ungefähr 90%, mindestens ungefähr 93%, mindestens ungefähr 94%, mindestens ungefähr 95%, mindestens ungefähr 96%, mindestens ungefähr 97%, mindestens ungefähr 98% oder mindestens ungefähr 99% Identität oder Homologie mit jenen aufweisen, die hierin dargelegt sind, zum Beispiel.
• Wie hierin verwendet bezieht sich der Ausdruck „Sequenzidentität” auf eine Beziehung zwischen zwei oder mehreren Polynukleotidsequenzen oder zwischen zwei oder mehreren Polypeptidsequenzen. Wenn eine Stelle in einer Sequenz von der gleichen Nukleinsäurebase oder Aminosäurerest in der entsprechenden Stelle der Vergleichssequenz besetzt ist werden die Sequenzen an dieser Stelle als „identisch” bezeichnet. Der Prozentanteil „Sequenzidentität” wird berechnet durch Bestimmen der Anzahl der Positionen, an welchen die identische Nukleinsäurebase oder Aminosäurerest in beiden Sequenzen vorkommt, um die Anzahl von „identischen” Positionen zu erhalten. Die Anzahl von „identischen” Positionen wird dann durch die Gesamtzahl der Positionen im Vergleichsfenster geteilt und mit 100 multipliziert, um den Prozentanteil von „Sequenzidentität” zu erhalten. Prozentanteil von „Sequenzidentität” wird bestimmt durch Vergleichen zweier optimal alignierter Sequenzen über ein Vergleichsfenster. Um die Sequenzen zum Vergleich optimal zu alignieren kann der Bereich einer Polynukleotid- oder Polypeptidsequenz im Vergleichsfenster Additionen oder Deletionen, Lücken genannt, umfassen während die Referenzsequenz konstant gehalten wird. Ein optimales Alignment ist jenes Alignment, das auch mit Lücken die größtmögliche Anzahl von „identischen” Positionen zwischen der Referenz und den Vergleichssequenzen produziert. Prozentanteil „Sequenzidentität” zwischen zwei Sequenzen kann durch Verwenden des BLAST-Programmes bestimmt werden, welches online vom National Center for Biotechnology Information erhältlich ist, welches Programm die Programme BLASTN (für Nukleotidsequenz-Vergleich) und BLASTP (für Polypeptidsequenz-Vergleich) enthält und die auf dem Algorithmus von Karlin und Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(12): 5873–5877, 1933) beruhen. Die Default-Parameter für Proteine können verwendet werden, z. B. Wortgröße (3), Offenlückenkosten (11), Ausdehnungslückenkosten (1) und Erwartungs-Schwellenwert (10). Die Default-Parameter für Nukleinsäuren können verwendet werden, z. B. Wortgröße (28), Offenlückenkosten (Linear), Match/Mismatch-Punktzahlen (1, –2) und Erwartungs-Schwellenwert (10). Zwei Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen werden als eine „im Wesentlichen ähnliche Sequenzidentität” oder „wesentliche Sequenzidentität” habend angesehen, wenn die beiden Sequenzen mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98% oder mindestens 99% Sequenzidentität relativ zueinander haben.
• In einigen Ausführungsformen ist eine kodierende Region für ein modifiziertes RSV-F-Protein im Leserahmen mit einer kodierenden Region für mindestens einen Teil des RSV-G-Proteins fusioniert. Das modifizierte RSV-F-Protein kann N-terminal oder C-terminal zu mindestens einem Bereich des RSV-G-Proteins sein. Zwei RSV-Proteine, wie ein modifiziertes RSV-F-Protein und ein RSV-G-Protein, oder Fragment davon, können von separaten Promotoren oder demselben Promotor exprimiert werden, unter Verwenden von zum Beispiel irgendeiner der Techniken, die hierin beschrieben sind, einschließlich Fusionieren der kodierenden Regionen der zwei Proteine oder Inserieren einer Proteasestelle-kodierenden Region, 2A-ähnlicher Sequenz oder IRES-Sequenz zwischen den kodierenden Regionen für die zwei Proteine. In einigen Ausführungsformen sind eine modifiziertes RSV-F-Protein kodierende Region und eine RSV-G-Protein kodierende Region in derselben Nukleinsäure oder Vektor enthalten und sind beide operativ mit einer unterschiedlichen Kopie desselben Promotors verbunden. In einigen dieser Ausführungsformen sind die kodierenden Regionen in entgegengesetzten Orientierungen oder Richtungen, z. B. siehe die vEM155/mEM87- und vEM155/mEM87-Konstrukte von 1A. Dies schließt eine doppelsträngige Nukleinsäure ein, wo eine kodierende Region von 5' zu 3' auf einem Strang kodiert und die andere kodierende Region von 5' zu 3' auf dem anderen Strang kodiert. In diesen Ausführungsformen können die zwei kodierenden Regionen operativ mit unterschiedlichen Kopien desselben Promotors oder mit zwei verschiedenen Promotoren verbunden sein.
• In einigen Ausführungsformen sind zwei kodierende Regionen in derselben Richtung orientiert, auf demselben Strang, und jede kodierende Region kann operativ mit einer Kopie desselben Promotors, mit unterschiedlichen Kopien desselben Promotors oder mit zwei verschiedenen Promotoren verbunden sein.
• In einigen Ausführungsformen der Erfindung ist eine kodierende Region für ein modifiziertes RSV-F-Protein (wie hierin beschrieben) operativ verbunden mit einem ersten Promotor und eine kodierende Region für mindestens einen Teil eines RAGP (wie hierin beschrieben) ist mit einem zweiten Promotor verbunden. In anderen Ausführungsformen sind eine kodierende Region für ein modifiziertes RSV-F-Protein und eine kodierende Region für mindestens einen Teil eines RAGP in entgegengesetzter Orientierung miteinander verglichen. In einigen Ausführungsformen sind eine kodierende Region für ein modifiziertes RSV-F-Protein und eine kodierende Region für mindestens einen Teil eines RAGP beide operativ mit demselben Promotor verbunden. Dies kann auf mehreren Wegen durchgeführt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, wobei (i) eine kodierende Region für das modifizierte RSV-F-Protein im Leserahmen mit einer kodierenden Region für den Teil des RSV-G-Proteins fusioniert wird und (ii) die kodierende Region für ein modifiziertes RSV-F-Protein und eine kodierende Region für mindestens einen Teil eines RAGP operativ verbunden sind durch eine kodierende Region für ein 2A-Peptid, eine kodierende Region für eine Proteasestelle oder eine interne Ribosomeneintrittsstelle. In einigen Ausführungsformen ist ein Verbindungspeptid im Leserahmen zwischen die kodierende Region für das modifizierte RSV-F-Protein und die kodierende Region für den Teil des RSV-G-Proteins fusioniert.
• Die Erfindung schließt auch Nukleinsäuren und Vektoren ein, die Nukleinsäuresequenzen beinhalten, die für irgendeines der RSV-Proteine (z. B. modifiziert) kodieren, wie hierin beschrieben. Wo eine Nukleinsäure hierin beschrieben ist schließt die Verbindung auch Vektoren ein, die die beschriebene(n) Nukleinsäure(n) enthalten.
• RSV-Proteine können mit und operativ verbunden mit irgendeinem Promotor exprimiert werden, welcher in dem gewünschten Niveau des Proteins in den anwendbaren Typ(en) von Zellen und/oder für den Vektortyp, welche genutzt werden, resultiert. In einigen Ausführungsformen ist ein Promotor ein Säugetier-Promotor oder ein viraler Promotor. In einigen Ausführungsformen ist ein Promotor ein Vaccinia-H5-Promotor oder ein Vaccinia-p7.5-Promotor. Diese Promotoren können eine Sequenz umfassen, die strangaufwärts von einem Vaccinia-H5- oder -p7.5-Gen sind, solche wie diejenigen, die SEQ ID NOs: 8 beziehungsweise 7 umfassen oder daraus bestehen. In einigen Ausführungsformen kann ein relativ starker Promotor verwendet werden, während in anderen Ausführungsformen ein relativ schwacher Promotor verwendet werden kann. Zum Beispiel ist ein Vaccinia-H5-Promotor grundsätzlich ein stärkerer Promotor, der zu höheren Niveaus von Transkription und Expression von einer operativ verbundenen kodierenden Region führt, wobei ein p7.5-Promotor grundsätzlich zu niedrigeren Niveaus von Transkription und Expression führt.
• In einigen Ausführungsformen der Erfindung kann ein Promotor ein gewebespezifischer Promotor, ein zellspezifischer Promotor, ein induzierbarer Promotor, ein reprimierbarer Promotor, ein konstitutiver Promotor, ein synthetischer Promotor oder ein Hybrid-Promotor sein.
• Regulatorische(Expressions-/Kontroll-)Sequenzen und Promotoren sind operativ mit einer Nukleinsäure-kodierenden Sequenz verbunden wenn sie die Transkription und, wenn angebracht, Translation der Nukleinsäuresequenz regulieren. Expressions/Kontroll-Sequenzen, die in den Nukleinsäuren und Vektoren der Erfindung eingeschlossen sein können, schließen, aber sind nicht beschränkt auf, Promotoren, Verstärker, Transkriptionsterminatoren, ein Startcodon (z. B. ATG) vor einer kodierenden Sequenz, Spleiß-Signale für Introns und Stopcodons ein.
• Wo eine Nukleinsäure für zwei oder mehrere Polypeptide kodiert, kann eine Kopie eines Promotors operativ mit zwei oder mehreren kodierenden Regionen verbunden sein. Multiple Polypeptide, einschließlich jener, die von RSV abgeleitet sind, können von einem Promotor exprimiert werden durch, zum Beispiel, Inserieren einer internen Ribosomeneintrittsstelle (IRES), einer 2A-ähnlichen Sequenz oder einer Proteaseschnittstelle, die im Leserahmen fusioniert ist, zwischen den kodierenden Regionen. Zusätzlich können die zwei oder mehreren kodierenden Regionen im Leserahmen mit oder ohne Inserieren einer verbindenden kodierenden Sequenz für ein Verbindungs-Peptid fusioniert werden. Mit anderen Worten, die zwei oder mehreren Polypeptide werden als ein fusioniertes Polypeptid exprimiert, zumindest vor irgendwelchen posttranslationalen Modifikationen. Ein(e) Verbindungs-Sequenz/Peptid würde relativ kurz sein (z. B. 3–5, 3–10, 3–15, 7–15, 10–20 oder 3–20 Aminosäuresequenz) und würde es ermöglichen, dass die zwei oder mehreren Polypeptide als ein Fusionsprotein exprimiert werden.
• IRES-Sequenzen können verwendet werden um die Translation/Expression von einer zweiten, dritten, vierten kodierenden Sequenz, usw., von einem Promotor zu erleichtern. Beispiele von IRESs, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen, aber sind nicht beschränkt auf, jene, abgeleitet von Picornavirus, z. B. HAV (Glass et al. 1993. Virol 193: 842–852), Encephalomyocarditis-Virus (EMCV) (Duke et al. (1992) J. Virol 66(3): 1602–9; Jang & Wimmer, 1990 Gene Dev 4: 1560–1572), und Poliovirus (Borman et al., 1994. EMBO J 13: 3149–3157); HCV (Tsukiyama-Kohara et al., 1992. J Virol 66: 1476–1483), BVDV (Frolov et al., 1998. RNA. 4: 1418–1435); Leishmania-Virus, z. B., LRV-1 (Maga et al., 1995. Mol Cell Biol 15: 4884–4889); Retroviren z. B., MoMLV (Torrent et al., 1996. Hum Gene Ther 7: 603–612), VL30 (Harvey murine sarcoma virus), REV (Lopez-Lastra et al., 1997. Hum Gene Ther 8: 1855–1865); und eukaryotische mRNA z. B. Immunglobulin Schwerkettenbindeprotein (BiP) (Macejak & Sarnow, 1991. Nature 353: 90–94), Antennapedia mRNA (Oh et al., 1992. Gene & Dev 6: 1643–1653), Fibroblastenwachstumsfaktor 2 (FGF-2) (Vagner et al., 1995. Mol Cell Biol 15: 35–44), PDGF-B (Bernstein et al., 1997. J Biol Chem 272: 9356–9362), IGFII (Teerink et al., 1995. Biochim Biophys Acta 1264: 403–408), Translationsinitiationsfaktor eIF4G (Gan & Rhoads, 1996. J Biol Chem 271: 623–626), insulinartigem Wachstumsfaktor (IGF), Hefe-Transkriptionsfaktoren TFIID und HAP4 und dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) (Stein et al., 1998. Mol Cell Biol 18: 3112–3119; Huez et al., 1998. Mol Cell Biol 18: 6178–6190) sowie jenen, die in U.S.-Patent 6,692,736 beschrieben sind. Von IRES wurde auch in verschiedenen Viren berichtet, so wie Cardioviren, Rhinoviren, Aphtoviren, HCV, Friend-Maus-Leukämie-Virus (FrMLV) und Moloney-Maus-Leukämie-Virus (MoMLV). Wie hierin beschrieben umfasst der Begriff „IRES” funktionelle Variationen von IRES-Sequenzen solange die Variation fähig ist, direkten internen Ribosomeneintritt an das Initiationscodon von einem strangabwärts gelegenen Cistron zu fördern, was zur Kappen-unabhängigen Translation führt. Ein IRES, welcher in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann von einem Säugetier, viral oder von einem Protozoon sein.
• Maul- und Klauenseuche-Viren (FMDV) sind eine Gruppe innerhalb der Picornaviridae, welche einen einzelnen, langen offenen Leserahmen exprimieren, der ein Polyprotein von ungefähr 225 kD kodiert. Das Volle-Länge-Pranslationsprodukt durchläuft schnelle intramolekulare(cis)-Spaltung am C-Terminus einer selbstprozessierenden Schnittstelle, zum Beispiel, einer 2A-Stelle oder -Region, die zwischen dem Capsid-Protein-Vorläufer (P1-2A) und replikativen Domänen des Polyproteins 2BC und P3 liegt, wobei die Spaltung, die von Proteinase-ähnlicher Aktivität der 2A-Region selbst vermittelt wird (Ryan et al., J. Gen. Virol. 72: 2727–2732, 1991); Vakharia et al., J. Virol. 61: 3199–3207, 1987). Ähnliche Domänen sind auch von Aphtoviridae und Cardioviridae von der Picornavirus-Familie charakterisiert worden (Donnelly et al., J. Gen. Virol. 78: 13–21, 1997).
• Es wurde berichtet dass eine 2A-Stelle, -Sequenz oder -Domäne einen translationalen Effekt durch Modifizieren der Aktivität des Ribosoms zeigt, um Hydrolyse einer Esterbindung zu begünstigen, wobei das Polypeptid von dem translationalen Komplex auf eine Weise freigesetzt wird, die erlaubt, dass die Synthese eines eigenständigen Strangabwärts-Translationsprodukts abläuft (Donnelly et al. J. Gen. Virol. (2001) 82: 1013–1025). Alternativ zeigt eine 2A-Stelle, -Sequenz oder -Domäne Auto-Proteolyse oder -Spaltung durch Spalten ihres eigenen C-Terminus in cis um primäre Spaltprodukte zu produzieren (Palmenberg, Arm. Rev. Microbiol. 44: 603–623 (1990)).
• Für die voliegende Erfindung ist die DNA-Sequenz, die eine 2A-Sequenz oder 2A-ähnliche Sequenz kodiert, durch virale Sequenzen, die von einem Picornavirus abgeleitet sind, veranschaulicht, einschließlich, aber nicht beschränkt auf einen Entero-, Rhino-, Cardio-, Aphto- oder Maul- und Klauenseuche-Virus (FMDV). In einigen Ausführungsformen ist eine 2A- ähnlich-kodierende Sequenz von einem FMDV abgeleitet. Beispiele von 2A- und 2A-ähnlichen Stellen, Sequenzen oder Domänen sind in Donnelly et al., J. Gen. Virol. 82: 1027–1041 (2001) beschrieben.
• FMDV-2A ist eine Polyprotein-Region, welche in dem FMDV-Genom so funktioniert, eine einzelne Spaltung an ihrem eigenen C-Terminus zu regeln, weshalb sie in cis funktioniert. Von der FMDV-2A-Domäne wird typischerweise berichtet, dass sie ungefähr neunzehn Aminosäuren Länge hat ((LLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 20); TLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 21) (Ryan et al., J. Gen. Virol. 72: 2727–2732 (1991)), dennoch ist gezeigt worden, dass Oligopeptide mit so wenig wie vierzehn Aminosäureresten ((LLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 22)) Spaltung am 2A-C-Terminus auf eine Weise vermitteln, die ähnlich zu ihrer Rolle in der Verarbeitung des nativen FMDV-Polyproteins ist.
• Variationen der 2A-Sequenz sind auf ihre Fähigkeit untersucht wurden, effizientes Prozessieren von Polyproteinen zu vermitteln (Donnelly et al. J. Gen. Virol. 82: 1027–1041 (2001)). Homologe und variante 2A-Sequenzen sind im Umfang der Erfindung eingeschlossen und schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf: LLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 20); TLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 21); LLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 22); NFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 23); QLLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 24); APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 25); VTELLYRMKRAETYCPRPLLAIHPTEARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLA GDVESNPGP (SEQ ID NO: 26); EARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 27); und LLAIHPTEARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 28).
• Wie hierin diskutiert können zwei Polypeptide von einem Promotor exprimiert werden, der operativ mit einer kodierenden Region für ein erstes Polypeptid verbunden ist, welches im Leserahmen mit einer kodierenden Sequenz für eine Proteasestelle verbunden ist, welche im Leserahmen mit einer kodierenden Sequenz für eine zweite kodierende Region verbunden ist. Mehr als zwei Polypeptide können auf diese Weise exprimiert werden durch Inserieren Proteasestellen-kodierender Regionen zwischen jeder der Polypeptid-kodierenden Regionen oder durch Verwenden einer Kombination von IRES, Proteasestelle, und/oder 2A-ähnlichen Sequenzen.
• Eine Proteasestelle sollte eine sein, die von einer Protease gespalten wird, die in der Zelle von Interesse exprimiert wird. Dies kann Protease sein, die von der Zelle natürlich exprimiert wird, oder eine Protease, bei der die Zelle manipuliert wurde, um sie zu exprimieren. Beispiele von proteolytischen Schnittstellen, die in der Erfindung verwendet werden können, sind Furinschnittstellen, z. B. mit der Konsensussequenz RXK(R)R (SEQ ID NO: 29), wie RAKR (SEQ ID NO: 30), welche von endogenen Subtilisin-ähnlichen Proteasen, wie Furin und anderen Serinproteasen, gespalten werden können. Andere proteolytische Schnittstellen können beim Ausführen der Erfindung eingesetzt werden. Beispielhafte zusätzliche proteolytische Schnittstellen, welche zwischen einer Polypeptid- oder Protein-kodierenden Sequenz inseriert werden können, schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf eine Faktor Xa Schnittstellensequenz wie IEGR (SEQ ID NO: 31); IDGR (SEQ ID NO: 32); eine Signalpeptidase-I-Schnittstellensequenz wie LAGFATVAQA (SEQ ID NO: 33); und eine Thrombin-Schnittstellensequenz wie LVPRGS (SEQ ID NO: 34).
• Es wird davon ausgegangen, dass aufgrund der Degeneration von Codons für Translation von Aminosäuren jede beliebige Aminosäuresequenz unter Verwendung verschiedener Nukleinsäuresequenzen und verschiedenen Kombinationen von Codons kodiert werden kann, und eine kodierende Sequenz nicht beschränkt auf eine kodierende Sequenz ist. In einigen Ausführungsformen wird eine Nukleinsäure kodierende Sequenz (z. B. die für ein RSV-Protein oder ein modifiziertes RSV-Protein kodiert) rekodiert.
• Der Begriff „rekodiert” bedeutet, dass mindestens ein natives Codon zu einem unterschiedlichen Codon verändert ist, welches für dieselbe Aminosäure wie das native Codon kodiert. In einigen Ausführungsformen sind in der rekodierten Region mindestens 5%, mindestens 10%, mindestens 15%, mindestens 20%, mindestens 25%, mindestens 30%, mindestens 35%, mindestens 40%, mindestens 45%, oder mindestens 50% der Codons rekodiert. In einigen Ausführungsformen ist ein rekodiertes Codon mit einem Codon ersetzt, welches häufiger in einer bestimmten Spezies, wie Menschen, verwendet wird. In einigen Ausführungsformen sind mindestens 5%, mindestens 10%, mindestens 15%, mindestens 20%, mindestens 25%, mindestens 30%, mindestens 35%, mindestens 40%, mindestens 45%, oder mindestens 50% mit einem Codon ersetzt worden, welches häufiger in Menschen vorkommt.
• Rekodieren kann Codon-Optimierung einschließen, welche Modifizieren/Ändern der Codons einer kodierenden Sequenz in einer Nukleinsäuresequenz für verstärkte Expression in einer spezifizierten Wirtsstelle oder Spezies von Wirtszelle durch Ersetzen mindestens einer, mehr als einer, oder einer signifikanten Anzahl an Codons der nativen Sequenz mit Codons, die häufiger oder am häufigsten in den Genen von diesem Wirt verwendet werden, umfasst. Viele Organismen zeigen eine Tendenz zur Verwendung von bestimmten Codons um die Insertion einer bestimmten Aminosäure in einer wachsenden Polypeptidkette zu kodieren. Codonpräferenz oder Codon Bias, Unterschiede in der Codonverwendung zwischen Organismen, wird ermöglicht durch Degeneration des genetischen Codes, und ist in vielen Organismen gut dokumentiert. Codon Bias korreliert oft mit der Effizienz der Translation von Boten-RNA (mRNA), von welcher wiederum geglaubt wird, dass sie unter anderem von den Eigenschaften der Codons, die translatiert werden, und der Verfügbarkeit von bestimmten Transfer-RNA(tRNA)-Molekülen abhängt. Die Prädominanz von ausgewählten tRNAs in einer Zelle ist üblicherweise eine Widerspiegelung der Codons, die am häufigsten in der Peptidsynthese verwendet werden. Dementsprechend können Gene, basierend auf Codon-Optimierung für optimale Genexpression in einem gegebenen Organismus, zugeschnitten sein.
• In einigen Ausführungsformen hat eine rekodierte Sequenz zwischen ungefähr 60–65%, ungefähr 65–70%, ungefähr 70–75%, ungefähr 75–80%, ungefähr 80–85%, ungefähr 85–90%, ungefähr 90–95%, ungefähr 70–90%, ungefähr 75–85%, ungefähr 90–95% oder ungefähr 95–98% Identität mit der entsprechenden nativen kodierenden Sequenz.
• Rekodieren kann auch verwendet werden um den chemischen Aufbau einer DNA- und/oder einer RNA-kodierenden Sequenz wie den Guanin/Cytosin(GC)-Prozentanteil zu verändern. Abhängig von der bestimmten Situation oder Vektor kann es vorteilhaft sein, den GC-Prozentanteil in der rekodierten Sequenz zu erhöhen oder zu vermindern.
• Rekodieren kann verwendet werden, um bestimmte Motive an eine kodierende Sequenz oder Nukleinsäuremolekül zu entfernen/modifizieren oder hinzuzufügen, wie inhibitorische Procarya-Motive, Konsensus-Spleiß-Donor-Stellen, kryptische Spleiß-Donor-Stellen oder eine Kombination davon. In einigen Ausführungsformen hat eine rekodierte kodierende Sequenz weniger inhibitorische Procarya-Motive, Konsensus-Spleiß-Donor-Stellen, kryptische Spleiß-Donor-Stellen oder eine Kombination davon, als die native Sequenz. In einigen Ausführungsformen enthält eine rekodierte kodierende Sequenz keine inhibitorischen Procarya-Motive, Konsensus-Spleiß-Donor-Stellen und/oder kryptische Spleiß-Donor-Stellen. Rekodieren kann auch verwendet werden, um Abschnitte/Bereiche von Sequenzen zu verändern, welche identisch sind mit oder signifikante Homologie/Identität (z. B. > 80%) haben zu anderen Sequenzen in dem Vektor oder Polynukleotid, zum Beispiel um Rekombinierungs-Ereignisse zu reduzieren. Zusätzlich kann Rekodieren vorgenommen werden, um Abschnitte von Sequenzen zu verändern, die Poly-Guanin/Cytosin-Sequenzen haben, weil in einigen Situationen das Beseitigen von Poly-Guanin/Cytosin-Sequenzen und Konvertieren dieser in Sequenzen ohne oder mit niedrigeren Mengen von Poly-Guanin/Cytosin-Sequenzen zu besseren Eigenschaften für die Nukleinsäure oder den Vektor führen kann, wie in einigen Fällen zu höheren Expressionsraten.
• Hoover et al. (Nucleic Acids Res. (2002) 30: e43, pp1–7); U.S.-Patentanmeldung 20070141557; Fath et al. (PLoS ONE (2011) 6: e17596 pp1–14); Graf et al. (J Virol (2000) 74: 10822–10826); und U.S.-Patent-Nr. 8,224,578 beschreiben Beispiele von Rekodieren kodierender Regionen.
• Um lokale und/oder langfristige Expression von einer Nukleinsäure von Interesse zu gewährleisten, erwägen einige Ausführungsformen der Erfindung Transduzieren einer Zelle mit einer Nukleinsäure oder Vektor der Erfindung. Die vorliegende Erfindung ist nicht auszulegen, dass sie beschränkt ist auf irgendeine bestimmte Nukleinsäureeinbringungsverfahren, und irgendeinen verfügbaren Nukleinsäureeinbringungsträger und/oder -Verfahren mit entweder einer in vivo oder in vitro Nukleinsäureeinbringungsstrategie, oder die Verwendung von manipulierten Zellen (wie die Technologie von Neurotech, Lincoln, RI, z. B. siehe U.S.-Patent Nr. 6,231,879 ; 6,262,034 ; 6,264,941 ; 6,303,136 ; 6,322,804 ; 6,436,427 ; 6,878,544 ) sowie Nukleinsäuren der Erfindung (z. B. „nackte DNA”) können in der Ausführung der Erfindung verwendet werden. Verschiedene Einbringungsträger, wie Vektoren, können mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel können virale Vektoren, amphitrophe Lipide, kationische Polymere, wie Polyethylenimin (PEI) und Polylysin, Dendrimere, wie Combburst-Moleküle und Starburst-Moleküle, nichtionische Lipide, anionische Lipide, Vesikel, Liposomen und andere synthetische Nukleinsäuremittel der Geneinbrinung (z. B. siehe U.S.-Pat.-Nr. 6,958,325 und 7,098,030 ; Langer, Science 249: 1527–1533 (1990); Treat et al., in „Liposomes" in „The Therapy of Infectious Disease and Cancer"; und Lopez-Berestein & Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 317–327 und 353–365 (1989)); „nackte” Nukleinsäuren und so weiter in der Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
• In einigen Ausführungsformen umfasst ein Vektor oder eine Nukleinsäure der Erfindung ein Intron, welches operativ mit einer kodierenden Sequenz verbunden ist. Heterologe Introns sind bekannt und nicht-beschränkende Beispiele schließen ein humanes β-Globingen-Intron und ein Beta-Aktin-Intron ein. Ein Intron kann ein heterologes Intron sein.
• Die vorliegende Erfindung erwägt die Verwendung von irgendeinem Vektor zum Einbringen einer oder mehrerer Gene oder Nukleinsäuren in Zellen, z. B. Säugetierzellen. Beispielhafte Vektoren schließen ein aber sind nicht beschränkt auf virale und nichtvirale Vektoren, wie Vaccinia-Virus-Vektoren (z. B. modifiziertes Vaccinia Ankara (MVA)), Retrovirusvektoren (einschließlich Lentiviren), Adenovirus(Ad)-Vektoren einschließlich replikationskompetenter, replikationsdefizienter und leere Formen davon, Adeno-assoziierte Virus-(AAV)-Vektoren, Simian-Virus-40(SV 40)-Vektoren, Rinderpapillomvirus-Vektoren, Epstein-Barr-Virus-Vektoren, Herpes-Virus-Vektoren, Vaccinia-Virus-Vektoren, Moloney-Maus-Leukämie-Virus-Vektoren, Harvey-Maus-Sarkom-Virus-Vektoren, Maus-Mamma-Tumor-Virus-Vektoren, Rous-Sarkom-Virus-Vektoren, Venezuelanische-Pferde-Encephalitis-Vektor (z. B. Replikon) und nichtvirale Plasmidvektoren. Viren können Zellen effizient transduzieren und ihre eigene DNA in eine Wirtszelle schleusen. In einigen Ausführungsformen, die virale Vektoren verwenden, ist ein nichtessenzielles virales Gen(e) durch ein Gen oder eine kodierenden Sequenz für ein heterologes (oder nichtnatives) Protein, wie ein modifiziertes RSV-Protein ersetzt. In einigen Ausführungsformen ist eine kodierende Region zwischen zwei virale Gene inseriert.
• Adenovirale Vektoren sind beschrieben, z. B. in Hitt et al. Adv in Virus Res 55: 479–505 (2000); U.S.-Patent-Nr. 5,872,005 , 5,994,106 , 6,133,028 und 6,127,175 . AAV-Vektoren sind beschrieben, z. B. in Davidson et al. (2000), PNAS 97(7) 3428–32; Passini et al. (2003), J. Virol 77(12): 7034–40; Gao et al. (2002), PNAS 99(18): 11854–6; Gao et al. (2003), PNAS 100(10): 6081–6; Bossis and Chiorini (2003) J. Virol. 77(12): 6799–810; McCarty et al., Gene Ther. 2001 Aug; 8(16): 1248–54; U.S.-Patent-Nr. 5,436,146 , 5,753,500 , 6,040,183 , 6,093,570 und 6,548,286 . Beispiele von retroviralen Vektoren sind beschrieben in Miller (1992) Nature 357: 455–460. Beispiele von lentiviralen Vektoren sind beschrieben in Picanco-Castro et al. Recent Pat DNA Gene Seq. (2012) 6(2): 82–90 und U.S.-Patent Nr. 8,236,558 und 8,183,356 .
• In einigen Ausführungsformen ist der virale Vektor ein Pockenvirus-Vektor, z. B. ein Vaccinia-Virus, z. B. ein modifizierter Vaccinia-Virus Ankara (MVA). MVA ist ein stark abgeschwächter Vaccinia-Virus-Stamm. Pockenviren umfassen vier Gattungen von Pockenviren, d. h. Orthopox-, Parapox-, Yatapox-, und Molluscipox-Viren.
• Vaccinia-Viren können zur heterologen Genexpression und/oder zur Verwendung als rekombinante Impfstoffe manipuliert werden (Mackett et al. (1982) PNAS USA 79: 7415–7419; Smith et al., (1984) Biotech Genet Engin Rev 2: 383–407).
• In einigen Ausführungsformen wird ein rekombinantes Vaccinia-Virus (z. B. MVA) der Erfindung zur Prophylaxe von infektiösen RSV-Krankheiten verwendet. In einigen Ausführungsformen ist ein Vaccinia-Virus ein stark abgeschwächtes modifiziertes Vaccinia-Virus Ankara (MVA), z. B. siehe Mayr. et al. (1975) Infection 3: 6–14; und Schweizer Patent-Nr. 568,392 . MVA-Viren sind öffentlich verfügbar, z. B. von der American Type Culture Collection als ATCC Nr. VR-1508. MVA ist durch seine Abschwächung gekennzeichnet, z. B. verminderte Virulent und eingeschränkte Fähigkeit, infektiöse Virionen in bestimmten Säugetierzellen zu reproduzieren, während die Kapazität, infektiöse Virionen in bestimmten Vogelzellen zu replizieren und zu produzieren, erhalten bleibt. MVA-Vektoren können beschränkte Replikation in humanen Zellen durchlaufen, da seine Replikation in der späten Phase der Infektion gelockt wird, wobei die Assemblierung reifer infektiöser Virionen verhindert wird.
• In einigen Ausführungsformen der Erfindung ist eine Polynukleotidsequenz, die ein modifiziertes RSV-Polypeptid(e) kodiert, zwischen MVA-flankierende Sequenzen inseriert, z. B. an eine natürlich vorkommende Deletion angrenzend, z. B. Deletion I, Deletion II, Deletion III, Deletion IV, Deletion V oder Deletion VI, oder andere nichtwesentliche Stellen, die im MVA-Genom vorliegen. Nichtwesentliche Regionen des MVA-Genoms schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf, intergenische Regionen und Regionen natürlich vorkommender Deletionen sowie andere nichtwesentliche Gene, z. B. das tk-Gen.
• Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zum Produzieren eines Vektors bereit, z. B. eines MVA-Vektors, umfassend Einführen in eine Wirtszelle von einem Vektor, einem isoliertes Polynukleotid(DNA)-Konstrukt, welches ein Polynukleotid umfasst, das ein modifiziertes RSV-Protein kodiert, um Insertion in die Vektor-Nukleinsäure, z. B. durch homologe Rekombination, zu ermöglichen. PCT-Publikation Nr. WO2011120045 beschreibt beispielhafte Verfahren zum Konstruieren Vaccinia-viraler Vektoren und die Verfahren können zur Konstruktion von anderen Typen viraler Vektoren verwendet werden.
• Ein MVA-Vektor kann immer noch eine beschränkte Kapazität haben, in bestimmten Säugetierzellen zu replizieren, z. B. BS-C-1- und CV-1-Zellen (Carroll und Moss (1997) Virology 238: 198–211). Während er in einigen oder meisten Säugetierzellen replikationsunfähig ist, kann ein MVA-Vektor immer noch die Kapazität haben, in anderen Säugetierzellen (z. B. BHK-21 Zellen) sowie in einigen Vogelzellen zu replizieren, zum Beispiel primären oder immortalisierten Küken- oder Entenzellen, z. B. AGE1.CR-, AGE1.CR.pIX-, oder EB66^TM-Zellen.
• Beispiele von Vaccinia-Virus-Vektoren, und in einigen Fällen MVA-Vektoren, und Verfahren, diese herzustellen, sind beschrieben in Carroll und Moss (Virology (1997) 238: 198–211; Moroziewicz et al. Curr. Opin. Mol. Ther. (2005) 7: 317–325; US-Patent-Nr. 5,110,587 ; 5,185,146 ; 6,440,422 ; 6,682,743 ; 7,094,412 ; 7,198,934 ; 7,550,147 ; und 7,816,508 ; US-Patent Veröffentlichungsnr. 20120028336 ; und PCT-Veröffentlichungen WO20 10/072365 und WO2011/120045 ).
• Die Erfindung schließt auch Wirtszellen (z. B. in vitro) ein, welche einen Vektor und/oder eine Nukleinsäure der Erfindung umfassen. In einigen Ausführungsformen exprimierte eine Wirtszelle ein modifiziertes RSV-Protein und/oder umfasst einen viralen Vektor der Erfindung. Die Erfindung schließt auch Verabreichen von Zellen, die ein modifiziertes RSV-Protein(e) der Erfindung exprimieren, an ein Tier ein. In einigen Ausführungsformen sind diese Zellen eine Zelllinie oder eine Zelle, die von einem Tier isoliert wurde, welche manipuliert wurde, sodass sie eine Nukleinsäure oder Vektor der Erfindung enthält und/oder dass sie ein Polypeptid der Erfindung exprimiert. Die Erfindung schließt auch Zellen ein, die einen Replikations-Vektor der Erfindung enthalten. Zellen, die einem Tier verabreicht werden, können zum Beispiel autolog, allogen, syngen oder xenogen sein.
• Einige Ausführungsformen der Erfindung stellen eine Zelle bereit, welche eine Nukleinsäure oder Vektor umfasst, welche aus einer kodierenden Region besteht, welche ein Polypeptid kodiert, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, 4, 13, 15, 17 oder 19; oder Aminosäuren 23–564 von SEQ ID NO: 2; 23–515 von SEQ ID NO: 4; 23–573 von SEQ ID NO: 13; 23–524 von SEQ ID NO: 15; 23–554 von SEQ ID NO: 17; und 23–505 von SEQ ID NO: 19 umfasst oder daraus besteht.
• Die Erfindung schließt auch Zusammensetzungen, immunogene Zusammensetzungen und pharmazeutische Zusammensetzungen oder Präparationen ein, die Nukleinsäure(n), Vektor(en) und/oder Protein(e) wie hierin beschrieben enthalten. Zusammensetzungen, wie z. B. pharmazeutische oder Impfstoff-Zusammensetzungen, die eine immunologisch wirksame Menge eines isolierten Polynukleotids, Polypeptids oder Vektors enthalten sind weitere Ausführungsformen der Erfindung. Die Zusammensetzungen können pharmazeutische, antigenische, immunogene, und/oder Impfstoff-Zusammensetzungen sein.
• Zusammensetzungen, wie z. B. Impfstoff-Zusammensetzungen, der vorliegenden Erfindung können z. B. nach den bekannten Verfahren formuliert sein. Geeignete Präparationverfahren sind zum Beispiel in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, A. Osol, Hrsg., Mack Publishing Co., Easton, P A (1980), und Remington's Pharmaceutical Sciences, 19. Auflage, A. R. Gennaro, Hrsg., Mack Publishing Co., Easton, PA (1995) beschrieben. Obwohl eine Zusammensetzung als eine wässrige Lösung formuliert sein kann, kann sie auch als eine Emulsion, Gel, Lösung, Suspension, lyophilisierte Form oder andere Form, die aus dem Stand der Technik bekannt ist, formuliert sein. In einigen Ausführungsformen enthält eine Zusammensetzung ein oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Zusatzstoffe einschließlich, zum Beispiel, Verdünner, Binder, Stabilisatoren, und Konservierungsmittel. Zusammensetzungen oder Formulierungen können auch andere Träger, Adjuvanzien, oder Nichttoxische, Nichttherapeutische, Stabilisatoren und dergleichen einschließen.
• Geeignete Formulierungen für eine gewünschte Art und Weise der Verabreichung können grundsätzlich in Remington's Pharmaceutical Sciences, letzte Auflage, Mack Publishing Co., Easton, Pa. gefunden werden.
• Grundsätzlich können Wasser, ein geeignetes Öl, Saline, wässrige Dextrose (z. B. Glucose), und verwandte Zuckerlösungen und Glykole, wie Propylenglykol oder Polyethylenglykole, geeignete Träger sein, z. B. für parenterale Lösungen. In einigen Ausführungsformen enthalten Lösungen für parenterale Verabreichung ein wasserlösliches Salz des aktiven Inhaltsstoffes, geeignete Stabilisatoren und/oder, falls gewünscht oder notwendig, Puffersubstanzen. Einige Ausführungsformen können antioxidierende Agenzien, wie Natriumbisulfit, Natriumsulfit, oder Ascorbinsäure, entweder allein oder in Kombination, als geeignete Stabilisatoren verwenden. Zitronensäure und ihre Salze und Natrium-EDTA können auch verwendet werden. Zusätzlich können Lösungen (z. B. für parenterale Verabreichung) Konservierungsmittel, wie Benzalkoniumchlorid, Methyl- oder Propylparaben, und Chlorbutanol enthalten.
• Zusammensetzungen, Nukleinsäuren, Vektoren und/oder Proteine der Erfindung können zu einem Impfstoff formuliert werden. Ein Impfstoff kann an ein Tier verabreicht werden, z. B. wie hierin beschrieben.
• In einigen Ausführungsformen enthält weiter eine Zusammensetzung (z. B. eine immunogene) der Erfindung ein pharmazeutisch akzeptables Adjuvans. Der Ausdruck „immunogene Zusammensetzung” wie hierin verwendet bezieht sich auf irgendeinen Typ biologischen Agens in einer verabreichbaren Form, die fähig ist, eine Immunantwort in einem Tier (einschließlich des Menschen), welches mit der immunogenen Zusammensetzung geimpft ist, zu stimulieren. Dies schließt Zusammensetzungen ein, die ein Polypeptid/Protein/Peptid umfassen, welches direkt eine Immunantwort stimulieren wird und Nukleinsäuren und Vektoren, die an ein Tier verabreicht werden können und die das Polypeptid/Protein/Peptid exprimieren werden, gegen welches eine Immunantwort hervorgerufen wird. In einigen Ausführungsformen kann eine Immunantwort Induktion von Antikörpern und/oder Induktion einer T-Zell-Antwort einschließen. In einigen Ausführungsformen verbessert eine Immunantwort (entweder teilweise oder vollständig) irgendein oder mehrere der Symptome, die mit der betreffenden Krankheit, Zustand oder Infektion assoziiert sind.
• In bestimmten Ausführungsformen werden immunogene Zusammensetzungen in der Immunisierung eines Tieres (z. B. einer Maus) durch Verfahren und Wege von Immunisierung, die dem Fachmann bekannt sind (z. B. intranasal, parenteral, intramuskulär, oral, rektal, vaginal, transdermal, intraperitoneal, intravenös, subkutan usw.) verwendet.
• In einigen Ausführungsformen umfasst eine Zusammensetzung der Erfindung einen oder mehrere Adjuvanzien. Für eine Zahl von Materialien ist gezeigt worden, dass sie Adjuvansaktivität durch eine Vielzahl an Mechanismen haben. In einigen Ausführungsformen umfasst ein oder mehrere Adjuvanzien, die mit einer Nukleinsäure, Vektor, Polypeptid oder Zusammensetzung verwendet werden, ist aber nicht beschränkt auf: inerte Träger, wie Alum, Bentonit, Latex, und Acrylpartikel; pluronische Blockpolymere, wie TITERMAX^® (Block-Copolymer CRL-8941, Squalen (ein metabolisierbares Öl) und ein Mikropartikel-Silica-Stabilisierer), Depotbilder, wie Freundsches-Adjuvans, oberflächenaktive Materialien, wie Saponin, Lysolecithin, Retinal, Quil A, Liposomen, und Formulierungen pluronischer Polymere, Makrophagen-Stimulatoren, wie bakterielle Lipopolysaccharide, polykationische Polymere, wie Chitosan, Komplement-Aktivatoren über den alternativen Weg, wie Insulin, Zymosan, Endotoxin, und Levamisol; und Nicht-WMC-Tenside, wie Poloxamere, Poly(oxyethylen)poly(oxypropylen)-Tri-Block-Copolymere, Zytokine und Wachstumsfaktoren; bakterielle Komponenten (z. B. Endotoxine, insbesondere Superantigene, Exotoxine und Zellwandkomponenten); Aluminium-basierte Salze wie Aluminiumhydroxid; Calcium-basierte Salze; Siliziumdioxid; Polynukleotide; Toxoide; Serumproteine, Viren und viralabgeleitete Materialien, Giftstoffe, Gifte, Imidazochinolverbindungen, Poloxamere, mLT, kationische Lipide, Toll-ähnliche-Rezeptoren(TLRs)-stimulierende Adjuvanzien (siehe z. B. Science 312: 184–187 (2006)). TLR-Adjuvanzien schließen Verbindungen ein, die die TLRs (z. B. TLR1–TLR17) stimulieren, was in einer erhöhten Immunsystemantwort auf eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung resultiert. TLR-Adjuvanzien schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf, CpG (z. B. Coley Pharmaceutical Group Inc.) und MPL (z. B. Corixa). Ein Beispiel eines CpG-Adjuvans ist CpG7909, welches in US-Patentanmeldungs-Publikationsar. 2002/0164341A, US-Patentnr. 6,727,230 , und Internationale Publikationen Nr. WO98/32462 und WO98/018810 beschrieben ist.
• In bestimmten Adjuvans-enthaltenden Zusammensetzungen ist das Adjuvans ein Zytokin. Einige Ausführungsformen der Erfindung umfassen ein oder mehrere Zytokine, Chemokine, oder Verbindungen, die die Produktion von Zytokinen und Chemokinen induzieren, oder ein Polynukleotid, das ein oder mehrere Zytokine, Chemokine, oder Polypeptide kodiert, welche die Produktion von Zytokinen und Chemokinen induzieren. Beispiele von Zytokinen schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf Granulozyten-Makrophagen Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF; siehe z. B. U.S.-Pat.-Nr. 5,078,996 und ATCC-Zugangsnr. 39900), Granulozyten Koloniestimulierenden Faktor (G-CSF), Makrophagen Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF), Kolonie-stimulierenden Faktor (CSF), Erythropoietin (EPO), Interleukin 2 (IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 (siehe, z. B. U.S.-Pat.-Nr. 5,723,127 ), IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, Interferon alpha (IFN-α), IFN-beta, IFN-gamma, IFN-omega, IFN-tau, Interferon gamma induzierender Faktor I (IGIF), transformierender Wachstumsfaktor beta (TGF-β), RANTES, Makrophagen-Entzündungs-Proteine (z. B. MIP-1 alpha und MIP-1 beta), Leishmania Elongations-Initiationsfaktor (LEIF) und Flt-3-Ligand.
• In einigen Ausführungsformen ist ein Adjuvans ein Aluminiumsalzadjuvans, ein Alum-präzipitierter Impfstoff oder ein Alum-adsorbierter Impfstoff. Beispiele von Aluminiumsalz-Adjuvanzien sind z. B. in Harlow und Lane (1988; Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory) und Nicklas (1992; Aluminum salts. Research in Immunology 143: 489–493) beschrieben. In einigen Ausführungsformen ist ein Aluminiumsalz ein hydratisiertes Aluminiumoxid, ein Aluminiumoxidhydrat, ein Aluminiumoxidtrihydrat (ATH), ein Aluminiumhydrat, ein Aluminiumtrihydrat, ein ALHYDROGEL^TM (eine sterilisierte Aluminiumhydroxid-Feuchtgel-Suspension), ein Aluminium-(III)-Hydroxid, ein amorphes Aluminiumoxid, trihydratisiertes Aluminiumoxid oder ein Trihydroxyaluminium. In einigen Ausführungsformen wird eine Aluminium-enthaltende Verbindung, wie Aluminiumhydroxid verwendet, um Proteine zu adsorbieren, z. B. in einem Verhältnis von 50–200 g Protein/mg Aluminiumhydroxid.
• In einigen Ausführungsformen ist ein Adjuvans ein Trägerpolypeptid. Trägerpolypeptid bezieht sich auf ein Protein oder immunogenes Fragment davon, welches mit einem RSV-Polypeptid der Erfindung (z. B. RSV modifiziertes F-Protein) konjugiert oder verbunden werden kann um Immunogenität des Polypeptids zu verstärken. Beispiele von Trägerproteinen schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf Schlitzschnecken-Hämocyanin, Albumin, Choleratoxin, hitzelabiles Enterotoxin und dergleichen. In einigen Ausführungsformen sind die zwei Komponenten als ein chimäres Konstrukt zur Expression als ein Fusionspolypeptid vorbereitet.
• In einigen Ausführungsformen kann die Fähigkeit eines Adjuvans, eine Immunantwort auf ein Antigen zu erhöhen, durch einen signifikanten Anstieg in einer immunvermittelten Reaktion(en) und/oder Reduktion in Krankheitssymptomen manifestiert sein. Zum Beispiel kann ein Anstieg in humoraler Immunität durch einen signifikanten Anstieg im Titer von Antikörpern, die gegen das Antigen produziert werden, manifestiert sein. Ein Anstieg in T-Zell-Aktivität kann durch erhöhte Zellproliferation, zelluläre Zytotoxizität und/oder Zytokinsekretion manifestiert sein. Ein Adjuvans kann die Immunantwort modifizieren, zum Beispiel, durch Ändern einer vorwiegend humoralen oder Th2-Antwort in eine vorwiegend zelluläre oder Th1-Antwort. Immunantworten auf ein gegebenes Antigen können durch verschiedene bekannte Immunassays und/oder wie hierin beschrieben getestet werden.
• In einigen Ausführungsformen umfasst ein Adjuvans irgendeine Kombination von Adjuvanzien, z. B. diese, die hierin offenbart sind. Zusammensetzungen der Erfindung können mit oder ohne ein Adjuvans formuliert werden.
• Einige Ausführungsformen der Erfindung stellen Verfahren bereit, um RSV-Infektion und/oder einen Zustand, der mit einer RSV-Infektion in einem Probanden assoziiert ist, zu behandeln oder zu inhibieren. Einige Verfahren umfassen Verabreichen einer Zusammensetzung, die ein Polynukleotid(e), Polypeptid(e), oder Vektor(en) der vorliegenden Erfindung enthält, an einen Probanden. In einigen Ausführungsformen ist der Proband ein Wirbeltier, z. B. ein Säugetier, ein Primat, oder ein Mensch. In einigen Ausführungsformen ist die Erfindung auf eine Methode zum Induzieren einer Immunantwort gegen ein RSV in einem Tier gerichtet, umfassend Verabreichen einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung, die irgendeine oder mehrere der Zusammensetzungen, Polynukleotide, Polypeptide, und/oder Vektoren der vorliegenden Erfindung enthält. In einigen Ausführungsformen kann ein Tier prophylaktisch mit den Polynukleotiden, Polypeptiden, Vektoren oder Zusammensetzungen der Erfindung behandelt werden, z. B. als ein prophylaktischer Impfstoff, um Immunität gegen einen oder mehrere Typen von RSV-Virus (z. B. RSV-A und/oder RSV-B) zu schaffen oder zu verstärken, z. B. in einem gesunden Tier vor Kontakt mit einem RSV oder vor Aufweisen eines Symptoms, welches mit RSV-Infektion zusammenhängt. Deshalb verhindern einige Ausführungsformen der Erfindung RSV-bedingte Krankheitssymptome oder reduzieren den Schweregrad der Krankheitssymptome. Ein oder mehrere Polynukleotide, Polypeptide, Vektoren oder Zusammensetzungen der Erfindung können auch verwendet werden, um ein Tier zu behandeln, welches bereits einem RSV ausgesetzt ist oder welches bereits an einem RSV-bedingten Symptom(en) leidet, durch Stimulieren des Immunsystems des Tieres, wodurch die Symptome, die mit der Aussetzung assoziiert sind, reduziert oder eliminiert werden.
• „Behandlung” bezieht sich auf die Verwendung eines oder mehrerer Polynukleotide, Polypeptide, Vektoren oder Zusammensetzungen der Erfindung, um den Schweregrad der Symptome, die durch eine RSV-Infektion verursacht werden, zu verhindern, zu heilen, zu verzögern, zu verbessern, zu inhibieren oder zu reduzieren und/oder jegliches Verschlechtern der Symptome über einen bestimmten Zeitabschnitt zu inhibieren. Es ist nicht vonnöten, dass irgendwelche Polynukleotide, Polypeptide, Vektoren oder Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung völligen Schutz bereitstellen, z. B. gegen eine RSV-Infektion oder vollständig alle Symptome heilen oder eliminieren. Behandlung mit Zusammensetzungen, die ein Polynukleotid(e), Polypeptid(e), oder Vektor(en) der Erfindung umfassen, kann separat oder in Verbindung mit anderen Behandlungen, falls angemessen, geschehen, zum Beispiel während ein Patient gleichzeitig mit einem Antikörper behandelt wird, wie Palivizumab oder Motavizumab, welcher ein RSV-Protein bindet.
• Einige Ausführungsformen stellen Verfahren zum Generieren von Antikörpern und/oder Immunantworten in einem Tier gegen RSV oder gegen RSV-Proteine bereit. Einige Ausführungsformen sind Verfahren zum Produzieren einer Immunantwort auf ein RSV-F-Protein und/oder RAGP umfassend Verabreichung eines viralen Vektors, immunogener Zusammensetzung oder pharmazeutischer Zusammensetzung der Erfindung an ein Tier. In einigen Ausführungsformen wird ein RAGP der Erfindung ohne ein RSV-F-Protein verwendet, z. B. um eine Immunantwort zu induzieren oder in einer immunogenen Zusammensetzung. In einigen Ausführungsformen kodiert eine Nukleinsäure oder Vektor (z. B. MVA-Vektor), der ein RAGP der Erfindung kodiert, nicht für ein RSV F-Protein.
• In einigen Ausführungsformen wird ein modifiziertes RSV-Protein der Erfindung verwendet um Antikörper, die an das modifizierte RSV-Protein binden, auszusondern und/oder auszuwählen.
• In einigen Ausführungsformen werden diese Antikörper weiter ausgesondert und/oder ausgewählt für jene, die das modifizierte RSV-Protein und das korrespondierende native Protein binden.
• In einigen Ausführungsformen der Erfindung wird ein Polynukleotid(e), Polypeptid(e), Vektor und/oder Zusammensetzung(en) der Erfindung an einen Patienten in einer Menge verabreicht, die ausreichend ist, eine wirksame zytotoxische T-Lyphozyten(CTL)-Antwort auf ein RSV-Polypeptid hervorzurufen.
• In einigen Ausführungsformen sind die Bereiche für Verabreichung und/oder Immunisierung von viralen Vektoren, einschließlich Vaccinia- und MVA-Vektoren von ungefähr 100 bis ungefähr 1 × 10¹⁵ oder ungefähr 10⁵ bis ungefähr 10⁹ Plaque-bildende Einheiten (pfu) oder Transduziereinheiten. In einigen Ausführungsformen wird eine verstärkende Dosierung von ungefähr 10³ pfu bis ungefähr 10⁸ pfu oder ungefähr 10⁶ pfu bis ungefähr 10⁹ pfu an Vektor gegeben, zum Beispiel, gemäß eines verstärkenden Regimes über Wochen bis Monate. Dies kann von der Antwort und dem Zustand des Patienten abhängen, z. B. durch Messen spezifischer CTL-Aktivität im Blut des Patienten. In einigen Ausführungsformen für die humane Verabreichung ist ein Dosisbereich für die initiale Immunisierung (z. B. für therapeutische oder prophylaktische Verabreichung) von ungefähr 10² bis ungefähr 10²⁰ pfu oder Transduziereinheiten für einen 70-kg-Patienten. In einigen Ausführungsformen wird ungefähr 1000, 5 × 10⁴, 10⁵, 5 × 10⁵, 10⁶, 5 × 10⁶, 10⁷, 5 × 10⁷, 10⁸, 5 × 10⁸, 10⁹, oder 10¹⁰ pfu oder Tranduziereinheiten als initiale Dosismenge und/oder als verstärkende Dosismenge und in einigen Fällen gemäß eines verstärkenden Regimes über Wochen bis Monate, z. B. abhängig von Antwort und Zustand des Patienten. In einigen Ausführungsformen produziert eine wirksame Menge einer Nukleinsäure, Vektor, Polypeptid oder Zusammensetzung der Erfindung einen Anstieg des Antikörper-Titers auf mindestens das zwei- oder dreifache des Antikörper-Titers vor der Verabreichung.
• In einigen Ausführungsformen der Erfindung werden Nukleinsäuren, Vektoren, Polypeptide oder Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung durch mukosale Gabe, transdermale Gabe, subkutane Injektion, intravenöse Injektion, orale Verabreichung, pulmonale Verabreichung, intramuskuläre Verabreichung oder durch intradurale Injektion verabreicht. In einigen Ausführungsformen werden sie transdermal eingeschleust, einschließlich, aber nicht beschränkt auf intradermale (z. B. in die Dermis oder Epidermis), transdermale (z. B. perkutane) und transmucosale Verabreichung (z. B. in oder durch die Haut oder Schleimhautgewebe).
• In einigen Ausführungsformen stimulieren Polynukleotide, Polypeptide, Vektoren, oder Zusammensetzungen der Erfindung eine zellvermittelte Immunantwort, die z. B. für Schutz eines Tieres gegen eine RSV-virale Infektion ausreichend ist oder die Symptome einer RSV-Infektion abzuschwächen, zu lindern, zu reduzieren und/oder zu inhibieren. In anderen Ausführungsformen induzieren Polynukleotide, Polypeptide, Vektoren oder Zusammensetzungen der Erfindung eine humorale Immunantwort. In bestimmten Ausführungsformen stimulieren Polynukleotide, Polypeptide oder Vektoren der Erfindung sowohl eine humorale als auch eine zellvermittelte Antwort, wobei in einigen Fällen die Kombination davon für den Schutz gegen eine oder Reduktion/Inhibition einer RSV-Infektion ausreichend ist.
• Verabreichung kann wiederholt werden, falls notwendig oder erwünscht. In einigen Ausführungsformen kann eine Initialdosis von einer, zwei, drei oder mehr Verstärkungsdosen. In einigen Ausführungsformen kann eine Verstärkungsinjektion 4 bis 8 Wochen nach der ersten zugehörigen Immunisierung verabreicht werden und optional kann eine zweite Verstärkung 8 bis 12 Wochen später verabreicht werden, z. B. durch Verwenden derselben Formulierung. Wenn multiple immunverstärkende Dosen (z. B. Impfstoffe) verabreicht werden, können die multiplen Dosen (i) alle dieselbe Nukleinsäure, Vektor, Protein oder Zusammensetzung der Erfindung, (ii) verschiedene Nukleinsäuren, Vektoren, Proteine oder Zusammensetzungen der Erfindung sein; oder (iii) können eine Kombination einer Nukleinsäure(n), Vektor(en), Protein(e) oder Zusammensetzung(en) der Erfindung sein und können andere Verbindungen oder Agenzien einschließen, z. B. diese, die eine Immunantwort auf RSV oder RSV-Protein(e) induzieren.
• Für Behandlung zugängliche Probanden schließen Individuen mit Risiko für RSV-verwandte Krankheit, die keine Symptome zeigen, sowie Patienten, die derzeit Symptome zeigen, ein. Deshalb können die Zusammensetzungen prophylaktisch an die allgemeine Bevölkerung verabreicht werden. In symptomatischen Probanden kann die Behandlung in jedem Alter beginnen. Die Behandlung kann überwacht werden, zum Beispiel, durch Untersuchen der Antikörperspiegel über Zeit und/oder RSV-spezifischer T-Zell-Antworten. Wenn die Immunantwort oder der Antikörperspiegel fällt kann eine Verstärkerdosis angezeigt sein.
• Alle Publikationen, Patente und Patentanmeldungen, die in dieser Spezifikation erwähnt werden sind hierin in ihrer Gesamtheit per Bezug in die Spezifikation eingegliedert, im selben Umfang als ob für jede einzelne Publikation, Patent oder Patentanmeldung spezifisch und einzeln angedeutet wäre, dass sie hierin per Bezug eingegliedert ist. Außerdem ist jede ergänzende Information per Bezug eingegliedert, die mit irgendeiner der obengenannten Publikationen, Patente und Patentanmeldungen publiziert wurde. Zum Beispiel sind einige Journalartikel mit ergänzender Information publiziert, die typischerweise online erhältlich ist.
• Beispiele
• Die Erfindung wird jetzt in Bezug auf die folgenden Beispiele beschrieben. Diese Beispiele werden nur zum Zwecke der Veranschaulichung bereitgestellt und die Erfindung sollte keinesfalls interpretiert werden, dass sie auf diese Beispiele beschränkt ist, sondern sollte vielmehr interpretiert werden, dass sie jede und alle Variationen umfasst, die als Ergebnis der Lehre, die hierin bereitgestellt wird, offensichtlich werden.
• Während bestimmte Ausführungsformen der Erfindung zum Zwecke der Beschreibung hierin beschrieben worden sind, wird es von den Fachleuten anerkannt werden, dass zahlreiche Variationen der Details gemacht werden können, ohne von der Erfindung, wie sie in den angefügten Ansprüchen beschrieben wird, abzuweichen.
• Beispiel 1 – Aufbau von mEM60-mEM67
• Konstrukte mEM60-mEM67 enthalten kodierende Regionen für verschiedene Versionen eines RSV-F-Proteins mit oder ohne eine kodierenden Region für eine konservierte Domäne/Region für ein RSV-Anheftungs-G-Protein.
• Aufbau der Konstrukte mEM60-mEM67 wurde durch Verwenden von Standard-Techniken durchgeführt. Die DNA-Sequenz, die das RSV-F-Protein oder modifizierte RSV-F-Protein für Konstrukte mEM60-mEM67 kodiert lautet wie folgt: mEM60 = SEQ ID NO:2; mEM61 = SEQ ID NO: 14; mEM62 = SEQ ID NO: 16; mEM63 = SEQ ID NO: 18; mEM64 = SEQ ID NO: 18; mEM65 = SEQ ID NO: 16; mEM66 = SEQ ID NO: 16; und mEM67 = SEQ ID NO: 18. Die mEM60-mEM67-DNA-Konstrukte wurden für den Aufbau rekombinanter MVA-Vektoren wie in Beispiel 2 beschrieben verwendet.
• Tabelle 1 und 1B fasst die Eigenschaften jeder dieser Konstrukte/Inserts zusammen. Tabelle 1 – Eigenschaften von mEM60-mEM67

  Konstrukt	Promotor	Fusionspeptid	TM/CT	konservierte G-Domäne	RSV-F-Protein Aminosäuresequenz
  mEM60	H5	+	+	–	SEQ ID NO: 13
  mEM61	H5	+	–	–	SEQ ID NO: 15
  mEM62	H5	–	+	–	SEQ ID NO: 17
  mEM63	H5	–	–	–	SEQ ID NO: 19
  mEM64	H5	–	–	+	SEQ ID NO: 19
  mEM65	p7.5	–	+	–	SEQ ID NO: 17
  mEM66	H5	–	+	+	SEQ ID NO: 17
  mEM67	p7.5	–	–	–	SEQ ID NO: 19

• Promotoren H5 und p7.5 stammen aus den H5 und p7.5-Vaccinia-Virus-Genen und die bestimmte Sequenz, die in diesen Konstrukten verwendet wird ist in SEQ ID NO: 7 (p7.5) beziehungsweise SEQ ID NO: 8 (H5) dargestellt. Fusionspeptid bezieht sich auf das Fusionspeptid innerhalb eines RSV-F-Proteins wobei sich ein Plus(+)-Zeichen auf ein RSV-F-Protein ohne Deletion der Fusionspeptidsequenz bezieht, während sich ein Minus-Zeichen (–), in diesem Fall auf ein RSV-F-Protein mit einer Deletion in der Fusionspeptidsequenz bezieht, die Aminosäuren 137–155 eines RSV-F-Proteins (SEQ ID NO: 11) entspricht. TM/CT bezieht sich auf die Transmembran(TM)- und zytoplasmatische Schwanz(CT)-Domäne eines RSV-F-Proteins wobei sich ein Plus(+)-Zeichen auf ein RSV-F-Protein ohne Deletion in dieser Domäne bezieht, während sich ein Minus-Zeichen (–), in diesem Fall auf ein RSV-F-Protein mit einer Deletion bezieht, die Aminosäuren 525–573 eines RSV-F-Proteins (SEQ ID NO: 11) entspricht, carboxyterminale 49 Aminosäuren. Konservierte G-Domäne bezieht sich auf die Anwesenheit (+) oder Abwesenheit (–) von Aminosäuren 2 bis 102 von SEQ ID NO: 6, einer konservierten Domäne eines RSV-Anheftungs-G-Proteins.
• Beispiel 2 – Aufbau von vEM153, vEM154, vEM155 and vEM156
• Vier verschiedene Konstrukte wurden hergestellt, sodass sie eine kodierende Region für ein modifiziertes RSF-F-Protein mit einer Deletion im Fusionspeptid enthielten. Die Konstrukte unterschieden sich je nachdem ob die das modifizierte RSF-F-Protein kodierende Region für eine Transmembrandomäne und einen zytoplasmatischen Schwanz/Domäne eines RSV-F-Proteins kodierte und ob die Konstrukte eine kodierende Region für eine konservierte Region eines RSV-A-G-Proteins enthielten. Siehe 1A.
• vEM132 und vEM134 (2A beziehungsweise 2B) wurden als Template für eine in vitro Mutagenese für die Deletion von Aminosäuren 137–145 des F-Proteins verwendet, welche Teil des Fusionspeptids sind. (Dies steht im Gegensatz zu Konstrukten in Beispiel 1, welche eine größere Deletion der Aminosäuren 137–155 hatten.) Die Primer, die für die in vitro Mutagenese verwendet wurden, waren: Fwd:

  

  Rev:

  
• Für die in vitro Mutagenese wurden zwei verschiedene Polymerasen verwendet:
• A) PFU aus dem Quick-Change-Kit für ortsgerichtete Mutagenese: 5 μl Template-DNA (10 ng/μl) wurden mit 5 μl 10x Puffer, 2,5 μl pro Primer Arbeitsstammlösung, 1 μl dNTPs und 1,0 μl PFU-Polymerase gemischt und mit H₂O auf 50 μl aufgefüllt.
• Die nachfolgende PCR-Reaktion wurde unter folgenden Einstellungen durchgeführt:
  95°C 5 min, 20 Zyklen bei 95°C 1 min dann 72°C 15 min, 67°C 1 min, 72°C 30 min, 4°C bis zum Ende.
• B) PHUSION^TM-Polymerase (New England Biolabs): 5 μl Template-DNA (10 ng/μl) wurden mit 10 μl 5x HF-Puffer, 2,5 μl pro Primer Arbeitsstammlösung, 1 μl dNTPs und 0,5 μl PFU-Polymerase gemischt und mit H₂O auf 50 μl aufgefüllt.
• Die nachfolgende PCR-Reaktion wurde unter folgenden Einstellungen durchgeführt:
  98°C 3 min, 20 Zyklen bei 98°C 45 sec dann 72°C 8 min, 72°C 10 min, 4°C bis zum Ende.
• 3 μl des resultierenden PCR-Produkts wurden auf einem 1%-Agarosegel analysiert und das verbliebene Material mit DpnI verdaut. Die verdauten Proben wurden für eine Gelextraktion des benötigen Produkts verwendet durch Verwenden des Macherey-Nagel PCR-Aufreinigungs-Kits. Die DNA wurde in 15 μl Elutionspuffer eluiert und die aufgereinigte DNA für die Transformation von DHSα^TM (MAX EFFICIENCY^TM DHSα^TM kompetente Zellen, Life Technologies) und XL-1 Blue kompetente Zellen (QuikChange^TM-Kit für ortsgerichtete Mutagenese, Stratagene Cloning Systems) gemäß Standardprotokollen verwendet. 2A und 2B zeigen schematische Repräsentationen der Vektoren vEM132 beziehungsweise vEM134.
• Bakterien, die die modifizierten Shuttle-Vektoren vEM153 und 154 enthielten, wurden amplifiziert und DNA wurde unter Verwenden von Standard-Plasmid-Midi-Präparationsprotokollen extrahiert. Die DNA wurde dann für den Aufbau eines rekombinanten MVA verwendet.
• Für die Generierung rekombinanter RSV-F-Protein-Varianten exprimierender MVA wurden CEF-Zellen mit einem MVA bei MOI 0,5 infiziert und nach 1 Stunde Inkubation mit den rekombinanten Vektoren vEM153 (F-Protein Δ137–145) beziehungsweise vEM154 (F-Protein Δ137–145 und ΔTM) transfiziert. 1,75 μg der Plasmid-DNA und 6 μ des X-TREMEGENE^TM HD Transfektionsreagens (Roche) wurden zur Transfektion verwendet, die gemäß der Anleitung des Herstellers durchgeführt wurde. Nach Inkubation wurden die Zellen visuell nach fluoreszierenden Zellen ausgesondert, welche die Anwesenheit des Rekombinationsvektors (vEM153 oder vEM154) und MVA innerhalb der Zellen anzeigt. Um rekombinante MVAs (mit RSV-F-Protein) von parentalen MVA zu separieren wurden mehrere Plaque-Aufreinigungsrunden unter selektiven Bedingungen unter Verwenden von Blasticidin durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden die infizierten (und transfizierten) Zellen geerntet und Virus wurde durch drei Gefrier/Tau-Zyklen zwischen flüssigem Stickstoffund 37°C-Wasserbad und nachfolgender Ultraschallbehandlung freigesetzt. CEF-Zellen wurden mit Serien von Virusverdünnungen infiziert und nach Inkubation für 48 bis 72 Stunden nach fluoreszierenden Foci abgesondert. Mehrere einzelne Foci wurden isoliert und nach jeder Runde von Plaque-Aufreinigung abgesondert. Das Virus wurde passagiert und Plaque-aufgereinigt bis keine parentale MVA detektierbar war. Für die darauffolgende Deletion der Selektionskassette, die eine Azami-Green und eine Blasticidin-Resistenz (BsdR) kodierenden Region enthielt, wurden die klonal reinen rekombinanten Viren ohne Blasticidin passagiert. Ohne Blasticidinselektion wird die Kassette durch Rekombination zwischen dem Fla...at und dem 3'-Ende von Flank 1, siehe 2A–C, deletiert. Plaques ohne Fluoreszenz wurden durch mehrere Runden von Plaque-Aufreinigung isoliert. Schließlich wurde ein Roh-Virus-Stamm in CEF-Zellen amplifiziert.
• Beispiel 3 – Aufbau von vEM155 und vEM156
• Für den Aufbau der Shuttle-Vektoren vEM155 und vEM156 wurden das trunkierte Fusionspeptid und flankierende Sequenzen durch PCR von Vektor vEM153 und vEM154 amplifiziert und in vEM138 inseriert (2C), um das existierende F-Protein in dem Rekombinations-Vektor durch das PCR-amplifizierte F-Protein mit trunkiertem Fusionspeptid zu ersetzen.
• Für die PCR-Amplifikation des F-Proteins mit trunkiertem Fusionspeptid, wurden vEM153 und vEM154 als Template verwendet unter Verwendung der Oligonukleotid-Primer SEQ ID NO: 11/SEQ ID NO: 12 (für vEM153) oder SEQ ID NO: 11/SEQ ID NO: 13 (für vEM154). Der SEQ ID NO: 11 Primer (Forward-Primer) fügt die Restriktionsendonukleasestelle für KpnI zum 5'-Ende des H5-Promotors hinzu. Am 3'-Ende der kodierenden Region wurde die existierende Restriktionsendonukleasestelle für PacI verwendet.
• 
• Kleingeschriebene Buchstaben zeigen Sequenzen an, die nicht an die Template-Sequenz binden. Unterstrichene Sequenzen zeigen Restriktionsendonukleasestellen an, die für weiteres Klonen verwendet wurden.
• Für die PCR wurden 5 μl Template-DNA (10 ng/μl) mit 10 μl 5x HF-Puffer, 2,5 μl Forward- und Reverse-Primer (10 mmol/μl), 1 μl dNTPs und 0,5 μl PHUSION^TM-Polymerase (New England Biolabs) gemischt und mit H₂O auf 50 μl aufgefüllt.
• Die nachfolgende PCR-Reaktion wurde unter folgenden Einstellungen durchgeführt:
  98°C 3 min, 35 Zyklen bei 98°C 20 sec dann 63°C 30 sec dann 72°C 90 sec, 72°C 10 min, 4°C bis zum Ende.
• Die resultierenden PCR-Produkte wurden auf einem 1%-Agarosegel analysiert und das verbliebene PCR-Produkt wurde unter Verwenden des Macherey-Nagel PCR-Aufreinigungs-Kits aufgereinigt. Die aufgereinigte DNA und der Vektor vEM138 wurden mit KpnI und PacI verdaut und die Fragmente mit der korrekten Größe von einem 1%-Agarosegel aufgereinigt (PCR-Produkte ~1.8 kb und vEM138 ~5.5 kb). Eine Ligation wurde mit einer T4 DNA-Ligase und einem Vektor zu einem Inserierungsverhältnis von 1:3 durchgeführt. 1 μl des Ligationsgemisches wurden für die Transformation von DH5α^TM (MAX EFFICIENCY^TM DH5α^TM kompetente Zellen) Bakterien gemäß Standardprotokollen verwendet.
• Plasmide vEM155 und 156 enthaltende Bakterien wurden amplifiziert und DNA wurde unter Verwenden von Standard-Plasmid-Midi-Präparationsprotokollen extrahiert. Die DNA wurde dann für den Aufbau eines rekombinanten MVA-Vektors verwendet, wie in Beispiel 2 beschrieben.
• Beispiel 4 – Überprüfen der Expression der Konstrukte
• Die RSV-Expressions-Konstrukte und/oder MVA-Vektoren, die die Konstrukte exprimieren, werden auf Expression des modifizierten RSV-F-Proteins und, falls zutreffend, Expression der RSV-G-Protein konservierten Region überprüft. Expression kann durch zum Beispiel Western Blot, ELISA und/oder Immunfluoreszenz analysiert werden.
• Im Folgenden ist ein ELISA beschrieben, der verwendet werden kann. Zu diesem Zwecke werden A549- oder HeLa-Zellen in Zellkulturplatten (z. B. 6-Well-Platten) in einer angemessenen Zellzahl ausgesät, um ~90% Konfluenz innerhalb von 24 Stunden zu erreichen. (z. B. HeLa-Zellen und A549-Zellen zu ungefähr 8 × 10⁵ Zellen/Well beziehungsweise 4 × 10⁵ Zellen/Well in 6-Well-Platten). Am nächsten Tag werden die Zellen in einem Well gezählt. Basierend auf der Zahl werden die Wells mit einem MOI 5 durch Ersetzen des Mediums mit dem Infektionsmix in Medium ohne FBS infiziert. Die Platte wird bei Raumtemperatur (R/T) für 30 min geschüttelt und dann in einen Inkubator für 30 min gelegt. Der Infektionsmix wird dann durch ein geeignetes Volumen an Medium ohne FBS ersetzt (z. B. 1 mL/Well für 6-Well-Platten) und für 18–48 Stunden inkubiert.
• Die totalen Proteinextrakte und der Überstand werden dann geerntet. Für MVA werden direkte ELISA Totalproteinextrakte verwendet. Das 10xx RIPA (Thermo Scientific) plus 100x HALT^TM Proteaseinhibitor (Thermo Scientific) und 100x EDTA in PBS zu 1 × Endkonzentration werden gemischt (z. B. für 1 ml Lysepuffer: 100 μl 10x RIPA + 10 μl 100x HALT^TM Proteaseinhibitor + 10 μl 100x EDTA + 880 μl PBS). 100–200 μl dieses Lysepuffers wird zu pelletierten und PBS-gewaschenen Zellen für jedes Well einer 6-Well-Platte hinzugefügt.
• Zellen werden für 30 min bis 1 Stunde auf Eis inkubiert, in flüssigem N₂ schockgefroren und auf Eis getaut. Die Gefäße werden gevortext und zellulärer Rückstand wird pelletiert, z. B. 11000x g, 5 min, 4°C). Überstand wird in frische Gefäße transferiert, gevortext und in geeignete Volumina aliquotiert (z. B. 200 μl in 0,5 μl-Gefäßen).
• Für den ELISA verdünne man die Proben & Standards in 1 × PBS auf eine geeignete Konzentration (z. B. verwende man nur PBS oder äquivalente Puffer, da andere Proteine von BSA oder FBS den Assay durch Limitieren verfügbarer Bindungsstellen auf der Plastikoberfläche verschlechtern können). In einer 96-Well-Platte (Pierce REACTI-BIND^TM) füge man 100 μl/Well an Probe und Standardverdünnungen hinzu, bedecke die Platte und inkubiere 2 Stunden bei 37°C oder über Nacht bei 4°C. In der Zwischenzeit bereite man Blockierungspuffer (PBS-TWEEN^TM 0,05% + 2% BSA) und Verdünnungspuffer (PBS-TWEEN^TM 0,05% + 0,5% BSA) vor.
• Nach der Inkubationszeit schüttele man die Platte bei R/T für 10–15 min um zusätzliches Binden zu ermöglichen. Um die Beschichtungslösung zu entfernen, wasche man 5-mal mit 250 μl PBS-T 0,05%. Dann füge man 250–300 μl/Well Blockierungspuffer hinzu und inkubiere für 1 Stunde bei R/T mit moderatem Schütteln. Man verdünne den primären Antikörper auf eine geeignete Konzentration mit Verdünnungspuffer. Man entferne Blockierungspuffer und füge 100 μl/Well Primärantikörperlösung hinzu und inkubiere für 1 Stunde bei R/T mit moderatem Schütteln. Man entferne die Primärantikörperlösung und wasche 5-mal mit 250 μl PBS-T 0,05%. Man verdünne den sekundären Antikörper in Verdünnungspuffer, füge 100 μl/Well hinzu und inkubiere 1 Stunde bei R/T mit moderatem Schütteln. In der Zwischenzeit wärme man ein Aliquot von TMB-Substrat auf R/T im Dunkeln auf (11 ml pro Platte). Man entferne Sekundärantikörperlösung und wasche Platte 5-mal mit 250 μl PBS-T 0,05%. Als nächstes füge man 100 μl/Well TMB-Substrat hinzu und inkubiere bei R/T mit starkem Schütteln (z. B. 600 rpm) bis sich die gewünschte Farbe entwickelt (1–30 min). Man beendee die Reaktion durch Hinzufügen von 100 μl/Well einer H₂SO₄-Lösung und messe Absorption bei 450 nm (z. B. in einem Tecan Infinite F200Pro Plattenleser). Die Daten können mittels einer vorbereiteten Excel-Datei analysiert werden. Die gesamten RSV-F-Protein-spezifischen Werte werden zu den MVA spezifischen Werten normalisiert und verglichen.
• Während sich dieses Beispiel auf Verwenden eines MVA-Vektors bezieht um die Konstrukte zu exprimieren, können ähnliche Expressionsstudien durch Verwenden anderer Verfahren durchgeführt werden, um die Konstrukte zu exprimieren, wie Transfektion von DNA, die die Konstrukte enthält oder Verwenden anderer viraler Vektoren, um die Konstrukte zu exprimieren.
• Beispiel 5 – Bestimmen der Stabilität viraler Vektoren, die Konstrukte enthalten
• Genetische Stabilität der RSV-Konstrukte wird durch serielles Passagieren des Virus auf Zellen evaluiert, z. B. Vogelzellen wie CEF-Zellen oder AGE1.CR.pIX-Zellen (ProBioGen).
• Zu diesem Zwecke werden 20 ml von AGE1.CR.pIX-Zellen auf 1 × 10⁶ Zellen/ml eingestellt und bei 37°C mit Schütteln kultiviert. Nach 3–4 Tagen werden die Zellen gezählt, mit MVA-RSV-Varianten bei einem MOI von 0,1 unter Zugabe von 20 ml CD-VP4-Medium (ProBioGen AG/Biochrom AG) infiziert, und bei 37°C mit Schütteln für 3 Tage inkubiert. Als nächstes werden die Zellen geerntet und MVA wird von infizierten Zellen durch drei Zyklen von Gefrieren/Tauen und/oder Beschallung freigesetzt. Um die Zeit der Stabilitätsstudie zu reduzieren wird der Titer des freigesetzten Virus für weitere Infektionsrunden abhängig von der Startmenge von infizierten Zellen (z. B. Virustiter auf AGE-Zellen 1 × 10⁷ TCID₅₀/ml) abgeschätzt. Dieser abgeschätzte Titer wird für alle folgenden Infektionsrunden verwendet. Die RSV-Konstrukte werden 6-mal auf AGE1.CR.pIX-Zellen passagiert. Nach Passage 3 und Passage 6 wird die Integrität des Inserts durch Sequenzieren verifiziert. Zum Sequenzieren wird DNA infizierter Zellen mit dem NUCLEOSPIN^TM Blood Quick Pure DNA Kit (Macherey-Nagel) gemäß des Protokolls des Herstellers isoliert. PCR wird zur Amplifikation der Insertionsstelle plus flankierender Regionen innerhalb des MVA-Genoms durchgeführt und die Insertionssequenz durch Sanger-Sequenzierung bestimmt.
• Ein optimal stabiles rekombinantes MVA würde eine Insertionssequenz zu 100% wie erwartet haben, aber jene mit minimalen Änderungen können von Wert sein. Im Falle von Instabilitäten kann das Verhältnis von intakten/defekten Genomen bestimmt werden. Defekte Genome bis 5% der Gesamtmenge an Genomen kann akzeptiert werden.
• Beispiel 6 – Testen von Konstrukten in Tierstudien
• Die Konstrukte oder die resultierenden Proteine/Antigene werden in Tiermodellen getestet, um Immunogenität, Schutzwirkung, Sicherheit, Langzeitimmunogenität, Beständigkeit des Schutzes zu testen.
• Die Konstrukte werden an Nagetiere (z. B. Mäuse und/oder Ratten) verabreicht. Verschiedene Parameter können bewertet werden, wie IgA-Antwort (Cusi et al. Vaccine (2002) 20: 3436–42), Menge an anti-RSV-Antikörpern und/oder neutralisierenden Antikörpern, z. B. siehe Nguyen et al. (PLOS One (2012) 7(3): e34331: 1–11).
• Die Konstrukte werden an Baumwollratten, z. B. zu verschiedenen Dosierungen, verabreicht. Verschiedene Parameter können bewertet werden, wie B-Zell- oder T-Zellantworten, z. B. siehe Zhan et al. (Vaccine (2007) 25: 8782–8793).
• Verabreichung kann auf jedem Weg oder Kombination von Wegen getestet werden, zum Beispiel, intranasal, intramuskulär, subkutan, intradermal, und/oder intravenös.
• Beispiel 7 – Immunogenitäts- und Schutzstudie
• MVA-Vektoren, die RSV-Antigene exprimieren, werden intranasal und/oder intramuskulär an Baumwollratten oder Mäuse (z. B. BALB/C Mäuse) beimpft. Eine Dosiermenge (z. B. 5 × 10 infektiöse Einheiten) von MVA wird z. B. in 0,1 ml intranasal verabreicht. Die MVA-Vektoren werden einmal, zweimal oder mehrmals verabreicht, z. B. an Tag 0 und an Tag 28. Die Anti-RSV-Antikörper werden während der Studie gemessen, z. B. durch ELISA. Für Challenge/Schutz-Studien wird RSV zu einer späteren Zeit verabreicht (z. B. 60 Tage nach der ersten Dosierung mit MVA), z. B. werden 1 × 10⁶ infektiöse Einheiten von RSV intranasal verabreicht. Mäuse werden später geopfert und Titer von Challenge-Virus werden bestimmt, z. B. in den Nasenmuscheln und/oder Lungen, z. B. siehe Whitehead et al. (1998) Virology 247: 232–239. Titer von Virus von den Lungen von Tieren, die MVA-Vektoren empfangen, die RSV-Antigene exprimieren, werden miteinander verglichen, falls verschiedene Dosierungsmengen und/oder -abläufe getestet werden, und mit denen von Tieren verglichen, die MVA-Vektoren, die RSV-Antigene exprimieren, nicht empfangen oder jenen, die ein MVA, der RSV-Antigen nicht exprimiert, empfangen.
• Beispiel 8 – Analyse von aus den mEM60–mEM67-Konstrukten hergestellten MVA-Vektoren
• Die mEM60–mEM67-Konstrukte kodieren für verschiedene Versionen eines RSV-F-Proteins und einige dieser Konstrukte kodieren zusätzlich für eine konservierte Region/Domäne eines RSV-Anheftungs-G-Proteins.
• Die resultierenden MVA-Vektoren wurden charakterisiert durch: Sequenzieren der Insertionsregion; PCR-Analyse von restlichem leeren Vektor; Titrieren; Wachstumsanalyse, quantitative und qualitative Expressionsanalyse; und Stabilität nach 6 Passagen auf AGE.CR1.pIX-Zellen.
• Für alle 8 Konstrukte wurde gezeigt, dass die Sequenz der Insertionsregion wie erwartet war, das Fehlen von restlichem leeren Vektor wurde bewiesen, der Titer wurde bestimmt und die Wachstumsstudie deckte auf, dass alle Konstrukte effizientes Wachstum zeigen.
• Im Gegensatz deckte die Expressionsanalyse auffällige Unterschiede im Expressionslevel auf, welche abhängig vom Vorhandensein des Fusionspeptids (3A und 3B) und möglicherweise vom verwendeten Promotor (3B) erschienen.
• Zellen wurden mit den MVA-RSV-Konstrukten mEM60–mEM67 infiziert und die Zelllysate sowie Überstände wurden auf F-Protein getestet. Zellen wurden auch mit leerem Vektor MVAtor und Attrappen als Negativkontrolle infiziert. Expression der F-Proteine wurde durch ELISA detektiert. Die Konstrukte einschließlich des Fusionspeptids zeigten sehr hohe Expression innerhalb der Zellen sowie im Überstand (3: mEM60 und mEM61), während die Konstrukte frei von Fusionspeptid reduzierte oder sogar sehr geringe Expression zeigten (3: mEM62–mEM67). Die Konstrukte ohne die Transmembran-Domäne wurden hauptsächlich wie zu erwarten im Überstand detektiert, außer für mEM64 (2B: mEM61, mEM63, mEM67).
• Zusätzlich resultierten die Fusionspeptide nicht in der Fusion von Zellen oder unzureichenden Titern aufgrund Fusion von Viruspartikeln.
• Die mEM60- und mEM61-basierten MVA-Viren deckten Instabilitäten in einer Stabilitätsstudie auf, und die Instabilität reduzierte Expression. Nach 6 Passagen auf der AGE1.CR.pIX-Zelllinie deckte PCR-Analyse von mEM60 ein kleineres Signal auf, was eine auf potenzielle Deletion hinwies. Aufgrund des schwachen Signals, welches auf eine sehr geringe Menge trunkierter Genom hinwies, konnte die Deletion nicht durch Sequenzieren bestätigt werden. Passagieren von mEM61 resultierte in Punktmutationen im F-Gen, welche im Austausch von einem Aminosäure kodierenden Codon in ein Stop-Codon resultierte. Alle anderen Konstrukte waren stabil. Deshalb scheint es, dass das Expressionslevel und/oder Vorhandensein des gesamten Fusionspeptids, aber nicht die TM-Domäne oder Abwesenheit einer kodierenden Region für eine konservierte Region/Domäne eines RSV-Anheftungs-G-Proteins, eine Auswirkung auf die Stabilität der Konstrukte haben kann. SEQUENCE LISTING

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  
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Claims (27)

1. Ein viraler Vektor, umfassend eine kodierende Region für ein modifiziertes Respiratorisches Synzytial-Virus(RSV)-F-Protein, wobei das F-Protein modifiziert ist, um Fusionsaktivität zu reduzieren.
2. Der virale Vektor von Anspruch 1, wobei das modifizierte RS-F-Protein eine Deletion mindestens eines Bereiches der Fusionspeptiddomäne umfasst.
3. Der virale Vektor von Anspruch 2, wobei die Deletion der Fusionspeptid-Domäne eine Deletion entsprechend Aminosäuren 137–145, 137–146 oder 137–155 von SEQ ID NO: 11 umfasst.
4. Der virale Vektor irgendeines der vorherigen Ansprüche, wobei das modifizierte RSV-F-Protein eine Deletion mindestens eines Bereiches der zytoplasmatischen Domäne, Transmembran-Domäne oder beider umfasst.
5. Der virale Vektor irgendeines der vorherigen Ansprüche, wobei die Deletion der zytoplasmatischen Domäne und Transmembran-Domäne eine Deletion entsprechend Aminosäuren 525–573 von SEQ ID NO: 11 umfasst.
6. Der virale Vektor von Anspruch 1, wobei das modifizierte RSV-F-Protein eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuren 23–564 von SEQ ID NO: 2; 23–515 von SEQ ID NO: 4; 23–573 von SEQ ID NO: 13; 23–524 von SEQ ID NO: 15; 23–554 von SEQ ID NO: 17; und 23–505 von SEQ ID NO: 19 umfasst.
7. Der virale Vektor irgendeines der vorherigen Ansprüche, wobei die kodierende Region für das modifizierte RSV-F-Protein operativ mit einem Vaccinia-H5-Promotor oder einem Vaccinia-p7.5-Promotor verbunden ist.
8. Der virale Vektor irgendeines der vorherigen Ansprüche, wobei der virale Vektor weiter eine kodierende Region für mindestens einen Teil eines RSV-Anheftungs-G-Proteins umfasst.
9. Der virale Vektor von Anspruch 8, wobei der mindestens eine Bereich eines RSV-Anheftungs-G-Proteins eine Sequenz entsprechend Aminosäuren 2–101, 10–77 oder 45–58 von SEQ ID NO: 6 umfasst.
10. Der virale Vektor von Anspruch 8, wobei das RSV-G-Protein ein RSV-A-G-Protein ist.
11. Der virale Vektor irgendeines der Ansprüche 8–10, wobei die kodierende Region für den mindestens einen Bereich des RSV-G-Proteins operativ mit einem Vaccinia-H5-Promotor oder einem Vaccinia-p7.5-Promotor verbunden ist.
12. Der virale Vektor irgendeines der Ansprüche 8–10, wobei sowohl die kodierende Region für das modifizierte RSV-F-Protein als auch für den Bereich des RSV-G-Proteins beide mit einem Vaccinia-H5-Promotor oder einem Vaccinia-p7.5-Promotor verbunden sind.
13. Der virale Vektor irgendeines der Ansprüche 7, 11 oder 12, wobei der H5-Promotor SEQ ID NO: 8 umfasst, oder der p7.5-Promotor SEQ ID NO: 7 umfasst.
14. Der virale Vektor irgendeines der Ansprüche 8–10, wobei a. die kodierende Region für das modifizierte RSV-F-Protein operativ mit einem ersten Promotor verbunden ist und die kodierende Region für den mindestens einen Bereich des RSV-G-Proteins mit einem zweiten Promotor verbunden ist; b. die kodierende Region für das modifizierte RSV-F-Protein und die kodierende Region für den mindestens einen Bereich des RSV-G-Proteins in entgegengesetzter Orientierung verglichen miteinander sind; c. die kodierende Region für das modifizierte RSV-F-Protein und die kodierende Region für den mindestens einen Bereich des RSV-G-Proteins beide operativ mit demselben Promotor verbunden sind; oder d. die kodierende Region für das modifizierte RSV-F-Protein im Leserahmen mit der kodierenden Region für den Bereich des RSV-G-Proteins fusioniert ist.
15. Der virale Vektor von Anspruch 14, wobei a. die kodierende Region für das modifizierte RSV-F-Protein und die kodierende Region für den mindestens einen Bereich des RSV-G-Proteins beide operativ mit demselben Promotor verbunden sind und die kodierende Region für das modifizierte RSV-F-Protein und die kodierende Region für den mindestens einen Bereich des RSV-G-Proteins operativ durch eine kodierende Region für ein 2A-Peptid, eine kodierende Region für eine Proteasestelle oder eine interne Ribosomeneintrittsstelle verbunden sind.
16. Der virale Vektor von Anspruch 1, wobei a. die kodierende Region für das modifizierte RSV-F-Protein im Leserahmen mit der kodierenden Region für den Bereich des RSV G-Proteins fusioniert ist und b. Ein Linkerpeptid im Leserahmen zwischen die kodierende Region für das modifizierte RSV-F-Protein und die kodierende Region für einen Bereich des RSV G-Proteins fusioniert ist.
17. Eine immunogene Zusammensetzung, die den viralen Vektor irgendeines der Ansprüche 1–16 umfasst.
18. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die den viralen Vektor irgendeines der Ansprüche 1–16 umfasst.
19. Ein Verfahren zum Induzieren einer Immunantwort auf ein RSV-F-Protein umfassend Verabreichen des viralen Vektors irgendeines der Ansprüche 1–16, der immunogenen Zusammensetzung von Anspruch 17 oder der pharmazeutischen Zusammensetzung von Anspruch 18 an ein Tier.
20. Ein Verfahren zum Induzieren einer Immunantwort auf ein RSV-F-Protein und ein RSV-G-Protein umfassend Verabreichen des viralen Vektors irgendeines der Ansprüche 8–16, der immunogenen Zusammensetzung von Anspruch 17 oder der pharmazeutischen Zusammensetzung von Anspruch 18 an ein Tier.
21. Ein Verfahren zum Inhibieren von RSV-Krankheit in einem Tier umfassend Verabreichen des viralen Vektors irgendeines der Ansprüche 1–16, der immunogenen Zusammensetzung von Anspruch 17 oder der pharmazeutischen Zusammensetzung von Anspruch 18 an ein Tier.
22. Das Verfahren irgendeines der Ansprüche 19–21, wobei der virale Vektor, die immunogene Zusammensetzung oder die pharmazeutische Zusammensetzung auf einem intravenösen, sukutanen, intradermalen, intramuskulären oder intranasalen Weg verabreicht wird.
23. Das Verfahren irgendeines der Ansprüche 19–22, wobei das Tier ein Primat oder Mensch ist.
24. Eine Zelle, die den viralen Vektor irgendeines der Ansprüche 1–16 umfasst.
25. Ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 umfasst.
26. Eine Nukleinsäure, die eine kodierende Region umfasst, die das Polypeptid von Anspruch 25 kodiert.
27. Die Nukleinsäure von Anspruch 26, die weiter eine kodierende Region für Aminosäuren 2–101, 10–77 oder 45–58 von SEQ ID NO: 6 umfasst.

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