DE60302356T2 - Fusionsprotein regulatorischer/akzessorischer hiv-proteine - Google Patents

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Description

  • Die Erfindung betrifft Fusionsproteine, welche die Aminosäuresequenz von mindestens vier HIV-Proteinen, die aus Vif, Vpr, Vpu, Vpx, Rev, Tat und Nef ausgewählt sind, oder Derivate der Aminosäuresequenz eines oder mehrerer der Proteine umfassen, wobei das Fusionsprotein nicht in einzelne HIV-Proteine mit den natürlichen N- und C-Termini verarbeitet wird. Die Erfindung betrifft des Weiteren Nukleinsäuren, welche die Proteine codieren, Vektoren, welche die Nukleinsäure aufweisen, und Verfahren zum Herstellen der Proteine. Das Fusionsprotein, die Nukleinsäuren und Vektoren sind als Impfstoffe für die mindestens partielle Prophylaxe gegen HIV-Infektionen geeignet.
  • Allgemeiner Stand der Technik
  • Das menschliche Immunschwächevirus (Human Immunodeficiency Virus, HIV) ist das ursächliche Agens des erworbenen Immunschwächesyndroms (Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS). Wie alle Retroviren codiert das Genom des Virus die Proteine Gag, Pol und Env. Darüber hinaus codiert das virale Genom weitere regulatorische Proteine, d. h. Tat und Rev, sowie Hilfsproteine, d. h. Vpr, Vpx, Vpu, Vif und Nef.
  • Trotz der Bemühungen des öffentlichen Gesundheitswesens, die Ausbreitung der AIDS-Epidemie zu kontrollieren, steigt die Anzahl der Neuinfektionen immer noch an. Die Weltgesundheitsorganisation schätzte Ende des Jahres 2000 die globale Epidemie auf 36,1 Millionen Infizierte, was um 50% höher liegt, als die Zahlen, die vor einem Jahrzehnt auf der Basis der damals vorliegenden Daten vorhergesagt worden sind (WHO & UNAIDS. UNAIDS, 2000). Weltweit wird die Anzahl der HIV-1-Neuinfektionen im Jahr 2000 auf 5,3 Millionen geschätzt.
  • In Anbetracht der stetigen Ausbreitung der Epidemie gibt es immer noch einen Bedarf für einen wirksamen Impfstoff für die klinische Anwendung. Inzwischen ist eine Reihe unterschiedlicher Verabreichungsstrategien für HIV-1-Impfstoffe, beispielsweise neuartige Vektoren oder Hilfssysteme, entwickelt und unter verschiedenen vorklinischen Bedingungen sowie in klinischen Studien geprüft worden. Der erste Impfstoffkandidat, der in einer klinischen Phase-III-Studie getestet wurde, beruht auf dem Hüllprotein gp 120 in Alum (Francis et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 1998; 14 (Suppl. 3) (5): S. 325-31). Die Phase-III-Studien wurden begonnen, obgleich sich der Impfstoff in der früheren Phase-II-Studie nicht als erfolgreich erwies.
  • Nach vielen Jahren der Bemühungen um einen prophylaktischen Impfstoff auf Basis von Hüllantigenen, konzentrieren sich neuere Arbeiten auf die Verwendung regulatorischer Proteine wie Tat, Nev und Rev als Kandidaten-Impfstoffantigene. Die Verwendung dieser regulatorischen Antigene für therapeutische Zwecke läuft seit mehreren Jahren (Miller et al., Nature Medicine 1997, 3, 389-94, Calarota et al., Lancet 1998, 351, 1320-5, Ayyavoo et al., AIDS, 2000, 14, 1-9). Unlängst hat sich die Verwendung dieser Antigene in prophylaktischen Impfstoffuntersuchungen in kleinen vorklinischen Studien als aussichtsreich erwiesen. Die Verwendung von Tat und Rev oder von Tat allein als ein Kandidat für einen prophylaktischen Impfstoff wurde zur Kontrolle von SIVmac gezeigt (Osterhaus et al., Vaccine 1999, 17, 2713-4). Darüber hinaus gibt es Hinweise, dass ZTL, die gegen die frühen regulatorischen Proteine des Virus gerichtet sind, für die Eliminierung infizierter Zellen wichtig sind, bevor diese hohe Mengen an reifen Virionen produzieren (van Baalen et al., J. Gen. Virol 1997, 78, 1913-8; Addo et al., PNAS, 2001, 98, 1781-6).
  • Obgleich die regulatorischen/akzessorischen Proteine von HIV eine effektive Immunantwort auslösen, haben die meisten, wenn nicht alle von ihnen schwere Nebenwirkun gen, welche bisher ihre Verwendung als Impfstoff einschränkte: es wurde gezeigt, dass Nef, Tat und Vpu eine Rolle bei der Dämpfung (Down Regulation) der Expression von CD4+ und/oder MHC-Klasse-I spielen (Howcroft et al., Science, 1993, 260, 1320-2, Schwartz et al., Nature Med. 1996, 2, 338-42, Swann et al., Virology, 2001, 282, 267-77; Janvier et al., J. Virol., 2001, 78, 3971-6; Weissmann et al., PNAS 1998, 95, 11601-6). Es ist bekannt, dass Tat in vivo eine akute Immunsuppression vermittelt (Cohen et al., PNAS, 1999, 96, 10842-10847). Auch für Vpr sind immunsuppressive Effekte beschrieben worden (Ayyavoo et al., Nature Med., 1997, 3: 1117-1123). Es wurde beschrieben, dass Vpr und Vpx in Hefezellen verschiedene zytostatische und zytotoxische Effekte haben (Zhang et al., Virology, 1997, 230, 103-12). Die meisten, wenn nicht alle, akzessorischen/regulatorischen Proteine von HIV scheinen also funktionelle Eigenschaften aufzuweisen, die in einer Impfstoffformulierung unerwünscht sind.
  • Versuche, die schädlichen Effekte der HIV-Proteine zu verringern, sind in WO 02/06303 beschrieben. Insbesondere beschreibt WO 02/06303 ein Fusionsprotein, einschließlich Aminosäuresequenzen von HIV-Vif, -Vpu und -Nef, wobei die Komponentenproteine zu anderen Komponentenproteinen benachbart sind oder durch Nicht-Komponenten-Proteine, wie beispielsweise Aminosäuresequenzen, die proteolytische Spaltstellen bilden, getrennt sind. Es ist beschrieben, dass es bevorzugt ist, solche Fusionsproteine zu verwenden, die zwischen den Komponentenproteinen proteolytische Spaltstellen aufweisen. Da die Komponentenproteine durch proteolytische Spaltstellen getrennt sind, werden native HIV-Proteine produziert, die bekannterweise schädlich sind. Zur Reduzierung aller schädlicher Effekte der HIV-Proteine, die sich durch die Spaltung des Fusionsproteins ergeben, schlägt WO 02/06303 die Verwendung abgeschwächter Proteine vor. WO 02/06303 lehrt also, ein Fusionsprotein zu verwenden, welches das HIV-Vif, -Vpr und -Nef- Protein umfasst, wobei zwischen den HIV-Proteinen Spaltstellen eingefügt sind und wobei es sich bei den HIV-Proteinen um abgeschwächte Proteine handelt. Abgeschwächte Proteine haben allerdings den Nachteil, dass sich die Aminosäuresequenz des abgeschwächten Proteins derart von der Aminosäuresequenz des nativen Proteins unterscheidet, dass eine Immunisierung mit dem abgeschwächten Protein zu einer Immunantwort führt, die das native Protein nur schwach erkennt oder die das native Protein gar nicht erkennt.
  • Aufgabe der Erfindung
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, einen Impfstoff bereit zu stellen, der die Erzeugung einer effektiven Immunantwort, insbesondere einer effektiven Antwort zytotoxischer T-Zellen, gegen mehrere oder alle regulatorische/akzessorische HIV-Proteine ermöglicht, wobei die regulatorischen/akzessorischen HIV-Proteine in dem Impfstoff oder die von dem Impfstoff produziert werden, weniger funktional sind als die nativen einzelnen regulatorischen/akzessorischen Proteine, so dass das Risiko verringert ist, dass die regulatorischen/akzessorischen Proteine in dem Impfstoff unerwünschte Nebenwirkungen ausüben, und wobei die weniger aktiven HIV-Proteine eine ähnliche Immunantwort wie die nativen HIV-Proteine auslösen.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Diese Aufgabe wurde gelöst, indem ein Fusionsprotein bereitgestellt wurde, das die Aminosäuresequenz von mindestens vier HIV-Proteinen, die aus Vif, Vpr, Vpu, Vpx, Rev, Tat und Nef ausgewählt sind, oder Derivate der Aminosäuresequenz eines oder mehrerer der Proteine umfasst, wobei das Fusionsprotein nicht zu einzelnen HIV-Proteinen mit den natürlichen N- und C-Termini verarbeitet wird. Insbesondere ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung durch Nukleinsäuren und Vektoren gelöst worden, welche die Fusionsproteine codieren.
  • Wenn das Fusionsprotein in Tierzellen, einschließlich humanen Zellen, produziert wird, wird das Fusionsprotein von zellulären Proteasen nicht derart gespalten, dass akzessorische/regulatorische Proteine mit nativen N- und C-Termini erhalten werden.
  • Aufgrund der Tatsache, dass ein HIV-Protein, welches Teil eines Fusionsproteins ist, im Vergleich zu dem einzelnen HIV-Protein eine veränderte Sekundär-/Tertiärstruktur aufweist, ist das HIV-Protein in dem Fusionsprotein weniger funktional als das einzelne Protein, wenn nicht sogar völlig dysfunktional. Ein regulatorisches/akzessorisches Protein, das weniger funktional oder sogar gar nicht funktional ist, hat nicht die unerwünschten Nebenwirkungen des HIV-Proteins in seiner nativen Konformation. Was die Immunogenität angeht, gibt es keinen wesentlichen Unterschied, wenn die Immunogenität des Fusionsproteins mit der Immunogenität der einzelnen regulatorischen/akzessorischen HIV-Proteine, welche das Fusionsprotein bilden, verglichen wird. Insbesondere gibt es keinen wesentlichen Unterschied in Bezug auf die Reaktion der zytotoxischen T-Zellen (ZTL), da die Epitope, die dem Immunsystem präsentiert werden, identisch sind. Dieselben Überlegungen gelten, wenn das Fusionsprotein dem Patienten verabreicht wird.
  • Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff „HIV" auf jede HIV-Gruppe, jeden HIV-Subtyp (Stamm), jeden HIV-Stamm oder jedes HIV-Isolat, das einem Fachmann bekannt ist. Insbesondere kann HIV HIV-1 oder HIV-2 sein. HIV-1 wurde in neun Subtypen klassifiziert (Stamm A bis I), wohingegen HIV-2 in fünf Subtypen (A bis E) klassifiziert wurde, die alle vom Schutzumfang der vorliegenden Erfindung abgedeckt sind. Die am meisten bevorzugten HIV-Stämme gemäß der vorliegen den Erfindung sind die HIV-1-Stämme A, B und C. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese am meisten bevorzugten Stämme beschränkt.
  • Die Proteinsequenzen der regulatorischen HIV-Proteine Vif, Vpr, Vpu, Rev, Tat, Vpx und Nef sind einem Fachmann bekannt. Beispielhaft, und ohne sich auf die Ausführungsformen zu beschränken, wird Bezug genommen auf die verschiedenen Sequenzen, wie sie in der Genbankdatenbank beschrieben sind, insbesondere auf die Sequenz des HIV-1-Isolats HXB2R mit der Genbank-Zugangsnummer K03455. In diesem Genbankeintrag sind die Sequenzen der verschiedenen HIV1-Gene und der von den Genen codierten Proteine spezifiziert.
  • Die HIV-Proteine, welche das Fusionsprotein codieren, sind vorzugsweise aus dem gleichen Stamm. Gemäß einer alternativen Ausführungsform stammen die HIV-Proteine, welche das Fusionsprotein bilden, aus zwei oder mehr Stämmen. Es ist auch möglich, dass eines oder mehrere der HIV-Proteine, welche das Fusionsprotein bilden, HIV-1-Proteine sind und dass eines oder mehrere der HIV-Proteine, welche das Fusionsprotein bilden, HIV-2-Proteine sind.
  • Die Aminosäuresequenzen der HIV-Proteine, welche das Fusionsprotein bilden, sind vorzugsweise Sequenzen, die von bekannten HIV-Isolaten codiert werden, d. h. die Aminosäuresequenz der HIV-Proteine in dem Fusionsprotein ist identisch zu der Aminosäuresequenz der korrespondierenden Proteine, wie codiert von natürlich vorkommenden HIV-Isolaten. Alternativ kann es sich bei der Aminosäuresequenz von einem oder mehreren HIV-Proteinen in dem Fusionsprotein um eine Konsensussequenz handeln, d. h. um eine Sequenz, die als solche in keinem bekannten HIV-Isolat vorkommt, aber eine optimale Homologie – insbesondere in Bezug auf ZTL-Epitope – gegen mehrere oder alle bekannten HIV-Isolate zeigt. Rechneralgorithmen zur Berechnung einer Konsensussequenz sind einem Fachmann bekannt.
  • In einer alternativen Ausführungsform kann das Fusionsprotein Derivate der Aminosäuresequenz von einem oder mehreren HIV-Proteinen umfassen, die Teil des Fusionsproteins sind. Der Begriff „Derivat der Aminosäuresequenz eines HIV-Proteins" wie in der vorliegenden Spezifikation verwendet, betrifft HIV-Proteine, die im Vergleich zu dem entsprechenden natürlich vorkommenden HIV-Protein eine veränderte Aminosäuresequenz aufweisen. Eine veränderte Aminosäuresequenz kann eine Sequenz sein, in welcher eine oder mehrere Aminosäuren der Sequenz des HIV-Proteins substituiert, eingesetzt oder deletiert sind. Insbesondere ist ein „Derivat der Aminosäuresequenz eines HIV-Proteins" eine Aminosäuresequenz, die eine Homologie von mindestens 50% aufweist, mehr bevorzugt von mindestens 70%, noch mehr bevorzugt von mindestens 80%, am meisten bevorzugt von mindestens 90%, wenn der entsprechende Teil der Aminosäuresequenz in dem Fusionsprotein mit der Aminosäuresequenz des entsprechenden HIV-Proteins bekannter HIV-Isolate verglichen wird. Eine Aminosäuresequenz hat die oben angegebene Sequenzhomologie, selbst wenn die Homologie nur für das entsprechende Protein eines HIV-Isolates gefunden wird, unabhängig von der Tatsache, dass es korrespondierende Proteine in anderen Isolaten geben könnte, die eine geringere Homologie zeigen. Wenn beispielsweise ein Vpr-Derivat in dem Fusionsprotein eine Homologie von 95% zu der Vpr-Sequenz eines HIV-Isolates, aber nur eine Homologie von 50-70% zu (allen) anderen HIV-Isolaten zeigt, gilt die Homologie des Vpr-Derivates als mindestens 90%.
  • Es ist oben ausgeführt worden, dass die HIV-Proteine in dem Fusionsprotein eine verringerte Aktivität oder sogar gar keine Aktivität im Vergleich zu den einzelnen Proteinen aufweisen, da sich die Konformation der Proteine in dem Fusionsprotein von der natürlichen Konformation der biologisch aktiven Proteine unter scheidet. Es kann aber wünschenswert sein, das Risiko weiter zu verringern, dass die HIV-Proteine in dem Fusionsprotein biologisch aktiv sind. Zu diesem Zweck sind besonders bevorzugte „Derivate" eines einzelnen HIV-Proteins, das Teil eines Fusionsproteins ist, Aminosäuresequenzderivate, in denen mehrere Aminosäuren, mehr bevorzugt nicht mehr als 10 Aminosäuren, am meisten bevorzugt nicht mehr als 5 Aminosäuren, deletiert, eingesetzt oder substituiert sind, um ein HIV-Protein mit reduzierter Aktivität oder gar keiner Aktivität zu erhalten. Einem Fachmann sind Tests bekannt um zu bestimmen, ob ein HIV-Protein reduzierte biologische Aktivität aufweist:
    Der molekulare Mechanismus des Vif-Proteins, das in vivo für die virale Replikation essenziell ist, bleibt unbekannt, aber Vif besitzt eine starke Tendenz für eine Selbstassoziierung. Es wurde gezeigt, dass diese Multimerisierung für die Vif-Funktion im viralen Lebenszyklus wichtig ist (Yang S. et al., J. Biol Chem 2001; 276: 4889-4893). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Vif mit dem viralen Kernproteinkomplex spezifisch assoziiert ist und dies könnte funktionell signifikant sein (Khan M. A. et al., J. Virol. 2001; 75 (16): 7252-65). Ein Vif-Protein mit reduzierter Aktivität zeigt daher eine reduzierte Multimerisierung und/oder Assoziierung mit dem Kernproteinkomplex.
  • Das Vpr-Protein spielt eine wichtige Rolle im viralen Lebenszyklus. Vpr reguliert den Import des viralen Präintegrationskomplexes in den Kern und ermöglicht die Infektion nicht-teilender Zellen wie beispielsweise Makrophagen (Agostini et al., AIDS Res Hum Retroviruses 2002; 18(4): 283-8). Darüber hinaus besitzt es transaktivierende Aktivität, die durch die Wechselwirkung mit dem LTR vermittelt wird (Vanitharani R. et al., Virology 2001; 289 (2): 334-42). Ein vpr mit einer reduzierten Aktivität zeigt daher verringerte oder gar keine Transaktivierung und/oder Wechselwirkung mit dem viralen Präintegrationskomplex.
  • Vpx, das zu Vpr hoch homolog ist, ist auch für eine effiziente virale Replikation in nicht-teilenden Zellen wichtig. Vpx wird über eine Wechselwirkung mit der p6-Domäne des Gag-Vorstufenpolyproteins in Viruspartikel verpackt. Wie Vpr ist auch Vpx am Transport des Präintegrationskomplexes in den Kern beteiligt (Mahalingam et al., J. Virol 2001; 75(1): 362-74). Die Fähigkeit zur Assoziierung mit dem Präintegrationskomplex über Gag-Vorstufen ist daher bei einem Vpx mit reduzierter Aktivität verringert.
  • Das Vpu-Protein geht bekanntlich Wechselwirkungen mit dem zytoplasmatischen Schwanz von CD4 ein und verursacht den Abbau von CD4 (Bour et al., Virology 1995; 69 (3): 1510-20). Die Fähigkeit zur Auslösung des Abbaus von CD4 ist daher bei einem Vpu mit reduzierter Aktivität verringert.
  • Die relevante biologische Aktivität des gut charakterisierten Tat-Proteins ist die Transaktivierung der Transkription über Wechselwirkung mit dem Transaktivierungs-Response-Element (TAR). Es wurde gezeigt, dass Tat heterologe Promotoren transaktivieren kann, die außer TAR keine HIV-Sequenzen aufweisen (Han P. et al., Nucleic Acid Res 1991; 19 (25): 7225-9). Ein Tat-Protein mit reduzierter Aktivität zeigt daher verringerte Transaktivierung von Promotoren über das TAR-Element.
  • Das Nef-Protein ist für die virale Replikation essenziell, welche für den Krankheitsfortschritt verantwortlich ist, indem es die Dämpfung (Downregulation) von CD4 auf der Zelloberfläche induziert (Lou T. et al., J Biomed Sci 1997; 4(4): 132). Diese Dämpfung (Downregulation) wird durch direkte Wechselwirkung zwischen CD4 und Nef ausgelöst (Preusser A. et al., Biochem Biophys Res Commun 2002; 292 (3): 734-40) . Ein Nef-Protein mit reduzierter Funktion zeigt daher verringerte Wechsel wirkung mit CD4.
  • Die relevante Funktion von Rev ist die posttranskriptionale Transaktivierung, die durch Wechselwirkung mit dem Rev-Response-Element (RRE) der viralen RNA gestartet wird (Iwai et al., 1992; Nucleic Acids Res 1992; 20(24): 6465-72). Ein Rev-Protein mit reduzierter Funktion zeigt daher verringerte Wechselwirkung mit RRE.
  • Die Fusionsproteine gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen die Aminosäuresequenz von mindestens vier verschiedenen HIV-Proteinen, die aus Vif, Vpr, Vpu, Rev, Vpx, Tat und Nef ausgewählt sind. Das Fusionsprotein kann vorzugsweise 5, 6 oder alle der HIV-Proteine umfassen. Die Reihenfolge der HIV-Proteine in dem Fusionsprotein ist nicht ausschlaggebend.
  • Eines oder mehrere der mindestens vier verschiedenen HIV-Proteine können in dem Fusionsprotein zwei oder mehrere Kopien umfassen. Ein Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung kann daher beispielsweise Vif, Vpr, Vpu und zwei Kopien von Rev umfassen. Die Aminosäuresequenz der zwei oder mehr Kopien eines HIV-Proteins kann daher identisch sein. Alternativ kann die Aminosäuresequenz der Kopien unterschiedlich sein, insbesondere, wenn Proteinsequenzen verwendet werden, die von verschiedenen HIV-Stämmen abstammen (z. B. eine Kopie eines HIV-1-Rev und eine Kopie eines HIV-2-Rev).
  • Angrenzende HIV-Proteine in dem Fusionsprotein können ohne zusätzliche Aminosäuren oder so fusioniert werden, dass zwei angrenzende HIV-Proteine in dem Fusionsprotein von mindestens einer zusätzlichen Aminosäure getrennt werden. Im Umfang der vorliegenden Erfindung sind auch Kombinationen dieser beiden enthalten. In einem Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung, das die Aminosäuresequenz von vier HIV-Proteinen umfasst, können beispielsweise zwei angrenzende HIV- Proteine direkt miteinander verknüpft sein, wohingegen die dritten und vierten HIV-Proteine über zusätzliche Aminosäuren verknüpft sind. Der Begriff „zusätzliche Aminosäure" im Kontext dieser Ausführungsform betrifft Aminosäuren, die in den natürlich vorkommenden HIV-Proteinen an dieser Position nicht vorkommen.
  • Das Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung hat daher vorzugsweise folgende allgemeine Formel: +P1---P2---P3---P4---P5*---P6*---P7*+ wobei es sich bei P1 bis P7 um verschiedene HIV-Proteine handelt, die aus Vif, Vpr, Vpx, Vpu, Tat, Rev und Nef ausgewählt sind, wobei das Fusionsprotein mindestens vier verschiedene der HIV-Proteine, d. h. P1 bis P4, und wahlweise eines (P5*), zwei (P5*---P6*) oder drei (P5*---P6*---P7*) zusätzliche der HIV-Proteine umfasst. Die Abkürzung „---" steht unabhängig für 0 bis n zusätzliche Aminosäuren. Wo „---" für 0 Aminosäuren steht, sind die angrenzenden HIV-Proteine ohne zusätzliche Aminosäuren direkt miteinander fusioniert. Wenn „---" für 1 bis n Aminosäuren steht, sind die angrenzenden HIV-Proteine durch eine bis n Aminosäuren miteinander fusioniert. Die Obergrenze der zusätzlichen Aminosäuren, d. h. die ganze Zahl n, richtet sich nach der maximalen Größe des Fusionsproteins, das in Zellen produziert oder exprimiert werden kann.
  • Gemäß einer Ausführungsform stehen alle „---" unabhängig für 0 bis 20, mehr bevorzugt 0 bis 10, noch mehr bevorzugt 0 bis 5 zusätzliche Aminosäuren.
  • Gemäß einer alternativen Ausführungsform steht mindestens ein „---" für die Aminosäuresequenz eines zusätzlichen Proteins oder einen Teil davon, bei welchem es sich nicht um ein HIV-Protein handelt, das aus Vif, Vpr, Vpx, Vpu, Rev, Tat und Nef ausgewählt ist. Gemäß dieser alternativen Ausführungsform ist das zusätzliche Protein daher von regulatorischen/akzessorischen HIV-Proteinen flankiert. Das zusätzliche Protein kann jedes beliebige Protein sein. Mehr bevorzugt umfasst das zusätzliche Protein zusätzliche Epitope, die zum Auslösen einer besseren Immunreaktion gegen HIV beitragen können. Bei dem zusätzlichen Protein kann es sich daher um das Env-, Gag- und Pol-Protein von HIV oder Teile davon handeln. In diesem Zusammenhang bezieht sich der Begriff „Teil" von Env, Gag und Pol auf einen Aminosäurebereich, der von einem der Proteine stammt, der mindestens ein Epitop umfasst. Mehr bevorzugt bezieht sich der Begriff „Teil" auf mindestens 10, noch mehr bevorzugt auf mindestens 20, am meisten bevorzugt auf mindestens 50 Aminosäuren von einem der Proteine. Gemäß einer verwandten Ausführungsform steht mindestens eines der „---" für die Aminosäuresequenz von einem oder mehreren der Proteine P1 bis P7, die Teil des Fusionsproteins sind. In diesem Fall kann das Fusionsprotein eine oder mehrere Kopien von einem oder mehreren der Proteine, die Teil des Fusionsproteins sind, umfassen. Wie bereits erwähnt wurde, können die Kopien der Proteine eine identische Aminosäuresequenz aufweisen oder nicht.
  • In der obigen Formel steht die Abkürzung „+" unabhängig für 0 bis n zusätzliche endständige Aminosäuren. Das Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung kann daher zusätzliche Aminosäuren am C- und/oder N-Terminus des Proteins umfassen oder nicht. Gemäß einer Ausführungsform steht mindestens eines der „+" für die Aminosäuresequenz eines zusätzlichen Proteins oder einen Teil davon, das kein aus Vif, Vpr, Vpx, Vpu, Rev, Tat und Nef ausgewähltes HIV-Protein ist. Gemäß dieser Ausführungsform umfasst das Fusionsprotein an seinem C- und/oder N-Terminus ein zusätzliches Protein, bei dem es sich nicht um Vif, Vpr, Vpx, Vpu, Rev, Tat und Nef handelt. Das zusätzliche Protein kann jedes Protein sein. Mehr bevorzugt umfasst das zusätzliche Protein zusätzliche Epitope, die zum Auslösen einer besseren Immunreaktion gegen HIV beitragen können. Bei dem zusätzlichen Protein kann es sich daher beispielsweise um das Env-, Gag- und Pol-Protein von HIV oder Teile davon handeln. In diesem Zusammenhang bezieht sich der Begriff „Teil" von Env, Gag und Pol auf einen Aminosäurebereich, der von einem der Proteine stammt, der mindestens ein Epitop umfasst. Mehr bevorzugt bezieht sich der Begriff „Teil" auf mindestens 10, noch mehr bevorzugt auf mindestens 20, am meisten bevorzugt auf mindestens 50 Aminosäuren von einem der Proteine.
  • Gemäß einer alternativen Ausführungsform steht mindestens eines der „+" für eine Aminosäuresequenz, die ein leichteres Erfassen oder eine leichtere Reinigung des Fusionsproteins ermöglicht. Mindestens eines der „+" steht daher für einen Marker wie beispielsweise einen His-Marker.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das Fusionsprotein nicht zu einzelnen HIV-Proteinen mit den natürlichen N- und C-Termini verarbeitet. Insbesondere wird das Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung nicht zu einzelnen HIV-Proteinen mit den natürlichen N- und C-Termini verarbeitet, wenn es in menschlichen Zellen exprimiert wird. Einem Fachmann sind Verfahren bekannt um zu prüfen, ob ein Fusionsprotein bei Expression in menschlichen Zellen zu einzelnen HIV-Proteinen mit den natürlichen N- und C-Termini verarbeitet wird. In diesem Zusammenhang wird auf Ayyavoo et al., AIDS 2000, 14, 1-9 Bezug genommen, insbesondere auf das in 2 der Veröffentlichung beschriebene Experiment. Kurz zusammengefasst, kann der Fachmann das betreffende Fusionsprotein leicht in menschlichen Zellen wie beispielsweise HeLa-Zellen exprimieren; die Zellen werden dann lysiert, und die Zelllysate werden Western-Blotting-Experimenten oder Immunpräzipitationsassays mit Antikörpern unterzogen, die für die einzelnen HIV-Proteine, die zusammen das betreffende HIV-Fusionsprotein bilden, spezifisch sind. Bei einem Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung, wird keine wesentliche Menge an HIV-Proteinen festgestellt, deren Größe der Größe eines einzelnen regulatorischen/akzessorischen HIV-Proteins entspricht.
  • Um sicherzustellen, dass das Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung nicht zu einzelnen HIV-Proteinen mit den natürlichen N- und C-Termini verarbeitet wird, sollte das Fusionsprotein zwischen den Aminosäuresequenzen der HIV-Proteine, welche das Fusionsprotein bilden, keine spezifischen Spaltsequenzen für zelluläre Proteasen aufweisen, welche die Erzeugung von HIV-Proteinen mit den natürlichen N- und C-Termini auslösen könnten. Die Aminosäuresequenz „---", wie in der obigen allgemeinen Formeln abgekürzt, enthält keine spezifischen Spaltsequenzen für zelluläre Proteasen, welche die Erzeugung von HIV-Proteinen mit den natürlichen N- und C-Termini auslösen könnten. Insbesondere enthält das Fusionsprotein nicht die Spaltsequenz REKRAVVG (Ein-Buchstaben-Aminosäurecode) zwischen den Aminosäuresequenzen der verschiedenen HIV-Proteine, welche das Fusionsprotein bilden. Einem Fachmann sind weitere Spaltsequenzen für zelluläre Proteasen bekannt. Der Fachmann kann daher leicht vermeiden, Spaltsequenzen für (zelluläre) Proteasen einzuschließen, die zu einzelnen HIV-Proteinen mit natürlichen N- und C-Termini führen könnten. Ein Beispiel für die Spaltsequenz einer Cysteinprotease ist Ile/Leu-X-Thr-X-Gly.
  • Die Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen keine spezifischen Spaltsequenzen, die zu HIV-Proteinen führen, welche die nativen N- und C-Termini aufweisen. Dies schließt jedoch nicht allgemein das Vorhandensein von Spaltstellen für zelluläre Proteasen zwischen den Proteinen in dem Fusionsprotein aus, so lange diese Spaltstellen nicht die Erzeugung von HIV-Proteinen vermitteln, welche sowohl einen natürlichen N-Terminus als auch einen natürlichen C-Terminus aufweisen. Insbesondere kann die Aminosäuresequenz „---", wie in der obigen allgemeinen Formel abgekürzt, Spaltstellen für Proteasen umfassen, welche an der Erzeugung kurzer Peptide beteiligt sind, welche auf MHCI oder MHCII präsentiert werden. Gemäß dieser Ausführungsform ist das Ergebnis der Spaltreaktion ein kurzes Peptidstück von vorzugsweise weniger als 20 Aminosäuren, dessen N- oder C-Terminus dem N- oder C-Terminus eines der regulatorischen/akzessorischen HIV-Proteine entsprechen kann. Diese kurzen Peptide haben aber nicht mehr die Aktivität des HIV-Proteins, von dem sie abstammen, wenn sie während des Antigenpräsentationsprozesses produziert werden.
  • Die Erfindung betrifft ferner Nukleinsäuren, welche die oben definierten Fusionsproteine gemäß der vorliegenden Erfindung codieren. Bei der Nukleinsäure kann es sich um DNA oder RNA handeln. Vorzugsweise handelt es sich bei der Nukleinsäure um DNA, wenn die Nukleinsäure mithilfe eines DNA-Vektors wie beispielsweise mit einem Plasmid oder einem auf einem DNA-Virus basierten Vektor in menschliche Zellen eingefügt werden soll.
  • Einem Fachmann sind Verfahren zur Konstruktion einer Nukleinsäure bekannt, welche das Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung codiert. Ohne an die folgenden Verfahren gebunden zu sein, kann der Fachmann mit einem genomischen HIV-Klon, einem subgenomischen HIV-Klon oder einem beliebigen Startmaterial, wie beispielsweise Plasmiden, beginnen, welche die Codierungssequenz eines oder mehrerer der regulatorischen/akzessorischen HIV-Proteine umfassen. Wenn die Codierungssequenz eines regulatorischen/akzessorischen Proteins in der Form eines fortlaufenden Leserasters vorliegt, kann die Codierungssequenz isoliert werden, indem die Nukleinsäure, welche die Codierungssequenz umfasst, mit geeigneten Restriktionsenzymen geschnitten wird. Die so erhaltenen DNA-Fragmente können für das weitere Klonieren verwendet werden. Alternativ können die Codierungssequenzen eines regulatori schen/akzessorischen Proteins erhalten werden, indem Polymerasekettenreaktionsverfahren (PCR-Verfahren) mit geeigneten Primern verwendet werden. Wenn die regulatorischen/akzessorischen Proteine von mehr als einem Exon codiert werden, wie es z. B. für Tat und Rev der Fall ist, kann es notwendig sein, die verschiedenen Exons unabhängig zu klonieren und sie zu fusionieren, um für das regulatorische/akzessorische Protein ein kontinuierliches Leseraster zu erzeugen oder reverse Transkriptionstechnologie wie beispielsweise RT-PCR zu verwenden.
  • Eine Codierungssequenz kann auch durch Gensynthese bereitgestellt werden, d. H. durch Erzeugen eines Gens durch Verwendung eines Satzes komplementärer und/oder überlappender Oligonukleotide.
  • Um ein Fusionsprotein zu erhalten, enthält die Nukleinsäure, welche das Fusionsprotein codiert, vorzugsweise ein kontinuierliches Leseraster. Folglich sind die Stopp-Codons aller Sequenzen, außer der letzten Sequenz, die HIV-Proteine oder zusätzliche Proteine codieren, vorzugsweise zu einem Codon mutiert, das für eine Aminosäure codiert, oder vollständig deletiert. Vorzugsweise kann dies leicht erreicht werden, wenn für die PCR spezifische Primer verwendet werden, welche die Codierungssequenz ohne das Stopp-Codon amplifizieren. In anderen Worten sollte gemäß dieser Alternative der Downstream-Primer nicht zu dem Stopp-Codon komplementär sein. Das amplifizierte DNA-Fragment enthält daher kein Stopp-Codon und kann in den Klonierungsvektor kloniert werden. Alternativ ist es auch möglich, eine Codierungssequenz mit ihrem Stopp-Codon in den Klonierungsvektor zu klonieren. Das Stopp-Codon kann später deletiert werden, z. B. durch Verwendung spezifischer Endonukleasen oder durch Mutagenisierung.
  • Das Ergebnis der Klonierungsschritte sollte ein kontinuierliches Leseraster sein, welches das Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung codiert.
  • Die regulatorischen Elemente, die erforderlich sind, um die Expression des Fusionsproteins zu erhalten, können jedes regulatorische Element sein, welches die Expression in dem gewünschten Expressionssystem antreibt. Wenn beabsichtigt ist, das Fusionsprotein in prokaryontischen Zellen wie Escherichia coli zu produzieren, ist vorzugsweise ein bakterieller Promotor oder ein Phagenpromotor zu verwenden. Wenn beabsichtigt ist, das Fusionsprotein in eukaryontischen Zellen zu produzieren, ist vorzugsweise ein eukaryontischer oder viraler Promotor/Enhancer zu verwenden. Wenn beabsichtigt ist, das Fusionsprotein durch Verwendung eines Pockenvirus-Promotors zu exprimieren (siehe unten), ist vorzugsweise ein Pockenvirus-Promotor wie beispielsweise der Promotor 7,5 oder der ATI-Promotor zu verwenden.
  • Wie oben erwähnt, kann das Fusionsprotein Fusionspartner umfassen, bei denen es sich nicht um aus Vif, Vpr, Vpx, Vpu, Tat, Rev und Nef ausgewählten HIV-Proteine handelt. Die Fusionsproteine können daher die Aminosäuresequenz anderer Proteine oder von Teilen davon umfassen. Beispiele anderer Proteine sind die HIV-Proteine Gag, Pol und Env. Folglich kann die Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung auch die Codierungssequenzen für eines oder mehrere zusätzliche Proteine oder einen Teil davon im offenen Leseraster umfassen, welche mindestens vier regulatorische/akzessorische HIV-Proteine oder Derivate davon codieren.
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Nukleinsäure des Weiteren unabhängige Expressionskassetten umfassen, welche zusätzliche Proteine codieren, die dazu beitragen können, die Immunreaktion gegen HIV weiter zu verbessern. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Nukleinsäure des Weiteren Expressionskassetten umfassen, welche die Codierungssequenz von mindestens einem zusätzlichen HIV- Protein umfassen, das aus Gag, Pol und Env oder Teilen davon ausgewählt ist. Noch mehr bevorzugt kann die Nukleinsäure außer der Codierungssequenz des Fusionsproteins die Codierungssequenzen aller HIV-Proteine Gag, Pol und Env umfassen. Die Nukleinsäure ist vorzugsweise ein Teil eines Vektors. Die Nukleinsäure kann auch das virale Genom oder ein Teil davon eines viralen Vektors sein, vorzugsweise ein Pockenvirus-Vektors wie MVA. Es ist daher möglich, das Fusionsprotein sowie die zusätzlichen HIV-Proteine, z. B. mindestens ein zusätzliches, aus Gag, Pol und Env ausgewähltes HIV-Protein, von dem pockenviralen Vektor zu exprimieren.
  • Die Erfindung betrifft des Weiteren Vektoren, die eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen. Der Begriff „Vektor" bezieht sich auf alle Vektoren, die einem Fachmann bekannt sind. Ein Vektor kann ein Plasmidvektor wie pBR322 oder ein Vektor der pUC-Reihe sein. Mehr bevorzugt ist der Vektor ein Virusvektor. Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff „viraler Vektor" oder „Virusvektor" auf ein infektiöses und/oder abgeschwächtes Virus, das ein virales Genom umfasst. In diesem Fall ist die Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung Teil des viralen Genoms des entsprechenden viralen Vektors und/oder stellt das virale Genom dar. Die rekombinanten Vektoren können für die Infektion von Zellen und Zelllinien verwendet werden, insbesondere für die Infektion lebender Tiere, einschließlich Menschen. Typische Virusvektoren gemäß der vorliegenden Erfindung sind adenovirale Vektoren, retrovirale Vektoren oder Vektoren auf der Basis des adenoassoziierten Virus 2 (AAV2). Am meisten bevorzugt sind pockenvirale Vektoren. Das Pockenvirus kann vorzugsweise ein Kanarienpockenvirus, ein Geflügelpockenvirus oder ein Vacciniavirus sein. Mehr bevorzugt ist das modifizierte Vacciniavirus Ankara (MVA) (Sutter, G. et al. [1994], Vaccine 12: 1032-40). Ein typischer MVA-Stamm ist MVA 575, der in der European Collection of Animal Cell Cultures mit der Hinterle gungsnummer ECACC V00120707 hinterlegt wurde. Am meisten bevorzugt ist MVA-BN oder ein Derivat davon, welches in der PCT-Anmeldung PCT/EP01/13628 mit dem Titel „Modifizierte Ankara-Vacciniavirus-Variante" beschrieben ist, welche am 22. November 2001 beim Europäischen Patentamt eingereicht wurde. MVA-BN wurde in der European Collection of Animal Cell Cultures mit der Hinterlegungsnummer ECACC V00083008 hinterlegt. Durch Verwendung von MVA-BN oder eines seiner Derivate wurde das zusätzliche technische Problem gelöst, einen besonders sicheren Virusimpfstoff gegen HIV herzustellen, da der MVA-BN-Virusvektor ein extrem abgeschwächtes Virus ist, welches vom modifizierten Vacciniavirus Ankara stammt und durch den Verlust seiner Fähigkeit zur reproduktiven Replikation in menschlichen Zellen gekennzeichnet ist. MVA-BN ist aufgrund einer nicht vorhandenen Replikation im Menschen sicherer als alle anderen bekannten Vacciniavirusstämme. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung MVA-BN und Derivate von MVA-BN als einen viralen Vektor, welcher die DNA gemäß der vorliegenden Erfindung enthält. Die Merkmale von MVA-BN, die Beschreibung biologischer Assays, mit denen beurteilt werden kann, ob ein MVA ein MVA-BN oder ein Derivat davon ist, und Verfahren, mit denen MVA-BN oder ein Derivat davon erhalten werden können, sind in der PCT-Anmeldung PCT/EP01/13628 beschrieben, auf die oben Bezug genommen wird und die hiermit durch Bezugnahme enthalten ist.
  • Gemäß diesen Ausführungsformen betrifft die Erfindung daher vorzugsweise ein rekombinantes MVA wie beispielsweise MVA-BN, wobei das virale Genom eine Expressionskassette umfasst, welche ein Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung codiert.
  • Verfahren zum Einsetzen der Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung in das virale Genom und Verfahren zum Erhalten rekombinanter Viren sind dem Fachmann bekannt.
  • In einem rekombinanten Vacciniavirus befindet sich die Expression der DNA gemäß der vorliegenden Erfindung vorzugsweise, aber nicht ausschließlich, unter der transkriptionalen Kontrolle eines Pockenviruspromotors, mehr bevorzugt eines Vacciniaviruspromotors. Die DNA gemäß der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise in eine nicht essenzielle Region des Virusgenoms eingesetzt. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die heterologe Nukleinsäuresequenz in eine natürlich vorkommende Deletionsstelle des Pockenvirusgenoms (beschrieben in PCT/EP96/02926) eingesetzt. Die Natur der Insertionsstelle ist allerdings für die vorliegende Erfindung nicht ausschlaggebend, so lange ein rekombinantes Vacciniavirus erhalten wird. Der Fachmann kann sich daher leicht weitere geeignete Insertionsstellen vorstellen.
  • Der virale Vektor, insbesondere der Pockenvirusvektor, kann in dem viralen Genom außer der Codierungssequenz für das Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung zusätzliche retrovirale Gene umfassen, die aus HIV-Gag, -Pol und -Env-Genen ausgewählt sind. Mehr bevorzugt kann der virale Vektor, insbesondere der Pockenvirusvektor, zusätzlich zu der Codierungssequenz für das Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung alle HIV-Gene, die Gag, Pol und Env codieren, umfassen. Diese zusätzlichen Gene können mit derselben Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt worden sein. Gemäß dieser Ausführungsform würden sich alle HIV-Gene an der gleichen Insertionsstelle in dem viralen Genom befinden. In einer alternativen Ausführungsform sind die zusätzlichen Gene an unterschiedlichen Stellen des viralen Genoms eingesetzt.
  • In einer bevorzugten Ausführung betrifft die vorliegende Erfindung die Nukleinsäure, den Vektor oder das Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung als einen Impfstoff für die mindestens partielle Prophylaxe gegen HIV-Infektionen und AIDS. Ein „Impfstoff" ist eine Verbindung, d. h. eine Nukleinsäure, ein Fusionsprotein, ein Vektor oder ein Virus, die, der oder das eine spezifische Immunreaktion auslöst.
  • Gemäß einer Alternative dieser Ausführungsform basiert der „Impfstoff" gemäß der vorliegenden Erfindung auf dem Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere DNA, als ein Impfstoff verwendet. Der Fachmann weiß, dass die Verabreichung nackter DNA, die eine eukaryontische Expressionskassette enthält, wie in der vorliegenden Erfindung, insbesondere die intramuskuläre Injektion von DNA, zu der Expression des von der Expressionskassette codierten Proteins führt. Das Protein wird dem Immunsystem ausgesetzt, und es wird eine spezifische Immunantwort gebildet. In einer alternativen Ausführungsform erfolgt die Impfung durch Verabreichung eines Vektors gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere eines viralen Vektors, mehr bevorzugt eines Pockenvirusvektors, am meisten bevorzugt eines Vacciniavirusvektors, z. B. eines MVA-Vektors.
  • Für die Herstellung eines Vacciniavirus-basierten Impfstoffes wird das Virus gemäß der vorliegenden Erfindung in eine physiologisch annehmbare Form umgewandelt . Dies kann ausgehend von der Erfahrung bei der Herstellung von Pockenvirusimpfstoffen erfolgen, welche für die Pockenschutzimpfung verwendet werden (wie beschrieben von Stickl, H. et al. [1974] Dtsch. Med. Wschr. 99, 2386-2392). Beispielsweise wird das gereinigte Virus bei –80°C mit einem Titer von 5 × 108 TCID50/ml, formuliert in etwa 10 mM Tris, 140 mM NaCl pH 7,4, aufbewahrt. Zur Herstellung von einzelnen Impfstoffspritzendosen werden beispielsweise 102-108 Viruspartikel in 100 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) in Gegenwart von 2% Pepton und 1% Humanserumalbumin in einer Ampulle, vorzugsweise einer Glasampulle, lyophilisiert. Alternativ können die einzelnen Impfstoffspritzendosen durch schrittweises Gefriertrocknen des Virus in einer Formulierung hergestellt werden. Diese Formulierung kann weitere Zusatzstoffe wie beispielsweise Mannitol, Dextran, Zucker, Glycin, Laktose oder Polyvinylpyrrolidon oder sonstige Zusatzstoffe wie Antioxidanzien oder inertes Gas, Stabilisatoren oder rekombinante Proteine (z. B. Humanserumalbumin) enthalten, die für eine Verabreichung in vivo geeignet sind. Die Glasampulle wird anschließend verschlossen und kann mehrere Monate lang zwischen 4°C und Raumtemperatur aufbewahrt werden. So lange jedoch kein Bedarf besteht, wird die Ampulle vorzugsweise bei Temperaturen unter –20°C aufbewahrt. Zur Impfung kann das Lyophilisat in 0,1 bis 0,5 ml einer wässrigen Lösung, vorzugsweise physiologische Salzlösung oder Tris-Puffer, gelöst und entweder systemisch oder lokal verabreicht werden, d. h. durch parenterale, intramuskuläre oder eine andere Art der Verabreichung, die dem Fachmann bekannt ist. Die Art der Verabreichung, die Dosis und die Anzahl der Verabreichungen können von Fachleuten auf bekannte Weise optimiert werden. Subkutane oder intramuskuläre Verabreichung ist für Pockenvirusvektoren am meisten bevorzugt.
  • Wenn es sich bei dem Impfstoff um einen MVA-BN-Vektor oder ein Derivat davon handelt, der oder das eine DNA gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, betrifft eine bestimmte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Verabreichung des Impfstoffes in therapeutisch wirksamen Mengen in einer ersten Inokulierung („Priming-Inokulierung") und in einer zweiten Inokulierung („Boosting-Inokulierung").
  • Wenn es sich bei dem Impfstoff um einen MVA-BN-Vektor oder ein Derivat davon handelt, der oder das eine DNA gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, betrifft eine bestimmte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Kit für die Impfung, umfassend einen MVA-BN-Virusvektor gemäß der vorliegenden Erfindung für die erste Impfung („Priming") in einem ersten Gefäß/Behälter und für eine zweite Impfung („Boosting") in einem zweiten Gefäß/Behälter.
  • Die Erfindung betrifft daher in den Impfstoff-Ausführungsformen einen Impfstoff, der eine Nukleinsäure, einen Vektor oder ein Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, und die Verwendung der Nukleinsäure, des Vektors oder des Proteins für die Herstellung eines Impfstoffes.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Schützen eines Tieres, einschließlich eines Menschen, vor einer HIV-Infektion durch Verabreichung eines Fusionsproteins gemäß der vorliegenden Erfindung, einer Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung oder eines Vektors gemäß der vorliegenden Erfindung an ein Tier, einschließlich einen Menschen, das oder der dies benötigt.
  • Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines Proteins gemäß der vorliegenden Erfindung, das die Schritte (i) des Transfizierens einer Wirtszelle mit einer Nukleinsäure oder eines Vektors gemäß der vorliegenden Erfindung oder (ii) des Infizierens einer Wirtszelle mit einem viralen Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung, (iii) des Exprimierens des Fusionsproteins in der transfizierten Wirtszelle von Schritt (i) oder der infizierten Wirtszelle von Schritt (ii) und (iv) des Wiedergewinnens des Fusionsproteins umfasst.
  • Die Erfindung betrifft des Weiteren Wirtszellen, die mit einer Nukleinsäure oder einem Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung transfiziert oder mit einem viralen Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung infiziert sind.
  • Gemäß einer alternativen Ausführungsform kann das Fusionsprotein mindestens drei verschiedene HIV-Proteine umfassen, welche aus Vif, Vpr, Vpu, Rev, Vpx und Tat ausgewählt sind. Das Fusionsprotein kann vorzugsweise 4, 5 oder alle der HIV-Proteine umfassen. Ein typisches Fusionsprotein gemäß dieser Ausführungsform umfasst die Aminosäuresequenzen der HIV-Proteine Vpr, Vif, Vpu, Rev, und Tat oder Derivate der Aminosäuresequenzen eines oder mehrere dieser Proteine. Wie oben ausgeführt, ist die Reihenfolge der HIV-Proteine in dem Fusionsprotein nicht wichtig. Alle bevorzugten Ausführungsformen wie oben spezifiziert gelten auch für diese alternative Ausführungsform.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1: Schematische Darstellung des Anheftens von Oligonukleotiden
    Die Abbildung zeigt das Anheften von vier Oligonukleotiden. Sie sind einzelsträngig und können sich durch komplementäre Enden anheften. Die Lücken werden mit einer Polymerase gefüllt, die eine Korrekturlese („Proofreading")-Aktivität aufweist (z. B. Pfx-Polymerase).
  • 2: Schematische Darstellung des Anheftens von vier Genen des blob
    Das vif-Gen zeigt eine mit dem vpr-Fragment überlappende Sequenz, das vpu-Codierungsfragment zeigt eine mit dem rev-Gen (grau) überlappende Sequenz. Die PCR-Fragmente sind denaturiert, und die überlappenden komplementären Enden sind hybridisiert. Die resultierenden Lücken werden mit Pfx-Polymerase gefüllt. Das vif-vpr-Fragment ist mit einer überlappenden Sequenz des vpu-rev-Fragments fusioniert, welches wiederum für die Fusion verwendet wird.
  • 3: Klonierungsstrategie der Sequenz, welche ein Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, in einem Rekombinationsvektor für die Insertion fremder Gene in das MVA-Genom
    Die fusionierte vif-, vpr-, vpu- und rev-Polyprotein-Koderierungsregion wurde mit Primern amplifiziert, die eine ClaI- und eine ApaI-Restriktionsschnittstelle umfassen. Dieses PCR-Produkt wurde in den mit ClaI/ApaI geschnittenen Vektor pBNX65 kloniert, der den ATI-Pockenviruspromotor enthält. Die tat-Codierungsregion wurde mit einer PCR mit Primern amplifiziert, die eine Acc65I-Restriktionsschnittstelle enthalten, und in den mit Acc65I linearisierten pBNX65+vif+rev ligiert. Die resultierende Expressionskassette (ATI-Promotor + Sequenz, die ein Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung codiert), wurde durch PacI-Restriktion iso liert und in den Rekombinationsvektor eingesetzt, um fremde Gene in die Zwischengenregion I4L des MVA-Genoms (pBNX39) einzusetzen. pBNX39 enthält Sequenzen, die zu den flankierenden Sequenzen der Insertionsstelle des MVA-Genoms homolog sind (F1 I4L und F2 I4L). Zur Auswahl rekombinanter Viren nach homologer Rekombination des MVA-Genoms und pBNX39 enthält der Vektor zusätzlich das gpt-Gen von E. coli (Phosphoribosyltransferase-Gen). Nach Reinigung rekombinanter Viren wird die Selektionskassette durch homologe Rekombination zwischen Flank 1 und einer Wiederholungssequenz von flank 1 (F1rpt) deletiert.
  • 4: Schematische Darstellung des MVA-Genoms
    MVA enthält ein lineares Genom, das nach Restriktion mit Hind III charakteristische Fragmente zeigt (A – O). Die nicht-funktionelle Region zwischen den I4L und den I5L Genen befindet sich in dem I-Fragment. Die Insertion fremder Gene mithilfe von pBNX39 findet an Position 56767-56768 statt.
  • Beispiele
  • Erzeugung einer DNA, die ein HIV-Vif-Vpr-Vpu-Rev-Tat- Fusionsprotein codiert
  • Die einzelnen Gene des HIV-Genoms wurden entweder mit einer PCR anhand von PCR-Standardprotokollen aus genomischer DNA oder synthetisch mit einer Technik hergestellt, die auf dem Anheften von Oligonukleotiden an überlappenden Sequenzen und dem Auffüllen der resultierenden Einzelstranglücken beruht.
  • Für die Oligonukleotid-basierte Erzeugung von Codierungsregionen von Genen, die in die Nukleinsäure eingesetzt werden sollen, welche das Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung codiert, werden 40mer-Oligonukleotide mit 15-bp-Überlappungen entworfen. Die Sequenz der Oligonukleotide beruht auf der genomischen Karte des HIV1-Isolats HXB2R, das von Stamm IIIB abstammt. Die Oligonukleotide für die Anheftungsreaktion oder die PCR zur Isolierung der erforderlichen Sequenz wurden derart entworfen, dass die Stopp-Codons für den Abbruch der Translation in der resultierenden Codierungsregion deletiert waren. Das tat-Gen wurde mithilfe von Oligos synthetisiert, die ein Stopp-Codon enthielten, da dieses Gen an die letzte Position der Nukleinsäure eingesetzt werden sollte, welche das Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung codiert, und daher ein Stopp-Triplet für einen korrekten Abbruch der Translation des Polyproteins enthalten muss.
  • Für die Anheftungsreaktion der Oligonukleotide wurden 10 Zyklen einer aus zwei Schritten bestehenden Pfx-Polymerase (Gibco-BRL)-Reaktion (Denaturierung bei 95°C und Anheften/Verlängern bei 68°C) durchgeführt. Während dieser Reaktion werden die überlappenden Sequenzen der Oligos angeheftet und die Lücken von der Pfx-Polymerase aufgefüllt (1).
  • Zur Synthese der vif-Codierungsregion, dem ersten codierten Gen in der Nukleotidsequenz, die das Fusionsprotein codiert, wurde eine PCR mit genomischer HIV-cDNA durchgeführt. Die PCR wurde derart durchgeführt, dass die vif-Codierungsregion für das anschließende Anheften von vif und vpr mit den ersten 15 bp des folgenden vpr-Gens fusioniert wurde. Die Vpr-Codierungsregion, die bp 5559-5847 des HIV HXB2R-Genoms abdeckt, wurde durch Anheften von 10 Oligonukleotiden hergestellt. Die resultierenden Lücken wurden aufgefüllt, und nach anschließender PCR zur Amplifikation enthielt das Produkt die vpr-Codierungsregion fusioniert an die flankierenden Regionen für vif und vpu, welche nach der vpr-Codierungsregion eingesetzt werden sollten.
  • Die Vpu-Codierungsregion wurde in einer PCR aus derselben cDNA amplifiziert, die zur Synthese von vif verwendet wurde, und das resultierende Produkt enthielt die flankierenden Regionen zur Fusion mit vpr und rev.
  • Die rev-Codierungsregion wurde durch Anheften von 14 Oligonukleotiden synthetisiert, welche die Region der Basenpaare 5970-6045 und 8379-8650 des HIV HXB2R-Genoms und 15-bp-Überlappungen zum Anheften mit vpu und tat abdecken.
  • Die tat-Codierungsregion wurde durch Verwendung von 10 Oligonukleotiden erzeugt, welche die Basenpaare 5831-6045 und 8379-8466 des HIV HXB2R-Genoms abdecken.
  • Die vif- und die vpr-Codierungsregion sowie die vpu- und die rev-Codierungsregion wurden fusioniert, indem die beiden Fragmente über ihre Überlappungen in einer aus zwei Schritten bestehenden Pfx-Polymerase-Reaktion angeheftet wurden (2). Nach zusätzlicher PCR-Amplifikation der Fusionsproteine wurden die Fragmente gereinigt und über die Überlappung von vpr und vpu aneinander ligiert (2). Nach PCR-Amplifikation des resultierenden Produktes (Codierungssequenzen für vif-vpr-vpu-rev) wurde die tat-Codierungsregion durch Klonierung des vif-vpr-vpu-rev-Fragmentes und von tat in angrenzende Klonierungsstellen in einem pBluesc-riptKS+-Vektor, der den ATI-Pockenviruspromotor enthielt, fusioniert (3, pBNX65). Die komplette Expressionskassette wurde dann durch PacI-Restriktion isoliert und in pBNX39 eingesetzt (3). PBNX39 enthält Sequenzen, die zum MVA-Genom homolog sind, was die Insertion in eine nicht codierende Region (I4L) des Genoms (4) durch homologe Rekombination ermöglicht.

Claims (25)

  1. Fusionsprotein, umfassend die Aminosäuresequenz von mindestens vier HIV-Proteinen, ausgewählt aus Vif, Vpr, Vpu, Vpx, Rev, Tat und Nef, oder Derivate der Aminosäuresequenzen eines oder mehrerer der Proteine, wobei das Fusionsprotein keine spezifischen Spaltsequenzen für zelluläre Proteasen, durch die die Erzeugung von HIV-Proteinen mit den natürlichen N- und C-Termini ausgelöst werden könnte, zwischen den Aminosäuresequenzen der HIV-Proteine, die das Fusionsprotein bilden, enthält und wobei es sich bei einem Derivat eines HIV-Proteins um eine Aminosäuresequenz handelt, die beim Vergleich des entsprechenden Teils der Aminosäuresequenz im Fusionsprotein mit der Aminosäuresequenz des jeweiligen HIV-Proteins im HIV-1-Isolat HXB2R (Genbank-Zugangsnummer K03455) eine Homologie von mindestens 50% zeigt.
  2. Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei die Homologie mindestens 80% beträgt.
  3. Fusionsprotein, umfassend die Aminosäuresequenz von mindestens vier HIV-Proteinen, ausgewählt aus Vif, Vpr, Vpu, Vpx, Rev, Tat und Nef, oder Derivate der Aminosäuresequenzen eines oder mehrerer der Proteine, wobei das Fusionsprotein keine spezifischen Spaltsequenzen für zelluläre Proteasen, durch die die Erzeugung von HIV-Proteinen mit den natürlichen N- und C-Termini ausgelöst werden könnte, zwischen den Aminosäuresequenzen der HIV-Proteine, die das Fusionsprotein bilden, enthält und wobei es sich bei dem Derivat eines individuellen HIV-Proteins, das Teil des Fusionsproteins ist, um eine Aminosäuresequenz handelt, bei der nicht mehr als 10 Aminosäuren deletiert, inseriert oder substituiert werden, um ein HIV-Protein mit reduzierter oder überhaupt keiner Aktivität zu erhalten.
  4. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die HIV-Proteine ausgewählt sind aus Vif, Vpr, Vpx, Vpu, Rev, und Tat.
  5. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend die Aminosäuresequenz der HIV-Proteine Vif, Vpr, Vpu, Rev, und Tat oder Derivate der Aminosäuresequenz eines oder mehrerer der Proteine.
  6. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Aminosäuresequenzen von mindestens zwei der HIV-Proteine ohne zusätzliche Aminosäuren aneinander fusioniert werden.
  7. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Aminosäuresequenzen von mindestens zwei der HIV-Proteine durch mindestens eine zusätzliche Aminosäure getrennt sind.
  8. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Aminosäuresequenz mindestens eines der HIV-Proteine an einen Fusionspartner fusioniert ist, bei dem es sich nicht um ein HIV-Protein, ausgewählt aus Vif, Vpr, Vpx, Vpu, Rev, Tat und Nef, handelt.
  9. Nukleinsäure, codierend für ein Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
  10. Nukleinsäure nach Anspruch 9, wobei es sich um DNA handelt.
  11. Nukleinsäure nach Anspruch 10, wobei die Expression des Fusionsproteins von der DNA durch Regulationselemente, ausgewählt aus eukaryontischen, prokaryontischen und viralen Promotoren, kontrolliert wird.
  12. Nukleinsäure nach Anspruch 11, wobei es sich bei dem viralen Promotor um einen Pockenviruspromotor handelt.
  13. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei die Nukleinsäure ferner die codierende Sequenz für mindestens ein zusätzliches HIV-Protein, ausgewählt aus Gag, Pol und Env, umfaßt.
  14. Nukleinsäure nach Anspruch 13, wobei die Nukleinsäure die codierende Sequenz für die HIV-Proteine Gag, Pol und Env umfaßt.
  15. Vektor, umfassend die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 9 bis 14.
  16. Vektor nach Anspruch 15, wobei es sich um einen Virusvektor handelt.
  17. Vektor nach Anspruch 16, wobei es sich bei dem Virusvektor um einen Pockenvirusvektor, insbesondere um einen Vacciniavirusvektor, handelt.
  18. Vektor nach Anspruch 17, wobei es sich bei dem Vacciniavirusvektor um das modifizierte Vacciniavirus Ankara (MVA) handelt.
  19. Vektor nach Anspruch 18, wobei das MVA ausgewählt ist aus MVA-575, hinterlegt bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) unter der Hinterlegungsnummer V00120707, und MVA-BN, hinterlegt bei der ECACC unter der Hinterlegungsnummer V00083008.
  20. Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 8, das die folgenden Schritte umfaßt – Transfizieren einer Wirtszelle mit einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 9 bis 14 oder mit einem Vektor nach Anspruch 15 oder – Infizieren einer Wirtszelle mit einem Virusvektor nach einem der Ansprüche 16 bis 19, – Exprimieren des Fusionsproteins in der transfizierten Wirtszelle oder der infizierten Wirtszelle und – Gewinnen des Fusionsproteins.
  21. Wirtszelle, transfiziert mit einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 9 bis 14 oder einem Vektor nach Anspruch 15 oder infiziert mit einem Virusvektor nach einem der Ansprüche 16 bis 19.
  22. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 8, Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 9 bis 14 oder Vektor nach einem der Ansprüche 15 bis 19 als Arzneimittel.
  23. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 8, Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 9 bis 14 oder Vektor nach einem der Ansprüche 15 bis 19 als Impfstoff.
  24. Impfstoff, umfassend ein Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 8, eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 9 bis 14 oder einen Vektor nach einem der Ansprüche 15 bis 19 als Arzneimittel.
  25. Verwendung eines Fusionsproteins nach einem der Ansprüche 1 bis 8, einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 9 bis 14 oder eines Vektors nach einem der Ansprüche 15 bis 19 zur Herstellung eines Impfstoffs.
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