ES2313166T3

ES2313166T3 - Proteina de fusion de proteinas reguladoras/accesorias del vih.

Info

Publication number: ES2313166T3
Application number: ES05017695T
Authority: ES
Inventors: Paul Howley; Sonja Leyrer; Eva Dr. Felder
Original assignee: Bavarian Nordic AS
Current assignee: Bavarian Nordic AS
Priority date: 2002-05-16
Filing date: 2003-05-14
Publication date: 2009-03-01
Anticipated expiration: 2023-05-14
Also published as: EP1506223A1; EP1652857B9; PL372092A1; IL164178A0; US20120142097A1; IL197304A0; US20060257974A1; NZ556144A; WO2003097675A1; US20050222388A1; ES2253675T3; AU2003240638A1; NZ536499A; US8435535B2; CN101108882A; US8143054B2; KR100996330B1; US20120142096A1; EP1652857B1; ATE407143T1

Abstract

Proteína de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos de al menos tres proteínas del VIH seleccionadas de Vif, Vpr, Vpu, Vpx, Rev y Tat, o derivados de la secuencia de aminoácidos de una o más de dichas proteínas, en la que la proteína de fusión no contiene secuencias de escisión específicas para proteasas celulares, que podrían desencadenar la generación de proteínas del VIH que tengan los términos N y C naturales, entre las secuencias de aminoácidos de las proteínas del VIH que forman la proteína de fusión, y en la que un derivado de la secuencia de aminoácidos de una proteína del VIH es una secuencia de aminoácidos que muestra una homología de al menos 50%, cuando la parte correspondiente de la secuencia de aminoácidos en la proteína de fusión se compara con la secuencia de aminoácidos de la proteína del VIH respectiva en el aislado HXB2R de VIH-1.

Description

Proteína de fusión de proteínas reguladoras/accesorias del VIH.

La invención se refiere a proteínas de fusión que comprenden la secuencia de aminoácidos de al menos tres proteínas del VIH seleccionadas de Vif, Vpr, Vpu, Vpx, Rev y Tat, o derivados de la secuencia de aminoácidos de una o más de dichas proteínas, en donde la proteína de fusión no se procesa a proteínas del VIH individuales que tengan los términos N y C naturales. La invención se refiere adicionalmente a ácidos nucleicos que codifican dichas proteínas, a vectores que comprenden dichos ácidos nucleicos, y a métodos para producir dichas proteínas. La proteína de fusión, los ácidos nucleicos y los vectores se pueden utilizar como vacunas para la profilaxis al menos parcial contra las infecciones por VIH.

Antecedentes de la invención

El Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) es el agente causante del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA). Al igual que todos los retrovirus, el genoma del virus codifica las proteínas Gag, Pol y Env. Adicionalmente, el genoma vírico codifica proteínas reguladoras adicionales, a saber, Tat y Rev, así como proteínas accesorias, a saber, Vpr, Vpx, Vpu, Vif y Nef.

A pesar de los esfuerzos de la sanidad pública para reprimir la propagación de la epidemia de SIDA, el número de nuevas infecciones está aumentando todavía. La Organización Mundial de la Salud estimaba la epidemia global en 36,1 millones de individuos infectados a finales del año 2000, 50% más que lo que se había predicho en base a los datos disponibles diez años atrás (WHO & UNAIDS, UNAIDS, 2000). Globalmente, el número de nuevas infecciones por VIH-1 en el año 2000 se estima en 5,3 millones.

Dada la propagación continua de la epidemia, existe todavía necesidad de proporcionar una vacuna eficaz a la clínica. Se han desarrollado actualmente varias estrategias diferentes de suministro de vacunas contra el VIH-1, tales como nuevos vectores o sistemas adyuvantes, y se han evaluado en diferentes situaciones pre-clínicas así como en estudios clínicos. El primer candidato a vacuna que entró en un estudio clínico de fase III está basado en la proteína gp 120 de cubierta en alumbre (Francis et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 1998; 14 (Supl. 3)(5): S325-31). Los estudios de fase III se han iniciado, aunque la vacuna

\hbox{no demostró tener demasiado 
éxito en el primer estudio de fase II.}

Después de muchos años de esfuerzos por obtener una vacuna profiláctica basados en antígenos de cubierta, los esfuerzos más recientes se han concentrado en el uso de proteínas reguladoras, tales como Tat, Nef y Rev, como antígenos de vacuna candidatos. El uso de estos antígenos reguladores en situaciones terapéuticas ha sido continuo durante varios años (Miller et al., Nature Medicine 1997, 3, 389-94, Calarota et al., Lancet 1998, 351, 1320-5, Ayyavoo et al., AIDS, 2000, 14, 1-9). Más recientemente, el uso de estos antígenos, en estudios para la obtención de vacunas profilácticas, en pequeños estudios pre-clínicos, se ha revelado prometedor. Se demostró que el uso de Tat y Rev, o Tat sola, como candidato a vacuna profiláctica, reprimía SIVmac (Osterhaus et al., Vaccine 1999, 17, 2713-4). Además, existen indicaciones de que los CTL dirigidos contra las proteínas reguladoras precoces del virus son importantes para eliminar células infectadas antes que alcancen su nivel elevado de producción de viriones maduros (van Baalen et al., J. Gen. Virol. 1997, 78, 1913-8; Addo et al., PNAS, 2001, 98, 1781-6).

Aunque las proteínas reguladoras/accesorias del VIH inducen una respuesta inmunitaria eficaz, la mayoría, si no todas, tienen efectos secundarios graves, que limitan hasta ahora su uso como vacuna: se ha demostrado que Nef, Tat y Vpu desempeñan un papel en la reducción de la expresión de CD4+ y/o MHC clase I (Howcroft et al., Science, 1993, 260, 1320-2; Schwartz et al., Nature Med. 1996, 2, 338-42; Swann et al., Virology, 2001, 282, 267-77; Janvier et al., J. Virol., 2001, 78, 3971-6; Weissmann et al., PNAS 1998, 95, 11601-6). Se sabe que Tat media la inmunosupresión aguda in vivo (Cohen et al., PNAS, 1999, 96, 10842-10847). Se han descrito también efectos inmunosupresores para Vpr (Ayyavoo et al., Nature Med., 1997, 3: 1117-1123). Se ha descrito que Vpr y Vpx tienen efectos citostáticos y citotóxicos diferenciales en células de levadura (Zhang et al., Virology, 1997, 230, 103-12). Así, la mayoría, si no todas, de las proteínas accesorias/reguladoras del VIH parecen tener propiedades funcionales que no son deseables en una formulación de vacuna.

En el documento WO 02/06303 se describen intentos para reducir los efectos perjudiciales de las proteínas del VIH. En particular, WO 02/06303 describe una proteína de fusión que incluye las secuencias de aminoácidos de Vif, Vpu y Nef del VIH, en la que las proteínas componentes son contiguas a otra proteína componente, o están separadas por proteínas no componentes tales comos secuencias de aminoácidos, que proporcionan sitios de escisión proteolítica. Se expone que es preferible utilizar aquellas proteínas de fusión que comprenden sitios de escisión proteolítica entre las proteínas componentes. Dado que las proteínas componentes están separadas por sitios de escisión proteolítica, se producen proteínas del VIH nativas que se sabe que son perjudiciales. Para reducir cualesquiera efectos perjudiciales de las proteínas del VIH que resultan de la escisión de la proteína de fusión, el documento WO 02/06303 sugiere la utilización de proteínas atenuadas. Así, el documento WO 02/06303 propugna la utilización de una proteína de fusión que comprende las proteínas Vif, Vpr y Nef del VIH, en la que los sitios de escisión están insertados entre las proteínas del VIH, y en la que las proteínas del VIH son proteínas atenuadas. Sin embargo, la desventaja de las proteínas atenuadas es que la secuencia de aminoácidos de la proteína atenuada difiere de la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa, por lo que una inmunización con la proteína atenuada puede conducir a una respuesta inmunitaria que reconoce sólo débilmente la proteína nativa, o que incluso no reconoce la proteína nativa en absoluto.

Objeto de la invención

Fue el objeto de la presente invención proporcionar una vacuna que permita la generación de una respuesta inmunitaria eficaz, en particular una respuesta eficaz de las células T citotóxicas, contra varias o todas las proteínas reguladoras/accesorias del VIH, en la que las proteínas reguladoras/accesorias del VIH en la vacuna o producidas por la vacuna son menos funcionales que las proteínas reguladoras/accesorias nativas individuales, de tal modo que se reduce el riesgo de que las proteínas accesorias/reguladoras en la vacuna ejerzan efectos secundarios no deseados, y en la que las proteínas del VIH menos activas induzcan una respuesta inmunitaria similar a la de las proteínas del VIH nativas.

Descripción detallada de la invención

Este objeto se ha conseguido por la provisión de una proteína de fusión que comprende la secuencia de amino-ácidos de al menos tres proteínas del VIH diferentes, seleccionadas de Vif, Vpr, Vpu, Vpx, Rev y Tat, o derivados de la secuencia de aminoácidos de una o más de dichas proteínas, en donde la proteína de fusión no se procesa a proteínas individuales del VIH que tengan los términos N y C naturales. En particular, el objeto de la presente invención se ha conseguido mediante ácidos nucleicos y vectores que codifican dichas proteínas de fusión.

Si la proteína de fusión se produce en células animales, incluyendo células humanas, la proteína de fusión no es escindida por proteasas celulares de manera que se obtengan proteínas accesorias/reguladoras con los términos N y C nativos.

Debido al hecho de que una proteína del VIH que forma parte de una proteína de fusión tiene una estructura secundaria/terciaria alterada en comparación con la proteína del VIH individual, la proteína del VIH en la proteína de fusión es menos funcional que la proteína individual, si no totalmente disfuncional. Una proteína reguladora/accesoria que es menos funcional o incluso que no es funcional en absoluto no produce los efectos secundarios indeseables de la proteína del VIH en su conformación natural. En la medida en que está implicada la inmunogenicidad, no existe diferencia sustancial alguna cuando se compara la inmunogenicidad de la proteína de fusión con la inmunogenicidad de las proteínas reguladoras/accesorias del VIH individuales que forman la proteína de fusión. En particular, no existe ninguna diferencia sustancial con respecto a la respuesta de las células T citotóxicas (CTL), dado que los epítopos que se presentan al sistema inmunitario son idénticos. Las mismas consideraciones son aplicables también si la proteína de fusión se administra al paciente.

En el contexto de la presente invención, el término "VIH" hace referencia a cualquier grupo, subtipo ("clado"), cepa o aislado del VIH conocido por la persona experta en la técnica. En particular, VIH puede ser VIH-1 o VIH-2. VIH-1 ha sido clasificado en nueve subtipos (clados A a I), en tanto que VIH-2 ha sido clasificado en cinco subtipos (A a E), todos los cuales están abarcados por el alcance de la presente invención. Los clados más preferidos del VIH de acuerdo con la presente invención son los clados A, B y C del VIH-1. Sin embargo, la invención no está restringida a estas clados más preferidos.

Las secuencias proteínicas de las proteínas reguladoras del VIH Vif, Vpr, Vpu, Rev, Tat, Vpx y Nef son conocidas por la persona experta en la técnica. A modo de ejemplo y sin quedar restringido a dichas realizaciones, se hace referencia a las diversas secuencias que se describen en la base de datos de Genebank, en particular a la secuencia del aislado HXB2R del VIH-1 que tiene el número de acceso a Genebank KO3455. En esta entrada de Genebank, se especifican las secuencias de los diversos genes del VIH-1 y de las proteínas codificadas por dichos genes.

Preferiblemente, las proteínas del VIH que forman la proteína de fusión derivan del mismo clado. De acuerdo con una realización alternativa, las proteínas del VIH que forman la proteína de fusión derivan de dos o más clados. Es posible también que una o más de las proteínas del VIH que forman la proteína de fusión sean proteínas del VIH-1, y que una o más de las proteínas del VIH que forman la proteína de fusión sean proteínas del VIH-2.

Las secuencias de aminoácidos de las proteínas del VIH que forman la proteína de fusión son preferiblemente secuencias que están codificadas por aislados del VIH conocidos; es decir, la secuencia de aminoácidos de las proteínas del VIH en la proteína de fusión es idéntica a las secuencias de aminoácidos de las proteínas correspondientes tal como son codificadas por aislados del VIH de origen natural. En una alternativa, la secuencia de aminoácidos de una o más proteínas del VIH en la proteína de fusión puede ser una secuencia de consenso, es decir, una secuencia que puede no encontrarse como tal en un aislado del VIH conocido, pero que exhibe una homología óptima - en particular con respecto a epítopos de CTL - con varios o todos los aislados del VIH conocidos. La persona experta en la técnica conoce algoritmos de ordenador para calcular una secuencia de consenso.

En una realización alternativa, la proteína de fusión puede comprender derivados de la secuencia de aminoácidos de una o más proteínas del VIH que son parte de la proteína de fusión. La expresión "derivado de la secuencia de aminoácidos de una proteína del VIH", tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, se refiere a proteínas del VIH que tienen una secuencia de aminoácidos alterada comparada con la proteína del VIH correspondiente existente naturalmente. Una secuencia de aminoácidos alterada puede ser una secuencia en la cual uno o más aminoácidos de la secuencia de la proteína del VIH están sustituidos, insertados o suprimidos. Más particularmente, un "derivado de la secuencia de aminoácidos de una proteína del VIH" es una secuencia de aminoácidos que exhibe una homología de al menos 50%, más preferiblemente de al menos 70%, todavía más preferiblemente de al menos 80%, muy preferiblemente de al menos 90%, cuando la parte correspondiente de la secuencia de aminoácidos en la proteína de fusión se compara con la secuencia de aminoácidos de la proteína del VIH respectiva de aislados del VIH conocidos. Se considera que una secuencia de aminoácidos tiene la homología de secuencia arriba indicada aun cuando la homología se encuentre para la proteína correspondiente de un solo aislado del VIH, independientemente del hecho de que pudieran existir proteínas correspondientes en otros aislados que exhiban una homología menor. A modo de ejemplo, si un derivado de Vpr en la proteína de fusión exhibe una homología de 95% con la secuencia Vpr de un solo aislado del VIH, pero sólo una homología de 50-70% para (todos) los demás aislados del VIH, se considera que la homología de dicho derivado de Vpr es de al menos 90%.

Se ha señalado anteriormente que las proteínas del VIH en la proteína de fusión tienen una actividad reducida, o incluso no tienen actividad en absoluto, en comparación con las proteínas individuales, dado que la conformación de las proteínas en la proteína de fusión es diferente a la conformación natural de las proteínas biológicamente activas. Sin embargo, pudiera ser deseable reducir adicionalmente el riesgo de que las proteínas del VIH en la proteína de fusión sean biológicamente activas. Para este fin, "derivados" particularmente preferidos de una proteína del VIH individual que forma parte de una proteína de fusión son derivados de secuencias de aminoácidos en los cuales varios aminoácidos están suprimidos, insertados o sustituidos, más preferiblemente no más de 10 aminoácidos, muy preferiblemente no más de 5 aminoácidos, para obtener una proteína del VIH con actividad reducida o sin actividad alguna en absoluto. La persona experta en la técnica conoce ensayos para determinar si una proteína del VIH tiene actividad biológica reducida:

El mecanismo molecular de la proteína Vif, que es esencial para la replicación vírica in vivo, sigue siendo desconocido, pero Vif posee una fuerte tendencia a la autoasociación. Se ha demostrado que esta multimerización es importante para la función de Vif en el ciclo vital del virus (Yang S. et al., J Biol Chem 2001; 276: 4889-4893). Adicionalmente, se ha demostrado que Vif se asocia específicamente con el complejo de nucleoproteínas vírico, y esto pudiera ser funcionalmente importante (Khan M.A. et al., J Virol. 2001; 75(16): 7252-65). Así, una proteína vif con actividad reducida exhibe una multimerización y/o asociación reducida con el complejo de nucleoproteínas.

La proteína Vpr desempeña un papel importante en el ciclo vital del virus. Vpr regula la importación nuclear del complejo de preintegración vírico, y facilita la infección de las células que no se dividen, tales como macrófagos (Agostini et al., AIDS Res Hum Retroviruses 2002; 18(4): 283-8). Adicionalmente, aquélla tiene actividad de trans-activación mediada por interacción con la LTR (Vanitharani R. et al., Virology 2001; 289(2): 334-42). Así, una vpr con actividad reducida exhibe una transactivación y/o interacción disminuida o incluso nulas con el complejo de preintegración vírico.

Vpx, que es altamente homóloga a Vpr, también es crítica para la replicación vírica eficiente en células que no se dividen. Vpx está empaquetada en partículas de virus por una interacción con el dominio p6 de la poliproteína precursora gag. Al igual que Vpr, Vpx está involucrada en el transporte del complejo de preintegración al núcleo (Mahalingam et al., J. Virol 2001; 75(1): 362-74). Así, una Vpx con actividad reducida tiene una capacidad disminuida para asociarse al complejo de preintegración por la vía del precursor gag.

Se sabe que la proteína Vpu interacciona con la cola citoplásmica de CD4 y provoca la degradación de CD4 (Bour et al., Virology 1995; 69(3): 1510-20). Por esta razón, la Vpu con actividad reducida tiene una capacidad reducida para desencadenar la degradación de CD4.

La actividad biológica relevante de la bien caracterizada proteína Tat es la transactivación de la transcripción mediante interacción con el elemento de respuesta a la transactivación (TAR). Se ha demostrado que Tat es capaz de transactivar promotores heterólogos que carecen de secuencias del VIH distintas de TAR (Han P. et al., Nucleic Acid Res 1991; 19(25): 7225-9). Así, una proteína tat con actividad reducida exhibe una transactivación reducida de los promotores por la vía del elemento TAR.

La proteína Nef es esencial para la replicación vírica responsable del progreso de la enfermedad por inducción de la reducción de la superficie celular de CD4 (Lou T et al., J Biomed Sci 1997; 4(4): 132). Esta reducción se inicia por interacción directa entre CD4 y Nef (Preusser A. et al., Biochem Biophys Res Commun 2002; 292(3): 734-40). Así, la proteína Nef con función reducida exhibe una interacción reducida con CD4.

La función relevante de Rev es la transactivación posterior a la transcripción iniciada por interacción con el elemento de respuesta Rev (RRE) del ARN vírico (Iwai et al., 1992; Nucleic Acids Res 1992; 20(24): 6465-72). Así, una Rev con actividad reducida exhibe una interacción reducida con el RRE.

Las proteínas de fusión de acuerdo con la presente invención comprenden la secuencia de aminoácidos de al menos tres proteínas del VIH diferentes, seleccionadas de Vif, Vpr, Vpu, Rev, Vpx y Tat. La proteína de fusión puede comprender preferiblemente 4, 5 o la totalidad de dichas proteínas del VIH. Una proteína de fusión típica de acuerdo con esta realización comprende la secuencia de aminoácidos de las proteínas del VIH Vpr, Vif, Vpu, Rev y Tat, o derivados de la secuencia de aminoácidos de una o más de dichas proteínas. El orden de las proteínas del VIH en la proteína de fusión no es crítico.

Una o más de las al menos tres proteínas del VIH diferentes pueden estar comprendidas en la proteína de fusión en dos o más copias. Así, a modo de ejemplo, una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención puede comprender Vif, Vpr, Vpu y dos copias de Rev. La secuencia de aminoácidos de las dos o más copias de una proteína del VIH puede ser idéntica. Alternativamente, la secuencia de aminoácidos de las copias puede ser diferente, en particular si se utilizan secuencias de proteína que derivan de cepas o clados del VIH diferentes (v.g., una copia de una VIH-1 Rev y una copia de una VIH-2 Rev).

Las proteínas del VIH adyacentes, en la proteína de fusión, se pueden fusionar sin aminoácidos adicionales, o se pueden fusionar de tal manera que dos proteínas del VIH adyacentes, en la proteína de fusión, están separadas por al menos un aminoácido adicional. Asimismo, combinaciones de ambas están dentro del alcance de la presente invención. A modo de ejemplo, en una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención que comprende la secuencia de aminoácidos de cuatro proteínas del VIH, dos proteínas del VIH adyacentes pueden estar enlazadas directamente entre sí, mientras que las proteínas del VIH tercera y cuarta están enlazadas por aminoácidos adicionales. El término "aminoácido adicional" en el contexto de esta realización hace referencia a aminoácidos que no se encuentran en esta posición en las proteínas del VIH de origen natural.

Así, la proteína de fusión de acuerdo con la presente invención tiene preferiblemente la fórmula general siguiente:

+P1---P2---P3---P4---P5\text{*}---P6\text{*}---P7\text{*}+

en la cual P1 a P7 son proteínas del VIH diferentes, seleccionadas de Vif, Vpr, Vpx, Vpu, Tat y Rev, en la que la proteína de fusión comprende por ejemplo cuatro de dichas proteínas del VIH diferentes, a saber, P1 a P4, y opcionalmente una (P5*), dos (P5*- - -P6*) o tres (P5*- - -P6*- - -P7*) de dichas proteínas del VIH adicionales. La abreviatura "- - -" representa independientemente 0 a n aminoácidos adicionales. Cuando "- - -" representa 0 aminoácidos, las proteínas del VIH adyacentes están fusionadas directamente entre sí, sin aminoácidos adicionales. Cuando "- - -" representa 1 a n aminoácidos, las proteínas del VIH adyacentes están separadas por uno a n aminoácidos. El límite superior de los aminoácidos adicionales, es decir, el número entero n, depende del tamaño máximo de la proteína de fusión que puede producirse o expresarse en las células.

De acuerdo con una realización, todos los "- - -" representan independientemente 0 a 20, más preferiblemente 0 a 10, todavía más preferiblemente 0 a 5 aminoácidos adicionales.

De acuerdo con una realización alternativa, al menos uno de "- - -" representa la secuencia de aminoácidos de una proteína adicional o una parte de la misma, que no es una proteína del VIH seleccionada de Vif, Vpr, Vpx, Vpu, Rev y Tat. Así, de acuerdo con esta realización alternativa, la proteína adicional está flanqueada por proteínas del VIH reguladoras/accesorias. La proteína adicional puede ser cualquier proteína. Más preferiblemente, la proteína adicional comprende epítopos adicionales que pueden ayudar a inducir una mejor respuesta inmunitaria frente al VIH. Así, la proteína adicional puede ser la proteína del VIH Env, Gag y/o Pol, o partes de las mismas. En este contexto, el término "parte" de Env, Gag y Pol hace referencia a un tramo de aminoácidos derivado de una de dichas proteínas, que comprende al menos un epítopo. Más preferiblemente, el término "parte" hace referencia a al menos 10, todavía más preferiblemente a al menos 20, aún más preferiblemente a al menos 50 aminoácidos de una de dichas proteínas. De acuerdo con una realización afín, al menos uno de "- - -" representa la secuencia de aminoácidos de una o más de las proteínas P1 a P7 que forman parte de la proteína de fusión. Así, en este caso, la proteína de fusión puede comprender una o más copias de una o más de las proteínas que forman parte de la proteína de fusión. Como se ha reseñado, las copias de las proteínas pueden tener o no una secuencia de aminoácidos idéntica.

En la fórmula anterior, la abreviatura "+" representa independientemente 0 hasta n aminoácidos terminales adicionales. Así, la proteína de fusión de acuerdo con la presente invención puede comprender o no aminoácidos adicionales en el término C y/o N de la proteína. De acuerdo con una realización, al menos uno de "+" representa la secuencia de aminoácidos de una proteína adicional o parte de la misma, que no es una proteína del VIH seleccionada de Vif, Vpr, Vpx, Vpu, Rev y Tat. Así, de acuerdo con esta realización, la proteína de fusión comprende en su término C y/o N una proteína adicional, que no es Vif, Vpr, Vpx, Vpu, Rev o Tat. La proteína adicional puede ser cualquier proteína. Más preferiblemente, la proteína adicional comprende epítopos adicionales que pueden ayudar a inducir una mejor respuesta inmunitaria frente al VIH. V.g., la proteína adicional puede ser la proteína Env, Gag y/o Pol del VIH, o partes de las mismas. En este contexto, el término "parte" de Env, Gag y Pol hace referencia a un tramo de aminoácidos derivado de una de dichas proteínas, que comprende al menos un epítopo. Más preferiblemente, el término "parte" hace referencia a al menos 10, todavía más preferiblemente a al menos 20, y muy preferiblemente a al menos 50 aminoácidos de una de dichas proteínas.

De acuerdo con una realización alternativa, al menos uno de "+" representa una secuencia de aminoácidos que permite una detección o purificación fácil de la proteína de fusión. Así, al menos uno de "+" pudiera ser por ejemplo un marcador tal como un marcador His.

De acuerdo con la presente invención, la proteína de fusión no se procesa para dar proteínas del VIH individuales que tienen los términos N y C naturales. Más particularmente, la proteína de fusión de acuerdo con la presente invención no se procesa para dar proteínas del VIH individuales que tienen los términos naturales N y C, cuando se expresa en células humanas. La persona experta en la técnica conoce métodos sobre cómo comprobar si una proteína de fusión, una vez expresada en células humanas, se procesa a proteínas del VIH individuales que tienen los términos N y C naturales. En este contexto, se hace referencia a Ayyavoo et al., AIDS 2000, 14, 1-9, en particular al experimento descrito en la Figura 2 de dicha publicación. Resumidamente, la persona experta en la técnica podría expresar fácilmente la proteína de fusión respectiva en células humanas, tales como células HeLa; las células se lisan entonces, y los lisados celulares se someten a experimentos de transferencia Western o a ensayos de inmunoprecipitación con anticuerpos específicos para las proteínas del VIH individuales que forman juntas la proteína de fusión del VIH respectiva. Para una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención, no se detecta cantidad significativa alguna de proteínas del VIH, cuyo tamaño corresponde al tamaño de una proteína individual reguladora/accesoria del VIH.

Con objeto de asegurar que la proteína de fusión de acuerdo con la presente invención no se procesa a proteínas del VIH individuales que tengan los términos N y C naturales, la proteína de fusión no debería de contener, entre las secuencias de aminoácidos de las proteínas del VIH que forman la proteína de fusión, secuencias de escisión específicas para proteasas celulares, las cuales podrían desencadenar la generación de proteínas del VIH que tengan los términos N y C naturales. Así, la secuencia de aminoácidos "- - -", tal como se abrevia en la fórmula general anterior, no contiene secuencias de escisión específicas para proteasas celulares, las cuales podrían desencadenar la generación de proteínas del VIH que tengan los términos N y C naturales. En particular, la proteína de fusión no contiene la secuencia de escisión REKRAVVG (código de aminoácidos de una sola letra) entre las secuencias de aminoácidos de las diferentes proteínas del VIH que forman la proteína de fusión. Las secuencias de escisión adicionales para proteasas celulares son conocidas por la persona experta en la técnica. Así, la persona experta en la técnica puede evitar fácilmente la inclusión de secuencias de escisión para proteasas (celulares) que podrían conducir a proteínas del VIH individuales que tengan términos N y C naturales. Un ejemplo de la secuencia de escisión de una cisteinproteasa es Ile/Leu-X-Thr-X-Gly.

Las proteínas de acuerdo con la presente invención no comprenden secuencias de escisión específicas que conduzcan a proteínas del VIH que tengan ambos términos N y C nativos. Sin embargo, esto no excluye generalmente la presencia de sitios de escisión para proteasas celulares entre las proteínas en la proteína de fusión, con tal de que estos sitios de escisión no medien la generación de proteínas del VIH que tengan a la vez un término N natural y un término C natural. En particular, la secuencia de aminoácidos "- - -", tal como se abrevia en la fórmula general anterior, puede comprender sitios de escisión para las proteasas que están implicadas en la generación de péptidos cortos presentados sobre MHCI o MHCII. De acuerdo con esta realización, el resultado de la reacción de escisión es un tramo peptídico corto que tiene preferiblemente menos de 20 aminoácidos, cuyo término N o C puede corresponder al término N o C de una de las proteínas accesorias/reguladoras del VIH. Sin embargo, estos péptidos cortos, cuando se producen durante el proceso de presentación de antígenos, ya no tienen la actividad de la proteína del VIH de la que
derivan.

La invención se refiere adicionalmente a ácidos nucleicos que codifican las proteínas de fusión arriba definidas de acuerdo con la presente invención. El ácido nucleico puede ser ADN o ARN. Preferiblemente, el ácido nucleico es ADN si se pretende insertar el ácido nucleico en células humanas utilizando un vector de ADN, tal como un plásmido o un vector basado en un virus de ADN.

La persona experta en la técnica conoce métodos de cómo construir un ácido nucleico que codifique la proteína de fusión de acuerdo con la presente invención. Sin ligarse a los métodos que siguen, la persona experta en la técnica puede partir de un clon de VIH genómico, de un clon de VIH subgenómico, o de cualquier material de partida, tal como plásmidos, que comprenda la secuencia codificante de una o más de las proteínas reguladoras/accesorias del VIH. Si la secuencia codificante de una proteína reguladora/accesoria se encuentra en la forma de un marco de lectura continua, dicha secuencia codificante se puede aislar escindiendo, con enzimas de restricción apropiadas, el ácido nucleico que comprende dicha secuencia codificante. Los fragmentos de ADN así obtenidos se pueden utilizar para la clonación ulterior. Alternativamente, las secuencias codificantes de una proteína accesoria/reguladora se pueden obtener utilizando los métodos de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) con iniciadores apropiados. Si las proteínas reguladoras/accesorias están codificadas por más de un exón, como ocurre v.g. en el caso de Tat y Rev, puede ser necesario clonar independientemente los diferentes exones y fusionarlos para generar un marco de lectura continua para la proteína reguladora/accesoria, o utilizar tecnología de transcripción inversa tal como RT-PCR.

Se puede proporcionar también una secuencia codificante mediante síntesis de genes, es decir, generando un gen utilizando una serie de oligonucleótidos complementarios y/o solapantes.

Con objeto de obtener una proteína de fusión, el ácido nucleico que codifica dicha proteína de fusión contiene preferiblemente un marco de lectura continua. Por consiguiente, los codones de parada de todas menos la última secuencia que codifica las proteínas del VIH o proteínas adicionales se someten preferiblemente a mutación en un codón que codifica un aminoácido, o se suprimen completamente. Con preferencia, esto se puede lograr fácilmente si se utilizan para la PCR iniciadores específicos que amplifican la secuencia codificante sin el codón de parada. Dicho de otro modo, de acuerdo con esta alternativa, el iniciador en dirección 3' no debería de ser complementario al codón de parada. El fragmento de ADN amplificado no contendrá por lo tanto un codón de parada, y se puede clonar en el vector de clonación. Alternativamente, también es posible clonar en el vector de clonación una secuencia codificante con su codón de parada. El codón de parada se puede suprimir más tarde, v.g. utilizando endonucleasas específicas o por mutagenización.

El resultado de las etapas de clonación debería de ser un marco de lectura continua que codifique la proteína de fusión de acuerdo con la presente invención.

Los elementos reguladores que son necesarios para obtener la expresión de la proteína de fusión pueden ser cualesquiera elementos reguladores que impulsen la expresión en el sistema de expresión deseado. Si se pretende producir la proteína de fusión en células procariotas, tales como Escherichia coli, es preferible utilizar un promotor bacteriano o fágico. Si se pretende expresar la proteína de fusión en células eucariotas, es preferible utilizar un promotor/potenciador eucariota o vírico. Si se pretende expresar la proteína de fusión utilizando un promotor poxvírico (véase más adelante), es preferible utilizar un promotor poxvírico tal como el promotor 7.5 o el promotor
ATI.

Como se ha reseñado anteriormente, la proteína de fusión puede comprender parejas de fusión que no son proteínas del VIH seleccionadas de Vif, Vpr, Vpx, Vpu, Tat y Rev. Así, la proteína de fusión puede comprender la secuencia de aminoácidos de otras proteínas o partes de las mismas. Ejemplos de otras proteínas son las proteínas Gag, Pol y Env del VIH. En consecuencia, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede comprender también las secuencias codificantes de una o más proteínas adicionales o partes de las mismas en el marco de lectura abierta que codifica al menos cuatro proteínas reguladoras/accesorias del VIH o derivados de las mismas.

En una realización adicional de la presente invención, el ácido nucleico puede comprender adicionalmente casetes de expresión independientes que codifiquen proteínas adicionales que pueden contribuir a mejorar adicionalmente la respuesta inmunitaria contra el VIH. En una realización preferida, el ácido nucleico puede comprender adicionalmente casetes de expresión que comprenden la secuencia codificante de al menos una proteína del VIH adicional seleccionada de Gag, Pol y Env, o partes de las mismas. Todavía más preferiblemente, el ácido nucleico puede comprender además de la secuencia codificante de la proteína de fusión, las secuencias codificantes de todas las proteínas del VIH Gag, Pol y Env. El ácido nucleico es preferiblemente parte de un vector. El ácido nucleico puede ser también el genoma vírico o parte del mismo de un vector vírico, preferiblemente un vector de poxvirus tal como MVA. De este modo, es posible expresar a partir del vector poxvírico la proteína de fusión así como las proteínas del VIH adicionales, v.g. al menos una proteína del VIH adicional seleccionada de Gag, Pol y Env.

La invención se refiere adicionalmente a vectores que comprenden un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. El término "vector" hace referencia a cualesquiera vectores conocidos por la persona experta en la técnica. Un vector puede ser un vector plasmídico, tal como pBR322, o un vector de la serie pUC. Más preferiblemente, el vector es un vector de virus. En el contexto de la presente invención, el término "vector vírico" o "vector de virus" hace referencia a un virus infeccioso y/o atenuado que comprende un genoma vírico. En este caso, el ácido nucleico de la presente invención es parte del genoma vírico del vector vírico respectivo, y/o constituye el genoma vírico. Los vectores recombinantes se pueden utilizar para la infección de células y líneas de células, en particular para la infección de animales vivos, incluyendo seres humanos. Vectores de virus típicos de acuerdo con la presente invención son vectores de adenovirus, vectores de retrovirus o vectores basados en el virus 2 adeno-asociado (AAV2). Son muy preferidos los vectores poxvíricos. El poxvirus puede ser preferiblemente un poxvirus de canario, un poxvirus de ave de corral o un virus vacunal. Es más preferido el virus vacunal Ankara modificado (MVA) (Sutter, G. et al., [1994], Vaccine 12: 1032-40). Una cepa de MVA típica es MVA 575, que se ha depositado en la European Collection of Animal Cell Cultures bajo el número de depósito ECACC V00120707. Es muy preferida la cepa MVA-BN o un derivado de la misma, que se ha descrito en la Solicitud PCT PCT/EP01/13628, presentada en la Oficina Europea de Patentes el 22 de noviembre de 2001, titulada "Modified Vaccinia Ankara Virus Variant". MVA-BN se ha depositado en la European Collection of Animal Cell Cultures con el número de depósito ECACC V00083008. Usando MVA-BN o un derivado de la misma, se ha resuelto el problema técnico adicional de proporcionar una vacuna de virus particular segura contra el VIH, dado que el vector vírico de MVA-BN es un virus extremadamente atenuado, que deriva del virus vacunal Ankara Modificado, y que se caracteriza por la pérdida de su capacidad para replicarse reproductivamente en células humanas. MVA-BN es más segura que cualesquiera otras cepas del virus vacunal conocidas, debido a la falta de replicación en seres humanos. En una realización preferida, la invención se refiere, como un vector vírico que contiene el ADN de acuerdo con la presente invención, a MVA-BN y derivados de MVA-BN. Las características de MVA-BN, la descripción de los ensayos biológicos que permiten evaluar si un MVA es MVA-BN o un derivado del mismo, y los métodos que permiten obtener MVA-BN o un derivado del mismo se describen en la Solicitud PCT PCT/EP01/13628 arriba citada, que se incorpora en esta memoria por referencia.

Así, de acuerdo con estas realizaciones, la invención se refiere preferiblemente a un MVA recombinante, tal como MVA-BN, que comprende en el genoma vírico una casete de expresión que codifica una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención.

La persona experta en la técnica conoce métodos para insertar el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención en el genoma vírico, y métodos para obtener virus recombinantes.

En un virus vacunal recombinante, la expresión del ADN de acuerdo con la presente invención está preferiblemente, pero no de modo exclusivo, bajo el control transcripcional de un promotor de poxvirus, más preferiblemente de un promotor del virus vacunal. La inserción del ADN de acuerdo con la presente invención tiene lugar preferiblemente en una región no esencial del genoma vírico. En otra realización preferida de la invención, la secuencia de ácido nucleico heterólogo se inserta en un sitio de supresión de origen natural del genoma poxviríco (descrito en el documento PCT/EP96/02926). Sin embargo, la naturaleza del sitio de inserción no es crítica para la presente invención, con tal de que se obtenga un virus vacunal recombinante. Así, la persona experta en la técnica puede idear fácilmente sitios de inserción adicionales adecuados.

Preferiblemente, el vector vírico, en particular el vector de poxvirus, puede comprender, en el genoma vírico, genes retrovíricos adicionales, seleccionados de los genes Gag, Pol y Env del VIH, además de la secuencia codificante para la proteína de fusión de acuerdo con la presente invención. Más preferiblemente, el vector vírico, en particular el vector poxvírico, puede comprender todos los genes del VIH que codifican Gag, Pol y Env, además de la secuencia codificante para la proteína de fusión de acuerdo con la presente invención. Estos genes adicionales pudieran haber sido insertados con el mismo ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. De acuerdo con esta realización, todos los genes del VIH estarían localizados en el mismo sitio de inserción en el genoma vírico. En una realización alternativa, los genes adicionales están insertados en localizaciones diferentes del genoma vírico.

En una realización preferida, la presente invención se refiere al ácido nucleico, al vector o a la proteína de fusión de acuerdo con la presente invención como una vacuna para la profilaxis al menos parcial contra infecciones por VIH y SIDA. Una "vacuna" es un compuesto, es decir, un ácido nucleico, una proteína de fusión, un vector o un virus que induce una respuesta inmunitaria específica.

De acuerdo con una alternativa de esta realización, la "vacuna" de acuerdo con la presente invención se basa en la proteína de fusión de acuerdo con la presente invención.

En una realización preferida, se utiliza como vacuna el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, en particular ADN. Es sabido por la persona experta en la técnica que la administración de ADN desnudo que aloja una casete de expresión eucariota como en la presente invención, en particular la inyección intramuscular de ADN, conduce a la expresión de la proteína codificada por el casete de expresión. La proteína se expone al sistema inmunitario y se genera una respuesta inmunitaria específica. En una realización alternativa, la vacunación se realiza administrando un vector de acuerdo con la presente invención, en particular un vector vírico, más preferiblemente un vector de poxvirus, y muy preferiblemente un vector del virus vacunal, v.g. un vector del MVA.

Para la preparación de una vacuna basada en el virus vacunal, el virus de acuerdo con la invención se convierte en una forma fisiológicamente aceptable. Esto puede hacerse basándose en la experiencia en la preparación de vacunas de poxvirus utilizadas para la vacunación contra la viruela (como se describe por Stickl, H. et al. [1974] Dtsch. Med. Wschr. 99, 2386-2392). Por ejemplo, el virus purificado se guarda a -80ºC con un título de 5x10^{8} TCID_{50}/ml, formulado en Tris aproximadamente 10 mM, NaCl 140 mM, de pH 7,4. Para la preparación de dosis de vacuna, v.g., se liofilizan 10^{2}-10^{8} partículas del virus en 100 ml de disolución salina tamponada con fosfato (PBS), en presencia de peptona al 2% y albúmina humana al 1%, en una ampolla, preferiblemente una ampolla de vidrio. Alternativamente, las dosis de la vacuna se pueden producir por liofilización gradual del virus en una formulación. Esta formulación puede contener aditivos adicionales tales como manitol, dextrano, azúcar, glicina, lactosa o polivinilpirrolidona, u otros aditivos tales como antioxidantes o gas inerte, estabilizadores o proteínas recombinantes (v.g. seroalbúmina humana), adecuados para la administración in vivo. La ampolla de vidrio se cierra entonces herméticamente, y se puede guardar entre 4ºC y la temperatura ambiente durante varios meses. Sin embargo, mientras que no exista necesidad alguna, la ampolla se guarda preferiblemente a temperaturas por debajo de -20ºC. Para la vacunación, el liofilizado se puede disolver en 0,1 a 0,5 ml de una disolución acuosa, preferiblemente disolución salina fisiológica o tampón Tris, y se puede administrar sistémica o localmente, es decir, por vía parenteral, intramuscular o cualquier otra ruta de administración conocida por el profesional sanitario experto. El modo de administración, la dosis y el número de administraciones se pueden optimizar de manera conocida por los expertos en la técnica. Es muy preferida para vectores poxvíricos la administración subcutánea o intramuscular.

Si la vacuna es un vector de MVA-BN o derivado del mismo que comprende un ADN de acuerdo con la presente invención, una realización particular de la presente invención se refiere a la administración de la vacuna en cantidades terapéuticamente eficaces en una primera inoculación ("inoculación de sensibilización") y en una segunda inoculación ("inoculación de refuerzo").

Si la vacuna es un vector de MVA-BN o derivado del mismo que comprende un ADN de acuerdo con la presente invención, una realización particular de la presente invención se refiere a un kit para vacunación que comprende un vector de virus de MVA-BN de acuerdo con la presente invención para la primera vacunación ("sensibilización") en un primer vial/envase, y para una segunda vacunación ("refuerzo") en un segundo vial/envase.

Así, la invención se refiere, en las realizaciones de vacuna, a una vacuna que comprende un ácido nucleico, un vector o una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención, y al uso de dicho ácido nucleico, vector o proteína para la preparación de una vacuna.

De acuerdo con una realización adicional, la invención se refiere a un método para proteger a un animal, incluyendo un ser humano, contra una infección por VIH administrando a un animal, incluyendo un ser humano, que lo necesite, una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención, un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, o un vector de acuerdo con la presente invención.

Además, la invención se refiere a un método para producir una proteína de acuerdo con la presente invención, que comprende las etapas de (i) transfectar una célula hospedante con un ácido nucleico o un vector de acuerdo con la presente invención, o (ii) infectar una célula hospedante con un vector vírico de acuerdo con la presente invención, (iii) expresar la proteína de fusión en la célula hospedante transfectada de la etapa (i), o la célula hospedante infectada de la etapa (ii), y (iv) recuperar la proteína de fusión.

La invención se refiere adicionalmente a células hospedantes transfectadas con un ácido nucleico o un vector de acuerdo con la presente invención, o infectadas con un vector vírico de acuerdo con la presente invención.

Breve descripción de las Figuras

Fig. 1: Representación esquemática de la hibridación de oligonucleótidos

La imagen muestra la hibridación de cuatro oligonucleótidos. Los oligonucleótidos son monocatenarios, y se pueden hibridar mediante extremos complementarios. Los saltos se rellenan con una polimerasa, que exhibe una actividad de corrección de lectura (v.g., polimerasa Pfx).

Fig. 2: Representación esquemática de la hibridación de cuatro genes de la mancha ("blob")

El gen vif muestra una secuencia solapante con el fragmento vpr, y el fragmento codificante vpu muestra una secuencia solapante con el gen rev (gris). Los fragmentos de la PCR se desnaturalizan, y se hibridan los extremos complementarios solapantes. Los saltos resultantes se rellenan utilizando polimerasa Pfx. El fragmento vif-vpr se fusiona a una secuencia solapante del fragmento vpu-rev, que se utiliza de nuevo para fusión.

Fig. 3: Estrategia de clonación de la secuencia que codifica una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención en un vector de recombinación para inserción de genes extraños en el genoma de MVA

La región codificante de la poliproteína fusionada vif, vpr, vpu y rev se amplificó con cebadores que comprendían un sitio de restricción ClaI y ApaI. Este producto de la PCR se clonó en el vector pBNX65 cortado con ClaI/ApaI, que contiene el promotor ATI de poxvirus. La región codificante de tat se amplificó mediante PCR con cebadores que contenían un sitio de restricción Acc651, y se ligó al pBNX65+vif-rev linealizado con Acc651. El casete de expresión resultante (promotor ATI + secuencia que codifica una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención) se aisló mediante restricción con PacI, y se insertó en el vector de recombinación para inserción de genes extraños en la región intergénica 14L del genoma de MVA (pBNX39). PBNX39 contiene secuencias homólogas a las secuencias de flanqueo del sitio de inserción del genoma de MVA (F1 14L y F2 14L). Para la selección de virus recombinantes después de la recombinación homóloga del genoma de MVA y pBNX39, el vector contiene adicionalmente el gen gpt de E. coli (gen de la fosforribosiltransferasa). Después de la purificación de los virus recombinantes, el casete de selección se suprime mediante recombinación homóloga entre Flank 1 y una secuencia de repetición de flank 1 (F1rpt).

Fig. 4: Representación esquemática del genoma de MVA

MVA contiene un genoma lineal, que muestra fragmentos característicos después de la restricción con Hind III (A-O). La región no funcional entre los genes 14L e 15L está localizada en el fragmento I. La inserción de genes extraños utilizando pBNX39 se produce en la posición 56767-56768.

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Ejemplos Generación de un ADN que codifica una proteína de fusión Vif-Vpr-Vpu-Rev-Tat del VIH

Los genes individuales del genoma del VIH se prepararon mediante PCR de ADN genómico, utilizando protocolos estándar de PCR, o sintéticamente mediante una técnica que está basada en la hibridación de oligonucleótidos por la vía de secuencias solapantes y llenado de los saltos monocatenarios resultantes.

Para la generación, basada en oligonucleótidos, de regiones codificantes de genes, que deben insertarse en el ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de acuerdo con la presente invención, se diseñaron oligonucleótidos 40-meros con saltos de 15 pb. La secuencia de los oligonucleótidos está basada en el mapa genómico del aislado HXB2R de VIH1, que deriva de la cepa IIIB. Los oligonucleótidos para la reacción de hibridación o la PCR para el aislamiento de la secuencia requerida se diseñaron de tal manera que, en la región codificante resultante, se suprimieron los codones de parada para la terminación de la traducción. Se sintetizó el gen tat utilizando oligonucleótidos que contenían un codón de parada, dado que este gen debía insertarse en la última posición del ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de acuerdo con la presente invención, y por consiguiente debería de contener un triplete de parada para una terminación correcta de la traducción de la poliproteína.

Para la reacción de hibridación de oligonucleótidos, se realizaron 10 ciclos de una reacción de polimerasa Pfx (Gibco-BRL) de dos etapas (desnaturalización a 95ºC, e hibridación/extensión a 68ºC). Durante dicha reacción, las secuencias solapantes de los oligonucleótidos se hibridaron, y los saltos se rellenaron por medio de la polimerasa de corrección de lectura Pfx (Fig. 1).

Para la síntesis de la región codificante de vif, el primer gen codificado en la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión, se realizó una PCR utilizando ADNc genómico del VIH. La PCR se realizó de tal manera que la región codificante de vif se fusionó a los primeros 15 pb del gen vpr siguiente, para la hibridación subsiguiente de vif y vpr. La región codificante de Vpr, que abarca los pares de bases 5559-5847 del genoma HXB2R del VIH, se preparó hibridando 10 oligonucleótidos. Se rellenaron los saltos resultantes y, después de una PCR subsiguiente para amplificación, el producto contenía la región codificante de vpr fusionada a las regiones de flanqueo para vif y vpu, que debía insertarse después de la región codificante de vpr.

La región codificante de Vpu se amplificó mediante PCR a partir del mismo ADNc utilizado para la síntesis de vif, y el producto resultante contenía las regiones de flanqueo para fusión con vpr y rev.

La región codificante de rev se sintetizó hibridando 14 oligonucleótidos, que abarcan la región de los pares de bases 5970-6045 y 8379-8650 del genoma HXB2R del VIH, y solapamientos de 15 pares de bases para la hibridación con vpu y tat.

La región codificante de tat se creó utilizando 10 oligonucleótidos, que abarcan los pares de bases 5831-6045 y 8379-8466 del genoma HXB2R del VIH.

La región codificante de vif y la región codificante de vpr, así como la región codificante de vpu y la región codificante de rev, se fusionaron mediante hibridación de los dos fragmentos, a través de sus solapamientos, con una reacción con polimerasa Pfx de dos etapas (Fig. 2). Después de la amplificación adicional de los productos de fusión mediante PCR, los fragmentos se purificaron y se ligaron entre sí a través del solapamiento de vpr y vpu (Fig. 2). Después de la amplificación del producto resultante (secuencias codificantes para vif-vpr-vpu-rev) mediante PCR, la región codificante de tat se fusionó, mediante clonación del fragmento vif-vpr-vpu-rev y tat en sitios de clonación adyacentes, en un vector pBluescriptKS+ que contenía el promotor ATI de poxvirus (Fig. 3, pBNX65). El casete de expresión completo se aisló entonces mediante restricción con PacI, y se insertó en pBNX39 (Fig. 3). PBNX39 contiene secuencias homólogas al genoma de MVA, lo cual permite la inserción en una región no codificante (14L) del genoma (Fig. 4) mediante recombinación homóloga.

Claims

1. Proteína de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos de al menos tres proteínas del VIH seleccionadas de Vif, Vpr, Vpu, Vpx, Rev y Tat, o derivados de la secuencia de aminoácidos de una o más de dichas proteínas, en la que la proteína de fusión no contiene secuencias de escisión específicas para proteasas celulares, que podrían desencadenar la generación de proteínas del VIH que tengan los términos N y C naturales, entre las secuencias de aminoácidos de las proteínas del VIH que forman la proteína de fusión, y en la que un derivado de la secuencia de aminoácidos de una proteína del VIH es una secuencia de aminoácidos que muestra una homología de al menos 50%, cuando la parte correspondiente de la secuencia de aminoácidos en la proteína de fusión se compara con la secuencia de aminoácidos de la proteína del VIH respectiva en el aislado HXB2R de VIH-1.

2. Proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, en la cual la homología es al menos 80%.

3. Proteína de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos de al menos tres proteínas del VIH seleccionadas de Vif, Vpr, Vpu, Vpx, Rev y Tat, o derivados de la secuencia de aminoácidos de una o más de dichas proteínas, en la que la proteína de fusión no contiene secuencias de escisión específicas para proteasas celulares, que podrían desencadenar la generación de proteínas del VIH que tengan los términos N y C naturales, entre las secuencias de aminoácidos de las proteínas del VIH que forman la proteína de fusión, y en la que el derivado de una proteína del VIH individual que forma parte de la proteína de fusión es una secuencia de aminoácidos en la que se suprimen, insertan o sustituyen no más de 10 aminoácidos para obtener una proteína del VIH con actividad reducida o sin actividad alguna.

4. Proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la proteína de fusión comprende 4, 5 o todas las proteínas del VIH, seleccionadas de Vpr, Vif, Vpx, Vpu, Rev y Tat, o derivados de la secuencia de aminoácidos de una o más de dichas proteínas.

5. Proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende la secuencia de aminoácidos de las proteínas del VIH Vif, Vpr, Vpu, Rev y Tat, o derivados de la secuencia de aminoácidos de una o más de dichas proteínas.

6. Proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que las secuencias de aminoácidos de al menos dos de las proteínas del VIH están fusionadas entre sí sin aminoácidos adicionales.

7. Proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que las secuencias de aminoácidos de al menos dos de las proteínas del VIH están separadas por al menos un aminoácido adicional.

8. Proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la secuencia de aminoácidos de al menos una de las proteínas del VIH está fusionada a una pareja de fusión que no es una proteína del VIH seleccionada de Vif, Vpr, Vpx, Vpu, Rev, Tat y Nef.

9. Ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. Ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el ácido nucleico es ADN.

11. Ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la expresión de la proteína de fusión a partir del ADN está controlada por elementos reguladores seleccionados de promotores eucariotas, procariotas y víricos.

12. Ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el promotor vírico es un promotor de poxvirus.

13. Ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el que el ácido nucleico comprende adicionalmente la secuencia codificante para al menos una proteína del VIH adicional seleccionada de Gag, Pol y Env.

14. Ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el ácido nucleico comprende la secuencia codificante para las proteínas del VIH Gag, Pol y Env.

15. Vector que comprende un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14.

16. Vector de acuerdo con la reivindicación 15, en el que el vector es un vector vírico.

17. Vector de acuerdo con la reivindicación 16, en el que el vector vírico es un vector de poxvirus, en particular un vector del virus vacunal.

18. Vector de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el vector del virus vacunal es el Virus Vacunal Ankara Modificado (MVA).

19. Vector de acuerdo con la reivindicación 18, en el que el MVA se selecciona de MVA-575, depositado en la European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) bajo el número de depósito V00120707, y MVA-BN, depositado en la ECACC bajo el número de depósito V00083008.

20. Método para producir una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende las etapas de

- transfectar una célula hospedante con un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, o con un vector de acuerdo con la reivindicación 15, o

- infectar una célula hospedante con un vector vírico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19,

- expresar la proteína de fusión en la célula hospedante transfectada, o en la célula hospedante infectada, y

- recuperar la proteína de fusión.

21. Célula hospedante transfectada con un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, o un vector de acuerdo con la reivindicación 15, o infectada con un vector vírico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19.

22. Proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, o vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, como medicamento.

23. Proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, o vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, como vacuna.

24. Vacuna que comprende una proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, o un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19.

25. Uso de una proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, de un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, o de un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, para la preparación de una vacuna.

26. Uso de una proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, de un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, o de un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, para la preparación de un medicamento.